JP2007509040A - 先天性免疫及び抗体依存性細胞傷害を強化するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
免疫刺激性核酸を有する陽イオン性リポソームは先天性免疫応答を刺激することが示され、そして抗体依存性細胞傷害及び標的細胞溶解を劇的に向上させるために、このようなリポソーム核酸及び処置用抗体の相乗的組み合わせが提供される。
Description
関連出願
本出願は、2004年10月4日付けで出願された米国特許仮出願第(未定)号;及び2004年2月6日付けで出願された米国特許仮出願第60/542,754号;及び2003年10月11日付けで出願された米国特許出願第60/510,799号の優先権を主張する。
本出願は、2004年10月4日付けで出願された米国特許仮出願第(未定)号;及び2004年2月6日付けで出願された米国特許仮出願第60/542,754号;及び2003年10月11日付けで出願された米国特許出願第60/510,799号の優先権を主張する。
本発明は、抗体処置、そしてさらに具体的には、先天性免疫応答を刺激することによるそれらの効果を強化することに関する。
先天性免疫は、感染後又は癌の発生後に急速に起こるそれらの免疫応答を指す。それらは病原体又は悪性細胞に対する前感作を伴わずに開始し、抗原特異的ではなく、マクロファージなどの食細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞などの細胞傷害性細胞、及び樹状細胞(DC)などの抗原提示細胞によって直接的に介在され、同様に、これらの細胞によって産生されたサイトカインにより間接的に介在される。適応免疫は、初期感染又は癌発生後の発達に幾分かの時間を要し、且つ免疫細胞の学習を伴い、その結果、高度に特異的で、極めて強力且つ長寿命の応答の発達をもたらすそれらの応答を指す。これは、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、ヘルパーTリンパ球及び抗体産生Bリンパ球により介在される。これらのラインに沿って、適応免疫応答は細胞性(CTLにより介在されるもの)又は体液性(抗体が介在する応答)いずれかに分類され、ヘルパーTリンパ球は両方の応答を促進する。同時に、急速な先天性免疫応答は、疾患の早期拡大を抑制するのに機能し、そして適応免疫応答の発達を促進し、一方、極めて強力で、特異的且つ長寿命の適応応答は疾患の除去及び再発の防止に貢献する。
先天性免疫及び適応免疫は独立の現象としてしばしば考えられてきたが、例えば先天性免疫応答が適応免疫を開始するという事実を含め、それらをつなげる多くの橋(bridge)が存在する。それらを関連付ける別の方法は、抗体依存性細胞傷害(「ADCC」)として知られているプロセスを経由する。ADCCは、主にNK細胞及びマクロファージといった先天性免疫システムの細胞が、表面に抗体を結合させている標的細胞(すなわち、オプソニン化された細胞)を特異的に認識し、そして攻撃することを可能とするプロセスを伴う。これは、抗体のFc領域を認識しそして結合するこれらの先天性免疫細胞上の特異的受容体の存在により介在される。この結合は、標的細胞の認識を可能にし、そして標的細胞の殺傷を引き起こすその細胞の細胞傷害機序も誘発する。
癌免疫療法の有望且つ急速に発達している領域は、腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体を利用し、腫瘍の根絶を目的として免疫エフェクター機序を利用することに集中している。マウス由来の抗体のヒト型化における進歩は、この分子に対する拒絶免疫応答を減少させ又は実質的に排除することにより、これらの分子の処置薬としての実用性を大いに改善してきた。これらの中で典型的なものは、Herceptin(登録商標)(転移性肺癌に対して開発されたCDR移植抗Her2/neu抗体)、及びRituxan(登録商標)(非ホジキンリンパ腫のためのキメラ型抗CD20抗体)である。
作用の具体的様式は各抗体に対して異なるが、それらは一般的に直接的作用(例えば、成長又は生存又はアポトーシスの直接的誘導に必要な細胞表面の受容体の関与の遮断)と間接的作用(例えば、免疫介在性応答の誘導)の組み合わせである。これらの免疫介在性作用は、特異的にADCCの介在及び補体介在性溶解の誘導を含む。不運なことに、mAbsはその特異性が極度に高いという有利性を有しているが、それらの可能性は有限である。従って、当業界においては、それらの投与により生み出される抗腫瘍免疫応答の効力を強化することで、この部類の処置薬の効果を改善する著しい必要性が残されている。
関連文献の要約
当業界では、1又は複数の非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含有するオリゴヌクレオチドは、有効な免疫刺激剤として説明されてきた。例えば、米国特許第6,194,388号;6,207,646号;6,239,116号;6,653,292号;6,429,199号;及び6,426,334号を参照されたい。脊椎動物のDNAで見いだされるメチル化シトシン残基の頻度が高くなると、メチル化CpGsが脊椎動物の免疫システムにおいて重要な応答を誘導するのを妨げるであろうという認識が原因で、一般に、メチル化CpGオリゴヌクレオチドの潜在的免疫刺激特性の大部分が見落とされてきた。Messina他 , J.Immunol. 147:1759(1991)を参照されたい。潜在的免疫刺激性を有する遊離型メチル化CpGオリゴヌクレオチドに関するいくつかの報告がなされてきたが、それらの基礎をなすデータの分析はそれらの活性の広範な主張をサポートしていない。国際公開第02/069369号(データは多重メチル化CpGを有するオリゴヌクレオチドの制限された活性を実証している)を参照されたい。最近では、オリゴヌクレオチドなどの脂質カプセル化(encapsulation)が適応免疫応答におけるそれらの免疫刺激特性を改善することが示されてきている。例えば、同時係属米国特許出願第10/437,275号を参照されたい。
当業界では、1又は複数の非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含有するオリゴヌクレオチドは、有効な免疫刺激剤として説明されてきた。例えば、米国特許第6,194,388号;6,207,646号;6,239,116号;6,653,292号;6,429,199号;及び6,426,334号を参照されたい。脊椎動物のDNAで見いだされるメチル化シトシン残基の頻度が高くなると、メチル化CpGsが脊椎動物の免疫システムにおいて重要な応答を誘導するのを妨げるであろうという認識が原因で、一般に、メチル化CpGオリゴヌクレオチドの潜在的免疫刺激特性の大部分が見落とされてきた。Messina他 , J.Immunol. 147:1759(1991)を参照されたい。潜在的免疫刺激性を有する遊離型メチル化CpGオリゴヌクレオチドに関するいくつかの報告がなされてきたが、それらの基礎をなすデータの分析はそれらの活性の広範な主張をサポートしていない。国際公開第02/069369号(データは多重メチル化CpGを有するオリゴヌクレオチドの制限された活性を実証している)を参照されたい。最近では、オリゴヌクレオチドなどの脂質カプセル化(encapsulation)が適応免疫応答におけるそれらの免疫刺激特性を改善することが示されてきている。例えば、同時係属米国特許出願第10/437,275号を参照されたい。
発明の概要
驚いたことに、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームと併せて抗体を投与することで、標的細胞の溶解をもたらす抗体処置の効果を劇的に向上できることが発見された。本明細書中で最初に実証されているように、処置用抗体及びこのようなリポソーム核酸の同時投与は、標的細胞溶解における強力な相乗的向上を提供する。理論により拘束されるものではないが、陽イオン性リポソームによる免疫刺激性核酸の送達が、先天性免疫応答そして特に抗体依存性細胞傷害の顕著な強化をもたらすようである。
驚いたことに、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームと併せて抗体を投与することで、標的細胞の溶解をもたらす抗体処置の効果を劇的に向上できることが発見された。本明細書中で最初に実証されているように、処置用抗体及びこのようなリポソーム核酸の同時投与は、標的細胞溶解における強力な相乗的向上を提供する。理論により拘束されるものではないが、陽イオン性リポソームによる免疫刺激性核酸の送達が、先天性免疫応答そして特に抗体依存性細胞傷害の顕著な強化をもたらすようである。
従って、一つの側面において、本発明は抗体依存性細胞傷害を強化しそして被験体中で標的細胞の溶解を介在するための組成物を提供する。ここでこの組成物は、処置用抗体及び免疫刺激性核酸、好ましくはオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、より好ましくは少なくとも1つのCpGモチーフ含むODN、そして最も好ましくは少なくとも1つのメチル化CpGを含むODNを含んだ陽イオン性リポソーム、を含んで成る。具体的実施態様においいて、ODNは核酸配列5'TAAZGTTGAGGGGCAT3'(ODN1m)(配列番号:4)を含んで成る。別の具体的実施態様において、ODNは核酸配列5'TTCCATGAZGTTCCTGAZGTT3'(ODN2m)(配列番号:31)を含んで成る。核酸は、陽イオン性リポソームと複合体を形成し又は陽イオン性リポソームによりカプセル化されることができ、好ましくは陽イオン性リポソームにより完全にカプセル化される。
処置用抗体はモノクローナル又はポリクローナルであることができ、そして病原体抗原及び腫瘍関連抗原を含む着目の任意の標的抗原を対象にすることができる。本明細書中で説明する組成物及び方法において使用する好ましい処置用抗体としては、抗CD20抗体(例えば、Rituxan(登録商標)、Bexxar(登録商標)、Zevalin(登録商標))、抗Her2/neu抗体(例えば、Herceptin(登録商標))、抗CD33抗体(例えば、Mylotarg(登録商標))、抗CD52抗体(例えば、Campath(登録商標))、抗CD22抗体、抗EGF−R抗体(Erbitux(登録商標))、抗HLA−DR10β抗体、抗MUC1抗体、抗T細胞抗体(Thymoglobulin(登録商標)、Simulect(登録商標)、OKT3(登録商標))などが挙げられる。
別の側面において、本発明は、哺乳類の被験体中の標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害を誘導する改善された方法を提供する。この改善された方法は、免疫刺激性核酸、好ましくはメチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含む陽イオン性リポソームを用いてex vivo又はin vivoで被験体のNK細胞を活性化すること、及び標的細胞抗原に対する処置用抗体を用いてin vivoで標的細胞をオプソニン化することを含んでなる;ここで、活性化されたNK細胞はin vivoで処置用抗体のFc部分に結合する。好ましい実施態様において、標的細胞は腫瘍細胞であり、そして標的細胞抗原は腫瘍関連抗原である。
腫瘍細胞を溶解するための方法もまた提供される。この方法は、処置用抗体及び免疫刺激性核酸、好ましくは少なくとも1つのメチル化CpGジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチドを含む陽イオン性リポソームを、腫瘍細胞を有する患者に投与することを含む。ここで、抗体依存性細胞傷害をもたらすために処置用抗体は腫瘍細胞に関連する表面膜抗原に結合し、陽イオン性リポソームは患者のNK細胞を動員し(mobilize)そして活性化する。処置用抗体及び陽イオン性リポソームは同時に又は順に投与することができる。特に好ましい実施態様においては、陽イオン性リポソームは抗体より前に投与する。
本明細書中では、腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体を用いて癌患者を処置するための改善された方法も提供される。この改善は、免疫刺激性核酸、好ましくはメチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含む陽イオン性リポソームを用いて患者を前処置することを含む。ここで、この前処置は、抗体依存性細胞傷害をもたらすために患者のNK細胞の動員及び活性化を引き起こす。具体的実施態様において、癌はリンパ腫であり、モノクローナル抗体はリツキシマブである。別の具体的実施態様において、癌は乳癌であり、処置用抗体はトラスツズマブである。
更なる側面において、本発明は、被験体中の標的細胞の溶解を介在するためのキットを提供する。このキットは、標的細胞抗原に対する処置用抗体及び免疫刺激性核酸、好ましくはオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、より好ましくは少なくとも1つのCpGモチーフ含むODN、そして最も好ましくは少なくとも1つのメチル化CpGを含むODNを含んだ陽イオン性リポソームを含んで成る。処置用抗体及び陽イオン性リポソームは、同一の又は別々のバイアルにおいて提供することができる。好ましい実施態様において、標的細胞は腫瘍細胞であり、標的細胞抗原は腫瘍関連抗原である。
本発明は、免疫刺激性核酸、好ましくは少なくとも1つのメチル化CpGジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチドを含む陽イオン性リポソームによりex vivo又はin vivoで活性化された処置用の哺乳類NK細胞にも関連する。ここで、この活性化されたNK細胞は、腫瘍関連抗原に対する処置用抗体のFc領域に結合する。本明細書中では、腫瘍細胞を溶解するための方法も提供される。この方法は、上記の腫瘍関連抗原に対する処置用抗体及び活性化された哺乳類NK細胞を含む。
発明の詳細な説明
本明細書中で説明されている本発明は、抗体処置の効果の劇的な向上に関する。ここでこの向上は、所望の標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害(ADCC)応答を顕著に増加させるための、処置用抗体と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの投与を含む。本明細書中で実証されているように、対象の陽イオン性リポソームの投与は、ナチュラルキラー(NK)細胞及びマクロファージの動員、増殖及び/又は活性化を引き起こす。NK細胞及びマクロファージの2つは、ADCC活性に関与する主なエフェクター集団である。
本明細書中で説明されている本発明は、抗体処置の効果の劇的な向上に関する。ここでこの向上は、所望の標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害(ADCC)応答を顕著に増加させるための、処置用抗体と組み合わせた免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの投与を含む。本明細書中で実証されているように、対象の陽イオン性リポソームの投与は、ナチュラルキラー(NK)細胞及びマクロファージの動員、増殖及び/又は活性化を引き起こす。NK細胞及びマクロファージの2つは、ADCC活性に関与する主なエフェクター集団である。
従って、1つの側面において、本発明は、標的抗原に対する免疫応答、より好ましくは先天性免疫応答、そしてさらにより好ましくはADCC応答を刺激するための方法及び組成物を提供する。1つの実施態様において、NK細胞の動員、増殖及び活性化を誘導する組成物及び方法が提供される。本明細書中で説明されているように、対象の組成物の投与後に、特に脾臓のNK細胞の劇的且つ急速な再分布が観察され、それらを高い腫瘍負荷部位へのホーム(home)及び局在に利用することができる末梢血液NKコンパートメント(compartment)の増殖を引き起こす。NK細胞のこの急速な動員及び増殖と同時に、NK細胞集団の急速な活性化が起こることが、細胞活性化マーカーの発現及び上昇した細胞溶解活性の両方により決定された。対象の組成物を用いた処理は、末梢血液及び脾臓コンパートメントから得たNK細胞の表面上におけるCD69などの活性マーカーの発現を上昇させた。
本明細書中で実証されているように、未処理動物から得た細胞と比較して、対象の方法により得た活性化されたNK細胞が細胞溶解活性を強化することが、4時間のクロム遊離細胞傷害性アッセイにおける標準的標的細胞であるYAC−1に対する活性により決定された。興味深いことに、対象の脂質製剤により活性化された細胞は、P815腫瘍細胞系に対する強化された細胞傷害性を示さなかった。この標的細胞は、サイトカイン活性化キラー細胞における強化された活性の検出にしばしば使用される。これは、核酸及びサイトカイン両方がNK細胞を活性化し、そしてより高い細胞溶解活性を誘導する一方で、その得られた活性は質的に異なることを示唆しており、これら2つの活性ストラテジーは相補的(complementary)及び/又は相乗的である可能性を高めている。さらに、これらの核酸活性化免疫細胞はADCC活性のレベルの強化を介在した。腫瘍細胞の表面上の抗原に対するmAbsの存在が、未処理動物から得た免疫細胞の腫瘍細胞を認識し破壊する能力を強化することを見いだしたのと同時に、陽イオン性リポソームで調製された核酸のin vivoでの投与が、様々な組織コンパートメントから得た免疫細胞によるADCC活性の劇的且つ相乗的な強化をもたらし、mAbsの存在下で腫瘍細胞に対する細胞傷害性を上昇させた。細胞分離実験により実証されているとおり、この強化されたADCC活性がそのNK細胞集団内にほぼ完全に備わっていた。
従って、別の側面において、本発明は抗体により介在される免疫応答(特にADCCを含む)を強化することで、抗体処置の活性を増強しそれによりそれらの処置効果を増強するための組成物及び方法を提供する。本明細書中で説明される組成物及び方法は、ADCC機序により既に作用する抗体活性を増大させることができ、また付加的なエフェクター機序を代替経路によって作用するそれらの抗体に加えることができ、そして非処置用抗体に抗腫瘍活性を潜在的に付与することができる。好ましい実施態様においては、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームは抗体処置と組み合わされて、抗体処置の標的に対するより強力な免疫応答を誘導する。この組成物によっては、サイトカインなどの付加的な成分、付加的な処置薬及び/又は他の成分を用いるが、これらの付加的な成分は全ての使用に対して必要というわけではない。
本明細書中で実証されているように、対象の免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの投与が、いくつかの許容された動物モデルにおいて、様々なmAbsの効果を強化することを見出した。ヒトB細胞リンパ腫細胞系であるNamalwaを用いてチャレンジし、そして免疫刺激性核酸及び様々な用量の抗CD20mAbを含む陽イオン性リポソームで処理したSCIDマウスのヒト異種移植モデルにおいては、mAbs単独(18−31% ILS)又は核酸単独(寿命が112%増加)を用いて処理した未処理の動物と比較して、その組み合わせによる処理がこれらの動物の生存を強化すること(寿命又はILSにおいて、>270%の増加)を見出した。同様に、C57BI/6−EL4胸腺腫静脈及び皮下モデルにおいて、脂質で調製された核酸及びmAb(この場合、ガングリオシドGD2に対して特異的な)の組み合わせが、どちらの単独処理よりも、生存の強化及び腫瘍成長の阻害においてそれぞれ処置上の有利性を示した。
本発明は、製剤及びその使用方法を提供する。これは、特にメチル化オリゴヌクレオチドを含む核酸、そしてより詳細にはメチル化CpGジヌクレオチドモチーフを有する核酸が、それらを陽イオン性リポソーム中に含有させることによって、in vivoで劇的に先天性免疫応答を強化することができるという発見に基づいている。
1つの実施態様において、免疫刺激性核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む。好ましい実施態様において、核酸は1つのCpGジヌクレオチドを含み、ここでこのCpGジヌクレオチド中のシトシンはメチル化されている。具体的実施態様において、核酸は配列5'TAACGTTGAGGGGCAT3'(ODN1m)を含む。代わりの実施例において、核酸は少なくとも2つのCpGジヌクレオチドを含み、ここでこのCpGジヌクレオチド中の少なくとも1つのシトシンはメチル化されている。さらなる実施態様において、配列中に存在するCpGジヌクレオチド中の各シトシンがメチル化されている。別の具体的実施態様において、核酸は配列5'TTCCATGACGTTCCTGACGTT3'(ODN2m)を含む。別の実施態様において、核酸は複数のCpGジヌクレオチドを含み、ここでこのCpGジヌクレオチドの少なくとも1つはメチル化シトシンを含む。本明細書中で実証されているように、メチル化シトシンを含む唯一のCpGジヌクレオチドを有する核酸、又はこのCpGジヌクレオチドの唯一の若しくは2〜3のシトシンがメチル化されている多くのCpGジヌクレオチドを利用して、先天性免疫応答の効果的な刺激を獲得することができる。
本発明の多様な製剤の詳細な製造方法、使用方法及び試験方法については、以下及び本明細書中で引用されている引用文献(それらの全ては引用文献として組み込まれている)において説明されている。
略語及び定義
下記の略語は本明細書中で使用される:
下記の略語は本明細書中で使用される:
RBC、赤血球;
DDAB、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロマイド;
DODAC、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロライド;
DOPE、1,2−sn−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン;
DOSPA、2,3−ジオレイロキシ−N−(2(スペルミンカルボキサミド)エチル)−N,N−ジメチル−1−プロパナミニウムトリフルオロアセテート;
DOTAP、1,2−ジオレオイロキシ−3−(N,N,N,−トリメチルアミノ)プロパンクロライド;
DOTMA、1,2−ジオレイロキシ−3−(N,N,N−トリメチルアミノ)プロパンクロライド;
OSDAC、N−オレイル−N−ステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムクロライド;
RT、室温;
HEPES、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸;
FBS、ウシ胎児血清;
DMEM、ダルベッコ改変イーグルス培地;
PEG−DMG 3−O−[2'−(w−モノメトキシポリエチレン グリコール2000)スクシノイル]−1,2−ジミリストイル−sn−グリセロール
PEG−Cer−C14、1−O−(2'−(オメガ-メトキシポリエチレングリコール)サクシノイル)−2−N−ミリストイル-スフィンゴシン;
PEG−Cer−C20、1−O−(2'−(オメガ-メトキシポリエチレングリコール)サクシノイル)−2−N−アラキドイル-スフィンゴシン;
PBS、リン酸緩衝生理食塩水;
THF、テトラヒドロフラン;
EGTA、エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)−テトラ酢酸;
SF−DMEM、無血清DMEM;
NP40、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール;
1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアミノプロパン(DODAP)、
パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC);及び
ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)。
本明細書中で使用される技術的及び科学的用語は、特段の断りのない限り、本発明が関係する分野の当業者に一般的に理解される意味を有する。本明細書中で、当業者に知られた多様な方法論について言及される。言及されるそのような知られた方法論を説明する刊行物及び他の資料はそっくりそのまま本明細書中に引用文献として組み込まれている。組換えDNA技術の一般的原理について説明している標準的な引用文献としては、Sambrook,J.,他 Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, N.Y.(1989); Mcpherson, M,J., Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford(1991); Jones, J., Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford(1992); Austen, B. M. 及び Westwood, O.M.R., Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford(1991)、が挙げられる。本発明を実施する上で、当業者に知られた任意の適切な材料及び/又は方法を使用することができる;しかし、好ましい材料及び/又は方法が説明されている。以下の記載及び実施例において言及される材料、試薬等は、特段の断りのない限り商業的な供給源から入手可能である。当業者は本明細書の記載に基づいて本発明を最大限活用できるだろう。本出願で引用される(引用文献、発行された特許、公開された特許出願、及び同時係属特許出願を含む)すべての引用文献の全内容は、本明細書により引用文献として明確で援用される。
本明細書中で提供される組成物及び方法は、少なくとも1つの免疫刺激性核酸、好ましくは少なくとも1つのメチル化核酸、より好ましくは少なくとも1つのメチル化オリゴヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも1つのメチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含んだ陽イオン性リポソームを含む。具体的実施態様において、メチル化シトシン残基はその配列中に位置するCpGジヌクレオチドモチーフの一部である。CpGは少なくとも1つのシトシンの4位の炭素(4−mC)又は5位の炭素(5−mC)に付着したメチル基又はヒドロキシメチル基を含む。さらなる実施態様において、Henry他の2000 J. Pharmacol. Exp. Ther. 292: 468、 Zhao他の1999 Bioorg. Med. Chem Lett. 9: 3453、Zhao他の2000 Biorg Med. Chem Lett. 10: 1051において説明されているように、メチル化核酸配列はデオキシリボース又はリボース糖部分のメチル化修飾を選択的に又は付加的に含むことができる。特に好ましい実施態様において、ODNは、非メチル化形態において免疫刺激活性を有し且つ免疫刺激性配列(「ISS」)と名づけられたメチル化核酸配列を含む。
本明細書中で使用される「処置用抗体」は、対象の処置において有利な効果を提供する、任意の合成、組み換え、又は天然の抗体を指す。免疫エフェクター機序によるその後の溶解のために、所望の標的細胞の表面膜抗原に結合し、標的細胞をオプソニン化することができる、処置用抗体が特に好ましい。適切な抗体処置薬は、腫瘍関連抗原及び病原体抗原に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を含む。典型的な処置用抗体としては、抗Her2/neu抗体、抗CD20抗体、抗CD33抗体、抗CD22抗体、抗EGF−R抗体、抗HLA−DR10β抗体、抗MUC1抗体、抗T細胞受容体抗体、などが挙げられる。
本明細書中で使用される「標的細胞抗原」は、処置用抗体を対象にすることができ、そしてADCC応答を対象にし且つ刺激することができる、着目の抗原を指す。好ましい抗原は表面膜抗原であり、腫瘍関連抗原及び病原体抗原を含む。
本明細書中で使用される「腫瘍関連抗原」は、腫瘍又は癌細胞に関連する分子又は成分(例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物及び/又はDNA)であり、MHC分子との関連において抗原提示細胞表面上に提示された場合、免疫応答を引き起こすことができる。腫瘍関連抗原は、自己抗原、並びに動物に投与した場合に特異的に癌と関連しないかもしれないが、それでもなお癌の成長に対する免疫応答の促進及び/又は癌の成長を減少させる他の抗原を含む。自己免疫応答の潜在的リスクに鑑みると、対象のワクチン中での自己抗原の使用は、乳房、前立腺、精巣、メラニン細胞などの決定的でない組織に限定することができる。より具体的な実施態様は本明細書中で提供される。
本明細書中で使用される「微生物抗原」は微生物の抗原である。微生物には、感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生生物及び感染性真菌を含むがこれらに限定されない。微生物抗原は、無傷の微生物及び天然の単離物、断片又はそれらの誘導体、天然の微生物抗原と同一又はこれに類似した合成成分であって、好ましくは(天然の微生物抗原がそれに由来する)対応する微生物に特異的な免疫応答を誘導するものであることができる。好ましい実施態様において、成分は、もしそれが天然の微生物抗原に対する(体液性及び/又は細胞性の)免疫応答を誘導するならば、天然の微生物抗原に類似する。天然の微生物抗原に類似する成分又は抗原は、当業者に周知である。天然の微生物抗原に類似する成分の制限されない例は、ポリサッカライド抗原のペプチド模倣体である。より具体的な実施態様は、本明細書中で提供される。
本明細書中で使用される「対象」又は「宿主」は、免疫系を有する雄性又は雌性の生物、好ましくは動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、なおより好ましくはげっ歯類、最も好ましくはヒトを指す。対象のさらなる例としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ及びラットが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される「患者」は、癌又は病原体感染などの病状(例えば、疾患又は病気)に対する処置を必要とする対象を指す。
本明細書中で使用される「in vivo」は、生物において、好ましくは哺乳動物において、より好ましくはげっ歯類において、最も好ましくはヒトにおいてということを指す。
本明細書中で使用される「免疫刺激性の」、「免疫刺激活性」又は「免疫応答を刺激する」及びそれらの文法的な同義語は、免疫応答を誘導、増加、強化、又は調節する、或いは他の方法で免疫応答に関して有益な効果を提供することを指す。好ましくは、そして従来技術中で報告されたin vitroでの実験結果における広い変動に鑑みて、所定の製剤及び核酸配列の免疫刺激活性は、本明細書に記載の適切なin vivoアッセイにおいて決定される。
本明細書中で使用される「アジュバント」は、免疫応答の刺激を刺激又は強化することのできる任意の物質を指す。いくつかのアジュバントは免疫系の細胞を活性化することができ、例えば、アジュバントは免疫系の細胞にサイトカインを産生させ、そして分泌させることができる。免疫細胞の活性化を引き起こすことのできるアジュバントの例としては、Q.サポナリア(Q. saponaria tree)の樹皮から精製されたサポニン、例えばQS21(HPLC分画の21番目のピーク中に溶出する糖脂質;Aquila Biopharmacueticals, Inc., Worcester, Mass.);ポリ(ジ(カルボキシラートフェノキシ)ホスファゼン(PCPPポリマー;Virus Research Institute, USA);モノホスホリルリピッドA(MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.)のようなリポポリサッカライド誘導体、ムラミルジペプチド(MDP; Ribi)及びトレオニル−ムラミルジペプチド(t−MDP; Ribi);OM-174(リピッドAに関連したグルコサミンジサッカライド;OM Pharma SA, Meyrin, Switzerland);及びレイシュマニア伸長因子(精製レイシュマニアタンパク質;Corixa Corporation, Seattle, Wash.)が挙げられるが、これらに限定されない。伝統的なアジュバントは当業界において周知であり、例えばリン酸アルミニウム又はヒドロキシド塩(「ミョウバン」)を含む。
「免疫刺激」又は「免疫応答の誘導」は介入に対する免疫系細胞又は成分の直接又は間接的な応答として広く特徴づけられている。これらの応答は免疫系細胞(B細胞,T細胞,樹状細胞、APC,マクロファージ,NK細胞,NKT細胞等)の活性化、増殖又は分化、マーカーの発現の上方制御もしくは下方制御、血清中へのサイトカイン、インターフェロン、IgMおよびIgGの放出、巨脾腫(脾臓の細胞質の増大を含む)、各種臓器の過形成および混合細胞性浸潤を含む多くの方法で測定することができる。さらに刺激又は応答は先天性の免疫細胞系細胞でも後天性免疫系細胞(たとえば、正常な弱い抗原を含有するワクチンによる)でもよい。本明細書中で実証されているように、対象のリポソーム核酸の投与は、NK細胞、マクロファージ及び先天性免疫システムのその他の重要な免疫エフェクター細胞の増殖及び活性化の両方を引き起こす。1つの実施態様において、その組成物はADCCなどの免疫エフェクター機序の改善における使用を見出す。好ましい実施態様において、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームは、処置用抗体との組み合わせで使用する場合に相乗作用をもたらす。
本発明の組成物及び方法は、免疫刺激性核酸を含んだリポソーム、そしてより好ましくは、陽イオン性リポソームを含む。このようなリポソームは、当業界で周知であり、単層リポソーム小胞、多重膜リポソーム小胞、脂質複合体及び脂質粒子を含むが、これらに限定されるわけではない。本明細書中では、1の脂質含有膜を有するリポソームは「単一層」と呼ばれる。複数の脂質含有膜を有するリポソームは、本明細書中では「多重層」と呼ばれる。本明細書中で使用される「脂質二重層」は、2の層を有する、脂質含有膜を指す。好ましい実施態様において、リポソームは多重層である。免疫刺激性核酸は、陽イオン性リポソームと複合体を形成するか又は陽イオン性リポソームによりカプセル化されることができ、そして最も好ましくは、陽イオン性脂質小胞内で完全にカプセル化される。
核酸
本発明の組成物及び方法における使用に適切な核酸は、例えば、DNA又はRNAを含む。好ましくは、核酸はオリゴヌクレオチド、より好ましくはオリゴデオキシヌクレオチド(ODNs)、そして最も好ましくはISSを含むODN(「ISS ODN」)である。好ましいISSは、例えば、ヘアピン型2次構造を導くいくつかのパリンドローム(Yamamoto S., 他(1992) J. Immunol. 148: 4072−4076、を参照されたい)、又はCpGモチーフ、及びその他の既知のISSの特徴を含む(マルチ−Gドメインなど、国際公開第96/11266号を参照されたい)。特に好ましい実施態様において、核酸はメチル化シトシンを有する少なくとも1つのCpGモチーフを含む。
本発明の組成物及び方法における使用に適切な核酸は、例えば、DNA又はRNAを含む。好ましくは、核酸はオリゴヌクレオチド、より好ましくはオリゴデオキシヌクレオチド(ODNs)、そして最も好ましくはISSを含むODN(「ISS ODN」)である。好ましいISSは、例えば、ヘアピン型2次構造を導くいくつかのパリンドローム(Yamamoto S., 他(1992) J. Immunol. 148: 4072−4076、を参照されたい)、又はCpGモチーフ、及びその他の既知のISSの特徴を含む(マルチ−Gドメインなど、国際公開第96/11266号を参照されたい)。特に好ましい実施態様において、核酸はメチル化シトシンを有する少なくとも1つのCpGモチーフを含む。
本明細書中で使用される「核酸」は、複数のヌクレオチド(すなわち、リン酸基及び交換可能な有機塩基に結合した糖(例えば、リボース又はデオキシリボース)を含む分子であり、置換ピリミジン(例えば、シトシン(C)、チミン(T)又はウラシル(U))又は置換プリン(例えば、アデニン(A)又はグアニン(G))のいずれかである)を指す。核酸は、例えば、DNA又はRNAであることができる。好ましくは、核酸はオリゴリボヌクレオチドであり、より好ましくはODNである。核酸は、ポリヌクレオシド、すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸塩を除いたもの、及び他の任意の有機塩基を含むポリマーであることもできる。
好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは一本鎖であり、5−50ヌクレオチド(「nt」)の範囲の長さである。しかしながら、例えば、500−50,000塩基対(「bp」)の範囲の大きな二本鎖プラスミドDNAを含む任意のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
本発明の組成物及び方法において有用な核酸は、知られた供給源から得ることができ、又は当業界において周知の方法を用いて単離することができる。核酸はまた、同様に当業界において周知の組換え方法又は合成方法によって調製することもできる。そのような核酸はその後、脂質粒子中に内包することができ、そして得られた組成物は本明細書中に記載された本発明の方法を用いて免疫刺激活性について試験することができる。
in vivoでの使用のためには、核酸は(例えば、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを介した)分解に対して耐性であることができる。ステムループのような二次構造は核酸を分解に対して安定化させることができる。或いは、核酸の安定化はリン酸塩骨格の修飾によって達成することができる。好ましい安定化された核酸は、少なくとも部分的にホスホロチオエート修飾された骨格(PS)を有する。ホスホロチオエートはホスホラミデート又はH−ホスホネートの化学作用のいずれかを用いる自動化された技術を利用して合成することができる。例えば、米国特許第4,469,863号中で説明されているように、アリール−ホスホネート及びアルキル−ホスホネートを生成することができ;そしてアルキルホスホトリエステル(米国特許第5,023,243号及びヨーロッパ特許第092,574号で説明されているように、荷電した酸素部分がアルキル化された)は、商業的に入手可能な試薬を用いて自動化された固相合成法によって調製することができる。他のDNA骨格の修飾方法及び置換方法が説明されている(Uhlmann 及び Peyman, Chem. Rev. 90:544, 1990; Goodchild, Bioconjugate Chem. 1:165, 1990)。しかし、本明細書中で実証されているように、このような修飾は、本発明の方法及び組成物の利用に対して必須ではない。
したがって、本発明の組成物及び方法において有用なオリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、並びにそれらを相互に組み合わせたもの及び/又はそれらとホスホジエステルオリゴヌクレオチドを組み合わせたものなどの修飾されたリン酸骨格を有することができる。さらに、他の修飾オリゴヌクレオチドとしては:アルキル−アリールリン酸塩及びアリールリン酸塩(その中の荷電したホスホネートの酸素がアルキル又はアリール基で置換されている)のような非イオン性DNAアナログ、その中の荷電した酸素部分がアルキル化されているホスホジエステル及びアルキルホスホトリエステルが挙げられる。細胞性免疫応答が望まれる場合にはPO ODNが好ましい、一方体液性免疫応答が望まれる場合には、PS ODNのような修飾ODNが好ましい。
塩基、糖又は結合部分への他の多くの化学的修飾もまた有用である。塩基はメチル化又は非メチル化であってよい。好ましい実施態様において、メチル基又はヒドロキシメチル基が、少なくとも1つのシトシンの4位の炭素(4−mC)又は5位の炭素(5−mC)に結合している。好ましくは、メチル化シトシンは、核酸配列中のCpGモチーフ内に位置する。或いは又はさらに、糖部分は、従来技術において説明されているように、メチル基で修飾することができる。
本発明の組成物及び方法において有用なヌクレオチド配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのように患者/対象のmRNAに相補的なものであることができ、或いはそれらは外来又は非相補的なもの(例えば、このヌクレオチド配列は患者/対象のゲノムに特異的にハイブリダイズしない。)であることができる。ヌクレオチド配列は発現されることができ、そして得られた発現産物はRNA及び/又はタンパク質であることができる。さらに、そのようなヌクレオチド配列は適切なプロモーター及び発現要素に連結することができ、発現ベクターに含まれることができる。本明細書中で使用される「非配列特異的」という用語は、非相補的であり、発現産物をコードしない核酸配列を指す。
本発明の核酸は、当業界において周知の任意の多数の方法を用いてデノボ合成することができる。例えば、b−シアノエチルホスホラミダイト法(Beaucage, S.L., 及び Caruthers, M.H. Tet. Let. 22:1859, 1981);ヌクレオシドH−ホスホネート法(Garegg 他., Tet. Let. 27:4051−4054, 1986; Froehler 他., Nucl. Acid. Res. 14:5399−5407, 1986,; Garegg 他., Tet. Let. 27:4055−4058, 1986, Gaffney 他., Tet. Let. 29:2619−2622, 1988)である。これらの化学反応は、市場で入手可能な多様な自動化されたオリゴヌクレオチド合成装置によって実施することができる。また、CpGジヌクレオチドもプラスミド中で大量に産生することができる(Sambrook, T. 他., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989を参照されたい)。そのようなプラスミドはまた、DNAワクチンの場合の抗原をコードする遺伝子のように、発現される他の遺伝子をコードすることもできる。オリゴヌクレオチドは制限酵素、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを用いるもののような既知の技術を利用して、現存の核酸配列(例えば、ゲノム又はcDNA)から調製することもできる。
in vivoでの投与のためには、例えば脂質成分又は核酸成分などの組成物の成分を含む本発明の組成物は、標的細胞(例えば、B細胞、単核球細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞)の表面とのより高い親和性での結合及び/又は標的細胞による細胞取り込みの増加をもたらす分子と結合させることができる。この組成物の成分を含む本発明の組成物は、当業界において周知の技術を用いて所望の分子とイオン結合又は共有結合させることができる。プロテインA、カルボジイミド、及びN−サクシニミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)などの多様なカップリング剤又は架橋剤を使用することができる。
生物中における核酸配列の免疫刺激活性は、例えば、問題の配列と他の免疫刺激剤(例えば、他のアジュバント又はISSなど)との比較など;或いは、問題の配列の免疫刺激活性の検出又は測定(例えば、宿主の防御機構の活性化又は免疫系成分の活性化の検出又は測定など)など、の単純な実験により決定することができる。そのようなアッセイは当業界において周知である。また、当業者は、本明細書中説明された及び/又は当業界において知られたありきたりのアッセイを使用して、着目の特定の哺乳動物種に対して有用な最適のオリゴヌクレオチドを同定する方法も知っているであろう。
本発明の組成物及び方法における使用に適した特定のODNの核酸配列は、米国特許出願第60/379,343号、同第09/649,527号、国際公開第02/069369号、同第01/15726号、米国特許第6,406,705号及びRaney 他, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 298:1185−1192(2001)において説明されており、それらは全て本明細書中に引用文献として組み込まれている。ODNの典型的な配列は、表1に示した核酸配列を含むが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法において使用するODNはホスホジエステル(「PO」)骨格又はホスホロチオエート(「PS」)骨格、及びCpGモチーフ中に少なくとも1つのメチル化シトシン残基を有する。
リポソーム
リポソーム及びそれらを調製する方法は当業界で周知であり、そして任意の多くのリポソーム製剤が本明細書中で有利な使用を見出すことができ、米国特許第6,465,439号;同第6,379,698号;同第6,365,611号;同第6,093,816号、及び第6,693,086号において説明されているものを含み、それらの開示は本明細書中に引用文献として組み込まれている。好ましいリポソームは陽イオン性脂質を含むリポソームであり、そしてさらにより好ましくは、本明細書中で説明される陽イオン性脂質小胞製剤及び例えば米国特許第5,785,992号;同第6,287,591号;6,287,591 B1;同時係属米国特許出願第60/379,343号、及び同時係属米国特許出願第09/649,527号においてより完全に説明される陽イオン性脂質小胞製剤であり、それらは全て本明細書中に引用文献として組み込まれている。
リポソーム及びそれらを調製する方法は当業界で周知であり、そして任意の多くのリポソーム製剤が本明細書中で有利な使用を見出すことができ、米国特許第6,465,439号;同第6,379,698号;同第6,365,611号;同第6,093,816号、及び第6,693,086号において説明されているものを含み、それらの開示は本明細書中に引用文献として組み込まれている。好ましいリポソームは陽イオン性脂質を含むリポソームであり、そしてさらにより好ましくは、本明細書中で説明される陽イオン性脂質小胞製剤及び例えば米国特許第5,785,992号;同第6,287,591号;6,287,591 B1;同時係属米国特許出願第60/379,343号、及び同時係属米国特許出願第09/649,527号においてより完全に説明される陽イオン性脂質小胞製剤であり、それらは全て本明細書中に引用文献として組み込まれている。
特に好ましい実施態様において、陽イオン性リポソームは、20:25:45:10モル/モルの比率のDSPC、DODMA、Chol、及びPEG−DMGを含む。本明細書中で使用されているように、モル量の各脂質は脂質が列挙されたのと同じ順番で与えられる(例えば、DSPC対DODMA対Chol対PEG−DMGの比率は20DSPC:25DODMA:45Chol:10PEG−DMG又は「20:25:45:10」である)。別の実施態様において、DSPCはPOPCで、DODMAはDODAPで、そしてPEG−DMGはPEGCer14又はPEGCer20で置換することができる。
「脂質」という用語は、脂肪酸エステルであって水中では不溶性であるが多くの有機溶媒中では溶解性であるという特徴を有する、有機成分の群を指す。それらは通常少なくとも3つのクラス:(1)脂肪及び油並びにワックスを含む「単純脂質」;(2)リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」;及び(3)ステロイド及び脂質の操作により誘導体化された成分などの「誘導体化脂質」、に分けられる。広く多様な脂質を本発明とともに使用することができ、そのうちのいくつかが以下で説明される。
「荷電された脂質」という用語は、正電荷若しくは負電荷を有する脂質種を指すか、又は正味で中性に荷電されず、かつ脂質が見つかる溶液のpHとの関連を一般的に必要とする双性イオンである脂質種を指す。
生理的pHにおいて正に荷電された脂質としては、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロライド(「DODAC」);N−(2,3−ジオレイロキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロライド(「DOTMA」);N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロマイド(「DDAB」);N−(2,3−ジオレイロキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロライド(「DOTAP」);3b−(N−(N',N'−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル)コレステロール(「DC−Chol」)及びN−(1,2−ジミリスチロキシプロプ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド(「DMRIE」)が挙げられる、これらに限定されない。さらに、本発明において使用されることのできる多くの陽イオン性脂質の市販調製物が入手可能である。これらは、例えば、Lipofectin(登録商標)(GIBCO/BRL、Grand Island, New York, U.S.A.から商業的に入手可能な、DOTMA及び1,2−ジオレオイル−sn−3−ホスホエタノールアミン(「DOPE」)を含む陽イオン性リポソームである);及びLipofectamine(登録商標)(商業的に入手可能な、N−(1−(2,3−ジオレイロキシ)プロピル)−N−(2−(スペルミンカルボキサミド)エチル)−N,N−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート(「DOSPA」)を含む陽イオン性リポソームである);を含む。
いくつかの正に荷電された脂質が滴定可能であり、すなわち、それらは生理的pH又はその付近でpKaを有し、弱酸性条件下で強く陽イオン性であり、生理的pHで弱く(又は非)陽イオン性であるという本発明に対して意味ある結果を有する。このような正に荷電された脂質としては、N−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N,N−ジメチルアンモニウムクロライド(DODMA)、及び1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウム−プロパン(DODAP)が挙げられるが、これらに限定されない。DMDMAもまた、有用な滴定可能な陽イオン性脂質である。
生理的pHにおいて陰イオン性に荷電された脂質としては、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ジホスファチジルグリセロール、ポリ(エチレングリコール)−ホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアリロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルリン酸、ジパルミトイルリン酸、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン等が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの負に荷電された脂質が滴定可能であり、すなわち、それらは生理的pH又はその付近でpKaを有し、弱塩基性条件下で強く陰イオン性であり、生理的pHで弱い(又は非)陰イオン性であるという本発明に対して意味ある結果を有する。こうした負に荷電した脂質は、本明細書中で開示される原理に基づいて当業者により同定されうる。
「中性脂質」という用語は、生理的pHにおいて荷電されない形態又は中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの任意の脂質種を指す。このような脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド及びジアシルグリセロールが挙げられる。
本発明において使用される特定の好ましい脂質製剤としては、PEG−脂質又は(ATTA−脂質のような)ポリアミドオリゴマー−脂質(ATTA−脂質など)、及び他の立体障害(steric barrier)又は「ステルス」−脂質、界面活性剤などのような凝集防止成分が挙げられる。そのような脂質は、米国特許第4,320,121号、同第5,820,873号、同第5,885,613号、国際公開第98/51278号、及びポリアミドオリゴマーに関する米国特許出願第09/218,988号中で説明され、これらはすべて本明細書中に引用文献として組み込まれている。これらの脂質及び界面活性成分は、反対に荷電された脂質及び処置剤を含む製剤の沈殿及び凝集を防止する。これらの脂質はまた、in vivoにおける循環寿命を向上させるのに用いることもでき(Klibanov 他.(1990) FEBS Letters, 268(1): 235−237を参照されたい)、又はそれらはin vivoにおける製剤からの迅速な交換のために選択されることができる(米国特許第5,885,613号を参照されたい。これは本明細書中に引用文献として組み込まれている)。
本発明の好ましい実施態様は、交換可能な立体障害脂質を用いる。(米国特許第5,820,873号、同第5,885,613号及び米国特許出願第09/094540及び米国特許第6,320,017号中で説明されている。それらのすべては引用文献として本明細書中で援用される。)PEG2000−CerC14及びATTA8−CerC14のような交換可能な立体障害脂質は、対象/患者に投与されると急速に脂質粒子の外側の一重層から交換する立体障害脂質である。そのような各脂質は、アシル鎖の長さ、飽和度、立体障害部分のサイズ、膜組成物及び血清組成物などを含む多様な因子に依存する、粒子から交換される速度に特徴を有する。上記の特許出願書類中で説明されているように、そのような脂質は粒子形成の間の凝集の防止において有用であり、投与の際それらの粒子からの促進された離脱は、プログラム可能な膜融合性及び粒子不安定化活性のなどの利益を提供する。
いくつかのリポソームが、特定の標的細胞又は標的組織へのリポソームの局在化を促進するように設計されたターゲティング部分を用いることができる。ターゲティング部分は製剤中又は製剤後に脂質粒子の外側の二重層に結合させることができる(すなわち、直接的な結合、疎水性相互作用又は別の方法によって)。これらの方法は当業界において周知である。さらに、いくつかのリポソームは、PEAA、ヘマグルチニン、他のリポペプチドなどの膜融合性ポリマー(米国特許第6,417,326号及び米国特許出願第09/674,191号を参照されたい。それらすべては引用文献として本明細書中で援用される。)、及びin vivoでの及び/又は細胞内のデリバリーに有用な他の特徴を用いることができる。
他の好ましい実施態様において、本発明のリポソームはスフィンゴミエリン及びコレステロール(「スフィンゴソーム」)を含む。好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法中で使用されるリポソームはスフィンゴミエリン及びコレステロールから成り、酸性のリポソーム内pHを有する。スフィンゴミエリン及びコレステロールを含む脂質粒子は、他の製剤と比較していくつかの利点を有する。スフィンゴミエリン/コレステロールの組み合わせは、試験した他のリポソーム製剤よりも延長された循環寿命を有し、酸加水分解に対して大いに安定であり、顕著により良好な薬物保持特性を有し、腫瘍等へのより良好な負荷特性を有し、顕著により良好な抗腫瘍効力を示すリポソームを生成する。
好ましい実施態様において、本発明のリポソームは式Iの陽イオン性成分、及び少なくとも1つの下記の中性脂質を含む(そして米国特許第5,785,992号中で完全に説明されている。これは本明細書中で引用文献として組み込まれている。)。好ましい実施態様において、本発明のLNA製剤は、式Iの陽イオン性成分及び少なくとも1つの下記の中性脂質を含む(そして米国特許第5,785,992号中で完全に説明されている。これは本明細書中で引用文献として組み込まれている。)。
式Iにおいて、R1及びR2はそれぞれ独立してC1〜C3;アルキルである。Y及びZはアルキル鎖又はアルケニル鎖であって、それぞれ独立して以下の:−CH2CH2CH2CH2CH2−、−CH=CHCH2CH2CH2−、−CH2CH=CHCH2CH2−、−CH2CH2CH=CHCH2−、−CH2CH2CH2CH=CH−、−CH=CHCH=CHCH2−、−CH=CHCH2CH=CH−又は−CH2CH=CHCH=CH−であり、ただし、Y及びZが両方とも−CH2CH2CH2CH2CH2−ではない。n及びqという文字は3〜7の間の整数を表し、一方m及びpという文字は4〜9の間の整数を表し、ただし、合計であるn+m及びq+pがそれぞれ10〜14の間の整数である。シンボルX-は医薬として許容可能な陰イオンを表す。上記の式において、二重結合の配向性はシス又はトランスのいずれでもよいが、シスアイソマーが一般的に好ましい。
別の好ましい実施態様において、陽イオン性リポソームは式Iのものであり、ここで、R1及びR2はメチルであり、そしてY及びZはそれぞれ独立して以下の:−CH=CHCH2CH2CH2−、−CH2CH=CHCH2CH2−、−CH2CH2CH=CHCH2−又は−CH2CH2CH2CH=CH−である。好ましい実施態様において、R1及びR2はメチルであり;Y及びZはそれぞれ−CH=CHCH2CH2CH2−であり;n及びqは両方とも7であり;そしてm及びpは両方とも5である。別の好ましい実施態様において、陽イオン性の成分はDODAC(N,N−ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロライド)である。DODACは当業界において知られており、界面活性剤及びシャンプー中に添加剤として広く使用されている成分である。DODAもまた、他の界面活性剤と共にリポソーム組成物中の共存脂質として使用される(Takahashi,他,GB2147243を参照されたい)。
本発明の陽イオン性リポソーム中の中性脂質は、典型的には界面活性剤中で使用され、又はミセル若しくはリポソームの形成のために使用される任意の多様な中性脂質であることができる。本組成物において有用な中性脂質の例は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、及びセレブロシドであるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、本組成物はジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド又はスフィンゴミエリンである中性脂質の1又は複数を含むだろう。これらの中性脂質中のアシル基は、好ましくはC10〜C24の炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。より好ましくは、アシル基はラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。特に好ましい実施態様においては、中性脂質は1,2−sn−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンであろう。
陰イオンX-は、同様に医薬として許容可能な任意の多様な陰イオンであることができる。これらの陰イオンは、例えばBr-、Cl-、F-、I-、硫酸、リン酸、酢酸、硝酸、安息香酸、クエン酸、グルタミン酸、及び乳酸を含む、有機イオン又は無機イオンであることができる。好ましい実施態様において、X-はCl-又はAcO-である。
本明細書中で説明される他の成分に加えて、本発明の組成物は医薬として許容可能な担体を含むことができる。医薬として許容可能な担体は当業界において周知である。担体の選択は、投与される特別な組成物並びにその組成物の投与に使用される特別な方法により部分的に決定される。好ましくは、薬剤担体は溶液中、水又は生理食塩水中に存在する。
本発明の組成物において、陽イオン性成分の中性脂質に対する比率は、好ましくは約25:75(陽イオン性成分:中性脂質)から好ましくは75:25(陽イオン性成分:中性脂質)の範囲内にあり、又は好ましくは約50:50である。
本発明の組成物中で使用される陽イオン性成分は、標準的な合成反応(March, Advanced Organic Chemistry, 4th Ed., Wiley−Interscience, NY, N.Y.(1992)を参照されたい。これは本明細書中に引用文献として組み込まれている。)を用いる当業者に知られた方法によって調製することができる。例えば、OSDACの合成は、最初に、アミンの還元的アルキル化となる条件下でホルムアルデヒドとシアノボロハイドライドナトリウムでオレイルアミンを処理することによって実施することができる。このアプローチは、ジメチルオレイルアミンを提供し、これは対応するアンモニウム塩を形成するためにその後ステアリルブロマイドでアルキル化されることができる。陰イオン交換によりOSDACが形成される。ジメチルオレイルアミンはまた、大過剰のジメチルアミンによってオレイルブロマイドを処理し、さらに上記のように誘導体化することによっても合成することができる。
両方の脂肪酸鎖が不飽和である陽イオン性成分(すなわち、DODAC)については、以下の一般的な手順を使用することができる。不飽和脂肪酸(すなわち、オレイン酸)は、塩化オキサリル、塩化チオニル、PCl3又はPCl5などの試薬によってそれに対応するアシルクロライドに変換することができる。アシルクロライドは不飽和アミン(すなわち、オレイルアミン)で処理されて、対応するアミドを提供することができる。例えば、水素化アルミニウムリチウムによるアミドの還元は、両方のアルキル基が不飽和長鎖アルキル基である二級アミンを提供する。二級アミンはその後、メチルヨーダイドなどのアルキルハライドで処理されて四級アンモニウム成分を提供することができる。その後、陰イオン交換は所望の医薬として許容可能な陰イオンを有する陽イオン性成分を提供するために実施することができる。アルキルアミン前駆体は、同様の様式で合成することができる。例えば、アルキルハライドを大過剰のアンモニアのメタノール溶液で処理することにより、精製後に必要なアミンが産生されるだろう。或いは、適当なカルボン酸をオキサリルクロライドで処理することによって生成されたアシルクロライドは、アンモニアと反応してアミドを産生することができる。LiAlH4によるアミドの還元は必要なアルキルアミンを提供するだろう。
好ましい実施態様において、本発明の医薬組成物はミセル又はリポソームとして製剤される。本発明の陽イオン性成分及び中性脂質を含むミセルは、当業界において周知の方法によって調製することができる。本組成物のミセル製剤に加えて、本発明はリソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルセリン、リソホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミンポリオキシエチレン結合体、セラミド−ポリオキシエチレン結合体又はホスファチジン酸−ポリオキシエチレン結合体などの他の種を含むミセル製剤をも提供する。
本発明の組成物において使用されるポリオキシエチレン結合体は、結合基(すなわち、ホスファチジン酸又はホスファチジルエタノールアミン)と適切に官能化されたポリオキシエチレン誘導体とを結合させることによって調製されることができる。例えば、ホスファチジルエタノールアミンはオメガ−メトキシポリエチレングリコールコハク酸塩と結合してホスファチジルエタノールアミンポリオキシエチレン結合体を提供することができる(例えば、Parr, 他, Biochim.Biophys.Acta.1195:21−30(1994)を参照されたい。これは本明細書中に引用文献として組み込まれている。)。
本発明の組成物及び方法中で使用するための中性脂質の選択は、一般的には、例えば、リポソームのサイズ及び血流中でのリポソームの安定性などを考慮することによって導かれる。上記のように、リポソーム中の中性脂質成分は2つのアシル基を有する脂質(すなわち、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジル−エタノールアミン)である。多様な鎖長および飽和度の多様なアシル鎖基を有する脂質は、入手可能であり、又は周知の技術によって単離又は合成することができる。一般的に、濾過滅菌のために、リポソームが約0.3ミクロン未満に寸法決めしなければならない場合には特別に、より飽和度の低い脂質はより容易に寸法決めすることができる。1つの群の実施態様において、炭素鎖の長さがC14〜C22の範囲である飽和脂肪酸を含む脂質が好ましい。別の群の実施態様においては、炭素鎖の長さがC14〜C22の範囲のモノ又はジ不飽和脂肪酸を有する脂質が使用される。さらに、飽和及び不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を使用することができる。
本発明の組成物及び方法中で有用なリポソームはまた、スフィンゴミエリン又は、セリン及びイノシトールなどの他の頭部基を有するリン脂質から構成されることもできる。本発明において有用なさらに他のリポソームは、コレステロール、ジグリセリド、セラミド、ホスファチジルエタノールアミンポリオキシエチレン結合体、ホスファチジン酸−ポリオキシエチレン結合体、又はポリエチレングリコール−セラミド結合体(例えば、PEG−Cer−C14又はPEG−Cer−C20)を含むだろう。リポソームの寸法決め及び濾過滅菌において使用される方法は以下で検討される。
リポソームを調製するための多様な方法が当業界において知られている(例えば、Szoka 他, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467(1980) 、米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号、the text Liposomes, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, 1983, Chapter 1, 及びHope, 他, Chem Phys. Lip. 40:89(1986)を参照されたい。これらのすべては引用文献として本明細書中で援用される。)。1つの知られた方法は、不均質なサイズの多重層小胞を産生する。この方法において、小胞を形成する脂質は適切な有機溶媒又は溶媒系に溶解され、そして真空下又は不活性ガス中で乾燥されて、脂質の薄膜を形成する。必要ならば、この膜は3級ブタノールなどの適切な溶媒中に再溶解され、そして次に凍結乾燥されて、より均一な脂質混合物を形成する。この混合物は、より簡単に水和される粉末様形態である。この膜は水性の緩衝溶液で覆われ、典型的には15−60分の間振とうすることによって水和される。得られた多重層小胞の大きさの分布は、より強く攪拌する条件下で脂質を水和することにより、又はデオキシコレートなどの可溶化界面活性剤を添加することにより、より小さいサイズへと移行しうる。
リポソームの調製に続いて、リポソームは所望のサイズ範囲及び比較的狭いリポソームサイズ分布を達成するような大きさに作ることができる。約0.2〜0.4ミクロンのサイズ範囲は、リポソーム懸濁液が慣用のフィルター、典型的には0.22ミクロンのフィルターを通る濾過によって滅菌されることを可能とする。仮にリポソームが約0.2〜0.4ミクロンまで小さくなっていれば、濾過滅菌法はハイスループット基礎(basis)で実施することができる。
リポソームの大きさを所望の寸法とするために、いくつかの技術を利用できる。1つの定寸法(sizing metod)は米国特許第4,737,323号中で説明されており、これは本明細書中に引用文献として組み込まれている。浴槽超音波処理又はプローブ超音波処理によるリポソーム懸濁液の超音波処理は、約0.05ミクロン未満のサイズの小さな単一層小胞まで革新的に寸法を減少させる。ホモジェナイズは、大きなリポソームからより小さいリポソームへ断片化するための剪断エネルギーに依存する別の方法である。典型的なホモジェナイズ方法においては、多重層小胞は標準的なエマルジョンホモジェナイザーを介して、選ばれたリポソームサイズ、典型的には約0.1〜0.5ミクロンの間であることが観察されるまで再循環される。両方法において、粒子のサイズ分布は、慣用のレーザービームによる粒子サイズの識別によってモニターすることができる。
小孔ポリカーボネート膜又は非対称のセラミック膜を通してリポソームを押し出すことも、比較的明確なサイズ分布にリポソームサイズを減少させるための有効な方法である。典型的には、懸濁液は所望のリポソームサイズ分布が達成されるまで、1又は複数回膜を通して循環させられる。リポソームは、リポソームサイズを徐々に減少させるために、引き続いてより孔の小さい膜を通して押し出されることができる。本発明における使用のために、約0.05ミクロン〜約0.15ミクロンのサイズを有するリポソームが好ましい。
以下においてさらに説明されるように、本発明の組成物は任意の知られた投与ルートによって対象に投与することができる。いったん細胞に吸着すると、リポソーム(先に説明された複合体を含む)は細胞のある部分によってエンドサイトーシスされ、細胞膜と脂質を交換し、又は細胞と融合することができる。複合体のポリアニオン性部分の転位又は取り込みは、これらの経路の任意の1つを介して行われうる。特に、融合が起こる場合、リポソーム膜は細胞膜に統合され、リポソームの内容物が細胞内流体と結合することができる。
以下で詳細に説明されるように、特定の細胞型を標的とするために、処置成分であることもできる付加的な成分を、本発明のリポソームに加えることができる。例えば、リポソームは、特異的細胞型上にのみ存在するエピトープ、例えば癌関連抗原などに結合するモノクローナル抗体又はその結合断片に結合されて、全身投与の後リポソームを標的する手段を提供することができる。或いは、標的細胞型の表面受容体に結合するリガンドは、リポソームに結合しうる。リポソームを標的するための別の手段も、本発明で用いることができる。
リポソームを含む溶媒から遊離薬剤を取り除くために必要とされうる分離ステップの後に、リポソーム懸濁液は、患者又は宿主細胞に対し投与するため、医薬として許容される担体中で所望の濃度とされる。多くの医薬として許容される担体は、本発明の組成物及び方法において用いることができる。例えば、水、緩衝液、0.4%生理食塩水、0.3%グリシンなどの様々な水性担体を使用することができ、そして安定性を強化するため、例えばアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの糖タンパク質を含むことができる。一般的に、通常の緩衝化生理食塩水(135〜150mMのNaCl)は、医薬として許容される担体として使用されるだろうが、他の適切な担体でも十分である。これらの組成物は、例えばろ過などの慣用のリポソーム滅菌技術によって滅菌できる。組成物は、大体の生理条件が必要とされるとき、pH調節剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤などの医薬として許容される補助的な物質を含むことができ、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどである。これらの組成物は、上記の技術によって滅菌するか又は滅菌条件下で製造することができる。得られた水溶液は、使用のために包装するか、又は無菌条件下でろ過し凍結乾燥することができる。この凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌水溶液と混合される。
担体中のリポソームの濃度は変化しうる。好ましい態様において、リポソーム濃度は約0.1〜200mg/mlである。当業者は、異なるリポソーム成分での又は特定の患者に対する処置を最適化するために、これらの濃度を変える方法を知っているだろう。例えば濃度を高くして、処置に伴う流体負荷を低下させることができる。
対象の細胞は、通常、in vivo又はex vivoでの投与により本発明の組成物にさらされる。本明細書中で説明される好ましい態様においては、本発明の組成物は、例えば静脈投与により全身投与され、筋肉内、皮下、及び局所投与も考慮される。或いは、鼻腔内又は気管内投与を使用することもできる。気管内投与は液体として提供することができ、好ましくはエアロゾルとして提供することができる。噴霧器を使用して、例えば直径70〜100μmの液滴のエアロゾルを作ることができる。一般的に、液滴のサイズはリポソームのサイズより大きくされるべきであることが理解されるだろう。
患者に対する複数回投与が考慮される。処置の投与量計画は、疾患及び患者の条件により決定されるだろう。免疫刺激組成物を含む処置用成分による標準的処置は、当業界において周知であり、処置成分を含むリポソームによる処置の指針として役立ちうる。処置期間及び処置計画は、当業者に周知の方法により変わりうるが、一般的に循環時間の増大、及びリポソームの漏出の減少は、投与量を以前使用した投与量から下方修正することを許容する。本発明のリポソームの投与量は、臨床条件及び処置を受ける動物の又は患者のサイズに依存して変わりうる。内包されない処置用成分の標準的投与量は、リポソームに内包される成分の投与量に対する指針として役に立ちうる。いくつかの場合において投与量は変わりうるが、典型的には投与量は処置過程において一定であるだろう。処置中に標準的な生理的パラメーターを評価し、本発明のリポソームの投与量を変えるために使用することができる。
抗体処置
本発明の好ましい実施態様において、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームは、例えば腫瘍関連抗原及び病原体抗原を含む着目の標的抗原に対する抗体処置と組み合わせて投与される。特に好ましい実施態様において、抗体処置は腫瘍関連抗原を対象とする。本明細書中で使用される「組み合わせて」という文言は、同一の製剤中又は別々の製剤中のいずれかでの、対象の薬剤の同時投与又は連続投与を指す。
本発明の好ましい実施態様において、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームは、例えば腫瘍関連抗原及び病原体抗原を含む着目の標的抗原に対する抗体処置と組み合わせて投与される。特に好ましい実施態様において、抗体処置は腫瘍関連抗原を対象とする。本明細書中で使用される「組み合わせて」という文言は、同一の製剤中又は別々の製剤中のいずれかでの、対象の薬剤の同時投与又は連続投与を指す。
本明細書中で説明及び実証される実施態様において、抗体処置薬と対象の陽イオン性リポソームの組み合わせは、強力な先天性免疫応答、及び特に強力な抗体依存性の細胞傷害性応答の誘導において相乗的作用を提供する。この相乗的作用は、抗体の標的特異的なオプソニン化能力を備えた対象の粒子により獲得される、先天性免疫エフェクター細胞の劇的な増殖及び活性化によってもたらされる。それは同時に、より大きな効力を有する先天性免疫応答を提供する。このように、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソーム及び抗体処置薬は、1つの製剤で一緒に投与することができ、又は別個の組成物として動物に同時投与することができる。さらに、免疫応答は、同一の製剤の一部として又は同時投与プロトコルの一部としてのいずれかで、サイトカインなどの付加的な免疫アジュバントを含めることによってさらに強化することができるが、アジュバントなどの含有は効果的応答の誘導に必要というわけではない。
適切な抗体処置は、腫瘍関連抗原及び病原体抗原、特に表面膜抗原に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を含む。典型的な抗体処置薬としては、RITUXAN(登録商標)などの抗CD20抗体、Herceptin(登録商標)などの抗Her2/neu抗体、抗CD33抗体、抗CD22抗体、抗EGF−R抗体、抗HLA−DR10抗体、抗MUC1抗体などが挙げられる。
下記の実施例において、対象の陽イオン性リポソーム組成物は、効力及び相乗的処置効果を向上させるために、抗体処置薬と組み合わされる。
本発明における使用に適切な抗原の例としては、ポリペプチド抗原、及びDNA抗原が挙げられるが、これらに限定されない。抗原の特異的な例は、A型肝炎、B型肝炎、天然痘、ポリオ、炭疽、インフルエンザ、チフス、破傷風、はしか、ロタウイルス、ジフテリア、百日咳、結核、及び風疹の抗原である。好ましい実施態様において、抗原は組換えB型肝炎抗原である。他の側面において、抗原は組換えA型肝炎抗原である。別の側面において、抗原は腫瘍抗原である。そのような腫瘍関連抗原の例は、MUC−1、EBV抗原及びバーキットリンパ腫に関連する抗原である。さらなる側面において、抗原は組換えチロシナーゼ関連タンパク質腫瘍抗原である。当業者は、本発明における使用に適切な他の抗原を知っているであろう。
対象の発明における使用に適切な腫瘍関連抗原は、単一の腫瘍型を示し、数種の腫瘍型で共有し、及び/又は正常の細胞に比べて腫瘍細胞において独占的に又は過剰に発現しうる、突然変異した及び突然変異していない分子の両方を含む。タンパク質及び糖タンパク質に加えて、炭化水素、ガングリオシド、糖脂質及びムチンの発現の腫瘍特異的パターンもまた実証されてきた。上記のMoingeon。対象の癌ワクチン中で使用される典型的な腫瘍関連抗原としては、癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子及び腫瘍細胞独自の突然変異又は再配列を有する他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化された胚遺伝子の産物、癌胎児性抗原、組織特異的(しかし、腫瘍特異的でない)分化抗原、成長因子受容体、細胞表面の炭化水素残基、外来のウイルスタンパク質並びに多数の他の自己タンパク質が挙げられる。
腫瘍関連抗原の具体的実施態様としては、例えば、Ras p21プロトオンコジーンのタンパク質産物、腫瘍サプレッサーp53及びBCR−ablオンコジーン、並びにCDK4、MUM1、Caspase8、及びベータカテニンなどの突然変異抗原;ガレクチン4、ガレクチン9、カルボニックアンヒドラーゼ、アルドラーゼA、PRAME、Her2/neu、ErbB−2及びKSAなどの過剰発現された抗原、アルファフェトプロテイン(AFP)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)などの癌胎児性抗原;癌胎児性抗原(CEA)などの自己抗原及びMart1/MelanA、gp100、gp75、チロシナーゼ、TRP1及びTRP2などのメラニン細胞分化抗原;PSA、PAP、PSMA、PSM−P1、及びPSM−P2などの前立腺関連抗原;MAGE1、MAGE3、MAGE4、GAGE1、GAGE2、BAGE、RAGEなどの再活性化された胚遺伝子産物並びにNY−ESO1、SSX2、及びSCP1などの他の癌精巣抗原;Muc−1及びMuc−2などのムチン;GM2、GD2及びGD3などのガングリオシド、中性糖脂質及びルイス(y)及びグロボ−H(globo−H)などの糖タンパク質;そしてTn,トンプソン−フリードリッヒ抗原(TF)及びsTnなどの糖タンパク質が挙げられる。完全な細胞及び腫瘍細胞ライセート並びにそれらの免疫原性の部分、並びにB細胞リンパ腫に対して使用されるBリンパ球のモノクローナル増殖において発現される免疫グロブリンイディオタイプもまた、本明細書中で腫瘍関連抗原に含められる。
病原体としては、哺乳動物、より特別にはヒトに感染する感染性ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。感染性ウイルスの例としては:レトロウイルス科(例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えばHIV-1(また、HTLV-III、LAV、又はHTLV-III/LAV、又はHIV-IIIとも称される);及び他の単離体、例えばHIV-LP);ピコルナウイルス科(例えばポリオウイルス、A型肝炎ウイルス;エンテロウイルス、ヒト・コクサッキー・ウイルス、リノウイルス、エコウイルス);カルシウイルス科(例えば、胃腸炎を引き起こす種);トガウイルス科(例えばウマ・脳炎ウイルス、風疹ウイルス);フラウイルス科(Flaviridae)(例えば、デング・ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス);コロナウイルス科(例えば、コロナウイルス);ラブドウイルス科(例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス);フィロウイルス科(例えば、エボラ・ウイルス);パラミキソウイルス科(例えば、パラインフルエンザ・ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ハシカウイルス、呼吸器合胞体ウイルス);オルソミクソウイルス科(例えば、インフルエンザ・ウイルス);ブンヤウイルス科(Bungaviridae)(例えば、ハンタ・ウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、及びナイロ・ウイルス);アレナウイルス科(出血熱ウイルス);レオウイルス科(例えば、レオウイルス、オービウイルス、及びロタウイルス);ビルナウイルス科;肝炎ウイルス科(B型肝炎ウイルス);パルボウイルス科(パルボウイルス);パポバウイルス科(パピローマ・ウイルス、ポリオーマ・ウイルス);アデノウイルス科(大部分のアデノウイルス);ヘルペス・ウイルス科(単純ヘルペス(HSV)1及び2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペス・ウイルス);ポックスウイルス科(痘瘡ウイルス、ワクシニア・ウイルス、ポックス・ウイルス);及びイリドウイルス科(例えば、アフリカ・ブタ・熱ウイルス);および未分類ウイルス(例えば、海面上脳症の病理学的病原体、δ型肝炎の病原体(B型肝炎ウイルスの欠陥サテライトであると考えられる)、非A、非B型肝炎の病原体(クラス1=内部伝染;クラス2=非経口的に伝染する(つまり、C型肝炎);ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルス)が挙げられるが、これらに限定されない。
また、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌も、脊椎動物において抗原として働く。このようなグラム陽性細菌としては、パスツレラ属、ブドウ球菌属、及び連鎖球菌属が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌としては、大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス属、及びサルモネラ属が挙げられるが、これらに限定されない。感染性細菌の特異的な例としては、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pyloris)、ボレリア・ブルドルフェリ(Borelia burgdorferi)、レジオネラ・ニューモフィリア(Legionella pneumophilia)、ミコバクテリア・エスピーエス(Mycobacteria sps)(例えば、エム. ツベルクロシス(M. tuberculosis)、エム. アビウム(M. avium)、エム. イントラセルラー(M. intracellulare)、エム. カンサイ、(M. kansaii)、エム. ゴルドナエ(M. gordonae)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ネイセリア・ゴノロエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、リステリア・モノサイトジーン(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・ピオゲン(Streptococcus pyogenes)(グループAストレプトコッカス(Group A Streptococcus))、ストレプトコッカス・アガラクチー(Streptococcus agalactie)(グループBストレプトコッカス(Group B Streptococcus))、ストレプトコッカス(ビリダン・グループ)(Streptococcus(viridans group))、ストレプトコッカスファエカリス(Streptococcusfaecalis)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス(アナエロビック エスピーエス.)(Streptococcus(anaerobic sps.))、ストレプトコッカス・ニューモニア(Streptococcus pneumoniae)、病原性カンピロバクター・エスピー.,(Pathogenic Campylobacter sp.)、エンテロコッカス・エスピー.,(Enterococcus sp.)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus infuenzae)、バチルス・アントラシス(Bacillus antracis)、コリーネバクテリウム・ジフテリア(corynebacterium diphtheriae)、コリーネバクテリウム・エスピー.,(corynebacterium sp.)、エリシペロスリックス・ルーシオパチー(Erysipelothrix rhusiopathiae)、クロストリジウム・ペルフリンガー(Clostridium perfringers)、クロストリジウム・テンターニ(Clostridium tetani)、エンテロバクター・アエロゲン(Enterobacter aerogenes)、クレブシエラ・ニューモニア(Klebsiella pneumoniae)、パスツレラ・マルトシーダ(Pasturella multocida)、バクテロイド・エスピー(Bacteroides sp.)、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、ストレプトバシラス・モニリフォルミス(Streptobacillus moniliformis)、トレポネマ・パリダム(Treponema pallidum)、トレポネマ・ペルテヌー(Treponema pertenue)、レプトスピラ(Leptospira)、リッケットシア(Rickettsia)、及びアクチノミセス・イスラエリ(Actinomyces israelli)が挙げられるが、これらに限定されない。
さらなる病原体の例としては、哺乳動物、より特別にはヒトに感染する感染性真菌が挙げられるが、これらに限定されない。感染性真菌の例としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラスマ・カプスラタム(Histoplasma capsulatum)、コシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis)、ブラストミセス・デルマティティジス(Blastomyces dermatitidis)、クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)が挙げられるが、これらに限定されない。感染性寄生虫の例としては、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)、及び三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)などのマラリア原虫が挙げられる。他の感染性生物(つまり、原生生物)としては、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)が挙げられる。
他の薬剤成分
本発明のいくつかの好ましい実施態様は、例えば薬剤又は生理活性薬剤などの、さらに他の処置用薬剤を含む。これらの追加の成分は、直接付加的な処置上の利益又は付加的な免疫を刺激する上での利益を提供することができる。幅広い様々な処置用成分は、本発明の組成物及び方法により送達することができる。処置用成分の例としては、核酸、タンパク質、ペプチド、腫瘍退縮薬、抗感染薬、抗不安薬、向精神薬、免疫調節薬、向イオン性薬、ゲロニン等の毒素、及び真核生物タンパク質合成の阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の脂質成分における内包のための好ましい処置用成分は、親油性の陽イオンである。これらの中には、リポソームの脂質2重層に分離することができ、それゆえ膜形成のリポソームと関連することができる親油性の分子のクラスに属する処置用薬剤が存在する。処置用成分の更なる例としては、プロスタグランジン、アンホテリシンB、メトトレキセート、シスプラチン及びその誘導体、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール、ドキソルビシン、エピルビシン、ベクロメタゾン及びそのエステル、ビタミンE、コルチゾン、デキサメタゾン及びそのエステル、βメタソン・バレレート(betamethasone valerete)、及び他のステロイド、フッ化キノロン、抗細菌シプロフロキサシン及びその誘導体、並びにアルカロイド成分及びその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。アルカロイド誘導体の中には、スワンソニン及びビンカ・アルカロイドのメンバー並びに半合成誘導体、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、エトポシド・ホスフェート、及びテニポシドが存在する。この群の中では、ビンブラスチン及びビンクリスチン、並びにスワンソニン(swainsonine)が、特に好ましい。スワンソニン(Creaven 及び Mihich, Semin. Oncol. 4: 147(1977))は、骨髄増殖を刺激する能力を有する(White 及び Olden, Cancer Commun. 3: 83(1991))。スワンソニンは、また、IL-1、IL-2、TNF、GM-CSF、及びインターフェロン(Newton, Cancer Commun. 1: 373(1989); Olden, K., J.Natl. Cancer Inst., 83: 1149(1991))を含む複数のサイトカインの生産を刺激する。さらに、スワンソニンは、報告によるとB細胞及びT細胞免疫を誘導し、ナチュラルキラーT細胞及びマクロファージに誘導されるin vitroでの腫瘍細胞の破壊を誘導する。そしてインターフェロンと混ぜたとき、スワンソニンは、in vivoにおいて、大腸ガン及びメラノーマガンに対する直接的な抗腫瘍活性を有する(Dennis, J., Cancer Res., 50: 1867(1990); Olden, K., Pharm. Ther. 44: 85(1989); White 及び Olden, Anticancer Res., 10: 1515(1990))。本発明の組成物及び方法において有用な他のアルカロイドとしては、パクリタキセル(タキソール)及びその合成誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。追加の薬剤成分としては、当業界に知られている任意の生理活性薬剤であって、脂質粒子に取り込まれうる薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のいくつかの好ましい実施態様は、例えば薬剤又は生理活性薬剤などの、さらに他の処置用薬剤を含む。これらの追加の成分は、直接付加的な処置上の利益又は付加的な免疫を刺激する上での利益を提供することができる。幅広い様々な処置用成分は、本発明の組成物及び方法により送達することができる。処置用成分の例としては、核酸、タンパク質、ペプチド、腫瘍退縮薬、抗感染薬、抗不安薬、向精神薬、免疫調節薬、向イオン性薬、ゲロニン等の毒素、及び真核生物タンパク質合成の阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の脂質成分における内包のための好ましい処置用成分は、親油性の陽イオンである。これらの中には、リポソームの脂質2重層に分離することができ、それゆえ膜形成のリポソームと関連することができる親油性の分子のクラスに属する処置用薬剤が存在する。処置用成分の更なる例としては、プロスタグランジン、アンホテリシンB、メトトレキセート、シスプラチン及びその誘導体、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール、ドキソルビシン、エピルビシン、ベクロメタゾン及びそのエステル、ビタミンE、コルチゾン、デキサメタゾン及びそのエステル、βメタソン・バレレート(betamethasone valerete)、及び他のステロイド、フッ化キノロン、抗細菌シプロフロキサシン及びその誘導体、並びにアルカロイド成分及びその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。アルカロイド誘導体の中には、スワンソニン及びビンカ・アルカロイドのメンバー並びに半合成誘導体、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、エトポシド・ホスフェート、及びテニポシドが存在する。この群の中では、ビンブラスチン及びビンクリスチン、並びにスワンソニン(swainsonine)が、特に好ましい。スワンソニン(Creaven 及び Mihich, Semin. Oncol. 4: 147(1977))は、骨髄増殖を刺激する能力を有する(White 及び Olden, Cancer Commun. 3: 83(1991))。スワンソニンは、また、IL-1、IL-2、TNF、GM-CSF、及びインターフェロン(Newton, Cancer Commun. 1: 373(1989); Olden, K., J.Natl. Cancer Inst., 83: 1149(1991))を含む複数のサイトカインの生産を刺激する。さらに、スワンソニンは、報告によるとB細胞及びT細胞免疫を誘導し、ナチュラルキラーT細胞及びマクロファージに誘導されるin vitroでの腫瘍細胞の破壊を誘導する。そしてインターフェロンと混ぜたとき、スワンソニンは、in vivoにおいて、大腸ガン及びメラノーマガンに対する直接的な抗腫瘍活性を有する(Dennis, J., Cancer Res., 50: 1867(1990); Olden, K., Pharm. Ther. 44: 85(1989); White 及び Olden, Anticancer Res., 10: 1515(1990))。本発明の組成物及び方法において有用な他のアルカロイドとしては、パクリタキセル(タキソール)及びその合成誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。追加の薬剤成分としては、当業界に知られている任意の生理活性薬剤であって、脂質粒子に取り込まれうる薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。
これらの追加の薬剤成分は、本明細書中に説明される陽イオン性リポソームに内包させるか又は他の方法でこれに結合させることができる。或いは、本発明の組成物は、処置用抗体を含む陽イオン性リポソームと結合しない薬剤又は生理活性物質を含むことができる。本明細書中で説明されているように、このような薬剤又は生理活性物質は別のリポソーム中に存在するか又は同時投与されることができる。
キット
本発明の組成物は、キットとして提供することができる。1つの実施態様において、キットは、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを含む。好ましい実施態様において、免疫刺激性核酸はメチル化シトシンを有する少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む。さらに好ましい実施態様において、キットは免疫刺激性核酸及び処置用抗体を含む陽イオン性リポソームを含む。好ましい実施態様において、キットは、一方のバイアルに免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを、そして別のバイアルに処置用抗体を含む。さらに好ましい実施態様において、キットは免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソーム及び処置用抗体を同一のバイアル中に含む。
本発明の組成物は、キットとして提供することができる。1つの実施態様において、キットは、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを含む。好ましい実施態様において、免疫刺激性核酸はメチル化シトシンを有する少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む。さらに好ましい実施態様において、キットは免疫刺激性核酸及び処置用抗体を含む陽イオン性リポソームを含む。好ましい実施態様において、キットは、一方のバイアルに免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを、そして別のバイアルに処置用抗体を含む。さらに好ましい実施態様において、キットは免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソーム及び処置用抗体を同一のバイアル中に含む。
組成物の製造
本発明の組成物の製造は任意の技術によって達成することができるが、エタノール透析又界面活性剤透析法が最も好ましく、本明細書中に引用文献としてそれぞれ援用される下記の刊行物、特許、及び特許出願において詳述されている:米国特許第5,705,385号;同第5,976,567号;米国特許出願第09/140,476号;米国特許第5,981,501号;同第6,287,591号;国際公開第96/40964号;及び同第98/51278号。これらの製造方法は、脂質粒子に内包された処置剤、好ましくは脂質−核酸粒子を含む免疫刺激性組成物の小規模及び大規模の製造を提供する。この方法はまた、優れた薬剤特性を有するそのような粒子を作り出す。
本発明の組成物の製造は任意の技術によって達成することができるが、エタノール透析又界面活性剤透析法が最も好ましく、本明細書中に引用文献としてそれぞれ援用される下記の刊行物、特許、及び特許出願において詳述されている:米国特許第5,705,385号;同第5,976,567号;米国特許出願第09/140,476号;米国特許第5,981,501号;同第6,287,591号;国際公開第96/40964号;及び同第98/51278号。これらの製造方法は、脂質粒子に内包された処置剤、好ましくは脂質−核酸粒子を含む免疫刺激性組成物の小規模及び大規模の製造を提供する。この方法はまた、優れた薬剤特性を有するそのような粒子を作り出す。
当業界で周知の任意の多くの手段を用いて、抗原又は細胞傷害物質などの付加的な成分を、本発明の陽イオン性リポソームに添加することができ、例えば:1)製剤プロセス中における受動的内包(例えば、この成分をODNを含有する溶液中に添加されることができる);2)エタノール脂質混合物中への糖脂質及び他の抗原性脂質の添加及び本明細書中に記載のエタノールに基づくプロトコルを用いた製剤;3)脂質小胞中への挿入(例えば、小胞と抗原−脂質ミセルをインキュベートすることによって形成された脂質小胞中に、抗原−脂質を加えることができる);及び4)抗原又は他の成分を製剤後に添加することができる(例えば、カップリング、ここで、リンカー部位を有する脂質が、製剤される粒子へと含まれ、そしてリンカーは製剤後に活性化されて、所望の抗原と結合する)を含む。標準的なカップリング及び架橋方法論は、当業界において周知である。代わりの調製は、抗原を、核酸を含まない陽イオン性リポソームに取り込み、そしてこれらのリポソームは、対象への投与に先立って、リポソーム核酸と混合される。
本発明の方法中で使用される組成物の特徴付け
本発明の組成物及び方法中で使用されるリポソームの好ましい特徴は下記のとおりである。
本発明の組成物及び方法中で使用されるリポソームの好ましい特徴は下記のとおりである。
本発明の好ましいリポソームは、十分な内部空間を内包する脂質膜 (一般的にリン脂質二重層)外部を含む。これらのリポソームは、本明細書中で時々、脂質膜小胞とも呼ばれ、平均直径50〜200nm、好ましくは60〜130nmを有する小粒子である。静脈投与に対しては、比較的均一のサイズの粒子が最も好まれ、ここで95%の粒子が、平均30nm以内である。核酸及び他の生理活性薬剤は、内部空間に含まれるか、又は内包膜の内表面と結合される。
本明細書中で使用される「完全に内包される」は、リポソーム中の核酸が、血清にさらされた後又は遊離DNAを有意に分解するヌクレアーゼ・アッセイの後に、有意に分解されないことを意味する。完全に内包されるシステムでは、通常100%の遊離核酸を分解する処置において、好ましくは25%未満の粒子核酸が分解され、より好ましくは10%未満そして最も好ましくは、5%未満の粒子核酸が分解される。或いは、完全な内包は、Oligrren(登録商標)アッセイにより判断することができる。完全な内包はまた、粒子が血清安定であるということ、つまり、in vivo投与された際、それらが成分部分に即座に分解しないということを意味する。
本発明の組成物のこれらの特徴は、本発明の好ましい粒子を、DOTMA/DOPE(LIPOFECTIN(登録商標))製剤などの脂質―核酸凝集体(陽イオン性複合体又はリポプレックスとしても知られる)から区別する。これらの複合体/凝集体は、一般的にかなり大きい(>250nM)直径であり、それらは、完全にはヌクレアーゼ切断に耐えない。それらは、一般的にはin vivo投与の際、徐々に分解する。これらのタイプの陽イオン性脂質―核酸複合体は、例えば筋肉内、腹腔内、及びくも膜下内投与、及びより好ましくは鼻腔内投与などの局所的及び領域的な使用に対して適したリポソーム組成物を提供することができる。
本発明の脂質組成物は、広い範囲の薬剤:脂質の比率において製剤することができる。本明細書中で使用される「薬剤対脂質比率」は、規定された体積の調製物中の処置用核酸の量(すなわち、内包され、そして血液にさらされたとき即座に分解されない核酸の量)を、同じ体積中の脂質の量で割った比率を指す。これは、モル対モル若しくは重量対重量、又は重量対モルに基づいて決定することができる。薬剤対脂質比率は、所与の投与量の核酸と会合される脂質投与量を決定することができる。好ましい実施態様において、本発明の組成物は、約0.01〜0.25(wt/wt)の範囲の薬剤:脂質比率を有する。
適応症、投与及び用量
本発明の組成物及び方法は、免疫系の刺激を必要とする任意の患者又は生物における使用を意図したものである。このような必要性は、腫瘍学、炎症、関節炎及びリューマチ、免疫不全障害などのほとんどの医学分野を包含するが、これらに限定されない。当業者は、本明細書の開示に基づいて効力を試験するために適切な適応症を選択することができる。好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法は、下記の実施例で説明した腫瘍症などの腫瘍症(病理学的又は潜在的に病理学的な任意の新形成細胞の増殖)を処置するために使用される。
本発明の組成物及び方法は、免疫系の刺激を必要とする任意の患者又は生物における使用を意図したものである。このような必要性は、腫瘍学、炎症、関節炎及びリューマチ、免疫不全障害などのほとんどの医学分野を包含するが、これらに限定されない。当業者は、本明細書の開示に基づいて効力を試験するために適切な適応症を選択することができる。好ましい実施態様において、本発明の組成物及び方法は、下記の実施例で説明した腫瘍症などの腫瘍症(病理学的又は潜在的に病理学的な任意の新形成細胞の増殖)を処置するために使用される。
本発明の組成物の対象への投与は、in vivo又はex vivoでの方法を含む任意の方法によることができる。in vivoでの方法は局所的、部分的又は全身的適用を含むことができる。好ましい実施態様において、この組成物は、粒子が患者のB細胞、マクロファージ又は脾臓細胞に到達できるように、及び/又は粒子がリンパ球の増殖を刺激し、該患者においてIL−6、IL−12、IFNg及び/又はIgMの分泌ができるように、静脈内投与される。この組成物は、それぞれの構成部分を混合させた単一製剤として投与することができる。本発明のこの側面の実施態様は、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの処置用抗体との同時投与を含む。
或いは、製剤の成分は同時投与することができる。本明細書中で使用されているように、「同時投与」は、本明細書中で実証されている強化されたADCC応答を提供するのに十分な短い時間内で、陽イオン性リポソーム及び処置用抗体を投与することを意味する。一般的に、抗体による標的細胞のオプソニン化に先立って先天性免疫エフェクター細胞の動員及び活性化を可能とするために、免疫刺激性核酸を有する陽イオン性リポソームが処置用抗体の前に投与されるだろう。別々の同時投与による組み合わせた成分の免疫刺激の利益を提供するための典型的な時間は、1日〜7日以内、12時間〜72時間以内、より好ましくは48時間以内、そして最も好ましくは24時間〜48時間以内である。本発明のこの側面の好ましい実施態様は、処置用抗体の投与前に免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを投与することを含む。或いは、陽イオン性リポソーム組成物は、抗体のin vivoでの半減期に依存して、処置用抗体の投与後に投与することができる。適切な半減期(例えば、2日〜5日)を有する抗体は、陽イオン性リポソームの投与前に投与することができる。
本明細書中で説明されるin vivoでの研究で実証されているように、動物の腫瘍の状態は、処置用抗体と組み合わせた陽イオン性リポソームによる免疫刺激に応答する能力に影響をえず、腫瘍のない動物及び腫瘍を持つ動物から得た血液免疫細胞又は脾臓免疫細胞は同様に応答する。これらの組成物に対するin vivoでの応答は、投与レベル及び投与方式の両方に依存するようである。リポソーム核酸製剤の濃度を5mg/kgから40mg/kgに増加させるin vivoでの投与は、末梢血液NK細胞のADCC活性を徐々に上昇させた。投与方式に関して、単回投与は、注射後24時間〜48時間をピークに、5日〜7日の間NK活性及びADCC活性を上昇させた。興味深いことに、複数回投与は有益ではなかった:3日〜4日間の複数回投与は、単回投与と比較して、NK活性又はADCC活性のいずれも全く強化しなかった。しかし、例えば1週間に1回又は2回といった、より長期間での投与は若干付加的な利益をもたらした。
本発明の組成物は、任意の知られた投与経路で投与することができる。1つの実施態様において、本発明の組成物は静脈注射によって投与される。別の実施態様においては、筋肉内又は皮下注射が用いられ、この方法ではより大きなサイズの(150〜300nm)リポソームを使用することができる。結局、高価な排出段階の必要性を減らし又は除くことができ、リポソームを循環させる必要がないため、リポソーム成分の選択をより安価な材料に偏らせることができる。例えば、Chol量を減少させることができ、DSPCをより柔軟なもの(例えば、POPC又はDMPC)に置換することができ、そしてPEG−脂質をより安価なPEG−アシル鎖に置換することができる。さらなる実施態様においては、本発明の組成物は、気道内注入又は鼻腔内吸入などによって、気道を介して投与される。
当業者は、例えば補体の活性化、凝集、腎毒性、肝臓酵素アッセイなどの、製剤の可能性のある毒性を同定する方法を知っているであろう。そのような毒性は、生物間で異なりうる。
組成物の医薬調製物は通常、送達様式を改善又は補助する追加の担体を用いる。典型的には、本発明の組成物は標準的な生理食塩水又は標準的な薬剤実務(pharmaceutical practice)に従って選択されたリン酸緩衝液などの生理学的に許容可能な担体中で投与されるだろう。他の適切な担体としては、水、0.9%生理食塩水、0.3%グリシン、などが挙げられ、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの安定性の強化のための糖タンパク質を含む。
陽イオン性リポソームの用量は、所望の脂質用量、所望の核酸用量、及び組成物の薬剤:脂質の比率に依存する。当業者は本明細書中に提供された情報に基づいて適切な用量を選択することができる。同様に、本明細書中での使用のために考えられた処置用抗体の免疫処置プロトコルは、当業界で周知であり及び/又は当業者により簡単に確かめられる。
特に、当業者は、本明細書中に説明される投与量に基いて、対象、特に哺乳動物、及びより特別にヒトに対する投与量の計算方法を知っているだろう。ある動物から別の動物への(例えば、マウスからヒトへの)投与量を変換するための特異的変換因子は、当業界で周知であり、そして、例えばFood and Drug Administrationウェブサイト:www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm(腫瘍学ツール部門において)で十分に説明されており、本明細書中で引例として援用される。遊離核酸を有する既知の免疫刺激性組成物と比較して、本発明の免疫刺激性組成物及び方法は、低減された核酸量をin vivoにおける強化された免疫応答の刺激に利用することができる。さらに、本明細書中で実証されるように、陽イオン性リポソームと抗体の相乗的組み合わせは、優れた効力を維持したまま、より少量の抗体での使用も可能とする。
本発明の製剤中の核酸量は、一般的に、約0.001〜60mg/kg(投与量あたりの核酸mg/マウスの体重kg)の間で変化するだろう。静脈(i.v.)投与の好ましい実施態様においては、本発明の組成物及び方法は、約1〜50mg/kg、より好ましくは約5〜20mg/kgを利用する。皮下(s.c.)投与の好ましい実施態様においては、本発明の組成物及び方法は、約1〜10mg/kg、より好ましくは約1〜5mg/kg、通常は約3〜5mg/kgを利用する。本発明脂質粒子と会合される抗原量は、好ましくは約0.04〜40mg/kgであり、より好ましくは約0.04〜4mg/kgである。上記で説明するように、当業者は、上記で同定された周知変換因子及び更なる経験的試験に基づいて、本明細書中で説明される所与の投与量を考慮して、他の哺乳動物に適した投与量を容易に決定することができる。
本発明の製剤は、医薬として許容される溶液中で投与することができる。この溶液は、医薬として許容される濃度の塩、緩衝材、保存剤、相性の良い担体、アジュバント、及び任意に他の処置用成分を型通りに含むことができる。
処置における使用については、本発明の免疫刺激性組成物の有効量は、適切な標的細胞による取り込みを可能にする任意の方法で、対象に投与することができる。本発明の免疫刺激性組成物の「投与」は、当業者に既知の任意の方法により達成されうる。投与の好ましい経路としては、非経口注射(例えば、皮下、皮内、静脈、非経口、腹腔内、くも膜下腔内、など)、及び粘膜、鼻腔内、気管内、吸入、及び直腸内、膣内;又は経口、経皮(例えば、パッチを介して)が挙げられるが、これらに限定されない。注射は、ボーラス又は持続注入であることができる。
例えば、本発明の組成物は、筋肉内又は皮内注射、又は他の非経口的手段により、又は表皮に「遺伝子銃」を適用することにより、投与することができる。本発明の組成物は、例えば吸入、局所的に、静脈、経口、移植、経直腸、又は経膣によっても投与することができる。適切な液体又は固体医薬調製物の形態は、例えば、注射又は吸入のための水溶液又は生理食塩水であり、エンコクレート(encochleated)され、微小金粒子上に被膜され、そして噴霧される。薬剤送達のための本方法の簡単な文献については、Langer, Science 249: 1527−1533,1990を参照されたい。これは本明細書中で引用文献として援用される。
医薬組成物は、好ましくは投与量単位で調製され、そして投与される。液体投与量単位は、注射又は他の非経口投与のためのバイアル又はアンプルである。固体投与量単位は錠剤、カプセル、及び坐薬である。患者の処置のために、成分の活性、投与の方式、免疫化の目的(つまり、予防又は処置)、疾患の性質及び重篤度、患者の年齢及び体重に依存して、異なる投与量が必要だろう。所与の投与量での投与は、個々の投与量単位の又はその他のいくつかの少ない投与量単位の形態における単回投与によって、両方実施することができる。本明細書中で説明されるように、数週又は数ヶ月離れた特定の間隔での用量の複数回投与は、先天性免疫応答を促進するのに有利であろう。
適切な緩衝剤としては、酢酸及びその塩(1〜2%w/v);クエン酸及びその塩(1〜3%w/v);ホウ酸及びその塩(0.5〜2.5%w/v);及びリン酸及びその塩(0.8〜2%w/v)が挙げられる。適切な保存剤としては、ベンザルコニウムクロライド(0.003〜0.03%w/v);クロロブタノール(0.3〜0.9%w/v):パラベン類(0.01〜0.25%w・v)、及びチメロサール(0.004〜0.02%w/v)が挙げられる。
好ましい実施態様において、本発明の組成物は、医薬として許容される担体中に任意に含まれる。本明細書中で使用される「医薬として許容される担体」は、ヒト又は他の哺乳動物への投与に適している、1又は複数の相性の良い固体又は液体の賦形剤、希釈剤、又は内包物質を指す。本明細書中で使用される「担体」は、天然又は合成の有機成分又は無機成分を指す。担体は、適用を容易にするために活性成分と混ぜ合わせられる。本発明の免疫刺激性組成物の成分は、所望の医薬効力を実質的に損なうような相互作用が生じない方法で、本発明の成分とそして互いに混ぜ合わせることができる。
非経口投与に適した組成物は、滅菌水性調製物を都合よく含み、これは受容者の血液と等張でありうる。許容される溶媒及び溶剤の中には、水、リンゲル溶液、リン酸緩衝生理食塩水及び等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌固定油(fixed oil)は、溶媒又は懸濁溶媒として慣用的に利用される。この目的のために、合成モノ-又はジ-グリセリドを含む、任意の無刺激性(brand)の固定化ミネラルオイル又は固定化非ミネラルオイルを使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製において使用を見出す。皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などの投与に適した担体製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Paにおいて見出すことができる。
様々な投与経路が利用できる。選択される特定の方式は、もちろん特定のアジュバント又は選択される抗原、対象の年齢及び一般的な健康状態、処置される特定の条件、及び処置効力に必要とされる投与量に依存するだろう。本発明の方法は、一般的に、医学的に許容される任意の投与方式、つまり、臨床上許容されない拒絶効果を引き起こすことなく、有効レベルの免疫応答を生じさせる任意の方式を使用して実行することができる。好ましい投与方式は、上記で検討される。
組成物は、単位投与量形態において都合よく提供することができ、薬学分野に周知である任意の方法により調製することができる。全ての方法は、1又は複数の付属成分から構成される担体とその成分を関連させる段階を含む。一般的に、組成物は、均一かつ密接にその成分と、液体担体、微粉化した固体担体、又はその両方とを関連させ、そしてもし必要ならその産物の形を整えることにより調製される。
他の送達系は、時間−放出、遅延放出、又は持続放出の送達系を含むことができる。このようなシステムは、成分の繰り返しの投与を避けることができ、被験者及び医師に対する利便性を増大させる。多くのタイプの放出送達系が利用でき、そして当業者に知られている。それらは、例えばポリ(ラクチド-グリコリド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシブチル酸及びポリ酸無水物などの、ポリマーを基礎とする系を含む。薬剤を含む前述のポリマーの微小カプセルについては、例えば米国特許第5,075,109号で説明されている。送達系は、例えばコレステロール、コレステロール・エステルなどのステロール、及び例えばモノグリセリド- ジグリセリド-及びトリグリセリドなどの脂肪酸又は中性脂肪を含む脂質;ヒドロゲル放出系;シラスティック(Sylastic)系;ペプチドを基礎とする系;ワックスコーティング;慣用の結合剤及び賦形剤使用する加圧された錠剤;部分的に融合された移植錠などである非ポリマー系を含むことができる。具体的な例としては、(a)米国特許第4,452,775号、第4,675,189号、及び第5,736,152号に記載で説明されている、本発明の物質がマトリックス中の形態に含まれる侵食(erosional)系、及び(b)米国特許第3,854,480号、5,133,974号、及び5,407,686号中で説明されている、活性成分が制御された割合でポリマーから浸透する拡散系、が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ポンプにを基礎とするハードウェア送達系を使用することができ、それらのいくつかは移植に適用される。
材料及び方法
下記の実施例において使用される脂質成分及び核酸成分は、本明細書中で説明された。下記の実施例で使用される陽イオン性リポソームの好ましい実施態様は、POPC:CH:DODMA:PEG−DMGが20:45:25:10の比率で構成される陽イオン性リポソームである。
下記の実施例において使用される脂質成分及び核酸成分は、本明細書中で説明された。下記の実施例で使用される陽イオン性リポソームの好ましい実施態様は、POPC:CH:DODMA:PEG−DMGが20:45:25:10の比率で構成される陽イオン性リポソームである。
下記の実施例において使用される全てのODNsは、特に断りのない限り、ホスホジエステル骨格を有する。本明細書中で使用される「遊離」という用語は、脂質核酸組成物中に存在しないODNを指す。
使用されるプラスミドDNAは、ルシフェラーゼ発現プラスミド、pCMVluc18(pCMVLucとも呼ばれる)であった。プラスミドをE.コリ(E.Coli)中で産生し、以前説明したとおりに単離、精製した(Wheeler, J. J., Palmer, L., Ossanlou, M., MacLachlan, I., Graham, R. W., Zhang, Y.P., Hope, M. J., Scherrer, P., & Cullis, P. R.(1999) Gene Ther.6, 271−281.)。(Mortimer I, Tam P, MacLachlan I, Graham RW, Saravolac EG, Joshi PB. Cationic lipid mediated transfection of cells in culture requires mitotic activity. Gene Ther. 1999; 6: 403−411.も参照されたい。)
ホスホジエステル(PO)及びホスホロチオエート(PS)ODNは、Hybridon Specialty Products(マサチューセッツ州、ミルフォード)から購入し、又はInex Pharmaceuticals(カナダ、バンクーバー、バーナビー)において標準的な技術により製造した。メチル化ODNは、Inex Pharmaceuticals(アメリカ合衆国)、Inc(カリフォルニア州、ヘイワード)において標準的な技術により製造した。骨格組成物は、31P−NMRによって確認した。全てのODNについて、特に内毒素を分析し、0.05EU/mg未満を含有させた。
実施例1
この一連の実験は、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの、ADCCを介在し、そしてNK及びLAKを活性化する能力を調べるために設計された。
この一連の実験は、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの、ADCCを介在し、そしてNK及びLAKを活性化する能力を調べるために設計された。
材料及び方法
マウス。本実験では、本実験の時までに8−9週齢(22〜25g)の60C3H雌性マウスを使用した。これらの動物を4つの群で飼育した。
マウス。本実験では、本実験の時までに8−9週齢(22〜25g)の60C3H雌性マウスを使用した。これらの動物を4つの群で飼育した。
投与量。5つの時点において、3つの処理群と1つのコントロールが存在した。試験サンプル及びコントロールの投与は、体重に依存した注射体積(例えば、20gマウスには200ml、25gマウスには350mlなど)で尾静脈注射により行った。動物は、注射毎にODN2[配列番号:1]PS遊離型又はODN1m[配列番号:4]遊離型又はODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの20mgODN/kgの投与を受けるだろう;PBS中において2mg/mlで。
採取。マウスの脾臓及び血液を採取した(滅菌条件は必要でない)。組織を分離し、そして細胞をin vitroでの分析用に回収した。
データ分析。血液及び脾臓細胞は、抗CD20抗体(Rituxan(登録商標)及び/又はマウス抗ヒトIgG1)の存在下及び不在下で、P815、YAC−1、Daudi標的細胞に対するCTL/ADCCアッセイに使用され、そしてHerceptin(登録商標)の存在下及び不在下でSKBR−3標的細胞に対するCTL/ADCCアッセイに使用されるだろう;そして、NK及び単球/マクロファージ活性(DX5/CD16−CD69、CD11b/CD16−CD69、Mac−3/CD16−CD69)をFACSで分析されるだろう。
結果。ODN2[配列番号:1]PS遊離型、ODN1m[配列番号:4]遊離型又はODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの単回投与後の、有力なエフェクター細胞の増殖/移行。全ての3つの投与は、一日目までに脾臓における総NK集団の著しい減少を引き起こし、そしてこの減少は1日−5日を通してほとんど変化せずに持続した。最も高い効果はODN2[配列番号:1]PS遊離型(コントロールレベルの11%から4%まで減少)であり、次にODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソーム(6%まで)であり、そして最も低い影響はODN1m[配列番号:4]遊離型(7%まで)であった(図1A)。同時に、ODN1m[配列番号:4] 遊離型は血液NK集団に影響を与えなかった;ODN2[配列番号:1]PS遊離型は1日目で血液中のNKの増加(50%)を引き起こし、2日−5日でコントロールレベル(〜10%)まで戻った;ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのNK血液集団における影響は周期的のようであり、最も高いレベルは〜30%であった(図1B)。
ODN2[配列番号:1]PS遊離型、ODN1m[配列番号:4]遊離型又はODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの単回投与後の、エフェクター細胞活性(CD69の発現)。CD69の発現レベルを、特定の細胞集団のCD69発現細胞の%により評価した。脾臓におけるNK細胞の総数がODN注射により減少しているが(図2A)、全NK集団のCD69+NK細胞の%は増加する(図2B);ODN2[配列番号:1]PS遊離型及びODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームは、同様の活性レベルを引き起こす(1日目のコントロール群の50%から80〜90%まで上昇し、その後2日目〜5日目で60%まで減少)。
4時間CrアッセイにおけるYac−1標的の殺傷により測定したNK活性化。遊離型ODN1m[配列番号:4]のIV投与は、注射後24時間で脾臓細胞においてピーク活性(25%のCr放出)を引き起こし、その後2日目〜4日目で15〜20%レベルまで減少する(図3A)。ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームは、Cr放出を35〜40%まで上昇させ、そして注射後24〜72時間まで上昇を引き伸ばし、4日目までに遊離型ODNのレベルまで減少する。遊離型ODN2[配列番号:1]PSは、1日目〜3日目はODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームと同じレベルのCr放出を示し、4日〜5日目ではより緩やかな減少であった。血液においては(図3B)、遊離型ODN1m[配列番号:4]は、Yac−1標的に対して活性を刺激せず、そしてODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームによる刺激は2日目〜3日目でピークに達し(28〜33%Cr放出)、4日目〜5日目までにコントロールレベルまで回復する。ODN2[配列番号:1]PS遊離型は、非常に異なった刺激のプロファイルを示し、1日目で最初のピークに達し、2日目〜3日目でコントロールレベルまで戻り、そして4日目〜5日目で第二のピークに達した。
実施例2
この一連の実験は、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの、ADCCを介在し、そしてNK及びLAKを活性化する能力を調べるために設計された。
この一連の実験は、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの、ADCCを介在し、そしてNK及びLAKを活性化する能力を調べるために設計された。
マウス。本実験の時までに6〜8週齢(20〜22g)の40C3H雌性マウス。これらの動物を3つ及び4つの群で飼育した。
投与量。5つの時点において、2つの処理群と1つのコントロール群。試験サンプル及びコントロールの投与は、体重に依存した注射体積(例えば、20gマウスには200ml、25gマウスには350mlなど)で尾静脈注射により行った。動物は、ODN1m[配列番号:4]遊離型は、PBSにおいて2mg/mlで調製されたODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの20mgODN/kgの投与を受けるだろう。
採取。滅菌条件でマウスの血液、肝臓、リンパ節、及び脾臓を採取した。組織を分離し、そして細胞をin vitroでの分析用に回収した。
製剤。陽イオン性リポソームは、予備成形小胞(PFV)技術を用いて生成し、エタノールを利用した。改質(reformulated)PFVは、2回通過のために100nmフィルターの上の200nmフィルターを通して押し出された。
データ分析.グループAにおいて(in vitroでの刺激、グループ6a及びb):脾細胞(コントロール及びサイトカイン又はODNにより刺激された)は、0、1、2、3日目での抗CD20抗体(Rituxan(登録商標)/Herceptin(登録商標)/m−a−CD20)の存在下及び不在下におけるP815、YAC−1及び(Daudi/MCF−7/SK−BR−3)標的細胞に対する51Cr放出により、表現型及び活性化(DX5/CD16又はCD69及びCD11b/CD16又はCD69及びMac−3/CD16又はCD69)及び活性を、フローサイトメトリーにより分析されるだろう。
グループBにおいて(in vitroでの刺激、グループ1〜5):血液細胞、脾細胞、リンパ節細胞又は肝細胞は、抗CD20抗体(マウス抗ヒト、IgG1)の存在下及び不在下におけるP815、YAC−1及びDaudi標的細胞に対するADCCアッセイに使用され、そしてNK及び単球/マクロファージ活性化(DX5/CD16−CD69、CD11b/CD16−CD69、Mac−s/CD16−CD69)がFACSで分析されるだろう。
結果。ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのIV投与は、NK細胞活性化を誘導し、Yac−1細胞からのCr放出の増加に反映されているが、P815標的からのCr放出における増加はなかった(図3C及びD):YAC−1細胞においては、単回投与における細胞の活性化は全ての4つの臓器に対して同じパターンを有している:24時間〜48時間で顕著に上昇し、その後72時間で減少するか(脾臓、肝臓)又は48時間及び72時間で緩やかに減少する(リンパ節、血液)。72時間までに顕著に減少するが、依然としてエフェクター活性はコントロール群のものよりも高い。2回目の投与は、脾臓及びリンパ節から単離した細胞に対して有益ではないようであり、そして肝臓及び血液細胞に対してはわずかに活性を増加させた。
Yac−1殺傷に対する主なエフェクター集団は、NK細胞であるようである(図3E):ADCCにおいて最も高い影響を有するエフェクター集団を同定するために、コントロール及びいくつかの時点の脾細胞をNK細胞単離カラム(ポジティブ選択)に通し、元の集団と平行して単離物及び通過流出物をCrアッセイに使用した。単離手順により、コントロール群、24時間群、72時間−シングル群及び72時間−ダブル群それぞれの単離物において、初期の4〜7%から25%、15%、45%及び25%まで、全集団におけるNK細胞の量が増加した。NK単離物は10倍低いE:T比においてでも初期の画分よりわずかに高いレベルのCr放出を生み出すが、それは主なエフェクター集団としてNK細胞を単離する全く正当な理由ではないだろう。しかし、同時に通過流出物が初期の画分と同じE:T比で実質的に不活性であるという事実は、この結論を支持する。
ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのIV投与がNK細胞のADCC能を増加させることが、Daudi細胞(マウス及びヒト化抗体)に対して実証され、そしてSKBR−3細胞(ヒト化抗体)に対してはより小さな程度であることが実証される(図4A)。Rituxan(登録商標)及びマウス抗CD20抗体の比較性能は、異なる器官から得たエフェクターに対して異なる:マウス抗体は血液細胞のADCCを介在する能力においてRituxan(登録商標)よりも優れており、脾臓及び肝臓に対してはわずかに優れており、そしてリンパ節に対しては違いがない。誘導されるADCCのレベルは、肝臓において最も高く、次に脾臓と血液であり、最も低いレベルはリンパ節である。3日間の時間経過におけるADCCの発達は、4つの全ての器官から得たエフェクターに対して同じである:24時間及び48時間では上昇し、その後72時間で減少する(依然としてコントロールよりも高いが)。製剤の2回目の注射により、24〜48時間の時点のレベルまで肝細胞及び血液細胞のADCCレベルは回復したが、リンパ節に対するADCCは向上せず、脾細胞に対してはさらに減少する。製剤注射におけるADCCの全体的な増加は、エフェクター細胞の供給源に依存して、Rituxan(登録商標)に対しては10〜15%の上昇であり、そしてマウス抗CD20に対しては15〜20%の上昇であった。
Daudi/抗CD20系におけるADCCに対する主なエフェクター集団は、NK細胞のようである(図4B)。ADCCにおいて最も高い影響を有するエフェクター集団を同定するために、コントロール及びいくつかの時点の脾細胞をNK細胞単離カラム(ポジティブ選択)に通し、元の集団と平行して単離物及び通過流出物をCrアッセイに使用した。単離手順により、コントロール群、24時間群、72時間−シングル群及び72時間−ダブル群それぞれの単離物において、初期の4〜7%から25%、15%、45%及び25%まで、全集団におけるNK細胞の量が増加した。Daudi:NK単離物は10倍低いE:T比においてでも初期の画分よりわずかに高いレベルのCr放出を生み出すが、それは主なエフェクター集団としてNK細胞を単離する全く正当な理由ではないだろう。しかし、同時に通過流出物が初期の画分と同じE:T比で実質的に活性を欠いているという事実は、この結論を支持する。
実施例3
この一連の実験は、腫瘍を有しない及び腫瘍を有するマウスにおけるNK及びLAK活性及びADCCを介在する能力を評価するために設計された。
この一連の実験は、腫瘍を有しない及び腫瘍を有するマウスにおけるNK及びLAK活性及びADCCを介在する能力を評価するために設計された。
マウス。本実験において、8〜9週齢(20〜22g)の20 C57BI/6J雌性マウスを使用した。これらの動物を5つの群で飼育した。
投与量。4つの処理群が存在した。2つの群においては、各マウスは200mlのPBS(IV)中の105 B16/BL6細胞を受けた。10日後、腫瘍を有しない処理群及び腫瘍を有する処理群のマウスは、ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの静脈内(i.v.)尾静脈注射を受けた;体重に基づいた体積(20gマウスに対しては200ml、25gマウスに対しては250ml、など)。動物は、注射毎にODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの20ODN/kgの投与を受けた;製剤をHBSにおいて2mg/mlで調製した。
採取。動物を48時間後に屠殺し、そして器官(脾臓、血液、及び肺)を採取した(滅菌条件である必要はない)。滅菌条件は必要でない。組織を分離し、そして細胞をin vitroでの分析用に回収した。
データ分析。血液、脾細胞(元の集団、NK単離物及び通過流出物)を、Rituxan(登録商標)の存在下及び不在下において、YAC−1、Daudi標的細胞に対するCTL/ADCCアッセイに使用した;そしてNK及び単球/マクロファージ活性化(DX5/CD11b/Mac−3及びCD16/CD69/IL12−R)をFACSで分析した。血漿サンプルをIFNg及びIL−12に対するELISAにおいて試験した。
結果。In vitroでの細胞傷害性。ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの注射がNK細胞のかなりの活性化を誘導することを、腫瘍を有しない動物及び腫瘍を有する動物双方におけるYac−1標的に対するin vitroでの細胞毒性レベルによって測定した。TF及びTB群の脾臓NK細胞に対するYac−1殺傷の基準レベルは同じであった;血液NK細胞に関しては、それらのYac−1に対する活性は、TB群においてわずかに低かった(図5A)。ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの注射は、M14細胞(ヒト黒色腫)のin vitroでの殺傷をも直接的及び抗体を介在して刺激した(図5B及び5C)。脾臓においては、TFコントロールと比較してTBコントロール群におけるADCCレベルが増加した。ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームによる処理における、直接的及び抗体を介在した殺傷の刺激のレベルは、TB及びTF動物において同じであった。血液においては、M14細胞に対する直接的及び抗体依存的な細胞傷害性のTB及びTF基準レベルに違いはなかった;一方、TBマウスにおいてODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームによる処理は、直接的な殺傷を高いレベルで誘導し、そして抗体依存的殺傷を低いレベルで誘導した。
実施例4
この一連の実験は、NK及びLAK活性及びADCC(C3Hマウス)を介在する能力のための、注射投与量及び投与方式(ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソーム)を調べるために設計された。
この一連の実験は、NK及びLAK活性及びADCC(C3Hマウス)を介在する能力のための、注射投与量及び投与方式(ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソーム)を調べるために設計された。
マウス。この実験においては、8〜9週齢(22〜25g)の50 C3H雌性マウスを使用した。これらの動物を5つの群で飼育した。
投与量。様々な時点における、1つのコントロールと1つの投与群が存在した。試験サンプル及びコントロールの投与を、体重に依存した(例えば、20gのマウスに対して200ml、25gのマウスに対して350ml、など)注射体積で静脈性尾静脈により行った。動物は、10/20/30/40mgODN/kgの投与量のODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームを受けた;HBS中において1,2,3及び4mg/mlで調製された。
採取。マウスの血液及び脾臓を採取した。滅菌条件である必要はない。組織を分離し、そして細胞をin vitroでの分析用に回収した。
データ分析。血液及び脾細胞は、抗CD20抗体の存在下及び不在下にけるYAC−1、Daudi標的細胞に対するCTL/ADCCアッセイに使用された;そしてNK及び単球/マクロファージの増殖/活性化(DX5/CD11b/Mac−3及びCD16/CD69/IL12−R)をFACSで分析した。血漿はIFNg及びIL−12に対するELISAに使用されることとなる。
結果。ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの投与は、未処理動物における細胞活性と比較して、試験された全ての投与量でNK活性を強化した(図6A及びB)。IV投与量を増加することにより、脾臓NK細胞と比較して、血液NK細胞の活性化が平行して増加することが、Yac−1標的細胞に対するin vitroでの細胞傷害活性により測定された(図6B)。その活性は5〜10mg/mlで最大となりその後減少する(図6A)。これは脾臓から末梢血液への細胞の移動に起因しているのかもしれない。脾臓及び血液両方におけるNK活性の傾向は、これらの細胞のADCCを介在する能力にも反映された。ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの投与量の増加により、抗CD20抗体の存在下でのDaudi細胞に対するADCC活性能の増加が平行して生じる一方で(図7B)、脾臓NK細胞におけるADCC活性は5〜20mg/kgで最大になりその後減少した(図7A)。予想されたとおり、処理された動物は、未処理動物から得た細胞と比較して、ADCC活性の劇的な強化を示し、そして、抗体の不在下において全ての群の細胞溶解活性は最小であった。
投与量に加えて、ODN1m含有陽イオン性リポソームのNK及びADCC活性における効果は、投与方式に依存することも見出された。単回投与と比較して、42〜72時間以内のリポソームODN1mの複数回投与は、活性を強化しなかった(図8)。しかし、より長期間の複数回投与は、若干活性を強化した。週1回の投与方式での陽イオン性リポソームODN1mの投与は、脾臓(図9A)及び血液(図9B)それぞれにおいて、抗CD20抗体の存在下でのDaudi細胞に対するADCC活性の穏やか且つ顕著な強化を生じさせることが見出された。この活性は抗体の存在に依存していた。
実施例5
この一連の実験は、ADCCの処置モデルにおいて、Ritiximabと組み合わせたODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの有効性を調べるために設計された。
この一連の実験は、ADCCの処置モデルにおいて、Ritiximabと組み合わせたODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの有効性を調べるために設計された。
マウス。この実験においては、6〜8週齢(20〜22g)の50 SCID C.B−17Balb/c雌性マウスを使用した。これらの動物を5つの群で飼育した。
処理。様々な時点における、1つのコントロール群と9つの処理群が存在した。コントロール群を、5×106のNamalwa細胞でIVチャレンジし、HBSで処理された。4つの処理コントロール群は、5×106のNamalwa細胞でIVチャレンジを受け、そして5、10,20又は40mg/用量で週に1回Rituximabを用いたIV処理を受けた。1つの処理コントロール群を、5×106のNamalwa細胞でIVチャレンジし、週に2回10mg/kgでODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのIV注射を受けた。4つの処理群は、5×106のNamalwa細胞でIVチャレンジを受け、週に2回10mg/kgでODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのIV注射で処理され、そして5、10、20又は40ug/用量で週に1回Rituximab抗体で処理された。
投与量。動物は、PBS中において1mg/mLで調製されたODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの、10mgODN/kgの投与量を受けた。
腫瘍成長。Namalwa細胞を、本実験の開始前にin vitroで3〜5代継代の間培養した。本実験に用いたフラスコは、採取時に50〜60%の細胞密集度を示した。この単一細胞懸濁液を、氷上の50mLコニカルチューブに移した。いったん全ての細胞を採取したら、それらを1000rpm、5分間、4℃で1×滅菌ハンクス液中で洗った。細胞を数え、生存率が90%超の場合に限り使用した。細胞を、滅菌ハンクス液中で200mLあたり5×106細胞数(2.5×107細胞数/mL)となるように希釈した。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をマウスi.v.内に(尾静脈を通して)移植した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。週に2回体重を測定した。
データ分析。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少>20%の兆候を示した時に、それらを安楽死させた。CO2吸入によりマウスを屠殺した。分析は体重及び安楽死の時期に基づいた。癌の動物モデルにおける主体(principal)のADCCの証明として、MST(平均生存期間)を用いて抗腫瘍効力を判断した。週2回動物の体重を測定した。この投与方式の耐容性及び毒性を評価した。
結果。ヒトB細胞リンパ腫細胞系のNamalwaでチャレンジしたSCIDマウスでの効力試験において、抗CD20抗体のRituxan(登録商標)及びODN1m含有陽イオン性リポソームとの組み合わせでの処理が、抗体又はリポソームODN1m単独のいずれかによる処理と比較して、抗腫瘍効力の強化をもたらすことが、強化された生存により判断された(図10A)。未処理動物は16日の平均生存期間を有し、一方10又は20mgの抗体で処理した動物はそれぞれ20日及び21日の平均生存期間を有し(25%及び31%の寿命の増加(%)又はILS(%))、そしてリポソームODN1m単独で処理した動物は34日の平均生存期間を有した(112%のILS(%))。しかし、10又は20mgいずれかのRituxan(登録商標)とリポソームODN1mとの組み合わせで処理した動物は、67日の異常な平均生存期間を有していた(ILS(%)>325%)(図10B)。
実施例6
この一連の実験は、癌の同系動物モデルにおいて(EL4腫瘍細胞をC57BI/6マウスにIV投与)、ADCC適用のために抗GD2モノクローナル抗体と共に投与された免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの抗腫瘍効力を評価するために設計された。
この一連の実験は、癌の同系動物モデルにおいて(EL4腫瘍細胞をC57BI/6マウスにIV投与)、ADCC適用のために抗GD2モノクローナル抗体と共に投与された免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームの抗腫瘍効力を評価するために設計された。
マウス。本実験において、10〜12週齢(20g〜22g)の30 C57BI/6雌性マウスを用いた。これらの動物を5つの群で飼育した。6つのマウスの群が存在した。
処理。動物を、5×104のEL4細胞でIVチャレンジした。1つの群は未処理(HBS)であり、他方の5つは5又は10mg/kg(体重に基づいて)の投与量のODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのIV注射を週2回受けた。3つの群も、20mg/マウス(0.250mg/mlストックの80ml)でGD2抗体のIV注射を週1回受けた。
投与量。動物は、注射毎にODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの5mg/kg又は10mg/kg ODN/kg投与量を受けた;製剤はPBS中において0.5mg/mL及び1.0mg/mLで調製された。
腫瘍成長。本実験の開始前に、EL4細胞をin vitroで3〜5代継代の間培養した。単一細胞懸濁液を氷上の50mLコニカルチューブに移した。いったん全ての細胞を採取して、それらを1,000rpm、5分間、4℃で1×滅菌ハンクス液中で洗った。細胞数を数え、生存率が90%超の場合のみ使用した。細胞を、滅菌ハンクス液中で200mLあたり5×104細胞数(2.5×105細胞数/mL)となるように希釈した。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をIV投与した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。
データ分析。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少>20%の兆候を示した時に、それらを安楽死させた。CO2吸入によりマウスを屠殺した。分析は生存曲線に基づいた。癌の同系モデルにおいて、モノクローナル抗体と共に投与されたODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの抗腫瘍効果を発揮する効力を評価するために、MST(平均生存期間)が用いられた。週2回動物の体重を測定した。ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの投与方式の耐容性及び毒性を評価した。
結果。同系C57BI/6−EL4胸腺腫IV及びSC腫瘍モデルにおける効力研究において、腫瘍関連抗原GD2を認識する抗体とODN1m含有陽イオン性リポソームとの組み合わせでの処理は、抗体又はリポソームODN1mのいずれかの単独処理と比較して、抗腫瘍効力の強化をもたらした。C57BI/6−EL4 SCモデルにおいては、20mg/kgの抗GD2抗体と5mg/kgのリポソームODNとの組み合わせでの処理は、同等の用量の抗GD2抗体又はリポソームODN1m単独での処理と比較して腫瘍成長の優れた阻害をもたらした(図11A)。全ての処理は、未処理の動物と比較して腫瘍成長の阻害をもたらした。同様に、C57BI/6−EL4IV腫瘍モデルにおいては、抗GD2抗体及びリポソームODN1mとの組み合わせでの処理はそれぞれの単独での処理と比較して効力の強化がもたらされることが、強化された生存により判断された(図11B)。未処理の動物は17日の平均生存期間を有し、一方、抗GD2抗体とリポソームODN1m単独で処理された動物は、それぞれ24日及び23日の平均生存期間を有した(35%及び41%のILS(%))。抗体とリポソームODN1mとの組み合わせでの処理は、31日の異常な平均生存期間をもたらした(82%超のILS(%))(図11C)。
実施例7
この一連の実験は、注射投与方式(ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソーム及びODN2[配列番号:1]PS遊離型)のNK及びLAK活性並びにADCCを介在する能力を評価するために設計された(C3Hマウス)。
この一連の実験は、注射投与方式(ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソーム及びODN2[配列番号:1]PS遊離型)のNK及びLAK活性並びにADCCを介在する能力を評価するために設計された(C3Hマウス)。
マウス。本実験において、実験の時期までに8〜9週齢(22〜25g)の60 C3H雌性マウスを用いた。動物を5つの群で飼育した。
処理。様々な時点における1つのコントロール群及び1つの処理群が存在した。マウスは体重に基づいた体積(20gのマウスに対して200mL、25gのマウスに対して250mL、など)で、静脈性(i.v.)尾静脈注射を受けた。
採取。血液及び脾臓を採取した。滅菌条件は必要とされなかった。組織を分離し、そして細胞をin vitroでの分析用に回収した。
投与量。動物は注射毎にODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの20mgODN/kgの投与量を受けた;製剤はPBS中において2mg/mlで調製された。
データ分析。血液細胞及び脾細胞を、抗CD20抗体(Rituxan(登録商標)及び/又はマウス抗ヒトIgG1)の存在下及び不在下でのP815、YAC−1、Daudi標的細胞に対するCTL/ADCCアッセイ並びにHerceptin(登録商標)の存在下及び不在下でのSKBR−3標的細胞に対するCTL/ADCCアッセイに使用した;そしてNK及び単球/マクロファージ活性化(DX5/CD16−CD69、CD11b/CD16−CD69、Mac−3/CD16−CD69)をFACSで分析した。
結果。図8Bで示された結果は、投与方式の重要性に関する実施例4で記載された結論を支持する。図8Aで見られるように、ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの単回注射は5日間のADCC活性の強化をもたらし、投与後24〜48時間後ピークが現れた。24、48又は72時間内の2回投与は、血液又は脾臓それぞれにおけるこの刺激動態を変化させず、ADCC活性の強化は単回又は2回注射のいずれに対しても同様である。
実施例8
この一連の実験は、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームのADCC介在能力並びにBrDu取り込み実験に用いるNK細胞の増殖及び動員を容易にする能力を調べるために設計された。
この一連の実験は、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームのADCC介在能力並びにBrDu取り込み実験に用いるNK細胞の増殖及び動員を容易にする能力を調べるために設計された。
マウス。本実験の時期までに8〜9週齢(20〜22g)の36 C3H雌性マウス。これらの動物を3つの群で飼育した。
投与量。2つの時点において、2つの処理群と1つのコントロールが存在した。試験サンプル及びコントロールの投与は、体重に依存した注射体積(例えば、20gのマウスに対して200ml、25gのマウスに対して250ml、など)で静脈性尾静脈注射により行った。1つ目の群において、動物は遊離型ODN2[配列番号:1]の20mgODN/kgを受けた。2つ目の群においては、動物はPBS中において2mg/mlで調製されたODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの20mgODN/kg投与量を受けた。コントロール群においては、動物はHBSを受けた。いずれの処理群においても、4つのサブグループが存在した。各処理投与方式に対する4つのサブグループのうち2つは、48時間で回収され、残りのサブグループは168時間で回収された。各時点において、1つのサブグループは全期間においてBrDuで標識し、そして他のサブグループは処理の最後の18時間においてBrDuで標識した。
採取。血液、骨髄及び脾臓を採取した。組織を分離し、そして細胞をin vitroでの分析用に回収した。
製剤。ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームを、予備成形小胞(PFV)技術及び、実用的エタノール(utilized ethanol)を用いて生成した。改質(reformulated)PFVは、2回通過のために100nmフィルターの上の200nmフィルターを通して押し出された。
データ分析。全ての群の細胞について、フローサイトメトリー(FACS)によりNK細胞中へのBrDuの取り込みを分析した。全期間、48時間又は168時間の間BrDuで標識した細胞を、標識する期間のNK細胞の全増殖を判断するのに用いた。NK細胞が分裂すると、ヌクレオチドアナログであるBrDuは新たに形成されたDNA中に取り込まれる。処理の最後の18時間においてBrDuで標識された細胞は、処理後48時間又は168時間に増殖した細胞の比率を決定するのに用いた。
結果。ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのIV投与は、コントロールと比較して血液中の全NK細胞の増加に反映されるNK細胞集団の増殖を誘導する(図12A)。これらのデータは、末梢血液における2日の時点までのNK細胞集団の急速な増殖を示す。7日までには、NK細胞集団はコントロールと同じになり、これは増殖の大部分が早期の2日の時点で生じ、7日までにはコントロールレベルまで減少することを示している。
ODN1m含有陽イオン性リポソーム及び遊離型ODN2のIV投与は、NK細胞の増殖を誘導し、これはNK細胞へのBrDuの取り込みの増加に反映される(図12B)。2日目の時点(48時間)において、リポソームODN1mで処理した動物は、NK細胞増殖においてコンロトール(1.25%から29.32%まで)を超えておよそ2250%の増加を示し、そして全期間においてBrDuが存在する場合には遊離型ODNを超えて50%超(19.01%から29.32%まで)の増加を示した。さらに、処理の最後の18時間の間において、リポソームODN1mはコントロール(1.37%から21.54%まで)よりも1472%超の細胞増殖を示した。その後7日目まで増殖は減少し、NK細部集団はコントロールよりもほんのわずか良かった。最後に、図12Cは、血液中に存在する全NK細胞数と比較した、増殖に起因するNK細胞のパーセンテージを説明している。ほんの12%が増殖に起因するコントロール及び遊離型ODN2で処理した動物における60%と比較して、2日後の陽イオン性リポソームODN1mによる処理後に存在するNK細胞のおよそ80%は増殖に起因する。
実施例9
この一連の実験は、Herceptin(登録商標)との組み合わせでのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの、癌処置モデルにおいてADCCを強化する有効性を調べるために設計された。
この一連の実験は、Herceptin(登録商標)との組み合わせでのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの、癌処置モデルにおいてADCCを強化する有効性を調べるために設計された。
マウス。本実験において、8〜9週齢(20〜22g)の75 C3H雌性マウスを使用した。これらの動物を5つの群で飼育した。
処理。いくつかの時点における、1つのコントロール群と4つの処理群が存在した。各群を、200ul体積中の103 38C13−Her2/neu細胞でIVチャレンジした。コントロール群はHBSで処理した。1つの処理群は、3週間の間週に1回50mg/用量のHerceptin(登録商標)で処理した。別の処理群は、20mg/kgのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソーム及び50ug/用量のHerceptin(登録商標)抗体のIV注射で週に1回処理した。付加的処理群は、20mg/kgのODN1m[配列番号:4]遊離型又はODN2m[配列番号:1]PS遊離型の1つのIV注射を受けた。
腫瘍成長。実験開始前に、38C13−Her2/neu細胞をin vitroで3〜5代継代の間培養した。この細胞を採取して、単一細胞懸濁液を氷上の50mLコニカルチューブに移し、そして1400rpm、5分間、4℃で1回滅菌ハンクス液中において洗った。細胞を数え、生存率が90%超の場合のみ使用した。細胞を滅菌ハンクス液中で200ul(IV)あたり1×103まで希釈した。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をマウスのIV中に移植した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。週に2回体重を測定した。
データ分析。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少>20%の兆候を示した時に、それらを安楽死させた。CO2吸入によりマウスを屠殺した。分析は体重及び安楽死の時期に基づいた。癌の動物モデルにおける主体のADCCの証明として、抗腫瘍効力を判断するためにMST(平均生存期間)を用いた。週2回この動物の体重を測定した。この投与方式の耐容性及び毒性を評価した。
結果。これらのデータは、ヒト抗原Her2/neuを発現させるために導入されたマウスリンパ腫細胞系の38C13でチャレンジしたC3Hマウスでのこの同系腫瘍モデルにおいて、ODN1m含有陽イオン性リポソームのIV投与がHerceptin(登録商標)の抗腫瘍効力の強化に効果的であることを示している(図13A)。50mg/マウスの投与量でのHerceptin(登録商標)の単独投与は、14%の少しの寿命の増加をもたらし(図13B)、一方、50mg/マウスのHerceptin(登録商標)との組み合わせでの遊離型ODN1mの20mg/kgの投与は、コントロールを超えて54%まで少しのさらなる寿命の増加をもたらした。驚いたことに、50mg/マウスのHerceptin(登録商標)との組み合わせでの遊離型ODN2PSの20mg/kgの投与は、本明細書中で試験された条件下では寿命を増加させなかった。しかし、Herceptin(登録商標)との組み合わせでの20mg/kgODN1m含有陽イオン性リポソームの投与は、相乗的に作用して、抗腫瘍の効力を強化し、未処理のコントロールを超えて400%の寿命の増加をもたらした。これらのデータは、リポソームODN1mがHerceptin(登録商標)と相乗的に作用し、その活性は遊離型ODN2PS又はODN1mそれぞれより優れていることを示している。
導入された38C13細胞系においてHer2/neuが機能的役割を有さないことが予想されるだろうという事実を考慮すると、このモデルは特に興味深い。Herceptin(登録商標)による処置の候補であるヒト乳癌及び卵巣癌において、Her2/neuは過剰発現され、そして成長因子の結合において腫瘍細胞の増殖をもたらす増殖及び生存シグナルを変換する受容体として機能する。これらの細胞に対して、Herceptin(登録商標)は2つの方法で抗腫瘍作用を発揮する。この2つの方法は、1)成長因子の結合をブロックし、そして細胞表面の発現を下方制御して、これによりこれらの生存/増殖シグナルを妨げること;及び2)ADCCなどによる免疫介在性破壊のためにその細胞を標的とすること、による。しかし、Her2/neuが成長因子受容体としての機能を全く有さないと予想されるこれらの導入された38C13細胞の場合、抗腫瘍作用は多分ADCC活性に単独で直接的に起因するだろう。従って、シグナル機序としてのADCCは顕著な抗腫瘍活性を発揮することができ、そして腫瘍細胞を認識し結合するが、それら自身では処置活性を全く有しないか又は少ししか有しないモノクローナル抗体の使用の可能性を上げるという強力な証拠を、このモデルは提供する。
実施例10
この一連の実験は、抗GD2モノクローナル抗体との組み合わせでのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの、癌処置モデルにおいてADCCを強化する有効性を調べるために設計された。
この一連の実験は、抗GD2モノクローナル抗体との組み合わせでのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの、癌処置モデルにおいてADCCを強化する有効性を調べるために設計された。
マウス。本実験において、10〜12週齢(20〜22g)の30 C57BI/6雌性マウスを用いた。これらの動物を5つの群で飼育した。
処理。1つのコントロール群と5つの処理群が存在した。各群を5×105のEL4細胞でSCチャレンジした。コントロール群をHBSで処理した。2つの処理群は、週2回、5又は10mg/kg(体重に基づいた)の投与量で単独のODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのIV注射を受けた。3つの処理群は、5又は10mg/kgの投与量(体重に基づいた)での週2回のODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのIV注射及び20ug/用量での週1回の抗GD2抗体のIV注射を受けた。
腫瘍成長。本実験の開始前に、細胞をin vitroで3〜5代継代の間培養した。細胞を採取し、そして単一細胞懸濁液を氷上の50mLのコニカルチューブに移し、滅菌ハンクス液中において1400rpm、5分、4℃で1×洗った。細胞を数え、そして生存率が90%超の場合に使用した。細胞を希釈して、滅菌ハンクス液中で200ul(IV)あたり5×105細胞数とした。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をマウスSC中へ移植した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。週に2回体重を測定した。
データ分析。本研究の間は1日おきにキャリパー(caliper)を用いて一次腫瘍容積を測定した。本研究の間は1日おきに、長さ(mm)、幅(mm)、及び高さ(mm)の測定を行った。腫瘍容積は以下の2つの式から計算した:
腫瘍容積(mm3)=(L×W2)/2
腫瘍容積(mm3)=(L×W×H)×p/6
腫瘍容積(mm3)=(L×W2)/2
腫瘍容積(mm3)=(L×W×H)×p/6
腫瘍容積がおよそ2000mm3に達した時又は腫瘍細胞注射後約15日でマウスを屠殺した。投与期間中の動物の任意の拒絶反応を観察した。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少>20%の兆候を示した時にも、それらを安楽死させた。
結果。20mg/動物での抗GD2抗体又は10若しくは20mg/kgでのODN1m含有陽イオン性リポソームのいずれかの単独での投与は、腫瘍成長のごく穏やかな阻害を引き起こした。20mg/動物の抗GD3抗体との組み合わせでの10又は20mg/kgのリポソームODN1mの投与は、コントロール動物及び抗GDX2又はリポソームODN1mの単独で処理したものと比較して、抗GD2抗腫瘍活性の穏やかな強化を引き起こした(図14A)。興味深いことに、ごく穏やかな活性の強化が見られたが、抗体の存在下及び不在下のどちらにおいても、リポソームODN1mを受けた動物の25〜60%において比較的高い頻度での腫瘍の退化が観察された(図14B)。腫瘍退化が後に続く腫瘍成長の動態は、最終的に腫瘍の完全な退化の原因であろう適応免疫応答の発達を示唆した。これがその場合であるかを評価するために、腫瘍が退化した動物の抗原特異的細胞性免疫応答又は体液性免疫応答を分析した。
実施例11
この一連の実験は、抗GD2モノクローナル抗体との組み合わせでのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの、癌処置モデルにおけるADCCを強化する能力及び二次免疫応答の発達を容易にする能力を調べるために設計された。
この一連の実験は、抗GD2モノクローナル抗体との組み合わせでのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの、癌処置モデルにおけるADCCを強化する能力及び二次免疫応答の発達を容易にする能力を調べるために設計された。
マウス。実施例10で説明された処理の後に生存する動物。
採取。マウスの脾臓及び血漿を採取した。組織を分離し、そして細胞をin vitroでの分析用に回収した。
データ分析。採取した脾細胞を、マイトマイシンCで処理したEL4腫瘍細胞を用いてin vitroで刺激した。次に、Cr放出アッセイにより脾細胞のin vitroでの腫瘍細胞を殺傷する能力を分析した。フローサイトメトリー(FACS)により、血漿サンプルに腫瘍細胞を認識しそして結合することのできる抗体が存在するかを試験した。
結果。これらの研究のデータは、抗原特異的細胞性応答及び体液性応答の両方に関して二次適応免疫応答の発達を示す。図15Aで示されているように、EL−4腫瘍をSC中に投与された動物から単離した脾細胞はリポソームODN1mとの組み合わせでの処理後に完全に退化し、そしてin vitroで刺激され、未処理動物の脾細胞と比較して、クロム放出アッセイにおいて抗原特異的な様式でEL−4腫瘍細胞を溶解する能力が強化されることが実証された。さらに、これらの同一の動物から単離されそしてフローサイトメトリーにより分析された血清は、EL−4腫瘍細胞を認識しそして結合することのできる免疫グロブリンの存在を明らかにした、図15B。これらの結果の両方は、初期の腫瘍チャレンジを完全に消去することが可能なそれらの動物における二次的な抗原特異的、抗腫瘍適応免疫応答の発達を示す。これらのデータは、腫瘍特異的抗原との組み合わせでのリポソームODN1mを用いた処理が長期持続的、抗原特異的適応免疫応答の発達をもたらし、そして疾患再発の長期予防を発達させることの可能性を高めることができることを示す。
実施例12
この一連の実験は、同系動物モデルにおいて、抗PSモノクローナル抗体と共に投与されたODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの、癌の処置モデルにおけるADCCを強化する抗腫瘍効力を評価するために設計された。
この一連の実験は、同系動物モデルにおいて、抗PSモノクローナル抗体と共に投与されたODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの、癌の処置モデルにおけるADCCを強化する抗腫瘍効力を評価するために設計された。
マウス。本実験においては、10〜12週齢(20〜22g)の38 C57BI/6雌性マウスを使用した。これらの動物を5つのグループで飼育した。
処理。1つのコントロール群と5つの処理群が存在した。各群を、1×105のEL−4細胞でSCチャレンジした。コントロール群はHBSで処理した。1つの処理群は、週に2回、10mg/kgのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソーム(体重に基づいた)のIV投与を受けた。1つの処理群は、週に1回、50ug/mlで抗PS抗体のIV注射を受けた。付加的な処理群は、週に2回、10mg/kgのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソーム(体重に基づいた)のIV投与及び、週に1回、50ug/用量で抗PS2抗体又はHerceptin(登録商標)のいずれかのIV投与を受けた。
腫瘍成長。本実験の開始前に、EL4細胞をin vitroで3〜5代継代の間培養した。単一細胞懸濁液を氷上の50mLコニカルチューブに移した、いったん全ての細胞が採取されたら、それらを滅菌ハンクス液中において1000rpm、5分、4℃で1×洗った。細胞を、その生存率が90%超の場合に使用した。細胞を、滅菌ハンクス液中で100mLあたり105細胞数(1×106細胞数/mL)まで希釈した。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をsc投与した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。
データ分析。投与する間、動物の任意の拒絶反応を観察した。一次腫瘍容積はキャリパーを用いて測定した。本研究の間は1日おきに、長さ(mm)、幅(mm)、及び高さ(mm)の測定を行うだろう。腫瘍容積は以下の2つの式から計算した:
腫瘍容積(mm3)=(L×W2)/2
腫瘍容積(mm3)=(L×W×H)×p/6
腫瘍容積(mm3)=(L×W2)/2
腫瘍容積(mm3)=(L×W×H)×p/6
腫瘍容積がおよそ2000mm3に達した時、又は腫瘍細胞注射後約15日で、又は生体動物園のスタッフ(vivarium staff)の判断によりマウスを屠殺した。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少>20%の兆候を示した時にも、それらを安楽死させた。CO2吸入によりマウスを屠殺した。
結果。これらのデータは、ODN1m含有陽イオン性リポソームのIV投与がC57BI/6マウス中のマウス胸腺腫細胞系EL−4を用いたこの同系sc腫瘍モデルにおいて、抗脈管形成抗体の抗腫瘍効果を強化するのに効果的であることを示している。この抗体は、腫瘍血管系及び腫瘍細胞の両方で高く発現することが見出された脂質である、ホスファチジルセリン(PS)に対して特異的である。抗PS抗体の50mg/マウスでの単独投与は、腫瘍成長において全く適切な効果を有さなかった。同様に、10mg/kgの投与量でのリポソームODN1mの単独投与は、腫瘍成長のごく穏やかな阻害をもたらした。しかし、図16に示されているように、10mg/kgのリポソームODN1mとの組み合わせでの50mg/マウスの抗PS抗体の投与は、腫瘍成長の顕著な阻害をもたらした。事実、平均腫瘍容積が16日目までにおよそ1800mm3まで増加した後に、腫瘍の退化が観察され、平均容積は21日目までに1000mm3まで減少し、そして最終的には検出可能な腫瘍の完全な除去がもたらされた。
実施例13
この一連の実験は、抗PS抗体との組み合わせでのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの、癌の処置モデルにおけるADCCを強化する効力を調べるために設計された。
この一連の実験は、抗PS抗体との組み合わせでのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの、癌の処置モデルにおけるADCCを強化する効力を調べるために設計された。
マウス。本実験においては、8〜9週齢(20〜22g)の72 C3H雌性マウスを使用した。これらの動物を3又は4つの群で飼育した。
処理。様々な時点における、1つのコントロール群と3つの処理群が存在した。各群を、50ul容積において3×103の38C13細胞でIVチャレンジした。コントロール群をHBSで処理した。1つの処理群は、3週間の間、週に1回、15ug/用量の抗PS抗体で処理した。別の処理群は、週に1回20mg/kgのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソーム及び15ug/用量の抗PS抗体のIV注射により処理した。さらなる処理群は、20mg/kgのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのIV注射を受けた。
腫瘍成長。本実験の開始までに、細胞は31代継代であった。細胞を採取して、単一細胞懸濁液を氷上の10mLコニカルチューブに移し、そして滅菌PBS中で1000rpm、5分、4℃で1×洗った。細胞は、その生存率が90%超の場合に使用した。細胞を、滅菌PBS中(各濃度に対して2mL)で、50ulあたり3×103細胞数(20×103及び60×103細胞数/ml)まで希釈した。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をマウスSC中へ移植した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。週に2回腫瘍サイズ及び体重を測定した。
データ分析。本研究の間は1日おきにキャリパーを用いて一次腫瘍容積を測定した。腫瘍容積がおよそ2000mm3(L×W×W/2)に達した時又は生体動物園のスタッフの判断によりマウスを屠殺した。マウスを観察し、疾患進行の兆候が表れた時に安楽死させた。
結果。これらのデータは、ODN1m含有陽イオン性リポソームのIV投与が、C57BI/6マウス中のマウスリンパ腫細胞系38C13を用いたこの同系sc腫瘍モデルにおいて抗脈管形成抗体の抗腫瘍効果を強化するのに効果的であることを示している。この抗体は、腫瘍血管系及び腫瘍細胞の両方で高く発現することが見出される脂質である、ホスファチジルセリン(PS)に対して特異的である、図17。15mg/マウスの投与量での抗PS抗体の単独投与及び10mg/kgの投与量でのリポソームODN1mの単独投与は両方とも、未処理のコントロール動物と比較して腫瘍成長における穏やかな阻害効果を発揮することが見出された。しかし、10mg/kgのリポソームODN1mとの組み合わせでの15mg/マウスの抗PS抗体の投与は、未処理のコントロール動物及びどちらかの物質単独で処理した動物の両方と比較して、腫瘍成長の顕著な阻害がもたらされた。
実施例13
この一連の実験は、Rituximabとの組み合わせでのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの、癌の処置モデルにおけるADCCを強化する効力を調べるために設計された。
この一連の実験は、Rituximabとの組み合わせでのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームの、癌の処置モデルにおけるADCCを強化する効力を調べるために設計された。
マウス。本実験においては、6〜8週齢(20〜22g)の50 SCID C.B−17 Balb/c雌性マウスを使用した。これらの動物を5つの群で飼育した。
処理。2つの抗体コントロール群と3つの処理群が存在した。各群を、5×106のDaudi細胞でIVチャレンジした。コントロール群は、週に1回、5ug/用量及び40ug/用量で処理した。1つの処理群は、週に2回、10mg/kgでのODN1m含有陽イオン性リポソームのIV注射を受けた。付加的な処理群は、週に2回の10mg/kgのODN1m含有陽イオン性リポソーム、及び週に1回の5ug/用量又は40ug/用量でのRituximab抗体のIV注射を受けた。
腫瘍成長。本実験の開始前に、in vitroでDaudi細胞を3〜5代継代の間培養した。本実験で使用したフラスコは、採取の時50〜60%の細胞密集度を示した。単一細胞懸濁液を氷上の50mLコニカルチューブに移した。いったん細胞が採取されたら、それらを1×滅菌ハンクス液中で100rpm、5分、4℃で洗った。細胞は、その生存率が90%超の場合に使用した。細胞を、滅菌ハンクス液中で200mLあたり5×106細胞数(2.5×107細胞数/mL)まで希釈した。いったん全ての細胞懸濁液が温められたら、細胞をマウスIV中(尾静脈により)に移植した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。マウスを毎日チェックした。週に2回体重を測定した。
データ分析。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少>20%の兆候を示した時に、それらを安楽死させた。CO2吸入によりマウスを屠殺した。分析は体重及び安楽死の時期に基づいた。癌の動物モデルにおける主体のADCCの証明として、MST(平均生存期間)を用いて抗腫瘍効力を判断した。週2回動物の体重を測定した。この投与方式の耐容性及び毒性を評価した。
結果。これらのデータは、ODN1m含有陽イオン性リポソームのIV投与が、SCIDマウス中のヒトB細リンパ腺腫細胞系であるDaudiを用いたこの異種腫瘍モデルにおいて、Rituxan(登録商標)の抗腫瘍効果を強化するのに効果的であることを示している。5及び40mg/マウスの投与量でのRituxan(登録商標)の単独投与は、未処理動物と比較して、それぞれ250及び120%超の寿命の増加において効果的であり、一方、10mg/kgの投与量でのリポソームODN1mの投与はほぼ350%の寿命の増加をもたらした。しかし、10mg/kgのリポソームODN1mとの組み合わせでの5及び40mg/マウスのRituxan(登録商標)の投与は、450%超の寿命の強化された増加をもたらした、図18。これらのデータは、組み合わせの群における動物は悪性疾患に負けずに安楽死させられたという事実を考慮するとより印象的である。両方の組み合わせの群における全ての動物は、見掛けは健康であり、安楽死の時点でも疾患の兆候はなかった。従って、この組み合わせは寿命においてさらに高い顕著な効果を有し、そして470%は非常に控えめな推定値であると予測することができた。
実施例14
この一連の実験は、リポソームODNとHerceptin(登録商標)との間のMCF−7 her2/neuの腫瘍成長を阻害する相乗作用を、強化されたADCC活性を介して調べるために設計された。
この一連の実験は、リポソームODNとHerceptin(登録商標)との間のMCF−7 her2/neuの腫瘍成長を阻害する相乗作用を、強化されたADCC活性を介して調べるために設計された。
マウス。本実験においては、6〜8週齢(20〜22g)の50 SCID C.B−17 Balb/c雌性マウスを使用した。これらの動物を5つの群で飼育した。
処理。1つのコントロール群と7つの処理群が存在した。各群を、50ul中で1×107のMCF−7細胞でSCチャレンジした。コントロール群はHBSで処理した。処理群の1組は、3週間の間、週に2回、10又は20mg/kgのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのIV注射を受けた。別の処理群は、10mg/kgのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソーム及び50ugの無関係の抗体であるRituximabのIV注射を受けた。処理群の別の組は、50ug/用量のHerceptin(登録商標)又は75ug/用量のHerceptin(登録商標)の1つを受けた。付加的な処理群は、週に2回の20mg/kgのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソーム及び週に1回の50ug/用量又は75ug/用量のHerceptin(登録商標)抗体のIV注射を受けた。腫瘍細胞で動物をチャレンジする期間のある1日に、MCF−7腫瘍細胞が成長するのにエストロゲンが必要であるので、各動物に17−b−エストラジオール錠剤を移植した。
腫瘍成長。MCF−7細胞は、本実験の開始前にin vitroで3〜5代継代の間培養した。この単一細胞懸濁液は、氷上の50mLコニカルチューブに移した。いったん全ての細胞が採取されると、1000rpm、5分間、4℃で滅菌ハンクス液中で1×洗った。細胞の生存率が90%超の場合に限り、それらを使用した。細胞を、滅菌ハンクス液中で50mLあたり10×106細胞数(200×106細胞数/mL)まで希釈した。いったん細胞懸濁液が温められたら、細胞をSC投与した。接種前に細胞を良く混合させるために注意を払った。週に2回、腫瘍の大きさを測定した。
データ分析。マウスが病的状態、腹部膨張、後肢麻痺又は体重減少>20%の兆候を示した時に、それらを安楽死させた。CO2吸入によりマウスを屠殺した。ADCC発達に対するODN1m[配列番号:4]の最適な投与量を選択するために、MST(メディアン腫瘍サイズ)を用いた。週に2回動物の体重を測定した。ODN1m[配列番号:4]投与の投与方式の耐容性及び毒性を評価した。
結果。これらのデータは、ODN1m含有陽イオン性リポソームのIV投与が、SCIDマウス中のヒト乳癌細胞系であるMCF−7を用いたこの異種腫瘍モデルにおいてHerceptin(登録商標)の抗腫瘍効果を強化するのに効果的であることを示している。50及び75mg/マウスの投与量でのHerceptin(登録商標)の単独投与は、未処理のコントロール動物と比較して、それぞれ87%及び89%で腫瘍サイズを減少させるのに効果的であり、一方、10及び20mg/kgの投与量でのリポソームODN1mの単独投与は34%及び54%の腫瘍サイズの減少をもたらした、図19。しかし、20mg/kgのリポソームODN1mとの組み合わせでの50及び75mg/マウスの投与量でのHerceptin(登録商標)の投与は、MCF−7腫瘍成長の完全な阻害をもたらし、検出可能な腫瘍はなかった。予測されたとおり、腫瘍細胞を認識しない無関係な抗体(この場合はRituxan(登録商標))との組み合わせでの10mg/kgのリポソームODN1mの投与は、等量の陽イオン性リポソームODN1mの単独と比較して、腫瘍成長の阻害を強化しなかった。さらに、コントロール群、無関係の抗体の群、10及び20mg/kgのリポソームODN1mの群並びに50mg/動物のHerceptin(登録商標)の群における全ての動物、そして75mg/動物の群の80%の動物は、腫瘍負荷を示し、一方、Herceptin(登録商標)及びリポソームODN1mの組み合わせで処理した群の全ての動物は全く腫瘍がなかったという事実によって、リポソームODN1mのこの動物モデルにおいてHerceptin(登録商標)の抗腫瘍効果を強化する能力がさらに実証された。
実施例15
2つの独立した腫瘍モデルを用いたこの一連の実験は、腫瘍部位へのNK細胞の移行を評価するために設計された。
2つの独立した腫瘍モデルを用いたこの一連の実験は、腫瘍部位へのNK細胞の移行を評価するために設計された。
EL−4腫瘍モデル
マウス。本実験においては、8〜9週齢(20〜22g)の65 C57BI/6J雌性マウスを使用した。これらの動物を5つの群で飼育した。
マウス。本実験においては、8〜9週齢(20〜22g)の65 C57BI/6J雌性マウスを使用した。これらの動物を5つの群で飼育した。
処理。2つの処理群が存在した。各群を、50ulのPBS中の5×105のEL−4細胞でSCチャレンジした。最初の処理群は腫瘍を有しており、HBSで処理された。2番目の群は腫瘍を有しており、そして20mg/kgのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのIV注射を受けた。
採取。腫瘍を採取した、滅菌条件は必要ない。組織を分離し、そして細胞をin vitroでの分析用に回収した。
製剤。免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームは、予備成形小胞(PFV)技術を用いて生成し、エタノールを利用した。改質(reformulated)PFVは、2回通過のために100nmフィルターの上の200nmフィルターを通して押し出された。
データ分析。腫瘍から得た細胞は、フローサイトメトリー(FACS)により、NK細胞数の活性化(DX5の発現により)及び活性化状態(CD16の発現により)を分析した。
38C13腫瘍モデル
マウス。本実験においては、8〜9週齢(20〜22g)の30 CH3雌性マウスを使用した。これらの動物を3つの群で飼育した。
マウス。本実験においては、8〜9週齢(20〜22g)の30 CH3雌性マウスを使用した。これらの動物を3つの群で飼育した。
処理。3つの処理群が存在した。最初の群は腫瘍がなく、週に1回、20mg/kgのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのIV注射を受けた。腫瘍を持つ各群を、100ulのPBS中のMMC(マイトマイシンC)で前処理した1×106の38C13細胞を用いてSCチャレンジした。腫瘍を持つマウスの1つの群はHBSで処理された。腫瘍を持つマウスの2番目の群は、週に1回、20mg/kgのODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソーム(体重に基づいた)のIV注射を受けた。
採取。腹膜洗浄、滅菌条件は必要ない。組織を分離し、そして細胞をin vitroでの分析用に回収した。
製剤。ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームは、予備成形小胞(PFV)技術を用いて生成し、エタノールを利用した。改質(reformulated)PFVは、2回通過のために100nmフィルターの上の200nmフィルターを通して押し出された。
データ分析。腹膜洗浄から得た細胞は、フローサイトメトリー(FACS)により、NK細胞数(DX5の発現により)及び活性化状態(CD16の発現により)を分析した。
結果。これらの2つの研究のデータは、未処理動物と比較して、ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのiv投与がNK細胞の腫瘍負荷部位へのホーミングをもたらし、疾患部位のこれらの免疫エフェクター細胞の数を効果的に増加させることを示している。NK細胞ホーミングのこの現象は、2つの異なる動物モデルにおいて実証された。SC固形EL−4腫瘍を持つC57BI/6動物においては、未処理動物と比較して、活性化されたNK細胞の強化されたレベル(DX−5 NK表現型マーカー及びCD16活性化マーカーの発現により評価された)が、腫瘍組織において処理後4〜7日に検出され、コントロール動物におけるたった2.3%と比較して腫瘍中の細胞の5.3%もの高い割合を占めていた、図20A。同様に、腫瘍中のNK細胞の活性化状態の評価は、iv投与が腫瘍内のNK細胞の活性化の強化をもたらし、未処理動物のたった37%と比較して、腫瘍内のNK細胞の66%(図20B)がリポソームODN1mの投与後に活性化されることも実証した。
IP 38C13腫瘍を持つC3H動物においては、腹膜洗浄における活性化されたNK細胞の数の評価(DX−5 NK表現型マーカー及びCD69活性化マーカーの発現により評価された)は、未処理のコントロールの動物と比較して、陽イオン性リポソームODN1mのIV投与後の腫瘍負荷部位へのホーミングが強化されることも実証した。活性化されたNK細胞の数が、未処理で腫瘍を持つ動物において、全単離細胞のおよそ1.2%で一定のままである一方で、IV投与は腫瘍のない動物の腹膜腔中の活性化されたNK細胞の数の穏やかな増加をもたらし、48時間で3%まで増加する、図21。しかし、腫瘍を持つ動物では、リポソームODN1mの投与後に、活性化されたNK細胞含有量が48時間でおよそ6%まで増加した。
これらの研究の両方のデータは、ODN1m[配列番号:4]含有陽イオン性リポソームのIV投与が腫瘍負荷部位中の活性化されたNK細胞の数を効果的に増加させることを実証している。この観察結果は関連しており、つまり、これらの細胞が必要とされ且つ最も効果的であろう疾患部位に対してこれらの細胞により発揮される効果的な免疫活性を濃縮する。
Claims (26)
- 被験体における強化された抗体依存性細胞傷害応答を刺激するための組成物であって、免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームとの組み合わせでの処置用抗体を含んで成る、前記組成物。
- 前記免疫刺激性核酸が少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)である、請求項1に記載の組成物。
- 前記CpGジヌクレオチド中のシトシンがメチル化されている、請求項2に記載の組成物。
- 前記免疫刺激性核酸が核酸配列5'TAAZGTTGAGGGGCAT3'(ODN1m)(配列番号:4)を含んで成る、請求項1に記載の組成物。
- 前記免疫刺激性核酸が核酸配列5'TTCCATGAZGTTCCTGAZGTT3'(ODN2m)(配列番号:31)を含んで成る、請求項1に記載の組成物。
- 前記陽イオン性リポソームが完全に前記核酸を内包している、請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記処置用抗体が抗CD20モノクローナル抗体である、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗CD20抗体モノクローナル抗体がRituxan(登録商標)である、請求項7に記載の組成物。
- 前記処置用抗体が抗Her2/neu抗体である、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗Her2/neu抗体がHerceptin(登録商標)である、請求項9に記載の組成物。
- ex vivo又はin vivoで免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームにより活性化された哺乳類NK細胞であって、腫瘍関連抗原に対する処置用抗体のFc部分に結合している、前記活性化されたNK細胞。
- 前記免疫刺激性核酸が少なくとも1つのメチル化CpGジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)である、請求項11に記載の組成物。
- 哺乳類被験体における標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害を誘導する改善された方法であって、前記方法が、以下の:
a)免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを用いてex vivo又はin vivoで被験体のNK細胞を活性化すること;及び
b)標的細胞抗原に対する処置用抗体を用いてin vivoで前記標的細胞をオプソニン化すること;
を含み、ここで、前記活性化NK細胞がin vivoで前記処置用抗体のFc部分に結合している、前記方法。 - 前記免疫刺激性核酸が少なくとも1つのメチル化CpGジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)である、請求項13に記載の方法。
- 前記標的細胞が腫瘍細胞であり、前記標的細胞抗原が腫瘍関連抗原である、請求項13に記載の方法。
- 腫瘍細胞を溶解する方法であって、前記腫瘍細胞を有する患者に処置用抗体及び免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを投与することを含み、ここで、前記処置用抗体が前記腫瘍細胞と関連する抗原を対象とし且つ抗体依存性細胞傷害をもたらすために前記陽イオン性リポソームがin vivoで患者のNK細胞を動員及び活性化する、前記方法。
- 前記免疫刺激性核酸が少なくとも1つのメチル化CpGジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)である、請求項16に記載の方法。
- 前記陽イオン性リポソームが前記処置用抗体の前に投与される、請求項16に記載の方法。
- 腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体を用いて癌患者を処置する改善された方法であって、前記改善が免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを用いて前記患者を前処置することを含み、ここで、前記前処置が抗体依存性細胞傷害をもたらすために患者のNK細胞の動員及び活性化を引き起こす、前記方法。
- 前記免疫刺激性核酸が少なくとも1つのメチル化CpGジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)である、請求項19に記載の方法。
- 前記癌がリンパ腫であり、そして前記モノクローナル抗体がリツキシマブである、請求項19に記載の方法。
- 前記癌が乳癌であり、そして前記処置用抗体がトラスツズマブである、請求項19に記載の方法。
- 哺乳類患者において標的細胞の溶解に適切なキットであって、標的細胞抗原に対する処置用抗体及び免疫刺激性核酸含有陽イオン性リポソームを含んで成る、前記キット。
- 前記処置用抗体及び前記陽イオン性リポソームが別々のバイアルにおいて提供される、請求項23に記載のキット。
- 前記免疫刺激性核酸が少なくとも1つのメチル化CpGジヌクレオチドを有するオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)である、請求項23に記載のキット。
- 前記標的細胞が腫瘍細胞であり、そして前記標的細胞抗原が腫瘍関連抗原である、請求項23に記載のキット。
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