CN105980401A - 编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸分子的组合物、制备方法、生产和治疗性用途，所述低密度脂蛋白受体包含至少一个突变(例如，LDLR信号增强性突变)。

Description

编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年9月18日提交的名为“编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸”的美国临时专利申请号62/052,139、2014年3月14日提交的名为“编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸”的美国临时专利申请号61/952,906、2013年10月3日提交的名为“编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸”的美国临时专利申请号61/886,137和2013年11月13日提交的名为“编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸”的美国临时专利申请号61/903,485的优先权，所述每份文献的内容通过引用方式完整并入本文。
序列表的引用
本申请随电子格式的序列表一起提交。该序列表作为2014年10月3日创建、大小2,607,599比特、名为M070PCT.txt的文件提供。电子格式的序列表中的信息通过引用的方式完整并入本文。
技术领域
本发明涉及用于设计，制备、制造和/或配制多核苷酸的组合物、方法、过程、试剂盒和装置，所述多核苷酸编码低密度脂蛋白受体，所述低密度脂蛋白受体包含至少一个突变，例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变。
背景技术
高胆固醇是心脏病发作和卒中的众多风险因素之一。尽管饮食不良和缺少锻炼是高胆固醇的常见原因，但是遗传改变，如由LDLR缺乏引起的家族性高胆固醇血症(FH)，可能是高胆固醇的原因。目前市场上有众多降胆固醇药物，但是它们并非没有风险或在某些情况或其他药物情况下并非没有禁忌。这类药物包括他汀类、贝特类、烟酸、胆汁酸螯合剂(树脂)、植物甾醇或阻止脂肪吸收、减少胆固醇吸收或靶向胆固醇运输途径中诸基因的其他化合物。
基于核酸的降胆固醇药物包括，例如靶向ApoB-100的反义寡核苷酸抑制剂，米泊美生(mipomersen)，其在2013年1月获批用于治疗纯合家族性高胆固醇血症(FH)。在2012年12月，FDA还批准洛美他派用于同一病症。
更麻烦之处是与靶向胆固醇的药物相关的肝相关问题，尤其血清氨基转移酶升高和肝脂肪蓄积(或肝脂肪变性)。例如，因为围绕泊美生的潜在明显安全顾虑，该药物将附带关于肝毒性以及需要处方者和药房证明的加框警告，以及该药物应当随每张新处方恰当使用的文件记录。尽管米泊美生总体上有效降低LDL胆固醇(临床试验中超过半数的患者具有超过20％的LDL水平下降并且在纯合FH试验中，它降低LDL24.7％)，但是一般FH患者具有400-1000mg/dL之间的平均LDL。因此，降低作用在这些患者中可能不充分。此外，这些试验并不大到足以有把握评估心血管结果，尽管心血管益处当然是该药物的最终预期作用。另外，在III期试验的米泊美生组中出现心脏病患的严重不良事件。
本发明通过提供编码目的多肽的多核苷酸解决了LDLR降解问题，所述目的多肽包含至少一个突变，例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变。本发明通过提供具有避免本领域一个或多个问题的结构特征和/或化学特征的基于核酸的化合物或多核苷酸(编码性和非编码性及其组合)，解决了这种需求，所述特征例如可用于优化基于核酸的治疗药，同时保留结构和功能完整性，克服表达阈值，改善表达速率、半寿期和/或蛋白质浓度，优化蛋白质定位，并且避免有害生物反应如免疫反应和/或降解途径。可以使用本发明减少或消除这些屏障。
发明概述
本文中描述了用于设计，制备、制造和/或配制多核苷酸的组合物、方法、过程、试剂盒和装置，所述多核苷酸编码低密度脂蛋白受体(LDLR)，所述低密度脂蛋白受体包含至少一个突变，例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变。在一个非限制性实施方案中，这类多核苷酸采取修饰的mRNA分子的形式或作为修饰的mRNA分子发挥作用，所述修饰的mRNA分子编码一种或多种肽或目的多肽。在一个实施方案中，这类多核苷酸是基本上非编码的。
本文中提供编码LDLR的多核苷酸。在一个方面，多核苷酸包含至少一个在本文公开的化学修饰的核苷，如天然存在和非天然存在的核苷。
在一个实施方案中，本文中提供用于表达LDLR的多核苷酸，例如，IVT多核苷酸，所述多核苷酸包含连接的核苷的第一区域、相对于第一区域位于5’的第一侧翼区和相对于第一区域位于3’的第二侧翼区。第一区域可以编码目的多肽，编码LDLR，如，但不限于SEQ IDNO:37-55。连接的核苷的第一区域可以至少包含核酸序列的开放阅读框，如，但不限于，SEQID NO:56-718。
在一个实施方案中，本文中提供用于表达LDLR的多核苷酸，例如，IVT多核苷酸，所述多核苷酸包含连接的核苷的第一区域、相对于第一区域位于5’的第一侧翼区和相对于第一区域位于3’的第二侧翼区。第一区域可以编码目的多肽，编码LDLR，如，但不限于SEQ IDNO:37-55。连接的核苷的第一区域可以至少包含核酸序列的开放阅读框，如，但不限于，SEQID NO:56-718。
在一个实施方案中，多核苷酸例，如本文所述的IVT多核苷酸，可以编码目的多肽，所述目的多肽包含至少两个突变，例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变。突变可以位于胞内结构域、EGF-A结构域上或位于胞内结构域和EGF-A结构域两者上。作为一个非限制性例子，目的多肽包含在胞内结构域上的两个突变，如K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，目的多肽包含在胞内结构域上的三个突变，如K816R、K830R和C839A。
在另一个实施方案中，多核苷酸例，如本文所述的IVT多核苷酸，可以编码目的多肽，所述目的多肽包含在EGF-A结构域上的一个突变，例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变，和在胞内结构域上的至少两个突变。在EGF-A结构域上的突变可以是，但不限于，N316A和L339D，并且在胞内结构域上的突变可以是，但不限于K816R、K830R和C839A。作为一个非限制性例子，目的多肽可以包含在EGF-A结构域上的突变N316A和在胞内结构域上的突变K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，目的多肽可以包含在EGF-A结构域上的突变N316A和在胞内结构域上的突变K816R、K830R和C839A。作为一个非限制性例子，目的多肽可以包含在EGF-A结构域上的突变L339D和在胞内结构域上的突变K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，目的多肽可以包含在EGF-A结构域上的突变L339D和在胞内结构域上的突变K816R、K830R和C839A。
在一个实施方案中，第一侧翼区可以包含连接的核苷的序列，所述序列具有5’非翻译区(UTR)的特性，如，但不限于，编码SEQ ID NO:37-55、SEQ ID NO:3-19和其功能性变体中任一者的任意核酸的天然5′UTR。在一个方面，第一侧翼区可以是结构化UTR。第一侧翼区还可以包含至少一个5′末端帽，如，但不限于帽0(Cap0)、帽1(Cap1)、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2′氟-鸟苷、7-去氮杂-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、帽2(Cap2)和帽4(Cap4)。
在一个实施方案中，第二侧翼区可以包含连接的核苷的序列，所述序列具有3’非翻译区(UTR)的特性，如，但不限于，编码SEQ ID NO:37-55、SEQ ID NO:20-36和其功能性变体中任一者的任意核酸的天然3′UTR。第二侧翼区还可以包含连接的核苷的3’加尾序列，如，但不限于，至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾、聚A-G四重体和茎环序列。
在一个实施方案中，多核苷酸，例如IVT多核苷酸，可以包含至少一个化学修饰的核苷，如，但不限于，表5中列出的修饰，如但不限于，尿苷修饰、胞苷修饰、鸟苷修饰、腺苷修饰和/或胸苷修饰。在另一个实施方案中，多核苷酸，例如IVT多核苷酸，包含两个化学修饰的核苷。两个化学修饰的核苷可以是表5中列出的修饰，如但不限于，尿苷修饰、胞苷修饰、鸟苷修饰、腺苷修饰和/或胸苷修饰。在又一个实施方案中，多核苷酸，例如IVT多核苷酸，可以包含三个化学修饰的核苷。
本发明的多核苷酸，例如，IVT多核苷酸，可以是纯化的。
在一个实施方案中，本文中提供多核苷酸，例如，编码LDLR的嵌合多核苷酸，其中所述多核苷酸，例如，嵌合多核苷酸，具有包含式I的序列，
5’[An]x-L1-[Bo]y-L2-[Cp]z-L3 3’
I
其中：
每个A和B独立地包含连接的核苷的区域；
C是连接的核苷的任选区域；
区域A、B或C至少之一被位置修饰；
n、o和p独立地是15-1000之间的整数；
x和y独立地是1-20；
z是0-5；
L1和L2独立地是任选的接头部分，所述接头部分基于核酸或基于非核酸；并且
L3是任选的缀合物或任选的接头部分，所述接头部分基于核酸或基于非核酸。
在一个实施方案中，位置A、B或C被位置修饰并且位置修饰的区域包含一个或多个相同核苷类型即腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷或尿苷的至少两个化学修饰的核苷，并且其中相同类型核苷的至少两个化学修饰是不同的化学修饰。在一个方面，相同的核苷酸类型可以是表5中描述的尿苷修饰、腺苷修饰、胸苷修饰、胞苷修饰或鸟苷修饰的任一修饰，如相同核苷类型的两个、三个或四个或更多个修饰。作为一个非限制性例子，相同的核苷类型的两个选自尿苷和胞苷。作为另一个非限制性例子，化学修饰可以是全部天然存在的或全部非天然存在的。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸，例如，嵌合多核苷酸，可以编码包含至少两个突变的目的多肽。突变可以位于胞内结构域、EGF-A结构域上或位于胞内结构域和EGF-A结构域两者上。作为一个非限制性例子，目的多肽包含在胞内结构域上的两个突变如K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，目的多肽包含在胞内结构域上的三个突变如K816R、K830R和C839A。
在另一个实施方案中，本文所述的多核苷酸，例如，嵌合多核苷酸，可以编码目的多肽，所述目的多肽包含在EGF-A结构域上的一个突变和在胞内结构域上的至少两个突变。在EGF-A结构域上的突变可以是，但不限于，N316A和L339D，并且在胞内结构域上的突变可以是，但不限于K816R、K830R和C839A。作为一个非限制性例子，目的多肽可以包含在EGF-A结构域上的突变N316A和在胞内结构域上的突变K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，目的多肽可以包含在EGF-A结构域上的突变N316A和在胞内结构域上的突变K816R、K830R和C839A。作为一个非限制性例子，目的多肽可以包含在EGF-A结构域上的突变L339D和在胞内结构域上的突变K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，目的多肽可以包含在EGF-A结构域上的突变L339D和在胞内结构域上的突变K816R、K830R和C839A。
在一个实施方案中，至少一个连接的核苷的区域A可以包含连接的核苷的序列，如，但不限于，编码SEQ ID NO:37-55、SEQ ID NO:3-19和其功能性变体中任一者的任意核酸的天然5′UTR。
在另一个实施方案中，至少一个连接的核苷的区域A是帽区域。帽区域还可以包含至少一个帽，如，但不限于帽0、帽1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2′氟-鸟苷、7-去氮杂-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、帽2和帽4。
在一个实施方案中，至少一个连接的核苷的区域C可以包含连接的核苷的序列，如，但不限于，编码SEQ ID NO:37-55、SEQ ID NO:20-36和其功能性变体中任一者的任意核酸的天然3′UTR。
在一个实施方案中，至少一个连接的核苷的区域C是聚腺苷酸尾区域。
在一个实施方案中，至少一个连接的核苷的区域B至少包含核酸序列的开放阅读框，如，但不限于，SEQ ID NO:56-718。
在一个实施方案中，嵌合多核苷酸跨两个区域编码。
在一个实施方案中，嵌合多核苷酸的B区或C区被位置修饰并且多肽完全在A区内部编码。
在另一个实施方案中，A区或C区被位置修饰并且多肽完全在B区内部编码。
在一个实施方案中，A区、B区或C区至少之一可以经密码子优化在人细胞中表达。
在另一个实施方案中，密码子优化区域的总G:C含量可以不大于密码子优化前的G:C含量。
本文所述的嵌合多核苷酸也可以是环形的。
本文中提供包含至少一种编码LDLR的多核苷酸和至少一种可药用赋形剂的组合物。可药用赋形剂可以是，但不限于溶剂、水溶剂、非水溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、混悬助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、脂质、类脂质脂质体、脂质纳米粒子、核-壳纳米粒子、聚合物、脂质-核酸复合物(lipoplex)、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶及其混合物。作为一个非限制性例子，可药用赋形剂是脂质并且脂质可以选自DLin-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、reLNP、PLGA、PEG、PEG-DMA和聚乙二醇化脂质及其混合物。
在下文描述中叙述了本发明的多种实施方案的详细内容。本发明的其他特征、目的和优点将从本描述及附图并且从权利要求书中显而易见。
附图简述
前述目的和其他目的、特征和优点将从以下对如附图中所示的本发明具体实施方案的描述显而易见，其中相同参考字符在不同视图间始终指相同的部分。附图不必然地符合比例，反而重点在于说明本发明各种实施方案的原理。
图1是在2013年3月9日提交的共有待决美国专利申请13/791,922中教授的IVT多核苷酸构建体的示意图，所述文献的内容通过引用的方式并入本文。
图2是IVT多核苷酸构建体的示意图。
图3是本发明的一系列嵌合多核苷酸的示意图。
图4是一系列嵌合多核苷酸的示意图，所述示意图说明多种样式的位置修饰并且显示与mRNA多核苷酸的那些区域类似的区域。
图5是一系列嵌合多核苷酸的示意图，所述示意图说明基于式I的多种样式的位置修饰。
图6是一系列嵌合多核苷酸的示意图，所述示意图说明基于式I的多种样式的位置修饰并进一步说明封闭或结构化的3’末端。
图7是本发明的环状多核苷酸构建体的示意图。
图8是本发明的环状多核苷酸构建体的示意图。
图9是包含至少一个间隔区的本发明环状多核苷酸构建体的示意图。
图10是包含至少一个传感器区的本发明环状多核苷酸构建体的示意图。
图11是包含至少一个传感器区和一个间隔区的本发明环状多核苷酸构建体的示意图。
图12是本发明的非编码环状多核苷酸构建体的示意图。
图13是本发明的非编码环状多核苷酸构建体的示意图。
图14是来自Watson等人(Nature Reviews Drug Discovery 7,84-99(2008年1月))的显示LDLR结构的简图。
图15是来自Daniels等人(Int J Biol Sci 2009；5(5):474-488)的显示LDLR功能的简图。
图16是HEK293细胞的流式细胞术图，所述HEK293细胞用编码LDLR(野生型LDLR或具有各种增强LDLR细胞表面表达的突变的LDLR)的本发明各种多核苷酸转染。
图17是HEK293细胞的流式细胞术图，所述HEK293细胞用编码LDLR(野生型LDLR或具有各种增强LDLR细胞表面表达的突变的LDLR)的本发明各种多核苷酸伴以或不伴以PCSK9转染。
图18A-18B是细胞的流式细胞术图，所述细胞用编码LDLR的本发明各种多核苷酸(例如编码具有各种增强LDLR细胞表面表达的突变的修饰的mRNA)转染。图18A显示BODIPY-LDL与LDLR mRNA转染细胞的结合作用的等值线图。图18B显示BODIPY-LDL的最大半数细胞结合作用。
图19A-19G显示用LDLR mRNA转染后对半寿期的影响。图19A显示野生型LDLRmRNA。图19B显示编码具有4个突变(N316A、E317A、D331A和Y336A)的LDLR的LDLR mRNA。图19C显示编码具有1个突变Y336A的LDLR的LDLR mRNA。图19D显示编码具有1个突变E317A的LDLR的LDLR mRNA。图19E显示编码具有1个突变N316A的LDLR的LDLR mRNA。图19F显示编码具有1个突变L339D的LDLR的LDLR mRNA。图19G显示编码具有1个突变D331E的LDLR的LDLRmRNA。
图20显示当PCSK的量变动时对细胞表面LDLR表达的影响。
图21显示LDLR表达的凝胶图谱。
发明详述
在治疗药、诊断学、试剂领域并且对于生物测定法而言有重大意义的是能够设计、合成并输送核酸(例如，核糖核酸(RNA))至细胞内部，无论体外、体内、原位或离体递送，从而实现有益于细胞、组织或器官并最终有益于生物的生理结果。一个有益结果是引起该核酸的胞内翻译和产生至少一种编码的肽或目的多肽。以类似方式，非编码性RNA已经变成多个研究的焦点；并且单独和连同编码性多核苷酸一起使用非编码性多核苷酸可能在治疗情境下提供有益结果。
本文中描述了用于设计、制备、制造和/或配制多核苷酸、尤其IVT多核苷酸、嵌合多核苷酸和/或环状多核苷酸的组合物(包括药物组合物)和方法。
还提供用于选择、设计和/或利用本文所述的多核苷酸的系统、方法、装置和试剂盒。
根据本发明，优选地以如此方式修饰这些多核苷酸，从而避免领域中其他分子的缺陷。
先前已经探索在人类疾病、抗体、病毒、兽医应用领域和多种体内环境下使用多核苷酸如编码多肽的修饰的多核苷酸(即，修饰的mRNA)，并且这些研究公开在例如以下表中列出的那些：美国临时专利申请号61/618,862、61/681,645、61/737,130、61/618,866、61/681,647、61/737,134、61/618,868、61/681,648、61/737,135、61/618,873、61/681,650、61/737,147、61/618,878、61/681,654、61/737,152、61/618,885、61/681,658、61/737,155、61/618,896、61/668,157、61/681,661、61/737,160、61/618,911、61/681,667、61/737,168、61/618,922、61/681,675、61/737,174、61/618,935、61/681,687、61/737,184、61/618,945、61/681,696、61/737,191、61/618,953、61/681,704、61/737,203的表6；美国临时专利申请号61/681,720、61/737,213、61/681,742的表6和表7；国际公开号WO2013151666、WO2013151668、WO2013151663、WO2013151669、WO2013151670、WO2013151664、WO2013151665、WO2013151736的表6；国际公开号WO2013151672的表6和表7；国际公开号WO2013151671的表6、表178和表179；美国临时专利申请号61/618,870的表6、表28和表29；美国临时专利申请号61/681,649的表6、表56和表57；美国临时专利申请号61/737,139的表6、表186和表187；国际公开号WO2013151667的表6、表185和表186中公开；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。前述任一者可以作为IVT多核苷酸、嵌合多核苷酸或环状多核苷酸合成并且这类实施方案包含在本发明中。
因此本文中提供多核苷酸，所述多核苷酸已经设计成改善本领域一个或多个问题，如组织中的稳定性和/或清除率、受体摄取和/或动力学、细胞接近性、参与翻译机器、mRNA半寿期、翻译效率、免疫逃避、蛋白质产生能力、分泌效率(当适用时)、循环可及性、蛋白质半寿期和/或细胞状态调节作用、功能和/或活性。
在一个方面，本发明提供了编码LDLR的多核苷酸。在示例性实施方案中，本发明的多核苷酸编码包含至少一个突变的LDLR。在示例性实施方案中，本发明的多核苷酸编码包含至少一个增强LDLR细胞表面表达的突变(例如，增加LDLR在细胞表面的停留时间的上或LDLR在细胞表面的水平增加)的LDLR。如技术人员会所理解，调节细胞表面受体，例如，调节细胞表面受体的活性和/或表达以实现所需生物学结果或治疗性结果可相当具有挑战性。特别地，调节(例如，增加)细胞表面复杂受体的表达可能困难，特别地当尝试在体内这么做时。本发明特征在于使用多核苷酸，例如，修饰的mRNA，特别适用于体内递送。本发明的修饰的mRNA设计成例如促进生物活性LDLR在多种生物环境和/或治疗性环境下增强的表达。
I.本发明的组合物
多核苷酸
本发明提供了核酸分子，尤其提供在一些实施方案中编码一种或多种目的肽或目的多肽的多核苷酸。按其最广意义，术语“核酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。这些聚合物经常称作多核苷酸。
本发明的示例性核酸或多核苷酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2′-氨基官能化的2′-氨基-LNA和具有2′-氨基官能化的2′-氨基-α-LNA))、亚乙基核酸(ENA)、环己烯基核酸(CeNA)或其杂交分子或组合。
在一个实施方案中，仅使用体外转录(IVT)酶促合成方法产生的本发明多核苷酸称作“IVT多核苷酸”。产生IVT多核苷酸的方法是本领域已知的并且在美国临时专利申请号61/618,862、No 61/681,645、61/737,130、61/618,866、61/681,647、61/737,134、61/618,868、61/681,648、61/737,135、61/618,873、61/681,650、61/737,147、61/618,878、61/681,654、61/737,152、61/618,885、61/681,658、61/737,155、61/618,896、61/668,157、61/681,661、61/737,160、61/618,911、61/681,667、61/737,168、61/618,922、61/681,675、61/737,174、61/618,935、61/681,687、61/737,184、61/618,945、61/681,696、61/737,191、61/618,953、61/681,704、61/737,203、61/618,870、61/681,649和61/737,139；和国际公开号WO2013151666、WO2013151667、WO2013151668、WO2013151663、WO2013151669、WO2013151670、WO2013151664、WO2013151665、WO2013151671、WO2013151672和WO2013151736中描述；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，具有在大小和/或化学修饰样式、化学修饰位置、化学修饰百分数或化学修饰群体和前述组合方面不同的部分或区域的本发明多核苷酸称作“嵌合多核苷酸”。本发明的“嵌合体”是具有两个或更多个不一致或或不均一(杂合)部分或区域的实体。如本文所用，多核苷酸的“部分”或“区域”定义为多核苷酸的小于多核苷酸整个长度的任何部分。
在又一个实施方案中，呈环状的本发明多核苷酸称作“环状多核苷酸”或“circP”。如本文所用，“环状多核苷酸”或“circP”意指基本上像RNA那样发挥作用并且具有RNA特性的单链环状多核苷酸。术语“环状”还意在涵盖circP的任何二级或三级构型。
在一些实施方案中，多核苷酸包含约30个至约100,000个(例如，30至50个、30至100个、30至250个、30至500个、30至1,000个、30至1,500个、30至3,000个、30至5,000个、30至7,000个、30至10,000个、30至25,000个、30至50,000个、30至70,000个、100至250个、100至500个、100至1,000个、100至1,500个、100至3,000个、100至5,000个、100至7,000个、100至10,000个、100至25,000个、100至50,000个、100至70,000个、100至100,000个、500至1,000个、500至1,500个、500至2,000个、500至3,000个、500至5,000个、500至7,000个、500至10,000个、500至25,000个、500至50,000个、500至70,000个、500至100,000个、1,000至1,500个、1,000至2,000个、1,000至3,000个、1,000至5,000个、1,000至7,000个、1,000至10,000个、1,000至25,000个、1,000至50,000个、1,000至70,000个、1,000至100,000个、1,500至3,000个、1,500至5,000个、1,500至7,000个、1,500至10,000个、1,500至25,000个、1,500至50,000个、1,500至70,000个、1,500至100,000个、2,000至3,000个、2,000至5,000个、2,000至7,000个、2,000至10,000个、2,000至25,000个、2,000至50,000个、2,000至70,000个和2,000至100,000个)核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以编码至少一种目的肽或目的多肽。目的肽或目的多肽可以是低密度脂蛋白受体(LDLR)、其变体或突变体。
在示例性实施方案中，本发明的多核苷酸编码LDLR蛋白，如野生型LDLR或野生型蛋白的变体。在示例性实施方案中，本发明的多核苷酸编码变异LDLR蛋白，即，因一个或多个氨基酸差异，插入或缺失与野生型LDLR不同的LDLR。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白可以包含多态性，例如，天然存在的多态性。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白包含突变，例如，天然存在的突变或非天然存在的突变或这二者。
在示例性实施方案中，本发明的多核苷酸包含至少一个突变，所述突变改变LDLR蛋白或LDLR蛋白的生物学特性。在示例性实施方案中，本发明的多核苷酸包含至少一个突变，所述突变改变LDLR的表达、尤其细胞表面表达。这类突变在本文中称作“增强细胞表面表达的”突变。示例性“增强细胞表面表达的突变”改变，例如，抑制或减少，LDLR降解，因此导致增加LDLR或LDLR蛋白的表达增加，例如，其细胞表面表达，或LDLR在细胞表面的水平增加。在示例性实施方案中，增强细胞表面表达的突变出现在与LDLR降解相关的LDLR结构域中。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以编码在EGF-A结构域中包含突变的LDLR蛋白。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以编码LDLR蛋白的变体，其中LDLR蛋白包含在IDOL相互作用结构域中的突变。IDOL(LDLR的诱导性降解蛋白)是已知在激活肝X受体后被诱导并且随后与LDLR内部介导受体泛素化和降解的胞质结构域(IDOL相互作用结构域)相互作用的E3泛素连接酶。作为一个非限制性例子，改变IDOL相互作用结构域(例如，通过在其中引入突变)导致抑制IDOL介导的LDLR降解并且造成LDLR蛋白表达的增加。作为又一个非限制性例子，改变IDOL相互作用结构域(例如，通过在其中引入突变)导致DOL介导的LDLR降解并且促进低密度脂蛋白(LDL)摄取。
在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以编码LDLR蛋白，其中LDLR蛋白包含改变，例如在PCSK9相互作用结构域中的突变。PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9)是与LDLR的表皮生长因子样重复A(EGF-A)结构域(PCSK9相互作用结构域)结合，诱导LDLR降解的蛋白酶K。作为一个非限制性例子，改变PCSK9相互作用结构域(例如，通过在其中引入突变)导致PCSK9介导的LDLR降解受到抑制，造成LDLR蛋白表达的增加。作为又一个非限制性例子，改变PCSK9相互作用结构域(例如，通过在其中引入突变)导致抑制PCSK9介导的LDLR降解并且促进低密度脂蛋白(LDL)摄取。
在又一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以编码LDLR蛋白，其中LDLR蛋白包含对IDOL相互作用结构域和PCSK9相互作用结构域的改变。作为一个非限制性例子，PCSK9相互作用结构域和IDOL相互作用结构域的改变，例如，突变，导致LDLR蛋白表达增加。作为又一个非限制性例子，PCSK9相互作用结构域和IDOL相互作用结构域的改变，例如，突变，促进低密度脂蛋白(LDL)摄取。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以编码长839个氨基酸的LDLR蛋白或其变体。在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以编码长860个氨基酸的LDLR蛋白或其变体。
在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以包含至少一个非编码的核酸序列。
在一个实施方案中，编码至少一种目的肽、目的多肽的本发明多核苷酸的区域的长度大于约30个核苷酸长度(例如，至少或大于约35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或至多并包含100,000个核苷酸)。如本文所用，这种区域可以称作“编码区”或“编码……的区域”。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸是信使RNA(mRNA)或作为信使RNA发挥作用。如本文所用，术语“信使RNA”(mRNA)指编码至少一种目的肽或目的多肽并且能够在体外、体内、原位或离体翻译以产生所编码目的肽或目的多肽的任何多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以是结构上修饰的或化学修饰的。如本文所用，“结构性”修饰是这样一种情况，其中在多核苷酸中插入、缺失、重复、倒转或随机分配两个或更多个连接的核苷，并且对核苷酸本身无明显化学修饰。因为化学键将必然地破裂并重新形成以实现结构性修饰，所以结构性修饰本质是化学的并且因此是化学修饰。然而，结构性修饰将产生不同的核苷酸序列。例如，可以将多核苷酸“ATCG”化学修饰成“AT-5meC-G”。相同的多核苷酸可以在结构上从“ATCG”修饰成“ATCCCG”。这里，已经插入二核苷酸“CC”，导致对多核苷酸的结构性修饰。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸，如IVT多核苷酸或环状多核苷酸，可以具有全部的或任何相同核苷类型的均匀化学修饰或通过单纯下行(mere downward)滴定全部或任何同一核苷类型中的相同起始修饰所产生的修饰群体，或具有计量百分数的全部或任何同一核苷类型的化学修饰，但伴以随机掺入，如其中全部尿苷由尿苷类似物(例如，假尿苷)替代。在另一个实施方案中，多核苷酸可以遍及整个多核苷酸具有两个、三个或四个相同核苷类型的均匀化学修饰(如全部尿苷和全部胞嘧啶等均以相同方式修饰)。
当本发明的多核苷酸经化学修饰和/或结构修饰时，该多核苷酸可以称作“修饰的多核苷酸(经修饰的多核苷酸或修饰多核苷酸)”。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以包括编码自我切割肽的序列。自我切割肽可以是，但不限于，2A肽。作为一个非限制性例子，2A肽可以具有蛋白质序列：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:1)、其片段或变体。在一个实施方案中，2A肽在最后的甘氨酸和最后的脯氨酸之间切割。作为另一个非限制性例子，本发明的多核苷酸可以包括编码2A肽的多核苷酸序列，所述2A肽具有蛋白质序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ IDNO:1)、其片段或变体。
这样一个编码2A肽的多核苷酸序列是GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT(SEQ ID NO:2)。2A肽的多核苷酸序列可以是通过本文所述和/或本领域已知的方法修饰或经密码子优化。
在一个实施方案中，这个序列可以用来分隔两个或更多个目的多肽的编码区。作为一个非限制性例子，编码2A肽的序列可以在第一编码区A和第二编码区B之间(A-2Apep-B)。2A肽的存在将导致一个长的蛋白质裂解成蛋白质A、蛋白质B和2A肽。蛋白裂解A和蛋白质B可以是相同或不同的目的肽或目的多肽。在另一个实施方案中，2A肽可以用于本发明的多核苷酸中以产生2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种蛋白质。
IVT多核苷酸构造
传统上，mRNA分子的基本组分至少包含编码区、5′UTR、3′UTR、5′帽和聚腺苷酸尾。本发明的IVT多核苷酸可以作为mRNA发挥作用，但是与野生型mRNA区分在于其功能性和/或结构性设计特征，其中所述特征起到克服使用基于核酸的治疗药时多肽有效产生中的现有问题。
图1显示本发明IVT多核苷酸的初级构建体100。如本文所用，“初级构建体”指本发明的多核苷酸，其编码一种或多种目的多肽并且保留足够结构性特征和/或化学特征以允许其中所编码的目的多肽翻译。
根据图1，IVT多核苷酸的初级构建体100这里含有连接的核苷酸的第一区域102，其旁侧分布有第一侧翼区104和第二侧翼区106。第一侧翼区104可以包括连接的核苷的序列，所述序列作为5’非翻译区(UTR)发挥作用，如编码多肽的天然5’UTR的任何核酸的5’UTR或非天然5’UTR(如，但不限于，异源5’UTR或合成性5’UTR)。目的多肽可以在其5'末端处包含一个或多个由信号序列区域103编码的信号序列。侧翼区104可以包含一个连接的核苷酸的区域，所述区域包含一个或多个完整或不完整的5′UTR序列。侧翼区104还可以包含5′末端帽108。第二侧翼区106可以包含一个连接的核苷酸的区域，所述区域包含一个或多个完整或不完整的3′UTR，所述3′UTR可以编码多肽的天然3’UTR或非天然3’UTR如，但不限于，异源3’UTR或合成性3’UTR。侧翼区106还可以包含3’加尾序列110。所述3’加尾序列可以是，但不限于，聚腺苷酸尾、聚A-G四重体和/或茎环序列。
桥接第一区域102的5'末端和第一侧翼区104的是第一可操作区域105。传统上，这个可操作区域包含起始密码子。这个可操作区域可以可选地包含任何翻译起始序列或信号，包括起始密码子。
桥接第一区域102的5'末端和第一侧翼区104的是第一可操作区域105。传统上，这个可操作区域包含起始密码子。这个可操作区域可以可选地包含任何翻译起始序列或信号，包括起始密码子。
桥接第一区域102的3'末端和第二侧翼区106的是第二可操作区域107。传统上，这个可操作区域包含终止密码子。这个可操作区域可以可选地包含任何翻译起始序列或信号，包括终止密码子。也可以在IVT多核苷酸中使用多个系列终止密码子。在一个实施方案中，本发明的操作区域可以包含两个终止密码子。第一终止密码子可以是“TGA”或“UGA”，第二终止密码子可以选自“TAA”、“TGA”、“TAG”、“UAA”、“UGA”或“UAG”。
图2显示本发明的代表性IVT多核苷酸初级构建体130。多核苷酸初级构建体指这样的多核苷酸转录物，其编码一种或多种目的多肽并且保留足够结构性特征和/或化学特征以允许其中所编码的目的多肽翻译。目的多肽的非限制性例子包括低密度脂蛋白受体(LDLR)及其变体(例如，包含至少一个突变(如增强LDLR细胞表面的突变)的LDLR蛋白)(本文中的表3、10和11)并且编码目的多肽的多核苷酸在本文表3中及在美国临时专利申请号61/618,862、61/681,645、61/737,130、61/618,866、61/681,647、61/737,134、61/618,868、61/681,648、61/737,135、61/618,873、61/681,650、61/737,147、61/618,878、61/681,654、61/737,152、61/618,885、61/681,658、61/737,155、61/618,896、61/668,157、61/681,661、61/737,160、61/618,911、61/681,667、61/737,168、61/618,922、61/681,675、61/737,174、61/618,935、61/681,687、61/737,184、61/618,945、61/681,696、61/737,191、61/618,953、61/681,704、61/737,203的表6；美国临时专利申请号61/681,720、61/737,213、61/681,742的表6和表7；国际公开号WO2013151666、WO2013151668、WO2013151663、WO2013151669、WO2013151670、WO2013151664、WO2013151665、WO2013151736的表6；国际公开号WO2013151672的表6和表7；国际公开号WO2013151671的表6、表178和表179；美国临时专利申请号61/618,870的表6、表28和表29；美国临时专利申请号61/681,649的表6、表56和表57；美国临时专利申请号61/737,139的表6、表186和表187；国际公开号WO2013151667的表6、表185和表186中描述，所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。野生型人低密度脂蛋白受体(LDLR)的示例性参考氨基酸序列和核酸序列分别在>gi|4504975|ref|NP_000518.1|低密度脂蛋白受体同工型1前体[智人(Homo sapiens)](SEQ ID NO:744)和>gi|307775410|ref|NM_000527.4|智人低密度脂蛋白受体(LDLR)，转录物变体1，mRNA(SEQID NO:745)中描述。野生型小鼠低密度脂蛋白受体(LDLR)的示例性参考氨基酸序列和核酸序列分别在>gi|113195700|ref|NP_034830.2|低密度脂蛋白受体同工型1前体[小家鼠(Mus musculus)](SEQ ID NO:746)和>gi|358030302|ref|NM_010700.3|小家鼠低密度脂蛋白受体(Ldlr)，转录物变体1，mRNA(SEQ ID NO:747)中描述。登录号存在于国家生物技术信息中心(NCBI)网址处。
回到图2，IVT多核苷酸初级构建体130这里含有连接的核苷酸的第一区域132，其旁侧分布有第一侧翼区134和第二侧翼区136。如本文所用，“第一区域”可以称作“编码区”或“编码……的区域”或简单称作“第一区域”。该第一区域可以包括，但不限于，编码的目的多肽。在一个方面，第一区域132可以包括，但不限于，编码至少一种目的多肽的开放阅读框。该开放阅读框可以完全或部分地经密码子优化。侧翼区134可以包含连接的核苷酸的区域，所述区域包含一个或多个完整或不完整的5′UTR序列，所述5′UTR序列可以完全经密码子优化或部分地经密码子优化。侧翼区134可以包括至少一个核酸序列，包括但不限于miR序列、TERZAKTM序列和翻译控制序列。侧翼区134还可以包含5′末端帽138。5′末端帽区138可以包括天然存在的帽、合成帽或优化帽。优化帽的非限制性例子包括由Rhoads在美国专利号US7074596和国际专利公开号WO2008157668、WO2009149253和WO2013103659中教导的帽。第二侧翼区106可以包含连接的核苷酸的区域，所述区域包含一个或多个完整或不完整的3′UTR。第二侧翼区136可以完全经密码子优化或部分地经密码子优化。侧翼区134可以包括至少一个核酸序列，包括但不限于miR序列和翻译控制序列。在第二侧翼区136后，多核苷酸初级构建体可以包含3’加尾序列140。3’加尾序列140可以包括合成性加尾区142和/或链终止性核苷144。合成性加尾区的非限制性例子包括聚腺苷酸序列、聚胞苷酸序列、聚A-G四重体。链终止性核苷的非限制性例子包括2’-O甲基、F和锁核酸(LNA)。
桥接第一区域132的5'末端和第一侧翼区134的是第一可操作区域144。传统上，这个可操作区域包含起始密码子。这个可操作区域可以可选地包含任何翻译起始序列或信号，包括起始密码子。
桥接第一区域132的3'末端和第二侧翼区136是第二可操作区域146。传统上，这个可操作区域包含终止密码子。这个可操作区域可以可选地包含任何翻译起始序列或信号，包括终止密码子。根据本发明，也可以使用多个系列终止密码子。
本发明IVT多核苷酸的初级构建体的第一区域的最短长度可以是足以编码二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽或十肽的核酸序列的长度。在另一个实施方案中，该长度可以足以编码2-30个氨基酸例如5-30、10-30、2-25、5-25、10-25或10-20个氨基酸的肽。该长度可以足以编码至少11、12、13、14、15、17、20、25或30个氨基酸的肽，或不超过40个氨基酸，例如不超过35、30、25、20、17、15、14、13、12、11或10个氨基酸的肽。多核苷酸序列可以编码的二肽的例子包括但不限于肌肽和鹅肌肽(anserine)。
编码本发明目的多肽的IVT多核苷酸的初级构建体的第一区域的长度是大于约30个核苷酸长度(例如，至少或大于约35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、and 3,000、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或至多并包括100,000个核苷酸)。
在一些实施方案中，IVT多核苷酸包含约30至约100,000个(例如，30至50个、30至100个、30至250个、30至500个、30至1,000个、30至1,500个、30至3,000个、30至5,000个、30至7,000个、30至10,000个、30至25,000个、30至50,000个、30至70,000个、100至250个、100至500个、100至1,000个、100至1,500个、100至3,000个、100至5,000个、100至7,000个、100至10,000个、100至25,000个、100至50,000个、100至70,000个、100至100,000个、500至1,000个、500至1,500个、500至2,000个、500至3,000个、500至5,000个、500至7,000个、500至10,000个、500至25,000个、500至50,000个、500至70,000个、500至100,000个、1,000至1,500个、1,000至2,000个、1,000至3,000个、1,000至5,000个、1,000至7,000个、1,000至10,000个、1,000至25,000个、1,000至50,000个、1,000至70,000个、1,000至100,000个、1,500至3,000个、1,500至5,000个、1,500至7,000个、1,500至10,000个、1,500至25,000个、1,500至50,000个、1,500至70,000个、1,500至100,000个、2,000至3,000个、2,000至5,000个、2,000至7,000个、2,000至10,000个、2,000至25,000个、2,000至50,000个、2,000至70,000个、2,000至100,000个和4,500至5,500个)核苷酸。
根据本发明，IVT多核苷酸的第一和第二侧翼区可以独立地具有15-1,000个核苷酸长度(例如，大于30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500个核苷酸或至少30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500个核苷酸长度)。
根据本发明，IVT多核苷酸的加尾序列可以从不存在至具有500个核苷酸长度(例如，至少60、70、80、90、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸)。在加尾区是聚腺苷酸尾情况下，该长度可以按聚腺苷酸结合蛋白结合作用的单位确定或作为聚腺苷酸结合蛋白结合作用的函数确定。在这个实施方案中，聚腺苷酸尾长到足以结合聚腺苷酸结合蛋白的至少4单体。聚腺苷酸结合蛋白单体与大约38个核苷酸的核苷酸段结合。因而，已经观察到约80个核苷酸和160个核苷酸的聚腺苷酸尾是有功能的。
根据本发明，IVT多核苷酸的加帽区可以包含单个帽或一系列形成帽的核苷酸。在这个实施方案中，加帽区可以是1至10个核苷酸长度，例如2-9、3-8、4-7、1-5、5-10或至少2个核苷酸长度、或10个核苷酸长度或更小核苷酸长度。在一些实施方案中，帽不存在。
根据本发明，IVT多核苷酸的第一和第二可操作区域可以是3至40个核苷酸长度，例如，5-30、10-20、15或至少4个核苷酸长度，或30个核苷酸长度或更小核苷酸长度并且除起始和/或终止密码子之外，还可以包含一个或多个信号和/或限制性序列。
在一个实施方案中，本发明的IVT多核苷酸可以是结构上修饰的或化学修饰的。当本发明的IVT多核苷酸经化学修饰和/或结构修饰时，该多核苷酸可以称作“修饰的IVT多核苷酸”。
在一个实施方案中，如果本发明的IVT多核苷酸经化学修饰，则它们可以具有全部或任何同一核苷类型的均匀化学修饰或通过单纯下行(mere downward)滴定全部或任何同一核苷类型中的相同起始修饰所产生的修饰群体，或计量百分数的全部或任何同一核苷类型的化学修饰，但伴以随机掺入，如其中全部尿苷由尿苷类似物(例如，假尿苷)替代。在另一个实施方案中，IVT多核苷酸可以遍及整个多核苷酸具有两个、三个或四个同一核苷类型的均匀化学修饰(如全部尿苷和全部胞嘧啶等均以相同方式修饰)。
在一个实施方案中，本发明的IVT多核苷酸可以包括编码本文所述的自我切割肽(如但不限于2A肽)的序列。IVT多核苷酸中2A肽的多核苷酸序列可以通过本文所述和/或本领域已知的方法修饰或经密码子优化。
在一个实施方案中，这个序列可以用来分隔IVT多核苷酸中两个或更多个目的多肽的编码区。
在一个实施方案中，本发明的IVT多核苷酸可以是结构上修饰的和/或化学修饰的。当化学修饰和/或结构上修饰时，IVT多核苷酸可以称作“修饰的IVT多核苷酸”。
在一个实施方案中，IVT多核苷酸可以编码至少一种目的肽或目的多肽。在另一个实施方案中，IVT多核苷酸可以编码两种或更多种目的肽或目的多肽。目的肽或目的多肽的非限制性例子包括抗体重链和轻链、酶和其底物、标记物和其结合分子、第二信使和其酶或多聚体蛋白或复合物的组分。
IVT多核苷酸(如，但不限于，初级构建体)、包含IVT多核苷酸的制剂和组合物以及产生、使用和施用IVT多核苷酸的方法在待决美国临时专利申请号61/618,862、61/681,645、61/737,130、61/618,866、61/681,647、61/737,134、61/618,868、61/681,648、61/737,135、61/618,873、61/681,650、61/737,147、61/618,878、61/681,654、61/737,152、61/618,885、61/681,658、61/737,155、61/618,896、61/668,157、61/681,661、61/737,160、61/618,911、61/681,667、61/737,168、61/618,922、61/681,675、61/737,174、61/618,935、61/681,687、61/737,184、61/618,945、61/681,696、61/737,191、61/618,953、61/681,704、61/737,203、61/618,870、61/681,649和61/737,139；国际公开号WO2013151666、WO2013151667、WO2013151668、WO2013151663、WO2013151669、WO2013151670、WO2013151664、WO2013151665、WO2013151671、WO2013151672和WO2013151736中描述；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，IVT多核苷酸编码LDLR蛋白，如但不限于，包含至少一个突变的LDLR蛋白序列，所述突变是例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变。
嵌合多核苷酸构造
本发明的嵌合多核苷酸或RNA构建体维持与IVT多核苷酸相似的模块化构造，但是嵌合多核苷酸包含赋予多核苷酸有用特性的一个或多个结构修饰和/或化学修饰或改变。因而，作为本发明的修饰mRNA分子的嵌合多核苷酸称作“嵌合的修饰mRNA”或“嵌合mRNA”。
嵌合多核苷酸具有在大小和/或化学修饰样式、化学修饰位置、化学修饰百分数或化学修饰群体和前述组合方面不同的部分或区域。
其中嵌合多核苷酸作为mRNA发挥作用并且编码目的多肽的部分或区(区域)的例子包括但不限于，非翻译区(UTR，如5’UTR或3’UTR)、编码区、帽区、聚腺苷酸尾区、起始区、终止区、信号序列区及其组合。图3显示可以作为mRNA使用的本发明嵌合多核苷酸的某些实施方案。图4显示一系列嵌合多核苷酸的示意图，所述示意图确定多种样式的位置修饰并且显示与mRNA多核苷酸的那些区域类似的区域。在其他区域之中或在其他区域之间的区域或部分也可以设计成具有亚区域。图中显示这些亚区域。
在一些实施方案中，本发明的嵌合多核苷酸具有包含式I的结构。
5’[An]x-L1-[Bo]y-L2-[Cp]z-L3 3’
式I
其中：
每个A和B独立地包含连接的核苷的区域；
C是连接的核苷的任选区域；
A区、B区或C区至少之一按位置修饰，其中所述位置修饰的区域包含一个或多个同一核苷类型即腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷或尿苷的至少两个化学修饰的核苷，并且其中同一类型核苷的至少两个化学修饰是不同的化学修饰；
n、o和p独立地是15-1000之间的整数；
x和y独立地是1-20；
z是0-5；
L1和L2独立地是任选的接头部分，所述接头部分基于核酸或基于非核酸；并且
L3是任选的缀合物(conjugate)或任选的接头部分，所述接头部分基于核酸或基于非核酸。
在一些实施方案中，式I的嵌合多核苷酸编码一种或多种目的肽或目的多肽。这类编码的分子可以跨两个或更多个区域编码。
在一个实施方案中，至少一个连接的核苷的区域A可以包含连接的核苷的序列，所述序列可以作为5’非翻译区(UTR)发挥作用。连接的核苷的序列可以是天然的或合成的5’UTR。作为一个非限制性例子，嵌合多核苷酸可以编码目的多肽并且连接的核苷的序列A可以编码由嵌合多核苷酸编码的多肽的天然5’UTR，或连接的核苷的序列可以是非异源5’UTR如，但不限于合成的UTR。
在另一个实施方案中，至少一个连接的核苷的区域A可以是帽区域。帽区域可以相对于作为5’UTR发挥作用的连接的核苷的区域A位于5’。帽区域还可以包含至少一个帽，如，但不限于帽0、帽1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2′氟-鸟苷、7-去氮杂-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、帽2和帽4。
在一个实施方案中，至少一个连接的核苷的区域B可以包含核酸序列的至少一个开放阅读框。核酸序列可以经密码子优化和/或包含至少一个修饰。
在一个实施方案中，至少一个连接的核苷的区域C可以包含作为3’UTR发挥作用的连接的核苷的序列。所述连接的核苷的序列可以是天然的或合成的3’UTR。作为一个非限制性例子，嵌合多核苷酸可以编码目的多肽并且连接的核苷的序列C可以编码由嵌合多核苷酸编码的多肽的天然3’UTR，或连接的核苷的序列可以是非异源3’UTR如，但不限于合成的UTR。
在一个实施方案中，至少一个连接的核苷的区域A包含作为5’UTR发挥作用的连接的核苷的序列，并且至少一个连接的核苷的区域C包含作为3’UTR发挥作用的连接的核苷的序列。在一个实施方案中，5’UTR和3’UTR可以来自相同或不同的物种。在另一个实施方案中，5’UTR和3’UTR可以编码来自源于相同或不同物种的不同蛋白质的天然非翻译区。
图5和图6提供一系列嵌合多核苷酸的示意图，所述示意图说明基于式I的多种样式的位置修饰以及具有封闭或结构化3’末端的那些。
本发明的嵌合多核苷酸(包括其部分或区域)可以划分为半聚物(hemimers)、缺口聚物(gapmers)、翼聚物(wingmers)或嵌段聚物(blockmers)。
如本文所用，“半聚物”是包含下述区域或部分的嵌合多核苷酸，所述区域或部分包含一半的一种化学修饰的样式、百分数、位置或群体，一半的第二种化学修饰的样式、百分数、位置或群体。本发明的嵌合多核苷酸还可以包含半聚物亚区域。在一个实施方案中，部分或区域是50％的一种和50％的另一种。
在一个实施方案中，整个嵌合多核苷酸可以是50％的一种和50％的另一种。本发明的任何嵌合多核苷酸的任何区域或部分均可以是半聚物。半聚物的类型包括样式半聚物、群体半聚物或位置半聚物。按定义，半聚物是50:50百分比的半聚物。
如本文所用，“缺口聚物”是具有至少三个之间具有缺口的部分或区域的嵌合多核苷酸。“缺口”可以包含与其侧翼的两个部分或区域的嵌合性质不同的连接的核苷的区域或单个核苷。缺口聚物的所述两个部分或区域可以彼此相同或不同。
如本文所用，“翼聚物”是具有至少三个之间具有缺口的部分或区域的嵌合多核苷酸。不同于缺口聚物，包围翼聚物中缺口的两个侧翼部分或区域是在程度或种类上相同的。这种相似性可以是不同修饰的单元数目的长度方面或是在修饰数目方面。翼聚物的翼可以比缺口长或短。翼部分或区域可以在长度方面比包含缺口的区域长或短20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
如本文所用，“嵌段聚物”是样式化多核苷酸，其中部分或区域具有相等的大小或修饰数目和类型。嵌段聚物中的区域或亚区域可以长50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500个核苷。
具有化学修饰样式的本发明嵌合多核苷酸(包括其部分或区域)称作“样式嵌合体”。样式嵌合体也可以称作嵌段聚物。样式嵌合体是在区域或部分内部、跨区域或部分或在区域或部分之间具有修饰样式的那些多核苷酸。
在区域或部分内部的修饰样式是在限定区域内部开始并终止的那些样式。跨区域或部分的修饰样式是在部分或区域上开始并在另一个毗邻部分或区域中结束的那些样式。在区域或部分之间的修饰样式是在一个部分或区域中开始并结束并且在不必然与第一区域或部分毗邻的不同部分或区域中重复的那些样式。
样式嵌合体或嵌段聚物的区域或亚区域可以具有简单的交替样式，如ABAB[AB]n，其中每个“A”和每个“B”代表不同的化学修饰(碱基、糖或主链接头至少之一)，不同类型(例如，天然存在的和非天然存在的)的化学修饰，不同百分数的修饰或不同的修饰群体。该样式可以重复n次数，其中n＝3-300。进一步，每个A或B可以在样式中代表1-2500个单位(例如，核苷)。样式也可以是交替多个，如AABBAABB[AABB]n(交替双倍)或AAABBBAAABBB[AAABBB]n(交替三倍)。该样式可以重复n次数，其中n＝3-300。
不同样式也可以混合在一起以形成二级样式。例如，单一交替样式可以与三重交替样式组合以形成二级交替样式A’B’。一个例子将是[ABABAB][AAABBBAAABBB][ABABAB][AAABBBAAABBB][ABABAB][AAABBBAAABBB]，其中[ABABAB]是A’并且[AAABBBAAABBB]是B’。以类似方式，这些样式可以重复n次数，其中n＝3-300。
样式可以包括三个或更多个不同修饰以形成ABCABC[ABC]n样式。这些三组件样式也可以是多倍，如AABBCCAABBCC[AABBCC]n并且可以设计为与其他样式组合如ABCABCAABBCCABCABCAABBCC，并且可以是高阶样式。
位置修饰、百分数修饰和群体修饰的区域或亚区域不需要反映来自每种修饰类型的相等贡献。它们可以形成系列如“1-2-3-4”，“1-2-4-8”，其中每个整数代表特定修饰类型的单位的数目。可选地，它们可以仅是奇数，如“1-3-3-1-3-1-5”或甚至仅为“2-4-2-4-6-4-8”或奇数和偶数个单位的混合如“1-3-4-2-5-7-3-3-4”。
样式嵌合体可以在其化学修饰方面按程度(如上文描述的那些)或种类(例如，不同修饰)变动。
将具有至少一个区域，且该区域具有同一核苷类型(A、C、G、T或U)的两个或更多个核苷构件的两个或更多个不同化学修饰的本发明嵌合多核苷酸(包含其部分或区域)称作“位置修饰的”嵌合体。位置修饰的嵌合体在本文也称作“选择性安置”嵌合体或“选择性安置多核苷酸”。如名称暗示，选择性安置指这样的多核苷酸设计，与本领域多核苷酸中通过合成方法对A、C、G、T或U任一者的相同修饰不同，所述设计可以使多核苷酸或其区域中各个A、C、G、T或U具有不同的修饰。例如，在位置修饰的嵌合多核苷酸中，可以存在对核苷类型A、C、G、T或U任一者的两种或更多种不同化学修饰。也可以存在两种或更多种对任何两种或更多种相同核苷类型的修饰的组合。例如，位置修饰的或选择性安置的嵌合多核苷酸可以包含对分子中腺嘌呤群体的3种不同修饰并且还对所述构建体中胞嘧啶群体具有3种不同修饰—全部修饰可以是一种唯一、非随机安置。
具有化学修饰百分数的本发明嵌合多核苷酸(包括其部分或区域)，称作“百分嵌合体”。百分嵌合体可以具有包含至少1％、至少2％、至少5％、至少8％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％位置修饰、样式修饰或群体修饰的区域或部分。可选地，百分嵌合体可以就修饰位置、样式或群体而言完全修饰。百分嵌合体的修饰百分数可以划分成天然存在的修饰和非天然存在的修饰。
具有化学修饰群体的本发明嵌合多核苷酸(包括其部分或区域)称作“群体嵌合体”。群体嵌合体可以包含其中的核苷(其碱基、糖或主链键或其组合)具有选定修饰群体的区域或部分。这类修饰可以选自功能性群体，如诱导、改变或调节表型结果的修饰。例如，功能性群体可以是增加细胞因子水平的化学修饰的群体或选集。其他功能性群体可以单独或集体地发挥作用以减少一种或多种细胞因子的水平。在嵌合多核苷酸中使用这些相似功能修饰的选集将因此构成“功能性群体嵌合体”。如本文所用，“功能性群体嵌合体”可以是其独特功能特征由如上文所述的修饰群体定义的一种嵌合体，或本术语可以适用于嵌合多核苷酸本身的总体功能。例如，作为整体，如与未修饰的或非嵌合的多核苷酸相比，嵌合多核苷酸可以按不同方式或优越方式发挥作用。
应当指出，下述多核苷酸不视为嵌合，所述多核苷酸具有全部的任一相同核苷类型的均匀化学修饰或通过单纯下行(mere downward)滴定全部的任一相同核苷类型中的相同起始修饰所产生的修饰群体，或计量百分数的全部的任一相同核苷类型的化学修饰，但伴以随机掺入，如其中全部尿苷由尿苷类似物(例如，假尿苷)替代。同样地，遍及整个多核苷酸具有两个、三个或四个相同核苷类型的均匀化学修饰(如全部尿苷和全部胞嘧啶等均以相同方式修饰)的多核苷酸不视为嵌合多核苷酸。非嵌合的多核苷酸的一个例子是现有技术的标准假尿苷/5-甲基胞嘧啶修饰的多核苷酸。这些均匀多核苷酸完全借助体外转录(IVT)酶促合成得到；并且由于合成酶的局限性，它们在多核苷酸内存在的每个相同核苷类型(即，腺苷(A)、胸苷(T)、鸟苷(G)、胞苷(C)或尿苷(U))出现时仅含有一个种类的修饰。这类多核苷酸可以表征为IVT多核苷酸。
本发明的嵌合多核苷酸可以是结构上修饰的或化学修饰的。当本发明的嵌合多核苷酸经化学修饰和/或结构修饰时，该多核苷酸可以称作“修饰的嵌合多核苷酸”。
在本发明的一些实施方案中，嵌合多核苷酸可以编码两种或更多种目的肽或目的多肽。这类目的肽或目的多肽包括抗体重链和轻链，酶和其底物，标记物和其结合分子，第二信使和其酶或多聚体蛋白或复合物的组分。
本发明嵌合多核苷酸的区域或部分可以由接头或间隔团部分分隔。这类接头或间隔团可以是基于核酸的或非核苷的。
在一个实施方案中，本发明的嵌合多核苷酸可以包括编码本文所述的自我切割肽(如但不限于2A肽)的序列。嵌合多核苷酸中2A肽的多核苷酸序列可以是通过本文所述和/或本领域已知的方法修饰或经密码子优化。
如前述，本发明的嵌合多核苷酸可以包含如本文定义的非位置修饰或非嵌合的区域或部分。
例如，嵌合多核苷酸的区域或部分可以在一个或多个A，T、C，G，或U处均匀地受到修饰，但是根据本发明，多核苷酸将不在整个区域或部分均一地受到修饰。
嵌合多核苷酸的区域或部分可以长15-1000个核苷并且多核苷酸可以具有2-100个如本文所述的不同区域或区域样式。
在一个实施方案中，嵌合多核苷酸编码一种或多种目的多肽。在另一个实施方案中，嵌合多核苷酸是基本上非编码的。在另一个实施方案中，嵌合多核苷酸具有编码性和非编码性区域和部分。
图3显示当基于图1多核苷酸的支架时，本发明的某些嵌合多核苷酸的设计。本图中显示嵌合多核苷酸的区域或部分，其中样式区域代表按位置修饰的那些区域，空心区域显示可能修饰或可能未修饰，但修饰时均匀修饰的区域。本发明的嵌合多核苷酸可以是完全位置修饰的或部分位置修饰的。它们还可以具有可以呈任何样式或设计的亚区域。图3中显示嵌合亚区域和半聚物亚区域。
在一个实施方案中，编码肽的本发明嵌合多核苷酸的区域的最短长度可以是足以编码二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽或十肽的长度。在另一个实施方案中，该长度可以足以编码2-30个氨基酸例如5-30、10-30、2-25、5-25、10-25或10-20个氨基酸的肽。该长度可以足以编码至少11、12、13、14、15、17、20、25或30个氨基酸的肽，或不超过40个氨基酸例如不超过35、30、25、20、17、15、14、13、12、11或10个氨基酸的肽。多核苷酸序列可以编码的二肽的例子包括但不限于肌肽和鹅肌肽。
在一个实施方案中，编码目的肽或目的多肽的本发明多核苷酸的区域的长度是大于约30个核苷酸长度(例如，至少或大于约35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、850、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、and 3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或至多并包括100,000个核苷酸)。如本文所用，这种区域可以称作“编码区”或“编码……的区域”。
在一些实施方案中，多核苷酸如嵌合多核苷酸包含约30至约100,000个(例如，30至50个、30至100个、30至250个、30至500个、30至1,000个、30至1,500个、30至3,000个、30至5,000个、30至7,000个、30至10,000个、30至25,000个、30至50,000个、30至70,000个、100至250个、100至500个、100至1,000个、100至1,500个、100至3,000个、100至5,000个、100至7,000个、100至10,000个、100至25,000个、100至50,000个、100至70,000个、100至100,000个、500至1,000个、500至1,500个、500至2,000个、500至3,000个、500至5,000个、500至7,000个、500至10,000个、500至25,000个、500至50,000个、500至70,000个、500至100,000个、1,000至1,500个、1,000至2,000个、1,000至3,000个、1,000至5,000个、1,000至7,000个、1,000至10,000个、1,000至25,000个、1,000至50,000个、1,000至70,000个、1,000至100,000个、1,500至3,000个、1,500至5,000个、1,500至7,000个、1,500至10,000个、1,500至25,000个、1,500至50,000个、1,500至70,000个、1,500至100,000个、2,000至3,000个、2,000至5,000个、2,000至7,000个、2,000至10,000个、2,000至25,000个、2,000至50,000个、2,000至70,000个、2,000至100,000个和4,500至5,500个)核苷酸。
根据本发明，多核苷酸的区域或亚区域还可以独立地具有15-1,000个核苷酸长度(例如，大于30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900和950核苷酸或至少30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、2,000、3,000、4,000和5,000个核苷酸)。
根据本发明的，多核苷酸的区域或亚区域可以从不存在至具有500个核苷酸长度(例如，至少60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸)。在区域是聚腺苷酸尾的情况下，该长度可以按聚腺苷酸结合蛋白结合作用的单位确定或作为聚腺苷酸结合蛋白结合作用的函数确定。在这个实施方案中，聚腺苷酸尾长到足以结合聚腺苷酸结合蛋白的至少4单体。聚腺苷酸结合蛋白单体与一段大约38个核苷酸结合。因而，已经观察到约80个核苷酸至约160个核苷酸的聚腺苷酸尾是有功能的。作为mRNA发挥作用的本发明嵌合多核苷酸不需要包含聚腺苷酸尾。
根据本发明，作为mRNA发挥作用的嵌合多核苷酸可以具有加帽区。加帽区可以包含单个帽或一系列形成帽的核苷酸。在这个实施方案中，加帽区可以是1至10个核苷酸长度，例如2-9、3-8、4-7、1-5、5-10或至少2个核苷酸长度、或10个核苷酸长度或更小核苷酸长度。在一些实施方案中，帽不存在。
本发明包括呈环状或环形的嵌合多核苷酸。如名称暗示，环状多核苷酸本质上是环状的，这意味着末端以某种方式接合，无论是否通过连接作用、共价键、与相同蛋白质或其他分子或复合物公共缔合或通过杂交作用接合。可以根据本发明，使得如例如国际专利申请号PCT/US2014/53904(代理人案号M51.20)中教导的任何环状多核苷酸嵌合，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
嵌合多核苷酸、包含嵌合多核苷酸的制剂和组合物以及产生、使用和施用嵌合多核苷酸的方法还在待决国际专利申请号PCT/US2014/53907(代理人案号M57.20)中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入。
环状多核苷酸构造
本发明包括呈环状或环形的多核苷酸。如名称暗示，环状多核苷酸本质上是环状的，这意味着末端以某种方式接合，无论是否通过连接作用、共价键、与相同蛋白质或其他分子或复合物公共缔合或通过杂交作用接合。如例如2014年9月3日提交的国际专利申请号PCT/US2014/053904(代理人案号M51)中教授的任何环状多核苷酸，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
本发明的环状多核苷酸可以根据图7-13中显示的环状RNA构建体支架设计。这类多核苷酸为环状多核苷酸或环状构建体。
编码至少一种目的肽或目的多肽的本发明环状多核苷酸或circP称作环状RNAs或circRNA。如本文所用，“环状RNA”或“circRNA”意指可以编码至少一种目的肽或目的多肽的环状多核苷酸。包含至少一个传感器序列并且不编码目的肽或目的多肽的本发明circP称作环状海绵(circular sponges)或circSP。如本文所用，“环状海绵”、“环状多核苷酸海绵”或“circSP”意指包含至少一个传感器序列并且不编码目的多肽的环状多核苷酸。如本文所用，“传感器序列”意指内源核酸结合分子的受体或假受体。传感器序列的非限制性例子包括微RNA结合位点、微RNA种子序列、无种子序列的微RNA结合位点、转录因子结合位点和经工程化以充当假受体的人工结合位点以及其部分及片段。
包含至少一个传感器序列并且编码至少一种目的肽或目的多肽的本发明circP称作环状RNA海绵或circRNA-SP。如本文所用，“环状RNA海绵”或“circRNA-SP”意指包含至少一个传感器序列和编码至少一种目的肽或目的多肽的至少一个区域的环状多核苷酸。
图7显示本发明环状多核苷酸的代表性环状构建体200。如本文所用，术语“环状构建体”指可以与RNA分子基本上相似地发挥作用并且具有其特性的环状多核苷酸转录物。在一个实施方案中，环状构建体充当mRNA。如果环状构建体编码一种或多种目的肽或目的多肽(例如，circRNA或circRNA-SP)，则多核苷酸转录物保留了足够结构性特征和/或化学特征以允许其中所编码的目的多肽翻译。环状构建体可以是本发明的多核苷酸。在结构上或化学修饰时，这种构建体可以称作修饰的circP、修饰的circSP、修饰的circRNA或修饰的circRNA-SP。
返回图7，环状构建体200这里含有连接的核苷酸的第一区域202，其旁侧分布有第一侧翼区204和第二侧翼区206。如本文所用，“第一区域”可以称作“编码区”、“非编码区”或“编码……的区域”或简单称作“第一区域”。在一个实施方案中，这种第一区域可以包含如，但不限于，编码至少一种目的肽或目的多肽的核苷酸和/或编码传感器区域的核苷酸。目的肽或目的多肽可以在其5'末端处包含一个或多个由信号态序列区域203编码的信号序列。第一侧翼区204可以包含连接的核苷的区域或其部分，其可以按类似于mRNA和/或DNA序列中非翻译区(UTR)的方式发挥作用。第一侧翼区还可以包含极性区域208。极性区域208可以包含IRES序列或其部分。作为一个非限制性例子，当线性化时，这个区域可以遭分割以具有在第一区域202的5'末端上的第一部分和在第一区域202的3'末端上的第二部。第二侧翼区206可以包含加尾序列区210并且可以包含连接的核苷酸的区域或其部分212，其可以按类似于mRNA和/或DNA中UTR的方式发挥作用。
桥接第一区域202的5'末端和第一侧翼区204是第一可操作区域205。在一个实施方案中这个可操作区域可以包含起始密码子。这个可操作区域可以可选地包含任何翻译起始序列或信号，包括起始密码子。
桥接第一区域202的3'末端和第二侧翼区206是第二可操作区域207。传统上，这个可操作区域包含终止密码子。这个可操作区域可以可选地包含任何翻译起始序列或信号，包括终止密码子。根据本发明，也可以使用多个系列终止密码子。在一个实施方案中，本发明的操作区域可以包含两个终止密码子。第一终止密码子可以是“TGA”或“UGA”并且第二终止密码子可以选自“TAA”、“TGA”、“TAG”、“UAA”、“UGA”或“UAG”。
转向图8，至少一个非核酸部分201可以用来制备环状构建体200，其中非核酸部分201用来将第一侧翼区204带到第二侧翼区206附近。本文中描述了可以在本发明中使用的非核酸部分的非限制性例子。环状构建体200可以包含多于一个非核酸部分，其中额外的非核酸部分可以相对于第一非核酸部分是异源或同源的。
转向图9，连接的核苷的第一区域202可以包含间隔区214。这个间隔区214可以用来分隔连接的核苷的第一区域202，从而环状构建体可以包括多于一个开放阅读框、非编码区或开放阅读框和非编码区。
转向图10，第二侧翼区206可以在3’UTR212中包含一个或多个传感器区域216。如本文中讨论，这些传感器序列作为环状构建体局部微环境的配体的假受体(或结合位点)而起作用。例如，可以使用微RNA结合位点或miRNA种子序列(miRNA seeds)作为传感器，从而它们作为环状多核苷酸环境中存在的任何微RNA的假受体发挥作用。如图9中所示，一个或多个传感器区域216可以由间隔区214分隔。
如图11中所示，包含一个或多个传感器区域216的环状构建体200还可以在连接的核苷的第一区域202中包含间隔区214。如上文对图7讨论，这个间隔区214可以用来分隔连接的核苷的第一区域202，从而环状构建体可以包括多于一个开放阅读框和/或多于一个非编码区。
转向图12，环状构建体200可以是称作circSP的非编码构建体，其包含至少一个非编码区，如，但不限于，传感器区域216。每种传感器区域216可以包含但不限于，miR序列、miR种子序列、miR结合位点和/或无种子序列的miR序列。
转向图13，至少一个非核酸部分201可以用来制备作为非编码构建体的环状构建体200。作为非编码构建体的环状构建体200可以包含多于一个非核酸部分，其中额外的非核酸部分可以相对于第一非核酸部分是异源或同源的。
环状多核苷酸、包含环状多核苷酸的制剂和组合物以及制备、使用和施用环状多核苷酸的方法还在待决国际专利申请号PCT/US2014/53904(代理人案号M51.20)中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入。
多核苷酸的多聚体
根据本发明，可以使用在3′-末端修饰的核苷酸，将多个不同嵌合多核苷酸和/或IVT多核苷酸通过3′-端连接在一起。化学缀合可以用来控制向细胞中递送的化学计量。例如，可以将乙醛酸循环酶、异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶按1:1比率供应至细胞中，以改变细胞的脂肪酸代谢。可以使用在一个多核苷酸上的3′-叠氮基封端的核苷酸和对侧多核苷酸上含有C5-乙炔基或炔基的核苷酸通过化学连接嵌合多核苷酸或IVT多核苷酸，控制这个比率。使用末端转移酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)，根据制造商的操作方案，转录后添加修饰的核苷酸。在添加3′-修饰的核苷酸后，可以将两个多核苷酸在水溶液中在铜存在或不存在时合并，以通过如文献中所述的点击化学机制形成新共价键。
在另一个例子中，多于两个嵌合多核苷酸和/或IVT多核苷酸可以利用官能化的接头分子连接在一起。例如，可以化学修饰官能化的糖分子以含有多个化学反应基团(SH-、NH2-、N3等)，以与3′-官能化的mRNA分子上的同族部分(即，3′-马来酰亚胺酯、3′-NHS-酯、炔基)反应。修饰糖上的反应基团的数目可以按化学计量方式控制以直接控制缀合的嵌合多核苷酸和/或IVT多核苷酸的化学计量比率。
在一个实施方案中，嵌合多核苷酸和/或IVT多核苷酸可以按某种样式连接在一起。该样式可以是简单的交替样式如CD[CD]x，其中每个“C”和每个“D”代表嵌合多核苷酸、IVT多核苷酸、不同的嵌合多核苷酸或不同的IVT多核苷酸。该样式可以重复x次数，其中n＝1-300。样式也可以是交替多个，如CCDD[CCDD]x(交替双倍)或CCCDDD[CCCDDD]x(交替三倍)。交替双倍或交替三倍可以重复x次数，其中n＝1-300。
多核苷酸的缀合物(conjugates)和组合
为了进一步增强蛋白质生产，本发明的多核苷酸可以设计成缀合至其他多核苷酸、染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射标记的标记物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成性核糖核酸酶、蛋白质，例如糖蛋白或肽如对辅助配体具有特异性亲和力的分子，或抗体，例如与特定细胞类型如癌细胞、内皮细胞或骨细胞结合的抗体，激素和激素受体、非肽种类如脂质，凝集素、糖、维生素、辅因子或药物。
缀合可以导致稳定性和/或半寿期增加并且可以特别可用于使多核苷酸靶向至细胞、组织或生物中的特定位点。
根据本发明，多核苷酸可以随以下一者或多者一起施用、与之缀合或进一步编码以下一者或多者：RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、miRNA结合位点、反义RNA、核酶、催化性DNA、tRNA、诱导三螺旋形成的RNA、适配体或载体等。
纳米粒子制剂可以包含磷酸酯缀合物。磷酸酯缀合物可以增加纳米粒子的体内循环时间和/或增加其定向递送。随本发明使用的磷酸酯缀合物可以通过国际申请号WO2013033438或美国专利公开号US20130196948中描述的方法产生，所述每份文献的内容通过引用方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，磷酸酯缀合物可以包含国际申请号WO2013033438中描述的任一个式的化合物，所述文献通过引用方式完整并入本文。
纳米粒子制剂可以包含聚合物缀合物。聚合物缀合物可以是水溶性缀合物。聚合物缀合物可以具有如美国专利申请号20130059360中所述的结构，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。在一个方面，与本发明多核苷酸的聚合物缀合物可以使用美国专利申请号20130072709中描述的方法和/或分段聚合物试剂产生，所述文献通过引用方式完整并入本文。在另一个方面，聚合物缀合物可以具有包含环部分的侧式侧基团，如，但不限于，美国专利公开号US20130196948中描述的聚合物缀合物，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
纳米粒子制剂可以包含缀合物以增强本发明纳米粒子在受试者中的递送。进一步，缀合物可以抑制受试者中对纳米粒子的吞噬性清除过程。在一个方面，该缀合物可以是从人膜蛋白CD47设计的“自我”肽(例如，Rodriguez等人(Science 2013 339,971-975)描述的“自我”粒子，所述文献通过引用方式完整并入本文)。如通过Rodriguez等人所示，自我肽延迟了巨噬细胞介导的纳米粒子清除过程，这增强了纳米粒子递送。在另一个方面，缀合物可以是膜蛋白CD47(例如，参见Rodriguez等人,Science 2013 339,971-975，所述文献通过引用方式完整并入本文)。Rodriguez等人显示，类似于“自我”肽，如与秩乱肽和PEG包覆的纳米粒子相比，CD47可以增加受试者中循环粒子的比率。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸配制于纳米粒子中，所述纳米粒子包含缀合物以增强本发明纳米粒子在受试者中的递送。缀合物可以是CD47膜蛋白或者缀合物可以衍生自CD47膜蛋白，如先前描述的“自我”肽。在另一个方面，纳米粒子可以包含PEG和CD47或其衍生物的缀合物。在又一个方面，纳米粒子可以包含上文描述的“自我”肽和膜蛋白CD47二者。
在另一个方面，“自我”肽和/或CD47蛋白可以缀合于病毒样颗粒或假病毒粒，如本文所述，用于递送本发明的多核苷酸。
在另一个实施方案中，药物组合物包含本发明的多核苷酸和可以具有可降解的连接的缀合物。缀合物的非限制性例子包括包含可解离氢原子的芳族部分、间隔团部分和水溶性聚合物。作为一个非限制性例子，美国专利公开号US20130184443中描述了包含具有可降解连接的缀合物的药物组合物和用于递送这类药物组合物的方法，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
双官能多核苷酸
在本发明的一个实施方案中是双官能多核苷酸(例如，双官能IVT多核苷酸、双官能嵌合多核苷酸或双官能环状多核苷酸)。如名称提示，双官能多核苷酸是具有或能够发挥至少两个功能的那些。按常规，这些分子还可以称作多官能。
双官能多核苷酸的多个官能团可以由RNA编码(该官能团可以直至编码产物翻译才表现)或可以是多核苷酸本身的特性。它可以是结构性或化学性的。双官能的修饰多核苷酸可以包含与多核苷酸共价或静电结合的官能团。进一步，可以在嵌合多核苷酸和另一个分子的复合物的背景下提供两种功能。
双官能多核苷酸可以编码具有抗增殖性的肽。这些肽可以是线性、环状、被约束或随机卷曲。它们可以作为适配体、信号传导分子、配体或其模拟物或拟似物发挥作用。翻译时，抗增殖肽可以具有3至50个氨基酸长度。它们可以长5-40、10-30个或大约15个氨基酸。它们可以是单链、多链或支链并且一旦翻译，可以形成复合物、聚集物或任何多单位结构。
非编码多核苷酸
如本文所述，本文所述的多核苷酸可以包含部分或基本上不可翻译的序列，例如，具有非编码区。作为一个非限制性例子，非编码区可以是IVT多核苷酸或环状多核苷酸的第一区域。可选地，非编码区可以是除第一区域之外的区域。作为另一个非限制性例子，非编码区可以是嵌合多核苷酸的A区、B区和/或C区。
这类分子通常不翻译，但是可以通过以下方式对蛋白质生产形成影响：结合至并掩蔽一种或多种翻译机器组分如核糖体蛋白或转运RNA(tRNA)，因而有效减少细胞中的蛋白质表达或调节细胞中的一个或多个途径或级联，这转而改变蛋白质水平。多核苷酸可以含有或编码一种或多种长的非编码RNA(lncRNA或lincRNA)或其部分、小核仁RNA(sno-RNA)、微RNA(miRNA)、小干扰性RNA(siRNA)或Piwi-相互作用RNA(piRNA)。这类lncRNA分子和设计成靶向可以在多核苷酸中编码其中任一者的这类lncRNA的RNAi构建体的例子在国际公开WO2012/018881A2中教授，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
目的多肽
本发明的多核苷酸可以编码一种或多种目的肽或目的多肽。目的肽或目的多肽可以包含至少一个突变，例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变。作为一个非限制性例子，目的肽或目的多肽可以是包含至少两个突变的LDLR蛋白，所述突变例如是增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变。本发明的多核苷酸还可以影响一种或多种肽或多肽的水平、信号传导或功能。目的多肽包括LDLR、野生型LDLR和LDLR突变体和在本文表3、表10和表11中教授的那些或例如下表中所列那些中的任一者：美国临时专利申请号61/618,862、61/681,645、61/737,130、61/618,866、61/681,647、61/737,134、61/618,868、61/681,648、61/737,135、61/618,873、61/681,650、61/737,147、61/618,878、61/681,654、61/737,152、61/618,885、61/681,658、61/737,155、61/618,896、61/668,157、61/681,661、61/737,160、61/618,911、61/681,667、61/737,168、61/618,922、61/681,675、61/737,174、61/618,935、61/681,687、61/737,184、61/618,945、61/681,696、61/737,191、61/618,953、61/681,704、61/737,203的表6；美国临时专利申请号61/681,720、61/737,213、61/681,742的表6和表7；国际公开号WO2013151666、WO2013151668、WO2013151663、WO2013151669、WO2013151670、WO2013151664、WO2013151665、WO2013151736的表6；国际公开号WO2013151672的表6和表7；国际公开号WO2013151671的表6、表178和表179；美国临时专利申请号61/618,870的表6、表28和表29；美国临时专利申请号61/681,649的表6、表56和表57；美国临时专利申请号61/737,139的表6、表186和表187；国际公开号WO2013151667的表6、表185和表186；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
根据本发明，多核苷酸可以设计成编码一种或多种目的多肽或其片段。这种目的多肽可以包括，但不限于，完整多肽、多种多肽或多肽片段，它们可以独立地由多核苷酸的一个或多个区域或部分或完整的多核苷酸编码。如本文所用，术语“目的多肽”指经选择在本发明多核苷酸内部编码或其功能受本发明多核苷酸影响的任何多肽。
如本文所用，“多肽”意指最经常通过肽键连接在一起的(天然或非天然)氨基酸残基的聚合物。如本文所用，该术语指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。在一些情况下，编码的多肽小于约50个氨基酸并且该多肽则称作肽。如果多肽是肽，它将长至少约2、3、4个氨基酸残基或至少5个氨基酸残基。因此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述任一者的其他等同物、变体及类似物。多肽可以是单个分子或可以是多分子复合体如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包含单链或多链多肽如抗体或胰岛素并且可以缔合或连接。最常见地，二硫键存在于多链多肽中。术语多肽也可以适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物。
术语“多肽变体”指其氨基酸序列与天然或参考序列不同的分子。与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体可以在氨基酸序列内部的某些位置处拥有置换、缺失和/或插入。通常，变体将拥有与天然或参考序列的至少约50％同一性(同源性)、至少约60％同一性、至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约99％同一性。优选地，它们将与天然或参考序列至少约80％，更优选地至少约90％相同(同源)。
在一些实施方案中提供了“变体模拟物”。如本文所用，术语“变体模拟物”是含有模拟激活序列的一个或多个氨基酸的物质。例如，谷氨酸盐可以充当磷酰-苏氨酸和/或磷酰-丝氨酸的模拟物。可选地，变体模拟物可以导致失活或产生含有该模拟物的失活产物，例如，苯丙氨酸可以充当酪氨酸的失活置换物；或丙氨酸可以充当丝氨酸的失活置换物。
“同源性”在其用于氨基酸序列时定义为在对齐序列并且根据需要引入空位以实现最大同源性百分数后，候选氨基酸序列中与第二序列的氨基酸序列中残基相同的残基的百分数。用于比对的方法和计算机程序是本领域熟知的。可以理解，同源性取决于同一性百分数的计算，但是可以因计算中引入的空位和罚分而在数值上不同。
“同源物”在其用于多肽序列时意指其他物种的相应序列与第二物种的第二序列具有基本同一性。
“类似物”意在包含因一个或多个氨基酸改变(例如，置换、添加或缺失氨基酸残基)而不同、但仍然维持一种或多种亲本或起始多肽特性的多肽变体。
本发明包括基于多肽(包括变体和衍生物)的几个类型的组合物。这些组合物包含置换、插入、缺失和共价变体和衍生物。术语“衍生物”按照与术语“变体”同义的方式使用，但是通常指已经相对参考分子或开始分子以任何方式修饰和/或改变的分子。
因而，本发明的范围内包括编码肽或多肽的多核苷酸，所述肽或多肽相对于参考序列、尤其本文公开的多肽序列含有置换、插入和/或添加、缺失和共价修饰。例如，可以添加序列标签或氨基酸，如一个或多个赖氨酸至本发明的肽序列(例如，在N末端或C末端添加)。序列标签可以用于肽纯化或定位。赖氨酸可以用来增加肽溶解度或以允许生物素酰化。可选地，可以任选删除位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基端和氨基端区域的氨基酸残基，从而提供截短的序列。根据序列的用途(例如，表达作为可溶解或与固相支持物连接的更大序列的一部分的序列)，可以可选地缺失某些氨基酸(例如，C末端或N端残基)。
当提到多肽时，“置换变体”是具有在天然或起始序列中移除至少一个氨基酸残基并且在相同位置处其原位插入不同氨基酸的那些变体。置换可以是单个的，其中置换分子中的仅一个氨基酸，或它们可以是多个的，其中在同一分子中置换两个或更多个氨基酸。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码LDLR蛋白的置换变体。置换变体可以包含一个、两个、三个或多于三个置换。作为一个非限制性例子，一个、两个、三个或多于三个置换可以位于LDLR蛋白的EGF-A结构域中。作为另一个非限制性例子，一个置换或多个置换可以位于LDLR蛋白的IDOL相互作用结构域。作为另一个非限制性例子，一个置换或多个置换可以位于LDLR蛋白的PCSK9相互作用结构域。作为又一个非限制性例子，置换可以位于LDLR蛋白的IDOL相互作用结构域和PCSK9相互作用结构域中。作为又一个非限制性例子，置换可以位于EGF-A结构域和IDOL相互作用结构域中。作为又一个非限制性例子，置换可以位于EGF-A结构域和PCSK9相互作用结构域中。作为又一个非限制性例子，置换可以位于PCSK9相互作用结构域和IDOL相互作用结构域汇总。
在一个实施方案中，置换性变体称作突变。本文所述的多核苷酸可以包含一个、两个、三个、四个或多于四个突变。作为一个非限制性例子，多核苷酸编码在LDLR蛋白的EGF-A结构域中包含至少一个突变的LDLR蛋白。作为一个非限制性例子，多核苷酸编码在LDLR蛋白的IDOL相互作用结构域中包含至少一个突变的LDLR蛋白。作为一个非限制性例子，多核苷酸编码在LDLR蛋白的PCSK9结合结构域中包含至少一个突变的LDLR蛋白。作为一个非限制性例子，多核苷酸编码在LDLR蛋白的IDOL相互作用结构域和PCSK9相互作用结构域中包含至少一个突变的LDLR蛋白。作为一个非限制性例子，多核苷酸编码在EGF-A结构域和IDOL相互作用结构域中包含至少一个突变的LDLR蛋白。作为一个非限制性例子，多核苷酸编码在PCSK9相互作用结构域和IDOL相互作用结构域中包含至少一个突变的LDLR蛋白。
如本文所用，术语“保守性氨基酸置换”指通常存在于序列中的具有相似大小、电荷或极性的不同氨基酸的氨基酸置换。保守性置换的例子包括将非极性(疏水性)残基如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸置换成另一种非极性残基。同样地，保守性置换的例子包括将一个极性(亲水)残基置换成另一者，如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间和甘氨酸和丝氨酸之间置换。另外，保守性置换的额外例子有将碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸置换成另一者，或将一种酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸置换成另一种酸性残基。非保守性置换的例子包括将非极性(疏水性)氨基酸残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸置换成极性(亲水性)残基如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸和/或将极性残基置换成非极性残基。
当指多肽时，“插入性变体”是在紧邻天然或起始序列中特定位置处某个氨基酸插入一个或多个氨基酸的那些。“紧邻”氨基酸意指与氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。
当指多肽时，“缺失变体”是移除天然或起始氨基酸序列中一个或多个氨基酸的那种。通常，缺失变体将缺失分子特定区域中的一个或多个氨基酸。
当指多肽时，“共价衍生物”包括用蛋白质性或非蛋白质性有机衍化剂修饰天然或起始蛋白质，和/或翻译后修饰。传统上通过使得蛋白质的靶向氨基酸残基与能够与选择的侧链或末端残基反应的有机衍化剂反应或通过利用在选择的重组宿主细胞中发挥功能的翻译后修饰机制，引入共价修饰。所得到的共价衍生物可用于以下程序中，所述程序旨在鉴定对生物活性、对免疫测定法或对制备用于免疫亲和纯化重组糖蛋白的抗蛋白质抗体重要的残基。这类修饰处于本领域技术人员能力范围内并且在无需过多实验的情况下进行。
某些翻译后修饰是重组宿主细胞在所表达多肽上作用的结果。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基经常翻译后脱酰胺成相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基。可选地，这些残基在微酸性条件下脱酰胺。这些残基的任一种形式可以存在于根据本发明产生的多肽中。
其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟化，丝氨酰残基或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,第79-86页(1983))。
当指多肽时，“特征”定义为分子的独特的基于氨基酸序列的组分。由本发明多核苷酸编码的多肽的特征包括表面显化(surface manifestation)、局部构象形状、折叠、环、半环、结构域、半结构域、位点、末端或其任意组合。
如本文所用，当指多肽时，术语“表面显化”指蛋白质出现在最外表面上的基于多肽的组分。
如本文所用，当指多肽时，术语“局部构象形状”意指蛋白质的位于该蛋白质的可限定空间内部的基于多肽的结构性显化。
如本文所用，当指多肽时，术语“折叠”指氨基酸序列在能量最小化时所得到的构象。折叠可以在折叠过程的二级或三级水平出现。二级水平折叠的例子包含β折叠和α螺旋。三级折叠的例子包括因能学力的聚集或分离所形成的结构域和区域。以这种方式形成的区域包括疏水袋和亲水袋等。
如本文所用，术语“转角”在涉及蛋白质构象时意指改变肽或多肽主链方向并且可以包含一个、两个、三个或更多个氨基酸残基的弯曲。
如本文所用，当指多肽时，术语“环(loop)”指多肽的结构性特征，所述特征可以起到逆转肽或多肽主链方向的作用。在环存在于多肽中并仅改变主链方向的情况下，它可以包含4个或更多个氨基酸残基。Oliva等人已经鉴定了至少5类蛋白质环(J.Mol Biol 266(4):814-830；1997)。环可以是开放或封闭的。闭环或“圆形”环可以在桥接部分之间包含2、3、4、5，6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。这类桥接部分可以包含在具有二硫键的多肽中常见的半胱氨酸-半胱氨酸桥(Cys-Cys)，或可选地，桥接部分可以不基于蛋白质，如本文所用的双溴酰基(dibromozylyl)剂。
如本文所用，当指多肽时，术语“半环”指已鉴定环的一部分，所述部分具有衍生所述部分的环的至少一半数目的氨基酸残基。可以理解，环可以并不总是含有偶数目的氨基酸残基。因此，在其中环含有或经鉴定包含奇数个氨基酸的情况下，奇数编号的环的半环将包含该环的整数部分或下一个整数部分(环的氨基酸数目/2+/-0.5个氨基酸)。例如，经鉴定为7氨基酸环的环可能产生3氨基酸或4氨基酸的半环(7/2＝3.5+/-0.5是3或4)。
如本文所用，当指多肽时，术语“结构域”指多肽的具有一个或多个可辨认的结构性或功能性特征或特性(例如，结合能力、充当蛋白质-蛋白质相互作用位点)的基序。
如本文所用，当指多肽时，术语“半结构域”指已鉴定结构域的一部分，所述部分具有衍生所述部分的结构域的至少一半数目的氨基酸残基。可以理解，结构域可以并不总是含有偶数目的氨基酸残基。因此，在其中结构域含有或经鉴定包含奇数个氨基酸的情况下，奇数编号的结构域的半结构域将包含该结构域的整数部分或下一个整数部分(结构域的氨基酸数目/2+/-0.5个氨基酸)。例如，经鉴定为7氨基酸结构域的结构域可能产生3氨基酸或4氨基酸的半结构域(7/2＝3.5+/-0.5是3或4)。还理解，可以在结构域或半结构域内部鉴定亚结构域，这些亚结构域拥有不到全部的在衍生这些亚结构域的结构域或半结构中鉴定的结构性或功能特性。还理解，包含本文中任何结构域类型的氨基酸不需要沿多肽主链为连续(即，非相邻的氨基酸可以在结构上折叠以产生结构域、半结构域或亚结构域)。
如本文所用，当指多肽时，术语“位点”在它涉及基于氨基酸的实施方案时按照与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义的方式使用。位点表示肽或多肽内部的某个位置，其中可以在基于多肽的本发明分子内部修饰、操作、改变、衍生化或变动所述位置。
如本文所用，当指多肽时，术语“末端”指肽或多肽的端点。这种端点不仅限于肽或多肽的第一位点或最终位点，还可以包括末端区的额外氨基酸。本发明基于多肽的分子可以表征作同时具有N末端(以具有游离氨基(NH2)的氨基酸终止)和C末端(以具有游离羧基(COOH)的氨基酸终止)。本发明的蛋白质在一些情况下由通过二硫键或通过非共价力在一起的多条多肽链组成(多聚体、寡聚体)。这些类别的蛋白质将具有多个N末端和C末端。可选地，多肽的末端可以如此修饰，从而它们始于或终于基于非多肽的部分如有机缀合物，视具体情况而定。
一旦任何特征已经得到鉴定或被定义为由本发明多核苷酸编码的多肽的期望组分，则可以通过移动、交换、倒置、缺失、随机化或重复，对这些特征进行几种操作和/或修饰的任一项。另外，可以理解，对特征的操作可以导致与修饰本发明分子相同的结果。例如，涉及使结构域缺失的操作将导致分子长度改变，与编码小于全长的分子的核酸修饰一样。
修饰和操作可以通过本领域已知的方法如，但不限于，位点定向诱变或在化学合成期间的先行掺入法(priori incorporation)完成。随后可以使用体外或体内测定法如本文所述的那些或本领域已知的任何其他合适筛选分析法，对所得到的修饰的分子测试活性。
根据本发明，多肽可以包含通过多轮实验发现的共有序列。如本文所用，“共有序列”是代表了允许在一个或多个位点处变异的序列集群的单个序列，。
如本领域技术人员认识到，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白也视为处于本发明目的多肽的范围内。例如，本文提供了参比蛋白的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或超过100个氨基酸长度的任何蛋白质片段(意指至少比参考多肽序列短一个氨基酸残基，但是其他相同的多肽序列)。在另一个例子中，可以根据本发明使用任何蛋白质，所述蛋白质包括一段与本文所述的任何序列约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％相同的约20个、约30个、约40个、约50个或约100个氨基酸。在某些实施方案中，根据本发明待利用的多肽包含如本文中提供或提到的任何序列中所示的2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个突变。
目的多肽的类型
本发明的多核苷酸可以设计成编码选自几种目的分类中任一者的目的多肽，所述分类包括但不限于：生物制品、抗体、疫苗、治疗性蛋白或肽、细胞渗透肽、分泌蛋白、质膜蛋白、胞质或细胞骨架蛋白、胞内膜结合型蛋白、核蛋白、与人类疾病相关的蛋白质、靶向部分或由人类基因组编码的尚未确定治疗适应症、但是在研究和发现领域具有实用性的那些蛋白质。作为一个非限制性例子，本发明的多核苷酸可以设计成编码如国际专利公开号WO2013151666中所述的生物制品、抗体、疫苗、治疗性蛋白或肽、细胞渗透肽、分泌型蛋白、质膜蛋白、胞质或细胞骨架蛋白、胞内膜结合型蛋白、核蛋白、与人类疾病相关的蛋白质，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，多核苷酸可以编码与参考多肽序列具有某种同一性的变体多肽。如本文所用，“参考多肽序列”指起始多肽序列。参考序列可以是野生型序列或在设计另一个序列时所参照的任何序列。“参考多肽序列”可以是例如LDLR蛋白如野生型LDLR或包含至少一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)的LDLR，在本文表3、表10和表11中描述的任一多肽或在下表中公开的那些多肽的任一种：美国临时专利申请号61/618,862、61/681,645、61/737,130、61/618,866、61/681,647、61/737,134、61/618,868、61/681,648、61/737,135、61/618,873、61/681,650、61/737,147、61/618,878、61/681,654、61/737,152、61/618,885、61/681,658、61/737,155、61/618,896、61/668,157、61/681,661、61/737,160、61/618,911、61/681,667、61/737,168、61/618,922、61/681,675、61/737,174、61/618,935、61/681,687、61/737,184、61/618,945、61/681,696、61/737,191、61/618,953、61/681,704、61/737,203的表6；美国临时专利申请号61/681,720、61/737,213、61/681,742的表6和表7；国际公开号WO2013151666、WO2013151668、WO2013151663、WO2013151669、WO2013151670、WO2013151664、WO2013151665、WO2013151736的表6；国际公开号WO2013151672的表6和表7；国际公开号WO2013151671的表6、表178和表179；美国临时专利申请号61/618,870的表6、表28和表29；美国临时专利申请号61/681,649的表6、表56和表57；美国临时专利申请号61/737,139的表6、表186和表187；国际公开号WO2013151667的表6、表185和表186；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，参考多肽序列可以是编码低密度脂蛋白受体(LDLR)或其变体的任何多肽序列。
参考分子(多肽或多核苷酸)可以与设计的分子(多肽或多核苷酸)共有某种同一性。如本领域已知，术语“同一性”指通过比较所确定的两种或更多种肽、多肽或多核苷酸的序列之间的关系。在本领域，同一性还意指它们之间的序列相关性程度，如通过两个或更多个氨基酸残基或核苷的链之间的匹配数目所确定。同一性测量在两个或更多个序列中更小者之间相同匹配的百分数，其空位比对(如果有)由特定数学模型或计算机程序(即“算法”)解决。可以通过已知的方法容易地计算相关肽的同一性。这类方法包括但不限于以下文献中描述的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编著,Oxford UniversityPress,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编著,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysisin Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence AnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.编著,M Stockton Press,New York,1991及Carillo等人,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)。
在一些实施方案中，编码的多肽变体可以具有与参考多肽相同或相似的活性。可选地，变体可以相对于参考多肽具有改变的活性(例如，增加或减少的活性)。通常，本发明的特定多核苷酸或多肽的变体将与这种特定参考多核苷酸或多肽具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％序列同一性，如通过本文所述的和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所测定。这类用于比对的工具包括BLAST软件包的那些(StephenF.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller和David J.Lipman(1997),"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of protein database search programs",Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。本文中描述了其他工具，尤其在“同一性”的定义中。
BLAST算法中的默认参数包括例如期望阈值：10；字长：28；匹配/错配评分：1、-2；空位成本：线性。任何过滤程序可以应用以及应用针对物种特异性重复序列(例如，智人(Homo sapiens))的选择。
靶向部分
在本发明的一些实施方案中，提供了多核苷酸以表达靶向部分。这些靶向部分包括蛋白质-结合配偶体或在细胞表面上的受体，它们发挥作用以使细胞靶向至特定组织间隙或在体内或在体外与特定部分相互作用。合适的蛋白质-结合配偶体包括但不限于抗体及其功能性片段、支架蛋白或肽。另外，多核苷酸可以用来指导脂质、糖或其他生物部分或生物分子的合成和胞外定位。
多肽文库
在一个实施方案中，多核苷酸可以用来产生多肽文库。这些文库可以源自多核苷酸群体的产生，所述多核苷酸各自含有多种结构设计或化学修饰设计。在这个实施方案中，多核苷酸群体可以包含多种编码的多肽，包括但不限于，抗体或抗体片段、蛋白质结合配偶体、支架蛋白和本文中教授的或本领域已知的其他多肽。在一个实施方案中，多核苷酸可以适于向靶细胞或培养物中直接引入，后者转而可以合成编码的多肽。
在某些实施方案中，可以产生并且测试各自具有不同氨基酸修饰的多种蛋白质变体，以确定就药代动力学、稳定性、生物相容性和/或生物学活性、或生物物理特性如表达水平而言最好的变体。这种文库可以含有10,102,103,104,105,106,107,108,109或超过109种可能的变体(包括但不限于，置换、缺失一个或多个残基和插入一个或多个残基)。
抗微生物多肽和抗病毒多肽
本发明的多核苷酸可以设计成编码一种或多种抗微生物肽(AMP)或抗病毒肽(AVP)。AMP和AVP已经从广泛类型的生物分离并描述，所述生物如，但不限于微生物、无脊椎动物、植物、两栖类、鸟、鱼类和哺乳动物(Wang等人,Nucleic Acids Res.2009；37(数据库专刊):D933-7)。
国际公开号WO2013151666中描述了抗微生物多肽和抗病毒多肽，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，国际公开号WO2013151666第[000189]–[000199]段中描述了抗微生物多肽，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为另一个非限制性例子，国际公开号WO2013151666第[000189]–[000195]段和第[000200]段中描述了抗病毒多肽，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
多核苷酸区域
在一些实施方案中，多核苷酸可以设计成包含按照与其他基于核酸的分子的已知区域或部分相似的方式发挥作用的区域、亚区域或部分。这类区域包括那些在本文中讨论的mRNA区域以及非编码区。非编码区可以在单个核苷的商品，如当该区域是或并入一个或多个细胞毒核苷时的情况。
细胞毒性核苷
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以并入一个或多个细胞毒性核苷。例如，可以将细胞毒性核苷并入多核苷酸如双官能的修饰RNA或mRNA。细胞毒性核苷抗癌药包括但不限于阿糖腺苷、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、(替加氟和尿嘧啶的组合)、替加氟((RS)-5-氟-1-(四氢呋喃-2-基)嘧啶--2,4(1H,3H)-二酮)和6-巯基嘌呤。
作为抗癌药，多种细胞毒性核苷类似物处于临床应用或已经进行临床试验。这类类似物的例子包括但不限于阿糖胞苷，吉西他滨，曲他沙滨，地西他滨，替扎他滨，2′-脱氧-2′-亚甲基胞苷(DMDC)，克拉立滨，氯法拉滨，5-氮杂胞苷，4'-硫代-阿糖胞苷，环丙烯基胞嘧啶和1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)-胞嘧啶。这种化合物的另一个例子是磷酸氟达拉滨。这些化合物可以全身施用并且可以具有细胞毒药物常见的副作用如，但不限于，相对于正在增殖的正常细胞而言对肿瘤细胞的特异性低或无特异性。
本领域中还报告了细胞毒性核苷类似物的许多前药。例子包括但不限于，N4-山嵛酰-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、N4-十八烷基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、N4-棕榈酰-1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶和P-4055(阿糖胞苷5'-反油酸酯)。通常而言，这些前药可以转化成活性药物，主要在肝脏和全身循环中转化，并且在肿瘤组织中显示活性药物的少许选择性释放或无选择性释放。例如，卡培他滨，5'-脱氧-5-氟胞苷的前药(和最终5-氟尿嘧啶)，在肝脏中和肿瘤组织中代谢。一系列含有“生理条件下易水解基团”的卡培他滨类似物已经由Fujiu等人(美国专利号4,966,891)要求保护并且通过引用的方式并入本文。由Fujiu描述的系列包括5'-脱氧-5-氟胞苷的N4烷基和芳烷基氨基甲酸酯及下述意义：这些化合物将在正常生理条件下通过水解过程激活以提供5'-脱氧-5-氟胞苷。
一系列阿糖胞苷N4-氨基甲酸酯已经由Fadl等人报道(Pharmazie.1995,50,382-7，所述文献通过引用方式完整并入本文)，其中化合物设计成在肝脏和血浆中转化为阿糖胞苷。通过引用方式完整并入本文的WO2004/041203公开了吉西他滨的前药，其中一些前药是N4-氨基甲酸酯。这些化合物设计成克服吉西他滨的胃肠道毒性，并且意在从胃肠道吸收完整前药后，通过在肝脏和血浆中水解释放而提供吉西他滨。Nomura等人(BioorgMed.Chem.2003,11,2453-61，所述文献通过引用方式完整并入本文)已经描述了1-(3-C-乙炔基-β-D-核糖-戊呋喃糖基)胞嘧啶的缩醛衍生物，所述衍生物在生物还原时产生需要在酸性条件下进一步水解以产生细胞毒性核苷化合物的中间体。
可以是化疗药的细胞毒性核苷酸还包括但不限于吡唑[3,4-D]-嘧啶、别嘌呤醇、硫唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿昔洛韦、阿糖腺苷、利巴韦林、7-去氮杂-腺苷、7-去氮杂-鸟苷、6-氮杂-尿嘧啶、6-氮杂-胞苷、胸苷核糖核苷酸、5-溴脱氧尿苷、2-氯-嘌呤和肌苷或其组合。
具有非翻译区(UTR)的多核苷酸
本发明的多核苷酸可以包含一个或多个充当或作为非翻译区发挥作用的区域或部分。在多核苷酸设计成编码至少一种目的多肽的情况下，多核苷酸可以包含一个或多个这些非翻译区。
按定义，基因的野生型非翻译区(UTR)转录但是不翻译。在mRNA中，5′UTR始于转录起点位点并延续至起始密码子，但是不包括起始密码子；而3′UTR紧邻终止密码子后开始并延续直至转录终止信号。关于UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面发挥的调节作用，存在日益增长的大量证据。UTR的调节特征可以并入本发明的多核苷酸中以增强分子的稳定性，这仅为其中之一。也可以并入特定特征以确保在转录物被错误引入不期望的器官部位情况下受控地下调转录物。
表1和表2提供了可以在本发明的多核苷酸中利用的示例性UTR列表。表1中显示本发明5′-非翻译区的列表。可以利用5’UTR的变体，其中向末端添加或移除一个或多个核苷酸，包括A、T、C或G。
表1. 5′-非翻译区
表2中显示本发明3′-非翻译区的列表。可以利用3’UTR的变体，其中向末端添加或移除一个或多个核苷酸，包括A、T、C或G。
表2. 3′-非翻译区
5′UTR和翻译起始
天然5′UTR具有在翻译起始中发挥作用的特征。它们携带特征标识如Kozak序列，其中公知所述特征标识参与核糖体启动许多基因翻译的过程。Kozak序列具有共有的CCR(A/G)CCAUGG，其中R是距起始密码子(AUG)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，后接另一个'G'。还已经已知5′UTR形成参与延伸因子结合的二级结构。
通过对常发现于在特定靶器官中大量表达的基因的特征进行工程化，可以增强本发明的多核苷酸的稳定性和蛋白质产生。例如，引入肝脏表达的mRNA(如白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子VII)的5′UTR，可以用来增强核酸分子如多核苷酸在肝细胞系或肝中的表达。同样地，使用来自其他组织特异性mRNA的5′UTR改善在这种组织中的表达对于以下都是可能的：肌肉(MyoD、肌球蛋白、肌红蛋白、肌形成蛋白、力蛋白)，对于内皮细胞(Tie-1、CD36)，对于髓样细胞(C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CD11b、MSR、Fr-1、i-NOS)，对于白细胞(CD45、CD18)，对于脂肪组织(CD36、GLUT4、ACRP30、脂连蛋白)并且对于肺上皮细胞(SP-A/B/C/D)。可用于设计和制造多核苷酸的非翻译区包括但不限于在待决的国际专利申请号PCT/US2014/021522(代理人案号M42)中公开的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
也可以使用其他的非UTR序列作为多核苷酸内部的区域或亚区域。例如，可以将内含子或部分内含子序列并入本发明多核苷酸的区域。并入内含子序列可以增加蛋白质产生以及多核苷酸水平。
特征组合可以纳入侧翼区中并且可以含于其他特征内部。例如，ORF可以旁侧分布有可以含有强Kozak翻译起始信号的5'UTR和/或可以包括用于模仿指导添加聚腺苷酸尾的寡聚(dT)序列的3'UTR。5’UTR可以包含来自相同和/或不同基因的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，如美国专利申请公开号20100293625中描述的5’UTR，所述文献通过引用方式完整并入本文。
共同待决的共有国际专利申请号PCT/US2014/021522(代理人案号M42)提供了一系列可以在本发明的多核苷酸中作为侧翼区利用的示例性UTR。可以利用5’或3’UTR的变体，其中向末端添加或移除一个或多个核苷酸，包括A、T、C或G。
应当理解，来自任何基因的任何UTR都可以并入多核苷酸的区域。另外，可以利用任何已知基因的多个野生型UTR。提供不是野生型区域的变体的人工UTR也处于本发明的范围内。可以将这些UTR或其部分按照与从中选出它们的转录物相同的取向安置或可以在取向或位置上改变。因此，5′或3′UTR可以倒转、缩短、加长、用一种或多种其他5′UTR或3′UTR产生。如本文所用，术语“改变”在它指UTR序列时，意指UTR已经相对于参考序列以某种方式改变。例如，3′或5′UTR可以因如上文教授的取向或位置变化而相对于野生型或天然UTR改变，或可以因纳入额外的核苷酸、核苷酸缺失、核苷酸交换或转位而改变。产生“改变的”UTR(3′或5′)的这些变化中任一变化均包含变体UTR。
在一个实施方案中，可以使用双重、三重或四重UTR，如5′或3′UTR。如本文所用，“双重”UTR是其中两个拷贝的相同UTR以串联或基本上串联方式编码的一种UTR。例如，双重β-珠蛋白3′UTR可以如美国专利公开0100129877中所述那样使用，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
具有样式化UTR(patterned UTR)也处于本发明的范围内。如本文所用，“样式化UTR”是反映重复或交替样式的那些UTR，如ABABAB或AABBAABBAABB或ABCABCABC或其重复1次、2次或超过3次的变体。在这些样式中，每个字母A、B或C代表一个在核苷酸水平不同的UTR。
在一个实施方案中，侧翼区选自其蛋白质共享共同功能、结构、性能特征的转录物家族。例如，目的多肽可以属于在特定细胞、组织中或在发育期间某个时间表达的蛋白家族。来自这些基因之任一者的UTR可以针对相同或不同蛋白家族的任何其他UTR进行交换，以产生新的多核苷酸。如本文所用，“蛋白家族”以最广意义用来指两个或更多个目的多肽的群组，所述多肽共有至少一种功能、结构、特征、定位、来源或表达模式。
在一个实施方案中，侧翼区可以是异源的。
在一个实施方案中，5’非翻译区可以衍生自与3'非翻译区不同的物种。
非翻译区还可以包括翻译增强子元件(TEE)。作为一个非限制性例子，TEE可以包括在通过引用方式完整并入本文的美国申请号20090226470中描述那些和本领域已知的那些。
3′UTR和富AU元件
已知天然或野生型3′UTR具有嵌入它们当中的多段腺苷和尿苷。这些AU丰富特征标识在高翻转率的基因中尤其盛行。基于它们的序列特征和功能特性，AU丰富元件(ARE)可以划分成三个类别(Chen等人,1995)：I类ARE在富U区内含有几个分散的AUUUA基序拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE拥有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚物。含有这种类型ARE的分子包括GM-CSF和TNF-α。III类ARE界定得较不充分。这些U丰富区不含有AUUUA基序。c-Jun和肌形成蛋白是这个类别中两个充分研究的例子。大部分与ARE结合的蛋白质都已知使信去稳定化，而已经记录ELAV家族的成员，最值得注意地是HuR，增加mRNA的稳定性。HuR与全部三个类别的ARE结合。将HuR特异性结合位点工程化至核酸分子的3′UTR中将导致与HuR结合，并且因此导致体内信使的稳定化。
引入、移除或修饰3′UTR AU丰富元件(ARE)可以用来调节本发明多核苷酸的稳定性。当工程化特定多核苷酸时，可以引入一个或多个拷贝的ARE以使得本发明的多核苷酸较不稳定并因而阻止翻译并减少所得蛋白质的产生。同样地，可以鉴定并移除或突变ARE以增加胞内稳定性并且因此增加翻译和所得蛋白质的产生。转染实验可以在相关细胞系中使用本发明的多核苷酸实施，并且可以在转染后的多个时间点测定蛋白质产生。例如，细胞可以用不同的ARE-工程化分子来转染，并且使用针对相关蛋白质的ELISA试剂盒，在转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7日分析产生的蛋白质。
微RNA结合位点
微RNA(或miRNA)是19-25核苷酸长的非编码性RNA，所述非编码性RNA与核酸分子的3′UTR结合，并通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译下调基因表达。本发明的多核苷酸可以包含一个或多个微RNA靶序列、微RNA序列或微RNA种子区。这类序列可以对应于任何已知的微RNA，如在美国公开US2005/0261218和美国公开US2005/0059005中教授的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
微RNA序列包含“种子”区，即在成熟微RNA的位置2-8的区域中的序列，所述序列与miRNA靶序列具有完美的Watson-Crick互补性。微RNA种子区可以包含成熟微RNA的位置2-8或位置2-7。在一些实施方案中，微RNA种子区可以包含7个核苷酸(例如，成熟微RNA的核苷酸2-8)，其中，相应miRNA靶中的种子区互补位点旁侧分布有与微RNA位置1相对的腺嘌呤(A)。在一些实施方案中，微RNA种子区可以包含6个核苷酸(例如，成熟微RNA的核苷酸2-7)，其中，相应miRNA靶中的种子区互补位点旁侧分布有与微RNA位置1相对的腺嘌呤(A)。参见例如，Grimson A,Farh KK,Johnston WK,Garrett-Engele P,Lim LP,Bartel DP；MolCell.2007Jul 6；27(1):91-105；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。微RNA种子区的碱基与靶序列具有完全互补性。通过将微RNA靶序列工程化至本发明的多核苷酸(例如，于3’UTR样区域或其他区域)中，可以导引分子降解或减少翻译，前提是所讨论的微RNA是可获得的。这个过程将减少递送核酸分子时脱靶效应的危害。已经报道了微RNA的鉴定、微RNA靶区和它们在生物学中的表达模式和作用(Bonauer等人,Curr Drug Targets2010 11:943-949；Anand和Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176；Contreras和Rao Leukemia 2012 26:404-413(2011Dec 20.doi:10.1038/leu.2011.356)；Bartel Cell2009 136:215-233；Landgraf等人,Cell,2007 129:1401-1414；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。
例如，如果核酸分子是mRNA并且不意在递送至肝，而是在那里终结，则如果将miR-122(一种在肝脏中丰富的微RNA)的一个或多个靶位点工程化至多核苷酸的3′UTR区中，那么miR-122可以抑制目的基因表达。可以将引入不同微RNA的一个或多个结合位点工程化，以进一步减少多核苷酸的寿命、稳定性和蛋白质翻译。
如本文所用，术语“微RNA位点”指微RNA靶位点或微RNA识别位点，或与微RNA结合或缔合的任何核苷酸序列。应当理解，“结合”可以遵循传统的Watson-Crick杂交规则或可以反映微RNA与靶序列在微RNA位点处或其附近的任何稳定缔合。
相反，为了本发明多核苷酸的目的，可以将微RNA结合位点从它们在其中存在的序列工程化去掉(即移除)，以增加特定组织中的蛋白质表达。例如，可以移除miR-122结合位点以改善肝脏中的蛋白质表达。可以通过引入或移除一个或几个微RNA结合位点，实现对多个组织中表达的调节。
已知微RNA在其中调节mRNA并因而调节蛋白质表达的组织的例子包括但不限于肝(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、髓样细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-1d、miR-149)、肾(miR-192、miR-194、miR-204)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。微RNA还可以调节复合物生物学过程，如血管生成(miR-132)(Anand和Cheresh Curr Opin Hematol201118：171-176；所述文献通过引用方式完整并入本文)。
可用于本发明中的表达谱、微RNA和细胞系包括在例如国际专利公开号WO2014113089(代理人案号M37)和WO2014081507(代理人案号M39)中教授的那些，所述文献的每一篇的内容通过引的用方式完整并入本文。
在本发明的多核苷酸中，可以移除或引入参与这类过程的微RNA的结合位点，以便相对于生物相关细胞类型或相对于相关生物学过程的环境调节多核苷酸的表达。一系列微RNA、miR序列和miR结合位点在下表中列出：2013年1月17日提交的美国临时申请号61/753,661的表9、2013年1月18日提交的美国临时申请号61/754,159的表9和2013年1月31日提交的美国临时申请号61/758,921的表7，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
列出了微RNA驱动组织特异性或疾病特异性基因表达的用途的例子(Getner andNaldini,Tissue Antigens.2012,80:393-403；所述文献通过引用方式完整并入本文)。此外，微RNA种子位点可以并入mRNA以减少在某些细胞中的表达，这导致生物学改善。这个的例子是将miR-142位点并入表达UGT1A1的慢病毒载体。miR-142种子位点的存在减少了造血细胞中的表达，并且因此减少了在抗原呈递细胞中的表达，导致不存在针对病毒表达的UGT1A1的免疫反应(Schmitt等人,Gastroenterology 2010；139:999-1007；Gonzalez-Asequinolaza等人,Gastroenterology 2010,139:726-729：726-729；二者均通过引用方式完整并入本文)。miR-142位点并入修饰的mRNA不仅能减少编码的蛋白质在造血细胞中的表达，还能减少或消除针对mRNA所编码蛋白质的免疫反应。(一个或多个)miR-142种子位点并入mRNA在治疗完全蛋白质缺陷患者(UGT1A1I型、LDLR缺陷的患者，CRIM阴性Pompe患者等)的情况下是重要的。
最后，通过理解微RNA在不同细胞类型中的表达模式，可以工程化多核苷酸用于特定细胞类型中或仅在特定生物学条件下更为靶向的表达。通过引入组织特异性微RNA结合位点，可以设计出最适于某组织中或某生物学条件背景下蛋白质表达的多核苷酸。
转染实验可以在相关细胞系中使用工程化多核苷酸实施，并且可以在转染后的多个时间点测定蛋白质产生。例如，细胞可以用不同的微RNA结合位点-工程化多核苷酸转染，并且通过使用针对相关蛋白质的ELISA试剂盒，分析转染后6小时、12小时、24小时、48小时、72小时和7日产生的蛋白质。也可以使用微RNA结合位点工程化的分子，实施体内实验，以检验所制作的多核苷酸的组织特异性表达的变化。
在一个实施方案中，多核苷酸可以包含至少一个miR序列或其变体。待决国际专利申请号PCT/US13/62531(M037.20)的表9中描述了用于多核苷酸中的miR序列非穷尽列表，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，多核苷酸可以包含至少一个结合并抑制HMG-CoA还原酶或PCSK9的非翻译区的miR序列。结合并抑制HMG-CoA还原酶或PCSK9的非翻译区的miR序列的非限制性例子在国际专利公开号WO2013154766中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，多核苷酸可以包含含有miR-520d-5p、miR-224或其变体的miR序列(参见例如，国际专利公开号WO2013154766，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。作为另一个非限制性例子，多核苷酸可以包含含有或编码国际专利公开号WO2013154766的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:11的miR序列，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为又一个非限制性例子，多核苷酸可以包含含有miR-224或其变体的miR序列(参见例如，国际专利公开号WO2013154766，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。作为另一个非限制性例子，多核苷酸可以包含含有miR-520d-5p和miR-224或其变体的miR序列(参见例如，国际专利公开号WO2013154766，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
具有5′帽的区域
天然mRNA的5′帽结构参与核输出、增加mRNA稳定性，并且结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，所述帽结合蛋白通过CBP与多聚腺苷酸结合蛋白缔合以形成成熟环状mRNA种类，负责细胞中的mRNA稳定性和翻译能力。该帽进一步辅助在mRNA剪接期间移除5′近端内含子。
内源mRNA分子可以被5′-端加帽，在mRNA分子的末端鸟苷帽残基和5′-末端转录的有义核苷酸之间产生5′-ppp-5′-三磷酸键。这种5′-鸟苷酰帽随后可以被甲基化，以产生N7-甲基-鸟苷酸残基。mRNA 5'末端的末端核苷酸和/或反末端转录的核苷酸的核糖可以还任选地被2′-O-甲基化。通过水解和切割鸟苷酸帽结构所致的5′-脱帽作用可以指引核酸分子(如mRNA分子)降解。
在一些实施方案中，多核苷酸可以设计成并入帽部分。修饰本发明的多核苷酸可以产生不可水解的帽结构，这阻止脱帽并且因此增加mRNA半寿期。因为帽结构水解需要切割5′-ppp-5′磷酸二酯键，所以可以在加帽反应期间使用修饰的核苷酸。例如，根据制造商的说明书，来自New England Biolabs(Ipswich，MA)的痘苗病毒加帽酶可以随α-硫代-鸟苷核苷酸一起使用，以在5′-ppp-5′帽中产生硫代磷酸键。可以使用额外的修饰的鸟苷核苷酸如α-甲基-膦酸酯和硒-磷酸酯核苷酸。
额外的修饰包括但不限于，在糖环的2′-羟基上(如上文提到的)多核苷酸的5′-末端和/或5′-反末端核苷酸的核糖的2′-O-甲基化。多个不同5′-帽结构可以用来产生核酸分子(如作为mRNA分子发挥作用的多核苷酸)的5′-帽。
帽类似物(本文中也称作合成性帽类似物)、化学帽、化学帽类似物或结构性或功能性帽类似物，与天然(即内源、野生型或生理学)5′-帽在化学结构上不同，同时保留帽功能。帽类似物可以是化学地(即非酶促地)或酶促地合成和/或与本发明的多核苷酸连接。
例如，抗反转帽类似物(ARCA)帽含有由5′-5′-三磷酸基团连接的两个鸟嘌呤，其中一个鸟嘌呤含有N7甲基以及3′-O-甲基(即，N7,3′-O-二甲基-鸟苷-5′-三磷酸-5′-鸟苷(m7G-3′mppp-G；其可以等同地命名为3′O-Me-m7G(5')ppp(5')G)。另一个未修饰的鸟嘌呤的3′-O原子与加帽多核苷酸的5′-末端核苷酸连接。N7-和3′-O-甲基化的鸟嘌呤提供了加帽多核苷酸的末端部。
另一个示例性帽是mCAP，其类似于ARCA，但是在鸟苷上具有2′-O-甲基(即，N7,2′-O-二甲基-鸟苷-5′-三磷酸-5′-鸟苷，m7Gm-ppp-G)。
在一个实施方案中，帽是二核苷酸帽类似物。作为一个非限制性例子，二核苷酸帽类似物可以在不同磷酸酯位置用硼烷磷酸酯基团或硒代磷酸酯基团修饰，如美国专利号US8,519,110中描述的二核苷酸帽类似物，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，帽是本领域已知和/或本文所述的N7-(4-氯苯氧乙基)取代的二核苷酸形式的帽类似物。N7-(4-氯苯氧乙基)取代的二核苷酸形式的帽类似物的非限制性例子包括a N7-(4-氯苯氧乙基)-G(5’)ppp(5’)G和N7-(4-氯苯氧乙基)-m3’-OG(5’)ppp(5’)G帽类似物(参见例如，Kore等人,Bioorganic&Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574中描述的多种帽类似物和合成帽类似物的方法；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。在另一个实施方案中，本发明的帽类似物是4-氯/溴苯氧乙基类似物。
尽管帽类似物允许在体外转录反应中对核苷酸或其区域伴随加帽，但是至多20％的转录物可以保持未加帽。这种差异以及帽类似物与细胞内源转录机器产生的核酸的内源5′-帽结构的结构性差异可以导致减低的翻译能力和降低的细胞稳定性。
本发明的多核苷酸也可以在制造(无论IVT或化学合成)后使用酶加帽，以产生更真实的5′-帽结构。如本文所用，短语“更真实”指在结构上或功能上严格反映或模拟内源或野生型特征的特征。即，与现有技术的合成性特征或类似物等相比，“更真实的”特征更好地代表了内源、野生型、天然或生理学细胞功能和/或结构，或在一个或多个方面优于相应内源、野生型，天然或生理特征。更真实的本发明5′帽结构的非限制性例子是与本领域已知的合性5′帽结构(或与野生型，天然或生理学5′帽结构)相比，其帽结合蛋白结合作用增强、半寿期增加、5′核酸内切酶敏感性降低和/或5′脱帽降低，这仅为其中之一。例如，重组痘苗病毒加帽酶和重组2′-O-甲基转移酶可以在多核苷酸的5′-末端核苷酸和鸟嘌呤帽核苷酸之间产生规范的5′-5′-三磷酸键，其中帽鸟嘌呤含有N7甲基化，mRNA的5′-末端核苷酸含有2′-O-甲基。这种结构被称作帽1结构。例如与本领域已知的其他5′帽类似物结构相比，这种帽导致更高的翻译能力和细胞稳定性以及减少的细胞促炎性细胞因子活化作用。帽结构包括但不限于7mG(5')ppp(5')N、pN2p(帽0)、7mG(5')ppp(5')NlmpNp(帽1)和7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp(帽2)。
作为一个非限制性例子，制造后的嵌合多核苷酸加帽可以更高效，因为几乎100％的嵌合多核苷酸可以加帽。相比之下，帽类似物在体外转录反应过程中连接至嵌合多核苷酸时大约80％。
根据本发明，5′末端帽可以包括内源帽或帽类似物。根据本发明，5′末端帽可以包含鸟嘌呤类似物。可用的鸟嘌呤类似物包括但不限于肌苷、N1-甲基-鸟苷、2′氟-鸟苷、7-去氮杂-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
病毒序列
额外的病毒序列如，但不限于，大麦黄矮病毒(BYDV-PAV)、Jaagsiekte羊逆转录病毒(JSRV)和/或地方性鼻内肿瘤病毒(参见例如，国际公开号WO2012129648；所述文献通过引用方式完整并入本文)的翻译增强序列，可以工程化并插入本发明的多核苷酸中，并且可以刺激构建体体外和体内翻译。转染实验可以在相关细胞系中实施，并且可以在转染后12小时、24小时、48小时、72小时和7日通过ELISA分析蛋白质产生。
IRES序列
进一步，提供了可以含有内部核糖体进入位点(IRES)的多核苷酸。最初作为Picoran病毒RNA的特征鉴定的IRES在不存在5′帽结构情况下启动蛋白质合成中发挥重要作用。IRES可以充当单独的核糖体结合位点，或可以充当mRNA的多个核糖体结合位点之一。含有多于一个功能性核糖体结合位点的多核苷酸可以编码由核糖体独立翻译的几种肽或多肽(“多顺反子核酸分子”)。当多核苷酸配备IRES时，进一步任选地提供第二可翻译区域。根据本发明可以使用的IRES序列的例子包括而不限于来自picorna病毒(例如FMDV)、害虫病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒((CrPV)的那些。
聚腺苷酸尾
在RNA加工期间，腺嘌呤核苷酸长链(聚腺苷酸尾)可以添加至多核苷酸如mRNA分子，以增加稳定性。转录后转录物3’末端旋即可以被切割以释放3'羟基。随后聚腺苷酸聚合酶向RNA添加腺嘌呤核苷酸链。该过程，称作多聚腺苷化，添加长度可以例如在大约80个至大约250个残基之间、包括大约80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个残基长度的聚腺苷酸尾。
也可以在构建体从胞核输出后添加聚腺苷酸尾。
根据本发明，可以在聚腺苷酸尾上并入末端基团用于稳定。本发明的多核苷酸可以包括des-3'羟基尾。它们还可以包括如Junjie Li等人教授的结构性部分或2’-O甲基修饰(Current Biology,第15卷,1501–1507,2005年8月23日，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
本发明的多核苷酸可以设计成编码具有可选聚腺苷酸尾结构的转录物，包括组蛋白mRNA。根据Norbury，还已经在人复制依赖性组蛋白mRNA上检测到末端尿苷化。认为这些mRNA的翻转(turnover)对于染色体DNA复制完成或抑制后防止潜在毒性组蛋白的堆积是重要的。这些mRNA区别在于它们缺少3′聚腺苷酸尾，其功能反而由稳定的茎环结构及其同源茎环结合蛋白(SLBP)承担；后者对聚腺苷酸化mRNA执行与PABP相同的功能”(Norbury,“Cytoplasmic RNA:a case of the tail wagging the dog,”Nature Reviews MolecularCell Biology；AOP，2013年8月29日在线发表；doi:10.1038/nrm3645)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
独特的聚腺苷酸尾长度为本发明的多核苷酸提供了某些优点。
通常，当存在时，聚腺苷酸尾的长度是大于30个核苷酸长度。在另一个实施方案中，聚腺苷酸尾具有大于35个核苷酸长度(例如，至少或大于约35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000个核苷酸)。在一些实施方案中，多核苷酸或其区域包括约30个至约3,000个核苷酸(例如，30至50个、30至100个、30至250个、30至500个、30至750个、30至1,000个、30至1,500个、30至2,000个、30至2,500个、50至100个、50至250个、50至500个、50至750个、50至1,000个、50至1,500个、50至2,000个、50至2,500个、50至3,000个、100至500个、100至750个、100至1,000个、100至1,500个、100至2,000个、100至2,500个、100至3,000个、500至750个、500至1,000个、500至1,500个、500至2,000个、500至2,500个、500至3,000个、1,000至1,500个、1,000至2,000个、1,000至2,500个、1,000至3,000个、1,500至2,000个、1,500至2,500个、1,500至3,000个、2,000至3,000个、2,000至2,500个和2,500至3,000个核苷酸)。
在一个实施方案中，相对于整个多核苷酸的长度或多核苷酸特定区域的长度，设计聚腺苷酸尾。这种设计可以基于编码区长度、特定特征或区域的长度或基于由多核苷酸表达的终产物的长度。
在这种情况下，聚腺苷酸尾可以在长度上比多核苷酸或其特征长10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90或100％。也可以设计聚腺苷酸尾作为其所属的多核苷酸的一部分。在这种情况下，聚腺苷酸尾可以是构建体的总长度、构建体区域或构建体减去聚腺苷酸尾的总长度的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。进一步，工程化的结合位点以及缀合聚腺苷酸结合蛋白的多核苷酸可以增强表达。
可以使用在聚腺苷酸尾的3′末端处修饰的核苷酸，将多个不同的多核苷酸通过3′-端借助PABP(聚腺苷酸结合蛋白)连接在一起。转染实验可以在相关细胞系中实施，并且可以在转染后12小时、24小时、48小时、72小时和7日通过ELISA分析蛋白质的产生。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸设计成包含聚A-G四重体区。G-四重体是一种氢键结合的四鸟嘌呤核苷酸环状阵列，其可以由DNA和RNA中的富G序列形成。在这个实施方案中，G-四重体在聚腺苷酸尾末端并入。在各种时间点，分析所得到的多核苷酸的稳定性、蛋白质产生和其他参数，包括半寿期。已经发现聚A-G四重体导致来自mRNA的蛋白质产生，其等同于仅使用120个核苷酸的聚腺苷酸尾时所见的蛋白质产生的至少75％。
起始密码子区域
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸可以具有类似于或功能上类似起始密码子区域的区域。
在一个实施方案中，多核苷酸的翻译可以在不是起始密码子AUG的密码子上起始。多核苷酸的翻译可以在可选的起始密码子上起始，所述可选起始密码子例如是但不限于ACG，AGG，AAG，CTG/CUG，GTG/GUG，ATA/AUA，ATT/AUU，TTG/UUG(参见Touriol等人,Biologyof the Cell 95(2003)169-178以及Matsuda和Mauro PLoS ONE,2010 5:11；所述每份文献的内容通过引用方式完整并入本文)。作为一个非限制性例子，多核苷酸的翻译可以在可选的起始密码子ACG上起始。作为另一个非限制性例子，多核苷酸翻译在可选的起始密码子CTG或CUG上起始。作为又一个非限制性例子，多核苷酸翻译在可选的起始密码子GTG或GUG上起始。
已知在起始翻译的密码子如但不限于起始密码子或可选的起始密码子侧翼分布的核苷酸影响翻译效率、多核苷酸的长度和/或结构。(参见例如，Matsuda和Mauro PLoSONE,2010 5:11；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。掩蔽在起始翻译的密码子侧翼分布的核苷酸可以用来改变翻译起始位置、翻译效率、多核苷酸的长度和/或结构。
在一个实施方案中，掩蔽物可以靠近起始密码子或可选的起始密码子使用，以掩蔽或隐藏密码子，从而减少在掩蔽的起始密码子或可选的起始密码子处翻译起始的概率。掩蔽物的非限制性例子包括反义锁核酸(LNA)多核苷酸和外显子-连接蛋白复合物(EJC)(参见例如，描述掩蔽物LNA多核苷酸和EJC的Matsuda和Mauro(PLoS ONE,2010 5:11)；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在另一个实施方案中，掩蔽物可以用来掩蔽多核苷酸的起始密码子，以增加翻译将在可选起始密码子上起始的可能性。
在一个实施方案中，掩蔽物可以用来掩蔽第一起始密码子或可选起始密码子，以增加翻译在所掩蔽的起始密码子或可选起始密码子下游的起始密码子或可选起始密码子上起始的机会。
在一个实施方案中，起始密码子或可选起始密码子可以位于miR结合位点的完全互补物内部。与掩蔽物相似，miR结合位点的完全互补物可以帮助控制多核苷酸的翻译、长度和/或结构。作为一个非限制性例子，起始密码子或可选起始密码子可以位于miR-122结合位点的完全互补物中间。起始密码子或可选起始密码子可以位于第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸、第四核苷酸、第五核苷酸、第六核苷酸、第七核苷酸、第八核苷酸、第九核苷酸、第十核苷酸、第十一核苷酸、第十二核苷酸、第十三核苷酸、第十四核苷酸、第十五核苷酸、第十六核苷酸、第十七核苷酸、第十八核苷酸、第十九核苷酸、第二十核苷酸或第二十一核苷酸之后。
在另一个实施方案中，可以从多核苷酸序列移除多核苷酸的起始密码子，以使多核苷酸的翻译在不是起始密码子AUG的密码子上开始。多核苷酸的翻译可以在所移除的起始密码子之后的密码子上或在下游起始密码子或可选起始密码子上开始。在非限制性例子中，将起始密码子ATG或AUG作为多核苷酸序列的前3个核苷酸移除，以使翻译在下游起始密码子或可选起始密码子上起始。其中起始密码子被移除的多核苷酸序列还可以包含下游起始密码子和/或可选起始密码子的至少一个掩蔽物，以控制或尝试控制翻译起始、多核苷酸的长度和/或多核苷酸的结构。
终止密码子区域
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以在3'非翻译区(UTR)之前包含至少两个终止密码子。终止密码子可以选自TGA、TAA和TAG。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸包括终止密码子TGA和一个额外的终止密码子。在又一个实施方案中，额外的终止密码子可以是TAA。在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含三个终止密码子。
信号序列
多核苷酸还可以编码促进多肽运输至有治疗意义的部位的额外特征。辅助蛋白质运输的这样一个特征是信号序列。如本文所用，“信号序列”或“信号肽”分别是分别在编码区或所编码多肽的5′(或N末端)并入的长度约9至200个核苷酸(3-60个氨基酸)的多核苷酸或多肽。添加这些序列导致编码的多肽通过一个或多个分泌途径运输到内质网。在蛋白质被运后，一些信号肽由信号肽酶从蛋白质切下。
可以在本发明中利用的额外信号序列包括，例如在数据库，如http://www.signalpeptide.de/或http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/处找到的那些数据库中教授的那些。在美国专利8,124,379；7,413,875和7,385,034中描述的那些信号序列也处于本发明的范围内并且所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
靶选择
根据本发明，多核苷酸可至少包含编码至少一种目的多肽的连接的核苷的第一区域。下表3中列出本发明的目的多肽或“靶”。除编码目的多肽的基因的名称和描述之外，表3中还显示ENSEMBL转录物ID(ENST)、ENSEMBL蛋白质ID(ENSP)和当可获得时的优化序列ID(OPTSEQ ID)。对于任何特定基因，可能存在一种或多种变体或同工型。在它们存在的情况下，也在该表中显示它们。本领域技术人员将理解，在该表中公开了潜在侧翼区。在每种ENST转录物中，这些侧翼区在ORF或编码区的5′(上游)或3′(下游)编码。通过教授ENSP序列，确定并具体地公开了编码区。因此，所教授的在编码蛋白质的序列旁侧分布的序列视为侧翼区。通过利用一个或多个可获得的数据库或算法，还可能进一步表征5′和3′侧翼区。数据库注释了在ENST转录物的侧翼区中所含的特征，并且这些数据库是本领域可获得的。
表3.靶
表3显示了人LDLR蛋白序列，其包括包含至少一个突变的LDLR蛋白序列(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)，和相应的DNA构建体和/或mRNA构建体。
蛋白质切割信号和位点
在一个实施方案中，本发明的多肽可以包括至少一个蛋白质切割信号，所述蛋白质切割信号含有至少一个蛋白质切割位点。蛋白质切割位点可以位于N末端、C末端、N末端和C末端之间的任何空间，如，但不限于N末端和C末端之间的半途、N末端和中途点之间、在中途点和C末端之间及其组合。
本发明的多肽可以包括，但不限于前蛋白转化酶(或激素原转化酶)、凝血酶或因子Xa蛋白质切割信号。前蛋白转化酶是一个9种蛋白酶的家族，包含7种与酵母kexin相关的碱性氨基酸特异性枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，称作激素原转化酶1/3(PC1/3)、PC2、弗林蛋白酶(furin)、PC4、PC5/6，配对碱性氨基酸切割酶4(PACE4)和PC7，以及两种在非碱性残基处切割的其他枯草杆菌酶，称作枯草杆菌蛋白酶kexin同工酶1(SKI-1)和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9(PCSK9)。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以可以如此工程化，从而多核苷酸含有至少一个编码的蛋白质切割信号。所编码的蛋白质切割信号可以位于任何区域，所述区域包括但不限于起始密码子之前、起始密码子之后、编码区之前、编码区内部，如，但不限于编码区中的半途、在起始密码子和半路点之间、在半路点和终止密码子之间、编码区后后，终止密码子之前、在两个终止密码子之间、终止密码子之后及其组合。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以包括至少一个编码的蛋白质切割信号，所述编码的蛋白质切割信号含有至少一个蛋白质切割位点。编码的蛋白质切割信号可以包括，但不限于前蛋白转化酶(或激素原转化酶)、凝血酶和/或因子Xa蛋白质裂解信号。
作为一个非限制性例子，通过引用的方式完整并入本文的美国专利号7,374,930和美国公开号20090227660使用弗林蛋白酶切割位点，以切割来自细胞高尔基体的表达产物中GLP-1的N末端甲硫氨酸。在一个实施方案中，本发明的多肽包含至少一个蛋白质切割信号和/或位点，条件是该多肽不是GLP-1。
插入和置换
在一个实施方案中，通过插入至少一个区域的和/或一段的具有相同碱基的核苷酸，可以替换多核苷酸的5’UTR。所述核苷酸区域和/或段可以包含但不限于至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个核苷酸并且所述核苷酸可以是天然和/或非天然的。作为一个非限制性例子，核苷酸群可以包含5-8个腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、一段在本文公开的任何其他核苷酸和/或其组合。
在一个实施方案中，可以通过插入至少两个区域的和/或至少两段的具有两种不同碱基(如，但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、本文公开的任何其他核苷酸和/或其组合)的核苷酸，替换多核苷酸的5’UTR。例如，可以通过插入5-8个腺嘌呤碱基随后插入5-8个胞嘧啶碱基，替换5’UTR。在另一个例子中，可以通过插入5-8个胞嘧啶碱基随后插入5-8个腺嘌呤碱基，替换5’UTR。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在可由RNA聚合酶识别的转录起点位点下游包括至少一个置换和/或插入。作为一个非限制性例子，通过在紧邻转录起点位点下游(如，但不限于，+1至+6)的区域中置换至少一个核酸，可以在转录起点位点下游出现至少一个置换和/或插入。紧邻转录起点位点下游的核苷酸区域的变化可能影响起始速率，增加核苷酸三磷酸(NTP)反应表观常数值，并增加短转录物从转录复合体解离，从而修复初始转录(Brieba等人,Biochemistry(2002)41:5144-5149；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。修饰、置换和/或插入至少一个核苷可以造成序列的沉默突变或可以在氨基酸序列中造成突变。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在转录起点位点下游包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12或至少13个鸟嘌呤碱基置换。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在紧邻转录起点位点下游的区域中包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6个鸟嘌呤碱基置换。作为一个非限制性例子，如果该区域中的核苷酸是GGGAGA，则鸟嘌呤碱基可以被至少1、至少2、至少3或至少4个腺嘌呤核苷酸置换。在另一个非限制性例子中，如果该区域中的核苷酸是GGGAGA，则鸟嘌呤碱基可以被至少1、至少2、至少3或至少4个胞嘧啶碱基置换。在另一个非限制性例子中，如果该区域中的核苷酸是GGGAGA，则鸟嘌呤碱基可以被至少1、至少2、至少3或至少4个胸腺嘧啶和/或本文所述的任何核苷酸置换。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在起始密码子上游包括至少一个置换和/或插入。出于清楚目的，本领域技术人员将领会，起始密码子是蛋白质编码区的第一个密码子，而转录起点位点是转录在此开始的位点。多核苷酸可以包括，但不限于至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8个核苷酸碱基置换和/或插入。可以在起始密码子上游的1、至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个位置插入或置换核苷酸碱基。插入和/或置换的核苷酸可以是相同的碱基(例如，全部是A或全部是C或全部是T或全部是G)、两种不同的碱基(例如，A和C、A和T或C和T)、三种不同的碱基(例如，A、C和T或A、C和T)或至少四种不同的碱基。作为一个非限制性例子，多核苷酸中编码区上游的鸟嘌呤碱基可以用腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或本文所述的任何核苷酸置换。在另一个非限制性例子中，可以设计多核苷酸中的鸟嘌呤碱基置换，从而在转录起点位点下游的区域中和在起始密码子之前留下一个鸟嘌呤碱基(参见Esvelt等人,Nature(2011)472(7344):499-503；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。作为一个非限制性例子，可以在转录起点位点下游但是起始密码子上游的1个位置处插入至少5个核苷酸，并且所述至少5个核苷酸可以是相同的碱基类型。
并入转录后控制调节物
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以包括至少一种转录后控制调节物。这些转录后控制调节物可以是，但不限于，小分子、化合物和调节序列。作为一个非限制性例子，可以使用PTC Therapeutics Inc.(South Plainfield,NJ)鉴定的小分子，使用其GEMSTM(通过小分子调节基因表达)筛选技术，实现转录后控制。
转录后控制调节物可以是通过国际公开号WO2006022712详述的方法或国际公开号WO2006022712描述的基因表达调节物筛选的基因表达调节物，所述文献通过引用方式完整并入本文。鉴定参与翻译控制的RNA调节序列的方法在国际公开号WO2004067728中描述，所述文献通过引用方式完整并入本文；鉴定调节非翻译区依赖性基因表达的化合物的方法在国际公开号WO2004065561中描述，所述文献通过引用方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以包括位于本发明多核苷酸的5’和/或3'非翻译区的至少一种转录后控制调节物。
在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以包括至少一种转录后控制调节物，以调节过早翻译终止。转录后控制调节物可以是在下述文献中描述的化合物或通过下述文献中略述的方法找到的化合物：国际公开号WO2004010106、WO2006044456、WO2006044682、WO2006044503和WO2006044505，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，化合物可以与28S核糖体RNA的区域结合，以调节过早翻译终止(参见例如，通过引用方式完整并入本文的WO2004010106)。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以包括至少一种转录后控制调节物，以改变蛋白质表达。作为一个非限制性例子，通过在下述文献中描述的化合物或通过下述文献中描述的方法找到的化合物，可以调节VEGF的表达：国际公开号WO2005118857、WO2006065480、WO2006065479和WO2006058088，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
本发明的多核苷酸可以包括至少一种转录后控制调节物，以控制翻译。在一个实施方案中，转录后控制调节物可以是RNA调节序列。作为一个非限制性例子，RNA调节序列可以通过国际公开号WO2006071903中描述的方法鉴定，所述文献通过引用方式完整并入本文。
II.多核苷酸的设计、合成和定量
设计-密码子优化
多核苷酸、它们的区域或部分或亚区域可以经密码子优化。密码子优化方法是本领域已知的并且可以用于实现几种目的中的一个或多个目的。这些目的包括匹配靶生物和宿主生物中的密码子频率以确保正确折叠，匹配偏爱GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构，最大程度减少可能破坏基因构建或表达的串联重复序列密码子或碱基列，定制转录性和翻译性控制区，插入或移除蛋白质转运序列，在编码的蛋白质中移除/添加翻译后修饰位点(例如糖基化位点)，添加、移除或改组蛋白质结构域，插入或删除限制性位点，修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点，以调节翻译速率从而使蛋白质的各种结构域正确折叠或者减少或消除多核苷酸内部带来问题的二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域已知的，其非限制性例子包括来自GeneArt(Life Technologies)的服务、DNA2.0(Menlo ParkCA)和/或专利方法。在一个实施方案中，使用优化算法优化ORF序列。表4中给出每种氨基酸的密码子选择。
表4.密码子选择
在本发明的一些实施方案中可以视为有益的特征，可以由多核苷酸的多个区域编码并且这类区域可以在编码多肽的区域的上游(5’)或下游(3’)。在蛋白质编码区或开放阅读框(ORF)的密码子优化过程前和/或之后，可以将这些区域并入多核苷酸。不要求多核苷酸含有5′和3′侧翼区两者。这类特征的例子包括但不限于非翻译区(UTR)、Kozak序列、寡聚(dT)序列和可检测标签，并且可以包括多个可以由Xba I识别的克隆位点。
在一些实施方案中，可以提供5′UTR和/或3′UTR区作为侧翼区。多个5′或3′UTR可以纳入侧翼区中并且可以具有相同或不同的序列。侧翼区的任何部分(包含无)，可以经密码子优化，并且任一个部分可以在密码子优化之前和/或在之后独立地含有一种或多种不同结构性或化学性修饰。
在优化后(如果需要)，将多核苷酸组分重构并转化入载体，如但不限于质粒、病毒、粘粒和人工染色体。例如，优化的多核苷酸可以重构并转化入其中通过本文所述的方法而存在高拷贝质粒样结构或染色体结构的化学感受态大肠杆菌、酵母、脉孢菌(neurospora)、玉米、果蝇等。
合成的多核苷酸和它们的核酸类似物在探索和研究生物化学过程中发挥重要作用。已经开发各种酶辅助的方法和基于化学的方法以合成多核苷酸和核酸。
酶促方法包括使用RNA聚合酶合成本发明多核苷酸的体外转录法。用于转录的酶促方法和RNA聚合酶在国际专利申请号PCT/US2014/53907中(如在第[000276]-[000297]段中)描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
固相化学合成可以用来制造本文所述的多核苷酸或其部分。制造本文所述的多核苷酸的固相化学合成法在国际专利申请号PCT/US2014/53907中(如在第[000298]-[000307]段)描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
液相化学合成法可以用来制造本文所述的多核苷酸或其部分。制造本文所述的多核苷酸的液相化学合成法在国际专利申请号PCT/US2014/53907中(如在第[000308]段中)描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
不同合成方法的组合可以用来制造本文所述的多核苷酸或其部分。这些组合在国际专利申请号PCT/US2014/53907中(如在第[000309]–[000312]段中)描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
小区域合成法可以用于本发明多核苷酸的区域或亚区域。这些合成方法在国际专利申请号PCT/US2014/53907中(如在第[000313]–[000314]段中)描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
多核苷酸区域或亚区域的连接可以用来制备本文所述的多核苷酸。这些连接方法在国际专利申请号PCT/US2014/53907中(如在第[000315]–[000322]段中)描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
修饰的和缀合的多核苷酸
非天然的修饰的核苷酸可以在链合成期间或链合成后向多核苷酸或核酸引入，以实现所需的功能或特性。修饰可以在核苷酸间键、嘌呤碱基或嘧啶碱基或糖上。修饰可以在链末端或链中任何其他地方用化学合成或用聚合酶引入。例如，己糖醇核酸(HNA)具有核酸酶抗性并且提供与RNA的强烈杂交。已经构建了在两个密码子中具有己糖醇残基的短信使RNA(mRNA)(Lavrik等人,Biochemistry,40,11777-11784(2001))，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。也已经研究了包含旁侧分布有5’和3’HNA序列的硫代磷酸中央序列的嵌合HNA缺口聚物寡核苷酸的反义效果(参见例如，Kang等人,Nucleic AcidsResearch,vol.32(4),4411-4419(2004)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。包含6元环的修饰核苷酸的制备及其在RNA干扰、反义疗法或其他应用中的用途在美国专利申请号2008/0261905、美国专利申请号2010/0009865和Herdewijn等人的PCT申请号WO97/30064中公开；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文)。修饰的核酸及其合成在共同待决国际专利公开号WO2013052523(代理人案号M09)中公开，所述文献的内容通过引用的方式完整地并入本文。修饰的多核苷酸的合成和策略由Verma和Eckstein在Annual Review of Biochemistry,vol.76,99-134(1998)中综述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
酶促法或化学连接法可以用来将多核苷酸或它们的区域与不同功能性区段(block)(如荧光标记物、液体、纳米粒子、递送剂等)缀合。多核苷酸和修饰的多核苷酸的缀合物由Goodchild在Bioconjugate Chemistry,vol.1(3),165-187(1990)中综述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。Vinayak等人的美国专利号6,835,827和美国专利号6,525,183(所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文)教授了使用标记的固相支持物合成标记的寡核苷酸。
定量
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以在外来体中定量或当衍生自一种或多种体液时定量。本文所用“体液”包含外周血、血清、血浆、腹水、尿、脑脊液(CSF)、痰(sputum)、唾液(saliva)、骨髓、滑液、眼房水、羊水、耵聍、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、尿道球腺液或预射精液、汗、粪尿、毛发、泪、囊肿液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺抽吸物、囊胚腔液和脐带血。可选地，外来体可以从选自肺、心脏、胰、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结肠、乳腺、前列腺、脑、食道、肝和胎盘的器官提取。
在外来体定量方法中，从受试者获得不多于2mL样品并且通过大小排阻层析、密度梯度离心、差异性离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合分离外来体。在分析中，多核苷酸的水平或浓度可以是所施用构建体的表达水平、存在、不存在、截短或改变。有利的是将该水平与一个或多个临床表型或与人类疾病生物标记物的测定法关联。可以使用构建体特异性探针、细胞测量术、qRT-PCR，实时PCR、PCR、流式细胞术、电泳、质谱法或其组合进行该测定法，同时可以使用免疫组织化学方法如酶联免疫吸附测定(ELISA)方法分离外来体。也可以通过大小排阻层析、密度梯度离心、差异性离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合外分离切体。
这些方法使研究者能够实时监测剩余或已递送的多核苷酸的水平。因为本发明的多核苷酸因结构性或化学性修饰而与内源形式不同，所以这是可能的。
在一个实施方案中，多核苷酸可以使用如，但不限于紫外可见光光谱法(UV/Vis)的方法定量。UV/Vis光谱仪的非限制性例子是光谱仪(ThermoFisher,Waltham,MA)。可以分析定量的多核苷酸，以确定多核苷酸是否具有正确大小，检查多核苷酸是否出现降解。可以通过多种方法检查多核苷酸的降解，所述方法是例如但不限于琼脂糖凝胶电泳，基于HPLC的纯化方法，如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)、液相色谱-质谱(LCMS)、毛细管电泳法(CE)和毛细管凝胶电泳(CGE)。
纯化
本文所述的多核苷酸的纯化可以包括，但不限于，多核苷酸净化(clean-up)、质量保证和质量控制。净化可以通过本领域已知的方法进行，所述方法例如是，但不限于珠(Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA)、聚-T珠、LNATM寡聚物-T捕获探针(Inc,Vedbaek,丹麦)或基于HPLC的纯化方法，如，但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)。术语“纯化”在相对于多核苷酸使用时，如“纯化的多核苷酸”，该术语指与至少一个污染物分离的那种。如本文所用，“污染物”是使另一者不适宜、不纯或变次的任何物质。因此，纯化的多核苷酸(例如，DNA和RNA)按照与它在自然界中存在的不同形式和设置存在，或者按照使其经历处理或纯化方法之前存在的不同形式和设置存在。
可以使用方法如但不限于凝胶电泳、UV吸光度或分析性HPLC，实施质量保证和/或质量控制检查。
在另一个实施方案中，多核苷酸可以通过包括但不限于逆转-转录酶-PCR的方法测序。
III.修饰
如本文在多核苷酸(如嵌合多核苷酸、IVT多核苷酸或环状多核苷酸)中所用的，术语“化学修饰”或适合时“化学修饰的”指腺苷(A)、鸟苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)或胞苷(C)核糖核苷或脱氧核糖核苷在其位置、样式、百分数或群体中一个方面或多个方面的修饰。通常，本文中，这些术语不意在指在天然存在的5′-末端mRNA帽部分中的核糖核苷酸修饰。
在多肽中，术语“修饰”指与20种氨基酸的常规集合相比的修饰。
修饰可以是多种不同的修饰。在一些实施方案中，区域可以含有一个、两个或更多个(任选不同的)核苷或核苷酸修饰。在一些实施方案中，与未修饰的多核苷酸相比，向细胞中引入的修饰多核苷酸可以在细胞中显示出降解减少。
可用于本发明中的修饰包括但不限于表5中列出的那些。在表中标出修饰符号、核碱基类型和修饰是否为天然存在的。
表5.修饰
表6中列出可以用于本发明多核苷酸中的其他修饰。
表6.额外的修饰类型
多核苷酸可以在核苷之间包含任何有用的接头。表7中给出这类接头(包括主链修饰)。
表7.接头修饰
多核苷酸可以包括任何有用的修饰，如对糖、核碱基或核苷间连接(例如对连接性磷酸酯/对磷酸二酯连接/对磷酸二酯主链)的修饰。嘧啶核碱基的一种或多种原子可以用任选取代的氨基、任选取代的巯基、任选取代的烷基(例如，甲基或乙基)或卤素(例如，氯或氟)替换或取代。在某些实施方案中，修饰(例如，一个或多个修饰)是存在于每个糖和核苷间连接中。本发明的修饰可以是核糖核酸(RNA)至脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂交分子的修饰)。本文中描述了额外的修饰。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸基本上不诱导向其中引入mRNA的细胞的先天免疫反应。诱导型先天免疫反应的特征包括1)促炎细胞因子的表达增加，2)胞内PRR激活(RIG-I、MDA5等的活化和/或3)蛋白质翻译终止或减少。
在某些实施方案中，可以需要胞内降解引入细胞中的多核苷酸。例如，如果需要蛋白质产生的精确时程，则降解多核苷酸可能是优选的。因此，在一些实施方案中，本发明提供含有降解结构域的多核苷酸，所述降解结构域能够在细胞内部以直接方式受到作用。
多核苷酸的任何区域都可以被化学修饰，如本文中教授或如2012年10月3日提交的国际申请号PCT/2012/058519(代理人案号M9)和2013年6月20日提交的美国临时申请号61/837297(代理人案号M36)中教授，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
修饰的多核苷酸分子
本发明还包括多核苷酸分子的构件(building block)，例如，修饰的核糖核苷和修饰的核糖核苷酸。例如，这些构件可以用于制备本发明的多核苷酸。这类构件在国际专利公开号WO2013052523(代理人案号M9)和国际专利申请号PCT/US2013/75177(代理人案号M36)中教授，所述文献每一篇的内容通过引的用方式完整并入本文。
糖上的修饰
可以掺入多核苷酸(例如，如本文所述的RNA或mRNA)中的修饰的核苷和核苷酸(例如，构件分子)，可以在核糖核酸的糖上修饰。例如，可以将2′羟基(OH)修饰或替换为众多不同的取代基。在2′-位置处的示例性取代包括但不限于H、卤素、任选取代的C1-6烷基；任选取代的C1-6烷氧基；任选取代的C6-10芳氧基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的C3-8环烷氧基；任选取代的C6-10芳氧基；任选取代的C6-10芳基-C1-6烷氧基、任选取代的C1-12(杂环基)氧；糖(例如，核糖、戊糖或本文所述的任何糖)；聚乙二醇(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R是H或任选取代的烷基，并且n是从0至20(例如，从0至4、从0至8、从0至10、从0至16、从1至4、从1至8、从1至10、从1至16、从1至20、从2至4、从2至8、从2至10、从2至16、从2至20、从4至8、从4至10、从4至16和从8至18)的整数；“锁”核酸(LNA)，其中2′-羟基由C1-6亚烷基桥或C1-6杂亚烷基桥连接至相同核糖的4’-碳，其中示例性桥包括亚甲基桥、丙烯桥、醚桥或氨基桥；如本文定义的氨烷基；如本文定义的氨基烷氧基；如本文定义的氨基；和如本文定义的氨基酸。
通常，RNA包括糖基团核糖，其是具有氧的5元环。示例的非限制性修饰核苷酸包括替换核糖中的氧(例如，用S、Se或亚烷基，如亚甲基或亚乙基)；添加双键(例如，以用环丙烯基或环己烯基替换核糖)；核糖的环收缩(例如，以形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的环扩充(例如，以形成具有额外碳或杂原子的6元或7元环，如对于也具有磷酰胺酯主链的失水己糖醇、阿卓糖醇、甘露醇、环己烷基、环己烯基和吗啉)；多环形式(例如，三环；和“解锁”形式，如二醇核酸(GNA)(例如，R-GNA或S-GNA，其中核糖由连接至磷酸二酯键的二醇单位替换)、苏糖核酸(TNA，其中核糖替换为α-1-苏呋喃糖基-(3′→2′)和肽核酸(PNA，其中2-氨基-乙基-甘氨酸连接替换核糖和磷酸二酯主链)。糖基团还可以含有一个或多个拥有与核糖中相应碳相反的立体化学构型的碳。因此，多核苷酸分子可以包括例如含有作为糖的阿拉伯糖的核苷酸。这类糖修饰在国际专利公开号WO2013052523(代理人案号M9)和国际专利申请号PCT/US2013/75177(代理人案号M36)中教授，所述文献每一篇的内容通过引的用方式完整并入本文。
核碱基上的修饰
本公开提供了修饰的核苷和核苷酸。本文所述的“核苷”定义为含有与有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文也称作“核碱基”)组合的糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物的化合物。如本文所述，“核苷酸”是定义为包含磷酸基团的核苷。修饰的核苷酸可以通过如本文所述的任何有用方法合成(例如，化学、酶促或重组方式合成，以包含一个或多个修饰的核苷或非天然核苷)。多核苷酸可以包含连接的核苷的一个区域或多个区域。此区域可以具有可变的主链连接。所述连接可以是标准的磷酸连接，其中多核苷酸将包含核苷酸区域。
修饰的核苷酸碱基对不仅涵盖标准腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，还涵盖在核苷酸和/或包含非标准碱基或修饰碱基的修饰核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键接纳体的排列使非标准碱基和标准碱基之间或两个互补性非标准碱基结构之间产生氢键。这类非标准碱基对的一个例子是在修饰的核苷酸肌苷和腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基对。
修饰的核苷和核苷酸可以包括修饰的核碱基。存在于RNA中的核碱基的例子包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。存在于DNA中的核碱基的例子包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。这类修饰的核碱基(包括在天然存在和非天然存在之间的区别)在国际专利公开号WO2013052523(代理人案号M9)和国际专利申请号PCT/US2013/75177(代理人案号M36)中教授，所述文献每一篇的内容通过引的用方式完整并入本文。
修饰的糖、核碱基和核苷间连接的组合
本发明的多核苷酸可以包括对糖、核碱基和/或核苷间连接的修饰的组合。这些组合可以包括本文所述的任一种或多种修饰。
下文在表8中提供了修饰的核苷酸和修饰的核苷酸组合的例子。修饰的核苷酸的这些组合可以用来形成本发明的多核苷酸。除非另外指出，可以用修饰的核苷酸完全置换本发明多核苷酸的天然核苷酸。作为一个非限制性例子，天然核苷酸尿苷可以置换为本文所述的修饰核苷。在另一个非限制性例子中，天然核苷酸尿苷可以部分地(例如，约0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.9％)置换为本文公开的至少一种修饰核苷。可以将碱基/糖或接头的任何组合并入本发明的多核苷酸并且这类修饰在国际专利公开号WO2013052523(代理人案号M9)和国际专利申请号PCT/US2013/75177(代理人案号M36)中教授，所述文献每一篇的内容通过引的用方式完整并入本文。
表8.组合
IV.药物组合物
配制、施用、递送和给药
本发明提供了与一种或多种可药用赋形剂组合的多核苷酸组合物和复合物。药物组合物可以任选地包含一种或多种额外的活性物质，例如有治疗和/或预防活性的物质。本发明的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。在配制和/或制造药剂(pharmaceuticalagent)中的一般考虑事项可以例如在Remington:The Science and Practice ofPharmacy第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005 5(通过引用的方式完整并入本文)中找到。
在一些实施方案中，将组合物施用至人类、人类患者或受试者。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常指本文所述的待递送的多核苷酸。
虽然本文提供的药物组合物描述主要涉及适于施用至人类的药物组合物，技术人员将理解这类组合物通常适于施用至任何其他动物，例如，施用至非人类动物，例如非人类哺乳动物。对修饰适于施用至人类的药物组合物以使得该组合物适于施用至多种动物有充分的理解，并且普通技术的兽医药理学家可以仅用普通(如果有的话)实验即可设计和/或开展这类修饰。涉及药物组合物施用的受试者包括但不限于人类和/或其他灵长类；哺乳类，包括有商业意义的哺乳动物如牛、猪、马、羊、猫、犬、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括有商业意义的鸟类如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
本文所述药物组合物的制剂可以通过药理学领域已知或此后开发的任何方法制备。通常而言，这类制备方法包括步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分组合，并且随后，如果需要和/或要求，将产品分割、成型和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
本发明药物组合物中活性成分、可药用赋形剂和/或任何额外成分的相对量将根据受到治疗的受试者的身份、体格大小和/或状况变动，并且进一步根据组合物待施用的途径变动。以举例方式，组合物可以包含0.1％和100％之间，例如0.5％和50％之间、1-30％之间、5-80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
制剂
可以使用一种或多种赋形剂配制本发明的多核苷酸，从而(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许缓释或延迟释放(例如，从多核苷酸的贮库制剂释放)；(4)改变生物分布(例如，指引多核苷酸至特定组织或细胞类型)；(5)增加所编码蛋白质的体内翻译；和/或(6)改变所编码蛋白质的体内释放谱。除传统赋形剂如任何和全部溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体溶媒、分散助剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂之外，本发明的赋形剂可以包括而不限于类脂质、脂质体、脂质纳米粒子、聚合物、脂质-核酸复合物(lipoplexe)、核-壳纳米粒子、肽、蛋白质、用多核苷酸转染的细胞(例如，用于移植入受试者)、透明质酸酶、纳米粒子模拟物及其组合。因此，本发明的制剂可以包含一种或多种各自处于以下量的赋形剂，所述量共同增加多核苷酸的稳定性、增加多核苷酸对细胞的转染、增加多核苷酸编码的蛋白质的表达，和/或改变多核苷酸编码的蛋白质的释放谱。另外，可以使用自装配核酸纳米粒子配制本发明的多核苷酸。
本文所述药物组合物的制剂可以通过药理学领域已知或此后开发的任何方法制备。通常而言，这类制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合的步骤。
可以将本公开的药物组合物作为单一单位剂量，和/或作为多个单一单位剂量制备、包装和/或散装出售。如本文所用，“单位剂量”指分立量的药物组合物，其包含预定量的活性成分。活性成分的量通常等于将施用至受试者的活性成分的剂量和/或是这种剂量的便利部分，例如，如一半或三分之一的这种剂量。
本公开的药物组合物中活性成分、可药用赋形剂和/或任何额外成分的相对量将根据受到治疗的受试者的身份、体格大小和/或状况治疗变动并且进一步根据组合物待施用的途径变动。例如，组合物可以包含0.1％和99％(w/w)之间的活性成分。以举例方式，组合物可以包含0.1％和100％之间，例如0.5％和50％之间、1-30％之间、5-80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，本文所述的制剂可以含有至少一种多核苷酸。作为一个非限制性例子，制剂可以含有1、2、3、4或5种多核苷酸。
在一个实施方案中，本文所述的制剂可以包含多于一个类型的多核苷酸。在一个实施方案中，制剂可以包含线性和环状形式的多核苷酸。在另一个实施方案中，制剂可以包含环状多核苷酸和IVT多核苷酸。在又一个实施方案中，制剂可以包含IVT多核苷酸、嵌合多核苷酸和环状多核苷酸。
在一个实施方案中，制剂可以含有多核苷酸，所述多核苷酸编码LDLR蛋白或包含至少一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)的LDLR蛋白。
药物制剂可以另外包含可药用赋形剂，如本文所用，所述的可药用赋形剂包括，但不限于对所期望的具体剂型合适的任何和全部溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体溶媒、分散助剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等。用于配制药物组合物的多种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；通过引用方式完整并入本文)。除了任何常规赋形剂介质可能与某物质或其衍生物不相容的情况下(如因产生任何不想要的生物学效应或另外以有害方式与药物组合物的任何其他组分相互作用)，否则使用常规赋形剂介质均在本公开的范围内。
在一些实施方案中，可以增加和/或减少脂质纳米粒子的粒度。粒度的变化可以能够帮助对抗生物学反应如，但不限于炎症，或可以增加向哺乳动物输送的修饰的mRNA的生物学效果。
制造药物组合物中所用的可药用赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、表面活性剂和/或乳化剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。这类赋形剂可以任选地纳入本发明的药物制剂中。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在可掩蔽分子的纳米结构物(如胆固醇)中或随之一起施用，在所述纳米结构物中配制或随之一起递送。这些纳米结构物的非限制性例子和制造这些纳米结构物的方法在美国专利公开号US20130195759中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。这些纳米结构物的示例性结构在美国专利公开号US20130195759的图1中显示，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文，并且可以包括核芯和包围核芯的壳。
类脂质(lipidoids)
已经广泛地描述了类脂质的合成并且含有这些化合物的制剂特别适用于递送多核苷酸(参见Mahon等人,Bioconjug Chem.2010 21:1448-1454；Schroeder等人,J InternMed.2010 267:9-21；Akinc等人,Nat Biotechnol.2008 26:561-569；Love等人,Proc NatlAcad Sci USA.2010 107:1864-1869；Siegwart等人,Proc Natl Acad Sci USA.2011 108:12996-3001；所述文献均完整并入本文)。
尽管这些类脂质已经用来在啮齿类和非人灵长类中有效递送双链小干扰RNA分子(参见Akinc等人,Nat Biotechnol.2008 26:561-569；Frank-Kamenetsky等人,Proc NatlAcad Sci U S A.2008 105:11915-11920；Akinc等人,Mol Ther.2009 17:872-879；Love等人,Proc Natl Acad Sci USA.2010 107:1864-1869；Leuschner等人,NatBiotechnol.2011 29:1005-10100；全部文献均完整并入本文)，本公开描述了它们的配制和在递送多核苷酸中的用途。
可以制备含有这些类脂质的复合物、胶束、脂质体或粒子，并且因此，它们可以导致多核苷酸的有效递送，这通过局部和/或全身性施用途径注射脂质制剂之后产生编码的蛋白质判定。多核苷酸的类脂质复合物可以通过各种手段施用，包括但不限于静脉内、肌内或皮下途径。
体内递送核酸可能受许多参数影响，包括但不限于制剂组成、粒子的性质、PEG化、装载程度、多核苷酸对脂质比和生物物理参数如，但不限于粒度(Akinc等人,MolTher.2009 17:872-879；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。作为一个例子，聚(乙二醇))(PEG)脂质的锚定链长度的微小变化可能导致显著影响体内效力。可以测试具有不同类脂质的制剂的体内活性，所述类脂质包括但不限于五[3-(1-月桂基氨基丙酰基)]-三乙烯四胺盐酸盐(TETA–5LAP；aka 98N12-5，参见Murugaiah等人,Analytical Biochemistry,401:61(2010)；所述文献通过引用方式完整并入本文)、C12-200(包括衍生物和变体)和MD1。
本文中称作“98N12-5”的类脂质由Akinc等人,Mol Ther.2009 17:872-879公开并且通过引用的方式完整并入。
本文中称作“C12-200”的类脂质由Love等人,Proc Natl Acad Sci USA.2010107:1864-1869及Liu和Huang,Molecular Therapy.2010 669-670公开；所述两篇文献通过引用的方式完整并入本文。类脂质制剂可以包含粒子，除多核苷酸之外，所述粒子还包含3或4种或更多种组分。
类脂质和包含类脂质的多核苷酸制剂在国际专利申请号PCT/US2014/097077(代理人案号M030.20)中(如在第[000415]–[000422]段中)描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
脂质体、脂质-核酸复合物(lipoplexes)和脂质纳米粒子
可以使用一种或多种脂质体、脂质-核酸复合物或脂质纳米粒子，配制本发明的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸的药物组合物包含脂质体。脂质体是人工制备的小泡，所述小泡可以主要由脂质双层组成并且可以用作递送载具以施用养分和药物制剂。脂质体可以具有不同规格，如但不限于多层小泡(MLV),其直径可以是数百纳米并且可以含有一系列由狭窄水质区室分隔的同心双层的；小单膜小泡(SUV),其直径可以小于50nm；和大单层小泡(LUV)，其直径可以在50和500nm之间。脂质体设计可以包含但不限于调理素或配体，以改善脂质体与不健康组织结合或以激活事件，如，但不限于内吞。脂质体可以含有低pH或高pH，以改善药物制剂递送。
脂质体的形成可以取决于多种物理化学特征，如，但不限于捕获的药物制剂和脂质体成分、脂质小泡分散于其中的介质的性质、所捕获物质的有效浓度和其潜在毒性、在施加和/或递送小泡期间涉及的任何额外过程、优化规格、多分散性和小泡用于预期应用的货架期，和批次间重复性和大规模生产安全和高效脂质体产品的可能性。
作为一个非限制性例子，脂质体如合成性膜泡可以通过在美国专利公开号US20130177638、US20130177637、US20130177636、US20130177635、US20130177634、US20130177633、US20130183375，US20130183373和US20130183372中描述的方法、装备和装置制备，所述每份文献的内容通过引用方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的药物组合物可以包含而不限于多种脂质体，如从1,2-二油基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DODMA)脂质体形成的那些脂质体、来自MarinaBiotech(Bothell,WA)的DiLa2脂质体、1,2-二亚油氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烯(DLin-KC2-DMA)和MC3(US20100324120；所述文献通过引用的方式完整并入本文)和可以递送小分子药物的脂质体，如，但不限于来自Janssen Biotech,Inc.(Horsham,PA)的
在一个实施方案中，本文所述的药物组合物可以包含而不限于多种脂质体，如从合成先前已经描述并显示适用于体外和体内递送寡核苷酸的稳定化质粒-脂质粒子(SPLP)或稳定化核酸脂质粒子(SNALP)形成的那些脂质体(参见Wheeler等人,Gene Therapy.19996:271-281；Zhang等人,Gene Therapy.1999 6:1438-1447；Jeffs等人,Pharm Res.200522:362-372；Morrissey等人,Nat Biotechnol.2005 2:1002-1007；Zimmermann等人,Nature.2006 441:111-114；Heyes等人,J Contr Rel.2005 107:276-287；Semple等人,Nature Biotech.2010 28:172-176；Judge等人,J Clin Invest.2009 119:661-673；deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132；美国专利公开号US20130122104；所述文献均完整并入本文)。Wheeler等人的原始制造方法是去垢剂透析法，所述方法稍后由Jeffs等人改进，并且称作自发性小泡形成法。除多核苷酸之外，脂质体制剂还包含3至4种脂质组分。作为一个例子，脂质体可以含有但不限于55％胆固醇、20％二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、10％PEG-S-DSG和15％1,2-二油基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DODMA)，如Jeffs等人所描述。作为另一个例子，某些脂质体制剂可以含有但不限于48％胆固醇、20％DSPC、2％PEG-c-DMA和30％阳离子脂质，其中阳离子脂质可以是1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DSDMA)、DODMA、DLin-DMA或1,2-二亚麻基氧基-3-二甲氨基丙烷(DLenDMA)，如Heyes等人所描述。
在一些实施方案中，脂质体制剂可以包含约25.0％胆固醇至约40.0％胆固醇、约30.0％胆固醇至约45.0％胆固醇、约35.0％胆固醇至约50.0％胆固醇和/或约48.5％胆固醇至约60％胆固醇。在一个优选实施方案中，制剂可以包含选自28.5％、31.5％、33.5％、36.5％、37.0％、38.5％、39.0％和43.5％的百分数的胆固醇。在一些实施方案中，制剂可以包含约5.0％至约10.0％的DSPC和/或约7.0％至约15.0％的DSPC。
在一个实施方案中，药物组合物可以包括脂质体，其中可以形成所述脂质体以递送可以编码至少一个免疫原或任何其他目的多肽的多核苷酸。多核苷酸可以由脂质体包封和/或它可以含于含水核芯内，所述含水核芯随后可以由脂质体包封(参见国际公开号WO2012031046、WO2012031043、WO2012030901和WO2012006378和美国专利公开号US20130189351、US20130195969和US20130202684；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整地并入本文)。
在另一个实施方案中，可以是配制脂质体用于靶向递送。作为一个非限制性例子，可以配制脂质体用靶向递送至肝脏。用于靶向递送的脂质体可以包括，但不限于，美国专利公开号US20130195967描述中的脂质体并且产生脂质体的方法在美国专利公开号US20130195967中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，多核苷酸可以在阳离子性水包油乳液中配制，其中乳液粒子包含油芯和阳离子脂质，所述阳离子脂质可以与多核苷酸相互作用，从而将分子锚定至乳液粒子(参见国际公开号WO2012006380；所述文献通过引用方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在油包水乳液中配制，所述油包水乳液包含其中分散有亲水相的连续疏水相。作为一个非限制性例子，乳液可以通过国际公开号WO201087791中描述的方法产生，所述文献通过引用方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，脂质制剂可以至少包括阳离子脂质、可以增强转染的脂质和至少一种含有与脂质部分连接的亲水头基的脂质(国际公开号WO2011076807和美国公开号20110200582；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文)。在另一个实施方案中，多核苷酸可以在脂质小泡中配制，所述脂质小泡可以在官能化脂质双层之间具有交联(参见美国公开号20120177724，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在如国际专利公开号WO2013086526中所述的脂质体配制，所述文献通过引用方式完整并入本文。多核苷酸可以使用反pH梯度和/或优化的内部缓冲液组合物而包封在脂质体中，如国际专利公开号WO2013086526中所述，该文献通过引用方式完整并入本文。
在一个实施方案中，药物组合物可以配制在脂质体中，所述脂质体例如是但不限于DiLa2脂质体(Marina Biotech,Bothell,WA)、(Marina Biotech,Bothell,WA)、基于中性DOPC(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)的脂质体(例如，针对卵巢癌的siRNA递送(Landen等人,Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708-1713)；所述文献通过引用方式完整并入本文)和透明质糖包覆的脂质体(Quiet Therapeutics,Israel)。
在一个实施方案中，阳离子脂质可以是低分子量阳离子脂质，如美国专利申请号20130090372中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在脂质小泡中配制，所述脂质小泡可以在官能化脂质双层之间具有交联。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在包含阳离子脂质的脂质体中配制。脂质体可以具有阳离子脂质中氮原子对RNA中磷酸的1:1和20:1之间的摩尔比(N:P比率)，如国际公开号WO2013006825中所述，所述文献通过引用方式完整并入本文。在另一个实施方案中，脂质体可以具有大于20:1或小于1:1的N:P比率。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在脂质-聚阳离子复合物中配制。脂质-聚阳离子复合物的形成可以通过本领域已知的方法和/或如美国公开号20120178702中所述那样实现，所述文献通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，聚阳离子可以包括阳离子肽或多肽，如，但不限于，在国际公开号WO2012013326或美国专利公开号US20130142818中描述的聚赖氨酸、聚鸟氨酸和/或聚精氨酸和阳离子肽；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。在另一个实施方案中，多核苷酸可以在脂质-聚阳离子复合物中配制，所述质-聚阳离子复合物还可以包含中性脂质，如，但不限于胆固醇或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在氨基醇类脂质中配制。可以在本发明中使用的氨基醇类脂质可以通过美国专利号8,450,298中描述的方法制备，所述文献通过引用方式完整并入本文。
脂质体制剂可能受到但不限于选择阳离子脂质组分、阳离子脂质饱和度、PEG化的性质、全部组分比率和生物物理参数如大小的影响。在Semple等人(Semple等人,NatureBiotech.2010 28:172-176；所述文献通过引用方式完整并入本文)的一个例子中，脂质体制剂由57.1％阳离子脂质、7.1％二棕榈酰磷脂酰胆碱、34.3％胆固醇和1.4％PEG-c-DMA组成。作为另一个例子，改变阳离子脂质的组成可能更有效地递送siRNA至多种抗原呈递细胞(Basha等人,Mol Ther.2011 19:2186-2200；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。在一些实施方案中，脂质体制剂可以包含约35％至约45％阳离子脂质，约40％至约50％阳离子脂质，约50％至约60％阳离子脂质和/或约55％至约65％阳离子脂质。在一些实施方案中，脂质体中脂质对mRNA的比率可以是约5至约20:1、约10:1至约25:1、约15:1至约30:1和/或至少30:1。
在一些实施方案中，可以增加或减少脂质纳米粒子(LNP)制剂中PEG的比率和/或可以调整PEG脂质的碳链长度从C14至C18，以改变LNP制剂的药代动力学和/或生物分布。作为一个非限制性例子，与阳离子脂质、DSPC和胆固醇相比，LNP制剂可以含有约0.5％至约3.0％、约1.0％至约3.5％、约1.5％至约4.0％、约2.0％至约4.5％、约2.5％至约5.0％和/或约3.0％至约6.0％的脂质摩尔比的PEG-c-DOMG。在另一个实施方案中，可以将PEG-c-DOMG替换为PEG脂质，如，但不限于PEG-DSG(1,2-二硬脂酰-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油)和/或PEG-DPG(1,2-二棕榈酰-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)。阳离子脂质可以选自本领域已知的任何脂质，如，但不限于DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200和DLin-KC2-DMA。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在脂质纳米粒子(如在国际公开号WO2012170930中描述的那些，所述文献通过引用方式完整并入本文)中配制。
在一个实施方案中，包含多核苷酸的制剂是可以包含至少一种脂质的纳米粒子。脂质可以选自，但不限于DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、聚乙二醇化脂质和氨基醇脂质。在另一个方面，脂质可以是阳离子脂质，如，但不限于DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA，DLin-KC2-DMA、DODMA和氨基醇脂质。氨基醇阳离子脂质可以是在美国专利公开号US20130150625中描述和/或通过美国专利公开号US20130150625中描述的方法产生的脂质，所述文献通过引用方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，阳离子脂质可以是2-氨基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-2-{[(9Z,2Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物1)；2-氨基-3-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧]-2-{[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物2)；2-氨基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-2-[(辛基氧)甲基]丙-1-醇(US20130150625中的化合物3)；和2-(二甲基氨基)-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-2-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物4)；或其任何可药用盐或立体异构体。
在一个实施方案中，阳离子脂质可以选自，但不限于以下文文献中描述的阳离子脂质：国际公开号WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724、WO201021865、WO2008103276、WO2013086373和WO2013086354，美国专利号7,893,302、7,404,969、8,283,333和8,466,122和美国专利公开号US20100036115、US20120202871、US20130064894、US20130129785、US20130150625、US20130178541和US20130225836；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整地并入本文。在另一个实施方案中，阳离子脂质可以选自，但不限于国际公开号WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638和WO2013116126或美国专利公开号US20130178541和US20130225836中描述的式A；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。在又一个实施方案中，阳离子脂质可以选自，但不限于国际公开号WO2008103276的式CLI-CLXXIX、美国专利号7,893,302的式CLI-CLXXIX、美国专利号7,404,969的式CLI-CLXXXXII和美国专利公开号US20100036115的式I-VI、美国专利公开号US20130123338的式I；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，阳离子脂质可以选自(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-9-胺、(1Z,19Z)-N5N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-8-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二碳-13,16-二烯-5-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基二十一碳-12,15-二烯-4-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-6-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-7-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-10-胺、(15Ζ,18Ζ)-Ν,Ν-二甲基二十四碳-15,18-二烯-5-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-4-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-9-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-8-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-7-胺、(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-6-胺、(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十七碳-22,25-二烯-10-胺、(21Z,24Z)-N,N-二甲基三十碳-21,24-二烯-9-胺、(18Z)-N,N-二甲基二十七碳-18-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十六碳-17-烯-9-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-7-胺、N,N-二甲基二十七烷-10-胺、(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺、1-[(11Z,14Z)-1-壬基二十碳-11,14-二烯-1-基]吡咯烷、(20Z)-N,N-二甲基二十七碳-20-烯-10-胺、(15Z)-N,N-二甲基二十七碳-15-烯-10-胺、(14Z)-N,N-二甲基二十九碳-14-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十九碳-17-烯-10-胺、(24Z)-N,N-二甲基三十三碳-24-烯-10-胺、(20Z)-N,N-二甲基二十九碳-20-烯-10-胺、(22Z)-N,N-二甲基三十六碳-22-烯-10-胺、(16Z)-N,N-二甲基二十五碳-16-烯-8-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十七碳-8-胺、1-[(1S,2R)-2-己基环丙基]-N,N-二甲基十九碳-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十九碳-10-胺、N,N-二甲基-21-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]二十一碳-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]十九碳-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十六碳-8-胺、Ν,Ν-二甲基H-[(1R,2S)-2-十一基环丙基]十四碳-5-胺、N,N-二甲基-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]庚基}十二碳-1-胺、1-[(1R,2S)-2-庚基环丙基]-Ν,Ν-二甲基十八碳-9-胺、1-[(1S,2R)-2-癸基环丙基]-N,N-二甲基十五碳-6-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十五碳-8-胺、R-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-3-(辛氧基)丙-2-胺、S-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吡咯烷、(2S)-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-3-[(5Z)-辛-5-烯-1-基氧]丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吖丁啶、(2S)-1-(己氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、(2S)-1-(庚氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、Ν,Ν-二甲基-1-(壬氧基)-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧]-3-(辛氧基)丙-2-胺；(2S)-N,N-二甲基-1-[(6Z,9Z,12Z)-十八碳-6,9,12-三烯-1-基氧]-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧]-N,N-二甲基-3-(戊氧基)丙-2-胺、(2S)-1-(己氧基)-3-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧]-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧]-Ν,Ν-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(13Z,16Z)-二十二碳-l3,16-二烯-1-基氧]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z,16Z)-二十二碳-13,16-二烯-1-基氧]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(9Z)-十六碳-9-烯-1-基氧]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2R)-N,N-二甲基-H(1-甲基辛基)氧]-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、(2R)-1-[(3,7-二甲基辛基)氧]-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-(辛氧基)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]辛基}氧)丙-2-胺、N,N-二甲基-1-{[8-(2-辛基环丙基)辛基]氧}-3-(辛氧基)丙-2-胺和(11E,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-11,20,2-三烯-10-胺或其可药用盐或立体异构体。
在一个实施方案中，脂质可以是可切割脂质，如国际公开号WO2012170889中描述的那些，所述文献通过引用方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，脂质可以是阳离子脂质，如，但不限于，美国专利申请号US20130064894的式(I)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，阳离子脂质可以通过本领域已知和/或如国际公开号WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724、WO201021865、WO2013086373and WO2013086354中所述的方法合成；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整地并入本文。
在另一个实施方案中，阳离子脂质可以是三烷基阳离子脂质。三烷基阳离子脂质的非限制性例子和产生及使用三烷基阳离子脂质的方法在国际专利公开号WO2013126803中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，多核苷酸的LNP制剂可以按3％脂质摩尔比含有PEG-c-DOMG。在另一个实施方案中，多核苷酸的LNP制剂可以按1.5％脂质摩尔比含有PEG-c-DOMG。
在一个实施方案中，多核苷酸的药物组合物可以包含至少一种在国际公开号WO2012099755中描述的聚乙二醇化脂质，所述文献通过引用方式并入本文。
在一个实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油酰-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)。在一个实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000、本领域已知的一种阳离子脂质和至少一个其他组分。在另一个实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000、本领域已知的一种阳离子脂质、DSPC和胆固醇。作为一个非限制性例子，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC和胆固醇。作为另一个非限制性例子，LNP制剂可以含有摩尔比2:40:10:48的PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC和胆固醇(参见例如Geall等人,Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines,PNAS2012；PMID:22908294；所述文献通过引用方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，LNP制剂可以通过国际公开号WO2011127255或WO2008103276中描述的方法配制，所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，本文所述的多核苷酸可以包封于LNP制剂中，如WO2011127255和/或WO2008103276中所述；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸可以在纳米粒子中配制，以通过肠胃外途径递送，如美国公开号US20120207845中所述；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在通过美国专利公开号US20130156845或国际公开号WO2013093648或WO2012024526中描述的方法产生的脂质纳米粒子中配制，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
本文所述的脂质纳米粒子可以在无菌环境中通过美国专利公开号US20130164400中描述的系统和/或方法产生，所述文献通过引用方式完整并入本文。
在一个实施方案中，LNP制剂可以在纳米粒子如美国专利号8,492,359中描述的核酸-脂质粒子中配制，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，脂质颗粒可以包含一种或多种活性剂或治疗剂；一种或多种包含粒子中存在的总脂质的约50mol％至约85mol％的阳离子脂质；一种或多种包含粒子中存在的总脂质的约13mol％至约49.5mol％的非阳离子脂质；和一种或多种抑制粒子聚集的缀合脂质，其包含粒子中存在的总脂质的约0.5mol％至约2mol％。纳米粒子中的核酸可以是本文所述的多核苷酸和/或是本领域已知的。
在一个实施方案中，LNP制剂可以通过国际公开号WO2011127255或WO2008103276中描述的方法配制，所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，本文所述的修饰的RNA可以是包封于LNP制剂中，如WO2011127255和/或WO2008103276中所述；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整地并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的LNP制剂可以包含聚阳离子组合物。作为一个非限制性例子，聚阳离子组合物可以选自美国专利公开号US20050222064的式1-60；所述文献的内容通过引用的方式完整地并入本文。在另一个实施方案中，包含聚阳离子组合物的LNP制剂可以用于体内和/或体外递送本文所述的修饰的RNA。
在一个实施方案中，本文所述的LNP制剂可以另外包含渗透促进物。非限制的渗透促进物在美国专利公开号US20050222064中描述；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，药物组合物可以配制在脂质体中，所述脂质体例如是但不限于DiLa2脂质体(Marina Biotech,Bothell,WA)、(Marina Biotech,Bothell,WA)、基于中性DOPC(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)的脂质体(例如，针对卵巢癌的siRNA递送(Landen等人,Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708-1713)；所述文献通过引用方式完整并入本文)和透明质糖包覆的脂质体(Quiet Therapeutics,Israel)。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在冻干凝胶相脂质体组合物中配制，如美国公开号US2012060293中所述，所述文献通过引用方式完整并入本文。
纳米粒子制剂可以是包含糖载体和多核苷酸的糖纳米粒子。作为一个非限制性例子，糖载体可以包括，但不限于酐修饰的植物糖原或糖原型物质、植物糖原琥珀酸辛烯酯、植物糖原β-糊精、酐修饰的植物糖原β-糊精。(参见例如，国际公开号WO2012109121；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
本发明的纳米粒子制剂可以用表面活性剂或聚合物包覆，以改善粒子递送。在一个实施方案中，纳米粒子可以用亲水包覆物(如，但不限于，PEG包覆物和/或具有中性表面电荷的包覆物)包覆。亲水包覆物可以帮助递送酬载较大的纳米粒子如，但不限于，中枢神经系统内部的多核苷酸。作为一个非限制性例子，包含亲水包覆物的纳米粒子和产生这类纳米粒子的方法在美国专利公开号US20130183244中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的脂质纳米粒子可以是亲水性聚合物粒子。亲水性聚合物粒的非限制性例子和产生亲水性聚合物粒子的方法在美国专利公开号US20130210991中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，本发明的脂质纳米粒子可以是疏水性聚合物粒子。
可以通过将阳离子脂质替换为称作快速消除性脂质纳米粒子(reLNP)的生物可降解阳离子脂质，改进脂质纳米粒子制剂。可电离阳离子脂质，如，但不限于DLinDMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA，已经显示随时间推移蓄积在血浆和组织中并且可能是毒性的潜在来源。快速消除性脂质的快速代谢可以改善脂质纳米粒子在大鼠中的耐受性和治疗指数从1mg/kg剂量至10mg/kg剂量的数量级。纳入酶促降级的酯连接可以改善阳离子组分的降解与代谢谱，同时仍然维持reLNP制剂的活性。酯连接可以内在地位于脂质链内部或它可以末端地位于脂质链的终末端处。内部酯连接可以替换脂质链中的任何碳。
在一个实施方案中，内部酯连接可以位于饱和碳的任一侧面上。
在一个实施方案中，可以通过递送脂质纳米粒子(可以包括纳米物、聚合物和免疫原)激发免疫反应。(美国公开号20120189700和国际公开号WO2012099805；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。聚合物可以包封纳米物质或部分地包封纳米物质。免疫原可以是重组蛋白、修饰的RNA和/或本文所述的多核苷酸。在一个实施方案中，脂质纳米粒子可以配制，用于疫苗(如，但不限于，针对病原体的疫苗)中。
脂质纳米粒子可以经工程化以改变粒子表面特性，从而脂质纳米粒子可以穿透粘膜屏障。渗透粘膜屏障和其中存在粘液的区域的脂质纳米粒子在国际专利申请号PCT/US2014/027077(代理人案号M030.20)中，例如在第[000491]–[000501]段中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，将多核苷酸配制为脂质-核酸复合物，如，而不限于，来自Silence Therapeutics(伦敦，英国)的ATUPLEXTM系统、DACC系统、DBTC系统和其他siRNA-lipoplex技术，来自(Cambridge,MA)的STEMFECTTM和基于聚乙烯亚胺(PEI)或鱼精蛋白的靶向及非靶向核酸递送(Aleku等人,Cancer Res.2008 68:9788-9798；Strumberg等人,Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78；Santel等人,Gene Ther2006 13:1222-1234；Santel等人,Gene Ther 2006 13:1360-1370；Gutbier等人,PulmPharmacol.Ther.2010 23:334-344；Kaufmann等人,Microvasc Res 2010 80:286-293Weide等人,J Immunother.2009 32:498-507；Weide等人,J Immunother.2008 31:180-188；Pascolo Expert Opin.Biol.Ther.4:1285-1294；Fotin-Mleczek等人,2011J.Immunother.34:1-15；Song等人,Nature Biotechnol.2005,23:709-717；Peer等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2007 6；104:4095-4100；deFougerolles Hum GeneTher.2008 19:125-132；所述全部文献通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，也可以构建这类制剂或改变组合物，从而它们被动或主动地在体内指向不同细胞类型，包括但不限于肝细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、抗原呈递细胞和白细胞(Akinc等人,Mol Ther.2010 18:1357-1364；Song等人,NatBiotechnol.2005 23:709-717；Judge等人,J Clin Invest.2009 119:661-673；Kaufmann等人,Microvasc Res 2010 80:286-293；Santel等人,Gene Ther 2006 13:1222-1234；Santel等人,Gene Ther 2006 13:1360-1370；Gutbier等人,Pulm Pharmacol.Ther.201023:334-344；Basha等人,Mol.Ther.2011 19:2186-2200；Fenske和Cullis,Expert OpinDrug Deliv.2008 5:25-44；Peer等人,Science.2008 319:627-630；Peer和Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127-1133；所述全部文献通过引用的方式完整并入本文)。将制剂被动靶向至肝脏细胞的一个例子包括基于DLin-DMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA-的脂质纳米粒子制剂，其中已经显示所述制剂与载脂蛋白E结合并在体内促进这些制剂的结合及其摄入肝细胞(Akinc等人,Mol Ther.2010 18:1357-1364；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。制剂也可以通过在其表面上表达不同配体被选择性地靶向，作为示例如叶酸靶向、转铁蛋白靶向、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)靶向和抗体靶向方案，但不限于此(Kolhatkar等人,Curr Drug Discov Technol.2011 8:197-206；Musacchio和Torchilin,FrontBiosci.2011 16:1388-1412；Yu等人,Mol Membr Biol.2010 27:286-298；Patil等人,CritRev Ther Drug Carrier Syst.2008 25:1-61；Benoit等人,Biomacromolecules.2011 12:2708-2714；Zhao等人,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:309-319；Akinc等人,MolTher.2010 18:1357-1364；Srinivasan等人,Methods Mol Biol.2012 820:105-116；Ben-Arie等人,Methods Mol Biol.2012 757:497-507；Peer 2010J Control Release.20:63-68；Peer等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104:4095-4100；Kim等人,Methods MolBiol.2011 721:339-353；Subramanya等人,Mol Ther.2010 18:2028-2037；Song等人,NatBiotechnol.2005 23:709-717；Peer等人,Science.2008 319:627-630；Peer andLieberman,Gene Ther.2011 18:1127-1133；所述全部文献通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，多核苷酸配制为固态脂质纳米粒子。固态脂质纳米粒子(SLN)可以为球状，平均直径在10至1000nm之间。SLN拥有可以溶解亲脂分子并可以用表面活性剂和/或乳化剂稳定化的固态脂质核芯基质。在又一个实施方案中，脂质纳米粒子可以是自装配脂质-聚合物纳米粒子(参见Zhang等人,ACS Nano,2008,2(8),第1696–1702页；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。作为一个非限制性例子，SLN可以是在国际专利公开号WO2013105101中描述的SLN，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为另一个非限制性例子，SLN可以通过国际专利公开号WO2013105101中描述的方法或过程产生，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
脂质体、脂质-核酸复合物或脂质纳米粒子可以用来改善多核苷酸指导的蛋白质产生的效率，因为这些制剂可能能够增加多核苷酸转染细胞；和/或增加所编码蛋白质的翻译。这样一个例子涉及使用脂质包封过程，以能够有效全身性递送polyplex质粒DNA(Heyes等人,Mol Ther.2007 15:713-720；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。脂质体、脂质-核酸复合物或脂质纳米粒子也可以用来增加多核苷酸的稳定性。
在一个实施方案中，可以配制本发明的多核苷酸，用于控释和/或靶向递送。如本文所用，“控释”指符合特定释放模式以实现治疗结果的药物组合物或化合物释放谱。在一个实施方案中，多核苷酸可以包封入本文所述和/或本领域已知的递送剂中，以便控释和/或靶向递送。如本文所用，术语“包封”意指围绕、包围或包裹。在它涉及本发明化合物的制剂时，包封可以是基本上的、完全的或部分的。术语“基本上包封”意指至少大于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.9％或大于99.999％的本发明药物组合物或化合物可以封闭、包围或包裹在递送剂内部。“部分包封”意指小于10％、10％、20％、30％、40％、50％或更少的本发明药物组合物或化合物可以封闭、包围或包裹在递送剂内部。有利地，可以通过使用荧光和/或电子显微照片测量本发明药物组合物或化合物的逃逸或活性，测定包封。例如，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大99.99％的本发明药物组合物或化合物包封在递送剂中。
在一个实施方案中，控释制剂可以包括，但不限于三嵌段共聚物。作为一个非限制性例子，制剂可以包括两个不同类型的三嵌段共聚物(国际公开号WO2012131104和WO2012131106；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。
在另一个实施方案中，多核苷酸可以包封入脂质纳米粒子或消除快速的脂质纳米粒子中，并且脂质纳米粒子或消除快速的脂质纳米粒子随后可以包封入本文所述的和/或本领域已知的聚合物、水凝胶和/或手术密封剂中。作为一个非限制性例子，聚合物、水凝胶或外科密封剂可以是PLGA、乙烯醋酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、(Nanotherapeutics,Inc.Alachua,FL)、(Halozyme Therapeutics,SanDiego CA)、外科密封剂如纤维蛋白原聚合物(Ethicon Inc.Cornelia,GA)、(Baxter International,Inc Deerfield,IL)、基于PEG的密封剂和(BaxterInternational,Inc Deerfield,IL)。
在另一个实施方案中，脂质纳米粒子可以包封到本领域已知的可以在注入受试者时形成凝胶的任何聚合物中。作为另一个非限制性例子，脂质纳米粒子可以包封入可以呈生物可降解的聚合物基质中。
在一个实施方案中，用于控释和/或靶向递送的多核苷酸制剂还可以包含至少一种控释涂覆物。控释涂覆物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、EUDRAGITEUDRAGIT和纤维素衍生物如乙基纤维素含水分散体(和)。控释和/或靶向递送制剂在国际专利申请号PCT/US2014/027077中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文，并且制剂的非限制性例子在第[000515]–[000519]段中。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以包封于治疗性纳米粒子(包括ACCURINSTM)中。治疗性纳米粒子可以通过本文所述的和本领域已知(如，但不限于，国际专利申请号PCT/US2014/027077(代理人案号M030.20)，如在第[000519]–[000551]段中)的方法配制，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个例子，治疗性纳米粒子可以是缓释纳米粒子，如在国际专利申请号PCT/US2014/027077(代理人案号M030.20)中，如在第[000531]–[000533]段中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的纳米粒子可以包含聚合物基质。作为一个非限制性例子，纳米粒子可以包含两种或更多种聚合物，如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羟酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯)亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟-L-脯氨酸酯)或其组合。
在一个实施方案中，治疗性纳米粒子包含双嵌段共聚物。在一个实施方案中，双嵌段共聚物可以包含与以下聚合物组合的PEG，如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羟酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯)亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟-L-脯氨酸酯)或其组合。在另一个实施方案中，双嵌段共聚物可以包含欧洲专利公开号中描述的双嵌段共聚物，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。在另一个实施方案中，双嵌段共聚物可以是高-X双嵌段共聚物，如国际专利公开号WO2013120052中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在又一个非限制性例子中，脂质纳米粒子包含嵌段共聚物PEG-PLGA-PEG(参见例如，使用热敏感水凝胶(PEG-PLGA-PEG)作为Lee等人,Thermosensitive Hydrogel as aTgf-β1Gene Delivery Vehicle Enhances Diabetic Wound Healing.PharmaceuticalResearch,2003 20(12):1995-2000中的TGF-β1基因递送载具；作为Li等人,ControlledGene Delivery System Based on Thermosensitive BiodegradableHydrogel.Pharmaceutical Research 2003 20(6):884-888；和Chang等人,Non-ionicamphiphilic biodegradable PEG-PLGA-PEG copolymer enhances gene deliveryefficiency in rat skeletal muscle.J Controlled Release.2007 118:245-253中的受控基因递送系统；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。本发明的多核苷酸可以在包含PEG-PLGA-PEG嵌段共聚物的脂质纳米粒子中配制。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以包封在合成性纳米载体中。合成纳米粒子可以通过本文所述的和本领域已知的方法配制如，但不限于，国际专利申请号PCT/US2014/027077(代理人案号M030.20)，如在第[000552]–[000563]段中的方法，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，多核苷酸可以包封于两性离子脂质内、与之连接和/或缔合。两性离子脂质的非限制性例子和使用两性离子脂质的方法在美国专利公开号US20130216607中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。在一个方面，两性离子脂质可以用于本文所述的脂质体和脂质纳米粒子中。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在胶态纳米载体中配制，如美国专利公开号US20130197100中所述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，纳米粒子可以优化，用于口服施用。纳米粒子可以包含至少一种阳离子生物聚合物，如，但不限于壳聚糖或其衍生物。作为一个非限制性例子，纳米粒子可以通过美国公开号20120282343中描述的方法配制；所述文献通过引用方式完整并入本文。
在一些实施方案中，LNP包含脂质KL52(美国申请公开号2012/0295832中公开的氨基-脂质，所述文献通过引用的方式明确地完整并入本文)。可以通过掺入这类脂质改善LNP施用的活性和/或安全性(如通过检查ALT/AST、白细胞计数和细胞因子诱导中一者或多者所测量)。包含KL52的LNP可以静脉内施用和/或按一个或多个剂量施用。在一些实施方案中，与包含MC3的LNP相比，施用包含KL52的LNP导致相等或改善的mRNA和/或蛋白质表达。
在一些实施方案中，多核苷酸可以使用更小的LNP递送。这类粒子可以包含低于0.1μm直至100nm的直径，如，但不限于小于0.1μm、小于1.0μm、小于5μm、小于10μm、小于15μm、小于20μm、小于25μm、小于30μm、小于35μm、小于40μm、小于50μm、小于55μm、小于60μm、小于65μm、小于70μm、小于75μm、小于80μm、小于85μm、小于90μm、小于95μm、小于100μm、小于125μm、小于150μm、小于175μm、小于200μm、小于225μm、小于250μm、小于275μm、小于300μm、小于325μm、小于350μm、小于375μm、小于400μm、小于425μm、小于450μm、小于475μm、小于500μm、小于525μm、小于550μm、小于575μm、小于600μm、小于625μm、小于650μm、小于675μm、小于700μm、小于725μm、小于750μm、小于775μm、小于800μm、小于825μm、小于850μm、小于875μm、小于900μm、小于925μm、小于950μm、小于975μm的直径。
在另一个实施方案中，多核苷酸可以使用更小的LNP递送，所述LNP可以包含约1nm至约100nm、约1nm至约10nm、约1nm至约20nm、约1nm至约30nm、约1nm至约40nm、约1nm至约50nm、约1nm至约60nm、约1nm至约70nm、约1nm至约80nm、约1nm至约90nm、约5nm至约100nm、约5nm至约10nm、约5nm至约20nm、约5nm至约30nm、约5nm至约40nm、约5nm至约50nm、约5nm至约60nm、约5nm至约70nm、约5nm至约80nm、约5nm至约90nm、约10至约50nm、约20至约50nm、约30至约50nm、约40至约50nm、约20至约60nm、约30至约60nm、约40至约60nm、约20至约70nm、约30至约70nm、约40至约70nm、约50至约70nm、约60至约70nm、约20至约80nm、约30至约80nm、约40至约80nm、约50至约80nm、约60至约80nm、约20至约90nm、约30至约90nm、约40至约90nm、约50至约90nm、约60至约90nm和/或约70至约90nm的直径。
在一些实施方案中，用包括微流体混合器的方法，合成这类LNP。示例性微流体混合器可以包括但不限于狭长口交指型微混合器(slit interdigitial mixer)，包括但不限于Microinnova(Allerheiligen bei Wildon，奥地利)制造的那些和/或交错人字形微量混合器(SHM)(Zhigaltsev,I.V.等人,Bottom-up design and synthesis of limit sizelipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores usingmillisecond microfluidic mixing have been published(Langmuir.2012.28:3633-40；Belliveau,N.M.等人,Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipidnanoparticles for in vivo delivery of siRNA.Molecular Therapy-NucleicAcids.2012.1:e37；Chen,D.等人,Rapid discovery of potent siRNA-containing lipidnanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.J Am ChemSoc.2012.134(16):6948-51；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。在一些实施方案中，包括SHM的LNP产生方法进一步包括混合至少两股输入流，其中混合因微观结构诱导的混沌对流(MICA)而发生。根据这种方法，流体流流经人字形花纹中存在的通道，造成旋转流动并且折叠彼此周围的流体。这种方法还可以包括用于流体混合的表面，其中所述表面在流体循环期间改变取向。使用SHM产生LNP的方法包括在美国申请公开号2004/0262223和2012/0276209中公开的那些，所述文献的每一篇通过引用的方式明确地完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以在使用微量混合器产生的脂质纳米粒子中配制，所述微量混合器例如是但不限于狭长口交指型微观结构混合物(SIMM-V2)或标准狭长交指型微量混合器(SSIMM)或来自Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH,Mainz德国的Caterpillar(CPMM)或Impinging-jet(IJMM)。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以在使用微流体技术产生的脂质纳米粒子中配制(参见Whitesides,George M.The Origins and the Future ofMicrofluidics.Nature,2006 442:368-373；以及Abraham等人,Chaotic Mixer forMicrochannels.Science,2002 295:647-651；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。作为一个非限制性例子，受控微流体制剂包括在微量通道中以低雷诺数来混合稳压驱动流量的流动的被动方法(参见例如，Abraham等人,Chaotic Mixer forMicrochannels.Science,2002 295:647-651；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以在使用微量混合器芯片产生的脂质纳米粒子中配制，所述微量混合器芯片例如是但不限于来自Harvard Apparatus(Holliston,MA)或Dolomite Microfluidics(Royston,UK)的那些。微量混合器芯片可以用于以分割和重组机制快速混合两种或更多种流体流。
在一个实施方案中，可以使用国际专利公开号WO2013063468或美国专利号8,440,614中描述的药物包封微球，配制本发明的多核苷酸以便递送，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。微球可以包含如国际专利申请号WO2013063468中描述的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。在另一个方面，氨基酸、肽、多肽、脂质(APPL)可用于递送本发明的多核苷酸至细胞(参见国际专利公开号WO2013063468，所述文献通过引用方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以在具有约10nm至约100nm，如，但不限于约10nm至约20nm、约10nm至约30nm、约10nm至约40nm、约10nm至约50nm、约10nm至约60nm、约10nm至约70nm、约10nm至约80nm、约10nm至约90nm、约20nm至约30nm、约20nm至约40nm、约20nm至约50nm、约20nm至约60nm、约20nm至约70nm、约20nm至约80nm、约20nm至约90nm、约20nm至约100nm、约30nm至约40nm、约30nm至约50nm、约30nm至约60nm、约30nm至约70nm、约30nm至约80nm、约30nm至约90nm、约30nm至约100nm、约40nm至约50nm、约40nm至约60nm、约40nm至约70nm、约40nm至约80nm、约40nm至约90nm、约40nm至约100nm、约50nm至约60nm、约50nm至约70nm约50nm至约80nm、约50nm至约90nm、约50nm至约100nm、约60nm至约70nm、约60nm至约80nm、约60nm至约90nm、约60nm至约100nm、约70nm至约80nm、约70nm至约90nm、约70nm至约100nm、约80nm至约90nm、约80nm至约100nm和/或约90nm至约100nm直径的脂质纳米粒子中配制。
在一个实施方案中，脂质纳米粒子可以具有约10至500nm的直径。
在一个实施方案中，脂质纳米粒子可以具有大于100nm、大于150nm、大于200nm、大于250nm、大于300nm、大于350nm、大于400nm、大于450nm、大于500nm、大于550nm、大于600nm、大于650nm、大于700nm、大于750nm、大于800nm、大于850nm、大于900nm、大于950nm或大于1000nm的直径。
在一个方面，脂质纳米粒子可以是国际专利公开号WO2013059922中描述的限制大小的脂质纳米粒子，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。限制大小的脂质纳米粒子可以包含包围含水核芯或疏水核芯的脂质双层；其中脂质双层可以包含磷脂，如，但不限于二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂、脑苷脂、C8-C20脂肪酸二酰基磷脂酰胆碱和1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)。在另一个方面，限制大小的脂质纳米粒子可以包含聚乙烯二醇-脂质，如，但不限于DLPE-PEG、DMPE-PEG、DPPC-PEG和DSPE-PEG。
在一个实施方案中，可以使用国际专利公开号WO2013063530中描述的递送方法，将多核苷酸递送、定位于和/或浓集于特定位置中，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，可以在递送多核苷酸至受试者之前、与之同时或之后，向受试者施用空聚合物粒子。一旦与受试者接触，空聚合物粒子发生体积变化并且在受试者中的特定位置埋入、嵌入、固定化或包埋。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在活性物质释放系统中配制(参见例如，美国专利公开号US20130102545，所述文献通过引用方式完整并入本文)。活性物质释放系统可以包含1)至少一个纳米粒子，其与杂交于催化活性核酸的寡核苷酸抑制物链结合，和2)与结合至治疗活性物质(例如，本文所述的多核苷酸)的至少一个底物分子结合的化合物，其中通过催化活性核酸切割底物分子，释放治疗活性物质。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在纳米粒子中配制，所述纳米粒子包含了包含非细胞物质的内芯和包含细胞膜的外表面。细胞膜可以衍生自细胞或衍生自衍生病毒的膜。作为一个非限制性例子，纳米粒子可以通过国际专利公开号WO2013052167中描述的方法产生，所述文献通过引用方式完整并入本文。作为另一个非限制性例子，通过国际专利公开号WO2013052167(引用方式完整并入本文)中描述的纳米粒子，可以用来递送本文所述的多核苷酸。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在多孔纳米粒子-支持的脂质双层(原细胞)中配制。原细胞在国际专利公开号WO2013056132中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸可以在如下述文献中所述或通过下述文献中描述的方法产生的聚合物纳米粒子中配制：美国专利号8,420,123和8,518,963和欧洲专利号EP2073848B1，所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整地并入本文。作为一个非限制性例子，聚合物纳米粒子可以具有高玻璃转化温度，如美国专利号8,518,963中描述的纳米粒子或通过美国专利号8,518,963中描述的方法产生的纳米粒子，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为另一个非限制性例子，用于口服、肠胃外和局部用制剂的聚合物纳米粒子可以是通过欧洲专利号EP2073848B1中描述的方法产生，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，本文所述的多核苷酸可以在用于成像的纳米粒子中配制。纳米粒子可以是脂质体纳米粒子，如美国专利公开号US20130129636中描述的那些，所述文献通过引用方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，脂质体可以包含钆(III)2-{4,7-双-羧甲基-10-[(N,N-双硬脂基氨基甲基-N′-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四-氮杂环十二碳-1-基}-乙酸和中性的完全饱和磷脂组分(参见例如，美国专利公开号US20130129636，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，可以在本发明中使用的纳米粒子通过美国专利申请号US20130130348中描述的方法形成，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
本发明的纳米粒子还可以包含养分，如，但不限于其缺陷可能导致从贫血至神经管缺陷的健康危害的那些养分(参见例如，国际专利公开号WO2013072929中描述的纳米粒子，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。作为一个非限制性例子，养分可以是处于亚铁、三价铁盐或元素铁形式的铁、碘、叶酸、维生素或微养分。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以在可溶胀纳米粒子中配制。可溶胀纳米粒子可以是，但不限于，在美国专利号8,440,231中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为非限制性实施方案，可溶胀纳米粒子可以用于递送本发明的多核苷酸至肺系统(参见例如，美国专利号8,440,231，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
本发明的多核苷酸可以在聚酐纳米粒子中配制，如，但不限于美国专利号8,449,916中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
本发明的纳米粒子和微粒子可以在几何形状上工程化以调节巨噬细胞和/或免疫反应。在一个方面，几何形状上工程化的粒子可以具有变动的形状、大小和/或表面电荷，以便掺入本发明的多核苷酸用于靶向递送，如，但不限于肺递送(参见例如，国际公开号WO2013082111，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。几何形状上工程化的粒子可以具有的其他物理特征包括但不限于，开窗(fenestration)、角度臂、非对称性和表面粗度、可以改变与细胞和组织相互作用的电荷。作为一个非限制性例子，本发明的纳米粒子可以通过国际公开号WO2013082111中描述的方法产生，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的纳米粒子可以是水溶性纳米粒子，如，但不限于国际公开号WO2013090601中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。纳米粒子可以是具有紧凑和两性离子配体以显示良好水溶解度的无机纳米粒子。纳米粒子还可以具有小的流体动力直径(HD)，时间、pH和盐度方面的稳定性及低水平的非特异性蛋白质结合作用。
在一个实施方案中，本发明的纳米粒子可以通过美国专利公开号US20130172406中描述的方法形成，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的纳米粒子是隐形纳米粒子或靶特异性隐形纳米粒子，如，但不限于美国专利公开号US20130172406中描述的那些；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。本发明的纳米粒子可以通过美国专利公开号US20130172406中描述的方法产生，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，隐形或靶特异性隐形纳米粒子可以包含聚合物基质。聚合物基质(matrix)可以包含两种或更多种聚合物，如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羟酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚酯、聚酐、聚醚、聚氨酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯或其组合。
在一个实施方案中，纳米粒子可以是具有高密度核酸层的纳米粒子-核酸杂交分子结构。作为一个非限制性例子，纳米粒子-核酸杂交分子结构可以通过美国专利公开号US20130171646中描述的方法产生，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。纳米粒子可以包含核酸，如，但不限于本文所述和/或本领域已知的多核苷酸。
至少一个本发明纳米粒子可以嵌入纳米结构的核芯中或用能够在纳米结构内部或其表面上携带或缔合至少一个酬载的低密度多孔3-D结构或涂覆物包覆。包含至少一个纳米粒子的纳米结构的非限制性例子在国际专利公开号WO2013123523中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
聚合物、生物可降解纳米粒子和核-壳纳米粒子
本发明的多核苷酸可以使用天然聚合物和/或合成聚合物配制。可以用于递送的聚合物的非限制性例子包括但不限于来自Bio(Madison,WI)和Roche Madison(Madison,WI)的DYNAMIC(Arrowhead Research Corp.,Pasadena,CA)制剂、PHASERXTM聚合物制剂，如，而不限于SMARTT POLYMER TECHNOLOGYTM(Seattle,WA)、DMRI/DOPE、泊洛沙姆、来自Vical(San Diego,CA)的辅助剂、壳聚糖、来自Calando Pharmaceuticals(Pasadena,CA)的环糊精、树状物和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)聚合物。RONDELTM(RNAi/寡核苷酸纳米粒子递送)聚合物(Arrowhead Research Corporation,Pasadena,CA)和pH响应性嵌段共聚合物，如，但不限于(Seattle,WA)。
壳聚糖制剂的非限制性例子包括带正电荷壳聚糖的芯部和带负电荷基材的外部(美国公开号20120258176；所述文献通过引用方式完整并入本文)。壳聚糖包括，但不限于N-三甲基壳聚糖、单-N-羧甲基壳聚糖(MCC)、N-棕榈酰壳聚糖(NPCS)、EDTA-壳聚糖、低分子量壳聚糖、壳聚糖衍生物或其组合。
在一个实施方案中，本发明中所用的聚合物已经接受加工，以减少和/或抑制不期望的物质(如，但不限于细菌)与聚合物表面的结合。聚合物可以通过本领域已知的和/或所述的和/或国际公开号WO2012150467中描述的方法加工，所述文献通过引用方式完整并入本文。
PLGA制剂的非限制性例子包括但不限于PLGA可注射用储库(例如，通过在66％N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中溶解PLGA并且剩余部分是水溶剂和亮丙瑞林而形成的)。一旦注射，则PLGA和亮丙瑞林肽沉淀至皮下腔隙中。
许多的这些聚合物方案已经证明了在体内递送寡核苷酸至细胞胞质中的功效(在deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132中综述；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。已经引起显著的核酸体内递送(在这种情况下是使用小干扰性RNA(siRNA))的两种聚合物方案是动态聚缀合物(dynamic polyconjugate)和基于环糊精的纳米粒子(参见例如，美国专利公开号US20130156721，所述文献通过引用方式完整并入本文)。这些递送方案的第一种使用动态聚缀合物并且已经显示在体内在小鼠中有效递送siRNA并沉默肝细胞中的内源靶mRNA(Rozema等人,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982-12887；所述文献通过引用方式完整并入本文)。这种具体方案是多组分聚合物体系，其关键特征包括有膜活性的聚合物，所述聚合物通过二硫键与核酸(在这种情况下是siRNA)共价偶联并且其中PEG(用于电荷掩蔽)基团和N-乙酰半乳糖胺(用于肝细胞靶向)基团均通过pH敏感键连接(Rozema等人,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982-12887；所述文献通过引用方式完整并入本文)。一旦与肝细胞结合并进入内体中，聚合物复合物在低pH环境中分解，聚合物暴露其正电荷，导致siRNA逃逸内体以及从聚合物的胞质释放。通过将N-乙酰半乳糖胺基团替换为甘露糖基团，显示可以将靶向作用从表达脱唾液酸糖蛋白受体的肝细胞改变成窦样内皮和枯否细胞。另一个聚合物方案涉及使用靶向转铁蛋白的含有环糊精的聚阳离子纳米粒子。这些纳米粒子具有已证明的靶向沉默表达转铁蛋白受体的Ewing肉瘤细胞中的EWS-FLI1基因产物(Hu-Lieskovan等人,Cancer Res.2005 65:8984-8982；所述文献通过引用方式完整并入本文)并且在这些纳米粒子中配制的siRNA在非人灵长类中耐受良好(Heidel等人,Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715-21；所述文献通过引用方式完整并入本文)。这两种递送策略均合并了同时使用靶向递送和内体逃逸机理的理性方案。
聚合物制剂可以允许缓释或延迟释放多核苷酸(例如，在肌内或皮下注射之后)。改变的多核苷酸释放谱可以导致，例如，在延长的时间段范围内翻译编码的蛋白质。聚合物制剂也可以用来增加多核苷酸的稳定性。生物可降解聚合物先前已经用来保护除多核苷酸之外的核酸免于降解并且已经显示导致酬载(payload)在体内缓释(Rozema等人,ProcNatl Acad Sci U S A.2007 104:12982-12887；Sullivan等人,Expert Opin DrugDeliv.2010 7:1433-1446；Convertine等人,Biomacromolecules.2010Oct 1；Chu等人,AccChem Res.2012Jan 13；Manganiello等人,Biomaterials.2012 33:2301-2309；Benoit等人,Biomacromolecules.2011 12:2708-2714；Singha等人,Nucleic Acid Ther.2011 2:133-147；deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132；Schaffert和Wagner,GeneTher.2008 16:1131-1138；Chaturvedi等人,Expert Opin Drug Deliv.2011 8:1455-1468；Davis,Mol Pharm.2009 6:659-668；Davis,Nature 2010 464:1067-1070；所述文献的每一篇通过引用方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，药物组合物可以是缓释制剂。在又一个实施方案中，持续释放制剂可以用于皮下递送。缓释制剂可以包括但不限于PLGA微球、乙烯醋酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、(Nanotherapeutics,Inc.Alachua,FL)、(HalozymeTherapeutics,San Diego CA)、外科密封剂如纤维蛋白原聚合物(Ethicon Inc.Cornelia,GA)、(Baxter International,Inc Deerfield,IL)、基于PEG的密封剂和(Baxter International,Inc Deerfield,IL)。
作为一个非限制性例子，修饰的mRNA可以通过以下方式配制在PLGA微球中：制备具有可调释放速率(例如，数日和数周)的PLGA微球并将修饰的mRNA包封在PLGA微球中，同时在包封过程期间维持修饰的mRNA的完整性。EVAc是生物不可降解的生物相容性聚合物，所述聚合物广泛地用于中临床前缓释植入物应用(例如，延长释放产品Ocusert，用于青光眼的毛果芸香碱眼科用插入物，或progestasert，孕酮缓释子宫内装置；透皮递送系统Testoderm、Duragesic和Selegiline；导管)。泊洛沙姆F-407NF是一种亲水性、非离子型表面活性聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物，其在低于5℃的温度具有低粘度并在高于15℃的温度形成固态凝胶。基于PEG的外科密封剂包含在输送装置中混合的两种合成的PEG组分，其可以在1分钟内准备好，在3分钟内密封并且在30天内重吸。和天然聚合物能够在施用部位原位凝胶化。它们已经显示通过离子相互作用与治疗性候选蛋白质和肽相互作用以提供稳定化作用。
也可以通过表达不同配体选择性地靶向聚合物制剂，作为示例，所述配体如叶酸、转铁蛋白和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，但不限于此(Benoit等人,Biomacromolecules.201112:2708-2714；Rozema等人,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982-12887；Davis,MolPharm.2009 6:659-668；Davis,Nature 2010 464:1067-1070；所述文献的每一篇通过引用方式完整并入本文)。
本发明的多核苷酸可以用聚合化合物配制或配制在其中。聚合物可以包括至少一种聚合物，如但不限于聚乙烯、聚乙二醇(PEG)、聚(l-赖氨酸)(PLL)、接枝至PLL的PEG、阳离子脂质聚合物、生物可降解阳离子脂质聚合物、聚乙烯亚胺(PEI)、交联分枝型聚(亚烷基亚胺)、聚胺衍生物、改性泊洛沙姆、生物可降解聚合物、弹性生物可降解聚合物、生物可降解嵌段共聚物、生物可降解随机共聚物、生物可降解聚酯共聚物、生物可降解聚酯嵌段共聚物、生物可降解聚酯嵌段随机共聚物、多嵌段共聚物、线型生物可降解共聚物、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸)(PAGA)、生物可降解交联型阳离子多嵌段共聚物、聚碳酸酯、聚酐、聚羟酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟-L-脯氨酸酯)、丙烯酸聚合物、含胺的聚合物、葡聚糖聚合物、葡聚糖聚合物衍生物或其组合物。
作为一个非限制性例子，本发明的多核苷酸可以用PLL接枝的PEG的聚合化合物配制，如通过引用的方式完整并入本文的美国专利号6,177,274中所述。该制剂可以用于体外转染细胞或用于体内递送多核苷酸。在另一个例子中，多核苷酸可以是悬浮在含有阳离子聚合物的溶液或介质中、干燥药物组合物中或能够被干燥的溶液中，如美国公开号20090042829和20090042825中所述，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
作为另一个非限制性例子，本发明的多核苷酸可以用PLGA-PEG嵌段共聚物(参见美国公开号US20120004293和美国专利号8,236,330，所述文献通过引用方式完整并入本文)或PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物(参见美国专利号6,004,573，所述文献通过引用方式完整并入本文)配制。作为一个非限制性例子，本发明的多核苷酸可以用PEG和PLA或PEG和PLGA的双嵌段共聚物配制(参见美国专利号8,246,968，所述文献通过引用的方式完整并入本文)。
多胺衍生物可以用来递送核酸或治疗和/或预防疾病或纳入可植入或可注射装置中(美国公开号20100260817)(现在美的国专利号8,460,696)，所述文献每一篇的内容通过引用方式并入完整并入本文)。作为一个非限制性例子，药物组合物可以包括在美国公开号20100260817(现在的美国专利号8,460,696；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)中描述的多核苷酸及聚胺衍生物。作为一个非限制性例子，本发明的多核苷酸可以使用聚酰胺聚合物递送，如，但不限于使用包含1,3-偶极加成聚合物的聚合物递送，所述1,3-偶极加成聚合物通过合并糖二叠氮单体与含有寡胺的二炔单元制备(美国专利号8,236,280；所述文献通过引用方式完整并入本文)。
本发明的多核苷酸可以用至少一种丙烯酸聚合物配制。丙烯酸聚合物包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧乙酯、甲基丙烯酸氰乙酯、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯及其组合。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以用国际公开号WO2011115862、WO2012082574和WO2012068187和美国公开号20120283427中描述的至少一种聚合物和/或其衍生物配制，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以用如WO2011115862中所述的式Z聚合物配制，所述文献通过引用的方式完整并入本文。在又一个实施方案中，多核苷酸可以用如国际公开号WO2012082574或WO2012068187和美国公开号2012028342中所述的式Z、Z’或Z”聚合物配制，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。用本发明的修饰的RNA配制的聚合物可以通过国际公开号WO2012082574或WO2012068187中描述的方法合成，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
本发明的多核苷酸可以用至少一种丙烯酸聚合物配制。丙烯酸聚合物包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧乙酯、甲基丙烯酸氰乙酯、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯及其组合。
本发明多核苷酸的制剂可以包含至少一种含胺的聚合物，如，但不限于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰氨基胺)树状物、聚(胺-共-酯)或其组合。作为一个非限制性例子，聚(胺-共-酯)可以是在国际公开号WO2013082529中描述的和/或通过国际公开号WO2013082529中描述的方法产生的聚合物，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
例如，本发明的多核苷酸可以配制在药物化合物中，所述药物化合物包括聚(亚烷亚胺)、生物可降解阳离子脂质聚合物、生物可降解嵌段共聚物、生物可降解聚合物或生物可降解随机共聚物、生物可降解聚酯嵌段共聚物、生物可降解聚酯聚合物、生物可降解聚酯随机共聚物、线型生物可降解共聚物、PAGA、生物可降解交联型阳离子多嵌段共聚物或其组合。可以通过本领域已知的和/或在美国专利号6,696,038、美国申请号20030073619和20040142474中描述的方法产生生物可降解阳离子脂质聚合物，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。可以使用本领域已知的和/或如美国公开号20100004315中所述的方法产生聚(亚烷基亚胺)，所述文献通过引用的方式完整并入本文。可以使用本领域已知的和/或如美国专利号6,517,869和6,267,987中所述的方法产生生物可降解聚合物、生物可降解嵌段共聚物、生物可降解随机共聚物、生物可降解聚酯嵌段共聚物、生物可降解聚酯聚合物或生物可降解聚酯随机共聚物，所述每篇文献的内容通过引用的方式完整并入本文。可以使用本领域已知的和/或如美国专利号6,652,886中所述的方法产生生物可降解的线型共聚物。可以使用本领域已知的和/或如美国专利号6,217,91中所述的方法产生PAGA聚合物，所述文献通过引用的方式完整并入本文。PAGA聚合物可以与聚合物如但不限于聚-L-赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、组蛋白、抗生物素蛋白、鱼精蛋白、聚乳酸和聚(丙交酯-共-乙交酯)共聚以形成共聚物或嵌段共聚物。可以通过本领域已知的和/或在美国专利号美国专利号8,057,821、8,444,992或美国公开号2012009145中描述的方法产生生物可降解的交联的阳离子多嵌段共聚物，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。例如，可以使用线型聚乙烯亚胺(LPEI)嵌段合成多嵌段共聚物，所述LPEI嵌段与分枝的聚乙烯亚胺相比具有不同样式。另外，可以通过本领域已知、本文所述或如美国公开号20100004315或美国专利号6,267,987和6,217,912中所述的方法产生组合物或药物组合物，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
本发明的多核苷酸可以用可以含有聚阳离子侧链的至少一种可降解聚酯配制。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟-L-脯氨酸酯)及其组合。在另一个实施方案中，可降解聚酯可以包含PEG缀合物以形成聚乙二醇化聚合物。
本发明的多核苷酸可以用至少一种可交联聚酯配制。可交联聚酯包括本领域已知的并且在美国公开号20120269761中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
本发明的多核苷酸可以在至少一种环糊精聚合物中或用其配制。环糊精聚合物和产生环糊精聚合物的方法包括本领域已知的并且在美国公开号20130184453中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以在至少一种交联型阳离子结合性聚合物中或用其配制。交联型阳离子结合性聚合物和产生交联型阳离子结合性聚合物的方法包括本领域已知的并且在国际专利公开号WO2013106072、WO2013106073和WO2013106086中描述的那些，所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以配制在至少一种支链型聚合物中或用其配制。支链型聚合物和产生支链型聚合物的方法包括本领域已知的并且在国际专利公开号WO2013113071中描述的那些，所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以配制在聚乙二醇化的白蛋白聚合物中或用其配制至少。聚乙二醇化的白蛋白聚合物和产生聚乙二醇化的白蛋白聚合物的方法包括本领域已知的并且在美国专利公开号US20130231287中描述的那些，所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的聚合物可以缀合至脂质封端的PEG。作为一个非限制性例子，PLGA可以缀合至形成脂质封端的PEG的PLGA-DSPE-PEG。作为另一个非限制性例子，国际公开号WO2008103276中描述了随本发明一起使用的PEG缀合物，所述文献通过引用的方式完整并入本文。聚合物可以使用配体缀合物缀合，如，但不限于美国专利号8,273,363中描述的缀合物缀合，所述文献通过引用方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本文公开的多核苷酸可以在施用之前与PEG或磷酸钠/碳酸钠溶液混合。在另一个实施方案中，编码目的蛋白的多核苷酸可以与PEG混合并且还与磷酸钠/碳酸钠溶液混合。在又一个实施方案中，编码目的蛋白的多核苷酸可以与PEG混合并且编码第二目的蛋白的多核苷酸可以与磷酸钠/碳酸钠溶液混合。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸可以另一个化合物与缀合。缀合物的非限制性例子在美国专利号7,964,578和7,833,992中描述，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。在另一个实施方案中，本发明的修饰的RNA可以与如美国专利号7,964,578和7,833,992中所述的式1-122缀合物缀合，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。本文所述的多核苷酸可以与金属(如，但不限于金)缀合。(参见例如，Giljohann等人,Journ.Amer.Chem.Soc.2009 131(6):2072-2073；所述文献通过引用方式完整并入本文)。在另一个实施方案中，本文所述的多核苷酸可以与金-纳米粒子缀合和/或包封在金-纳米粒子中。(国际公开号WO201216269和美国公开号20120302940和US20130177523；所述文献每一篇的内容通过引用方式并入完整并入本文)。
如通过引用方式完整并入本文的美国公开号20100004313中所述，基因递送组合物可以包含核苷酸序列和泊洛沙姆。例如，本发明的多核苷酸可以用于美国公开号20100004313中描述的含有泊洛沙姆的基因递送组合物中。
在一个实施方案中，本发明的聚合物制剂可以通过以下方式稳定化：将可以包括阳离子载体的聚合物制剂与可以共价连接至胆固醇和聚乙二醇基团的阳离子脂质聚合物接触。可以使用美国公开号20090042829中描述的方法，使聚合物制剂与阳离子脂质聚合物接触，所述方法通过引用的方式完整并入本文。阳离子载体可以包括，但不限于聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚亚丙基亚胺、氨基糖甙类-聚胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚(2-二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树状物、壳聚糖、1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷)(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1-[2-(油酰氧)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)氯化咪唑鎓(DOTIM)、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺羰酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)、3B-[N-(N′,N′-二甲氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇HCl)、双十七烷基氨基甘氨酰亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)及其组合。作为一个非限制性例子，多核苷酸可以用阳离子脂质聚合物配制，如美国专利申请号20130065942中描述的那些，所述文献通过引用方式完整并入本文。
本发明的多核苷酸可以在一种或多种聚合物的多重物(polyplex)中配制(参见例如，美国专利号8,501,478、美国公开号20120237565和20120270927和20130149783和国际专利公开号WO2013090861；所述文献每一篇的内容通过引用方式并入完整并入本文)。作为一个非限制性例子，多重物可以使用国际公开号WO2013090861中描述的新颖α-氨基酰胺聚合物形成，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为另一个非限制性例子，多重物可以使用美国专利号8,501,478中描述的点击聚合物形成，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，多重物包含两种或更多种阳离子聚合物。阳离子聚合物可以包括聚(乙烯)亚胺)(PEI),如线型PEI。在另一个实施方案中，多重物包括p(TETA/CBA)、其聚乙二醇化类似物p(TETA/CBA)-g-PEG2k及其混合物(参见例如，美国专利公开号US20130149783，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
也可以使用聚合物、脂质和/或其他生物可降解物质(如，但不限于磷酸钙)的组合，将本发明的多核苷酸配制为纳米粒子。各组分可以在核-壳、杂合和/或层-接-层构造中合并，以允许精细调节纳米粒子，从而可以增强多核苷酸的递送(Wang等人,NatMater.2006 5:791-796；Fuller等人,Biomaterials.2008 29:1526-1532；DeKoker等人,Adv Drug Deliv Rev.2011 63:748-761；Endres等人,Biomaterials.2011 32:7721-7731；Su等人,Mol Pharm.2011Jun 6；8(3):774-87；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。作为一个非限制性例子，纳米粒子可以包含多种聚合物，如，但不限于亲水-疏水聚合物(例如，PEG-PLGA)，疏水聚合物(例如，PEG)和/或亲水聚合物(国际公开号WO20120225129；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
作为另一个非限制性例子，包含用于多核苷酸的亲水聚合物的纳米粒子可以是在国际专利公开号WO2013119936中描述或通过国际专利公开号WO2013119936中描述的方法产生的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，可以在本发明中使用的生物可降解聚合物是聚(醚-酐)嵌段共聚物。作为一个非限制性例子，本文所用的生物可降解聚合物可以是如通过引用方式完整并入本文的国际专利公开号WO2006063249中所述的或借助通过引用方式完整并入本文的国际专利公开号WO2006063249中描述的方法产生的嵌段共聚物。
在另一个实施方案中，可以在本发明中使用的生物可降解聚合物是烷基和环烷基封端的生物可降解脂质。作为一个非限制性例子，烷基和环烷基封端的生物可降解脂质可以是在国际公开号WO2013086322中描述的和/或通过国际公开号WO2013086322中描述的方法产生的聚合物，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在又一个实施方案中，可以在本发明中使用的生物可降解聚合物是具有一个或多个位于脂质部分中的生物可降解基团的阳离子脂质。作为一个非限制性例子，生物可降解脂质可以是在美国专利公开号US20130195920中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
与脂质和/或聚合物组合的生物可降解磷酸钙纳米粒子已经显示在体内递送多核苷酸。在一个实施方案中，脂质包覆的磷酸钙纳米粒子(其还可以含有靶向配体如茴香酰胺)可以用来递送本发明的多核苷酸。例如，为了在小鼠转移性肺模型中有效递送siRNA，使用脂质包覆的磷酸钙纳米粒子(Li等人,J Contr Rel.2010 142:416-421；Li等人,J ContrRel.2012 158:108-114；Yang等人,Mol Ther.2012 20:609-615；所述文献通过引用方式完整并入本文)。这种递送系统结合靶向的纳米粒子和增强内体逃逸的组分(磷酸钙)，以改善siRNA的递送。
在一个实施方案中，磷酸钙连同PEG-聚阴离子嵌段共聚物可以用来递送多核苷酸(Kazikawa等人,J Contr Rel.2004 97:345-356；Kazikawa等人,J Contr Rel.2006 111:368-370；所述每份文献的内容通过引用方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，PEG-电荷可转化聚合物(Pitella等人,Biomaterials.201132:3106-3114；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)可以用来形成递送本发明的多核苷酸的纳米粒子。PEG-电荷-可转化聚合物可以通过在酸性pH被切割成聚阳离子而改善PEG-聚阴离子嵌段共聚物，由此增强内体逃逸。
在一个实施方案中，本发明中使用的聚合物可以是五嵌段聚合物，如，但不限于国际专利公开号WO2013055331中描述的五嵌段聚合物，所述文献通过引用方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，五嵌段聚合物包含PGA-PCL-PEG-PCL-PGA，其中PEG是聚乙二醇，PCL是聚(E-己内酯)、PGA是聚(乙醇酸)，PLA是聚(乳酸)。作为另一个非限制性例子，五嵌段聚合物包含sPEG-PCL-PLA-PCL-PEG，其中PEG是聚乙二醇，PCL是聚(E-己内酯)、PGA是聚(乙醇酸)，PLA是聚(乳酸)。
在一个实施方案中，可以在本发明中使用的聚合物包含至少一种二环氧乙烷和至少一种氨基糖苷(参见例如，国际专利公开号WO2013055971，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。二环氧乙烷可以选自，但不限于1,4丁二醇二环氧甘油醚(1,4B)，1,4-环己烷二甲醇二环氧甘油醚(1,4C)、4-乙烯基环己烯二环氧乙烷(4VCD)、乙二醇二环氧甘油醚(EDGE)、甘油二环氧甘油醚(GDE)、新戊二醇二环氧甘油醚(NPDGE)、聚(乙烯二醇)二环氧甘油醚(PEGDE)、聚(丙二醇)二环氧甘油醚(PPGDE)和间苯二酚二环氧甘油醚(RDE)。氨基糖苷类可以选自，但不限于链霉素、新霉素、弗氏菌丝素、巴龙霉素、核糖霉素、卡那霉素、阿米卡星、阿贝卡星、卡那霉素B、地贝卡星、妥布霉素、壮观霉素、潮霉素、庆大霉素、奈替米星、西索米星、异帕米星、威达米星、阿司米星和安普霉素。作为一个非限制性例子，聚合物可以通过国际专利公开号WO2013055971中描述的方法产生，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为另一个非限制性例子，包含了含有至少一种二环氧乙烷和至少一种氨基糖苷的任何聚合物的组合物可以通过国际专利公开号WO2013055971中描述的方法产生，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，可以在本发明中使用的聚合物可以是交联型聚合物。作为一个非限制性例子，交联型聚合物可以用来形成如美国专利号8,414,927中所述的粒子，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为另一个非限制性例子，交联型聚合物可以通过美国专利公开号US20130172600中描述的方法获得，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，可以在本发明中使用的聚合物可以是交联型聚合物，如美国专利号8,461,132中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，交联型聚合物可以用于治疗身体组织的治疗性组合物中。可以使用本领域已知的和/或本文所述的多种方法如注射或插管术，将治疗性组合物施用至受损的组织。
在一个实施方案中，可以在本发明中使用的聚合物可以是二脂族取代的聚乙二醇化脂质，如，但不限于国际专利公开号WO2013049328中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，嵌段共聚物是PEG-PLGA-PEG(参见例如，热敏感水凝胶(PEG-PLGA-PEG)，用作Lee等人,Thermosensitive Hydrogel as a Tgf-β1Gene DeliveryVehicle Enhances Diabetic Wound Healing.Pharmaceutical Research,2003 20(12):1995-2000中的TGF-β1基因递送载具；作为Li等人,Controlled Gene Delivery SystemBased on Thermosensitive Biodegradable Hydrogel.Pharmaceutical Research 200320(6):884-888；和Chang等人,Non-ionic amphiphilic biodegradable PEG-PLGA-PEGcopolymer enhances gene delivery efficiency in rat skeletal muscle.JControlled Release.2007 118:245-253中的受控基因递送系统；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)，可以用于本发明中。本发明可以用PEG-PLGA-PEG配制用于施用，如，但不限于肌内和皮下施用。
在另一个实施方案中，PEG-PLGA-PEG嵌段共聚物在本发明中使用，以形成生物可降解的缓释系统。在一个方面，本发明的多核苷酸在施用之前与嵌段共聚物混合。在另一个方面，本发明的多核苷酸酸与嵌段共聚物共施用。
在一个实施方案中，本发明中使用的聚合物可以是多功能聚合物衍生物，如，但不限于多功能N-马来酰亚胺-巯基基聚合物衍生物，如美国专利号US8454946中所述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
核-壳纳米粒子的用途还集中于合成阳离子交联纳米凝胶核芯和各种壳的高通量方案(Siegwart等人,Proc Natl Acad Sci USA.2011 108:12996-13001；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。可以通过改变纳米粒子的核芯组分和壳组分的化学组成精确地控制聚合物纳米粒子的复合、递送和内化。例如，核-壳纳米粒子可以在将胆固醇共价连接至纳米粒子后有效地递送siRNA至小鼠肝细胞。
在一个实施方案中，包含PLGA中间层的中空脂质芯部和含有PEG的中性脂质外层可以用来递送本发明的多核苷酸。作为一个非限制性例子，在携带表达萤光素酶的肿瘤的小鼠中测得，与常规的脂质-核酸复合物相比，脂质-聚合物-脂质杂合纳米粒子显著地抑制萤光素酶表达(Shi等人,Angew Chem Int Ed.2011 50:7027-7031；所述文献通过引用方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，脂质纳米粒子可以包含本文公开的多核苷酸芯部和聚合物壳。聚合物壳可以是本文所述的任何聚合物并且是本领域已知的。在一个额外的实施方案中，聚合物壳可以用来保护核芯中的多核苷酸。
美国专利号8,313,777或国际专利公开号WO2013124867中描述了与本发明的多核苷酸一起使用的核–壳纳米粒子，并且这些纳米粒子可以通过这两个文献中描述的方法形成，所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整地并入本文。
在一个实施方案中，核-壳纳米粒子可以包含本文公开的多核苷酸芯部和聚合物壳。聚合物壳可以是本文所述的任何聚合物并且是本领域已知的。在一个额外的实施方案中，聚合物壳可以用来保护核芯中的多核苷酸。
在一个实施方案中，随本文所述的制剂一起使用的聚合物可以是如国际公开号WO2011120053中所述的改性聚合物(如，但不限于改性聚缩醛)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，制剂可以是包含聚合物载体和至少一个核酸分子的聚合载体-载货复合物。聚合载体-载货复合物的非限制性例子在国际专利公开号WO2013113326、WO2013113501、WO2013113325，WO2013113502和WO2013113736和欧洲专利公开号EP2623121中描述，所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。在一个方面，聚合载体-载货复合物可以包含带负电荷的核酸分子，如，但不限于国际专利公开号WO2013113325和WO2013113502中描述的那些，所述每份文献的内容通过引用方式完整并入本文。
在一个实施方案中，药物组合物可以包含本发明的多核苷酸和聚合载体-载货复合物。多核苷酸可以编码目的蛋白，如，但不限于来自与感染性疾病相关的病原体的抗原、与过敏或变应性疾病相关的抗原、与自身免疫疾病相关的抗原或与癌症或肿瘤疾病相关的抗原(参见例如，国际专利公开号WO2013113326、WO2013113501、WO2013113325、WO2013113502和WO2013113736和欧洲专利公开号EP2623121中描述的抗原，所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文)。
作为一个非限制性例子，核-壳纳米粒子可以用来治疗眼部疾病或病症(参见例如美国公开号20120321719，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，随本文所述的制剂一起使用的聚合物可以是如国际公开号WO2011120053中所述的改性聚合物(如，但不限于改性聚缩醛)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
肽和蛋白质
本发明的多核苷酸可以随肽和/或蛋白质一起配制，以提高多核苷酸对细胞的转染。在一个实施方案中，诸如但不限于细胞渗透性肽的肽和能够实现胞内递送的蛋白质和肽，可以用来递送药物制剂。可以随本发明药物制剂使用的细胞渗透性肽的非限制性例子包括与促进递送至细胞内间隙的聚阳离子连接的细胞渗透肽序列，例如，HIV衍生的TAT肽、渗透素(penetratin)、transportan或hCT衍生的细胞渗透肽(参见，例如，Caron等人,Mol.Ther.3(3):310-8(2001)；Langel,Cell-Penetrating Peptides:Processes andApplications(CRC Press,Boca Raton FL,2002)；El-Andaloussi等人,Curr.Pharm.Des.11(28):3597-611(2003)；和Deshayes等人,Cell.Mol.Life Sci.62(16):1839-49(2005)，所述全部文献均通过引用的方式完整并入本文)。也可以配制组合物使其包含增强该组合物递送至细胞内间隙的细胞渗透物质，例如，脂质体。本发明的多核苷酸可以与肽和/或蛋白质复合，如，但不限于来自Aileron Therapeutics(Cambridge,MA)和Permeon Biologics(Cambridge,MA)的肽和/或蛋白质，以实现胞内递送(Cronican等人,ACS Chem.Biol.2010 5:747-752；McNaughton等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2009 106:6111-6116；Sawyer,Chem Biol Drug Des.2009 73:3-6；Verdine and Hilinski,MethodsEnzymol.2012；503:3-332；503：3-33；所述全部文献均通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，细胞渗透性多肽可以包含第一结构域和第二结构域。第一结构域可以包含超正电荷的多肽。第二结构域可以包含蛋白质-结合配偶体。如本文所用，“蛋白质-结合配偶体”包括，但不限于抗体及其功能性片段、支架蛋白或肽。细胞渗透性多肽还可以包含针对蛋白质-结合配偶体的胞内结合配偶体。细胞渗透性多肽可能能够从其中可以引入多核苷酸的细胞分泌出来。
包含肽或蛋白质的制剂可以用来通过多核苷酸转染，改变多核苷酸的生物分布(例如，通过靶向特定组织或细胞类型)，和/或增加所编码蛋白质的翻译。(参见例如，国际公开号WO2012110636和WO2013123298；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，细胞渗透性肽可以是，但不限于美国专利公开号US20130129726、US20130137644和US20130164219中描述的那些，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
细胞
可以将本发明的多核苷酸离体转染至细胞中，所述细胞随后移植至受试者中。作为非限制性例子，药物组合物可以包含向肝和髓样细胞递送修饰的RNA的红细胞、在病毒样粒子(VLP)中递送修饰的RNA的病毒体和电穿孔的递送修饰的RNA的细胞，如，但不限于来自(Gaithersburg,MD)和来自(Lyon,法国)的细胞。已经文献报告了使用红细胞、病毒粒子和电穿孔的细胞递送除多核苷酸之外的酬载的例子(Godfrin等人,Expert Opin Biol Ther.2012 12:127-133；Fang等人,Expert Opin Biol Ther.201212:385-389；Hu等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2011 108:10980-10985；Lund等人,Pharm Res.2010 27:400-420；Huckriede等人,J Liposome Res.2007；17:39-47；Cusi,HumVaccin.2006 2:1-7；de Jonge等人,Gene Ther.2006 13:400-411；所述全部文献均通过引用的方式完整并入本文)。
可以在通过国际公开号WO2011085231和WO2013116656和美国公开号20110171248中所述方法合成的合成性VLP中递送多核苷酸，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
本发明多核苷酸的基于细胞的制剂可以用来确保细胞转染(例如，在细胞载体中)、改变多核苷酸的生物分布(例如，通过靶向细胞载体到特定组织或细胞类型)和/或增加所编码蛋白质的翻译。
引入细胞中
多种方法是本领域已知的并且适于将核酸引入细胞中，包括病毒介导和非病毒介导的技术。非病毒介导的常见技术的例子包括但不限于电穿孔法、磷酸钙介导的转移法、核转染法、声致穿孔法(sonoporation)、热休克法、磁性转染、脂质体介导的转移法、微注射法、微抛射体介导的转移法(纳米粒子)、阳离子聚合物介导的转移法(DEAE-葡聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙二醇(PEG)等)或细胞融合法。
声致穿孔技术或细胞超声处理是利用声音(例如，超声频率)以调节细胞质膜的通透性。声致穿孔法是本领域那些技术人员已知的并且用来在体内递送核酸(Yoon和Park,Expert Opin Drug Deliv.2010 7:321-330；Postema和Gilja,Curr PharmBiotechnol.2007 8:355-361；Newman和Bettinger,Gene Ther.2007 14:465-475；全部通过引用的方式完整并入本文)。声致穿孔法是本领域已知的并且当它涉及细菌时还例如在美国专利公开20100196983中教授并且当它涉及细菌时还例如在美国专利公开20100009424中教授，所述每篇文献通过引用的方式完整并入本文。
电穿孔技术也是本领域熟知的并用来在体内和临床上递送核酸(Andre等人,CurrGene Ther.2010 10:267-280；Chiarella等人,Curr Gene Ther.2010 10:281-286；Hojman,Curr Gene Ther.2010 10:128-138；全部文献通过引用的方式完整并入本文)。电穿孔装置由全球多家公司出售，包括但不限于仪(Holliston，MA)(例如，AgilePulse In Vivo System)和Inovio(Blue Bell,PA)(例如，Inovio SP-5P肌内递送装置或3000真皮内递送装置)。在一个实施方案中，多核苷酸可以通过电穿孔法递送。
微器官
多核苷酸可以容纳于微器官中，所述微器官随后可以在长效治疗性制剂中表达编码的目的多肽。微器官和其制剂在国际专利申请号PCT/US2014/027077中，如在第[000701]–[000705]段中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
透明质酸
肌内或皮下局部注射本发明的多核苷酸可以包含透明质酸酶，所述酶催化透明质糖的水解。通过催化透明质糖(间质屏障的组分)水解，透明质酸酶降低了透明质糖的粘度，因而增加了组织通透性(Frost,Expert Opin.Drug Deliv.(2007)4:427-440；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。它可用于加速由转染细胞产生的编码蛋白质的分散和全身性分布。可选地，透明质酸酶可以用来增加暴露于肌内或皮下施用的本发明多核苷酸的细胞的数目。
纳米粒子模拟物
本发明的多核苷酸可以包封在纳米粒子模拟物内部和/或吸附到其上。纳米粒子模拟物可以模拟执行递送功能的生物或粒子，如但不限于病原体、病毒、细菌、真菌、寄生体、朊病毒和细胞。作为一个非限制性例子，本发明的多核苷酸可以包封于能够模拟病毒递送功能的非病毒子粒子(参见国际公开号WO2012006376和美国专利公开号US20130171241和US20130195968，所述文献通过引用的方式完整并入本文)。
纳米管
本发明的多核苷酸可以连接或否则与结合于至少一个纳米管，如，但不限于莲座丛纳米管、具有孪生基部连同接头的莲座丛纳米管、碳纳米管和/或单壁碳纳米管。多核苷酸可以通过各种力如，但不限于立体力、离子力、共价力和/或其他力与纳米管结合。纳米管和包含多核苷酸的纳米管制剂在国际专利申请号PCT/US2014/027077中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文，如在第段[000708]–[000714]中描述。
缀合物
本发明的多核苷酸包含缀合物，如与载体或靶向基团共价连接或包含两个编码区的多核苷酸，所述两个编码区一起产生融合蛋白(例如，携带靶向基团和治疗性蛋白或肽)。
本发明的缀合物可以包含天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；糖类(例如，葡聚糖、茁霉多糖、壳质、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组的或合成的分子，如合成的聚合物，例如，合成的聚氨基酸、寡核苷酸(例如适配体)。聚氨基酸的例子包括以下聚氨基酸：聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯酸-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的例子包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟物聚胺、树状物聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子的卟啉、聚胺季盐或α螺旋肽。
教授制备多核苷酸缀合物尤其RNA缀合物的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的缀合物可以作为本发明多核苷酸的载体发挥作用。缀合物可以包含可以阳离子聚合物，如，但不限于与聚(乙二醇)接枝的聚胺、聚赖氨酸、聚亚烷基亚胺和聚乙烯亚胺。作为一个非限制性例子，缀合物可以类似于聚合缀合物并且合成聚合缀合物的方法在通过引用的方式完整并入本文的美国专利号6,586,524中描述。
一种用于缀合至基底物的方法的非限制性例在美国专利公开号US20130211249中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。该方法可以用来产生包含多核苷酸的缀合的聚合粒子。
缀合物还可以包含靶向基团，例如，与特定的细胞类型如肾细胞结合的细胞或组织靶向剂，例如，凝集素，糖蛋白，脂质或蛋白质，例如，抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白质A、黏蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸、维生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模拟物或适配体。
靶向基团可以是蛋白质，例如，糖蛋白，或肽，例如，对辅助配体具有特异亲和力的分子，或抗体，例如，与特定细胞类型如癌细胞、内皮细胞或骨细胞结合的抗体。靶向基团还可以包括激素和激素受体。它们也可以包括非肽物质，如脂类、凝集素、糖类、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖或适配体。配体可以是，例如脂多糖或p38MAP激酶的激活物。
靶向基团可以是能够靶向特定受体的任何配体。例子包括，而不限于叶酸、GalNAc、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6P、适配体、整联蛋白受体配体、趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、血清素受体配体、PSMA、内皮素、GCPII、生长抑素、LDL和HDL配体。在具体的实施方案中，靶向基团是适配体。适配体可以未经修饰或具有本文公开的修饰的任何组合。
作为一个非限制性例子，靶向基团可以是用于跨血液-中枢神经系统屏障的靶向递送的谷胱甘肽受体(GR)结合缀合物(参见例如，美国专利公开号US2013021661012，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，本发明的缀合物可以是协同性生物分子-聚合物缀合物。协同性生物分子-聚合物缀合物可以是提供更大治疗功效的长效连续释放系统。协同性生物分子-聚合物缀合物可以是美国专利公开号US20130195799中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，可以在本发明中使用的缀合物可以是适配体缀合物。适配体缀合物的非限制性例子在国际专利公开号WO2012040524中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。适配体缀合物可以用来提供靶向递送包含多核苷酸的制剂。
在一个实施方案中，可以在本发明中使用的缀合物可以是含有胺的聚合物缀合物。含有胺的聚合物缀合物的非限制性例子在美国专利号US8,507,653中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以包含化学性修饰，如，但不限于与锁核酸相似的修饰。
制备锁核酸(LNA)的代表性美国专利，如来自Santaris的那些，包括但不限于以下：美国专利号6,268,490；6,670,461；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,084,125；和7,399,845，所述专利的每一份通过引用的方式完整并入本文。
教授制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，所述文献的每一篇通过引用的方式并入本文。对PNA化合物的其他教授内容可以在例如Nielsen等人,Science,1991,254,1497-1500中找到。
本发明中表征的一些实施方案包括具有硫代磷酸酯主链的多核苷酸和具有其他修饰的主链的寡核苷，尤其是上文所提及美国专利号5,489,677的CH2-NH-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-[称作亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]，-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然磷酸二酯主链表述为-O-P(O)2-O-CH2-]以及上文所参考的美国专利号5,602,240的酰胺主链。在一些实施例中，本文表征的多核苷酸具有上文所提及的美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构。
在2′位置处的修饰还可以有助于递送。优选地，在2′位置处的修饰不位于编码多肽的序列中，即，不位于可翻译区域中。在2′位置处的修饰可以位于5′UTR、3′UTR和/或加尾区。在2′位置处的修饰可以在2'位置包含以下之一：H(即，2′-脱氧)；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例的合适修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是1至约10。在其他实施方案中在2'位置包含以下之一：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改善药物代谢动力学特性的基团或用于改善药效特征的基团和具有相似特性的其他置换基(取代基)。在一些实施例中，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也称作2'-O-(2-甲氧乙基)或2'-MOE)(Martin等人,Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504)，即，烷氧基-烷氧基。另一个示例性修饰是2'-二甲基氨基氧乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3基团，也称作2'-DMAOE，如下文实施例中所述，和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称作2'-O-二甲基氨基乙氧乙基或2'-DMAEOE)，即，2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2，也在下文实施例中描述。其他修饰包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)和2'-氟(2'-F)。相似修饰也可以在其他位置作出，尤其在3'末端核苷酸上或在2'-5'连接的dsRNA中的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。本发明的多核苷酸也可以具有糖模拟物，如替代戊呋喃糖基糖的环丁基。教授制备这类修饰糖结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633及5,700,920；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整并入本文。
在另外的实施方案中，多核苷酸共价缀合至细胞渗透性多肽。细胞渗透肽还可以包含信号序列。本发明的缀合物可以设计成具有增加的稳定性；增加的细胞转染；和/或改变的生物分布(例如，靶向特定组织或细胞类型)。
在一个实施方案中，多核苷酸可以与增强递送的物质缀合。作为一个非限制性例子，该物质可以是单体或聚合物，如靶向单体或具有靶向嵌段的聚合物，如国际公开号WO2011062965中所述，所述文献通过引用方式完整并入本文。在另一个非限制性例子中，该物质可以是与本发明多核苷酸共价偶联的转运物质(参见例如，美国专利号6,835,393和7,374,778，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。在又一个非限制性例子中，该物质可以是膜屏障转运增强物质，如美国专利号7,737,108和8,003,129中描述的那些，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，多核苷酸可以与SMARTT POLYMER (Inc.Seattle,WA)缀合。
在另一个方面，缀合物可以是选择性指导纳米粒子至组织或生物中的神经元的肽。作为一个非限制性例子，使用的肽可以是，但不限于，美国专利公开号US20130129627中描述的肽，所述文献通过引用方式完整并入本文。
在又一个方面，缀合物可以是可以帮助跨越血-脑屏障的肽。
自装配型纳米粒子
本文所述的多核苷酸可以在自装配型纳米粒子中配制。核酸自装配型纳米粒子在国际专利申请号PCT/US2014/027077中，如在第[000740]–[000743]段中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。基于聚合物的自装配型纳米粒子在国际专利申请号PCT/US2014/027077中，如在第[000744]–[000749]段中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
自装配型大分子
多核苷酸可以在两性大分子(AM)中配制，用于递送。AM包含具有与聚(乙二醇)共价连接的烷基化糖主链的生物相容的两性聚合物。在水溶液中，AM自装配以形成胶束。形成AM的方法和AM的非限制性例子在美国专利公开号US20130217753中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
无机纳米粒子
本发明的多核苷酸可以在无机纳米粒子中配制(美国专利号8,257,745，所述文献通过引用方式完整并入本文)。无机纳米粒子可以包括但不限于，水可溶胀的黏土物质。作为一个非限制性例子，无机纳米粒子可以包括由简单硅酸盐制成的合成性蒙皂石黏土(参见例如，美国专利号5,585,108和8,257,745，所述文献的每一篇通过引用的方式完整地并入本文)。
在一个实施方案中，无机纳米粒子可以包含本文公开的多核苷酸芯部和聚合物壳。聚合物壳可以是本文所述的任何聚合物并且是本领域已知的。在一个额外的实施方案中，聚合物壳可以用来保护核芯中的多核苷酸。
半导体的和金属的纳米粒子
本发明的多核苷酸可以在包含半导体或金属的材料的水可分散性纳米粒子中配制(美国公开号20120228565；所述文献通过引用方式完整并入本文)或在磁性纳米粒子中形成(美国公开号20120265001和20120283503；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。水可分散性纳米粒子可以是疏水性纳米粒子或亲水性纳米粒子。
在一个实施方案中，半导体纳米粒子和/或金属纳米粒子可以包含本文公开的多核苷酸芯部和聚合物壳。聚合物壳可以是本文所述的任何聚合物并且是本领域已知的。在一个额外的实施方案中，聚合物壳可以用来保护核芯中的多核苷酸。
外科密封材料：凝胶和水凝胶
在一个实施方案中，本文公开的多核苷酸可以包封到本领域已知的可以在注入受试者时形成凝胶的任何水凝胶中。外科密封材料如在国际专利申请号PCT/US2014/027077中，如在第[000762]–[000809]段中描述的凝胶和水凝胶，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
混悬制剂
在一些实施方案中，提供包含多核苷酸、水不溶混性油储库、表面活性剂和/或辅助表面活性剂和/或助溶剂的混悬制剂。油和表面活性剂的组合可以实现含多核苷酸的混悬制剂。在水不溶混性储库中递送多核苷酸可以用来通过mRNA从储库缓释到周围生理环境并防止多核苷酸被核酸酶降解，改善生物利用率。
在一些实施方案中，mRNA的混悬制剂可以使用多核苷酸、油基溶液和表面活性剂的组合制备。这类制剂可以作为包含水相和油基相的两部分体系制备，所水相包含多核苷酸，所述油基相包含油和表面活性剂。用于混悬制剂的示例性油可以包括但不限于芝麻油和Miglyol(包含饱和椰油和棕榈仁油衍生的辛酸和癸酸和丙三醇或丙二醇的酯)、玉米油、大豆油、花生油、蜂蜡和/或棕榈籽油。示例性表面活性剂可以包括但不限于Cremophor、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚乙二醇、二乙二醇单乙基醚(transcutol)、labrasol、肉豆蔻酸异丙酯和/或Span 80。在一些实施方案中，混悬剂可以包含助溶剂，包括但不限于乙醇、甘油和/或丙二醇。
混悬剂可以通过首先制备多核苷酸制剂形成，所述多核苷酸制剂包含多核苷酸的水溶液和含有一种或多种表面活性剂的油基相。混悬剂形成因两种相(水相和油基相)的混合而发生。在一些实施方案中，可以将这种混悬剂输送至水相以形成水包油乳液。在一些实施方案中，输送混悬剂至水相导致水包油乳液形成，其中包含多核苷酸的油基相形成液滴，所述液滴在大小方面可以是纳米尺度的小液滴至微米尺度的液滴。在一些实施方案中，油、表面活性剂、辅助表面活性剂和/或助溶剂的特定组合可以用来使多核苷酸悬浮于油相中和/或当输送入水质环境时形成水包油乳液。
在一些实施方案中，混悬剂可以提供对多核苷酸向周围环境释放的调节作用。在这类实施方案中，可以通过从水不溶混性储库扩散，随后复溶至周围环境(例如水质环境)中，调节多核苷酸释放。
在一些实施方案中，水不溶混性储库内部的多核苷酸(例如悬浮于油相内部)可以导致改变的多核苷酸稳定性(例如改变的核酸酶降解过程)。
在一些实施方案中，多核苷酸可以如此配制，从而注射时，乳液自发地形成(例如当输送至水相时)。这种粒子形成过程可以为多核苷酸从油相释放至水相提供高的表面积对体积比。
在一个实施方案中，多核苷酸可以在纳米乳液中配制，如，但不限于美国专利号8,496,945中描述的纳米乳液，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。纳米乳液可以包含本文所述的纳米粒子。作为一个非限制性例子，纳米粒子可以包含液态疏水核心，所述液态疏水核心可以用脂质或表面活性剂层包围或包覆。脂质或表面活性剂层可以包含至少一种膜整合肽并且还可以包含靶向配体(参见例如，美国专利号8,496,945，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
阳离子和阴离子
本文公开的多核苷酸的制剂可以包含阳离子或阴离子。在一个实施方案中，制剂包含金属阳离子，如，但不限于Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+及其组合。作为一个非限制性例子，制剂可以包含聚合物和与金属阳离子络合的多核苷酸(参见例如，美国专利号6,265,389和6,555,525，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。
在一些实施方案中，包含二价和一价阳离子组合的阳离子性纳米粒子可以与多核苷酸配制在一起。这类纳米粒子可以在溶液中经给定的时间(例如数小时、数天等)自发形成。这类纳米粒子在仅二价阳离子存在或仅一价阳离子存在时不形成。在阳离子性纳米粒子中或在包含阳离子性纳米粒子的一种或多种储库中递送多核苷酸可以通过充当长效储库和/或减少核酸酶降解率，改善多核苷酸生物利用率。
模制的纳米粒子和微粒子
本文公开的多核苷酸可以在纳米粒子和/或微粒子中配制。这些纳米粒子和/或微粒子可以按任何大小、形状和化学模制。作为一个例子，可以使用LIQUIDA的技术，产生纳米粒子和/或微粒子(参见例如，国际公开号WO2007024323；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，模制的纳米粒子可以包含本文公开的多核苷酸芯部和聚合物壳。聚合物壳可以是本文所述的任何聚合物并且是本领域已知的。在一个额外的实施方案中，聚合物壳可以用来保护核芯中的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以在微粒子中配制。微粒子可以含有多核苷酸芯部和生物相容性和/或生物可降解聚合物外皮。作为一个非限制性例子，可以随本发明一起使用的微粒子可以是美国专利号8,460,709、美国专利公开号US20130129830和国际专利公开号WO2013075068中描述的那些，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。作为另一个非限制性例子，微粒子可以设计成在所需的时间段延长本发明多核苷酸的释放(参见例如，美国专利公开号US20130129830中治疗性蛋白的延长释放，所述文献通过引用方式完整并入本文)。
随本发明一起使用的微粒子可以具有至少1微米至至少100微米(例如，至少1微米、至少5微米、至少10微米、至少15微米、至少20微米、至少25微米、至少30微米、至少35微米、至少40微米、至少45微米、至少50微米、至少55微米、至少60微米、至少65微米、至少70微米、至少75微米、至少80微米、至少85微米、至少90微米、至少95微米、至少97微米、至少99微米和至少100微米)的直径。
纳米夹套和纳米脂质体
本文公开的多核苷酸可以在Keystone Nano(State College,PA)的纳米夹套和纳米脂质体中配制。纳米夹套(nanojacket)由身体内天然存在的化合物(包括磷酸、钙)制成，并且还可以包含少量硅酸盐。纳米夹套的大小可以是5至50nm并且可以用来递送亲水性和疏水性化合物，如，但不限于多核苷酸。
纳米脂质体由脂质(如，但不限于身体内天然存在的脂质)制成。纳米脂质体的大小可以是60-80nm并且可以用来递送亲水性和疏水性化合物，如，但不限于多核苷酸。在一个方面，本文公开的多核苷酸在纳米脂质体，如，但不限于神经酰胺纳米脂质体中配制。
假病毒粒
在一个实施方案中，本文公开的多核苷酸可以在假病毒粒(例如，假病毒粒)中配制。作为一个非限制性例子，假病毒粒可以是Aura Biosciences(Cambridge,MA)开发的和/或描述的那些。在一个方面，可以开发假病毒粒以递送药物至角质形成细胞和基底膜(参见例如，美国专利公开号US20130012450、US20130012566、US21030012426和US20120207840和国际公开号WO2013009717，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。
在一个实施方案中，用于递送本发明多核苷酸的假病毒粒可以衍生自病毒，如，但不限于疱疹病毒和乳头瘤病毒(参见例如，美国专利公开号美国专利公开号US20130012450、US20130012566、US21030012426和US20120207840和国际公开号WO2013009717，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文；和Ma等人,HPVpseudovirions as DNA delivery vehicles.Ther Deliv.2011:2(4):427-430；Kines等人,The initial steps leading to papillomavirus infection occur on thebasement membrane prior to cell surface binding.PNAS 2009:106(48),20458-20463；Roberts等人,Genital transmission of HPV in a mouse model is potentiatedby nonoxynol-9and inhibited by carrageenan.Nature Medicine.2007:13(7)857-861；Gordon等人,Targeting the Vaginal Mucosa with Human PapillomavirusPsedudovirion Vaccines delivering SIV DNA.J Immunol.2012 188(2)714-723；Cuburu等人,Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+Tcell responses.The Journal of Clinical Investigation.2012:122(12)4606-4620；Hung等人,Ovarian Cancer Gene Therapy Using HPV-16Psedudovirion Carrying theHSV-tk Gene.PLoS ONE.2012:7(7)e40983；Johnson等人,Role of Heparan Sulfate inAttachment to and Infection of the Murine Femal Genital Tract by HumanPapillomavirus.J Virology.2009:83(5)2067-2074；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。
假病毒粒可以是通过美国专利公开号US20120015899和US20130177587和国际专利公开号WO2010047839、WO2013116656、WO2013106525和WO2013122262中描述的方法制备的病毒样粒子(VLP)，所述文献每一篇的内容通过引用方式并入完整并入本文。在一个方面，VLP可以是但不限于噬菌体MS、Qβ、R17、fr、GA、Sp、MI、I、MXI、NL95、AP205、f2、PP7和植物病毒蔓青皱缩病毒(TCV)、番茄丛矮病毒(TBSV)、南方菜豆花叶病毒(SBMV)和雀麦花叶病毒属(Bromovirus)成员，包括蚕豆斑驳病毒、雀麦花叶病毒、决明黄斑病毒、豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)、女娄菜黄斑病毒和弹春美草潜隐病毒。在另一个方面，VLP可以衍生自流感病毒，如美国专利公开号US20130177587或美国专利号8,506,967中所述，所述每份文献的内容通过引用方式完整并入本文。在又一个方面，VLP可以包含锚定至粒子的脂质膜或外部的B7-1和/或B7-2分子，如国际专利公开号WO2013116656中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。在一个方面，VLP可以衍生自诺如病毒、轮状病毒重组VP6蛋白质或双层VP2/VP6，如国际专利公开号WO2012049366中描述的VLP，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
假病毒粒可以是人乳头瘤病毒样粒子，如，但不限于下述文献中描述的那些：国际公开号WO2010120266和美国专利公开号US20120171290，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文，和Ma等人,HPV pseudovirions as DNA delivery vehicles.TherDeliv.2011:2(4):427-430；Kines等人,The initial steps leading to papillomavirusinfection occur on the basement membrane prior to cell surface binding.PNAS2009:106(48),20458-20463；Roberts等人,Genital transmission of HPV in a mousemodel is potentiated by nonoxynol-9and inhibited by carrageenan.NatureMedicine.2007:13(7)857-861；Gordon等人,Targeting the Vaginal Mucosa with HumanPapillomavirus Psedudovirion Vaccines delivering SIV DNA.J Immunol.2012 188(2)714-723；Cuburu等人,Intravaginal immunization with HPV vectors inducestissue-resident CD8+T cell responses.The Journal of ClinicalInvestigation.2012:122(12)4606-4620；Hung等人,Ovarian Cancer Gene TherapyUsing HPV-16Psedudovirion Carrying the HSV-tk Gene.PLoS ONE.2012:7(7)e40983；Johnson等人,Role of Heparan Sulfate in Attachment to and Infection of theMurine Femal Genital Tract by Human Papillomavirus.J Virology.2009:83(5)2067-2074；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
在一个方面，假病毒粒可以是病毒粒衍生的纳米粒子，如，但不限于美国专利公开号US20130116408和US20130115247中描述的那些，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，病毒粒衍生的纳米粒子可以用来递送可以用于治疗癌症和/或增强免疫系统识别肿瘤的多核苷酸。作为一个非限制性例子，可以向至少一种肿瘤选择性递送药物的病毒粒衍生的纳米粒子可以是国际专利公开号WO2013119877中描述的乳头状瘤衍生的粒子，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。病毒粒衍生的纳米粒子可以通过美国专利公开号US20130116408和US20130115247或国际专利公开号WO2013119877中描述的方法产生，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，病毒样粒子(VLP)可以是自装配粒子。自装配VLP和产生自装配VLP的方法的非限制性例子在国际专利公开号WO2013122262中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
小细胞
在一个方面，多核苷酸可以在细菌小细胞中配制。作为一个非限制性例子，细菌小细胞可以是国际公开号WO2013088250或美国专利公开号US20130177499中描述的那些，所述每份文献的内容通过引用方式完整并入本文。包含治疗药(如本文所述的多核苷酸)的细菌小细胞可以用来向脑肿瘤递送治疗剂。
半固态组合物
在一个实施方案中，多核苷酸可以用疏水基质配制以形成半固态组合物。作为一个非限制性例子，半固态组合物或糊膏样组合物可以通过国际专利公开号WO201307604中描述的方法产生，所述文献通过引用方式完整并入本文。半固态组合物可以是如国际专利公开号WO201307604中所述的持续释放制剂，所述文献通过引用方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，半固态组合物还可以具有在组合物周围形成的微多孔膜或生物可降解聚合物(参见例如，国际专利公开号WO201307604，所述文献通过引用方式完整并入本文)。
使用本发明多核苷酸的半固态组合物可以具有如通过引用方式完整并入本文的国际专利公开号WO201307604中所述的半固体混合物特征(例如，至少10-4N·mm-2的弹性模量和/或至少100mPa·s的粘度)。
外来体
在一个实施方案中，多核苷酸可以在外来体中配制。外来体可以加载至少一种多核苷酸并递送至细胞、组织和/或生物体。作为一个非限制性例子，多核苷酸可以加载在国际公开号WO2013084000中描述的外来体中，所述文献通过引用方式完整并入本文。
基于丝(silk-based)的递送过程
在一个实施方案中，多核苷酸可以在基于丝的缓释递送体系中配制。基于丝的递送体系可以通过使丝心蛋白溶液与治疗剂(如，但不限于本文所述和/或本领域已知的多核苷酸)接触来形成。作为一个非限制性例子，可以在本发明中使用的基于丝的缓释递送体系和产生这种体系的方法在美国专利公开号US20130177611中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
微粒子
在一个实施方案中，包含多核苷酸的制剂可以包含微粒子。微粒子可以包含本文所述的和/或本领域已知的聚合物，如，但不限于聚(α-羟酸)、聚羟丁酸、聚己内酯、聚原酸酯和聚酐。微粒子可以具有吸收性表面以吸收生物活性分子如多核苷酸。作为一个非限制性例子，本发明一起使用的微粒子和产生微粒子的方法在美国专利公开号US2013195923和US20130195898和美国专利号8,309,139和8,206,749中描述，所述每份文献的内容通过引用方式完整并入本文。
在另一个实施方案中，制剂可以是包含微粒子和多核苷酸的微乳剂。作为一个非限制性例子，包含微粒子的微乳剂在美国专利公开号US2013195923和US20130195898和美国专利号8,309,139和8,206,749中描述，所述每份文献的内容通过引用方式完整并入本文。
氨基酸脂质
在一个实施方案中，多核苷酸可以在氨基酸脂质中配制。氨基酸脂质是包含氨基酸残基和一种或多种亲脂尾的亲脂化合物。氨基酸脂和产生氨基酸脂的方法的非限制性例子在美国专利号8,501,824中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，氨基酸脂质具有亲水部分和亲脂部分。亲水部分可以是氨基酸残基并且亲脂部分可以包含至少一个亲脂尾。
在一个实施方案中，氨基酸脂质制剂可以用来递送多核苷酸至受试者。
在另一个实施方案中，氨基酸脂质制剂可以递送可释放形式的多核苷酸，所述可释放形式包含结合并释放多核苷酸的氨基酸脂质。作为一个非限制性例子，可以通过酸不稳定接头(如，但美国专利号7,098,032、6,897,196、6,426,086、7,138,382、5,563,250和5,505,931不限于中描述的那些，所述每份文献的内容通过引用方式完整并入本文)提供多核苷酸的释放。
微泡
在一个实施方案中，多核苷酸可以在微泡中配制。微泡的非限制性例子包括美国专利公开号US20130209544中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，微泡是ARRDC1-介导的微泡(ARMM)。ARMM和产生ARMM的方法的非限制性例子在国际专利公开号WO2013119602中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
聚电解质间复合物
在一个实施方案中，多核苷酸可以在聚电解质间复合物中配制。当电荷动态聚合物与一个或多个阴离子分子复合时，聚电解质间复合物形成。电荷动态聚合物和聚电解质间复合物及产生聚电解质间复合物的方法的非限制性例子在美国专利号8,524,368中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
晶态聚合物系统
在一个实施方案中，多核苷酸可以在晶态聚合物系统中配制。晶态聚合物系统是具有晶态部分和/或包含晶态部分的末端单位的聚合物。具有晶态部分和/或包含晶态部分的末端单位的聚合物(称作“CYC聚合物”)、晶态聚合物系统以及产生这类聚合物和系统方法的非限制性例子在美国专利号US8,524,259中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
赋形剂
药物制剂可以另外包含可药用赋形剂，如本文所用，所述可药用赋形剂包括，但不限于对所需的具体剂型合适的任何和全部溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体溶媒、分散助剂或助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固态粘合剂、润滑剂，调味剂、稳定剂、抗氧化剂、重量摩尔渗透压调节剂、pH调节剂等。用于配制药物组合物的多种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；通过引用方式完整并入本文)。除了任何常规赋形剂介质与某物质或其衍生物不相容的情况下(如因产生任何不期望的生物学效应或另外以有害方式与药物组合物的任何其他组分相互作用，其用途处于本发明的范围内)，否则可以在本公开的范围内包括使用常规赋形剂介质。
在一些实施方案中，可药用赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％纯的。在一些实施方案中，赋形剂经批准用于人类中和用于兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂可以由美国食品药品管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂可以是药用级的。在一些实施方案中，赋形剂可以符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
制造药物组合物中所用的可药用赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散剂/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。这类赋形剂可以任选地纳入药物组合物中。组合物还可以包括多种赋形剂，如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂(flavoring agent)和/或香味剂。
示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸氢二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、粉状糖等和/或其组合。
示例性造粒剂和/或分散剂包括但不限于马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、淀粉羟乙酸钠、黏土、海藻酸、瓜耳胶、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维素和木材产物、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯基咯烷酮)(交联聚维酮)、羧甲基淀粉钠(淀粉羟乙酸钠)、羧甲基纤维素、交联钠羧甲基纤维素(交联羧甲基纤维素)、甲基纤维素、预糊化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、非水溶淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝十二烷基硫酸钠、季铵化合物等和/或其组合。
示例性表面活性剂和/或乳化剂包括但不限于天然乳化剂(例如，阿位伯树胶、琼脂、海藻酸、藻酸钠、黄蓍胶、软骨酸、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、卵黄、酪蛋白、羊毛脂肪、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶态粘土(例如，膨润土[硅酸铝]和[硅酸镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如，硬脂醇、鲸蜡基醇、油醇、三醋精单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(例如，羧聚甲烯、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧乙烯基聚合物)、角叉菜胶、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素钠、粉状纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯[20]、聚氧乙烯脱水山梨糖醇[60]、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯[80]、山梨糖醇酐单棕榈酸酯[40]、山梨糖醇酐单硬脂酸酯[60]、山梨糖醇酐三硬脂酸酯[65]、单油酸甘油酯、山梨醇酐单油酸酯[80])、聚氧乙烯酯(例如，聚氧乙烯单硬脂酸酯[45]、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基蓖麻油、聚氧甲烯硬脂酸酯和)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如，)、聚氧乙烯醚(例如，聚氧乙烯月桂基醚[30])、聚(乙烯吡咯烷酮)、二甘醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、乙基月桂酸酯、十二烷基硫酸钠、F68、188、西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶嗡、苯扎氯铵、多库酯钠等和/或其组合。
示例性粘合剂包括但不限于淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)；氨基酸(例如，甘氨酸)；天然树胶和合成树胶(例如阿位伯树胶、藻酸钠、爱尔兰苔提取物、潘瓦尔胶(panwar gum)、茄替胶、isapol husk的粘质、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、醋酸纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、硅酸镁铝和落叶松阿拉伯半乳聚糖)；藻酸盐；聚环氧乙烷；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇；等及其组合。
示例性防腐剂可以包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌药防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其他防腐剂。氧化是mRNA的潜在降解途径，特别对液体mRNA制剂。为了防止氧化，可以向制剂中添加抗氧化剂。示例性抗氧化剂包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、苄醇、丁化羟基茴香醚、EDTA、间甲酚、甲硫氨酸、丁化羟基甲苯、硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代甘油和和/或亚硫酸钠。示例性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、一水合柠檬酸、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、延胡索酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。示例性抗微生物防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、溴硝丙二醇(bronopol)、西三溴胺(cetrimide)、氯化十六烷基吡啶嗡、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、丙三醇、海克替啶、咪脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙基醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞。示例性抗真菌防腐剂包括但不限于尼泊金丁酯、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。示例性醇防腐剂包括但不限于乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙基醇。示例性酸性防腐剂包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其他防腐剂包括但不限于生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸次肟酯(deteroxime mesylate)、西三溴胺(cetrimide)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁化羟基甲苯(BHT)、乙二胺、十二烷基硫酸钠(SLS)、月桂基醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、GLYDANT尼泊金甲酯、115、II、NEOLONETM、KATHONTM和/或
在一些实施方案中，将多核苷酸溶液的pH维持在pH 5和pH 8之间,以改善稳定性。控制pH的示例性缓冲剂可以包括但不限于磷酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠、组氨酸(或组氨酸-HCl)、碳酸钠和/或苹果酸钠。在另一个实施方案中，上文所列的示例性缓冲剂可以随额外的单价反离子(包括但不限于钾)一起使用。也可以使用二价阳离子作为缓冲剂反离子；然而，它们并非优选，原因在于形成复合物和/或mRNA降解。
示例性缓冲剂还可以包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡糖酸钙、D-葡糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢二钙、磷酸、磷酸钙、磷酸氢钙、乙酸钾、氯化钾、葡糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、乙醇等和/或其组合。
示例性润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、甘油二十二烷酸酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、十二烷基硫酸钠等及其组合。
示例性油包括但不限于扁桃油、杏仁油、鳄梨油、佛手柑油、香柠檬油、黑加仑籽油、玻璃苣油、杜松油、春黄菊油、卡诺拉油、藏茴香油、巴西棕榈蜡、蓖麻油、肉桂油、可可脂、椰油、鳕鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶醇、葫芦油、葡萄籽油、榛油、牛膝草、肉豆蔻酸异丙酯、霍霍巴油、夏威夷坚果油、熏衣草油、薰衣草油(lavender)、柠檬油、山鸡椒油、澳洲坚果油、锦葵、芒果种子、绣线菊籽油、貂油、肉豆蔻油、橄榄、橙、橘刺鲷、棕榈油、棕榈仁、桃仁油、花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花、檀香木油、山茶花(sasquana)油、皱叶甘蓝(savoury)油、沙棘油、芝麻油、乳木果油、硅油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、椿花油、香根油、胡桃油和小麦胚芽油。示例性油包括但不限于硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环甲基硅酮、癸二酸二乙酯、聚二甲基硅氧烷360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油和/或其组合。
根据制剂师的判断，赋形剂如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和/或香味剂可以存在于组合物中。
示例性添加物包括生理生物相容性缓冲液(例如，三甲胺盐酸盐)、添加螯合剂(如，例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合物复合物(例如钙DTPA，CaNaDTPA-双酰胺)，或任选地，添加钙盐或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。此外，可以使用抗氧化剂和助悬剂。
用于mRNA的低温保护剂
在一些实施方案中，多核苷酸制剂可以包含低温保护剂。如本文所用，术语“低温保护剂”指一种或多种物质，所述物质与给定物质组合时，有助于减少或消除冻结时对该物质的损伤。在一些实施方案中，低温保护剂与多核苷酸组合以在冻结期间稳定它们。mRNA在-20℃和-80℃之间的冷冻储存可有利于多核苷酸的长期(例如36个月)稳定性。在一些实施方案中，低温保护剂纳入多核苷酸制剂中以使多核苷酸经历冻/融循环和在冷冻储存条件下稳定。本发明的低温保护剂可以包括但不限于蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油、右旋糖、蜜三糖和/或甘露醇。海藻糖由美国食品药品管理局列作为总体上视为安全(GRAS)并且常用于商业药物制剂中。
填充剂(bulking agent)
在一些实施方案中，多核苷酸制剂可以包含填充剂。如本文所用，术语“填充剂”指制剂中所含的一种或多种物质，所述物质旨在向制剂赋予所需一致性和/或制剂组分的稳定作用。在一些实施方案中，填充剂纳入冻干的多核苷酸制剂，以产生“药学精致的(pharmaceutically elegant)”滤饼，从而在长期(例如36月)储存期间稳定冻干的多核苷酸。本发明的填充剂可以包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、乳糖和/或蜜三糖。在一些实施方案中，可以纳入低温保护剂和填充剂的组合(例如，蔗糖/甘氨酸或海藻糖/甘露醇)以在冻结期间稳定多核苷酸并且为冻干提供填充剂。
制剂和用于配制本发明多核苷酸的方法|的非限制性例子还在2012年12月14日提交的国际公开号WO2013090648中提供，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
非活性成分
在一些实施方案中，多核苷酸制剂可以包含作为非活性成分的至少一种赋形剂。如本文所用，术语“非活性成分”指制剂中包含的一种或多种无活性物质。在一些实施方案中，可以在本发明制剂中使用的全部、无一或一些非活性成分可以由美国食品药品管理局(FDA)批准。在待决国际申请号PCT/US2014/027077(代理人案号M030)的表4中描述了非活性成分和可以在其中配制非活性成分的施用途径的非穷尽性列表。
递送
本公开涵盖了考虑可能的药物递送科学进展同时，通过任何适宜途径递送多核苷酸用于治疗、药物、诊断或成像用途中任一者。递送可以是裸的或配制的。
裸递送
本发明的多核苷酸可以输送至裸细胞。如本文所用在中，“裸”指不含促进转染的物质情况下递送多核苷酸。例如，递送至细胞的多核苷酸可以不含有修饰。可以使用本领域已知的和本文所述的施用途径，将裸多核苷酸递送至细胞。
配制递送
可以使用本文所述的方法，配制本发明的多核苷酸。制剂可以含有可以经修饰的和/或未经修饰的多核苷酸。制剂还可以包括但不限于细胞渗透剂、可药用载体、递送剂、生物溶蚀性或生物相容性聚合物、溶剂和缓释递送储库。可以使用本领域已知的和本文所述的施用途径，将配制的多核苷酸递送至细胞。
也可以配制组合物制以按照本领域几种方式中任一方式，直接递送至器官或组织，所述方式包括但不限于直接浸泡或浸浴、通过导管、通过凝胶剂、散剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、洗剂和/或滴剂、通过使用以该组合物涂覆或浸渍的基质如织物或生物可降解材料等。
施用
本发明的多核苷酸可以通过产生治疗有效结果的任何途径施用。这些包括但不限于肠内(进入肠)、胃肠、硬膜(epidural,进入硬脑膜)、口(借助口腔)、透皮、硬膜外(peridural)、脑内(进入脑)、脑室内(进入脑室内)、表皮(施加到皮肤上)、真皮内(进入皮肤本身)、皮下(在皮肤下)、经鼻施用(通过鼻)、静脉内(进入静脉)、静脉内快速浓注、静脉内滴注、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、腹膜内(输注或注射至腹膜)、膀胱内输注、玻璃体内(经眼)、海绵体内注射(进入病理腔)、腔内(进入阴茎基部)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、经皮(透过完整皮肤扩散用于全身分布)、经黏膜(扩散透过黏膜)、经阴道、吹入(鼻吸)、舌下、唇下、灌肠、滴眼剂(到结膜上)、在滴耳剂中、耳部(在耳中或借助耳)、颊部(指向面颊)、结膜、皮肤、牙齿(到一颗牙齿或多颗齿)、电渗透、子宫颈内、窦内、气管内、体外的、血液透析、浸润、间质、腹内、羊膜内、关节内、胆管内、支气管内、囊内、软骨内(软骨内部)、尾椎内(马尾内部)、脑池内(小脑延髓池cerebellomedularis内部)、角膜内(角膜内部)、牙冠内、冠状动脉内(冠状动脉内部)、海绵体内(阴茎海绵体的可膨大间隙内部)、椎间盘内(椎间盘内部)、导管内(腺体导管内部)、十二指肠内(十二指肠内部)、硬膜内(硬膜内部或下方)、表皮内(至表皮)、食道内(至食道)、胃内(胃内部)、齿龈内(齿龈内部)、回肠内(小肠远端部分内部)、病灶内(局部病灶内部或直接引入到局部病灶)、管腔内(管的管腔内部)、淋巴内(淋巴内部)、髓内(骨的骨髓腔内部)、脑膜内(脑膜内部)、眼内(眼内部)、卵巢内(卵巢内部)、心包内(心包膜内部)、胸膜内(胸膜内部)、前列腺内(前列腺内部)、肺内(肺或其支气管内部)、窦内(鼻窦或眶周窦内部)、椎管内(脊柱内部)、滑膜内(关节的滑膜腔内部)、腱内(腱内部)、睾丸内(睾丸内部)、鞘内(在脑脊髓轴的任何层级处的脑脊液内部)、胸腔内(胸腔内部)、小管内(器官的小管内部)、肿瘤内(肿瘤内部)、鼓室内(中耳内部)、血管内(一根血管或多根血管内部)、心室内(心室内部)、离子导入(借助电流，其中可溶性盐的离子迁移入身体的组织)、冲洗(浸泡或冲洗开放伤口或体腔)、喉部(直接到喉上)、鼻胃(经鼻并入胃)、封闭敷裹技术(局部施用途径，其随后由封闭该区域的敷料覆盖)、眼科(至外眼)、口咽(直接至口腔和咽)、肠胃外、透皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸道(为了局部或全身效果，通过口腔或鼻吸入而在呼吸道内部)、眼球后(脑桥后或眼球后)、心肌内(进入心肌)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下、局部、跨胎盘(穿过或跨过盘)、经气管(穿过气管壁)、经鼓膜(跨过或穿过鼓室)、输尿管(到输尿管)、尿道(到尿道)、阴道、骶管阻滞、诊断性、神经阻滞、胆管灌注、心脏灌注、光分离置换或脊柱施用。在具体实施方案中，组合物可以按照允许它们跨越血-脑屏障、血管屏障或其他上皮屏障的方式施用。在一个实施方案中，用于施用途径的制剂可以包含至少一种非活性成分。表9中显示了施用途径和可以在用于特定施用途径的制剂中包含的非活性成分的非限制性例子。在表9中，“AN”意指麻醉药，“CNBLK”意指颈神经阻滞，“NBLK”意指神经阻断，“IV”意指静脉内，“IM”意指肌内，“SC”意指皮下。
表9.施用途径和非活性成分
下文描述本发明的多核苷酸的非限制施用途径。
肠胃外和可注射施用
用于肠胃外施用的液态剂型包括但不限于可药用的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和/或酏剂。除活性成分之外，液态剂型可以包含本领域常使用的惰性稀释剂如，例如，水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别地是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物可以包含辅助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和/或香味剂。在肠胃外施用的某些实施方案中，组合物与增溶剂如醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合混合。
用于肠胃外施用的药物组合物可以包含至少一种非活性成分。任何或无一种所用的非活性成分可能已经由美国食品药品管理局(FDA)批准。用于肠胃外施用的药物组合物中的非活性成分的非穷尽性列表包括氢氯酸、甘露醇、氮、乙酸钠、氯化钠和氢氧化钠。
可以根据已知技术，使用合适的分散剂、润湿剂和/或助悬剂配制可注射制品，例如，无菌可注射的水性或油性混悬剂。无菌可注射制品可以是肠胃外可接受的无毒稀释剂和/或溶剂中的无菌注射溶液剂、混悬剂和/或乳剂，例如，作为1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受溶媒和溶剂包括水、林格溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。常规地使用无菌非挥发性油作溶剂或助悬介质。出于这个目的，可以使用任何温和的非挥发性油，包括合成性甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可以同样用于注射剂的制备。无菌制剂还可以包含辅助剂，如局部麻醉药、防腐剂和缓冲剂。
可注射制剂可以例如通过截留细菌的滤器过滤和/或通过掺入无菌固体组合物形式的消毒剂制备，其中所述的消毒剂可以在使用之前溶解于或分散在无菌水或其他无菌的可注射介质中。
注射制剂可以直接注射至组织，器官和/或受试者的某区域。作为一个非限制性例子，可以通过心肌内注射，向组织、器官和/或受试者直接注射制剂至缺血区中。(参见例如，Zangi等人,Nature Biotechnology 2013；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。
为了延长活性成分的效果，经常希望减缓所述活性成分从皮下或肌内注射的吸收。这可以通过使用水溶性差的晶态或无定形物质的液态悬液而实现。药物的吸收速率取决于其溶解速率，所述溶解速率转而可能依赖于其晶体大小和结晶形式。可选地，肠胃外施用药物形式的延迟吸收通过将该药物溶解或混悬于油溶媒中实现。通过形成所述药物在诸如聚丙交酯-聚乙交酯的可生物降解的聚合物中的微胶囊基质，来制备注射用储器剂型。根据药物对聚合物的比率以及所用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他生物可降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可注射性贮库制剂通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
直肠施用和阴道施用
在一个实施方案中，可以通过国际专利申请号PCT/US2014/027077中描述(如在第[000910]–[000913]段中描述)的方法或组合物，将本文描述的多核苷酸配制用于直肠施用和阴道施用，所述文献的内容通过引用方式完整地并入。
经口施用
在一个实施方案中，可以通过国际专利申请号PCT/US2014/027077中描述(如在第[000914]–[000924]段中描述)的方法或组合物，将本文描述的多核苷酸配制用于经口施用，所述文献的内容通过引用方式完整地并入。经口施用可以是液体剂型或固态剂型。
局部施用或经皮施用
在一个实施方案中，可以通过国际专利申请号PCT/US2014/027077中描述(如在第[000925]–[000941]段中描述)的方法或组合物，将本文描述的多核苷酸配制用于局部施用或透皮施用，所述文献的内容通过引用方式完整地并入。
储库施用
在一个实施方案中，可以通过国际专利申请号PCT/US2014/027077中描述(如在第[000942]–[000948]段中描述)的方法或组合物，将本文描述的多核苷酸配制用于储库施用，所述文献的内容通过引用方式完整地并入。
肺施用
在一个实施方案中，可以通过国际专利申请号PCT/US2014/027077中描述(如在第[000949]–[000954]段中描述)的方法或组合物，将本文描述的多核苷酸配制用于肺施用，所述文献的内容通过引用方式完整地并入。
鼻内、经鼻和颊含施用
在一个实施方案中，可以通过国际专利申请号PCT/US2014/027077中描述(如在第[000955]–[000958]段中描述)的方法或组合物，将本文描述的多核苷酸配制用于鼻内、经鼻或颊含施用，所述文献的内容通过引用方式完整地并入。
眼科和耳部(耳的)施用
在一个实施方案中，可以通过国际专利申请号PCT/US2014/027077中描述(如在第[000959]–[000965]段中描述)的方法或组合物，将本文描述的多核苷酸配制用于眼科或耳部(耳)施用，所述文献的内容通过引用方式完整地并入。
酬载施用：可检测物质和治疗剂
本文所述的多核苷酸可以用于其中需要向生物学靶递送物质(“酬载”)(例如递送可检测物质以检测该靶或治疗药的递送)的众多不同情景。检测方法可以包括但不限于体外成像法和体内成像方法，例如，免疫组织化学、生物发光成像(BLI)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影术(PET)、电子显微术、X射线计算机断层成像、Raman成像、光学相干断层摄影术、吸收成像、热成像、荧光反射成像、荧光显微术、荧光分子断层成像、核磁共振成像、X射线成像、超声成像、光声成像、lab测定法或在其中需要加标签/染色/成像的任何情况下。
多核苷酸可以设计成以有用取向包括接头和酬载两者。例如，具有两个末端的接头用来将一个末端与酬载连接并将另一端与核碱基连接，如在去氮杂-腺苷或去氮杂-鸟苷的C-7或C-8位置或连接至胞嘧啶或尿嘧啶的N-3或C-5位置。本发明的多核苷酸可以包含多于一种酬载(例如，标记物和转录抑制剂)，以及可切割接头。在一个实施方案中，修饰的核苷酸是修饰的7-去氮杂-三磷酸腺苷，其中可切割接头的一个末端连接至7-去氮杂-腺嘌呤的C7位置，接头的另一端连接至抑制剂(例如，连接至胞苷上核碱基的C5位置)，并且标记物(例如，Cy5)连接至接头的中心(参见，例如，在美国专利号7,994,304的图5和第9栏和第10栏中的A*pCpC5Parg Caples的化合物1，所述文献通过引用方式并入本文)。一旦将修饰的7-去氮杂-三磷酸腺苷掺入编码区中，所产生的多核苷酸具有与标记物和抑制剂(例如，聚合酶抑制剂)连接的可切割接头。一旦切割接头(例如，采用还原性条件以还原具有可切割二硫键部分的接头)，标记物和抑制剂被释放。本文中和2013年3月9日提交的国际申请PCT/US2013/30062(代理人案号M300)中描述了额外的接头和酬载(例如，治疗剂、可检测标记物和细胞渗透性酬载)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
本文所述的多核苷酸可以用于胞内靶向酬载(例如，可检测物质或治疗剂)到特定的细胞器。示例性胞内靶可以包括，但不限于，用于晚期mRNA加工的核定位或与含有抑制剂的mRNA连接核定位序列(NLS)。
在一个例子中，接头在核糖环的2’-位置处和/或在处多核苷酸的3’和/或5’位置处连接(参见例如，国际公开号WO2012030683，所述文献通过引用方式完整并入本文)。接头可以是本文公开的、本领域已知的和/或国际公开号WO2012030683中公开的任何接头，所述文献通过引用方式完整并入本文。
在另一个例子中，多核苷酸可以通过可切割接头与编码病毒抑制肽(VIP)的多核苷酸连接。可切割接头可以释放VIP和染料至细胞中。在另一个例子中，多核苷酸可以通过接头连接至负责某些细菌毒素(如霍乱毒素、白喉毒素和百日咳毒素)的作用的ADP-核糖基化物。这些毒素蛋白是修饰人细胞中靶蛋白的ADP-核糖基转移酶。例如，霍乱毒素ADP-核糖基G蛋白通过引起大量流体从小肠衬层分泌(这导致危及生命的腹泻)调节人细胞。
在一些实施方案中，酬载可以是治疗剂如细胞毒素、放射性离子、化疗药或其他治疗药。细胞毒素或细胞毒药物包括可能有害于细胞的任何物质。例子包括但不限于紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、佐柔比星、二氢蒽二酮(dihydroxyanthracinedione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、类美登素(maytansinoid)，例如美登醇(参见完整并入本文的美国专利号5,208,020)、rachelmycin(CC-1065，参见美国专利号5,475,092、5,585,499和5,846,545，所述全部文献均通过引用的方式并入本文)及其类似物或同源物。放射性离子包括但不限于碘(例如，碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸盐、钴、钇90、钐153和镨。其他治疗药包括但不限于抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷基化剂(例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、rachelmycin(CC-1065)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，佐柔比星(旧称柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)(旧称放线菌素D)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱、长春碱、紫杉酚和类美登素(maytansinoid))。
在一些实施方案中，酬载可以是可检测物质，如各种有机小分子、无机化合物、纳米粒子、酶或酶底物、荧光物质、发光物质(例如，鲁米诺)、生物发光物质(例如，萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白)、化学发光物质、放射性物质(例如，18F、67Ga、81mKr、82Rb、111In、123I、133Xe、201Tl、125I、35S、14C、3H或99mTc(例如，如过锝酸盐(锝酸盐(VII)、TcO4 -))和造影剂(例如，金(例如，金纳米粒子)、钆(例如，螯合Gd)、铁氧化物(例如，超顺磁氧化铁(SPIO)、单晶氧化铁纳米粒子(MIONs)和超小超顺磁氧化铁(USPIO))、锰螯合物(例如，Mn-DPDP)、硫酸钡、碘化造影剂(iohexol)、微泡或全氟碳)。这类种光学可检测的标记物包括例如而不限于4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸茋-2,2'-二磺酸；吖啶和衍生物(例如，吖啶和吖啶异硫氰酸酯)；5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸盐；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；BODIPY；亮黄(BrilliantYellow)；香豆素和衍生物(例如，香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、香豆素120)和7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151))；菁染料；焰红染料；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5′,5"-二溴连苯三酚磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4’-二异硫氰酸基二氢-茋-2,2′-二磺酸；4,4’-二异硫氰酸基茋-2,2′-二磺酸；5-[二甲氨基]-萘-1-磺酰氯(DNS、丹磺酰氯)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’-异硫氰酸酯(DABITC)；伊红和衍生物(例如，伊红和伊红异硫氰酸酯)；赤藓红和衍生物(例如，赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯)；乙锭；荧光素和衍生物(例如，5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2′,7’-二甲氧基-4’,5′-二氯-6-羧基荧光素、荧光素、异硫氰酸荧光素、X-罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸酯(QFITC或XRITC)和荧光胺)；2-[2-[3-[[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(3-磺丙基)-2H-苯并[e]吲哚-2-亚基]亚乙基]-2-[4-(乙氧羰基)-1-哌嗪基]-1-环戊烯-1-基]乙烯基]-1,1-二甲基-3-(3-磺酰丙基)-1H-苯并[e]吲哚鎓氢氧化物、内盐、与n,n-二乙基乙胺的化合物(1:1)(IR144)；5-氯-2-[2-[3-[(5-氯-3-乙基-2(3H)-苯并噻唑-亚基)亚乙基]-2-(二苯基氨基)-1-环戊烯-1-基]乙烯基]-3-乙基苯并噻唑高氯酸盐(IR140)；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二醛；芘和衍生物(例如，芘、丁酸芘和琥珀酰亚胺基1-芘)；丁酸酯量子点；反应红4(CIBACRONTM亮红3B-A)；罗丹明和衍生物(例如，6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明x异硫氰酸酯、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101、磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(得克萨斯红)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)四甲基罗丹明和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC))；核黄素；玫红酸；铽螯合物衍生物；花青-3(Cy3)；花青-5(Cy5)；花青-5,5(Cy5,5)、花青-7(Cy7)；IRD700；IRD800；Alexa647；La Jolta蓝；酞菁；和萘酞菁。
在一些实施方案中，可检测物质可以是在激活时变得可检测的不可检测前体(例如，荧光团四嗪-荧光团构建体(例如，四嗪-BODIPY FL，四嗪-俄勒冈绿488或四嗪-BODIPYTMR-X)或酶可激活的荧光团物质(例如，(VisEn Medical))。其中可以使用酶标记组合物的体外测定法包括，但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀测定法、免疫荧光法、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和蛋白质印迹分析。
组合
多核苷酸可以与一种或多种其他治疗药、预防药、诊断药或成像剂组合使用。“与……组合”不意在暗示所述药物必须在相同的时间施用和/或配制在一起递送，不过这些递送方法处于本公开的范围内。组合物可以与一种或多种其他所需的治疗剂或医疗方法同时、在其之前或之后施用。通常而言，每种药剂将按确定用于该药剂的剂量和/或按确定用于该药剂的时间方案施用。在一些实施方案中，本公开涵盖递送与可以改善其生物利用率，减少和/或调节其代谢、抑制其排泄和/或调节其体内分布的物质组合的药物、预防性、诊断性或成像组合物。在一个实施方案中，本文描述的多核苷酸可以与如国际专利申请号PCT/US2014/027077中(如在第[000978]–[001023]段中)描述的一种或多种其他药剂组合施用，所述文献的内容通过引用方式完整地并入。
进一步理解，组合利用的治疗活性、预防活性、诊断活性或成像活性药剂(试剂)可以在单个组合物中一起施用或在不同组合物中分别施用。通常而言，预期组合利用的药剂应当按照不超过单独利用它们的水平利用。在一些实施方案中，组合利用的水平将低于单独利用的那些水平。在一个实施方案中，各组合，每种或一起，可以根据本文所述的分割给药方案施用。
剂量(dosing)
本发明提供了包括向有需求的受试者施用本发明的修饰mRNA及其编码的蛋白质或复合物的方法。可以使用有效预防、治疗、诊断疾病、病症和/或病状(例如，涉及工作记忆缺失的疾病、病症和/或病状)或对其成像的任何量和任何施用途径，施用核酸、蛋白质或复合物或其药物组合物、成像组合物、诊断组合物或预防性组合物至受试者。所要求的确切量将在受试者之间不同，这取决于受试者的物种、年龄和总体状况、疾病严重程度、具体组合物、其施用模式、其活性模式等。本发明的组合物一般以易于施用和剂量均匀的剂量单位形式配制。然而，将理解，本发明组合物的每日总用量可以由主治医师在正确医学判断的能力范围内决定。任何特定患者的具体的治疗有效、预防有效或适宜成像的剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的病症和病症的严重性；所用特定化合物的活性；所用的特定组成；患者的年龄、体重、总体健康、性别和膳食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗持续期；与所用特定化合物联合或同时使用的药物和医学领域中熟知的类似因素。
在某些实施方案中，本发明的组合物可以按这样的剂量水平施用，所述剂量水平足以递送约0.0001mg/kg至约100mg/kg、约0.001mg/kg至约0.05mg/kg、约0.005mg/kg至约0.05mg/kg、约0.001mg/kg至约0.005mg/kg、约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg或约1mg/kg至约25mg/kg受试者体重，每日一日一次或多次，以获得所需的治疗、诊断、预防或成像效果(参见例如，国际公开号WO2013078199中描述的单位剂量范围，所述文献通过引用方式完整并入本文)。所需的剂量可以一日3次、一日2次、一日1次、每隔1日、每隔2日、每周、每两周、每三周或每四周递送。在某些实施方案中，可以使用多次给药(例如、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14次或更多次施用)，递送所需的剂量。当使用多次给药时，可以使用分割给药方案，如本文所述的那些。
根据本发明，已经发现以分割剂量方案施用多核苷酸在哺乳动物受试者中产生较高水平的蛋白质。如本文所用，“分割剂量”是单个单位剂量或每日总剂量分成两个或更多个剂量，例如单个单位剂量的两次或更次施用。如本文所用，“单个单位剂量”是以一个剂量/在一个时间/单个途径/单个接触点(即，单个施用事件)施用的任何治疗药的剂量。如本文所用，“每日总剂量”是在24小时时间给予或开具的量。它可以作为单个单位剂量施用。在一个实施方案中，将本发明的多核苷酸按分割剂量施用至受试者。多核苷酸可以在仅缓冲剂中或在本文所述的制剂中配制。
剂型
本文所述的药物组合物可以配制成本文所述的剂型，如局部用、鼻内、气管内或可注射用(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、心内、腹膜内、皮下)。
液态剂型
用于肠胃外施用的液态剂型包括但不限于可药用的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和/或酏剂。除活性成分之外，液态剂型可以包含本领域常使用的惰性稀释剂，包括，但不限于水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。在肠胃外施用的某些实施方案中，组合物可以与增溶剂如醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合混合。
可注射
可注射制品，例如，无菌可注射的水性或油性混悬剂，可以根据已知技术配制，并且可以包含合适的分散剂、润湿剂和/或助悬剂。无菌可注射制品可以是肠胃外可接受的无毒稀释剂和/或溶剂中的无菌注射溶液剂、混悬剂和/或乳剂，例如，1,3-丁二醇中的溶液剂。可以使用的可接受的溶媒和溶剂包括但不限于水、林格溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。常规地使用无菌非挥发性油作溶剂或助悬介质。出于这个目的，可以使用任何温和的非挥发性油，包括合成性甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可以用于注射剂的制备。
可注射制剂可以例如通过截留细菌的滤器过滤和/或通过掺入无菌固体组合物形式的消毒剂制备，其中所述的消毒剂可以在使用之前溶解于或分散在无菌水或其他无菌的可注射介质中。
为了延长活性成分的效果，可能希望减缓所述活性成分从皮下或肌内注射的吸收。这可以通过使用水溶性差的晶态或无定形材料的液态悬液而实现。多核苷酸的吸收速率取决于其溶解速率，所述溶解速率转而可能依赖于其晶体大小和结晶形式。可选地，肠胃外施用的多核苷酸的延迟吸收可以通过将该多核苷酸溶解或混悬于油溶媒中实现。通过在诸如聚丙交酯-聚乙交酯的可生物降解的聚合物中形成所述多核苷的微胶囊基质，来制备注射用储器剂型。取决于多核苷酸对聚合物的比率以及所用的特定聚合物的本性，可以控制多核苷酸释放的速率。其他生物可降解聚合物的例子包括但不限于聚(原酸酯)和聚(酐)。可以通过将多核苷酸包裹在与身体组织相容的脂质体或微乳液中，来制备可注射贮库形式制剂。
肺用
可用于肺递送的本文所述制剂也可以用于鼻内递送药物组合物。适于鼻内施用的另一个制剂可以是包含活性成分并具有约0.2μm至500μm平均粒径的粗粉。这种制剂可以按其中服用嗅剂的形式施用，即从靠近鼻子所持的含有该粉末的容器经鼻道快速吸入。
适于经鼻施用的制剂可以例如包含约少达0.1％(w/w)和多达100％(w/w)的活性成分，并且可以包含本文所述的一种或多种额外成分。药物组合物可以以适于口颊施用的制剂而制备、包装和/或出售。这类制剂可以例如处于使用常规方法制造的片剂和/或锭剂形式，并且可以含有例如约0.1％至20％(w/w)的活性成分，其中余量可以包含口服可溶解和/或可降解组合物和任选地本文所述的一种或多种额外成分。可选地，适于口颊施用的制剂可以包括包含活性成分的散剂和/或气雾化和/或喷雾化溶液剂和/或混悬剂。当分散时，这类粉状、气雾化和/或喷雾化制剂可以具有范围约0.1nm至约200nm的平均粒子和/或液滴大小，并且还可以包含本文所述的任意一种或多种额外成分。
在配制和/或制造药剂(pharmaceutical agent)中的一般考虑事项可以例如在Remington:The Science and Practice of Pharmacy第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005 5(通过引用的方式完整并入本文)中找到。
包衣或壳
片剂、锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固态剂型可以用包衣和壳(如肠衣和药物配制领域中熟知的其他包衣)制备。它们可以任选地包含遮光剂并且可以是这样一种组合物，它们仅在或优选地在肠道的某些部分中，任选地以延迟方式释放活性成分。可以使用的包埋型组合物的实例包含聚合物质和蜡。可以使用相似类型的固体组合物作为使用这类赋形剂如乳糖或奶糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的软质和硬质填胶胶囊剂中的填料。
多剂量和重复剂量施用
在一些实施方案中，本发明的化合物和/或组合物可以按两种或更多种剂量施用(在本文中称作“多剂量施用”)。这类剂量可以包含相同组分或可以包含先前剂量中未纳入的组分。这类剂量可以包含相同质量和/或体积的组分，或与先前剂量相比，质量和/或体积改变的组分。在一些实施方案中，多剂量施用可以包括重复剂量施用。如本文所用，术语“重复剂量施用”指连续施用或在重复剂量方案内部施用的两个或更多个剂量，所述重复剂量方案包含按基本上相同的质量和/或体积提供的基本上相同的组分。在一些实施方案中，受试者可显示重复剂量反应。如本文所用，术语“重复剂量反应”指受试者中对重复剂量的反应，所述反应与重复剂量施用方案内部施用的另一个剂量的反应不同。在一些实施方案中，这种反应可以是与包含mRNA的重复剂量响应的蛋白质表达。在这类实施方案中，蛋白质表达可以与重复剂量施用方案内部施用的另一个剂量相比升高，或蛋白质表达可以与重复剂量施用方案内部施用的另一个剂量相比减少。蛋白质表达的改变可以是约1％至约20％、约5％至约50％、约10％至约60％、约25％至约75％、约40％至约100％和/或至少100％。作为重复剂量方案组成部分施用的mRNA的表达减少，其中从施用的RNA翻译的蛋白质的水平与重复剂量方案内部的另一个剂量相比降低超过40％，在本文中称作“重复剂量抗性”。
药物组合物的特性
本文所述的药物组合物可以通过以下一种或多种特性表征：
生物利用率
当配制成含有如本文所述的递送剂的组合物时，与缺少如本文所述的递送剂的组合物相比，多核苷酸可以显示出生物利用率增加。如本文所用，术语“生物利用率”指施用至哺乳动物的给定量的多核苷酸的全身利用率。可以通过施用化合物至哺乳动物之后测量未改变形式的化合物的曲线下面积(AUC)或最大血清或血浆浓度(Cmax)，评估生物利用率。AUC是沿纵坐标(Y-轴)的化合物血清或血浆浓度对沿横坐标(X-轴)的时间作图的曲线下面积测定值。通常，特定化合物的AUC可以使用本领域普通技术人员已知的和如G.S.Banker,Modern Pharmaceutics,Drugs and the Pharmaceutical Sciences,v.72,MarcelDekker,New York,Inc.,1996中所述的方法计算，所述文献通过引用方式完整并入本文。
Cmax值是施用化合物至哺乳动物之后在哺乳动物血清或血浆中实现的最高化合物浓度。特定化合物的Cmax值可以使用本领域普通技术人员已知的方法测量。如本文所用的短语“增加生物利用率”或“改善药代动力学”意指与如本文所述的递送剂一起共施用时，在哺乳动物中作为AUC、Cmax或Cmin测量的第一多核苷酸全身利用率是比不进行这类共施用时更大。在一些实施方案中，多核苷酸的生物利用率可以增加至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在一些实施方案中，多核苷酸的液态制剂可以具有变动的体内半寿期，从而需要调节剂量以产生治疗效果。为了解决这个问题，在本发明的一些实施方案中，可以设计多核苷酸制剂以改善重复施用期间的生物利用率和/或治疗作用。这类制剂可以实现多核苷酸缓释和/或降低多核苷酸遭核酸酶降解的速率。在一些实施方案中，提供包含多核苷酸、水不溶混性油储库、表面活性剂和/或辅助表面活性剂和/或助溶剂的混悬制剂。油和表面活性剂的组合可以实现含多核苷酸的混悬制剂。在水不溶混性储库中递送多核苷酸可以用来通过多核苷酸从储库缓释到周围生理环境和/或防止多核苷酸被核酸酶降解，从而改善生物利用率。
在一些实施方案中，包含二价和一价阳离子组合的阳离子性纳米粒子可以与多核苷酸配制在一起。这类纳米粒子可以在溶液中经给定的时间(例如数小时、数天等)自发形成。这类纳米粒子在仅二价阳离子存在或仅一价阳离子存在时不形成。在阳离子性纳米粒子中或在包含阳离子性纳米粒子的一种或多种储库中递送多核苷酸可以通过充当长效储库和/或减少核酸酶降解率，改善多核苷酸生物利用率。
治疗窗口
当配制成含有如本文所述的递送剂的组合物时，与缺少如本文所述的递送剂时施用的多核苷酸组合物的治疗窗口相比，多核苷酸可以显示所施用的多核苷酸组合物的治疗窗口增加。如本文所用，“治疗窗口”指作用部位处治疗活性物质的血浆浓度范围或水平范围，具有高的激发治疗效果的概率。在一些实施方案中，与如本文所述的递送剂共施用时，多核苷酸的治疗窗口可以增加至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
分布容积
当配制成含有如本文所述的递送剂的组合物时，与缺少如本文所述的递送剂的组合物相比，多核苷酸可以显示出改善(例如，减少或定向)的分布容积(Vdist)。分布容积(Vdist)使身体内药物的量与药物在血液或血浆中的浓度关联。如本文所用，术语“分布容积”指以按照与血液或血浆中相同的浓度在身体内含有药物总量时所需要的流体体积：Vdist等于身体内药物的量/药物在血液或血浆中的浓度。例如，对于10mg剂量和10mg/L血浆浓度，分布容积将为1升。分布容积反映了药物在血管外组织中存在的程度。大的分布容积反映了与血浆蛋白结合作用相比，化合物与组织组分结合的倾向性。在临床环境下，Vdist可以用来确定负荷剂量以实现稳态浓度。在一些实施方案中，与如本文所述的递送剂共施用时，多核苷酸的分布容积可以减少至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％。
生物学效果
在一个实施方案中，可以通过分析动物中的蛋白质表达，将向动物输送的修饰的mRNA的生物学效果进行归类。可以通过分析从施用过本发明修饰的mRNA的哺乳动物采集的生物样品，确定蛋白质表达。在一个实施方案中，可以优选由至少50pg/ml施用至哺乳动物的修饰的mRNA编码的蛋白质表达。例如，针对递送至哺乳动物的修饰的mRNA编码的蛋白质，50-200pg/ml蛋白质表达可被视为哺乳动物中该蛋白质的治疗有效量。
通过质谱法检测多核苷酸
质谱法(MS)是可以在分子转化成离子后提供关于分子的结构和分子质量/浓度的信息的分析技术。分子首先电离以获得正电荷或负电荷，随后它们穿过质量分析器以根据其质量/电荷(m/z)比到达检测器的不同区域。
使用质谱仪实施质谱法，所述质谱仪包括用于电离分级样品并产生用于进一步分析的带电荷分子的离子源。例如，可以通过电喷雾电离(ESI)、常压化学电离(APCI)、光电离、电子电离、快原子轰击(FAB)/液体二次电离(LSIMS)、基质辅助激光解吸附/电离(MALDI)、场致电离、场致解吸附、热喷雾/等离子喷雾电离和粒子束电离，实施样品的电离。技术人员理解，电离方法的选择可以根据待测量的分析物、样品类型、检测器类型、正模式与负模式的选择等确定。
在样品已经电离后，可以分析如此产生的带正电荷离子或带负电荷离子以确定质荷比(即，m/z)。确定质荷比的合适分析仪包括四级分析仪、离子阱分析仪和飞行时间分析仪。可以使用几种检测模式检测离子。例如，所选择的离子(即，使用选择性离子监测模式(SIM))，或可选地，离子可以使用扫描模式，例如，多反应监测(MRM)或选择的反应监测(SRM)，检测。
已经显示液相色谱-多反应监测(LC-MS/MRM)偶联稳定同位素标记的肽标准品稀释物法是验证蛋白质的有效方法(例如Keshishian等人,Mol Cell Proteomics 2009 8:2339-2349；Kuhn等人,Clin Chem 2009 55:1108-1117；Lopez等人,Clin Chem 2010 56:281-290；所述文献的每一篇通过引用的方式完整地并入本文)。不同于生物标记物发现研究中经常使用的非靶向质谱法，靶向MS法是基于肽序列的MS模式，其重点在于仪器对复杂混合物中数十种至数百种所选肽的完整分析能力。通过将检测和片段化限制至仅对衍生自目的蛋白的那些肽，与发现模式MS法相比，敏感性和重现性大幅度改善。通过对临床样品的快速、靶向、多重蛋白质表达概况分析，这种基于质谱法的多反应监测(MRM)蛋白质定量方法可以大幅度影响生物标记物的发现和定量。
在一个实施方案中，可以通过MRM-MS法分析生物样品，所述生物样品可能含有由本发明的至少一种修饰的mRNA编码的至少一种蛋白质。生物样品定量还可以包含但不限于同位素标记的肽或蛋白质作为内标物。
根据本发明，一旦从受试者获得，生物样品可以接受酶消化。如本文所用，术语“消化”意指分解成较短的肽。如本文所用，短语“处理样品以消化蛋白质”意指以如此方式处理样品，从而分解样品中的蛋白质。这些酶包括但不限于胰蛋白酶、蛋白内切酶Glu-C和胰凝乳蛋白酶。在一个实施方案中，可以使用酶消化生物样品，所述生物样品可含有由本发明的至少一种修饰的mRNA编码的至少一种蛋白质。
在一个实施方案中，可以使用电喷雾电离法分析生物样品的蛋白质，所述生物样品可含有由本发明的修饰的mRNA编码的蛋白质。电喷雾电离(ESI)质谱法(ESIMS)使用电能以辅助离子在通过质谱法分析前从溶液转移至气相。可以使用本领域已知的方法分析样品(例如，Ho等人,Clin Biochem Rev.2003 24(1):3-12；所述文献通过引用方式完整并入本文)。通过分散带电液滴的细喷雾、蒸发溶剂并从带电荷液滴抛射离子以产生高度带电荷的液滴雾，可以将溶液中所含的离子物质转移至气体相中。可以使用至少1台、至少2台、至少3台或至少4台质量分析器如，但不限于四极质量分析器，分析高度带电荷的液滴雾。另外，质谱法可以包括纯化步骤。作为一个非限制性例子，可以设定第一四极以选择单一m/z比率，从而它可以滤除具有不同m/z比的其他分子离子率，这可以消除MS分析之前复杂和费时的样品纯化程序。
在一个实施方案中，可以在串联ESIMS系统(例如，MS/MS)中分析生物样品的蛋白质，所述生物样品可含有由本发明的修饰的mRNA编码的蛋白质。作为非限制性例子，可以使用产物扫描(或子离子扫描)、前体扫描(母离子扫描)、中性丢失或多次反应监测，分析液滴。
在一个实施方案中，可以使用基质辅助激光解吸附/电离(MALDI)质谱法(MALDIMS)分析生物样品，所述生物样品可含有由本发明的修饰的mRNA编码的蛋白质。MALDI提供大分子和小分子(如蛋白质)的非毁灭性蒸发和电离。在MALDI分析中，分析物首先与巨大摩尔过量的基质化合物共结晶，所述基质化合物还可以包含，但不限于紫外吸收性弱有机酸。MALDI中使用的基质的非限制性例子是α-氰-4-羟肉桂酸、3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸和2,5-二羟苯甲酸。对分析物-基质混合物的激光辐射可以导致基质和分析物的蒸发。激光引起的解吸附提供了完整分析物的高离子产率并允许以高准确度测量化合物。可以使用本领域已知的方法分析样品(例如，Lewis,Wei和Siuzdak,Encyclopedia ofAnalytical Chemistry 2000:5880-5894；所述文献通过引用方式完整并入本文)。作为非限制性例子，MALDI分析中使用的质量分析器可以包括线性飞行时间(TOF)、TOF反射器或傅立叶变换质量分析器。
在一个实施方案中，可以使用干燥液滴法形成分析物-基质混合物。生物样品与基质混合以产生饱和的基质溶液，其中基质-对-样品之比大约是5000:1。随后允许饱和基质溶液的等分试样(大约0.5-2.0μL)干燥，以形成分析物-基质混合物。
在一个实施方案中，可以使用薄层法形成分析物-基质混合物。首先形成均匀的基质薄膜并且随后施加样品并且样品可以被基质吸附以形成分析物-基质混合物。
在一个实施方案中，可以使用厚层法形成分析物-基质混合物。用硝基-纤维素基质添加物形成均匀的基质薄膜。一旦获得均匀的硝基-纤维素基质层，则施加样品并吸附至基质中，以形成分析物-基质混合物。
在一个实施方案中，可以使用夹心法形成分析物-基质混合物。如薄层法中那样制备基质晶体的薄层，随后添加含水三氟乙酸、样品和基质的液滴。样品随后吸附至基质中以形成分析物-基质混合物。
V.本发明多核苷酸的用途
在优选的实施方案中，设计本发明的多核苷酸以实现对有害生物反应如免疫反应和/或降解途径的避让或规避，克服表达阈值和/或改善蛋白质产生能力、改善的表达速率或翻译效率、改善的药物或蛋白质半寿期和/或蛋白质浓度、优化的蛋白质定位，旨在改善以下一者或多者：组织中的稳定性和/或清除作用、受体摄取和/或动力学、组合物的细胞可接近性，与翻译机器的协调、分泌效率(当适用时)、循环可及性，和/或对细胞状态、功能和/或活性的调节作用。
治疗药
LDLR相关疾病、病症和/或病状
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以用来治疗和/或预防LDLR相关疾病、病症或病状。LDLR相关疾病、病症或病状的非限制性例子包括LDL降低、胆固醇降低、高胆固醇血症、高脂血症和动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以用来减少心脏病风险。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以用来减少形成动脉粥样硬化的风险。尽管不希望受理论约束，但动脉粥样硬化是大部分心血管疾病的原因。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以用来治疗和/或预防高胆固醇血症。作为一个非限制性例子，高胆固醇血症是家族性高胆固醇血症。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以用来降低LDL。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以用来降低受试者中的胆固醇。作为一个非限制性例子，本文所述的多核苷酸可以能够降低受试者血浆中的胆固醇水平。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以用来治疗或预防高脂血症。
代谢性疾病、病症和/或病状
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以用来治疗和/或预防代谢性疾病、病症和/或病状。作为一个非限制性例子，代谢性疾病、病症或病状可以是酸性脂肪酶病、Barth综合征(BTHS)、脑桥中央髓鞘溶解(Central Pontine Myelinolysis)、Farber病、神经节苷脂沉积病、Hunter综合征、Hurler综合征、臭鱼症(Trimethylaminuria)、Lesch-Nyhan综合征、脂质贮积病、代谢性肌病、线粒体肌病、粘脂贮积症、粘脂贮积症、粘多糖病、Pompe病、糖原贮积病、脲循环疾病、高草酸尿和草酸盐沉着症。
心血管疾病、病症和/或病状
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以用来治疗和/或预防心血管疾病、病症和/或病状。作为一个非限制性例子，心血管疾病、病症或病状可以是心力衰竭，缺血性卒中、出血性卒中、心率失常、狭窄、反流、二尖瓣脱垂。
治疗剂
本文所述的本发明多核苷酸，如修饰的核酸和修饰的RNA和从中翻译的蛋白质，可以用作治疗药或预防药。它们被用于药物中。例如，本文所述的多核苷酸可以施用至受试者，其中所述多核苷酸在体内翻译以在受试者中产生治疗性或预防性多肽。本文提供了用于诊断、治疗或预防人类和其他哺乳动物中疾病或病状的组合物、方法、试剂盒和试剂。本发明的活性治疗剂包括多核苷酸、含有多核苷酸的细胞或从多核苷酸翻译的多肽。
在某些实施方案中，本文提供了含有一种或多种含有编码一种蛋白质或多种蛋白质的可翻译区的多核苷酸的组合治疗药，所述蛋白质与诱导抗体依赖性细胞毒性的蛋白质一起强化哺乳动物受试者的免疫力。例如，本文中提供了治疗药，所述治疗药含有编码曲妥珠单抗和粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)的一种或多种核酸。特别地，这类组合治疗药可用于形成曲妥珠单抗诱导型耐药的Her2+乳腺癌患者中。(参见，例如，Albrecht,Immunotherapy.2(6):795-8(2010))。
本文提供了使用本文所述的多核苷酸诱导重组多肽在细胞群体中翻译的方法。这种翻译可以是体内、离体、在培养物中或体外。细胞群体与有效量的组合物接触，所述组合物含有具有至少一个核苷修饰和编码重组多肽的可翻译区的核酸。接触细胞群体的条件使得核酸定位于细胞群体的一个或多个细胞中并且在细胞中由核酸翻译重组多肽。
至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用手段、核酸的物理特征(例如，修饰核苷的大小和程度)和其他决定因素，提供“有效量”的组合物。通常，有效量的组合物在细胞中提供有效的蛋白质生产，优选比含有相应的未修饰核酸的组合物更高效。增加的效率可以由以下证实：细胞转染(即，核酸转染的细胞的百分数)增加，来自核酸的蛋白质翻译增加、核酸降解减少(如通过例如来自修饰的核酸的蛋白质翻译持续时间增加所证明的)或宿主细胞的先天免疫反应减少。
本发明的多个方面涉及在有需要的哺乳动物受试者中诱导重组多肽体内翻译的方法。因此，使用本文所述的递送方法，将有效量的组合物施用至受试者，所述组合物含有具有至少一个结构性或化学性修饰和编码重组多肽的可翻译区的核酸。核酸以某个量并且在其他条件下如此提供，从而核酸定位于受试者的细胞中，并且在细胞中由核酸翻译重组多肽。可以通过一轮或多于一轮的核酸施用，靶向其中定位有核酸的细胞或其中存在该细胞的组织。
在某些实施方案中，施用的多核苷酸指导一种或多种重组多肽的产生，所述重组多肽提供了在翻译重组多肽的细胞、组织或生物中基本上不存在的功能活性。例如，丢失的功能活性可以是酶促、结构或基因调节性质的。在相关的实施方案中，施用的多核苷酸指导一种或多种重组多肽的产生，所述重组多肽增加(例如，协同地增加)在翻译重组多肽的细胞中存在但明显不足的功能活性。
在其他实施方案中，施用的多核苷酸指导一种或多种重组多肽的产生，所述重组多肽替换在翻译重组多肽的细胞中基本上缺乏的一种多肽(或多种多肽)。此种缺乏可以归因于编码基因或其调节途径的遗传突变。在一些实施方案中，重组多肽增加了细胞中内源蛋白的水平到期望的水平；这种增加可以导致内源蛋白的水平从逊常水平到正常水平或从正常水平到超正常水平。
可选地，重组多肽发挥作用以拮抗在细胞中存在、在细胞表面上或从细胞分泌的内源蛋白的活性。通常，内源蛋白的活性对受试者是不利的；例如，归因于导致活性或定位改变的内源蛋白突变。另外，重组多肽功能直接或间接拮抗在细胞中存在、在细胞表面上或从细胞分泌的生物部分的活性。拮抗的生物部分的例子包括脂质(例如，胆固醇)、脂蛋白(例如，低密度脂蛋白)、核酸、糖、蛋白质毒素如志贺氏毒素和破伤风毒素、或小分子毒素如肉毒杆菌毒素、霍乱毒素和白喉毒素。另外，所拮抗的生物分子可以是显示出不利活性如细胞毒活性或细胞抑制活性的内源蛋白。
本文所述的重组蛋白可以工程化以定位于细胞内部、可能定位于特定区室如胞核内部，或经工程化以便从细胞分泌或转运到细胞的质膜上。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸及它们编码的多肽可以用于治疗多种疾病、病症和/或病状中的任一者，所述疾病、病症和/或病状包括但不限于以下一者或多者：自身免疫疾病(例如，糖尿病、狼疮、多个硬化、银屑病、类风湿性关节炎)；炎性疾病(例如，关节炎、盆腔炎性疾病)；感染性疾病(例如，病毒性感染(例如，HIV、HCV、RSV)、细菌性感染、真菌性感染、败血症)；神经系统疾病(例如，阿尔茨海默病、亨廷顿病；孤独症；杜兴氏肌营养不良；心血管病(例如，动脉粥样硬化、高胆固醇血症、血栓形成、凝血障碍、血管生成病如黄斑变性)；增殖性病症(例如，癌症、良性肿瘤)；呼吸道病(例如，慢性阻塞性肺病)；消化道病(例如，炎性肠病、溃疡)；骨骼肌病(例如，纤维肌痛、关节炎)；内分泌、代谢性和营养性病症(例如，糖尿病、骨质疏松症)；泌尿系统病症(例如，肾脏疾病)；心理病症(例如，抑郁、精神分裂症)；皮肤病症(例如，伤口、湿疹)；血液及淋巴疾病(例如，贫血、血友病)；等。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过向受试者的细胞群体引入编码Sortilin(基因组研究最近表征的一种蛋白质)的修饰的mRNA分子，因而改善受试者中的高脂血症，由此治疗受试者中高脂血症的方法。SORT1基因编码一种反面高尔基体网络(TGN)跨膜蛋白，称作Sortilin。遗传研究已经显示，五分之一的个体在SORT1基因的1p13基因座中具有单核苷酸多态性，rs12740374，所述单核苷酸多态性使它们预先倾向具有低水平的低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)。存在于约30％人群中的每个拷贝的次要等位基因改变了LDL胆固醇8mg/dL，而存在于约5％群体中的两个拷贝的次要等位基因降低了LDL胆固醇16mg/dL。次要等位基因的携带者也已经显示具有减少40％的心肌梗死风险。小鼠中的体内功能性研究描述道，小鼠肝组织中SORT1的过量表达导致显著降低LDL胆固醇水平，降低达80％，并且沉默SORT1增加了LDL胆固醇大约200％(Musunuru K等人,Fromnoncoding variant to phenotype via SORT1at the 1p13cholesterol locus.Nature2010；466:714-721)。
本公开的其他方面涉及移植含有多核苷酸的细胞至哺乳动物受试者。向哺乳动物受试者施用细胞是本领域普通技术人员已知的，并且包括，但不限于局部植入法(例如，局部或皮下施用)、器官递送或全身注射(例如，静脉内注射或吸入)和可药用载体中的细胞制剂。可以配制含有多核苷酸的这类组合物，用于肌内、经动脉、腹腔内、静脉内、鼻内、皮下、内窥方式、经皮或鞘内施用。在一些实施方案中，可以配制组合物用于延长的释放。
可以对其施用治疗药的受试者患有疾病、病症或有害病状或可以面临形成疾病、病症或有害病状的风险。本文提供了根据这些碱基鉴定、诊断受试者和对其分类的方法，所述方法可以包括临床诊断、生物标记物水平、全基因组关联研究(GWAS)和其他本领域已知的方法。
免疫反应的调节
避免免疫反应
如本文所述，本发明多核苷酸的一个有用特征是能够减少、规避或避免细胞的先天免疫反应。在一个方面，本文中提供了编码目的多肽的多核苷酸，所述目的多肽在递送至细胞时导致如与参考化合物(例如与本发明的多核苷酸相对应的未修饰的多核苷酸或本发明的不同多核苷酸)触发的反应相比，来自宿主的免疫反应降低。如本文所用，“参考化合物”是当施用至哺乳动物时导致具有已知程度、水平或数量的免疫刺激作用的先天免疫反应的任何分子或物质。参考化合物不必是核酸分子，并且它不必是本发明的任何多核苷酸。因此，对多核苷酸避让、规避免疫反应或无法触发免疫反应的度量可以相对于已知触发这种反应的任何化合物或物质而言表示。
术语“先天免疫反应”包括对外源单链核酸(通常为病毒源或细菌源)的细胞反应，这涉及诱导细胞因子(尤其干扰素)的表达和释放以及细胞死亡。如本文所用，先天免疫反应或干扰素反应在单个细胞水平发挥作用，造成细胞因子表达、细胞因子释放、全面抑制蛋白质合成、全面破坏细胞RNA、上调主要组织相容性分子和/或诱导凋亡性死亡、诱导参与凋亡的基因发生基因转录、抗生长以及先天性和适应性免疫细胞活化。受I型IFN诱导的一些基因包括PKR、ADAR(对RNA起作用的腺苷脱氨酶)、OAS(2',5'-寡腺苷酸合成酶)、RNase L和Mx蛋白。PKR和ADAR分别导致抑制翻译起始和RNA编辑。OAS是一种dsRNA依赖性合成酶，其激活核糖核酸内切酶RNase L以降解ssRNA。
在一些实施方案中，先天免疫反应包括I型或II型干扰素的表达，并且与来自尚未接触本发明多核苷酸的细胞的参考比较，I型或II型干扰素的表达增长不超过两倍。
在一些实施方案中，先天免疫反应包括一个或多个IFN标签基因的表达，并且其中与来自尚未接触本发明多核苷酸的细胞的参考比较，一个或多个IFN标签基因的表达增长不超过三倍。
尽管在某些环境下，可能有利的是消除细胞中的先天免疫反应，但本发明提供的多核苷酸在施用时产生明显降低(显著较少)的免疫反应(包括干扰素信号传导)，而不完全消除这种反应。
在一些实施方案中，如与参考化合物诱导的免疫反应相比，该免疫反应低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或大于99.9％。免疫反应本身可以是通过测量I型干扰素的表达或活性水平或干扰素调节基因如toll-样受体(例如，TLR7和TLR8)的表达而测量。先天免疫反应的降低也可以通过测量向某个细胞群体施用一次或多次后细胞死亡减少的水平度量；例如，细胞死亡比采用参考化合物时观察到的细胞死亡频率低10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％或超过95％。另外，细胞死亡可以影响少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％或少于0.01％与多核苷酸接触的细胞。
在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸具有比具有相同序列的未修饰的体外合成的多核苷酸或参考化合物显著较少的免疫原性。如本文所用，“显著较少的免疫原性”指免疫原性的可检测的降低。在另一个实施方案中，该术语指免疫原性下降倍数。在另一个实施方案中，该术语指这样的下降，从而可以施用有效量的多核苷酸时不触发可检测的免疫反应。在另一个实施方案中，该术语指这样的下降，其可以反复施用多核苷酸而不激发足以可检测地减少重组蛋白表达的免疫反应。在另一个实施方案中，下降是这样的，其可以反复施用多核苷酸而不激发足以消除重组蛋白可检测表达的免疫反应。
在另一个实施方案中，多核苷酸的免疫原性比其未修饰的对应物或参考化合物小2倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低3倍(3-fold)。在另一个实施方案中，免疫原性降低5倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低7倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低10倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低15倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低某个倍数。在另一个实施方案中，免疫原性降低50倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低100倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低200倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低500倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低1000倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低2000倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低另一个倍数差异。
测定免疫原性的方法是本领域熟知的并且例如包括测量细胞因子(例如IL-12、IFNα、TNF-α、RANTES、MIP-1α或β、IL-6、IFN-β或IL-8)分泌、测量DC活化标志物(例如CD83、HLA-DR、CD80和CD86)表达或测量充当适应性免疫反应的佐剂的能力。
本发明的多核苷酸，包含本文中教授的修饰组合，可具有优越特性，从而使它们更合适作为治疗形式。
已经确定本领域中的“全或无”模式是完全不足以描述与多核苷酸的治疗性实用性相关的生物现象。发明人已经确定，为了改善蛋白质产生，可以考虑修饰或修饰组合的性质、修饰百分数并且调查多于一种细胞因子或计量，以确定特定多核苷酸的有效性和风险谱。
在本发明的一个方面，测定与未修饰的多核苷酸相比多核苷酸的有效性的方法涉及测量和分析一种或多种由施用本发明外源核酸触发其表达的细胞因子。这些值与施用未修饰的核酸或与标准计量如细胞因子反应、PolyIC、R-848或本领域已知的其他标准比较。
本文中形成的标准计量的一个例子是测量细胞、组织或生物中产生的编码多肽(蛋白质)的水平或量与细胞、组织或生物中因施用或接触于修饰的核酸而触发其表达的一种或多种(或一组)细胞因子的比率。所述比率在本文中称作蛋白质:细胞因子比率或“PC”比率。PC比率越高，修饰的核酸(编码所测量的蛋白质的多核苷酸)越有效。按细胞因子，本发明的优选PC比率可以大于1、大于10、大于100、大于1000、大于10,000或更大。优选比不同的或未修饰的构建体的修饰核酸具有更高PC比率的修饰核酸。
PC比率可以进一步按多核苷酸中存在的修饰的百分数证明。例如，针对100％修饰的核酸归一化，可以确定随细胞因子(或风险)或细胞因子谱变化而变化的蛋白质生产。
在一个实施方案中，本发明提供一种通过比较修饰的核酸(多核苷酸)的PC比率，跨化学、细胞因子或修饰百分数而确定任何特定修饰的多核苷酸的相对有效性的方法。
可以产生含有水平变动的核碱基置换的多核苷酸，所述多核苷酸维持增加的蛋白质生产及降低的免疫刺激性潜力。任何修饰的核苷酸对其天然存在的核苷酸对应物的相对百分数可以在IVT反应期间变动(例如，相对于胞苷，100％、50％、25％、10％、5％、2.5％、1％、0.1％、0.01％5甲基胞苷使用频率；相对于尿苷，100％、50％、25％、10％、5％、2.5％、1％、0.1％、0.01％假尿苷或N1-甲基-假尿苷使用频率)。也可以相对于相同碱基使用2种或更多种不同核苷酸，利用不同比率(例如，假尿苷和N1-甲基-假尿苷的不同比率)产生多核苷酸。也可以在相同时间，在多于1个“碱基”位置处按混合比率(如5甲基胞苷/胞苷和假尿苷/N1-甲基-假尿苷/尿苷的比率)，产生多核苷酸。使用修饰核苷酸比率改变的修饰mRNA可能在减少可能暴露于化学修饰的核苷酸方面有益。最后，也可能向多核苷酸按位置引入调节蛋白质产生或免疫刺激潜力或这两者的修饰核苷酸。这类多核苷酸证明这些改善特性的能力可以在体外(使用多种测定法，如本文所述的PBMC测定法)评估，还可以通过测量多核苷酸编码的蛋白质产生和天然免疫识别的介导物如细胞因子，在体内评估。
在另一个实施方案中，通过确定为激发上述反应之一至与给定量的未修饰核苷酸或参考化合物相同的程度所要求的多核苷酸量，确定多核苷酸和其未修饰的对应物的相对免疫原性。例如，如果要求2倍量的多核苷酸以激发相同反应，则多核苷酸具有比未修饰的核苷酸或参考化合物小两倍的免疫原性。
在另一个实施方案中，通过相对于相同量的未修饰核苷酸或参考化合物，确定响应于施用多核苷酸所分泌的细胞因子(例如IL-12、IFNα、TNF-α、RANTES、MIP-1α或β、IL-6、IFN-β或IL-8)的量，确定多核苷酸和其未修饰的对应物的相对免疫原性。例如，如果分泌半数量的细胞因子，则多核苷酸具有比未修饰的核苷酸小两倍的免疫原性。在另一个实施方案中，在上述方法中计算免疫原性前扣除背景刺激水平。
本文中还提供在细胞或细胞群中滴定、减少或清除免疫反应的方法。在一些实施方案中，细胞与不同剂量的同一多核苷酸接触并评价剂量反应。在一些实施方案中，细胞与相同或不同剂量的众多不同多核苷酸接触以确定产生所需效果的最佳组成。关于免疫反应，所需效果可以是避免、规避或减少细胞的免疫反应。所需效果也可以是改变蛋白质产生效率。
使用国际公开号WO2013003475中描述的方法，本发明的多核苷酸可以用来减少免疫反应，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
天然存在的突变体
在另一个实施方案中，多核苷酸可以用来表达天然存在蛋白质的变体，所述变体具有改进的疾病调节活性，包括增加的生物学活性、改善的患者结局或保护性功能等。已经在哺乳动物中描述了许多这类调节物基因(Nadeau,Current Opinion in Genetics&Development 2003 13:290-295；Hamilton和Yu,PLoS Genet.2012；8:e1002644；Corder等人,Nature Genetics 1994 7:180–184；全部文献均通过引用方式完整地并入本文)。人类中的例子包括ApoE2蛋白、Apo A-I变体蛋白(Apo A-I Milano，Apo A-I Paris)、超反应性因子IX蛋白(因子IX Padua Arg338Lys)、转甲状腺素蛋白突变体(TTR Thr119Met)。已经显示相对于其他ApoE同工型(ApoE3(cys112，arg158)和ApoE4(arg112，arg158))，ApoE2(cys112，cys158)的表达通过降低对阿尔茨海默病和可能其他病状如心血管疾病的易感性，带来保护作用(Corder等人,Nature Genetics 1994 7:180–184；Seripa等人,Rejuvenation Res.2011 14:491-500；Liu等人Nat Rev Neurol.2013 9:106-118；全部文献均通过引用方式完整地并入本文)。Apo A-I变体的表达与胆固醇降低相关(deGoma和Rader,2011Nature Rev Cardiol 8:266-271；Nissen等人,2003JAMA 290:2292-2300；全部文献均通过引用方式完整地并入本文)。某些群体中ApoA-I的氨基酸序列已经在Apo A-IMilano中(Arg 173变成Cys)和在Apo A-I Paris中(Arg 151变成Cys)改变成半胱氨酸。位置R338L处的因子IX突变(FIX Padua)产生活性增长约10倍的因子IX蛋白(Simioni等人,NEngl J Med.2009 361:1671-1675；Finn等人,Blood.2012 120:4521-4523；Cantore等人,Blood.2012 120:4517-20；全部文献均通过引用方式完整地并入本文)。转甲状腺素蛋白在位置104或119处的突变(Arg104His，Thr119Met)已经显示为还携带致病性Val30Met突变的患者提供保护(Saraiva,Hum Mutat.2001 17:493-503；DATA BASE ON TRANSTHYRETINMUTATIONS http://www.ibmc.up.pt/mjsaraiva/ttrmut.html；全部文献均通过引用方式完整地并入本文)。利用赋予分子更多稳定性的非致病突变体产生的明显保护作用，观察到分别携带Met119突变和His104突变的葡萄牙Met 30患者和日本Met 30患者之间临床表现和症状严重程度的差异(Coelho等人,1996Neuromuscular Disorders(Suppl)6:S20；Terazaki等人,1999.Biochem Biophys Res Commun 264:365-370；全部文献均通过引用方式完整地并入本文)。编码这些保护性TTR等位基因的修饰的mRNA可以在TTR淀粉样变性患者中表达，从而减少致病性突变TTR蛋白的影响。
低密度脂蛋白受体(LDLR)
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白或其变体。来自Watson等人的图14显示LDLR的结构(参见Watson等人,Nature ReviewsDrug Discovery 7,84-99(2008年1月)中的图4a；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)，并且星号代表通过钙结合作用稳定化的区域。LDLR包含配体结合结构域、表皮生长因子(EGF)样区域、β-螺桨结构、糖基化区域、跨膜结构域和胞质区域。该受体由组成七个半胱氨酸丰富配体结合结构域重复序列、三个EGF前体样重复序、由Tyr-Trp-Thr-Asp组成的六叶β-螺旋桨结构、重度糖基化区域、跨膜结构域和含有信号转导用NPXY基序的胞质小结构域。
LDLR在调节血液中胆固醇的量中发挥至关重要的作用。LDLR在肝脏中特别丰富，肝脏是负责从身体移除大部分过量胆固醇的器官。肝脏细胞表面上LDLR的数目决定从血流多快地移除胆固醇(低密度脂蛋白形式)。LDLR蛋白中的变体，如突变体，可以造成常染色体显性疾病，家族性高胆固醇血症(FH)，也称作遗传性形式的高胆固醇。
如来自Daniels等人的图15中所示，LDLR转运血流中的循环型LDL至细胞中，在细胞中LDL分解以释放待使用、储存和/或从身体移除的胆固醇(参见例如，Daniels等人,IntJ Biol Sci 2009；5(5):474-488中的图4，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。受体随后再循环至细胞表面。缺陷性LDLR导致FH并且可以增加动脉粥样硬化和心脏病的风险。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种包含至少一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)的LDLR蛋白。该LDLR蛋白可以包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个突变。突变可以位于LDLR蛋白的1、2、3、4、5个或多于5个不同结构域内。在一个方面，一个突变或多个突变可以位于LDLR蛋白的相同结构域内。在另一个方面，突变可以位于LDLR的2不同结构域内。其中可以存在突变的LDLR蛋白结构域的非限制性例子包括EGF-A结构域、胞内结构域和PCSK9相互作用结构域。
在一个实施方案中，当LDLR蛋白包含多于一个突变时，突变可以位于LDLR蛋白的相同结构域内或可以位于LDLR蛋白的不同结构域内。作为一个非限制性例子，突变可以位于LDLR蛋白的胞内结构域内。作为另一个非限制性例子，位于LDLR蛋白的EGF-A结构域内。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸包含至少一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)。
LDLR突变体–EGF-A结构域
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种LDLR蛋白，所述LDLR蛋白包含在LDLR蛋白的EGF-A结构域中的至少一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白的胞内结构域可以包含与序列GTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCE(SEQ ID NO:719)同源至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白的胞内结构域可以包含序列GTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCE(SEQ ID NO:719)。在一个方面，突变可以是将具有带电荷侧链的酸性氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)替换为具有带电荷侧链的另一种酸性氨基酸。作为一个非限制性例子，可以将天冬氨酸(Asp，D)替换为谷氨酸(Glu，E)。在另一个方面，突变可以是将具有疏水性侧链的脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸)替换为具有带电荷侧链的酸性氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)。作为一个非限制性例子，可以将亮氨酸(Leu，L)替换为天冬氨酸(Asp，D)。在另一个方面，突变可以是将具有极性中性侧链的氨基酸(例如，天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸或苏氨酸)替换为具有疏水性侧链的脂族氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸)。作为一个非限制性例子，可以将天冬酰胺(Asn，N)替换为丙氨酸(Ala，A)。在另一个方面，突变可以是将具有带电荷侧链的酸性氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)替换为具有疏水性侧链的脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸)。作为一个非限制性例子，可以将谷氨酸(Glu，E)替换为丙氨酸(Ala，A)。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种人类LDLR蛋白，其中该蛋白质是SEQ ID NO:43并且EGF-A结构域定义为是SEQ ID NO:43的氨基酸314-氨基酸353。LDLR蛋白可以包括至少一个在EGF-A结构域中的突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)，如，但不限于位置331处的天冬氨酸替换为谷氨酸(称作D331E)、位置339处的亮氨酸替换为天冬氨酸(称作L339D)、位置316处的天冬酰胺替换为丙氨酸(称作N316A)、位置317处的谷氨酸替换为丙氨酸(称作E317A)或其组合。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白包括至少一个在EGF-A结构域中的突变，其是D331E。作为另一个非限制性例子，LDLR蛋白包括至少一个在EGF-A结构域中的突变，其是L339D。作为又一个非限制性例子，LDLR蛋白包括至少一个在EGF-A结构域中的突变，其是N316A。作为又一个非限制性例子，LDLR蛋白包括至少一个在EGF-A结构域中的突变，其是E317A。作为另一个非限制性例子，LDLR蛋白包括至少一个在EGF-A结构域中的突变，其是D331E和L339D。作为另一个非限制性例子，LDLR蛋白包括至少一个在EGF-A结构域中的突变，其是D331E和N316A。作为另一个非限制性例子，LDLR蛋白包括至少一个在EGF-A结构域中的突变，其是D331E和E317A。作为另一个非限制性例子，LDLR蛋白包括至少一个在EGF-A结构域中的突变，其是L339D和N316A。作为另一个非限制性例子，LDLR蛋白包括至少一个在EGF-A结构域中的突变，其是L339D和E317A。作为另一个非限制性例子，LDLR蛋白包括至少一个在EGF-A结构域中的突变，其是N316A和E317A。
LDLR突变体–胞内结构域
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种LDLR蛋白，所述LDLR蛋白包含在LDLR蛋白的胞内结构域中的至少一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白的胞内结构域可以包含与序列KNWRLKNINSINFDNPVYQKTTEDEVHICHNQDGYSYPSRQMVSLEDDVA(SEQ ID NO:720)同源至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白的胞内结构域可以包含序列KNWRLKNINSINFDNPVYQKTTEDEVHICHNQDGYSYPSRQMVSLEDDVA(SEQ ID NO:720)。在一个方面，突变可以是将具有带电荷侧链的碱性氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸、赖氨酸)替换为具有带电荷侧链的另一种碱性氨基酸。作为一个非限制性例子，可以将赖氨酸(Lys，K)替换为精氨酸(Arg，R)。在另一个方面，突变可以是将具有极性中性侧链的氨基酸(例如，天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸或苏氨酸)替换为具有疏水性侧链的脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸)。作为一个非限制性例子，可以将半胱氨酸(Cys，C)替换为丙氨酸(Ala，A)。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种LDLR蛋白，其中该蛋白质是SEQ ID NO:43并且胞内结构域定义为是SEQ ID NO:43的氨基酸811-氨基酸860。LDLR蛋白可以包括至少一个在胞内结构域中的突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)，如，但不限于位置811处的赖氨酸替换为精氨酸(称作K811R)、位置816处的赖氨酸替换为精氨酸(称作K816R)、位置830处的赖氨酸替换为精氨酸(称作K830R)以及位置839处的半胱氨酸替换为丙氨酸(称作C839A)。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种LDLR蛋白，所述LDLR蛋白包含在人类LDLR蛋白质序列的胞内结构域中的两个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白包含在胞内结构域中的突变K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，LDLR蛋白具有在胞内结构域中包含突变K830R和C839A的SEQ ID NO:54中所示的蛋白质序列。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种LDLR蛋白，所述LDLR蛋白包含在LDLR蛋白的胞内结构域中的三个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白包含在胞内结构域中的突变K816R、K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，LDLR蛋白具有在胞内结构域中包含突变K816R、K830R和C839A的SEQ ID NO:55中所示的蛋白质序列。
LDLR突变体–EGF-A结构域和胞内结构域
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种LDLR蛋白，所述LDLR蛋白包含在LDLR蛋白的EGF-A结构域中的至少一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)和在LDLR蛋白的胞内结构域中的至少一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种LDLR蛋白，所述LDLR蛋白包含在EGF-A结构域中的一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)和在胞内结构域中的两个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白包含在EGF-A结构域中的突变N316A以及在胞内结构域中的突变K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，LDLR蛋白具有包含在EGF-A结构域中突变N316A和胞内结构域中突变K830R和C839A的SEQID NO:50中所示的蛋白质序列。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白包含在EGF-A结构域中的突变L339D以及在胞内结构域中的突变K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，LDLR蛋白具有包含在EGF-A结构域中突变L339D和胞内结构域中突变K830R和C839A的SEQ ID NO:52中所示的蛋白质序列。
在另一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种LDLR蛋白，所述LDLR蛋白包含在EGF-A结构域中的一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)和在胞内结构域中的三个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白包含在EGF-A结构域中的突变N316A以及在胞内结构域中的突变K816R、K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，LDLR蛋白具有包含在EGF-A结构域中突变N316A和胞内结构域中突变K816R、K830R和C839A的SEQ ID NO:51中所示的蛋白质序列。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白包含在EGF-A结构域中的突变L339D以及在胞内结构域中的突变K816R、K830R和C839A。作为另一个非限制性例子，LDLR蛋白具有包含在EGF-A结构域中突变L339D和胞内结构域中突变K816R、K830R和C839A的SEQ ID NO:53中所示的蛋白质序列。
LDLR突变体–EGF-A结构域和PCSK9结合作用
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种LDLR蛋白，所述LDLR蛋白包含在LDLR蛋白的EGF-A结构域中的至少一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)，所述突变造成LDLR蛋白在前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)结合作用方面存在缺陷。PCSK-9的结合位点已经先前定位至LDLR的EGF-A(或EGF样重复序列)结构域(参见例如，Kwon等人,Molecular Basis for LDL receptor recognition by PCSK9.PNAS.2008105(6),1820-1825；所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。因此，PCSK9结合作用缺陷型LDLR将携带胆固醇进入肝细胞中。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种在PCSK9结合作用方面缺陷的LDLR蛋白。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白可以包含至少一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)，以成为如本文所述的PCSK9结合作用缺陷。
LDLR突变体–胞内结构域和IDOL
在另一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种LDLR蛋白，所述LDLR蛋白包含在胞内结构域中的至少一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)，所述突变防止IDOL(LDLR的诱导性降解蛋白，也称作肌球蛋白调节性轻链相互作用蛋白(MYLIP))降解LDLR蛋白的胞内结构域(参见例如，Zelcer等人,Science 2009 325(5936):100-104；Sorrentino和Zelcer 2012 23(3):213-219；和Zhang等人,J Lipid Research 2013 54:1410-1420描述的胞内结构域突变；所述文献每一篇的内容通过引用的方式完整地并入本文)。尽管不希望受理论约束，IDOL含有条带4.1和介导与跨膜蛋白的胞质结构域相互作用的Ezrin/Radizin/Moeisin同源性(FERM)结构域。IDOL还含有C末端RING结构域并且已经提出其充当E3-泛素连接酶。
根据Zelcer，LDLR胞内结构域含有可能是泛素化潜在位点的三个高度保守的赖氨酸和一个半胱氨酸，但是这些残基任一者的单突变或全部三个赖氨酸的突变并不防止LDLR遭IDOL降解。Zelcer描述到，胞内结构域的完整K20或完整C29对IDOL介导的降解是重要的。Zhang声称，根据赖氨酸残基在泛素化上的使用，可能发生各种连接特异性泛素化，而K48和K68连接特异性泛素化是多泛素化的最优势形式。
LDLR突变体–DAB2结合缺陷
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸可以在与失效同源物2有丝分裂原反应磷蛋白(DAB2)结合方面存在缺陷。尽管不希望受理论约束，DAB2结合缺陷型LDLR可以限制LDLR经DAB2途径内化并且因此减少LDLR摄取。
LDLR突变体–NPXY基序
在一个实施方案中，可以修饰LDLR的NPXY基序以改变用于通过LDLR的被膜小窝快速内吞的信号。NPXY基序可以包含至少一个突变、至少两个突变、至少三个突变、至少四个突变或超过四个突变。作为一个非限制性例子，NPXY基序可以包含LDLR序列的氨基酸822至氨基酸829。作为另一个非限制性例子，NPXY基序可以包含序列NFDNPVYQ(SEQ ID NO:721)。
在一个实施方案中，LDLR序列不包含NPXY基序中的突变。在另一个实施方案中，LDLR序列可以包含突变，但是该突变可以不在LDLR的位置822、826、827或828处，其中LDLR的氨基酸822至氨基酸829在SEQ ID NO:721中显示。
LDLR突变体–NPXY基序和SNX17结合
在另一个实施方案中，可以修饰LDLR的NPXY基序，以减少分选微管连接蛋白17(SNX17)与LDLR的NPXY基序的结合。SNX17与LDLR的NPXY基序的结合的减少可以用来调节受体的内体再循环。
在一个实施方案中，SNX17的PX结构域(PI3P结合)可以包含至少一个突变。所述至少一个突变可以改变SNX17与LDLR的NPXY基序结合的能力并且因此调节受体的内体再循环。
在一个实施方案中，SNX17的FERM样结构域可以包含至少一个突变。所述至少一个突变可以改变SNX17与LDLR的NPXY基序结合的能力并且因此调节受体的内体再循环。
在一个实施方案中，SNX17的Ras缔合结构域可以包含至少一个突变。所述至少一个突变可以改变SNX17与LDLR的NPXY基序结合的能力并且因此调节受体的内体再循环。
LDLR突变体和磷酸化
在一个实施方案中，本文所述的LDLR序列可以包含至少一个已经磷酸化的氨基酸。作为一个非限制性例子，序列NQDGYSYPSR(SEQ ID NO:722)中的至少一个氨基酸可以磷酸化。作为一个非限制性例子，LDLR的SEQ ID NO:722中的两个酪氨酸(Y)可以磷酸化。作为另一个非限制性例子，本文所述的LDLR序列中的至少一个酪氨酸(Y)可以磷酸化。作为又一个非限制性例子，在本文所述的LDLR的位置845处的酪氨酸和在其位置847处的酪氨酸被磷酸化。
在一个实施方案中，本文所述的LDLR序列可以包含至少一个已经磷酸化的氨基酸，但是位置828处的酪氨酸未磷酸化。
在一个实施方案中，本文所述的LDLR序列可以包含至少一个已经磷酸化的氨基酸，其中至少一个氨基酸是位置828处的酪氨酸。
LDLR突变体–C末端变体
在一个实施方案中，本文所述的LDLR序列可以在C末端序列LEDDVA(SEQ ID NO:7)中包含至少一个氨基酸突变。作为一个非限制性例子，SEQ ID NO:723可以是LDLR序列的氨基酸855至氨基酸860。
LDLR突变体–N-联糖基化位点
在一个实施方案中，LDLR序列可以在LDLR序列的N-联糖基化位点处包含至少一个突变。作为一个非限制性例子，至少一个突变可以位于氨基酸97、156、272、515和/或657处。
在另一个实施方案中，LDLR序列可以在LDLR序列的O-联糖基化位点处包含至少一个突变。作为一个非限制性例子，至少一个突变可以位于氨基酸721-768处。
在一个实施方案中，LDLR序列可以在N-联糖基化位点处包含至少一个突变，并且至少一个突变位于O-联糖基化位点处。
LDLR突变体–LDLRAP1
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸可以在与低密度脂蛋白受体衔接子蛋白1(LDLRAP1)结合方面存在缺陷。尽管不希望受理论约束，LDLRAP1结合缺陷型LDLR可以限制LDLR的结合和内化并且因此减少LDLR摄取。
LDLR突变体–融合物
在一个实施方案中，本文所述的LDLR序列和构建体的胞外结构域(ecto-domain)可以与胞质结构域融合。作为一个非限制性例子，LDLR胞外结构域可以与叶酸受体TM-胞质结构域融合。作为另一个非限制性例子，LDLR胞外结构域可以与GPI-连接的受体TM-胞质结构域融合。
LDLR突变体–表面信号传导增强性突变
在一个实施方案中，LDLR蛋白包含至少一个突变(例如，增强LDLR细胞表面表达的突变、增加LDLR在细胞表面的停留时间的突变或导致LDLR在细胞表面的水平增加的突变)，以增强LDLR的表面表达。作为一个非限制性例子，至少一个突变位于EGF-A结构域、胞内结构域、本文所述的LDLR结构域或区域或其组合内。作为一个非限制性例子，至少一个突变位于EGF-A结构域和胞内结构域内，以增强LDLR的表面表达。
靶向致病生物或病变细胞
本文中提供了使用编码细胞抑制多肽或细胞毒多肽的多核苷酸靶向致病生物如细菌、酵母、原虫、蠕虫等或病变细胞如癌细胞的方法。优选地，引入的mRNA含有修饰的核苷或其他核酸序列修饰，其在目标致病生物中排他或偏好地翻译以减少治疗药可能的脱靶效应。这类方法可用于移除任何生物材料(包括血液，精液，卵子和移植物，包括胚胎、组织和器官)中存在的致病生物或杀死其中存在的病变细胞。
生物加工过程
多核苷酸和产生多核苷酸的方法可以用于增强细胞培养过程中的蛋白质产物产量。生物加工方法及其用途在国际专利公开号WO2013151666中(如在第[000934]–[000945]段中)描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
细胞
在一个实施方案中、细胞选自哺乳动物细胞、细菌细胞、植物细胞、微生物细胞、藻细胞和真菌细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，如，但不限于人、小鼠、大鼠、山羊、马、兔、仓鼠或牛细胞。在又一个实施方案中，细胞可以来自建立的细胞系，包括但不限于HeLa、NS0、SP2/0、KEK 293T、Vero、Caco、Caco-2、MDCK、COS-1、COS-7、K562、Jurkat、CHO-K1、DG44、CHOK1SV、CHO-S、Huvec、CV-1、Huh-7、NIH3T3、HEK293、293、A549、HepG2、IMR-90、MCF-7、U-20S、Per.C6、SF9、SF21或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在某些实施方案中，细胞是真菌细胞、如，但不限于金孢属(Chrysosporium)细胞、曲霉属(Aspergillus)细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、网柄菌属(Dictyostelium)细胞、假丝酵母属(Candida)细胞、酵母属(Saccharomyces)细胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)细胞和青霉属(Penicillium)细胞。
在某些实施方案中，细胞是细菌细胞，如，但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或BL21细胞。通过本发明方法待转染的原代和继代细胞可以从多种组织获得并且包括但不限于，可以在培养物中维持的全部细胞类型。例如，可以通过本发明方法转染的原代和继代细胞包括但不限于，成纤维细胞、角质形成细胞、上皮细胞(例如，乳腺上皮细胞、肠上皮细胞)、内皮细胞、神经胶质细胞、神经细胞、形成的血液成分(例如，淋巴细胞、骨髓细胞)、肌肉细胞和这些体细胞类型的前体。原代细胞也可以从相同物种的供体获得或从另一个物种(例如，小鼠、大鼠、兔、猫、犬、猪、牛、鸟、羊、山羊、马)获得。
纯化和分离
本领域普通技术人员应当能够决定待用于从培养的细胞纯化或分离目的蛋白的方法。通常，这通过使用亲和结合或非亲和纯化的捕获方法实现。如果目的蛋白不由培养的细胞分泌，则应当在纯化或分离之前裂解培养的细胞。在本发明中，可以使用含有目的蛋白连同细胞培养基组分以及细胞培养添加物如消泡化合物和其他养分和补充物、细胞、细胞残片、宿主细胞蛋白、DNA、病毒等的未澄清细胞培养液。该过程可以在生物反应器本身中实施。流体可以预条件化至所需的刺激如pH、温度或其他刺激特征，或者流体可以在添加聚合物时条件化，或者聚合物可以添加至恰当条件化至刺激条件所要求参数的载体液体，其中所述刺激条件是所述聚合物溶解在流体中所要求的。可以允许聚合物随流体彻底循环并且随后可以应用刺激(pH、温度、盐浓度的变化等)，并且所需的蛋白质和聚合物可以从溶液离开。聚合物和所需的蛋白质可以与剩余的流体分离并且任选地洗涤一次或多次以移走任何夹带的或松散结合的污染物。所需的蛋白质随后可以通过例如洗脱等从聚合物回收。优选地，洗脱可以在一组条件下进行，从而在所需的蛋白质的选择性洗脱期间，聚合物保留其沉淀形式并且将任何杂质滞留于它上。聚合物和蛋白质以及任何杂质可以溶解在新流体如水或缓冲溶液中，并且可以通过一种手段回收蛋白质，如亲和力、离子交换、疏水性或相对于聚合物或杂质对蛋白质具有偏好和选择性的某个其他类型的层析。洗脱的蛋白质随后可以回收并且可以接受额外的加工步骤，恰当时为分批样步骤或连续通流步骤。
在另一个实施方案中，它可能用于优化特定多肽在有潜在意义的细胞系或细胞系集合中的表达，尤其目的多肽如具有已知活性的参考蛋白的蛋白质变体。在一个实施方案中，提供一种通过以下方式优化目的多肽在靶细胞中表达的方法：提供多个靶细胞类型并且使多个靶细胞类型的每一者独立地与编码多肽的修饰mRNA接触。另外，可以改变培养条件以增加蛋白质产生效率。随后，检测和/或定量多个靶细胞类型中目的多肽的存在和/或水平，从而允许通过选择有效靶细胞和与之相关的细胞培养条件，优化目的多肽的表达。当目的多肽含有一个或多个翻译后修饰或具有经常使高效蛋白质产生复杂化的实质性三级结构时，可以使用这类方法。
蛋白质回收
目的蛋白可以是优选地作为分泌型多肽从培养基回收，或如果在无分泌信号的情况下表达，它可以从宿主细胞裂解物回收。可能需要以得到基本上均一的目的蛋白制备物的方式，将目的蛋白从其他重组蛋白和宿主细胞蛋白中纯化。细胞和/或颗粒状细胞残片可以从培养基或裂解物移除。目的产物随后可以通过例如在免疫亲和柱或离子交换柱上分离、乙醇沉淀、反相HPLC(RP-HPLC)、色谱、硅胶上或阳离子交换树脂如DEAE上色谱，从污染性可溶性蛋白、多肽和核酸纯化。纯化宿主细胞表达的异源蛋白的方法是本领域熟知的。
本文所述的方法和组合物可以用来产生能够在哺乳动物受试者中减弱或阻断内源激动剂生物学反应和/或拮抗受体或信号传导分子的蛋白质。例如，IL-12和IL-23受体信号传导可能在慢性自身免疫疾病如多发性硬化和炎性疾病如类风湿性关节炎、银屑病、红斑狼疮、强直性脊柱炎和Chron’s病中增强(Kikly K,Liu L,Na S,Sedgwich JD(2006)Cur.Opin.Immunol.18(6):670-5)。在另一个实施方案中，核酸编码趋化因子受体的拮抗剂。趋化因子受体CXCR-4和CCR-5是HIV进入宿主细胞所需要的(Arenzana-Seisdedos F等人,(1996)Nature.Oct 3；383(6599):400)。
基因沉默
本文所述的多核苷酸可用于沉默(即，阻止或实质上减少)细胞群体中一个或多个靶基因的表达。将编码能够指导序列特异性组蛋白H3甲基化的目的多肽的多核苷酸在各种条件下引入到细胞群体中，从而使多肽被翻译并通过组蛋白H3甲基化和后续的异染色质形成而减少靶基因的基因转录。在一些实施方案中，对哺乳动物受试者中存在的细胞群体实施沉默机理。通过非限制性举例方式，有用靶基因是突变的Janus激酶-2家族成员，其中表达突变靶基因的哺乳动物受试者患有因异常激酶活性所致的骨髓增生病。
本文还提供了多核苷酸和RNAi剂的共施用。
调节生物途径
引入细胞中的快速翻译多核苷酸提供了合乎需要的调节靶生物途径机制。这种调节作用包括对给定途径的拮抗或激动作用。在一个实施方案中，提供通过以下方式拮抗细胞中生物途径的方法：使细胞与有效量的包含编码目的多肽的多核苷酸的组合物在多种条件下接触，从而多核苷酸定位至细胞中并且多肽能够在细胞中从多核苷酸翻译，其中多肽抑制了在生物途径中有功能的多肽的活性。示例性生物途径是在自身免疫性疾病或炎性疾病如多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、红斑狼疮、强直性脊柱炎结肠炎或Crohn病中缺陷的那些途径；尤其，拮抗IL-12和IL-23信号传导途径具有特别的实用性。(参见Kikly K,Liu L,Na S,Sedgwick JD(2006)Curr.Opin.Immunol.18(6):670–5)。
另外，提供编码趋化因子受体的拮抗物的多核苷酸；趋化因子受体CXCR-4和CCR-5是例如HIV进入宿主细胞所需要的(Arenzana-Seisdedos F等人,(1996)Nature.Oct 3；383(6599):400).00)。
可选地，提供通过以下方式激动细胞中生物途径的方法：使细胞与有效量的编码重组多肽的多核苷酸在多种条件下接触，从而使核酸被定位至细胞中并且重组多肽能够在细胞中从该核酸翻译，并且重组多肽诱导在生物途径中有功能的多肽的活性。示例性的被激动生物途径包括调节细胞命运决定的途径。这种激动作用是可逆的或可选地，是不可逆的。
配体或受体在细胞表面上的表达
在本文所述多个方面的一些方面和实施方案中，本文所述的多核苷酸可以用来在细胞的表面上表达配体或配体受体(例如，归巢部分)。连接细胞表面的配体或配体受体部分可以允许细胞在体内与组织或药剂具有所需的生物学相互作用。配体可以是抗体、抗体片段、适配体、肽、维生素、糖、蛋白质或多肽、受体，例如细胞表面受体、黏附分子、糖蛋白、糖残基、治疗剂、药物、糖胺聚糖或其任意组合。例如，配体可以是识别癌细胞特异性抗原的抗体，从而使得细胞能够偏好性地与肿瘤细胞相互作用，以实现修饰细胞的肿瘤特异性定位。配体可以赋予细胞组合物在待治疗的组织中蓄积的能力，因为优选的配体可以能够与待治疗组织的外侧面上的靶分子相互作用。通常优选与其他组织具有有限交叉反应性的配体。
在一些情况下，配体可以充当允许细胞靶向特定组织或与特定配体相互作用的归巢部分。这类归巢部分可以包括，但不限于特异性结合配对物、抗体、单克隆抗体或其衍生物或类似物的任何成员，包括而不限于：Fv片段、单链Fv(scFv)片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、单结构域抗体、骆驼化抗体和抗体片段、人源化抗体和抗体片段和前述的多价形式；多价结合试剂，包括而不限于单特异性或双特异性抗体，如二硫键稳定的Fv片段、scFv串联((scFv)2片段)、双体抗体、三体或四体抗体，其一般是共价连接或其他方式稳定的(即，亮氨酸拉链或螺旋稳定化)scFv片段；和其他归巢部分，包括例如适配体、受体和融合蛋白。
在一些实施方案中，归巢部分可以是表面结合的抗体，其可以允许调节细胞靶向特异性。这特别有用，因为其可以针对目的表位产生高度特异性抗体用于所需的靶向位点。在一个实施方案中，在细胞的表面上表达多种抗体，并且每种抗体可以针对所需的靶具有不同特异性。这类方案可以增加归巢相互作用的亲合力(avidity)和特异性。
技术人员可以基于所需的细胞定位或功能选择任何归巢部分，例如雌激素受体配体，如他莫昔芬，可以将细胞靶向在细胞表面上具有增加数目的雌激素受体的雌激素依赖性乳腺癌细胞。配体/受体相互作用的其他非限制性例子包括CCRI(例如，用于治疗类风湿性关节炎和/或多发性硬化中发炎的关节组织或脑)、CCR7、CCR8(例如，靶向至淋巴结组织)、CCR6、CCR9，CCR10(例如，以靶向至肠组织)、CCR4、CCR10(例如，用于靶向至皮肤)、CXCR4(例如，用于广泛增强的变移)、HCELL(例如，用于治疗炎症和炎性疾病、骨髓)、α4β7(例如，用于靶向肠粘膜)、VLA-4/VCAM-1(例如，靶向至内皮)。通常而言，参与靶向作用(例如，癌转移)的任何受体可以用于本文所述的方法和组合物中。
细胞谱系调节作用
本文提供了引起目标哺乳动物细胞中细胞命运改变的方法。目标哺乳动物细胞可以是前体细胞并且这种改变可以包括驱动分化成某个谱系，或阻断这种分化。可选地，目标哺乳动物细胞可以是分化的细胞，并且细胞命运改变包括驱动去分化成多潜能前体细胞，或阻断这种去分化，如癌细胞去分化成癌干细胞。在需要细胞命运改变的情况下，将有效量的编码细胞命运诱导多肽的mRNA在多种条件下引入靶细胞，从而诱导细胞命运改变。在一些实施方案中，修饰的mRNA可用于使细胞亚群从第一表型再编程为第二表型。这种再编程可以是临时或永久的。任选地，再编程过程诱导靶细胞采取中间表型。
另外，由于转染效率高、再转染细胞的能力和靶细胞中产生的重组多肽的量可保持性，本发明的方法特别可用于产生诱导的多潜能干细胞(iPS细胞)。进一步，使用本文所述方法生成的iPS细胞的用途预期引起减少的畸胎瘤形成发生率。
本文还提供了减少靶细胞群体中细胞分化的方法。例如，将含有一个或多个前体细胞类型的靶细胞群体与具有有效量的编码多肽的多核苷酸的组合物在多种条件下接触，从而使多肽被翻译并减少前体细胞分化。在非限制性实施方案中，靶细胞群体含于哺乳动物受试者的受损组织中或受外科手术受影响的组织中。前体细胞是例如间质前体细胞、神经前体细胞或间充质前体细胞。
在一个具体实施方案中，提供了编码一种或多种分化因子Gata4、Mef2c和Tbx4的多核苷酸。这些mRNA生成的因子被引入成纤维细胞中并且驱动再编程为心肌细胞。可以通过使含有mRNA的贴剂或其他材料与受损的心脏组织接触以促进心脏再生，在体内执行这种再编程过程。这个过程促进心肌细胞生成，这与纤维化相反。
介导细胞死亡
在一个实施方案中，多核苷酸组合物可以通过增加死亡受体、死亡受体配体或其组合的表达，用来在细胞中(例如，癌细胞)诱导凋亡。组合物及其使用方法在国际专利公开号WO2013151666中(如在第[000966]–[000969]段中)描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
VI.试剂盒和装置
试剂盒
本发明提供了用于便利和/或有效实施本发明方法的多种试剂盒。一般，试剂盒将包含足够数量和/或数目的组分以允许使用者对受试者进行多次治疗)和/或以进行多次实验。
在一个方面，本发明提供了包含本发明分子(多核苷酸)的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含一种或多种有功能的抗体或其功能片段。
所述试剂盒可以用于蛋白质产生，包含含有可翻译区域的第一多核苷酸。试剂盒还可以包含包装和说明书和/或形成制剂组合物的递送剂。递送剂可以包括盐水、缓冲溶液、脂质或本文公开的任何递送剂。
在一个实施方案中，缓冲溶液可以包括氯化钠、氯化钙、磷酸盐和/或EDTA。在另一个实施方案中，缓冲溶液可以包括，但不限于盐水、含2mM钙的盐水、5％蔗糖、含2mM钙的5％蔗糖、5％甘露醇、含2mM钙的5％甘露醇、Ringer乳酸盐、氯化钠、含2mM钙的氯化钠和甘露糖(参见例如，美国公开号20120258046；所述文献通过引用方式完整并入本文)。在又一个实施方案中，可以将缓冲溶液沉淀或可以将它冻干。每种组分的量可以变动以实现一致、可重复的较高浓度盐水或简单缓冲制剂。也可以变动组分以增加修饰的RNA在缓冲溶液中随时间推移和/或在多种条件下的稳定性。在一个方面，本发明提供了用于产生蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包含含有可翻译区域的多核苷酸，其所提供的数量在引入靶细胞时可有效产生所需量的由可翻译区域编码的蛋白质；含有抑制性核酸的第二多核苷酸，所提供的数量可有效地大幅度抑制细胞的先天免疫反应；和包装及说明书。
在一个方面，本发明提供了用于产生蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包含含有可翻译区域的多核苷酸，其中多核苷酸显示出遭细核酸酶降解减少；和包装及说明书。
在一个方面，本发明提供了用于产生蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包含：含有可翻译区域的多核苷酸，其中多核苷酸显示出遭细核酸酶降解减少；和适合翻译第一核酸的可翻译区的哺乳动物细胞。
装置
本发明提供了可以并入编码目的多肽的多核苷酸的装置。这些装置在稳定制剂中含有试剂以合成可用于立即递送至有需求的受试者(如人类患者)制剂中的多核苷酸。
用于施用的装置可以用来根据本文中教授的单次、多次或分割给药方案，递送本发明的多核苷酸。这类装置在例如2013年3月9日提交的国际申请PCT/US2013/30062(代理人案号M300)中教授，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
本领域已知向细胞、器官和组织多次施用的方法和装置被用于与本文中作为本发明实施方案公开的方法和组合物联合使用。这些包括，例如具有多针头的那些方法和装置，例如使用管腔或导管的混合装置，以及利用热、电流或辐射驱动机制的装置。
根据本发明，这些多次施用装置可以用来递送本文中的单次剂量、多次剂量或分割剂量。这类装置在例如2013年3月9日提交的国际申请PCT/US2013/30062(代理人案号M300)中教授，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，将多核苷酸借助至少3个针头皮下或肌内同时或在60分钟时间内施用至三个不同的、任选毗邻的部位(例如，同时或在60分钟时间内施用至4，5、6、7、8、9或10个部位)。
利用导管和/或管腔的方法和装置
使用导管和管腔的方法和装置可以用来按单次、多次或分割给药方案施用本发明的多核苷酸。这类方法和装置在2013年3月9日提交的国际申请PCT/US2013/30062(代理人案号M300)中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
利用电流的方法和装置
利用电流的方法和装置可以用来根据本文中教授的单次、多次或分割给药方案，递送本发明的多核苷酸。这类方法和装置在2013年3月9日提交的国际申请PCT/US2013/30062(代理人案号M300)中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
VII.定义
在本说明书中的各个位置，本公开化合物的取代基以群组或范围公开。本公开特别意在包括这类群组和范围的各成员的每个和每种单独子组合。
约：如本文所用，术语“约”意指所述值的+/-10％。
组合施用：如本文所用，术语“组合施用”或“联合施用”意指将两种或更多种药物(药剂、试剂)在相同时间或在如此间隔时间内施用至受试者，从而每种药物在该患者上的作用可能存在重叠。在一些实施方案中，将它们在彼此的约60、30、15、10、5或1分钟范围内施用。在一些实施方案中，药物的施用足够紧密地如此间隔，从而实现联合(例如，协同)效应。
佐剂：如本文所用，术语“佐剂”意指增强受试者对抗原的免疫反应的物质。
动物：如本文所用，术语“动物”指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中，非人类动物是哺乳动物(例如，啮齿类、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、羊、牛、灵长类或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行类、两栖类、鱼类和蠕虫类。在一些实施方案中，动物是转基因动物、基因修饰动物或克隆。
抗原：如本文所用，术语“抗原”指与相应的抗体特异性结合的物质。抗原可以源自身体，如本文所用的癌抗原，或源自外部环境，例如，源自传染因子。
目的抗原或所需的抗原(期望的抗原)：如本文所用，术语“目的抗原”或“所需的抗原(期望的抗原)”包括本文中提供的由本文所述的抗体和其片段、突变体、变体和变异体免疫特异性结合的那些蛋白质和其他生物分子。目的抗原的例子包括但不限于胰岛素、胰岛素样生长因子、hGH、tPA、细胞因子，如白介素(IL)，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、干扰素(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNω或IFNτ、肿瘤坏死因子(TNF)，如TNFα和TNFβ、TNFγ、TRAIL；G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1和VEGF。
大约：如本文所用，术语“大约”或“约”如适用于一个或多个目的值时，指与所述参比值(参考值)相似的值。在某些实施方案中，除非另外声明或否则从上下文显而易见(例外是其中这类数目将超过100％的可能值)，术语“大约”或“约”指以任一方向(大于或更小)落于所述参比值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的范围内的数值范围。
与……缔合：如本文所用，术语“与……缔合”、“缀合”、“连接”、“接合”和“系留”，当相对于两个或更多个部分(moiety)使用时，意指所述部分在物理上彼此直接或通过一个或多个充当连接剂的额外部分缔合或连接，以形成这样的结构，所述结构足够地稳定，从而各部分在其中使用该结构的条件(例如，生理条件)下保持物理缔合。“缔合”不必要严格地通过直接共价化学键进行。它还可以表示足够稳定从而“所缔合的”实体保持物理缔合的离子键合作用或氢键合作用或基于杂交的连接。
双官能：如本文所用，术语“双官能的”指能够执行或维持至少两种功能的任何物质、分子或部分。所述功能可以实现相同结果或不同结果。产生功能的结构可以是相同或不同的。例如，本发明的修饰的双官能RNA可以编码细胞毒性肽(第一功能)，而包含编码RNA的那些核苷本身具有细胞毒性(第二功能)。在这个例子中，向癌细胞递送修饰的双官能RNA将不仅产生可以改善或治疗癌症的肽或蛋白质分子，且如果修饰的RNA降解而非发生翻译时，还将向细胞递送细胞毒性核苷酬载。
生物相容性：如本文所用，术语“生物相容”意指与活细胞、组织、器官或系统相容，带来微小的损伤、毒性或免疫系统排异风险或不带来所述风险。
生物可降解：如本文所用，术语“生物可降解的”意指能够通过活生命的作用分解成无害产物。
生物活性的：如本文所用，短语“生物活性的”指在生物系统和/或生物中具有活性的任何物质特征。例如，施用某物质至生物时，该物质对该生物具有生物学效果，则认为该物质是生物活性的。在具体的实施方案中，如果甚至本发明的多核苷酸的一部分有生物活性或模拟生物学上相关的活性，则本发明的多核苷酸可以视为有生物活性。
癌干细胞：如本文所用，“癌干细胞”是可以发生自我更新和/或异常增殖和分化以形成肿瘤的细胞。
嵌合体：如本文所用，“嵌合体”是具有两个或更多个不一致或不均一部分或区域的实体。
嵌合多核苷酸：如本文所用，“嵌合多核苷酸”是这些核酸聚合物，它们具有在大小和/或化学修饰样式、化学修饰位置、化学修饰百分数或化学修饰群体和前述组合方面不同的部分或区域。
化合物：如本文所用，术语“化合物”意在包括所述结构的全部立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。
本文所述的化合物可以是非对称的(例如，具有一个或多个立构中心)。除非另外说明，否则意指全部立体异构体，如对映异构体和非对映异构体。含有非对称取代的碳原子的本发明化合物可以按光学活性形式或外消旋形式分离。关于如何从自光学活性原料制备光学活性形式的方法是本领域已知的，如通过拆分外消旋混合物或通过立体选择性合成制备。烯烃、C＝N双键等的许多几何异构体也可以存在于本文所述的化合物中，并且本公开中包括全部这类稳定的异构体。本文描述了本公开的化合物的顺式几何异构体和反式几何异构体并且它们可以作为异构体混合物或作为分离的异构形式分离。
本公开的化合物还包括互变异构形式。互变异构形式来自于与毗邻双键交换单键和质子同步移行。互变异构形式包括质子转移互变异构体，所述质子转移互变异构体是具有相同实验验式和总电荷的异构质子化状态。质子转移互变异构体的例子包括酮–烯醇对、酰胺–亚胺酸对、内酰胺–内酰亚胺对、酰胺–亚胺酸对、烯胺–亚胺对和其中质子可能占据杂环体系的两个或更多个位置的环形式，如1H-和3H-咪唑、1H-、2H-和4H-1,2,4-三唑、1H-和2H-异吲哚以及1H-和2H-吡唑。互变异构形式可以处于平衡或通过适宜取代在空间上锁定成一种形式。
本公开的化合物还包括在中间体化合物或最终化合物中出现的原子的全部同位素。“同位素”指具有相同原子数，但是因原子核内中子数不同而产生的不同质量数的原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。
本公开的化合物和盐可以通过例行方法与溶剂或水分子组合的情况下制备以，形成溶剂化物和水合物。
定向(committed)：如本文所用，当提到细胞时，术语“定向”意指当细胞远未进入分化途径时，在此细胞在正常环境下将继续分化成特定细胞类型或细胞类型亚类，而不是分化成不同的细胞类型或逆转成分化程度较低的细胞类型。
保守：如本文所用，术语“保守”指多核苷酸序列或多肽序列各自的核苷酸或氨基酸残基，所述核苷酸或氨基酸残基是在正在比较的两个或更多个序列的相同位置中未改变的那些。相对保守的核苷酸或氨基酸是在更相关的序列中与所述序列中其他地方出现的核苷酸或氨基酸相比保守的那些。
在一些实施方案中，如果两个或更多个序列是100％彼此相同的，则称它们是“完全保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同或至少95％相同，则称它们是“高度保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此约70％相同、约80％相同、约90％相同、约95％、约98％、或约99％相同，则称它们是“高度保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此至少30％相同、至少40％相同、至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同或至少95％相同，则称它们是“保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此约30％相同、约40％相同、约50％相同、约60％相同、约70％相同、约80％相同、约90％相同、约95％相同、约98％相同或约99％相同，则称它们是“保守的”。序列的保守可以适用于多核苷酸或多肽的整个长度或可以适用于其部分、区域或特征。
控释：如本文所用，术语“控释”指符合特定释放模式以产生治疗结果的药物组合物或化合物释放谱。
环状或环化：如本文所用，术语“环状的”指存在连续环。环状分子不必是圆形的，只要连接以形成不断裂的亚单位链。环状分子如本发明的工程化RNA或mRNA可以是单个单位或多聚体或包含复杂的或高级的结构的一个或多个组分。
抑制细胞的：如本文所用，“抑制细胞的”指抑制、减少、压制细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合生长、分裂或倍增。
细胞毒性：如本文所用，“细胞毒的”指杀死细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合或对其造成有害、有毒或致死效果。
递送：如本文所用，“递送”指递送化合物、物质、实体、部分、载货或酬载的行为或方式。
递送剂：如本文所用，“递送剂”指促进(至少部分地)多核苷酸体内递送至所靶向细胞的任何物质。
去稳定：如本文所用，术语“可去稳定的”、“去稳定”或“去稳定区域”意指与相同区域或分子的起始、野生型或天然形式相比较不稳定的区域或分子。
可检测标记物：如本文所用，“可检测标记物”指与另一种实体连接、合并或缔合的一种或多种标记、信号或部分，其中通过本领域已知的方法轻易检测到所述另一种实体，所述方法包括放射线照相术、荧光、化学发光、酶活性、吸光度等。可检测标记物包括放射性同位素、荧光团、发色团、酶、染料、金属离子、配体如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素和半抗原、量子点等。可检测标记物可以位于本文公开的肽或蛋白质中的任何位置。它们可以位于氨基酸、肽或蛋白质内部，或位于N-末端或C-末端。
非对映异构体：如本文所用，术语“非对映异构体”意指彼此并非为镜像并且彼此不可叠合的立体异构体。
消化：如本文所用，术语“消化”意指分解成更小的小片或组分。当指多肽或蛋白质时，消化导致肽的产生。
分化的细胞：如本文所用，术语“分化的细胞”指在其天然形式下不是多潜能的任何体细胞。分化的细胞还涵盖部分分化的细胞。
分化(名词)：如本文所用，术语“分化因子”指可以诱导细胞分化成所需细胞类型的发育潜能改变因子，如蛋白质、RNA或小分子。
分化(动词)：如本文所用，“分化”指其中未定向或定向程度较小的细胞获得定向细胞特征的过程。
远端：如本文所用，术语“远端”意指远离中心或远离目的点或目的区域存在。
给药方案：如本文所用，“给药方案”是执行的方案或医师确定的治疗、预防或姑息护理的方案。
剂量分割系数(DSF)-剂量分割治疗的PUD除以每日总剂量或单个单位剂量的PUD的之比。该值来自给药方案组的比较。
对映异构体：如本文所用，术语“对映异构体”意指本发明化合物的每种独立光学活性形式，所述的光学活性形式具有至少80％(即，至少90％的一种对映异构体和最多10％的另一种对映异构体)、优选地至少90％和更优选地至少98％的光学纯度或对映异构过量(如通过本领域标准的方法所测定)。
包封：如本文所用，术语“包封”意指围绕、包围或包裹。
编码的蛋白质切割信号：如本文所用，“编码的蛋白质切割信号”指编码蛋白质切割信号的核苷酸序列。
工程化：如本文所用，当本发明的实施方案设计成具有与起始、野生型或天然分子不同的(结构性或化学性)特征或性质时，本发明的实施方案被“工程化”。
有效量：如本文所用，术语药剂的“有效量”是这样的量，所述量足以实现有益或所需的结果，例如，临床结果，并且“有效量”本身取决于应用它的语境。例如，在施用治疗高胆固醇的药剂的语境下，药剂的有效量例如是这样的量，与不施用所述药剂情况下获得的反应相比，所述量足以实现如本文定义的高胆固醇治疗。
外来体：如本文所用，“外来体”是由哺乳动物细胞分泌的小泡或RNA降解中涉及的复合物。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”指以下一个或多个事件：(1)从DNA序列(例如，通过转录)产生RNA模板；(2)加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5′帽形成和/或3’端加工)；(3)RNA翻译成多肽或蛋白质；和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
特征：如本文所用，“特征”指性质、特性或不同元素。
制剂：如本文所用，“制剂”至少包含多核苷酸和递送剂。
片段：如本文所用，“片段”指部分。例如，蛋白质的片段可以包括通过消化从培养细胞分离的全长蛋白质获得的多肽。
功能性(有功能的)：如本文所用，“有功能的(有功能的)”生物分子是处于这种形式的生物分子，其中所述生物分子显示作为其特征的特性和/或活性。
同源性：如本文所用，术语“同源性”指聚合物分子之间例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列是至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同或相似的，则认为它们彼此“同源”。术语“同源的”必然地指至少两个序列(多核苷酸序列或多肽序列)之间的比较。根据本发明，如果两个多核苷酸序列编码的多肽就至少约20个氨基酸的至少一个片段而言至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％相同，则认为这两个多核苷酸序列同源。在一些实施方案中，同源多核苷酸序列以编码至少4–5个唯一指定氨基酸的片段的能力为特征。对于小于60个核苷酸长度的多核苷酸序列，通过编码至少4–5个唯一指定氨基酸的片段的能力确定同源性。根据本发明，如果两种蛋白质就至少一个至少约20个氨基酸的片段而言至少约50％、60％、70％、80％或90％相同，则认为这两个蛋白质序列同源。
同一性：如本文所用，术语“同一性”指聚合物分子之间例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。例如，可以通过以下方式实施两个多核苷酸序列的同一性百分数计算：将两个序列为最佳比较目的比对(例如，可以为最佳比对结果而在第一和第二核酸序列之一或二者中引入空位并且可以为比较目的而抛弃不相同的序列)。在某些实施方案中，为比较目的所比对的序列的长度是至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的参考序列长度。随后比较相应核苷酸位置处的核苷酸。在第一序列中的位置由第二序列中在对应位置处的相同核苷酸占据时，则所述分子在该位置处是相同的。考虑到为最佳比对两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分数使所述序列共有的相同位置数的函数。可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。例如，两个核苷酸序列之间的同一性百分数可以使用多种方法如在以下文献中描述的那些方法来确定：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编著,OxfordUniversity Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编著,Academic Press,New York,1993；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著,Humana Press,New Jersey,1994；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编著,M Stockton Press,NewYork,1991；所述文献的每一篇通过引用的方式并入本文。例如，可以利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的Meyers和Miller算法(CABIOS,1989,4:11-17)，使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12、空位罚分4，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。可以可选地使用GCG软件包中的GAP程序，利用NWSgapdna.CMP矩阵，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。常用来确定序列之间同一性百分数的方法包括但不限于在Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM JApplied Math.,48:1073(1988)中公开的那些；所述文献通过引用方式并入本文。另外，确定同一性的技术编纂于公众可获得的计算机程序中。确定两个序列之间同源性的示例性计算机软件包括包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Res 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215,403(1990))。
传染剂：如本文所用，短语“传染剂”意指能够产生感染的试剂。
抑制基因表达：如本文所用，短语“抑制基因表达”意指造成基因表达产物量减少。表达产物可以是从基因转录的RNA(例如，mRNA)或从转录自基因的mRNA翻译的多肽。一般，mRNA水平降低导致从其中翻译的多肽的水平降低。可以使用测量mRNA或蛋白质的标准技术确定表达的水平。
传染剂：如本文所用，“传染剂”指可以因生物技术而工程化的任何微生物、病毒、传染性物质或生物产品，或任何这类微生物、病毒、传染性物质或生物产品的任何天然存在组分或生物工程化组分可以在人类、动物、植物或另一种活生物中造成新发疾病和传染病、死亡或其他生物学功能异常。
流感：如本文所用，“流感”或“flu”是鸟和哺乳动物的感染性疾病，由正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的RNA病毒-流感病毒引起。
异构体：如本文所用，术语“异构体”意指本发明任何化合物的任何互变异构体、立体异构体、对映异构体或非对映异构体。认识到本发明的化合物可以具有一个或多个手性中心和/或双键，并且因此作为立体异构体如双键异构体(即，几何E/Z异构体)或非对映异构体(例如，对映异构体(即，(+)或(-))或顺/反式异构体)存在。根据本发明，本文所述的化学结构和因此本发明的化合物涵盖了全部的相应立体异构体，即，立体异构上纯的形式(例如，几何上纯、对映上纯或非对映上纯)形式以及对映异构和立体异构的混合物，例如，消旋物。通过熟知方法，如手性-相气相色谱、手性-相高效液相色谱、使化合物结晶为手性盐复合物或使化合物在手性溶剂中结晶，本发明化合物的对映异构混合物和立体异构混合物一般可以分解成其组分对映异构体或立体异构体。对映异构体和立体异构体也可以通过熟知的非对称合成方法由立体异构或对映异构纯的中间体、试剂和催化剂获得。
体外：如本文所用，术语“体外”指在人工环境下例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在皮式培养皿中等发生，而不是在生物(例如，动物、植物或微生物)内部发生的事件。
体内：如本文所用，术语“体内”指在生物(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内部发生的事件。
分离的：如本文所用，术语“分离的”指已经与至少同它们结合的一些组分分离(是否在自然界中或在实验环境中)的物质或实体。分离的物质可以根据同它们结合的物质具有变动的纯度水平。分离的物质和/或实体可以与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多起初同它们结合的其他组分分离。在一些实施方案中，所分离的药物纯度大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％。如本文所用，如果某物质基本上不含其他组分，则它是“纯的”。
基本上分离的：“基本上分离的”意指化合物基本上与形成或检测到它的环境中分离。部分的分离可以例如包括富含本公开化合物的组合物。基本上分离可以包括含有以重量计至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％本公开化合物或其盐的组合物。用于分离化合物及其盐的方法是本领域常规的。
IVT多核苷酸：如本文所用，“IVT多核苷酸”是可以仅使用体外转录(IVT)酶促合成方法产生的线性多核苷酸。
LDLR相关的疾病：如本文所用，“LDLR相关的疾病”或“LDLR相关的病症”分别指因异常LDLR活性(例如，下降的活性或增加的活性)导致的疾病或病症。作为一个非限制性例子，高胆固醇血症是LDLR相关的疾病。
接头：如本文所用，接头指一组原子，例如，10-1,000个原子，并且可以由原子或基团如但不限于碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰、羰基和亚胺组成。接头可以在第一末端连接至核碱基或糖部分上的修饰的核苷或核苷酸，并且在第二末端连接至酬载，例如，可检测物质或治疗剂。接头可以具有足够长度，从而不干扰向核酸序列中并入。接头可以用于任何可用目的，如用来形成多核苷酸多聚体(例如，通过连接两个或更多个嵌合多核苷酸分子或IVT多核苷酸)或多核苷酸缀合物，以及用来施用酬载，如本文所述。可以并入接头中的化学基团的例子包括但不限于烷基、链烯基、炔基、酰氨基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、杂亚烷基、芳基或杂环基，每种基团可以是任选取代的，如本文所述。接头的例子包括但不限于不饱和链烷、聚乙二醇(例如，乙二醇或丙二醇单体单位，例如，二甘醇、双丙甘醇、三乙基二醇、三丙基二醇、四乙二醇或四乙二醇)和葡聚糖聚合物及其衍生物。其他例子包括但不限于接头内部可以利用还原剂或光解作用切割的可切割部分，如，例如，二硫键(-S-S-)或偶氮键(-N＝N-)。可选择性切割键的非限制性例子包括可以例如通过使用三(2-羧乙基)膦)(TCEP)、或其他还原剂和/或光解作用切割的酰氨基键以及可以例如通过酸性或碱性水解切割的酯键。
微RNA(miRNA)结合位点：如本文所用，微RNA(miRNA)结合位点表示核酸转录物中与至少miRNA“种子区结合的核苷酸位置或区域”。
修饰的：如本文所用“修饰的”指本发明分子的改变的状态或结构。分子可以按多种方式修饰，包括在化学、结构和功能上的修饰。在一个实施方案中，通过引入非天然核苷和/或核苷酸修饰本发明的mRNA分子，例如，在它涉及天然核糖核苷酸A、U、G和C时。非规范核苷酸如帽结构不视为“修饰的”，虽然它们与A、C、G、U核糖核苷酸的化学结构不同。
黏液：如本文所用，“黏液”指粘稠并且包含黏蛋白糖蛋白的天然物质。
天然存在的：如本文所用，“天然存在的”意指在自然界中无人工辅助情况下存在。
中和抗体：如本文所用，“中和抗体”指与其抗原结合并且通过抵消或消除抗原或传染因子具有的任何生物学活性，使细胞抵御该抗原或传染因子的抗体。
非人类脊椎动物：如本文所用，“非人类脊椎动物”包括除智人(Homo sapiens)之外的全部脊椎动物，包括野生和驯化物种。非人类脊椎动物的例子包括但不限于哺乳动物，如驼羊、爪哇野牛、野牛、骆驼、猫、牛、鹿、犬、驴、大额牛、山羊、豚鼠、马、羊驼、骡、猪、兔、驯鹿、羊、水牛和牦牛。
脱靶：如本文所用，“脱靶”指对任一个或多个靶、基因或细胞转录物的任何非预期效果。
开放阅读框：如本文所用，“开放阅读框”或“ORF”指在给定的阅读框中不含有终止密码子的序列。
有效连接(operably linked)：如本文所用，短语“有效连接”指两个或更多个分子、构建体、转录物、实体、部分等之间有功能的连接。
任选取代的：本文中，短语形式“任选取代的X”(例如，任选取代的烷基)意在等同于“X，其中X是任选取代的”(例如，“烷基，其中所述烷基是任选取代的”)。它不意指特征“X”(例如烷基)本身是任选的。
部分：如本文所用，多核苷酸的“部分”或“区域”定义为多核苷酸的小于多核苷酸整个长度的任何部分。
肽：如本文所用，“肽”长度小于或等于50个氨基酸，例如，长度约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
互补位：如本文所用，“互补位”指抗体的抗原结合位点。
患者：如本文所用，“患者”指可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将会接受治疗的受试者，或因特定疾病或病状而在训练有素的专业人员护理下的受试者。
可药用：短语“可药用的”在本文中用来指这些化合物、物质、组合物和/或剂型，其中它们在合理医学判断力范围内，适用于接触人和动物的组织而没有过多毒性、刺激性、变态反应或其他问题或并发症，与合理益处/风险比相称。
可药用赋形剂：如本文所用，短语“可药用赋形剂”指除本文所述的化合物之外(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的溶媒)并具有在患者中基本上无毒和非炎性特性的任何成分。赋形剂可以包括例如抗粘附剂、抗氧化剂、粘合剂(binder)、包衣、压制助剂、崩解剂、染料(色料)、软化剂、乳化剂、填料(稀释剂)、成膜物质或包衣、风味剂、香料、助流剂(流动增进剂)、润滑剂、防腐剂、印刷墨、吸附剂、助悬剂或分散剂、甜味剂和水化的水。示例性赋形剂包括但不限于：丁化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸(氢二)钙、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、尼泊金甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预糊化淀粉、尼泊金丙酯、视黄醇棕榈酸酯、紫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、淀粉羟乙酸钠、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
可药用盐：本公开还包括本文所述化合物的可药用盐。如本文所用，“可药用盐”指所公开化合物的衍生物，其中通过将现有的酸部分或碱部分转化成其盐形式(例如，通过游离碱基团与合适的有机酸反应)修饰母体化合物。可药用盐的例子包括但不限于碱性残基如胺的无机盐和有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱式盐或有机盐等。代表性酸加成盐包含乙酸盐、乙酸、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚糖酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙基胺、乙胺等。本公开的可药用盐包括形成的母体化合物的常规无毒盐，例如，从无毒无机酸或有机酸形成。本公开的可药用盐可以通过常规化学方法从含有碱性部分或酸性部分的母体化合物合成。简而言之，这类盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量数量的适宜碱或酸在水中或在有机溶剂中或在这二者的混合物中反应来制备；通常，优选非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适盐的列表存在以下文献中：Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编著),Wiley-VCH,2008以及Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)，所述文献的每一篇通过引用方式完整地并入本文。
可药用溶剂化物：如本文所用，术语“可药用溶剂化物”意指其中合适溶剂分子掺入晶体晶格中的本发明化合物。合适的溶剂是在施用的剂量上生理可耐受的。例如，可以通过结晶、再结晶或沉淀由包含有机溶剂、水或其混合物的溶液制备溶剂化物。合适溶剂的例子是乙醇、水(例如、一水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N’-二甲基乙酰胺(DMAC)、1.3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMEU)、1.3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苄醇、2-吡咯、苄基苯甲酸盐等。当水是溶剂时，溶剂化物称作“水合物”。
药代动力学：如本文所用，“药代动力学”表示施用至活生物的物质的命运有关的分子或化合物的任一种或多种特性。药代动力学分成几个领域，包括吸收的程度和速率、分布、代谢和排泄。这常称作ADME，其中：(A)吸收是物质进入血液循环的过程；(D)分布是物质分散或散布遍及身体的流体和组织各处；(M)代谢(或生物转化)是母体化合物不可逆性转化成子代谢物；和(E)排泄(或清除)指物质从身体清除。在罕见情况下，一些药物不可逆地蓄积在身体组织中。
物理化学：如本文所用，“物理化学”意指或涉及物理和/或化学特性。
每单位药物多肽(PUD)：如本文所用，PUD或每单位药物的产品，定义为产品(如多肽)每日总剂量(通常1mg、pg、kg，如体液或组织中所测量，通常以浓度如pmol/mL、mmol/mL等定义)的分割部分除以身体流体内的量值。
预防：如本文所用，术语“预防”指部分地或完全地延迟感染、疾病、病症和/或病状发作；部分地或完全地延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或临床表现发作；部分地或完全地延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或表现发作；部分地或完全地延迟自感染、特定疾病、病症和/或病状的进展；和/或降低形成与感染、疾病、病症和/或病状相关的病变的风险。
前药：本公开还包括本文所述化合物的前药。如本文所用，“前药”指任何物质、分子或实体，其所处的形式据预测该物质、分子或实体在化学或物理改变后即用作治疗药。前药可以按某种方式共价地结合或掩蔽并且在施用至哺乳动物受试者之前、之时或其后释放或被转化成活性药物部分。前药可以通过以下方式制备：以如此方式修饰化合物中存在的官能团，从而相对于母体化合物，以例行操作或在体内切去所述修饰。前药包含这样的化合物，其中羟基、氨基、硫氢基或羧基与施用至哺乳动物受试者时遭受切割以分别形成游离羟基、氨基、硫氢基或羧基的任何基团结合。在T.Higuchi和V.Stella,“Pro-drugs as NovelDelivery Systems,”A.C.S.Symposium Series第14卷以及Bioreversible Carriers inDrug Design,编者Edward B.Roche,American Pharmaceutical Association andPergamon Press,1987中讨论了前药的制备和施用，所述两篇文献因而通过引用的方式完整并入。
增殖：如本文所用，术语“增殖”意指生长、扩大或增加或造成快速地生长、扩大或增加。“增殖性”意指具有增殖能力。“抗增殖性”意指具有与增殖性特性对抗或不适合增殖的特性。
祖先细胞：如本文所用，术语“祖先细胞”指相对于它可以通过分化产生的细胞而具有更大发育潜能的细胞。
预防性：如本文所用，“预防性的”指用来防止疾病扩散的治疗药或做法。
预防：如本文所用，“预防”指为维持健康和防止疾病扩散所采取的措施。“免疫预防”指产生主动或被动式免疫力以防止疾病扩散的措施。
蛋白质切割位点：如本文所用，“蛋白质切割位点”指其中可以通过化学、酶促或光化学手段完成氨基酸链的受控切割的位点。
蛋白质切割信号：如本文所用，“蛋白质切割信号”指标示或标记多肽以便切割的至少一个氨基酸。
目的蛋白：如本文所用，术语“目的蛋白”或“所需的蛋白质”包括本文提供的那些及其片段、突变体、变体和改变。
近端：如本文所用，术语“近端的”意指更靠近中心或更靠近目的点或目的区域存在。
假尿苷：如本文所用，假尿苷指核苷尿苷的C-糖苷异构体。“假尿苷类似物”是假尿苷的任何修饰、变体、同工型或衍生物。例如，假尿苷类似物包括但不限于1-羧甲基-假尿苷、1-丙炔基-假尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、1-甲基假尿苷(m1ψ)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)、和2′-O-甲基-假尿苷(ψm)。
纯化：如本文所用，“所纯化的”、“纯化的”、“纯化”意指使得基本上纯的或不包含不想要的组分、污秽物质、混合物或杂质。
反复转染：如本文所用，术语“反复转染”指用多核苷酸多次转染相同的细胞培养物。可以将细胞培养物转染至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10倍、至少11次、至少12次、至少13次、至少14次、至少15次、至少16次、至少17次、至少18次、至少19次、至少20次、至少25次、至少30次、至少35次、至少40次、至少45次、至少50次或更多次。
样品：如本文所用，术语“样品”或“生物样品”指其组织、细胞或组分部分的子集(例如体液，包括但不限于血液、黏液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿、阴道液和精液)。样品还可以包括从完整生物或组织、细胞或组分部分的子集制备的匀浆、裂解物或提取物、或其级分或其部分，包括但不限于例如，血浆、血清、脊液、淋巴液、皮肤外断面、呼吸道、肠道和生殖泌尿道、泪、唾液、牛奶、血细胞、肿瘤、器官。样品还涉及培养基，如营养培养液或凝胶，其可以含有细胞组分，如蛋白质或核酸分子。
信号序列：如本文所用，短语“信号序列”指可以指导蛋白质转运或定位的序列。
单个单位剂量：如本文所用，“单个单位剂量”是在一个剂量中/在一个时间/单个途径/单个接触点(即，单个施用事件)所施用的任何治疗药的剂量
相似性：如本文所用，术语“相似性”指聚合物分子之间例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。可以按照与计算同一性百分数相同的方式计算聚合物分子彼此间的相似性百分数，例外是如本领域理解的相似性百分数的计算考虑保守性置换。
分割剂量：如本文所用，“分割剂量”是单个单位剂量或每日总剂量分成两个或更多个剂量。
稳定的：如本文所用“稳定的”指充分稳健以承受从反应混合物分离至有用纯度的分离并且优选地能够配制成有效治疗剂的化合物。
稳定化：如本文所用，术语“稳定化”、“稳定化的”、“稳定化的区域”意指使得或变得稳定。
立体异构体：如本文所用，术语“立体异构体”指化合物(例如，本文所述的任何式化合物)可能拥有的全部可能的不同异构形式以及构象形式，尤其全部可能的立体化学和构象学异构形式、基本分子结构的全部非对映异构体、对映异构体和/或构象异构体。本发明的一些化合物可以按不同的互变异构形式存在，后者全部纳入本发明的范围内。
受试者：如本文所用，术语“受试者”或“患者”指可以例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的而向其施用本发明组合物的任何生物。常见的受试者包括动物(例如，哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类和人)和/或植物。
基本上：如本文所用，术语“基本上”指显示目的特征或性质的总程度或近似总程度或度的定性条件。普通生物技术人员将理解，生物学现象和化学现象很少(就算有的话)达到完成和/或很少推进到完全或者很少实现或避免绝对结果。术语“基本上”因此在本文中用来包括许多生物学现象和化学现象中内在的完整性的可能缺缺乏。
基本上相等的：如本文所用在它涉及剂量之间的时间区别时，该术语意指加/减2％。
基本上同时：如本文所用并且在它涉及多个剂量时，该术语意指2秒范围内。
患有：正在“患有”疾病、病症和/或病状的个体已经诊断患有或显示疾病、病症和/或病状的一种或多种症状。
易患：“易患”某疾病、病症和/或病状的个体尚未诊断患有该疾病、病症和/或病状和/或可以不显示出该疾病、病症和/或病状的症状，但是存在形成疾病或其症状的倾向性。在一些实施方案中，易患某疾病、病症和/或病状(例如，癌症)的个体可以由以下一项或多项表征：(1)与形成该疾病、病症和/或病状相关的基因突变；(2)与形成该疾病、病症和/或病状相关的遗传多态性；(3)与该疾病、病症和/或病状相关的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性增加和/或减少；(4)与形成该疾病、病症和/或病状相关的习惯和/或生活方式；(5)该疾病、病症和/或病状的家族史；和(6)暴露于与形成该疾病、病症和/或病状相关的微生物和/或被其感染。在一些实施方案中，易患某疾病、病症和/或病状的个体将形成该疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易患某疾病、病症和/或病状的个体将不形成该疾病、病症和/或病状。
缓释：如本文所用，术语“缓释”指在特定时间段范围内符合释放速率的药物组合物或化合物释放谱。
合成的：术语“合成的”意指借助人手产生、制备和/或制造。本发明多核苷酸或多肽或其他分子的合成可以是化学或酶促的。
靶向的细胞：如本文所用，“靶向的细胞”指任一种或多种目的细胞。所述细胞可以在体外、在体内、原位存在或在生物的组织或器官中存在。生物可以是动物，优选地是哺乳动物，更优选地是人，并且最优选地是患者。
治疗剂：术语“治疗剂”指当施用至受试者时具有治疗、诊断和/或预防效果和/或激发所需生物学和/或药理学效果的任何物质。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指待递送物质(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，在施用至患有或易患感染、疾病、病症和/或病状的受试者时，所述量足够治疗该感染、疾病、病症和/或病状，改善其症状，诊断、预防该感染、疾病、病症和/或病状和/或延迟其发作。
治疗有效结果：如本文所用，术语“治疗有效结果”意指在患有或易患感染、疾病、病症和/或病状的受试者中足以治疗该感染、疾病、病症和/或病状，改善其症状，诊断、预防该感染、疾病、病症和/或病状和/或延迟其发作的结果。
每日总剂量：如本文所用，“每日总剂量”是在24小时时间给予或开具的量。它可以作为单个单位剂量施用。
全能性：如本文所用，“全能性”指具有产生在成年身体以及胚外组织(包括胎盘)中存在的全部细胞的发育潜能的细胞。
转录因子：如本文所用，术语“转录因子”指例如，通过激活或阻遏转录而调节DNA转录成RNA的DNA结合蛋白。一些转录因子单独实现转录的调节作用，而其他与其他蛋白质一起发挥作用。一些转录因子可以在某些条件下激活并阻抑转录。通常而言，转录因子在靶基因调节区中与特定靶序列或与高度相似于特定共有序列的序列结合。转录因子可以单独或在具有其他分子的复合物中调节靶基因的转录。
转录：如本文所用，术语“转录”指将外源核酸引入细胞中的方法。转染方法包括但不限于化学方法、物理处理和阳离子脂质或混合物。
转分化：如本文所用，“转分化”指一个类型的分化细胞丧失鉴别性特征并且将其表型变成其他充分分化的细胞表型的能力。
治疗：如本文所用，术语“治疗”指部分地或完全地缓和、改善、改量、减轻特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征，延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或减少其发生率。例如，“治疗”癌症可以指抑制肿瘤存活、生长和/或扩散。可以将治疗施用至不显示疾病、病症和/或病状迹象的受试者和/或施用至仅显示疾病、病症和/或病状早期迹象的受试者，目的在于降低形成与该疾病、病症和/或病状相关的病变的风险。
未修饰：如本文所用，“未修饰的”指以任何方式改变之前的任何物质、化合物或分子。未修饰可以指，但不总是指生物分子的野生型或天然形式。分子可以经历一系列修饰，因而每种修饰的分子可以充当后续修饰的“未修饰的”起始分子。
单潜能：如本文所用，当提及细胞时，“单潜能”意指产生单个细胞谱系。
疫苗：如本文所用，短语“疫苗”指改善针对特定疾病的免疫力的生物制品。
病毒蛋白：如本文所用，短语“病毒蛋白”意指源自病毒的任何蛋白质。
等同物和范围
本领域那些普通技术人员会认识到或将能够利用不超出常规的实验确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等同物。本发明的范围不意在限于以上说明书，而是如所附权利要求书所述。
在权利要求书中，除非指出相反或另外从上下文显而易见，否则冠词如“a”、“an”和“the”可以表示一个或多于一个。除非相反地指示或从上下文显而易见，否则，如果某群组的一个、多于一个或全部成员均存在于给定的产物或过程中、用于其中或与之相关，则将该群组的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求或说明视为满足。本发明包括其中该群组的一个成员完全存在于给定的产物或过程中、用于其中或与之相关的实施方式。本发明包括其中该群组的多于一个或全部成员均存在于给定的产物或过程中、用于其中或与之相关的实施方案。
还应当指出，术语“包含”意在是开放式的并且允许但不要求纳入额外的要素或步骤。当本文中使用术语“包含”时，因此还涵盖和公开术语“由……组成”。
在给出范围的情况下，包括端值。另外，应当理解，除非另外说明或另外从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，否则，作为范围表述的值可以在本发明的不同实施方案中采取所述范围内部的任何特定值或子范围，至该范围下限的十分之一单位，除非上下文另外清楚地说明。
此外，应当理解，落在现有技术范围内的本发明的任何具体实施方案可以从任一项或多项权利要求中明确地排除。由于这类实施方案视为本领域普通技术人员已知，所以可以排除它们，即使这种排除并未在本文中明确地阐明。本发明组合物的任何具体实施方案(例如，任何核酸或由其编码的蛋白质；任何产生方法；任何使用方法等)可以因任何原因从任一项或多项权利要求排除，无论是否与现有技术的存在相关。
全部援引的来源，例如，本文中援引的参考文献、出版物、数据库，数据库条目和论文，均通过参考并入本申请，即便没有在引文中明确地描述。在援引的来源和本申请的描述发生冲突的情况下，本申请中的描述应当占主导地位。
章节和表头不意在是限制的。
实施例
实施例1.多核苷酸的制造
根据本发明的，多核苷酸和/或其部分或区域的制造可以利用在2013年3月15日提交的名为“产生RNA转录物的制造方法”的美国61/800,049(代理人案号M500)中教授的方法完成，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
纯化方法可以包括在2013年3月15日提交的名为“在mRNA产生中移除DNA片段的方法”的USSN 61/799,872(代理人案号M501)；2013年3月15日提交的名为“核糖核酸纯化”的USSN 61/794,842(代理人案号M502)中教授的那些，所述文献每一篇的内容通过引用方式完整地并入本文。
多核苷酸的检测方法和表征方法可以如2013年3月15日提交的名为“表征mRNA分子”的美国61/798,945(代理人案号M505)中教授那样进行，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
本发明多核苷酸的表征可以使用选自多核苷酸作图(mapping)、逆转录酶测序、电荷分布分析和RNA杂质检测法的方法完成，其中表征过程包括测定RNA转录物序列、确定RNA转录物纯度或确定RNA转录物的电荷异质性。这类方法在例如2013年3月15日提交的名为“分析mRNA异质性和稳定性的USSN61/799,905”(代理人案号M506)和2013年3月15日提交的名为“离子交换纯化mRNA”USSN 61/800,110(代理人案号M507)中教授，所述文献每一篇的内容通过引用方式完整地并入本文。
实施例2.嵌合多核苷酸合成：三磷酸酯途径
引言
根据本发明的，嵌合多核苷酸的两个区域或部分可以使用三磷酸酯化学接合或连接。
根据这种方法，化学合成100个核苷酸或更小的第一区域或部分，5’单磷酸酯和末端3’desOH或封闭的OH。如果该区域长超过80个核苷酸，可以将它作为两条链合成，用于连接。
如果使用体外转录(IVT)，将第一区域或部分作为非位置方式修饰的区域或部分合成，则可以遵循5’单磷酸酯，随后3’末端加帽。
单磷酸酯保护基可以选自本领域已知的那些保护基的任一种。
嵌合多核苷酸的第二区域或部分可以使用化学合成或IVT方法合成。IVT方法可以包括RNA聚合酶，所述RNA聚合酶可以利用含修饰的帽的引物。可选地，多达80个核苷酸的帽可以化学合成并与IVT区域或部分偶联。
应当指出，对于连接方法，DNA T4连接酶连接随后用DNA酶处理应易于避免串联。不必要用磷酸酯-糖主链制造整个嵌合多核苷酸。如果区域或部分之一编码多肽，则优选这个区域或部分包含磷酸酯-糖主链。
随后使用任何已知的点击化学、邻点击(orthoclick)化学，solulink或本领域技术人员已知的其他生物缀合物化学，进行连接。
合成途径
使用一系列起始区段，产生嵌合多核苷酸。这类区段包括：
(a)包含正常3’OH的加帽的受保护5’区段(SEG.1)
(b)可以包含多肽编码区并包含正常3’OH的5’三磷酸酯区段(SEG.2)
(c)包含蛹虫草菌素(cordycepin)或不包含3’OH的嵌合多核苷酸的3’末端(例如，尾)的5’单磷酸酯区段(SEG.3)
在(化学或IVT)合成后，区段3(SEG.3)用蛹虫草菌素处理并且随后用焦磷酸酶处理以产生5’单磷酸酯。
随后使用RNA连接酶，将区段2(SEG.2)连接至SEG.3。连接的多核苷酸随后纯化并用焦磷酸酶处理以切割二磷酸酯。处理的SEG.2-SEG.3构建体随后纯化并将SEG.1连接至5'末端。可以进行嵌合多核苷酸的再纯化步骤。
在嵌合多核苷酸编码多肽的情况下，连接或接合的区段可以表述为：5’UTR(SEG.1)、开放阅读框或ORF(SEG.2)和3’UTR+聚A(SEG.3)。
每个步骤的产率可以多达90-95％。
实施例3.产生cDNA的PCR
使用2x KAPA HIFITM HotStart ReadyMix由Kapa Biosystems(Woburn，MA)执行用于制备cDNA的PCR程序。这个体系包括2x KAPA ReadyMix 12.5μl；正向引物(10μM)0.75μl；反向引物(10μM)0.75μl；模板cDNA-100ng；和dH2O，稀释至25.0μl。反应条件是95℃，5分钟，以下25个循环：98℃20秒随后58℃15秒随后72℃45秒随后72℃5分钟，然后4℃至终止。
本发明的反向引物并入聚-T120替换mRNA中的聚-A120。具有更长或更短聚(T)串的其他反向引物可以用来调节多核苷酸mRNA中聚(A)尾的长度。
使用Invitrogen的PURELINKTM PCR Micro试剂盒(Carlsbad，CA)，遵循制造商的说明书，净化反应物(达5μg)。更多反应物将需要使用具有更大容量的产品净化。在净化之后，将cDNA使用NANODROPTM定量并通过琼脂糖凝胶电泳分析以证实cDNA具有预期大小。随后提交cDNA用于测序分析，之后为体外转录反应。
实施例4.体外转录(IVT)
体外转录反应产生含有均匀修饰的多核苷酸的多核苷酸。这类均匀修饰的多核苷酸可以包含本发明多核苷酸的区域或部分。使用天然和非天然NTP，自行产生输入的核苷酸三磷酸(NTP)混合物。
常见体外转录反应包含以下：
粗制IVT混合物可以贮存在4℃过夜以便次日净化。1U无RNase的DNase随后用来消化原始模板。在37℃温育15分钟后，使用Ambion的MEGACLEARTM试剂盒(Austin，TX)遵循制造商的说明书，纯化mRNA。这个试剂盒可以纯化达500μg RNA。在净化之后，RNA使用NanoDrop定量并通过琼脂糖凝胶电泳分析以证实RNA具有正确大小并且RNA未发生降解。
实施例5.酶促加帽
如下进行多核苷酸的加帽，其中混合物包含：IVT RNA 60μg-180μg和dH2O直至72μl。将混合物在65℃温育5分钟以使RNA变性，并且随后立即转移到冰上。
该方案随后包括混合10x加帽缓冲液(0.5M Tris-HCl(pH 8.0)，60mM KCl，12.5mMMgCl2)(10.0μl)；20mM GTP(5.0μl)；20mM S-腺苷酰甲硫氨酸(2.5μl)；RNase抑制剂(100U)；2′-O-甲基转移酶(400U)；痘苗病毒加帽酶(鸟苷酰基转移酶)(40U)；dH2O(至多28μl)；并且在37℃对于60μg RNA温育30分钟或对于180μg RNA温育达2小时。
随后，使用Ambion的MEGACLEARTM试剂盒(Austin，TX)遵循制造商的说明书，纯化多核苷酸。在净化之后，RNA使用NANODROPTM(ThermoFisher,Waltham,MA)定量并通过琼脂糖凝胶电泳分析以证实RNA具有正确大小并且RNA未发生降解。也可以通过运行逆转-转录-PCR产生测序用cDNA，将RNA产物测序。
实施例6.聚腺苷酸加尾反应
在cDNA中无聚-T的情况，必须在净化终产物之前进行聚腺苷酸加尾反应。这通过以下方式做到：混合加帽的IVT RNA(100μl)；RNase抑制剂(20U)；10x加尾缓冲液(0.5MTris-HCl(pH 8.0)，2.5M NaCl，100mM MgCl2)(12.0μl)；20mM ATP(6.0μl)；聚腺苷酸聚合酶(20U)；dH2O达到123.5μl并在37℃温育30分钟。如果聚腺苷酸尾已经存在于转录物中，则加尾反应可以略过并直接推进到用Ambion’s MEGACLEARTM试剂盒(Austin，TX)(达500μg)净化。聚腺苷酸聚合酶优选地是酵母中表达的重组酶。
应当理解，聚腺苷酸加尾反应的持续合成能力或完整性可能不总是产生确切大小的聚腺苷酸尾。因此，大约40-200个核苷酸之间例如约40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、150-165、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164或165个核苷酸的聚腺苷酸尾在本发明的范围内。
实施例7.天然5′帽和5′帽类似物
多核苷酸的5′-加帽可以在体外-转录反应期间使用以下化学性RNA帽类似物同步完成，以根据制造商的方案产生5′-鸟苷帽结构：3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G[ARCA帽]；G(5')ppp(5')A；G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')A；m7G(5')ppp(5')G(New EnglandBioLabs,Ipswich,MA)。修饰的RNA的5′-加帽可以使用痘苗病毒加帽酶转录后完成，以产生“帽0”结构：m7G(5')ppp(5')G(New England BioLabs,Ipswich,MA)。帽1结构可以使用痘苗病毒加帽酶和2′-O甲基-转移酶生成，从而产生m7G(5')ppp(5')G-2′-O-甲基。帽2结构可以从帽1结构生成，随后使用2′-O甲基-转移酶对5′-倒数第三个核苷酸进行2′-O-甲基化。帽3结构可以从帽2结构生成，随后使用2′-O甲基-转移酶对5′-倒数第四个核苷酸进行2′-O-甲基化。酶优选地衍生自重组来源。
当转染入哺乳动物细胞时，修饰的mRNA具有12-18小时之间或长于18小时(例如，24、36、48、60、72小时或长于72小时)的稳定性。
实施例8.加帽测定法
A.蛋白质表达测定法
可以将含有本文中教授的任何帽的编码多肽的多核苷酸按以相等浓度转染至细胞中。转染后6、12、24和36小时，可以通过ELISA测定分泌入培养基的蛋白质的量。分泌更高水平蛋白质至培养基中的合成性多核苷酸将对应于具有更高翻译能力的帽结构的合成性多核苷酸。
B.纯度分析合成
可以使用变性琼脂糖-脲凝胶电泳或HPLC分析，比较含有本文中教授的任何帽的编码多肽的多核苷酸的纯度。与具有多个条带或波纹条带的多核苷酸相比，电泳时具有单一齐整条带的多核苷酸对应于较高纯度的产物。具有单个HPLC峰的合成性多核苷酸将也对应于较高纯度的产物。效率较高的加帽反应将产生更纯的多核苷酸群体。
C.细胞因子分析
可以将含有本文中教授的任何帽的编码多肽的多核苷酸按多个浓度转染至细胞中。转染后6、12、24和36小时，可以通过ELISA测定分泌入培养基的促炎性细胞因子如TNF-α和IFN-β的量。导致更高水平促炎细胞因子分泌入培养基的多核苷酸对应于含有免疫激活性帽结构的多核苷酸。
D.加帽反应效率
可以在核酸酶处理后通过LC-MS分析含有本文中教授的任何帽的编码多肽的多核苷酸的加帽反应效率。核酸酶处理加帽的多核苷酸将产生通过LC-MS可检测的游离核苷酸和加帽的5′-5-三磷酸酯帽结构的混合物。LC-MS谱上加帽产物的量可以表述为来自反应的总多核苷酸的百分数，并且将对应于加帽反应效率。通过LC-MS，具有较高加帽反应效率的帽结构具有更多量的加帽产物。
实施例9.修饰的RNA或RT PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
将各种多核苷酸(20μl体积中200-400ng)或逆转录的PCR产物(200-400ng)装入非变性1.2％琼脂糖E-凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上的孔中并根据制造商方案运行12-15分钟。
实施例10.修饰的RNA的Nanodrop定量和紫外光谱数据
TE缓冲液(1μl)中修饰的多核苷酸用于Nanodrop紫外吸光度读数，以定量来自化学合成或体外转录反应的每种多核苷酸的产率。
实施例11.使用类脂质配制修饰的mRNA
通过将多核苷酸与类脂质在添加至细胞之前按设定比率混合，配制多核苷酸，用于体外实验。体内制剂可能需要添加额外成分以促进循环遍及整个身体。为了检验这些类脂质形成适于体内发挥作用的粒子的能力，可以使用用于siRNA-类脂质制剂的标准配制方法作为起点。在形成粒子后，添加多核苷酸并且允许与复合物整合。使用标准染料排阻测定法确定包封效率。
实施例12.筛选蛋白质表达的方法
A.电喷雾电离
制备可能含有由施用至受试者的多核苷酸编码的蛋白质的生物样品，并根据制造商的电喷雾电离(ESI)方案，使用1、2、3或4台质量分析器分析。也可以使用串联ESI质谱系统分析生物样品。
将蛋白质片段或完整蛋白质的图案与给定蛋白质的已知对照比较，并且通过比较确定身份。
B.基质辅助激光解吸附/电离
制备可能含有由施用至受试者的一种或多种多核苷酸编码的蛋白质的生物样品，并根据基质辅助激光解吸附/电离(MALDI)分析。
将蛋白质片段或完整蛋白质的图案与给定蛋白质的已知对照比较，并且通过比较确定身份。
C.液相色谱-质谱-质谱法
可能含有由一种或多种多核苷酸编码的蛋白质的生物样品可以用胰蛋白酶处理，以消化其内部所含的蛋白质。通过液相色谱-质谱-质谱法(LC/MS/MS)分析所产生的肽。将肽在质谱仪中片段化以产生判断用图案，所述判断用图案可以借助计算机算法与蛋白质序列数据库匹配。可以稀释消化的样品，以产生给定蛋白质的1ng或更低起始材料。含有单纯缓冲液背景(例如水或挥发性盐)的生物样品可用于直接溶液中消化；更复杂的背景(例如去垢剂、非挥发性盐、甘油)需要额外的净化步骤以促进样品分析。
将蛋白质片段或完整蛋白质的图案(pattern)与给定蛋白质的已知对照比较，并且通过比较确定身份。
实施例13.环化和/或连环化
根据本发明，多核苷酸可以是环化或连环化，以产生有翻译能力的分子，从而辅助聚腺苷酸结合蛋白和5′端结合蛋白之间的相互作用。环化或连环化的机理可以通过至少3种不同途径实现：1)化学、2)酶促和3)核酶催化。新形成的5′-/3′-键可以是分子内或分子间的。
在第一途径中，核酸的5′-端和3′-端含有当靠近时在分子5′-端和3′-端之间形成新共价键的化学反应性基团。5′-端可以含有NHS-酯反应基团，3′-端可以含有3′-氨基封端的核苷酸，从而在有机溶剂中时，合成性mRNA分子3′-端上的3′-氨基封端的核苷酸将对5′-NHS-酯部分发起亲核性攻击，形成新的5′-/3′-酰胺键。
在第二途径中，T4RNA连接酶可以用来酶促连接5′-磷酸化的核酸分子至核酸的3′-羟基，形成新磷酸二酯键。在一个例子反应中，根据制造商的操作方案，将1μg核酸分子在37℃与1-10单位T4RNA连接酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)温育1小时。连接反应可以在分裂多核苷酸存在下进行，所述分裂多核苷酸能够与附近的5′-区域和3′-区域两者碱基配对，以帮助酶促连接反应。
在第三途径中，cDNA模板的5′-端或3′-端编码连接酶核酶序列，从而在体外转录期间，所得到的核酸分子可以含有能够使核酸分子5′-端连接至核酸分子3′-端的活性核酶序列。连接酶核酶可以衍生自组I内含子、组I内含子、丁型肝炎病毒、发夹核酶或可以通过SELEX(通过指数富集的配体系统进化)选出。核酶连接酶反应可以在0℃和37℃之间的温度进行1至24小时。
实施例14.LDL受体的体外表达
在6孔板(BD Biosciences,San Jose,美国)上接种人胚肾上皮(HEK293)细胞(LGCstandards GmbH,Wesel,德国)。将HEK293以每孔约500,000个细胞的密度接种在3mL细胞培养基中。在接种细胞后随即按每孔800ng的量添加含有野生型LDLR mRNA(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)、LDLR EGF-A结构域序列变体mRNA(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)、LDLR EGF-A和胞质结构域序列变体(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)，或LDLR胞质结构域序列变体(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)或G-CSF对照(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)的制剂并且温育。制备和检验的LDLR mRNA序列变体将包括：四氨基酸置换变体，N316A、E317A、D331A和Y336A(#399)，或以下单氨基酸置换变体：Y336A(#400)、E317A(#401)、N316A(#402)、L339D(#403)、D331E(#404)。这些序列变体还可以含有几种胞质结构域变体(包括K816R、K830R或C839A)的一种或多种。mRNA转染的细胞用抗LDLR抗体处理，一组LDLR转染的细胞用正常山羊IgG处理作为对照。用藻红蛋白(PE)标记的第二抗体处理之后，通过FACS分析检测所结合的第一抗体。检测表达LDLR的百分数设门活细胞。认为在用对照非免疫IgG染色的LDLR mRNA处理的细胞中观察不到染色，并且在G-CSF mRNA转染的细胞检测不到LDLR阳性细胞。
实施例15.体外LDLR表达
A.表达
在6孔板(BD Biosciences,San Jose,美国)上接种人胚肾上皮(HEK293)细胞(LGCstandards GmbH,Wesel,德国)。将HEK293以每孔约500,000个细胞的密度接种在3mL细胞培养基中。在接种细胞后随即按每孔800ng的量添加含有野生型LDLR mRNA(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)、LDLR EGF-A结构域序列变体mRNA(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)、LDLR EGF-A和胞质结构域序列变体(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)，或LDLR胞质结构域序列变体(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)或G-CSF对照(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)的制剂并且在60g/mL外源人PCSK9存在和不存在的情况下温育。制备和检验的LDLR mRNA序列变体将包括：四氨基酸置换变体，N316A、E317A、D331A和Y336A(#399)(本文也称作具有4个突变的LDLR突变体)，或以下单氨基酸置换变体：Y336A(#400)、E317A(#401)、N316A(#402)、L339D(#403)、D331E(#404)。这些序列变体还可以含有几种胞质结构域变体(包括K816R、K830R或C839A)的一种或多种。mRNA转染的细胞用抗LDLR抗体处理，并且一组LDLR转染的细胞用正常山羊IgG处理作为对照。在37℃15小时后，移除转染培养基，洗涤细胞并用缀合有藻红蛋白(PE)的抗LDLR抗体如上文所述那样处理。一组LDLR转染的细胞用缀合有PE的正常山羊IgG处理并使用另一组未转染的细胞作为对照。用G-CSF修饰的mRNA转染的细胞作为额外的阴性对照使用。如上文所述，通过流式细胞术分析检测结合的第一抗体。
认为FACS分析显示，在野生型LDLR mRNA转染的细胞中以某个百分数的设门活细胞在细胞表面表达LDLR。相比之下，认为在PCSK9结合结构域中具有置换的每种LDLR mRNA变体显示对外源PCSK9的下调作用较不敏感性，(与随野生型LDLR观察到的58％的减少相比)减少的百分值范围为-8.1％至29％。还认为，在胞质结构域中含有一个或多个突变(包括K816R、K830R或C839A或这些变体的任何组合)的LDLR PCSK9结合变体对外源PCSK9不敏感。由于期望后面那些变体在LDLR的IDOL依赖性泛素化方面具有缺陷，这些变体甚至可能因表观LDLR半寿期增加而对PCSK9下调节作用更不敏感。
B.LDLR的官能性
为了评价表达的LDLR是否有功能，使用BODIPY标记的LDL。HEK293细胞用LDLRmRNA或G-CSF mRNA转染过夜，洗涤细胞并且与渐增量的BODIPY-LDL温育。在在37℃温育1.0小时后，洗涤细胞并通过流式细胞术评估结合BODIPY-LDL的细胞。获得BODIPY-LDL结合作用的等值线图。对于野生、LDLR PCSK9和/或胞质结构域结合变体，BODIPY-LDL与LDLR mRNA转染的细胞结合是明显的，因为设门细胞群体中随BODIPY-LDL浓度而增加的右偏移。认为用对于用每种LDLR mRNA构建体转染的细胞，在设门的细胞群体中观察到相似的右偏移。还认为，对于用野生型、PCSK9结合缺陷型和/或胞质结构域变异LDLR mRNA转染的细胞与BODIPY-LDL结合作用而言，半数最大细胞结合作用是相同的。对于每个构建体，认为BODIPY-LDL结合作用具有高亲和力(0.6-0.7ng/mL之间的半数最大结合作用)并且是可饱和的。有可能的是，对于用G-CSF mRNA转染的细胞，将观察不到BODIPY-LDL结合作用。
C.对细胞中细胞表面LDLR半寿期的影响
为了评估外源PCSK9是否可以在LDLR mRNA转染的细胞中调节细胞表面LDL受体的表观半寿期，铺种HEK293细胞、温育并用如上文所述的LDLR mRNA转染。洗涤细胞单层并且添加含PCSK9(60μg/ml)或不含PCSK9的新鲜培养基。在37℃温育各种时间后，使用如上文所述的抗LDLR抗体，通过流式细胞术监测细胞表面LDLR表达。可认为，在野生型LDLR mRNA转染的细胞中细胞表面LDLR以时间依赖性方式减少。类似地，认为添加PCSK9至用野生型LDLRmRNA转染的细胞的培养基降低了细胞表面LDLR的表观半寿期。相比之下，添加PCSK9至用PCSK9结合缺陷型LDLR mRNA或PCSK9结合缺陷型和胞质结构域突变LDLR mRNA转染的细胞的培养基，对细胞表面LDLR的表观半寿期引起微小变化或不引起变。认为这些数据显示，在胞质结构域突变存在或不存在下用编码在PCSK9结合位点中具有突变的LDLR的LDLR mRNA转染的细胞将不会响应于外源PCSK9，这表明这些结合变体可以在体内比野生型LDLR具有更长的半寿期并且可用于治疗高胆固醇血症患者。
D.LDLR的泛素化
认为在编码LDLR胞质结构域的LDLR mRNA中的突变(K816R，K830R，或C839A)在一起或单独或组合情况下阻止LDLR的泛素化并且因此延长LDLR的细胞半寿期。为了评估这一点，HEK293细胞或Hep-G2细胞在接种细胞后随即用下述制剂按每孔800ng的量转染并且温育，所述制剂含有野生型LDLR mRNA(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)、LDLR EGF-A结构域序列变体mRNA(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)、LDLR EGF-A和胞质结构域序列变体(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)，或LDLR胞质结构域序列变体(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)或G-CSF对照(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)的制剂。制备和检验的LDLR mRNA序列变体将包括：四氨基酸置换变体，N316A、E317A、D331A和Y336A(#399)，或以下单氨基酸置换变体：Y336A(#400)、E317A(#401)、N316A(#402)、L339D(#403)、D331E(#404)。这些序列变体还可以含有几种胞质结构域变体(包括K816R、K830R或C839A)的一种或多种。细胞将在37℃与LXRα的氧固醇配体温育达24小时以诱导IDOL的表达。IDOL泛素化LDLR的能力将通过细胞提取物的蛋白质印迹分析用泛素特异性抗体和LDLR特异性抗体评估。认为含有胞质结构域突变的LDLR变体显示减少的泛素化。
实施例16.体内LDLR表达
为了评估LDLR mRNA在体内的功能，利用LDL受体缺陷型小鼠。动物接受多种剂量的纳米粒子制剂，如利用C12-200的那些，所述纳米粒子制剂例如含有野生型LDLR mRNA(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)、LDLR EGF-A结构域序列变体mRNA(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)、LDLR EGF-A和胞质结构域序列变体(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)，或LDLR胞质结构域序列变体(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)或G-CSF对照(用5-甲基胞苷和假尿苷完全修饰或用1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾)，在接种细胞后随即按每孔800ng的量转染并且温育。制备和检验的LDLR mRNA序列变体包括：四氨基酸置换变体，N316A、E317A、D331A和Y336A(#399)，或以下单氨基酸置换变体：Y336A(#400)、E317A(#401)、N316A(#402)、L339D(#403)、D331E(#404)。这些序列变体还可以含有几种胞质结构域变体(包括K816R、K830R或C839A)的一种或多种。在各种时间段后处死小鼠，获得血清样品，并且通过蛋白质印迹法评估肝脏LDLR表达水平。认为由PCSK9结合变体编码的LDLR的表观半寿期增加。进一步认为，由胞质结构域中还携带突变的PCSK9结合突变体编码的LDLR半寿期增加。认为LDLR突变体的延长的半寿期与血清VLDL+IDL+LDL胆固醇水平降低相关。这些数据进一步验证用LDLR mRNA治疗家族性高胆固醇血症的方法。
实施例17.小鼠LDLR突变体构建体
根据本发明，多核苷酸至少可包含编码小鼠LDLR的连接的核苷的第一区域。下表10中列出本发明的小鼠LDLR蛋白序列。表10中显示基因和蛋白质序列识别码的名称和描述。对于任何特定基因，可能存在一种或多种变体或同工型。本领域技术人员将理解，在该表中公开的是潜在侧翼区。通过教授蛋白质序列，确定并具体地公开了编码区。因此，教授的编码蛋白质的序列旁侧分布的序列被视为侧翼区。通过利用一个或多个可获得的数据库或算法，还可能进一步表征5′和3′侧翼区。数据库具有注释在ENST转录物的侧翼区中所含的特征并且这些数据库库是本领域可获得的。
表10.靶
LDLR小鼠蛋白质序列的EGF-A结构域是KTNECLDNNGGCSHICKDLKIGSECLCPSGFRLVDLHRCE(SEQ ID NO:730)并且胞内结构域是RNWRLKNINSINFDNPVYQKTTEDELHICRSQDGYTYPSRQMVSLEDDVA(SEQ ID NO:731)。
本文所述的任何多核苷酸可以编码小鼠LDLR构建体并且可以用于在体内实验中评价突变对动物的影响。
实施例17.LDLR突变体构建体
根据本发明，多核苷酸至少可包含编码人类LDLR的连接的核苷的第一区域。下表11中列出本发明的人类LDLR蛋白序列。表11中显示基因和蛋白质序列识别码的名称和描述。对于任何特定基因，可能存在一种或多种变体或同工型。本领域技术人员理解，在该表中公开了潜在侧翼区。通过教授蛋白质序列，确定并具体地公开了编码区。因此，教授的编码蛋白质的序列旁侧分布的序列被视为侧翼区。通过利用一个或多个可获得的数据库或算法，还可能进一步表征5′和3′侧翼区。数据库具有注释在ENST转录物的侧翼区中所含的特征并且这些数据库库是本领域可获得的。
表11：靶
实施例18.LDLR-IDOL突变体的体外研究
A.LDLR-IDOL突变体的体外表达
将HEK293细胞用编码人LDLR突变体或小鼠LDLR突变体的mRNA转染并且与人或小鼠LDLR的对照(野生型)比较。使用lipofectamine 2000连同渐增量的mRNA(约4ng至4000ngmRNA)，用编码人或小鼠LDLR的mRNA转染HEK293细胞12-14小时。收获细胞并用山羊抗-hLDLR-PE或山羊IgG-PE抗体染色并用流式细胞仪分析。针对所评价的每种剂量和构建体，将LDLR表达评定为LDLR阳性细胞百分数。
用于这项研究的编码人LDLR突变体的mRNA包含突变N316A、K830R和C839A(氨基酸序列在SEQ ID NO:50中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:735中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)；突变K830R、C839A和L339D(氨基酸序列在SEQ ID NO:52中显示；mRNA序列在SEQ IDNO:736中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或突变K830R和C839A(氨基酸序列在SEQ ID NO:54中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:737中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。
用于这项研究的编码小鼠LDLR突变体的mRNA包含突变N317A、K832R和C841A(氨基酸序列在SEQ ID NO:724中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:732中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)；突变L340D、K832R和C841A(氨基酸序列在SEQ ID NO:726中显示；mRNA序列在SEQ IDNO:733中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或突变K832R和C841A(氨基酸序列在SEQ ID NO:728中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:734中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。
B.体外LDL与LDLR-IDOL突变体结合
在建立LDLR-IDOL突变体的表达后，评估这些mRNA的体外生物活性并且与野生型受体在体外的生物活性比较。使用BODIPY-标记的LDL结合测定法，评价编码LDLR-IDOL突变体的mRNA的配体结合作用。将HEK293细胞用编码LDLR-IDOL突变体的mRNA按范围约4ng至约4000ng的量转染12-14小时。
用于这项研究的编码人LDLR突变体的mRNA包含突变N316A、K830R和C839A(氨基酸序列在SEQ ID NO:50中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:735中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)；突变K830R、C839A和L339D(氨基酸序列在SEQ ID NO:52中显示；mRNA序列在SEQ IDNO:736中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或突变K830R和C839A(氨基酸序列在SEQ ID NO:54中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:737中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。
用于这项研究的编码小鼠LDLR突变体的mRNA包含突变N317A、K832R和C841A(氨基酸序列在SEQ ID NO:724中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:732中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)；突变L340D、K832R和C841A(氨基酸序列在SEQ ID NO:726中显示；mRNA序列在SEQ IDNO:733中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或突变K832R和C841A(氨基酸序列在SEQ ID NO:728中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:734中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。
细胞与渐增浓度的荧光标记的LDLR配体(LDL-BODIPY)(约0.1μg/ml至约50μg/ml)在37℃温育1小时。随后收获细胞并用流式细胞仪分析。
C.PCSK9下调LDLR表达
评价编码LDLR-IDOL突变体的mRNA对PCSK9下调作用的抵抗性。
用lipofectamine 2000将HEK293细胞用编码LDLR-IDOL突变体的mRNA按范围约4ng至约4000ng的量转染12-14小时。
用于这项研究的编码人LDLR突变体的mRNA包含突变N316A、K830R和C839A(氨基酸序列在SEQ ID NO:50中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:735中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)；突变K830R、C839A和L339D(氨基酸序列在SEQ ID NO:52中显示；mRNA序列在SEQ IDNO:736中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或突变K830R和C839A(氨基酸序列在SEQ ID NO:54中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:737中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。
用于这项研究的编码小鼠LDLR突变体的mRNA包含突变N317A、K832R和C841A(氨基酸序列在SEQ ID NO:724中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:732中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)；突变L340D、K832R和C841A(氨基酸序列在SEQ ID NO:726中显示；mRNA序列在SEQ IDNO:733中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或突变K832R和C841A(氨基酸序列在SEQ ID NO:728中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:734中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。
细胞与培养基在具有或没有75μg/mL PCSK9的情况下经8小时时间过程温育。收获细胞并用山羊抗-hLDLR-PE抗体染色。细胞用流式细胞仪分析以评价PCSK9介导的LDLR下调作用。
实施例19.LDLR-IDOL突变体的体内研究
编码人或小鼠LDLR-IDOL突变体的mRNA的能力在体内与人或小鼠LDLR(野生型)比较。
通过尾静脉注射静脉内施用编码LDLR-IDOL突变体的mRNA，以敲除(KO)LDLR小鼠。mRNA在脂质纳米粒子中配制并且mRNA以0.01mg/kg至5mg/kg的剂量施用。
用于这项研究的编码人LDLR突变体的mRNA包含突变N316A、K830R和C839A(氨基酸序列在SEQ ID NO:50中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:735中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)；突变K830R、C839A和L339D(氨基酸序列在SEQ ID NO:52中显示；mRNA序列在SEQ IDNO:736中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或突变K830R和C839A(氨基酸序列在SEQ ID NO:54中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:737中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。
用于这项研究的编码小鼠LDLR突变体的mRNA包含突变N317A、K832R和C841A(氨基酸序列在SEQ ID NO:724中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:732中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)；突变L340D、K832R和C841A(氨基酸序列在SEQ ID NO:726中显示；mRNA序列在SEQ IDNO:733中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或突变K832R和C841A(氨基酸序列在SEQ ID NO:728中显示；mRNA序列在SEQ ID NO:734中显示，其中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示，5’帽是帽并且mRNA用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。
在施用mRNA后30分钟和施用mRNA后96小时之间收获小鼠肝。将肝加工用于mRNA表达(qPCR)和/或蛋白质表达(蛋白质印迹法)。
实施例20.表达野生型LDLR和PCSK9结合缺陷型突变体
在48孔板(BD Biosciences,San Jose,美国)上接种人胚肾上皮(HEK293)细胞(LGC standards GmbH,Wesel,德国)。将HEK293以每孔约60,000个细胞的密度接种在0.2mL细胞培养基中。按每孔60,000的量接种细胞随后即添加含有1μL lipofectamine和150ng野生型(WT)LDLR mRNA(mRNA序列在SEQ ID NO:738中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或150ng LDLR序列突变mRNA或对照G-CSF mRNA(mRNA在SEQ ID NO:739中显示；用5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰；5'帽，帽1；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示)的制剂，并温育。
制备和检验的突变LDLR mRNA序列包括：一个四氨基酸置换变体(4A：N316A、E317A、D331A和Y336A)(mRNA序列在SEQ ID NO:69中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)，或以下单氨基酸置换变体：Y336A(mRNA序列在SEQ ID NO:68中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、E317A(mRNA序列在SEQID NO:67中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、N316A(mRNA序列在中显示SEQ ID NO:66；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、L339D(mRNA序列在SEQ ID NO:65中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、D331E(mRNA序列在SEQ ID NO:64中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。
作为对照，将G-CSF mRNA转染的细胞用抗LDLR抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN；人LDLR亲和纯化的多克隆AbAF2148)处理并将一组LDLR转染的细胞用正常山羊IgG(R&DSystems,Minneapolis,MN；纯化的山羊IgG R&D Systems目录号AC-108-C)处理。用藻红蛋白(PE)标记的抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN)处理之后，通过FACS分析检测结合的第一抗体。用Innova biosciences lightning-连接缀合试剂盒(Lightning-Link R-PE抗体标记试剂盒，Novus生物学的目录号：703-0010)完成与PE的缀合。
如图16中所示，FACS分析显示，检测到全部设门的活细胞的32％在150ng剂量野生型LDLR mRNA(图16中的WT)时表达LDLR。类似地，对于用LDLR mRNA突变体转染的细胞，在150ng剂量时检测到全部设门的活细胞的12-33％表达LDLR。在LDLR mRNA处理的用对照非免疫IgG染色的细胞中未观察到染色(LDLR WT转染，同种型染色)，并且在G-CSF mRNA转染的细胞中没有检测到LDLR阳性细胞(GCSF转染，LDLR染色)。
实施例21.通过外源PCSK9下调LDLR
在48孔板(BD Biosciences,San Jose,美国)上接种人胚肾上皮(HEK293)细胞(LGC standards GmbH,Wesel,德国)。将HEK293以每孔约60,000个细胞的密度接种在0.2mL细胞培养基中。按每孔800ng的量接种细胞随后即添加含有1μLlipofectamine 2000和150ng野生型(WT)LDLR mRNA(mRNA序列在SEQ ID NO:738中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或150ngLDLR序列变体mRNA或150ng对照G-CSF mRNA(mRNA在SEQ ID NO:739中显示；用5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰；5'帽，帽1；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示)的制剂，并在60μg/ml的外源人PCSK9存在和不存在的情况下温育。
制备和检验的LDLR mRNA序列突变体包括：一个四氨基酸置换变体(4A：N316A、E317A、D331A和Y336A)(mRNA序列在SEQ ID NO:69中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)，或以下单氨基酸置换变体：Y336A(mRNA序列在SEQ ID NO:68中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、E317A(mRNA序列在SEQID NO:67中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、N316A(mRNA序列在中显示SEQ ID NO:66；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、L339D(mRNA序列在SEQ ID NO:65中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、D331E(mRNA序列在SEQ ID NO:64中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。
在37℃15小时后，移除转染培养基，将细胞洗涤并用藻红蛋白(PE)缀合的抗LDLR抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN；人LDLR亲和纯化的多克隆AbAF2148)如上文所述那样处理。将一组LDLR转染的细胞用PE缀合的正常山羊IgG(R&D Systems,Minneapolis,MN；纯化的山羊IgG R&D Systems目录号AC-108-C)处理并使用另一组未转染的细胞作为对照。使用G-CSF修饰的mRNA转染的细胞作为额外的阴性对照。用Innova biosciences lightning-连接缀合试剂盒(Lightning-Link R-PE抗体标记试剂盒，Novus生物学的目录号：703-0010)完成与PE的缀合。如上文所述，通过流式细胞术分析检测结合的第一抗体。
如图17中所示，FACS分析显示，在野生型LDLR mRNA转染的细胞中51.6％设门的活细胞在细胞表面表达LDLR。当细胞转染期间添加外源PCSK9至培养基时，这个值减降低至21.5％设门的活细胞。相比之下，在PCSK9结合结构域中具有置换的每种LDLR mRNA突变体显示对外源PCSK9下调作用较不敏感性(表12)，(与随野生型LDLR观察到的58％减少相比)减少百分值范围从-8.1％至29％。
表12.外源PCSK9下调细胞表面LDLR表达
实施例22.突变LDLR mRNA表达的LDLR的功能
为了评价表达的LDLR是否有功能，使用BODIPY标记的LDL。60,000个HEK293细胞/孔用制剂转染过夜，所述制剂含有1μLlipofectamine 2000和150ng编码野生型(WT)LDLRmRNA(mRNA序列在SEQ ID NO:738中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或150ng LDLR突变mRNA或150ng对照G-CSF mRNA(mRNA在SEQ ID NO:739中显示；用5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰；5'帽，帽1；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示)。
制备和检验的LDLR突变mRNA序列包含：一个四氨基酸置换变体(4A：N316A、E317A、D331A和Y336A)(mRNA序列在SEQ ID NO:69中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)，或以下单氨基酸置换变体：Y336A(mRNA序列在SEQ ID NO:68中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、E317A(mRNA序列在SEQ ID NO:67中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、N316A(mRNA序列在中显示SEQ ID NO:66；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、L339D(mRNA序列在SEQ ID NO:65中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、D331E(mRNA序列在SEQ ID NO:64中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。
将细胞洗涤并且与递增量(0μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml或50μg/ml)的BODIPY-LDL温育。在在37℃温育1小时后，洗涤细胞并通过流式细胞术评估结合BODIPY-LDL的细胞。图18A中显示等值线图。对于野生型(WT)和LDLR PCSK9结合变体，BODIPY-LDL与LDLR mRNA转染的细胞的结合是明显的，因为设门细胞群体中随BODIPY-LDL浓度而增加的右偏移。对用每种LDLR mRNA构建体转染的细胞，在设门的细胞群体中观察到相似的右偏移。如图18B中显示，对于用野生型或PCSK9结合缺陷型LDLR mRNA转染的细胞与BODIPY-LDL的结合作用而言，半数最大细胞结合作用(half-maximal cell association)相同。对于每个构建体，BODIPY-LDL结合作用具有高亲和力(0.6-0.7ng/mL之间的半数最大结合作用)并且是可饱和的。对于用G-CSF mRNA转染的细胞，没有观察到BODIPY-LDL结合作用。
实施例23.评价细胞表面LDLR的半寿期
为了评估外源PCSK9是否可以在LDLR mRNA转染的细胞中调节细胞表面LDL受体的表观半寿期，将HEK293细胞铺种在24孔平板上，130,000个细胞/孔，用LDLR mRNA转染并且如上文所述温育14小时。将细胞单层洗涤并且添加含PCSK9(60μg/ml)或不含PCSK9的新鲜培养基。在37℃温育各种时间后，如上文所述使用抗LDLR抗体，通过流式细胞术监测细胞表面LDLR表达。如图19A中显示，在用300ng野生型LDLR mRNA(mRNA序列在SEQ ID NO:738中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)转染的细胞中，细胞表面LDLR以时间依赖性方式减少，表观半寿期为大约13小时。添加PCSK9至用野生型LDLR mRNA转染的细胞的培养基将细胞表面LDLR的表观半寿期降低至约4小时。在图19A中，“*”表示统计检验时显著差异。
相比之下，添加PCSK9至用300ng PCSK9结合缺陷型LDLR mRNA转染的细胞的培养基对细胞表面LDLR的表观半寿期引起微小变化或不引起变化(图19B-19G)。制备和检验的PCSK9结合缺陷型LDLR mRNA序列(突变LDLR mRNA)包含：一个四氨基酸置换变体(4A：N316A、E317A、D331A和Y336A)(mRNA序列在SEQ ID NO:69中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)，或以下单氨基酸置换变体：Y336A(mRNA序列在SEQ ID NO:68中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、E317A(mRNA序列在SEQ ID NO:67中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、N316A(mRNA序列在中显示SEQ ID NO:66；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、L339D(mRNA序列在SEQ ID NO:65中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、D331E(mRNA序列在SEQ IDNO:64中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。
图19B-19G中的这些数据显示，用编码在PCSK9结合位点中具有变体的LDLR的LDLRmRNA转染的细胞不能响应于外源PCSK9，从而显示这些结合性突变体可以在体内比野生型LDLR具有更长的半寿期并且可用于治疗高胆固醇血症患者。
实施例24.渐增PCSK9量对细胞表面LDLR的影响
为了评价添加至完全细胞培养基的渐增量PCSK9对细胞表面LDLR表达的下调作用，将MEM(GlutaMAX,Life Science,目录号41090-036)用10％胎牛血清补充。将HEK293细胞按300,000个细胞/孔铺种，温育6小时，并用300ng野生型LDLR mRNA(mRNA序列在SEQ IDNO:738中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或编码PCSK9结合突变体的LDLR mRNA转染15小时。制备和检验的PCSK9结合突变mRNA序列包含N316A(mRNA序列在SEQ ID NO:66中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)和D331E(mRNA序列在SEQ ID NO:64中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)的单氨基酸置换变体。还使用编码UGT1A1的对照mRNA(mRNA序列在SEQ ID NO:740中显示；大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。
在温育15小时后，将细胞单层洗涤并且添加单独的缓冲液或含有渐增量PCSK9的缓冲液。将细胞温育5小时并且通过流式细胞术如上文所述测量细胞表面LDLR表达。如图20中显示，PCSK9在用野生型LDLR mRNA转染的细胞中以剂量-依赖性方式减少细胞表面LDL受体。LDLR的最大减少在在20μg/ml外源PCSK9时实现。相比之下，PCSK9对用编码PCSK9结合缺陷型变体N316A或D331E的LDLR mRNA转染的细胞中的细胞表面LDLR没有影响。在用编码UGT1A1的mRNA转染的HEK293细胞中未检测到细胞表面LDLR。这些数据显示，从编码在PCSK9结合位点中的变体的LDLR mRNA表达的LDLR对不外源PCSK9敏感。
实施例25.LDLR的肝脏细胞转导制剂
使用本领域已知、本文所述和/或在通过引用方式完整并入本文的名为“修饰的核苷、核苷酸和核酸组合物”的国际专利公开号WO2013090648中描述的方法，配制脂质纳米粒子(LNP)。本文所用的LNP可以包含可解离脂质DLin-KC2-DMA或阳离子脂质C12-200。
编码LDLR或LDLR突变体的修饰的mRNA(例如，SEQ ID NO:63-69；至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1；用本文所述的至少一种化学性修饰所修饰)配制在包含DLin-KC2-DMA或C12-200的LNP中。将配制的LDLR或LDLR突变体施用至野生型小鼠和LDLR缺陷型小鼠。在施用修饰的mRNA后以预定时间间隔，使用本领域已知或本文所述的方法测量LDLR在野生型和LDLR缺陷小鼠的肝脏细胞中的表达。
实施例26.递送LNP配制的修饰的mRNA
将萤光素酶mRNA(mRNA序列在SEQ ID NO:741中显示；大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5'帽，帽1)用5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰、用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰、用假尿苷完全修饰、用1-甲基假尿苷完全修饰、或者25％的尿苷残基用2-硫代尿苷修饰并且25％的胞嘧啶残基用5-甲基胞嘧啶修饰。随后将萤光素酶mRNA配制在包含阳离子脂质DLin-KC2-DMA(KC2)或C12-200的脂质纳米粒子中。如表13中所概述，将PBS中的配制LNP或单独的对照PBS静脉内施用于LDLR-/-小鼠或正常小鼠。在注射后2小时、8小时、24小时和48小时对小鼠成像。在成像之前10分钟用D-萤光素溶液以150mg/kg腹腔内注射小鼠。随后将动物麻醉并且用IVIS Lumina II成像系统(Perkin Elmer)获得图像。
表13.给药方案
实施例27.体内研究LDLR的小鼠模型
使用插入LDLR受体基因的外显子4中的neo盒，从C57BL/6背景品系形成一个小鼠模型(LDLR-/-小鼠)。该小鼠模型具有升高的血清胆固醇的水平200-400mg/dl(80-100mg/dl视为正常水平)，并且当饲以高脂膳食时升高到大于200mg/dl。
实施例28.LDLR的体内研究
在包含C12-200(摩尔比40％)、胆固醇(摩尔比25％)、PEG脂质(摩尔比5％)和DSPC(摩尔比30％)的脂质纳米粒子中配制1.1mg/kg的人LDLR mRNA(SEQ ID NO:63；大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或萤光素酶(SEQ ID NO:741；大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。脂质纳米粒子的平均大小是105nm，PDI为0.15，在pH 7.4的δ是0.7mV，包封效率(RiboGreen)是55％并且总脂质对修饰mRNA的质量比是20:1。将配制的mRNA以100uL静脉内施用。使用1.4ng/ml重组人LDLR作为对照。在施用后6小时和24小时收获肝脏，并且使用Licor蛋白质印迹法和CE测定法产生并分析微粒体制备物(microsomal preparation)。对于CE测定法，将浓度对钙联蛋白上样对照归一化。在施用后6小时和24小时看到LDLR表达。
实施例29.LDLR变体的体内研究
A.小鼠LDLR
配制编码小鼠LDLR双突变体(PCSK9和IDOL变体)的mRNA、编码小鼠LDLR PCSK9突变体的mRNA、编码小鼠LDLR IDOL突变体的mRNA和编码小鼠野生型LDLR的mRNA，并且施用至LDLR-/-小鼠。样品在施用后2、4、5、6、8和/或24小时采集并使用本领域已知的方法(例如，CE测定法或蛋白质印迹法)评价表达。
为了确定多次施用的影响，将最有前景的LDLR突变构建体的mRNA反复施用至小鼠(例如，3个连续剂量)。采集施用后2、4、5、6、8和/或24小时的样品并使用本领域已知的方法(例如，CE测定法或蛋白质印迹法)评价表达。
为了确定多次施用和双突变体的影响，将编码小鼠LDLR双变体(N317A和K832R)的mRNA反复施用至小鼠(例如，3个连续剂量)。采集施用后2、4、5、6、8和/或24小时的样品并使用本领域已知的方法(例如，CE测定法或蛋白质印迹法)评价表达。
B.人LDLR
配制编码人LDLR双突变体(PCSK9和IDOL变体)的mRNA、编码人LDLR PCSK9突变体的mRNA、编码人LDLR IDOL突变体的mRNA和编码小鼠野生型LDLR的mRNA并且施用至LDLR-/-小鼠。样品在施用后2、4、5、6、8和/或24小时采集并使用本领域已知的方法(例如，CE测定法或蛋白质印迹法)评价表达。
实施例30.PCSK9/IDOL LDLR变体的体内研究
向LDLR-/-小鼠静脉内施用在包含C12-200(摩尔比40％)、胆固醇(摩尔比25％)、PEG2000-DOMG脂质(摩尔比5％)和DSPC(摩尔比30％)的脂质纳米粒子中配制的100μl0.5mg/kg、0.1mg/kg或0.05mg/kg小鼠LDLR mRNA(SEQ ID NO:742；大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、小鼠LDLR突变体1(包含突变N317A、K832R和C841A，如与野生型序列(SEQ ID NO:742)mRNA相比(SEQID NO:724；大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰))、小鼠LDLR突变体2(包含突变L340D、K832R和C841A，如与野生型序列(SEQ ID NO:742)mRNA相比(SEQ ID NO:733；大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰))或小鼠IDOL突变体(包含突变K832R和C841A，如与野生型序列(SEQ ID NO:742)mRNA相比(SEQ ID NO:734；大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰))。脂质纳米粒子的平均大小是105nm，PDI为0.15，在pH 7.4的δ是0.7mV，包封效率(RiboGreen)是55％并且总脂质对修饰mRNA的质量比是20:1。在包含胆固醇、DSPC和PEG2000-DOMG(40:25:30:5摩尔比)的C12-200脂质纳米粒子中配制0.5mg/kg萤光素酶对照(SEQ ID NO:741；大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)，使用野生型小鼠LDLR标准和重组小鼠LDLR标准作为对照。在施用后6小时收获24小时施用后的肝脏并且使用Licor蛋白质印迹法产生微粒体制备物。如图21和表14中所示，在评价的全部浓度，小鼠LDLR变体均表达得比野生型LDLR更好。
表14.小鼠LDLR的表达
实施例31.LDLR IDOL结合突变体体外研究
在HeLa和Hepa1-6中转染100ng编码LDLR的野生型小鼠mRNA(SEQ ID NO:742；大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)和小鼠LDLR突变体1(包含突变N317A、K832R和C841A，如与野生型序列(SEQ ID NO:742)mRNA相比(SEQ ID NO:724；大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5’帽，帽0；用1-甲基假尿苷完全修饰))。细胞还用100uL中的100ng萤光素酶mRNA(SEQ ID NO:741；大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或100uL中的1.1mg/kg IDOLmRNA(SEQ ID NO:743；大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾在序列中未显示；5’帽，帽1；用1-甲基假尿苷完全修饰)转染。在14小时后通过流式细胞术分析LDLR表达。
如表15中所示，小鼠LDLR突变体1显示抵抗IDOL介导的LDLR下调作用。在Hepa1-6中，随小鼠IDOL共转染的小鼠LDLR野生型减少到16.7％的基线，小鼠LDLR突变体1减少到62.9％的基线表达并且野生型LDLR减少到62.3％的基线。在HeLa细胞中，随小鼠IDOL共转染的小鼠LDLR野生型减少到50.5％的基线，小鼠LDLR突变体1减少到84.2％的基线表达并且HeLa中野生型LDLR表达微弱至不表达。
表15.LDLR表达
其他实施例
应当理解，已经使用的词是描述性词汇，而非限制性作用的，并且可以所附权利要求书的范围内作出改变，而在其更宽方面不脱离本发明的实际范围和精神。
尽管已经就几个所述的实施方案而言相当详尽且相当特定的描述了本发明，但不希望的是本发明被限于任何这类细节或实施方案或任何具体实施方案，而是它将参考所附权利要求加以解释，从而考虑现有技术而提供这类权利要求的最广泛可能解释并因此将有效涵盖本发明的预期范围。
本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用方式完整地并入。在矛盾的情况下，本说明书(包括定义)将居主导。此外，章节标题、材料、方法和实施例仅为示例性的，而不意在限制。

Claims (21)

1.编码低密度脂蛋白受体(LDLR)的多核苷酸，其中所述LDLR包含在选自EGF-A结构域、胞内结构域以及所述EGF-结构域和胞内结构域两者的结构域中的至少一个突变，其中，所述多核苷酸包含；
(a)连接的核苷的第一区域，所述第一区域编码目的多肽，所述目的多肽选自SEQ IDNO:37-55和724-729；
(b)第一侧翼区，其相对于所述第一区域位于5’，包含至少一个5’末端帽；
(c)第二侧翼区，其相对于所述第一区域位于3’，包含连接的核苷的加尾序列；并且
其中所述多核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中连接的核苷的第一区域至少包含核酸序列的开放阅读框，其中所述核酸序列选自SEQ ID NO:56-718和732-737。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述目的多肽包含至少两个突变。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述至少两个突变位于所述胞内结构域内。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述两个突变选自K816R、K830R和C839A。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述两个突变是K830R和C839A。
7.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述目的多肽包含在所述胞内结构域中的三个突变，并且所述三个突变是K816R、K830R和C839A。
8.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述目的多肽包含在所述EGF-A结构域中的一个突变和在所述胞内结构域中的至少两个突变。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中在所述EGF-A结构域中的一个突变选自N316A和L339D，在所述胞内结构域中的至少两个突变选自K816R、K830R和C839A。
10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中在所述EGF-A结构域中的一个突变是N316A，所述胞内结构域包含突变K830R和C839A。
11.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中在所述EGF-A结构域中的一个突变体是N316A，所述胞内结构域包含突变K816R、K830R和C839A。
12.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中在所述EGF-A结构域中的一个突变体是L339D，所述胞内结构域包含突变K830R和C839A。
13.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中在所述EGF-A结构域中的一个突变体是L339D，胞内结构域包含突变K816R、K830R和C839A。
14.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述结构域是胞内结构域，并且所述至少一个突变阻止IDOL降解LDLR。
15.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述至少一个化学修饰的核苷选自表5的修饰。
16.根据权利要求15所述的多核苷酸，其中表5的所述修饰是尿苷修饰。
17.根据权利要求15所述的多核苷酸，其中表5的所述修饰是胞苷修饰。
18.根据权利要求15所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含两个化学修饰的核苷。
19.根据权利要求18所述的多核苷酸，其中第一化学修饰的核苷是尿苷，第二化学修饰的核苷是胞嘧啶。
20.调节受试者血浆中胆固醇水平的方法，所述方法包括使所述受试者与包含权利要求1-19所述的任一种多核苷酸的组合物相接触。
21.用于增加细胞表面上LDLR的水平或数量的方法，所述方法包括使所述受试者与包含权利要求1-19所述的任一种多核苷酸的组合物相接触。
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