JP2003510282A - 免疫刺激核酸 - Google Patents

免疫刺激核酸

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、免疫刺激核酸組成物およびその組成物を使用する方法に管Ｓル。Ｔリッチ核酸は、ポリＴ配列を含み、そして／または２５％より多いＴヌクレオチド残基を有する。ＴＧ核酸は、ＴＧジヌクレオチドを有する。Ｃリッチ核酸は、少なくとも１つのポリＣ領域および／または５０％より多いＣヌクレオチドを有する。これらの免疫刺激核酸は、ＣｐＧモチーフを含む核酸と類似の形態で機能する。本発明はまた、好ましいＣｐＧ核酸を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 細菌ＤＮＡは、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化する免疫刺激効果
を有するが、脊椎動物ＤＮＡは、そうではない（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．，ら，
１９８８．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７９：６８２〜６８６；Ｔｏｋ
ｕｎａｇａ，Ｔ．ら，１９８４，ＪＮＣＩ ７２：９５５〜９６２；Ｍｅｓｓｉ
ｎａ，Ｊ．Ｐ．ら，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９〜１７６
４；および総説、Ｋｒｉｅｇ，１９９８，：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃ．Ａ．Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ａ．Ｍ
．Ｋｒｉｅｇ，（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，４３１〜４４８頁）。細菌ＤＮＡのこれらの免
疫刺激効果は、特定の塩基内容（ｃｏｎｔｅｘｔ）（ＣｐＧモチーフ）における
非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの存在の結果であり、これは、細菌ＤＮＡにお
いては一般的であるが、脊椎動物ＤＮＡにおいてはメチル化され、実際以下に示
される（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔ）（Ｋｒｉｅｇら，１９９５ Ｎａｔｕ
ｒｅ ３７４：５４６〜５４９；Ｋｒｉｅｇ，１９９９ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９３３２１：１〜１０）。細菌ＤＮＡの免疫刺激効果は
、これらのＣｐＧモチーフを含む合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を
模倣し得る。このようなＣｐＧ ＯＤＮは、ヒトおよびマウスの白血球に対して
非常に刺激性の効果を有し、Ｂ細胞増殖；サイトカインおよび免疫グロブリン分
泌；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性およびＩＦＮ−γ分泌；ならびに樹
状細胞（ＤＣ）および他の抗原提示細胞を活性化して同時刺激性分子を発現し、
そしてサイトカイン（特に、Ｔｈ−１様Ｔ細胞応答の発生を促進する際に重要な
Ｔｈ様サイトカイン）を分泌することを誘導する。ネイティブなホスホジエステ
ル骨格ＣｐＧ ＯＤＮのこれらの免疫刺激効果は、ＣｐＧモチーフがメチル化さ
れるか、ＧｐＣに変化するか、あるいはそうでなければ除去されるかまたは変化
する場合、この効果が基本的に破壊される点で非常にＣｐＧ特異的である（Ｋｒ
ｉｅｇら，１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６〜５４９；Ｈａｒｔｍａｎ
ｎら，１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：９３
０５〜１０）。ホスホジエステルＣｐＧ ＯＤＮは、免疫刺激効果を高めるため
に、脂質、ミョウバン、あるいは蓄積の性質または改善された細胞取り込みを有
する他の種類のビヒクル中で処方され得る（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９９４ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：８３１〜８３６；Ｇｒａｍｚｉｎｓ
ｋｉら，１９９８ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４：１０９〜１１８）。
【０００２】 初期の研究において、免疫刺激性ＣｐＧモチーフが、式プリン−プリン−Ｃｐ
Ｇ−ピリミジン−ピリミジンに従うと考えられた（Ｋｒｉｅｇら，１９９５ Ｎ
ａｔｕｒｅ ３７４：５４６〜５４９；Ｐｉｓｅｔｓｋｙ，１９９６ Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５６：４２１〜４２３；Ｈａｃｋｅｒら，１９９８ ＥＭＢＯ
Ｊ．１７：６２３０〜６２４０；Ｌｉｐｆｏｒｄら，１９９８ Ｔｒｅｎｄｓ
ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：４９６〜５００）。しかし、マウスリンパ球が
この「式」に従わないホスホジエステルＣｐＧモチーフに対して非常によく応答
し（Ｙｉら，１９９８ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５８９８〜５９０６）、
そして同じことがヒトＢ細胞および樹状細胞に当てはまる（Ｈａｒｔｍａｎｎら
，１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：９３０５
〜１０；Ｌｉａｎｇ，１９９６ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１１１９
〜１１２９）ことが今や明かである。
【０００３】 数人の過去の研究者は、ＯＤＮのヌクレオチド含有量が、ＯＤＮの配列に独立
して効果を有し得るか否かを調査した。興味深いことに、アンチセンスＯＤＮは
、塩基の使用がランダムであった場合に予期される量と比較して、ＧＧ、ＣＣＣ
、ＣＣ、ＣＡＣ、およびＣＧの配列の含有量において一般的に濃縮されている一
方で、ＴＴまたはＴＣＣのヌクレオチド配列の頻度が減少していることが見出さ
れている（Ｓｍｅｔｓｅｒｓら，１９９６ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐ．６：６３〜６７）。これは、過剰に
示される配列がアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する好ましい標的エレメン
トを含み得、逆もまた真である（ｖｉｓａ ｖｅｒｓａ）可能性を上昇した。ア
ンチセンス実験についてチミジンリッチなＯＤＮの使用を避ける１つの理由は、
細胞内に存在するヌクレアーゼによるＯＤＮの分解が、細胞増殖を評価するため
の実験においてしばしば使用される3Ｈ−チミジンと競合する遊離チミジンを放
出することである（Ｍａｔｓｏｎら，１９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２：３２５〜３３０）。
【０００４】 （発明の要旨） 本発明は、ピリミジンリッチ（Ｐｙリッチ）な免疫刺激核酸およびいくつかの
実施形態においてチミジン（Ｔ）リッチな免疫刺激核酸（ＣｐＧモチーフの存在
を必要としない）に一部関する。本発明はまた、ＴＧジヌクレオチドモチーフを
含む核酸がまた、免疫刺激性であるという発見に一部関する。本発明は、ＣｐＧ
モチーフを含まない核酸配列が、免疫刺激性であるという予期されない発見に一
部基づく。多くの核酸配列の免疫刺激特性の分析に基づいて、これらの配列がＰ
ｙリッチ、例えば、Ｔリッチであり得るか、またはこれらがＴＧモチーフを含み
得ることが発見された。これらの配列が非ゲッ歯動物免疫細胞を優先的に活性化
することもまた発見した。Ｐｙリッチ配列およびＴＧ配列が非ゲッ歯動物免疫細
胞と比較して、ゲッ歯動物免疫細胞に関して最小限の免疫刺激性のみである。従
って、本発明の方法に従って、Ｐｙリッチ免疫刺激核酸またはＴＧ免疫刺激核酸
を投与することによって非ゲッ歯動物被験体における免疫応答を誘導することが
可能である。本発明のＰｙリッチ免疫刺激核酸およびＴＧ免疫刺激核酸は、必要
に応じて、ＣｐＧモチーフを含み得る。これらの発見は、免疫刺激性のＣｐＧ含
有核酸および非ＣｐＧ含有核酸の臨床的発生について重要な意味を有する。
【０００５】 １つの局面において、本発明は、単離されたＰｙリッチ免疫刺激核酸またはＴ
Ｇ免疫刺激核酸の免疫応答を刺激するのに有効な量および薬学的に受容可能なキ
ャリアを含む薬学的組成物である。他の局面において、本発明は、単離されたＰ
ｙリッチ免疫刺激核酸またはＴＧ免疫刺激核酸を含む組成物である。他の実施形
態において、免疫刺激核酸は、Ｔリッチであり得る。なお他の実施形態において
、免疫刺激核酸は、Ｔリッチであり得、そして少なくとも１つのＴＧモチーフも
有し得る。
【０００６】 好ましくは、Ｐｙリッチ核酸は、Ｔリッチ核酸である。いくつかの実施形態に
おいて、Ｔリッチ免疫刺激核酸は、５’ＴＴＴＴ３’を含むポリＴ核酸である。
なお他の実施形態において、ポリＴ核酸は、５’Ｘ1Ｘ2ＴＴＴＴＸ3Ｘ4３’を含
み、ここで、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3およびＸ4はヌクレオチドである。いくつかの実施形
態において、Ｘ1Ｘ2は、ＴＴであり、そして／またはＸ3Ｘ4は、ＴＴである。他
の実施形態において、Ｘ1Ｘ2は、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＡＴ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、
ＣＴ、ＣＣ、ＣＡ、ＣＧ、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、およびＧＣからなる群より選択さ
れ、そして／またはＸ3Ｘ4は、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＡＴ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、Ｃ
Ｔ、ＣＣ、ＣＡ、ＣＧ、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、およびＧＣからなる群より選択され
る。
【０００７】 Ｔリッチ免疫刺激核酸は、単一のポリＴモチーフのみを有し得るか、または複
数のポリＴ核酸モチーフを有し得る。いくつかの実施形態において、Ｔリッチ免
疫刺激核酸は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも
５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのＴモチーフを
含む。他の実施形態において、Ｔリッチ免疫刺激核酸は、少なくとも２つ、少な
くとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７
つ、または少なくとも８つのＣｐＧモチーフを含む。好ましい実施形態において
、複数のＣｐＧモチーフおよびポリＴモチーフが散在する。
【０００８】 なお他の実施形態において、複数のポリＴモチーフのうちの少なくとも１つが
、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なく
とも７つ、少なくとも８つ、または少なくとも９つの連続したＴヌクレオチド残
基を含む。他の実施形態において、複数のポリＴモチーフは、少なくとも３つの
モチーフであり、そしてここで少なくとも３つのモチーフがそれぞれ、少なくと
も３つの連続したＴヌクレオチド残基を含むか、または複数のポリＴモチーフが
少なくとも４つのモチーフであり、そしてここで少なくとも４つのモチーフがそ
れぞれ、少なくとも３つの連続したＴヌクレオチド残基を含む。
【０００９】 いくつかの場合において、Ｔリッチ免疫刺激核酸は、ポリＴモチーフを含まな
くてもよいが、むしろ２５％よりも多いＴのヌクレオチド組成を含む。他の実施
形態において、Ｔリッチ免疫刺激核酸は、ポリＴモチーフを有し、そして２５％
より多いＴのヌクレオチド組成を含む。好ましい実施形態において、Ｔリッチ免
疫刺激核酸は、３５％より多いＴ、４０％より多いＴ、５０％より多いＴ、６０
％より多いＴ、８０％より多いＴ、または９０％より多いＴのヌクレオチド残基
のヌクレオチド組成を含む。重要な実施形態において、核酸は、少なくとも５０
％のＴである。
【００１０】 Ｔリッチ免疫刺激核酸およびＴＧ免疫刺激核酸は、７ヌクレオチドよりも長い
任意の長さを有し得るが、いくつかの実施形態において、８ヌクレオチドと１０
０ヌクレオチドの間の残基の長さであり得る。好ましい実施形態において、Ｔリ
ッチ免疫刺激核酸は、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２４ヌクレオチ
ド、少なくとも２７ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチドを含む。
好ましい実施形態において、ＴＧ免疫刺激核酸は、１５ヌクレオチドと２５ヌク
レオチドの間の長さである。Ｔリッチ免疫刺激核酸およびＴＧ免疫刺激核酸は、
一本鎖または二本鎖であり得る。
【００１１】 １つの好ましい実施形態において、免疫刺激核酸は、その長さの中間に配置さ
れるＴリッチ領域を有する（すなわち、およそ等しい数のヌクレオチドが５’末
端および３’末端においてＴリッチ領域に隣接する）。
【００１２】 Ｔリッチ核酸は、いくつかの実施形態において、配列番号５９〜６３、７３〜
７５、１４２、２１５、２２６、２４１、２６７〜２６９、２８２、３０１、３
０４、３３０、３４２、３５８、３７０〜３７２、３９３、４３３、４７１、４
７９、４８６、４９１、４９７、５０３、５５６〜５５８、５６７、６９４、７
９３〜７９４、７９７、８３３、８５２、８６１、８６７、８６８、８８２、８
８６、９０５、９０７、９０８、および９１０〜９１３からなる群より選択され
る。他の実施形態において、Ｔリッチ核酸は、配列番号６４、９８、１１２、１
４６、１８５、２０４、２０８、２１４、２２４、２３３、２４４、２４６、２
４７、２５８、２６２、２６３、２６５、２７０〜２７３、３００、３０５、３
１６、３１７、３４３、３４４、３５０、３５２、３５４、３７４、３７６、３
９２、４０７、４１１〜４１３、４２９〜４３２、４３４、４３５、４４３、４
７４、４７５、４９８〜５０１、５１８、６８７、６９２、６９３、８０４、８
６２、８８３、８８４、８８８、８９０、および８９１からなる群より選択され
る配列である。
【００１３】 他の実施形態において、Ｐｙリッチ免疫刺激核酸は、Ｃリッチ核酸である。免
疫刺激Ｃリッチ核酸は、少なくとも１つ、そして好ましくは少なくとも２つのポ
リＣ領域または５０％より多いＣヌクレオチドを含む核酸である。
【００１４】 Ｐｙリッチ免疫刺激核酸およびＴＧ免疫刺激核酸は、１つ以上のＣｐＧモチー
フを含み得る。モチーフは、メチル化されていても良いしされていなくても良い
。他の実施形態において、Ｐｙリッチ免疫刺激核酸およびＴＧ免疫刺激核酸は、
１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含まない。
【００１５】 他の実施形態において、Ｐｙリッチ免疫刺激核酸およびＴＧ免疫刺激核酸はま
た、ポリＡモチーフ、ポリＧモチーフ、および／またはポリＣモチーフを含む。
なお他の実施形態において、Ｐｙリッチ免疫刺激核酸またはＴＧ免疫刺激核酸は
、少なくとも３つの連続したＣヌクレオチド残基の２つのポリＣ配列を含まない
か、または少なくとも３つの連続したＡヌクレオチド残基の２つのポリＡ配列を
含まない。他の実施形態において、Ｐｙリッチ免疫刺激核酸またはＴＧ免疫刺激
核酸は、２５％より多いＣまたは２５％より多いＡのヌクレオチド組成を含む。
なお他の実施形態において、Ｐｙリッチ免疫刺激核酸またはＴＧ免疫刺激核酸は
、ポリＣ配列、ポリＧ配列またはポリＡ配列を含まない。
【００１６】 ポリＧ核酸は、いくつかの実施形態において、配列番号５、６、７３、２１５
、２６７〜２６９、２７６、２８２、２８８、２９７〜２９９、３５５、３５９
、３８６、３８７、４４４、４７６、５３１、５５７〜５５９、７３３、７６８
、７９５、７９６、９１４〜９２５、９２８〜９３１、９３３〜９３６、および
９３８からなる群より選択される。他の実施形態において、ポリＧ核酸は、配列
番号６７、８０〜８２、１４１、１４７、１４８、１７３、１７８、１８３、１
８５、２１４、２２４、２６４、２６５、３１５、３２９、４３４、４３５、４
７５、５１９、５２１〜５２４、５２６、５２７、５３５、５５４、５６５、６
０９、６２８、６６０、６６１、６６２、７２５、７６７、８２５、８５６、８
５７、８７６、８９２、９０９、９２６、９２７、９３２、および９３７からな
る群より選択される配列を含む。
【００１７】 本発明の別の局面に従って、免疫刺激核酸は、ＴＧモチーフを保有する核酸（
本明細書中において、ＴＧ免疫刺激核酸と呼ばれる）として定義され得る。ＴＧ
核酸は、１つの実施形態において、少なくとも以下の式：５’Ｎ1Ｘ1ＴＧＸ2Ｎ2 ３’を含む配列を有する少なくとも１つのＴＧジヌクレオチドを含む。関連した
実施形態において、Ｎ1は、（１１−Ｎ2）〜（２１−Ｎ2）の範囲の多数のヌク
レオチドから構成される核酸配列であり、そしてＮ2は、（１１−Ｎ1）〜（２１
−Ｎ1）の範囲の多数のヌクレオチドから構成される核酸配列である。好ましい
実施形態において、Ｘ2は、チミジンである。
【００１８】 他の実施形態において、ＴＧ核酸は、少なくとも以下の式：５’Ｘ1Ｘ2ＴＧＸ 3 Ｘ4３’を有する。なお別の実施形態において、ＴＧ核酸は、以下の式：５’Ｎ 1 Ｘ1Ｘ2ＴＧＸ3Ｘ4Ｎ2３’を含む。関連した実施形態において、Ｎ1は、（９−
Ｎ2）〜（１９−Ｎ2）の範囲の多数のヌクレオチドから構成される核酸配列であ
り、そしてＮ2は、（９−Ｎ1）〜（１９−Ｎ1）の範囲の多数のヌクレオチドか
ら構成される核酸配列である。１つの好ましい実施形態において、Ｘ3は、チミ
ジンである。Ｘ1Ｘ2は、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＡＡ、ＡＴ、ＡＧ、ＣＴ、ＣＡ、Ｃ
Ｇ、ＴＡおよびＴＴからなる群より選択され得るヌクレオチドであり、そしてＸ 3 Ｘ4は、ＴＴ、ＣＴ、ＡＴ、ＡＧ、ＣＧ、ＴＣ、ＡＣ、ＣＣ、ＴＡ、ＡＡ、およ
びＣＡからなる群より選択され得るヌクレオチドである。いくつかの好ましい実
施形態において、Ｘ3は、チミジンである。重要な実施形態において、Ｘ3Ｘ4は
、ＴＴ、ＴＣ、ＴＡおよびＴＧからなる群より選択されるヌクレオチドである。
他の実施形態において、Ｘ1Ｘ2は、ＧＡまたはＧＴであり、そしてＸ3Ｘ4は、Ｔ
Ｔである。なお他の実施形態において、Ｘ1またはＸ2またはその両方がプリンで
あり、そしてＸ3またはＸ4またはその両方がピリミジンであるか、あるいはＸ1
Ｘ2がＧｐＡでありそしてＸ3またはＸ4またはその両方がピリミジンである。１
つの実施形態において、Ｘ2は、Ｔであり、そしてＸ3はピリミジンである。
【００１９】 １つの実施形態において、ＴＧ核酸の５’Ｘ1Ｘ2ＴＧＸ3Ｘ4３’配列あるいは
ＴＧ核酸の全長またはそのいくつかのフラグメントは、非パリンドローム配列で
あり、そして他の実施形態において、これは、パリンドローム配列である。
【００２０】 いくつかの好ましい実施形態において、ＴＧ核酸はまた、Ｔリッチである。
【００２１】 Ｐｙリッチ免疫刺激核酸およびＴＧ免疫刺激核酸は、いくつかの実施形態にお
いて、少なくとも１つの骨格修飾（例えば、ホスホロチオエート修飾）を含むヌ
クレオチド骨格を有する。ヌクレオチド骨格は、キメラであり得るか、または好
ましくはヌクレオチド骨格は、完全に修飾される。１つの好ましい実施形態にお
いて、免疫刺激核酸は、ポリＴモチーフおよびホスホロチオエート骨格を有する
。
【００２２】 別の局面において、本発明は、Ｐｙリッチ核酸またはＴＧ核酸の形態の免疫刺
激核酸および抗原の組成物であり、ここで、この核酸は、メチル化されていない
ＣｐＧモチーフを含まない。
【００２３】 本発明の別の組成物は、Ｐｙリッチ免疫刺激核酸またはＴＧ免疫刺激核酸およ
び抗微生物薬剤であり、ここで、Ｐｙリッチ核酸またはＴＧ核酸は、メチル化さ
れていないＣｐＧモチーフを含まない。好ましくは、抗微生物薬剤は、抗ウイル
ス剤、抗寄生生物剤、抗菌剤および抗真菌剤からなる群より選択される。
【００２４】 Ｐｙリッチ免疫刺激核酸および／またはＴＧ免疫刺激核酸（ここで、Ｐｙリッ
チ核酸および／またはＴＧ核酸は、メチル化されていないＣｐＧモチーフを含ま
ない）を含む持続放出デバイスの組成物は、本発明の別の局面に従って提供され
る。
【００２５】 本発明はまた、カプセル、丸剤、および舌下錠からなる群より選択される送達
デバイス中にＰｙリッチ免疫刺激核酸またはＴＧ免疫刺激核酸の栄養補助剤を含
み、ここで、Ｐｙリッチ核酸またはＴＧ核酸は、メチル化されていないＣｐＧモ
チーフを含まない。
【００２６】 Ｐｙリッチオリゴヌクレオチド、例えば、ポリＴオリゴヌクレオチド、Ｔリッ
チオリゴヌクレオチド、Ｃリッチオリゴヌクレオチド、またはＴＧオリゴヌクレ
オチドおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドを投与することが有用である場合、物理
的に別のＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＰｙリッチオリゴヌクレオチドまたはＴＧ
オリゴヌクレオチドとともに、ＰｙリッチオリゴヌクレオチドまたはＴＧオリゴ
ヌクレオチドを同時投与することが望ましくあり得る。あるいは、ＣｐＧモチー
フ、ＰｙリッチモチーフまたはＴＧモチーフは、同じ連続した核酸上にＰｙリッ
チオリゴヌクレオチドまたはＴＧオリゴヌクレオチドとして存在し得る。なおさ
らなる実施形態において、Ｐｙリッチ核酸、ＴＧ核酸およびＣｐＧ核酸の全てま
たはいくつかの組み合わせは、別の核酸上または同じ核酸分子内のいずれかに同
時投与され得る。同時投与によって、核酸が、両方のオリゴヌクレオチドの組み
合わせた利益（好ましくは、そのオリゴヌクレオチドのみをそれぞれ同じ用量で
投与することによって達成される利益よりも大きい）を達成するのに十分近く、
互いに遅れずに投与されることが意図される。
【００２７】 ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、一般に、式５’Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ4３’を有し、
ここで、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3およびＸ4がヌクレオチドであり、そして少なくともＣｐ
ＧのＣがメチル化されていない。好ましいＣｐＧオリゴヌクレオチドは、８〜１
００ヌクレオチドの長さであり、そして修飾された骨格を有する。特定の構造は
、公開されたＰＣＴ出願、米国出願、および本明細書中で引用される参考文献に
詳細に記載され、これらの開示は、その全体において本明細書中で参考として援
用される。１つの実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ポリＴモチ
ーフおよびＴＧモチーフを含まず、Ｔリッチではない。
【００２８】 他の実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、４、
１４〜１６、１８〜２４、２８、２９、３３〜４６、４９、５０、５２〜５６、
５８、６４〜６７、６９、７１、７２、７６〜８７、９０、９１、９３、９４、
９６、９８、１０２〜１２４、１２６〜１２８、１３１〜１３３、１３６〜１４
１、１４６〜１５０、１５２〜１５３、１５５〜１７１、１７３〜１７８、１８
０〜１８６、１８８〜１９８、２０１、２０３〜２１４、２１６〜２２０、２２
３、２２４、２２７〜２４０、２４２〜２５６、２５８、２６０〜２６５、２７
０〜２７３、２７５、２７７〜２８１、２８６〜２８７、２９２、２９５〜２９
６、３００、３０２、３０５〜３０７、３０９〜３１２、３１４〜３１７、３２
０〜３２７、３２９、３３５、３３７〜３４１、３４３〜３５２、３５４、３５
７、３６１〜３６５、３６７〜３６９、３７３〜３７６、３７８〜３８５、３８
８〜３９２、３９４、３９５、３９９、４０１〜４０４、４０６〜４２６、４２
９〜４３３、４３４〜４３７、４３９、４４１〜４４３、４４５、４４７、４４
８、４５０、４５３〜４５６、４６０〜４６４、４６６〜４６９、４７２〜４７
５、４７７、４７８、４８０、４８３〜４８５、４８８、４８９、４９２、４９
３、４９５〜５０２、５０４〜５０５、５０７〜５０９、５１１、５１３〜５２
９、５３２〜５４１、５４３〜５５５、５６４〜５６６、５６８〜５７６、５７
８、５８０、５９９、６０１〜６０５、６０７〜６１１、６１３〜６１５、６１
７、６１９〜６２２、６２５〜６４６、６４８〜６５０、６５３〜６６４、６６
６〜６９７、６９９〜７０６、７０８、７０９、７１１〜７１６、７１８〜７３
２、７３６、７３７、７３９〜７４４、７４６、７４７、７４９〜７６１、７６
３、７６６〜７６７、７６９、７７２〜７７９、７８１〜７８３、７８５〜７８
６、７９００７９２、７９８〜７９９、８０４〜８０８、８１０、８１５、８１
７、８１８、８２０〜８３２、８３５〜８４６、８４９〜８５０、８５５〜８５
９、８６２、８６５、８７２、８７４〜８７７、８７９〜８８１、８８３〜８８
５、８８８〜９０４、および９０９〜９１３からなる群より選択される配列を有
する。
【００２９】 別の実施形態において、ＰｙリッチまたはＴＧオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧ
モチーフを含まない。本発明のこの実施形態はまた、ＣｐＧオリゴヌクレオチド
（これは、ポリＴおよびＴＧモチーフを含み得ず、そしてＴリッチでない）なら
びにＣｐＧオリゴヌクレオチドから物理的に別々のＰｙリッチおよび／またはＴ
Ｇオリゴヌクレオチドの両方を含む、薬学的組成物およびキットを含む。この薬
学的調製物は、有効量であり、そして代表的に、薬学的に受容可能なキャリア（
ＰｙリッチおよびＴＧオリゴヌクレオチドに関して本明細書中で詳細に記載され
る全て）を含む。このキットは、ＰｙリッチまたはＴＧオリゴヌクレオチド（ま
たはそれらの組合せ）であるオリゴヌクレオチドを含む、少なくとも１個の内容
物を含む。同一の内容物（または他の実施形態において、第２の内容物）は、Ｃ
ｐＧモチーフ（これは、Ｐｙリッチおよび／またはＴＧモチーフを含み得ない）
を有するオリゴヌクレオチドを含み得る。このキットはまた、このオリゴヌクレ
オチドを被験体に投与するための指示書を含む。このキットはまた、溶媒または
希釈剤を含む内容物を含み得る。
【００３０】 要約すれば、本明細書中で完全に引用される場合、ＰｙリッチまたはＴＧオリ
ゴヌクレオチドから物理的に別々のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、この方法にお
いて、ＰｙリッチまたはＴＧオリゴヌクレオチド、上記の組成物および生成物と
共に使用され得る。
【００３１】 他の局面において、本発明は、キメラ骨格を有しかつＣｐＧモチーフの存在を
必要としない免疫刺激オリゴヌクレオチドに関する。本発明は、ＣｐＧモチーフ
を含まない核酸配列が免疫刺激性であり、そしてキメラ骨格を有するＣｐＧモチ
ーフが、予想外の増強された免疫刺激特性を有するという発見に部分的に基づい
ている。従って、１局面において、本発明は、式５’Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2３’を有す
るオリゴヌクレオチドの組成物に関し、ここで、Ｙ1およびＹ2は、互いに独立し
て、１個〜１０個のヌクレオチドを有する核酸分子であり、Ｙ1は、少なくとも
１個の修飾されたヌクレオチド間結合を含み、そしてＹ2は、少なくとも１個の
修飾されたヌクレオチド間結合を含み、そしてここで、Ｎ1およびＮ2は、互いに
独立して０個〜５個のヌクレオチドを有する核酸分子であり、しかし、ここで、
Ｎ1ＺＮ2は、全部で少なくとも６個のヌクレオチドを有し、そしてここで、Ｎ1
ＺＮ2のヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を有し、そしてここで、Ｚは、
免疫刺激核酸モチーフであるが、ＣＧを含まない。１実施形態において、Ｚは、
ＴＴＴＴ、ＴＧおよびこの配列の塩基の少なくとも５０％がＴである配列からな
る群から選択される核酸配列である。
【００３２】 いくつかの実施形態において、Ｙ1および／またはＹ2は、３個〜８個のヌクレ
オチドを有する。他の実施形態において、Ｙ1および／またはＹ2は、少なくとも
３個のＧ、少なくとも４個のＧ、少なくとも７個のＧ、または全てＧからなる。
別の実施形態において、Ｙ1および／またはＹ2は、ＴＣＧＴＣＧ、ＴＣＧＴＣＧ
Ｔ、およびＴＣＧＴＣＧＴＴ（配列番号１１４５）からなる群から選択される。
なお別の実施形態において、Ｙ1および／またはＹ2は、少なくとも１個、２個、
３個、４個、または５個のポリＡ、ポリＴ、またはポリＣ配列を含む。
【００３３】 式Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2の中心のヌクレオチド（Ｎ1ＺＮ2）は、ホスホジエステルヌ
クレオチド間結合を有し、そしてＹ1およびＹ2は、少なくとも１個の修飾ヌクレ
オチド間結合を有する。いくつかの実施形態において、Ｙ1および／またはＹ2は
少なくとも２個の修飾ヌクレオチド間結合を有する。別の実施形態において、Ｙ 1 および／またはＹ2は、２個〜５個の修飾ヌクレオチド間結合を有する。なお別
の実施形態において、Ｙ1は、２個の修飾ヌクレオチド間結合を有し、そしてＹ2 は、５個の修飾ヌクレオチド間結合を有するか、またはＹ1は、５個の改変ヌク
レオチド間連結を有し、そしてＹ2は、２個の修飾ヌクレオチド間結合を有する
。いくつかの実施形態において、この修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオ
ネート修飾結合、ホスホロチオネート修飾結合またはｐ−エトキシ改変連結であ
る。
【００３４】 式Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2の一部は、必要に応じてパリンドロームを形成し得る。従っ
て、いくつかの実施形態において、このＮ1ＺＮ2のヌクレオチドは、パリンドロ
ームを形成する。いくつかの実施形態において、このパリンドロームは、直接型
反復ではない。なお別の実施形態において、Ｎ1ＺＮ2のヌクレオチドは、パリン
ドロームを形成しない。
【００３５】 他の実施形態に従って、Ｎ1ＺＮ2は、以下からなる群から選択されたヌクレオ
チドの配列を有する：ＧＡＴＴＴＴＡＴＣＧＴＣ（配列番号：１０９８），ＴＣ
ＧＡＴＴＴＴＴＣＧＡ（配列番号１０９９）；ＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＧＡ（配列
番号１１００）；ＧＴＴＴＴＴＴＡＣＧＡＣ（配列番号１１０１）；ＴＣＡＡＴ
ＴＴＴＴＴＧＡ（配列番号１１０２）；ＡＣＧＴＴＴＴＴＡＣＧＴ（配列番号１
１０３）；ＴＣＧＴＴＴＴＴＡＣＧＡ（配列番号１１０４）；ＴＣＧＡＴＴＴＴ
ＴＡＣＧＴＣＧＡ（配列番号１１０５）；ＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＣＧＴＴ（配列
番号１１０６）；ＴＣＧＴＴＴＴＴＴＡＡＣＧＡ（配列番号１１０７）；ＡＣＧ
ＴＴＴＴＴＴＡＡＣＧＴ（配列番号１１０８）；ＧＡＴＴＴＴＴＡＴＣＧＴＣ（
配列番号１１０９）；ＧＡＣＧＡＴＴＴＴＴＣＧＴＣ（配列番号１１１０）；Ｇ
ＡＴＴＴＴＡＧＣＴＣＧＴＣ（配列番号１１１１）；ＧＡＴＴＴＴＴＡＣＧＴＣ
（配列番号１１１２）；ＡＴＴＴＴＡＴＣＧＴ（配列番号１１１３）；ＡＡＣＧ
ＡＴＴＴＴＴＣＧＴＴ（配列番号１１１４）；ＴＣＡＣＴＴＴＴＧＴＧＡ（配列
番号１１１５）；ＴＣＧＴＡＴＴＴＴＡ（配列番号１１１６）；ＡＣＴＴＴＴＧ
ＴＡＣＣＧＧＴ（配列番号１１１７）；ＴＣＧＡＴＴＴＴＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡ
（配列番号１１１８）；ＡＣＧＡＴＴＴＴＴＣＧＴ（配列番号１１１９）；ＧＡ
ＴＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号１１２０）；ＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡ（配列番号１１
２１）；ＴＣＡＴＧＴＡＴＧＡ（配列番号１１２２）；ＧＴＧＴＴＡＣＧＡＣ（
配列番号１１２３）；ＴＣＡＡＴＧＴＴＧＡ（配列番号１１２４）；ＡＣＧＴＧ
ＴＡＣＧＴ（配列番号１１２５）；ＴＣＧＴＧＴＡＣＧＡ（配列番号１１２６）
；ＴＣＧＡＴＧＴＡＣＧＴＣＧＡ（配列番号１１２７）；ＡＡＴＧＴＴＡＡＣＧ
ＴＴ（配列番号１１２８）；ＴＣＧＴＧＴＴＡＡＣＧＡ（配列番号１１２９）；
ＡＣＧＴＧＴＴＡＡＣＧＴ（配列番号１１３０）；ＧＡＴＧＴＡＴＣＧＴＣ（配
列番号１１３１）；ＧＡＣＧＡＴＧＴＣＧＴＣ（配列番号１１３２）；ＧＡＴＧ
ＡＧＣＴＣＧＴＣ（配列番号１１３３）；ＧＡＴＧＴＡＣＧＴＣ（配列番号１１
３４）；ＡＴＧＡＴＣＧＴ（配列番号１１３５）；ＡＡＣＧＡＴＧＴＣＧＴＴ（
配列番号１１３６）；ＴＣＡＣＴＧＧＴＧＡ（配列番号１１３７）；ＴＣＧＴＡ
ＴＧＡ（配列番号１１３８）；ＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＧＴ（配列番号１１３９）
；ＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡ（配列番号１１４０）；およびＡＣＧＡＴ
ＧＴＣＧＴ（配列番号１１４１）。
【００３６】 この組成物は、必要に応じて、薬学的キャリアを含みそして／または送達デバ
イス中で処方され得る。いくつかの実施形態において、この送達デバイスは、カ
チオン性脂質、細胞透過タンパク質、および持続性放出デバイスからなる群から
選択される。１つの好ましい実施形態において、この徐放デバイスは、生分解性
ポリマーである。別の実施形態において、この徐放デバイスは、微粒子である。
【００３７】 別の局面において、本発明は、式Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2を有する免疫刺激オリゴヌク
レオチドおよび抗原の組成物である。
【００３８】 本発明の別の組成物は、式Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2を有する免疫刺激オリゴヌクレオチ
ドおよび抗菌治療剤である。好ましい抗微生物治療剤は、抗ウイルス剤、抗寄生
虫剤、抗細菌剤、または抗真菌剤からなる群から選択される。
【００３９】 式Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2を有する免疫刺激オリゴヌクレオチドを有する徐放デバイス
の組成物は、本発明の別の局面に従って提供される。
【００４０】 本発明はまた、カプセル、舌下錠および丸剤からなる群から選択される送達デ
バイス中にある、式Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2を有する免疫刺激オリゴヌクレオチドの栄養
補助剤を含む。
【００４１】 別の局面において、上記の組成物は、非メチル化ＣＧジヌクレオチド、ＴＧジ
ヌクレオチドまたはＰｙリッチ配列を有する、免疫刺激核酸を含み、ここで、非
メチル化ＣＧジヌクレオチド、ＴＧジヌクレオチドまたはＰｙリッチ配列を有す
る免疫刺激核酸は、５’Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2３’を含むオリゴヌクレオチドとは異な
る配列を有する。
【００４２】 いくつかの実施形態において、非メチル化ＣＧジヌクレオチド、ＴＧジヌクレ
オチドまたはＰｙリッチ配列を有する免疫刺激核酸は、完全にホスホジエステル
骨格を有し、そして他の実施形態において、非メチル化ＣＧジヌクレオチド、Ｔ
ＧジヌクレオチドまたはＰｙリッチ配列を有する免疫刺激核酸は、修飾された骨
格を有し、これは、必要に応じて、ホスホロチオネート、ホスホロジチオネート
、およびｐ−エトキシからなる群から選択されるヌクレオチド間結合を有し得る
。
【００４３】 １実施形態において、非メチル化ＣＧジヌクレオチドを有する、免疫刺激核酸
配列は、５’Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ4３’を含む式を有し、ここで、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3お
よびＸ4は、ヌクレオチドである。他の実施形態において、免疫刺激核酸配列は
、少なくとも以下の式５’ＴＣＮＴＸ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ4３’を含み、ここで、Ｎは
、約０〜２５個のヌクレオチドから構成される核酸配列であり、ここで、少なく
とも１個のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間結合を有し、そしてここで、こ
の核酸は、１００個のヌクレオチド以下を有する。いくつかの実施形態に従って
、Ｘ1Ｘ2は、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡおよびＡＡからなる群から選択されるヌクレオチ
ドであり、そしてＸ3Ｘ4は、ＴＴ、ＣＴまたはＧＴからなる群から選択されるヌ
クレオチドである。好ましい実施形態において、Ｘ1Ｘ2は、ＧＡであり、そして
Ｘ3Ｘ4は、ＴＴである。
【００４４】 別の実施形態において、非メチル化ＣＧジヌクレオチドを有する、免疫刺激核
酸配列は、少なくとも１個の以下の配列を有する： ＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ（配列番号１５）；ＴＣＣＡＴＧＴ
ＣＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴ（配列番号３２）；ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＧＴＺＣＴ
ＧＡＴＧＣＴ（配列番号３１）；ＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＺＴＣ（
配列番号１８）；ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号２８）
；ＧＧＧＧＧＧ（配列番号１２）；ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ
（配列番号３５）；ＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３４
）；ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号７）；ＴＣＣＡＴＧ
ＴＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３８）；ＧＧＧＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧ
ＡＣＧＧＧＧ（配列番号４１）；ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＣＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（
配列番号３７）；ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３６）
；ＴＣＣＡＴＧＣＣＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３３）；ＴＣＣＡＴＡ
ＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３）；ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴ
ＧＡＴＧＣＴ（配列番号７）；ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＣＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（配
列番号３９）；ＴＣＣＡＴＣＡＣＧＴＧＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号４８）；
ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号１０）；ＡＴＧＡＣＧＴ
ＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号７０）；ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡ
Ｔ（配列番号７２）；ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＣＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号７
３）；ＴＣＣＡＴＡＧＣＧＴＴＣＣＴＡＧＣＧＴＴ（配列番号７４）；ＴＣＣＴ
ＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号７６）；ＴＣＣＴＧＴＣＧＴＴＣＣ
ＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号７７）；ＴＣＣＴＧＴＣＧＴＴＣＣＴＴＧＴＣＧＴＴ
（配列番号５２）；ＴＣＣＴＴＧＴＣＧＴＴＣＣＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号１２
１）；ＴＣＣＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号２０８）；ＴＣＧ
ＴＣＧＣＴＧＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＴＴ（配列番号１２０）；ＴＣＣＡＴＧＣＧ
ＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＴＴ（配列番号８１）；ＴＣＣＡＣＧＡＣＧＴＴＴＴＣＧ
ＡＣＧＴＴ（配列番号８２）；ＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴ（配
列番号４７）；ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号
４６）；ＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号４９）；Ｇ
ＣＧＴＧＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号５６）；ＴＧＴＣＧＴＴ
ＴＧＴＣＧＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号４８）；ＴＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴ
ＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号８４）；ＴＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴ
ＣＧＴＴ（配列番号５０）；ＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴ（配列番号５１）；
およびＴＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号８５）。別の実施形態において、
Ｐｙ−リッチまたはＴＧ配列を有する免疫刺激核酸は、上記のような核酸である
。
【００４５】 別の局面において、本発明は、式Ｙ1Ｎ1ＣＧＮ2Ｙ2を有するオリゴヌクレオチ
ドおよびＣｐＧオリゴヌクレオチド（これは、必要に応じて、ポリＴおよびＴＧ
モチーフを含み得ず、Ｐｙリッチでない）の両方を含む薬学的組成物およびキッ
トに関連し、Ｐｙリッチおよび／またはＴＧオリゴヌクレオチドは、式Ｙ1Ｎ1Ｚ
Ｎ2Ｙ2を有するオリゴヌクレオチドから物理的に離れている。この薬学的調製物
は、有効量であり、そして代表的に、薬学的に受容可能なキャリア（本明細書中
で詳細に記載される全て）を含む。このキットは、式Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2を有する、
オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１個の内容物を含有する。同一の内容物（
または他の実施形態において、第２の内容物）は、ＣｐＧモチーフを有するオリ
ゴヌクレオチド（これは、必要に応じて、Ｐｙリッチおよび／もしくはＴＧモチ
ーフならびに／またはＰｙリッチもしくはＴＧオリゴヌクレオチド（またはそれ
らのいくつかの組合せ）を含み得ない）を含み得る。このキットはまた、このオ
リゴヌクレオチドを被験体に投与するための指示書を含む。このキットはまた、
溶媒または希釈剤を含む内容物を含み得る。
【００４６】 要約すれば、本明細書中で完全に引用される場合、ＣｐＧ、Ｐｙ−リッチまた
はＴＧオリゴヌクレオチドから物理的に離れている式Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2を有するオ
リゴヌクレオチドは、この方法において、ＣｐＧ、Ｐｙ−リッチまたはＴＧオリ
ゴヌクレオチド、本明細書中に記載される組成物および生成物と共に使用され得
る。
【００４７】 別の局面において、本発明は、本発明の少なくとも２個のオリゴヌクレオチド
を含む薬学的組成物に関し、ここで、２個のオリゴヌクレオチドは、互いに異な
る配列および薬学的に受容可能なキャリアを有する。
【００４８】 ワクチン処方物が、本発明の別の局面に従って提供される。このワクチンは、
抗原と組合せた本発明の任意の組成物を含む。
【００４９】 本発明の別の局面に従って、免疫応答を刺激する方法が提供される。この方法
は、ＰｙリッチまたはＴＧ免疫刺激核酸を非げっ歯類の被験体に有効量で投与す
る工程を包含し、この非げっ歯類の被験体の免疫応答を誘導する。好ましくは、
ＰｙリッチまたはＴＧ免疫応答性核酸は、経口的に、局所的に、持続性放出デバ
イスで、粘膜表面に粘膜的に、全身的に、非経口的に、または筋肉内に投与され
る。ＰｙリッチまたはＴＧ免疫刺激核酸が、粘膜表面に投与される場合、粘膜免
疫応答または全身免疫応答を誘導するために有効量で送達され得る。好ましい実
施形態において、この粘膜表面は、経口、経鼻、直腸、膣、および眼表面からな
る群から選択される。
【００５０】 いくつかの実施形態において、この方法は、被験体を抗原に曝露する工程を包
含し、ここで、この免疫応答は、抗原特異的免疫応答である。この抗原は、核酸
ベクターによってコードされ得、この核酸ベクターは、この被験体に送達され得
る。いくつかの実施形態において、この抗原は、腫瘍抗原、ウイルス性抗原、細
菌性抗原、寄生性抗原およびペプチド抗原からなる群から選択される。
【００５１】 ＰｙリッチおよびＴＧ免疫刺激核酸は、免疫応答の幅広い範囲を刺激し得る。
例えば、これらの免疫刺激核酸は、Ｔｈ２をＴｈ１免疫応答に変えるために使用
され得る。ＰｙリッチおよびＴＧ核酸はまた、免疫細胞（例えば、白血球、樹状
細胞、およびＮＫ細胞）を活性化するために使用され得る。この活性は、インビ
ボ、インビトロ、またはエキソビボで、免疫細胞を被験体から単離する工程；免
疫細胞を有効量で接触させ、ＰｙリッチまたはＴＧ免疫刺激核酸の免疫細胞を活
性化する工程；および活性化した免疫細胞を被験体に再投与する工程によって実
施され得る。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、癌抗原を発現する。こ
の樹状細胞は、エキソビボで癌抗原に曝露され得る。
【００５２】 ＰｙリッチまたはＴＧ核酸によって産生される免疫応答は、サイトカイン産物
（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８ＴＮＦ、ＩＦＮ−αおよびＩＮＦ
−γの産物）の誘導から得られ得る。
【００５３】 さらに別の実施形態において、Ｐｙリッチ核酸およびＴＧ核酸は、癌を処置す
るために有用である。このＰｙリッチ核酸およびＴＧ核酸はまた、本発明の他の
局面によると、癌を発生する危険性のある被験体において癌を予防する（例えば
、癌を発生する危険性を軽減する）際に有用である。癌は、以下からなる群から
選択され得る：胆管癌；乳癌；頸部（ｃｅｒｖｉｃａｌ）癌；絨毛癌；結腸癌；
子宮内膜癌；胃癌；上皮内新生物；リンパ腫；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞お
よび非小細胞）；黒色腫；神経芽細胞腫；口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）；
卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；甲状腺癌；および腎臓癌、ならびに
他の癌腫および肉腫。いくつかの重要な実施形態において、癌は、骨の癌、脳の
癌およびＣＮＳ癌、結合組織癌、食道癌、眼の癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、
口腔癌、皮膚癌および精巣癌からなる群から選択される。
【００５４】 Ｐｙリッチ核酸およびＴＧ核酸はまた、癌治療（例えば、抗癌治療）に対する
癌細胞の感応性を増加させるため、必要に応じて、Ｐｙリッチ核酸またはＴＧ免
疫刺激核酸が抗癌治療剤と共に投与される場合に、使用され得る。抗癌治療は、
化学治療、ワクチン（例えば、インビトロでプライム化された樹状細胞ワクチン
または癌抗原ワクチン）、または抗体ベースの治療であり得る。この後者の治療
はまた、例えば、癌細胞の細胞表面抗原に対して特異的な抗体を投与する工程を
包含し、ここで、免疫応答は抗原依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を生じる。
一実施形態において、抗体は、以下からなる群から選択され得る：Ｒｉｂｕｔａ
ｘｉｎ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｑｕａｄｒａｍｅｔ、Ｐａｎｏｒｅｘ、ＩＤＥＣ
−Ｙ２Ｂ８、ＢＥＣ２、Ｃ２２５、Ｏｎｃｏｌｙｍ、ＳＭＡＲＴ Ｍ１９５、Ａ
ＴＲＡＧＥＮ、Ｏｖａｒｅｘ、Ｂｅｘｘａｒ、ＬＤＰ−０３、ｉｏｒ ｔ６、Ｍ
ＤＸ−２１０、ＭＤＸ−１１、ＭＤＸ−２２、ＯＶ１０３、３６２２Ｗ９４、
抗ＶＥＧＦ、Ｚｅｎａｐａｘ、ＭＤＸ−２２０、ＭＤＸ−４４７、ＭＥＬＩＭＭ
ＵＮＥ−２、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−１、ＣＥＡＣＩＤＥ、Ｐｒｅｔａｒｇｅｔ、
ＮｏｖｏＭＡｂ−Ｇ２、ＴＮＴ、Ｇｌｉｏｍａｂ−Ｈ、ＧＮＩ−２５０、ＥＭＤ
−７２０００、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ、ＣＭＡ ６７６、Ｍｏｎｏｐｈａｒｍ−
Ｃ、４Ｂ５、ｉｏｒ ｅｇｆ．ｒ３、ｉｏｒ ｃ５、ＢＡＢＳ、抗ＦＬＫ−２、
ＭＤＸ−２６０、ＡＮＡ Ａｂ、ＳＭＡＲＴ １Ｄ１０ Ａｂ、ＳＭＡＲＴ Ａ
ＢＬ ３６４ Ａｂ、およびＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡ。
【００５５】 従って、本発明のいくつかの局面によると、癌を有する被験体または癌を有す
る危険性のある被験体は、免疫刺激核酸および抗癌治療剤を投与され得る。いく
つかの実施形態において、抗癌治療剤は、化学療法剤、免疫療法剤および癌ワク
チンからなる群から選択される。化学療法剤は、以下からなる群から選択され得
るが、これらに限定されない：メトトレキセート、ビンクリスチン、アドリアマ
イシン、シスプラチン、非糖含有クロロエチルニトロソ尿素、５−フルオロウラ
シル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タ
キソール、フラギリン（ｆｒａｇｙｌｉｎｅ）、メグルミンＧＬＡ、バルビシン
（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔａｉｎｅ）およびポ
リフェルポサン（ｐｏｌｉｆｅｒｐｏｓａｎ）、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ１２−９
５６６、ＲＡＳファメシル（ｆａｍｅｓｙｌ）トランスフェラーゼインヒビター
、ファメシルトランスフェラーゼインヒビター、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５
１４、ＬＹ２６４６１８／Ｌｏｍｅｔｅｘｏｌ、Ｇｌａｍｏｌｅｃ、ＣＩ−９９
４、ＴＮＰ−４７０、Ｈｙｃａｍｔｉｎ／Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ、ＰＫＣ４１２、
Ｖａｌｓｐｏｄａｒ／ＰＳＣ８３３、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ／Ｍｉｔｒｏｘａｎ
ｔｒｏｎｅ、Ｍｅｔａｒｅｔ／Ｓｕｒａｍｉｎ、Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ、Ｅ７０
７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３
３、Ｉｎｃｅｌ／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、
ＯＤＮ６９８、ＴＡ２５１６／Ｍａｒｍｉｓｔａｔ、ＢＢ２５１６／Ｍａｒｍｉ
ｓｔａｔ、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、Ｌ
ｅｍｏｎａｌ ＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ／ＯＫ−４３２
、ＡＤ３２／Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ、Ｍｅｔａｓｔｒｏｎ／ストロンチウム誘導
体、Ｔｅｍｏｄａｌ／Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ、Ｅｖａｃｅｔ／リポソームド
キソルビシン、Ｙｅｗｔａｘａｎ／Ｐｌａｃｌｉｔａｘｅｌ、Ｔａｘｏｌ／Ｐａ
ｃｌｉｔａｘｅｌ、Ｘｅｌｏａｄ／Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ、Ｆｕｒｔｕｌｏ
ｎ／Ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ、Ｃｙｃｌｏｐａｘ／経口パクリタキセル、経
口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ＨＭＲ１２７５／Ｆｌａ
ｖｏｐｉｒｉｄｏｌ、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５
４）／ＲＡＳ癌遺伝子インヒビター、ＢＭＳ−１８２７５１／経口白金、ＵＦＴ
（Ｔｅｇａｆｕｒ／Ｕｒａｃｉｌ）、Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ／Ｌｅｖａｍｉｓｏｌ
ｅ、Ｅｎｉｌｕｒａｃｉｌ／７７６Ｃ８５／５ＦＵエンハンサー、Ｃａｍｐｔｏ
／Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ／Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、Ｔｕｍ
ｏｄｅｘ／Ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ／Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ
、Ｐａｘｅｘ／Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、Ｄｏｘｉｌ／リポソームドキソルビシン
、Ｃａｅｌｙｘ／リポソームドキソルビシン、Ｆｌｕｄａｒａ／Ｆｌｕｄａｒａ
ｂｉｎｅ、Ｐｈａｒｍａｒｕｂｉｃｉｎ／Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ、ＤｅｐｏＣｙ
ｔ、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５５３／ビス−ナフタルイミド、ＬＵ１０３７９３
／Ｄｏｌａｓｔａｉｎ、Ｃａｅｔｙｘ／リポソームドキソルビシン、Ｇｅｍｚａ
ｒ／Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、ＺＤ０４７３／Ａｎｏｒｍｅｄ、ＹＭ１１６、ロ
ジンシード（ｌｏｄｉｎｅ ｓｅｅｄ）、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２インヒビター
、ＰＡＲＰインヒビター、Ｄ４８０９／Ｄｅｘｉｆｏｓａｍｉｄｅ、Ｉｆｅｓ／
Ｍｅｓｎｅｘ／Ｉｆｏｓａｍｉｄｅ、Ｖｕｍｏｎ／Ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ、Ｐａ
ｒａｐｌａｔｉｎ／Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ、Ｐｌａｎｔｉｎｏｌ／シスプラチ
ン、Ｖｅｐｅｓｉｄｅ／Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ、ＺＤ９３３１、Ｔａｘｏｔｅｒｅ
／Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、Ｔａｘａｎｅア
ナログ、ニトロソ尿素、アルキル化剤（例えば、メルフェランおよびシクロホス
ファミド）、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプ
ラチン、クロラムブシル、塩酸シタラビン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビ
シン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、
フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシ尿
素（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンα−２ａ、α
−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ−放出因子アナログ）、ロムスチン（ＣＣ
ＮＵ）、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン
、メスナ、ミトーテン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、塩酸ミトザントロン、オクトレオ
チド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモ
キシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（ｍ
−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポイエチン、ヘキサメチルメラミン（Ｈ
ＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリコサ
ールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコ
ホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）
および硫酸ビンデシン。
【００５６】 免疫療法剤は、以下からなる群から選択され得るが、これらに限定されない：
Ｒｉｂｕｔａｘｉｎ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｑｕａｄｒａｍｅｔ、Ｐａｎｏｒｅ
ｘ、ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＢＥＣ２、Ｃ２２５、Ｏｎｃｏｌｙｍ、ＳＭＡＲＴＭ
１９５、ＡＴＲＡＧＥＮ、Ｏｖａｒｅｘ、Ｂｅｘｘａｒ、ＬＤＰ−０３、ｉｏｒ
ｔ６、ＭＤＸ−２１０、ＭＤＸ−１１、ＭＤＸ−２２、ＯＶ１０３、３６２２Ｗ
９４、抗ＶＥＧＦ、Ｚｅｎａｐａｘ、ＭＤＸ−２２０、ＭＤＸ−４４７、ＭＥＬ
ＩＭＭＵＮＥ−２、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−１、ＣＥＡＣＩＤＥ、Ｐｒｅｔａｒｇ
ｅｔ、ＮｏｖｏＭＡｂ−Ｇ２、ＴＮＴ、Ｇｌｉｏｍａｂ−Ｈ、ＧＮＩ−２５０、
ＥＭＤ−７２０００、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ、ＣＭＡ６７６、Ｍｏｎｏｐｈａｒ
ｍ−Ｃ、４Ｂ５、ｉｏｒ ｅｇｆ．ｒ３、ｉｏｒ ｃ５、ＢＡＢＳ、抗ＦＬＫ−
２、ＭＤＸ−２６０、ＡＮＡ Ａｂ、ＳＭＡＲＴ １Ｄ１０ Ａｂ、ＳＭＡＲＴ
ＡＢＬ ３６４ ＡｂおよびＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡ。
【００５７】 癌ワクチンは、以下からなる群から選択されるが、これらに限定されない：Ｅ
ＧＦ、抗イディオタイプワクチン、Ｇｐ７５抗原、ＧＭＫメラノーマワクチン、
ＭＧＶガングリオシド結合ワクチン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｏｖａｒｅｘ、Ｍ−Ｖ
ａｘ、Ｏ−Ｖａｘ、Ｌ−Ｖａｘ、ＳＴｎ−ＫＨＬセラトープ（ｔｈｅｒａｔｏｐ
ｅ）、ＢＬＰ２５（ＭＵＣ−１）、リポソームイディオタイプワクチン、Ｍｅｌ
ａｃｉｎｅ、ペプチド抗原ワクチン、トキシン／抗原ワクチン、ＭＶＡベースの
ワクチン、ＰＡＣＩＳ、ＢＣＧワクチン、ＴＡ−ＨＰＶ、ＴＡ−ＣＩＮ、ＤＩＳ
ＣウイルスおよびＩｍｍｕＣｙｓｔ／ＴｈｅｒａＣｙｓ。
【００５８】 癌を予防または処置することに関する方法のさらに別の実施形態において、被
験体はインターフェロンαをさらに投与され得る。
【００５９】 本発明は、他の局面において、被験体の疾患を予防するための方法に関する。
この方法は、Ｐｙリッチ核酸またはＴＧ免疫刺激核酸を定期的に被験体に投与し
、免疫系応答を促進してこの被験体の疾患を予防する工程を包含する。本発明の
予防的方法を使用して予防されることが求められる疾患または状態には、細菌感
染（例えば、性感染病）および食物アレルギーによるアナフィラキシーショック
が挙げられる。
【００６０】 他の局面において、本発明は、先天免疫応答を活性化するために有効な量のＰ
ｙリッチ核酸またはＴＧ免疫刺激核酸を被験体に投与することによって、先天免
疫応答を誘導するための方法である。
【００６１】 本発明の別の局面によると、ウイルス感染またはレトロウイルス感染を処置ま
たは予防するための方法が提供される。この方法は、ウイルス感染またはレトロ
ウイルス感染を有するかまたは有する危険性のある被験体に、このウイルス感染
またはレトロウイルス感染を処置または予防するために有効な量の本発明の任意
の組成物を投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、このウイル
スは、肝炎ウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、または乳
頭腫ウイルスによって誘発される。
【００６２】 細菌感染を処置または予防するための方法は、本発明の別の局面に従って提供
される。この方法は、細菌感染を有するかまたはその危険性のある被験体に、こ
の細菌感染を処置または予防するために有効な量の本発明の任意の組成物を投与
する工程を包含する。一実施形態において、細菌感染は、細胞内細菌に起因する
。
【００６３】 別の局面において、本発明は、寄生生物感染を有するかまたは有する危険性の
ある被験体に、この寄生生物感染を処置または予防するために有効な量の本発明
の任意の組成物を投与することによって、寄生生物感染を処置または予防するた
めの方法である。一実施形態において、寄生生物感染は、細胞内寄生生物に起因
する。別の実施形態において、寄生生物感染は、非寄生虫性寄生生物に起因する
。
【００６４】 いくつかの実施形態において、被験体はヒトであり、そして他の実施形態にお
いて、被験体は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、魚、サル、ニワトリお
よびヒツジからなる群から選択される非ヒト脊椎動物である。
【００６５】 さらに別の局面において、本発明は、喘息を有するかまたは有する危険性のあ
る被験体に、喘息を処置または予防するために有効な量の本発明の任意の組成物
を投与することによって、喘息を処置または予防するための方法である。一実施
形態において、喘息はアレルギー性喘息である。
【００６６】 別の局面において、本発明は、アレルギーを処置または予防するための方法に
関する。この方法は、アレルギーを有するかまたは有する危険性のある被験体に
、アレルギーを処置または予防するために有効な量の本発明の任意の組成物を投
与する工程を包含する。
【００６７】 免疫欠損を処置または予防するための方法は、本発明の別の局面に従って提供
される。この方法は、免疫欠損を有するかまたは有する危険性のある被験体に、
免疫欠損を処置または予防するために有効な量の本発明の任意の組成物を投与す
る工程を包含する。
【００６８】 別の局面において、本発明は、ＴＨ１免疫応答を生成するために有効な量の本
発明の任意の組成物を、被験体に投与することによってＴＨ１免疫応答を誘発す
るための方法に関する。
【００６９】 一実施形態において、本発明の方法は、式５’Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2３’のオリゴヌ
クレオチド、およびメチル化されていないＣＧジヌクレオチドのＴＧジヌクレオ
チドまたはＴリッチ配列を有する免疫刺激核酸を投与する工程を包含する。一実
施形態において、５’Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2３’を含むオリゴヌクレオチドは、免疫刺
激核酸と別に投与される。いくつかの実施形態において、５’Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2３
’を含むオリゴヌクレオチドおよび免疫刺激核酸は、毎週交互のスケジュールで
投与され、そして一実施形態において、５’Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2３’を含むオリゴヌ
クレオチドおよび免疫刺激核酸は、隔週交互のスケジュールで投与される。
【００７０】 別の局面において、本発明は、免疫刺激核酸および抗癌治療剤を含む組成物を
提供し、この組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中で、癌を処置するためま
たは癌を発生する危険性を軽減するために有効な量で処方される。重要な実施形
態において、免疫刺激核酸は、Ｔリッチ核酸、ＴＧ核酸およびＣリッチ核酸から
なる群から選択される。
【００７１】 本発明はさらに、免疫刺激核酸を収容する第１の容器、および抗癌治療剤を収
容する少なくとも１つの他の容器（例えば、第２の容器）、ならびに使用のため
の説明書を備えるキットを提供する。一実施形態において、このキットは、イン
ターフェロンαをさらに含み、このインターフェロンαは、さらに別の容器（例
えば、第３の容器）に別々に収容され得る。重要な実施形態において、このキッ
トは、免疫刺激核酸を含む徐放ビヒクル、および抗癌治療剤を収容する少なくと
も１つの容器、および抗癌治療剤の投与のタイミングについての使用説明書を備
える。免疫刺激核酸は、Ｐｙリッチ核酸、ＴＧ核酸およびＣｐＧ核酸からなる群
から選択され得、ここで、このＣｐＧ核酸は、配列番号２４６を含むヌクレオチ
ド配列を有する。
【００７２】 本発明はさらに、喘息またはアレルギーを予防または処置するための方法を提
供し、この方法は、喘息またはアレルギーを処置または予防するために有効な量
の免疫刺激核酸および喘息／アレルギー薬を投与する工程を包含する。重要な実
施形態において、免疫刺激核酸は、Ｔリッチ核酸、ＴＧ核酸およびＣリッチ核酸
からなる群から選択される。
【００７３】 一実施形態において、免疫刺激核酸はＴリッチ核酸である。関連の実施形態に
おいて、Ｔリッチ核酸は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有
する：配列番号５９−６３、７３−７５、１４２、２１５、２２６、２４１、２
６７−２６９、２８２、３０１、３０４、３３０、３４２、３５８、３７０−３
７２、３９３、４３３、４７１、４７９、４８６、４９１、４９７、５０３、５
５６−５５８、５６７、６９４、７９３−７９４、７９７、８３３、８５２、８
６１、８６７、８６８、８８２、８８６、９０５、９０７、９０８、および９１
０−９１３。他の実施形態において、Ｔリッチ核酸は、以下からなる群から選択
される配列である：配列番号６４、９８、１１２、１４６、１８５、２０４、２
０８、２１４、２２４、２３３、２４４、２４６、２４７、２５８、２６２、２
６３、２６５、２７０−２７３、３００、３０５、３１６、３１７、３４３、３
４４、３５０、３５２、３５４、３７４、３７６、３９２、４０７、４１１−４
１３、４２９−４３２、４３４、４３５、４４３、４７４、４７５、４９８−５
０１、５１８、６８７、６９２、６９３、８０４、８６２、８８３、８８４、８
８８、８９０、および８９１。
【００７４】 さらに関連の実施形態において、Ｔリッチ核酸はＴＧ核酸ではない。さらに別
の実施形態において、Ｔリッチ核酸はＣｐＧ核酸ではない。
【００７５】 一実施形態において、免疫刺激核酸は、ＴＧ核酸である。さらに関連の実施形
態において、ＴＧ核酸は、Ｔリッチ核酸ではない。別の関連の実施形態において
、ＴＧ核酸はＣｐＧ核酸ではない。
【００７６】 一実施形態において、免疫刺激核酸はＣｐＧ核酸であり、ここで、ＣｐＧ核酸
は、配列番号２４６を含むヌクレオチド配列を有する。
【００７７】 別の実施形態において、喘息／アレルギー薬は以下からなる群から選択される
医薬であるが、これらに限定されない：ＰＤＥ−４インヒビター、気管支拡張薬
／β−２アゴニスト、Ｋ+チャネルオープナー、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、ニ
ューロキニンアンタゴニスト、ＴＸＡ２合成インヒビター、キサンタニン（Ｘａ
ｎｔｈａｎｉｎｅ）、アラキドン酸アンタゴニスト、５リポキシゲナーゼインヒ
ビター、トロンボキシン（Ｔｈｒｏｍｂｏｘｉｎ）Ａ２レセプターアンタゴニス
ト、トロンボキサンＡ２アンタゴニスト、５−リポックス（ｌｉｐｏｘ）活性化
タンパク質のインヒビター、およびプロテアーゼインヒビター。いくつかの重要
な実施形態において、喘息／アレルギー薬は、以下からなる群から選択される気
管支拡張薬／β−２アゴニストである：サルメテロール、サルブタモール、テル
ブタリン、Ｄ２５２２／フォルモテロール、フェノテロール、およびオルシプレ
ナリン。
【００７８】 別の実施形態において、喘息／アレルギー薬は、抗ヒスタミン薬およびプロス
タグランジン誘発剤からなる群から選択される医薬である。一実施形態において
、抗ヒスタミン薬は、以下からなる群から選択される：ロラチジン（ｌｏｒａｔ
ｉｄｉｎｅ）、セチリジン、ブクリジン、セテリジン（ｃｅｔｅｒｉｚｉｎｅ）
アナログ、フェキソフェナジン（ｆｅｘｏｆｅｎａｄｉｎｅ）、テルフェナジン
、デスロラタジン、ノラステミゾール（ｎｏｒａｓｔｅｍｉｚｏｌｅ）、エピナ
スチン、エバスチン、エバスチン、アステミゾール、レボカルニチン、アゼラス
チン、トラニスラスト、テルフェナジン、ミゾラスチン（ｍｉｚｏｌａｓｔｉｎ
ｅ）、ベタタスチン（ｂｅｔａｔａｓｔｉｎｅ）、ＣＳ５６０、およびＨＳＲ６
０９。別の実施形態において、プロスタグランジン誘発剤はＳ−５７５１である
。
【００７９】 さらに別の実施形態において、喘息／アレルギー薬は、ステロイドおよび免疫
調節薬からなる群から選択される。免疫調節薬は、以下からなる群から選択され
得るが、これらに限定されない：抗炎症薬、ロイコトリエンアゴニスト、ＩＬ４
ムテイン、可溶性ＩＬ−４レセプター、免疫抑制薬、抗ＩＬ−４抗体、ＩＬ−４
アンタゴニスト、抗ＩＬ−５抗体、可溶性ＩＬ−１３レセプター−Ｆｃ融合タン
パク質、抗ＩＬ−９抗体、ＣＣＲ３アンタゴニスト、ＣＣＲ５アンタゴニスト、
ＶＬＡ−４インヒビター、およびＩｇＥのダウンレギュレーター。一実施形態に
おいて、ＩｇＥのダウンレギュレーターは、抗ＩｇＥである。
【００８０】 別の実施形態において、ステロイドは、以下からなる群から選択される：ベク
ロメタゾン、フルチカゾン、トラムシノロン（ｔｒａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）、ブ
デソニド、およびブデソニド。なおさらなる実施形態において、免疫調抑制薬は
、寛容化ペプチドワクチンである。
【００８１】 一実施形態において、免疫刺激核酸は、喘息／アレルギー薬と同時に投与され
る。別の実施形態において、被験体は、免疫無防備状態の被験体である。
【００８２】 喘息／アレルギーの予防および処置に関して本明細書中で開示される方法にお
いて、被験体に投与される免疫刺激核酸は、本発明の他の方法の局面について記
載される通りである。
【００８３】 別の局面において、本発明は、免疫刺激核酸を収容する第１の容器、および喘
息／アレルギー薬を収容する少なくとも別の容器（例えば、第２の容器）、なら
びに使用のための説明書を備えるキットを提供する。このキットにおいて有用な
免疫刺激核酸は、本明細書中で記載される通りである。重要な実施形態において
、免疫刺激核酸は、Ｔリッチ核酸、ＴＧ核酸およびＣリッチ核酸からなる群から
選択される。別の重要な実施形態において、このキットは、免疫刺激核酸を含む
徐放ビヒクル、および喘息／アレルギー薬を収容する少なくとも１つの容器、お
よび喘息／アレルギー薬の投与のタイミングについての使用説明書を備える。喘
息／アレルギー薬は、喘息／アレルギーの予防または処置に関する前述の方法に
おいて記載された喘息／アレルギー薬の群から選択され得る。
【００８４】 さらに別の局面において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアで、そして
、喘息またはアレルギーの媒介物への曝露に関連した免疫応答を予防および処置
するための有効量で、免疫刺激核酸および喘息／アレルギー薬を含む組成物を提
供する。免疫応答性核酸は、前述の方法および組成物について記載された免疫刺
激核酸の群から選択され得る。重要な実施形態において、免疫刺激核酸は、Ｔリ
ッチ核酸、ＴＧ核酸およびＣリッチ核酸からなる群から選択される。喘息／アレ
ルギー薬は、前述の方法および組成物に記載されるように、喘息薬およびアレル
ギー薬からなる群から選択され得る。
【００８５】 なおさらに別の局面において、本発明は、配列番号９５〜１３６、配列番号１
３８〜１５２、配列番号１５４〜２２２、配列番号２２４〜２４５、配列番号２
４７〜２６１、配列番号２６３〜２９９、配列番号３０１、配列番号３０３〜４
１０９、配列番号４１４〜４２０、配列番号４２４、配列番号４２６〜４９７、
配列番号９５９〜１０２２、配列番号１０２４〜１０９３からなる群から選択さ
れる免疫刺激核酸、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を提供する
。好ましくは、免疫刺激核酸は、有効量で組成物中に存在する。１つの実施形態
において、免疫刺激核酸は、免疫応答を誘導するために有効量で存在する。別の
実施形態において、免疫刺激核酸は、癌を予防または処置するための有効量で存
在する。なおさらなる実施形態において、免疫刺激核酸は、喘息／アレルギーを
予防または処置するための有効量で存在する。本発明はまた、前述の免疫刺激核
酸組成物のいずれかおよび使用についての説明書を含むキットを提供する。
【００８６】 別の局面において、本発明は、基本的に５’Ｍ1ＴＣＧＴＣＧＴＴＭ2３’から
なる免疫刺激核酸の組成物を含み、ここで、少なくとも１つのＣは、メチル化さ
れておらず、ここで、Ｍ1は、少なくとも１つのヌクレオチドを有する核酸であ
って、Ｍ2は、０〜５０個のヌクレオチドを有する核酸であり、ここで、免疫刺
激核酸は、少なくとも１００個未満のヌクレオチドを有する。
【００８７】 さらに他の局面において、本発明は、５’ＴＣＧＴＣＧＴＴ３’からなる免疫
刺激核酸および徐放デバイスの薬学的組成物に関し、ここで、少なくとも１つの
Ｃは、メチル化されておらず、この免疫刺激核酸は、１００個未満のヌクレオチ
ドおよびリン酸ジエステル骨格を有する。いくつかの実施形態において、徐放デ
バイスは微小粒子である。他の実施形態において、この組成物は、抗原を含む。
【００８８】 本発明の制限のそれぞれは、本発明の種々の実施形態を包含し得る。従って、
任意の１つのエレメントまたはエレメントの組み合わせを含む本発明の制限のそ
れぞれは、本発明のそれぞれの局面において含まれ得ることが期待される。
【００８９】 （詳細な説明） １つの局面において、本発明は、ピリミジン（Ｐｙ）リッチおよび好ましくは
チミジン（Ｔ）リッチ核酸およびＴＧジヌクレオチド部分を含む核酸が免疫刺激
効果を媒介する際に効果的であるという知見を含む。ＣｐＧ含有核酸は、癌、感
染性疾患、アレルギー、ぜん息および他の障害を処置するため、ならびに癌の化
学療法後の日和見感染に対する防御を補助するために免疫系を刺激する、治療組
成物および予防組成物であることが、当該分野で公知である。さらに強力な平衡
化された、ＣｐＧの刺激に起因する細胞性免疫応答および体液性免疫応答は、侵
入してくる病原および癌細胞に対する身体自身の自然な防御系を反映する。Ｃｐ
Ｇ配列は、ヒトＤＮＡにおいては比較的稀であるが、細菌のような感染生物のＤ
ＮＡにおいて、一般に見出される。ヒト免疫系は、感染の初期の危険信号として
ＣｐＧ配列を認識し、そして他の免疫刺激因子によって頻繁に見られるような有
害な反応を引き起こすことなく、侵入してくる病原に対して急速かつ強力な免疫
応答を開始するように、明らかに進化している。従って、ＣｐＧ含有核酸は、こ
の先天免疫防御機構に依存して、免疫療法のための独特かつ自然の経路を利用し
得る。免疫調節に対するＣｐＧ核酸の効果は、本特許出願の発明者により発見さ
れ、そして例えば、以下のような同時係属中の特許出願において広範に記載され
ている：米国特許出願番号：０８／３８６，０６３（１９９５年２月７日出願）
（および関連ＰＣＴ ＵＳ９５／０１５７０）；０８／７３８，６５２（１９９
６年１０月３０日出願）；０８／９６０，７７４（１９９７年１０月３０日出願
）（および関連ＰＣＴ／ＵＳ９７／１９７９１、ＷＯ９８／１８８１０）；０９
／１９１，１７０（１９９８年１１月１３日出願）；０９／０３０，７０１（１
９９８年２月２５日出願）（および関連ＰＣＴ／ＵＳ９８／０３６７８）；０９
／０８２，６４９（１９９８年５月２０日出願）（および関連ＰＣＴ／ＵＳ９８
／１０４０８）；０９／３２５，１９３（１９９９年６月３日出願）（および関
連ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４７０３）；０９／２８６，０９８（１９９９年４月２
日出願）（および関連ＰＣＴ／ＵＳ９９／０７３３５）；０９／３０６，２８１
（１９９９年５月６日出願）（および関連ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９８６３）。こ
れらの特許および特許出願の各々の全体の内容は、本明細書中に参考として援用
される。
【００９０】 本発明の知見は、上記のＣｐＧ含有核酸の使用およびＣｐＧ核酸についての任
意の他の公知の使用の全てに適用可能である。１つの局面において、本発明は、
Ｐｙリッチおよび好ましくはＴリッチおよびＴＧ核酸が、ＣｐＧ部分が存在する
か否かに関わらず、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに類似した免疫刺激特性を有する
という発見を含む。従って、本発明は、ＰｙリッチまたはＴＧ核酸を使用する免
疫系を刺激するための任意の方法について有用である。本発明に従って、ＣｐＧ
部分を欠くキメラオリゴヌクレオチドは免疫刺激性であり、そして、ＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドと同一の予防的および治療的活性の多くを有する。
【００９１】 Ｐｙリッチ核酸は、ＴリッチまたはＣリッチ免疫刺激核酸である。いくつかの
実施形態において、Ｔリッチ核酸が好ましい。Ｔリッチ核酸は、少なくとも１つ
のポリＴ配列を含みそして／または２５％を超えるＴヌクレオチド残基のヌクレ
オチド組成物を有する核酸である。ポリＴ配列を有する核酸は、少なくとも４つ
のＴ（例えば、５’ＴＴＴＴ３’）を連続して含む。好ましくは、Ｔリッチ核酸
は、１つ以上のポリＴ配列を含む。好ましい実施形態において、Ｔリッチ核酸は
、２、３、４、などのポリＴ配列（例えば、オリゴヌクレオチド＃２００６（配
列番号２４６））を有し得る。本発明に従って発見された最も高度に免疫刺激性
のＴリッチオリゴヌクレオチドの１つは、全体のＴヌクレオチド残基（例えば、
オリゴヌクレオチド＃２１８３（配列番号４３３））から構成される核酸である
。本発明に従う、他のＴリッチ核酸は、２５％を超えるＴヌクレチド残基のヌク
レオチド組成物を有するが、ポリＴ配列を必ずしも含まない。これらのＴリッチ
核酸において、Ｔヌクレオチド残基は、他の型のヌクレオチド残基（すなわち、
Ｇ、Ｃ、およびＡ）によってお互いから分離され得る。いくつかの実施形態にお
いては、Ｔリッチ核酸は、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、
９０％および９９％より多いおよびその間の全ての整数のＴヌクレオチド残基の
ヌクレオチド組成物を有する。好ましくは、Ｔリッチ核酸は、少なくとも１つの
ポリＴ配列および２５％より多いＴヌクレオチド残基のヌクレオチド組成物を有
する。
【００９２】 本発明に従って、ＯＤＮのＴ含有量は、ＯＤＮの免疫刺激効果に対して劇的な
効果を有し、そして、ＴリッチＯＤＮは、任意のＣｐＧ部分の非存在下で複数の
ヒト免疫細胞型を活性化し得ることが発見された。３’ポリＴ領域および２つの
５’ＣＧを有するオリゴヌクレオチド（例えば、ＯＤＮ２１８１（配列番号４３
１））は、高度に免疫刺激性である。類似した長さのオリゴヌクレオチド、５’
末端の２つのＣＧジヌクレオチドおよび３’末端のポリＣ領域を含むＯＤＮ２１
１６（配列番号３５７）はまた、標準的実験条件を使用して、Ｔリッチオリゴヌ
クレオチドよりもより低い程度であるが、免疫刺激性であった。従って、Ｃおよ
びＴは、およそ同一の構造を有するが、ＯＤＮの免疫性質に対する効果は変化す
る。これらは両方とも、異なった程度であるが、免疫応答性を誘導し得る。従っ
て、ＴリッチおよびＣリッチオリゴヌクレオチドの両方は、本発明に従って有用
であるが、Ｔリッチオリゴヌクレオチドが好ましい。さらに、ＯＤＮのＴ含有量
がＧ、Ａ、またはＣのような他の塩基を取り込むことによって減少する場合、次
いで、免疫刺激効果が減少される（ＯＤＮ＃２１８８（配列番号９０５）、２１
９０（配列番号９０７）、２１９１（配列番号９０８）、および２１９３（配列
番号９１０））。
【００９３】 Ｃリッチ核酸は、少なくとも１つまたは好ましくは少なくとも２つのポリＣ領
域を有するかまたは少なくとも５０％のＣヌクレオチドから構成される核酸分子
である。ポリＣ領域は、少なくとも４つの連続したＣ残基である。従って、ポリ
Ｃ領域は、一般式５’ＣＣＣＣ３’によって含まれる。いくつかの実施形態にお
いて、ポリＣ領域は一般式５’ＣＣＣＣＣＣ３’を有することが好ましい。本発
明に従う他のＣリッチ核酸は、５０％を超えるヌクレオチド残基のヌクレオチド
組成物を有するが、必ずしもポリＣ配列を含まない。これらのＣリッチ核酸にお
いて、Ｃヌクレオチド残基は、他の型のヌクレオチド残基（すなわち、Ｇ、Ｔ、
およびＡ）によってお互いから分離され得る。いくつかの実施形態において、Ｃ
リッチ核酸は、６０％、７０％、８０％、９０％、および９９％を超えるおよび
その間の全ての整数のＣヌクレオチド残基のヌクレオチド組成物を有する。好ま
しくは、Ｃリッチタンパク質は、少なくとも１つのポリＣ配列および５０％を超
えるＣヌクレオチド残基のヌクレオチド組成物を有し、そして、いくつかの実施
形態において、Ｔリッチでもある。
【００９４】 実施例において示されるように、非刺激性であると以前に記載されそしてコン
トロールＯＤＮとして主に使用される、２つのＯＤＮの配列番号２２５および配
列番号２８２を含む非免疫刺激性であると以前に考えられていたいくつかのＯＤ
Ｎ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔら、２０００．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４４
５８）は、免疫刺激性であることが見出された。当業者らの実験は、ＣｐＧ Ｏ
ＤＮと比較して高い濃度であるが、これらのＯＣＮがＢ細胞を刺激し得ることを
実証した（図６）。長いポリＴ ＯＤＮ（３０マー）は、少なくともいくつかの
実験において、Ｂ細胞の最も強いＣｐＧ ＯＤＮ活性化因子の１つに対して、比
較可能なＢ細胞の強い活性化を誘導した。これらの実験はまた、ポリＣ ＯＤＮ
でさえもＢ細胞の刺激を生じ得るという驚くべき知見を開示する。
【００９５】 しかし、これらのＯＤＮによる免疫刺激は、ヒトＢ細胞に制限されない。異な
った実験アッセイは、単球に加えて、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞でさえも、この
ような非ＣｐＧ ＯＤＮによって活性化され得ることを明白に実証した（図７〜
１０）。ポリＴおよびポリＣ配列と対照的に、ポリＡ配列（少なくとも単球、Ｂ
およびＮＫ細胞について）による免疫化は達成されない。興味深いことに、Ｃｐ
Ｇ部分の配列番号２２５への導入は免疫刺激活性を増強することが見出されたが
、ポリＴストレッチを使用する伸長は、免疫刺激を増強しなかった。このことは
、ＣｐＧおよびＴリッチＯＣＮが、異なった機構または経路を通って働き得るこ
とを示唆する。ポリＴ部分の配列番号２２５の異なった部分への挿入が、免疫刺
激特性における変化を生じ得ることはまたありうる。
【００９６】 本明細書中で使用される場合、「ＴＧ核酸」または「ＴＧ免疫刺激核酸」は、
少なくとも１つのＴｑＧジヌクレオチド（チミジン−グアニンジヌクレオチド配
列（すなわち、「ＴＧ ＤＮＡ」）または３’グアノシンが後に続き、リン酸結
合によって連結される５’チミジンを含むＤＮＡ）であり、そして、免疫系の成
分を活性化する。
【００９７】 １つの実施形態において、本発明は、少なくとも以下の式： ５’Ｎ1Ｘ1ＴＧＸ2Ｎ2３’ によって示されるＴＧ核酸を提供し、ここで、Ｘ1およびＸ2はヌクレオチドであ
り、そしてＮは任意のヌクレオチドであり、そしてＮ1およびＮ2は、Ｎ1および
Ｎ2の総合計が１１から２１の範囲にあるという条件で、任意の数のＮから構成
される核酸配列である。例えば、Ｎ1が５である場合、次いでＮ2は６であり得る
（これは、全長１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを導く）。ＴＧは、オリ
ゴヌクレオチドストレッチ内の任意の位置（５’末端、中央、および３’末端を
含む）に位置し得る。従って、包括的に１１から２１に等しいＮ2およびＮ1の合
計を与えるようにＮ2を適切に選択するという条件で、Ｎ1は、包括的に０〜２１
であり得る。同様に、包括的にＮ1およびＮ2の合計が１１から２１に等しいとい
う条件で、Ｎ2は、包括的に０〜２１であり得る。いくつかの実施形態において
、Ｘ1はアデニン、グアニン、またはチミジンであり、そしてＸ2は、シトシン、
アデニン、またはチミジンである。好ましい実施形態において、Ｘ2はチミジン
である。他の実施形態において、Ｘ1はシトシンであり、そして／またはＸ２は
グアニンである。他の実施形態において、本明細書中で議論されるように、そう
するのに十分長いという条件で、核酸は他の部分を含み得る。
【００９８】 他の実施形態において、ＴＧ核酸は、少なくとも以下の式： ５’Ｎ1Ｘ1Ｘ2ＴＧＸ3Ｘ4Ｎ2３’ によって示され、ここで、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、およびＸ4はヌクレオチドである。い
くつかの実施形態において、Ｘ1Ｘ2は、以下：ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ
、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＴｐＡおよびＴｐＴからなる群から選択さ
れるヌクレオチドであり；そしてＸ3Ｘ4は、以下：ＴｐＴ、ＣｐＴ、ＡｐＴ、Ａ
ｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、およびＣｐＡからなる群より
選択されるヌクレオチドであり；Ｎは任意のヌクレオチドであり、そしてＮ1お
よびＮ2は、、Ｎ1およびＮ2の総合計が９から１２の範囲であるという条件で、
任意の数のヌクレオチドから構成される核酸配列である。いくつかの実施形態に
おいて、Ｘ1Ｘ2は、ＧｐＡまたはＧｐＴであり、そしてＸ3Ｘ4はＴｐＴである。
他の実施形態において、Ｘ1もしくはＸ2または両方がプリンであり、そしてＸ3
もしくはＸ4または両方がピリミジンであり、あるいは、Ｘ1Ｘ2はＧｐＡであり
、そしてＸ3もしくはＸ4または両方がピリミジンである。１つの好ましい実施形
態においては、Ｘ3Ｘ4は、以下：ＴｐＴ、ＴｐＣおよびＴｐＡからなる群から選
択されるヌクレオチドである。
【００９９】 免疫刺激核酸は、少なくとも４ヌクレオチドを提供する任意のサイズ（すなわ
ち、長さ）であり得る。重要な実施形態において、免疫刺激核酸は、６と１００
との間の範囲の長さを有する。さらに他の実施形態において、長さは、８ヌクレ
オチドと３５ヌクレオチドとの間の範囲である。好ましくは、ＴＧオリゴヌクレ
オチドは、１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドのサイズの範囲である。
【０１００】 免疫刺激核酸のサイズ（すなわち、核酸の長さに沿ったヌクレオチド残基の数
）はまた、核酸の刺激活性の一因となる。驚いたことに、高い免疫刺激性の免疫
刺激核酸に対してさえ、核酸の長さは、達成され得る免疫刺激の程度に影響を及
ぼす。２４ヌクレオチドまでのＴリッチ核酸の長さの増加は、免疫刺激を増加さ
せる原因となることが示された。実施例における実験は、Ｔリッチ核酸の長さが
、１８ヌクレオチド〜２７ヌクレオチドまで増加する場合、免疫応答を刺激する
核酸の能力は、有意である（２７ヌクレオチドから１８ヌクレオチドへ減少する
ＯＤＮ２１９４、２１８３、２１９５、および２１９６と比較して）ことを示す
。３０ヌクレオチドまでの核酸の長さの増加は、核酸の生物学的特性に対して劇
的な影響を有するが、３０ヌクレオチドを超える長さは、さらに免疫刺激効果に
影響を及ぼすことを現わさない（例えば、ＯＤＮ２１７９をＯＤＮ２００６と比
較して）。
【０１０１】 長さ１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの範囲にあるＴＧ核酸が、増加され
た免疫刺激性を示し得ることが示された。従って、１つの局面において、本発明
は、１５ヌクレオチド長〜２７ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド（すなわち
、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６
または２７ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド）を提供し、このヌクレオチド
は、Ｔリッチ核酸であり得、またはＴＧ核酸であり得、またはＴリッチ核酸およ
びＴＧ核酸の両方であり得る。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは
、Ｔリッチ核酸ではなく、ＴＧ核酸でもない。他の実施形態において、オリゴヌ
クレオチドは、ＣＧモチーフを有さない。本発明は同様に、１５〜２７ヌクレオ
チド長のオリゴヌクレオチド、１８〜２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド
、２０〜２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、および２３〜２５ヌクレオ
チド長のオリゴヌクレオチドを提供する。１５〜２７長のオリゴヌクレオチドに
関する任意の前述の実施形態はまた、これらの異なる長さのオリゴヌクレオチド
に関する。本発明はさらに、本明細書中に列挙される方法における任意のこれら
前述のオリゴヌクレオチドの使用を包含する。
【０１０２】 免疫刺激の最大レベルは、核酸が２４〜３０ヌクレオチド残基長である場合、
いくつかのＴリッチ核酸で、および１５〜２５ヌクレオチド長の範囲のいくつか
のＴＧ核酸で達成されるにもかかわらず、より短いまたはより長い免疫刺激核酸
もまた、本発明の方法に従って使用され得る。細胞への取り込みを容易にするた
め、免疫刺激核酸は、好ましくは６ヌクレオチド残基の最小長さを有する。６ヌ
クレオチドより大きい任意のサイズ（何ｋｂ長でさえある）の核酸は、十分な免
疫刺激モチーフが存在する場合、本発明に従う免疫応答を誘導し得る。なぜなら
、より大きい核酸は、細胞内部でオリゴヌクレオチドに分解されるからである。
好ましくは、免疫刺激核酸は、８と１００との間の範囲にあり、そしていくつか
の実施態様においては、免疫刺激核酸を含むＴリッチ核酸は、２４と４０との間
のヌクレオチド長であり、そして免疫刺激核酸を含むＴＧ核酸は、１５と２５と
の間のヌクレオチド長である。
【０１０３】 １実施形態において、Ｔリッチ核酸は、少なくとも以下の式： ５’Ｘ1Ｘ2ＴＴＴＸ3Ｘ4３’ によって表され、 ここでＸ1、Ｘ2、Ｘ3、およびＸ4は、ヌクレオチドである。１つの実施形態にお
いて、Ｘ1Ｘ2はＴＴおよび／またはＸ3Ｘ4はＴＴである。別の実施形態において
、Ｘ1Ｘ2は以下のヌクレオチド： ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＡＴ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＡ、ＧＴ、ＧＧ、
ＧＡ、およびＧＣ； の任意の１つであり、ならびにＸ3Ｘ4は以下のヌクレオチド： ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＡＴ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＡ、ＧＴ、ＧＧ、
ＧＡ、およびＧＣの任意の１つである。
【０１０４】 いくつかの実施形態において、免疫刺激核酸は、ポリＣ（ＣＣＣＣ）、または
ポリＡ（ＡＡＡＡ）を含まないことが好ましい。他の実施形態において、免疫刺
激核酸は、ポリＣ、ポリＡ、ポリＧ（ＧＧＧＧ）または複数ＧＧを含むことが好
ましい。特に、ポリＧまたは複数ＧＧモチーフは、いくつかの免疫刺激核酸に対
して劇的な効果を有する。これらの非Ｔ配列の効果は、核酸骨格の状態にある程
度依存する。例えば、核酸がホスホジエステル骨格またはキメラ骨格を有する場
合、その核酸において、これらの配列を含むことは、核酸の生物学的活性への任
意の影響がある場合、最小限のことに過ぎない。この骨格が、完全にホスホロチ
オエート（または他のリン酸修飾）であるか、または有意にホスホロチオエート
であるならば、これらの配列を含むことは、生物学的活性または生物学的活性の
反応速度論により影響を有し得る。これは、Ｔリッチ免疫刺激核酸およびＴＧ免
疫刺激核酸の潜在能の減少による。
【０１０５】 Ｃリッチ核酸は、免疫刺激性特性を有することを示されたとはいえ、核酸にお
いてＴヌクレオチドの相対的な割合を減ずる様式でのＴリッチ核酸へのポリＣ配
列の挿入は、核酸に対して悪影響を有し得る。出願人は、提案されたメカニズム
に拘束されるとはいえ、免疫系が、異なる配列を認める結合タンパク質または異
なる親和性を有するが全ての免疫刺激配列を認める特異的タンパク質の異なるセ
ットからおそらく生じる異なるヌクレオチド特性を有する核酸を特徴付けるため
のメカニズムを明らかにしたと考える。一般的に、非メチル化ＣｐＧモチーフを
含む核酸は、最も免疫刺激であり、次いでＴリッチ核酸、ＴＧ核酸およびＣリッ
チ核酸である。しかし、この一般化は、多くの除外がある。例えば、配列番号８
８６のような強力なＴリッチ核酸は、いくつかのアッセイにおいておくつかのＣ
ｐＧを含む核酸（例えば、ホスホロチオエートＣｐＧ核酸を含む単一ＣｐＧモチ
ーフ）よりもより免疫刺激である。
【０１０６】 免疫刺激核酸に対するポリＡ末端の付加は、核酸の活性を高め得ることもまた
、明らかにされた。高い免疫刺激ＣｐＧ核酸（配列番号２４６）が、ポリＡ末端
（ＡＡＡＡＡＡ）またはポリＴ末端（ＴＴＴＴＴＴ）の付加によって改変される
場合、生じるオリゴヌクレオチドは、免疫刺激活性を増大する。オリゴヌクレオ
チドの免疫刺激特性を増大させるポリＡ末端およびポリＴ末端の能力は、非常に
似ている。配列番号２４６は、Ｔリッチオリゴヌクレオチドである。ポリＡ末端
およびポリＴ末端が、Ｔリッチでない核酸に付加される場合、核酸の免疫刺激性
能力に対してより大きな影響を有するようである。ポリＴ末端が、すでにＴリッ
チな核酸に付加されるため、ポリＴ付加の免疫刺激性特性は、完全ではないにし
てもいくらか弱まった。この知見は、ポリＡ領域の使用のための重要な含みを有
する。従って、いくつかの実施形態において、免疫刺激核酸は、ポリＡ領域を含
み、そして他の実施形態においては含まない。
【０１０７】 本発明の免疫刺激核酸のいくつかは、１つ以上のＣＧモチーフを含む。免疫刺
激核酸におけるＣＧモチーフの存在はまた、核酸の生物学的活性への影響を有す
る。免疫刺激核酸の全長が、２０ヌクレオチド残基以下である場合、次いでＣｐ
Ｇモチーフは、核酸の免疫効果の決定に重要であり、そしてこれらのモチーフの
メチル化は、核酸の免疫刺激効果の潜在能を減ずる。免疫刺激核酸の長さが、２
４に増えた場合、次いで核酸の免疫刺激効果は、ＣｐＧモチーフへの依存性は少
なくなり、そしてＣｐＧモチーフのメチル化によりまたはＧＣジヌクレオチドへ
の転化によりもはや完全には破壊されず、これらのことが本明細書に記載される
他の免疫刺激特性の存在を提供する。
【０１０８】 例えば、ＯＤＮ２００６（配列番号２４６）は、４つのＣｐＧジヌクレオチド
を有する２４ヌクレオチド残基長の高い免疫刺激Ｔリッチ核酸である。しかし、
ＣｐＧモチーフがメチル化されたＯＤＮ２１１７（配列番号３５８）もまた、高
い免疫刺激である。ＯＤＮ２１３７（配列番号８８６）（ＯＤＮ２００６のＣｐ
ＧモチーフがＧｐＣへ転化され、そして結果として６つのＴＧジヌクレオチドを
有する）もまた、免疫刺激である。ＯＤＮ２１１７および２１３７などの核酸の
免疫刺激効果は、それらのＴ含量およびＴＧ含量によって調節される。これらの
３つの核酸のそれぞれは、Ｔリッチであり、そしてＯＤＮ２１３７は、さらにＴ
Ｇリッチである。これらのＴ含量が、他の塩基（Ａ（ＯＤＮ２１１７（配列番号
３５８））など）の挿入によって減じられる場合、またはこれらのＴＧ含量が、
ＴＧをＡＧで置換することによって減じられる場合、次いで免疫刺激効果は、い
くらか減じられる。別の実施例において、全ての位置がランダム化された２４ヌ
クレオチド長核酸は、適度な免疫刺激効果だけを有する（ＯＤＮ２１８２（配列
番号４３２））。同様に、他のヌクレオチド組成物を有する２４ヌクレオチド長
核酸は、そのＴ含量に依存して可変の免疫刺激効果を有する（ＯＤＮ２１８８（
配列番号９０５）、２１８９（配列番号９０６）、２１９０（配列番号９０７、
２１９１ （配列番号９０８）、２１９３（配列番号９１０）、２１８３（配列
番号４３３）、および２１７８（配列番号４２８））。ＴＧＴモチーフを有する
ＯＤＮ２１９０は、ＴＧＧモチーフを有するＯＤＮ２２０２よりも免疫刺激であ
る。従って、いくつかの実施形態において、ＴＧＴモチーフは、好ましい。さら
に他の実施形態において、ＴＧモチーフの数は、ＴＧモチーフの数が免疫刺激に
ついて増加を導く点において、その増加が重要である。いくつかの好ましいＴＧ
核酸は、少なくとも３つのＴＧモチーフを含む。
【０１０９】 ＣｐＧ核酸の例は、表Ａに列挙されたもの（配列番号１、３、４、１４〜１６
、１８〜２４、２８、２９、３３〜４６、４９、５０、５２〜５６、５８、６４
〜６７、６９、７１、７２、７６〜８７、９０、９１、９３、９４、９６、９８
、１０２〜１２４、１２６〜１２８、１３１〜１３３、１３６〜１４１、１４６
〜１５０、１５２〜１５３、１５５〜１７１、１７３〜１７８、１８０〜１８６
、１８８〜１９８、２０１、２０３〜２１４、２１６〜２２０、２２３、２２４
、２２７〜２４０、２４２〜２５６、２５８、２６０〜２６５、２７０〜２７３
、２７５、２７７〜２８１、２８６〜２８７、２９２、２９５〜２９６、３００
、３０２、３０５〜３０７、３０９〜３１２、３１４〜３１７、３２０〜３２７
、３２９、３３５、３３７〜３４１、３４３〜３５２、３５４、３５７、３６１
〜３６５、３６７〜３６９、３７３〜３７６、３７８〜３８５、３８８〜３９２
、３９４、３９５、３９９、４０１〜４０４、４０６〜４２６、４２９〜４３３
、４３４〜４３７、４３９、４４１〜４４３、４４５、４４７、４４８、４５０
、４５３〜４５６、４６０〜４６４、４６６〜４６９、４７２〜４７５、４７７
、４７８、４８０、４８３〜４８５、４８８、４８９、４９２、４９３、４９５
〜５０２、５０４〜５０５、５０７〜５０９、５１１、５１３〜５２９、５３２
〜５４１、５４３〜５５５、５６４〜５６６、５６８〜５７６、５７８、５８０
、５９９、６０１〜６０５、６０７〜６１１、６１３〜６１５、６１７、６１９
〜６２２、６２５〜６４６、６４８〜６５０、６５３〜６６４、６６６〜６９７
、６９９〜７０６、７０８、７０９、７１１〜７１６、７１８〜７３２、７３６
、７３７、７３９〜７４４、７４６、７４７、７４９〜７６１、７６３、７６６
〜７６７、７６９、７７２〜７７９、７８１〜７８３、７８５〜７８６、７９０
０７９２、７９８〜７９９、８０４〜８０８、８１０、８１５、８１７、８１８
、８２０〜８３２、８３５〜８４６、８４９〜８５０、８５５〜８５９、８６２
、８６５、８７２、８７４〜８７７、８７９〜８８１、８８３〜８８５、８８８
〜９０４、および９０９〜９１３など）を含むが、それらに限定されない。
【０１１０】 本発明のいくつかの実施形態において、免疫刺激核酸は、ＣｐＧジヌクレオチ
ドを含み、そして他の実施形態において、免疫刺激核酸は、ＣｐＧジヌクレオチ
ドがない。ＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化され得るか、または非メチル化さ
れ得る。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸は、非メ
チル化シトシン−グアニンジヌクレオチド配列を含む核酸分子（すなわち、「Ｃ
ｐＧ ＤＮＡ」または非メチル化５’シトシンに続いて３’グアノシンを含み、
そしてこれらがリン酸結合によって連結されたＤＮＡ）であり、そして免疫系を
活性化する。少なくとも１つのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸は、メ
チル化シトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、メチル化された５’
シトシンに続いて３’グアノシン、そしてこれらがリン酸結合により連結された
）を含む核酸分子である。
【０１１１】 ＣｐＧ核酸のないＴリッチ核酸の例は、表Ａに列挙されたもの（配列番号５９
〜６３、７３〜７５、１４２、２１５、２２６、２４１、２６７〜２６９、２８
２、３０１、３０４、３３０、３４２、３５８、３７０〜３７２、３９３、４３
３、４７１、４７９、４８６、４９１、４９７、５０３、５５６〜５５８、５６
７、６９４、７９３〜７９４、７９７、８３３、８５２、８６１、８６７、８６
８、８８２、８８６、９０５、９０７、９０８、および９１０〜９１３など）を
含むが、これらに限定されない。ＣｐＧ核酸を含むＴリッチ核酸の例は、表Ａに
列挙されたもの（配列番号６４、９８、１１２、１４６、１８５、２０４、２０
８、２１４、２２４、２３３、２４４、２４６、２４７、２５８、２６２、２６
３、２６５、２７０〜２７３、３００、３０５、３１６、３１７、３４３、３４
４、３５０、３５２、３５４、３７４、３７６、３９２、４０７、４１１〜４１
３、４２９〜４３２、４３４、４３５、４４３、４７４、４７５、４９８〜５０
１、５１８、６８７、６９２、６９３、８０４、８６２、８８３、８８４、８８
８、８９０、および８９１など）を含むが、これらに限定されない。
【０１１２】 免疫刺激核酸は、二本鎖または一本鎖であり得る。一般的に、二本鎖分子は、
インビボにおいてより安定であるが、一方、一本鎖分子は、増強された免疫活性
を有する。従って、本発明のいくつかの局面において、核酸は、一本鎖であるこ
とが好ましく、そして他の局面において核酸は、二本鎖であることが好ましい。
【０１１３】 用語Ｔリッチ核酸およびＴＧ核酸は、本明細書中で使用される場合、他に示さ
ない限り、免疫刺激性Ｔリッチ核酸および免疫刺激性ＴＧ核酸をいう。本発明の
Ｔリッチ核酸配列は、上記に広く記載された配列および表Ａに示される核酸であ
る。この核酸は、少なくとも１つのポリＴモチーフを有し、そして／または２５
％Ｔもしくは好ましくは３５％ヌクレオチド残基より多い組成物を有する。Ｃリ
ッチ核酸は、少なくとも１つのポリＣ領域および好ましくは少なくとも２つのポ
リＣ領域を有する核酸である。本発明のＴＧ核酸は、上記に広く記載される核酸
および表Ａに示される少なくとも１つのＴＧモチーフを有する特異的核酸である
。本発明の核酸はまた、ポリＧモチーフを含み得るが、必要はない。ポリＧを含
む核酸はまた、免疫刺激である。種々の参考文献（ＰｉｓｅｔｓｋｙおよびＲｅ
ｉｃｈ、１９９３ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、１８：２１７−２２１
；ＫｒｉｅｇｅｒおよびＨｅｒｚ、１９９４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．、６３：６０１−６３７；Ｍａｃａｙａら、１９９３、ＰＮＡＳ、９０：３７
４５−３７４９；Ｗｙａｔｔら、１９９４、ＰＮＡＳ、９１：１３５６−１３６
０；ＲａｎｄｏおよびＨｏｇａｎ、１９９８、Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎ
ｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｒｉｅｇお
よびＳｔｅｉｎ編、ｐ．３３５−３５２；およびＫｉｍｕｒａら、１９９４、Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６、９９１−９９４を含む）はまた、ポリＧ核酸の免疫
刺激特性を記載している。
【０１１４】 ポリＧ核酸は、好ましくは以下の式を有する核酸である： ５’Ｘ1Ｘ2ＧＧＧＸ3Ｘ4３’ ここでＸ1、Ｘ2、Ｘ3、およびＸ4はヌクレオチドである。好ましい実施形態にお
いて、Ｘ3およびＸ4の少なくとも１つがＧである。他の実施形態において、Ｘ3
およびＸ4の両方がＧである。さらに他の実施形態において、好ましい式は、５
’ＧＧＧＮＧＧＧ３’、または５’ＧＧＧＮＧＧＧＮＧＧＧ３’であり、ここで
Ｎは、０と２０の間のヌクレオチドを示す。他の実施形態において、ポリＧ核酸
は、非メチル化ＣＧジヌクレオチドがない（例えば配列番号５、６、７３、２１
５、２６７〜２６９、２７６、２８２、２８８、２９７〜２９９、３５５、３５
９、３８６、３８７、４４４、４７６、５３１、５５７〜５５９、７３３、７６
８、７９５、７９６、９１４〜９２５、９２８〜９３１、９３３〜９３６、およ
び９３８として以下に列挙される核酸など）。他の実施形態において、ポリＧ核
酸は、少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチドを含む（例えば配列番号
６７、８０〜８２、１４１、１４７、１４８、１７３、１７８、１８３、 １８
５、２１４、２２４、２６４、２６５、３１５、３２９、４３４、４３５、４７
５、５１９、５２１〜５２４、５２６、５２７、５３５、５５４、５６５、６０
９、６２８、６６０、６６１、６６２、７２５、７６７、８２５、８５６、８５
７、８７６、８９２、９０９、９２６、９２７、９３２、および９３７として上
記に列挙される核酸など）。
【０１１５】 用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、複数のヌクレオチド（すなわ
ち、リン酸基および交換可能な有機塩基に連結された糖（例えば、リボースまた
はデオキシリボース）を含む分子であり、これは、置換されたピリミジン（例え
ば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換されたプ
リン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである）を意
味するために交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、この用語は
、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドをいう。この
用語はまた、ポリヌクレオシド（すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸を除い
たもの）および任意の他の有機塩基を含有するポリマーを含む。核酸分子は、存
在する核酸供給源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得られ得るが、合成（
例えば、オリゴヌクレオチド合成により生成される）が好ましい。
【０１１６】 用語核酸およびオリゴヌクレオチドはまた、置換または改変（塩基および／ま
たは糖におけるなど）を有する核酸またはオリゴヌクレオチドを包含する。例え
ば、これらは、共有結合的に３’位でのヒドロキシ基以外および５’位でのリン
酸基以外の低分子量の有機基に結合された骨格糖を有する核酸を含む。従って、
改変された核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含み得る。さらに、改変
された核酸は、リボースの代わりにアラビノースなどの糖を含み得る。従って、
この核酸は、骨格組成物において異質であり得、それによってペプチド−核酸（
これは、核酸ベースでアミノ酸骨格を有する）などの共に連結されるポリマーユ
ニットの任意の可能な組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、核
酸は、骨格組成物において均質である。核酸はまた、Ｃ−５プロピン（ｐｒｏｐ
ｙｎｅ）改変置換された塩基などのプリンおよびピリミジンを含む（Ｗａｇｎｅ
ｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４０〜８４４、１
９９６）。プリンおよびピリミジンとして、アデニン、シトシン、グアニン、チ
ミジン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリ
ン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然に存在するお
よび存在しない核塩基、置換されたおよび置換されていない芳香族分子が挙げら
れるが、これらに限定されない。他のそのような改変体は、当業者に周知である
。
【０１１７】 本発明における使用のために、本発明の核酸（Ｓキラル核酸およびＲキラル核
酸の両方）が、当該分野で周知の多数の手順のいずれかを用いて新規に合成され
得る。例えば、ｂ−シアノエチルホスホルアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ
．Ｌ．，およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５
９，１９８１）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇら、Ｔｅｔ．
Ｌｅｔ．２７：４０５１−４０５４，１９８６；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４０７，１９８６，；Ｇａｒｅｇｇら
、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５−４０５８，１９８６，Ｇａｆｆｎｅｙら、
Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９−２６２２，１９８８）。これらのケミストリ
ーは、市販されている種々の自動核酸合成機によって行われ得る。これらの核酸
は、合成核酸といわれる。あるいは、Ｔ−リッチおよび／またはＴＧジヌクレオ
チドは、プラスミド中で大規模で産生され得（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｔ．ら、「Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）、そして小さい部分に分けられ
るか、または全体が投与される。核酸は、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、また
はエンドヌクレアーゼを使用する技術のような、公知の技術を使用して、既存の
核酸配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から調製され得る。この様式におい
て調製される核酸は、単離された核酸といわれる。単離された核酸とは、通常、
その核酸が天然に通常結合する成分から分離された核酸をいう。一例として、単
利された核酸は、細胞から、核から、ミトコンドリアから、または染色質から分
離される核酸であり得る。用語Ｐｙ−リッチ核酸およびＴＧ核酸は、合成のＰｙ
−リッチ核酸およびＴＧ核酸、ならびに単離されたＰｙ−リッチ核酸およびＴＧ
核酸の両方を含む。
【０１１８】 インビボでの使用のために、Ｐｙ−リッチおよびＴＧ核酸は、必要に応じて、
分解に対して比較的耐性である（例えば、安定化される）。「安定化された核酸
分子」は、インビボでの分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレ
アーゼを介する分解）に比較的耐性である核酸分子を意味する。安定化は、長さ
または二次構造の関数である。１０〜数百ｋｂ長のメチル化されていない核酸は
、インビボでの分解に比較的耐性である。より短い核酸については、二次構造が
これらの効果を安定化および増加させ得る。例えば、核酸の３’末端が上流の領
域に対して自己相補性を有するならば、その結果、それは再折り畳みされ得、そ
して一種のステムループ構造を形成し、次いで核酸は安定となり、従ってより活
性を示す。
【０１１９】 あるいは、核酸の安定化は、リン酸骨格の修飾を介して達成され得る。本発明
の好ましい安定化核酸は、修飾された骨格を有する。核酸骨格の修飾は、インビ
ボで投与された場合に、Ｐｙ−リッチおよびＴＧ核酸の増強された活性を提供す
ることが実証された。これらの安定化された構造は、本発明のＰｙ−リッチおよ
びＴＧ分子が少なくとも部分的に修飾された骨格を有するので、好ましい。ホス
ホロチオエート結合を有するＰｙ−リッチおよびＴＧ構築物は、好ましくは、最
大活性を提供し、そして細胞内エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに
よる分解から核酸を保護する。他の修飾された核酸としては、ホスホジエステル
修飾された核酸、ホスホジエステルの組合せ、およびホスホロチオエート核酸、
メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−
エトキシおよびそれらの組合せが挙げられる。これらの組合せの各々および免疫
細胞上のそれらの特定の効果は、１９９５年２月７日および１９９７年１０月３
０日にそれぞれ出願された、米国特許出願番号０８／３８６，０６３および０８
／９６０，７７４に対する優先権を主張する、ＰＣＴ公開特許出願ＰＣＴ／ＵＳ
９５／０１５７０（ＷＯ９６／０２５５５）およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１９７９
１（ＷＯ９８／１８８１０）においてＣｐＧ核酸に関してより詳細に議論され、
これらの全体の内容は本明細書によって参考として援用される。これらの修飾し
た核酸は、増強されたヌクレアーゼ耐性、増加された細胞の取り込み、増加され
たタンパク質結合、および／または変化した細胞内局在に起因して、より刺激活
性を示し得ると考えられる。
【０１２０】 本発明の組成物は、必要に応じて、キメラオリゴヌクレオチドであり得る。キ
メラオリゴヌクレオチドは、以下の式を有するオリゴヌクレオチドである：５’
Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2３’。Ｙ1およびＹ2は、１〜１０の間のヌクレオチドを有する核
酸分子である。Ｙ1およびＹ2は、それぞれ、少なくとも１つの修飾されたヌクレ
オチド間結合を含む。キメラオリゴヌクレオチドの少なくとも２つのヌクレオチ
ドは、骨格修飾を含むので、これらの核酸は、「安定化免疫刺激核酸」の１つの
型の例である。
【０１２１】 キメラオリゴヌクレオチドに関して、Ｙ1およびＹ2は、お互いに独立している
と考えられる。これは、Ｙ1およびＹ2の各々は、同じ分子内で、お互いと異なる
配列および異なる骨格結合を有するかもしれないし、または有さないかもしれな
いことを意味する。配列は変化するが、いくらかの場合、Ｙ1およびＹ2は、ポリ
−Ｇ配列を有する。ポリ−Ｇ配列とは、１つの列において少なくとも３つのＧを
いう。他の実施形態において、ポリ−Ｇ配列とは、１つの列において少なくとも
４、５、６、７、または８つのＧをいう。他の実施形態において、Ｙ1およびＹ2 は、ＴＣＧＴＣＧ、ＴＣＧＴＣＧＴ、またはＴＣＧＴＣＧＴＴであり得る（配列
番号：１１４５）。Ｙ1およびＹ2はまた、ポリ−Ｃ、ポリ−Ｔ、またはポリ−Ａ
配列を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｙ1および／またはＹ2は、３と
８の間のヌクレオチドを有する。
【０１２２】 Ｎ1およびＮ2は、Ｎ1ＺＮ2が、全体で少なくとも６ヌクレオチドを有する限り
、０と５の間のヌクレオチドを有する核酸分子である。Ｎ1ＺＮ2のヌクレオチド
は、リン酸ジエステル骨格を有し、そして修飾された骨格を有する核酸を含まな
い。
【０１２３】 Ｚは、免疫刺激核酸モチーフであるが、ＣＧを含まない。例えば、Ｚは、Ｔリ
ッチ（Ｔ−ｒｉｃｈ）配列の核酸であり得、例えば、ＴＴＴＴモチーフまたは少
なくとも配列の塩基の５０％がＴである配列を含み、あるいは、ＺはＴＧ配列で
あり得る。
【０１２４】 式Ｙ1Ｎ1ＺＮ2Ｙ2の中心のヌクレオチド（Ｎ1ＺＮ2）は、リン酸ジエステルヌ
クレオチド間結合を有し、そしてＹ1およびＹ2は、少なくとも１つの修飾された
ヌクレオチド間結合を有するが、１以上の修飾されたヌクレオチド間結合を有し
得、または、なお全ての修飾されたヌクレオチド間結合を有し得る。好ましい実
施形態において、Ｙ1および／またはＹ2は、少なくとも２つの修飾されたヌクレ
オチド間結合を有するか、または２と５の間の修飾されたヌクレオチド間結合を
有するか、あるいはＹ1は、２つの修飾されたヌクレオチド間結合を有し、そし
てＹ2は、５つの修飾されたヌクレオチド間結合を有するか、もしくは、Ｙ1は、
５つの修飾されたヌクレオチド間結合を有し、そしてＹ2は、２つの修飾された
ヌクレオチド間結合を有する。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレ
オチド間結合は、ホスホロチオエート修飾結合、ホスホロジチオエート修飾結合
、またはｐ−エトキシ修飾結合である。
【０１２５】 ホスホロチオエートのような改変された骨格は、ホスホルアミデートまたはＨ
−ホスホネートケミストリーのいずれかを利用する自動化技術を用いて合成され
得る。アリールホスホネートおよびアルキルホスホネートは、例えば、米国特許
第４，４６９，８６３号に記載されるように作製され得；そしてアルキルホスホ
トリエステル（ここで荷電した酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号お
よび欧州特許第０９２，５７４号に記載されるようにアルキル化される）は、市
販の試薬を使用して、自動化固相合成によって調製され得る。他のＤＮＡ骨格修
飾体および置換体の生成方法が記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰ
ｅｙｍａｎ，Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４，１９９０；Ｇｏｏｄｃｈ
ｉｌｄ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５，１９９０）
。
【０１２６】 他の安定化された核酸としては、非イオン性ＤＮＡアナログ（例えば、アルキ
ル−ホスフェートおよびアリール−ホスフェート（ここで、荷電したホスホネー
ト酸素がアルキル基またはアリール基によって置換されている））、ホスホジエ
ステルおよびアルキルホスホトリエステル（ここで、荷電した酸素部分がアルキ
ル化されている）が挙げられる。いずれかまたは両方の末端でジオール（例えば
、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール）を含む核酸はま
た、ヌクレアーゼ分解に実質的に耐性であることが示された。 Ｐｙ−リッチおよびＴＧ核酸が、核酸ベクターにコードされている抗原と組み合
わせて投与される場合、Ｐｙ−リッチおよびＴＧ核酸骨格は、ホスホジエステル
およびホスホロチオエート（または他のリン酸修飾）のキメラ的な組合せである
ことが好ましい。細胞は、完全なホスホロチオエート核酸の存在下で、プラスミ
ドベクターを取り込むという問題を有し得る。従って、ベクターおよび核酸の両
方が被験体に投与される場合、核酸がキメラ骨格を有するか、またはホスホロチ
オエート骨格を有することが好ましいが、プラスミドが細胞に直接的にそれを送
達するビヒクルと結合し、従って、細胞の取り込みの必要を避けることが好まし
い。このようなビヒクルは当業者に公知であり、そして、例えば、リポソームお
よび遺伝子銃を含む。
【０１２７】 本明細書中に記載される核酸および種々のコントロール核酸を、以下の表Ａに
示す。
【０１２８】
【表１】 マウスにおけるＣｐＧ効果は十分に特徴付けられているが、ヒトの系に関する
情報は限定される。マウス系において強力な刺激活性を有するＣｐＧホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドは、ヒトおよび他の非げっ歯類の免疫細胞において
低い活性を示す。例として、強力なヒトＣｐＧモチーフの発生、ならびにその効
果およびヒト初代Ｂ細胞上の作用の機構の特徴づけが記載される。このＣｐＧモ
チーフを含むＤＮＡは、一次ヒトＢ細胞を強力に刺激し、増殖、ＩＬ−６の産生
、ならびにＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ５４およびＭＨＣ ＩＩの増加したレベル
を発現する。これは、転写因子ＮＦκＢおよびＡＰ−１のＤＮＡ結合活性、なら
びにストレス活性化プロテインキナーゼＪＮＫおよびｐ３８、ならびに転写因子
ＡＴＦ−２のリン酸化を増大した。ＣｐＧ ＤＮＡによって活性化されたＢ細胞
シグナル伝達経路は、Ｂ細胞レセプターによって活性化されたシグナル伝達経路
とは異なり、これはＥＲＫ、およびＪＮＫの異なるアイソフォームを活性化した
が、ｐ３８およびＡＴＦ−２は活性化しなかった。一般に、ＣｐＧ ＤＮＡで開
始されたシグナル伝達についてのデータは、マウスにおいて得られたデータと一
致する（Ｈａｃｋｅｒ Ｈ．ら，１９９８．Ｅｍｂｏ Ｊ １７：６２３０，Ｙ
ｉ Ａ．Ｋ．，およびＫｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．１９９８．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １
６１：４４９３）。
【０１２９】 好ましい非げっ歯類モチーフは、
【０１３０】
【化１】 である。最も強力な８マーのＣｐＧモチーフ
【０１３１】
【化２】 内の塩基の交換は、このオリゴヌクレオチドの活性を減少した。このモチーフの
５’および３’位のチミジンは、中間位置のチミジンよりも重要である。中間位
置のアデニンまたはグアノシンは、活性の減少を生じる。
【０１３２】 本発明者らの研究は、リン酸ジエステルオリゴヌクレオチド（２０８０）内の
１つのヒトＣｐＧモチーフが、最大限の効果を生じるために十分であり、そして
さらなるＣｐＧモチーフ（２０５９）は活性をさらに増大しないことを実証する
ことが注目される。２つのＣｐＧジヌクレオチドを含む８マーモチーフ
【０１３３】
【化３】 （２０８０）を有するオリゴヌクレオチドは、この研究における最も高い活性を
示した。２つのＣｐＧジヌクレオチドに隣接する塩基（５’位、中間位置、３’
位）の置換は、この配列の活性を減少した。８マーＣｐＧモチーフ内の両方のＣ
ｐＧジヌクレオチドは、最適な活性のために必要である（２１０８，２１０６）
。ＣｐＧジヌクレオチド（２０９５）のシチジンのメチル化は２０８０の活性を
消滅させたが、無関係のシチジン（２０９４）のメチル化は、消滅させない。２
０５９を生じる２０８０の配列への２つのＣｐＧモチーフの追加は、リン酸ジエ
ステルオリゴヌクレオチドの活性をさらには増加させなかった。ホスホロチオエ
ート骨格（２１１６）を有する２０８０の配列は、低い活性を示し、これはさら
なるＣｐＧモチーフが、強力なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのために
好ましいことを示唆する。
【０１３４】 本発明に従って、免疫刺激核酸が、インビトロでヒト細胞（例えば、ＮＫ細胞
、Ｂ細胞、およびＤＣ）に対する劇的な免疫刺激効果を有することが発見された
。本明細書中で使用されるインビトロアッセイが、非げっ歯類脊椎動物における
ワクチンアジュバントとしてのインビボ有効性を予測することを実証し（実施例
１２）、このことは免疫刺激核酸が、ヒトのワクチン接種、癌の免疫療法、喘息
の免疫療法、免疫機能の全体的増大、放射線または化学療法の後の造血回復の増
大、および他の免疫調節適用のための有効な治療剤であることを示唆する。
【０１３５】 従って、この免疫刺激核酸は、本発明のいくつかの局面において、感染性生物
体への感染または癌（ここで、特定の癌抗原が同定されている）、あるいはアレ
ルギーまたは喘息（ここで、このアレルゲンまたは喘息の素因が既知である）の
発生の危険性のある被験体の処置のための予防的ワクチンとして有用である。こ
の免疫刺激核酸はまた、感染、アレルギーまたは癌に対するより短期の保護のた
めに抗原またはアレルゲンなしで与えられ得、そしてこの場合、反復用量がより
長期の保護を可能にする。本明細書中で用いられる危険性を有する被験体は、感
染を引き起こす病原、または癌またはアレルゲンへの暴露のいずれかの危険性を
有する被験体であるか、または癌の発生の危険性を有する被験体である。例えば
、危険性を有する被験体は、特定の型の病原菌が見出される領域への旅行を計画
している被験体であり得、あるいは生活様式または医療手順を通して感染性生物
体を含み得る体液に暴露されたかまたはこの生物体に直接暴露された被験体、あ
るいはなお感染性生物体またはアレルゲンが同定された領域に住む任意の被験体
であり得る。感染の発生の危険性を有する被験体はまた、医療機関が特定の感染
性生物体抗原でのワクチン接種を推奨している一般的な集団を含む。この抗原が
アレルゲンであり、そしてこの被験体がこの特定の抗原に対するアレルギー応答
を生じ、そしてこの被験体がこの抗原に暴露され得る場合（すなわち、花粉の季
節の間に）、この被験体は抗原への暴露の危険性を有する。喘息へのアレルギー
を生じる危険性を有する被験体は、アレルギーまたは喘息を有すると同定された
が、免疫刺激核酸処置の間に活性な疾患を有さない被験体、ならびに遺伝的また
は環境的要因の理由でこれらの疾患を発生する危険性を有すると考えられる被験
体を含む。
【０１３６】 癌の発生の危険性を有する被験体は、癌の発生の高い確率を有する被験体であ
る。これらの被験体は、例えば、遺伝的異常性（この存在は、癌の発生のより高
い可能性に対して相関関係を有することが実証されている）を有する被験体、お
よび癌を引き起こす因子（例えば、タバコ、アスベスト、または他の化学的毒素
）に暴露された被検体、あるいは以前に癌を処置された被験体および明らかな緩
解状態にある被験体が含まれる。癌の発生の危険性を有する被験体が、この被験
体に発生の危険性がある癌の型に特異的な抗原および免疫刺激核酸を用いて処置
された場合、この被験体は、それらが発生した場合に癌細胞を殺傷し得る。腫瘍
が被験体内で形成し始める場合、この被験体は、腫瘍抗原に対して特異的な免疫
応答を生じる。
【０１３７】 予防的処置のための免疫刺激核酸の使用に加えて、本発明はまた、感染、アレ
ルギー、喘息または癌を有する被験体の処置のための免疫刺激核酸の使用を含む
。
【０１３８】 感染を有する被験体は、感染性の病原に暴露され、そして身体内に急性または
慢性の検出可能なレベルの病原を有する被験体である。免疫刺激核酸は、抗原特
異的な全身性または粘膜の免疫応答（これは、感染性病原のレベルを減少し得る
か、または感染性病原を全滅させ得る）を備えるために抗原を用いて使用され得
る。本明細書中で使用される場合、感染性疾患は、身体中の外来性微生物の存在
に起因する疾患である。有効なワクチンストラテジーおよび身体の粘膜表面（こ
れは、病原体侵入の主な部位である）を保護するための処置を開発することが特
に重要である。
【０１３９】 アレルギーを有する被験体は、アレルゲンに対する応答におけるアレルギー反
応を有するか、またはアレルギー反応を生じる危険性を有する被験体である。ア
レルギーは、物質（アレルゲン）に対する後天性過敏症をいう。アレルギー状態
としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：湿疹、アレルギー性の鼻
炎またはコリーザ、枯草熱、結膜炎、気管支ぜん息、じんま疹（ｕｒｔｉｃａｒ
ｉａ、ｈｉｖｅｓ）および食品アレルギー、ならびに他のアトピー状態。
【０１４０】 現在、アレルギー疾患は、一般に、抗原の低用量注入、続いて抗原の増加した
用量の注入によって処置される。この手順は、さらなるアレルギー反応を防止す
るために、アレルゲンへの寛容化を誘導すると考えられる。しかし、これらの方
法は、有効であるためには数年を要し得、そしてアナフィラキシーショックのよ
うな副作用の危険性が付随する。本発明の方法は、これらの問題を回避する。
【０１４１】 アレルギーは、一般に無害なアレルゲンに対するＩｇＥ抗体の産生によって引
き起こされる。免疫刺激核酸の全身性または粘膜性の投与によって誘導されるサ
イトカインは、主にＴｈ１と呼ばれるクラス（例は、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−
γである）であり、そしてこれらは体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方
を誘導する。Ｔｈ１応答と関連する抗体の型は、一般により保護性である。なぜ
なら、これらは高い中和可能性およびオプソニン作用可能性を有するためである
。免疫応答の他の主要な型（これは、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０サイ
トカインの産生に関連する）は、Ｔｈ２免疫応答と呼ばれる。Ｔｈ２応答は主に
抗体に関与し、そしてこれらは感染に対して低い保護効果を有し、そしていくつ
かのＴｈ２アイソタイプ（例えば、ＩｇＥ）は、アレルギーに関連する。一般に
、アレルギー性疾患はＴｈ２型の免疫応答によって媒介され、一方、Ｔｈ１応答
は感染に対して最良の保護を提供するが、過剰なＴｈ１応答は自己免疫疾患を付
随することが明らかである。被験体における免疫応答をＴｈ２（これは、ＩｇＥ
抗体およびアレルギーの産生に関連する）からＴｈ１応答（これは、アレルギー
反応に対して保護性である）にシフトする免疫刺激核酸の能力に基づいて、免疫
刺激核酸の免疫応答を誘導するために効果的な用量が被験体に投与され、アレル
ギーを処置または予防し得る。
【０１４２】 従って、免疫刺激核酸は、ぜん息のようなアレルギー性状態および非アレルギ
ー性状態の処置における有意な治療有用性を有する。Ｔｈ２サイトカイン（特に
、ＩＬ−４およびＩＬ−５）は、ぜん息の被験体の気道において増大される。こ
れらのサイトカインは、ぜん息の炎症性応答の重要な局面（ＩｇＥ同位体の切り
替え（ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）、好酸球の走化性および活性化、ならびに肥満細胞
の増殖を含む）を促進する。Ｔｈ１サイトカイン（特に、ＩＦＮ−γおよびＩＬ
−１２）は、Ｔｈ２クローンの形成およびＴｈ２サイトカインの保護を抑制し得
る。ぜん息は、炎症、気道の狭小化、および吸入した因子に対する気道の増加し
た反応性によって特徴付けられる呼吸系の障害をいう。ぜん息は、頻繁にアトピ
ー性またはアレルギー性の症状と関連するが、これらだけに関連するわけではな
い。
【０１４３】 癌を有する被験体は、検出可能な癌性細胞を有する被験体である。この癌は、
悪性または非悪性の癌であり得る。癌または腫瘍としては、以下が挙げられるが
これらに限定されない：胆管癌；脳癌；乳癌；頸部癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内
膜癌；食道癌；胃癌；上皮内新生物；リンパ腫；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞
および非小細胞）；黒色腫；神経芽細胞腫；口の癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌
；直腸癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；および腎癌、ならびに他の癌およ
び肉腫。１つの実施形態において、この癌は、毛様細胞白血病、慢性骨髄性白血
病、皮膚のＴ細胞白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、扁平上
皮癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱細胞癌、または結腸癌である。
【０１４４】 本発明に従う被験体は、非げっ歯類の被験体である。非げっ歯類の被験体は、
ヒトまたは脊椎動物（イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ
、霊長類（例えば、サル）、および魚（水産養殖種）（例えば、サケ）が挙げら
れるがこれらに限定されないが、ラットおよびマウスのようなげっ歯類は特に除
く）を意味すべきである。
【０１４５】 従って、本発明はまた、非ヒト被験体における癌および腫瘍を処置するために
使用され得る。癌は、家庭動物（すなわち、ネコおよびイヌ）における主な死因
の一つである。癌は通常、家で飼うペットの場合、家族に組み入れられたより高
齢の動物を襲う。１０歳よりも高齢のイヌの４５％は、おそらくこの疾患で倒れ
る。最も一般的な処置の選択肢としては、手術、化学療法および放射線治療が挙
げられる。ある程度の成功を伴って使用される他の処置様式は、レーザー治療、
寒冷療法、温熱療法および免疫療法である。処置の選択は、癌の型および播種の
程度に依存する。悪性腫瘍が身体の個別の領域に限定されない限り、正常細胞に
影響することなく悪性組織のみを除去することは困難である。
【０１４６】 イヌおよびネコにおいて通常診断される悪性障害としては、以下が挙げられる
がこれらに限定されない：リンパ肉腫、骨肉腫、乳房の腫瘍、肥満細胞腫、脳腫
瘍、黒色腫、腺扁平上皮癌、肺カルチノイド、気管支腺腫瘍、細気管支癌、線維
腫、粘液軟骨腫、肺癌、神経肉腫、骨腫、乳頭腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉
腫、ウィルムス腫瘍、バーキットリンパ腫、小膠細胞腫、神経芽細胞腫、骨巨細
胞腫、口の新形成、線維肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫。イヌにおける他の新形
成としては、以下が挙げられる：生殖器の扁平上皮癌、伝播性側面（ｔｒａｎｓ
ｍｉｓｓａｂｌｅ ｖｅｎｅｒａｌ）腫瘍、精巣腫瘍、セミノーマ、セルトーリ
細胞腫、血管周囲細胞腫、組織球腫、緑色腫（顆粒球性肉腫）、角膜乳頭腫、角
膜扁平上皮癌、血管肉腫、胸膜中皮腫、基底細胞腫瘍、胸腺腫、胃の腫瘍、副腎
癌、口の乳頭腫症、血管内皮腫および嚢胞腺腫。ネコにおいて診断されるさらな
る悪性疾患としては、以下が挙げられる：濾胞性リンパ腫、腸リンパ肉腫、線維
肉腫および肺扁平上皮癌。クロアシイタチ（ますます人気のある家で飼うペット
）は、インスリノーマ、リンパ腫、肉腫、神経腫、ランゲルハンス島細胞腫瘍、
胃のＭＡＬＴリンパ腫および胃の腺癌を発生することが公知である。
【０１４７】 農業的家畜に影響する新形成としては、以下が挙げられる：白血病、血管周囲
細胞腫およびウシの眼の新形成（ウシ）；包皮線維肉腫、潰瘍性扁平上皮癌、包
皮癌、結合組織新形成および肥満細胞腫（ウマ）；肝細胞癌（ブタ）；リンパ腫
および肺腺腫症（ヒツジ）；肺肉腫、リンパ腫、ラウス肉腫、細網内皮症、線維
肉腫、腎芽細胞腫、Ｂ細胞リンパ腫およびリンパ系白血症（鳥類種）；網膜芽細
胞腫、肝性新形成、リンパ肉腫（リンパ芽球性リンパ腫）、プラズマ細胞様（ｐ
ｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ）白血病および浮き袋肉腫（魚）、乾酪性リンパ節炎（
ＣＬＡ）：細菌コリネバクテリウム仮性結核によって引き起こされるヒツジおよ
びヤギの慢性、感染性、伝染性の疾患、ならびに肺線腫症によって引き起こされ
るヒツジの伝染性肺腫瘍。
【０１４８】 この被験体は、抗原に暴露される。本明細書中で使用される場合、暴露される
という用語は、インビボでの、被験体を抗原に接触させる能動的工程か、または
被験体の抗原への受動的暴露のいずれかをいう。被験体の抗原への能動的暴露の
ための方法は、当該分野で周知である。一般に、抗原は、任意の手段（例えば、
静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、経皮投与、粘膜投与、鼻腔内投与、気管内
投与、または皮下投与）によって直接被験体に投与される。抗原は、全身的また
は局所的に投与され得る。抗原および免疫刺激核酸を投与するための方法は、以
下により詳細に記載される。身体における免疫細胞への暴露について抗原が利用
可能になった場合に、被験体は抗原に受動的に暴露される。被験体は、例えば、
外来病原の身体への侵入によってか、または表面に外来抗原を発現する腫瘍細胞
の発生によって、抗原に受動的に暴露され得る。
【０１４９】 被験体が抗原に受動的に暴露される方法は、免疫刺激核酸の投与のタイミング
に特に依存し得る。例えば、癌または感染性疾患、あるいはアレルギー応答また
はぜん息応答の発生の危険性を有する被験体において、この被験体は、この危険
性が最大であるときに（すなわち、アレルギーの季節の間または癌を引き起こす
因子への暴露の後に）、規則的な基準で免疫刺激核酸を投与され得る。さらに、
この免疫刺激核酸は、旅行者に、彼らが病原菌への暴露の危険性を有する外国へ
旅行する前に投与され得る。同様に、この免疫刺激核酸は、細菌戦に暴露される
危険性を有する兵士または一般人に投与され得、被験体がこれらに暴露される場
合に、この抗原に対する全身性または粘膜の免疫応答を誘導する。
【０１５０】 本明細書中で使用される場合、抗原は、免疫応答を誘起し得る分子である。抗
原としては、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類
、多糖類結合体、多糖類および他の分子のペプチド模倣物および非ペプチド模倣
物、小分子、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルスおよびウイルス抽出物、ならび
に多細胞（ｍｕｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ）生物（例えば、寄生虫）ならびにアレル
ゲンが挙げられるがこれらに限定されない。用語アレルゲンは、宿主免疫系によ
り外来物として認識される任意の型の分子を広範囲に含む。抗原としては、癌抗
原、微生物抗原およびアレルゲンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５１】 本明細書中で使用される場合、癌抗原は、腫瘍細胞表面および癌細胞表面と結
合する、ペプチドまたはタンパク質のような化合物であり、そしてこれは、ＭＨ
Ｃ分子の関係で抗原を提示する細胞の表面上に発現される場合、免疫応答を誘起
し得る。癌抗原は、たとえば、Ｃｏｈｅｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ、５４：１０５５に記載されるように癌細胞の粗抽出物を調製するこ
とによるか、抗原を部分的に精製することによるか、組換え技術によるか、また
は公知の抗原の新規合成のいずれかにより癌細胞から調製され得る。癌抗原とし
ては、組換え発現された抗原、これらの免疫原性部分、または腫瘍全体もしくは
癌全体が挙げられるがこれらに限定されない。このような抗原は、組換え的にか
または当該分野で公知の任意の他の手段により、単離される得るかまたは調製さ
れ得る。
【０１５２】 本明細書中で使用される場合、微生物抗原（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｔｉｇ
ｅｎ）は、微生物の抗原（ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ａ ｍｉｃｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍ）であり、そしてこれらとしては、ウイルス、細菌、寄生虫および真
菌が挙げられるがこれらに限定されない。このような抗原としては、インタクト
な微生物、ならびにそれらの天然の単離物およびフラグメントまたは誘導体が挙
げられ、そして、天然の微生物抗原と同一または類似する合成化合物をも含み、
そしてその微生物について特異的な免疫応答を誘導する。化合物が天然の微生物
抗原に対する免疫応答（体液性および／または細胞性）を誘導する場合、この化
合物は、天然の微生物抗原に類似する。このような抗原は、当該分野で慣用的に
使用され、そして当業者に周知である。
【０１５３】 ヒトにおいて見出されているウイルスの例としては、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない：レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（例え
ば、ＨＩＶ−１）（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡ
ＶまたはＨＩＶ−ＩＩＩともいう））；他の単離物（例えば、ＨＩＶ−ＬＰ）；
ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウ
イルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、ＥＣＨＯウイルス）；Ｃ
ａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（
例えば、ウマの脳症ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デ
ング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば
、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬
病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス
科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例
えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザ
ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス）；オルトミ
クソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ビルナウイルス科（例え
ば、ハンターンウイルス、ブンガ（ｂｕｎｇａ）ウイルス、フレボウイルスおよ
びＮａｉｒｏウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス
科（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイ
ルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボ
ウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；
アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純疱
疹ウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）、疱疹ウイルス）；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニ
アウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（例えば、アフリカ
豚コレラウイルス）；ならびに分類されてないウイルス（例えば、海綿状脳障害
の病因学的抗原、デルタ型肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損付随物であると
考えられる）、非Ａ，非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内部透過される；クラス２
＝非経口的に透過される（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークウイルおよび関
連ウイルス、ならびにアストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ））。
【０１５４】 グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両方は、脊椎動物における抗原として
機能する。このようなグラム陽性細菌としては、パスツレラ種、ブドウ球菌種お
よび連鎖球菌種が挙げられるがこれらに限定されない。グラム陰性細菌としては
、大腸菌、シュードモナス種およびサルモネラ種が挙げられるがこれらに限定さ
れない。感染性細菌の具体的な例としては、ヘリコバクターピロリ、Ｂｏｒｅｌ
ｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、レジオネラ・ニューモフィラ菌、ミコバクテリ
ア種（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒ
ａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、黄色ブ
ドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌、化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）、Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌
属（緑色群（ｖｉｒｉｄａｎｓ ｇｒｏｕｐ））、糞便連鎖球菌、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、連鎖球菌属（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌、病原性
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、エンテロコッカス種、インフルエンザ菌、炭疽
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌、コリネバクテリウ
ム種、豚丹毒菌、ウェルチ菌、破傷風菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏ
ｇｅｎｅｓ、肺炎杆菌、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、バクテロ
イデス種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉ
ｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ、レプトスピラ属、リケッチ
ア属およびイスラエル放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ）が
挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５５】 真菌の例としては、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉ
ｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍ
ｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍ
ｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓが挙げ
られる。
【０１５６】 他の感染性微生物（すなわち、原生生物）としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｓｐｐ．（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅおよびＰｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉが
挙げられる。血液運搬（ｂｏｒｎｅ）寄生虫および／または組織寄生虫としては
、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｂ
ｅｓｉａ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌｅ
ｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ．、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉ
ｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｇａ
ｍｂｉｅｎｓｅおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ（アフ
リカ睡眠病）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ（シャーガス病）、ならび
にＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉが挙げられる。
【０１５７】 他の医学的に関連する微生物は、文献において広範に記載されている。例えば
、Ｃ．Ｇ．Ａ Ｔｈｏｍａｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂ
ａｉｌｌｉｅｒｅ Ｔｉｎｄａｌｌ、Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ １９８３（
この内容全体は、本明細書により参考として援用される）を参照のこと。
【０１５８】 上記の微生物の多くはヒト疾患に関与するが、本発明はまた、他の非ヒト脊椎
動物を処置するために有用である。非ヒト脊椎動物はまた、本明細書中に開示さ
れる免疫刺激核酸で予防または処置され得る感染を発症し得る。例えば、感染性
ヒト疾患の処置に加えて、本発明の方法は、動物の感染を処置するために有用で
ある。
【０１５９】 本明細書中で使用される場合、用語処置する、処置されるまたは処置すること
は、感染性疾患に関して使用される場合、予防的な処置（これは病因での感染に
対する被検体（感染の危険にある）の耐性を増加させるか、または換言すると、
被検体が病理に感染するようになる確率を減少させる）およびその被検体（感染
した被検体）が感染した後にその感染と戦う（例えば、その感染を減じるかもし
くは取り除くか、または悪化することを防ぐ）ための処置をいう。
【０１６０】 非ヒト脊椎動物の処置のための多くのワクチンが、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ、第３版 Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕ
ｍｓ、Ｉｎｃ．、１９９５のＢｅｎｎｅｔｔ，Ｋ．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍに開示
されている。上記のように、抗原としては、感染性細菌（例えば、ウイルス、寄
生虫、細菌および真菌）ならびに天然の供給源に由来するかまたは合成的に誘導
されたそれらのフラグメントを含む。ヒトおよび非ヒト脊椎動物の感染性ウイル
スとしては、レトロウイルス、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスが挙げられ
る。レトロウイルスのこの群は、単純レトロウイルスおよび複合レトロウイルス
の両方を含む。単純レトロウイルスとしては、レトロウイルスＢ型、レトロウイ
ルスＣ型およびレトロウイルスＤ型が挙げられる。レトロウイルスＢ型の例は、
マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）である。レトロウイルスＣ型としては、サブ
グループのＣ型Ａ群（ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、鳥類白血病ウイルス（Ａ
ＬＶ）および鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）を含む）およびＣ型Ｂ群（ネコ
白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、テナガザル白血病（ｇｉｂｂｏｎ ａｐｅ ｌｅ
ｕｋｅｍｉａ）ウイルス（ＧＡＬＶ）、脾臓壊死（ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒｏｓ
ｉｓ）ウイルス（ＳＮＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＶ）およびシミアン肉腫（
ｓｉｍｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ）ウイルス（ＳＳＶ）を含む）が挙げられる。レ
トロウイルスＤ型としては、マソン−ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）およ
びシミアンレトロウイルスＩ型（ＳＲＶ−１）が挙げられる。複合レトロウイル
スとしては、レンチウイルスのサブグループ、Ｔ細胞白血病ウイルスおよび泡沫
状ウイルスが挙げられる。レンチウイルスとしては、ＨＩＶ−１が挙げられるが
、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ビスナウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およ
びウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をも含む。Ｔ細胞白血病ウイルスとして
は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、シミアンＴ細胞白血病ウイルス（ＳＴＬＶ
）およびウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）が挙げられる。泡沫状ウイルスとしては
、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）、シミアン泡沫状ウイルス（ＳＦＶ）およびウ
シ泡沫状ウイルス（ＢＦＶ）が挙げられる。
【０１６１】 脊椎動物における抗原である他のＲＮＡウイルスの例としては、以下が挙げら
れるがこれらに限定されない：レオウイルス科ファミリーのメンバー（オルトレ
オウイルス属（ｇｅｎｕｓ Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）（哺乳動物および鳥
類の両方のレトロウイルスの複数の血清型）、オルビウイルス属（ブルータング
ウイルス、Ｅｕｇｅｎａｎｇｅｅウイルス、Ｋｅｍｅｒｏｖｏウイルス、アフリ
カウマ病ウイルスおよびコロラドダニ熱ウイルス）、ロタウイルス属（ヒトロタ
ウイルス、ネブラスカ子ウシ下痢（Ｎｅｂｒａｓｋａ ｃａｌｆ ｄｉａｒｒｈ
ｅａ）ウイルス、シミアンレトロウイルス、ウシレトロウイルスまたはヒツジレ
トロウイルス、鳥類レトロウイルス）を含む）；ピコルナウイルス科（エンテロ
ウイルス属（ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡおよびＢ、ＥＣＨＯウイ
ルス（ｅｎｔｅｒｉｃ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｈｕｍａｎ ｏｒｐｈａｎ（Ｅ
ＣＨＯ）ｖｉｒｕｓ）、Ａ型肝炎ウイルス、シミアンエンテロウイルス（Ｓｉｍ
ｉａｎ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、マウス脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス、マ
ウスポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ ｍｕｒｉｓ）、ウシエンテロウイ
ルス、ブタエンテロウイルス）、カーディオウイルス属（脳心筋炎ウイルス（Ｅ
ＭＣ）、メンゴウイルス）、ライノウイルス属（少なくとも１１３サブタイプを
含むヒトライノウイルス；他のライノウイルス）、Ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ属（口
蹄疫（ＦＭＤＶ））を含む）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ科（ブタ小水疱性発疹
ウイルス、サンミグエルアザラシウイルス、ネコピコルナウイルスおよびノーウ
ォークウイルスを含む）；トガウイルス科（アルファウイルス属（東部ウマ脳脊
髄炎、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、Ｏ
’Ｎｙｏｎｇ−Ｎｙｏｎｇウイルス、ロス川ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎
ウイルス、西部ウマ脳炎（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉ
ｔｉｓ）ウイルスを含む））、Ｆｌａｖｉｒｉｕｓ属（蚊保有（Ｍｏｓｑｕｉｔ
ｏ ｂｏｒｎｅ）黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、セン
トルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、Ｋｕｎ
ｊｉｎウイルス、中央ヨーロッパダニ保有（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｅｕｒｏｐｅａｎ
ｔｉｃｋ ｂｏｒｎｅ）ウイルス、ファーウエスタンダニ保有（Ｆａｒ Ｅａ
ｓｔｅｒｎ ｔｉｃｋ ｂｏｒｎｅ）ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ヒ
ツジの跳躍病ウイルス、ポーワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、
ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、豚コレ
ラウイルス、ボーダー病ウイルス）；ブンヤウイルス科（ブンヤウイルス属（ブ
ンヤムウェラウイルスおよび関連するウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス
）、フレボウイルス属（サシチョウバエ熱Ｓｉｃｉｌｉａｎウイルス、リフトバ
レー熱ウイルス）、神経ウイルス属（クリミア−コンゴ出血性熱ウイルス、ナイ
ロビヒツジ病ウイルス）およびＵｕｋｕｖｉｒｕｓ属（Ｕｕｋｕｎｉｅｍｉおよ
び関連するウイルス）を含む）；オルトミクソウイルス科（インフルエンザウイ
ルス属（インフルエンザウイルスＡ型、多くのヒトサブタイプ）；ブタインフル
エンザウイルスならびに鳥類インフルエンザウイルスおよびウマインフルエンザ
ウイルス；インフルエンザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、ならびにインフルエ
ンザＣ型（可能な別の属）を含む）；パラミクソウイルス科（パラミクソウイル
ス属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、血球吸着性ウイル
ス、パラインフルエンザウイルス２型〜５型、ニューカッスル病ウイルス、流行
性耳下腺炎ウイルス）、麻疹ウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化性汎脳炎ウ
イルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス属（ＲＳウイル
ス（ＲＳＶ）、ウシの呼吸器性シンシチアルウイルスおよび肺炎ウイルス）を含
む）；ラブドウイルス科（ベシクロウイルス属（ＶＳＶ）、Ｃｈａｎｄｉｐｕｒ
ａウイルス、Ｆｌａｎｄｅｒｓ−Ｈａｒｔ Ｐａｒｋウイルス、リッサウイルス
属（狂犬病ウイルス）、魚類ラブドウイルスおよび２つの可能なラブドウイルス
（マルブルクウイルスおよびエボラウイルス）を含む）；アレナウイルス科（リ
ンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、タカリベウイルス複合体およびＬａｓｓ
ａウイルスを含む）；コロナウイルス科（伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、
肝炎ウイルス、ヒト腸コロナ（Ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｉｃ ｃｏｒｏｎａ）ウ
イルスおよびネコの伝染性腹膜炎（ネココロナウイルス）を含む）。
【０１６２】 脊椎動物における抗原である例示的なＤＮＡウイルスとしては、以下が挙げら
れるがこれらに限定されない：ポックスウイルス科（オルトポックスウイルス属
（大痘瘡、小痘瘡、サルポックス痘疹（Ｍｏｎｋｅｙ ｐｏｘ Ｖａｃｃｉｎｉ
ａ）、牛痘、バッファロー痘（Ｂｕｆｆａｌｏｐｏｘ）、家兎痘、欠肢症）、レ
ポリポックスウイルス属（粘液腫、線維腫）、Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ属（鶏痘
、他の鳥類ポックスウイルス）、カプリポックスウイルス属（羊痘、ヤギ痘）、
Ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓ属（豚痘）、パラポックスウイルス属（伝染性膿疱性口
内炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス）を含む）；イリドウイルス
科（アフリカ豚コレラウイルス、カエルウイルス（Ｆｒｏｇ ｖｉｒｕｓｅｓ）
２および３、魚類のリンパ球ウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｓｔｉｓ ｖｉｒｕｓ
ｏｆ ｆｉｓｈ））；ヘルペスウイルス科（α−疱疹ウイルス（単純疱疹１型
および２型、水痘−帯状疱疹、ウマ流産ウイルス、ウマヘルペスウイルス２およ
び３、仮性狂犬病ウイルス、ウシの伝染性角膜炎ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎
ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス）を含む）；β−
疱疹ウイルス（ヒトサイトメガロウイルスならびにブタおよびサルのサイトメガ
ロウイルス）；γ−疱疹ウイルス（エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、マ
レク病ウイルス、Ｈｅｒｐｅｓ ｓａｉｍｉｒｉ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ａ
ｔｅｌｅｓ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ、モルモット疱疹
ウイルス、Ｌｕｃｋｅ腫瘍ウイルス）；アデノウイルス科（マストアデノウイル
ス属（ヒトサブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよびグループ化されていないウイ
ルス；シミアンアデノウイルス（少なくとも２３の血清型）、イヌの伝染性肝炎
、およびウシ、ブタ、ヒツジ、カエルおよび多くのほかの種のアデノウイルス、
Ａｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ属（鳥類アデノウイルス）を含む）；ならびに培養
不可能なアデノウイルス；ポドウイルス科（パピローマウイルス属（ヒトパピロ
ーマウイルス、ウシパピローマウイルス、ショープウサギパピローマウイルス、
および他の種の種々の病原性パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス属（ポ
リオーマウイルス、サル空胞形成因子（ＳＶ−４０）、ウザギ空胞形成因子（Ｒ
ＫＶ）、Ｋウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、および他の主なポリオーマ
ウイルス（例えば、リンパ栄養性（Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）パピローマウ
イルス））を含む）；パルボウイルス科（アデノ関連ウイルス属、パルボウイル
ス属（ネコ汎白血球減少症ウイルス、ウシパルボウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｐａ
ｒｖｏｖｉｒｕｓ）、イヌパルボウイルス、アリューシャンミンク病ウイルスな
ど）を含む）。最後に、ＤＮＡウイルスは、上記の科に当てはまらないウイルス
（例えば、クールーおよびクロイツフェルト−ヤーコプ病のウイルスならびに慢
性感染性壊疽因子（ＣＨＩＮＡウイルス））を含み得る。
【０１６３】 各々の上記列挙は、例示的であり、そしてこれは限定を意図するものではない
。
【０１６４】 ヒトにおける抗原特異的免疫応答を誘導するための免疫応答性核酸の使用に加
えて、好ましい実施形態の方法は、鳥類（例えば、雌鳥、ニワトリ、シチメンチ
ョウ、アヒル、ガン、ウズラ、およびキジ）の処置に特に適切である。鳥類は、
多くのタイプの感染の主な標的である。
【０１６５】 孵化しつつある鳥類を、誕生後、病原性微生物に短時間曝す。これらの鳥類は
、初めは、母性の誘起された抗体により病原に対して保護されるが、この保護は
、一過性でしかなく、そして鳥類自身の未発達の免疫系は、病原からその鳥類を
保護するために保護し始めなければならない。若年の鳥類が最も感受性である場
合、その若年の鳥類における感染を予防することは、しばしば望ましい。特に、
老年の鳥類が、閉鎖された区画（ｑｕａｒｔｅｒ）に閉じ込められて、疾患の急
速な各段を生じる場合、その老年の鳥類における感染を防ぐこともまた望ましい
。従って、抗原が存在する場合に、鳥類に本発明の免疫刺激核酸および非核酸ア
ジュバントを投与して、抗原特異的免疫応答を増強することは望ましい。
【０１６６】 ニワトリにおける通常の感染の例は、ニワトリ感染性貧血（ｃｈｉｃｋｅｎ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ）ウイルス（ＣＩＡＶ）である。ＣＩＡＶ
は、マレク病ワクチン接種のブレーク（ｂｒｅａｋ）の研究の間に、１９７９年
に日本において最初に単離された（Ｙｕａｓａら、１９７９、Ａｖｉａｎ Ｄｉ
ｓ．２３：３６６〜３８５）。この時から、ＣＩＡＶは、禽類を生産する全ての
主要な国における商業的家禽類において検出された（ｖａｎ Ｂｕｌｏｗ ら、
１９９１、６９０−６９９頁、Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ、第９
版、Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【０１６７】 ＣＩＡＶ感染は、若年の感受性のニワトリにおいて臨床的疾患を生じ、これは
、貧血、出血および免疫抑制により特徴付けられる。ＣＩＡＶ感染したニワトリ
の胸腺の萎縮症および骨髄の萎縮症ならびに一致する領域もまた、ＣＩＡＶ感染
の特徴である。胸腺における（そして時々ファブリーキウス嚢における）リンパ
球欠乏は、免疫抑制および二次的なウイルス感染、細菌感染または真菌感染への
感受性の増加を生じ、これは次いで、疾患の経過を複雑にする。免疫抑制は、マ
レク病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性ファルビキウス病ウイルス、細網内皮症ウイ
ルス、アデノウイルスまたはレオウイルスの１以上に感染した後に疾患の悪化を
引き起こし得る。ＭＤＶの病理がＣＩＡＶにより促進されることは、報告されて
いる（ＤｅＢｏｅｒら、１９８９、２８頁、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔ
ｈｅ ３８ｔｈ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｃｏｎ
ｆｅｒｅｎｃｅ，Ｔｅｍｐｅ，Ａｒｉｚ．）。さらにＣＩＡＶが伝染性ファブリ
ーキウス嚢病の徴候を悪化させることが報告されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅ
ｒら、１９８９、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３３：７０７−７１３）。ニワトリは、
実験的に増加されたＣＡＡに起因する疾患に対する年齢耐性（ａｇｅ ｒｅｓｉ
ｓｔａｎｃｅ）を発達させる。このことは、２週間の年齢により本質的には達成
されるが、老齢のトリは、感染に対してまだ感受性である（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら
、１９７９（前出）；Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、Ａｒｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２
４、２０２−２０９、１９８０）。しかし、ニワトリがＣＡＡおよび免疫抑制剤
（ＩＢＤＶ、ＭＤＶなど）で二重に感染される場合、疾患に対する年齢耐性は遅
れる（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９７９および１９８０（前出）；Ｂｕｌｏｗ ｖ
ｏｎ Ｖ．ら、Ｊ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３３、９３−１
１６、１９８６）。疾患伝染を増強し得るＣＩＡＶの特徴は、環境的な不活性化
およびいくつかの共通の消毒薬に対する高い抵抗性を含む。家禽産業に対するＣ
ＩＡＶ感染の経済的な影響は、疾患が発症した、感染した鳥類の１０％〜３０％
が死亡する事実から明らかである。
【０１６８】 鳥類の予防接種は、他の脊椎動物と同様に、任意の年齢で実施され得る。通常
、予防接種は、生微生物に関しては１２週齢までに、不活性化微生物または他の
型のワクチンに関しては１４−１８週の間に実施される。卵における（ｉｎ ｏ
ｖｏ）予防接種に関しては、予防接種は、胚発達の最後の４分の１に実施され得
る。ワクチンは皮下に、スプレーによって、経口で、眼球内に、気管内に、鼻腔
内に、または本明細書中で記載される他の粘膜伝達方法によって投与され得る。
従って、本発明の免疫刺激核酸は、慣用的な予防接種スケジュールを用いて、鳥
類および他の非ヒト脊椎動物に投与され得、そして抗原は、本明細書中で記載さ
れるように、適切な時間の後投与される。
【０１６９】 ウシおよび家畜もまた感染に感受性である。これらの動物に影響を与える疾患
は、特にウシにおいて重大な経済的損失を産生し得る。本発明の方法は、ウシ、
ウマ、ブタ、ヒツジ、およびヤギのような家畜において、感染から保護するため
に使用され得る。
【０１７０】 ウシはウシウイルスによって感染され得る。ウシウイルス性下痢ウイルス（Ｂ
ＶＤＶ）は、小さな、エンベロープに包まれた＋鎖ＲＮＡウイルスであり、そし
てブタコレラウイルス（ＨＯＣＶ）およびヒツジボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）
と共にペスチウイルス属に分類される。ペスチウイルスは以前トガウイルス科に
分類されていたが、いくつかの研究が、フラビウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）グループと共に、そのフラビウイルス科への再分類を示唆した（Ｆｒ
ａｎｃｋｉら、１９９１）。
【０１７１】 ウシおいて重要な病原体であるＢＶＤＶは、細胞培養分析に基づいて、細胞病
原性（ＣＰ）および非細胞病原性（ＮＣＰ）生物型に区別され得る。ＮＣＰ生物
型がより広まっているが、両方の生物型をウシにおいて見出し得る。妊娠ウシが
ＮＣＰ系統に感染した場合、そのウシは、持続的に感染し、そしてその生涯の間
にウイルスを広める、特異的に免疫寛容の仔ウシを出産し得る。持続感染したウ
シは、粘膜疾患に屈服し得、次いで両方の生物型がその動物から単離され得る。
臨床的な徴候としては、流産、奇形発生、および呼吸器の問題、粘膜疾患および
軽症の下痢が挙げられ得る。さらに、群れの流行と関連した、動物の死を引き起
こし得る重症の血小板減少症が記載され、そしてこの疾患と関連する系統は、古
典的なＢＶＤＶよりも悪性であるようである。
【０１７２】 ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）は、無症状から致死的疾患にわたる、ウマに
おける種々の感染を引き起こす、抗原的に区別される生物学的因子のグループを
含む。これらはウマヘルペスウイルス−１（ＥＨＶ−１）、ウマにおける遍在的
な病原体を含む。ＥＨＶ−１は、流産、気道疾患、および中枢神経系の障害の流
行に関連する。若いウマにおける上部気道の最初の感染が、８〜１０日間続く熱
性の疾患を引き起こす。免疫学的に経験した雌馬は、疾患が明らかになることな
く上部気道によって再感染し得るので、流産は、通常前兆無しに起こる。神経学
的な症候群は、呼吸器疾患または流産と関連しており、そしてあらゆる年齢でど
ちらの性別の動物にも影響し得、協調不能、衰弱、および後部麻痺に至る（Ｔｅ
ｌｆｏｒｄ，Ｅ．Ａ．Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９、３０４−３１６、１
９９２）。他のＥＨＶは、ＥＨＶ−２、またはウマサイトメガロウイルス、ＥＨ
Ｖ−３、ウマ交疹ウイルス、および以前はＥＨＶ−１サブタイプ２と分類されて
いたＥＨＶ−４を含む。
【０１７３】 ヒツジおよびヤギは、ビスナ−マエディを含む種々の危険な微生物に感染し得
る。
【０１７４】 サル、類人猿、およびマカクザルのような霊長類は、サル免疫不全ウイルスに
感染し得る。不活性化細胞ウイルスおよび細胞を含まない全サル免疫不全ワクチ
ンが、マカクザルにおいて保護を提供することが報告された（Ｓｔｏｔｔら（１
９９０）Ｌａｎｃｅｔ ３６：１５３８−１５４１；Ｄｅｓｔｒｏｓｉｅｒｓら
、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９８９）８６：６３５３−６３５７；Ｍｕｒｐｈｅｙ−
Ｃｏｒｂら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２９３−１２９７；および
Ｃａｒｌｓｏｎら（１９９０）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉ
ｒｕｓｅｓ ６：１２３９−１２４６）。組換えＨＩＶｇｐ１２０ワクチンが、
チンパンジーにおいて保護を提供することが報告された（Ｂｅｒｍａｎら（１９
９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４５：６２２−６２５）。
【０１７５】 飼育されているネコおよび野生のネコはどちらも、種々の微生物の感染に感受
性である。例えば、ネコ伝染性腹膜炎は、ライオン、ヒョウ、チーター、および
ジャガーのような飼育または野生ネコのどちらにおいても起こる疾患である。ネ
コにおけるこの型または他の型の病原性生物による感染を防止するのが望ましい
場合、本発明の方法が、感染から守るためにネコに予防接種するために使用され
得る。
【０１７６】 飼育ネコは、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ肉腫ウイルス（ＦｅＳＶ
）、内因性Ｃ型オンコルナウイルス（ＲＤ−１１４）、およびネコシンシチア形
成ウイルス（ＦｅＳＦＶ）を含むがこれに限定されないいくつかのレトロウイル
スに感染し得る。これらのうち、ＦｅＬＶがリンパ網内性および骨髄性の新生物
、貧血、免疫による疾患、およびヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に似た
免疫不全症候群を含む多様な症状を引き起こす最も重要な病原体である。最近、
ＦｅＬＶ−ＡＩＤＳと呼ばれる特定の複製欠損ＦｅＬＶ変異体が、より特異的に
免疫抑制性質と関連していた。
【０１７７】 ネコＴリンパ指向性レンチウイルス（ネコ免疫不全とも呼ばれる）の発見は、
Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：７９０−７９３にお
いて最初に報告された。ＦＩＶの特徴は、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８８）Ｌｅ
ｕｋｅｍｉａ、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２：２０４Ｓ−２１
５Ｓ；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４９：１２
４６−１２５８；およびＡｃｋｌｅｙら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５
６５２−５６５５で報告された。ＦＩＶのクローニングおよび配列分析は、Ｏｌ
ｍｓｔｅｄら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６：２４４８−２４５２および８６：４３５５−４３６０で報告された。
【０１７８】 ネコ伝染性腹膜炎（ＦＩＰ）は、飼育および野生のネコ科動物において予測不
能に起こる散発性の疾患である。ＦＩＰは主には飼育ネコの疾患であるが、ライ
オン、クーガー、ヒョウ、チーター、およびジャガーで診断された。ＦＩＰに罹
患した小型野生ネコは、リンクスおよびカラカル、サンドキャット（ｓａｎｄ
ｃａｔ）、およびパラスキャット（ｐａｌｌａｓ ｃａｔ）を含む。飼育ネコに
おいて、全ての年齢のネコが感受性であるが、その疾患は大部分若い動物におい
て起こる。発症のピークは、６〜１２月齢の間に起こる。５〜１３年齢で発症の
減少が見られ、続いて１４〜１５歳のネコで発生が増加する。
【０１７９】 魚、貝または他の水生生物におけるウイルス、細菌および寄生生物性の疾患は
、水産養殖産業で深刻な問題を提起する。孵化タンクまたは閉ざされた海洋養殖
領域における動物の高い密度のために、伝染性疾患は、例えば、魚、貝または他
の水生生物の施設における大部分のストックを根絶し得る。一旦疾患が進行して
からの介入よりも、疾患の予防が、この魚への脅威に対するより望ましい治療で
ある。魚の予防接種は、免疫を介した長期間の保護を付与し得る唯一の予防的方
法である。核酸に基づくワクチン接種が、Ｄａｖｉｓに発行された米国特許第５
，７８０，４４８号で記載されている。
【０１８０】 魚の免疫系は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、リンホカイン、補体、および免疫グロブリン
の存在のような、哺乳動物免疫系と似た多くの特徴を有している。魚は多くの点
で哺乳動物のＢおよびＴ細胞のものと似ているようである役割を有するリンパ球
のサブクラスを有している。ワクチンは、浸漬または経口によって投与され得る
。
【０１８１】 水産養殖種は、魚、貝、および他の水生動物を含むがこれに限定されない。魚
は、全ての脊椎のある魚を含む。それは、例えば、サケ科の魚、コイ、ナマズ、
ブリ、タイ、およびスズキのような硬骨魚または軟骨魚であり得る。サケ科は魚
の１つの科であり、マス（ニジマスを含む）、サケ、および北極のイワナ（Ａｒ
ｃｔｉｃ ｃｈａｒ）を含む。貝の例は、クラム、ロブスター、エビ、カニ、お
よびカキを含むがこれに限定されない。他の養殖水生動物は、ウナギ、イカ、お
よびタコを含むがこれに限定されない。
【０１８２】 ウイルス性水産養殖病原体のポリペプチドは、ウイルス性出血性敗血症ウイル
ス（ＶＨＳＶ）の糖タンパク質（Ｇ）または核タンパク質（Ｎ）；伝染性造血性
壊死ウイルス（ＩＨＮＶ）のＧまたはＮタンパク質；伝染性膵臓壊死ウイルス（
ＩＰＮＶ）のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、またはＮ構造タンパク質；コイ春ウイル
ス血症（ＳＶＣ）のＧタンパク質；およびブチナマズウイルス（ＣＣＶ）の膜関
連タンパク質、テグミン（ｔｅｇｕｍｉｎ）もしくはキャプシドタンパク質また
は糖タンパク質を含むがこれに限定されない。
【０１８３】 ウマに感染する代表的な寄生生物は、Ｇａｓｔｅｒｏｐｈｉｌｕｓ種；Ｅｉｍ
ｅｒｉａ ｌｅｕｃｋａｒｔｉ、Ｇｉａｒｄｉａ種；Ｔｒｉｔｒｉｃｈｏｍｏｎ
ａｓ ｅｑｕｉ；Ｂａｂｅｓｉａ種（ＲＢＣ’ｓ）、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｅｑ
ｕｉ；Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種；Ｋｌｏｓｓｉｅｌｌａ ｅｑｕｉ；Ｓａｒｃ
ｏｃｙｓｔｉｓ種である。
【０１８４】 ブタに感染する代表的な寄生生物としては、Ｅｉｍｅｒｉａ ｂｅｂｌｉｅｃ
ｋｉ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｃａｂｒａ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｓｕｉｓ、Ｇｉａｒ
ｄｉａ種；Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔ
ｏｌｙｔｉｃａ；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉおよびＳａｒｃｏｃｙｓ
ｔｉｓ種、ならびにＴｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓが挙げられる。
【０１８５】 乳用牛および肉牛の主な寄生生物としては、Ｅｉｍｅｒｉａ種、Ｃｒｙｐｔｏ
ｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種、Ｇｉａｒｄｉａ種；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉ
ｉ；Ｂａｂｅｓｉａ ｂｏｖｉｓ（ＲＢＣ）、Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎ
ａ（ＲＢＣ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種（血漿）、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ種（Ｒ
ＢＣ）；Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｐａｒｖａ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）；Ｔｒｉ
ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｆｏｅｔｕｓ；およびＳａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ種が挙
げられる。
【０１８６】 猛禽類の主な寄生生物としては、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｇａｌｌｉｎａｅ
；Ｃｏｃｃｉｄｉａ（Ｅｉｍｅｒｉａ種）；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｒｅｌｉｃ
ｔｕｍ、Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｄａｎｉｌｅｗｓｋｙｉ（フクロウ）、
Ｈａｅｍｏｐｒｏｔｅｕｓ種、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種；Ｈｉｓｔｏｍｏｎａ
ｓ；Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏ
ｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｅｉｍｅｒｉａ；Ｔｏ
ｘｏｐｌａｓｍａが挙げられる。
【０１８７】 ヒツジおよびヤギを感染する代表的な寄生生物としては、Ｅｉｍｅｒｉａ種、
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種、Ｇｉａｒｄｉａ種；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ
ｇｏｎｄｉｉ；Ｂａｂｅｓｉａ種（ＲＢＣ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種（血
漿）、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ種（ＲＢＣ）；およびＳａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ種が挙
げられる。
【０１８８】 家禽における代表的な寄生生物感染としては、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕ
ｌｉｎａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ種お
よびＥｉｍｅｒｉａ ｔｒｕｎｃａｔａにより引き起こされるコクシジウム症；
Ｈｉｓｔｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓおよびＨｉｓｔｏｍｏｎａｓ
ｇａｌｌｉｎａｒｕｍにより引き起こされるヒストモナス症；Ｔｒｉｃｈｏｍｏ
ｎａｓ ｇａｌｌｉｎａｅにより引き起こされるトリコモナス症；およびＨｅｘ
ａｍｉｔａ ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓにより引き起こされるヘキサミタ症が挙げ
られる。家禽はまた、Ｅｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｍｅｒｉａ ｍｅｌｅａ
ｇｒｉｄｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｅ
ｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｅｉｍｅｒｉａ
ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅｍｅｒｉａ ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏ
ｚｏｏｎ種、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、Ｈｅｍｏｐｒｏｔｅｕｓ ｍｅｌｅａｇ
ｒｉｄｉｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉおよびＳａｒｃｏｃｙｓｔｉ
ｓに感染され得る。
【０１８９】 本発明の方法はまた、イヌ、ネコ、鳥類、魚およびフェレットにおける寄生生
物感染の処置および／または予防に適用され得る。鳥類の代表的な寄生生物とし
ては、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｇａｌｌｉｎａｅ；Ｅｉｍｅｒｉａ種、Ｉｓｏ
ｓｐｏｒａ種、Ｇｉａｒｄｉａ；Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ；Ｓａｒｃｏ
ｃｙｓｔｉｓ種、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｈａｅｍｏｐｒｏｔｅ
ｕｓ／Ｐａｒａｈａｅｍｏｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、Ｌｅｕｃ
ｏｃｙｔｏｚｏｏｎ／Ａｋｉｂａ、Ａｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓ
ｏｍａ種が挙げられる。代表的な寄生生物感染イヌとしては、Ｔｒｉｃｈｉｎｅ
ｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ；Ｉｓｏｐｏｒａ種、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｃ
ｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種、Ｈａｍｍｏｎｄｉａ種、Ｇｉａｒｄｉａ ｄ
ｕｏｄｅｎａｌｉｓ（ｃａｎｉｓ）；Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ、Ｅｎ
ｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ；Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ ｃａｎｉｓ
；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ
；Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ；Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｍａｓｔｉｇｏｔｅ
ｓ；Ｎｅｏｓｐｏｒａ ｃａｎｉｎｕｍ、が挙げられる。
【０１９０】 ネコ種を感染する代表的な寄生生物としては、Ｉｓｏｓｐｏｒａ種、Ｔｏｘｏ
ｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｈａｍｍｏｎｄｉａ
ｈａｍｍｏｎｄｉ、Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ種、Ｇｉａｒｄｉａ種；Ｅｎｔａｍｏ
ｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ；Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ ｃａｎｉｓ、Ｃｙｔ
ａｕｘｚｏｏｎ種、Ｃｙｔａｕｘｚｏｏｎ種、Ｃｙｔａｕｘｚｏｏｎ種（赤血球
、ＲＥ細胞）が挙げられる。
【０１９１】 魚を感染する代表的な寄生生物としては、Ｈｅｘａｍｉｔａ種、Ｅｉｍｅｒｉ
ａ種；Ｃｒｙｐｔｏｂｉａ種、Ｎｏｓｅｍａ種、Ｍｙｘｏｓｏｍａ種、Ｃｈｉｌ
ｏｄｏｎｅｌｌａ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｉｎａ種；Ｐｌｉｓｔｏｐｈｏｒａ種、Ｍ
ｙｘｏｓｏｍａ Ｈｅｎｎｅｇｕｙａ；Ｃｏｓｔｉａ種、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｉ
ｔｈｉｒｉｕｓ種、およびＯｏｄｉｎｉｕｍ種が挙げられる。
【０１９２】 野生型哺乳動物の代表的な寄生生物としては、Ｇｉａｒｄｉａ種（ｃａｒｎｉ
ｖｏｒｅｓ、ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ）、Ｉｓｏｓｐｏｒａ種（ｃａｒｎｉｖｏｒ
ｅｓ）、Ｅｉｍｅｒｉａ種（ｃａｒｎｉｖｏｒｅｓ、ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ）；
Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ種（ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ）、Ｂａｂｅｓｉａ種（ｃａｒｎ
ｉｖｏｒｅｓ、ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種（ｃａｒｎ
ｉｖｏｒｅｓ、ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ）；Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ種（ｈｅｒｂ
ｉｖｏｒｅｓ）；Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ（ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ
）、Ｆａｓｃｉｏｌｏｉｄｅｓ ｍａｇｎａ（ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ）、Ｆａｓ
ｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ（ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ）、Ｔｒｉｃｈｉｎｅ
ｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ（ｃａｒｎｉｖｏｒｅｓ、ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ）が
挙げられる。
【０１９３】 動物園における寄生生物感染はまた、深刻な問題を引き起こし得る。ウシ科フ
ァミリー（ブレスボック、レイヨウ、バンテン、エランド、ガウア、インパラ、
クリップスプリンガー、ネヅツノカモシカ、ガゼル）の代表的な寄生生物は、Ｅ
ｉｍｅｒｉａ種を含む。ひれ足動物ファミリー（アザラシ、アシカ）代表的な寄
生生物は、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｈｏｃａｅが挙げられる。ラクダファミリー（ラ
クダ、ラマ）における代表的な寄生生物は、Ｅｉｍｅｒｉａ種を含む。キリンフ
ァミリー（キリン）の代表的な寄生生物は、Ｅｉｍｅｒｉａ種を含む。象ファミ
リー（アフリカおよびアジア）における代表的な寄生生物は、Ｆａｓｃｉｏｌａ
種を含む。下等な方の霊長類（チンパンジー、オラウータン、類人猿、ヒヒ、マ
カク、サル）は、Ｇｉａｒｄｉａ種；Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ、Ｅｎ
ｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｔｏｘ
ｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ；Ｐｌａｓｍｏｄｉｍ種（ＲＢＣ）、Ｂａｂｅｓ
ｉａ種（ＲＢＣ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種（血漿）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ
種（マクロファージ）が挙げられる。
【０１９４】 細菌性病原体のポリペプチドは、フルンケル症を引き起こすＡｅｒｏｍｏｎｉ
ｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの鉄調節外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰ）、外膜タン
パク質（ＯＭＰ）、およびＡタンパク質、細菌性腎臓疾患（ＢＫＤ）を引き起こ
すＲｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍのｐ５７タンパク質
、エルジニア症の主要表面関連抗原（ｍｓａ）、表面発現サイトトキシン（ｍｐ
ｒ）、表面発現溶血素（ｉｓｈ）、および鞭毛抗原；パスツレラ症の細胞外タン
パク質（ＥＣＰ）、鉄調節外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰ）、および構造タンパク
質；Ｖｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍおよびＶ．ｏｒｄａｌｉｉのＯ
ＭＰおよび鞭毛タンパク質；Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌｏｓｉｓ ｉｃｔａｌｕｒ
ｉおよびＥ．ｔａｒｄａの鞭毛タンパク質、ＯＭＰタンパク質、ａｒｏＡ、およ
びｐｕｒＡ；およびＩｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表面抗原；およびＣｙ
ｔｏｐｈａｇａ ｃｏｌｕｍｎａｒｉの構造タンパク質および調節タンパク質；
およびリケッチアの構造タンパク質および調節タンパク質を含むがこれに限定さ
れない。
【０１９５】 寄生生物性の病原体のポリペプチドは、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの
表面抗原を含むがこれに限定されない。
【０１９６】 「アレルゲン」は、感受性の被験体でアレルギー性または喘息応答を誘導し得
る物質（抗原）をいう。アレルゲンのリストは膨大であり、そして花粉、昆虫の
毒液、動物の鱗屑、真菌の胞子および薬物（例えばペニシリン）を含み得る。天
然の、動物および植物アレルゲンの例は以下の属に特異的なタンパク質を含むが
これに限定されない：Ｃａｎｉｎｅ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）；Ｄ
ｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ（例えばＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ
ｆａｒｉｎａｅ）；Ｆｅｌｉｓ（Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）；Ａｍｂ
ｒｏｓｉａ（Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ）；Ｌｏｌｉｕｍ
（例えばＬｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏ
ｒｕｍ）；Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃ
ａ）；Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）；
Ａｌｄｅｒ；Ａｌｎｕｓ（Ａｌｎｕｓ ｇｕｌｔｉｎｏａｓａ）；Ｂｅｔｕｌａ
（Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）；Ｑｕｅｒｃｕｓ（Ｑｕｅｒｃｕｓ ａ
ｌｂａ）；Ｏｌｅａ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａ）；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ（Ａｒｔ
ｅｍｉｓｉａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）；Ｐｌａｎｔａｇｏ（例えばＰｌａｎｔａｇ
ｏ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）；Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ（例えばＰａｒｉｅｔａｒ
ｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓまたはＰａｒｉｅｔａｒｉａ ｊｕｄａｉｃａ）
；Ｂｌａｔｔｅｌｌａ（例えばＢｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）；Ａ
ｐｉｓ（例えばＡｐｉｓ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）；Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ（例
えばＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ａ
ｒｉｚｏｎｉｃａ、およびＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）；Ｊｕ
ｎｉｐｅｒｕｓ（例えばＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ、Ｊｕｎｉ
ｐｅｒｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ、
およびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ）；Ｔｈｕｙａ（例えばＴｈｕｙａ ｏ
ｒｉｅｎｔａｌｉｓ）；Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ（例えばＣｈａｍａｅｃｙ
ｐａｒｉｓ ｏｂｔｕｓａ）；Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ（例えばＰｅｒｉｐｌａ
ｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）；Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ（例えばＡｇｒｏｐｙｒ
ｏｎ ｒｅｐｅｎｓ）；Ｓｅｃａｌｅ（例えばＳｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）
；Ｔｒｉｔｉｃｕｍ（例えばＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）；Ｄａｃｔ
ｙｌｉｓ（例えばＤａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ）；Ｆｅｓｔｕｃａ（
例えばＦｅｓｔｕｃａ ｅｌａｔｉｏｒ）；Ｐｏａ（例えばＰｏａ ｐｒａｔｅ
ｎｓｉｓまたはＰｏａ ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）；Ａｖｅｎａ（例えばＡｖｅｎａ
ｓａｔｉｖａ）；Ｈｏｌｃｕｓ（例えばＨｏｌｃｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）；Ａ
ｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ（例えばＡｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ ｏｄｏｒａｔｕｍ
）；Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ（例えばＡｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ ｅｌａ
ｔｉｕｓ）；Ａｇｒｏｓｔｉｓ（例えばＡｇｒｏｓｔｉｓ ａｌｂａ）；Ｐｈｌ
ｅｕｍ（例えばＰｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ）；Ｐｈａｌａｒｉｓ（例えば
Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）；Ｐａｓｐａｌｕｍ（例えばＰａ
ｓｐａｌｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ）；Ｓｏｒｇｈｕｍ（例えばＳｏｒｇｈｕｍ ｈ
ａｌｅｐｅｎｓｉｓ）；およびＢｒｏｍｕｓ（例えばＢｒｏｍｕｓ ｉｎｅｒｍ
ｉｓ）。
【０１９７】 抗原は、核酸ベクターにコードされた抗原であってもよいし、または抗原は核
酸ベクターにコードされなくともよい。前者の場合、核酸ベクターは被験体に投
与され、そしてインビボで抗原が発現する。後者の場合、抗原は被験体に直接投
与され得る。核酸ベクターにコードされない抗原は、本明細書中で使用される場
合、核酸ではない任意の型の抗原をいう。例えば、本発明のいくつかの局面では
、核酸ベクターにコードされない抗原はポリペプチドである。ポリペプチド抗原
の一次アミノ酸配列に対する重要でない修飾も、未修飾の対応するポリペプチド
と比べて実質的に等価な抗原活性を有するポリペプチドとなり得る。そのような
修飾は、部位特異的変異誘発によるように意図的、または自然発生的であり得る
。これらの修飾によって産生される全てのポリペプチドは、抗原性が依然として
存在する限り、この中に含まれる。ポリペプチドは、例えば、ウイルスポリペプ
チドであり得る。
【０１９８】 実質的に精製されたという用語は、本明細書中で使用される場合、天然で会合
している他のタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質を実質的に含まない
ポリペプチドをいう。当業者は、タンパク質精製の標準的な技術を用いて、ウイ
ルスまたは細菌のポリペプチドを精製し得る。実質的に純粋なポリペプチドはし
ばしば、非還元ポリアクリルアミドゲルで単一の主要なバンドを生じる。部分的
にグリコシル化されたポリペプチド、またはいくつかの開始コドンを有するポリ
ペプチドの場合、非還元ポリアクリルアミドゲルでいくつかのバンドが存在し得
るが、これらは、そのポリペプチドについて特有のパターンを形成する。ウイル
スまたは細菌のポリペプチドの純度はまた、アミノ末端アミノ酸配列分析によっ
て決定され得る。ポリサッカライド、低分子、模倣物などのような、核酸ベクタ
ーによってコードされない他の型の抗原は、上記で記載される。
【０１９９】 本発明はまた、抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する
。抗原が、抗原をコードする核酸分子において被験体に送達され得、その結果、
抗原がインビボで発現されなければならないと考えられる。核酸ベクターにおい
て被験体に送達されるそのような抗原は、核酸ベクターによってコードされる抗
原と呼ばれる。抗原をコードする核酸は、真核生物細胞内での抗原核酸の発現を
指示する遺伝子発現配列に作動可能に連結される。遺伝子発現配列は、それに作
動可能に連結される抗原核酸の効率的な転写および翻訳を促進する、プロモータ
ー配列またはプロモーター−エンハンサーの組み合せのような、任意の調節性ヌ
クレオチド配列である。遺伝子発現配列は、例えば構成的または誘導性プロモー
ターのような、哺乳動物またはウイルスのプロモーターであり得る。構成的哺乳
動物プロモーターとしては、以下の遺伝子のプロモーターおよび他の構成的プロ
モーターが挙げられるがこれに限定されない：ヒポキサンチンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ
、β−アクチンプロモーター。真核生物細胞において構成的に機能する例示的な
ウイルスプロモーターとしては、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミ
アンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒ
ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス由
来のプロモーター、モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長末端
反復（ＬＴＲ）、ならびに単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが
挙げられる。他の構成的プロモーターは、当業者に公知である。本発明の遺伝子
発現配列として有用なプロモーターはまた、誘導性プロモーターを含む。誘導性
プロモーターは、誘導剤の存在下で発現する。例えば、メタロチオネインプロモ
ーターは、特定の金属イオンの存在下で誘導されて、転写および翻訳を促進する
。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。
【０２００】 一般的に、遺伝子発現配列は、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピン
グ配列、ＣＡＡＴ配列などのような、それぞれ転写および翻訳の開始に関わる、
５’非転写配列および５’非翻訳配列を含む。特にそのような５’非転写配列は
、作動可能に連結された抗原核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプ
ロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、所望の場合、必要に応じてエンハン
サー配列または上流のアクチベーター配列を含む。
【０２０１】 抗原核酸は、遺伝子発現配列に作動可能に連結される。本明細書中で使用され
る場合、抗原核酸配列および遺伝子発現配列は、それらが抗原をコードする配列
の発現または転写および／または翻訳を、遺伝子発現配列の影響または制御下に
置くような様式で共有結合している場合、作動可能に連結しているといわれる。
２つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列のプロモーターの誘導が抗原配列の転
写を引き起こす場合、および２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が（１）フレーム
シフト変異の導入を引き起こさず、（２）プロモーター領域が抗原配列の転写を
指示する能力を妨害せず、（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質へと翻訳さ
れる能力を妨害もしない場合、作動可能に連結しているといわれる。従って、遺
伝子発現配列がその抗原核酸配列の転写をもたらすことができ、その結果、得ら
れる転写物が望ましいタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるなら、遺伝子
発現配列は抗原核酸配列に作動可能に連結されている。
【０２０２】 本発明の抗原核酸は、免疫系に単独でまたはベクターと共に送達され得る。最
も広い意味では、ベクターは、抗原が免疫細胞の表面に発現および提示され得る
ように、抗原核酸の免疫系細胞への移入を促進することができる任意のビヒクル
である。ベクターは一般的に、ベクターの非存在下で起こる分解の程度に比べて
分解が減少して、核酸を免疫細胞に輸送する。ベクターは、免疫細胞中での抗原
核酸の発現を増強するために、必要に応じて上記の遺伝子発現配列を含む。一般
的に、本発明で有用なベクターとしては、抗原核酸配列の挿入または組込みによ
って操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス供給源または
細菌供給源由来の他のビヒクルが挙げられるがこれらに限定されない。ウイルス
ベクターは、好ましい型のベクターであり、そしてウイルスベクターとしては以
下のウイルス由来の核酸配列が挙げられるがこれらに限定されない：モロニーマ
ウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、お
よびラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴
ウイルス；ＳＶ−４０型のウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタインバーウ
イルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオ
ウイルス；およびレトロウイルスのようなＲＮＡウイルス。示されていないが当
該分野で公知の他のベクターを容易に用い得る。
【０２０３】 好ましいウイルスベクターは、本質的でない遺伝子が目的の遺伝子で置換され
た非細胞変性真核ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスは、レトロウイルスを
含み、その生活環はゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写、続く宿主細胞Ｄ
ＮＡへのプロウイルスの組込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療試験
のために認可された。最も有用なものは、複製欠損レトロウイルスである（すな
わち、望ましいタンパク質の合成を指示できるが、感染性粒子を作ることができ
ない）。そのような遺伝的に変化したレトロウイルス発現ベクターは、インビボ
での高い効率の遺伝子形質導入のために一般的な有用性を有する。複製欠損レト
ロウイルスを産生するための標準的なプロトコール（外来性の遺伝物質のプラス
ミドへの組込み、プラスミドでのパッケージング細胞株のトランスフェクション
、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地から
のウイルス粒子の収集、およびウイルス粒子による標的細胞の感染の工程を含む
）が、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ Ｃ．Ｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）およびＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、７巻、Ｈｕｍａ
ｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｆｔｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９
９１）で提供される。
【０２０４】 ある適用に好ましいウイルスは、アデノ随伴ウイルス、２本鎖ＤＮＡウイルス
である。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損になるように操作され得、そして広い
範囲の細胞型および種に感染することができる。それはさらに、熱および脂質溶
媒安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞における高い形質導入頻度；および
重感染阻害を欠き、従って複数の一連の形質導入を可能にするというような利点
を有する。伝える所によれば、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的な様式でヒト
細胞ＤＮＡに組み込まれ得、それによって、レトロウイルスの感染に特徴的な、
挿入変異誘発の可能性および挿入された遺伝子発現の変動を最小にする。さらに
、野生型アデノ随伴ウイルスの感染は、組織培養において、選択圧の非存在下で
１００を越える継代にわたって追跡され、このことは、アデノ随伴ウイルスのゲ
ノム組込みは、比較的安定な事象であることを示した。アデノ随伴ウイルスはま
た、染色体外の様式でも機能し得る。
【０２０５】 他のベクターは、プラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは、当該分
野で大量に記載され、そして当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと。過去数年間、プラスミドベクターは、宿
主ゲノム内で複製されることも、宿主ゲノムに組み込まれることもできないので
、プラスミドベクターは、インビボで遺伝子を細胞に送達するのに特に有利であ
ることが見出された。しかし、宿主細胞と適合性のプロモーターを有するこれら
のプラスミドは、プラスミド内に作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを
発現することができる。いくつかの普通に使用されるプラスミドとしては、ｐＢ
Ｒ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、およびｐＢｌ
ｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドが当業者に周知である。さらに
、プラスミドは、制限酵素および連結反応を用いて特定のＤＮＡフラグメントを
除去および付加するように注文設計され得る。
【０２０６】 遺伝子を運ぶプラスミドが細菌を用いて免疫系に送達され得ることが、最近発
見された。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのような改変された形の細菌が、プラスミドで
トランスフェクトされ、そして送達ビヒクルとして使用され得る。細菌性送達ビ
ヒクルは、宿主被験体に経口または他の投与手段によって投与され得る。細菌は
プラスミドを、おそらく消化管の関門を通り抜けることによって、免疫細胞、例
えばＢ細胞、樹状細胞に送達する。高レベルの免疫保護が、この方法論を用いて
達成された。そのような送達方法は、抗原、免疫刺激核酸、および／または他の
治療剤の全身性送達を利用する、本発明の局面に有用である。
【０２０７】 従って、免疫刺激核酸は、ウイルスアジュバントとして有用である。ＣｐＧオ
リゴヌクレオチドは、優れたワクチンアジュバントであることが、以前に確立さ
れた。しかし、ＣｐＧ ＯＤＮ（これは、マウス中の優れたワクチンアジュバン
トである）は、非げっ歯類動物において好ましいアジュバントではない。ヒトお
よび他の非げっ歯類動物におけるワクチンアジュバントとしての使用のための最
も良好な免疫刺激核酸を同定するために、この目的のための異なる核酸のインビ
ボスクリーニングを行った。いくつかのインビトロアッセイを、マウスにおける
インビボでのアジュバント活性のそれらの予測値について、マウスにおいて評価
した。この研究の過程の間で、インビボ効力の予測となるインビトロ試験を確認
した。むしろ驚くべきことに、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の両方の活性化は、免疫刺
激核酸が抗原に対するインビボ免疫応答を増強する能力に特によく相関した。
【０２０８】 インビボワクチンアジュバント活性についてのＢ細胞活性化の良好な予測値は
、特定の免疫応答の確立において、Ｂ細胞の中心的な役割に最も関係しているよ
うである。Ｂ細胞のポリクローナル増殖（免疫刺激核酸によって誘導される）は
、抗原特異的Ｂ細胞／Ｔヘルパー細胞適合の可能性を増加する。さらに、ポリク
ローナル的に拡大されたＢ細胞上の同時刺激分子ＣＤ８６の増強された発現は、
抗原特異的Ｔヘルパー細胞を活性化する。Ｂ細胞はまた、活性化されたＴヘルパ
ー細胞を発現するＣＤ４０Ｌの能力を改善する免疫刺激核酸に応答してそれらの
ＣＤ４０発現を増加させ、Ｂ細胞を刺激する。Ｂ細胞上での増加したＩＣＡＭ−
１合成は、細胞の細胞接触を促進する。従って、ポリクローナルＢ細胞の活性化
状態は、特定の抗体応答の開始の間に重要な役割を果たす。
【０２０９】 しかし、特定の抗体の確立のためのＮＫ細胞活性の寄与は、驚くべきものであ
る。ＮＫ細胞は、生来の免疫系の一部であり、病原体に対する防御の第一のライ
ンに関係する。活性化の際にＮＫ細胞によって生成されるサイトカインパターン
は、特定の免疫応答の開始に密接に関連するようである。従って、１つの局面に
おいて、本発明は、ＮＫ細胞活性化を検出することによってアジュバントを同定
する方法に関する。このＮＫ細胞活性化アッセイは、以下の実施例に記載のよう
に実施され得るか、または他の公知のＮＫ細胞活性アッセイを使用して実施され
得る。しかし、ＮＫ細胞活性化が間接的な効果である可能性のために、混合細胞
集団（例えば、ＰＢＭＣ）が使用されることが好ましい。このアッセイは、好ま
しくは、ヒトおよび他の非げっ歯類動物においてアジュバントとして有用である
免疫刺激核酸を同定するために有用である。
【０２１０】 サイトカイン誘導をまた、インビボアジュバント活性の重要な予測として同定
した。マウス原始単球より、２ログ高いヒトの内毒素感受性が存在するために、
いくつかの注意が、ヒト系における試験のために使用される免疫刺激核酸の内毒
素汚染の防止するために必要とされる（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｇ．，およびＫｒｉ
ｅｇ Ａ．Ｍ．１９９９．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：８９３）。ＴＮＦ−
α、ＩＬ−６およびＩＬ−１２は、内毒素の低い量にでさえ応答してヒト単球に
よって産生されるので、ハイスループットスクリーニングアッセイについてそれ
らの値が制限される。一方で、ヒトＢ細胞およびＮＫ細胞は、内毒素による軽い
活性化のみを示し、従って、免疫刺激活性を試験する際に非常に有効である。
【０２１１】 ＮＫ細胞またはＢ細胞のいずれかにおける細胞機能（すなわち、溶解活性、増
殖）の刺激は、それらの表面での活性化マーカーの誘導より強力な免疫刺激核酸
を必要とする（ＣＤ６９、ＣＤ８６）。両方の細胞型について、細胞表面活性化
マーカーの使用は、機能的アッセイと比較してホスホロチオエート骨格に寄与可
能であるより高い非特異的バックグラウンドを示した。この表面マーカーの高い
感受性は、類似の活性の免疫刺激核酸間の最適な識別のために、低い免疫刺激核
酸濃度の使用を必要とする。従って、表面マーカーの使用は、弱い活性を有する
免疫刺激核酸の比較を可能にするが、機能アッセイは、高い活性を有する免疫刺
激核酸を比較するために好ましい。Ｂ細胞およびＮＫ細胞を刺激するための最適
な免疫刺激核酸濃度は異なることに注意すべきである。０．６μｇ／ｍｌ ＯＤ
Ｎが、既に、Ｂ細胞を刺激するために最大であるが、最適なＮＫ細胞活性化は、
６μｇ／ｍｌ ＯＤＮを必要とし得る。Ｂ細胞活性化およびＮＫ細胞の機能的活
性の両方は、新しく単離されたＰＢＭＣ内で測定された。高度に精製されたヒト
原始Ｂ細胞は、ＣｐＧ ＤＮＡによって活性化されることが、以前に発見されて
いる。ＮＫ細胞に対するＣｐＧ ＤＮＡの直接的な効果の存在は、あまり明確で
はなく、そしてＰＢＭＣ内の別の細胞型によって媒介される第二の機能が、ＮＫ
細胞のＣｐＧ誘導機能活性に寄与し得る。
【０２１２】 本発明の核酸は、抗菌剤と共に被験体に投与され得る、本明細書中で使用され
る場合、抗菌剤は、感染性微生物を殺傷または阻害し得る天然の化合物または合
成化合物をいう。本発明に従って有用な抗菌剤の型は、被験体に感染したか、ま
たは感染の危険性がある微生物の型の依存する。抗菌剤としては、以下が挙げら
れるがこれらに限定されない：抗菌薬、抗ウイルス剤、抗真菌剤および抗寄生生
物剤。「抗感染剤」、「抗菌剤」、「抗ウイルス剤」、「抗真菌剤」、「抗寄生
生物剤」および「殺寄生生物薬」のような句は、当業者に対して十分に確立され
た意味を持ち、そして標準的な医学教科書に定義されている。簡潔に、抗菌剤は
、細菌を殺傷するかまたは阻害し、そして抗生物質および他の合成または類似の
機能を有する天然の化合物を含む。抗生物質は、細胞（例えば、微生物）により
二次代謝物として生成される低分子量分子である。一般に、抗生物質は、微生物
に特異的でありそして宿主細胞に存在しない１つ以上の機能または構造を妨害す
る。抗ウイルス剤は、天然の供給源から単離され得るかまたは合成され得、そし
てウイルスを殺傷または阻害するために有用である。抗真菌剤は、表在性真菌感
染および日和見性真菌感染ならびに一次全身性真菌感染を処置するために使用さ
れる。抗寄生生物剤は、寄生生物を殺傷または阻害する。
【０２１３】 ヒト投与のために有用な抗寄生生物剤（殺寄生生物薬ともいわれる）の例とし
ては、アルべンダゾール、アンホテリシンＢ、ゼンズニダゾール、ビチオノール
、クロロキンＨＣｌ、リン酸クロロキン、クリンダマイシン、デヒドロエメチン
、ジエチルカルバマジン、ジロキサニドフロエート、エフロルニチン、フラゾリ
ドン（ｆｕｒａｚｏｌｉｄａｏｎｅ）、糖質コルチコイド、ハロファントリン（
ｈａｌｏｆａｎｔｒｉｎｅ）、ヨードキノール、アイバメクチン、メベンダゾー
ル、メフロキン、メグルミンアンチモニエート、メラルソプロール、メトリホナ
ート、メトロニダゾル、ニクロサミド、ニフルチモックス（ｎｉｆｕｒｔｉｍｏ
ｘ）、オキサムニキン、パラモマイシン、ペンタミジンイセチオネート、ピペラ
ジン、プラジカンテル、リン酸プリマキン、プログアニル（ｐｒｏｇｕａｎｉｌ
）、ピランテルパモエート、ピリメタミンスルホンアミド（ｐｙｒｉｍｅｔｈａ
ｎｍｉｎｅ−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、ピリメタミンスルファドキシン（ｐｙ
ｒｉｍｅｔｈａｎｍｉｎｅ−ｓｕｌｆａｄｏｘｉｎｅ）、キナクリンＨＣｌ、硫
酸キニーネ、キニジングルコネート、スピラマイシン、スチボグルコネートナト
リウム（グルコン酸アンチモンナトリウム）、スラミン、テトラサイクリン、ド
キシサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメトプリム−スルファ
メトキサゾール（ｔｒｉｍｅｔｈｒｏｐｒｉｍ−ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏ
ｌｅ）、およびトリパルサミドが挙げられるが、これらに限定されず、これらの
いくつかは、単独で、または他と組合せて使用される。
【０２１４】 非ヒト被験体で使用される殺寄生生物薬としては、以下が挙げられる：ピペラ
ジン、ジエチルカルバマジン、チアべンダゾール、フェンベンダゾール、アルベ
ンダゾール、オクスフェンダゾール（ｏｘｆｅｎｄａｚｏｌｅ）、オキシベンダ
ゾール、フェバンテル（ｆｅｂａｎｔｅｌ）、レバミゾール、ピランテルタート
レート、ピランテルパモエート、ジクロルボス、アイバメクチン、ドラメクチン
（ｄｏｒａｍｅｃｔｉｃ）、ミルベマイシンオキシム（ｍｉｌｂｅｍｙｃｉｎ
ｏｘｉｍｅ）、イプリノメクチン（ｉｐｒｉｎｏｍｅｃｔｉｎ）、モキシデクチ
ン（ｍｏｘｉｄｅｃｔｉｎ）、塩化Ｎ−ブチル、トルエン、ハイグロマイシンＢ
チアセタールセミドナトリウム、メラルソミン（ｍｅｌａｒｓｏｍｉｎｅ）、プ
ラジカンテル、エプシプランテル（ｅｐｓｉｐｒａｎｔｅｌ）、ベンズイミダゾ
ール（フェンベンダゾール、アルベンダゾール、オクスフェンダゾール、クロル
スロン（ｃｌｏｒｓｕｌｏｎ）、アルベンダゾール、アンプロリウム（ａｍｐｒ
ｏｌｉｕｍ）；デコキネート（ｄｅｃｏｑｕｉｎａｔｅ）、ラサロシド（ｌａｓ
ａｌｏｃｉｄ）、モネンシンスルファジメトキシン（ｍｏｎｅｎｓｉｎ ｓｕｌ
ｆａｄｉｍｅｔｈｏｘｉｎｅ）；スルファメチアジン、スルファキノクサリン、
メトロニダゾル）。
【０２１５】 ウマに使用される殺寄生生物薬としては、以下が挙げられる：メベンダゾール
、オクスフェンダゾール、フェバンテル、ピランテル、ジクロルボス、トリクロ
ルホン、アイバメクチン、ピペラジン；Ｓ．ｗｅｓｔｅｒｉに対して：アイバメ
クチン、ベンズイミダゾール（例えば、チアベンダゾール、カルベンダゾール、
オキシベンダゾールおよびフェンベンダゾール）。イヌにおいて有用な殺寄生生
物薬としては、ミルベマイシンオキシン（ｍｉｌｂｅｍｙｃｉｎ ｏｘｉｎｅ）
、アイバメクチン、ピランテルパモエート、およびアイバメクチンとピランテル
の組合せが挙げられる。ブタにおける寄生生物の処置は、レバミゾール、ピペラ
ジン、ピランテル、チアベンダゾール、ジクロルボスおよびフェンベンダゾール
の使用を含む。ヒツジおよびヤギにおいて、駆虫薬は、レバミゾール、またはア
イバメクチンを含む。カパルソレート（ｃａｐａｒｓｏｌａｔｅ）は、ネコのＤ
．ｉｍｍｉｔｉｓ（イヌ糸状虫）の処置において、いくらかの効力を示した。
【０２１６】 本発明において有用である抗細菌剤としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：天然ペニシリン，半合成ペニシリン、クラブラン酸，セファロス
ポリン（ｃｅｐｈａｌｏｌｓｐｏｒｉｎｓ），バシトラシン、アンピシリン、カ
ルベニシリン、オキサリシン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン、メ
チシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、セファロチン、セファピリン、セフ
ァレキシン、セファマンドール、セファクロール、セファゾリン、セフロキシン
、セフォキシチン、セフォタキシム、セフスロジン、セフェタメト、セフィキシ
ム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジン、モキサラクタム、カル
バペネム、イミペネム、モノバクタム、ユーズトレオナム（ｅｕｚｔｒｅｏｎａ
ｍ）、バンコマイシン、ポリミキシン、アンホテリシン Ｂ、ナイスタチン、イ
ミダゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾ
ール、フルコナゾール、リファンピン、エタンブトール、テトラサイクリン、ク
ロラムフェニコール、マクロライド系抗生物質、アミノ配糖体、ストレプトマイ
シン、カナマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、テトラサ
イクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、クロルテトラサイクリン、エリ
スロマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、オレアンドマイシン
、アジスロマイシン、クロラムフェニコール、キノロン類、コトリモキサゾール
、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ナリジクス酸、テマ
フロキサシン、スルホンアミド、ガントリシン（ｇａｎｔｒｉｓｉｎ），および
トリメトプリム；アセダプソン；アセトスルホンナトリウム；アラメシン；アレ
キシジン；アムジノシリン（Ａｍｄｉｎｏｃｉｌｌｉｎ）；アムジノシリンピボ
キシル（Ｐｉｖｏｘｉｌ）；アミサイクリン；アミフロキサシン；メタンスルホ
ン酸アミフロキサシン；アミカシン；硫酸アミカシン；アミノサリチル酸；アミ
ノサリチル酸ナトリウム；アモキシリン；アンホマイシン；アンピシリン；アン
ピシリンナトリウム；アパルシリンナトリウム；アプラマイシン；アスパルトシ
ン；硫酸アストロマイシン；アビラマイシン；アボパルシン；アジスロマイシン
；アズロシリン；アズロシリンナトリウム；塩酸バカンピシリン；バシトラシン
；ジサリチル酸バシトラシンメチレン；バシトラシン亜鉛（Ｂａｃｉｔｒａｃｉ
ｎ Ｚｉｎｃ）；バムベルマイシン；ベンゾイルパスカルシウム；ベリスロマイ
シン；硫酸ベタミシン；ビアペネム（Ｂｉａｐｅｎｅｍ）；ビンラマイシン（Ｂ
ｉｎｉｒａｍｙｃｉｎ）；塩酸ビフェナミン；Ｂｉｓｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ Ｍ
ａｇｓｕｌｆｅｘ；ブチカシン；硫酸ブチロシン；硫酸カプレオマイシン；カル
バドックス；カルベニシリン二ナトリウム；カルベニシリンインダニル（Ｉｎｄ
ａｎｙｌ）ナトリウム；カルベニシリンフェニルナトリウム；カルベニシリンカ
リウム；カルモナムナトリウム；セファクロール；セファドロキシル；セファマ
ンドール；セファマンドールナファート；セファマンドールナトリウム；セファ
パロール；セファトリジン；セファザフルルナトリウム；セファゾリン；セファ
ゾリンナトリウム；セフブペラゾン；セフジニル；セフェピム；塩酸セフェピム
；セフェテコール（Ｃｅｆｅｔｅｃｏｌ）；セフィキシム；塩酸セフメノキシム
；セフメタゾール；セフメタゾールナトリウム；セフォニシドモノナトリウム；
セフォニシドナトリウム；セフォペラゾンナトリウム；セフォラニド；セフォタ
キシムナトリウム；セフォテタン；セフォテタン二ナトリウム；塩酸セフォチア
ム；セフォキシチン；セフォキシチンナトリウム；セフピミゾール；セフピミゾ
ールナトリウム；セフピラミド；セフピラミドナトリウム；硫酸セフピローム；
セフポドキシム・プロキセチル；セフプロジル；セフロキサジン；セフスロジン
ナトリウム；セフタジジム；セフチブテン；セフチゾキシムナトリウム；セフト
リアキソンナトリウム；セフロキシム；セフロキシム・アキセチル；セフロキシ
ム・ピボキセチル；セフロキシムナトリウム；セファセトリルナトリウム；セフ
ァレキシン；塩酸セファレキシン；セファログリシン；セファロリジン；セファ
ロチンナトリウム；セファピリンナトリウム；セフラジン；塩酸セトサイクリン
；セトフェニコール；クロラムフェニコール；パルミチン酸クロラムフェニコー
ル；パントテン酸クロラムフェニコール複合体；コハク酸クロラムフェニコール
ナトリウム；クロルヘキシジンホスファニレート（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ
Ｐｈｏｓｐｈａｎｉｌａｔｅ）；クロロキシレノール；重硫酸クロルテトラサ
イクリン；塩酸クロルテトラサイクリン；シノキサシン；シプロフロキサシン；
塩酸シプロフロキサシン；シロレマイシン；クラリスロマイシン；塩酸クリナフ
ロキサシン（Ｃｌｉｎａｆｌｏｘａｃｉｎ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ク
リンダマイシン；塩酸クリンダマイシン；塩酸パルミチン酸クリンダマイシン；
リン酸クリンダマイシン；クロファジミン；クロキサシリンベンザチン；クロキ
サシリンナトリウム；クロキシキン（Ｃｌｏｘｙｑｕｉｎ）；コリスチメテート
・ナトリウム；硫酸コリスチン；クメルマイシン；クメルマイシンナトリウム；
サイクラシリン（Ｃｙｃｌａｃｉｌｌｉｎ）；サイクロセリン；ダルホプリスチ
ン（Ｄａｌｆｏｐｒｉｓｔｉｎ）；ダプソン（Ｄａｐｓｏｎｅ）；ダプトマイシ
ン；デメクロサイクリン；塩酸デメクロサイクリン；デメサイクリン；デノファ
ンギン（Ｄｅｎｏｆｕｎｇｉｎ）；ジアベリジン；ジクロキサシリン；ジクロキ
サシリンナトリウム；硫酸ジヒドロストレプトマイシン；ジピリチオン；ジリス
ロマイシン；ドキシサイクリン；ドキシサイクリンカルシウム；Ｄｏｘｙｃｙｃ
ｌｉｎｅ Ｆｏｓｆａｔｅｘ；Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ Ｈｙｃｌａｔｅ；ドキ
シサイクリンナトリウム；エノキサシン；エピシリン；塩酸エピテトラサイクリ
ン；エリスロマイシン；エリスロマイシンアシストラート；エストル酸エリスロ
マイシン；エチルコハク酸エリスロマイシン；グルセプト酸エリスロマイシン；
ラクトビオン酸エリスロマイシン；プロピオン酸エリスロマイシン；ステアリン
酸エリスロマイシン；塩酸エタンブトール；エチオナミド；フレロキサシン；フ
ロキサリシン；フルダラニン；フルメキン；ホスホマイシン；ホスホマイシント
ロメタミン；フモキシシリン；塩化フラゾリウム；酒石酸フラゾリウム；フシジ
ン酸ナトリウム；フシジン酸；硫酸ゲンタマイシン；グロキシモナム；グラミシ
ジン；ハロプロジン；ヘタシリン；ヘタシリンカリウム；ヘキセジン；イバフロ
キサシン；イミペネム；イソコナゾール；イセパマイシン；イソニアジド；ジョ
サマイシン；硫酸カナマイシン；キタサマイシン；レボフラルタドン；レボプロ
ピルシリン（Ｌｅｖｏｐｒｏｐｙｌｃｉｌｌｉｎ）カリウム；レキシスロマイシ
ン（Ｌｅｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）；リンコマイシン；塩酸リンコマイシン；ロ
メフロキサシン；塩酸ロメフロキサシン；メタンスルホン酸ロメフロキサシン；
ロラカルベフ；マフェニド；メクロサイクリン；スルホサリチル酸メクロサイク
リン；リン酸メガロミシンカリウム；メキドックス；メロペネム；メタサイクリ
ン；塩酸メタサイクリン；メテナミン；ヒプル酸メテナミン；マンデル酸メテナ
ミン；メチシリンナトリウム；メチオプリム；塩酸メトロニダゾール；リン酸メ
トロニダゾール；メズロシリン；メズロシリンナトリウム；ミノサイクリン；塩
酸ミノサイクリン；塩酸ミリンカマイシン；モネンシン；モネンシンナトリウム
；ナフシリンナトリウム；ナリジクス酸ナトリウム；ナリジクス酸；ナタマイシ
ン；ネブラマイシン；パルミチン酸ネオマイシン；硫酸ネオマイシン；ウンデシ
レン酸ネオマイシン；硫酸ネチルマイシン；ノイトラマイシン；ニフラデン；ニ
フラルデゾン；ニフラテル；ニフラトロン；ニフルダジル；ニフリミド；ニフル
ピリノール；ニフルキナゾール；ニフルチアゾール；ニトロサイクリン；ニトロ
フラントイン；ニトロミド（Ｎｉｔｒｏｍｉｄｅ）；ノルフロキサシン；ノボビ
オシンナトリウム；オフロキサシン；オルメトプリム；オキサリシンナトリウム
；オキシモナム；オキシモナムナトリウム；オキソリン酸；オキシテトラサイク
リン；オキシテトラサイクリンカルシウム；塩酸オキシテトラサイクリン；パル
ジマイシン；パラクロロフェノール；パウロマイシン；ペフロキサシン；メタン
スルホン酸ペフロキサシン；ペナメシリン；ペニシリンＧベンザチン；ペニシリ
ンＧカリウム；プロカインペニシリンＧ；ペニシリンＧナトリウム；ペニシリン
Ｖ；ペニシリンＶベンザチン；ヒドラバミンペニシリンＶ；ペニシリンＶカリウ
ム；ペンチジドンナトリウム；アミノサリチル酸フェニル；ピペラシリンナトリ
ウム；ピルベニシリンナトリウム；ピリジシリンナトリウム；塩酸ピルリマイシ
ン；塩酸ピバンピシリン；ピバンピシリンパモエート；ピバンピシリンプロベネ
ート；硫酸ポリミキシンＢ；ポルフィロマイシン；プロピカシン；ピラジナミド
；ピリチオン亜鉛（Ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ Ｚｉｎｃ）；酢酸キンデカミン；キ
ヌプリスチン（Ｑｕｉｎｕｐｒｉｓｔｉｎ）；ラセフェニコール；ラモプラニン
；ラニマイシン（Ｒａｎｉｍｙｃｉｎ）；レロマイシン；レプロミシン；リファ
ブチン；リファメタン；リファメキシル（Ｒｉｆａｍｅｘｉｌ）；リファミド；
リファンピン；リファペンチン；リファキシミン；ロリテトラサイクリン；硝酸
ロリテトラサイクリン；ロサラミシン（Ｒｏｓａｒａｍｉｃｉｎ）；酪酸ロサラ
ミシン；プロピオン酸ロサラミシン；リン酸ロサラミシンナトリウム；ステアリ
ン酸ロサラミシン；ロソキサシン；ロキサルソン；ロキシスロマイシン；サンサ
イクリン；サンフェトリネムナトリウム（Ｓａｎｆｅｔｒｉｎｅｍ Ｓｏｄｉｕ
ｍ）；サルモキシシリン；サルピシリン；スコパフンギン（Ｓｃｏｐａｆｕｎｇ
ｉｎ）；シソマイシン；硫酸シソマイシン；スパルフロキサシン；塩酸スペクチ
ノマイシン；スピラマイシン；塩酸スタリマイシン；ステッフィマイシン；硫酸
ストレプトマイシン；ストレプトニコジド；スルファベンズ；スルファベンザミ
ド；スルフアセタミド；スルフアセタミドナトリウム；スルファサイチン（Ｓｕ
ｌｆａｃｙｔｉｎｅ）；スルフアジアジン；スルフアジアジンナトリウム；スル
ファドキシン；スルファレン；スルファメラジン；スルファメーター（Ｓｕｌｆ
ａｍｅｔｅｒ）；スルファメタジン（Ｓｕｌｆａｍｅｔｈａｚｉｎｅ）；スルフ
ァメチゾール；スルファメトキサゾール；スルファモノメトキシン；スルファモ
クソール；スルファニレート亜鉛（Ｓｕｌｆａｎｉｌａｔｅ Ｚｉｎｃ）；スル
ファニトラン；スルファサラジン；スルファソミゾール；スルファチアゾール；
スルファザメット（Ｓｕｌｆａｚａｍｅｔ）；スルフイソキサゾール；スルフイ
ソキサゾールアセチル；スルフイソキサゾールジオラミン；スルホミキシン；ス
ロペネム（Ｓｕｌｏｐｅｎｅｍ）；スルタミシリン；サンシリンナトリウム；塩
酸タランピシリン；テイコプラニン；塩酸テマフロキサシン；テモシリン；テト
ラサイクリン；塩酸テトラサイクリン；リン酸テトラサイクリン複合体；テトロ
キソプリム；チアンフェニコール；チフェンシリンカリウム（Ｔｈｉｐｈｅｎｃ
ｉｌｌｉｎ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ）；チカルシリンクレシルナトリウム；チカル
シリン二ナトリウム；チカルシリン一ナトリウム；チクラトン；塩化チオドニウ
ム；トブラマイシン；硫酸トブラマイシン；トスフロキサシン；トリメトプリム
；硫酸トリメトプリム；トリスルファピリミジン（Ｔｒｉｓｕｌｆａｐｙｒｉｍ
ｉｄｉｎｅｓ）；トロレアンドマイシン；硫酸トロスペクトマイシン；タイロス
ライシン；バンコマイシン；塩酸バンコマイシン；バージニアマイシン；および
ゾルバマイシン。
【０２１７】 抗ウイルス剤は、ウイルスによる細胞の感染または細胞内のウイルスの複製を
防ぐ化合物である。抗菌薬物よりもずっと少ない抗ウイルス薬物が存在する。な
ぜなら、ウイルス複製の過程は、宿主細胞内でのＤＮＡ複製により密接に関連し
ており、非特異的な抗ウイルス剤は、しばしば宿主に対して毒性であるからであ
る。抗ウイルス剤によってブロックまたは阻害され得る、ウイルス感染の過程に
おけるいくつかの段階が存在する。これらの段階としては、ウイルスの宿主細胞
への結合（免疫グロブリンまたは結合ペプチド）、ウイルスの非被覆（例えば、
アマンタジン）、ウイルスｍＲＮＡの合成または翻訳（例えば、インターフェロ
ン）、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの複製（例えば、ヌクレオシドアナログ）、
新規なウイルスタンパク質の成熟（例えば、プロテアーゼインヒビター）、およ
びウイルスの出芽および放出が挙げられる。
【０２１８】 ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドに類似であるが、不完全または異常な
デオキシリボースおよびリボース基を有する合成化合物である。一旦、ヌクレオ
チドアナログが、細胞内に存在すると、このアナログは、リン酸化され、三リン
酸形態を産生する。この形態は、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡへの取り込みのた
めに正常なヌクレオチドと競合する。一旦、このヌクレオチドアナログの三リン
酸形態が成長中の核酸鎖に取り込まれると、ウイルスポリメラーゼと不可逆性の
結合を生じ、従って、鎖は終結する。ヌクレオチドアナログとしては、以下が挙
げられるが、これらに限定されない：アシクロビル（単純疱疹ウイルスおよび水
痘−帯状疱疹ウイルスの処置のために使用される）、ガンシクロビル（サイトメ
ガロウイルスの処置に有用である）、イドクスウリジン、リバビリン（ＲＳウイ
ルスの処置に有用である）、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、および
ジドブジン（アジドチミジン）。
【０２１９】 インターフェロンは、ウイルス感染細胞および免疫細胞によって分泌されるサ
イトカインである。インターフェロンは、感染細胞に近接する細胞上の特異的な
レセプターに結合することによって機能し、細胞における変化を生じる。この変
化は、ウイルスによる感染から細胞を防御する。α−インターフェロンおよびβ
−インターフェロンはまた、感染細胞の表面上のクラスＩ ＭＨＣ分子およびク
ラスＩＩ ＭＨＣ分子の発現を誘導し、宿主免疫細胞認識のための抗原提示の増
加を生じる。α−インターフェロンおよびβ−インターフェロンは、組換え形態
で利用可能であり、そして慢性Ｂ型肝炎感染および慢性Ｃ型肝炎感染の処置のた
めに使用されている。抗ウイルス治療のために効果的である投薬において、イン
ターフェロンは、重篤な副作用（例えば、熱、倦怠感および体重の損失）を有す
る。
【０２２０】 免疫グロブリン療法は、ウイルス感染の予防のために使用される。ウイルス感
染のための免疫グロブリン療法は、細菌感染とは異なる。なぜなら、抗原特異的
であるというよりはむしろ、この免疫グロブリン療法は、細胞外ビリオンに結合
し、そしてウイルス感染に感受性である細胞への結合および侵入からその細胞を
防御することによって機能する。この治療は、抗体が、宿主細胞に存在する期間
についてウイルス感染の予防に有用である。一般的には、２つの型の免疫グロブ
リン療法（正常な免疫グロブリン療法および高免疫グロブリン療法）が存在する
。正常な免疫グロブリン療法は、正常な血液ドナーの血清から調製され、そして
プールされる抗体産物を利用する。このプールされた産物は、広範囲のヒトウイ
ルス（例えば、Ａ型肝炎、パルボウイルス、エンテロウイルス（特に新生児にお
ける））に対する低力価の抗体を含む。高免疫グロブリン療法は、個体の血清か
ら調製される抗体（特定のウイルスに対する高力価の抗体を有する）を利用する
。次いで、これらの抗体は、特定のウイルスに対して使用される。高免疫グロブ
リンの例としては、帯状ヘルペス免疫グロブリン（免疫無防備状態の小児および
新生児における水痘の予防のために有用である）、ヒト狂犬病免疫グロブリン（
狂犬病動物によって噛まれた被験体の曝露後予防において有用である）、Ｂ型肝
炎免疫グロブリン（Ｂ型肝炎ウイルスの予防において有用である（特に、このウ
イルスに曝露された被験体において））、およびＲＳＶ免疫グロブリン（ＲＳウ
イルス感染の処置において有用である）が挙げられる。
【０２２１】 別の型の免疫グロブリン療法は、能動免疫である。これは、ウイルス表面タン
パク質に対する抗体または抗体フラグメントの投与を含む。Ｂ型肝炎の能動免疫
に利用可能な２つの型のワクチンとしては、血清誘導Ｂ型肝炎抗体および組換え
Ｂ型肝炎抗体が挙げられる。これらの両方は、ＨＢｓＡｇから調製される。これ
らの抗体は、Ｂ型肝炎ウイルスでの感染の高い危険性の被験体（例えば、医療従
事者、慢性のキャリアの性交渉の相手、および乳児）に３回の用量で投与される
。
【０２２２】 従って、本発明において有用である抗ウイルス剤としては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：免疫グロブリン、アマンタジン、インターフェロン
、ヌクレオシドアナログ、およびプロテアーゼインヒビター。抗ウイルス剤の特
定の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アセマンナン；
アシクロビル；アシクロビルナトリウム；アデホビル（Ａｄｅｆｏｖｉｒ）；ア
ロブジン（Ａｌｏｖｕｄｉｎｅ）；アルビルセプトスドトックス（Ａｌｖｉｒｃ
ｅｐｔ Ｓｕｄｏｔｏｘ）；塩酸アマンタジン；アラノチン；アリルドン；メタ
ンスルホン酸アテビルジン（Ａｔｅｖｉｒｄｉｎｅ）；アブリジン；シドホビル
（Ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）；シパムフィリン（Ｃｉｐａｍｆｙｌｌｉｎｅ）；塩酸
シタラビン；メタンスルホン酸デルアビルジン（Ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）；デ
スシクロビル；ジダノシン；ジソキサリル；エドクスジン；エンビラデン；エン
ビロキシム；ファムシクロビル；塩酸ファモチン；フィアシタビン；フィアルリ
ジン（Ｆｉａｌｕｒｉｄｉｎｅ）；ホサリラートホスカルネットナトリウム；フ
ォスフォネットナトリウム；ガンシクロビル；ガンシクロビルナトリウム；イド
クスウリジン；ケトキサール；ラミブジン（Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）；ロブカビ
ル（Ｌｏｂｕｃａｖｉｒ）；塩酸メモチン；メチサゾン；ネビラピン（Ｎｅｖｉ
ｒａｐｉｎｅ）；ペンシクロビル；ピロダビル（Ｐｉｒｏｄａｖｉｒ）；リバビ
リン；塩酸リマンタジン；メタンスルホン酸サクイナビル（Ｓａｑｕｉｎａｖｉ
ｒ Ｍｅｓｙｌａｔｅ）；塩酸ソマンタジン；ソリブジン（Ｓｏｒｉｖｕｄｉｎ
ｅ）；スタトロン（Ｓｔａｔｏｌｏｎ）；スタブジン（Ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）；
塩酸チロロン；トリフルリジン；塩酸バラシクロビル（Ｖａｌａｃｙｃｌｏｖｉ
ｒ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ビダラビン；リン酸ビダラビン；リン酸ビ
ダラビンナトリウム；ビロキシム；ザルシタビン（Ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）；
ジドブジン；およびジンビロキシム。
【０２２３】 抗真菌剤は、感染性真菌の処置および予防に有用である。抗真菌剤は、時々、
それらの作用機構によって分類される。いくつかの抗真菌剤は、グルコースシン
ターゼを阻害することによる細胞壁インヒビターとして機能する。これらのイン
ヒビターとしては、ｂａｓｉｕｎｇｉｎ／ＥＣＢが挙げられるが、これに限定さ
れない。他の抗真菌剤は、膜完全性を不安定化することによって機能する。これ
らの真菌剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イミダゾー
ル（例えば、クロトリマゾール、セルタコンゾール（ｓｅｒｔａｃｏｎｚｏｌｅ
）、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、およ
びボリコナコール（ｖｏｒｉｃｏｎａｃｏｌｅ））、ならびにＦＫ ４６３、ア
ンホテリシンＢ、ＢＡＹ ３８−９５０２、ＭＫ ９９１、プラジミシン（ｐｒ
ａｄｉｍｉｃｉｎ）、ＵＫ ２９２、ブテナフィン、およびテルビナフィン。他
の抗真菌剤は、キチン分解（例えば、キチナーゼ）または免疫抑制（５０１クリ
ーム）によって機能する。市販の薬剤のいくつかの例を、表Ｂに示す。
【０２２４】
【表２】 従って、本発明において有用な抗真菌剤としては、以下が挙げられるが、これ
らに限定されない：イミダゾール、ＦＫ ４６３、アンホテリシンＢ、ＢＡＹ
３８−９５０２、ＭＫ ９９１、プラジミシン、ＵＫ ２９２、ブテナフィン、
キチナーゼ、５０１クリーム、アクリソルシン；アンブルチシン；アモロルフィ
ン、アンホテリシン Ｂ；アザコナゾール；アザセリン；バシフンギン（Ｂａｓ
ｉｆｕｎｇｉｎ）；ビフォナゾール；塩酸ビフェンアミン（Ｂｉｐｈｅｎａｍｉ
ｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；Ｂｉｓｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ Ｍａｇｓ
ｕｌｆｅｘ；硝酸ブトコナゾール；ウンデシレン酸カルシウム；カンジシジン；
石炭酸フクシン；クロルダントイン；シクロピロックス；シクロピロックスオラ
ミン；シロフンギン；シスコナゾール；クロトリマゾール；クプリミキシン；デ
ノフンギン；ジピリチオン；ドコナゾール；エコナゾール；硝酸エコナゾール；
エニルコナゾール；硝酸エトナム；硝酸フェンチコナゾール；フィリピン；フル
コナゾール；フルシトシン；フンジマイシン（Ｆｕｎｇｉｍｙｃｉｎ）；グリセ
オフルビン；ハマイシン；イソコナゾール；イトラコナゾール；カラフンギン；
ケトコナゾール；ロモフンギン（Ｌｏｍｏｆｕｎｇｉｎ）；リジマイシン；メパ
ルトリシン；ミコナゾール；硝酸ミコナゾール；モネンシン；モネンシンナトリ
ウム；塩酸ナフチフィン；ウンデシレン酸ネオマイシン；ニフラテル；ニフルメ
ロン；塩酸ニトララミン（Ｎｉｔｒａｌａｍｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄ
ｅ）；ナイスタチン；オクタン酸；硝酸オルコナゾール；硝酸オキシコナゾール
；塩酸オキシフンジン；塩酸パルコナゾール；パルトリシン；ヨウ化カリウム；
プロクロノール；ピリチオン亜鉛（Ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ Ｚｉｎｃ）；ピロー
ルニトリン；ルタマイシン；塩化サングイナリウム（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉｕｍ
Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；サペルコナゾール；スコパフンギン（Ｓｃｏｐａｆｕｎ
ｇｉｎ）；硫化セレン；シネフンギン；硝酸スルコナゾール；テルビナフィン；
テルコナゾール（Ｔｅｒｃｏｎａｚｏｌｅ）；チラム；チクラトン；チオコナゾ
ール；トルシクラート；トリンダート；トルナフテート；トリアセチン；トリア
フンギン；ウンデシレン酸；ビリドフルビン；ウンデシレン酸亜鉛；および塩酸
ジノコナゾール。
【０２２５】 免疫刺激核酸は、他の治療剤（例えば、免疫応答を増強するアジュバント）と
組み合わされ得る。免疫刺激核酸および他の治療剤は、同時に、または連続的に
投与され得る。他の治療剤が、同時に投与される場合、これらの薬剤は、同一の
処方物または別個の処方物の状態で投与され得るが、同時に投与される。他の治
療剤および免疫刺激核酸の投与が、一時的に別々にされる場合、他の治療剤は、
互いに、そして免疫刺激核酸と別々に投与される。これらの化合物の投与の間の
時間の分離は、せいぜい分単位であり得るか、より長い時間であり得る。他の治
療剤としては、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原などが挙げられるが、
これらに限定されない。
【０２２６】 免疫刺激核酸は、全身性の免疫応答を誘導するためにアジュバントとして有用
である。従って、どちらも、抗原に対する増強された免疫応答を産生するために
抗原に曝された被験体に送達され得る。
【０２２７】 免疫刺激核酸に加えて、本発明の組成物はまた、非核酸アジュバントとともに
投与され得る。非核酸アジュバントは、体液性免疫応答および／または細胞性免
疫応答を刺激し得る、本明細書中に記載の免疫刺激核酸を除く任意の分子または
化合物であり得る。非核酸アジュバントとしては、例えば、デポー（ｄｅｐｏ）
効果を生じるアジュバント、免疫刺激性アジュバント、ならびにデポー効果を生
じ、かつ免疫系を刺激するアジュバントが挙げられる。
【０２２８】 デポー効果を引き起こすアジュバントは、本明細書中で使用される場合、抗原
が体内でゆっくりと放出され、従って免疫細胞の抗原への曝露を長くするのを引
き起こすアジュバントである。このクラスのアジュバントとしては、ミョウバン
（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）；またはＭｏｎｔａｎｉ
ｄｅアジュバントのＳｅｐｐｉｃ ＩＳＡシリーズ（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄ
ｅ ＩＳＡ ７２０、ＡｉｒＬｉｑｕｉｄｅ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）；Ｍ
Ｆ−５９（Ｓｐａｎ ８５およびＴｗｅｅｎ ８０で安定化した水中スクアレン
エマルジョン；Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ
、ＣＡ）；およびＰＲＯＶＡＸ（安定剤およびミセル形成剤を含む水中油型エマ
ルジョン；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のような、鉱油、非鉱油、油中水型または油中
水中油型エマルジョン、水中油型エマルジョンを含む、エマルジョンに基づく処
方物が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２９】 免疫刺激アジュバントは、免疫系細胞の活性化を引き起こすアジュバントであ
る。例えば、それは免疫細胞にサイトカインを産生および分泌させ得る。このク
ラスのアジュバントとしては、ＱＳ２１（ＨＰＬＣ分画で２１番目のピークに溶
出される糖脂質；Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎ
ｃ．、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）のような、Ｑ．ｓａｐｏｎａｒｉａの木の樹
皮から精製されたサポニン；ポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファ
ゼン（ｐｏｌｙ［ｄｉ（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｈｏｓｐｈ
ａｚｅｎｅ）（ＰＣＰＰポリマー；Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ、ＵＳＡ）；モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ；Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎ
ｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ムラミ
ルジペプチド（ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）およびスレオニル−ムラミルジペプチド（ｔ
−ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）のような、リポポリサッカライドの誘導体；ＯＭ−１７４
（リピドＡに関連するグルコサミンジサッカライド；ＯＭ Ｐｈａｒｍａ ＳＡ
、Ｍｅｙｒｉｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；およびＬｅｉｓｈｍａｎｉａ伸長
因子（精製Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａタンパク質；Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３０】 デポー効果を引き起こし、そして免疫系を刺激するアジュバントは、上記で同
定した機能を両方有する化合物である。このクラスのアジュバントとしては、Ｉ
ＳＣＯＭＳ（混合サポニン、脂質を含む免疫刺激複合体であり、そして抗原を保
持し得る孔を有するウイルスの大きさの粒子を形成する；ＣＳＬ、Ｍｅｌｂｏｕ
ｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）；ＳＢ−ＡＳ２（ＭＰＬおよびＱＳ２１を含む水
中油型エマルジョンであるＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍアジュバント
システム＃２；ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓ［ＳＢＢ］、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）；ＳＢ−ＡＳ４（ミョウ
バンおよびＭＰＬを含むＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍアジュバントシ
ステム＃４；ＳＢＢ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）；ＣＲＬ １００５（これらは、ポリオ
キシエチレン鎖に隣接した疎水性ポリオキシプロピレン（ｐｏｌｙｏｘｐｒｏｐ
ｙｌｅｎｅ）の直鎖を含む；Ｖａｘｃｅｌ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ
）のようなミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー；およびＳｙｎｔｅ
ｘ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ（ＳＡＦ、Ｔｅｗｅｅｎ ８０
および非イオン性ブロックコポリマーを含む水中油型エマルジョン；Ｓｙｎｔｅ
ｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）が挙げられるがこ
れらに限定されない。
【０２３１】 免疫刺激核酸はまた、粘膜アジュバントとして有用である。全身性免疫および
粘膜免疫は両方ともＣｐＧ核酸の粘膜送達によって誘導されることが、以前発見
された。ＣｐＧ核酸に応じて誘導される全身性免疫は、単独で粘膜に投与された
場合に全身性免疫を誘導できなかった特定の抗原に対する体液性応答および細胞
性応答の両方を含んでいた。さらに、ＣｐＧ核酸およびコレラ毒素（ＣＴ、Ｔｈ
２様応答を誘導する粘膜アジュバント）は両方ともＣＴＬを誘導した。全身性免
疫に関しては、Ｔｈ２様抗体の存在は通常ＣＴＬの欠如と関連するので、これは
驚くべきことであった（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋら、１９９５）。本明細書中に提
示される結果に基づいて、免疫刺激核酸が、類似の様式において機能することが
予期される。
【０２３２】 さらに、免疫刺激核酸は、局所粘膜部位（例えば、肺）および離れた粘膜部位
（例えば、下部消化管）の両方において粘膜応答を誘導する。ＩｇＡ抗体の有意
なレベルが、免疫刺激核酸により、末端の粘膜部位に誘導される。ＣＴは一般的
に非常に有効な粘膜アジュバントであると判断される。ＣｐＧオリゴヌクレオチ
ドがＣＴに優る別の方法は、応答のＴｈ型に関するものであった。以前に報告さ
れたように（Ｓｎｉｄｅｒ １９９５）、ＣＴは主に、Ｔｈ２型の応答を示す、
抗体のＩｇＧ１アイソタイプを誘導する。対照的に、免疫刺激核酸は、特に追加
免疫後、または２つのアジュバントを組み合わせた場合、主にＩｇＧ２ａ抗体を
伴う、よりＴｈ１である。一般的に、Ｔｈ１型抗体は、より良い中和能力を有し
、そしてさらに、肺におけるＴｈ２応答は、喘息と関連するので非常に望ましく
ない（Ｋａｙ、１９９６、Ｈｏｇｇ、１９９７）。従って、粘膜アジュバントと
して免疫刺激核酸の使用は、他の粘膜アジュバントが達成できない利点を有する
。本発明の免疫刺激核酸はまた、全身性免疫応答および粘膜免疫応答の両方を誘
導するための粘膜アジュバントとして有用である。
【０２３３】 非核酸粘膜アジュバントと呼ばれる粘膜アジュバントも、免疫刺激核酸と共に
投与され得る。非核酸粘膜アジュバントは、本明細書中で使用される場合、粘膜
表面に抗原と共に投与された場合に被験体において粘膜免疫応答を誘導できる、
免疫刺激核酸以外のアジュバントである。粘膜アジュバントとしては、細菌毒素
：例えばコレラ毒素（ＣＴ）、ＣＴ Ｂサブユニット（ＣＴＢ）（Ｗｕら、１９
９８、Ｔｏｃｈｉｋｕｂｏら、１９９８）；ＣＴＤ５３（ＶａｌからＡｓｐ）（
Ｆｏｎｔａｎａら、１９９５）；ＣＴＫ９７（ＶａｌからＬｙｓ）（Ｆｏｎｔａ
ｎａら、１９９５）；ＣＴＫ１０４（ＴｙｒからＬｙｓ）（Ｆｏｎｔａｎａら、
１９９５）；ＣＴＤ５３／Ｋ６３（ＶａｌからＡｓｐ、ＳｅｒからＬｙｓ）（Ｆ
ｏｎｔａｎａら、１９９５）；ＣＴＨ５４（ＡｒｇからＨｉｓ）（Ｆｏｎｔａｎ
ａら、１９９５）；ＣＴＮ１０７（ＨｉｓからＡｓｎ）（Ｆｏｎｔａｎａら、１
９９５）；ＣＴＥ１１４（ＳｅｒからＧｌｕ）（Ｆｏｎｔａｎａら、１９９５）
；ＣＴＥ１１２Ｋ（ＧｌｕからＬｙｓ）（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９７ａ）；
ＣＴＳ６１Ｆ（ＳｅｒからＰｈｅ）（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９７ａ、１９９
７ｂ）；ＣＴＳ１０６（ＰｒｏからＬｙｓ）（Ｄｏｕｃｅら、１９９７、Ｆｏｎ
ｔａｎａら、１９９５）；およびＣＴＫ６３（ＳｅｒからＬｙｓ）（Ｄｏｕｃｅ
ら、１９９７、Ｆｏｎｔａｎａら、１９９５）を含むがこれらに限定されないＣ
Ｔ誘導体、閉鎖帯毒素、ｚｏｔ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ熱不安定エ
ンテロトキシン、不安定毒素（ＬＴ）、ＬＴ Ｂサブユニット（ＬＴＢ）（Ｖｅ
ｒｗｅｉｊら、１９９８）；ＬＴ７Ｋ（ＡｒｇからＬｙｓ）（Ｋｏｍａｓｅら、
１９９８、Ｄｏｕｃｅら、１９９５）；ＬＴ６１Ｆ（ＳｅｒからＰｈｅ）（Ｋｏ
ｍａｓｅら、１９９８）；ＬＴ１１２Ｋ（ＧｌｕからＬｙｓ）（Ｋｏｍａｓｅら
、１９９８）；ＬＴ１１８Ｅ（ＧｌｙからＧｌｕ）（Ｋｏｍａｓｅら、１９９８
）；ＬＴ１４６Ｅ（ＡｒｇからＧｌｕ）（Ｋｏｍａｓｅら、１９９８）；ＬＴ１
９２Ｇ（ＡｒｇからＧｌｙ）（Ｋｏｍａｓｅら、１９９８）；ＬＴＫ６３（Ｓｅ
ｒからＬｙｓ）（Ｍａｒｃｈｅｔｔｉら、１９９８、Ｄｏｕｃｅら、１９９７、
１９９８、Ｄｉ Ｔｏｍｍａｓｏら、１９９６）；およびＬＴＲ７２（Ａｌａか
らＡｒｇ）（Ｇｉｕｌｉａｎｉら、１９９８）を含むがこれらに限定されないＬ
Ｔ誘導体、ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９５、Ｃｒｏｐｌｅ
ｙら、１９９５）を含む百日咳毒素ＰＴ（Ｌｙｃｋｅら、１９９２、Ｓｐａｎｇ
ｌｅｒ ＢＤ、１９９２、ＦｒｅｙｔａｇおよびＣｌｅｍｍｅｎｔｓ、１９９９
、Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９５、Ｗｉｌｓｏｎら、１９９５）；毒素誘導体（下
記参照）（Ｈｏｌｍｇｒｅｎら、１９９３、Ｖｅｒｗｅｉｊら、１９９８、Ｒａ
ｐｐｕｏｌｉら、１９９５、ＦｒｅｙｔａｇおよびＣｌｅｍｅｎｔｓ、１９９９
）；リピドＡ誘導体（例えば、モノホスホリルリピドＡ、ＭＰＬ）（Ｓａｓａｋ
ｉら、１９９８、Ｖａｎｃｏｔｔら、１９９８）；ムラミルジペプチド（ＭＤＰ
）誘導体（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら、１９９６、Ｏｇａｗａら、１９８９、Ｍｉｃ
ｈａｌｅｋら、１９８３、Ｍｏｒｉｓａｋｉら、１９８３）；細菌外膜タンパク
質（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの外表面タンパク質Ａ
（ＯｓｐＡ）リポタンパク質、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ
の外膜タンパク質）（Ｍａｒｉｎａｒｏら、１９９９、Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｒｇ
ら、１９９６）；水中油型エマルジョン（例えば、ＭＦ５９）（Ｂａｒｃｈｆｉ
ｅｌｄら、１９９９、Ｖｅｒｓｃｈｏｏｒら、１９９９、Ｏ’Ｈａｇａｎ、１９
９８）；アルミニウム塩（Ｉｓａｋａら、１９９８、１９９９）；およびサポニ
ン（例えば、ＱＳ２１；Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
，Ｉｎｃ．、Ｗｏｒｓｔｅｒ、ＭＡ）（Ｓａｓａｋｉら、１９９８、ＭａｃＮｅ
ａｌら、１９９８）、ＩＳＣＯＭＳ、ＭＦ−５９（Ｓｐａｎ ８５およびＴｗｅ
ｅｎ ８０で安定化された水中スクアレンエマルジョン；Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）；Ｍｏｎｔａｎｉｄｅアジュ
バントのＳｅｐｐｉｃ ＩＳＡシリーズ（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ
７２０；ＡｉｒＬｉｑｕｉｄｅ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）；ＰＲＯＶＡＸ
（安定化洗剤およびミセル形成剤を含む水中油型エマルジョン；ＩＤＥＣ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、
ＣＡ）；Ｓｙｎｔｅｘ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ（ＳＡＦ；
Ｓｙｎｔｅｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）；ポリ
［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー、Ｖｉｒ
ｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＳＡ）およびＬｅｉｓｈｍａ
ｎｉａ伸長因子（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗ
Ａ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３４】 免疫応答はまた、サイトカイン（ＢｕｅｌｅｒおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、１９
９６；Ｃｈｏｗら、１９９７；Ｇｅｉｓｓｌｅｒら、１９９７；Ｉｗａｓａｋｉ
ら、１９９７；Ｋｉｍら、１９９７）またはＢ−７補助的刺激分子（Ｉｗａｓａ
ｋｉら、１９９７；Ｔｓｕｊｉら、１９９７）と免疫刺激核酸との同時投与また
は同一線上の（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒ）発現によって誘導または増強され得る。サ
イトカインは、免疫刺激核酸と共に直接投与され得るか、またはサイトカインが
インビボで発現し得るように、サイトカインをコードする核酸ベクターの形態で
投与され得る。１つの実施態様では、サイトカインはプラスミド発現ベクターの
形態で投与される。サイトカインという用語は、ナノからピコモル濃度の濃度で
体液性レギュレーターとして作用し、そして正常な状態または病的状態のいずれ
かにおいて個々の細胞および組織の機能的活性を調節する、多様なグループの可
溶性のタンパク質およびペプチドの一般名として使用される。これらのタンパク
質はまた、直接細胞間の相互作用を媒介し、そして細胞外環境で起こるプロセス
を調節する。サイトカインの例としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ
−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８
、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー
刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（γ−ＩＦＮ）、ＩＦＮ−α、
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＧＦ−β、ＦＬＴ−３リガンドおよびＣＤ４０リガ
ンドが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３５】 サイトカインは、Ｔ細胞応答の指示において役割を果たしている。ヘルパー（
ＣＤ４＋）Ｔ細胞は、他のＴ細胞を含む他の免疫系細胞に対して作用する可溶性
因子の産生を通して、哺乳動物の免疫応答を組み合わせる。最も成熟したＣＤ４
＋Ｔヘルパー細胞は、Ｔｈ１またはＴｈ２の、２つのサイトカインプロフィール
の１つを発現する。Ｔｈ１細胞は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、
ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、および低レベルのＴＮＦ−
αを発現する。Ｔｈ１サブセットは、遅延型過敏症、細胞媒介性免疫、およびＩ
ｇＧ2aへの免疫グロブリンのクラススイッチを促進する。Ｔｈ２サブセットは、
Ｂ細胞の活性化、抗体産生の促進、およびＩｇＧ1からＩｇＥへのクラススイッ
チ誘導によって、体液性免疫を誘導する。いくつかの実施態様では、サイトカイ
ンはＴｈ１サイトカインであることが好ましい。
【０２３６】 核酸はまた、Ｔｈ２免疫応答からＴｈ１免疫応答へと、免疫応答を向けなおす
のにも有用である。Ｔｈ２免疫応答からＴｈ１免疫応答への免疫応答の向けなお
しは、核酸に応じて産生されるサイトカインレベルを測定することによって（例
えば、単球細胞および他の細胞を、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳ
Ｆを含むＴｈ１サイトカインを産生するように誘導することによって）評価され
得る。Ｔｈ２応答からＴｈ１応答への免疫応答の向けなおしは、喘息の治療また
は予防に特に有用である。例えば、喘息の治療に有効な量は、喘息に関連するＴ
ｈ２型免疫応答を、Ｔｈ１型の応答へと向けなおすのに有用な量であり得る。Ｔ
ｈ２サイトカイン、特にＩＬ−４およびＩＬ−５は、喘息被験体の気道で上昇し
ている。これらのサイトカインは、ＩｇＥアイソタイプのスイッチ、好酸球の走
化性および活性化、ならびに肥満細胞の増殖を含む、喘息の炎症性応答の重要な
局面を促進する。Ｔｈ１サイトカイン、特にＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２は、Ｔ
ｈ２クローンの形成およびＴｈ２サイトカインの産生を抑制し得る。本発明の免
疫刺激核酸は、免疫系を再び釣り合わせることを助けるＴｈ１サイトカインの増
大を引き起こし、優勢なＴｈ２免疫応答と関連する有害な効果を予防するかまた
は低減する。
【０２３７】 核酸はまた、樹状細胞の、細胞生存、分化、活性化および成熟を改善するのに
有用である。免疫刺激核酸は、樹状細胞の細胞生存、分化、活性化および成熟を
促進する独特の能力を有する。免疫磁性細胞選別によって血液から単離された樹
状前駆細胞は、ＧＭ−ＣＳＦを伴って２日間インキュベーションする間に、樹状
細胞の形態的および機能的特徴を発達させる。ＧＭ−ＣＳＦ無しでは、これらの
細胞はアポトーシスを受ける。免疫刺激核酸は、樹状細胞の生存および分化を促
進することにおいて、ＧＭ−ＣＳＦに優る（ＭＨＣ ＩＩ発現、細胞の大きさ、
粒度）。免疫刺激核酸はまた、樹状細胞の成熟を誘導することが見出された。樹
上細胞は、抗原を提示すること、および局所の環境でＬＰＳのような微生物分子
を検出するパターン認識レセプターの発現によって、先天的免疫系と後天的免疫
系との間にリンクを形成するので、免疫刺激核酸で樹状細胞を活性化する能力は
、癌およびアレルギー性疾患または感染性疾患のような障害に対するインビボま
たはエキソビボでの免疫治療のために、これらの免疫刺激核酸に基づく戦略の使
用を支持する。免疫刺激核酸はまた、樹状細胞の活性化および成熟誘導にも有用
である。
【０２３８】 免疫刺激核酸はまた、ナチュラルキラー細胞溶解活性および抗体依存性細胞傷
害性（ＡＤＣＣ）を増加させる。ＡＤＣＣは、免疫刺激核酸を、ガン細胞のよう
な細胞標的に特異的な抗体と組み合わせて使用して実施され得る。免疫刺激核酸
がこの抗体と組み合わせて被験体に投与される場合、被験体の免疫系は腫瘍細胞
を殺傷するように誘導される。ＡＤＣＣ手順で有用な抗体は、体内で細胞と相互
作用する抗体を含む。細胞標的に特異的なそのような多くの抗体が当該分野で記
載され、そして多くが市販されている。これらの抗体の例は、癌の免疫治療のリ
ストの中で、以下に記載される。
【０２３９】 免疫刺激核酸はまた、抗癌治療と組み合わされて投与され得る。抗癌治療とし
ては、癌医薬、放射線および外科的手順が挙げられる。本明細書中に使用される
場合、「癌医薬」は、癌を処置する目的のために被験体に投与される薬剤をいう
。本明細書中で使用される場合、「癌を処置すること」としては、癌の発症の予
防、癌の症状の低減、および／または確立された癌の成長を阻害することが挙げ
られる。他の局面において、癌医薬は、癌を発症する危険を低減する目的のため
に、癌を発症する危険のある被験体に投与される。癌の処置のための医薬の種々
の型が、本明細書中に記載される。この明細書の目的のために、癌の医薬が、化
学療法剤、免疫療法剤、癌ワクチン、ホルモン療法、および生物学的応答モディ
ファイアーとして分類される。
【０２４０】 本明細書中で使用される場合、「癌医薬」は、癌を処置する目的のために被験
体に投与される薬剤をいう。本明細書中で使用される場合、「癌を処置すること
」としては、癌の発症を予防すること、癌の症状を低減すること、および／また
は確立された癌の成長を阻害することが挙げられる。他の局面において、癌医薬
は、癌を発症する危険を低減する目的のために、癌を発症する危険のある被験体
に投与される。癌の処置のための医薬の種々の型が、本明細書中に記載される。
この明細書の目的のために、癌の医薬が、化学療法剤、免疫療法剤、癌ワクチン
、ホルモン療法、および生物学的応答の調節剤として分類される。さらに、本発
明の方法は、免疫刺激核酸を伴って、１つより多くの癌医薬の使用を包含するこ
とが意図される。例として、適切な場合、免疫刺激核酸は、化学療法剤および免
疫療法剤の両方と共に投与され得る。あるいは、癌医薬は、免疫療法剤および癌
ワクチン、または化学療法剤および癌ワクチン、または化学療法剤、免疫療法剤
および癌ワクチンを包含し、これら全ては、癌を有するかまたは癌を発症する危
険のある被験体を処置する目的のために、１被験体に投与され得る。
【０２４１】 癌医薬は、種々の方法において機能する。いくつかの癌の医薬は、腫瘍細胞に
特異的である生理学的機構を標的化することにより働く。例としては、癌におい
て変異する特異的遺伝子およびそれらの遺伝子産物（すなわち、主にタンパク質
）の標的化が挙げられる。このような遺伝子としては、オンコジーン（例えば、
Ｒａｓ、Ｈｅｒ２、ｂｃｌ−２）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＥＧＦ、ｐ５３、
Ｒｂ）、および細胞サイクル標的（例えば、ＣＤＫ４、ｐ２１、テロメアーゼ）
が挙げられるが、これらに限定されない。癌医薬は、癌細胞において変更される
シグナル形質導入経路および分子機構を代わりに標的化し得る。これらの細胞表
面上に発現されるエピトープを介して、癌細胞の標的化は、モノクローナル抗体
の使用を介して達成される。癌医薬のこの後者の型は、免疫治療として本明細書
中において一般に言及される。
【０２４２】 他の癌医薬は、癌細胞以外の細胞を標的化する。例えば、いくつかの医薬は、
腫瘍細胞（すなわち、癌ワクチン）を攻撃するために免疫系をプライムする。新
脈管形成インヒビターと呼ばれる、なお他の医薬は、固形腫瘍の血液供給を攻撃
することにより機能する。ほとんどの悪性癌は、転移し得るので（すなわち、主
な腫瘍部位に存在し、そして末端組織に播種し、それにより、２次腫瘍を形成す
る）、この転移を妨げる医薬品はまた、癌の処置に有用である。脈管形成メディ
エイタとしては、塩基性ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、アンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐ
ｏｉｅｔｉｎ）、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチ
ン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＴＮＦα、ＴＮＰ−４７０、トロンボスポンジン
−１、血小板第４因子、ＣＡＩ、およびタンパク質のインテグリンファミリーの
特定のメンバーが挙げられる。医薬品のこの型の１つのカテゴリーは、メタロプ
ロテイナーゼインヒビターであり、これは、主な腫瘍部位に存在し、そして別の
組織に溢出するために、癌細胞により使用される酵素を阻害する。
【０２４３】 いくつかの癌細胞は、抗原性であり、従って、免疫系により標的化され得る。
１つの局面において、免疫刺激核酸および癌医薬の組合された投与（特に、癌の
免疫療法として分類されるもの）が、癌抗原に対する特異的な免疫応答を刺激す
るために有用である。本明細書中で使用される「癌抗原」は、腫瘍または癌細胞
の表面に会合する化合物（例えば、ペプチド）であり、そしてこの化合物は、Ｍ
ＨＣ分子に関連する抗原提示細胞の表面上に発現された場合に免疫応答を引き起
こし得る。癌抗原（例えば、癌ワクチンに存在する抗原または癌免疫療法を調製
するために使用される抗原）は、癌細胞の粗抽出物から調製され得るか（Ｃｏｈ
ｅｎら、１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４：１０５５に記載さ
れるように）、あるいはこの抗原を部分的に精製するか、組換え技術を使用する
か、または既知の抗原のデノボ合成によって、調製され得る。癌抗原は、特定の
抗原の免疫原性部分の形態で使用され得るか、またはある場合、細胞全体もしく
は腫瘍の塊が、抗原として使用され得る。このような抗原は、組換え的にもしく
は当該分野で公知の任意の他の手段によって、単離され得るかまたは調製され得
る。
【０２４４】 免疫サーベイランスの理論は、腫瘍形成の前に免疫系のプライム機能が検出さ
れ、そして腫瘍性細胞を排除することである。この理論の基本的原理は、癌細胞
が正常細胞とは抗原的に異なること、従って免疫学的に非適合性の同種移植片の
拒絶を引き起こす反応と類似の免疫反応を惹起することである。研究は、腫瘍細
胞が、定性的にも定性的にも、その抗原の発現が異なることを確認した。例えば
、「腫瘍特異的抗原」とは、腫瘍細胞と特異的に会合するが正常細胞とは会合し
ない抗原である。腫瘍特異的抗原の例は、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスによって
誘導される、腫瘍中のウイルス抗原である。「腫瘍関連」抗原は、腫瘍細胞と正
常細胞との両方に存在するが、腫瘍細胞において異なる量または異なる形態で存
在する。このような抗原の例は、腫瘍胎児性抗原（例えば、癌胎児抗原）、分化
抗原（例えば、Ｔ抗原およびＴｎ抗原）、ならびに癌遺伝子産物（例えば、ＨＥ
Ｒ／ｎｅｕ）である。
【０２４５】 インビトロおよびインビボで腫瘍標的を殺傷し得る、異なる型の細胞が、同定
された：ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、細胞溶解Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、
リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、および活性化マクロファージ。ＮＫ
細胞は、特異的抗原に対して先に感作されることなく、腫瘍細胞を殺傷し得、そ
してその活性は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によってコードされるク
ラスＩ抗原が標的細胞に存在することを必要としない。ＮＫ細胞は、発生期の腫
瘍の制御、および転移性増殖の制御に関与すると考えられる。ＮＫ細胞と対照的
に、ＣＴＬは、これらが腫瘍抗原に対して感作された後にのみ、かつ標的抗原が
ＭＨＣクラスＩをもまた発現する腫瘍細胞において発現される場合にのみ、腫瘍
細胞を殺傷し得る。ＣＴＬは、移植された腫瘍、およびＤＮＡウイルスによって
引き起こされた腫瘍の拒絶における、エフェクター細胞であると考えられる。Ｌ
ＡＫ細胞は、ＮＫ集団およびＣＴＬ集団とは異なるヌルリンパ球のサブセットで
ある。活性化されたマクロファージは、一旦活性化されると、抗原依存性の様式
でもＭＨＣに制限される様式でもない様式で、腫瘍細胞を殺傷し得る。活性化さ
れたマクロファージは、これらが浸潤する腫瘍の増殖速度を低下させると考えら
れる。インビトロアッセイは、抗体依存性の、細胞媒介性の細胞傷害性反応、な
らびに抗体および相補体による溶解のような、他の免疫機構を同定した。しかし
、これらの免疫エフェクター機構は、インビボにおけるＮＫ、ＣＴＬ、ＬＡＫ、
およびマクロファージの機能ほどには、インビボにおいて重要ではないと考えら
れる（概説については、Ｐｉｅｓｓｅｎｓ，Ｗ．Ｆ．、およびＤａｖｉｄ，Ｊ．
，「Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第２巻、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｂｏｏｋｓ，Ｎ．Ｙ．，１−１３頁，１９９６を参照のこと）。
【０２４６】 免疫療法の目的は、樹立された腫瘍に対する患者の免疫応答を増大させること
である。免疫療法の１つの方法は、アジュバントの使用を含む。アジュバント物
質は、微生物（例えば、カルメット−ゲラン杆菌）由来であり、免疫応答を高め
、そして動物において腫瘍に対する抵抗性を増強する。
【０２４７】 免疫療法剤は、癌抗原を特異的に結合または認識する、抗体または抗体フラグ
メント由来の医薬である。本明細書中において使用される場合に、癌抗原とは、
癌細胞によって発現される抗原と広義に定義される。好ましくは、この抗原は、
癌細胞の細胞表面において発現される。なおより好ましくは、この抗原は、正常
細胞によっては発現されないか、または少なくとも癌細胞と同程度のレベルでは
発現されない、抗原である。抗体に基づく免疫療法は、癌細胞の細胞表面への結
合によって機能し得、そしてこれによって、癌細胞を攻撃するための内因性免疫
系を刺激し得る。抗体に基づく治療が機能する別の様式は、癌細胞への毒性物質
の特異的標的化のための、送達系としてである。抗体は、通常、リシン（例えば
、トウゴマ由来）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）およびマ
イタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）のような毒素、ヨウ素−１３１お
よびイットリウム−９０のような放射性同位体、化学療法剤（本明細書中に記載
されるような）、または生物学的応答改変剤と結合体化する。この様式で、毒性
物質は、癌の領域において濃縮され得、そして正常細胞に対する非特異的毒性は
、最小化され得る。癌抗原に対して特異的な抗体の使用に加えて、脈管構造に結
合する抗体（例えば、内皮細胞に結合する抗体）もまた、本発明において有用で
ある。このことは、固形腫瘍が一般に、生存のために新たに形成された血管に依
存すること、従って大部分の腫瘍が、新たな血管の増殖を漸増および刺激し得る
ことに起因する。その結果、多くの癌医薬の１つのストラテジーは、腫瘍に供給
する血管および／またはこのような血管を支持する結合組織（もしくは支質）を
攻撃することである。
【０２４８】 免疫刺激核酸を、免疫療法剤（例えば、モノクローナル抗体）と組み合わせて
使用することは、多数の機構（ＡＤＣＣの有意な増強（上記のような）、ナチュ
ラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化およびＩＦＮαのレベルの増加を含む）を介し
て、長期間の生存の増加を可能にする。核酸は、モノクローナル抗体と組み合わ
せて使用される場合には、生物学的結果を達成するために必要とされる抗体の用
量を減少させるよう働く。
【０２４９】 現在使用されているか、または現在開発中である、癌免疫療法の例を、表Ｃに
列挙する。
【０２５０】
【表３】 本発明によって使用され得る、なお他の型の化学療法剤としては、アミノグル
テチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル
（Ｃｈｌｏｒｏｍｂｕｃｉｌ）、シタラビンＨＣＩ、ダクチノマイシン、ダウノ
ルビシンＨＣｌ、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−
２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒ
ドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンα
−２ａ、α−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ関連因子アナログ）、ロムスチ
ン（ＣＣＮＵ）、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルカプ
トプリン、メスナ（Ｍｅｓｎａ）、ミトーテン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、塩酸ミト
ザントロン、オクトレオチド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプ
トゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラス
チン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリトロポエチン（Ｅｒ
ｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキ
ン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニジル
ヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セ
ムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）およびビンデシンス
ルフェートが挙げられる。
【０２５１】 癌ワクチンは、癌細胞に対する内因性免疫応答を刺激するよう意図された医薬
である。現在製造されるワクチンは、優先的に、体液性免疫系（すなわち、抗体
依存性免疫応答）を活性化する。現在開発中の他のワクチンは、細胞媒介性免疫
応答を活性化することに焦点を当てられる（腫瘍細胞を殺傷し得る細胞傷害性Ｔ
リンパ球を含む）。癌ワクチンは、一般に、両方の抗原提示細胞（例えば、マク
ロファージおよび樹状細胞）に対する癌抗原、ならびに／または他の免疫細胞（
例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞）に対する癌抗原の提示を増強する。
【０２５２】 癌ワクチンは、上で議論したように、いくつかの形態のうちの１つをとり得る
が、これらの目的は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対して癌抗原および／または癌
関連抗原を誘導して、ＡＰＣによるこのような抗原の内因性プロセシング、およ
びＭＨＣクラスＩ分子の関連における細胞表面上での最終的な抗原提示の提示を
容易にすることである。癌ワクチンの１つの形態は、全細胞ワクチンであり、こ
れは、被験体から除去され、エキソビボで処理され、次いで全細胞としてその被
験体に再導入された、癌細胞の調製物である。腫瘍細胞の溶解物もまた、免疫応
答を惹起するための癌ワクチンとして使用され得る。別の形態の癌ワクチンは、
ペプチドワクチンであり、これは、癌特異的小タンパク質または癌関連小タンパ
ク質を使用して、Ｔ細胞を活性化する。癌関連タンパク質とは、癌細胞によって
のみ発現されるわでではないタンパク質である（すなわち、他の正常な細胞がな
おこれらの抗原を発現し得る）。しかし、癌関連抗原の発現は、一般に、特定の
型の癌と一致してアップレギュレートされる。なお別の形態の癌ワクチンは、樹
状細胞ワクチンであり、これは、癌抗原または癌関連抗原にインビトロで曝露さ
れた全樹状細胞を含む。樹状細胞の溶解物または膜画分もまた、癌ワクチンとし
て使用され得る。樹状細胞ワクチンは、抗原提示細胞を直接活性化し得る。他の
癌ワクチンとしては、ガングリオシドワクチン、熱ショックタンパク質ワクチン
、ウイルスワクチンおよび細菌ワクチン、ならびに核酸ワクチンが挙げられる。
【０２５３】 免疫刺激核酸を、癌ワクチンと組み合わせて使用することによって、ＮＫ細胞
および内因性樹上細胞を活性化させること、ならびにＩＦＮαレベルを増加させ
ることに加えて、改善された抗原特異的な体液媒介免疫応答および細胞媒介免疫
応答が提供される。この増強は、抗原用量が減少したワクチンが、同じ有利な効
果を達成するために使用されることを可能にする。いくつかの例において、癌ワ
クチンは、アジュバント（上記のもののような）とともに使用され得る。
【０２５４】 本明細書中において使用される場合に、用語「癌抗原」および「腫瘍抗原」は
、互換可能に使用され、癌細胞によって差示的に発現され、そしてこれによって
癌細胞を標的するために利用され得る、抗原をいう。癌抗原とは、明らかに腫瘍
特異的免疫応答を潜在的に刺激し得る、抗原である。これらの抗原のいくつかは
、正常細胞によってコードされるが、必ずしも発現されるわけではない。これら
の抗原は、正常な細胞においては通常サイレントである（すなわち、発現されな
い）抗原、分化の特定の段階においてのみ発現される抗原、ならびに胚抗原およ
び胎児抗原のように一時的に発現される抗原として、特徴付けられ得る。他の癌
抗原は、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、変
異ｐ５３）、融合タンパク質のような、内部欠失または染色体転座から生じる変
異体細胞遺伝子によってコードされる。なお他の癌抗原は、ＲＮＡ腫瘍ウイルス
およびＤＮＡ腫瘍ウイルスに運ばれるもののような、ウイルス遺伝子によってコ
ードされ得る。
【０２５５】 他のワクチンは、他の免疫系細胞に対する効果的な抗原提示のために、ＭＨＣ
分子の関連において、インビトロで癌抗原に曝露され、抗原をプロセシングし、
そして癌抗原をその細胞表面において発現し得る樹状細胞の形態をとる。
【０２５６】 免疫刺激核酸は、本明細書の１つの局面において、樹状細胞に基づく癌ワクチ
ンと組み合わせて使用される。樹状細胞は、専門的な抗原提示細胞である。樹状
細胞は、先天性および後天性の免疫系の間の連結を、抗原を提示することによっ
て、そしてこれらのパターン認識レセプター（これらは、ＬＰＳのような微生物
分子をそれらの局所的環境において検出する）の発現を介して、形成する。樹状
細胞は、それが曝露される可溶性の特異的抗原を効果的にインターナリゼーショ
ンし、プロセシングし、そして提示する。抗原のインターナリゼーションおよび
提示のプロセスは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）および同時刺激分子の
発現、サイトカインの産生、ならびにこれらがＴ細胞の活性化に関与すると考え
られるリンパ器官への移動の、迅速なアップレギュレーションを引き起こす。
【０２５７】 表Ｄは、現在使用されているかまたは開発中であるかのいずれかである、種々
の癌ワクチンを列挙する。
【０２５８】
【表４】 本明細書中で使用される場合、化学療法剤は、免疫治療剤または癌ワクチンの
カテゴリーに分類されない癌医薬の他の全ての形態を含む。本明細書中で使用さ
れる場合、化学治療剤は、化学的薬剤および生物学的薬剤の両方を包含する。こ
れらの薬剤は、癌細胞が生存し続けるために依存する細胞活性を阻害するように
機能する。化学療法剤のカテゴリーは、アルキル化／アルカロイド剤、代謝拮抗
物質、ホルモンまたはホルモンアナログ、および雑多な抗腫瘍薬を含む。これら
の薬剤の全てではなくとも、そのほとんどは、癌細胞に対して直接的に毒性であ
り、そして免疫刺激を必要としない。化学療法と免疫刺激核酸投与との組合せは
、化学療法の最大耐容用量を増加させる。
【０２５９】 現在開発中であるか、または臨床的設定において使用されている化学療法剤を
、表Ｅに示す。
【０２６０】
【表５】 １つの実施形態においては、本発明の方法は、癌の処置において、ＩＦＮα治
療の使用の代わりとして免疫刺激核酸を使用する。現在、いくつかの処置プロト
コルは、ＩＦＮαの使用を必要とする。ＩＦＮαは、いくつかの免疫刺激核酸の
投与後に産生されるので、これらの核酸は、ＩＮＦα内因的に生成するために使
用され得る。
【０２６１】 本発明はまた、免疫刺激核酸を用いて、抗原非特異的先天性免疫活性化および
感染性チャレンジに対する広域スペクトル耐性を誘導するための方法を包含する
。本明細書中で使用される場合、用語、抗原非特異的先天性免疫活性化は、Ｂ細
胞以外の免疫細胞の活性化をいい、例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞または抗原非依存
性様式で応答し得る他の免疫細胞、あるいはこれらの細胞のある組合せの活性化
を誘導し得る。感染性チャレンジに対する広域スペクトル耐性が誘導される。な
ぜなら、これらの免疫細胞は活性形態であり、そして任意の侵入化合物または微
生物に対して応答するように初回刺激を受けているからである。これらの細胞は
、特定の抗原に対して特に初回刺激されていてはならない。これは、細菌戦およ
び上記の他の状況（例えば、旅行者）において特に有用である。
【０２６２】 特定の免疫刺激核酸の刺激指数は、種々の免疫細胞アッセイにおいて試験され
得る。好ましくは、Ｂ細胞増殖に関しては、免疫刺激核酸の刺激指数は、マウス
Ｂ細胞培養物（これは、２０μＭの核酸と３７℃で２０時間接触させ、そして１
μＣｉの3Ｈウリジンと共にパルスし；そしてＰＣＴ公開特許出願ＰＣＴ／ＵＳ
９５／０１５７０（ＷＯ９６／０２５５５）およびＰＣＴ／ＵＳ９７１９７９１
（ＷＯ９８／１８８１０）（それぞれ、米国特許出願第０８／３８６，０６３号
（１９９５年２月７日出願）および米国特許出願第０８／９６０，７７４号（１
９９７年１０月３０日出願）に対する優先権を主張する）に詳細に記載されるよ
うに、４時間後に収集およびカウントする）中の3Ｈウリジンの取込みによって
決定される場合、少なくとも約５、好ましくは、少なくとも約１０、より好まし
くは、少なくとも約１５、そして最も好ましくは、少なくとも約２０である。例
えば、インビボでの使用については、免疫刺激核酸は免疫応答（例えば、抗体産
生）を効率的に誘導し得ることが重要である。
【０２６３】 免疫刺激核酸は、非げっ歯類脊椎動物において有効である。異なる免疫刺激核
酸は、被験体の型およびその免疫刺激核酸の配列に依存して、最適な免疫刺激を
引き起こし得る。多くの脊椎動物は、本発明に従って、同じクラスの免疫刺激核
酸に対して応答性であることが見出され、しばしばヒト特異的免疫刺激核酸とい
われる。しかし、げっ歯類は、異なる核酸に対して応答する。本明細書中で示さ
れるように、ヒトにおいて最適な刺激を引き起こす免疫刺激核酸は、マウスにお
いて一般的には最適な刺激を引き起こし得ず、逆の場合も同じである。しかし、
ヒトにおいて最適な刺激を引き起こす免疫刺激核酸は、しばしば他の動物（例え
ば、ウシ、ウマ、ヒツジなど）において最適な刺激を引き起こす。当業者は、本
明細書中に記載される慣用的なアッセイおよび／または当該分野において公知の
慣用的なアッセイを用い、本明細書中で提供される手引きを用いて、目的の特定
の種のために有用な最適な核酸配列を同定し得る。
【０２６４】 免疫刺激核酸は、被験体に直接投与されてもよいし、または核酸送達複合体と
組合せて投与されてもよい。核酸送達複合体は、標的手段（例えば、標的細胞（
例えば、Ｂ細胞表面）に対するより高い親和性の結合および／または標的細胞に
よる細胞取りこみの増大を生じる分子）に会合する（例えば、イオン結合または
共有結合；または中に被包される）核酸分子を意味する。核酸送達複合体の例と
しては、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、カチオン性脂
質、ビロゾームまたはリポソーム）、または標的細胞特異的結合因子（例えば、
標的細胞特異的レセプターにより認識されたリガンド）に会合する核酸が挙げら
れる。好ましい複合体は、インビボで十分に安定であり、標的細胞による内在化
の前の有意な未結合を妨げる。しかし、この複合体は、細胞内で適切な条件下で
切断され得、その結果この核酸は機能的形態で放出される。
【０２６５】 表面に対して抗原および核酸を送達するための送達ビヒクルまたは送達デバイ
スが記載されている。免疫刺激核酸および／または抗原および／または他の治療
剤は、単独で（例えば、生理食塩水または緩衝液中で）、または当該分野で公知
の送達ビヒクルを用いて投与され得る。例えば、以下の送達ビヒクルが記載され
ている：ココレート（Ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）（Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅら
、１９９４，１９９６）；エマスゾーム（Ｅｍｕｌｓｏｍｅ）（Ｖａｎｃｏｔｔ
ら、１９９８、Ｌｏｗｅｌｌら、１９９７）；ＩＳＣＯＭ（Ｍｏｗａｔら、１９
９３、Ｃａｒｌｓｓｏｎら、１９９１、Ｈｕら、１９９８、Ｍｏｒｅｉｎら、１
９９９）；リポソーム（Ｃｈｉｌｄｅｒｓら、１９９９、Ｍｉｃｈａｌｅｋら、
１９８９、１９９２、ｄｅ Ｈａａｎ １９９５ａ，１９９５ｂ）；生菌ベクタ
ー（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｍａｔｔｅ−ｇｕｅｒｉｎ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（Ｈｏｎｅら、１９９６、Ｐｏｕｗｅｌｓら、１９９８、
Ｃｈａｔｆｉｅｌｄら、１９９３、Ｓｔｏｖｅｒら、１９９１、Ｎｕｇｅｎｔら
、１９９８）；生ウイルスベクター（例えば、Ｖａｃｃｉｎｉａ、ａｄｅｎｏｖ
ｉｒｕｓ，Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ）（Ｇａｌｌｉｃｈａｎら、１９９３
、１９９５、Ｍｏｓｓら、１９９６、Ｎｕｇｅｎｔら、１９９８、Ｆｌｅｘｎｅ
ｒら、１９８８、Ｍｏｒｒｏｗら、１９９９）；マイクロスフェア（Ｍｉｃｒｏ
ｓｐｈｅｒｅｓ）（Ｇｕｐｔａら、１９９８、Ｊｏｎｅｓら、１９９６、Ｍａｌ
ｏｙら、１９９４、Ｍｏｏｒｅら、１９９５、Ｏ’Ｈａｇａｎら、１９９４、Ｅ
ｌｄｒｉｄｇｅら、１９８９）；核酸ワクチン（Ｆｙｎａｎら、１９９３、Ｋｕ
ｋｌｉｎら、１９９７、Ｓａｓａｋｉら、１９９８、Ｏｋａｄａら、１９９７、
Ｉｓｈｉｉら、１９９７）；Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（例えば、カルボキシメチルセル
ロース、キトサン）（Ｈａｍａｊｉｍａら、１９９８、Ｊａｂｂａｌ−Ｇｉｌｌ
ら、１９９８）；ポリマー環（Ｗｙａｔｔら、１９９８）；プロテオソーム（Ｖ
ａｎｃｏｔｔら、１９９８、Ｌｏｗｅｌｌら、１９８８、１９９６、１９９７）
；Ｓｏｄｉｕｍ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ（Ｈａｓｈｉら、１９９８）；Ｔｒａｎｓｇ
ｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ（Ｔａｃｋｅｔら、１９９８、Ｍａｓｏｎら、１９９８
、Ｈａｑら、１９９５）；ビロソーム（Ｖｉｒｏｓｏｍｅ）（Ｇｌｕｃｋら、１
９９２、Ｍｅｎｇｉａｒｄｉら、１９９５、Ｃｒｙｚら、１９９８）；ウイルス
様粒子（Ｊｉａｎｇら、１９９９、Ｌｅｉｂｌら、１９９８）。他の送達ビヒク
ルが当該分野で公知であり、そして以下のベクターの考察において、いくつかの
さらなる例が提供される。
【０２６６】 有効な量の免疫刺激核酸という用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必
要かまたは十分な量をいう。例えば、粘膜免疫を誘導するのに有効な量の免疫刺
激核酸は、抗原に曝露された際のこの抗原に対するＩｇＡの発生を生じるのに必
要な量である。一方、全身の免疫を誘導するのに必要な量とは、抗原に曝露され
た際のこの抗原に対するＩｇＧの発生を生じるのに必要な量である。本明細書に
おいて提供される技術と組合せて、種々の活性な化合物および重み付け因子（例
えば、力価、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重篤
度、および投与の好ましい様式）を選択することにより、実質的な毒性を生じな
い、そして特定の被験体を処置するのに完全に有効である、有効な予防的または
治療的処置レジメンが計画され得る。任意の特定の適用に対して有効な量は、疾
患もしくは状態を処置している因子、投与されている特定の免疫刺激核酸、抗原
、被験体のサイズ、または疾患もしくは状態の重篤度に依存して変化し得る。当
業者は、有効量の特定の免疫刺激核酸および／または抗原および／または他の治
療剤を、過度の実験を要することなく経験的に決定し得る。
【０２６７】 粘膜または局所送達について本明細書において記載された化合物の被験量は、
代表的に、１投与あたり約０．１μｇ〜１０ｍｇの範囲にわたる。この範囲は、
毎日、毎週、または毎月、およびその間の任意の間隔で投与され得る適用に依存
する。より代表的には、粘膜投与または局所投与の用量は１投与あたり約１０μ
ｇ〜５ｍｇの範囲にわたり、そして最も代表的には約１００μｇ〜１ｍｇ（日ま
たは週の間隔を空けて２〜４回の投与）の範囲にわたる。より代表的には、免疫
賦活剤の投薬量は、１投与あたり１μｇ〜１０ｍｇ、そして最も代表的には１０
μｇ〜１ｍｇ（毎日または毎週の投与）の範囲にわたる。抗原特異的免疫応答を
誘導する目的で非経口送達について本明細書において記載されるこの化合物の被
験投与量（ここで、この化合物は抗原とともに、ただし別の治療剤はなしに、送
達される）は、ワクチンアジュバントまたは免疫刺激適用について有効な粘膜用
量よりも代表的に５〜１０，０００倍、そしてより代表的には１０〜１，０００
倍、そして最も代表的には２０〜１００倍高い。この免疫刺激核酸を、他の治療
剤と組合せて、または専門的送達ビヒクルにおいて投与する場合、生来の免疫応
答を誘導するため、またはＡＤＣＣを増大するため、または抗原特異的免疫応答
を誘導するための非経口送達について、本明細書において記載された化合物の用
量は、代表的には、１投与あたり約０．１μｇ〜１０ｍｇの範囲にわたり、この
範囲は、毎日、毎週または毎月、そしてその間の任意の他の時間で投与され得る
適用に依存する。より代表的には、これらの目的のための非経口投与の用量は、
１投与あたり約１０μｇ〜５ｍｇ、そして最も代表的には約１００μｇ〜１ｍｇ
（日または週の間隔を空けた２〜４回の投与）の範囲にわたる。しかし、いくつ
かの実施形態では、これらの目的のための非経口用量は、上記の代表的用量より
も５〜１０，０００倍高い範囲で用いられ得る。
【０２６８】 本明細書において記載される任意の化合物について、治療上有効な量は、動物
モデルから最初に決定され得る。治療上有効な量はまた、粘膜もしくは局所投与
について、ヒトにおいて試験された（ヒトの臨床試験が開始された）ＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドについて、および類似の薬理学的活性を示すことが公知である化
合物（例えば、他の粘膜アジュバント（例えば、ＬＴおよびワクチン接種目的の
ための他の抗原））についてのヒトのデータから決定され得る。非経口投与のた
めにはより高用量が要求される。適用された用量は、相対的バイオアベイラビリ
ティーおよび投与された化合物の力価に基いて調節され得る。上記の方法および
他の方法に基いて最大の有効性を獲得するための用量を調節することは、当該分
野で周知であり、十分に当業者が可能な範囲内である。
【０２６９】 本発明の処方物は、薬学的に受容可能な溶液中で投与される。この溶液は、慣
用的に薬学的に受容可能な濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性のキャリア、アジ
ュバント、および必要に応じて他の治療成分を含み得る。
【０２７０】 治療における使用のため、有効量の免疫刺激核酸を、所望の表面（例えば、粘
膜、全身に）核酸を送達する、任意の方法で被験体に投与し得る。本発明の薬学
的組成物の投与は、当業者に公知の任意の手段によって達成され得る。投与の好
ましい経路としては、経口、非経口、筋肉内、経鼻、気管内、吸入、眼、膣およ
び直腸が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２７１】 経口投与のために、化合物（すなわち、免疫刺激核酸、抗原、および他の治療
剤）が、当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアとこの化合物を合わせる
ことによって、容易に処方され得る。このようなキャリアは、本発明の化合物を
、処置されるべき被験体による経口摂食のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセ
ル、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁液などとして処方し得る。経口用
途のための薬学的調製物は、固体賦形剤として得られ得る。これは、必要に応じ
て、望まれる場合、適切な補助を追加した後に、得られた混合物を粉砕し、そし
て顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを得る。適切な賦形剤は、詳
細には、充填物（例えば、糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、または
ソルビトールを含む））；セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、
コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、ガムトラガカ
ント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリデン（ＰＶＰ）な
ど）である。所望の場合、崩壊剤（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、
またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩）が添加され得
る。必要に応じて、経口処方物はまた、内部の酸性状態を中和するため生理食塩
水もしくは緩衝液中で処方され得るか、またはいずれのキャリアもなしに投与さ
れ得る。
【０２７２】 適切なコーティングを有する糖衣錠コアが提供される。この目的のため、濃縮
糖溶液が使用され得る。この溶液は、必要に応じてアラビアゴム、タルク、ポリ
ビニルピロリドン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリ
コール、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒
または溶媒混合物を含む。染料または絵の具が、同定のためにまたは活性化合物
の用量の異なる組合せを特徴付けるために、錠剤もしくは糖衣錠コーティングに
添加され得る。
【０２７３】 経口で用いられ得る薬学的調製物としては、ゼラチン製の嵌め込み（ｐｕｓｈ
−ｆｉｔ）カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールま
たはソルビトール）から構成される軟性の密閉カプセルが挙げられる。この嵌め
込みカプセルは、ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤、および
／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、そして必要
に応じて安定剤と混合して活性成分を含み得る。軟カプセル剤においては、この
活性化合物は、適切な液体（例えば、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリ
エチレングリコール）中に溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤が投与され
得る。経口投与のために処方されたマイクロスフェアがまた用いられ得る。この
ようなマイクロスフェアは、当該分野で十分に規定されている。経口投与のため
の全ての処方物は、このような投与に適切な投薬量でなければならない。
【０２７４】 舌下（口内、頬内）投与のため、この組成物は、都合の良い様式で処方された
錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０２７５】 吸入による投与のため、本発明による使用のための組成物は、圧縮充填からの
エアロゾルスプレー噴霧の形態でまたはネブライザーで都合良く送達され得る。
この送達には、適切な噴霧剤（ｐｒｏｐｅｌｌａｎｔ）（例えば、ジクロロジフ
ルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二
酸化炭素、または他の適切な気体の使用を伴う。圧縮エアロゾルの場合、投薬単
位は、一定量を送達するためのバルブを備えることにより決定され得る。例えば
、吸入器（ｉｎｈａｌｅｒまたはｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）における使用のため
のゼラチンのカプセルおよびカートリッジが処方され得る。これには化合物およ
び適切な粉末ベース（例えば、ラクトースまたはデンプン）の粉末混合物を含む
。
【０２７６】 化合物は、これが全身に送達されることが所望される場合、注射によって（例
えば、ボーラス注射、または持続注入によって）非経口投与のために処方され得
る。注射のための処方物は、単位投薬形態、例えば、アンプルまたは複数用量容
器で、さらに保存剤を添加されて、存在し得る。この組成物は、油状または水性
ビヒクルにおいて、懸濁液、溶液、またはエマルジョンのような形態をとり得、
そして、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような処方化剤を含み得る
。
【０２７７】 非経口投与のための薬学的処方物は、活性化合物の水溶液を水溶性形態で含む
。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油状注射用懸濁液として調製され得る
。適切な脂肪親和性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油のような脂肪酸、また
は合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル、またはトリグリセリド）、
またはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増大する
物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、または
デキストラン）を含み得る。必要に応じて、懸濁液はまた、化合物の溶解性を増
大し、高度に濃縮された溶液の調節を可能にする、適切な安定剤または薬剤を含
み得る。
【０２７８】 あるいは、活性な化合物は、使用前には、適切なビヒクル（例えば、滅菌のパ
イロジェンを含まない水）での構築のために粉末形態であり得る。
【０２７９】 この化合物はまた、座剤または停留性浣腸剤（例えば、ココアバターまたは他
のグリセリドのような従来の座剤ベースを含む）のような直腸または膣の組成物
に処方され得る。
【０２８０】 先に記載した処方物に加えて、この組成物はまた、デポ調製物として処方され
得る。このような長時間作用性処方物は、適切なポリマー物質もしくは疎水性物
質（例えば、受容可能なオイル中のエマルジョンとして）、またはイオン交換樹
脂とともに、または可溶性の欠しい誘導体として、例えば、可溶性の欠しい塩と
して処方され得る。
【０２８１】 この薬学的組成物はまた、適切な固体もしくはゲル相キャリアまたは賦形剤を
含み得る。このようなキャリアまたは賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リ
ン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポ
リマー（例えば、ポリエチレングリコール）が挙げられるがこれらに限定されな
い。
【０２８２】 適切な液体または固体の薬学的調製物の形態は、例えば、吸入のための水溶液
または生理食塩水であり、マイクロカプセル化され、螺旋型に封入され（ｅｎｃ
ｏｃｈｌｅａｔｅｄ）、微視的金粒子の上に被覆され、リポソームに含まれ、噴
霧され、エアロゾルであり、皮膚への移入のためのペレットであり、または皮膚
を傷つけて進入するように尖った物体に乾燥されている。この薬学的組成物はま
た、顆粒、粉末、錠剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル、座剤、シロップ、エ
マルジョン、懸濁液、クリーム、ドロップ、または活性化合物の遅延性放出を伴
う調製物を含み、その調製物においては、賦形剤および添加剤、および／または
補助剤（例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、潤滑剤、香味料、
甘味料、または安定剤）が、上記のように習慣的に用いられる。この薬学的組成
物は、種々の薬物送達系における使用に適切である。薬物送達のための簡単な概
説については、本明細書において参考として援用される、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４９：１５２７〜１５３３（１９９０）を参照のこと。
【０２８３】 免疫刺激核酸および必要に応じて他の治療剤および／または抗原が、それ自体
で（ニート）、または薬学的に受容可能な塩の形態で投与され得る。医薬におい
て用いる場合、この塩は薬学的に受容可能であるが、薬学的に受容可能でない塩
が、その薬学的に受容可能な塩を調製するために、都合良く用いられ得る。この
ような塩としては、以下の酸から調製されたものが挙げられるがこれらに限定さ
れない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル
酸、ｐ−トルエンスルホン酸（ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、酒石酸、クエ
ン酸、メタン、スルホン酸（ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ギ酸、マロン酸
、コハク酸、ナフタリン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸（ｂｅｎ
ｚｅｎｅ ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）。また、このような塩は、アルカリ
金属、またはアルカリ土類塩（例えば、カルボン酸基のナトリウム、カリウム、
またはカルシウム塩）として調製され得る。
【０２８４】 適切な緩衝剤としては、以下が挙げられる：酢酸および塩（１〜２％ ｗ／ｖ
）；クエン酸および塩（１〜３％ ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５
％ ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ ｗ／ｖ）。適切な保存
剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ ｗ／ｖ）；クロ
ロブタノール（０．３〜０．９％ ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％
ｗ／ｖ）およびチメロサール（０，００４〜０．０２％ ｗ／ｖ）が挙げられ
る。
【０２８５】 本発明の薬学的組成物は、有効量の免疫刺激核酸、そして必要に応じて抗原お
よび／または他の治療剤（必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアに含まれる
）を含む。用語、薬学的に受容可能なキャリアは、１つ以上の適合性の固体また
は液体の充填剤、稀釈剤またはカプセル化物質（ヒトまたは他の脊椎動物への投
与に適切である）を意味する。用語、キャリアは、活性な成分が組合されて適用
を容易にする、有機成分または無機成分、天然または合成の成分を示す。薬学的
組成物の成分はまた、所望の薬学的有効性を実質的に阻害する相互作用がないよ
うな様式で、本発明の化合物と、およびお互いに、混ざり合うことが可能である
。
【０２８６】 本発明において有用な免疫刺激核酸は、さらなるアジュバント、他の治療剤、
または抗原と混合して送達され得る。免疫刺激核酸またはいくつかの抗原または
他の治療剤に加えて、いくつかのアジュバントから混合物が構成され得る。
【０２８７】 種々の投与経路が利用可能である。選択される特定の様式は、当然ながら、選
択される特定のアジュバントまたは抗原、処置されている特定の状態、および治
療効力に必要な投薬量に依存する。本発明の方法は、該して、医学的に受容可能
な任意の投与様式（臨床的に受容可能な副作用を生じることなく、有効なレベル
の免疫応答を生じる任意の様式を意図する）を用いて実施され得る。投与の好ま
しい様式は上記に考察されている。
【０２８８】 組成物は、単位投薬形態にて都合よく存在し得、そして薬学の分野にて周知の
任意の方法によって調製され得る。全ての方法は、化合物を１以上の付属成分を
構成するキャリアと会合させる工程を包含する。一般に、化合物は、この化合物
を液体キャリア、微細に分割された固体キャリア、またはそれらの両方と均一か
つ緊密に会合させること、次いで、必要な場合、この生成物を成形することによ
って調製される。液体投薬単位は、バイアルまたはアンプルである。固体投薬形
態は、錠剤、カプセル剤および坐剤である。患者の処置については、化合物の活
性、投与の様式、免疫の目的（すなわち、予防または治療）、障害の性質および
重篤度、患者の年齢および体重に依存して、異なる用量が必要とされ得る。所定
の用量の投与が、個々の用量の形態での単回投与、そうでなければいくつかのよ
り少ない用量単位の両方によって、実行され得る。数週間または数ヶ月離れた特
定の間隔での用量の複数投与は、抗原特異的応答をブーストするために有用であ
る。
【０２８９】 他の送達系は、時限放出、遅延放出、または徐放性放出の送達系を含み得る。
このような系は、化合物の反復投与を回避し得、このことは、被検体および医師
にとっての簡便性を増大させる。多くの型の放出送達系が、当業者に利用可能で
あり、そして公知である。これらには、ポリマーベースの系（例えば、ポリ（ラ
クチド−グリコチド）、コポリオキザラート、ポリカプロラクトン、ポリエステ
ルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物）が挙
げられる。薬物を含む前述のポリマーの微小カプセル剤は、例えば、米国特許第
５，０７５，１０９号に記載される。送達系はまた、以下の非ポリマー送達系を
含む：ステロール（例えば、コレステロール、コレステロールエステル）および
脂肪酸または中性脂肪（例えば、モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリ
セリド）を含む脂質；ヒドロゲル放出系；サイラスティック系；ペプチドベース
の系；ろうコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用して圧縮した錠剤；
部分的に融合した移植片など。特定の例は、以下のものを含むがこれらに限定さ
れない：（ａ）本発明の薬剤が、米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６
７５，１８９号、および同第５，７３６，１５２号に記載されるようなマトリク
ス内の形態に含まれている侵食系、ならびに（ｂ）活性成分が、米国特許第３，
８５４，４８０号、同第５，１３３，９７４号および同第５，４０７，６８６号
に記載されるようなポリマーから制御された速度で浸透する拡散系。さらに、ポ
ンプベースのハードウェア送達系が使用され得、これらのうちのいくつかは、移
植に採用される。
【０２９０】 本発明はさらに、以下の実施例によって例示され、これは、さらなる限定とし
てはどのようにも解釈されるべきではない。本出願の至る箇所で引用される全て
の参考文献（参考文献、発行された特許、公開特許出願、および同時係属出願を
含む）の内容の全体は、参考として本明細書によって明示的に援用される。
【０２９１】 （実施例） （材料および方法：） （オリゴヌクレオチド：）ネイティブのリン酸ジエステルおよびホスホロチオ
エート修飾ＯＤＮを、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｌａｍｅｄ
ａ，ＣＡ）およびＨｙｂｒｉｄｏｎ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（
Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した。ＯＤＮをＬＡＬアッセイ（ＬＡＬ−ａｓ
ｓａｙ ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；最小検
出限界０．１ ＥＵ／ｍｌ）を用いてエンドトキシンについて試験した。インビ
ボアッセイについて、ＯＤＮをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０，
１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で希釈し、そして−２０℃で保存した。インビボでの使用
のために、ＯＤＮをリン酸緩衝化生理食塩水（０．１Ｍ ＰＢＳ，ｐＨ ７．３
）中で希釈し、そして４℃で保存した。全ての希釈を発熱物質を含まない試薬を
用いて行った。
【０２９２】 （ヒトＰＢＭＣの単離および細胞培養：）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、記
載されるように（Ｈａｒｔｍａｎｎら、１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：９３０５−１０）、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度
勾配遠心分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により、健常なボランティアの末梢血か
ら単離した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）熱失活（５６℃、１時間）ＦＣＳ（Ｈｙ
Ｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍ
ｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（全てＧｉｂｃｏ Ｂ
ＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，製）を補充したＲＰＭＩ １６４０培
養培地（完全培地）に懸濁させた。細胞（最終濃度１×１０6細胞／ｍｌ）を、
５％ＣＯ2加湿インキュベーターの中で３７℃にて完全培地中で培養した。ＯＤ
ＮおよびＬＰＳ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、由来）または抗ＩｇＭ
を刺激に用いた。ヒトＮＫ溶解活性の測定のために、ＰＢＭＣを、２４ウェルプ
レート中に５×１０6／ウェルでインキュベートした。培養物を２４時間後に回
収し、そして細胞を、以前に記載された（Ｂａｌｌａｓら、１９９６ Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５７：１８４０−１８４５）ような、標準的な４時間のＫ５６２
標的細胞に対する51Ｃｒ放出アッセイにおけるエフェクターとして用いた。Ｂ細
胞増殖のために、3Ｈチミジンの１μＣｉを収集の１８時間前に添加し、そして3 Ｈチミジン取込みの量を、５日目にシンチレーションカウントにより決定した。
三連のウェルの標準偏差は、５％未満であった。
【０２９３】 （ヒトＰＢＭＣについてのフローサイトメトリー：）霊長類ＰＢＭＣの表面抗
原を、以前に記載（Ｈａｒｔｍａｎｎら、１９９８ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８５：９２０−９２８）のように染色した。ＣＤ３（ＵＣ
ＨＴ１）、ＣＤ１４（Ｍ５Ｅ２）、ＣＤ１９（Ｂ４３）、ＣＤ５６（Ｂ１５９）
、ＣＤ６９（ＦＮ５０）およびＣＤ８６（２３３１［ＦＵＮ−１］）に対するモ
ノクローナル抗体を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから購
入した。ＩｇＧ1，κ（ＭＯＰＣ−２１）およびＩｇＧ2b，κ（Ｈａｒｔｍａｎ
ｎら、１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：９３
０５−１０）を、非特異的染色についてのコントロールに用いた。ＮＫ細胞を、
ＣＤ３，ＣＤ１４およびＣＤ１９陰性細胞におけるＣＤ５６発現により同定した
。一方、Ｂ細胞を、ＣＤ１９の発現により同定した。１サンプルあたり１０００
０細胞のフローサイトメトリーデータを、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で得た。分析に用いたＦＳＣ／ＳＳＣゲート中の細胞の生存
率を、ヨウ化プロピジウム染色（２μｇ／ｍｌ）により決定し、そして９８％よ
りも高いことを見出した。データをコンピュータプログラムＦｌｏｗＪｏ（バー
ジョン２．５．１，Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡ）
を用いて分析した。
【０２９４】 （結果：） （実施例１：ヒトＢ細胞のＣｐＧ依存刺激は、メチル化およびＯＤＮ長に依存
する） ヒトＰＢＭＣを健常なドナーから獲得し、そして指定のＯＤＮ配列の指定の濃
度を用いて、２×１０5細胞／ウェルで５日間培養した。表Ｆに示したように、
ヒトＰＢＭＣは、種々の異なるＣｐＧ ＯＤＮと共に培養した場合、バックグラ
ウンドを超えて増殖するのみならず、ＣｐＧモチーフを含まないＯＤＮと共に培
養した場合でさえいくらかの増殖を示す。これらのＯＤＮを用いる最適な免疫刺
激を提供する際の非メチル化ＣｐＧの重要性は、ＯＤＮ１８４０（配列番号８３
）が、５６，６０３カウントの3Ｈチミジン取込みを導く一方で、メチル化され
たＣｐＧモチーフを有する同じＴリッチＯＤＮ（非−ＣｐＧ）である１９７９（
配列番号２２２）は、０．６μｇ／ｍｌの同じ濃度で、より少ないが、なおもバ
ックグラウンドを超えて増加した活性（わずか１８，６１８カウント）を導くと
いう事実により実証される。より高いＯＤＮ濃度での減少した増殖は、これらの
実験条件下で消耗してきている細胞の人為的結果であり得るか、またはより高い
ＯＤＮ濃度の何らかの毒性を反映し得る。興味深いことに、ＣｐＧモチーフを含
むより短いＯＤＮ（例えば、１３−１４マーの２０１５および２０１６）は、こ
れらのモル濃度が実際により高いという事実にもかかわらず、刺激性が低い。な
ぜならば、ＯＤＮは、モル濃度よりもむしろ質量に基づいて添加されたからであ
る。これは、ＯＤＮ長がまた、ＯＤＮの免疫効果における重要な決定因子であり
得ることを実証する。非ＣｐＧ ＯＤＮであるがわずかにＴリッチ（約３０％Ｔ
）のＯＤＮである１９８２（配列番号２２５）は、少量のバックグラウンド細胞
増殖のみを生じた。
【０２９５】
【表６】 数は、上記のように設定したヒトＰＢＭＣの培養のための3Ｈチミジン取込み
のｃｐｍを示す。
【０２９６】 （実施例２．チミジンリッチＯＤＮを用いるヒトＮＫ細胞活性の濃度依存活性
化） ヒトＰＢＭＣを、異なるＣｐＧまたは非ＣｐＧ ＯＤＮのパネルと共に、２つ
の異なる濃度で２４時間培養し、次いで、以前に記載される（Ｂａｌｌａｓら、
１９９６ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１８４０−１８４５）ように、ＮＫ標
的細胞を死滅させるそれらの能力について試験した。死滅を、溶解単位またはＬ
．Ｕ．として測定する。本実験に用いたヒトドナーは、陽性コントロール（ＩＬ
−２）を用いて、３．６９Ｌ．Ｕ．のバックグラウンドレベル（これは１８０．
３６Ｌ．Ｕ．まで増加した）を有した。ＣｐＧオリゴである２００６（配列番号
２４６）は、０．６の低濃度で高いレベルのＮＫ溶解機能を誘導し、６．０の濃
度で低いレベルのＮＫ溶解機能を誘導した。驚くべきことに、２００６のＣｐＧ
モチーフをメチル化した（２１１７（配列番号３５８）のＯＤＮ）またはＧｐＣ
に転化させた（ＯＤＮ２１３７（配列番号８８６））ＴリッチＯＤＮは、表Ｇに
示したように、より高いＯＤＮ濃度で、強い免疫刺激機能を維持した。これらの
濃度依存免疫刺激効果は、ホスホロチオエート骨格の一般的特性ではない。なぜ
ならば、以下に記載される実験は、ポリＡ ＯＤＮが、バックグラウンドレベル
を超える免疫刺激性ではないことを実証するからである。いくつかの刺激が、２
４塩基長のＯＤＮを用いて見られた（ＯＤＮ２１８２（配列番号４３２））。こ
こで、全ての塩基位置を、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴが、各塩基位置において２５％の
頻度で生じるように無作為化した。しかし、このような２４塩基のＯＤＮの刺激
効果は、それが純粋なポリＴである場合、非常に増大する。この場合、刺激はま
た、０．６μｇの最も低い濃度で見られた（ＯＤＮ２１８３（配列番号４３３）
）。実際、この低い濃度でのＯＤＮ配列番号４３３の刺激活性は、配列番号２４
６の最適なヒト免疫刺激性ＯＤＮの他は、この低い濃度で試験した他のいずれの
ＯＤＮの刺激活性よりも高い。実際、より高い濃度のＯＤＮ（配列番号４３３）
は、強いＣｐＧ ＯＤＮ２１４２（配列番号８９０）（これは、わずかにより高
い）以外の他のいずれのホスホロチオエートＯＤＮよりも、ＮＫ活性を刺激した
。 ＯＤＮ 配列番号２４６のＧ含有量が、さらなるＧの添加によりＴ含有量に対し
て増加する場合、これによりＴヌクレオチドの割合の低下を生じ、ＯＤＮの免疫
刺激効果を低下させる（ＯＤＮ２１３２（配列番号３７３）を参照のこと）。従
って、ＯＤＮのＴ含有量は、その免疫刺激効果の重要な決定因子である。ポリＴ
ＯＤＮは、最も刺激性の非ＣｐＧ ＯＤＮであるが、他の塩基もまた、非Ｃｐ
Ｇ ＯＤＮの免疫刺激効果を決定する際に重要である。ＯＤＮ２１３１（配列番
号３７２）（ここで、半分をわずかに超える塩基がＴである、かつＧが存在しな
い）は、６μｇ／ｍｌの濃度で免疫刺激性であるが、他のＴリッチ ＯＤＮより
も低い活性を有した。ＯＤＮ２１３１（配列番号３７２）の６Ａを６Ｇにより置
換する場合、ＯＤＮの免疫刺激効果を増加させ得る（ＯＤＮ２１３０（配列番号
３７１）を参照のこと）。
【０２９７】
【表７】 （実施例３：Ｔリッチ非ＣｐＧ ＯＤＮによるＢ細胞増殖の誘導） Ｂ細胞増殖を活性化するＴリッチＯＤＮの能力を評価するために、ヒトＰＢＭ
Ｃを細胞質色素であるＣＳＦＥを用いて染色し、０．１５または０．３μｇ／ｍ
ｌのいずれかの指定のＯＤＮと共に、５日間インキュベートし、次いで、フロー
サイトメトリーにより分析した。Ｂ細胞を、系列マーカー（ＣＤ１９）について
陽性の細胞に対するゲーティングにより同定した。ＣｐＧ ＯＤＮ２００６は、
Ｂ細胞増殖の強力なインデューサーであり、そしてこの効果は、ＣｐＧモチーフ
が、０．３μｇ／ｍｌのＯＤＮ濃度で、図１に示したように、メチル化されるか
、またはＧｐＣに転化された場合、低下した。ＯＤＮの塩基組成は、免疫刺激効
果を決定する際に重要であるようである。ＯＤＮのＴ含有量を低下させることは
、ＯＤＮ２１７７（配列番号４２７）により例示されるように、免疫刺激効果を
実質的に減少させる。ここで、ＯＤＮ２１３７（配列番号８８６）に存在する６
個のＴは、Ａに転化されており、その結果、非常に低下した免疫刺激効果を生じ
た。ＯＤＮの免疫刺激効果におけるＴの重要性をまた、ＯＤＮ２１１６（配列番
号３５７）および２１８１（配列番号４３１）（これらはＯＤＮの３’末端が異
なる）の比較により示す。ＯＤＮ２１８１（３’末端はポリＴである）は、両方
のＯＤＮが５’末端にＴＣＧＴＣＧを有するにもかかわらず、ＤＮ２１１６（３
’末端はポリＣである）よりも、より免疫刺激性である。
【０２９８】 （実施例４：ＴＧオリゴヌクレオチドによる誘導されるＢ細胞増殖） ＴＧモチーフの刺激効果を図２に示す。ＯＤＮ２１３７は、ＯＤＮ２００６と
同一の塩基組成を有するが、ＣＧモチーフは全てＧＣに転化されており、その結
果、ＣＧを含まない核酸を生じる。しかし、ＯＤＮは、６個のＴＧジヌクレオチ
ドを含む。ＯＤＮ２１７７において、ＯＤＮ２１３７の全てのＴＧジヌクレオチ
ドは、ＡＧに転化されている。ＯＤＮ２１７７は、６個のアデニンのみを含むが
、これは０．２μｇ／ｍｌの濃度で実際に非免疫刺激性である。比較のために、
各位置が４つの塩基のいずれかになるように無作為化される、２４塩基の長さの
ＯＤＮ（ＯＤＮ２１８２）は、１２％を超えるＢ細胞を、０．２μｇ／ｍｌの濃
度で増殖するように誘導する。これらの結果は、ＯＤＮ２１３７の刺激効果が、
単に、ホスホロチオエート骨格の効果ではなく、ＴＧジヌクレオチドの存在に関
係することを示す。
【０２９９】 ＴＧジヌクレオチドの数を変化させることの効果を決定するために、ＯＤＮ２
２００およびＯＤＮ２２０２を、図２に示したように比較した。ＯＤＮの両方は
１８個のＴおよび６個のＧを含む。しかし、ＯＤＮ２２００において、全てのＧ
を、唯一のＴＧジヌクレオチドが存在するように、連続させる。一方、ＯＤＮ２
００２において、Ｇを、３つのＴＧが存在するように、ＯＤＮを通じてＧＧジヌ
クレオチドとして分割させる。ＯＤＮ２２０２は、ＯＤＮ２２００よりも、わず
かにより刺激性である。これは、ＯＤＮにおける少なくとも３つのＴＧが、最適
な刺激活性に必要とされるというモデルと一致する。ＴＧモチーフが、本明細書
中に教示されるように最適化されている場合、さらに高レベルの刺激が達成され
得るようである。
【０３００】 （実施例５：ＴＴＧ対ＴＴＧモチーフの効果） 図３は、ＯＤＮの刺激効果に関連する、Ｔ対Ｇの相対レベルに関するＴＧ含有
量を研究するため行われた実験の結果を示す。図は、塩基の全てがＴまたはＣの
いずれかになるように無作為化されるＯＤＮ（ＯＤＮ２１８８（配列番号９０５
））が、塩基の全てがＡまたはＧのいずれかになるように無作為化されるＯＤＮ
（ＯＤＮ２１８９（配列番号９０６））に類似して、０．２μｇ／ｍｌの濃度で
非免疫刺激性であることを示す。しかし、２μｇ／ｍｌのより高い濃度で、無作
為化Ｔ／Ｇ ＯＤＮ２１８８は、有意により免疫刺激性である。この後者のレベ
ルの刺激は、全体的に無作為化したＯＤＮ（ＯＤＮ２１８２（配列番号４３２）
）により生じる刺激のレベルよりもさらに低い。低濃度で最も高い刺激は、塩基
の半分がＴに固定されかつ塩基の他の半分がＴまたはＧのいずれかに無作為化さ
れるＯＤＮ（ＯＤＮ２１９０（配列番号９０７））を用いて見られた。全ての他
の塩基がＴであるように固定されるので、ＴＧモチーフは存在しない。図３に示
されるデータは、ＯＤＮのＴＧ含有量を増加させることが、その刺激活性を改善
することを示す。
【０３０１】 さらに他の実施形態（この結果は本明細書中に図示しない）では、ＯＤＮ２１
９０（配列番号９０７）が、ＯＤＮ２１８８（配列番号９０５）またはＯＤＮ２
１８９（配列番号９０６）と比較してＮＫ活性の刺激を示した。
【０３０２】 （実施例６〜８） （緒言：） 上記で、本発明者らは、ポリＴ配列がＢ細胞およびＮＫ細胞の刺激を増強し得
ることを実証した。ここで、および以下で、本発明者らは、種々の非ＣｐＧ Ｔ
リッチＯＤＮの効果、ならびにポリＣ ＯＤＮがヒトＢ細胞、ＮＫ細胞および単
球を刺激するそれらの能力を調べる。
【０３０３】 （材料および方法：） オリゴヌクレオチド： ホスホロチオエート修飾ＯＤＮを、ＡＲＫ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した
。使用した配列は以下であった：１９８２：５’−ｔｃｃａｇｇａｃｔｔｃｔｃ
ｔｃａｇｇｔｔ−３’（配列番号２２５）、２００６：５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔ
ｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ−３’（配列番号２４６）、２０４１：５’
−ｃｔｇｇｔｃｔｔｔｃｔｇｇｔｔｔｔｔｔｔｃｔｇｇ−３’（配列番号２８２
）、２１１７：５’−ｔｚｇｔｚｇｔｔｔｔｇｔｇｔｚｇｔｔｔｔｇｔｚｇｔｔ
−３’（配列番号３５８）、２１３７：５’−ｔｇｃｔｇｃｔｔｔｔｇｔｇｃｔ
ｔｔｔｇｔｇｃｔｔ−３’（配列番号８８６）、２１８３：５’−ｔｔｔｔｔｔ
ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’（配列番号４３３）、２１９４：５’−
ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’（配列番号９
１１）、２１９６：５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’（配列
番号９１３）、５１２６：５’−ｇｇｔｔｃｔｔｔｔｇｇｔｃｃｔｔｇｔｃｔ−
３’（配列番号１０５８）、５１６２：５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ
ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’（配列番号１０９４）、５１６３：５’
−ａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ−３’（配
列番号１０９５）、５１６８：５’−ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃ
ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃ−３’（配列番号１０９６）および５１６９：５’−ｃ
ｇｃｇｃｇｃｇｃｇｃｇｃｇｃｇｃｇｃｇｃｇｃｇｃｇｃｇｃｇ−３’（配列番
号１０９７）。大部分のＯＤＮを、本明細書中にも記載のＬＡＬアッセイ（Ｂｉ
ｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）（下限検出限界０．１ＥＵ／ｍｌ）
を用いてＬＰＳ含量を試験した。全てのアッセイについて、ＯＤＮをＴＥ緩衝液
で希釈し、そして−２０℃で保存した。全ての希釈を、発熱物質を含まない試薬
を用いて行った。
【０３０４】 細胞の調製および細胞培養：ヒトＰＢＭＣを、上記実施例１に記載のように、
ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ（Ｒａｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）から得た健常ボランティアの末梢血から単離したが、全ての材料をＬｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、そしてエンドトキ
シンについて試験した。Ｂ細胞、ＮＫ細胞および単球の活性化アッセイについて
は、ＰＢＭＣを、９６穴丸底プレートにおいて２×１０6細胞／ｍｌ（２００μ
ｌ）の濃度で完全培地中、加湿インキュベーター中３７℃でで培養した。種々の
ＯＤＮ、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）またはＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳ
Ａ）を刺激物質として用いた。示された時間点で、細胞をフローサイトメトリー
のために採取した。
【０３０５】 フローサイトメトリー：表面抗原の染色のために用いたＭＡｂは以下であった
：ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ８０およびＣＤ８６
（全て、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ／Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｇｅｒｍ
ａｎｙから入手した）。単球については、以前に記載されたように（Ｂａｕｅｒ
，Ｍら、１９９９ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９７：６９９）、ヒトＩｇＧ（Ｍｙ
ｌｔｅｎｙｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＦｃレセプターをブロックした。特異
化した亜集団（Ｂ細胞、単球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはＴ細胞）の少なくと
も１０００細胞のフローサイトメトリーデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で得た。データを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔプロ
グラム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【０３０６】 ＮＫ媒介性細胞傷害性：ＰＢＭＣを、６μｇ／ｍｌ ＯＤＮまたは１００Ｕ／
ｍｌ ＩＬ−２ありまたはなしで、一晩、３７℃、５％ ＣＯ2で培養した。翌
朝、Ｋ−５６２標的細胞を、ヒトＢ細胞について以前に記載されたように（Ｈａ
ｒｔｍａｎｎ，Ｇ．およびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ、２０００ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１６４：９４４）、蛍光色素（ＣＦＳＥ）で標識した。ＰＢＭＣを、異なる比
（５０：１、２５：１および１２．５：１）で、２×１０5標的細胞に添加し、
そして３７℃で４時間インキュベートした。細胞を採取し、そしてアポトーシス
細胞の検出のために、ＤＮＡ特異的色素７−ＡＡＤ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と
ともにインキュベートした。結果を、フローサイトメトリーにより分析した。
【０３０７】 ＥＬＩＳＡ：ＰＢＭＣ（３×１０6細胞／ｍｌ）を、４８ウェルプレート中、
特異化した濃度のＯＤＮまたはＬＰＳとともに２４時間（ＩＬ−６、ＩＦＮγお
よびＴＮＦα）または８時間（ＩＬ−１β）、加湿雰囲気において３７℃で培養
した。上清を回収し、そしてＩＬ−６、ＩＦＮγおよびＴＮＦαについてはＯＰ
Ｔｅｉａ ＥＬＩＳＡキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、またはＩＬ−
１βについてはＥｌｉ−ｐａｉｒ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｈｏｅｌｚｅｌ，Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）を用いて、製造業者のプロトコルに従ってサイトカインを測定した
。
【０３０８】 （実施例６：ＣｐＧモチーフを欠いたＯＤＮにより誘導されるＢ細胞活性化） 上記実施例３において記載された実験において、本発明者らは、ＴリッチＯＤ
ＮがＢ細胞を活性化し得たことを実証する。本発明者らは、さらなるＯＤＮおよ
び種々の細胞および試薬供給源を用いて、ここでこれらの研究に拡張する。最初
の一連の実験において、本発明者らは、種々の非ＣｐＧ ＴリッチＯＤＮの活性
化能力と、非常に強力な公知のＣｐＧ ＯＤＮ２００６（配列番号２４６）とを
比較した。１名の血液ドナーのＰＢＭＣ（２×１０6細胞／ｍｌ）（ｎ＝２）を
、示された濃度のＯＤＮ２００６（配列番号２４６）、ＯＤＮ２１１７（配列番
号３５８）、ＯＤＮ２１３７（配列番号８８６）、ＯＤＮ５１２６（配列番号１
０５８）、およびＯＤＮ５１６２（配列番号１０９４）とともにインキュベート
した。細胞を上記のように３７℃で４８時間インキュベートし、そしてＣＤ１９
（Ｂ細胞マーカー）およびＣＤ８６（Ｂ細胞活性化マーカーＢ７−２）に対する
ｍＡｂで染色した。発現を、フローサイトメトリーにより分析した。
【０３０９】 種々の濃度のＯＤＮを用いて、本発明者らは、ＣｐＧモチーフを含まないＴリ
ッチＯＤＮがヒトＢ細胞の刺激を誘導し得ることを示した（図４）。単一のポリ
Ｔ配列のみを含むが、５０％ Ｔより多いＯＤＮ５１２６（配列番号１０５８）
は、高レベルのヒトＢ細胞活性化を生じた。配列番号２４６（例えば、Ｔ／Ｇ含
量が８０％より多い）にいくらか類似しているが、このＯＤＮは、いずれの公知
の免疫刺激性ＣｐＧモチーフを明らかに欠いている。驚くべきことに、全ての試
験したＴリッチＯＤＮに関して、最高刺激指数は、３μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍ
ｌとの間の濃度で得られた。試験したＯＤＮの最高刺激指数は、０．４μｇ／ｍ
ｌのＣｐＧ／ＴリッチＯＤＮ（配列番号２４６）により達成された。興味深いこ
とに、活性は、高濃度では減少した。
【０３１０】 ポリＡ、ポリＣおよびポリＴの配列を合成し、そして生物学的活性について試
験した。１名の代表的なドナーのＰＢＭＣ（２×１０6細胞／ｍｌ）（ｎ＝３）
を、以下のＯＤＮの０．４μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌまたは１０．０μｇ／
ｍｌにより上記のように刺激した：ＯＤＮ２００６（配列番号２４６）、ＯＤＮ
２１９６（配列番号９１３）（ポリＴ、１８塩基）、ＯＤＮ２１９４（配列番号
９１１）（ポリＴ、２７塩基）、ＯＤＮ５１６２（配列番号１０９４）（ポリＴ
、３０塩基）、ＯＤＮ５１６３（配列番号１０９５）（ポリＡ、３０塩基）、Ｏ
ＤＮ５１６８（配列番号１０９６）（ポリＣ、３０塩基）およびＯＤＮ５１６９
（配列番号１０９７）（ポリＣＧ、３０塩基）。ＣＤ１９陽性Ｂ細胞上での活性
化マーカーＣＤ８６（Ｂ７−２）の発現を、フローサイトメトリーにより測定し
た。
【０３１１】 図５は、配列の長さは、少なくともポリＴ ＯＤＮについてはその活性に対し
て重要な影響を有することを実証する。１８塩基のみを含むポリＴ配列（配列番
号９１３）は、２７塩基を有するポリＴ配列（配列番号９１１）または３０塩基
を有するポリＴ配列（配列番号１０９４）より、あまり刺激性でないことが示さ
れた。刺激の明らかな順位は以下である：配列番号１０９４＞配列番号９１１＞
配列番号９１３。対照的に、ポリＡ（配列番号１０９５）またはポリＣＧ（配列
番号１０９７）の配列は、ヒトＢ細胞の活性化を誘導しない。驚くべきことに、
ポリＣ配列（配列番号１０９６）が少なくとも高濃度で（１０μｇ／ｍｌ）でヒ
トＢ細胞を活性化し得ることもまた発見された（図５）。
【０３１２】 ＨｐＧモチーフを欠いている２つの他のＴリッチＯＤＮ（すなわち、１９８２
（配列番号２２５）および２０４１（配列番号２８２））を、ヒトＢ細胞に対す
るそれらの効果について試験した。ＰＢＭＣ（ｎ＝２）を、示された濃度のＯＤ
Ｎ２００６（配列番号２４６）、ＯＤＮ１９８２（配列番号２２５）およびＯＤ
Ｎ２０４１（配列番号２８２）とともに、上記のようにインキュベートした。Ｂ
細胞活性化（活性化マーカーＣＤ８６の発現）を、フローサイトメトリーにより
測定した。
【０３１３】 図６は、Ｔリッチ非ＣｐＧ ＯＤＮが１μｇ／ｍｌより高い濃度で免疫刺激性
であることを実証する。ＣｐＧモチーフを１９８２に組み込むことにより、免疫
刺激活性が増強された。ポリＴ配列での伸長は、このこれまでのＴリッチＯＤＮ
の免疫刺激活性を増強したのではなく、むしろ活性化能力をわずかに減少させた
。
【０３１４】 （実施例７：非ＣｐＧ ＯＤＮの免疫刺激は、ＮＫ活性化、ＮＫ細胞傷害性お
よび単球活性化の増強に反映される） ＮＫ細胞および単球を、非ＣｐＧ ＯＤＮに対するそれらの応答について試験
した。ＰＢＭＣ（２×１０6細胞／ｍｌ）を、以下のＯＤＮ ６μｇ／ｍｌとと
もにインキュベートした（ｎ＝４）：２００６（配列番号２４６）、２１１７（
配列番号３５８）、２１３７（配列番号８８６）、２１８３（配列番号４３３）
、２１９４（配列番号９１１）および５１２６（配列番号１０５８）。３７℃で
２４時間インキュベートした後、細部を採取し、そしてＣＤ３（Ｔ細胞マーカー
）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞マーカー）およびＣＤ６９（初期活性化マーカー）に対
するｍＡｂで上記のように染色した。ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞上でのＣＤ６９の発
現を、フローサイトメトリーにより測定した。
【０３１５】 図７は、ポリＴ ＯＤＮについて、図５に示された類似の効果が観察され得る
ことを示す。Ｂ細胞と同様に、ＮＫ細胞の刺激は、ＯＤＮの長さにより影響が及
ぼされ得る。ＯＤＮ２１８３（配列番号４３３）（２１塩基）は、初期活性化マ
ーカーＣＤ６９の増強した発現により測定されるように、ＮＫ細胞の活性化を誘
導したが、より長いＯＤＮ２１９４（配列番号９１１）（２７塩基）はより低い
程度であった。ＯＤＮ５１２６（配列番号１０５８）は、ヒトＮＫ細胞を活性化
することがまた実証された（図７）。
【０３１６】 ＣｐＧ ＯＤＮの抗腫瘍活性は、ＯＤＮがインビトロでＮＫ媒介性細胞傷害性
を増強する能力により評価され得ると考えられる。５’末端および３’末端にポ
リＧのストレッチを含むＯＤＮは、細胞傷害性の最も高い誘導を生じることが示
された（Ｂａｌｌａｓ，Ｚ．Ｋ．ら、１９９６ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：
１８４０）。ＮＫ細胞傷害性に対する非ＣｐＧ ＴリッチＯＤＮの影響を調査す
るために、本発明者らは、ＮＫ媒介性溶解に対するＯＤＮ２１９４（配列番号９
１１）およびＯＤＮ５１２６（配列番号１０５８）の効果を分析した（図８）。
Ｋ−５６２標的細胞のＮＫ媒介性溶解を、ＯＤＮ２００６（配列番号２４６）、
配列番号９１１（配列番号９１１）（ポリＴ、２７塩基）および５１２６（配列
番号１０５８）６μｇ／ｍｌとともにＰＢＭＣを上記のように一晩インキュベー
トした後に、測定した。配列番号１０５８は、ＯＤＮなしと比較して、ヒトＮＫ
細胞による溶解においてわずかな増加を示した。配列番号９１１および配列番号
２４６は、ヒトＮＫ細胞細胞傷害性をさらに高い程度に増強した。
【０３１７】 以前の報告により、ＮＫ細胞だけでなくＮＫＴ細胞もまた腫瘍細胞の細胞傷害
性応答のメディエーターであることが実証された（１４）。従って、本発明者ら
は、Ｔリッチ非ＣｐＧ ＯＤＮによるヒトＮＫＴ細胞の潜在的な活性化を調査し
た。１名の代表的なドナーのＰＢＭＣ（ｎ＝２）を、ＯＤＮ２００６（配列番号
２４６）、ＯＤＮ２１１７（配列番号３５８）、ＯＤＮ２１３７（配列番号８８
６）、ＯＤＮ２１８３（配列番号４３３）、ＯＤＮ２１９４（配列番号９１３）
およびＯＤＮ５１２６（配列番号１０５８）６μｇ／ｍｌとともに、上記のよう
に２４時間インキュベートした。ＮＫＴ細胞の活性化を、ＣＤ３（Ｔ細胞マーカ
ー）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞マーカー）およびＣＤ６９（初期活性化マーカー）に
対するｍＡｂで細胞を染色した後に、フローサイトメトリーにより測定した。Ｃ
Ｄ３およびＣＤ５６二重陽性細胞（ＮＫＴ細胞）上でのＣＤ６９の発現を示す。
【０３１８】 図９において、配列番号９１１および配列番号１０５８は、ＮＫＴ細胞を刺激
することが見出された。ＮＫ細胞に類似して、配列番号９１１（ポリＴ）は、配
列番号１０５８より活性であった。さらに、Ｂ細胞およびＮＫ細胞について上記
で示されるように、ＯＤＮの長さは、免疫刺激能力に対していくらかの影響を有
し、より長いＯＤＮは、ＮＫＴ細胞に対してより強い効果を有する。類似の効果
がヒトＴ細胞について観察された。
【０３１９】 感染に対抗することに関与する免疫系の細胞の別の型は、単球である。これら
の細胞は、活性化の際に種々のサイトカインを放出し、そして専門の抗原提示細
胞である樹状細胞（ＤＣ）へと成熟させ得る（Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．，Ｊ．Ｂｒｏｓ
ｔｏｆｆおよびＤ．Ｍａｌｅ．１９９８．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｍｏｓｂｙ，
Ｌｏｎｄｏｎ）。図１０は、ＰＢＭＣを種々のＯＤＮとともに培養した後のヒト
単球の活性化を示す。ＰＢＭＣ（２×１０6細胞／ｍｌ）を、２００６（配列番
号２４６）、２１１７（配列番号３５８）、２１３７（配列番号８８６）、２１
７８（配列番号１０９６）、２１８３（配列番号４３３）、２１９４（配列番号
９１１）、５１２６（配列番号１０５８）および５１６３（配列番号１０９５）
６μｇ／ｍｌとともに、上記のように３７℃で一晩インキュベートした（ｎ＝３
）。細胞を採取し、ＣＤ１４（単球マーカー)およびＣＤ８０（Ｂ７−１、活性
化マーカー）について染色した。発現をフローサイトメトリーにより測定した。
【０３２０】 ＮＫ細胞およびＢ細胞について実証されるように、種々の長さのＴリッチ配列
（例えば、配列番号４３３、配列番号９１１）は、単球刺激を誘導するが、異な
るレベルの活性を有する。例えば、配列番号４３３＞配列番号９１１。ポリＡ（
配列番号１０９５）およびポリＣ（配列番号１０９６）（２１７８）の配列は、
対照的に、単球の活性化をもたらさなかった（６μｇ／ｍｌ ＯＤＮの濃度でＣ
Ｄ８０のアップレギュレーションにより測定した）。
【０３２１】 （実施例８：非ＣｐＧ ＯＤＮによるサイトカイン放出の誘導） 次に、種々のＴリッチＯＤＮがサイトカイン環境に影響を及ぼす能力を試験し
た。ＰＢＭＣ（３×１０6細胞／ｍｌ）を、６μｇ／ｍｌの示されたＯＤＮあり
もしくはなしで、または陽性コントロールとして１μｇ／ｍｌ ＬＰＳともに２
４時間培養した（ｎ＝２）。インキュベートした後、上清を回収し、そしてＴＮ
Ｆαを上記のようにＥＬＩＳＡにより測定し、そして結果を図１１に示す。ＰＢ
ＭＣを、図１１に記載されたように、示されたＯＤＮ（１．０μｇ／ｍｌ）とと
もに培養し、そしてＩＬ−６を、ＥＬＩＳＡにより上清中で測定し、そして結果
を図１２に示す。
【０３２２】 図１１および１２は、Ｔリッチ非ＣｐＧおよびＴリッチ／ＣｐＧ ＯＤＮが前
炎症性サイトカインであるＴＮＦαおよびＩＬ−６の分泌を誘導し得ることを実
証する。両方のサイトカインについて、ＯＤＮ５１２６（配列番号１０５８）は
、大部分のアッセイにおいて、ＯＤＮ２１９４（配列番号９１１）と同程度に強
力であることが見いだされた。ＣｐＧ ＯＤＮが、優先的にＴｈ１サイトカイン
を誘導することによりＴｈ１／Ｔｈ２平衡に影響を及ぼすことは公知である（Ｋ
ｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．１９９９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａ Ａｃｔａ ９３３２１：１）。ＴリッチＯＤＮがＴｈ１サイトカインへの
類似のシフトを引き起こすか否かを試験するために、ＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ
生成を測定した。最初の一連の実験において、ＩＬ−６およびＴＮＦαについて
記載されるように、ＯＤＮ（配列番号１０５８および配列番号９１１）は、この
Ｔｈ１サイトカインＩＦＮγの匹敵する量の放出を誘導することを実証した。さ
らに、別の前炎症性サイトカインであるＩＬ−１βは、これら２つのＯＤＮとと
もにＰＢＭＣを培養した際に放出されることが実証された。ＣｐＧモチーフを欠
いているＴリッチＯＤＮにより誘導されたこれらのサイトカインの量は、ＣｐＧ
ＯＤＮ（配列番号２４６）が用いられた場合より少ないが、ＴリッチＯＤＮに
より誘導された量は、コントロールより有意に高かった。
【０３２３】 （実施例９〜１１） （緒言：） 非齧歯類脊椎動物における免疫系活性化のための最適なＣｐＧモチーフを、本
明細書中に記載する。このモチーフを含むホスホジエステルオリゴヌクレオチド
は、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ５４およびＭＨＣ ＩＩの発現、ＩＬ−６合成な
らびに初代ヒトＢ細胞の増殖を強く刺激することがわかった。これらの効果は、
オリゴヌクレオチドのインターナリゼーションおよびエンドソームの成熟を必要
とした。このＣｐＧモチーフは、ＮＦκＢ ｐ５０／ｐ６５ヘテロダイマーおよ
び転写因子複合体活性化タンパク質−１（ＡＰ−１）の持続的な誘導と関連付け
られる。ＣｐＧ ＤＮＡによる転写因子活性化を、ストレスキナーゼｃ−ｊｕｎ
ＮＨ2末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびｐ３８の増加したリン酸化、ならびに活
性化転写因子２（ＡＴＦ−２）のリン酸化により進めた。ＣｐＧとは対照的に、
Ｂ細胞レセプターを通じたシグナル伝達は、細胞外レセプターキナーゼ（ＥＲＫ
）の活性化およびＪＮＫの種々のアイソフォームのリン酸化をもたらした。
【０３２４】 （材料および方法：） オリゴデオキシヌクレオチド： 非修飾（ホスホジエステル、ＰＥ）および修
飾ヌクレアーゼ耐性（ホスホロチオエート、ＰＳ）ＯＤＮを、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）およびＨｙｂｒｉｄｏｎ Ｓ
ｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した。
用いた配列を表Ｈに示す。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡおよび仔牛胸腺ＤＮＡを、Ｓｉ
ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入した。ゲ
ノムＤＮＡサンプルを、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２
５／２４／１）での抽出およびエタノール沈殿により精製した。ＤＮＡを、ｔｒ
ｉｔｏｎ ｘ−１１４（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕ
ｉｓ，ＭＯ）を用いた反復抽出によりエンドトキシンから精製し、そしてＬＡＬ
アッセイ（ＬＡＬ−ａｓｓａｙ ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖ
ｉｌｌｅ，ＭＤ；下限検出限界０．１ＥＵ／ｍｌ）および先に記載したエンドト
キシンについては高感度アッセイ（下限検出限界０．００１４ＥＵ／ｍｌ）（Ｈ
ａｒｔｍａｎｎ Ｇ．，およびＫｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．１９９９）を用いてエンド
トキシンについて試験した。ＣｐＧ ＤＮＡおよびＬＰＳは、ヒト単球において
異なるパターンの活性化を誘導する（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：８９３）
。ＤＮＡサンプルのエンドトキシン含量は、０．００１４Ｕ／ｍｌ未満であった
。Ｅ．ｃｏｌｉおよび仔牛胸腺ＤＮＡを、１０分間煮沸し、続いて５分間氷上で
冷却することにより、使用前に１本鎖を作製した。ＤＮＡサンプルを、発熱物質
を含まない試薬を用いてＴＥ緩衝液で希釈した。
【０３２５】
【表８】 （細胞調製および細胞培養） ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なボランティの末梢血からＦｉｃｏ
ｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７，Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって記載され
るように（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｇ．ら、１９９６ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ６：２９１））単離した。細胞を、１
０％（ｖ／ｖ）熱不活性化（５６℃、１時間）ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇ
ａｎ，ＵＴ）、１．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび
１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（全てＧｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ
Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹより）を補充したＲＰＭＩ １６４０培養培地（完全培地
）中に懸濁した。全ての化合物は、内毒素試験されたものを購入した。生存率は
、トリパンブルー排除（従来の顕微鏡法）によってかまたはヨウ化プロピジウム
排除（フローサイトメトリー分析）によってＯＤＮを用いたインキュベーション
前後に決定した。全ての実験において、９６％〜９９％のＰＢＭＣが生存可能で
あった。細胞（最終濃度１×１０6細胞／ｍｌ）を、５％ ＣＯ2の加湿されたイ
ンキュベーター中、３７℃で完全培地中で培養した。異なるオリゴヌクレオチド
（表Ｉを参照のこと、濃度は、図の凡例に示される）、ＬＰＳ（ネズミチフス菌
由来、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）また
は抗ＩｇＭを、刺激として使用した。クロロキン（５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、エンドソー
ムの成熟／酸性化をブロックした。示された時点に、細胞を以下に記載されるよ
うなフローサイトメトリーのために収集した。
【０３２６】 シグナル伝達研究に関して、ヒト初代Ｂ細胞を、ＶＡＲＩＯＭＡＣＳ技術（Ｍ
ｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いて製造
者らによって記載されるように、免疫磁気細胞分類によって単離した。簡単に言
うと、健康な血液ドナーのバフィコートから得られたＰＢＭＣ（Ｅｌｍｅｒ Ｌ
．ＤｅＧｏｗｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｉｏｗａ）を、ＣＤ１９に対するマイクロビーズ結合体化抗体を用いてインキュ
ベートし、そしてポジティブ選択カラム上を通過させた。Ｂ細胞の純度は、９５
％よりも高かった。刺激後、シグナル伝達研究のために全細胞抽出物（ウエスタ
ンブロット）または核抽出物（ＥＭＳＡ）を、調製した。
【０３２７】 ＣｐＧ結合タンパク質研究のために、Ｒａｍｏｓ細胞（ヒトバーキットリンパ
腫Ｂ細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９２３またはＣＲＬ−１５９６；Ｉｎｔｅｒ
ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５：３１９−３３４，１９７５）を、完全培地中で増殖させ
た。未処理細胞を収集し、そして細胞質ゾルタンパク質抽出物を調製し、そして
ＣｐＧオリゴヌクレオチド結合タンパク質の存在に関して、以下に記載されるよ
うにＥＭＳＡおよびＵＶ架橋によって分析した。
【０３２８】 （フローサイトメトリー） 表面抗原の染色を、以前に記載されるように（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｇ．ら、１
９９８ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ２８５：９２０）実施し
た。ＨＬＡ−ＤＲに対するモノクローナル抗体を、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａ
ｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅから購入した。全ての他の抗体は、Ｐｈａｒｍｉ
ｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから購入した：ＣＤ１９（Ｂ４３）、ＣＤ
４０（５Ｃ３）、ＣＤ５４（ＨＡ５８）、ＣＤ８６（２３３１（ＦＵＮ−１））
に対するｍＡＢ。ＩｇＧ1,κ（ＭＯＰＣ−２１）およびＩｇＧ2b,κを特異的染
色に対するコントロールとして使用した。ＩＬ−６に対する細胞内サイトカイン
染色を、記載されるように（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｇ．およびＫｒｉｅｇ Ａ．Ｍ
．１９９９．ＣｐＧ ＤＮＡ ａｎｄ ＬＰＳ ｉｎｄｕｃｅ ｄｉｓｔｉｎｃ
ｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｏ
ｎｏｃｙｔｅｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：８９３）実施した。簡単に言
うと、ＰＢＭＣ（最終濃度１×１０6細胞／ｍｌ）を、ブレフェルジンＡ（最終
濃度１μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
，ＭＯ）の存在下でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を収集し
、そしてＦＩＴＣ標識されたＣＤ１９に対するｍＡＢ（Ｂ４３）、ＰＥ標識され
たラット抗ヒトＩＬ−６ ｍＡｂ（ＭＱ２−６Ａ３，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）お
よびＦｉｘ ａｎｄ Ｐｅｒｍキット（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて染色した。１サンプルあたり５００
０細胞のフローサイトメトリーのデータを、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａ
ｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で獲得した。非生存細胞を、ヨウ化プロピジウム染色（
２μｇ／ｍｌ）による分析から排除した。データを、コンピュータープログラム
ＦｌｏｗＪｏ（第２．５．１版、Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｓｔａｎｆｏ
ｒｄ，ＣＡ）を用いて分析した。
【０３２９】 （増殖アッセイ） ＣＦＳＥ（５−（および６−）カルボキシフルオレセインジアセテートスクシ
ンイミジルエステル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）は、フルオ
レセイン誘導体化細胞内蛍光標識であり、これは、細胞分裂に際し娘細胞間で等
しく分配される。ＣＦＳＥを用いた細胞染色は、混合細胞懸濁物中の増殖細胞の
定量および免疫表現型決定（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）（フィコエ
リトリン標識抗体）の両方を可能にする。簡単に言うと、ＰＢＭＣをＰＢＳ中で
２回洗浄し、５μＭの最終濃度でＣＦＳＥを含むＰＢＳ中に再懸濁し、そして３
７℃で１０分間インキュベートした。細胞を、図の凡例に示されるように、ＰＢ
Ｓで３回洗浄しそして５日間インキュベートした。増殖ＣＤ１９陽性Ｂ細胞を、
フローサイトメトリーを用いて減少するＣＦＳＥ含量によって同定した。
【０３３０】 （全細胞、核、および細胞質ゾルタンパク質抽出物の調製） ウエスタンブロット分析のために、全細胞抽出物を調製した。初代Ｂ細胞を、
培地、ホスホジエステルオリゴヌクレオチド２０８０（配列番号３２１）または
２０７８（配列番号３１９）を３０μｇ／ｍｌで、または抗ＩｇＭ（１０μｇ／
ｍｌ）を用いて処理した。細胞を収集し、１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4を含む氷冷ＰＢＳ
を用いて２回洗浄し、溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＴＲＩＳ
ｐＨ７．４、１％ ＮＰ４０、１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、５０ｍＭ ＮａＦ、３０
ｍｇ／ｍｌ ロイペプチン、５０ｍｇ／ｍｌ アプロチニン、５ｍｇ／ｍｌ ア
ンチパイン、５ｍｇ／ｍｌ ペプスタチン、５０μｇ／ｍｌ フェニルメチルス
ルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ））中に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベ
ートし、１４０００ｒｐｍで１０分間回転させた。上清を、−８０Ｃで凍結した
。核抽出物の調製のために、初代Ｂ細胞を、低張緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
／ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ ＮＰ４０、１．５ｍ
Ｍ ＭｇＣ１2、０．５ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ Ｐ
ＭＳＦ、３０ｍｇ／ｍｌ ロイペプチン、５０ｍｇ／ｍｌ アプロチニン、５ｍ
ｇ／ｍｌ アンチパイン、５ｍｇ／ｍｌ ペプスタチン）中に再懸濁した。氷上
で１５分間のインキュベーション後、懸濁物を、１０００×ｇで５分間遠心分離
した。ペレットの核を、抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、４
５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＦ、２０％ グリセロール、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、３０ｍｇ／ｍｌ
ロイペプチン、５０ｍｇ／ｍｌ アプロチニン、５ｍｇ／ｍｌ アンチパイン
、５ｍｇ／ｍｌ ペプスタチン）中に再懸濁し、そして氷上で１時間インキュベ
ートした。核懸濁物を、１６，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を
収集し、そして−８０℃で保存した。ＣｐＧ結合タンパク質研究のための細胞質
ゾル抽出物を、未刺激Ｒａｍｏｓ細胞から調製し、これらは、核抽出物の調製に
関して記載されたような低張緩衝液を用いて溶解した。遠心分離後、上清を細胞
質画分として取り除き、そして−８０℃で保存した。タンパク質濃度を、Ｂｒａ
ｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を
用いて製造者らに従って測定した。
【０３３１】 （ウエスタンブロット分析） 等濃度の全細胞タンパク質抽出物（２５μｇ／レーン）を、０．１％ ＳＤＳ
を含む１０％ ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上での電気泳動に
供する前に、ＳＤＳサンプル緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．８；
１％ β−メルカプトエタノール；２％ ＳＤＳ；０．１％ ブロモフェノール
ブルー；１０％ グリセロール）中、４分間煮沸した。電気泳動後、タンパク質
を、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｏｎ−Ｐ トランスファー膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ
ｒｐ．Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）へトランスファーした。ブロットを、５％ 脱脂
乾燥乳を用いてブロックした。リン酸化形態の細胞外レセプターキナーゼ（ＥＲ
Ｋ）、ｃ−ｊｕｎ ＮＨ２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８および活性化転写
因子−２（ＡＴＦ−２）に対する特異的抗体を使用した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。ブロットを、増感化学発光試薬
（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ａｙｌｅｓｂｕｒ
ｙ，Ｕ．Ｋ．）中で製造者らの推奨する手順に従って発色させた。
【０３３２】 （電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）） 転写因子活性化タンパク質−１（ＡＰ−１）およびＮＦκＢのＤＮＡ結合活性
を検出するために、核抽出物（１μｇ／レーン）を、プローブとしてＡＰ−１結
合配列を含むｄｓＯＤＮ ５’ＧＡＴ ＣＴＡ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＧＴ ＣＡ
Ｇ ＣＣＧ ＧＡＴ Ｃ ３’（配列番号８３８）およびｃ−ｍｙｃプロモータ
ー領域由来のＮＦκＢ ＵＲＥ ５’ＴＧＣ ＡＧＧ ＡＡＧ ＴＣＣ ＧＧＧ
ＴＴＴ ＴＣＣ ＣＣＡ ＡＣＣ ＣＣＣ Ｃ ３’（配列番号１１４２）を
用いてＥＭＳＡによって分析した。ＯＤＮを、Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および（γ−32Ｐ）ＡＴＰ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いて末端標識
した。結合反応を、１０μｌの総容量中に２０．０００〜４０．０００ｃｐｍ標
識ＯＤＮ有するＤＮＡ結合緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
、４０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオトレイトール、
８％グリセロールおよび１００〜４００ｎｇのポリ（ｄｌ−ｄＣ））中で１μｇ
核タンパク質抽出物を用いて実施した。ＮＦκＢバンドの特異性は、未関連転写
因子結合部位由来のコールドのオリゴヌクレオチド（１０〜１００ｎｇ）を用い
た競合研究によって確認した。スーパーシフトアッセイに関して、放射性標識プ
ローブを添加する前に、ｃ−Ｒｅｌ、ｐ５０およびｐ６５に対する２μｇの特異
的抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａ
ｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を、反応混合物中に３０分間添加した。室温で３０分
間のインキュベーション後、ローディング緩衝液を添加し、そしてプローブを、
Ｔｒｉｓ−ボレート−ＥＤＴＡ泳動緩衝液（９０ｍＭ Ｔｒｉｓ、９０ｍＭ ホ
ウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中、６％ポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動した。ゲルを乾燥させ、次いで、オートラジオグラフィーさせた。
【０３３３】 （ＵＶ架橋および変性タンパク質電気泳動） 核抽出物を、ＥＭＳＡに関して記載されたように標識ホスホジエステルオリゴ
ヌクレオチドを用いてインキュベートした。ＤＮＡ−タンパク質複合体を、１０
分間、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中でＵＶ光を用いて
架橋させた。プローブを、ＳＤＳサンプル緩衝液と混合し、１０分間煮沸し、そ
して７．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードした。このゲルを、Ｗｈａｔｍａｎ
紙上で乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーさせた。マーカータンパク質の
分子量に対する距離をプロットすることによって、標準曲線を作成し、この標準
曲線を使用して、架橋タンパク質−ＯＤＮ複合体の概算分子量を算出した。オリ
ゴヌクレオチドの分子量を、この値から差引きし、サイズを得た。
【０３３４】 （実施例９：単独またはＴ−リッチＯＤＮと組み合わせた使用のための、最適
ＣｐＧモチーフの同定） マウスＣｐＧモチーフの
【０３３５】
【化４】 を含みそしてマウスＢ細胞中で活性である濃度で使用されるホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド（例えば、１８２６（配列番号６９））（Ｙｉ Ａ．Ｋ．、
Ｃｈａｎｇ Ｍ．、Ｐｅｃｋｈａｍ Ｄ．Ｗ．、Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．、および
Ａｓｈｍａｎ Ｒ．Ｆ．１９９８．ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｒｅｓｃｕｅ ｍａｔｕｒｅ ｓｐｌｅｅｎ Ｂ ｃｅｌ
ｌｓ ｆｒｏｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒ
ｏｍｏｔｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｅｎｔｒｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６
０：５８９８）は、ヒト免疫細胞に対してほとんどまたは全く免疫刺激活性を示
していない。より高い濃度のこのＯＤＮは、ヒトＢ細胞に対していくらかの刺激
効果を示すことが見出された。
【０３３６】 マウス中のＢ細胞活性化に対する初期研究において、２つの５’プリンおよび
２つの３’ピリミジンが隣接し、そして好ましくは６マーモチーフ
【０３３７】
【化５】 のＣｐＧジヌクレオチドが、活性であるホスホジエステルオリゴヌクレオチドに
対して最適であったことが見出された（Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．ら、１９９５ Ｎ
ａｔｕｒｅ ３７４：５４６，Ｙｉ Ａ．Ｋ．、Ｃｈａｎｇ Ｍ．ら、１９９８
Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：５８９８）。
【０３３８】 ヒトおよび非げっ歯類脊椎動物における免疫応答の刺激に関して最適なモチー
フを同定するために、本発明者らは、一連のＯＤＮを設計し、そしてその活性を
試験した。最初に本発明者らは、ＴＣジヌクレオチドを用いて、５’末端に、最
適マウスＣｐＧモチーフ
【０３３９】
【化６】 が先行し、そしてポリＣテイルが続く２０マーのホスホジエステルオリゴヌクレ
オチド
【０３４０】
【化７】 を設計した。このオリゴヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡに関して最適で
あることが見出されているのと同じ条件下（０時間目、４時間目および１８時間
目での反復した添加；各時点に３０μｇ／ｍｌ）でヒト初代Ｂ細胞に添加した場
合、２日後にヒト初代Ｂ細胞に対して高レベルのＣＤ８６発現を刺激した。Ｃｐ
Ｇモチーフの構造−機能関係を決定するために、本発明者らは、２つのＣｐＧジ
ヌクレオチドを配列中に維持しながらＣｐＧジヌクレオチドに隣接して塩基を置
換した。チミジンによる両ＣｐＧジヌクレオチド間に配置するアデニンの置換（
２０８０（配列番号３２１））は、わずかに高い活性を引き起こした。この位置
におけるグアノシン（２１００（配列番号３４１））またはシチジン（２０８２
（配列番号３２３））による置換は、２０７９（配列番号３２０）と比較して主
要な変化を示さなかった。対照的に、プリングアノシン（２０９９（配列番号３
４０））またはアデニン（２０８３（配列番号３２４））による第２のＣｐＧジ
ヌクレオチドに対して３’のチミジンの置換は、このオリゴヌクレオチドの活性
に主要な低下を引き起こし、一方、ピリミジンシトシンは微小な減少を引き起こ
したに過ぎなかった。第１のＣｐＧジヌクレオチドに対してすぐ５’のチミジン
はまた、重要であった。任意の他の塩基（２１０５（配列番号３４６）、グアノ
シン；２１０７（配列番号３４８）、アデニン；２１０４（配列番号３４５）、
シチジン）によるチミジンの置換は、このオリゴヌクレオチドの活性に顕著な減
少を引き起こした。第１（２１０８（配列番号３４９））または第２（２１０６
（配列番号３４７））のＣｐＧジヌクレオチドの排除がまた、この活性を部分的
に減少した。
【０３４１】 ８マーの二重鎖ＣｐＧモチーフ
【０３４２】
【化８】 を含むホスホジエステルオリゴヌクレオチドへのさらなる
【０３４３】
【化９】 ＣｐＧモチーフの添加は、Ｂ細胞に対してＣＤ８６発現をさらに増強しなかった
（２０５９（配列番号３００））。２０８０（配列番号３２１）と同じ配列を有
するがホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドは、上記のバックグ
ラウンドを超えた活性を示さなかった（２１１６（配列番号３５７））。これは
、驚くべきことであった。なぜなら、ホスホロチオエート骨格は、オリゴヌクレ
オチドを大きく安定化し、そしてＣｐＧ誘導刺激を増強することが報告されてい
るからである（Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．、Ｙｉ Ａ．Ｋ．、Ｍａｔｓｏｎ Ｓ．、
Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｄｔ Ｔ．Ｊ．、Ｂｉｓｈｏｐ Ｇ．Ａ．、Ｔｅａｓｄａｌ
ｅ Ｒ．、Ｋｏｒｅｔｚｋｙ Ｇ．Ａ．、およびＫｌｉｎｍａｎ Ｄ．Ｍ．１９
９５．ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ ｔｒｉｇｇ
ｅｒ ｄｉｒｅｃｔ Ｂ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３
７４：５４６）。従って本発明者らは、
【０３４４】
【化１０】 を含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのさらなる構造−機能分析を実施
し、これによって、さらなるＣｐＧモチーフ（２００６（配列番号２４６））が
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの活性を増加する傾向にあることが示さ
れた。
【０３４５】 免疫磁気細胞分類による末梢血から単離された精製Ｂ細胞は、ＰＢＭＣ内の未
精製Ｂ細胞と同じ程度までＣｐＧ ＤＮＡによって活性化された。従って、Ｂ細
胞の活性化は、初期応答であり、そして他の細胞によって分泌されたサイトカイ
ンによって引き起こされた二次効果ではない。
【０３４６】 同時刺激分子ＣＤ８６に加えて、機能段階のＢ細胞は、他の表面マーカーによ
って特徴付けられる。例えば、活性化Ｔヘルパー細胞は、ＣＤ４０連結によって
Ｂ細胞を刺激し、細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１、ＣＤ５４）は、他の免疫
細胞への結合を媒介し、そして主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）
は、抗原提示を担う。本発明者らは、ＣＤ４０、ＣＤ５４およびＭＨＣ ＩＩの
Ｂ細胞発現が、ＣｐＧオリゴヌクレオチド２０８０（配列番号３２１）によって
アップレギュレートされたことを発見した。非ＣｐＧコントロールオリゴヌクレ
オチド２０７８（配列番号３１９）は、培地単独と比較して活性を示さなかった
。
【０３４７】 ＰＢＭＣを２０８０（配列番号３２１）の存在下で５日間インキュベートした
場合（０時間目、４時間目、１８時間目および引き続く毎朝に添加された）、リ
ンパ球の亜集団が細胞サイズ（ＦＳＣ）を増加しそしてより顆粒状（ＳＳＣ）に
なったことは、興味をそそられた。この亜集団が増殖Ｂ細胞を提示されたかどう
かを調べるために、本発明者らは、新鮮に単離されたＰＢＭＣをＣＦＳＥ（５−
（および６−）カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステ
ル）を用いて０日目に染色し、そしてこれらを上記のように２０８０（配列番号
３２１）を用いて５日間インキュベートした。ＣＦＳＥは、細胞タンパク質へ不
可逆に結合する蛍光分子である。各細胞部分は、ＣＦＳＥ染色を５０％減少した
。ＣＦＳＥで低く染色される細胞（増殖細胞）は、主にＣＤ１９陽性Ｂ細胞であ
ることが見出された。オリゴヌクレオチド２０８０（配列番号３２１）は、５日
間以内に増殖するＣＤ１９陽性Ｂ細胞の６０〜７０％誘導した。コントロールオ
リゴヌクレオチド２０７８（配列番号３１９）は、増殖するＢ細胞を５％より低
く誘導した。増殖Ｂ細胞（ＣＦＳＥが低い）は、より大きい細胞サイズ（ＦＳＣ
）およびより高い顆粒状性をしめした。
【０３４８】 増殖Ｂ細胞は、非増殖細胞よりもより高いレベルのＣＤ８６を発現した（示さ
ず）。この知見と一致して、ＣＤ８６発現の誘導に関して上記で試験されたオリ
ゴヌクレオチドパネルは、ほとんど同じＢ細胞増殖のパターンを生じた。３’チ
ミジンの置換は、中央位置においてチミジン変化するだけでなく活性も減少した
。
【０３４９】 （実施例１０：Ｂ細胞活性化は、エンドソームの成熟／酸性化を必要とする） クロロキン（エンドソーム酸性化のインヒビター）が、マウス抗原提示細胞お
よびＢ細胞のＣｐＧ媒介刺激をブロックするが、ＬＰＳ媒介効果に影響を与えな
いことが以前示された（Ｈａｃｋｅｒ Ｈ．ら、１９９８ Ｅｍｂｏ Ｊ １７
：６２３０、Ｙｉ Ａ．Ｋ．ら、１９９８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：４７
５５、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ Ｄ．Ｅ．、およびＭａｎｚｅｌ Ｌ．１９９８
Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：１１２２）。本発明者らは、５μｇ／ｍｌのクロ
ロキン添加が、初代Ｂ細胞に対するＣｐＧ ＤＮＡ媒介ＣＤ８６発現誘導を完全
にブロックすることを見出した（ＭＦＩ ＣＤ８６：２００６（配列番号２４６
）、４．７ ｖｓ １．４；Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、３．４ ｖｓ．１．４；培
地のみ、０．９；ｎ＝４）。さらに、クロロキンは、ホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチド２００６（配列番号２４６）によるＢ細胞増殖の誘導を完全に阻害
し、ＣＦＳＥ増殖アッセイならびに標準物質を用いて測定された。これらの結果
により、マウス細胞を用いたように、ＣｐＧ ＤＮＡによるヒトＢ細胞の活性化
が、エンドソーム中のＤＮＡ取り込み、引き続くエンドソーム酸性化を必要とす
ることが示唆された。
【０３５０】 （実施例１１：最適ヒトＯＤＮを用いたヒトＢ細胞刺激に対して生じる亜細胞
事象分析） 最大のＢ細胞活性化に対するＣｐＧモチーフの要求物が
【０３５１】
【化１１】 との間で実質的に異なるので、本発明者らは、基礎の細胞内シグナル伝達事象が
比較できるか否かに興味を持った。ＮＦκＢ結合活性の迅速な誘導が、マウスＢ
細胞およびマクロファージにおいて初期に見出されている（Ｓｔａｃｅｙ Ｋ．
Ｊ．ら、１９９６ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：２１１６，Ｙｉ Ａ．Ｋら
１９９８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：４７５５）。ヒトにおけるＣｐＧ Ｄ
ＮＡに対するＮＦκＢ応答を調べるために、ヒト初代Ｂ細胞を、免疫磁気細胞分
類によって末梢血から単離し、そしてＣｐＧオリゴヌクレオチド２０８０（配列
番号３２１）、非ＣｐＧコントロールオリゴヌクレオチド２０７８（配列番号３
１９）、または培地を用いてインキュベートした。示された時点において、細胞
を収集し、そして核抽出物を調製した。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの存在下、Ｎ
ＦκＢ結合活性は、１時間以内に増加し、そして１８時間（試験された最も遅い
時点）まで維持された。非ＣｐＧコントロールオリゴヌクレオチド２０７８（配
列番号３１９）は、培地のみを用いてインキュベートされた細胞と比較して増強
したＮＦκＢ活性を示さなかった。ＮＦκＢバンドは、コールド競合によって同
定し、そしてこれは、スーパーシフトアッセイによってｐ５０およびｐ６５サブ
ユニットから構成されることを示した。
【０３５２】 活性化タンパク質−１（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）（ＡＰ
−１）転写因子は、最初期遺伝子およびサイトカインの発現の調節に関与する（
Ｋａｒｉｎ Ｍ．１９９５．Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＰ−１
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｋｉｎａｓｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１６４８３）。マウス
Ｂ細胞では、ＡＰ−１結合活性は、ＣｐＧ ＤＮＡに応答して誘導される（Ｙｉ
Ａ．Ｋ．およびＫｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．１９９８．Ｒａｐｉｄ ｉｎｄｕｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａ
ｓｅｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＣｐＧ ＤＮＡ．Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：４４９３）。この転写因子がまた、ヒトにおいてＣｐ
Ｇ ＤＮＡによって誘導されるか否かを決定するために、本発明者らは、ヒト一
次Ｂ細胞におけるＡＰ−１ ＤＮＡ結合活性を試験した。細胞を、ＣｐＧオリゴ
ヌクレオチド２０８０（配列番号３２１）またはコントロールオリゴヌクレオチ
ド（配列番号３１９）と共にインキュベートした。核抽出物を調製し、そしてＥ
ＭＳＡによって、ＡＰ−１結合活性を分析した。ＡＰ−１結合活性は、１時間以
内に増強され、そして１８時間（試験された最も遅い時点）まで増加した。これ
により、持続的応答が示された。
【０３５３】 ＡＰ−１活性は、多くの刺激物によって誘導されるので（Ａｎｇｅｌ Ｐ．お
よびＫａｒｉｎ Ｍ．１９９１．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｊｕｎ，Ｆｏｓ ａ
ｎｄ ｔｈｅ ＡＰ−１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｃｅｌｌ−ｐｒｏｌｉｆｅｒ
ａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０７２：１２９）、本発明者らは、ＡＰ−１の上流のシ
グナル伝達経路に関心を抱いた。ＡＰ−１転写因子複合体は、異なるマイトジェ
ン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を統合する（Ｋａｒｉｎ Ｍ．１
９９５．Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＰ−１ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｂｙ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ
．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１６４８３）。ＣｐＧオリゴヌクレオチド
２０８０（配列番号３２１）、コントロール２０７８（配列番号３１９）、また
は培地単独と共にインキュベートされた一次Ｂ細胞由来の細胞抽出物全体を用い
て、ウェスタンブロットを実施した。ＪＮＫ、ｐ３８、ＡＴＦ−２およびＥＲＫ
のリン酸化形態に対する特異的抗体を使用した。ＪＮＫリン酸化の強力な誘導が
、ＣｐＧ ＤＮＡへの曝露の３０分後および６０分後に見られたが、非ＣｐＧオ
リゴヌクレオチドは、バックグラウンドを超えるいかなる活性も示さなかった。
タンパク質キナーゼｐ３８（別のストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＳＡＰＫ
））もまた、ＣｐＧ ＤＮＡに応答して６０分以内にリン酸化された。ｐ３８お
よびＪＮＫの両方の基質であるＡＴＦ−２（Ｇｕｐｔａ Ｓ．，Ｃａｍｐｂｅｌ
ｌ Ｄ．，Ｄｅｒｉｊａｒｄ Ｂ．およびＤａｖｉｓ Ｒ．Ｊ．１９９５．Ｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＡＴＦ２ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂ
ｙ ｔｈｅ ＪＮＫ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａ
ｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：３８９）およびＡＰ−１複合体の成分は、３０分
後に弱いリン酸化を示し、これは６０分後に増加した。ＣｐＧ ＤＮＡは、ＥＲ
Ｋの実質的なリン酸化を誘導できなかった。対照的に、Ｂ細胞レセプターを刺激
する抗ＩｇＭは、ＥＲＫのリン酸化を誘発した。抗ＩｇＭは、ＣｐＧ ＤＮＡで
はなくＪＮＫの異なるアイソフォームを活性化した。
【０３５４】 （実施例１２：インビボアジュバント活性についてのアッセイ） ヒトおよび他の非げっ歯類動物において、インビボでアジュバントとして有用
なＯＤＮを同定するためのインビトロスクリーニングアッセイを開発した。本発
明者らは、マウスにおける異なるＣｐＧ ＯＤＮの活性において、量的差異のみ
ならず質的差異をも観察したので、本発明者らはまず、マウス細胞におけるＣｐ
Ｇおよび非ＣｐＧコントロールＯＤＮのパネルをスクリーニングし、確実かつＢ
型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）でのインビボアジュバント活性に対する強力な相
関を伴うインビトロアッセイを見出した。次いで、本発明者らは、対応するヒト
アッセイにおいて、２５０より多いＯＤＮのパネルを体系的に試験して、インビ
トロ免疫刺激活性を有する配列を同定した。次いで、本発明者らは、これらのヒ
トアッセイにおいて最高の活性を有するＯＤＮが、チンパンジーおよびサルにお
いてもまたＢ細胞増殖を活性化するか否か、そして最終的には、これらが、チン
パンジーおよびカニクイザルにおいてインビボでＨＢｓＡｇを有するアジュバン
トとして活性であるか否かを試験した。これらの研究によって、個々のＣｐＧモ
チーフの配列、数、および間隔が、ＣｐＧホスホロチオエートＯＤＮの免疫刺激
活性に寄与することが明らかとなった。５’末端にＴＣジヌクレオチドを有し、
次いで、ＴＴジヌクレオチドによって隔てられた３つの６マーＣｐＧモチーフ（
５’ ＧＴＣＧＴＴ ３’）を有するＯＤＮは、ヒト、チンパンジー、およびア
カゲザルの白血球について一貫して最高の活性を示した。このＣｐＧ ＤＮＡア
ジュバントを伴うＢ型肝炎に対して一旦ワクチン接種されたチンパンジーまたは
サルは、ワクチン単独を受けたチンパンジーまたはサルよりも、１５倍高い抗Ｈ
Ｂ抗体力価を生じた。
【０３５５】 （材料および方法） （オリゴデオキシヌクレオチド） ホスホロチオエート改変ＯＤＮを、Ｏｐｅ
ｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）およびＨｙｂｒｉ
ｄｏｎ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から
購入した。ＯＤＮは、ＬＡＬアッセイ（ＬＡＬ−ａｓｓａｙ ＢｉｏＷｈｉｔｔ
ａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；最低検出限界０．１ ＥＵ／ｍｌ
）を使用して、内毒素について試験された。インビトロアッセイについて、ＯＤ
Ｎを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ ７．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）中
に希釈し、そして−２０℃で保存した。インビボ用途のために、ＯＤＮを、リン
酸緩衝化生理食塩水（０．１Ｍ ＰＢＳ，ｐＨ７．３）中に希釈し、そして４℃
で保存した。すべての希釈を、発熱物質を含まない試薬を用いて実施した。
【０３５６】 （マウス脾臓細胞培養） 脾臓を６〜１２週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ（Ｔｈｅ
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から取り出し、２×１０6個の脾細胞
を、０．２μＭ ＯＤＮと共に４時間（ＴＮＦ−α）または２４時間（ＩＬ−６
、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２）培養し、そして以前に記載されたようなＥＬＩＳＡ
（Ｙｉ Ａ．Ｋ．，Ｋｌｉｎｉｍａｎ Ｄ．Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎ Ｔ．Ｌ．，Ｍ
ａｔｓｏｎ Ｓ．およびＫｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．１９９６．Ｒａｐｉｄ ｉｍｍｕ
ｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｂａｃｔｅ
ｒｉａｌ ＤＮＡ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−６
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ
−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：５３９
４）によって、サイトカインを検出した。ＣｐＧ誘導性Ｂ細胞増殖を評価するた
めに、脾臓細胞は、抗Ｔｈｙ−１．２および補体、ならびにｌｙｍｐｈｏｌｙｔ
ｅ Ｍ（登録商標）（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｒ
ｎｂｙ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）に対する遠心分離によってＴ細胞を枯渇させ、示
されるＯＤＮと共に４４時間培養し、次いで、以前に記載されたように１μＣｉ
の3Ｈチミジンを４時間適用（ｐｌｕｓｅ）した（Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．，Ｙｉ
Ａ．Ｋ．，Ｍａｔｓｏｎ Ｓ．，Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｄｔ Ｔ．Ｊ．，Ｂｉｓ
ｈｏｐ Ｇ．Ａ．，Ｔｅａｓｄａｌｅ Ｒ．，Ｋｏｒｅｔｚｋｙ Ｇ．Ａ．およ
びＫｌｉｎｍａｎ Ｄ．Ｍ．１９９５．ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ ＤＮＡ ｔｒｉｇｇｅｒ ｄｉｒｅｃｔ Ｂ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉ
ｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６）。ＮＫ細胞溶解活性を試験する
ために、マウス脾臓細胞は、以前に詳述されたような（Ｂａｌｌａｓ Ｚ．Ｋ．
，およびＲａｓｍｕｓｓｅｎ Ｗ．１９９３．Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉ
ｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．ＶＩＩ．ＩＬ−４ ｉｎｄｕｃｅｓ
ａｎ ＮＫ１．１+ＣＤ８α+β-ＴＣＲ−αβ Ｂ２２０+ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ
−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｓｕｂｓｅｔ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １
５０：１７）、ヤギ抗マウスＩｇをコーティングした磁気ビーズを用いて、Ｂ細
胞を枯渇させた。細胞を、２４ウェルプレートにおいて５×１０6／ウェルで培
養し、そしてＹＡＣ−１標的細胞に対する標準的な４時間の51Ｃｒ放出アッセイ
におけるエフェクター細胞として使用するために、１８時間で収集した。１単位
（ＬＵ）を、３０％の特異的溶解をもたらすに必要とされる細胞数として規定し
た。
【０３５７】 （ＨＢｓＡｇに対するマウスの免疫および体液性応答の評価） ６〜８週齢の
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５または１０，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｍ
ｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣ）の群に、以前に記載されたように（Ｄａｖｉｓ Ｈ．Ｌ
．ら、１９９８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：８７０）、ＨＢｓＡｇに対して
免疫した。簡潔には、各マウスは、１μｇの組換えＨＢｓＡｇ（Ｍｅｄｉｘ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）および、単独のアジュバントと
してか、またはミョウバンと組み合わせて１０μｇのＣｐＧ ＯＤＮまたは非Ｃ
ｐＧ ＯＤＮを含有する（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ「８５」，Ｓｕｐｅｒｆｏｓ
Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ；２５ｍｇ Ａｌ3+／ｍ
ｇ ＨＢｓＡｇ）、５０μｌ ＰＢＳの単回ＩＭ注射を受けた。コントロールマ
ウスは、アジュバントなしかまたはミョウバンを伴うＨＢｓＡｇで免疫した。免
疫後、種々の時点でマウスから血漿を回収し、そしてＨＢｓＡｇに特異的なＡｂ
（抗−ＨＢ）を、以前に記載されたような終点希釈（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｄｉ
ｌｕｔｉｏｎ）ＥＬＩＳＡアッセイ（三連）（Ｄａｖｉｓ Ｈ．Ｌら、１９９８
Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：８７０）によって定量した。終点力価を、０．
０５のカットオフ値を用いて、非免疫血漿の値よりも２倍高い吸光度値（ＯＤ４
５０）を生じた最高の血漿希釈率として規定した。
【０３５８】 （霊長類ＰＢＭＣの単離および細胞培養） 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、
記載（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｇ．ら、１９９６ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ６：２９１）されたような、Ｆｉｃｏｌｌ
−ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７，Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって、健常ボ
ランティア、チンパンジー、またはアカゲザルもしくはカニクイザルの末梢血か
ら単離した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）熱非働化（５６℃、１時間）ＦＣＳ（Ｈ
ｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／
ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべて、Ｇｉｂｃ
ｏ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから）を補充したＲＰＭＩ １６
４０培養培地（完全培地）中に懸濁した。細胞（最終濃度１×１０6細胞／ｍｌ
）を、５％ＣＯ2加湿インキュベーター内で３７℃にて、完全培地中で培養した
。ＯＤＮおよびＬＰＳ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来、
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）または抗Ｉ
ｇＭを、刺激物として使用した。ヒトＮＫ溶解活性の測定のために、ＰＢＭＣを
、２４ウェルプレートにおいて５×１０6／ウェルにてインキュベートした。培
養物を、２４時間後に収集し、そして、以前に記載されたように（Ｂａｌｌａｓ
Ｚ．Ｋ．，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ｗ．Ｌ．およびＫｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．１９９
６．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ
ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｏｌ
ｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮ
Ａ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：１８４０；Ｂａｌｌａｓ Ｚ．Ｋ．およびＲ
ａｓｍｕｓｓｅｎ Ｗ．１９９３．Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ
ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．ＶＩＩ．ＩＬ−４ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｎ ＮＫ
Ｉ．１+ＣＤ８α+β-ＴＣＲ−αβ Ｂ２２０+ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉ
ｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｓｕｂｓｅｔ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：１７
）、Ｋ５６２標的細胞に対する標準的な４時間の51Ｃｒ放出アッセイにおけるエ
フェクターとして、細胞を使用した。Ｂ細胞増殖について、１μＣｉの3Ｈチミ
ジンを、収集の１８時間前に添加し、そして3Ｈチミジン取り込みの量を、５日
目にシンチレーション計数によって決定した。三連のウェルの標準偏差は、５％
未満であった。
【０３５９】 （霊長類ＰＢＭＣに対するフローサイトメトリー） 霊長類ＰＢＭＣにおける
表面抗原を、以前に記載されたように染色した（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｇら、１９
９８ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ２８５：９２０）。ＣＤ３
（ＵＣＨＴ１），ＣＤ１４（Ｍ５Ｅ２），ＣＤ１９（Ｂ４３），ＣＤ５６ （Ｂ１５９），ＣＤ６９（ＦＮ５０）およびＣＤ８６（２３３１（ＦＵＮ−１）
）に対するモノクローナル抗体を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
，ＣＡから購入した。ＩｇＧ1,κ（ＭＯＰＣ−２１）およびＩｇＧ2b,κ（Ｈａ
ｒｔｍａｎｎ Ｇら、１９９９ ＰＮＡＳ ９６：９３０５）を、非特異的染色
についてコントロールとするために使用した。ＮＫ細胞を、ＣＤ３，ＣＤ１４お
よびＣＤ１９ネガティブ細胞におけるＣＤ５６発現によって同定し、一方、Ｂ細
胞を、ＣＤ１９の発現によって同定した。１サンプルあたり１００００細胞から
のフローサイトメトリーデータを、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏ
ｓｅ，ＣＡ）で得た。分析に用いられたＦＳＣ／ＳＳＣゲートにおける細胞の生
存率を、ヨウ化プロピジウム染色（２μｇ／ｍｌ）によって試験し、そして９８
％よりも高いことが見出された。コンピュータープログラムＦｌｏｗＪｏ（バー
ジョン２．５．１，Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡ）
を用いて、データを分析した。
【０３６０】 （ＨＢｓＡｇに対するチンパンジーおよびカニクイザルの免疫、ならびに体液
性応答の評価） １４匹のカニクイザル（２．０〜３．５ｋｇ）に、ミョウバン
に吸着した１０μｇのＨＢｓＡｇ（２５ｍｇ Ａｌ3+／ｍｇ ＨＢｓＡｇ）を含
有するＥｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌｓ，Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，ＢＥ）の小児用量を用いて免疫した。こ
れは、単独（ｎ＝５）でか、またはＣｐＧ ＯＤＮ １９６８（ｎ＝５，５００
μｇ）またはＣｐＧ ＯＤＮ ２００６（配列番号２４６）（ｎ＝４，１５０μ
ｇ）と組み合わせて投与された。４匹のチンパンジー（１０〜２０ｋｇ）に、同
じ様式で免疫し、２匹がコントロールワクチン（Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂのみ）を受
け、そして２匹が実験ワクチン（Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ ＋ １ｍｇ ＣｐＧ Ｏ
ＤＮ ２００６）を受けた。すべてのワクチンを、総用量１ｍｌで右前方大腿に
ＩＭ投与した。サルを、Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂ
ｏｇｏｒ，Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ）の動物施設内に維持し、そしてチンパンジーを
、Ｂｉｏｑｕａｌ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に収容した。動物は、動物管理
専門家によって毎日モニターされた。一般的な健康障害または注射部位での局所
的有害反応の症状は全く見られなかった。血漿を、免疫前および免疫後の種々の
時点でＩＶ穿刺によって回収し、そして抗体についてアッセイするまで凍結（−
２０℃）保存した。抗ＨＢ抗体を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｍｏｎｏｌｉｓａ
抗−ＨＢ；Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣ）を用いて
検出し、そして力価を、ＷＨＯ規定標準（Ｍｏｎｏｌｉｓａ抗−ＨＢ標準；Ｓａ
ｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ）との比較に基づいて、ｍＩＵ／ｍｌで表した。
【０３６１】 （結果） 異なるプロフィールのインビトロ免疫活性を有するＣｐＧ ＤＮＡの同定： １つの研究によって、ＣｐＧモチーフ内のＣｐＧジヌクレオチドの５’および
３’部位における正確な塩基が、合成ＯＤＮの免疫活性のレベルに対して影響を
有し得ることが示されたが、異なるＣｐＧモチーフが、異なる免疫効果を示し得
るか否かは不明であった。この可能性を評価するために、本発明者らは、ＮＫ溶
解活性、Ｂ細胞増殖を誘導するＣｐＧ ＯＤＮの能力、およびマウス脾臓細胞中
においてＴＮＦ−α，ＩＬ−６，ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の合成を刺激する
ＣｐＧ ＯＤＮの能力について、ＣｐＧ ＯＤＮのパネルを試験した。ＣｐＧモ
チーフを有さないＯＤＮ（ＯＤＮ １９８２（配列番号２２５），ＯＤＮ １９
８３（配列番号２２６））の免疫刺激活性は、ＣｐＧ ＯＤＮと比較して、ネガ
ティブであるか、または弱かった。最適なＣｐＧモチーフを有さないＯＤＮ（Ｏ
ＤＮ １６２８（配列番号７６７），ＯＤＮ １７５８（配列番号１））は、２
個の５’プリンおよび２個の３’ピリミジンに隣接されたＣｐＧモチーフを含む
ＯＤＮ（ＯＤＮ １７６０（配列番号３），ＯＤＮ １８２６（配列番号６９）
，ＯＤＮ １８４１（配列番号８４））よりも低い活性であった。２個の最適マ
ウスＣｐＧモチーフ（５’ ＧＡＣＧＴＴ ３’）（配列番号１１４３）を含む
ＯＤＮ １８２６は、６つの測定終点のうちの５つで最高の活性を有した。ＯＤ
Ｎ １６２８を除いて、すべてのＯＤＮが、一般的に類似した活性パターンを示
した（ＮＫ細胞媒介性溶解、Ｂ細胞増殖、ＩＬ−１２，ＩＬ−６，ＴＮＦα，Ｉ
ＦＮ−γ）。注目すべきことに、２個のＧリッチ領域を含むために、このパネル
において独特であったＯＤＮ １６２８は、ＩＦＮ−γ合成の優先的誘導を示し
たが、他の活性については、比較的低刺激であった。
【０３６２】 インビボアジュバント活性と相関するインビトロアッセイの同定： アジュバント活性は、インビボ終点であるので、本発明者らは、インビボでの
ＣｐＧ ＯＤＮのアジュバント活性を予測するインビトロアッセイの同定に関心
を抱いた。従って、インビトロ終点に用いられたのと同じＯＤＮを、ＨＢｓＡｇ
に対してマウスを免疫するために、そのアジュバント活性について試験した。こ
れを、ＯＤＮ単独およびミョウバンと組み合わせたＯＤＮの両方で実施した。な
ぜなら、以前の研究によって、ＣｐＧ ＯＤＮとミョウバンアジュバントとにつ
いて、強力な相乗作用が示されていたからである（ＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９８
／４０１００）。
【０３６３】 アジュバントなしのＨＢｓＡｇで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスは、４週目ま
で低力価の抗ＨＢを達成するのみであり、そしてこれは、コントロールＯＤＮの
添加によって影響を受けなかった。対照的に、ＣｐＧ ＯＤＮの添加は、使用さ
れる配列に依存して、抗ＨＢ力価を５〜４０倍上昇させた。ミョウバンが添加さ
れる場合、抗ＨＢの力価は、ＨＢｓＡｇ単独よりも約６倍高かった。詳細には、
コントロールＯＤＮは効果を有さず、そして種々のＣｐＧ ＯＤＮは、これらの
力価を２〜３６倍増強した。異なるＯＤＮ単独を用いて得られた結果は、同じＯ
ＤＮ＋ミョウバンを用いて得られた結果と非常に強く相関した（ｒ＝０．９６）
。直線回帰が実施される場合、特定のインビトロアッセイと抗ＨＢ力価のインビ
ボ増強との間には、非常に高い程度の相関が見出された。試験されたすべてのイ
ンビトロ終点のうち、ＮＫ溶解活性の誘導が、インビボアジュバント活性に対し
て最良の相関を示した（ミョウバンなし、ｒ＝０．９８；ミョウバンあり、ｒ＝
０．９５；ｐ＜０．０００１）。アジュバント活性に関する良好な相関はまた、
Ｂ細胞刺激（ｒ＝０．８４および０．７）、ならびにＴＮＦ−α（ｒ＝０．９お
よび０．８８）、ＩＬ−１２（ｒ＝０．８８および０．８６）、およびＩＬ−６
（ｒ＝０．８５および０．９１）の分泌について得られた。インビボでの結果と
十分には相関しなかったインビトロアッセイの１つが、ＩＦＮ−γ分泌（ｒ＝０
．５７および０．６８）であった。これらのデータは、ＮＫ溶解活性、Ｂ細胞活
性、ならびにＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−１２の産生についてのインビ
トロアッセイが、インビボにおける所定のＯＤＮのアジュバント活性を予測する
ために役立つインビトロ情報を提供することを実証する。
【０３６４】 ヒトＮＫ細胞を活性化するためのホスホロチオエートＯＤＮパネルのスクリー
ニング： 以前の研究において、本発明者らは、ヒトＰＢＭＣによる炎症性サイトカイン
の合成が、極めて低い量の内毒素によって誘導されることを見出した（誘導され
るＴＮＦ−α分泌は、ちょうど６ｐｇ／ｍｌの内毒素で検出可能であり、マウス
免疫細胞よりも２ｌｏｇ高い感受性）。対照的に、ヒトＢ細胞の活性化および内
毒素でのＮＫ細胞溶解活性の誘導は、高い内毒素濃度においてさえ低い。これら
の結果に基づいて、本発明者らは、被験体間の変動性が低い、最も特異性が高く
かつ再現可能なアッセイとして、ＮＫ細胞（溶解活性およびＣＤ６９発現）およ
びＢ細胞（増殖およびＣＤ８６発現）の活性を選択し、そしてＯＤＮのプールの
インビトロスクリーニングのためにこれらのアッセイを使用した。
【０３６５】 最初に、本発明者らは、標的細胞のＮＫ細胞媒介溶解に対する、ＣｐＧモチー
フの種々の組み合わせおよび置換を含むホスホチオエートＯＤＮの効果を研究し
た。提示の明確さおよび容易さのために、選択された代表的なＣｐＧおよびコン
トロールＯＤＮでのデータのみを示す。ヒトＰＢＭＣを、異なるホスホロチオエ
ートＯＤＮ（６μｇ／ｍｌ）と共に２４時間インキュベートし、そして51Ｃｒ標
識化Ｋ５６２細胞を溶解するその能力について試験した。ＯＤＮの５’末端でＴ
ｐＣと組み合わせて２個の６マーＣｐＧモチーフ（５’ ＧＡＣＧＴＴ ３’（
配列番号１１４３）または５’ ＧＴＣＧＴＴ ３’（配列番号１１４４）のい
ずれか）を有するＯＤＮ
【０３６６】
【化１２】 か、またはこの５’末端でＴｐＣを有さずに少なくとも３つの６マーモチーフを
有するＯＤＮ（ＯＤＮ ２０１３（配列番号２５３））は、中間の活性を示した
。高い活性は、５’ＴｐＣが６マーのヒトＣｐＧモチーフ
【０３６７】
【化１３】 に直接先行し、そして２個の６マーモチーフが続いた場合（ＯＤＮ ２００５（
配列番号２４５），ＯＤＮ ２００６（配列番号２４６）およびＯＤＮ ２００
７（配列番号２４７））に見出された。この最良の結果は、６マーのＣｐＧモチ
ーフが互いから離され、そしてＴｐＴによって５’の８マーＣｐＧモチーフから
離された場合（ＯＤＮ ２００６（配列番号２４６））に得られた。
【０３６８】 活性化マーカーＣＤ６９の発現は、刺激後にＮＫ細胞の表面において急速のア
ップレギュレートされる。ＮＫ細胞溶解アッセイからの結果を確認するために、
ＰＢＭＣをＯＤＮ（２μｇ／ｍｌ）と共に１８時間インキュベートした。ＣＤ６
９発現を、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞（ＣＤ３，ＣＤ１４およびＣＤ１９ネガティブ
）において試験した。ＣＤ６９発現の誘導は、ＮＫ細胞の機能的活性の刺激より
も、さほど配列によって制限されないが、コントロールＯＤＮ（ＯＤＮ １９８
２，ＯＤＮ ２１１６，ＯＤＮ ２１１７，ＯＤＮ ２０１０）は、バックグラ
ウンドレベルと類似した低い活性しか示さなかった。５’ ＴＴＴＴ ３’によ
って隔てられた２個のヒトＣｐＧモチーフを有するＯＤＮ（ＯＤＮ １９６５（
配列番号２０８））、または空間を隔てずに４個のヒトＣｐＧモチーフを有する
ＯＤＮ（ＯＤＮ ２０１３（配列番号２５３））は、ＮＫ細胞溶解活性の刺激よ
りも、ＣＤ６９発現誘導において、相対的により活性であった。最適なＮＫ細胞
機能的活性、ならびにＣＤ６９発現は、ＴｐＣジヌクレオチド先行ヒトＣｐＧモ
チーフ、および配列内にさらなるヒトモチーフを含むＯＤＮ（ＯＤＮ ２００６
（配列番号２４６），ＯＤＮ ２００７（配列番号２４７））で得られた。
【０３６９】 ヒトＢ細胞を刺激することについてのホスホロチオエートＯＤＮの活性：予備
実験において、本発明者らは、増殖中のＢ細胞の割合（ＣＦＳＥアッセイ。方法
の節を参照のこと）が、フローサイトメトリーにより測定した場合に、Ｂ細胞上
の補助的刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）ＣＤ８６の表面発現に相関した
ことを見出した。従って、本発明者らは、その免疫刺激活性についてＯＤＮの群
をスクリーングするために、Ｂ細胞上でのＣＤ８６発現を使用した。ＰＢＭＣ（
末梢血単核球）を、０．６μｇ／ｍｌのＯＤＮとともにインキュベートした。Ｃ
Ｄ８６の発現（平均蛍光強度。ＭＦＩ）を、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞に対して試験し
た。ポリＣ ＯＤＮ（ＯＤＮ ２０１７（配列番号２５７））またはＣｐＧジヌ
クレオチドを含まないＯＤＮ（ＯＤＮ １９８２（配列番号２２５））は、これ
らの実験条件下でヒトＢ細胞を刺激しなかった。ＴｐＣの後に続く１つの最適な
ヒトＣｐＧモチーフ（５’ ＴＣＧＴＣＧＴＴ ３’（配列番号１１４５））を
含むホスホロチオエートＯＤＮ（ＯＤＮ ２１１６（配列番号２５６）は、低い
活性を有した。１つのヒト６マーＣｐＧモチーフ（５’ ＧＴＣＧＴＴ ３’（
配列番号１１４４））の存在は、活性化効果を有さなかった。配列中のこれらの
ＣｐＧモチーフのうちの２つは、その配列の状況に依存して、何の活性も示さな
い（ＯＤＮ １９６０（配列番号２０３）、ＯＤＮ ２０１６（配列番号２５６
））か、または中間の活性を示した（ＯＤＮ １９６５（配列番号２０８）。そ
のＯＤＮが３コピーまたは４コピーのこのモチーフから構成されていた場合（Ｏ
ＤＮ ２０１２（配列番号２５２）、ＯＤＮ ２０１３（配列番号２５３）、Ｏ
ＤＮ ２０１４（配列番号２５４））、Ｂ細胞に対する中間の活性が検出され得
た。２つの６マーＣｐＧモチーフとの、ＯＤＮの５’末端上のヒト８マーＣｐＧ
モチーフの組み合わせ（ＯＤＮ ２００５（配列番号２４５）、ＯＤＮ ２００
６（配列番号２４６）、ＯＤＮ ２００７（配列番号２４７）、ＯＤＮ ２１０
２（配列番号３４３）、ＯＤＮ ２１０３（配列番号３４４）は、そのＯＤＮが
Ｂ細胞を刺激する能力においてかなりの増加をもたらした。単一のモチーフ間の
間隔は重要であった。ＴｐＴによるＣｐＧモチーフの分離が、隔てられていない
ＣｐＧモチーフ（ＯＤＮ ２００５（配列番号））と比較して好ましかった（Ｏ
ＤＮ ２００６（配列番号２４６））；また、ＯＤＮ １９６５（配列番号２０
８）と比較したＯＤＮ１９６０（配列番号２０３））。ヒト６マーＣｐＧモチー
フ（５’ ＧＴＣＧＴＴ ３’）は、５’末端上のヒト８マーＣｐＧモチーフと
組み合わせた場合に、最適なマウス６マーＣｐＧモチーフ（５’ ＧＡＣＧＴＴ
３’（配列番号２４６））よりも良好であった（ＯＤＮ ２００６ 対 ＯＤ
Ｎ ２１０２（配列番号３４３）およびＯＤＮ ２１０３（配列番号３４４））
。（ＴＣＧ）poly ＯＤＮは、グアニンまたは他のＣｐＧジヌクレオチドに隣接
するＣｐＧジヌクレオチドを含むＯＤＮ（ＯＤＮ ２０１０（配列番号２５０）
）と同様に、不活性であるかまたはほんの弱くしか活性がなかった。まとめると
、ＮＫ細胞およびＢ細胞についての知見は、試験したＯＤＮの知見と一致して、
ＯＤＮ ２００６（配列番号２４６）が、ヒト免疫細胞に対して最も高い免疫刺
激活性を有することを示した。
【０３７０】 異なる霊長類におけるＣｐＧホスホロチオエートＯＤＮの効力の比較分析：異
なるＣｐＧモチーフが、マウスおよびヒトの免疫細胞を活性化するために最適で
ある。さらに、活性なホスホロチオエートＯＤＮ中のＣｐＧモチーフの数および
位置は、マウスおよびヒトにおいて異なる。本発明者らは、ＣｐＧホスホロチオ
エートＯＤＮが異なる種の霊長類の間で同様の活性を示すか否かを知ることに興
味を抱いた。本発明者らは、ヒト、チンパンジーおよびアカゲザルもしくはカニ
クイザルにおいてＢ細胞増殖を誘導する能力について、ＣｐＧ ＯＤＮの群を比
較した。ＯＤＮがヒトＢ細胞増殖を刺激する能力（表Ｊ）は、Ｂ細胞上でのＣＤ
８６発現を誘導する能力とよく相関した。ＯＤＮ２００６（配列番号２４６）は
、ヒトのＢ細胞およびＮＫ細胞において最高の活性を示したが、チンパンジーお
よびアカゲザルのＢ細胞増殖を刺激する際も最も活性であった（表Ｊ）。ＯＤＮ
１９６８（配列番号２１１）およびＯＤＮ ２００６（配列番号２４６）は、
インビトロでカニクイザルＢ細胞の最高の活性化を生じた（６μｇ ＯＤＮ／ｍ
ｌでそれぞれ、ＳＩが２５および２９）。驚くことに、ＣｐＧ ＯＤＮ ２００
７（配列番号２４７）は、ヒト細胞において最適なＯＤＮ２００６（配列番号２
４６）と同様に高い活性を示したが、アカゲザルまたはチンパンジーのＢ細胞増
殖は刺激せず、そしてＯＤＮ １９６８（配列番号２１１）は、低い活性を示し
た。マウスにおける高い活性で元々同定されたＣｐＧ ＯＤＮ（ＯＤＮ １７６
０（配列番号３）、ＯＤＮ １８２６（配列番号６９））は、サルにおいてほと
んど活性を示さなかった（表Ｊ）。
【０３７１】 （表Ｊ：霊長類におけるホスホロチオエートＣｐＧ ＯＤＮに対するＰＢＭＣ
（末梢血単核球）の増殖応答）
【０３７２】
【表９】 ＰＢＭＣを、末梢血から調製し、そして示されるように５日間ＯＤＮ（０．６μ
ｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。増殖は、最後の１８時間の間の3Ｈ／
チミジン取り込み（ｃｐｍ／１０００）により測定した。９５％を超える増殖中
の細胞が、ＣＦＳＥアッセイを使用して決定するとＢ細胞であった。４人のヒト
発端者、６匹のチンパンジーおよび２匹のアカゲザルを試験した。
【０３７３】 チンパンジーおよびカニクイザルにおけるＣｐＧ ＯＤＮのインビボアジュバ
ント活性：霊長類細胞に対して強力なインビトロ刺激効果を有するＣｐＧ ＯＤ
Ｎがインビボで検出可能なアジュバント活性を有するか否かを評価するために、
カニクイザルおよびチンパンジーに、ミョウバンに吸着したＨＢｓＡｇを含むＥ
ｎｇｅｒｉｘ Ｂで、単独でか、またはそれぞれ添加したＯＤＮ １９６８（５
００μｇ）もしくはＯＤＮ ２００６（配列番号２４６）（１ｍｇ）とともに、
免疫した。ＣｐＧ ＯＤＮを受けないコントロールと比較して、刺激後４週間目
およびブースト後２週間目の抗ＨＢｓ力価は、それぞれ、サルにおいて６６倍お
よび１６倍高く、そしてチンパンジーにおいて１５倍および３倍高かった（表Ｋ
）。従って、ＣｐＧ ＯＤＮの明らかなアジュバント効果が観察され、そしてこ
れは、単回免疫後に特に著しかった。
【０３７４】 （表Ｋ：ＣｐＧ ＯＤＮを含むＨＢｓＡｇに対して免疫された霊長類における
抗ＨＢｓ応答3）
【０３７５】
【表１０】 3 動物に、アルブミンに吸着した１０μｇ ＨＢｓＡｇを含むＥｎｇｅｒｉｘ
Ｂを、単独でか、または添加したＯＤＮとともに、ＩＭ（筋肉内）注射すること
により、免疫した。カニクイザルに、刺激後１０週目にブーストし、そしてチン
パンジーに、刺激後４週目にブーストした。抗ＨＢｓをＥＬＩＳＡアッセイによ
り決定した；サルについての値は、ＧＭＴ±ＳＥＭ（ｎ＝５）であるが、各群に
おける２匹のチンパンジーについての個々の値が提供される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、０．１５μｇ／ｍｌの濃度でＸ軸に示されたオリゴヌクレオチドに
対するこれらの細胞の曝露後のＣＤ１９＋細胞によるＣＤ８６（Ｙ軸）の発現の
棒グラフである。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、０．３０μｇ／ｍｌの濃度でＸ軸に示されたオリゴヌクレオチドに
対するこれらの細胞の曝露後のＣＤ１９＋細胞によるＣＤ８６（Ｙ軸）の発現の
棒グラフである。
【図２】 図２は、０．２μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌまで変化する濃度で、Ｂ細胞増
殖を刺激するＯＤＮ２１３７、ＯＤＮ２１７７、ＯＤＮ２２００およびＯＤＮ２
２０２の能力を比較するグラフである。
【図３】 図３は、０．２μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌまで変化する濃度で、Ｂ細胞増
殖を刺激するＯＤＮ２１８８、ＯＤＮ２１８９、ＯＤＮ２１９０およびＯＤＮ２
１８２の能力を比較するグラフである。
【図４】 図４は、非ＣｐＧ ＯＤＮによって誘導される用量依存Ｂ細胞活性化を示す棒
グラフである。血液ドナーのＰＢＭＣを、示される濃度のＯＤＮ２００６（配列
番号２４６）、２１１７（配列番号３５８）、２１３７（配列番号８８６）、５
１２６（配列番号１０５８）および５１６２（配列番号１０９４）でインキュベ
ートし、そして、ＣＤ１９（Ｂ細胞マーカー）およびＣＤ８６（Ｂ細胞活性化マ
ーカー、Ｂ７−２）について、ｍＡｂで染色した。発現をフローサイトメトリー
によって測定した。
【図５】 図５は、多様なセットの非ＣｐＧ ＯＤＮによるＢ細胞の活性化を示す棒グラ
フである。１つの代表的なドナーのＰＢＭＣを、以下の０．４μｇ／ｍｌ、１．
０μｇ／ｍｌまたは１０．０μｇ／ｍｌのＯＤＮ：２００６（配列番号２４６）
、２１９６（配列番号９１３）、２１９４（配列番号９１１）、５１６２（配列
番号１０９４）、５１６３（配列番号１０９５）、５１６８（配列番号１０９６
）および５１６９（配列番号１０９７）によって刺激し、そしてＣＤ１９陽性Ｂ
細胞に対する活性化マーカーＣＤ８６（Ｂ７−２）の発現をフローサイトメトリ
ーによって測定した。
【図６】 図６は、非ＣｐＧ ＯＤＮ １９８２および２０４１によるＢ細胞活性化を示
す棒グラフである。ＰＢＭＣを、示される濃度のＯＤＮ２００６（配列番号２４
６）、１９８２（配列番号２２５）および２０４１（配列番号２８２）でインキ
ュベートし、そして、Ｂ細胞活性化（活性化マーカーＣＤ８６の発現）をフロー
サイトメトリーによって測定した。
【図７】 図７は、ＮＫ細胞が非ＣｐＧ ＯＤＮによって活性化されることを示す棒グラ
フである。ＰＢＭＣを６μｇ／ｍｌの以下のＯＤＮ：２００６（配列番号２４６
）、２１１７（配列番号３５８）、２１３７（配列番号８８６）、２１８３（配
列番号４３３）、２１９４（配列番号９１１）および５１２６（配列番号１０５
８）でインキュベートし、そして、ＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）、ＣＤ５６（ＮＫ
細胞マーカー）およびＣＤ６９（初期活性化マーカー）についてｍＡｂで染色し
た。ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞に対するＣＤ６９の発現を、フローサイトメトリーに
よって測定した。
【図８】 図８は、ＮＫ媒介の細胞障害性が非ＣｐＧ ＯＤＮによって増強されることを
示す棒グラフである。６μｇ／ｍｌのＯＤＮ２００６（配列番号２４６）、２１
９４（配列番号９１１）および５１２６（配列番号１０５８）とＰＢＭＣを一晩
中インキュベートした後、Ｋ−５６２標的細胞のＮＫ媒介の溶解を測定した。
【図９】 図９は、ＮＫＴ細胞が非ＣｐＧ ＯＤＮによって活性化され得ることを示す棒
グラフである。１つの例示的なドナーのＰＢＭＣを、６μｇ／ｍｌのＯＤＮ２０
０６（配列番号２４６）、２１１７（配列番号３５８）、２１３７（配列番号８
８６）、２１８３（配列番号４３３）、２１９４（配列番号９１１）および５１
２６（配列番号１０５８）と２４時間インキュベートし、そして、ＣＤ３（Ｔ細
胞マーカー）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞マーカー）およびＣＤ６９（初期活性化マー
カー）についてｍＡｂを使用する細胞の染色後、フローサイトメトリーによって
ＮＫＴ細胞の活性化を測定した。
【図１０】 図１０は、異なったＣｐＧおよび非ＣｐＧ ＯＤＮによる単球の刺激を示す棒
グラフである。ＰＢＭＣを６μｇ／ｍｌの２００６（配列番号２４６）、２１１
７（配列番号３５８）、２１３７（配列番号８８６）、２１７８（配列番号４２
８）、２１８３（配列番号４３３）、２１９４（配列番号９１１）、５１２６（
配列番号１０５８）および５１６３（配列番号１０９５）でインキュベートし、
そして、ＣＤ１４（単球マーカー）およびＣＤ８０（Ｂ７−１、活性化マーカー
）について染色した。発現をフローサイトメトリーによって測定した。
【図１１】 図１１は、非ＣｐＧ ＯＤＮを使用するヒト細胞の培養の際のＴＮＦαの放出
を示す棒グラフである。６μｇ／ｍｌの示されたＯＤＮまたは陽性コントロール
として１μｇ／ｍｌ ＬＰＳを用いてかまたは用いずに、ＰＢＭＣを２４時間培
養し、そしてＴＮＦαをＥＬＩＳＡによって測定した。
【図１２】 図１２は、ＴＮＦαと同一のパターンを示す非ＣｐＧ ＯＤＮを使用する培養
後のＩＬ−６の放出を示す棒グラフである。ＰＢＭＣを、示されたＯＤＮ（１．
０μｇ／ｍｌ）とインキュベートし、そして、ＩＬ−６をＥＬＩＳＡによって上
清において測定した。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１２月２１日（２００１．１２．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】 （発明の背景） 細菌ＤＮＡ（脊椎動物ＤＮＡではない）は、インビトロにおいて、末梢血単核
細胞（ＰＢＭＣ）に対して直接的な免疫刺激効果を有する（Ｋｒｉｅｇら、１９
９５）。細菌ＤＮＡは、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化する免疫刺
激効果を有するが、脊椎動物ＤＮＡは、そうではない（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．
，ら，１９８８．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７９：６８２〜６８６；
Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．ら，１９８４，ＪＮＣＩ ７２：９５５〜９６２；Ｍｅ
ｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．ら，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９〜
１７６４；および総説、Ｋｒｉｅｇ，１９９８，：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃ．Ａ．Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ
Ａ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ，（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ
，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，４３１〜４４８頁）。細菌ＤＮＡのこれ
らの免疫刺激効果は、特定の塩基内容（ｃｏｎｔｅｘｔ）（ＣｐＧモチーフ）に
おける非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの存在の結果であり、これは、細菌ＤＮ
Ａにおいては一般的であるが、脊椎動物ＤＮＡにおいてはメチル化され、実際以
下に示される（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔ）（ＣｐＧ抑制、１／５０〜１／
６０）（Ｋｒｉｅｇら，１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６〜５４９；Ｋ
ｒｉｅｇ，１９９９ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９３３２１
：１〜１０）。細菌ＤＮＡの免疫刺激効果は、これらのＣｐＧモチーフを含む合
成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を模倣し得る。ＣｐＧ ＤＮＡに応答
した迅速な免疫活性化が、微生物分子に特異的な構造的パターンを認識する生得
の免疫防御機構の１つの成分として発展しただろうと思われる。 ＣｐＧ ＯＤＮは、ヒトおよびマウスの白血球に対して非常に刺激性の効果を
有し、ほとんど全て（＞９５％）のＢ細胞の増殖および免疫グロブリン（Ｉｇ）
分泌の増加；サイトカイン分泌；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性および
ＩＦＮ−γ分泌；ならびに樹状細胞（ＤＣ）および他の抗原提示細胞を活性化し
て同時刺激性分子を発現し、そしてサイトカイン（特に、Ｔｈ−１様Ｔ細胞応答
の発生を促進する際に重要なＴｈ様サイトカイン）を分泌することを誘導する。
ＣｐＧ ＤＮＡによるＢ細胞活性化は、Ｔ細胞依存性であり、そして抗原非特異
的である。しかし、低濃度のＣｐＧ ＤＮＡによるＢ細胞活性化は、Ｂ細胞増殖
とＩｇ分泌との両方に対するＢ細胞抗原レセプターを介して送達されるシグナル
と強力な相乗作用を有する（Ｋｒｉｅｇら、１９９５）。Ｂ細胞抗原レセプター
を介してそしてＣｐＧ ＤＮＡにより引き起こされるＢ細胞シグナル伝達経路間
のこの強力な相乗作用は、抗原特異的免疫応答を促進する。Ｂ細胞に対するその
直接的な効果に加えて、ＣｐＧ ＤＮＡはまた、単球、マクロファージ、および
樹状細胞を直接活性化して種々のサイトカイン（高レベルのＩＬ−１２を含む）
を分泌する（Ｋｌｉｎｍａｎら、１９９６；Ｈａｌｐｅｒｎら、１９９６；Ｃｏ
ｗｄｅｒｙら、１９９６）。これらのサイトカインは、ナチュラルキラー（ＮＫ
）細胞を刺激してｇ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）を分泌し、そして溶解性
活性を増加した（Ｋｌｉｎｍａｎら、１９９６、上記；Ｃｏｗｄｅｒｙら、１９
９６、上記；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９２；Ｂａｌｌａｓら、１９９２）。全
体として、ＣｐＧ ＤＮＡは、Ｔｈ２サイトカインのわずかな分泌とともに、Ｉ
Ｌ−１２およびＩＦＮ−γによって支配されるサイトカイン産生のＴｈ１様パタ
ーンを誘導する（Ｋｌｉｎｍａｎら、１９９６）。Ｂ細胞に対するＣｐＧ ＤＮ
Ａの強力な直接的な効果（Ｔ細胞依存性）、ならびにＴヘルプ経路を介するＢ細
胞に対する間接的な効果を有し得るサイトカインの誘導は、ワクチンアジュバン
トとしてＯＤＮの形態でのＣｐＧ ＤＮＡの有用性を示唆する（ＰＣＴ特許出願
公開番号ＷＯ９８／４０１００を参照のこと）。 ネイティブなホスホジエステル骨格ＣｐＧ ＯＤＮのこれらの免疫刺激効果は
、ＣｐＧモチーフがメチル化されるか、ＧｐＣに変化するか、あるいはそうでな
ければ除去されるかまたは変化する場合、この効果が基本的に破壊される点で非
常にＣｐＧ特異的である（Ｋｒｉｅｇら，１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５
４６〜５４９；Ｈａｒｔｍａｎｎら，１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：９３０５〜１０）。ホスホジエステルＣｐＧ ＯＤＮ
は、免疫刺激効果を高めるために、脂質、ミョウバン、あるいは蓄積の性質また
は改善された細胞取り込みを有する他の種類のビヒクル中で処方され得る（Ｙａ
ｍａｍｏｔｏら，１９９４ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：８３
１〜８３６；Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉら，１９９８ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４：１０９
〜１１８）。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年４月８日（２００２．４．８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９７】
【表７】 （実施例３：Ｔリッチ非ＣｐＧ ＯＤＮによるＢ細胞増殖の誘導） Ｂ細胞増殖を活性化するＴリッチＯＤＮの能力を評価するために、ヒトＰＢＭ
Ｃを細胞質色素であるＣＳＦＥを用いて染色し、０．１５または０．３μｇ／ｍ
ｌのいずれかの指定のＯＤＮと共に、５日間インキュベートし、次いで、フロー
サイトメトリーにより分析した。Ｂ細胞を、系列マーカー（ＣＤ１９）について
陽性の細胞に対するゲーティングにより同定した。ＣｐＧ ＯＤＮ２００６は、
Ｂ細胞増殖の強力なインデューサーであり、そしてこの効果は、ＣｐＧモチーフ
が、０．３μｇ／ｍｌのＯＤＮ濃度で、図１Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに示したように
、メチル化されるか、またはＧｐＣに転化された場合、低下した。ＯＤＮの塩基
組成は、免疫刺激効果を決定する際に重要であるようである。ＯＤＮのＴ含有量
を低下させることは、ＯＤＮ２１７７（配列番号４２７）により例示されるよう
に、免疫刺激効果を実質的に減少させる。ここで、ＯＤＮ２１３７（配列番号８
８６）に存在する６個のＴは、Ａに転化されており、その結果、非常に低下した
免疫刺激効果を生じた。ＯＤＮの免疫刺激効果におけるＴの重要性をまた、ＯＤ
Ｎ２１１６（配列番号３５７）および２１８１（配列番号４３１）（これらはＯ
ＤＮの３’末端が異なる）の比較により示す。ＯＤＮ２１８１（３’末端はポリ
Ｔである）は、両方のＯＤＮが５’末端にＴＣＧＴＣＧを有するにもかかわらず
、ＤＮ２１１６（３’末端はポリＣである）よりも、より免疫刺激性である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、０．１５μｇ／ｍｌの濃度でＸ軸に示されたオリゴヌクレオチドに
対するこれらの細胞の曝露後のＣＤ１９＋細胞によるＣＤ８６（Ｙ軸）の発現の
棒グラフである。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、図１Ａからのデータを含む表である。
【図１Ｃ】 図１Ｃは、０．３０μｇ／ｍｌの濃度でＸ軸に示されたオリゴヌクレオチドに 対するこれらの細胞の曝露後のＣＤ１９＋細胞によるＣＤ８６（Ｙ軸）の発現の 棒グラフである。
【図１Ｄ】 図１Ｄは、図１Ｃからのデータを含む表である。
【図２】 図２は、０．２μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌまで変化する濃度で、Ｂ細胞増
殖を刺激するＯＤＮ２１３７、ＯＤＮ２１７７、ＯＤＮ２２００およびＯＤＮ２
２０２の能力を比較するグラフである。
【図３】 図３は、０．２μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌまで変化する濃度で、Ｂ細胞増
殖を刺激するＯＤＮ２１８８、ＯＤＮ２１８９、ＯＤＮ２１９０およびＯＤＮ２
１８２の能力を比較するグラフである。
【図４】 図４は、非ＣｐＧ ＯＤＮによって誘導される用量依存Ｂ細胞活性化を示す棒
グラフである。血液ドナーのＰＢＭＣを、示される濃度のＯＤＮ２００６（配列
番号２４６）、２１１７（配列番号３５８）、２１３７（配列番号８８６）、５
１２６（配列番号１０５８）および５１６２（配列番号１０９４）でインキュベ
ートし、そして、ＣＤ１９（Ｂ細胞マーカー）およびＣＤ８６（Ｂ細胞活性化マ
ーカー、Ｂ７−２）について、ｍＡｂで染色した。発現をフローサイトメトリー
によって測定した。
【図５】 図５は、多様なセットの非ＣｐＧ ＯＤＮによるＢ細胞の活性化を示す棒グラ
フである。１つの代表的なドナーのＰＢＭＣを、以下の０．４μｇ／ｍｌ、１．
０μｇ／ｍｌまたは１０．０μｇ／ｍｌのＯＤＮ：２００６（配列番号２４６）
、２１９６（配列番号９１３）、２１９４（配列番号９１１）、５１６２（配列
番号１０９４）、５１６３（配列番号１０９５）、５１６８（配列番号１０９６
）および５１６９（配列番号１０９７）によって刺激し、そしてＣＤ１９陽性Ｂ
細胞に対する活性化マーカーＣＤ８６（Ｂ７−２）の発現をフローサイトメトリ
ーによって測定した。
【図６】 図６は、非ＣｐＧ ＯＤＮ １９８２および２０４１によるＢ細胞活性化を示
す棒グラフである。ＰＢＭＣを、示される濃度のＯＤＮ２００６（配列番号２４
６）、１９８２（配列番号２２５）および２０４１（配列番号２８２）でインキ
ュベートし、そして、Ｂ細胞活性化（活性化マーカーＣＤ８６の発現）をフロー
サイトメトリーによって測定した。
【図７】 図７は、ＮＫ細胞が非ＣｐＧ ＯＤＮによって活性化されることを示す棒グラ
フである。ＰＢＭＣを６μｇ／ｍｌの以下のＯＤＮ：２００６（配列番号２４６
）、２１１７（配列番号３５８）、２１３７（配列番号８８６）、２１８３（配
列番号４３３）、２１９４（配列番号９１１）および５１２６（配列番号１０５
８）でインキュベートし、そして、ＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）、ＣＤ５６（ＮＫ
細胞マーカー）およびＣＤ６９（初期活性化マーカー）についてｍＡｂで染色し
た。ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞に対するＣＤ６９の発現を、フローサイトメトリーに
よって測定した。
【図８】 図８は、ＮＫ媒介の細胞障害性が非ＣｐＧ ＯＤＮによって増強されることを
示す棒グラフである。６μｇ／ｍｌのＯＤＮ２００６（配列番号２４６）、２１
９４（配列番号９１１）および５１２６（配列番号１０５８）とＰＢＭＣを一晩
中インキュベートした後、Ｋ−５６２標的細胞のＮＫ媒介の溶解を測定した。
【図９】 図９は、ＮＫＴ細胞が非ＣｐＧ ＯＤＮによって活性化され得ることを示す棒
グラフである。１つの例示的なドナーのＰＢＭＣを、６μｇ／ｍｌのＯＤＮ２０
０６（配列番号２４６）、２１１７（配列番号３５８）、２１３７（配列番号８
８６）、２１８３（配列番号４３３）、２１９４（配列番号９１１）および５１
２６（配列番号１０５８）と２４時間インキュベートし、そして、ＣＤ３（Ｔ細
胞マーカー）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞マーカー）およびＣＤ６９（初期活性化マー
カー）についてｍＡｂを使用する細胞の染色後、フローサイトメトリーによって
ＮＫＴ細胞の活性化を測定した。
【図１０】 図１０は、異なったＣｐＧおよび非ＣｐＧ ＯＤＮによる単球の刺激を示す棒
グラフである。ＰＢＭＣを６μｇ／ｍｌの２００６（配列番号２４６）、２１１
７（配列番号３５８）、２１３７（配列番号８８６）、２１７８（配列番号４２
８）、２１８３（配列番号４３３）、２１９４（配列番号９１１）、５１２６（
配列番号１０５８）および５１６３（配列番号１０９５）でインキュベートし、
そして、ＣＤ１４（単球マーカー）およびＣＤ８０（Ｂ７−１、活性化マーカー
）について染色した。発現をフローサイトメトリーによって測定した。
【図１１】 図１１は、非ＣｐＧ ＯＤＮを使用するヒト細胞の培養の際のＴＮＦαの放出
を示す棒グラフである。６μｇ／ｍｌの示されたＯＤＮまたは陽性コントロール
として１μｇ／ｍｌ ＬＰＳを用いてかまたは用いずに、ＰＢＭＣを２４時間培
養し、そしてＴＮＦαをＥＬＩＳＡによって測定した。
【図１２】 図１２は、ＴＮＦαと同一のパターンを示す非ＣｐＧ ＯＤＮを使用する培養
後のＩＬ−６の放出を示す棒グラフである。ＰＢＭＣを、示されたＯＤＮ（１．
０μｇ／ｍｌ）とインキュベートし、そして、ＩＬ−６をＥＬＩＳＡによって上
清において測定した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ ４Ｃ０８６ 39/08 39/08 ４Ｃ０８７ 39/085 39/085 39/102 39/102 39/106 39/106 39/108 39/108 39/145 39/145 39/21 39/21 39/245 39/245 39/395 39/395 Ｅ Ｔ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 1/00 1/16 1/16 1/18 1/18 11/00 11/00 11/06 11/06 13/12 13/12 15/00 15/00 17/00 17/00 19/00 19/00 25/00 25/00 27/02 27/02 31/00 31/00 31/04 31/04 31/12 31/12 35/00 35/00 37/08 37/08 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｎ 5/06 5/00 Ｅ (31)優先権主張番号 ６０／２２７，４３６ (32)優先日 平成12年８月23日(2000．8．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クリーグ， アーサー エム． アメリカ合衆国 アイオワ 52242， ア イオワ シティー， イーエム アールビ ー 540， デパートメント オブ イン ターナル メディシン， ユニバーシティ オブ アイオワ (72)発明者 シェッター， クリスティアン ドイツ国 デー−40724 ヒルデン， マ ックス−フォルマー シュトラーベ ４， キアゲン ゲーエムベーハー， コーリ ー ファーマシューティカル グループ ゲーエムベーハー (72)発明者 フォルマー， ヨルク ドイツ国 デー−40724 ヒルデン， マ ックス−フォルマー シュトラーベ ４， キアゲン ゲーエムベーハー， コーリ ー ファーマシューティカル グループ ゲーエムベーハー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA04 GA11 4B065 AA90X BB19 BB34 BB40 CA44 4C076 AA36 AA49 AA53 BB01 BB02 BB22 BB24 BB25 BB29 BB30 CC03 CC06 CC07 CC26 CC27 CC31 CC34 CC35 4C084 AA13 AA19 AA20 AA23 AA24 MA02 MA35 MA37 MA52 MA55 MA57 MA58 MA59 MA60 ZA591 ZA592 ZB071 ZB072 ZB091 ZB092 ZB131 ZB132 ZB211 ZB212 ZB261 ZB262 ZB331 ZB332 ZB351 ZB352 ZB371 ZB372 4C085 AA03 AA13 AA14 BA02 BA12 BA13 BA18 BA20 BA21 BA55 BA65 BA78 BB31 DD62 EE03 EE05 GG08 GG10 4C086 AA02 EA16 MA02 MA03 MA05 MA35 MA37 MA52 MA55 MA57 MA58 MA59 MA60 ZA59 ZB07 ZB09 ZB13 ZB26 ZB33 ZB35 ZB37 4C087 AA02 BC83 MA02 MA35 MA37 MA52 MA55 MA57 MA58 MA59 MA60 ZA59 ZB07 ZB09 ZB13 ZB26 ZB32 ZB37

Claims (106)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 免疫応答を刺激する方法であって、以下 非齧歯目被験体にＰｙリッチ免疫刺激核酸を、該非齧歯目被験体において免疫
    応答を誘導するのに有効な量で、投与する工程であって、該核酸は、Ｔが６０％
    より多くかつＣｐＧジヌクレオチドを含む、Ｔリッチ核酸である、工程 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記Ｔリッチ免疫刺激核酸が、以下 ５’ＴＴＴＴ ３’ を含むポリＴ核酸である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ポリＴ核酸が、以下 ５’Ｘ1Ｘ2ＴＴＴＴＸ3Ｘ4 ３’ を含み、ここで、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3およびＸ4が、ヌクレオチドである、請求項２に
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記Ｔリッチ免疫刺激核酸が、複数のポリＴ核酸モチーフを
    含む、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 Ｘ1Ｘ2がＴＴである、請求項３に記載の方法。
  6. 【請求項６】 Ｘ3Ｘ4がＴＴである、請求項３に記載の方法。
  7. 【請求項７】 Ｘ1Ｘ2が、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＡＴ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、Ｃ
    Ｔ、ＣＣ、ＣＡ、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡおよびＧＣからなる群より選択される、、請
    求項３に記載の方法。
  8. 【請求項８】 Ｘ3Ｘ4が、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＡＴ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、Ｃ
    Ｔ、ＣＣ、ＣＡ、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡおよびＧＣからなる群より選択される、、請
    求項３に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記Ｔリッチ免疫刺激核酸が、８０％より多いＴのヌクレオ
    チド組成を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記免疫刺激核酸が、少なくとも２０ヌクレオチドを含む
    、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記免疫刺激核酸が、少なくとも２４ヌクレオチドを含む
    、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記免疫刺激核酸が、少なくとも１つの骨格修飾を含むヌ
    クレオチド骨格を有する、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾である、請求項
    １２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記ヌクレオチド骨格が、キメラである、請求項１２に記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記ヌクレオチド骨格が、完全に修飾されている、請求項
    １２に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記免疫刺激核酸が、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含
    まない、請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記免疫刺激核酸が、ポリＣ配列を含まない、請求項１に
    記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記免疫刺激核酸が、ポリＡ配列を含まない、請求項１に
    記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記免疫刺激核酸が、ポリＧ配列を含まない、請求項１４
    に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記免疫刺激核酸が、２５％より多いＣのヌクレオチド組
    成を含む、請求項１に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記免疫刺激核酸が、２５％より多いＡのヌクレオチド組
    成を含む、請求項１に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記免疫刺激核酸が、経口投与される、請求項１に記載の
    方法。
  23. 【請求項２３】 前記免疫刺激核酸が、局所投与される、請求項１に記載の
    方法。
  24. 【請求項２４】 前記免疫刺激核酸が、徐放デバイスにおいて投与される、
    請求項１に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記免疫刺激核酸が、粘膜表面に粘膜投与される、請求項
    １に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記免疫応答が、粘膜免疫応答である、請求項２５に記載
    の方法。
  27. 【請求項２７】 前記免疫応答が、全身性免疫応答である、請求項２５に記
    載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記粘膜表面が、口腔表面、鼻表面、直腸表面、膣表面お
    よび眼表面からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記被験体を抗原に曝露する工程をさらに包含し、前記免
    疫応答が、抗原特異的免疫応答である、請求項１に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記抗原をコードする核酸ベクターが前記被験体に投与さ
    れ、該核酸ベクターは、前記免疫刺激核酸とは別々である、請求項２９に記載の
    方法。
  31. 【請求項３１】 前記抗原がペプチド抗原である、請求項２９に記載の方法
    。
  32. 【請求項３２】 前記被験体から免疫細胞を単離する工程、該免疫細胞を活
    性化するのに有効量の前記免疫刺激核酸を該免疫細胞に接触させる工程、および
    該活性化した免疫細胞を該被験体に再投与する工程をさらに包含する、請求項１
    に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記免疫細胞が、白血球である、請求項３２に記載の方法
    。
  34. 【請求項３４】 前記免疫細胞に抗原を接触させる工程をさらに包含する、
    請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記抗原が、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原および寄
    生生物抗原からなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記免疫細胞が、樹状細胞である、請求項３２に記載の方
    法。
  37. 【請求項３７】 前記被験体が、ぜん息を有するかまたはぜん息を発症する
    危険性があり、前記方法が、該被験体におけるぜん息を処置または予防する方法
    である、請求項１に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記被験体が、アレルギーを有するかまたはアレルギーを
    発症する危険性があり、前記方法が、アレルギーを処置または予防する方法であ
    る、請求項１に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記被験体が癌を有し、前記方法が、該癌を処置する方法
    である、請求項１に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 請求項３９に記載の方法であって、前記癌が、胆管癌；脳
    の癌；乳癌；頸部癌；絨毛癌；ＣＮＳの癌；結腸癌；結合組織の癌；子宮内膜癌
    ；眼の癌；胃癌；上皮内新生物；喉頭癌；リンパ腫；ホジキンリンパ腫；肝臓癌
    ；肺癌（例えば、小細胞癌および非小細胞癌）；黒色腫；神経芽腫；口の癌；口
    腔癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；甲状腺癌；および腎臓癌、な
    らびに他の癌腫および肉腫からなる群より選択される、方法。
  41. 【請求項４１】 請求項１に記載の方法であって、前記癌が、骨の癌、脳お
    よびＣＮＳの癌、結合組織の癌、食道癌、眼の癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、
    口腔癌、皮膚癌および精巣癌からなる群より選択される、方法。
  42. 【請求項４２】 抗癌療法剤を投与する工程をさらに包含する、請求項３９
    に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記抗癌療法剤が、抗体である、請求項４２に記載の方法
    。
  44. 【請求項４４】 前記被験体が、ヒトである、請求項３９に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記被験体が、イヌ、ネコおよびウマからなる群より選択
    される、請求項３９に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 細胞表面抗原に特異的な抗体を投与する工程をさらに包含
    し、前記免疫応答が、抗原依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を生じる、請求項
    １に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記被験体が、感染疾患を有するかまたは感染疾患を発症
    する危険性があり、前記方法が、該感染疾患を処置または予防する方法である、
    請求項１に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記被験体が、ヒトである、請求項４６に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記被験体に抗原を投与する工程をさらに包含する、請求
    項４６に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原、寄生生物抗原およ
    び真菌抗原からなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記被験体が、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、
    ヤギ、ニワトリ、サルおよび魚類からなる群より選択される、請求項４８に記載
    の方法。
  52. 【請求項５２】 前記被験体に抗原を投与する工程をさらに包含する、請求
    項５１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記抗原が、ヘルペスウイルス科、レトロウイルス科、オ
    ルトミクソウイルス科、トキソプラスマ、ヘモフィルス属、キャンピロバクター
    属、クロストリジウム属、Ｅ．ｃｏｌｉおよびブドウ球菌からなる群より選択さ
    れる微生物に由来する、請求項５１に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記免疫刺激核酸が、ＴＧモチーフをさらに含む、請求項
    １に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記ＴＧ核酸が、以下 ５’Ｎ1Ｘ1ＴＧＸ2Ｎ2 ３’ を含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 前記ＴＧ核酸が、以下 ５’Ｎ1Ｘ1Ｘ2ＴＧＸ3Ｘ4Ｎ2 ３’ を含む、請求項５４に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 Ｎ1が、（１１−Ｎ2）から（２１−Ｎ2）までの範囲のヌ
    クレオチド数から構成される核酸配列である、請求項５５に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 Ｎ2が、（１１−Ｎ1）から（２１−Ｎ1）までの範囲のヌ
    クレオチド数から構成される核酸配列である、請求項５５に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 Ｎ1が、（９−Ｎ2）から（１９−Ｎ2）までの範囲のヌク
    レオチド数から構成される核酸配列である、請求項５６に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 Ｎ2が、（９−Ｎ1）から（１９−Ｎ1）までの範囲のヌク
    レオチド数から構成される核酸配列である、請求項５６に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 Ｘ2が、チミジンである、請求項５５に記載の方法。
  62. 【請求項６２】 Ｘ3が、チミジンである、請求項５６に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 Ｘ1Ｘ2が、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＡＡ、ＡＴ、ＡＧ、ＣＴ、
    ＣＡ、ＣＧ、ＴＡおよびＴＴからなる群より選択されるヌクレオチドである、請
    求項５６に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 Ｘ3Ｘ4が、ＴＴ、ＣＴ、ＡＴ、ＡＧ、ＣＧ、ＴＣ、ＡＣ、
    ＣＣ、ＴＡ、ＡＡおよびＣＡからなる群より選択されるヌクレオチドである、請
    求項５６に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 Ｘ3Ｘ4が、ＴＴ、ＴＣ、ＴＡおよびＴＧからなる群より選
    択されるヌクレオチドである、請求項５５に記載の方法。
  66. 【請求項６６】 前記被験体が癌を発症する危険性があり、前記方法が、該
    癌を予防する方法である、請求項１に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 前記抗癌療法剤が、化学療法剤、免疫療法剤および癌ワク
    チンからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 被験体における疾患を予防するための方法であって、以下
    ： 該被験体における疾患を予防するために免疫刺激核酸を該被験体に規則的に投
    与する工程であって、該免疫刺激核酸は、６０％より多いＴでありかつＣｐＧジ
    ヌクレオチドを含むＴリッチ核酸、ＣｐＧジヌクレオチドを含まないＴＧ核酸、
    および２５％〜６０％のＴでありかつＣｐＧジヌクレオチドを含まないＴリッチ
    核酸からなる群より選択される、工程 を包含する、方法。
  69. 【請求項６９】 先天免疫応答を誘導するための方法であって、以下： 先天免疫応答を活性化するのに有効量の免疫刺激核酸を被験体に投与する工程
    であって、該免疫刺激核酸は、６０％より多いＴでありかつＣｐＧジヌクレオチ
    ドを含むＴリッチ核酸、ＣｐＧジヌクレオチドを含まないＴＧ核酸、および２５
    ％〜６０％のＴでありかつＣｐＧジヌクレオチドを含まないＴリッチ核酸からな
    る群より選択される、工程 を包含する、方法。
  70. 【請求項７０】 組成物であって、 免疫刺激核酸を含む徐放デバイスを含み、該免疫刺激核酸は、非メチル化Ｃｐ
    Ｇモチーフを含まず、そしてＴリッチ核酸およびＴＧ核酸からなる群より選択さ
    れる、組成物。
  71. 【請求項７１】 前記免疫刺激核酸が、ホスホジエステル骨格を有する、請
    求項７０に記載の組成物。
  72. 【請求項７２】 栄養補助剤の組成物であって、 カプセル、丸剤および舌下錠剤からなる群より選択される送達デバイス中にあ
    る免疫刺激核酸を含み、該該免疫刺激核酸は、非メチル化ＣｐＧモチーフを含ま
    ず、Ｔリッチ核酸およびＴＧ核酸からなる群より選択される 組成物。
  73. 【請求項７３】 前記免疫刺激核酸が、ホスホロチオエート骨格を有する、
    請求項７２に記載の組成物。
  74. 【請求項７４】 組成物であって、 免疫刺激核酸および抗原を含み、該免疫刺激核酸は、非メチル化ＣｐＧモチー
    フを含まず、そして 以下の配列 ５’Ｎ1Ｘ1Ｘ2ＴＧＸ3Ｘ4Ｎ2 ３’ を含むＴＧ免疫刺激核酸であって、ここで、Ｘ1Ｘ2が、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＡＡ
    、ＡＧ、ＡＣ、ＣＣ、ＣＡ、ＧＧ、ＧＡおよびＧＣからなる群より選択され、そ
    してＸ3Ｘ4が、ＡＴ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＡ、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡ
    およびＧＣからなる群より選択される、ＴＧ免疫刺激核酸、ならびに 以下の配列 ５’Ｘ1Ｘ2ＴＴＴＴＸ3Ｘ4 ３’ を含むＰｙリッチ免疫刺激核酸であって、ここで、Ｘ1Ｘ2が、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ
    、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＣＣ、ＣＡ、ＧＧ、ＧＡおよびＧＣからなる群より選択さ
    れ、そしてＸ3Ｘ4が、ＡＴ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＡ、ＧＴ、ＧＧ
    、ＧＡおよびＧＣからなる群より選択される、Ｐｙリッチ免疫刺激核酸 からなる群より選択される 組成物。
  75. 【請求項７５】 組成物であって、 免疫刺激核酸および抗微生物剤を含み、該免疫刺激核酸は、非メチル化ＣｐＧ
    モチーフを含まず、そしてＴリッチ核酸およびＴＧ核酸からなる群より選択され
    る 組成物。
  76. 【請求項７６】 前記抗微生物剤が、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生生物
    剤および抗細菌剤からなる群より選択される、請求項７５に記載の組成物。
  77. 【請求項７７】 前記免疫刺激核酸が、少なくとも３つ、少なくとも４つ、
    少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つのポリ
    Ｔモチーフを含む、請求項４に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 前記複数のポリＴ核酸モチーフの少なくとも２つが、各々
    少なくとも３つ連続するＴヌクレオチド残基を含む、請求項４に記載の方法。
  79. 【請求項７９】 前記ポリＴ核酸モチーフの少なくとも２つが、各々少なく
    とも４つ連続するＴヌクレオチド残基を含む、請求項４に記載の方法。
  80. 【請求項８０】 前記複数のポリＴ核酸モチーフが、少なくとも３つのポリ
    Ｔ核酸モチーフであり、該少なくとも３つのポリＴ核酸モチーフが、各々少なく
    とも３つ連続するＴヌクレオチド残基を含む、請求項４に記載の方法。
  81. 【請求項８１】 前記複数のポリＴ核酸モチーフが、少なくとも４つのポリ
    Ｔ核酸モチーフであり、該少なくとも４つのポリＴ核酸モチーフが、各々少なく
    とも３つ連続するＴヌクレオチド残基を含む、請求項４に記載の方法。
  82. 【請求項８２】 前記複数のポリＴ核酸モチーフの少なくとも１つが、少な
    くとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つ連続するＴ
    ヌクレオチド残基を含む、請求項４に記載の方法。
  83. 【請求項８３】 前記免疫刺激核酸が、少なくとも３つ連続するＣヌクレオ
    チド残基のポリＣ配列を少なくとも２つ含む、請求項１に記載の方法。
  84. 【請求項８４】 前記免疫刺激核酸が、少なくとも３つ連続するＡヌクレオ
    チド残基のポリＡ配列２つを含まない、請求項１に記載の方法。
  85. 【請求項８５】 免疫応答を刺激するのに有効量の請求項１、２、３、４、
    ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８
    、１９、２０、２１、２４、３２、３３、５６、５７、５８、５９、６０、６１
    、６２、６３、６４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３または８４に
    記載の単離された免疫刺激核酸および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学
    的組成物。
  86. 【請求項８６】 請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
    、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、３２
    、３３、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７７、７８
    、７９、８０、８１、８２、８３または８４に記載の単離された免疫刺激核酸お
    よび薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
  87. 【請求項８７】 前記核酸が、複数のＣｐＧモチーフをさらに含み、該複数
    のモチーフは、少なくとも３つのモチーフ、少なくとも４つのモチーフであり、
    該少なくとも４つのモチーフは、各々、少なくとも３つ連続するＴヌクレオチド
    残基を含む、請求項８２に記載の方法。
  88. 【請求項８８】 前記複数のＣｐＧモチーフおよびポリＴモチーフが、 分散している、請求項８７に記載の方法。
  89. 【請求項８９】 組成物であって、 薬学的に受容可能なキャリア中に処方されており、かつ癌の処置または癌の発
    症の危険性の減少に有効な量の、免疫刺激核酸および抗癌療法剤を含み、該免疫
    刺激核酸は、６０％より多いＴでありかつＣｐＧジヌクレオチドを含むＴリッチ
    核酸、ＣｐＧジヌクレオチドを含まないＴＧ核酸、および２５％〜６０％のＴで
    ありかつＣｐＧジヌクレオチドを含まないＴリッチ核酸からなる群より選択され
    る、 組成物。
  90. 【請求項９０】 組成物であって、 薬学的に受容可能なキャリア中に処方されており、かつぜん息またはアレルギ
    ーの媒介物への曝露に関連する免疫応答の予防または処置に有効な量の、免疫刺
    激核酸およびぜん息薬／アレルギー薬を含み、該免疫刺激核酸は、６０％より多
    いＴでありかつＣｐＧジヌクレオチドを含むＴリッチ核酸、ＣｐＧジヌクレオチ
    ドを含まないＴＧ核酸、および２５％〜６０％のＴでありかつＣｐＧジヌクレオ
    チドを含まないＴリッチ核酸からなる群より選択される、 組成物。
  91. 【請求項９１】 組成物であって、 免疫刺激核酸および薬学的に受容可能なキャリアを含み、該免疫刺激核酸は、
    配列番号９５〜１１９、配列番号１２１〜１３６、配列番号１３８〜１５２、配
    列番号１５４〜２１０、配列番号２１２〜２２２、配列番号２２４〜２４４、配
    列番号２４７〜２６０、配列番号２６３〜２７２、配列番号２７４〜２９９、配
    列番号３０１、配列番号３０３〜４０９、配列番号４１４〜４２０、配列番号４
    ２４、配列番号４２７〜７５８、配列番号７６０〜９４７、配列番号９５９〜９
    ６３、配列番号９６８〜１０２２および配列番号１０２４〜１０９３からなる群
    より選択される、 組成物。
  92. 【請求項９２】 組成物であって、 ５’Ｍ1ＴＣＧＴＣＧＴＴＭ2 ３’ から本質的になる免疫刺激核酸を含み、ここで、該Ｃのうちの少なくとも１つは
    、メチル化されておらず、Ｍ1は、少なくとも１つのヌクレオチドを有する核酸
    であり、Ｍ2は、０〜５０個のヌクレオチドを有する核酸であって、そして該免
    疫刺激核酸は、１００個未満のヌクレオチドを有する、 組成物。
  93. 【請求項９３】 薬学的組成物であって、 以下 ５’ＴＣＧＴＣＧＴＴ ３’ を含む免疫刺激核酸であって、ここで、該Ｃのうちの少なくとも１つは、メチル
    化されておらず、そして該免疫刺激核酸は、１００個未満のヌクレオチドを有し
    かつホスホジエステル骨格を有する、免疫刺激核酸、ならびに 徐放デバイス を含む、組成物。
  94. 【請求項９４】 前記徐放デバイスが、微小粒子である、請求項９３に記載
    の組成物。
  95. 【請求項９５】 抗原をさらに含む、請求項９３に記載の薬学的組成物。
  96. 【請求項９６】 免疫応答を刺激する方法であって、以下 非齧歯目被験体にＴＧ免疫刺激核酸を、該非齧歯目被験体において免疫応答を
    誘導するのに有効な量で、投与する工程であって、該ＴＧ免疫刺激核酸は、Ｃｐ
    Ｇジヌクレオチドを含まない、工程 を包含する、方法。
  97. 【請求項９７】 ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＴＧＡ ＣＧＴ ＴＴＴ ＧＴ
    Ｃ ＧＴＴ（配列番号３４３）の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、
    組成物。
  98. 【請求項９８】 アレルギーまたはぜん息を処置または予防するための方法
    であって、以下 請求項９７に記載の組成物を、アレルギーまたはぜん息を処置または予防する
    のに有効な量で、該処置または予防を必要とする非齧歯目被験体に投与する工程
    を包含する、方法。
  99. 【請求項９９】 免疫応答を刺激する方法であって、以下 非齧歯目被験体にＴＧ免疫刺激核酸を、該非齧歯目被験体において免疫応答を
    誘導するのに有効な量で、投与する工程であって、該核酸は、以下の配列 ５’Ｎ1Ｘ1Ｘ2ＴＧＸ3Ｘ4Ｎ2 ３’ を含み、ここで、Ｘ1Ｘ2が、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＣＣ、ＣＡ
    、ＧＧ、ＧＡおよびＧＣからなる群より選択され、そしてＸ3Ｘ4が、ＡＴ、ＡＡ
    、ＡＧ、ＡＣ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＡ、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡおよびＧＣからなる群より
    選択され、そして該核酸は、ＣｐＧジヌクレオチドを含まない、工程 を包含する、方法。
  100. 【請求項１００】 免疫応答を刺激する方法であって、以下 非齧歯目被験体にＰｙリッチ免疫刺激核酸を、該非齧歯目被験体において免疫
    応答を誘導するのに有効な量で、投与する工程であって、該核酸は、以下の配列 ５’Ｘ1Ｘ2ＴＴＴＴＸ3Ｘ4 ３’ を含み、ここで、Ｘ1Ｘ2が、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＣＣ、ＣＡ
    、ＧＧ、ＧＡおよびＧＣからなる群より選択され、そしてＸ3Ｘ4が、ＡＴ、ＡＡ
    、ＡＧ、ＡＣ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＡ、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡおよびＧＣからなる群より
    選択され、そして該核酸は、ＣｐＧジヌクレオチドを含まない、工程 を包含する、方法。
  101. 【請求項１０１】 前記免疫刺激核酸が、Ｔリッチ核酸である、請求項９６
    に記載の方法。
  102. 【請求項１０２】 前記Ｔリッチ免疫刺激核酸が、２５％より多いＴのヌク
    レオチド組成を含む、請求項１０１に記載の方法。
  103. 【請求項１０３】 前記Ｔリッチ免疫刺激核酸が、３５％より多いＴのヌク
    レオチド組成を含む、請求項１０１に記載の方法。
  104. 【請求項１０４】 前記Ｔリッチ免疫刺激核酸が、４０％より多いＴのヌク
    レオチド組成を含む、請求項１０１に記載の方法。
  105. 【請求項１０５】 前記Ｔリッチ免疫刺激核酸が、５０％より多いＴのヌク
    レオチド組成を含む、請求項１０１に記載の方法。
  106. 【請求項１０６】 前記Ｔリッチ免疫刺激核酸が、６０％より多いＴのヌク
    レオチド組成を含む、請求項１０１に記載の方法。
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