DE69837706T2 - Zytolyse der geeigneten zielzellen mit superantigen konjugate mittels der induktion von t-zell aktivierung - Google Patents

Zytolyse der geeigneten zielzellen mit superantigen konjugate mittels der induktion von t-zell aktivierung Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Inaktivierung/Zytolyse von Zielzellen, die durch T-Zellen bewirkt wird, welche durch funktionelle Superantigene aktiviert werden. Eine Zytolyse kann für die Therapie und für in vitro-Tests eingesetzt werden.
  • Definitionen
  • Superantigene:
  • Gemäß der allerersten Definition (etwa 1988 bis 1993) sind Superantigene bakterielle oder virale Proteine, die in der Lage sind, ohne vorherige intrazelluläre Prozessierung an MHC-Klasse-II-Antigene zu binden, wobei sie T-Zellen durch eine Bindung an die variable Region der Vβ-Kette (Vβ) des T-Zell-Rezeptors (TCR) aktivieren. Die Bindung führt zu einer auf die Vβ-Familie beschränkten Aktivierung eines relativ großen Teils/Teilmenge von T-Zellen und zu einer Lyse von MHC-Klasse-II-exprimierenden Zellen (Superantigen-abhängige zellvermittelte Zytolyse = SDCC). Normalerweise macht die Superantigen-aktivierte Teilmenge von T-Zellen etwa 1 bis 30 % der Gesamtmenge der T-Zellen eines Individuum aus.
  • Bekannte Wildtyp-Superantigene gemäß der vorstehenden Definition sind die Staphylococcus-Enterotoxine (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SED, SEE und SEH). Weitere Beispiele sind Toxisches-Schocksyndrom-Toxin 1 (TSST-1, das auch von Staphylococcus stammt), Exfoliativtoxine (EXft), Pyrogenes Exotoxin A, B und C von Streptococcus (SPE A, B und C), Proteine des Maus-Mamma-Tumor-Virus (MMTV), Streptococcus-M-Proteine, Enterotoxin von Clostridium perfringens (CPET), Mycoplasma-Arthritis-Superantigene usw.. Eine Übersicht von Superantigenen und ihren Eigenschaften findet sich in Kotzin et al., 1993.
  • Außerdem wurden Wildtyp- und chimäre Superantigene mutiert, so dass sie eine reduzierte oder keine MHC-Klasse-II-Bindung und/oder TCRVβ-Bindung aufweisen (Kappler et al., WO 9314264 ; Kappler et al., 1993; Blanco et al.; Abrahmsén et al., WO 9601650 ; Antonsson et al., WO 9736932 ; Antonsson et al., 1997). Dieser Typ von Superantigenen ist dann weniger toxisch. In dem Fall, dass bei ihnen die Fähigkeit zum Binden an MHC-Klasse-11 oder an TCRVβ vollständig fehlt, sind sie keine funktionellen Superantigene mehr, da sie dann ihre Fähigkeit zum Aktivieren von T-Zellen verloren haben.
  • Durch Mutieren von strukturell ähnlichen Wildtyp-Superantigenen war es mög lich, chimäre, funktionell aktive Superantigene (Hybrid-Superantigene) zu konstruieren (Lamphaer et al., 1996; und Antonsson et al., WO 9736932 ).
  • Es wurde entdeckt, dass die Aktivierung und anschließende Zelllyse in dem Fall in einer MHC-Klasse-II-abhängigen Art und Weise erfolgen kann, wenn das Wildtyp-Superantigen mit einer Zielsuchenden Einheit konjugiert wurde, die in der Lage ist, an eine Zelloberflächenstruktur zu binden (Dohlsten et al., WO 9201470 ). Dieser neue Effektor-Mechanismus wurde als Superantigen-Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytolyse (= SADCC) bezeichnet. Dieser Mechanismus schließt auch die analogen Mechanismen für solche Zielsteuerungs-Einheiten („targeting moieties"), die keine Antikörper sind, ein (Abrahmsén et al., WO 9601650 ; Antonsson et al., WO 9736932 ).
  • Demgemäß umfasst das Superantigen-Konzept von heute eine beliebige Verbindung (vorzugsweise einer Polypeptidstruktur), die ohne intrazelluläre Prozessierung in der Lage ist, an eine Zelloberflächenstruktur (Zielstruktur) und an eine oder mehrere polymorphe TCR-Ketten, insbesondere die Vβ-Kette, zu binden, wodurch eine Teilmenge von T-Zellen aktiviert wird, welche die spezifische, an der Bindung beteiligte TCR-Kette exprimieren. Danach werden die T-Zellen zytotoxisch und richten ihre Zytotoxizität gegen Zellen, welche die Oberflächenstruktur tragen (Zielstruktur, Zielzellen). Somit umfasst die Definition von Superantigen (SAG), wie sie im Zusammenhang mit der Erfindung verwendet wird, und sofern sie nicht anderes spezifiziert ist, Konjugate zwischen einer Zielsteuerungs-Einheit und einem freien Superantigen, wie vorstehend für SADCC erörtert.
  • Mit dem Begriff Superantigen sind, sofern nichts anderes angegeben ist, nur funktionelle Superantigene gemeint.
  • Ein freies Superantigen (San) ist ein Wildtyp-Superantigen, das mutiert oder auf andere Weise modifiziert sein kann, das nicht an eine Zielsteuerungs-Einheit oder an einen Immunmodulator konjugiert ist. Die Fähigkeit von freien Superantigenen zur MHC-Klasse-II-Bindung ist eine eigene Zielsteuerungs-Eigenschaft. Da die freien Superantigene keine konjugierten Zielsteuerungs-Einheiten aufweisen, können sie nur eine SDCC bewirken.
  • Ein konjugiertes Superantigen ist ein Konjugat zwischen einem freien Superanti gen und einer Zielsteuerungs-Einheit oder einem Immunmodulator. Ein konjugiertes Superantigen bewirkt eine SDCC und/oder eine SADCC.
  • Ein Immunmodulator (IM) ist eine Verbindung, die in der Lage ist, das Immunsystem zu regeln. Im Zusammenhang mit der Erfindung werden Superantigene getrennt behandelt und sind nicht eingeschlossen, wenn der Begriff Immunmodulator verwendet wird. Ein Immunmodulator hat häufig eine eigene Zielsteuerungs-Fähigkeit, etwa für einen entsprechenden Lymphozyten-Rezeptor. Sofern nichts anderes angegeben ist, liegt ein Immunmodulator in einer nichtkonjugierten Form vor.
  • Eine Zielsteuerungs-Einheit (T) ist eine Einheit, die in der Lage ist, an eine Zelloberflächenstruktur und/oder Gewebestruktur zu binden.
  • Ein Konjugat ist aus zwei oder mehreren der Einheiten Sag, IM, T usw. zusammengesetzt, die kovalent aneinander gebunden sind.
  • Mit löslichen Formen von aktiven Bestandteilen sind Formen gemeint, die in vom Körper stammenden Flüssigkeiten, wie Serum und Plasma, löslich sind.
  • Stand der Technik – Therapeutische Verwendung von Superantigenen
  • Nicht-konjugierte Wildtyp- und mutierte Superantigene wurden für die Therapie vorgeschlagen, wobei die kurative Wirkung vermutlich durch eine Aktivierung des Immunsystems, entweder lokal an Klasse-II-exprimierenden Zellen, die mit der zu behandelnden Krankheit assoziiert sind, oder als eine systemische Aktivierung, erreicht wird (Kalland et al., WO 9104053 ; Terman et al., WO 9110680 und WO 9324136 ; Antonsson et al., WO 9736932 ; und Newell et al., 1991). Aufgrund der extremen Toxizität von Wildtyp-Superantigenen sollte diese Vorgehensweise hinsichtlich einer Krebsbehandlung jedoch nur für einen sehr kleinen Teil aller Krebserkrankungen geeignet sein.
  • Außerdem wurde vorgeschlagen, Superantigene zu verwenden, die an Zielsuchende Einheiten konjugiert sind (Dohlsten et al., WO 9201470 ; Abrahmsén et al., WO 9601650 ; Antonsson et al., WO 9736932 ; und Ochi et al., 1993).
  • Im Zusammenhang mit Studien über das Verhindern einer Superantigeninduzierten Niederregulation einer T-Zell-vermittelten zytotoxischen Aktivität durch IL-2 in vivo wurde spekuliert, dass es günstig sein sollte, IL-2 zusammen mit nicht-konjugierten Wildtyp-Superantigenen und mit Wildtyp-Superantigenen, die an Antikörper konjugiert sind, zu verabreichen (Belfrage Thesis Augusti/September 1996; Belfrage et al., 1994; Belfrage et al., 1995; Belfrage et al., 1997a; Belfrage et al., 1997b (Wildtyp-Superantigene)).
  • Außerdem wurde vermutet, dass Zellmembran-verankertes CD80 in der Superantigen-Aktivierung von T-Zellen in Abwesenheit von MHC-Klasse-II-Antigenen eine Rolle spielt (Lando et al., 1993 und 1996).
  • 4 in Lando et al., 1996, zeigt ein Experiment, in welchem die Fähigkeit eines Superantigens, das an einen Antikörper konjugiert ist, alleine oder in Kombination mit IL-2 analysiert wurde, die Proliferation ruhender menschlicher T-Zellen zu induzieren. In diesem viertägigen Experiment wurde das konjugierte Superantigen auf parentalen CHO-Zellen und auf CHO-Zellen, die transfiziert waren, so dass sie Klasse-II oder C215 oder Klasse-II plus C215 exprimierten, präsentiert. Die Wirkung von IL-2 war nicht signifikant.
  • Kappler et al. ( WO 9314634 ) haben ein nicht-konjugiertes Wildtyp-SEB vorgeschlagen, das so mutierte wurde, dass es seine Vβ- oder MHC-Klasse-II-Bindungseigenschaft verloren hat (im Zusammenhang von Impfstoffen und als Mittel zum Neutralisieren toxischer Effekte von Superantigenen). Abrahmsén et al. ( WO 9601650 ) haben eine Krebstherapie mit konjugierten Superantigenen vorgeschlagen, die eine modifizierte, vorzugsweise verminderte, Fähigkeit zum Binden von Klasse-II-Antigenen aufweisen. Antonsson et al. ( WO 9736932 ) haben eine Therapie mit chimären Superantigenen und Superantigenen mit einer reduzierten Seroreaktivität vorgeschlagen (vgl. auch Abrahmsén et al.). Mutationen, wie von Abrahmsén et al. ( WO 9601650 ) und Antonsson et al. ( WO 9736932 ) beschrieben, haben Superantigene mit einer verminderten systemischen Toxizität, einer verminderten Immunogenität und/oder einer verminderten Seroreaktivität in dem zu behandelnden Säuger zur Folge.
  • Therapien wurden vorgeschlagen, bei denen Nucleinsäuren, die Wildtyp-Superantigene codieren, verabreicht wurden (Terman et al., WO 9110680 ; WO 9324136 ; und Dow et al. WO 9636366 ). Dow et al. gehen noch weiter und schlagen eine gemeinsame Verabreichung einer Nucleinsäure, die ein Zytokin oder ein Chemokin codiert, und einer Nucleinsäure, die ein Superantigen codiert, vor. Ohne experimentelle Beweise liefern zu können, schlägt WO 9636366 außerdem Konstrukte in Form eines biscistronischen Genkonstrukts vor, in welchem das eine Cistron das Gen, welches das Superantigen codiert, enthält, und das andere Cistron das Gen, welches ein Zytokin oder Chemokin codiert, enthält.
  • Pouletty, P., (Sangstat, EP 510949 ) hat spekuliert, jedoch ohne einen experimentellen Beweis liefern zu können, dass Konjugate zwischen Zielsteuerungs-Einheiten, wie IL-2, und Wildtyp-Superantigenen für eine Inaktivierung von Zellen, die den IL-2-Rezeptor exprimieren, nützlich sein könnten.
  • Stand der Technik – Therapeutische Verwendung von Immunmodulatoren in Kombinati on mit Antikörpern, die für Zellen, die inaktiviert werden sollen, spezifisch sind
  • Früher wurde schon vorgeschlagen, Antikörper mit Modifikatoren der biologischen Antwort, z.B. einem Chemokin oder einem Zytokin, wie Interleukin-2, zu konjugieren (Fell et al., EP 439095 ; Rosenblum et al., EP 396387 ; Pancook et al., 1996; und Becker et al., 1996).
  • Das Problem, das durch die vorliegende Erfindung gelöst werden soll
  • Die vorliegende Erfindung soll Verbesserungen in Bezug auf eine Superantigen- Therapie bereitstellen, umfassend eine Aktivierung des Immunsystems, um unerwünschte Zielzellen in einem zu behandelnden Säuger zu inaktivieren. Insbesondere beziehen sich die Verbesserungen auf: 1. ein lokales Ausweiten der Aktivierungsperiode, z.B. in einem Tumor, während eines ersten Behandlungszyklus; 2) ein Entgegenwirken dem Auftreten einer Hyporesponsivität aufgrund der Neigung aktivierter T-Zellen, in die Anergie zu entkommen; 3) ein Erleichtern einer MHC-Klasse-II-unabhängigen T-Zell-Aktivierung im Tumorbereich; und 4) ein Verbreitern des therapeutischen Fensters für die Zytolyse durch Superantigen-Aktivierung. Nun wurde entdeckt, dass diese Verbesserungen vollständig oder teilweise erreicht werden können, mit der Maßgabe, dass die Verabreichung des Superantigens (SAG) mit der Verabreichung eines Immunmodulators in löslicher Form kombiniert wird, wobei mindestens eines/einer von Superantigen und Immunmodulator in Form eines Konjugats mit einer Einheit, die Zielsteuerungs-Eigenschaften für die zu inaktivierende Zelle besitzt, vorliegt.
  • Der erste Aspekt der Erfindung: Ein Verfahren zum Inaktivieren von Zielzellen
  • Der erste Aspekt der Erfindung betrifft sowohl die Therapie als auch in vitro-Tests und ist ein Verfahren zum Inaktivieren unerwünschter Zielzellen in Gegenwart von T-Zellen, indem die zwei Typen von Zellen mit einem Superantigen (SAG), insbesondere mit einem Superantigen, das T-Zellen durch die Bindung an TCRVβ aktiviert, in Gegenwart eines Immunmodulators (IM), der nicht ein Superantigen (Sag) ist, in Kontakt gebracht werden. In seinem umfassendsten Aspekt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines/einer von Superantigen und Immunmodulator in Form eines Konjugats mit einer Einheit (T), die Zielsteuerungs-Eigenschaften für die zu inaktivierende Zelle besitzt, vorliegt.
  • Der erste Hauptaspekt der Erfindung betrifft neue Superantigen-Konjugate der Formel:
    • a) eines Dreifachkonjugats (T) (Sag) (IM);
    • b) eines Doppelkonjugats (T) (Sag) in Kombination mit einem Doppelkonjugat (T') (IM), wobei T und T' verschieden oder gleich sind; oder
    • c) eines Doppelkonjugats (T) (Sag) in Kombination mit (IM), wobei T eine Zielsteuerungs-Einheit, Sag ein Superantigen und IM einen Immunmodulator, der kein Superantigen ist, darstellt.
  • Das Superantigen und der Immunmodulator können auf den gleichen Typ von Zellen, z.B. auf identische oder kreuzreagierende Strukturen/Epitope, oder auf verschiedene Typen von Zellen innerhalb des gleichen Gewebes abgezielt sein. Das Zielsteuern kann auf normale Zellen oder auf erkrankte Zellen ausgerichtet sein, die mit einem bestimmten und mit dem gleichen Gewebe assoziiert sind. Das Superantigen und/oder der Immunmodulator können/kann durch einen oder mehrere Antikörper zielgerichtet gesteuert werden.
  • T ist eine Zielsteuerungs-Einheit, Sag entspricht einem freien Superantigen, und T ist ein Immunmodulator, der kein Superantigen ist. T, Sag und IM sind durch organische Linker B aneinander gebunden, die innerhalb eines bestimmten und desselben Konjugatmoleküls oder einer Substanz verschieden oder gleich sein können. Konjugate umfassen sowohl chemische Konjugate als auch rekombinant produzierte Konjugate (Fusionsproteine).
  • A. Der Immunmodulator IM
  • IM steht für einen Immunmodulator, der kein freies oder konjugiertes Superantigen ist.
  • Der Immunmodulator kann ein Zytokin oder ein Chemokin sein. Zur Erläuterung angegebene Zytokine sind Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (GM-CSF), Tumornekrosefaktor α oder β (TNFα oder TNFβ), Makrophagenkoloniestimulierender Faktor (M-CSF), Granulozyten-stimulierender Faktor (G-CSF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 und IGF. Zur Erläuterung angegebene Chemokine sind C5a, IL-8, Monozyten-chemotaktisches Protein 1 alpha (MIP1alpha) oder Monozyten-chemotaktisches Protein 1β (MIP1β), Monozyten-chemoattraktives Protein 1 (MCP-1), Monozyten-chemoattraktives Protein 2 (MCP-2), Monozyten-chemoattraktives Protein 3 (MCP-3), Plättchen-aktivierender Faktor (PAFR), N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin (FMLPR), Leukotrien B4 (LTB4R), Gastrin-freisetzendes Peptid („gastrin releasing peptide", GRP), RANTES, Eotaxin, Lymphotactin, IP10, I-309, ENA78, GCP-2, NAP-2, MGSA/gro, DC-CK1, FIt3L (ektopische Domäne), Fractalkin, PF-4 usw..
  • Ein anderer Typ von Immunmodulatoren sind diejenigen, die von Zellmembranverankerten Rezeptor-Ligand-Paaren stammen, die an der Modulation einer ausgelösten Immunantwort beteiligt sind, wie einer Co-Stimulation (z.B. Lymphozytenoberfläche-gebundene Rezeptoren und entsprechende zellgebundene Liganden). Beispiele zu Erläuterung sind Mitglieder, die aus den Paaren CD40L/CD40, 4-BB1/4-BB1L, CD28/B7, CTLA-4/87 usw. ausgewählt sind. B7 schließt Varianten, wie CD80 und CD86 ein, wobei die erstere Variante bevorzugt ist. Bevorzugte Formen sind löslich, enthalten den extrazellulären Teil (ektopische Domäne) und weisen keine intrazellulären und Membran-verankerten Teile auf.
  • Besonders bevorzugte Immunmodulatoren sind in der Lage, die Effekte von Superantigenen in vivo zu verstärken, z.B. indem sie dagegen wirken, dass Superantigenaktivierte T-Zellen in die Anergie entkommen. Typische geeignete zellgebundene Rezeptoren/Liganden sind CD28/B7, einschließlich Analoga und Fragmente wie vorstehend definiert. Typische Zytokine dieser Gruppe sind IL-2, wobei es sich um den wichtigsten Stromabwärts-Effektor der CD28/B7-Signalgebung handelt, und die IL-2-ähnlichen Zytokine IL-7 und IL-15. Von T-Zelloberfläche-assoziierten Rezeptor-Ligand-Paaren ist der Vertreter, der nicht an die zu aktivierende T-Zelle gebunden ist, bevorzugt, in ein Konjugat gemäß der Erfindung eingebaut zu werden. Für CD40L/CD40, 4-BB1/4-BB1L und CD28/B7 bedeutet dies bevorzugt die löslichen Formen CD40, 4-BB1L und B7 wie vorstehend definiert. Der experimentelle Teil dieses Textes erläutert die Immunmodulator-Varianten, die sich bis zum Prioritätstag in der Erfindung als optimal erwiesen haben.
  • Immunmodulatoren sollten vorzugsweise von der gleichen Art stammen wie das Individuum, das behandelt werden soll. Native Immunmodulatoren, wie Zytokine und Chemokine, weisen in Säugern häufig eine hohe systemische Toxizität und eine relativ kurze Halbwertszeit auf. Die Literatur ist voll von Anleitungen, wie man Immunmodulatoren modifizieren kann, um eine erhöhte Stabilität gegenüber einer Oxidation, eine längere Halbwertszeit in vivo, eine niedrigere Toxizität, eine verbesserte Umfaltung bei einer Herstellung durch rekombinante Verfahren usw. zu erreichen. Z.B. beschreibt US 5 229 109 (Grimm et al.) Analoga von IL-2 mit niedriger Toxizität, die eine verminderte Affinität für den Hochaffinitäts-IL-2-Rezeptor (IL-2R) aufweisen, da ihnen die Bindung an die p55-α-Untereinheit des Rezeptors fehlt. Die Analoga werden hauptsächlich durch Mutation des Codons für eine Aminosäure in Position 33 bis 46 in IL-2 hergestellt (z.B. Arg38Ala und Phe42Lys oder Phe42Ala). Die Asp20Lys-Mutante hat eine 100- bis 500-fach reduzierte Affinität für die p75/β-Kette des IL-2-Rezeptors, ohne dass die Bindung an p55 beeinträchtigt ist (Collins et al., 1988). Andere Mutationen, z.B. Asp20Ser, sind weniger schwerwiegend (Berndt et al., 1994). Studien an murinem IL-2 zeigen, dass Asp84 und Asn88 des menschlichen IL-2 auch an der p75-Bindung beteiligt sind (Zurawski et al., 1993). Dies wird durch ein Modell der Bindung zwischen menschlichem IL-2 und seinem Rezeptor bestätigt (Bamborough et al., 1994). Die erwartete Reduktion in der Affinität durch diese Mutationen ist bei Asp20>Asn88>Asp84 ausgeprägt.
  • Wenn man die Mutationen in Arg38 und Phe42 mit Mutationen in Position 88 und 20 kombiniert, würde dies zu einer noch niedrigeren Affinität für IL-2R führen. Eine weitere wirksame und zum Prioritätstag bevorzugte IL-2-Mutation ist Thr51Pro, die ein IL-2-Analogon mit einer herabgesetzten Rate von Zell-Internalisierung und einer verlängerten Dauer seiner immunmodulierenden Wirkung ergibt (Chang et al., 1996).
  • Die Numerierung von Aminosäurepositionen erfolgt gemäß Taniguchi et al., 1983.
  • Die Veröffentlichungen von Grimm et al.; Collins et al., 1988; Berndt et al., 1994; Zurawski et al., 1993; Bamborough et al., 1994; Chang et al., 1996; und Taniguchi et al., 1983, sind durch Bezugnahme eingeschlossen.
  • Die Verwendung von Zytokin- und Chemokin-Analoga mit einer verringerten Affinität für ihre normalen Rezeptoren in Konjugaten wie vorstehend beschrieben führt dazu, dass ihre zielgerichtetes Hinsteuern zu der vorher gewählten Zielzelle verstärkt wird. Es ist denkbar, dass Zytokine und Chemokine, die so mutiert wurden, dass sie bei Bindung an ihren entsprechenden Zellrezeptor eine verminderte Rate von Zell-Intemalisierung aufweisen, und die dann in ein Konjugat gemäß der Formel I eingebaut werden, im Vergleich zu den entsprechenden Konjugaten mit der nativen Form des Immunmodulators eine verlängerte Superantigen-Aktivität zur Folge haben.
  • Der Begriff Immunmodulator (IM) umfasst somit eine beliebige modifizierte Form, z.B. eine beliebige mutierte Form, die in der Lage ist, die Effekte der entsprechenden nativen Form des Immunmodulators zu agonisieren oder zu antagonisieren.
  • B. Der Superantigen-Teil Sag
  • Sag stellt ein Superantigen dar, wie für freie Superantigene und unter der Überschrift „Stand der Technik ..." vorstehend definiert, d.h. Wildtyp-Superantigene, die modifiziert sein können, z.B. durch Mutation,
    • a. so dass sie im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp-Superantigen eine verminderte Fähigkeit zum Binden an MHC-Klasse-II-Antigen aufweisen (vgl. z.B. in Abrahmsén et al. ( WO 9601650 ));
    • b. so dass sie im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp-Superantigen eine verminderte Seroreaktivität in menschlichen Seren aufweisen (vgl. z.B. Abrahmsén et al. ( WO 9601650 ); Antonsson et al. ( WO 9736932 ); und Antonsson et al., 1997);
    • c. so dass sie im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp-Superantigen eine verminderte Immunogenität in Menschen aufweisen (vgl. z.B. Antonsson et al. ( WO 9736932 ); und Antonsson et al., 1997);
    • d. so dass sie eine Chimäre zwischen zwei oder mehreren analogen Wildtyp-Superantigenen sind, wobei die eine Region in einem ersten Wildtyp-Superantigen durch die entsprechende Region in einem zweiten analogen Superantigen ersetzt wurde. Die betreffende Region kann eine Region sein, welche die Bindung an TCRVβ bestimmt, z.B. wie für SEE/SEA- und SEA/SEE-Chimären definiert (vgl. z.B. Antonsson et al. WO 9736932 ; Antonsson et al., 1997; und Lamphaer et al., 1996).
  • Außerdem sind andere Modifikationen/Mutationen, die sich möglicherweise als geeignet erweisen, eingeschlossen, z.B. um bei einer Produktion in eukaryotischen Zellen eine unerwünschte Glykosylierung zu vermeiden.
  • Typische Mutationen für SEA/SEE-ähnliche Superantigene waren am Prioritätstag (Numerierung wie von Antonsson et al., 1997, und Antonsson et al., WO 9736932 verwendet):
    • a. eine verminderte MHC-Klasse-II-Bindung: Asp227Ala (= SEAm9), Phe47Ala und/oder Asp70Arg. Die Mutante Phe47Ala/Asp227Ala = SEAm23.
    • b. und d. Chimären zwischen SEA und SEE, deren Ziel es ist, die Seroreaktivität in Menschen zu reduzieren, während die SADCC-Fähigkeit des entsprechenden konjugierten Superantigens erhalten bleibt: SEE mit den folgenden Substitutionen: Gly20Arg, Thr21Asn, Gly24Ser, Lys27Arg.
  • Die im experimentellen Teil verwendeten Mutanten sind SEA(Asp227Ala) = SEAm9, SEA(Phe47Ala/Asp227Ala) = SEAm23 und SEA(/Phe47Ala/Asn 102Q/Asn 149Asp/Thr218Val/Asp227Ala) = SEAm57.
  • Am Prioritätstag wurden bevorzugte Superantigene ausgewählt aus:
    • 1. Superantigenen (Sag), die zwei MHC-Klasse-II-Bindungsstellen aufweisen (z.B. Staphylococcus-Enterotoxine A und E);
    • 2. Superantigenen (Sag), die in ihrer nicht-mutierten Form für eine optimale Bindung an MHC-Klasse-II ein Zn-Ion benötigten (z.B. SEA, SEE und SEH);
    • 3. Staphylococcus-Enterotoxinen.
  • Ein Sag-Molekül, das in ein Konjugat gemäß der Erfindung eingebaut werden soll, muss kein funktionelles Superantigen sein, wobei der wesentliche Punkt darin besteht, dass das endgültige Konjugat eine SADCC und/oder eine SDCC wie vorstehend angegeben bewirkt.
  • C. Zielsteuerungs-Einheit T
  • T kann im Prinzip eine beliebige Struktur aufweisen, die in der Lage ist, an eine Zelloberflächenstruktur, vorzugsweise eine Krankheits-spezifische Struktur, zu binden. Die Struktur, gegen die T gerichtet ist, ist üblicherweise verschieden (a) von dem polymorphen TCR-Kette-Epitop, an welches Sag bindet, und (b) von den MHC-Klasse-II-Epitopen, an die Sag bindet. Die Zielsuchende Einheit kann ausgewählt sein aus Interleukinen (z.B. Interleukin-2), Hormonen, Antikörpern, einschließlich Antigenbindender Fragmente von Antikörpern, Wachstumsfaktoren usw.. Vgl. z.B. Woodworth, 1993, (hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
  • Die Zielsteuerungs-Einheit kann somit ein Protein sein, das 1, 2, 3 oder 4 Polypeptidketten enthält.
  • Am Prioritätstag war es bevorzugt, dass T ein Antikörper war (vollständiger Antikörper, Fab, F(ab)2, Fv, ScFv (Einzelketten-Antikörper), mehrere Einzelketten-Antikörper (ScFv)n und ein beliebiges anderes Antigen-bindendes Antikörperfragment), einschließlich einer beliebigen funktionell aktiven, verkürzten Form der vorstehend erwähnten Antikörperformen. Andere Varianten sind monospezifisch und bispezifisch. Der Antikörper kann im Prinzip gegen eine beliebige Krankheits-assoziierte/spezifische Zelloberflächenstruktur gerichtet sein, z.B. gegen Strukturen, die mit einer beliebigen der vorstehend angegeben Krebsformen in Zusammenhang stehen, wobei aktive Fragmente von Antikörpern (wie Fab) besonders betont werden sollen. Typischerweise kann der Antikörper gegen ein Kolon- und/oder Pankreas-spezifisches Epitop, z.B. das sogenannte C242-Epitop (Lindholm et al., WO 9301303 ), ein Lungenkrebs-spezifisches Epitop, z.B. das Epitop für den 5T4-Antikörper (Stern et al., WO 8907947 ), ein Lymphom-spezifisches Epitop, z.B. auf CD19, ein Melanom-spezifisches Epitop, z.B. HMW-MAA, usw., gerichtet sein.
  • Der Begriff „Antikörper" umfasst sowohl monoclonale als auch polyclonale Varianten, wobei monoclonale Präparate bevorzugt sind.
  • Wenn die Zielsteuerungs-Einheit ein Fab-Fragment ist, wurden die Cysteinreste, die normalerweise die schweren und leichten Fab-Ketten miteinander verbinden, vorzugsweise durch eine Aminosäure ersetzt, die keine Disulfidbildung erlaubt, z.B. durch Serin. Vgl. auch Antonsson et al., WO 9736932 .
  • Das vorstehend Gesagte schließt außerdem ein, dass T gegen einmalige Strukturen auf mehr oder weniger gesunden Zeilen gerichtet sein kann, welche die Entwicklung einer Krankheit regulieren oder kontrollieren.
  • D. Der Linker B
  • Der Linker B kann wie vorstehend beschrieben ausgewählt werden (Dohlsten et al., WO 9201470 ); Abrahmsén et al., WO 9601650 ; und Antonsson et al., WO 9736932 ), d.h. B soll vorzugsweise hydrophil sein und eine oder mehrere Strukturen) aufweisen, die ausgewählt sind aus Amid, Thioether, Disulfid usw.. Die wichtigsten Linker sind diejenigen, die durch Rekombinationsverfahren erhalten werden, d.h. die Konjugation erfolgt auf Genom-Ebene, wodurch Oligopeptid-Linker zustande kommen. Typischerweise enthalten Oligopeptid-Linker 1 bis 30, wie 1 bis 20, Aminosäurereste, die vorzugsweise so ausgewählt sind, dass der Linker insgesamt hydrophil ist. Die Linkerreste sind somit vorzugsweise ausgewählt aus hydrophilen Aminosäureresten, wie Gin, Ser, Gly, Glu, Pro, His und Arg. Typische Oligopeptid-Linker umfassen das Tripeptid GlyGlyPro oder den sogenannten Q-Linker (Wootton et al., 1989, hier durch Bezugnahme eingeschlossen), der am aminoterminalen Ende mit Gly-Pro modifiziert sein kann.
  • E. Verknüpfungspunkte für T, Sag und IM
  • Chemische Konjugate werden typischerweise ein Gemisch aus Konjugatmolekülen, die sich in Bindungspositionen unterscheiden, enthalten. Der Konjugat-Stoff wird sowohl Hetero- als auch Homokonjugate enthalten.
  • Für rekombinante Konjugate (Fusionsproteine) wind der erhaltene Konjugat-Stoff hinsichtlich der Bindungsposition einheitlich sein. Für jede einzelne Untereinheit (T, Sag, IM) wird das Aminoende mit dem Carboxyende einer anderen Untereinheit oder umgekehrt, vorzugsweise über eine eingefügte Oligopeptidbrücke, fusioniert. Die Kombinationen sind, wenn das Konjugat jeweils einen Vertreter von T, IM und Sag enthält, T-IM-Sag, IM-T-Sag, Sag-IM-T, Sag-T-IM, T-Sag-IM, IM-Sag-T (wobei das Vorliegen der Linkerstruktur B nicht dargestellt ist). Wenn eine oder mehrere der Untereinheiten zwei oder mehr Polypeptidketten enthalten, steigt die Zahl der Möglichkeiten. Wenn T ein Fab-Antikörperfragment ist, sind die Möglichkeiten (wobei die Oligopeptid-Linker B nicht dargestellt sind):
    • 1. Sag-Fab (leichte Kette) - IM Fab (schwere Kette)
    • 2. Fab (leichte Kette) Sag-Fab (schwere Kette) - IM
    • 3. Sag-Fab (leichte Kette) Fab (schwere Kette) - IM
    • 4. Fab (leichte Kette) - IM Sag-Fab (schwere Kette)
    • 5. Sag-Fab (leichte Kette) IM-Fab (schwere Kette)
    • 6. IM - Fab (leichte Kette) Sag-Fab (schwere Kette)
    • 7. Fab (leichte Kette) - Sag Fab (schwere Kette) - IM
    • 8. Fab (leichte Kette) - IM Sag-Fab (schwere Kette) - Sag.
  • In weiteren Varianten können der Immunmodulator und das Superantigen in Folge an einem beliebigen Ende einer der Ketten in dem Antikörper fusioniert sein.
  • Am Prioritätstag waren rekombinante Konjugate bevorzugt, wobei besonders bevorzugt war, wenn Fab-Fragmente als Zielsteuerungs-Einheit eingesetzt wurden und das Aminoende des freien Superantigens mit der ersten konstanten Domäne der schweren (CH1) oder leichten Antikörperkette und der Immunmodulator mit dem restlichen Carboxyende verbunden war (gültig für die Formeln I bis IV).
  • Das Fusionsprotein wird für eine optimale Produktion und Funktion als ein zweikettiges Produkt rekombinant exprimiert, in welchem das Superantigen C-terminal mit der CH1-Domäne des Fab-Antikörperfragments über einen flexiblen hydrophilen Aminosäure-Linker von drei bis elf Resten fusioniert ist. Dieser Linker kann die Sequenz Gly-Gly-Pro oder Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO: 19) oder vier bis neun, auf SEQ ID NO: 19 basierende Reste aufweisen, wobei SEQ ID NO: 19 bevorzugt ist. Die Immunmodulator-Einheit ist über einen hydrophilen und neutralen oder positiv geladenen Linker von 10 bis 20 Aminosäureresten (Linker Q) mit der leichten Kette C-terminal fusioniert. Vorzugsweise kann der Linker Q die folgenden Sequenzen aufweisen: Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg (SEQ ID NO: 23), Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg (SEQ ID NO: 20), Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg (SEQ ID NO: 21) oder Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr (SEQ ID NO: 22), wobei SEQ ID NO: 20 und 21 am stärksten bevorzugt sind (vgl. Beispiel 2 für weitere Einzelheiten).
  • In diesem Stadium wurde vermutet, dass die analogen Kombinationen am Aminoterminus oder eine Kombination von Verknüpfungen an den Amino- und Carboxyenden der VH- und VL-Domäne zu aktiven, jedoch weniger wirksamen Konjugaten führen.
  • F. Andere aktive Einheiten
  • Freie Superantigene (Sag):
  • Vgl. unter der Überschrift „Definition". Typische Sags sind unter den Überschriften „Stand der Technik" und „B. Der Superantigen-Teil Sag" angegeben.
  • Nicht-konjugierte Immunmodulatoren:
  • Vgl. unter der Überschrift "Definition". Im Prinzip können die gleichen Immunmodulatoren wie unter der Überschrift „A. Der Immunmodulator IM" angegeben angewendet werden. Zytokine und Chemokine sind bevorzugt, wobei IL-2 und IL-2-ähnliche Zytokine besonders bevorzugt sind.
  • Zielgerichtete Immunmodulatoren (T,IM-Konjugate):
  • Diese Konjugate entsprechen der allgemeinen Formel (T')x(IM')z Formel IIIin welcher T' und IM' miteinander durch einen organischen Linker B' verbunden sind. T', IM' und B' sind aus den gleichen Gruppen von Verbindungen/Strukturen wie T, IM und B ausgewählt. x und z sind Zahlen, die typischerweise aus 0 bis 10, wie 0 bis 5, ausgewählt sind, und stellen die Anzahl von Einheiten T bzw. IM in einem bestimmten Konjugatmolekül dar, wobei ein oder zwei IM' pro T' und Konjugatmolekül bevorzugt ist/sind. Die Verknüpfungspunkte zwischen T' und IM' sind wie vorstehend definiert. Vgl. auch unter der Überschrift „E. Verknüpfungspunkte ...", wobei die Formeln 1 bis 8 und die Kommentare hierzu auch auf T,IM-Konjugate angewendet werden können, außer dass Sag weggelassen wird. Konjugate der Formel III können gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden, d.h. durch herkömmliche chemische Bindungs- oder Rekombinationstechniken (Fusionsproteine), wobei die letzteren bevorzugt sind (Fell et al., EP 439095 ; Rosenblum et al., EP 396387 ). Besonders wichtige T,IM-Konjugate umfassen eine IM'-Einheit, die modifiziert, z.B. mutiert, wurde, um eine reduzierte Affinität und/oder reduzierte Rate von Internalisierung wie vorstehend definiert zu erhalten.
  • Zielgerichtete Superantigene (T,Sag-Konjugate):
  • Diese Konjugate entsprechen der allgemeinen Formel (T'')x(Sag'')y Formel IVin welcher T'' und Sag' miteinander durch organische Linker B'' verbunden sind. T'', Sag'' und B'' sind aus den gleichen Gruppen von Verbindungen/Strukturen wie T, IM und B ausgewählt. x und y sind Zahlen, die typischerweise aus 0 bis 10, wie 0 bis 5, ausgewählt sind, und stellen die Anzahl von Einheiten T bzw. IM in einem bestimmten Konjugatmolekül dar, wobei ein oder zwei Sag'' pro T'' und Konjugatmolekül bevorzugt ist/sind. Die Verknüpfungspunkte zwischen T'' und Sag" sind wie vorstehend definiert. Vgl. auch unter der Überschrift „E. Verknüpfungspunkte ...", wobei die Formeln 1 bis 8 und die Kommentare hierzu auch auf T,Sag-Konjugate angewendet werden können, außer dass IM aus der Formel weggelassen wird. Konjugate der Formel II können gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden, d.h. durch herkömmliche chemische Bindungs- oder Rekombinationstechniken (Fusionsproteine), wobei die ersteren bevorzugt sind. Vgl. z.B. Dohlsten et al., WO 9201470 ; Abrahmsén et al., WO 9601650 ; Antonsson et al., WO 9736932 .
  • Die Krankheiten, die mit der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung oder mit dem gemäß der Erfindung hergestellten Medikament behandelt werden sollen
  • Die zu behandelnden Krankheiten sind im Prinzip die gleichen wie diejenigen, die früher für Superantigene vorgeschlagen wurden. Vgl. z.B. unter den vorstehenden Überschriften „Stand der Technik ...". Zur Erläuterung angegebene Beispiele sind Krebserkrankungen, Autoimmunkrankheiten, Befall durch Parasiten, Virusinfektionen und andere Krankheiten, die mit Zellen assoziiert sind, die auf ihrer Oberfläche MHC-Klasse-II-Antigene und/oder andere Strukturen exprimieren, die für die entsprechende Krankheit spezifisch sind und an die Zielsuchende Einheit binden, welche in dem Superantigen gemäß dem erfindungsgemäßen Konzept (Formel I) eingebaut ist. Außerdem können bakterielle Infektionen durch die Verwendung der Erfindung bekämpft werden.
  • Wichtige Krebsformen in Zusammenhang mit der Erfindung sind: Melanome, Karzinome, hämopoetische Neoplasien und Fibrosarkome und schließen spezifische Formen ein, wie Plattenepithelkarzinom, Mammakarzinome, Kopf- und Halskarzinome, Thyreoideakarzinome, Weichteilkarzinome, Knochensarkome, Hodenkrebs, Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Blasenkrebs, Hautkrebs, Karzinome im Gehirn, Angiosarkome, Hämangiosarkome, Mastzellentumoren, primäre Leberkarzinome, Lungenkarzinome, Zervixkarzinome, Nierenzellkarzinome, Leukämien und Lymphome. Eingeschlossen sind beliebige Arten von malignen oder benignen Tumoren, außerdem Arzneimittelmehrfachresistente Krebserkrankungen, metastatische Krebserkrankungen, verschiedene Formen von chemisch oder viral (Herpes, SV40, HIV usw.) induzierten Krebserkrankungen.
  • Herstellung von vorstehend definierten Konjugaten
  • Die Herstellung kann im Prinzip gemäß zwei Hauptwegen durchgeführt werden:
    • 1. Chemische Bindung der einzelnen Untereinheiten T, Sag und IM aneinander. Jede einzelne Untereinheit oder Kombination hiervon kann durch Rekombinationstechniken hergestellt werden.
    • 2. Rekombinationstechniken, die ein Konjugat wie in einer der vorstehend angegebenen Formeln definiert direkt bereitstellen.
  • Die genauen Verfahren sind dem durchschnittlichen Fachmann wohlbekannt und umfassen eine große Zahl von Varianten.
  • Bei der chemischen Bindung werden typischerweise funktionelle Gruppen (z.B. primäre Aminogruppen, Carboxygruppen, Mercaptogruppen, Kohlenhydratgruppen) genutzt, die typischerweise in mehreren Positionen von Superantigenen, proteinartigen Immunmodulatoren und proteinartigen Zielsteuerungs-Einheiten nativ vorliegen. Die Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
  • Die wichtigste Wirtszelle für eine rekombinante Produktion der erfindungsgemäßen Konjugate zwischen einem Superantigen und einem Immunmodulator (fusionierte Formen und auch nicht-konjugierte Formen) im großen Maßstab ist E. coli. Dieser Wirt stellt im Prinzip zwei Routen bereit: die intrazelluläre Produktion und die Sekretion. Die letztere Variante ist bevorzugt, da sie die Reinigung von korrekt gefalteten Proteinen aus dem Periplasma und aus dem Kulturmedium ermöglicht. Das Vorstehende schließt jedoch nicht aus, dass es möglich ist, aktive Konjugate auch in anderen Wirtszellen herzustellen, z.B. in eukaryotischen Zellen, wie Hefe- oder Säugerzellen. Einleitende Ergebnisse haben bisher gezeigt, dass eukaryotische Zellen, wie Säugerzellen, möglicherweise für den Einbau von Immunmodulatoren, die mit CD28 interagieren, z.B. B7 und seine Analoga, bevorzugt sind.
  • Der zweite Aspekt der Erfindung: Genkonstrukte, welche die neuen erfindungsgemäßen Konjugate codieren
  • Ein zweiter Aspekt der Erfindung ist ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, vorzugsweise DNA, wie cDNA, oder RNA, das ein Superantigen und einen Immunmodulator wie vorstehend definiert codiert, wobei IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, RANTES, ektopische Domäne von CD80, ektopische Domäne von CD86, 4-BB1L und Flt3L und ihre Analoga wie vorstehend definiert bevorzugt sind. In diesem Aspekt der Erfindung sollte die Nucleinsäure typischerweise regulatorische Kontrollsequenzen, wie Translations-Regulationssequenzen, Replikationsursprung, Sekretions-Signalsequenzen, für den Immunmodulator und/oder das Superantigen usw. enthalten, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in welcher der Immunmodulator und das Superantigen exprimiert werden sollen. Die Region zwischen den Teilsequenzen, die das Superantigen und den Immunmodulator codieren, kann eine Sequenz umfassen, welche Ribosomen-Eintrittstellen codiert, wie in biscistronischen Genkonstrukten. Durch das Letztere wird eine getrennte Expression jeder im Konjugat enthaltenden Polypeptidkette möglich gemacht. Im Fall von Mehrketten-Konjugat-Kombinationen, die IM, Sag, Zielsteuerungs-Einheit-Konjugat und die richtigen Signalsequenzen enthalten, werden biscistronische Konstrukte die Faltung und den Zusammenbau zu vollständig aktiven Konjugaten erleichtern, bei denen IM an eine der Ketten gebunden ist. Dies wird für die Fälle wichtig sein, in denen die Zielsteuerungs-Einheit ein zweikettiges Antikörpermolekül ist und mindestens eines/einer von Superantigen (Sag) und Immunmodulator an ein terminales Ende der Antikörperkette fusioniert ist. Vgl. vorstehend.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, Dosis und Verabreichungsrouten
  • Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusam mensetzung, welche die erfindungsgemäße Kombination von Superantigen (Sag), Zielsteuerungs-Einheit (T) und Immunmodulator (IM) enthält. Das charakteristische Merkmal dieses Aspekts der Erfindung besteht darin, dass mindestens eines/einer von Su perantigen und Immunmodulator in Form eines Konjugats vorliegt, welches die Zielsteuerung zu Zellen hin zulässt, die inaktiviert werden sollen, wie vorstehend beschrieben.
  • Die betreffenden Zusammensetzungen sind auf dem Fachgebiet bekannt, mit der Ausnahme, dass sie jetzt die erfindungsgemäße Konjugat-Kombination enthalten. In einer bestimmten Zusammensetzung kann die Kombination umfassen:
    • a. ein Dreifachkonjugat, umfassend ein Superantigen (Sag), eine Zielsteuerungs-Einheit (T) für die Zielzellen und einen Immunmodulator (IM) (T,IM,Sag-Konjugat);
    • b. zwei Doppelkonjugate – eines zwischen einem Zielsteuerungs-Antikörper (T) und einem Superantigen und eines zwischen einem Zielsteuerungs-Antikörper (T') und einem Immunmodulator (d.h. T,Sag-Konjugat + T',IM-Konjugat). T und T' können hinsichtlich der Epitopspezifität verschieden oder gleich sein;
    • c. ein Doppelkonjugat zwischen einem Superantigen (Sag) und einer Zielsteuerungs-Einheit (T) und einen Immunmodulator (IM) in freier Form (T,Sag-Konjugat + IM).
  • Vgl. weiter vorne im Zusammenhang der erfindungsgemäßen Konjugate. In dem Fall, dass die Zusammensetzungen zwei aktive Bestandteile enthalten (b bis c vorstehend), kann es für die Zusammensetzung möglich sein, dass die Komponenten bis zur Verabreichung getrennt gehalten werden.
  • Die Zusammensetzungen können in Form eines gefriergetrockneten partikulären Materials, einer sterilen oder keimfrei produzierten Lösung, einer Tablette, einer Ampulle usw. vorliegen. Träger, wie Wasser (vorzugsweise gepuffert auf einen physiologisch verträglichen pH-Wert, z.B. PBS) oder ein anderes inertes festes oder flüssiges Material, können vorliegen. Allgemein gesagt werden die Zusammensetzungen durch das Konjugat, möglicherweise in Kombination mit einer nicht-konjugierten aktiven Komponente, hergestellt, wobei diese mit einem oder mehreren wasserlöslichen oder wasserunlöslichen, wässrigen oder nicht-wässrigen Trägem gemischt, dann gelöst, daran gebunden oder auf andere Weise damit kombiniert werden, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusätzen und Adjuvantien. Keinesfalls dürfen die Träger und Bedingungen die Aktivität von aktiven Komponenten, wie in den vorstehenden Punkten a bis e definiert, ungünstig beeinflussen.
  • Normalerweise werden die Superantigene (SAG), die in der Erfindung verwendet werden sollen, in vorher dispergierten Dosierungen verkauft und verabreicht, wobei jede eine wirksame Menge von SAG enthält, von der aufgrund des nun dargestellten Ergebnisses angenommen wird, dass sie im Bereich von 1 pg bis 50 mg liegt. Die genaue Dosis wird von Fall zu Fall variieren, abhängig vom Gewicht und Alter des Patienten und vom vorherigen Titer von Antikörpern, die für das verwendete SAG spezifisch sind, von der Verabreichungsroute, der Art der Krankheit, der Zielsuchenden Einheit, dem Superantigen, der Bindung (-B-), dem Immunmodulator usw..
  • Ein wichtiger Faktor, der beim Bestimmen der Dosis für eine Kombination, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden soll, berücksichtigt werden muss, besteht darin, dass Superantigene und Immunmodulatoren optimale Dosisbereiche aufweisen. Eine zu niedrige Dosis wird zu keiner oder einer suboptimalen Wirkung führen, und eine zu hohe Dosis wird nicht annehmbare Nebenwirkungen, wie eine möglicherweise letale Toxizität, zur Folge haben. Somit muss betont werden, dass der vorstehend angegebene breite Bereich einen Versuch darstellt, alle für alle Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens möglichen Bereiche einzuschließen. Somit hat jede spezifische Kombination gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren einen Dosis-Unterbereich innerhalb des Bereichs von 0,1 pg bis 50 mg. Dies schließt nicht aus, dass zukünftige Entwicklungen und Ergebnisse zu Dosisniveaus außerhalb dieses Bereichs führen können.
  • Die Verabreichungsrouten sind diejenigen, die auf dem Fachgebiet üblich sind, d.h. eine das Ziel abtötende wirksame Menge oder eine therapeutisch wirksame Menge einer Superantigen-Immunmodulator-Kombination gemäß der Erfindung wird mit den Zielzellen in Kontakt gebracht. Für die vorstehend angegebenen Indikationen bedeutet dies meist eine parenterale Verabreichung, wie eine Injektion oder Infusion (subkutan, intravenös, intraarteriell, intramuskulär, intraperitoneal) an einen Säuger, wie einen Menschen. Die Konjugat-Kombination der Erfindung kann lokal oder systemisch verabreicht werden.
  • Mit dem Begriff „eine das Ziel abtötende wirksame Menge" ist gemeint, dass die Menge wirksam ist, T-Zellen so zu aktivieren und zu steuern, dass sie Zielzellen zerstören.
  • Die bevorzugten Verabreichungsrouten sind am Prioritätstag die gleichen, die für die Superantigen-Konjugate gemäß Dohlsten et al., WO 9201470 ; Abrahmsén et al., WO 9601650 ; und Antonsson et al., PCT/97/00537, angesprochen wurden. Dies bedeutet eine intravenöse Infusion von einer bis fünf Stunden (vorzugsweise vier Stunden) pro Tag, kombiniert mit einem fiebersenkenden Mittel (Paracetamol). Die Verabreichung muss an einigen Tagen, z.B. fünf bis acht Tagen, wiederholt werden, wobei das Risiko sorgfältig berücksichtigt werden muss, dass dadurch gegen das Konjugat gerichtete Antikörper geboostert werden. Optimal sind mehrere Therapiezyklen, wobei jeder Zyklus eine Behandlung an einem oder mehreren Tagen umfasst, worauf eine Ruheperiode an einem oder mehreren Tagen folgt, z.B. Zyklen mit Behandlung und Ruhe an fünf bzw. zwei Tagen.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können entweder als Haupttherapie oder in bevorzugten Fällen als Adjuvanstherapie in Verbindung mit einer Operation oder mit anderen Arzneistoffen verabreicht werden.
  • Experimenteller Teil
  • Legenden der Figuren
  • 1: FACS-Analyse von CHO-CD28-Zellen, die mit CD80-C215Fab, CD80-C215Fab-SEAm57 oder C215Fab-SEA gefärbt wurden, worauf eine Inkubation mit einem PE-markierten Anti-Maus-Kappa-Kette-mAb folgte. Die Färbung wurde bei 4°C ohne jegliche Waschgänge durchgeführt. Ordinate: mittlerer Kanal.
  • 2: FACS-Analyse von Colo205-Zellen, die mit CD80-C215Fab, CD80-C215Fab-SEAm57 oder C215Fab-SEA gefärbt wurden, worauf eine Inkubation mit einem PE-markierten Anti-Maus-Kappa-Kette-mAb folgte. Die Färbung wurde bei 4°C mit drei Waschgängen zwischen jedem Färbeschritt durchgeführt. Ordinate: mittlerer Kanal. Abszisse: Verhältnis von Effektor (E) zu Zielzelle (T).
  • 3: Proliferation. T-Zellen wurden mit Colo205-Zellen und 4 μM C242Fab-SEA und variierenden Mengen von CD80-C215Fab für vier Tage inkubiert, danach wurde das eingebaute 3H-Thymidin gezählt. Die Aktivität, die ohne jegliches CD80-C215Fab erhalten wurde, betrug 20039 cpm ± 1750.
  • 4: IL-2-Produktion. T-Zellen wurden mit Colo205-Zellen und 4 μM C242Fab-SEA und variierenden Mengen von CD80-C215Fab für vier Tage inkubiert, danach wurde der Überstand geerntet und die Menge IL-2 bestimmt. Die Menge IL-2, die ohne jegliches CD80-C215Fab erhalten wurde, betrug 2849 pg/ml.
  • 5: Proliferation. T-Zellen wurden mit Colo205-Zellen und variierenden Mengen von CD80-C215Fab-SEAm57 oder C215Fab-SEAm23 für vier Tage inkubiert, danach wurde das eingebaute 3H-Thymidin gezählt.
  • 6: IL-2-Produktion. T-Zellen wurden mit Colo205-Zellen und variierenden Mengen von CD80-C215Fab-SEAm57 oder C215Fab-SEAm23 für vier Tage inkubiert, danach wurden die Überstände geerntet und der IL-2-Gehalt bestimmt.
  • 7: Proliferative Kapazität menschlicher Blut-T-Zellen, die sieben Tage mit den angegebenen Proteinen und bestrahlten transfizierten CHO-Zellen (für die Präsentation von SEA) inkubiert wurden. Ordinate: 3H-Thymidin-Einbau (cpm).
  • 8: Die gleichzeitige Verabreichung von zielgerichtetem SEA und IL-2 führt in vivo zu einer gesteigerten T-Zell-Aktivierung. Zytotoxizität (ausgedrückt als Prozentsatz) gegen SEA-beschichtete MHC-Klasse-II+-Raji-Zellen von Splenozyten aus Mäusen, die mit einer oder drei Injektionen von C215FabSEA (FS), C215Fab-Q-hIL2 (FI), einer Kombination der beiden (FS + FI) oder C215FabSEA-Q-hIL2 (FSI) behandelt wurden. Das Effektor:Zielzelle-Verhältnis betrug 30:1, und die Zytotoxizität wurde in einem vierstündigen Standard-51Cr-Freisetzungstest gemessen.
  • 9: Therapie von Tag-5-B16-C215-Tumoren in C57BI/6-Mäusen mit drei Injektionen (Tage 5, 6 und 7 nach der Tumorinokulation) von C215FabSEA (FS), C215Fab-Q-hIL2 (FI), C215FabSEA + C215Fab-Q-hIL2 (FS + FI) oder C215Fab-Q-hIL2 (FSI). Äquimolare Mengen von FabSEA und Fab-Q-hIL2 wurden verwendet. Abszisse: Menge des injizierten Proteins. Ordinate: Tumorreduktion, ausgedrückt als Prozentsatz.
  • 10: Gesteigerte Tumorinfiltration von CD25+-T-Zellen nach einer Behandlung mit C215Fab-SEA (FS), C215Fab-Q-IL2 (FI) oder C215FabSEA-Q-IL2. CD25-positive Zellen, welche die Lunge von Mäusen, die etablierte B16-GA733-Lungentumoren aufwiesen, infiltrierten, wurden durch Immunhistochemie bestimmt. Ordinate: Prozentsatz des gefärbten Bereichs. Abszisse: 1 = PBS; 2 = erste Injektion; 3 = zweite Injektion; 4 = dritte Injektion; 5 = vierte Injektion.
  • 11: Lange aufrechterhaltenen Spiegel von Interferon-γ nach bis zu vier Injektionen, einmal täglich (37 mg/Injektion), von C215FabSEA-Q-hIL2 (FIS) (37 mg/). Blut wurde vier Stunden nach der letzten Injektion entnommen und der Interferon-γ-Gehalt (in der Ordinate) durch ELISA-Messung unter Verwendung von rekombinantem murinem Interferon-γ (Pharmingen) als Standard bestimmt. Ein ähnliches Experiment wurde mit äquimolaren Mengen (30 mg/Injektion) von C215FabSEA (FS) durchgeführt.
  • 12: Zytotoxizität (auf der Ordinate als Prozentsatz angegeben) von Splenozyten aus Mäusen, die mit PBS oder 1, 4 oder 6 Injektionen von C215FabSEAD227A-Q-hIL2 (= FSm9-IL2) behandelt wurden, gegen SEA-beschichtete MHC-Klasse-II+-Raji-Zellen. Die Zytotoxizität wurde in einem vierstündigen Standard-51Cr-Freisetzungstest gemessen. PBS wird als negative Kontrolle verwendet.
  • 13: Therapie von Tag-3-B16-C215-Tumoren in C57-BI/6-Mäusen nach einer Behandlung mit acht Injektionen von C215FabSEAD227A (= FSm9) oder C215FabSEAD227A-Q-hIL2 (= FSm9-IL2). Die Behandlung erfolgte täglich an acht aufeinander folgenden Tagen. Am Tag 21 wurden die Tiere getötet und die Lungenmetastasen gezählt. Ordinate: Tumorreduktion, ausgedrückt als Prozentsatz.
  • 14: Therapie von Tag-3-B16-C215-Tumoren in transgenen Vb3-TCR-Mäusen nach einer Behandlung mit acht Injektionen von C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A (= FSm9-IL2 (F42A)), C215FabSEAD227A-Q-hIL2 (= FSm9-IL2) oder C215FabSEAD227A (= FSm9-IL2). Die Behandlung erfolgte täglich an acht aufeinander folgenden Tagen. Am Tag 21 wurden die Tiere getötet und die Lungenmetastasen gezählt. Ordinate: Tumorreduktion, ausgedrückt als Prozentsatz.
  • 15: Therapie von Tag-3-B16-C215-Tumoren in transgenen Vb3-TCR-Mäusen nach einer Behandlung mit acht Injektionen von C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A (F42A), C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42K (F42K) oder C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A/D20S (F42A/D20S). Die Behandlung erfolgte täglich an acht aufeinander folgenden Tagen.
  • Am Tag 21 wurden die Tiere getötet und die Lungenmetastasen gezählt. Ordinate: Tumorreduktion, ausgedrückt als Prozentsatz.
  • Beispiel 1: Biologische Aktivität von CD80-C215Fab-Fusionsproteinen zur Verwendung in der Co-Stimulation für eine Tumortherapie mit Sag-zielgerichtetem Fab
  • Zusammenfassung:
  • CD80-C215Fab- und CD80-C215Fab-SEAm57-Fusionsproteine wurden so konstruiert, dass sie die extrazelluläre Domäne des menschlichen CD80 enthielten. Die Fusionsproteine wurden in Säugerzellen hergestellt und auf Bindung an CD28 unter Verwendung von CHO-Zell-Transfektanten und an C215-Antigen unter Verwendung von Colo205-Zellen getestet. Beide Fusionsproteine banden an CD28- und C215-Antigen, wobei die letztere Bindung im Vergleich zu C215Fab-SEA 100-fach reduziert war. Da CD80 an den N-terminalen Teil der L-Kette gebunden ist, ist es möglich, dass die CD80-Einheit die C215Fab-Bindung stört. Beide Fusionsproteine stimulieren zusammen („co-stimulieren") SAG-aktivierte menschliche T-Zellen, wodurch gezeigt wird, dass das lösliche CD80 seine biologische Funktion beibehält.
  • Material und Methoden
  • DNA-Rekombinationsverfahren und Enzyme:
  • Die Herstellung von Plasmid-DNA und andere Arbeitsschritte erfolgten im Wesentlichen gemäß Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989). E. coli HB101 (Boyer et al., 1969) wurde als Wirtsstamm verwendet. Restriktionsendonucleasen und das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase-1 wurden von Boehringer Mannheim oder New England Biolabs bezogen und gemäß den Empfehlungen der Lieferanten verwendet. Taq-Polymerase wurde von Perkin Elmer erhalten. cDNA wurde aus Gesamt-RNA hergestellt, wobei das GeneAmp RNA PCR Kit (Perkin-Elmer) verwendet wurde. Oligonucleotide wurden auf einem Gene Assembler (Pharmacia Biotech AB) oder einem ABI 392 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosytems) synthetisiert und durch Reverse-Phase-Chromatographie auf dem FPLC-System (Pharmacia Biotech) gereinigt. Die Sequenzierung erfolgte gemäß dem Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahren (Sanger et al., 1977) unter Verwendung eines Applied Biosystems Taq DyeDeoxy Termination Cycle Sequencing Kit, und die Produkte wurden auf einem DNA Sequencer ABI 373A (Applied Biosystems) aufgetrennt und nachgewiesen. Bakterien, die verschiedene Plasmide enthielten, wurden auf Platten selektiert, die 2 X YT und 15 g Agargrundlage pro Liter, angereichert mit 70 mg/l Kanamycin oder 100 mg/l Ampicillin, enthielten. Die flüssige Brühe bestand aus 2 X YT (pro Liter: 10 g Hefeextrakt (Difco), 16 g Trypton (Difco) und 5 g NaCl).
  • Tabelle I
    Figure 00200001
  • Plasmid-Konstruktionen
  • Die Gene, welche ein Fab-Fragment codierten, welches die variablen Domänen des murinen Antikörpers C215 enthielt, wurden wie früher beschrieben zusammengebaut (Dohlsten et al., 1994). Die Clonierung und die Mutagenese des Gens von Staphylococcus Enterotoxin A (SEA), so dass die Austausche F47A und D227A erhalten wurden, wurden schon früher beschrieben (Abrahmsén et al., 1995). Drei andere Mutationen wurden in das SEA-Gen eingeführt, wobei die Primer LAKQ88 bis 93 verwendet wurden (alle verwendeten Oligonucleotide sind in Tabelle I angegeben), wodurch die SEA-Mutante 57 erhalten wurde. LAKQ5 und LAKQ7 wurden in einer RT-PCR eingesetzt, um eine Kozak-Box stromaufwärts einzuführen und das Gen, welches ein Signalpeptid und den extrazellulären Teil des menschlichen CD80 codiert, aus Gesamt-RNA der menschlichen Milz zu clonieren. Es wurde gefunden, dass die Nucleotidsequenz der Genbank-Sequenz von CD80 entspricht (Hinterlegungsnummer M27533). Zwei Varianten des CD80-Gens wurden hergestellt, die unterschiedliche Clonierungsstellen am 3'-Ende aufwiesen: In getrennten PCRs wurden die Primer LAKQ30 und LAKQ108 eingesetzt, wodurch eine BssHII- bzw. eine MroI-Stelle erhalten wurde. Eine Genfusion, welche ein vor der Kappa-Kette durch einen Q-Linker fusioniertes CD80 codierte (Wooton et al., 1989), wurde konstruiert, indem der DNA-Linker LAKQ37/38 BssHII-Esp31 zwischen dem relevanten CD80-Gen und einer DsaI-Stelle direkt vor dem Kappa-Gen eingefügt wurde. Das Plasmid pKGE987 wurde durch Einfügen der Genfusion, welche CD80-(Q-Linker)-Kappa codierte, vor welchem das CD80-Signalpeptid steht, in einen Vektor erhalten, der zusätzlich zu einem CMV-Promotor und einem Poly-A-Schwanz noch ein Neomycin-Gen enthält, das dann für die Selektion von Transformanten verwendet werden kann. Die letzte Version des CD80-Gens wurde zum Konstruieren einer Genfusion verwendet, in welcher es vor der Fd-SEA-Mutante-57-Genfusion steht: Ein DNA-Fragment (LAKQ117/118), das einen Q-Linker codierte, wurde zwischen einer MroI-Stelle in dem CD80-Gen und einer PstI-Stelle an Codon 4 und 5 im C215-VH-Gen eingefügt. Diese Genfusion wurde in einen zweiten CMV-Promotor-Vektor eingefügt, wodurch das Plasmid pMB189 erhalten wurde, das somit das CD80-Signalpeptid und den extrazellulären Teil codierte, gefolgt von Fd- und SEA-Mutante 57, verbunden durch den aus drei Resten bestehenden Abstandhalter GGP. Im Plasmid pKGE961 wurde das Fd-Gen hinter einer Signalsequenz eingefügt (die von einem anderen murinen VH-Gen stammte). Das Plasmid pMB156 codiert die native Kappa-Kette, vor der ihr natives Signalpeptid steht, und enthält das Neomycin-Gen.
  • Herstellung
  • Embryonale Hamster-Nierenzellen 293 wurden entweder mit pKGE961 und pKGE987 oder mit pMB156 und pMB189 transfiziert, so dass Zelllinien erhalten wurden, die CD80-C215Fab bzw. CD80-C215Fab-SEAm57 produzierten. Stabile Zelllinien wur den erhalten, indem als Selektionsmedium DMEM ohne Phenolrot (Pharmacia Nr. MS 0127), angereichert mit L-Glutamin (GIBCO BRL Nr. 25030-24), 10 % Rinder-Kälberserum und Geneticin 1 mg/ml, verwendet wurde. Als das Produktionsmedium diente DMEM ohne Phenolrot, angereichert mit L-Glutamin und 0,1 % HSA (Pharmacia & Upjohn AB, Schweden). Die Fusionsproteine wurden aus den filtrierten (Sartobran 0,65 bis 0,4 μm) Kulturmedien durch Affinitätschromatographie auf Protein G Sepharose FF (Pharmacia Biotech AB) gereinigt, worauf eine Anti-CD80-Affinitäts-Reinigung (immobilisierter Anti-Mensch-CD80-Antikörper; Camfolio 1307.4) oder eine Ionenaustausch-Chromatographie auf SP Sepharose FF (Pharmacia Biotech) folgte.
  • Reagenzien:
  • RPMII 1640-Medium (Gibco, Middlesex, UK), angereichert mit 2 mM L-Glutamin (Gibco, Middlesex, UK), 0,01 M HEPES (Biological Industries, Israel), 1 mM HaHCO3 (Biochrom KG, Berlin, Deutschland), 0,1 mg/ml Gentamicinsulfat (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel), 1 mM Natriumpyruvat (JRH Biosciences Industries, USA) und 10 % hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (Gibco Middlesex, UK), wurde für alle Zellkulturen als Vollmedium verwendet.
  • Antikörper:
  • mAbs, die gegen menschliches CD57 (HNK1) und CD56 (H655) gerichtet waren, wurden aus den mAb-produzierenden Hybridomzellen erhalten (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Ein PE-markierter Anti-Maus-Kappa-Kette-mAb wurde von Becton Dickinson (San Jose, CA) bezogen.
  • Zellen:
  • K1-Zellen des Ovars des Chinesischen Hamsters (CHO) wurden mit menschlicher cDNA, welche das CD28-Gen codierte, bei Pharmacia und Upjohn, Stockholm, Schweden, transfiziert. Die Transfektanten wurden routinemäßig auf CD28-Expression analysiert und durch FACS-Sortierung auf ähnlichen Antigen-Expressionsniveaus gehalten. Die menschliche Kolonkarzinom-Zelllinie Colo205 wurde von ATCC erhalten. Alle Zelllinien waren frei von Mycoplasma.
  • T-Lymphozyten-Proliferationstest:
  • T-Zellen wurden von menschlichen mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBM) wie früher beschrieben erhalten (Lando et al., 1996), indem eine negative Selektion durch Panning mit CD57-, HLA-DR4-, CD14- und CD56-mAbs erfolgte. Alle Tests an T-Zellen wurden mit 0,1 × 106 Zellen/Vertiefung in Volumina von 200 μl unter Verwendung von Platten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden (Nunc, Roskilde, Dänemark) durchgeführt. Die DNA-Synthese wurde nach Einwirkenlassen von [3H]-Thymidin [3H]TdR (0,5 mCi/Vertiefung) auf die Kulturen wie früher beschrieben (10) untersucht.
  • Analyse durch Durchflusszytometrie:
  • Die Durchflusszytometrische Analyse und Sortierung erfolgten gemäß Standardeinstellung auf einem FACStarPlus Durchflusszytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Aufgrund der niedrigen Affinität von CD80 für CD28 wurde die Färbung von CHO-CD28-Zellen mit CD80-C215Fab- Fusionsproteinen durchgeführt, indem die Schritte zum Waschen der Zellen weggelassen wurden.
  • Zytokin-Test:
  • Die Produktion von IL-2 wurde unter Verwendung eines IL-2 ELISA Kits (huIL-2 Duoset, Genzyme) analysiert.
  • Ergebnisse
  • Beschreibung der CD80-Fab-Fusionsproteine:
  • Die Fab-Einheit weist den murinen Isotyp IgG1/k auf, wobei sie jedoch die variablen Domänen des monoclonalen IgG2A/k-Antikörpers C215 enthält (Dohlsten et al., 1995). Die Tripeptidsequenz GGP folgt auf das Cystein, das zwischen den Ketten ein Disulfid bildet, in der CH1-Domäne. In dem CD80-C215Fab-SEAm57-Dreifach-Fusionsprotein dient diese als ein Abstandhalter zwischen Fd und einer Mutante des Staphylococcus-Enterotoxin-A (SEA; Betley et al., 1988), die fünf Substitutionen aufweist. Die Austausche F47A und D227A wurden eingeführt, um die Affinität für MHC-Klasse-II zu vermindern (Abrahmsén et al., 1995), und die Austausche N102Q, N149D und T218V wurden eingeführt, um bei der Produktion in eukaryotischen Zellen eine zufällige Glykosylierung zu verhindern. Diese letzteren Austausche wurden mit Hilfe der Röntgenstruktur ausgewählt (Sundström et al., 1996). Die endgültige Pentamutante wurde als SEA-Mutante 57 bezeichnet. Beide Fusionsproteine enthalten die extrazelluläre Domäne des menschlichen CD80 (wobei das Ende mit FPDN definiert ist). Das native CD80-Signalpeptid wurde eingesetzt, und es wurde gefunden, dass das reife Protein mit VIHV beginnt, wie durch Aminosäuresequenzierung des gereinigten CD80-C215Fab bestimmt wurde. Ein Abstandhalter von 18 Aminosäuren verbindet CD80 mit der Kappa-Kette in CD80-C215Fab oder mit dem Fd-Teil des Fab-Fragments im CD80-C215Fab-SEAm57-Dreifach-Fusionsprotein. Die Abstandhalter gleichen einem Q-Linker (Wooton et al., 1996) und haben die Sequenzen SARQANELPGAPSQEERA (SEQ ID NO: 15) bzw. SARQANELPGAPSQEERP (SEQ ID NO: 16).
  • FACS-Analyse: Bindung von CD80-C215Fab-Fusionsproteinen an CD28-positive Zellen und an C215-positive Zellen
  • CD28-positive Zellen:
  • CHO-CD28-Zellen wurden mit CD80-C215Fab, CD80- C215Fab-SEAm57 oder C215Fab-SEA gefärbt, worauf eine Inkubation mit einem PE-markierten Anti-Maus-Kappa-Kette-mAb folgte. Die Färbung erfolgte bei 4°C ohne jegliche Waschgänge.
  • Sowohl das CD80-C215Fab als auch das Dreifach-Fusionsprotein banden an das auf den CHO-Zellen exprimierte CD28 in einer dosisabhängigen Art und Weise. Wie erwartet war bei dem Kontroll-Fusionsprotein C215Fab-SEA keine Färbung zu sehen.
  • C215-positive Zellen:
  • Die Bindung der Fusionsproteine an das C215-Antigen wurde an Colo205-Zellen untersucht. Colo205-Zellen wurden mit CD80-C215Fab, CD80-C215Fab-SEAm57 oder C215Fab-SEA gefärbt, worauf eine Inkubation mit einem PE-markierten Anti-Maus-Kappa-Kette-mAb folgte. Die Färbung wurde bei 4°C durchgeführt, wobei zwischen jedem Färbeschritt drei Waschgänge durchgeführt wurden.
  • Ergebnisse (1 bis 2):
  • Sowohl CD80-C215Fab als auch CD80-C215Fab-SEAm57 banden an die C215-Antigen-positiven Colo205-Zellen in einer dosisabhängigen Art und Weise. Die Bindung war 50- bis 100-fach schwächer als die von C215Fab-SEA. Dies zeigt, dass die Einführung von CD80 in den N-terminalen Teil des Fusionsproteins möglicherweise die Bindung des C215Fab-Teils an das 215-Antigen stört.
  • Doppelfusionen: Co-Stimulation von Superantigen-aktivierten T-Zellen
  • Um die biologische Aktivität der Fusionsproteine zu bestimmen, wurden sie auf eine Co-Stimulation von Superantigen-aktivierten T-Zellen getestet.
  • Proliferation:
  • T-Zellen wurden mit Colo205-Zellen und 4 μM C242Fab-SEA und variierenden Mengen von CD80-C215Fab vier Tage inkubiert, anschließend wurde die Proliferation gemessen, indem das eingebaute 3H-Thymidin gezählt wurde. Die ohne CD80-C215Fab erhaltene Aktivität betrug 20039 cpm ± 1750.
  • IL-2-Produktion:
  • T-Zellen wurden mit Colo205-Zellen und 4 μM C242Fab-SEA und variierenden Mengen von CD80-C215Fab vier Tage inkubiert, danach wurde der Überstand geerntet und die Menge IL-2 bestimmt. Die Menge von IL-2, die ohne CD80Fab-C215Fab erhalten wurde, betrug 2849 pg/ml.
  • Ergebnisse (3 bis 4):
  • CD80-C215Fab co-stimulierte die C242Fab-SEA-induzierte Aktivierung der T-Zellen in einer dosisabhängigen Art und Weise, dies zeigte sich sowohl bei der Proliferation als auch bei der IL-2-Produktion.
  • Dreifachfusionen: Co-Stimulation von Superantigen-aktivierten T-Zellen
  • Um die biologische Aktivität des Dreifach-Fusionsproteins zu testen, wurden gereinigte T-Zellen mit C215Fab-SEAm23 (wobei m23 die gleiche, die MHC-Klasse-II-Bindung beeinträchtigende SEA-Mutante ist, die in dem Dreifach-Fusionsprotein verwendet wurde, d.h. Phe47Ala/Asp227Ala) oder CD80-C215Fab-SEAm57, präsentiert auf Colo205-Zellen, inkubiert. Proliferation: Das eingebaute 3H-Thymidin wurde nach vier Tage gezählt. IL-2-Produktion: Die Überstände wurden geerntet und der IL-2-Gehalt nach vier Tagen bestimmt.
  • Ergebnisse (5 bis 6):
  • Das Dreifach-Fusionsprotein induzierte die T-Zell-Aktivierung und IL-2-Produktion, wenn es auf Colo205-Zellen präsentiert wurde. Keine solche Aktivität war mit dem C215Fab-SEAm23 zu sehen, dies zeigt, dass eine Co-Stimulation durch CD80 für die Aktivierung wichtig ist. Aufgrund der niedrigeren Bindungsaffinität des Dreifach-Fusionsproteins (50- bis 100-mal niedriger als diejenige von C215Fab-SEA, vgl. FACS-Daten) ist es wahrscheinlich, dass die tatsächliche Menge des an Zellen gebundenen C215Fab-SEAm23 wesentlich höher ist als diejenige des Dreifach-Fusionsproteins.
  • Beispiel 2: Zielgerichtetes IL-2 verstärkt und verlängert die Effekte von FabSEA auf die T-Zell-Aktivierung und in der Tumortherapie
  • Material und Methoden
  • Konstruieren von IL2-Expressionsplasmiden:
  • Die IL2-cDNA wurde durch RT-PCR unter Verwendung von mRNA cloniert, die aus menschlichen mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBM) isoliert wurden war, welche für 24 Stunden mit dem Superantigen SEA stimuliert worden waren. Die mRNA wurde aus 5 × 106 Zellen unter Verwendung eines mRNA Direct Kit von Dynal, Oslo, gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die an Oligo(dT)26-beschichtete magnetische Perlen angelagerte mRNA wurde durch Erhitzen auf 95°C eluiert. Anschließend wurde durch RT-PCR ein PCR-Produkt erhalten, wobei die RT- und DNA-Polymerase-Aktivitäten von Taq-Polymerase genutzt wurden. 1/10 der eluierten mRNA wurde mit den PCR-Primern IL2-1 und IL2-2 gemischt und sodann eine Standard-PCR-Reaktion durchgeführt (30 Runden). Das PCR-Produkt wurde einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen, die Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung des Prep-a-gene Kit (Bio-Rad) gereinigt. Nach der Spaltung mit EcoRI und BamHI wurde das Fragment in den EcoRI/BamHI-gespaltenen pBluescript KS II cloniert. Das Insert wurde sequenziert, wobei bestätigt wurde, dass es mit der früher beschriebenen IL2-cDNA (Taniguchi et al., 1983) identisch war. Jedoch war als Ergebnis der PCR-Reaktion ein DNA-Segment, welches die Sequenz Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg (SEQ ID NO: 23), „Gly-Pro-Q-Linker", codiert, an das Segment, welches das reife menschliche IL-2 codierte, 5' angefügt worden. Q-hIL2 wurde in ein Plasmid aus einer Hauskollektion (gespalten mit RsrII-XbaI) als ein RsrII-NheI-Fragment cloniert. Das resultierende Plasmid pMS306 steuert die Sekretion des C215FabSEA-Q-hIL2 ins Periplasma von E. coli. Die Linker zwischen den Einheiten wurden weiterhin wie folgt optimiert. Eine Linker-codierende Region, welche für Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO: 19) codiert (wodurch das ursprüngliche Gly-Gly-Pro ersetzt wurde), wurde zwischen den Superantigen- und Fab-Einheit-codierenden Regionen anhand von positionsgerichteter Mutagenese eingeführt. Genauso ersetzten die Linker Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg (SEQ ID NO: 20), Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg (SEQ ID NO: 21) oder Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr (SEQ ID NO: 22) den ursprünglichen Q-Linker zwischen der IL-2- und der Fab-Einheit. Für Kombinationen von Doppel-Fusionsproteinen wurden auch Konstrukte mit IL-2, fusioniert an die schwere bzw. die leichte Kette, verglichen.
  • Primer
    Figure 00260001
  • Expression der Fusionsproteine in einem Fermenter:
  • Die Fusionsproteine wurden in dem E. coli K-12 Stamm UL 635 (xyl-7, ara-14, T4R, deltaompT) unter Verwendung eines Plasmids mit einem Kanamycin-Resistenz-Gen und dem IacUV5-Promotor exprimiert. Bakterien aus einer gefrorenen Stammkultur wurden bei 25°C etwa 21 Stunden in Schüttelkolben inkubiert, die enthielten (g/l): (NH4)2SO4, 2,5; KH2PO4, 4,45; K2HPO4, 11,85; Natriumcitrat, 0,5; MgSO4·7H2O, 1; Glucose-Monohydrat, 11; 0,11 mM Kanamycin und 1 ml/l Spurenelementlösung (Forsberg et al., 1989), jedoch ohne Na2MoO4·2H2O. Die Zellen wurden bis zu einer OD600 von 1 bis 2 gezüchtet und sodann 450 ml des Kulturmedium zum Beimpfen eines Fermenters (Chemap, Schweiz) auf ein Endvolumen von 5 l verwendet. Das Fermentermedium enthielt (g/l): (NH4)2SO4, 2,5; KH2PO4, 9; K2HPO4, 6 Natriumcitrat, 0,5; Glucose-Monohydrat, 22; MgSO4·7H2O, 1; 0,11 mM Kanamycin; 1 ml Adecanol (Asahi Denka Kogyo K.K., Japan) und 1 ml/l Spurenelementlösung. Der pH-Wert wurde durch Titration mit 25 % Ammoniak bei 7,0 gehalten, die Temperatur betrug 25°C, und eine Belüftung mit atmosphärischer Luft erfolgte mit 5 l/Min.. Der Partialdruck des gelösten O2 wurde auf 30 % eingestellt, indem das Rühren während der Batch-Phase von 300 auf 1000 UpM verstärkt und wobei die Zugabe von 60 % (Gew./Vol.) Glucose während der Fed-Batch-Phase (Zulaufphase) reguliert wurde. Die Produktbildung wurde bei einer OD600 von 50 durch Zugabe von 0,1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, IPTG, induziert. Nach der Fermentation wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 8000xg, 40 Min., bei 4°C entfernt. Das geklärte Medium wurde entweder direkt analysiert und gereinigt, oder es wurde bei –20°C gelagert.
  • Reinigung von Fusionsproteinen:
  • Die in dem geklärten Medium vorliegende DNA wurde durch Fällung mit 0,19 % Polyethylenimin und 0,2 M NaCl während 30 Min. entfernt (Atkinson und Jack, 1973). Nach einer Zentrifugation wie vorstehend wurde der Überstand gewonnen und die NaCl-Konzentration auf 0,5 M eingestellt. Dieses Medium wurde auf eine Protein G Sepharose-Säule (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schwe den) aufgetragen, die mit 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4, enthaltend 0,05 % Tween 80, PEST, äquilibriert war. Danach wurde die Säule mit fünf Säulenvolumina PEST gewaschen und sodann das gebundene Protein mit 0,1 M Essigsäure, 0,02 % Tween 80, pH 3,2, eluiert. Der pH-Wert der Probe wurde unter Verwendung von 1 M Tris-HCl, pH 8,0, auf 5,0 eingestellt und diese sodann auf eine SP Sepharose HP-Säule (Pharmacia Biotech) aufgetragen, die mit 50 mM Ammoniumacetat, 0,02 % Tween 80, äquilibriert war. Danach wurde die Säule mit zwei Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Fusionsprotein unter Verwendung eines linearen Gradienten von 50 bis 500 mM Ammoniumacetat über zehn Säulenvolumina eluiert. Für die C215Fab-IL2-Fusionsproteine wurde ein pH-Wert von 6,0 verwendet, während der pH-Wert für die C215Fab-SEA-IL2-Dreifach-Fusionsproteine während der Trennung 5,7 betrug. Die Fusionsproteine wurden durch ein 0,22-μm-Filter filtriert und bei –70°C gelagert. Wenn das Eluat stärker verdünnt war, wurde es unter Verwendung von Centricon 30 (Amicon) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf eine Endkonzentration von 0,5 bis 1 mg/ml eingeengt.
  • Zytotoxizitätstests:
  • MHC-Klasse-II-abhängige und unabhängige Zytotoxizitätstests wurden wie früher beschrieben durchgeführt (Dohlsten et al., 1990). Kurz gesagt wurden für MHC-Klasse-II-abhängige Tests 51Cr-markierte Raji-Zellen (2500 Zellen pro Vertiefung in einem Endvolumen von 200 μl) mit einer SEA-abhängigen Effektor-Zelllinie gemischt, die durch Inkubation menschlicher PBM in Gegenwart niedriger Spiegel von rekombinantem hIL-2 erzeugt wurde. Das Verhältnis von Effektor-:Zielzelle betrug 30:1. Für MHC-Klasse-II-unabhängige Tests wurden 51Cr-markierte C215+-Colo205-Zellen (2500) mit SEA-abhängigen Effektorzellen bei einem E:T-Verhältnis von 45:1 inkubiert. Das in das Medium freigesetzte 51Cr wurde nach vier Stunden Inkubation durch Szintillationszählung bestimmt.
  • In vitro-Co-Stimulations-Test an gereinigten menschlichen T-Zellen:
  • Naive menschliche T-Zellen wurden im Wesentlichen wie von Lando et al., 1993, beschrieben gereinigt. Kurz gesagt wurden naive menschliche T-Zellen aus PBM aus menschlichem Blut durch Ficoll-Gradienten-Zentrifugation gereinigt, worauf eine Trennung über Gelatinesäulen und schließlich eine negative Selektion durch Panning in Petrischalen, die HNK1- und HLA-DR-mAbs enthielten, folgten. Proliferationsexperimente unter Verwendung naiver menschlicher T-Zellen wurden im Wesentlichen wie von Lando et al., 1996, beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurden naive T-Zellen (100.000 Zellen pro Vertiefung) mit bestrahlten CHO-Transfektanten (10.000 Zellen pro Vertiefung) in einem Gesamtvolumen von 200 μl RPMI-1640 mit Zusätzen (Lando et al., 1993) kombiniert. Für Experimente mit IL-2-enthaltenden Fusionsproteinen wurden die Zellen sieben Tage in Gegenwart von 1 nM der angegebenen Stoffe inkubiert. Am letzten Tag des Expe riments wurden die Zellen mit 3H-Thymidin gepulst, so dass der Einbau in DNA von sich teilenden Zellen gemessen werden konnte.
  • Therapie von B16-C215-Tumoren:
  • Die Therapie wurde im Wesentlichen wie früher beschrieben durchgeführt (Dohlsten et al., 1994; Hansson et al., 1997). Am Tag 0 erhielten C57BI/6-Mäuse i.v.-Injektionen in die Schwanzvene mit 75.000 bis 150.000 syngenen B16-F10-Melanomzellen. Diese B16-Zellen exprimierten das menschliche Antigen GA-733, das durch den mAb C215 erkannt wurde. Am Tag 1, 3 oder 5 wurde die Therapie mit den C215Fab-Proteinen begonnen. Am Tag 21 wurde das Experiment beendet, zu diesem Zeitpunkt wurden die Lungen entnommen und die disseminierten Lungentumoren gezählt.
  • Die Immunhistochemie wurde an Lungen von Tieren, die Tag-18-B16-C215-Tumoren enthielten, im Wesentlichen wie früher beschrieben (Dohlsten et al., 1995) durchgeführt. Die Proben wurden vier Stunden nach der letzten Injektion entnommen. Der gefärbte Bereich wurde manuell bestimmt.
  • Die Immunpharmakologie wurde im Wesentlichen wie beschrieben (Rosendahl et al., 1996) durchgeführt. Die Milzen aus C57-BI/6-Mäusen, die eine oder drei Injektionen, einmal täglich, erhalten hatten, wurden 48 Stunden nach der letzten Injektion entnommen und die SEA-abhängige Zytotoxizität unter Verwendung von Raji-Zellen als Ziele in einem Standard-51Cr-Freisetzungstest wie vorstehend beschrieben bestimmt. Das E:T-Verhältnis betrug 100:1.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Produktion und Reinigung von IL2-enthaltenden Fusionsproteinen:
  • Ein E. coli-Expressionsvektor wurde konstruiert, der ein C215FabSEA-Q-hIL2-Dreifach-Fusionsprotein codiert. Dieser Vektor codiert die zwei Untereinheiten des Dreifach-Fusionsproteins auf einer bi-cistronischen mRNA, die vom LacUV5-Promotor aus transkribiert wird. Vor jeder dieser zwei Untereinheiten steht ein Signalpeptid, welches das Ausschleusen in den periplasmatischen Raum von E. coli steuert. Die erste Untereinheit ist VH des C215Fab, gefolgt von einem Gly-Gly-Pro-Linker (VH-CH1-Gly-Gly-Pro-SEA). Die andere Untereinheit ist VK von C215Fab, gefolgt von CK des C242Fab, das durch einen Gly-Pro-Q-Linker an menschliches IL2 gebunden ist (Vk-Ck-Gly-Pro-Q-hIL2). Die Gly-Pro-Q-Linker-Sequenz (SEQ ID NO: 23) ist eine leicht modifizierte Version eines natürlichen Linkers, der im OmpR-E. coli-Protein gefunden wird (Wooton et al., 1989). Vollständigere Informationen finden sich in Material und Methoden. Außerdem wurde ein C215Fab-Q-hIL2-Fusionsprotein produziert. Es ist mit C215FabSEA-Q-hIL2 identisch, außer dass die Gly-Gly-Pro-SEA-Einheit des Proteins entfernt wurde. Die entsprechende DNA-Sequenz fehlt demgemäß im Expressionsvektor. Mutierte Derivate von C215FabSEA-Q-hIL2 wurden durch PCR-vermittelte positionsgerichtete Mutagenese durch Standardverfahren erzeugt, wodurch verschiedene Proteine, wie C215FabSEAD227A-Q-hIL2 und C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A, hergestellt wurden. In den späteren Varianten des Dreifach-Fusionsproteins wird die Inter-Untereinheit Cystein durch zwei Serinreste ersetzt. Diese Änderung hat keinen Einfluss auf die biologische Aktivität.
  • Plasmide, die IL2-enthaltende Proteine codieren, wurden in den E. coli-Produktionsstamm UL635 transformiert, und anschließend wurde eine Fermentation durchgeführt. Fusionsproteine wurden aus dem Kulturmedium durch Protein-G-Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Gespaltene Varianten der Fusionsproteine wurden anhand von Ionenaustausch-Chromatographie entfernt. Die erhaltenen Produkte waren zu mindestens 90 % vollständiges Fusionsprotein, dies wurde durch SDS-PAGE bestimmt (Material und Methoden). Wenn man das optimale Design des Fusionsproteins verwendet, kann man im Wachstumsmedium bis zu 130 mg/l Fusionsprotein erhalten, und typischerweise wurden aus 1 l Medium 70 mg Dreifach-Fusionsprotein erhalten.
  • Charakterisieren der Funktion von IL2-enthaltenden Fab-Fusionsproteinen:
  • Die Fähigkeit von IL2-enthaltenden Fusionsproteinen, wie C215FabSEA-Q-hIL2- und C215Fab-Q-hIL2-Fusionsproteinen, die Proliferation der IL-2-abhängigen murinen Zelllinie CTLL-2 zu induzieren, war auf molarer Basis im Wesentlichen ähnlich wie diejenige von rekombinantem menschlichem IL2 (Daten nicht dargestellt). Außerdem wurde gefunden, dass die Antigen-Bindung und SEA-Aktivität von C215FabSEA-Q-hIL2 und von C215FabSEA in verschiedenen Tests nicht zu unterscheiden waren, dies legt nahe, dass das Einführen von IL2 in das Molekül keine negativen Auswirkungen hatte. Diese Tests umfassten die Fähigkeit, in einem vierstündigen 51Cr-Freisetzungstest ein MHC-Klasse-II-unabhängiges Abtöten der menschlichen C215+-Kolonkrebs-Zellinie Colo205 durch eine SEA-reaktive T-Zell-Effektor-Zelllinie zu induzieren. Außerdem erfolgte ein MHC-Klasse-II-abhängiges Abtöten von MHC-Klasse-II+-Raji-Zellen (Ratten-Lymphomzellen) durch SEA-reaktive Effektor-T-Zellen mit ähnlicher Wirksamkeit (Daten nicht dargestellt). Ein direkterer Beweis für eine nicht beeinflusste C215-Antigen- und MHC-Klasse-II-Bindung wurde durch die FACS-Analyse erhalten. Es wurde gefunden, dass die Dosis-Abhängigkeit der C215FabSEA- und C215FabSEA-Q-hIL2-Bindung an Raji-Zellen auf molarer Basis ähnlich ist (Daten nicht dargestellt). Außerdem wurde gefunden, dass die dosisabhängige Bindung von C215FabSEA-Q-hIL2 und C215Fab-Q-hIL2 an Colo205-Zellen ähnlich wie diejenige ist, die für C215FabSEA gefunden wurde (Daten nicht dargestellt), dies zeigt, dass die Antigenbindung in den IL2-enthaltenden Fusionsproteinen nicht beeinträchtigt war.
  • IL2-abhängige Proliferation, induziert durch FabSEA:
  • Ruhende menschliche T-Zellen benötigen sowohl ein Signal 1 als auch ein Signal 2, um eine optimale T-Zell-Proliferation und Aktivierung auszulösen (Schwartz, 1990). Superantigene können Signal 1 liefern, wenn sie auf einer Zelle präsentiert werden. Man geht davon aus, dass IL-2, das den wichtigsten Stromabwarts-Effektor der B7/CD28-Signalgebung darstellt, Signal 2 ergibt.
  • Hier zeigen wir nun unter Verwendung ruhender T-Zellen, die aus menschlichem Blut gereinigt wurden, dass ein C215FabSEA-Q-hIL2-Dreifach-Fusionsprotein oder C215FabSEA in Kombination mit C215Fab-Q-hIL2 oder rekombinantem menschlichem IL-2 tatsächlich in vitro die T-Zell-Proliferation induziert (7).
  • Ruhende menschliche T-Zellen wurden mit zielgerichtetem SEA (C215FabSEA oder C215FabSEA-Q-hIL2) in Gegenwart von IL-2 (in Form von C215Fab-Q-hIL2, C215FabSEA-Q-hIL2 oder rekombinantem menschlichem IL-2) inkubiert. SEA wurde auf bestrahlten CHO-Zellen präsentiert, die transfiziert waren mit C215-Antigen (über den Fab-Teil), MHC-Klasse-II/Dr, das SEA bindet. Nicht-transfizierte CHO-Zellen dienten als Kontrolle. Nach sieben Tagen Inkubation von T-Zellen mit CHO-Transfektanten und den Substanzen von Interesse wurde die Proliferation durch den Einbau von 3H-Thymidin in die DNA gemessen.
  • C215FabSEA-Q-hIL2 induzierte die Proliferation menschlicher T-Zellen, wenn es auf CHO-Zellen präsentiert wurde, die mit dem menschlichen C215-Antigen transfiziert waren (CHO-C215), gegen welches das Fab gerichtet ist (7): Genauso wurde die Proliferation induziert, wenn das Protein auf CHO-Dr (menschliche MHC-Klasse-II) präsentiert wurde, wohingegen in Gegenwart von nicht-transfizierten CHO-Zellen (CHO) oder in Abwesenheit von CHO-Zellen (R10) keine Proliferation festgestellt wurde. C215FabSEA oder C215Fab-Q-hIL2 induzierten selbst keinerlei signifikante Proliferation, wenn sie auf CHO-Zellen präsentiert wurden, dies zeigt, dass sowohl SEA als auch IL-2 tatsächlich für die Induktion einer Proliferation erforderlich sind. Dies wurde dadurch bestätigt, dass die Kombination von C215FabSEA und C215Fab-Q-hIL2 oder C215FabSEA und rekombinantem menschlichem IL-2 eine qualitativ ähnliche Wirkung wie diejenige induzierte, die durch C215FabSEA-Q-hIL2 induziert wurde. Dies zeigt auch, dass in diesem Test IL-2 erforderlich ist, dass es jedoch, anders als SEA, nicht zellgebunden sein muss.
  • C215FabSEA-Q-hIL2 und auch die Kombination von C215FabSEA und C215Fab-Q-hIL2 verursachen eine gesteigerte und lang anhaltende T-Zell-Aktivierung und eine verbesserte Tumorinfiltration in vivo:
  • Sowohl C215Fab-Q-hIL2 + C215FabSEA als auch C215FabSEA-Q-hIL2 induzierten die T-Zell-Aktivierung viel wirksamer als C215FabSEA, wie durch die Fähigkeit, ein SEA-abhängiges Abtöten von Zielzellen zu induzieren, gemessen wurde (8). Kurz gesagt erhielten Mäuse täglich eine oder drei Injektionen der angegebenen Proteine verabreicht. Zwei Tage nach der letzten Injektion wurden die Milzen aus den behandelten Mäusen entnommen und die zytotoxische Aktivität gegen SEA-beschichtete Raji-Zellen in einem vierstündigen Standard-51Cr-Freisetzungstest bestimmt.
  • Sowohl C215FabSEA-Q-hIL2 als auch C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2 induzierten nicht nur eine verstärkte, sondern auch eine lang anhaltende T-Zell-Aktivierung. Die Spiegel von Serum-Zytokinen, wie IFNγ, die nach der vierten Injektion von C215FabSEA stark abfallen, bleiben auch nach der vierten Injektion von C215FabSEA-Q-hIL2 auf einem sehr hohen Niveau (Daten nicht dargestellt). Im Allgemeinen waren die Spiegel von IFNγ und TNFα viel höher (bis zu 10-fach) als im Fall von C215FabSEA.
  • Verbesserte Therapie von etablierten B16-C215-Tumoren mit einer C215FabSEA- und C215Fab-Q-hIL2-Kombinationsbehandlung:
  • Die Effekte einer Verstärkung der FabSag-Tumortherapie durch IL2 wurde in dem murinen B16-Melanom-Modell untersucht (9). In dem gezeigten Beispiel wurden 8 bis 12 Wochen alte weibliche C57-BI/6-Mäuse am Tag 0 mit 150.000 B16-Zellen geimpft, die mit dem menschlichen Tumorantigen GA-733 transfiziert waren, gegen das der mAb C215 gerichtet ist (im Folgenden 816-C215). Die angegebenen Stoffe wurden an den Tagen 5, 6 und 7 injiziert. Jeder Datenpunkt entspricht sieben Tieren. Am Tag 21 wurden die Tiere getötet und die Zahl der in der Lunge angesiedelten Melanin-pigmentierten B16-Tumoren gezählt. In verschiedenen Experimenten wurde gezeigt, dass die Kombination von C215FabSEA und C215Fab-Q-hIL2 im Vergleich zu einer nichtbehandelten Kontrolle eine bessere Therapie induzierte als C215FabSEA (9). In dem angegebenen Experiment ergab die C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2-Kombinationsbehandlung eine bessere therapeutische Wirkung als das C215FabSEA-Q-hIL2-Dreifach-Fusionsprotein.
  • Anschließende immunhistochemische Untersuchungen zeigten, dass C215FabSEA alleine oder in Kombination von C215FabSEA und C215Fab-Q-hIL2 eine ähnliche Anzahl von B16-C215-Tumor-infiltrierenden CD4- und CD8-T-Zellen hervorbrachte. Interessanterweise nahm jedoch die Zahl von CD25- (IL2Ra) positiven Zellen – ein guter Marker für die T-Zell-Aktivierung – zwischen der dritten und der vierten Injektion von C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2 dramatisch zu (10). Im Gegensatz dazu nahm sie jedoch im Fall von C215FabSEA ab, dies weist auf eine beginnende Anergie hin. Die Qualität von infiltrierenden T-Zellen scheint somit im Fall einer Kombinatinsbehandlung höher zu sein als beim C215FabSEA alleine, dies könnte dazu beitragen, die verbesserte therapeutische Wirkung zu erklären. Genauso nehmen Serum-Zytokine, wie Interferon-γ, die in Folge einer T-Zell-Aktivierung erzeugt werden, nach der vierten Injektion von FabSEA deutlich ab (11). Mit einem FabSEA-Q-hIL2-Dreifach-Fusionsprotein dagegen bleiben die Interferonspiegel auch nach der vierten Injektion noch auf einem hohen Niveau. Diese Beobachtung bietet einen weiteren Beweis, dass der Einbau von IL-2 in das Konstrukt einer Fab-SEA-induzierten T-Zell-Anergie entgegenwirken kann.
  • Verbesserte Therapie von B16-C215-Tumoren mit C215FabSEAD227A-Q-hIL2:
  • Superantigene sind in Menschen viel toxischer als in Mäusen, z.T. da die Affinität für MHC-Klasse-II in Menschen deutlich höher ist (Hansson et al., 1997). Man kann deshalb erwarten, dass die systemische Toxizität von FabSEA-Proteinen die wichtigste Einschränkung für eine Therapie bei Menschen darstellt. Eine Möglichkeit, die lokale Aktivierung in dem Tumor (Fab-abhängig) gegenüber einer systemischen Immunaktivierung (SEA-MHC-Klasse-II-abhängig) zu steigern, bestünde darin, die Affinität von SEA für MHC-Klasse-II zu verringern. Aufgrund der Kristallstruktur von SEA stellten wir eine Mutante von C215FabSEA, C215FabSEAD227A, mit einer 100-fach reduzierten Affinität für MHC-Klasse-II her. Sie besitzt, anders als WT-C215FabSEA, nicht die Fähigkeit zum Vernetzen von MHC-Klasse-II-Molekülen, die als ein Hauptgrund für die SEA-vermittelte systemische Toxizität angesehen wird (Hansson et al., 1997).
  • Das Fenster zwischen effizienter Therapie und Toxizität war in der Behandlung von Tag-1-B16-C215-Tumoren in Vb3-TCR-transgenen Mäusen für die C215FabSEAD227A-Mutante im Vergleich zu C215FabSEA mindestens 50-mal breiter (Hansson et al., 1997). In Übereinstimmung mit dieser Feststellung zeigte die Immunhistochemie, dass bei Dosen der zwei Proteine, die eine ähnliche Therapie zur Folge hatten, eine vergleichbare Immunaktivierung im Tumor festgestellt wurde, wohingegen mit C215FabSEAD227A in der Milz eine viel niedrigere systemische Immunaktivierung festgestellt wurde (Hansson et al., 1997). Außerdem zeigten pharmakokinetische Studien in Kaninchen im Vergleich zu C215FabSEA eine dramatische Reduktion im zielgerichteten Hinsteuern von C215FabSEAD227A zur Milz und anderen lymphatischen Organen, wo die meisten der MHC-Klasse-II+-Zellen liegen (Daten nicht dargestellt).
  • Man kann davon ausgehen, dass ein Fab-SEA-IL2-Dreifach-Fusionsprotein für die klinische Verwendung ein mutiertes Superantigen enthält. Deshalb stellten wir ein C215FabSEAD227A-Q-hIL2-Dreifach-Fusionsprotein her. Das hergestellte Protein war in der Lage, die Proliferation von ruhenden menschlichen T-Zellen zu induzieren (Daten nicht gezeigt), und es induzierte während bis zu sechs Injektionen eine lang anhaltende SEA-abhängige CTL-Aktivität in Mäusen (12). Im Gegensatz dazu wurde eine Hintergrund-CTL-Aktivität mit C215FabSEAD227A (< 10 %, Daten nicht dargestellt) und mit C215FabSEA-Q-hIL2 (< 15 %, Daten nicht dargestellt) gezeigt. Die Therapie von etablierten (Tag 3) B16-GA733-Tumoren in normalen C57-BI/6-Mäusen mit acht Injektionen dieses Proteins, täglich verabreicht, ergab eine genauso gute Therapie wie eine optimale Dosis von C215FabSEA (13). In diesem System hat C215FabSEAD227A, das für eine optimale Aktivität in Menschen, nicht in Mäusen, entworfen wurde, nur sehr geringe Effekte (13). Bei der höchsten Dosis von C215FabSEAD227A-Q-hIL2 wurde jedoch eine gewisse Toxizität festgestellt. Im Gegensatz dazu zeigen mehrere Therapieexperimente, dass die Kombination von C215FabSEAD227A und C215Fab-Q-hIL2 (acht Injektionen) auch im Vergleich zu C215FabSEAD227A alleine zu einer wesentlich verbesserten Therapie von Tag-3-B16-GA733-Tumoren in Vb3-TCR-transgenen Mäusen führt (Daten nicht gezeigt). In Vb3-TCR-transgenen Mäusen reagieren mehr als 90 % der T-Zellen mit SEA, im Gegensatz zu 10 bis 20 % in normalen Mäusen. Interessanterweise scheinen bei Kaninchen wiederholte Injektionen (bis zu acht) von C215FabSEAD227A-Q-hIL2 (0/4 Kaninchen verendete nach wiederholten Injektionen bei 20 μg/kg) nicht toxischer zu sein als C215FabSEAD227A ohne IL-2 (0/4 Kaninchen verendete nach wiederholten Injektionen bei 20 μg/kg; 4/4 verendeten bei 20 μg/kg) und viel weniger toxisch als C215FabSEA (1/4 Kaninchen verendete nach wiederholten Injektionen bei 1 μg/kg). Gleichzeitig wird eine lang anhaltende Immunaktivierung (Lymphozyten-Rebound-Effekt) nur nach einer Behandlung mit C215FabSEAD227A-Q-hIL2, nicht jedoch mit C215FabSEAD227A oder C215FabSEA, festgestellt, dies zeigt, dass der Einbau von IL-2 tatsächlich dazu beiträgt, einer FabSEA-induzierten T-Zell-Anergie entgegenzuwirken (Daten nicht dargestellt).
  • Therapie von B16-C215-Tumoren mit IL-2-mutierten C215FabSEAD227A-Q-hIL2-Proteinen:
  • Die höhere Toxizität und, im Fall von C215FabSEA-Q-hIL2 die niedrigere therapeutische Wirksamkeit, von IL2-enthaltenden Dreifach-Fusionsproteinen können zum Teil auf einer neuen Zielsteuerung („Retargeting") der SEA-Aktivität zu lymphatischen Geweben beruhen. Diese „Retargeting"-Wirkung ist auf die hohe Affinität von IL2 (Kd = 10 pM) für seinen Rezeptor zurückzuführen, der hauptsächlich auf T-Zellen in der Milz und anderen lymphatischen Geweben zu finden ist. Um diese Frage zu klären, haben wir Derivate von C215FabSEAD227A-Q-hIL2 hergestellt, in denen die IL-2-Einheit mutiert ist, um die Affinität für IL2R+-Zellen und somit die systemische Aktivierung zu reduzieren. Im Prinzip ist das die gleiche Vorgehensweise, die eingesetzt wurde, um das therapeutische Fenster für das C215FabSEAD227A-Protein zu verbreitern.
  • Die Wechselwirkung zwischen IL-2 und seinem Hochaffinitäts-Rezeptor ist bereits gut aufgeklärt. Der Rezeptor besteht aus den drei Untereinheiten a, b und g. Die Vernetzung von b und g ist für die biologische Aktivität erforderlich, während die Untereinheit a für eine optimal Bindung nötig ist. Unsere Strategie besteht darin, die Affinität von IL-2 für seinen Hochaffinitäts-Rezeptor (abg) zu reduzieren, indem man die a-Untereinheit-Bindung ausschaltet, und indem man anschließend die b- und g-Untereinheit-Bindung wie erforderlich reduziert, nicht jedoch ausschaltet.
  • Drei solche Mutanten von C215FabSEAD227A-Q-hIL2 wurden entworfen, um die IL2Ra-Bindung auszuschalten (F42A, F42K) und außerdem die IL2Rb-Bindung zu beeinträchtigen (F42A/D20S). Diese Proteine haben eine 100- (F42A), 1000- (F42K) bzw. 3000-fach (F42A/D20S) reduzierte Aktivität, die Proliferation der IL-2-abhängigen murinen Zelllinie CTLL-2 zu induzieren. Zurzeit werden Experimente durchgeführt, um die Eigenschaften dieser Proteine insbesondere hinsichtlich einer Affinität und „Ein-Raten" („on-rates") für eine Bindung an aktivierte menschliche T-Zellen und den IL2-Rezeptor genauer zu bestimmen. Anfängliche Therapieexperimente zeigen, dass eine solche Strategie vielversprechend ist (14, 15). In den gezeigten Beispielen wurden acht Injektionen an Vb3-TCR-transgene Mäuse (in denen mehr als 90 % der T-Zellen durch SEA aktiviert werden), die Tag-3-B16-GA733-Tumoren enthielten, verabreicht. Obwohl bei der höchsten Dosis noch eine gewisse Toxizität festgestellt wurde, trat diese später auf, wenn C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A oder C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42K verwendet wurde (8. Injektion), als wenn C215FabSEAD227A-Q-hIL2 eingesetzt wurde (6. Injektion), wobei eine Behandlung mit der höchsten Dosis im Vergleich zu einer PBS-behandelten Kontrolle durchgehend zu einer Tumorreduktion von mehr als 90 % führte (14). Zurzeit untersuchen wir diesen sehr erfolgversprechenden Ansatz, indem wir weitere Mutationen in die SEA- und IL2-Teile einführen, um auf diese Weise das Therapie-zu-Toxizitäts-Fenster noch weiter zu verbessern.
  • Außerdem werden Arbeiten durchgeführt, um C215FabSEA-Q-hIL2-Dreifach-Fusionsproteine herzustellen, die eine Thr51Pro-Mutation im IL-2-Teil umfassen (Chang et al., 1996). Diese Mutation kann dazu dienen, die IL2R-vermittelte Internalisierung des Fusionsproteins zu blockieren, ohne die biologische Aktivität von IL-2 zu reduzieren. Dies ist wahrscheinlich wichtig, da dadurch die Entfernung des Fusionsproteins durch diesen Stoffwechselweg reduziert wird und somit die lokale Konzentration und Wirksamkeit des Arzneistoffs gesteigert wird. Thr51Pro-mutierte Proteine können weitere Mutationen in den SEA- und IL-2-Teilen enthalten, um die Affinität für MHC-Klasse-II bzw. den IL2-Rezeptor zu reduzieren.
  • Beispiel 3: Experimente zum Verifizieren von Effekten von (Sag,IM)-Koniugaten.
  • IM-Rezeptor-positive Zielzellen oder MHC-Klasse-II-positive Zellen
  • Ein Sag-IM-Molekül kann an Zellen binden, die MHC-Klasse-II exprimieren, wodurch die SDCC erleichtert wird. Alternativ können Zellen, die den Rezeptor für IM exprimieren, zielgerichtet angesteuert werden. Deshalb ist es möglich, dass ein Sag-IM-Molekül dafür geeignet sein könnte, das Abtöten unerwünschter Zellen, die den Rezeptor für IM exprimieren, zu induzieren.
  • Ein C215FabSEA-hIL2-Dreifach-Fusionsprotein kann in dem Fall als ein Sag-IM-Molekül angesehen werden, dass weder Effektor- noch Zielzelle das durch das C215Fab erkannte Antigen exprimieren. Effektorzellen würden T-Zellen des richtigen Vβ-Subtyps sein. Zielzellen könnten z.B. abnorme hämopoetische Zellen sein, die den IL2-Rezeptor exprimieren, wie diejenigen, die bei bestimmten Leukämien oder Lymphomen vorliegen.
  • Experiment A:
  • In vitro-Machbarkeitsbeweis („Proof-of-concept"): Effektor-T-Zellen (menschliche T-Zellen, die wiederholt mit SEA stimuliert wurden) und Zielzellen (z.B. menschliche „Raji"-B-Zell-Lymphomzellen) werden mit dem C215FabSEA-IL2- Dreifach-Fusionsprotein inkubiert, das so mutiert wurde, dass die Bindung an MHC-Klasse-I reduziert ist. Dies ist der Standardansatz für SDCC-Tests (Effektor-T-Zellen, Raji-Zellen, Testsubstanz). Wir haben tatsächlich gefunden, dass ein C215FabSEAD227A-hIL2-Protein mit stark reduzierter Affinität für MHC-Klasse-II eine etwa 10-fach höhere Wirksamkeit als C215FabSEAD227A besitzt, Raji-Zellen abzutöten. Eine offensichtliche Erklärung für die gesteigerte Wirksamkeit besteht darin, dass das Dreifach-Fusionsprotein den auf Raji-Zellen exprimierten IL2-Rezeptoren präsentiert wird.
  • Experiment B:
  • In vivo-Machbarkeitsbeweis („Proof-of-concept"): Murine Lymphom-Modelle (wie das Lymphom RBL-5 in C57-BI/6-Mäusen) sind bereits eingeführt (Hoglund et al., J. Exp. Med. 168: 1469–1474). Ein zielgerichtetes Ansteuern des IL-2-Rezeptors oder eines anderen IM-R durch ein Sag-IM-Protein könnte in solchen Modellen einen Machbarkeitsbeweis für das zielgerichtete Ansteuern von IM-Rezeptorpositiven Zellen in vivo bereitstellen.
  • Die Sag-IM-Zielsteuerung von IM-R-positiven Zellen wird durch die Tatsache kompliziert, dass sowohl Effektor- als auch Zielzellen häufig den Rezeptor für IM exprimieren. Trotzdem kann diese Therapieart unter bestimmten Umständen wirksam sein. Wahrscheinlich spielen hierbei Faktoren, wie Dichte von IM-R-Expression auf Zielzellen, Zahl und Lage von Zielzellen usw., eine Rolle. Außerdem sollte nachdrücklich betont werden, dass z.B. der IL2R-alpha nur bei der T-Zell-Aktivierung hochreguliert wird, somit könnte es ein vorübergehendes Fenster geben, während dessen der IM-R auf Zielzellen in großer Menge exprimiert wird, nicht jedoch auf den Effektorzellen.
  • Genauso können Sag-IM-Fusionsproteine verwendet werden, in denen Sag für ein Wildtyp-Superantigen steht, das so mutiert ist, das eine reduzierte Affinität für MHC-Klasse-II erreicht wird.
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Claims (26)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Kombination eines Superantigens (Sag), einer Zielsteuerungs-Einheit („targeting moiety") (T) und eines Immunmodulators (IM), der kein Superantigen ist, wobei die Kombination ausgewählt ist aus a) einem Dreifachkonjugat (T)(Sag)(IM); b) einer Kombination eines Doppelkonjugats (T) (Sag) und eines Doppelkonjugats (T')(IM), wobei T und T' verschieden oder gleich sind; oder c) einer Kombination eines Doppelkonjugats (T) (Sag) und eines freien IM.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zielsteuerungs-Einheit (T und T') aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Antikörper, einem antigenbindenden Fragment eines Antikörpers, einem Fab-Fragment eines Antikörpers, einem Fab2-Fragment eines Antikörpers oder einem Einzelketten-Antikörper besteht.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das Superantigen (Sag) so modifiziert ist, dass es im Vergleich zu dem entsprechenden Wildtyp-Superantigen eine verminderte Fähigkeit zum Binden an MHC-Klasse-II-Antigen aufweist.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das Superantigen (Sag) so modifiziert ist, dass es im Vergleich zu dem entsprechenden Wildtyp-Superantigen eine verminderte Seroreaktivität und/oder Immunogenität in menschlichen Seren aufweist.
  5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Superantigen chimär ist und Regionen umfasst, die von zwei oder mehreren freien Superantigenen stammen.
  6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Immunmodulator (IM) aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Zytokinen, Chemokinen und extrazellulären Teilen von Lymphozytenoberflächegebundenen Rezeptoren und Liganden besteht.
  7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Immunmodulator (IM) natives oder mutiertes IL-2 ist.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Immunmodulator (IM) ein Teil des 67-Moleküls ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus CD80 und CD86 besteht.
  9. Superantigenkonjugat der Formel: a) eines Dreifachkonjugats (T) (Sag) (IM); b) eines Doppelkonjugats (T) (Sag) in Kombination mit einem Doppelkonjugat (T') (IM), wobei T und T' verschieden oder gleich sind; oder c) eines Doppelkonjugats (T) (Sag) in Kombination mit (IM), wobei T eine Zielsteuerungs-Einheit darstellt, Sag ein Superantigen ist, IM einen Immunmodulator darstellt, der kein Superantigen ist.
  10. Superantigenkonjugat nach Anspruch 9, wobei T mindestens eine Zielsteuerungs-Einheit T' und eine Zielsteuerungs-Einheit T'' umfasst, das Superantigen Sag C-terminal an T' fusioniert ist und der Immunmodulator IM C-terminal an T'' fusioniert ist.
  11. Superantigenkonjugat nach einem der Ansprüche 9 bis 10, wobei die Zielsteuerungs-Einheit aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Antikörper, einem antigenbindenden Fragment eines Antikörpers, einem Fab-Fragment eines Antikörpers, einem Fab2-Fragment eines Antikörpers oder einem Einzelketten-Antikörper besteht.
  12. Superantigenkonjugat nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Superantigen so modifiziert ist, dass es im Vergleich zu dem entsprechenden Wildtyp-Superantigen eine verminderte Fähigkeit zum Binden an MHC-Klasse-II-Antigen aufweist.
  13. Superantigenkonjugat nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Superantigen so modifiziert ist, dass es im Vergleich zu dem entsprechenden Wildtyp-Superantigen eine verminderte Seroreaktivität und/oder Immunogenität in menschlichen Seren aufweist.
  14. Superantigenkonjugat nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei das Superantigen chimär ist und Regionen umfasst, die von zwei oder mehreren freien Superantigenen stammen.
  15. Superantigenkonjugat nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei der Immunmodulator aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Zytokinen, Chemokinen und extrazellulären Teilen von Lymphozytenoberfläche-gebundenen Rezeptoren und Liganden besteht.
  16. Superantigenkonjugat nach einem der Ansprüche 9 bis 15, wobei der Immunmodulator natives oder mutiertes IL-2 ist.
  17. Superantigenkonjugat nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei der Immunmodulator ein extrazellulärer Teil eines B7-Moleküls ist.
  18. Superantigenkonjugat nach Anspruch 17, wobei der Teil des B7-Moleküls aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus CD80 und CD86 besteht.
  19. Superantigenkonjugat nach einem der Ansprüche 9 bis 18, wobei der Immunmodulator so modifiziert wurde, dass er eine verminderte Affinität für einen Lymphozyten-Rezeptor im Vergleich zur Affinität der entsprechenden nativen Form aufweist.
  20. Superantigenkonjugat nach Anspruch 10, wobei das Superantigen Staphylococcus-Enterotoxin-A ist, T die CH1-Domäne von C215-Fab ist, T'' die leichte Kette des C215-Antikörpers ist und der Immunmodulator natives oder mutiertes IL-2 ist.
  21. Superantigenkonjugat nach Anspruch 10, wobei das Superantigen über einen flexiblen hydrophilen Aminosäure-Linker B' von drei bis elf Aminosäureresten an T' fusioniert ist und wobei der Immunmodulator über einen hydrophilen und neutralen oder positiv geladenen Aminosäure-Linker Q von zehn bis 20 Aminosäureresten an T'' fusioniert ist.
  22. Superantigenkonjugat nach Anspruch 21, wobei B' aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Gly-Gly-Pro und Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO: 19) besteht, und wobei Q aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg (SEQ ID NO: 23), Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg (SEQ ID NO: 20); Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg (SEQ ID NO: 21) und Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr (SEQ ID NO: 22) besteht.
  23. Superantigenkonjugat nach einem der Ansprüche 9 bis 22 zur Verwendung als Medikament.
  24. Verwendung eines Superantigenkonjugats nach einem der Ansprüche 9 bis 22 zum Herstellen eines Medikaments zum Behandeln von Krebserkrankungen, Autoimmunkrankheiten, Befall durch Parasiten, Virusinfektionen oder bakteriellen Infektionen.
  25. Verwendung nach Anspruch 24 zum Behandeln von Melanomen, Karzinomen, hämatopoetischen Neoplasien oder Fibrosarkomen.
  26. Verwendung nach Anspruch 25 zum Behandeln von malignen oder benignen Tumoren, Arzneimittel-mehrfachresistenten Krebserkrankungen, metastatischen Krebserkrankungen oder verschiedenen Formen von chemisch oder viral induzierten Krebserkrankungen.
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