UA77152C2 - Method for stimulation of immune response using nucleic acid-containing immunostimulating compositions, method for treatment of cancer and method for treatment or prophylaxis of allergy or asthma - Google Patents

Description

Опис винаходу

Бактеріальна ДНК, але не ДНК хребетних, володіє імуностимулюючими ефектами на мононуклеарні клітини 2 периферичної крові (РВМС) іп мйго (Кпед сеї аїЇ., 1995). Бактеріальна ДІЖ, але не ДНК хребетних, характеризується імуностимулюючими ефектами відносно активації В-клітин і клітин-природних кілерів

ПоКипада, Т., ей аї., 1988, Орп. У. Сапсег Кев. 79:682-686; ТоКипада, Т., ей аї., 1984, ОМС! 72:955-962;

Меззіпа, 9.Р., еї аЇ., 1991, Оіттипої. 147:1759-1764; і в огляді Кгіед, 1998, Іп: Арріїей Оіідописіеойіде

Тесппоіоду, С.А. Бівеіп апа А.М. Кгпіед, (Едв.), допе МУПеу апа Бопв, Іпс., Мемж/ ЖМогКк, МУ, рр.431-448). Зараз 70 ясно, що дані імуностимулюючі ефекти бактеріальної ДНК є результатом присутності неметильованих

СрО-динуклеотидів в особливих контекстах основ (мотиви Сро), які звичайні для бактеріальної ДНК, але метильовані і недостатньо представлені (зменшення Сро від 1/50 до 1/60) в ДНК хребетних (Кгіед еї аїЇ, 1995

Маїйге 374:546-549; Кпед, 1999 Віоспіт. Віорпуз. Асіа 93321:1-10). Імуностимулюючі ефекти бактеріальної ДНК можуть бути змодельовані за допомогою синтетичних олігодезоксинуклеотидів (ОДН), що містять дані 12 Сро-мотиви. Представляється вірогідним, що швидка активація імунної системи у відповідь на СрОо-ДНК може розвиватися як один з компонентів природних імунних захисних механізмів, які дізнаються структурні характеристики, специфічні для молекул мікробів.

ОДН Сро володіють сильними стимулюючими ефектами відносно лейкоцитів людини і миші, індукуючи проліферацію майже всіх (29595) В-клітин, і збільшують секрецію імуноглобулінів (Ід); секрецію цитокінів; 20 лізисну активність клітин-природніх кілерів (МК) і секрецію ІЄМ-у, і активацію дендритних клітин (ОС) і інших антиген-являючих клітин відносно експресії костимулюючих молекул і секреції цитокінів, особливо Тп1-подібних цитокінів, які важливі для підтримки розвитку Тп1-подібних відповідей Т-клітин. Активація В-клітин під дією

Сро-ДНК є незалежною від Т-клітин і антигеннеспецифічною. Проте активація В-клітин низькими концентраціями

Сро-ДНК характеризується вираженим синергізмом з сигналами, що передаються через антигенні рецептори с 29 В-клітин, у відношенні як проліферації В-клітин, так і секреції Ід (Кгіед еї аїЇ., 1995). Даний виражений Ге) синергізм між сигнальними шляхами В-клітин, тригером яких є антигенний рецептор В-клітин, і Сро-ДНК сприяє розвитку антигенспецифічних імунних відповідей. На додаток до їх прямих ефектів на В-клітини, СрРО-ДНК також прямо активують моноцити, макрофаги і дендритні клітини відносно секреції цитокінів, включаючи високі рівні

ІЛ-12 ІКіїптап сеї аї., 1996; Наїрегтп сеї аї., 1996; Сом/дегу еї аї., 1996). Дані цитокіни стимулюють сч 30 клітини-природні кілери (МК) для секреції інтерферону гамма (ІЕМ- у) і збільшують їх лізисну активнісьь

ІКіптап еї аї., 1996, вище; Сом/дегу еї аі)., 1996, вище; МХататоїйа еї аї!., 1992; Ваїаз еї аї., 1996). Загалом

СроО-ДНК індукує Тп1-подібний характер продукції цитокінів з переважанням ІЛ-12 і ІРМ- у і з невеликою -- секрецією Тп2-цитокінів (Кіптап еї аїЇ., 1996). Сильні прямі ефекти (незалежні від Т-клітин) СрОо-ДНК на -

В-клітини, також як індукція цитокінів, які можуть характеризуватися непрямими ефектами на В-клітини через 35 . : І -

Т-хелперні шляхи, припускає використання СроО-ДНК у формі ОДН як ад'юванта вакцини. (Дивися патентну заявку РСТ, публікація Мо.: УУМО98/40100.)

Дані імуностимулюючі ефекти природного фосфодіефірного остову СрОо ОДН високоспецифічні для Сро, так що ефекти практично зникають, якщо мотив Сро метильований, змінений на Ссрс або знищений або змінений « 20 іншим шляхом (Кгіед еї аї., 1995 Майте 374:546-549; Нагітагтт еї а), 1999 Ргос. Май. Асай. Зсі ОБА -в 96:9305-10). Фосфодіефірні Сро ОДН можуть бути вміщені в пухирці з ліпідів, галуна або в пухирці інших типів с з властивостями запасання або поліпшеного захоплення клітинами для збільшення імуностимулюючих ефектів :з» (Мататоїй еї а!., 1994 Місгобіої!. Іттипої. 38:831-836; ОСгаттріпекі еї аі!., 1998 Мої. Меа. 4:109-118,.

В ранніх дослідженнях передбачалося, що імуностимулюючий мотив СроО відповідає формулі 15 пурин-пурин-Сро-піримідин-піримідин (Ктіед ей а), 1995 Майте 374:546-549; РівеївКу, 1996 3. Іттипої. -1 156:421-423; НасКег еї аі,, 1998 ЕМВО .. 17:6230-6240; Ііртога еї а), 1998 Тгепаз іп МісгобріоІ. 6:496-500).

Проте зараз ясно, що лімфоцити миші цілююм добре відповідають на фосфодіефірні СрО-мотиви, які не -| відповідають даній "формулі" (Мі еї аї., 1998 .). Іттипої. 160:5898-5906)| і те ж саме справедливо для В-клітин - людини і дендритних клітин (Нагітапп еї а), 1999 Ргос. Май. Асад. сі ЮБА 96:9305-10; іапо, 1996 4). Сііп.

Іпмеві. 98:1119-1129). 50 й й й й й й й 1 Декілька дослідників у минулому вивчали, чи може вміст нуклеотидів в ОДН діяти незалежно від

КЗ послідовності ОДН. Цікаво, що було знайдено, що антисмислові ОДН звичайно збагатили СО, ССС, СС, САС і

СО послідовностями, в той же час маючи знижену частоту нуклеотидних послідовностей ТТ або ТСС у порівнянні з очікуваним, якщо використовування основ було випадковим (|Зтеїзегз еї аї!., 1996 Апіізепзе Мисівїс

Асій Огид Оемеїор. 6:63-67)Ї. Це збільшує можливість того, що представлені в більшій кількості послідовності можуть містити переважні елементи, направлені на мішень у вигляді антисмислових олігонуклеотидів, і навпаки.

ГФ) Одна з причин уникати застосування тимідин-збагачених ОДН для експериментів за антисмисловими

Ге послідовностями полягає в тому, що руйнування ОДН нуклеазами, присутніми в клітинах, веде до вивільнення вільного тимідину, який конкурує з ЗН-тимідином, який часто застосовують в експериментах для оцінки клітинної во проліферації |Маїзоп еї а!., 1992 Апіізепзе Кезеагсп апа ЮОемеіортенпі 2:325-330)1.

Даний винахід відноситься частково до збагачених піридином (Ру-збагачених) і в деяких здійсненнях до збагачених тимідином (Т) імуностимулюючих нуклеїнових кислот, для яких не потрібна присутність Сро-мотиву.

Даний винахід також відноситься частково до відкриття того, що нуклеїнові кислоти, які містять

ТО-динуклеотидний мотив, також є імуностимулюючими. Винахід частково заснований на несподіваних даних дб про те, що послідовності нуклеїнових кислот, які не містять СроО-мотиви, є імуностимулюючими. При аналізі імуностимулюючих властивостей багато яких послідовностей нуклеїнових кислот було відкрито, що дані послідовності можуть бути Ру-збагаченими наприклад, Т-збагаченими, або вони можуть містити То-мотиви. Було також відкрито, що дані послідовності переважно активують імунні клітини тварин, відмінних від гризунів.

Ру-збагачені і ТО-послідовності володіють тільки мінімальними імуностимулюючими властивостями відносно імунних клітин гризунів у порівнянні з імунними клітинами тварин, відмінних від гризунів. Таким чином можливо, відповідно до способів винаходу, індукувати імунну відповідь у суб'єкта, що не є гризуном, шляхом введення Ру-збагачених або таких, що містять ТО-мотиви, імуностимулюючих нуклеїнових кислот. Ру-збагачені або такі, що містять ТО-мотиви, імуностимулюючі нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть - необов'язково - включати СрО-мотиви. Ці дані мають важливе значення для розвитку клінічного застосування 7/0 їмуностимулюючих, що містять Сро і не містять Сро, нуклеїнових кислот.

В одному варіанті винаходу пропонується фармацевтична композиція, що містить ефективну кількість для стимуляції імунної відповіді виділених Ру-збагачених або таких, що містять ТО-мотиви, імуностимулюючих нуклеїнових кислот і фармацевтично прийнятний носій. В інших варіантах винаходу пропонується композиція предмету винаходу, що включає виділену Ру-збагачену або таку, що містить ТО-мотиви, імуностимулюючу /5 Нуклеїнову кислоту. В інших здійсненнях імуностимулююча нуклеїнова кислота може бути Т-збагаченою. Ще в одному аспекті імуностимулююча нуклеїнова кислота може бути Т-збагаченою і також мати щонайменше один

То-мотив.

Переважно Ру-збагачена нуклеїнова кислота представляє собою Т-збагачену нуклеїнову кислоту. В деяких здійсненнях Т-збагачена нуклеїнова кислота представляє собою полі-Т-нуклеїнову кислоту, що включає 5'ТТТТ3. Ще в одному здійсненні полі-Т-нуклеїнова кислота включає в себе 5ХіХоТТТТХзХ.З,, де Хі, Хо, Хз і Ха є нуклеотидами. В деяких здійсненнях Х.Хо представляють собою ТТ та/або Х»Х, є ТТ. В інших здійсненнях Х4Хо вибирають з групи, що складається з ТА, ТО, ТС, АТ, АА, Ас, АС, СТ, СС, СА, СО, СТ, о, БА і ОС; та/або ХаХу вибирають з групи, що складається з ТА, ТО, ТС, АТ, АА, АС, АС, СТ, СС, СА, СО, СТ, БО, БА і С.

Т-збагачена імуностимулююча нуклеїнова кислота може мати тільки один полі-Т-мотив або вона може мати сч об Множину полі-Т-мотивів нуклеїнової кислоти. В деяких здійсненнях Т-збагачена імуностимулююча нуклеїнова кислота включає щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7 і) або щонайменше 8 Т-мотивів. В інших здійсненнях вона включає щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7 або щонайменше 8 СрО-мотивів. В переважних здійсненнях множина Сро-мотивів і полі-Т-мотивів розсіяно. с зо Ще в одному здійсненні щонайменше одне з множин полі-Т-мотивів містить щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше б щонайменше 7, щонайменше 8 або щонайменше 9 стичних Т-нуклеотидних о залишку. В інших здійсненнях множина полі-Т-мотивів представляє собою щонайменше З мотиви і з даних «- щонайменше З мотивів кожний включає щонайменше З стичні Т-нуклеотидних залишки або множина полі-Т-мотивів представляє собою щонайменше 4 мотиви і з даних щонайменше 4 мотивів, кожний включає в. щонайменше З стичні Т--чуклеотидних залишки. ї-

В деяких випадках Т-збагачена імуностимулююча нуклеїнова кислота може бути вільною від полі-Т-мотивів але може переважно включати нуклеотидний склад з більше, ніж 2595 Т. В інших здійсненнях Т-збагачені імуностимулюючі нуклеїнові кислоти мають полі-Т-мотиви і також включають нуклеотидний склад з більше, ніж 2596 Т. В переважних здійсненнях Т-збагачена імуностимулююча нуклеїнова кислота включає нуклеотидний « клад з більше, ніж 35905 Т, більше, ніж 40905 Т, більше, ніж 50905 Т, більше, ніж 6095 Т, більше, ніж 8095 Т або ств) с більше, ніж 9095 Т-нуклеотидних залишків. У важливих здійсненнях нуклеїнова кислота має щонайменше 5095 Т.

Т-збагачені і імуностимулюючі Т(з-нуклеїнові кислоти можуть мати будь-яку довжину, більшу, ніж 7 з нуклеотидів, але в деяких здійсненнях можуть мати між 8 і 100 нуклеотидними залишками в довжину. У переважних здійсненнях Т-збагачена імуностимулююча нуклеїнова кислота включає щонайменше 20 Нуклеотидів, щонайменше 24 нуклеотиди, щонайменше 27 нуклеотидів або щонайменше 30 нуклеотидів. В -І переважних здійсненнях імуностимулююча ТОо-нуклеїнова кислота в довжину складає між 15 і 25 нуклеотидами.

Т-збагачена і імуностимулюючі ТОо-нуклеїнові кислоти можуть бути односпіральними і двоспіральними.

Ш- В одному переважному здійсненні імуностимулююча нуклеїнова кислота має Т-збагачену область, - розташовану в середині її довжини (тобто приблизно рівна кількість нуклеотидів прилягає до Т-збагаченої області з 5 і 3 кінців). о Т-збагачену нуклеїнову кислоту в деяких здійсненнях вибирають з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 59-63,

Із 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 і 910-913. В інших здійсненнях Т-збагачені нуклеїнові кислоти є послідовністю, вибраною з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 64, в 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, (Ф, 692, 693, 804, 862, 883,884, 888, 890 і 891. ка В інших здійсненнях Ру-збагачена імуностимулююча нуклеїнова кислота представляє собою С-збагачену нуклеїнову кислоту. Імуностимулююча С-збагачена нуклеїнова кислота представляє собою нуклеїнову кислоту, бо що містить щонайменше одну, і переважно щонайменше 2 полі-С-області, або містить 5095 або більше

С-нуклеотидів.

Ру-збагачені та імуностимулюючі ТО-нуклеїнові кислоти можуть включати один або більше Сро-мотивів.

Мотиви можуть бути метильовані або неметильовані. В інших здійсненнях Ру-збагачені та імуностимулюючі

То-нуклеїнові кислоти вільні від одного або більше Сро-динуклеотидів. 65 В інших здійсненнях Ру-збагачені та імуностимулюючі ТО-нуклеїнові кислоти також включають полі-А, полі-( та/або полі-С мотиви. Ще в одному здійсненні Ру-збагачена або імуностимулююча ТО-нуклеїнова кислота вільна від двох полі-С-послідовностей з щонайменше З суміжних С-нуклеотидних залишків або вільна від двох полі-А-послідовностей з щонайменше З стичних А-нуклеотидних залишків. В інших здійсненнях Ру-збагачена або імуностимулююча ТО-нуклеїнова кислота має нуклеотидний склад із понад 2595 С або більше, ніж 2595 А. Ще в одному здійсненні Ру-збагачена або імуностимулююча ТО-нуклеїнова кислота вільна від полі-С-послідовностей, полі-С-послідовностей або полі-А-послідовностей.

Полі-С нуклеїнову кислоту в деяких здійсненнях вибирають з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936 і 938. В інших здійсненнях полі-С нуклеїнова кислота включає послідовність, вибрану з групи, 7/0 що складається з ЗЕС ІО МО: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329, 434, 435, 475, 519, 521-524, 526, 527, 535, 554, 565, 609, 628, 660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926, 927, 932 і 937.

Відповідно до іншого варіанту винаходу імуностимулюючі нуклеїнові кислоти можуть бути визначені як такі, володіючі ТО-мотивом, їх тут позначають як імуностимулюючі ТО-нуклеїнові кислоти. ТО-нуклеїнова кислота в 7/5 одному здійсненні містить щонайменше один ТО-динуклеотид, що має послідовність, що включає щонайменше наступну формулу: 5'МіХіТОХоМ.З3. В схожих здійсненнях М 4 є послідовністю нуклеїнової кислоти, що складається з кількості нуклеотидів, що коливається в діапазоні від (11-М 25) до (21-М2) і Мо є послідовністю нуклеїнової кислоти, що складається з кількості нуклеотидів, що коливається в діапазоні від(11-М 4) до (21-М.),

В переважному здійсненні Хо є тимідин.

В інших здійсненнях ТО-нуклеїнова кислота має щонайменше наступну формулу: 5'Х 4ХоТОХаХ.У. Ще в одному здійсненні ТО-нуклеїнова кислота включає наступну послідовність: 5'МІХ1ХоТСХахХ:АМ»З. В схожому здійсненні М. є послідовністю нуклеїнової кислоти, що складається з кількості нуклеотидів, що коливається в діапазоні від (9-М2) до (19-М2) і Мо є послідовністю нуклеїнової кислоти, що складається з кількості нуклеотидів, що коливається в діапазоні від(9-М 4) до (19-М4). В одному переважному здійсненні Хз є тимідин. сч

ХХ» є нуклеотиди, які можуть бути вибрані з групи, що складається з СТ, БО, СА, АА, АТ, АС, СТ, СА, СО, ТА і ТТ, а ХуХ,. є нуклеотиди, які можуть бути вибрані з групи, що складається з ТТ, СТ, АТ, А, СО, ТС, АС, СС, (8)

ТА, АА і СА. В деяких переважних здійсненнях Х з є тимідин. У важливих здійсненнях ХзХуі є нуклеотиди, які можуть бути вибрані з групи, що складається з ТТ, ТС, ТА і ТО. В іншому здійсненні ХіХо представляють собою

СА або СТ, а ХоХ, є ТТ. Ще в одному здійсненні Х; або Хо», або обидва є пуринами, а Хз або Х, або обидва є с зо піримідинами, або Х.Х» є ОрА, а Хз або Х,, або обидва вони є піримідинами. В одному здійсненні Х»о є Т, а Хз є піримідином. що)

В одному здійсненні 5'ХіХоТСХаХуЗ" послідовність То-нуклеїнової кислоти або ТО-нуклеїнова кислота повної - ди довжини, або її деякий фрагмент представляють собою непаліндромну послідовність, а в інших здійсненнях - паліндромну послідовність. в.

В деяких переважних здійсненнях То-нуклеїнова кислота є також Т-збагаченою. ї-

Ру-збагачені та імуностимулюючі ТО-нуклеїнові кислоти, що в деяких здійсненнях мають нуклеотидний остов, який включає щонайменше одну модифікацію остову, таку як фосфортіоатна модифікація. Нуклеотидний остов може бути гібридним або, переважно нуклеотидний остов є повністю модифікованим. В одному переважному здійсненні імуностимулююча нуклеїнова кислота має полі-Т-мотив і фосфортіоатний остов. «

В іншому варіанти винахід є композицією імуностимулюючої нуклеїнової кислоти у формі Ру-збагаченої або пт») с імуностимулюючої ТО-нуклеїнової кислоти і антигена, де нуклеїнова кислота є вільною від неметильованих

Сро-мотивів. ;» Інша композиція згідно з винаходом представляє собою Ру-збагачену або імуностимулюючу ТО-нуклеїнову кислоту і протимікробний агент, де Ру-збагачена або ТО-нуклеїнова кислота є вільною від неметильованих СрО-мотивів. Переважно протимікробний агент вибирають з групи, що складається з противірусного агента, -І антипаразитарного агента, антибактеріального агента і протигрибкового агента.

Композиція пристрою з постійним вивільненням, що включає Ру-збагачену та/(або імуностимулюючу

Ш- ТО-нуклеїнову кислоту, де кислота Ру-збагачена та/або ТО-нуклеїнова є вільною від неметильованих - Сро-мотивів, пропонується відповідно до іншого варіанту винаходу.

Винахід також включає харчові добавки Ру-збагаченої або імуностимулюючої ТО-нуклеїнової кислоти і 1 пристрій для доставки, вибраний з групи, що складається з капсули, пілюлі і під'язикової таблетки, де

Ге Ру-збагачена або ТО-нуклеїнова кислота є вільною від неметильованих Сро-мотивів.

Повинно бути зрозуміло, що коли корисно вводити Ру-збагачений, наприклад, полі-Т, Т-збагачений,

С-збагачений або ТО-олігонуклеотид і Ср(О-олігонуклеотид, може бути також бажаним сумісне введення

Ру-збагаченого або ТОо-олігонуклеотиду разом з фізично окремим Сро, Ру-збагаченим або ТО-олігонуклеотидом.

В протилежному варіанти Сро, Ру-збагачений або ТО-мотив може бути присутній в одній і тій же нуклеїновой

Ф) кислоті у вигляді прилеглого Ру-збагаченого або Т(з-олігонуклеотиду. Ще в одному здійсненні всі або деякі ка поєднання Ру-збагаченої, ТО- і Сро-нуклеїнових кислот можна вводити разом або як окремі нуклеїнові кислоти, або в одній і тій же молекулі нуклеїнової кислоти. Під сумісним введенням мається на увазі, що нуклеїнові бо Кислоти будуть вводитися достатньо близько за часом одна до іншої для досягнення з'єднаної корисної дії обох олігонуклеотидів, переважно більшої, ніж корисна дія, що досягається введенням кожного з олігонуклеотидів окремо в тій же дозі.

СрО-олігонуклеотиди мають в цілому формулу 5Х.ХоСОХазХ;АЗУ, де Хі, Хо, Хз і Х; є нуклеотиди і де щонайменше С з Сро неметильований. Переважні Сро-олігонуклеотиди складають 8-100 нуклеотидів в довжину 65 і мають модифіковані остови. Конкретні структури детально описані в опублікованих заявках РСТ, заявках США і цитованих тут посиланнях, відкриття яких включені тут повністю. В одному здійсненні Сроз-олігонуклеотид вільний від полі-Т і ТО-мотивів і не є Т-збагаченим.

В інших здійсненнях Сро-олігонуклеотид має послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 1,

З, 4, 14-16, 18-24, 28, 29, 33-46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-87, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227-240, 242-256, 258, 260-265, 270-273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-312, 314-317, 320-327, 329, 335, 337-341, 343-352, 354, 357, 361-365, 367-369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 399, 401-404, 406-426, 429-433, 434-437, 439, 441-443, 445, 447, 448, 450, 453-456, 460-464, 466-469, 472-475, 477, 478, 480, 483-485, 488, 489, 492, 493, 495-502, 504-505, 507-509, 511, 7/0 313-529, 532-541, 543-555, 564-566, 568-576, 578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615, 617, 619-622, 625-646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711-716, 718-732, 736, 737, 739-744, 746, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 7900792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904 і 909-913.

В іншому здійсненні Ру-збагачений або ТО-олігонуклеотид вільний від СрОо-мотивів. Дане здійснення 7/5 винаходу також включає фармацевтичні композиції і набори, які містять як Сро-олігонуклеотид (який може бути вільний від полі-Т і ТО-мотивів і не є Т-збагаченим), так і Ру-збагачений та/або ТО-олігонуклеотид, фізично окремий від Сро-олігонуклеотиду. Фармакологічні препарати знаходяться в ефективних кількостях і звичайно включають фармацевтично прийнятні носії, всі як тут детально пояснюється для Ру-збагачених і

ТО-олігонуклеотидів. Набори включають щонайменше один контейнер, що містить олігонуклеотид, який є

Ру-збагаченим або ТО-олігонуклеотид (або деякі їх поєднання). Той же контейнер або - в інших здійсненнях - другий контейнер може містити олігонуклеотид з Срі-мотивом, який може бути вільний від Ру-збагаченого та/або ТО-мотивів. Набір також містить інструкції для введення олігонуклеотидів суб'єкту. Набори також можуть включати контейнер, що містить розчинник або розріджувач.

В цілому, як тут повністю цитується, Сро-олігонуклеотид, фізично відокремлений від Ру-збагаченого або сч об ТО-олігонуклеотиду, може бути застосований разом з Ру-збагаченим або ТО-олігонуклеотидами в способах, композиціях і продуктах, описаних вище. о

Винахід відноситься до інших аспектів імуностимулюючих олігонуклеотидів, які мають химерні остови і які не вимагають присутності СрО-мотиву. Винахід частково заснований на відкритті того, що послідовності нуклеїнових кислот, які не містили Сро-мотивів, були імуностимулюючими і що ті, які мають химерні остови, с зо Володіють несподівано збільшеними імуностимулюючими властивостями. Таким чином, винахід в одному варіанти відноситься до складу олігонуклеотиду, що має формулу: 5" 4М42М»223", де У і Мо незалежно один від о одного є молекулами нуклеїнових кислот, що мають від 1 до 10 нуклеотидів, де Хі включає щонайменше один «- модифікований міжнуклеотидний зв'язок, У» включає щонайменше один модифікований міжнуклеотидний зв'язок і де М. і Мо є молекулами нуклеїнових кислот, які незалежно один від одного мають від 0 до 5 нуклеотидів, але в. зв Де М412Мо має щонайменше 6 нуклеотидів в сумі, і де нуклеотиди М42Мо мають фосфодіефірний остов, і де 7 ї- представляє собою імуностимулюючий мотив нуклеїнової кислоти, але не включає Со. В одному здійсненні 7 є послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраною з групи, що складається з ТТТТ, ТО, і послідовності, в якій щонайменше 5095 основ послідовності є Т8.

В деяких здійсненнях У 4 та/або У» мають від З до 8 нуклеотидів. В інших здійсненнях У. та/або У» включають « щонайменше три Оз, щонайменше чотири Оз, щонайменше сім Оз або всі Св. В інших здійсненнях ХУ. та/Лабо Мо 8 с вибирають з групи, що складається з ТСОТСО, ТСОТСОтТ і ТоОтТСОтТТ (5ЕО ІЮО МО:1145). Ще в одному

Й здійсненні М. та/або Мо включають щонайменше одну, дві, три, чотири або п'ять полі-А, полі-Т або и? полі-С-послідовності.

Центральні нуклеотиди (М42М2) формули Х4М424М2МУо мають фосфодіефірні міжнуклеотидні зв'язки, М 4 і Мо мають щонайменше один модифікований міжнуклеотидний зв'язок. В деяких здійсненнях У 4 та/або Мо мають -І щонайменше два модифіковані міжнуклеотидні зв'язки. В інших здійсненнях М 4 та/або Мо мають, від двох до п'яти модифікованих міжнуклеотидних зв'язків. Ще в одному здійсненні М має два модифіковані міжнуклеотидні - зв'язки, і Уо має п'ять модифікованих міжнуклеотидних зв'язків або 4 має п'ять модифікованих міжнуклеотидних - зв'язків і Мо має два модифіковані міжнуклеотидні зв'язки. Модифікований міжнуклеотидний зв'язок в деяких Здійсненнях представляє собою фосфортіоатний модифікований зв'язок, фосфордитіоатний, модифікований 1 зв'язок або п-етокси-модифікований зв'язок.

Ге Частини формули М.4М42МоМУо можуть необов'язково формувати паліндром. Таким чином, в деяких здійсненнях нуклеотиди М424М»о утворюють паліндром. В деяких здійсненнях паліндром не представляє собою прямий повтор. Ще в одних здійсненнях нуклеотиди М.42М» не утворюють паліндром.

Відповідно до інших здійснень МХАМ2 мають послідовність нуклеотидів, вибрану з групи, що складається з (Ф) ко бо б5

ВАНН НИ А: пінних іч він ніх Нв й ле тертя нет . пове іч тео тт ки що

ОКА иа ок АН ЕОМ НК А КАМИ;

ПЕН НДО ПИТ ОО ИН ВН ЯН КК АЧАК

Бор вмч и Ве В НЯ висо ван ях пійиснажніни пеДЕрЕИОВеИ аа ие. ВОЗ Кат ла ня МЛ яне пін син а кн п ка ши о ня ге

ВН а а АН МЕНЕ АНЯ ЕЕ додавав ПА вия дар: Кріон у зай алітютися ще х пре ден век зер: я Яяи Кн ть сл вся ЕЙ рю "февіккіючит т лине ни ік ян и ятки ие и Я В а Я КІ ЛЕ

Кей сдяківв оон і УоНЕк от КЕ ОД ОНЕ В В Кене Вся

ЕНН Са и ВИНИКАЛО СХ

КИ тні рин са Ж суне я птн св ня

ВАЛИ в Кран ВД ІД ВИ сне см Заст и Время Ви на КроБ ло м стилНи А ог ЛА ТИ А ве Я НЕ о

В ЕНН Пе ЗНЯТИ

Ку Кн І КК ВАНЯ ве нано б нах тив кто

ДИНИ М жа і и й БЕ ї ладан, Я зл ин М в лю МАК

ЕК рок Я пе: у еОАтн ПИОо КТ ав лав БЕЕНЯ кр кАвА в еВ ай че сі я пло ве рте З

ІЕЕ ан Аа а ОВ чатку Едвін Кн соц КТ ее НЯ Пт: З сти 2 Нива рей кдд п Кан Есе ке пиво кета енер Вс НН Не ні Я Кв ПАН ств спе а КК Но Кріон міну от с, "ВН ИН о ВНИХ НА ОА теле КЕ тре ТЕНТ

А Я ки ПАНІ ів; інки вве ев

ДНК ОЧНА НИ

Не в вв вет висоти ни пні СНИ і едасини ни в виня вень З . претнк даньтийнн Б. ЛЕ я ЕЕ ан А ЦИ Енн ати ко ев см а нс ен тв ннн см енжй нерва В ді вена р сл ВИ зд ю

І ди Б п о і її т я " й БАщ пов де 12 М ї Аня як : гу р К. ТЕ, Е і т кл ди их й пк Как ей чех з Х; Е гй Тл. Тт7я ій ен ик пн не янв у он ви -

В АНА А ВАН ОА ИНА КН А ИН се в а що АН НВ ИН овен М ВН шов з ше ен НЯ м

НЯ ши НО дз: ар пози Ар ВН

Зо Композиція може необов'язково включати в себе фармацевтичний носій та/або може бути складена у вигляді ї- пристрою для доставки. В деяких здійсненнях пристрій для доставки вибирають з групи, що складається з катіонних ліпідів, проникаючих в клітину білків, і пристроїв з постійним вивільненням. В одному переважному здійсненні пристрій з постійним вивільненням представляє собою біодеградований полімер. В іншому здійсненні « пристрій з постійним вивільненням є мікрочастинкою. -

В іншому варіанти у винаході пропонується композиція імуностимулюючого олігонуклеотиду, що має с формулу У4М124М»», і антигена. "» Інша композиція згідно з винаходом представляє собою імуностимулюючий олігонуклеотид, що має формулу п . . чо - . - -

МАМ12М»У», і протимікробний терапевтичний агент. Переважно протимікробний терапевтичний агент вибирають з групи, що складається з противірусного агента, антипаразитарного агента, антибактеріального агента або протигрибкового агента.

Ш- Композиція пристрою для постійного вивільнення, що включає імуностимулюючий олігонуклеотид, що має -І формулу У4М424М»2У»2, пропонується відповідно до іншого варіанту винаходу.

Винахід також включає харчові добавки імуностимулюючого олігонуклеотиду, що має формулу У4М424М»2х», - в пристрої для доставки, вибраний з групи складається з капсули, під'язикової таблетки і пілюлі. с 20 В іншому варіанти композиції, описані вище, також включають імуностимулюючу нуклеїнову кислоту, що має неметильований СО-динуклеотид, ТО-нуклеотид або Ру-збагачену послідовність де імуностимулююча г» нуклеїнова кислота, що має неметильований СО-динуклеотид, ТОо-динуклеотид або Ру-збагачену послідовність, має послідовність, відмінну від олігонуклеотиду, що включає в себе 5"У4М42М223..

В деяких здійсненнях імуностимулююча нуклеїнова кислота, що має неметильований СО-динуклеотид 99 ТОб-динуклеотид або Ру-збагачену послідовність, має повністю фосфодіефірний остов, і в інших здійсненнях

ГФ) імуностимулююча нуклеїнова кислота, що має неметильований СО-динуклеотид, ТО-динуклеотид або

Ру-збагачену послідовність має модифікований остов, який необов'язково може мати міжнуклеотидні зв'язки, де вибрані з групи, що складається з фосфортіоату, фосфордитіоату і п-етокси.

В одному здійсненні імуностимулююча нуклеїнова кислота, що має неметильований СО-динуклеотид, має бо формулу, що включає в'ХЇХоСОХаХа43, де Ху Хо, Хз і Х. є нуклеотиди. В інших здійсненнях послідовність імуностимулюючої нуклеїнової кислоти включає щонайменше наступну формулу: 5'ТСМТХ.Х»СОХ»5Ху,3, де М представляє собою послідовність нуклеїнової кислоти, що складається приблизно з 0-25 нуклеотидів, де щонайменше один нуклеотид має модифікований міжнуклеотидний зв'язок і де нуклеїнова кислота має менше, ніж або рівно 100 нуклеотидів. Відповідно до деяких здійснень Х 4Хо є нуклеотиди, вибрані з групи, що бо складається з СТ, 0, ОА і АА, а ХзХ, є нуклеотиди, вибрані з групи, що складається з ТТ, СТ або СТ. В переважному здійсненні ХХ» є СА, а ХаХ, є ТТ.

В іншому здійсненні послідовність імуностимулюючої нуклеїнової кислоти, що має неметильований

Со-динуклеотид, включає щонайменше одну з наступних послідовностей:

ВОНО жу и НМА ЕН Пекло Кт ТВ (КВ Ел ни КВ ВТ ЕН я

ЕЕ в В рнуснняня

АН ВА ее я МК А я Я еши нот 1 З з я ія сов копи нор дн ни ЧАЙ ЗЛ мов ОН іти рн до а вія в ЕС Я те иа тт тю ВЕКЗУ АК НН Я МК дин на Ав о ор В Внрвнься

Кт ду п НА шо СК 2 їй, пдв лкекя : Ме ма вето пи сіней нії те

ЕД стих тв киттикбвя нев КУТЯ орд зняті екв В Не

ВН а НК ТЯМ НО: не Енн нти ЕЕ ДЕК и нт ная у Я т пре нн и кн

УА аа НИ НЯ Й їх и ТЕ Я не т найіссові ТК К тт щі гру са Ві сі 7 : не те лат їх Ї шин й 7 А мі й

НИ нн во и і Мн и и НИ

НЕ ВЕ СБЕВЯНОВ Вл пахне ня ей у неон нн і он с счвнвренаваю ел 20 ВІКИ КЕ и ЕК НКИ

В р ни и: НИ пе КАЖЕ т а ТК ОК тре ПАКТ М Р ю я Нв ве р АН ЗА НО , с

А АН и в и и Ку шинок в ен нен ее ев с нос н, чі ХО У вка я тий ЗЕРЕН М туз ув; Мет ев ай ен Ак А Я І. пені рік ся п ит й сн ХР МНК НИ решения

ДО АК р ЕН КК о вкт ян мин в сч 30 зара ка Кен В НН НН

Мет вн ВЕ и джинс ов Я ул фр сей вання Ей і сл: юю одн снення Киян а и Кри

Нв ана а аа; ПОП ек ОНИ ше еркекжавко СН кднжовння З вне нвжнн м а в а р ВВ т па в З А ША М м ка дя А А ВАН

ВА КАК НК ПИ ГИ КАВА пе в Ен веі И к па З к р вс ій пд в в А АВ « о о ІН осв ви Янів ЕЛ Чл й З а НИ ДИ ВИК ЕТО пед перс ч зі я всі ; в со т ск кан яви ер ОКВИВКТ я Ин соц ВЕНАХ З

РУХ НН п я пд ЯК АНУ ПКТУНТ ОНИ с ДЯ т а ВИНИ ваний ц шій Ш й я ще Ой, Й а В іншому здійсненні імуностимулююча нуклеїнова кислота, що має Ру-збагачену або ТО-послідовність, представляє собою нуклеїнову кислоту, описану вище.

В іншому здійсненні винахід відноситься до фармацевтичних композицій і наборів, які містять як -І олігонуклеотид, що має формулу Х4М42М»оМ», так і Сро-олігонуклеотид (який необов'язково може бути вільний від полі-Т ії ТО-мотивів і не бути Ру-збагачений), Ру-збагачений та/або ТО-олігонуклеотид, фізично окремі від

Ш- олігонуклеотиду, що має формулу У4М42М2У». Фармацевтичні препарати знаходяться в ефективних кількостях і - звичайно включають фармацевтично прийнятні носії, і все це тут детально пояснюється. Набори включають щонайменше один контейнер, що містить олігонуклеотид, який має формулу У М12М»оМ»о. Той же контейнер або о - в інших здійсненнях - другий контейнер може містити олігонуклеотид з Сро-мотивом, який необов'язково може

Із бути вільний від Ру-збагаченого та/або То-мотивів, та/або Ру-збагачений або ТО-олігонуклеотид (або деяке їх поєднання). Набір також містить інструкції для введення олігонуклеотидів суб'єкту. Набори також можуть включати контейнер, що містить розчинник або розріджувач.

В цілому, як тут повністю цитується, олігонуклеотид, що має формулу М 4М42М2Мо, який фізично відокремлений від СроО, Ру-збагаченого або ТО-олігонуклеотиду, може бути застосований разом з Сро,

Ф) Ру-збагаченим або ТОо-олігонуклеотидами в описаних тут способах, композиціях і продуктах. ка В іншому варіанти винахід відноситься до фармацевтичної композиції що включає щонайменше два олігонуклеотиди згідно з винаходом, де щонайменше два олігонуклеотиди мають відмінні один від одного бор послідовності, і фармацевтично прийнятний носій.

Відповідно до іншого варіанту винаходу пропонується склад вакцини. Вакцина включає будь-яку з композицій в поєднанні з антигеном.

Відповідно до іншого варіанту винаходу пропонується спосіб стимуляції імунної відповіді. Спосіб включає в себе введення ТО-нуклеїнової кислоти, Ру-збагаченої або імуностимулюючої, суб'єкту, що не є гризуном, в 65 кількості, ефективній для індукції імунної відповіді у суб'єкта, що не є гризуном. Переважно Ру-збагачену або імуностимулюючу ТО-нуклеїнову кислоту вводять перорально, місцево, в пристрої з постійним вивільненням, на слизову поверхню, системно, парентерально або внутрішньом'язово. Коли Ру-збагачену або імуностимулюючу

То-нуклеїнову кислоту вводять на слизову поверхню, вона повинна бути доставлена в кількості, ефективній для індукції імунної відповіді у слизовій або системної імунної відповіді. В переважних здійсненнях слизову поверхню вибирають з групи, що складається з поверхні ротової порожнини, носової порожнини, ректальної, вагінальної поверхні і поверхні очної порожнини.

В деяких здійсненнях спосіб включає введення суб'єкту антигена, коли імунна відповідь є антиген-специфічною імунною відповіддю. Антиген може кодуватися вектором нуклеїнової кислоти, який може доставлятися суб'єкту. В деяких здійсненнях антиген вибирають з групи, що складається з пухлинного антигена, 7/0 Вірусного антигена, бактеріального антигена, паразитарного антигена і пептидного антигена.

Ру-збагачені і імуностимулюючі ТО-нуклеїнові кислоти здатні викликати широкий спектр імунної відповіді.

Наприклад, дані імуностимулюючі нуклеїнові кислоти можуть бути застосовані для перемикання імунної відповіді з ТН2 на ТНА1. Ру-збагачені і ТО-нуклеїнові кислоти можна також застосовувати для активації імунної клітини, такої як лейкоцит, дендритна клітина і клітина МК. Активація може бути проведена іп мімо, іп мйго або ех /5 УМО, тобто шляхом виділення імунної клітини у суб'єкта, контакти імунної клітини з ефективною кількістю

Ру-збагаченої або імуностимулюючої ТО-нуклеїнової кислоти для активації імунної клітини і повторного введення активованої імунної клітини суб'єкту. В деяких здійсненнях дендритна клітина експресує раковий антиген.

Дендритна клітина може бути експонована з раковим антигеном ех мімо.

Імунна відповідь, що викликається Ру-збагаченими або То-нуклеїновими кислотами може також приводити дО індукції продукції цитокінів, наприклад, продукції ІЛ-6, ІЛ-12, ІЛ-18 ТМЕ, ІЕМ-о; і ІЄМ-у.

Ще в одному здійсненні Ру-збагачені і ТО-нуклеїнові кислоти корисні для лікування рака. Ру-збагачені і

То-нуклеїнові кислоти відповідно до інших варіантив винаходу корисні також у профілактиці рака (наприклад, зниженні ризику розвитку рака) у суб'єкта з ризиком розвитку рака. Рак може бути вибраний з групи, що складається з рака жовчних шляхів, рака молочної залози, рака шийки матки, хоріокарциноми, рака прямої с

Кишки, рака ендометрію, рака шямку, внутрішньоепітеліальних неоплазій, лейкозу, рака печінки, рака легень (наприклад, дрібноклітинного і недрібноклітинного), меланоми, нейробластом, рака ротової порожнини, рака о яєчників, рака підшлункової залози, рака простати, ректального рака, сарком, рака щитовидної залози і рака нирок, також як і інших карцином і сарком. В деяких важливих здійсненнях рак вибирають з групи, що складається з рака кісток, мозку і рака ЦНС, рака сполучної тканини, рака стравоходу, рака очей, лімфоми Га

Ходжкіна, рака гортані, рака ротової порожнини, рака шкіри і рака сім'яників.

Ру-збагачені і ТО-нуклеїнові кислоти можна також застосовувати для збільшення відповіді ракових клітин на о терапію рака (наприклад, протиракову терапію), необов'язково коли Ру-збагачену і імуностимулюючу «--

ТО-нуклеїнову кислоту вводять в поєднанні з протираковою терапією. Протиракова терапія може бути хіміотерапією, вакцинацією (наприклад, активована іп міго вакцина дендритних клітин або вакцина ракового -

Зз5 антигену) або терапією на основі антитіл. Даний останній варіант терапії може також включати введення ї- антитіла, специфічного для антигену клітинної поверхні, наприклад, ракової клітини, коли імунна відповідь виявляється у вигляді антиген-залежної клітинної цитотоксичності (АОСС). В одному здійсненні антитіло може бути вибране з групи, що складається з рубитаксину, герцепіну, квадрамету, панорексу, ШОЕС-У288, ВЕС2,

С225, онколиму, ЗХМАКТ М195, АТКАСЕМ, оварексу, Веххаг, ГОР-О03, іог (Є, МОХ-210, МОХ-11, МОХ-22, ОМ103, « 420 3З622М/94, анти-МЕСР, зенапаксу, МОХ-220, МОХ-447, МЕНІММОМЕ-2, МЕСІММОМЕ-1, СЕАСІОЕ, претаргету, шщ с МомоМАБ-2, ТМТ, СІотабр-Н, ЗМІ-250, ЕМО-72000, Її утрпоСіде, СМА 676, монофарму-С, 485, іог едї.го, іог со, й ВАВ5Б, апіі-РІК-2, МОХ-260, АМА АБ, ЗМАКТ 1010 АБ, ЗМАКТ АВІ. 364 АБ і ІттивКАІТ-СЕА. и? Таким чином, відповідно до деяких варіантів винаходу, суб'єкту, який страждає раком або має ризик розвитку рака, вводять імуностимулюючу нуклеїнову кислоту Її проводять протиракову терапію. В деяких

Здійсненнях протиракову терапію вибирають з групи, що складається з хіміотерапевтичного агента, -і імунотерапевтичного агента і протиракової вакцини. Хіміотерапевтичний агент може бути вибраний з групи, що складається з метотрексату, вінкристину, адріаміцину, цисплатину, що не містять цукор хлоретилнітрозосечовин,

Ше 5-фторурацилу, мітоміцину С, блеоміцину, доксорубицину. дакарбазину, таксолу, фрагіліну, мегламіну СГА, - валрубіцину, кармустаїну і поліферпозану, ММІ270, ВАМ 12-9566, КА5 інгібітору фамезилтрансферази, інгібітору фамезилтрансферази, ММР, МТАЛ/Л У231514, ГУ26461в/лометексолу, гламолеку, СІ-994, ТМР-470, іні гікамтину/топотекану, РКС412, валсподару/РзС833 новантрону/мітроксантрону, метарету/сураміну, батимастату,

ГЯ6) Е7070, вСН-4556, С5-682, 9-АС АСЗ3340, АСЗ3433, інцела//х-710, УХх-853, 200101, І5БІЄЇЇ, ОДН 698, ТА 2516/мармістату, ВВ2516б/мармктату, СОР 845, 02163, РО183805, ОХ8951ї лемоналу, ОР 2202, ЕК 317, піцибанілу/ОК-432, Ар З2/валрубіцину, метастрону/похідного стронцію, темодалу/темозоломіду, евацету/ліпосомального доксорубіцину, ювтаксану/плацлитакселу, таксолу/паклітакселу, кселоаду/капецитабіну, фуртулону/доксифлуридину, циюіопаксу/перорального паклітакселу перорального таксоїду, іФ) ЗРИ-077/цисплатину, НМК 1275/флавопіридолу, СР-358 (774)/ЕСЕК, СР-609 (754)/інгібітору онкогена КАБ, ко вМ5-182751/пероральної платини ЦРТ(тегафуру/урацилу), ергамізолу/левамізолу, еніурацилу/7/76С85/5Е!й підсилювача, кампто/левамізолу, камптозару/ринотекану, тумодексу/ралітрекседу, леустатину/кладрибіну, бо паксексу/паклітакселу, доксилу/ліпосомального доксорубіцину, целіксу/ліпосомального доксорубіцину, флудару/флударабіну, фармарубіцину/епірубіцину, депоциту, 201839, 100 79553/біснафталіміду,,)ї ГО 103793/доластаїну, цетиксу/ліпосомального доксорубіцину, гемзару/гемцитабіну, 70 0473/анормеду, ММ 116 кульок йоду, інгібіторів СОК4 і СОК2, інгібіторів РАКР, 04809/дексифозаміду, іфесу/меснексу/іфозаміду, вумону/теніпозиду, параплатину, карбоплатину, плантинолу/цисплатину, вепезиду/етопозиду, 20 9331, б5 таксотеру/доцетакселу, проліків гуанінарабінозиду, аналога таксану, нітрозосечовин, алкілуючих агентів, таких як мелфелан і циклофосфамід, аміноглутетиміду, аспарагінази, бусульфану, карбоплатину, хлоромбуцилу,

цитарабіну МС, дактиноміцину, даунорубіцину НОЇ, натрієвої солі естрамустинфосфату, етопозиду (МР16-213), флоксуридину, фторурацилу (5-Р)), флутаміду, гідроксисечовини (гідроксикарбаміду), іфосфаміду, інтерферону альфа-2а, альфа-20, леупроліду ацетату (аналога | НКН-рилізинг фактора), ломустину (ССМУ), мехлоретаміну

НСЇ (гірчичного азоту), меркаптопурину, месни, міто тану (орто-пара-0ОЮОЮО), мітоксантрону НСЇ, октреотиду, плікаміцину, прокарбазину Неї, стрептозоцину, тамоксифену, цитрату, тіогуаніну, тіотепу, вінбластину сульфату, амсакрину (т-АМ5ЗА), азацитидину, ертропоетину, гексаметилмеламіну (НММ), інтерлейкіну 2, мітогуазону (метил-ЗАС; метилгліоксаль-біс-гуанілгідразону; МОВО), пентостатину (2'дезоксикоформіцину), семустину (метил-ССМУ), теніпозиду (ММ-26) і віндезину сульфату, але цим не обмежується. 70 Імунотерапевтичний агент може бути вибраний з групи, що складається з рибутаксину, герцептину, квадрамету, панорексу, ІОЕС-У288, ВЕС2, С225, онколиму, ЗМАКТ М195, АТКАСЕМ, оварексу, Веххаг, ГОР-О3, іог 16, МОХ-210, МОХ-11, МОХ-22, ОМ103, 362294, анти-МЕСЕ, зенапаксу, МОХ-220, МОХ-447, МЕГІММОМЕ-2,

МЕСІММИМЕ-1, СЕАСІОЕ, претаргету, МомоМАбБ-52, ТМТ, СіІотаб-Н, ЗМІ-250, ЕМО-72000, лімфоциду, СМА 676, монофарму-С, 4В5, іог едгі.г3, іог с5, ВАВ5, анти-РІ К-2, МОХ-260, АМА АБ, ЗМАКТ 1010 АБ, ЗМАКТ АВІ. 364 АБ і 7/5 ІттиКАЇІТ-СЕА, але яка цим не обмежується.

Протиракова вакцина може бути вибрана з групи, що складається з ЕСЕ, антиідіотипічних протиракових вакцин, антигена Ср/5, меланомної вакцини ЗМК, вакцини кон'югата МОМ гангліозиду, Негг/пеи, оварексу,

М-Мах, О-Мах, І-Мах, ЗТп-КНІ. тератопу, В Р25 (МОС-1), ліпосомальної ідіотипічної вакцини, мелацину, вакцин пептидних антигенів, вакцин токсинів/антигенів, вакцини на основі ММА, РАСІ5, вакцини ВСО, ТА-НРУ, ТА-СІМ,

РІЗС-вірусу і ІіттиСузуТпегасСув, але яка цим не обмежується.

Ще в одному здійсненні способів, направлених на профілактику або лікування рака, суб'єкту може додатково введений інтерферон-о.

В інших варіантах винахід відноситься до способів профілактики захворювання у суб'єкта. Спосіб включає регулярне введення суб'єкту Ру-збагаченої або імуностимулюючої ТО-нуклеїнової кислоти для підтримки с

Відповіді імунної системи для профілактики захворювання у суб'єкта. Приклади захворювань або станів, яким прагнуть запобігти із застосуванням способів профілактики згідно з винаходом, включають мікробні інфекції о (наприклад, захворювання, що передаються статевим шляхом) і анафілактичний шок від харчової алергії.

В інших варіантах у винаході пропонується спосіб індукції природної імунної відповіді шляхом введення суб'єкту Ру-збагаченої або імуностимулюючої ТО-нуклеїнової кислоти в кількості, ефективній для активації Га природної імунної відповіді.

Відповідно до іншого варіанту винаходу пропонується спосіб лікування або профілактики вірусної або о ретровірусної інфекції. Спосіб включає введення суб'єкту, схильному до ризику вірусної або ретровірусної «-- інфекції або страждаючому від неї, ефективної кількості будь-якої з композицій згідно з винаходом для лікування або профілактики вірусної або ретровірусної інфекції. В деяких здійсненнях вірусне захворювання -

Зз5 Викликається вірусом гепатиту, ВІЛ, гепатиту В, гепатиту С, вірусом герпесу або папіломавірусом. ї-

Відповідно до іншого варіанту винаходу пропонується спосіб лікування або профілактики бактеріальної інфекції. Спосіб включає введення суб'єкту, схильному до ризику захворювання бактеріальною інфекцією або страждаючому від неї, ефективної кількості будь-якої з композицій згідно з винаходом для лікування або профілактики бактеріальної інфекції В одному здійсненні бактеріальна інфекція обумовлюється «

Внутрішньоклітинними бактеріями. шщ с В іншому варіанти винаходу пропонується спосіб лікування або профілактики паразитарної інфекції за й допомогою введення суб'єкту, що має ризик або страждаючому від паразитарної інфекції, ефективної кількості «» будь-якої з композицій згідно з винаходом для лікування або профілактики паразитарної інфекції. В одному здійсненні паразитарна інфекція обумовлюється паразитом не гельмінтом.

В деяких здійсненнях суб'єкт є людиною, а в інших здійсненнях суб'єкт є хребетним, що не є людиною, -І вибраним з групи, що складається з собаки, кішки, коня, корови, свині, кози, риби, мавпи, курчати і вівці.

Ще в одному варіанти у винаході пропонується спосіб лікування або профілактики астми за допомогою

Ше введення суб'єкту, що має ризик або страждаючому від астми, ефективної кількості будь-якої з композицій - згідно з винаходом для лікування або профілактики астми. В одному здійсненні астма є алергічною астмою.

В іншому варіанти винахід відноситься до способу лікування або профілактики алергії. Спосіб включає іні введення суб'єкту, що має ризик або страждаючому від алергії, ефективної кількості будь-якої з композицій з згідно з винаходом для лікування або профілактики алергії.

Відповідно до іншого варіанту винаходу, пропонується спосіб лікування або профілактики імунодефіциту.

Спосіб включає введення суб'єкту, що має ризик або страждаючому від імунодефіциту, ефективної кількості будь-якої з композицій згідно з винаходом для лікування або профілактики імунодефіциту.

В іншому варіанти винахід відноситься до способу індукції ТА1 імунної відповіді за допомогою введення іФ) суб'єкту будь-якої з композицій згідно з винаходом в ефективній кількості для індукції ТА1 імунної відповіді. ко В одному здійсненні способи згідно з винаходом включають введення олігонуклеотиду, що має формулу 5У4М42М2У23, і імуностимулюючої нуклеїнової кислоти, що має неметильований СоО-динуклеотид, бо ТОС-динуклеотид або Т-збагачену послідовність. У здійсненні олігонуклеотид, що включає 574М.42М»У23, вводять окремо від імуностимулюючої нуклеїнової кислоти. В деяких здійсненнях олігонуклеотид, що включає 5У4М12М2М23, і імуностимулюючу нуклеїнову кислоту вводять по черзі по тижню, а в інших здійсненнях олігонуклеотид, що включає 5"4М42М»223 і імуностимулюючу нуклеїнову кислоту, вводять по черзі по два тижні.

В іншому варіанти у винаході пропонується композиція, що включає імуностимулюючу нуклеїнову кислоту і б5 агент протиракової терапії, в складі з фармацевтично прийнятним носієм і в ефективній кількості для лікування рака або зниження ризику розвитку рака. У важливих здійсненнях імуностимулюючу нуклеїнову кислоту вибирають з групи, що складається з Т-збагаченої нуклеїнової кислоти, То-нуклеїнової кислоти і С-збагаченої нуклеїнової кислоти.

У винаході додатково пропонується набір, що включає перший контейнер, що містить імуностимулюючу нуклеїнову кислоту і щонайменше ще один контейнер (наприклад, другий контейнер), що містить агент протиракової терапії, і інструкцію по застосуванню. В одному здійсненні набір додатково включає інтерферон-о, який може бути включений окремо ще в один контейнер (наприклад, третій контейнер). У важливому здійсненні набір включає пухирці з постійним вивільненням, що містять імуностимулюючу нуклеїнову кислоту, і щонайменше один контейнер, що містить агент протиракової терапії, і інструкцію по режиму введення агента 7/0 протиракової терапії. Імуностимулююча нуклеїнова кислота може бути вибрана з групи, що складається з

Ру-збагаченої нуклеїнової кислоти, ТО-нуклеїнової кислоти і Сро нуклеїнової кислоти, де Ср нуклеїнова кислота має послідовність нуклеотидів, що включає ЗЕО ІЮ МО: 246.

У винаході додатково пропонується спосіб профілактики або лікування астми або алергії, що включає введення імуностимулюючої нуклеїнової кислоти і ліків для лікування астми/алергії в кількості, ефективній для 7/5 лікування або запобігання астми або алергії. У важливих здійсненнях імуностимулюючу нуклеїнову кислоту вибирають з групи, що складається з Т-збагаченої нуклеїнової кислоти, То-нуклеїнової кислоти і С-збагаченої нуклеїнової кислоти.

В одному здійсненні імуностимулююча нуклеїнова кислота представляє собою Т-збагачену нуклеїнову кислоту. В здійсненнях, що відносяться до цього, Т-збагачена нуклеїнова кислота має послідовність Нуклеотидів, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 і 910-913. В інших здійсненнях Т-збагачені нуклеїнові кислоти мають послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, су 250 316, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884 888, 890 і 891. о

В додатковому здійсненні, що відноситься до цього, Т-збагачена нуклеїнова кислота не є ТО-нуклеїновою кислотою. Ще в одному здійсненні Т-збагачена нуклеїнова кислота не є Сроз нуклеїновою кислотою.

В одному здійсненні імуностимулююча нуклеїнова кислота представляє собою ТО нуклеїнову кислоту. В Га зо додатковому, що відноситься до цього, здійсненні ТО-нуклеїнова кислота не є Т-збагаченою нуклеїновою кислотою. В іншому здійсненні, що відноситься до цього, То-нуклеїнова кислота не є Сро нуклеїновою кислотою. о

В одному здійсненні імуностимулююча нуклеїнова кислота представляє собою Сро нуклеїнову кислоту, де - пе

Сро нуклеїнова кислота має послідовність нуклеотидів, що включає ЗЕО ІЮ МО: 246.

В іншому здійсненні ліки проти астми/алергії є ліками, вибраними з групи, що складається з інгібітору -

РОЕ-4, бронходилататора/бета-2 агоніста, ліки для відкриття Ки каналів, антагоніста МІ А-4, антагоніста ї- нейрокініну, інгібітору синтезу ТХА?, ксантаніну, антагоніста арахідонової кислоти, інгібітору

Б-ліпоксигенази, антагоніста рецептора тромбоксину | А2, антагоніста тромбоксану А2, інгібітору 5-ліпокс-активаторного білка і інгібітору протеази, але не обмежується цим. В деяких важливих здійсненнях ліки проти астми/алергії представляють собою бронходилататор/бета-2 агоніст, вибраний з групи, що « складається з сальметеролу, сальбутамолу, тербуталіну, 02522/формотеролу, фенотеролу і орципреналіну. шщ с В іншому здійсненні ліки проти астми/алергії є ліками, вибраними з групи, що складається з й антигістамінних препаратів і індукторів простагландинів. В одному здійсненні антигістамін вибирають з групи "» складається з лоратидину, цетиризину, баклізину, аналогів цетеризину, фексофенадину, терфенадину, деслоратадину, норастемізолу епінастину, ебастину, астемізолу, левокабастину, азеластину, траніласту, терфенадину, мізоластину, бетатастину, СЗ 560 і НБК 609. В іншому здійсненні індуктор простагландинів є -І 5-5751.

Ще в одному здійсненні ліки проти астми/алергії вибирають з групи, що складається із стероїдів і і імуномодуляторів. Іммуномодулятори можуть бути вибрані з групи, що складається з протизапальних агентів, - антагоністів лейкотриєнів, мутеїнів ІЛ-4, розчинних рецепторів ІЛ-4, імуносупресантив, анти-ІЛ-4-антитіл, антагоністів ІЛ-4, анти-ІЛ-5-антитіл, розчинних рецепторів ІЛ-13-Ес гібридних білків, анти-ІЛ-9 антитіл, ССКЗ іні антагоністів, ССК5 антагоністів, МІ А-4 інгібіторів і негативних регуляторів ІДЕ, але яка не обмежується цим. з В одному здійсненні негативним регулятором ІДЧЕ є анти-І9Е.

В іншому здійсненні стероїди вибирають з групи складається з беклометазону, флутиказону, трамцинолону, будесоніду і будесоніду. Ще в одному здійсненні імуносупресор є вакциною толерантного пептиду.

В одному здійсненні імуно стимулюючу нуклеїнову кислоту вводять одночасно з ліками проти астми/алергії. В іншому здійсненні суб'єкт є суб'єктом з порушенням імунної системи. іФ) Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти для введення суб'єкту в розкритих тут способах, що відносяться до ко профілактики і лікування астми/алергії, є такими, як описано для інших методичних аспектів винаходу.

В іншому варіанти у винаході пропонується набір, що включає перший контейнер, що містить бо імуностимулюючу нуклеїнову кислоту, і щонайменше інший контейнер (наприклад, другий контейнер), що містить ліки проти астми/алергії, і інструкції по застосуванню. Імуностимулююча нуклеїнова кислота, використовувана в наборі, є описаною тут. У важливих здійсненнях імуностимулюючу нуклеїнову кислоту вибирають з групи, що складається з Т-збагаченої нуклеїнової кислоти, ТО-нуклеїнової кислоти і С-збагаченої нуклеїнової кислоти. В іншому важливому здійсненні набір включає пухирці з постійним вивільненням, що містять імуностимулюючу 65 Нуклеїнову кислоту, і щонайменше один контейнер, що містить ліки проти астми/алергії, і Інструкції по режиму введення ліків проти астми/алергії. Ліки проти астми/алергії можуть бути вибрані з групи ліків проти астми/алергії, описаних у вищевикладених способах, направлених на профілактику або лікування астми/алергії.

Ще в одному варіанти у винаході пропонується композиція, що включає імуностимулюючу нуклеїнову кислоту і ліки проти астми/алергії в складі з фармацевтично прийнятним носієм, в кількості, ефективній для профілактики або лікування імунної відповіді, пов'язаної з експозицією з посередником астми або алергії.

Імуностимулююча нуклеїнова кислота може бути вибрана з групи імуностимулюючих нуклеїнових кислот, описаних у викладених вище способах і композиціях. У важливих здійсненнях імуностимулюючу нуклеїнову кислоту вибирають з групи, що складається з Т-збагаченої нуклеїнової кислоти, ТО-нуклеїнової кислоти і

С-збагаченої нуклеїнової кислоти. Ліки проти астми/алергії можуть бути вибрані з групи ліків проти астми і 7/0 ліків проти алергії, описаних у викладених вище способах і композиціях.

Ще в одному варіанти у винаході пропонується композиція, що включає імуностимулюючу нуклеїнову кислоту, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 95-136, 5ЕО ІЮ МО: 138-152, 5ЕО ІЮ МО: 154-222, БЕО ІЮ

МО: 224-245, 5ЕО ІЮ МО: 247-261, ЗЕО ІО МО: 263-299, 5ЕО ІО МО: 301, 5ЕО ІО МО: 303-4109, ЗЕО І МО: 414-420, 5ЕБО І МО: 424, 5ЕО ІЮ МО: 426-947, 5ЕО ІЮ МО: 959-1022, ЗЕО ІЮ МО: 1024-1093, і фрармацевтично прийнятний носій. Переважно імуностимулююча нуклеїнова кислота присутня в композиції в ефективній кількості.

В одному здійсненні імуностимулююча нуклеїнова кислота присутня в ефективній кількості для індукції імунної відповіді. В іншому здійсненні імуностимулююча нуклеїнова кислота присутня в ефективній кількості для профілактики або лікування рака. Ще в одному здійсненні імуностимулююча нуклеїнова кислота присутня в ефективній кількості для профілактики або лікування астми/алергії. У винаході також пропонуються набори, що 2о Включають композиції будь-яких описаних вище імуностимулюючих нуклеїнових кислот і інструкції по їх застосуванню.

В іншому варіанти винахід включає композицію імуностимулюючої нуклеїнової кислоти, що складається по суті із ЗМ. ТСОТСОТТМ 23", де щонайменше один з С не метильований, де Мі представляє собою нуклеїнову кислоту, що має щонайменше один нуклеотид, де Мо представляє собою нуклеїнову кислоту, що має від 0 до 50 сч ов Нуклеотидів, і де імуностимулююча нуклеїнова кислота має менше 100 нуклеотидів.

Ще в одному варіанти винахід відноситься до фармацевтичної композиції імуностимулюючої нуклеїнової і) кислоти, що включає: 5ТСОТСОТТ3, де щонайменше один із С не метильований, де імуностимулююча нуклеїнова кислота має менше 100 нуклеотидів і фосфодіефірний остов, і пристрої для постійного вивільнення.

В деяких здійсненнях пристрій для постійного вивільнення є мікрочастинкою. В інших здійсненнях композиція с зо Включає антиген.

Кожне з обмежень винаходу може охоплювати різні аспекти винаходу. Отже, очікується, що кожне з юю обмежень винаходу, включаючи будь-який елемент або поєднання елементів, може бути включено в кожний «- варіант винаходу.

ФіглЛА є гістограмою експресії СО8б (вісь В) СО19- клітинами після експозиції даних клітин з ї- олігонуклєотидами, представленими на осі Х, в концентрації О,15мкг/мл. ї-

Фіг.18 є таблицею з даними з Фіг1А.

Фіг1С є гістограмою експресії СО8б (вісь В) СО 19- клітинами після експозиції даних клітин з олігонуклєотидами, представленими на осі Х, в концентрації О,ЗОмкг/мл.

Фіг.10 є таблицею з даними з Фіг.1С. «

Фіг.2 є графіком порівняння здатності ОДН 2137, ОДН 2177, ОДН 2200 ї ОДН 2202 до стимуляції проліферації ств) с В-клітин при концентраціях в діапазоні від 0,2мкг/мл до 20мкг/мл. . Фіг.З є графіком порівняння здатності ОДН 2188, ОДН 2189, ОДН 2190 ї ОДН 2182 до стимуляції проліферації и? В-клітин при концентраціях в діапазоні від 0,2мкг/мл до 20мкг/мл.

Фіг.4 є гістограмою, що описує дозозалежну активацію В-клітин, що викликається ОДН, що не містять Сро.

РВМС крові донора інкубувала з вказаними концентраціями ОДН 2006 (ЗЕО 1О МО: 246), 2117 (БЕО І МО: 358), -І 2137 (5ЕО І МО: 886), 5126 (ЗЕО ІЮО МО: 1058) і 5162 (ЗЕО ІО МО: 1094) і рарбували тАБ проти СО 19 (маркер

В-клітин) і 086 (маркер активованих В-клітин, В7-2). Експресію виміряли за допомогою проточної цитометрії.

Ш- Фіг.5 є гістограмою, що описує стимуляцію В-клітин різноманітним набором ОДН, що не містять Сро. РВМС - крові одного репрезентативного донора стимулювала 0,4мкг/мл, 1,0мкг/мл або 10,Омкг/мл наступних ОДН: 2006 5о (ЗЕО О МО: 246), 2196 (5ЕО ІО МО: 913), 2194 (ЗЕО ІО МО: 911), 5162 (ЗБЕ ІЮ МО: 1094) ї 5163 (ЗЕО І МО: о 1095), 5168 (5ЕБО І МО: 1096) і 5169 (5БО ІО МО: 1097), і експресію маркера активації СО86 (87-2) на

Ге СОр19-позитивних В-клітинах виміряли за допомогою проточної цитометрії.

Фіг.б є гістограмою, що описує активацію В-клітин, що викликається ОДН 1982 і 2041, що не містять Сро.

РВМС інкубували з вказаними концентраціями ОДН 2006 (ЗЕО ІО МО: 246), 1982 (ЗЕО ІЮО МО: 225) і 2041 (5ЕО дво ГО МО: 282), і активацію В-клітин (експресію маркера активації СО86) виміряли проточною цитометрією.

Фіг.7 є гістограмою, що описує МК-клітини, активовані ОДН, що не містять Сро. РВМС інкубували з бмкг/мл (Ф, наступних ОДН: ОДН 2006 (ЗЕО ІЮО МО: 246), 2117 (ЗЕО ІО МО: 358), 2137 (5ЕО ІЮО МО: 886), 2183 (5ЕО І МО: ка 433), 2194 (ЗЕО ІЮО МО: 911) ії 5126 (5ЕО ІЮ МО: 1058) і фарбували тАбБ проти СО5 (маркер Т-клітин), СО5б (маркер МЕЇІ-клітин) і СО6О (маркер ранньої активації). Експресію СОб6ЗО на СО5б6 позитивних МК-клітинах бо Виміряли за допомогою проточної цитометрії.

Фіг.8 є гістограмою, що показує, що опосередкована МК цитотоксичність збільшується за допомогою ОДН, що не містять Сро. Опосередкований МК лізис клітин-мішеней К-562 виміряли після інкубації РВМС протягом ночі з бмкг/мл ОДН 2006 (ЗЕО ІЮО МО: 246), 2194 (5ЕО ІЮ МО: 911) і 5126 (5ЕО ІЮО МО: 1058).

Фіг.9 є гістограмою, що показує, що МКТ-клітини можуть бути активовані ОДН, що не містять Сро. РВМС 65 одного репрезентативного донора інкубували в присутності бмкг/мл ОДН: 2006 (5ЕО І МО: 246), 2117 (ЗЕО ІЮ

МО: 358), 2137 (ЗЕО ІО МО: 886), 2183 (5ЕБЕО ІО МО: 433) і 2194 (5ЕБО ІЮО МО: 911) і 5126 (З5ЕО ІЮО МО: 1058)

протягом 24 годин і активацію МКТ-клітин виміряли за допомогою проточної цитометрії після фарбування клітин тАб проти СОЗ (маркер Т-клітин), СО56 (маркер МК-клітин) і СО69 (маркер ранньої активації).

Фіг.10 є гістограмою, що описує стимуляцію моноцитів різними ОДН, що містять Сро і не містять Сро. РВМС інкубували у присутності бмкг/мл 2006 (5ЕО ІЮ МО: 246), 2117 (5ЕО ІЮО МО: 358), 2137 (ЗЕО ІЮ МО: 886), 2178 (ЗЕО ІЮО МО: 428), 2183 (ЗЕО ІЮ МО: 433), 2194 (5БО ІЮО МО: 911), 5126 (ЗЕО ІО МО: 1058) і 5163 (5ЕО ІЮО МО: 1095) і фарбували на СО14 (маркер моноцитів) і СО80 (маркер активації, В7-1). Експресію виміряли за допомогою проточної цитометрії.

Фіг.11 є гістограмою, що описує секреції ТМЕсі при культивуванні клітин людини з ОДН, що не містять Сро. 7/0 РВМС культивували протягом 24 годин з або без бмкг/мл вказаних ОДН або з мкг/мл І РЗ як позитивного контролю і ТМРо, виміряли за допомогою ТІФА.

Фіг.12 є гістограмою, що показує, що секреція ІЛ-6 після культивування з ОДН, що не містять Сро, має той же характер, що і ТМЕо. РВМС культивували вказаними ОДН (1,Омкг/мл), і ІЛ-6 виміряли в супернатантах за допомогою ТІФА.

В одному варіанти винахід включає дані про те, що піримідин (Ру)-збагачені і, переважно тимідин (Т)-збагачені нуклеїнові кислоти, так само як нуклеїнові кислоти, які містять ТО-динуклеотидні мотиви, ефективні в опосередкуванні імуностимулюючих ефектів. На попередньому рівні техніки було відомо, що нуклеїнові кислоти, що містять Сро, є терапевтичними і профілактичними композиціями, які стимулюють імунну систему для лікування рака, інфекційних захворювань, алергії, астми і інших порушень, і допомагають захистити проти інфекцій, що викликаються умовно-патогенними мікроорганізмами, після хіміотерапії рака. Сильні, але збалансовані, клітинна і гуморальна імунні відповіді, які виникають завдяки стимуляції Сро, відображають індивідуальну природну захисну систему організму проти хвороботворних патогенів і ракових клітин.

Послідовності Сро, хоча відносно рідкісні в ДНК людини, звичайно виявляються в ДНК інфекційних організмів, таких як бактерії. Імунна система людини, очевидно, розвивалася у напрямі пізнавання послідовностей Сро як Га ранньої застережливої ознаки інфекції і ініціації негайної і сильної імунної відповіді проти хвороботворних патогенів без розвитку несприятливих реакцій, часто спостережуваних відносно інших імуностимулюючих о агентів. Таким чином, нуклеїнові кислоти, що містять Сро, на основі природного імунного захисного механізму, можуть бути використані як унікальний і природний шлях імунної терапії. Модулюючі ефекти нуклеїнових кислот, що містять Сро, на імунну систему були розкриті заявниками даної патентної заявки і детально описані в разом сі поданих патентних заявках таких як (патентні заявки США, серійні Моз: 08/386063, зареєстрована 02/07/95 (їі відноситься до цього патент РСТ О5БОУБ/01570); 08/738652, зареєстрована 10/30/96; 08/960774, зареєстрована о 10/30/97 (і відноситься до цього патент РСТ/О597/19791, ММО 98/18810); 09/191170, зареєстрована 11/13/98; ч 09/030701, зареєстрована 02/25/98 (і відноситься до цього патент РСТ/О598/03678; 09/082649, зареєстрована 05/20/98 (і відноситься до цього патент РСТМИБ5О8/10408) ; 09/325193, зареєстрована 06/03/99 (і відноситься до в цього патент РСТ/ОБО8/04703); 09/286098, зареєстрована 04/02/99 (і відноситься до цього патент ч-

РСТ/О599/07335); 09/306281, зареєстрована 05/06/99 (і відноситься до цього патент РСТ/О599/09863)). Повний зміст кожного з даних патентів і патентних заявок включено тут як посилання.

Дані даного винаходу застосовні до всіх описаних вище застосувань нуклеїнових кислот, що містять Сро, « також як до будь-якого іншого відомого застосування нуклеїнових кислот, що містять Сро. В одному варіанти винахід пов'язаний з відкриттям того, що Ру-збагачені і, переважно, Т-збагачені і ТО-нуклеїнові кислоти мають - с схожі з СрОо-олігонуклеотидами імуностимулюючі властивості, незалежно від присутності СроО-мотиву. Таким ц чином, винахід корисний для будь-якого способу стимуляції імунної системи з застосуванням Ру-збагачених і "» ТоО-нуклеїнових кислот. Несподівано було також відкрито, відповідно до винаходу, що химерні олігонуклеотиди, в яких відсутній Сро-мотив, є імуностимулюючими і мають багато з тих же профілактичних і терапевтичних активностей, що і Сро-олігонуклеотиди. -І Ру-збагачена нуклеїнова кислота представляє собою Т-збагачену або С-збагачену імуностимулюючу нуклеїнову кислоту. В деяких здійсненнях Т-збагачені нуклеїнові кислоти переважні. Т-збагачена нуклеїнова кислота представляє собою нуклеїнову кислоту, яка включає щонайменше одну полі-Т-послідовність та/або яка - має композицію нуклеотидів з більше, ніж 2595 Т-нуклеотидних залишків. Нуклеїнова кислота, що має полі-Т-послідовність, включає щонайменше чотири Т в ряд, такий як 5ТТТТ3. Переважно Т-збагачена і-й нуклеїнова кислота включає більше однієї полі-Т-послідовності. В переважних здійсненнях Т-збагачена

Кз нуклеїнова кислота може мати 2, 3, 4 і т.д. полі-Т-послідовностей, таких як олігонуклеотид 22006 (ЗЕО ІЮ

МО:246). Один з Т-збагачених олігонуклеотидів з найбільш сильними імуностимулюючими властивостям представляє собою нуклеїнову кислоту, що складається повністю з Т-нуклеотидних залишків, наприклад, Оолігонуклеотид 2183 (ЗЕО І МО:433). Інші Т-збагачені нуклеїнові кислоти відповідно до винаходу мають нуклеотидний склад з більше, ніж 2595 Т-нуклеотидних залишків, але необов'язково включають

Ф, полі-Т-послідовність, В даних Т-збагачених нуклеїнових кислотах Т-нуклеотидні залишки можуть бути ко відокремлені один від одного іншими типами нуклеотидних залишків, тобто С, С і А. В деяких здійсненнях

Т-збагачені нуклеїнові кислоти мають нуклеотидний склад з більше 3595, 4095, 5095, 6095, 7095, 8095, 90905 і 99905 бо Т-нуклеотидних залишків і кожний цілий 905 між ними. Переважно Т-збагачені нуклеїнові кислоти мають щонайменше одну полі-Т-послідовність і нуклеотидний склад з більше, ніж 2595 Т-нуклеотидних залишків.

Відповідно до винаходу було відкрито, що вміст Т в ОДН має істотну дію на імуностимулюючий ефект ОДН і що Т-збагачені ОДН можуть активувати багато які типи клітин імунної системи людини у відсутності яких-небудь

Сро-мотивів. Олігонуклеотид, що має З'полі-Т-область і 2 5'ЄСв, наприклад, ОДН 2181 (5ЕО ІЮО МО:431), володіє 65 високою імуностимулюючою активністю. Олігонуклеотид схожої довжини, ОДН 2116 (5ЕО ІО МО:357), який містить два СО-динуклеотиди на 5і-кінці і полі-С область на 3-кінці, також був імуностимулюючим, але у меншій мірі, ніж Т-збагачений олігонуклеотид, при застосуванні стандартних експериментальних умов. Таким чином, хоча С і Т мають майже ідентичні структури, їх вплив на імунні властивості ОДН різні. Вони обидва здатні індукувати імунну відповідь, але різною мірою. Таким чином, як Т-збагачені, так і С-збагачені олігонуклеотиди корисні відповідно до винаходу, але Т-збагачені олігонуклеотиди є переважними. Більш того, якщо вміст Т в ОДН знизили шляхом включення інших основ, таких як с, А або С, то імуностимулюючі ефекти знижені (ОДН 82188 (ЗЕО ІЮ МО:905), 2190 (ЗЕО ІЮ МО:907), 2191 (ЗЕО ІЮО МО:908) і 2193 (ЗЕО ІО МО:910).

С-збагачена нуклеїнова кислота є молекулою нуклеїнової кислоти, яка має щонайменше одну або переважно щонайменше дві полі-С області, або яка складається щонайменше з 5095 С нуклеотидів. Полі-С область має 70 щонайменше чотири С залишки в ряд. Таким чином, полі-С область охоплюється формулою 5'СССС3". В деяких здійсненнях переважно, щоб полі-С область мала формулу ССССССУ. Інші С-збагачені нуклеїнові кислоти відповідно до винаходу мають нуклеотидний склад з більше 5095 С-нуклеотидних залишків, але не обов'язково включають полі-С-послідовність. В даних С-збагачених нуклеїнових кислотах С-нуклеотидні залишки можуть бути відокремлені один від одного іншими типами нуклеотидних залишків, тобто 0, Т і А. В деяких здійсненнях

С-збагачені нуклеїнові кислоти мають нуклеотидний склад з більше 6095. 7095, 8095, 9095 і 9995 С-нуклеотидних залишків і кожний цілий 956 між ними. Переважно С-збагачені нуклеїнові кислоти мають щонайменше одну полі-С-послідовність і нуклеотидний склад з більше, ніж 5095 С-нуклеотидних залишків і в деяких здійсненнях є також Т-збагаченими.

Як показано в прикладах, декілька ОДН, що раніше вважалися не володіючими імуностимулюючими го властивостями, включаючи два ОДН БЕО ІС МО:225 і 5БО ІЮ МО:282, раніше описані як не володіючі імуностимулюючими властивостями і застосовувалися головним чином як контрольні ОДН (ТакКапазвні, Т еї аї 2000. 9. Іттипої. 164:4458), як знайдено, є імуностимулюючими. Експерименти авторів винаходу показали, що дані ОДН можуть стимулювати В-клітини, хоча при більш високих концентраціях у порівнянні з Ср ОДН (Фіг.б).

Довгий полі-Т ОДН (30 членів) індукував, щонайменше в деяких експериментах, активацію В-клітин, порівнянну сч р ПО силі з одними з найбільш сильних СрО-олігонуклеотидних активаторів В-клітин. За допомогою даних експериментів виявлені також несподівані дані про те, що навіть полі-- ОДН можуть вести до стимуляції і)

В-клітин.

Іммуностімуляция за допомогою даних ОДН, проте, не обмежується В-клітинами людини. Різні експериментальні тести ясно продемонстрували, що додатково моноцити, МК-клітини і навіть МКТ клітини с зо Можуть бути проактивовані за допомогою таких, що не містять Ср ОДН (Фіг.7-10). На відміну від полі-ї і полі-С-послідовностей, імуностимуляція за допомогою полі-А- послідовностей (щонайменше, для моноцитів і що)

МК-клітин) не була досягнута. Цікаво, що було знайдено, що введення СрО-мотиву в 5ЕО ІЮ МО: 225 «- збільшувало імуностимулюючу активність, тоді як елонгація із застосуванням полі-Т подовження не збільшувала імуностимуляцію. Це припускає, що Сро- і Т-збагачені ОДН можуть діяти за допомогою різних механізмів або ї- шляхів. Можливо також, що введення полі-Т-мотиву в різні позиції БЕО І МО: 225 може вести до змін ї- імуностимулюючих властивостей.

Вживаний тут термін "То-нуклеїнова кислота" або "імуностимулююча ТО-нуклеїнова кислота" представляє собою нуклеїнову кислоту, що містить щонайменше один ТрО-динуклеотид (тимідин-гуанін динуклеотидну послідовність, тобто "ТО-ДНК" або ДНК, що містить 5-тимідин, за яким слідує 3-гуанозин, зв'язані фосфатним « зв'язком), яка активує компонент імунної системи. з с В одному здійсненні у винаході пропонується То-нуклеїнова кислота, представлена щонайменше формулою: 5МХ1ТОХ» Моз" з де Хі і Хо є нуклеотидами і М є будь-який нуклеотид, М. і Мо є послідовностями нуклеїнових кислот, складеними з будь-якого числа М, пропонованими так, що загальна сума М. і Мо знаходиться в діапазоні від 11 45. ДО 21. Як прикладу, якщо М 4 дорівнює 5, то М. може складати б (приводячи до загальної довжини -І олігонуклеотиду, що становить 15 нуклеотидів). т може бути локалізований в будь-якому місці за довжиною нуклеотиду, включаючи 5'-кінець, центр і З'кінець. Таким чином, М. може складати від нуля до 21 включно, за - умови, що Мо вибирають, відповідно, щоб одержати суму М» і М, яка дорівнює від 11 до 21 включно. Схоже Мо - може складати від нуля до 21 включно, за умови, що загальна сума М. і Мо дорівнює 11 до 21 включно. В деяких здійсненнях Х 4 є аденін, гуанін або тимідин, і Хо представляє собою цитозин, аденін або тимідин. В одному о переважному здійсненні Х» є тимідин. В інших здійсненнях Х. представляє собою цитозин і Х» є гуанін. В інших

Із здійсненнях, як тут обговорюється, нуклеїнова кислота може охоплювати інші мотиви, пропоновані так, щоб вони були достатньо довгі, щоб виконувати функцію, яка цікавить.

В інших здійсненнях ТО-нуклеїнова кислота представлена щонайменше формулою: 5Б 5МХ1Х»ТОХ ХМ" де Хі, Хо, Хз і Хі є нуклеотидами. В деяких здійсненнях Х 4Хо є нуклеотиди, які вибрані з групи, що (Ф) складається з; рт, зро, орА, АрА, Арт, Ар, Срт, СрА, ТрА і ТрТ; а ХаХ); являють собою нуклеотиди, які ка вибрані з групи, що складається з ТрТт, Срт, Арт, Ар, Трео, АрсС, Сро, ТрА, Ара і СрА; М є будь-який нуклеотид,

Мі Її Мо є послідовностями нуклеїнових кислот, складеними з будь-якого числа нуклеотидів, за умови, що бо загальна сума Му ї Мо знаходиться в діапазоні від 9 до 19. В деяких здійсненнях Х 4Хо являють собою СрА або

ОрТт, а ХоХ, є Трт.

В інших здійсненнях Х 4 або Хо, або обидва є пуринами, а Хз або Х,, або обидва є піримідинами, або Х/Хоє

ОрА, а Х»з або Х,, або обидва, є піримідинами. В одному переважному здійсненні ХаХу; є нуклеотиди, вибрані з групи, що складається з: Трт, Трс і ТрА. 65 Імуностимулююча нуклеїнова кислота може бути будь-якого розміру (тобто довжини), за умови, що має щонайменше 4 нуклеотиду. У важливих здійсненнях імуностимулюючі нуклеїнові кислоти мають довжину в діапазоні між б і 100. Ще в одних здійсненнях довжина ув'язнена в діапазоні між 8 і 35 нуклеотидів.

Переважно, щоб ТО-олігонуклеотиди коливалися за розміром від 15 до 25 нуклеотидів.

Розмір (тобто число нуклеотидних залишків за довжиною нуклеїнової кислоти) імуностимулюючої нуклеїнової

Кислоти може також вносити внесок в стимулюючу активність нуклеїнової кислоти. Несподівано було відкрито, що навіть для імуностимулюючих нуклеїнових кислот з високою імуностимулюючою активністю довжина нуклеїнової кислоти впливає на ступінь імунної стимуляції яка може бути досягнута. Було показано, що збільшення довжини Т-збагаченої нуклеїнової кислоти до 24 нуклеотидів викликає збільшення імунної стимуляції. Експерименти, представлені в прикладах демонструють, що коли довжина Т-збагаченої нуклеїнової 7/0 Кислоти зростає з 18 до 27 нуклеотидів, здатність нуклеїнової кислоти стимулювати імунну відповідь значно збільшується (порівняйте ОДН 82194, 2183, 2195 і 2196, які знижуються в розмірі від 27 до 18 нуклеотидів).

Збільшення довжини нуклеїнової кислоти до 30 нуклеотидів має істотний внесок в біологічні властивості нуклеїнової кислоти, але збільшення довжини вище 30 нуклеотидів, мабуть, додатково не впливає на імуностимулюючий ефект (наприклад, порівняйте ОДН з 2179 до 2006).

Було показано, що ТО-нуклеїнові кислоти з діапазоном довжини від 15 до 25 нуклеотидів можуть проявляти посилені імуностимулюючі властивості. Таким чином, у винаході пропонується олігонуклеотид, який має 15-27 нуклеотидів в довжину (тобто олігонуклеотид завдовжки в 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 або 27 нуклеотидів), який може бути Т-збагаченою нуклеїновою кислотою або може бути як Т-збагаченою, так і

ТО-нуклеїновою кислотою. В одному здійсненні олігонуклеотид не представляє собою ні Т-збагачену нуклеїнову 2о Кислоту, ні ТО-нуклеїнову кислоту. В інших здійсненнях олігонуклеотид не має СО-мотиву. У винаході схоже пропонуються олігонуклеотиди, які мають в довжину 15-27 нуклеотидів, олігонуклеотиди, які мають в довжину 18-25 нуклеотидів, олігонуклеотиди, які мають в довжину 20-23 нуклеотиди, і олігонуклеотиди, які мають в довжину 23-25 нуклеотидів. Будь-яке із згаданих вище здійснень, що відносяться до олігонуклеотидів завдовжки в 15-27 нуклеотидів, також відноситься до олігонуклеотидів з даними різними довжинами. Винахід додатково сч охоплює застосування будь-якого з даних вказаних вище нуклеотидів в цитованих тут способах.

Хоча максимальний рівень імунної стимуляції досягається з деякими Т-збагаченими нуклеїновими кислотами, і) коли нуклеїнова кислота має в довжину 24-30 нуклеотидних залишків, також як з деякими ТО-нуклеїновими кислотами, довжина яких знаходиться в діапазоні від 15 до 25 нуклеотидів більш короткі або більш довгі імуностимулюючі нуклеїнові кислоти також можуть бути застосовані відповідно до способів винаходу. Для с зо прискорення захоплення клітинами імуностимулюючих нуклеїнових кислот переважна мінімальна довжина з 6 нуклеїнових залишків. Нуклеїнові кислоти будь-якого розміру більше б нуклеотидів (навіть завдовжки більше о багато з т.п.н.) здатні індукувати імунну відповідь відповідно до винаходу, якщо присутня достатня кількість «- імуностимулюючих мотивів, оскільки більш крупні нуклеїнові кислоти деградують усередині клітини. Переважно імуностимулюючі нуклеїнові кислоти складають в довжину діапазон між 8 і 100 нуклеотидами, а в деяких в. здійсненнях імуностимулюючі нуклеїнові кислоти, що містять Т-збагачені ділянки, складають в довжину між 24 і ї- нуклеотидами та імуностимулюючі нуклеїнові кислоти, що містять ТО, складають в довжину між 15 і 25 нуклеотидами.

В одному здійсненні Т-збагачена нуклеїнова кислота представлена щонайменше формулою: 5ХІХоТТТТХзХ,У, « 40 де Хі, Хо, Хз і Х; є нуклеотидами. В одному здійсненні ХХ» є ТТ та/або ХьХ, є ТТ. В іншому здійсненні Х4іХо з с є одним будь-який з наступних нуклеотидів ТА, ТО, ТС, АТ, АА, АС, АС, СТ, СС, СА, ОТ, о, БАіОС;ахХзХ, є один будь-який з наступних нуклеотидів ТА, ТО, ТС, АТ, АА, АС, АС, СТ, СС, СА, СТ, бо, СА і ОС. ;» В деяких здійсненнях переважно, щоб імуностимулюючі нуклеїнові кислоти не містили полі-С (СССС) або полі-А (АААА). В інших здійсненнях переважно, щоб імуностимулююча нуклеїнова кислота включала полі-С, полі-А, полі-С (б5556) або множинні 50. Особливо полі-сз або множинні 5 мотиви надають істотні ефекти на -І деякі імуностимулюючі нуклеїнові кислоти. Ефект таких, що не містять Т-послідовностей частково залежить від статусу остову нуклеїнової кислоти. Наприклад, якщо нуклеїнова кислота має фосфодіефірний остов або ш- химерний остов, включення даних послідовностей в нуклеїнову кислоту повинне надавати тільки мінімальний, - якщо взагалі який-небудь, ефект на біологічну активність нуклеїнової кислоти. Якщо остов повністю фосфортіоатний (або з іншою фосфатною модифікацією) або в значній мірі фосфортіоатний, то включення даних 1 послідовностей може мати більший вплив на біологічну активність або кінетику біологічної активності,

Ге викликаючи зниження потенціалу Т-збагачених та імуностимулюючих То-нуклеїнових кислот.

Хоча показано, що С-збагачені нуклеїнові кислоти володіють імуностимулюючими властивостями, введення полі-С-послідовностей в Т-збагачену нуклеїнову кислоту так, щоб понизити відносну пропорцію Т-нуклеотидів у нуклеїновій кислоті може вносити негативний внесок в нуклеїнову кислоту. Хоча автори винаходу не зв'язані передбачуваним механізмом, передбачається, що імунна система розробила механізми для розрізнення

Ф) нуклеїнових кислот, що мають різні нуклеотидні властивості, можливо в результаті різної посадки зв'язуючих ка білків, які впізнають різні послідовності, або специфічно зв'язуючих білків, які впізнають всі імуностимулюючі послідовності, але зв'язуються з ними з різною спорідненістю. В цілому нуклеїнові кислоти, що бо Включають неметильовані Сро-мотиви, є в найбільшому ступені імуностимулюючими, за ними слідують

Т-збагачені нуклеїнові кислоти, ТО-нуклеїнові кислоти і С-збагачені нуклеїнові кислоти. Дане узагальнення, проте, має багато виключень. Наприклад, істотно Т-збагачена нуклеїнова кислота, подібна ЗЕО ІЮ МО: 886, є більшою мірою імуностимулюючою в деяких тестах, ніж деякі Сро нуклеїнові кислоти, що містять (наприклад, фосфортіоатна Сро нуклеїнова кислота, що містить єдині Сро-мотив). 65 Було також відкрито, що додавання полі-А хвоста до імуностимулюючої нуклеїнової кислоти може збільшувати активність нуклеїнової кислоти. Було відкрито, що, коли сильну імуностимулюючу Сро нуклеїнову кислоту (БЕО ІЮ МО: 246) модифікували шляхом додавання полі-А-хвоста (АААААА) або полі-Т-хвоста (ТТ), одержані олігонуклеотиди збільшували свою імуностимулюючу активність. Здатність полі-А і полі-Т-хвоста збільшувати імуностимулюючі властивості олігонуклеотиду дуже схожі. ЗЕО ІЮ МО:246 представляє собою

Т-збагачений олігонуклеотид. Ймовірно, що якщо полі-А- і полі-Т-хвости додають до нуклеїнової кислоти, яка не є Т- збагаченою, це повинне внести більший внесок в імуностимулюючу здатність нуклеїнової кислоти. Оскільки полі-Т-хвіст додавали до нуклеїнової кислоти, яка вже була високо Т-збагаченою, імуностимулюючі властивості додавання полі-Т в деякій мірі, але не повністю розмиваються. Дані результати мають важливе значення для застосування полі-А-областей. Таким чином, в деяких здійсненнях імуностимулюючі нуклеїнові кислоти /0 Включають полі-А область, а в інших здійсненнях вони не включають Її.

Деякі з імуностимулюючих нуклеїнових кислот згідно з винаходом включають один або більше Со-мотивів.

Присутність СО-мотивів в імуностимулюючих нуклеїнових кислотах також робить вплив на біологічну активність нуклеїнових кислот. Якщо сумарна довжина імуностимулюючої нуклеїнової кислоти складає 20 нуклеотидних залишків або менше, то СрО-мотиви важливі для визначення імунного ефекту нуклеїнової кислоти, і /5 Метилювання даних мотивів знижує силу імуностимулюючих ефектів нуклеїнової кислоти. Якщо довжину імуностимулюючої нуклеїнової кислоти збільшують до 24, то імуностимулюючі ефекти нуклеїнової кислоти стають менш залежними від Сро-мотивів і не знищуються більш шляхом метилювання Сро-мотивів або шляхом їх інверсії в зС-динуклеотиди, що дає представлені тут інші імуностимулюючі властивості.

Наприклад, ОДН 2006 (ЗЕО ІЮО МО:246) представляє собою сильну імуностимулюючу Т-збагачену нуклеїнову 2о Кислоту з 24 нуклеотидних залишків в довжину з чотирма Сро- динуклеотидами. Проте ОДН 2117 (ЗЕО І

МО:358), в якому СрО-мотиви метильовані, також є сильним імуностимулюючим олігонуклеотидом. ОДН 2137 (ЗЕО 0 МО:886), в якому СроОо-мотиви ОДН 2006 інвертовані до срсС і який в результаті володіє шістьма

ТОб-динуклеотидами, також є імуностимулюючим олігонуклеотидом. Імуностимулюючі ефекти нуклеїнових кислот, таких як ОДН 2117 їі 2137, регулюються з допомогою за змістом в них Т і ТО. Кожна з даних трьох сч нуклеїнових кислот є Т- збагаченою і ОДН 2137 додатково ТО-збагаченою. Якщо вміст в них Т понизити шляхом введення інших основ, таких як А (ОДН 2117 (5ЕО ІЮО МО:358)), або якщо вміст в них ТО знизити за рахунок і) заміни ТО на АС, то імуностимулюючі ефекти в деякій мірі знижуються. В іншому прикладі нуклеїнова кислота з 24 нуклеотидами в довжину, в якій всі з положень рандомізовані, має тільки помірний імуностимулюючий ефект (ОДН 2182 (5ЕБЕО ІЮО МО:432)). Подібно цьому, нуклеїнова кислота з 24 нуклеотидами в довжину з іншими с зо складами нуклеотидів має імуностимулюючі ефекти, що розрізняються, залежно від вмісту в них Т (ОДН 2188 (ЗЕО І МО:905), 2189 (ЗЕО ІЮ МО:906), 2190 (5ЕО ІО МО:907), 2191 (ЗЕО ІО МО:908), 2193 (5ЕО ІЮ МО:910), юю 2183 (ЗЕО 1О МО:433) і 2178 (БЕО ІЮ МО:428)). ОДН 2190, який містить ТОТ мотиви, є більш імуностимулюючим, - де ніж ОДН 2202, який містить ТО мотиви. Таким чином, в деяких здійсненнях ТОТ мотиви є переважними. Ще в одних здійсненнях важливе число ТО-мотивів, оскільки збільшення числа ТО-мотивів веде до збільшення імунної в. стимуляції. Деякі переважні ТО-нуклеїнові кислоти містять щонайменше три ТО-мотиви. ї-

Приклади СроО нуклеїнових кислот включають, але не обмежуючись цим, перераховані в таблиці А послідовності, такі як ЗЕО ІЮ МО:1, З, 4, 14-16, 18-24, 28, 29, 33-46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-87, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227-240, 242-256, 258, 260-265, 270-273, 275, 277-281, « 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-312, 314-317, 320-327, 329, 335, 337-341, 343-352, 354, 357, 7- с 361-365, 367-369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 399, 401-404, 406-426, 429-433, 434-437, 439, 441-443,

Й 445, 447, 448, 450, 453-456, 460-464, 466-469, 472-475, 477, 478, 480, 483-485, 488, 489, 492, 493, 495-502, и? 504-505, 507-509, 511, 513-529, 532-541, 543-555, 564-566, 568-576, 578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615, 617, 619-622, 625-646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711-716, 718-732, 736, 737, 739-744, 746, ТАТ, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 7900792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, -І 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904 і 909-913.

В деяких здійсненнях винаходу імуностимулюючі нуклеїнові кислоти включають Сро-динуклеотиди, і в інших

Ш- здійсненнях імуностимулюючі нуклеїнові кислоти вільні від Сро-динуклеотидів. Сро-динуклеотиди можуть бути - метильовані або неметильовані. Нуклеїнова кислота, що містить щонайменше один неметильований 5р СЄрО-динуклеотид, є молекулою нуклеїнової кислоти, яка містить неметильовану цитозин-гуанін динуклеотидну о послідовність (тобто "Сріз3-ДНК" або ДНК, що містить неметильований 5'-цитозин, за яким слідує 3'-гуанозін,

Ге зв'язані фосфатним зв'язком), і активує імунну систему. Нуклеїнова кислота, що містить щонайменше один метильований СрО-динуклеотид, є нуклеїновою кислотою, яка містить метильовану цитозин-гуанін динуклеотидну послідовність (тобто метильований 5'-цитозин, за яким слідує 3-гуанозін, зв'язані фосфатним ов ЗВ'ЯЗКОМ).

Приклади Т-збагачених нуклеїнових кислот, які вільні від СроО нуклеїнових кислот, включають, не (Ф) обмежуючись представленими в таблиці А послідовності, такі як ЗЕО ІЮО МО: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, ка 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 і 910-913. Приклади Т-збагачених нуклеїнових бо Кислот, які включають Сро нуклеїнові кислоти, включають, але не обмежуються представленими в таблиці А такими як 5ЕО ІЮО МО:64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890 і 891.

Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти можуть бути односпіральними і двоспіральними. Звичайно двоспіральні б5 Молекули більш стабільні іп мімо, тоді як односпіральні молекули мають підвищену імунну активність. Таким чином, в деяких варіантах винаходу переважно, щоб нуклеїнова кислота була односпіральною, а в інших варіантах переважно, щоб нуклеїнова кислота була двоспіральною.

Вживаний тут термін Т-збагачена нуклеїнова кислота і ТО-нуклеїнова кислота відноситься до імуностимулюючої Т-збагаченої нуклеїнової кислоти і до імуностимулюючої ТО-нуклеїнової кислоти, відповідно,

Якщо не вказано інакше. Т-збагачені послідовності нуклеїнової кислоти винаходу є тими, які детально описані вище, також як нуклеїнові кислоти, представлені в таблиці А, які мають щонайменше один полі-Т-мотив та/або які мають склад з більше, ніж 2595 або переважно 3595 Т-нуклеотидних залишків. С-збагачені нуклеїнові кислоти винаходу є тими, які мають щонайменше одну і переважно дві полі-С області. ТОо-нуклеїнові кислоти згідно з винаходом є тими, які детально описані вище, також як специфічні нуклеїнові кислоти представлені в таблиці А, 70 які мають щонайменше один ТО-мотив.

Нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть, але необов'язково, також включати полі-б мотив. Полі-(о вміщуючі нуклеїнові кислоти також є імуностимулюючими. В різних посиланнях, |іключаючи Різеї5Ку апа Кеїси, 1993 Мої. ВіоїЇ. Керогів, 18:217-221; Кгпедег апа Негг, 1994, Апп. Кеу. Віоспет., 63:601-637; Масауа еї а). 1993, РМАБ, 90:3745-3749; Уууаї!ї еї аіІ., 1994, РМА5, 91:1356-1360; Кападо апа Нодап, 1998, Іп Арріїеа Апіізепзе

Оіїдописіеоїїде Тесппоіоду, ед. Кпед апа 5іеїп, р.335-352; апа Кітига еї аї., 1994, ) Віоспет. 116, 991-994), також описані імуностимулюючі властивості полі-С нуклеїнових кислот.

Полі-с нуклеїнові кислоти переважно представляють собою нуклеїнові кислоти, що мають наступні формули: 5ХіХССсСХзХуЗ де Хі, Хо, Хз і Хі є нуклеотиди. В переважних здійсненнях щонайменше один з Хз і Х; є 0. В інших 2о Здійсненнях обидва Хз і Х; є б. Ще в одному здійсненні, переважна формула являє собою 5'ООМООО3 або

БОоСОМОоСОМООО3, де М складає між 0 і 20 нуклеотидами. В інших здійсненнях полі-С-нуклеїнові кислоти вільні від неметильованих Со-динуклеотидів, такі, наприклад, як нуклеїнові кислоти, перераховані нижче, як

ЗБО ІО МО:5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936 і 938. В інших здійсненнях полі-сз нуклеїнові кислоти включають сч щонайменше один неметильований СО-динуклеотид, такі, наприклад, як нуклеїнові кислоти, перераховані вище, як ЗЕБЕО ІЮО МО:67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329, 434, 435, 475, 519, і) 521-524, 526, 527, 535, 554, 565, 609, 628, 660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926, 927, 932 і 937.

Терміни "нуклеїнова кислота" і "олігонуклеотид" застосовуються взаємозамінно для позначення множинних нуклеотидів (тобто молекул, що включають цукор (наприклад, рибозу або дезоксирибозу), пов'язаний з с зо фосфатною групою і замінюваною органічною основою, яка представляє собою або заміняє піримідин (наприклад, цитозин (С), тимідин (Т) або урацил ()) або заміняє пурин (наприклад, аденін (А) або гуанін (5)). о

Вживані тут терміни відносяться до олігорибонуклеотидів, також як до олігодезоксинуклеотидів. Терміни повинні «- також включати полінуклєозиди (тобто полінуклеотид мінус фосфат) і будь-яку іншу органічну основу, що містить полімер. Молекули нуклеїнових кислот можуть бути одержані з існуючих джерел нуклеїнових кислот (наприклад, ї- геномної або кКДНК), але переважні синтетичні (наприклад, одержувані шляхом синтезу нуклеїнових кислот). ї-

Терміни нуклеїнова кислота і олігонуклеотид охоплюють також нуклеїнові кислоти або олігонуклеотиди із заміщеннями або модифікаціями, такими як в основах та/(або цукру. Наприклад, вони включають нуклеїнові кислоти, що мають остов цукрів, які ковалентно приєднані до органічних груп з низькою молекулярною масою, які відрізняються від гідроксильної групи в З положенні і відрізняються від фосфатної групи в 5 положенні. « Модифіковані таким чином нуклеїнові кислоти можуть включати 2'-О-алкіловану рибозну групу. Крім того, ств) с модифіковані нуклеїнові кислоти можуть включати цукор, такі як арабіноза, замість рибози. Таким чином, нуклеїнові кислоти можуть бути гетерогенними за складом остову, включаючи у зв'язку з цим будь-яку можливу ;» комбінацію полімерних одиниць, сполучених разом у вигляді пептид-нуклеїнових кислот (які мають амінокислотний остов з нуклеотидними основами). В деяких здійсненнях нуклеїнові кислоти є гомогенними за бкладом остову. Нуклеїнові кислоти також включають а себе заміщені пурини і піримідини, такі як 0-5 -І пропін-модифіковані основи (УУадпег еї аї.,, Маїшге Віоїесппоіоду 14:840-844, 1996). Пуріни і піримідини включають, але не обмежуються цим, аденін, цитозин, гуанін, тимідин, 5-метилцитозин, 2-амінопурин,

Ш- 2-аміно-б-хлорпурин, 2,6-діамінопурин, гіпоксантин та інші існуючі і не існуючі в природі нуклеотидні основи, - заміщені і незаміщені частини ароматизму. Інші такі модифікації добре відомі фахівцям в даній області.

Для застосування в даному винаході нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть бути синтезовані де помо о із застосуванням будь-якого числа процедур, добре відомих фахівцям в даній області. Наприклад, р-

Ге ціаноетилфосфорамідитний спосіб (|(Веаисаде, 5.Ї., апа Сагийегве, М.Н., Теї. Геї. 22:1859, 1981); нуклеозид

Н-фосфонатний спосіб |Сагедуд ей аїЇ., Тег Їеї 27:4051-4054 31986; Ргоенпіег еї аї., Мисі. Асіа. Кезв. 14:5399-5407, 1986; Сагедд ей аїЇ.,, Теї ей 27:4055-4058, 1986, Сапйпеу ей а). Теї Геї. 29:2619-2622, в 1988). Дані хімічні способи можуть бути виконані за допомогою множиш автоматичних синтезаторів нуклеїнових кислот, пропонованих на ринку. Дані нуклеїнові кислоти позначаються як синтетичні нуклеїнові кислоти. В

Ф) протилежному варіанти Т-збагачені талабо ТО-динуклеотиди можуть бути одержані у великому масштабі в ка плазмідах |дивися ЗатрбгоокК, Т., еї аїЇ., "МоІесшаг Сіопіпд: І арогаїогу Мапиа!", Сода Зргіпд Нагброг Іарогафгу

Ргезз Мем МогКк, 1989) і розділені на менші фрагменти або введені цілком. Нуклеїнові кислоти можуть бути 6о одержані з існуючих послідовностей нуклеїнових кислот (наприклад, геномної або кДНК) із застосуванням відомих способів, таких як застосування ферментів рестрикції екзонуклеаз або ендонуклеаз. Нуклеїнові кислоти, одержані у такий спосіб, позначаються як виділені нуклеїнові кислоти. Виділена нуклеїнова кислота звичайно означає нуклеїнову кислоту, яка відокремлена від компонентів, з якими вона звичайно зв'язана в природі.

Наприклад, виділеною нуклеїновою кислотою може бути кислота, яка виділена з клітини, з ядра, з мітохондрію 65 або хроматину. Терміни Ру-збагачені нуклеїнові кислоти і ТО-нуклеїнові кислоти охоплюють як синтетичні, так і виділені Ру-збагачені нуклеїнові кислоти і ТОо-нуклеїнові кислоти.

Для застосування Іп мімо Ру-збагачені і То-нуклеїнові кислоти можуть необов'язково бути відносно стійкими до деградації (наприклад, стабілізованими). "Стабілізована молекула нуклеїнової кислоти" повинна означати молекулу нуклеїнової кислоти, яка відносно стійка до деградації іп мімо (наприклад, під дією екзо- і ендонуклеаз). Стабілізація може бути функцією довжини або вторинної структури. Нуклеїнові кислоти, які складають в довжину від десятків до тисяч т.п.о. є відносно стійкими до деградації іп мімо. У разі більш коротких нуклеїнових кислот вторинну структуру можна стабілізувати і збільшити їх ефективність. Наприклад, якщо 3-кінець нуклеїнової кислоти комплементарний її вищележачій області, так що він може заломитися і утворити тип стовбурної петлевої структури, то нуклеїнова кислота стає стабілізованою, і отже, проявляє 7/о велику активність.

В протилежному варіанти стабілізація нуклеїнової кислоти може бути досягнута шляхом модифікацій фосфатного остову. Переважні стабілізовані нуклеїнові кислоти теперішнього часу згідно з винаходом мають модифікований остов. Показано, що модифікація остову нуклеїнової кислоти забезпечує збільшену активність

Ру-збагачених і ТО-нуклеїнових кислот при введенні іп мімо. Дані стабілізовані структури є переважними, /5 ОСКІЛЬКИ Ру-збагачені і То молекули винаходу мають щонайменше частково модифікований остов. Ру-збагачені і

ТО конструкти, що мають фосфортіоатні зв'язки, забезпечують максимальну активність і захищають нуклеїнові кислоти від деградації під дією екзо- і ендонуклеаз. Інші модифіковані нуклеїнові кислоти включають фосфодіефір-модифіковані нуклеїнові кислоти, поєднання фосфодіефірної і фосфортіоатної нуклеїнової кислоти, метилфосфонат, метилфосфортіоат, фосфордитіоат, п-етокси і їх поєднання. Кожне з даних поєднань і 2о їх конкретні ефекти на імунні клітини обговорюються більш детально відносно Ср нуклеїнових кислот в опублікованих (патентних заявках РСТ РСТ/ОЗОБ/01570 (МО 96/02555) і РСТ/О597/19791 (МУО 98/8810), заявляючих пріоритет патентів США серійні Моз. 08/386063 і 08/960774, зареєстрованих 7 лютого 1995р. і 30 жовтня 1997р.| відповідно, повний зміст яких включений тут як посилання. Передбачається, що дані модифіковані нуклеїнові кислоти можуть проявляти велику стимулюючу активність, обумовлену збільшеною сч стійкістю до нуклеаз, збільшеним захопленням клітинами, збільшеним зв'язуванням з білками та/або зміненою о внутрішньоклітинною локалізацією.

Композиції згідно з винаходом можуть необов'язково бути химерними олігонуклеотидами. Химерні олігонуклеотиди є олігонуклеотиди, що мають формулу: 5'У4М42М2У23. М і Мо є молекулами нуклеїнової кислоти, що мають від 1 до 10 нуклеотидів. М. і Мо», кожний включає щонайменше один модифікований с зо міжнуклеотидний зв'язок. Оскільки щонайменше 2 нуклеотиди з химерних олігонуклеотидів включають модифікації остову, дані нуклеїнові кислоти є прикладом одного типу "стабілізованих імуностимулюючих о нуклеїнових кислот". «-

Відносно химерних олігонуклеотидів У і Мо розглядаються як незалежні один від одного. Це означає, що кожний з М. і Мо може або не може мати різні послідовності і відмінні один від одного зв'язки остову в тій же в. самій молекулі. Послідовності варіюють, але в деяких випадках М 4 і Мо мають полі-о-послідовність. ї-

Полі-С-послідовність означає ту, що має щонайменше З С в ряді. В інших здійсненнях полі-С-послідовність означає ту, що має щонайменше 4, 5, 6, 7 або 8 о в ряді. В інших здійсненнях У 4 і Мо можуть являти собою

ТСотТСо, ТСОТСОТ або ТСОТСОТТ (5ЕБО І МО:1145). М. і Мо можуть також мати полі-С, полі-Т або полі-А-послідовність. В деяких здійсненнях У. та/або У» мають від З до 8 нуклеотидів. «

М. ії Мо є молекулами нуклеїнових кислот, що мають від 0 до 5 нуклеотидів, і мають таку довжину, щоб М42Мо пт») с мав щонайменше б нуклеотидів в сумі. Нуклеотиди М4і12Мо мають фосфодіефірний остов і не включають нуклеїнові кислоти, що мають модифікований остов. ;» 2 є мотивом імуностимулюючої нуклеїнової кислоти, але не включає СО. Наприклад, 7 може бути нуклеїновою кислотою з Т-збагаченою послідовністю, наприклад, включаючій ТТТТ мотив або послідовність, в якій щонайменше 5095 основ послідовності є Т, або 7 може бути ТО-послідовністю. -І Центральні нуклеотиди (М42М2) формули ХУ4М22М27» мають фосфодіефірні міжнуклеотидні зв'язки, М 4 і Мо мають щонайменше один, але можуть мати більше одного або навіть можуть мати всі модифіковані - міжнуклеотидні зв'язки. В переважних здійсненнях У 4 та/або У» мають щонайменше два або від двох до п'яти - модифікованих міжнуклеотидних зв'язків, або М має два модифіковані міжнуклеотидн зв'язки і Мо має п'ять модифікованих міжнуклеотидних зв'язків або У. має п'ять модифікованих міжнуклеотидних зв'язків і Мо має два 1 модифіковані міжнуклеотидні зв'язки. Модифіковані міжнуклеотидні зв'язки в деяких здійсненнях представляють

Ге собою фосфортіоатні модифіковані зв'язки, фосфордитіосатні модифіковані зв'язки або п-етокси модифіковані зв'язки.

Модифіковані остови, такі як фосфортіоати, можуть бути синтезовані із застосуванням автоматичних способів дв З використанням або фосфорамідату, або Н-фосфонату як хімічних реагентів. Арил- і алкілфосфонати можуть бути одержані, наприклад, як описано |в патенті США Мо4469863); і алкілфосфотриефіри (в яких заряджена

Ф) киснева частина алкілована, як описано |в патенті США Мо5023243 і в європейському патенті Мо092574Ї) можуть ка бути одержані за допомогою автоматичного твердофазного синтезу із застосуванням наявних у продажу реактивів. Описані способи для створення інших модифікацій остову ДНК і заміщень (ОпІтапп, Е. апа Реутап., во Спет. Кеу. 90:544, 1990; боосаснійа, 9., Віосопідаїе Спет. 1:165, 1990).

Інші стабілізовані нуклеїнові кислоти включають аналоги ДНК, такі як алкіл- і арилфосфатні (в яких заряджений кисень фосфонату заміщений алкільною або арильною групою), фосфодіефірні |і алкілфосфотриефірні, в яких заряджена киснева частина алкілована. Нуклеїнові кислоти, які містять діол, такий як тетраетиленгліколь або гексаетиленгліколь, або на одному, або на обох кінцях, також, як показано, є по 65 суті стійкими до деградації під дією нуклеаз.

У разі, коли Ру-збагачена або ТО-нуклеїнова кислота вводиться в поєднанні з антигеном, який кодується у векторі нуклеїнової кислоти, переважно, щоб остов Ру-збагаченої або ТО-нуклеїнової кислоти являв собою химерну комбінацію фосфодіефіру і фосфортіоату (або іншу модифікацію фосфату). Можна зіткнутися з проблемою захоплення клітиною плазмідного вектора у присутності повністю фосфортіоатної нуклеїнової кислоти. Тоді, коли суб'єкту доставляються як вектор, так і нуклеїнова кислота, переважно, щоб нуклеїнова кислота мала химерний остов або мала фосфортіоатний остов, але щоб плазміда була пов'язана з носієм, який доставляє її прямо в клітину, щоб уникнути в результаті цього необхідності захоплення клітинами. Такі носії відомі в даній області техніки і включають, наприклад, ліпосоми і генні гармати.

Описані тут нуклеїнові кислоти, також як контрольні нуклеїнові кислоти, представлені нижче в таблиці А.

Я Уа

ЯМ. то Я Кор ИНеНИ о и М нн МВВ В и о ск і КАК ин нн Принт хвою ЕВ НН Шен

ННІ НЕСБТН В одеса де в ПОВ

Еластстя ом те СЕ КЕТІ т ре 2 з КЕ ян е !

ЕК на рив ВВ ОВК он НН в СБ

Кн т и и Мн й які; іл тк

В кнурів катати тя вир а вка нива ок ра п а ЯН В нн ис ши ен о я ши ок ин в нн ой

Ко а іш нн ак

ЯН. ОН в іе А НН ан

Я інв кож ня ЖИ А БНЕНН В с масненнсь ня опиту М фета няні

ЖК я МЕ СН тека а ВД КН ЕВ В о вер ЕЕ Ен о они канва ее в ІЕЕ Та

НЕННЯ К НВ іди гін вв ГНН ке вн я Я с фе вк ж В Ка птн ен и я о

ПО Я ОД аккаК ик в р ВШ св й Ар в с ЕЕ п в в о ПА КЕ АК ви Кр о ов о с аю тата МШП С сти ес ин КК я ай КЕ вх пу рвана а КД

Вр ов НАНеНУ НИ ВЯстннннеєтне Ва нен нан ою

Мет: СЕК Яра ре п В я ЕНН

НЕ вия в АК с ДО спри НН о в кс Годван!

БІ І тт ри а КК НЕ ЯК НОЯ поше ш К Еоннна к иьиш ми рив анвн - «Носій сл ЕЛЕН НВО, датеннсь псоліл зовні пис м иа тен) і - - . и? -і -і - 1

Ко) іме) 60 б5 поетові ев Я рент ни СВІ. пен ва Ен зи нн ке еф ун винне ДА ан и ан в А а в ни и КАНА

Енн Во ВН НЕ ие ЯНА КИ НН а

НЕ ЛИ стр В НЕ свв я ця

ЩЕ вв ОВК оо и в ее дя

Чеки Но НЯ нею неон я ке ння НЯ МК

ТО ее я ен ВО но енн ря А пн ВМ аа ЕН ко КВ Я УНН

ВН Не С Кк ін и КИ е

Кано оно В Ве НЯНИ 15. Етно нки З З ДВ М ння Кот Нд ліф зв. нан Ве шко Й а о Мет ак А

На ОНИ рн

Кт ни Нв НКИ хи

КЕКВ ЕВ и ВОК ак еяА ОА ААЯЬЯ МОВ ВАНН

ЕЕ НКТ ДАК ЛКНИВ й тен КК ЕН ЕН СК ТВВНК В ків БАЯНА ЖЕНЕ НМА сч си дим мова и ровно ат ев ВИН і Кейн хЛНЙ и п снення вв ям т ицнис їх ненакі я окя ви КЕ КЛЕЙ шясвих

ВЕ АВЕНЮ ве Мін ЛЕН КК НН

Янв кекс В ВН я а ія ни зт кни ен Ван й ня

Перу ЗВИК З і в щей п М НЕК СЕК вд в в я націй сч зо Кв нет ОТАК ДНК ЕК нем ннеднив сі ока пи В В ЗІНК в днк ПОКИ НЕК в о в ик ННЯ --

Поає вет ЕЕ Ен о В ВНБЕ ВЕ ННЯ кв Вк ЯК ЕНН ї-

Зв Гран й ВИ вик в не м АКАД пана ге ке КН ФК Но нан ев ня

ВЕДЕ т со о НОВ НИ В Інв, с, 40. Енн НВО ва мо сни А і Соління ши ше аа

ШК в ВЕК НВ КОНИК ЯН ці і і що -І -І шк сл 50 "з т бо б5 й ан я Мк ! кан Яке Км Ко; КЕ ооо ВИНА У вне Кк там ужйя

Шен ная Кт в В НЕ зни ие вв пеня ак но гр ве и а Яка Ве сте зл ит т я те Дод аражтк: о де НИ Дт в вен я й пон М вна Нд ПЕД ка порок кінні петанк т ТВкрекн плен а ВН нНе ЯН ТВА я А ІЕЕННе и ШШШНИ З пак прання ті АН Ес ЛНИЕ: СЛ: ВОК доні ож ВАННЯ ана ви ов СА чн ПЕК рий Ва ай пс стя ин Іотаствук не нен юну и ен я го Кк нн в нн НН

Кави: ПО боененнння веенн я живу ненншевлеилоні аж я іже ко пеня ж о ди нн КА р кн кр о ек : ВН ОН лемеша ЕЕ КЕ Я З

КМ ад в теса снення Мен Ви НЕ о ша вс ВЕН во НК конк ооо дви ен и й

І мак киутиН вини Ес Еко кое їде и же а інд. ння Зіна Він нат не жяе як б зво ет с по НН ши сю й о ПОВ В нн іжаенньяний нео о

Ані ізррен нь Канал, ННЯ НЕ У вик зва с ен Н шк: М, вит зриви дала: вв вв и

ОТО пе М ку ен с шовнякях Модияет тра ТЕ: інж Кві он ве ек ша де ке шен спо ан я я ч с роіНн пл ситі не -й нн тт неси КАТ нюх хе Ку йно ново тя

Не Ва ел тет они іній; «и ко 0 вера ми щ 45 НН и ви в піно нар ин -І -й с 50

Ко) іме) 60 б5

НЕ НА од сь не НКВІЕННННЮВЯ

Деко В АСИНИ Кон они НК АКН ки нн к а

ВЕН ери пря ні-ні одне нн наші ВА ня

ВІ дова вв маки Ор тт вико. ее ЯК р МЕ ПО А НВ і ша вав екв СЕН

НА Е НН а ан Ес Во йййкя В щи іс Ь те ложе свят ве не Пса к вк ВВ Ето ТЕ Оп двраня я ЯМИ то 000 неннянянненннн ко тай вт а ов Вр на иКЯНк: шк РН ся

Р те ВВ тег ой Ен іінііній кот ак И щі

НЕК в ки а НЕНН «я кпеню ЕК а В СНЕАЖНр нь в ННВ

Ен а ше ур На у вон сте ЗЕНя СЕТ тс Я тнна Ж.

Не кА А ва нин Ве ШЕ план ще ЗОНА яра, в пев Анти : ї5 ел нення кож лан В у ЗВ Пе тЕ ЩО совки пе Зі Он г рака: вне іже Ва пев давня ПИ ТОНОН она Кк о А пен ик ПЕН В рве пил хе ан КК ЕЕ де ДЕК КК кв не Те зни

СІ аа в сення вн и ше ЕЕ ке заибл трі ні с Ен дшяте ен се сне сх очне т

Я ря в с; ШИК вил плед ес нн Бен чед; рив знртат СБ піти леттвпівнвснх з яна, с КІ пи в ве рокла і кіт

Гек яко воно кан яеннкяй Ко ай зй шен фер осв Зіна нка Пес ЕЕ се; с о ще ка: и но вант нс»

БЕК св ВЕТО ук сВВЯ МВВНЕЯ сок та війн ве ЗЕ іні жену ЗЕ ЕЕНЕДКМ НИ А сода Мак віки нн ЯН: Нв с ША пе В ен вас нини он

Би КК ТА ск! пюрена ів о яд ВИ дк: в ВН зо Зако сені у Ка іт Вол ее тя ет із ва ТЕ котре нинние ша скат ання ЗКУ В. ОК КЕН іль сесія нет и Кн: пою нс в ня сет ин памяти; сч вро т п рий сеть сш зх Во йон я пер н ІОАН он : г і: ; мах Ксеня овен сниЕ МЕН ТИВ ЕВ ні інн А наш ЕЕ ситет те жкіння вен зн ож й нн туя жк Ак пацаавнаать р в й

ДИ ИХ с п Еженннннсї ее іЕ-яне є з нен Я пен вет гя (І днйннни з роя ем ЕН МІ вв ер Ре ї ті х

Це І орі сов Ер ід нс йти пня сне іЖН р-непидвенеттотнтент ян я Ж вжи стос со с еНВЙ. т ЗНМ Зкьсіьвінв с! в дю ЩЕ кн ве ие я рин жи: нен: т Вени; оиктимнинвни шина ще а НЕ: Ятится зстнтель пе чо Н назва НЕ ння « с реа Ву А НА но паж ня м я жі ки Пенн явне тися 7

Боже Ве пи І й ЕНН ЕЕ КД кя з» фен НЕ юн ня у шо в

МИ ЕІ ЕН, й ; Ж я с -| ЕЕ ЯКЕ ННЯ тих ЕВ пише - -й с?

Ко) іме) бо б5

КВЕД ЕН ст КЕ НВ В ооо КК; МІВ КК

Дні Акорди в и і

Й. житт КВ нкентев тат т ук тат вен ра НН нн Дн тен ВВЕ Пт оаДЕ СЕК Ве ТО В ВВ ВН ініеву СЯНЯЙН

НН НН тн сти НЕ ВЕВКННВЮ ДО ВЯЕ ВВ, «НЕНИН МЕН в ро АНАМНЕЗ Ве НК СЕ зо Ясен а екон н вен ванн ен вись КЕ Ноти нан нн ан ринв і АЙ лись

НЕ ВЕ в нс КЕ рен

Ер м ла ія ЕН ВН В

ОВ кни а хх ОМОИННОИЙ Ва у хи з фа ВОК В ан и ак в ан

ТЕБЕ тив МЕТ гос аНе ВАН ВН вк е Ж М

Би ван ше МНК КК я пд Р ек лини в де ли т вл деле су втирати го ЕЕ жйан ж НОЯ тутюр я КК а се ері окин В МЯ

КК ОАЕ прое: Енн в вн и СВ ен Ав вн о й и г НЕЕЕ ДЕК АК НН нн сх АЕН ИН фін ВИ Вена не Я Не яна нн вв Но нан п КИЕВЕ Мас й с

МНН Он я МК ВН ВК І Ах інв ю вн ВО НН он арнАСЕВ км в Н іс

ДК АНА ВК І о екс вано КОНЯ --

Кік ПЕ О ак м екв «ВИН їм

КОН ЯК ння пеоононнінанттютеюєн тнетні Диня

ЧЕ и вед а ке ев й фен ин В ни в аа я ї-

ПК Ве нн СВ ІН яна ві

ОК в и Ал ВИН в в ня ВЕДЕ ЯНВ ша АНА інжир манто дрктвкин Дня тин «

Тв ни А В Я вн вну ніш кар оня н жи р нкеннв очні но) з» ЕІ Ву ев ти мне КН МЕ ЕЕ " Вони а НВ КВК СН штю пове як ківек о она оняня ти пак ав і НЕ ВЕК еВ ВН: УННАКИ

Що - - шк с їв» т 60 б5 ко рев а КЕ НИЙ ків ВЕК о НК Нести ШЕ айв наши. о не АК в ня па ана оееннюья Боетинх те фан ау дрон ен ЕнеНежк

Ки КЕН ВА Дів ль ткання А яр нак

Ен ВЕ ве в Енн ЕВ сне в СЕН ад ее ер жк нн тю ек рн ПЕ хни НВ па В БІК А В н инакн нн іднн стан ша и п в й дл ан

Мав, есть Ди тттйк УКИ П Нен Б ие, -. ен КД: М оДКЕВли ПД шов тан ВЕРН; ЧВЙНЕЕ ПЕЧЕ, оон пн ДН Он де ри пе ННЯ

М в АКА Кн ЕЕ терен вда кл ЗВ: Же йо ре тику З нки внй

Дасткрнх аро е нн тв Ні сь нин ше сь при КВ На мини ат нарад ней знайте НЕК

Де и Ин ря ера ща ОН З Я

В сі ИЙ с с С пон в БЕ тех

Ніл ий НВО не дю я ЕЕ риснння ме я КР БК УП

Поки Ан Ж в вела и й ; а уд ор я ень ВИК ТЕ, МИНА

КЕ кжнн З ит ДЕ Коні ання ОВ пак вже ВИ век п зі ЗИ В

Винілвк ла в оса а р и АННИ ее ВД Ек інт ня сао А ЕК д-ви ВИ АВ ЕЯА ий ак Ин ЗНМ Й фе ЗП КН ПОН нпиуеноттннн -зИйдс ий що са с вн в ще й

ПИВ бані век М Ве. ми дупі зі: ЗЕ: о

Кри А о ння нн ери я ї ЕНН на: сен века и НИ ля я де ут Корі ин крій й в'я Мн ве ЕННВ ЕНН МЕ:

І дека о п ЯНВ ОД КЕ дн Кк сни соді р НН КАК р вререн лит керпу кв НН ЕН вання з а АНЯ СКК АЦОВЕ МО У о ар в я Я с по тина вн ее Кз е ЕЕ ес п ЕЕККН МЕ еКе ес нин ок и ри ск ЩЕ ди

Ек в рр я ВА НЯ Я с ке шк К ї-

З ПЕН на а ни нн о пн не дв вна гінажйшЕ и в в КІ Нд реж те ЕЕ ЕЙ п иа ХВ ВЕР ЕН с, й не те ВДЕ ЕЕ и ет кове ТЕЕНЕя БЕК ко

Кир ше ннисж т ик, « ло іні ня пенні ГЕН нка і Как На он и ши ак не » я кій о НЕ ВЕ спдпекужень екю ке ниівни мине нн нн жити "и Де В НК АС Адх ВВ КК кі іі Ки афер рію стрій а ня они рин В РТ ннн - -й ст

І» ко во 65 ки й В ее в НОМ ВОВК и А нео НЕО пи тт с птн ий ; ва ИН са жен та тних Аня в сті КА о ЖАН ні фс кв нт ВИН НКИ то ок а ов В Ви Ми. фен ІН ЕЕ пс ПІВНІ КУН и НЕ ВЕУ В ВН НИХ ЕЕ, рн м МН Вей Ен а А Вико п ть ви в МВВ Ви ет

М и КН ин і скін сн п А в п ав ок:

Баш Вр у и Я рив ит кр АК тд тт уп тут тт ув ти НИ яті

ЕЕ я Ме НА АНА Но КД ен КИ и шо ин фрк нан сни ян винне ян нотні ов ЕН ВАК ж од В ЗИ

І нан т ві ендо ен и Ам

Піни в а В нин вени Як кн ши о) пн нини А ср НІК АЕН

НЕ, НК с пон КАНА МЕН С НИЕ зв ВЗА ВИНИ в Ен ванн к 2і-оа пе кори п; КО Я Бе КТ я

Же р ЕК ви сао ки а рінкі

Ши ака и я ее вн

Есе ка у на ня і Кир жі ВИНА НЕ ЕВ Кай ві ен о Я Анни ін ники п кни дн нн « 00 Маки кН ВИНИ вис в о не и нн -о

Хан ДЕННЯ ня вени ни они но нки "» ПЕ АНВ и ВН А в и ов вв НИМИ я сне Етно викине жан ниви ин мана о Во А КК КИ КЕ в ад 18 бо : - - шк го г) 5) бо б5 зго А ВИСКА А В, о щ : Слке

Че ЛАНИ срок в КЕ п шани на Я ві ші Еш нн вд СЕ районне ето ИН ой дн

Ен квест мн ервнкс ЯЛЬЕН Коен НЕВЖЕ Я о пох маяк й кн ння Тетеря їх нина бони се мес ВН. кни ТЕ ги у они «В саіко Я гелю вк Кр аванс пива ДЕННЯ А, Ме поси Ж в 5 ї

Е вовк аву ЕТО Зх зей твляв КАОЯ я іде ак я нив Кеаав В БЕК В но с ддЕсТ евро ПЕК ЕЕ УКН Е дент» свя вн рон Ер

З о БЕН НН пре лен ре ж ї рек іль пня с

Таке БИ 50 рай учнвйенаносх, пн

Зв и НН екй п я інн ой ні нет, тв Ви ро Кн :. диниищНН ниж: В св КН о нкнввннни ву но в ре кв в НН зи нд рент в пара о и тм сов в КН ДЕ штанах сісти отн ї

Ватт п ан

Ті у й Я СОВЕЕЕ ЕН СЕЯОКвя Н АН неерні ВЗ ЗНОВ : я я ще а п нн в НА тн кткт тв Вс с н- її нта вад НЕ; НИМ ННЯ ска шани жири чес ВЕН КЕ днини ва Ку Ет Кв ЯН іх осн нак ве кання ана доли Й век 7 о с нон ЕЕ Ех Я ЕП ножни в сан вино я як о фени Й беж ютюютякт пня ник нан я

Кос А ае Мкшн ех пе ин Ен вон

ПА и рн ев ВН ВЕЧЕАК ен ШЕ З Ми й не ЕЕ ЕН ек ун ета юлненя міне ее ВЕ, я ня зві знан ен А кран ес Аоняя Ей зельненки а пен ен йоіска З Пани свя річ едНя сесій ян Ге . пеня 5 ЕД тт в дня і. ін

З ик свт й

У еви ння Ех Я пастка НОСИН ен пкт НЕ Я и ннНн іонінінісньк Іжа

В дак ВИКЛ ВИК ОК т вно ЕЕ я ккд й з5 Цей? мет оо в й

КІ Енн ес Мо т отв НД с шк я ій че вве Ко ВВІВ Ят се ку теку кннет не Кт ВН ї

Я вймнх пен то ех МНК ВЕННИКИ Кн

БІ дик ПК о КВК й пи нев КК ЕН КАН ниревенні Пл ке:

Не КІ яри на КН ВЕ ом пінні наяв кт В кис саіей ю пеня голки пити, их

Я ве ее о гля ие 7 ; ва тшНвшн еВ вереск КЕ сення В й пл ПИ я о яння щ Де ЗВ КЕ Он на і В есте у вний -І -й с о

Ко) іме) бо б5

Пе енер вне ен й фимнаи БО вени НИ ПО ін він й ас пф й КЕ ення СЕННЯ Я КЯ і ивакнітитня с дж ицева ть якА те Кен ана нн НН В АН он ке; вн о ЗНА З ИН НИ юю Кн нн ми а Мо ил на о ее и В КВ КИ т анонімне ьи Важ пеки ей - ним ит а нн т5 а ІНН: о ав ор нн М НИ Ис Коси: Веі Ж фе ее зр ЕН НД яю ни о ак ки Й кН КН о я в Даня в о ун кни с пр Ай вки Ве с она ни о продано і Ки Ин В і п де она ен ян Ен НЯ зо БЕ ОЕМ іще НЕК мання ме Ка нен ее енд ДНК ати ж ння зро снаит АННИ а и ря о ЕМ ЕН Вот: ик які -

Ве вен аа

ЦЕН НВ Ина тн и Ен Ен в т

Ї сні пай Оу ван нд и ака М жи НН Ак шен т Вр вн 18 неотеавіт ванн : - - шк 1 що) ко бо б5

Еш нини

Ка ВИННУ и ЛАН и нт: ВВ Ь ВН и ВЛЕННЯ Є в ТНК ки в зи КН и ант ра ик КВ Іо о ОС АН

Кене ПНО Я шкяо т т о кл С АН астенія З с В ау

Я на и НАНУ ні он сив ши а ть най

МЕ Ше Я ОККО НИК дно ноя он ню нн нвви сь НВ св А ва нею ав а нн. нта

Ер а с ВК и на я сн зн Мія Аа

ЕНН З тт ВМ в ви НН ЕН ВЖЕ, ов ПВ: ВАНН НАВ ен нн

Я нак. КИ ЛА ри о кре ши ж

ОНА Аа МН пики Ван ня Я нен о - КЕ спін и квт Ки й і ие кра нива ер НЕ я Ат жа СКАН а онов ю

ДТ тх Ой дн нин не ск деЯ о тики т Ка в Код нік текс ЕЙ фе На не ЯРА Вин ї- рас КОНИК ви ки ВК кон ек Нева ср и А УА ни кВ ВЖК ад

Не ЕТ В и мин дня с ин ми в нен пп ре в ВВЕ Дн КЕ у зго порно квх ке ЕНИК ек да нин, В ит ен інт кн и ек дяк пенівиевЕнйкх

МА А АН ВН Ве сін нафті енві ін 0 ЕВ НУДНА кю а ве Янв о, і- Ес СЯ ПАВУКА ИН етан вер и ВИС Шквійу тт " йо дини се в вив о ВК вв ОІЩИ ДНЯ - п ва С Во ко а і ік НИ В с сі Кер фаст " нн ни, КН НАрЕНЯ імп дн ш Миу вК ин ТІ и кспие т онке Ее РК уд А он ее о в нан - - шк го о) о) бо б5

ОВО БЕ сен ен

Дешнк ляв ; по оте че і санавнеаА пики не нов не кеетінеен 51 я їн іо п - ПЕК бен ек дарірнет г бе ЕВ: ШІ тет ния Ето істо сані ен онани Ин: ЕКНТОя чу я

Етно це пе поп зв нн

ОН Го ря МР ЕТКа К-Яя днк Я пеня ин ж іст сх і ЛЕ них Ве ока тт

Панен пен кенння в: и с, оеінеке ех сн сен ЗЕ уз Жва ся; Ктитіні ман ав ся іо сет 0 о енввсен ен 7 их : с. в. зх СЕК зЕЕнн НЕ лн в ПЕК лише ВЕ п н- кн як. о

Я фія Бл дат ее не ІЕЕ ня пити | п. о фея ; КЛЕНИ: Бен Ей, ря Я золи повна не о 15 ОО НЕ Бо гнкня о ення кт ти те - : ти з : і ен я Кон вій ЗЯТЬ Тече в в бод я я ех коре дея ТЕН «нд ся СВІ ї ан ев о - нання н с - ; | о каша пня Кене У В СТИ есе ко; пк т яння ув 7 совно Б 2го В Бр кеш ве о ян. я наді» ІК нас Ат пос нк тей сн

ЕНН ни ся Не ня з ка о и БИх ря пен кажи ве реа, пос Нову житя вена п. : ре ВВ с ВННЕ о ння і фр сне вонаннкии

Пк не Баня се нс с ян - тс ж обі ож г ле пек тися тай КА УЕНЕЯНВ нія Бе ес смс

Д тЕН. зрання тотинвм ТЕ ув -: Зорий омйсалій інййовс шк ие о аніс ди І же миші ВК шоу в я 7 Е реє 7 я и и ен тЯкнв ке сакон 5 Гей в Все есе пи хни Ек інж ще нення имеет ;

Й ! чо з І ін ; ся Я хг т. ЧЕ, Ше МД о прісний АФ шу не НК Я

В ра це ТАКЕ я ШКТ я - и "

Я скит Ше га оон сеттуєтте ва й ;

Е ше Еш ЛІТ не і к- Шк ння р-н Най фея подо сни; порок хоне г5 ві ке о» я З те ї зв сени Ох Попр текіли я й Ди йеикія по сч - Ек я ие ня пес Дт То -ш Кри лненх би пий нні он нни се З сення ЕК ме : а ві 8 ТР Су нин інннюй ня Я, КЕЕЖ ІС в)

РЕ МИ, не КЕН прненеки : с її ре. сок Кр шк ПЕ 7 дя од жлатня в п

В в Енн МЕ КА МЕ тн Ен ве що с : те МДЕ я йти пев у ся й ? с, ся о фена ВЕ тиви ЧЕ ВХ Пен ЯН дея снів ЕК я пов Кт т ДЯНЕт нь я 40 дани Елот дак Шик ВТ я т птшння оре око до а сонне сів ня їх . ; їв а ня - ДВО о каеютия еко Енн с ще Ва пня Сен-єв кет с: ся їх патока рраленн зи, м ВА орі тин при пла у в - нення

І . - км де акне вм й «

Ще ння нта тат ПАПИ ех сов ї Ксеня кс не Не ши, ситі а, Дік Кв дир ос Я бен

ЕЕ тай і асттннН пдніння ен кн

Мі сова спини ОДНО ся, ДН : линии

Фо

Ко) іме) 60 бо

Я плит диво рик, сем еднтн тд Ат зар ся Яви т сл ІН с А АД

Бо ин мн аневоен дв викини м нн я ВЕ КС яр о ВУСТ ем Іс Ва МОЯ ит

Иван О В ДВОМ: Й: ЗЕЯВ

ИЙ Кн на НК і нку нанесена в НИ

ЕВ ТЕ се НН СЕ КА ВИН ее АН НАДА НК, 70 НВ Кв а КН Кн о а НК:

Кт а-тт сшаикнК Ів тити Ел ти Я ляє пові ват тр вит нд пра ун Я ПЕК р рис пін НН і сс пи А анноннненя вини р хр ся р Ов вх о ср: па о ДК и о фі В ЕТ о т ие ВІ дві п ков ь В Ні Ж а на в ши нин нина и и В -Я дек в і ян о ніс нак в ро

Енн неви в ери р

НК де ЕК А рони нен а нан див ЕВ ВН прожи мне в нка нн

Інн Аж ЕН нні Ин Мане як фр ТЕКИ ню Мун в Мн ен КЗ КИЙ и с в у ВВ АК Я

Кер лвв с МАНКИ НД с я В нку НА сеЖЯ

ДВС СЕК ВИНЕН а о юри в о КК НКИ НН и жень о

ЯНА НИК а арки й ни

ЩЕ коня ПИЕІАН ЗНЕНЯА веінн ія Звсісіоня тт ит

ИНА: НЕ осв НН НН МЕ СВБ - не, АЕН усві рн НЕ ВИН Ен сені кві

КОШІ Пи нні на ни а и нон НИ ЯЕНЯ осв нн Я есть писок ну ій ків ані НЕ іст ї- ву он ВШ и и и Всі « с Пльнв и: ВАК наш ня «нова ЖЖ НН м Яся й ВА оо КЕ ЕОМ "» з СЕС ЗК я КЕН ее і в а Ера зв ав НК НН но Ним ни Ана Нен -І -І шк

Б с 70 "з т бо б5 на Еш т ненні ен нан в

Бема ве иа

Пр нвнаив о и неук тнненх Пкетан інн на ни ни т ння кре аениавю Еш я як НН во КВ ; садійшєсст ЩИ шик ст ний Срепивввня ще ення тин ОА кт ее тт если я висі ан нини то НА он ні ру ення

БМК КМ піхв кв НН й іі АВ ЛИН:

СІК а шани ан а

Ва под Петя ня осла ЕН НЕ не в яв

Клте пд ЕЕ Кт Дт кліертея-ві ся ЕЕ во рн Но я: З ре кни Е жАжчИК ВНД ЕЕЕ ня ноші шкі кві Й ЕК, ікс Іл яр вн Я ки дерну коми ай нньій ще

Орос ль ная щу ше рек р НА НН мий іван в соня я Я ик м тан в о ОНА КН ня Ел Ро а А: ний 2о ПИШЕ НН нен тн я й й и и ення зо Ку ИН р аси фВииня Хв ени ж Па с

Ей ев ря яНИ ОК еко НИ нн а Кт ЯА ик ли НН пишна вн ння ше нд ен пише м зв З одну Я «БЕН ЖЕ Кано сере ак сан ан песен

М ЗНАВ Е сто Ве и о ее

Где пари у У ре ВК Ел нти й ен МсТНЕ най асани ція

Ен В сок вне і вія Ме я дв а ЕК

ІААЕІШ діл ан дян ВАН НН « с Бек іяеян і кі нення чині ян з ри стдтт Петя Сови Мн те сут У ней акнт

Ба ся НК кис ІДС а еру ни НЕ и кА рн шн ПЗАн не Нею щ : -І шк сл 50 то

Ф) о бо б5

ТНК Вс ОВК НВ Бен ПН ЕЕ у ке венднтнк мини дк НЕ конт КАВИ й 9 НЕ Ва ев я АС

Тека нн ей нн сн Мн лекси ШК в ке тен о рев и і я ЕНИОВЕ ОННИЙ:

НН т в Ко ЕН Не ТА МН не нт СН ня он В во о о ТК Вк вв в пи А Вя у я ник нн В

ШЕ ІНН КЕН от оо я ЕН п вн ОН

Пеня ОМ о ай ши ер ОВ зр крик свя я втіх ал КТ деривати ПЕ слот см тона ва зах посоліть а зр

ЕНН ВАЛ ли Колектор Рей 20 Нр НВК кс о и в о де й ДАМ и и нн ВЕ екв се, ВОК Вт и НН сн он

Нивки ВОД Ви Кн й З Й;

Яви Кв в п В сч ин и ев с В кутки ни пн

Іов они на нн ис ен Ян

Ж нене ДУМ я уникне ве а ен 30 Туди но ня кри яки Див аа АНЯ ою

ІНШ нн Рв ЕН НА дк ЗАМННЙ

Не ж ти ва ВЕН Аа

Ін Ве нн в ви ЕН Квас ни. ЖЕ

Же інн ОН вк село те ананіщі ле но) с в. СВ і ИН се дьдт ан квт Кен . п: ИН и рен ни Ко

Еш, ши се А ев АФ ув Вени кн ВКМ хек нон -І -І шк го о) о) бо б5

Ар ВИН ПЕ Ес пн т НДМИЯЯ яри Я ав НАННЯ Кктея НЕ ЖА а Он Ежен ривки Я виь Мая (нести ервК сет рані І

Я дадо и ККУ Ба тин шн т у мн р КЕ анкет с Шев з Зенон У и ПОМ на ян ОТ нні; їх оо ВК кеВ ска Кк рн ниж Ве петеортй шій ши ви сс нн нн ВЕНИ НЕ

Борнео жену ПЕ НО сі виють стос втернвсвсн с: ВЕ ее нь СИ пн я т зо ки ЕНКНиХ ТЕЗ вркт нв й ості нка ері іх ері ПЕ

Мн НИК А о т Кв пн око а он нка пон мем иа ШЕ о й в ей сина н ни я ол з фен ж я ан ше сома ен ин кни айв ецевн вер ве В ВЕНА ЕВ ЖК Я ВВЕ ЖЕ

А ник и Вк НЯ ВЕ р НЯ » ВД ви ЗВ В СВО В сек КН и ні ов М як ана ех сах Я Ен нні ни Мун я вив и ВХ ж кос тки В НК Вр т АК Кс ТВ вівіше се вве писане є В вач й ВЕ ай сч

Есе се кор ЯЧНУ Іль вро о ву и снів ДК Піни й и екон песо МСЕК деякі тні; о

Я Ь ча Ла ні З НЕ НЯ Гой пк витолнї те СА ТлТЕнЯ ки що ше КО онов ни он мине іні сен рн ев, ге

ВЕ с в КИМН тя ПИ ку и Ку шия ин рота пря поря тк ян, пак учи. пн МЕ неон ние НА ВВ р ня ще о А в ння оо ме еткрая ванни -- свв ей; зро в ниви ви ЖМЕНЮ

Дейс шк ОН иа р КИМ ИЙ оси титани

Врпова в я ЕК ВД ня сн Из вв Кс Я ів - с оо? снййн Ве А евскниананняя Коко зст женні З ЕЕ ЕР ані ї- ях ЕЕ те с ШЕ Пік как й ВЕ Ек нн Ен Ен т пат дет ли со пінки Ас ннне нев ВЕ

Над ст и КА «ЗЕД ВАВ НВ н рВєс: ЗтАШННА Й її: вени ЕН вен вена СОВОК он: ШОК то ЕВ оо в вв ч с ше м ення я не з» о КТ о Нв Ж НИ МЕНА ЖК, й поті а пенею я зх Вейн НИВИ к ан кн нки Ля - -й с? "о о; 60 б5 пре кий ВУ в в КК пеня нн нн и т ес енинкве ння, курс нак

НЕ орі пер р КИ Насос пон Енн: ситету нар ек рняй АК КН З Кф мнвАНК и я ин й

ОБЕНМН СВЙ ето ТЕНТ Ба НЕ ій Ки ск я с. ко т с г. т прості как ані палить 1 ся 70 яву МЕНА онко КВОТ ов щи ВЕК нт сені яма я Пи снення и я

Паслін пгт вини пн ОМ Яни ен ПОМ ЕІ о, я сік й ТЯ іди ка вал ян ет дн ет я пянвня в ЛВ й жи Яке вв ВХ

Я пенні ни винне тк о

Пот не пис ЗИ півнів й ЖЕ я сови, жирне нак пметинн ше го Бей ІК АД нір ові вен ІЕЕ стека і яй Ес ВВ вве ян че ВАК а орав в в нки ох пні ее ет ев КЕ і: кое ства нан дв ней сх но паю ос ах дан со ВА швів пі велнвн НоВ ск як

Жак ни ши со вен пнежннкв не з ЕНЕЙ ст. свт о Б и дек нин й паст дня яке нн кі

ТЯ «КК ДАНЕ я хмо Мао нн в рт а Ве ння

Ехо а НАСК В нінн можн кое Енн шар Кай пе в мор аневня ня й роки я Пай сан ЕМ пак Ен тварі ія нс Вій НВ ге мрія ван ІС в) нати р в в и ре ин не оо ЕК зб КЕ НЕМЕаУЕ дя п пять ЕЛЕ й со і о нен ная рот, п но ни НН БИ БИ нирінна в он тот в НАЖЕН ТО Коівнтйск вв рн їх

ВЕНИ ІЧНЯ пе их пкт ні ніде СОЯ ен зво ж блін сс ібн сна Аля гарервия

Ель ИН Кк: АНЯ пк Ер КИ пт тес віт сяг тн, 4? МОН шо ни ев і ЕНН я -І шк с 50

Ко) іме) бо б5

ЩЕ НЯ нь КВК ВЕЕН на нис на ДЕ фон вра нан нянь ре во В р-ни

НАЙ соло ВВ до ай осли сй ий Де МК

ЕЕ тив НН НИ НА З ВН

Шо жи о Невже с ВОДИ й пд пк дніл нн ЗІ и нн в я ач тадонне кн тн о. и о А АД ри кін екшн

М ЕН в он ВН У ав ЕНина ЕН й В 75 Мини в шин на

ПЕ в ЕН НИ ин ні они в вн в

НЕ ах и а о ни ус Ця чвар в СВНДЯЄЬ шин ДАМО і шви ки

ЗА а Новик лад вк вся В дя ден ДВК Ж С о р НН ен В НН кни Пн, ЯН с вен НН С р тин нн Ен о т с о НКИ ен і ША няних ЯН нен нет др Нв вен сч «кання Во раснни А юне рн кнісньнни не внні Бкаютьк нак З анна нн рек Ки ИН о как сни ю оо НЕ у НИВИ сш винні и ки Ве и КИ АК КИ в и шк по ШИ Ж п В а аа т о ве ВАН їч-

ЕН ОЖИНИ пня МДЕ в ВН я п о ДЕ В с СИ З

Мишеня нас вм «

ОНИ халва КЕ НЕ зо КЕ ВВ ЕН и нн НН 2

МЕ ЕЖИинан НН К я с СН ВИ вв З ЕІ ЛИН ЖЖ ЗИ с т нн я ср рн я дор АшВ и Ве о ан - - шк го о) о) бо б5

Е Лк. т ЕК ен ин Я

К-т деку Б дення пе їх ії Ей ШЕ нн ВВ : -кі ств ен 0 дна: й пк шо ши ння поши й век ет.

Канн «се о пря ти са

Коннов вна с оНВ а ЕДенння срамкх ве Е осінні: в ся щу Ен її ЗК ожісврнен-ореетея ; я я ря рр жка СИ нн Мік в сжкієис тил урн ММК

Квінт ДЕНЕХ ВОКЕИ Інни Пе дес нене ат: і як Же і сн я 5 о Ен он НК НН кожевохи х гядря ект ТЕННКХ ВД пок оре ВАН Ве ефе Є. не ще ЕЕ, Ж яння Не Сен

Ж тин пів и пенннетвння се : вно т оДВЕНЯ ШТ ЕК тв Ех іх сан т дол я ЕВ ней ран дея ЕЕ ож Каа КИ й я тик я. пу вн я тет ВА а як якій Я яке я ! док не Аае Кі М Кал ен. ІК: КИ й уккарсчя сни ой Я в кет ві т

ЕЕ Би Зішнв. ставі янв ай го жн-я пен ння З ж Її,

Гек г МЕЛЕ ето, Санті тат дя, Заря ее нія ікс ТЕТ Заетету вкнще тей ее ол з знан шення ан ку ДЕН ВВ я р шо ше о як сан я ва - ня нок - -- : се ен, НЕ нання пн Я и нан на ня т пит жиЬ НКИЕН кн рос ськ состст, ак аламя ::ИД: я ня інтен тн Е се у екс ї ї- ні У ке я дей Пил М за що дес: НЕ ка я ТЕН домен сл ее їде ше х чу з ВИ я Ж ді ет дя а: с панк они ері з --к

Я ее сх ЗИ Кя нн рення кн та ГКЕсяв ЕКОН НК т янв ния НН Акея БосонКссниєя 30 ши ЗВИВЕСТІ ев ок вніиши іа с. Зно ан о -ж в ші В нен ст дини А о зх дк іван ве пе сн у УКВ ВИН не їн

ТЕве хгеТвНВ п. п кет ноя БЕ Я з ужея по ен вчн о ово свя КЕ; с фрослтсся й риніт под. З М колі іон 35 Бена ДЕННІ Конетнеи Н п в - ж поем Бетсі -

ШЕ і вих км ПЕК т ор нн, Ен нор

ЕН Ер НВрва ДК Ат Денна тк одини он ка днннді ве як; й

Урни Не их СИ вдво ем сни вки техн ван Може Енн ЕЕ ВНак шле тн

Є ек й енся о лятнн ня ра стен пора ч- 40 ОО 0000000онненниннняк нон інтен ; Моя кивок втш он а пити ния Я и? З же пе стю бр 5

Я т кита: Пат Ен Оки М, ОД ок ун лни свя ання ЖЖ з К ї пив яна КЕ ян - зва Ел -й

Фо до) іме) 60 бо п еВ о рий ше АН Я пен ер ан Пекар щи Ван АНЯ янв киш Мені ЗЕ

ВЖИ ск З ВІІНИИНИИЩИЕ ННЯ оо Уже ю Кеплер В те вк син їх

З нн іі ЕК тя лтащ слижя Карі нм адгти схсдв нетитня, са ВАК сет КК, Міукпле Ен лнтКнь рр снів ся ню, ен, си зе ут5 ЧЕ ОНА ДНО НИ ди и шин фен Ен вот ват вен

СНИ КН Ме нен и и в вн

Енн на в ВЕ сви но нн я МНН ВАНЯ

Іоан вне я

Філе АН НК М ртететтте пустот тези

ПОВИ рел и и НК см в вени ОНИ сн ІН ромен де б нен

Ева ВЕ Ня Я НИКИ ан Ан НД ре НК но ИН в ша Вр сч пе АСВ п в сш ВЕН АНЯ де тм о м фран дрон нен ші о нн ад й ОВЕН еВ р ов вух в ПУЕ КУКИ ч» фо не КОН сти тет Те " ВВ сова ве МСГ Бест ЖАВ вв я ВОНО ее Я ЕС ЩО, ян ПОН ЕВ ні ств повне сна не

Екон в и а а дв ше - - шк 1

Ко) іме) бо б5 у Винна ний осені со ЛІВЕ КОМИ Ой іній: З: ЗМ

Шо и М нео ад п ПОВЕ ПЕ пев АК КО А наш а ЕЕ

Ве нн ВК Ки Кая Мат В:

Ци на тн ор ж их в тю при ЛА КВ на оф яка ЗИ НС сть дно вили ви шо сто ті юр С с в нт ин КАН ВАНН уні кутею ---теелнеуння ню ення

В і МВВ З АННА я стос юсротодо з вить С ик сни

М Ясон кис м ВН йВЕ ин Звірі ВИЙ; "ВВ ху ВАК НД Ко

Дн с ПЕН АНКНИНА ДИ пе и іеднеюм но

Мо в НН М ян ЛАНИ є М шен п Ан р о и св

Чтали АЛЕ ЗИ ВОК КН НАВ зорю у дан ак Цен рн жи ННЯ КН ше сни олень Ан кА сі

Вена ВШ ка ни ен Я ов А в Тл ВО сне ІННИ еко ІЩЕ і)

Я пі В т сан и и ка Пд ПЕ ЦІ ад ніна Щ а а іі ПЕР Яни 1 Версія ШИН ік птн ве МНН Ки ря де в о

Б сн нови НИ КЕ Я нанні потр рин коре чи см зо те ОН ЗДА в ВИ

Ниви са ян НН сво пав в а ід що зіва Я ВН ен нвнн віта нас нен -

Яни ВН ях зір З НН но ВИНИ НЕОНОВІ о Кт тив и в В НЕ а АКТА Кт и ре я! фени акне НИ ПВ зо Едакті ННЯ олюл шо нки Ат 3 с пре во ВОМ ато р ИЙ ч» Повинна кино рве кн ни ІН енаніяння " ЕЕ ОАЕ дні с тя школо зв ВДВ Дві ст лнаввимищес ТТН й

Но ВОНИ сш в Ер кшш -і -і шк с о) о) бо 65 а ЕЛ Я зр дик (ее ол я я Ак в щно сок и ; о що із кн состевнне кр веж окя дае ряжанка

Кт Ел овен ІВАтиКЕ Слиз й сесій зер ану

Яке се й ЇВ ки ле сюуиет ен пе аа ет З нк НЕ оди ние солені авт сію Дорі ве вк Е НК кт севаваечх Зіжнект сля

МК се й п нен похнинн воно сет в ВН -Й й ен сова пік яке засо ай ох я т вки кін з 2 же висі ЖАКА дня ча ке СА же ой ВВ ів рен нів не! ков

Кей ШЕ о вннненкя повен пеня

Кен ЯК знікння НЕТ ат тс я ля З дин ж ше гВйй вісі во зу ві віучня кн НИ НЕ Е ееЕ ЕЕ ПЕ р ЕВ я ее ін ай дл ин ТЕН жи: ж жен ЕНН цу а г сти вояк

Я ню кн Петя УА ЕК ренні ЕТ пня ен вну Ки тке Ен о ан упину зрання дині пт диня . ре ков, ї; п. о 1 й в каф ен НН ТЕЗЕ КЕРІ дк ок дл ж реа пи ванних - рек ово й хе засне Яке не он стен

Вин пен я шк век нення те я них ; ве -

Я пе ЕЕ а я агом се ов ше вв нави ях ПиТЕлвне ВЕК війну ЖК іх ЕСЕ ее ДИ ее роти сля У Соки КВ

Інай З вия ВЕ ах, Ед ШЕ Ме гія о

Коввн- тая ння сриеетя ря сотень: ДЕКО ДЕ пе тевк ек пкт дн еоннкш Кт тн о з0 НУ чий не кічамй В МКК тн алі со Я гх їй дн ін їні; Яое : й Я Денне ун не пня Сир у, ксзав ць ака І а ня я як шт на, кн, те ин ТЕ тя тки ре пити, що се дя я «НКИ я о її ще Пен КА ТИ кю ВиНЯЙ Зх едеиін пе се

Н весну ши ж! ее ПЕПННЕ ЕВ не орні й аск Ж кв ся

З кн а ен озон Як ля ший з ги кн тА дл НАВИ Я тилу со няня рем скл я їв я о ша ЕКО іржі си ся одн яки лшснунвн се й ря еувтьме й

Яравшнх ее п я Аля ил Бела не : тех нн КЕ Енн ЕНН арен й са іл о рі вкдкі 3 ши й наш а пів ет оС В ше пон нік СОТ Е к фннкаяни БК» ве слв г с ї па я ДЕК не у нЕнеое вн ; швея Й пе они Кс снркннх док ак ПжяНЙ г» --щ нн: ї ваше СИНИ КК іт Негж гі й за шк рекет --о усі ех лиття

Жодним с в Я полная а - -І с - с о

Ко) 25 іме) 60 бо -дДо-

ШОН о а ші І

Де Не В кт нткакт в ев ВК Іво є я каш пе та ШЕ ЕК ня не УНК а у рев МЕНЯ іх

КІ юні Яд КП Телля і НЕ ру ЛАК ВДВ ях се Пк рт ги ит анКс

Го в не «Я ЯН нон Я сш ние ін ек вра сте й то ди КИ тн ож ткиті кеВ ня ев

КИ ша и я в В і гу с в фо нь и БАН в-во

Тен ан КЕНЕ КЕ АН тен те тсев ий нн ше Ж х А кни р ик В кто яр НН т

Я цк и ати т тра лави вище т Р т яні Ялта ЗаВр и

Нове о НН совка сво ен 20 я Б А- 6 Із Тенльме Ва й ХЕ з ДЕ ії ай вині ант Як пе тет

БЕ Кві во ВИМ плн: МОВ

ЦІ ннкя ж В ВИНА ККНАНА соді 0но сЩ о

Ір ШК ПН и кл іс й п и стр НН ня коре о пед по МВ

Зо а В ев ния Я нік с кв Ен

НЕК ол оно т нвнван ит рив нн сн НН

Кві и ВИНА Кі ан в в ВВ АН и янв ню Вей і Я пен АЙВА ВЕЖ ЯН -- аа Е есною вИ вВв ЕК м каві Я ЗЕ КАсстетрсвндови Попит ВК

Б з. р птн новив отти авт пвааітля пу о ма вся пошти терти сити зв Пиши ВЕН они она ї-

МА Я ен ший ж ов во ан а НН АКХ Соки Енн о ки тя іш а ан вн « 40 ще не: жеНАИнНя 0си 1 ин асн в К пемит І тет В М СИС рев рннен и В ТЕН ООН, : ЗНА МК пок ях век п в вах т праву ра я Я нин и НИ дк сонна в Ват

Я Ярини У НК ЕН що 45 2 ринки о ВАНН вн пдв нн Ан кн а ве кон на р нтетр і іевие я, ЗИ ЯН них в. ша о окон ПМ ИЩІИИЩИЩИ Снне

Я прот метан лит ри полити Ковалик, ЕНІТЕРЕТ. Й, МАМ пра оси рюпиярток сви В т ЕН ок В у КН и 1 В той час, як ефекти Сро у мишей добре охарактеризовані, інформація відносно систем людини обмежена. "з Сро-фосфортіоатні олігонуклеотиди з сильною стимулюючою активністю в системах миші проявляють меншу активність на людині і імунних клітинах інших тварин, що не є гризунами. В прикладах описана розробка

СрОо-мотиву людини з сильною активністю і характеристика його ефектів і механізмів дії на первинні В-клітини людини. ДНК, що містять даний ро мотив, сильно стимулювали первинні В-клітини людини відносно проліферації, продукції МЛ-б і експресії збільшених рівнів СО86, СО40, СО54 і МНС І. Вони збільшували

ГФ) ДНК-зв'язуючу активність транскрипційних факторів МЕКВ і АРІ, також як фосфор плювання активованих стресом 7 протеїнкіназ МК і р38 і транскрипційного фактора АТЕ-2. Шляхи передачі сигналу у В-клітинах, активованих

Сро-ДНК, відрізнялися від тих, які активуються через рецептор В-клітин, який активував ЕКК і іншу ізоформу во УМК, але не активував р38 і АТЕ-2. В цілому дані про ініційовану СрО-ДНК передачу сигналу співпадають з такими, одержаними на мишах (НаскКег Н., еї аІ., 1998. Етбро у 17:6230, хі. К., апа Кгігед. М. 1998. у Іттипої 161:4493).

Переважний мотив для тварин, що не є гризунами, є 5-ТСОТОСОТТ-3. Заміна основ в найбільш сильному 8-ч-ленному СрО-мотиві (5-ТСОТСООТТ-3) знижувало активність олігонуклеотиду. Тімідіни в 5-- і 3і- положеннях ди даного мотиву були більш важливими, ніж тимідин в центральному положенні. Аденін або гуанозин в центральному положенні викликали зниження активності.

Слід зазначити, що дослідження авторів показують, що одного СрО-мотиву у фосфодіефірному олігонуклеотиді (2080) достатньо для одержання максимального ефекту і що додаткові СроО-мотиви (2059) додатково не збільшують активність. Олігонуклеотид з 8--ленним мотивом 5'ТСТСОТ13' (2080), що містить два

СрОо-динуклеотиди, проявляв в дослідженнях найбільшу активність. Заміщення основ, що примикають до двох

СрОо-динуклеотидів (б'положення, центральне положення, З'положення), знижувало активність даної послідовності. Обидва Сро-динуклеотиди з 8--ленним СрОо-мотивом були потрібні для оптимальної активності (2108, 2106). Метилювання цитидину в СрО-динуклеотидах (2095) знищувало активність 2080, тоді як метилювання цитидину (2094), не відноситься до цього, не впливало. Додавання двох Сро-мотивів в 70 послідовність 2080 приводило в 2059 до додаткового збільшення активності фосфодіефірного олігонуклеотиду.

Послідовність 2080 з фосфортіоатним остовом (2116) проявила меншу активність, що припускає, що додаткові

Сро-мотиви переважні для сильного фосфортіоатного олігонуклеотиду.

Відповідно до винаходу, було відкрито, що імуностимулюючі нуклеїнові кислоти охоплюють сильні імуностимулюючі ефекти на клітини людини, такі як МК-клітини, В-клітини і ОС іп міго. Показано, що вживані у5 тут тести іп мйго передбачають ефективність іп мімо у вигляді ад'юванта вакцини у хребетних, що не є гризунами (приклад 12), що припускає, що імуностимулюючі нуклеїнові кислоти є ефективними терапевтичними агентами для вакцинації людини, імунотерапії рака, імунотерапії астми, загального збільшення імунної функції, збільшення виявлення клітин гематопоезу після опромінювання або хіміотерапії і для інших застосувань імуномодуляції.

Таким чином, імуностимулюючі нуклеїнові кислоти корисні в деяких варіантах винаходу як профілактичної вакцини для лікування суб'єкта при ризику розвитку інфекції у інфікованого організму або рака, при якому ідентифікований специфічний раковий антиген, або алергії або астми, при яких алерген схильності до астми відомий. Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти можуть бути також використані без антигену або алергену для більш короткого захисту від інфекції, алергії або рака, і в даному випадку повторні дози повинні створити сч об більш тривалий захист. Вживаний тут термін - суб'єкт, що має ризик - відноситься до суб'єкта, який має який-небудь ризик зіткнення з інфекцією, що викликається патогеном або раком, або алергеном, або ризик і) розвитку рака. Наприклад, суб'єкт, що має ризик, може бути суб'єктом, який планує подорож в зону, в якій знайдений конкретний тип інфекційного агента, або це може бути суб'єкт, який через свій спосіб життя або медичні процедури контактує з рідинами тіла, які містять інфекційні організми, або прямо з організмом, або с зо навіть будь-який суб'єк, що живе в тій області, де ідентифікований інфекційний організм або алерген. "Суб'єкт, що має ризик розвитку інфекції"? також означає загальні популяції, для яких медична установа о рекомендує вакцинацію антигеном конкретного інфекційного організму. Якщо антиген є алергеном, у суб'єкта - де розвиваються алергічні відповіді на даний конкретний антиген, і суб'єкт може бути схильний до дії антигену, тобто якщо настав сезон цвітіння, суб'єкт має ризик експозиції з антигеном пилку. "Суб'єкт, що має ризик ї- зв розвитку алергії або астми", відноситься також до суб'єктів, які відомі як такі, що мають алергію або астму, ї- але не мають активної форми хвороби протягом лікування імуностимулюючою нуклеїновою кислотою, також як до суб'єктів, які розглядаються як такі, що мають ризик розвитку даних захворювань через генетичні фактори або фактори навколишнього середовища.

Суб'єкт, що має ризик розвитку рака, є одним з тих, хто має високу вірогідність розвитку рака. Це поняття « відноситься до суб'єктів, які, наприклад, мають генетичні дефекти, наявність яких, як показано, корелює з з с підвищеною вірогідністю розвитку рака, і до суб'єктів, які стикаються з агентами, що викликають рак, такими як тютюн, азбест або інші хімічні токсини, або до суб'єктів, які раніше лікувалися від рака і знаходяться в ;» стані безперечної ремісії. Коли суб'єкта, що має ризик розвитку рака, лікують антигеном, специфічним для типу рака, відносно якого у суб'єкта є ризик розвитку, і імуностимулюючою нуклеїновою кислотою, суб'єкт може набути здатність знищувати ракові клітини у міру їх виникнення. Якщо у суб'єкта почала утворюватися пухлина, -І у суб'єкта повинна розвинутися специфічна імунна відповідь проти антигена пухлини.

На додаток до застосування імуностимулюючих нуклеїнових кислот для профілактичного лікування винахід

Ш- також охоплює застосування імуностимулюючих нуклеїнових кислот для лікування суб'єкта, що має інфекцію, - алергію, астму або рак.

Суб'єкт, що має інфекцію, є суб'єктом, який зустрічався з інфекційним патогеном і має гострий або о хронічний рівень патогену в організмі, який визначається. Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти можуть бути

Ге використані з антигеном для підвищення антигенспецифічної системної відповіді або імунної відповіді слизової, що здатне понизити рівень або знищити інфекційний патоген. Вживаний тут термін "Інфекційне захворювання" є захворюванням, що виникає в результаті присутності в організмі чужорідного організму. Особливо важливо розробити стратегії ефективної вакцинації і лікування для захисту слизових поверхонь організму, які є первинними воротами інфекції.

Ф) Суб'єкт, що має алергію, є суб'єктом, який має алергічну реакцію або ризик її розвитку у відповідь на ка алерген. Алергія означає придбану гіперчутливість до речовини (алергену). Алергічні стани включають, але не обмежуються цим, екзему, алергічний риніт або гострий риніт, сінну лихоманку, кон'юнктивіт, бронхіальну бо астму, кропив'янку (висип) і харчові алергії, а також інші атопічні стани.

В даний час алергічні захворювання звичайно лікують шляхом введення малих доз антигена, за якими слідує подальше дозування антигена, що збільшується. Вважається, що дана процедура викликає толерантність до алергену, що запобігає подальшим алергічним реакціям. Дані способи, проте, можуть зайняти декілька років для досягнення ефективності і пов'язані з ризиком побічних ефектів, таких як анафілактичний шок. Способи згідно з 65 Винаходом позбавлені таких проблем.

Алергії звичайно викликаються генерацією антитіл ІДЕ проти нешкідливих алергенів. Цитокіни, які індукуються в результаті системного введення або введення в слизові імуностимулюючих нуклеїнових кислот, належать переважно до класу, що називається ТИ1 (прикладами є ІЛ-12 і ІРМ- у), і вони індукують як гуморальну, так і клітинну імунні відповіді. Типи антитіл, пов'язані з Тп1-відповіддю, звичайно володіють більшою захисною активністю, оскільки вони мають високу здібність до нейтралізації і опсонізації. Інший основний тип імунної відповіді, яка пов'язана з продукцією цитокінів - ІЛ-4, ІЛ-5Б і ІЛ-10, називають

Твп2-типом імунної відповіді. Тп2-відповіді залучають переважно антитіла, і це має менший захисний ефект проти інфекцій, і деякі Тп2-ізотипи (наприклад, ДЕ) пов'язані з алергією. В цілому передбачається, що алергічні захворювання опосередковуютсья Тп2-типом імунних відповідей, тоді як ТП1-відповіді забезпечують найкращий 7/о захист від інфекції, хоча надмірні Тп1-відповіді пов'язані з аутоїммунним захворюванням. Грунтуючись на здатності імуностимулюючих нуклеїнових кислот зсувати імунну відповідь у суб'єкта з Тп2 (яка пов'язана з продукцією ІДЕ антитіл і алергією) на Тп1-відповідь (яка є захисною проти алергічних реакцій), суб'єкту для лікування або профілактики алергії може бути введена ефективна доза імуностимулюючої нуклеїнової кислоти для індукції імунної відповіді.

Таким чином, імуностимулюючі нуклеїнові кислоти мають істотну терапевтичну застосовність при лікуванні алергічних і неалергічних станів, таких як астма. Рівень Тп2-цитокінів, особливо ІЛ-4 і ІЛ-5, збільшений в дихальних шляхах суб'єктів з астмою. Дані цитокіни спріяють розвитку основних варіантив астматичної запальної відповіді, включаючи перемикання на ІдЧЕ ізотип, хемотаксис еозинофілів і активацію зростання огрядних клітин.

Тп1-цитокіни, особливо ІЄМ-у ії ІЛ-12, можуть приглушувати утворення ТН2-клонів і продукцію Тп2-цитокінів.

Астма відноситься до стану респіраторної системи, що характеризується запаленням, звуженням дихальних шляхів і збільшеною реакцією дихальних шляхів на агенти, що вдихаються. Астма часто, хоча не виключно, пов'язана з атопічними або алергічними синдромами.

Суб'єкт, що має рак, представляє собою суб'єкт, який має ракові клітини, які визначаються. Раки або пухлини включають, але не обмежуються цим, рак жовчних шляхів; рак мозку; рак молочної залози; рак шийки Га гр; матки; хоріокарциному; рак товстої кишки; рак ендометрію; рак стравоходу; рак шямку; внутрішньоепітеліальні неоплазії; лімфоми; рак печінки; рак легень (наприклад, дрібноклітинний і не дрібноклітинний); меланому; о нейробластоми; рак рота; рак яєчників; рак підшлункової залози; рак простати; рак прямої кишки; саркоми; рак шкіри; рак сім'яників; рак щитовидної залози і рак нирок, також як інші карциноми і саркоми. В одному здійсненні рак представляє собою лейкемічний ретикулез, хронічний мієлоїдний лейкоз, лейкоз шкірних Т-клітин, Ге множинну мієлому, фолікулярну лімфому, злоякісну меланому, сквамозноклітинну карциному, рак клітин нирки, рак простати, рак клітин сечового міхура або рак прямої кишки. юю

Суб'єкт, відповідно до винаходу, є суб'єктом, що не є гризуном. Суб'єкт, що не є гризуном, повинен (че позначати людину або хребетну тварину, наприклад, може бути, але не обмежуючись ними собакою, кішкою, конем, коровою, свинею, вівцею, козою, курчам, приматом, наприклад, мавпою, і рибою (види, що розводяться у т

Воді), наприклад, лосось, але конкретно виключаючи гризунів, таких як криси і миші. ч-

Таким чином, винахід може бути також застосований для лікування рака і пухлин у суб'єктів, що не є людиною. Рак є однією з лідируючих причин смерті домашніх тварин (тобто кішок і собак). Рак звичайно вражає старих тварин, які, у разі домашніх тварин, стають інтегрованими в сім'ю. Сорок п'ять 96 собак старше 10 « років, ймовірно, стають жертвами хвороби. Найбільш звичайні можливості лікування включають хірургію, Хіміотерапію і радіаційну терапію. Інші можливості лікування, які були застосовані з деяким успіхом, - с включають лазерну терапію, кріотерапію, гіпертермію та імунотерапію. Вибір терапії залежить від типу рака і ц ступеня розповсюдження. Крім випадків, коли малігнієзоване зростання обмежене дискретною областю "» організму, важко видалити тільки пухлинну тканину без впливу також на нормальні клітини.

Злоякісні порушення, що звичайно діагностуються у собак і кішок, включають, але не обмежуються цим, лімфосаркому, остеосаркому, пухлини молочних залоз, мастоцитому, пухлину мозку, меланому, -І аденосквамозну, карциному, карциноїдну пухлину мозку, пухлину бронхіальної залози, бронхіолярну аденокарциному, фіброму, міксохондрому саркому легень, нейросаркому, остеому, папілому, ретинобластому, саркому Евінга, пухлину Вілма, лімфому Беркітта, мікрогліому, нейробластому, остеокластому, неоплазії рота, - фібросаркому, остеосаркому і рабдоміосаркому. Інші неоплазії у собак включають сквамозноклітинну карциному геніталій, пухлину, що передається венерично, пухлину сім'яників, семіному, пухлину клітин Сертолі, і-й гемангіоперіцитому, гістіоцитому, хлорому (гранулоцитну саркому), папілому рогівки, сквамозноклітинну з карциному рогівки, гемангіосаркому, плевральну мезотеліому, базальноклітинну пухлину, тимому, пухлину шямку, карциному надниркових, папіломатоз рота, гемангіоендотеліому і цистаденому. Додаткові злоякісні утворення, що діагностуються у собак, включають фолікулярну лімфому, лімфосаркому кишечнику, фібросаркому і сквамозноклітинну карциному легень. Відомо, що у тхора, навіть більш популярної домашньої тварини, розвивається інсулінома, лімфома, саркома, нейрома, пухлина островкового апарату підшлункової о залози, лімфома шямку МАГ Т і аденокарцинома шямку. ко Неоплазії, що розвиваються у сільськогосподарської худоби, включають лейкоз, гемангіоперіцитому і неоплазію ока биків (у великої рогатої худоби); препуціальну фібросаркому, виразкову сквамозноклітинну бо карциному, препуціальну карциному, неоплазії сполучної тканини і мастоцитому (у коней); гепатоклітинну карциному (у свині); лімфому і аденоматоз легень (у вівці)х саркому легень, лімфому, саркому Рауса, ретикулендотеліоз, фібросаркому, нефробластому, В-клітинну лімфому і лімфоїдний лейкоз (у видів овець); ретинобластому, неоплазію печінки, лімфосаркому (лімфобластну саркому), плазмацитоїдний лейкоз і саркому плавального міхура (у риб), сирнистий лімфаденіт (СІ А): хронічне інфекційне, заразне захворювання овець і 65 Кіз, що викликається бактерією Согуперасіегішт рзеийдоїшрегсціовіз, і заразну пухлину легень овець, що викликається іааозіек(е.

Суб'єкт піддається дії антигена. Вживаний тут термін "піддається дії" відноситься або до активної стадії контакту суб'єкта з антигеном, або пасивне експонування суб'єкту антигена іп мімо. Способи активного експонування антигена суб'єкту добре відомі фахівцям в даній області техніки. В цілому, антиген вводять прямо суб'єкту будь-яким способом, таким як внутрішньовенне, внутрішньом'язове, пероральне, трансдермальне введення, введення у слизову, інтраназальне, внутрішньотрахеальне або підшкірне введення. Антиген може бути введений системно або місцево. Способи введення антигена і імуностимулюючої нуклеїнової кислоти описані більш детально нижче. Суб'єкт пасивно експонується з антигеном, наприклад, при вході в організм чужорідного патогена або при розвитку пухлинної клітини, що експресує чужорідний антиген на своїй поверхні. 70 Способи, у яких суб'єкт пасивно експонується з антигеном, можуть особливо залежати від тимчасового режиму введення імуностимулюючої нуклеїнової кислоти. Наприклад, у разі суб'єкта з ризиком розвитку рака або інфекційного захворювання, або алергічної або астматичної відповіді, суб'єкту можна вводити імуностимулюючу нуклеїнову кислоту регулярно, коли ризик найбільший, тобто протягом алергенного сезону або після зустрічі з агентом, що викликає рак. Додатково імуностимулюючу нуклеїнову кислоту можна вводити мандрівникам перед у/5 їх подорожжю закордон, де вони ризикують зустрітися з інфекційними агентами. Таким же чином імуностимулююча нуклеїнова кислота може бути введена солдатам або цивільним при ризику зустрічі з біологічною зброєю для індукції системної імунної відповіді або відповіді слизової на антиген, коли, і якщо, суб'єкт з ним зустрінеться.

Вживаний тут термін "антиген" є молекулою, що викликає імунну відповідь. Антигени включають, але не обмежуються цим, клітини, клітинні екстракти, білки, поліпептиди, пептиди, полісахариди, полісахаридні кон'югати, пептидні і непептидні міметики полісахаридів та інші молекули, невеликі молекули, ліпіди, гліколіпіди, вуглеводи, віруси і екстракти вірусів, а також багатоклітинні організми, такі як паразити і алергени. Термін антиген в широкому сенсі включає будь-який тип молекули, який признається імунною системою хазяїна як чужорідний. Антигени включають, але не обмежуються цим, ракові антигени, мікробні сч г5 антигени і алергени.

Вживаний тут термін "раковий антиген" є сполукою, такою як пептид або білок, яка пов'язана з поверхнею і) пухлинної або ракової клітини і яка здатна викликати імунну відповідь при експресії на поверхні антиген-являючої клітини разом з молекулою МНС. Ракові антигени можуть бути одержані з ракових клітин або шляхом одержання сирих екстрактів пухлинних клітин, |наприклад, як описано Сопеп, еї аї., 1994, Сапсег с зо Кезеагсі, 54:1055), шляхом часткового очищення антигенів, рекомбінантним способом, або за допомогою синтезу де помо відомих антигенів. Ракові антигени включають, але не обмежуються цим, антигени, що юю експресуються рекомбінантно, їх імуногенну частину або цілу пухлину або ракову пухлину. Такі антигени можуть - п бути виділені або одержані за допомогою рекомбінантних способів або будь-яких інших способів, відомих в даній області техніки. -

Вживаний тут термін "мікробний антиген" є антигеном мікроорганізму і включає, але не обмежується цим, ї- віруси, бактерії, паразити і гриби. Такі антигени включають інтактний мікроорганізм, а також природні ізоляти і їх фрагменти або похідні, а також синтетичні сполуки, які ідентичні або схожі з антигенами природного мікроорганізму і індукують імунну відповідь, специфічну для даного мікроорганізму. Сполука схожа з антигеном природного мікроорганізму, якщо вона індукує імунну відповідь (гуморальну та/або клітинну) до антигену « природного мікроорганізму. Такі антигени звичайно застосовують в даній області техніки, ії вони добре відомі пт) с фахівцям в даній області. . Приклади вірусів, які знайдені у людини, включають, але не обмежуються цим, Кеїгомігідае (наприклад, и?» віруси імунодефіциту людини, такі як ВІЛ-1 (що також позначається як НТІМ-П, ГАМ або НТІМ-ПИ/ АМ, або

НІМ-Ш; й інші ізоляти, такі як НІМ-ІР; Рісогпамігідае (наприклад, поліовіруси, вірус гепатиту А; ентеровіруси; віруси Сохзаскіе людини, риновіруси, еховіруси); Саїсімігідае (наприклад, штами, які викликають -І гастроентеріт); Тодаміпідае (наприклад, віруси енцефаліту коней, віруси корової краснухи); Ріамігідаеє (наприклад, віруси денге, віруси енцефаліту, віруси жовтої лихоманки); Согопомігідае (наприклад,

Ш- коронавіруси); КПардомігадае (наприклад, віруси везикулярного стоматиту, віруси сказу); Согопамігідаеє - (наприклад, коронавіруси); Кпарадомігадае (наприклад, віруси везикулярного стоматиту, віруси сказу); бо / Ніомігдае (наприклад, віруси лихоманки ебола); Рагатухомігідае (наприклад, віруси парагрипу, віруси свинки, о вірус кору вірус дихального синцитію); Огіпотухомігідае (наприклад, віруси грипу); Випдамігідае (наприклад,

Ге віруси Напіаап, віруси рипда, флебовіруси і віруси Маїго); Агепа мігідае (віруси геморагічної лихоманки);

Кеомігідае (наприклад, реовіруси, орбивіруси і ротавіруси); Вітамігідаеє; Нераадпамігідае (вірус гепатиту В);

Рагмомігідаеє (парвовіруси); Раромамійідае (віруси папіломи, віруси поліоми); Аадепомігідае (більшість ов аденовірусів); Негревмігідає (вірус простого герпеса (НЗМ) 71 і 2, вірус вітряної віспи, цитомегаловірус (СМУМ), вірус осгерпеса; Рохмігідае (віруси віспи, віруси коров'ячої віспи, опоксвіруси); і Ігідомігідае

Ф) (наприклад, вірус африканської лихоманки свиней); і некласифіковані віруси (наприклад, агенти, що викликають ка губчастий енцефаліт, агент гепатиту дельта (як передбачається, що є вірусом-сателітом гепатиту В), агенти гепатиту не-А, не-В (клас 1- передається через внутрішні органи; клас 2- передається парентерально (тобто бо гепатиту С); віруси МогмаїК і відносяться до них віруси, а також астровіруси).

У хребетних тварин антигенами служать як грампозитивні, так і грамнегативні бактерії. Такі грампозитивні бактерії включають, але не обмежуються цим, види РазіецйгеМйа, види Зіарпуіососсі і види бігеріососсив.

Грамнегативні бактерії включають, але не обмежуються цим, ЕвзсПпепспіа соїї, види Рзепдотопаз і види

ЗаїІтопеїІа. Конкретні приклади інфекційних бактерій включають, але не обмежуються цим, Неїїсобасіег руЇопв, 65 Вогейа бБигдаопегі, І едіопейа рпешторпййа, Мусорасієега зврвз (наприклад, М. (Шрегсціовіз, М. амішт, М. іпігасеїшШаге, М. Капзап, М. догдопаєе), Зіарпуїюососсиз ацгеив, Меіввегіа допогпоеавае, Меїіззегіа тепіпуйіаів, І івїегіа топосуїодепе5, Зігеріососсив руодепез (Зігеріососсиз о групи А), Зпгеріососсив адаіасіавае (Зігеріососсиз групи В), Збгеріососсиз (група мігідапв), Зігеріососсив Таесадів, Зігеріососсив роміз, Зігеріососсиз (анаеробні види), Зігеріососсиз рпейтопіає, патогенна Сатруобрасіег зр., Епіегососсив

Вр. Наеторийиз тіПцеплаеє Васій5 апігасії, согуперасіегіига аірпійегіае, согуперасіегішт зр.,

Егузіреїоїйгіх гпизіора(піае, Сіовігідішт регптіпдеге, Сіовігідішт їейапі Епіегорасіег аегодепев5, КіебрзіеІМа рпештопіає, Равзіцйгейа тиМосіда, Васіегоіїдез вр., ЕРизорасіегішт писіеайт, Зіггеріорасійй5 /топійогтів,

Тгеропета раїЇІадіит, Теропета регепие, І еріозріга, Кіскейвіа і Асііпотусез ізгаеіії.

Приклади грибів включають Сгуріососсиз пеоїогтапе, Нівіоріазта сарзціайшт, Соссідіоідез іттійкв, 70 Віазвютусез дегтайіаів, Спіатуаїйа ігаспотаїйв, Сапаїда аїрісапв.

Інші інфекційні організми (тобто найпростіші) включають Ріазтодіт зрр., такі як Ріазтодіцт ТаЇІсірагит,

Ріавтодішт таїйагіае, Ріазтодішт омаіе і Ріавтодійт мімах, також Тохоріазта допаїйї. Паразити крові-кісток та/або тканин включають Ріазтодішт зрр., Вабезіа тісгоїї, Варезіа аімегдепв, І еізптапіа Ггоріса, І еізптапіа зрр., Іеївптапіа Бгалійепвзів, Іеізпйтапіа допомапі, Тгурапозота датбріепве і Тгурапозота гподевзіепзе 7/5 (африканська сонна хвороба), Ттурапозота сги?лі (хвороба Спадав) і Тохоріазта допіаії.

Інші мікроорганізми, що відносяться до медицини, детально описані в літературі, наприклад, дивись С.О.А

Тпотазг, Меадіса! Місгобіоіоду, ВайНеге Тіпааї, Сгеаї Вгйаіп 1983, повний зміст якої включений тут як посилання.

Хоча багато з мікробних агентів, описаних вище, відносяться до захворювань людини, винахід також корисний для лікування інших хребетних, що не є людиною. Хребетні що не є людиною, також можуть піддаватися інфекції, якій можна запобігти або вилікувати розкритими тут імуностимулюючими нуклеїновими кислотами. Наприклад, на додаток до лікування інфекційних захворювань людини способи винаходу корисні для лікування інфекцій в тварин.

Вживані тут терміни "лікувати", "підданий лікуванню", "лікування" при застосуванні відносно інфекційного захворювання, означають профілактичне лікування, яке збільшує стійкість суб'єкта (суб'єкта, що має ризик сч ов інфекції) до інфекції, що викликається патогеном або, іншими словами, знижує вірогідність того, що суб'єкт стане інфікованим патогеном, а також лікування після того, як суб'єкт (суб'єкт, який інфікований) стає і) інфікованим, для того, щоб боротися з інфекцією, наприклад, знижувати або знищувати інфекцію або запобігати її посиленню.

Багато вакцин для лікування хребетних, що не є людиною, розкрито Вепейй, К. Сотрепаїшт Мегегіпагу с зо Ргодисів, Зга ей. Мой Атегісап Сотрепаїіцтв, Іпс., 1995. Як обговорювалося вище, антигени включають інфекційні мікроби, такі як вірус, паразит, бактерії і гриби і їх фрагменти, які походять з природних або о синтетичних джерел. Інфекційні віруси хребетних, які є так і не є людиною, включають ретровіруси, РНК-ові «- віруси і ДНК-ові віруси. Дана група ретровірусів включає як прості ретровіруси, так і складні ретровіруси.

Прості ретровіруси включають підгрупу ретровірусів типу В, ретровірусів типу С і ретровірусів типу 0. ї-

Прикладом ретровірусу типу В є вірус пухлини молочної залози миші (ММТМ). Ретровіруси типу С включають ї- підгрупи групи типу С (включаючи вірус саркоми Рауса (КУБ), вірус лейкозу птахів (АГЇМ) і вірус мієлобластозу птахів (АММ)) і групу В типу С (включаючи вірус лейкозу котячих (Ре! М), вірус лейкозу людиноподібної мавпи - гібона (СЗАГУМ), вірус некрозу селезінки (ЗММ), вірус ретикулоендотеліозу (КМ) і вірус саркоми мавпячих (55М)).

Ретровіруси типу ЮО включають вірус мавпи Мазоп-Ріїгег (МРМУ) і ретровірус мавпячих типу 1 (5КМ-1). Складні « Бетровіруси включають підгрупи лентивірусів, вірусів лейкозу Т-клітин і спінюючих вірусів. Лентівіруси п) с включають ВІЛ-1, але також включають ВІЛ-2, ЗІМ, вірус Мізпа, вірус імунодефіциту котячих (РІМ) і вірус інфекційної анемії кінських (ЕІАМ). Віруси лейкозу Т-клітин включають НТІМ-1, НТІМ-Й, вірус Т-клітинного ;» лейкозу мавпячих (ЗТІ М) і вірус лейкозу корів (ВІ М).

Спінюючі віруси включають спінюючий вірус людини (НЕМ), спінюючий вірус мавпячих (ЗЕМ) і спінюючий вірус

Корів (ВЕМ). -І Приклади інших РНК-ових вірусів, які є антигенами в хребетних тварин, включають в себе, але не обмежуються цим, члени сімейства Кеомігідає, включаючи рід Огіпогеомігиз (множинні серологічні типи

Ш- ретровірусів як ссавців, так і птахів), рід ОгбБімігиз (вірус Вісеопдие, вірус Едепапдее, вірус Кетегомо, - вірус хвороби африканських коней і вірус колорадської кліщової лихоманки), рід Коїамігиз (ротавірус людини,

Вірус діареї телят Небраски, ротавірус мавпячих, ротавірус корів або овець, ротавірус птахів); сімейство о Рісогпамігідае включаючи рід Епіегомігиз (поліовірус, вірус А і В Коксаки, кишкові цитопатичні сирітські

Ге віруси людини (ЕСНО), вірус гепатиту А, ентеровіруси мавпячих, віруси енцефаломиєліту мишей, поліовірус тигів, ентеровіруси корів, ентеровіруси свиней, рід Сагаїомігиз (вірус енцефаломіокардиту (ЕМО), менговірус), рід Кпіпомігиз (риновіруси людини, що включають в себе щонайменше 113 підтипів, інші риновіруси), рід дв Аріпомігиз (захворювання рота і ніг (ЕМОМ); сімейство Саїмімігідаєе, включаючи вірус везикулярного висипу свиней, вірус морського лева Зап Міднцеї, пікорнавірус котячих і вірус МогмаїЇК; сімейство Тодамігідає,

Ф) включаючи рід АІрпамігиз (вірус східного кінського енцефаліту, вірус лісів Зетіїкі, вірус Зіпабрів, вірус ка Спікипдипуа, вірус ОС'Муопоа-Муопо, вірус річки Ковзв, вірус венесуельського кінського енцефаліту, вірус західного кінського енцефаліту), рід Ріамігиз (вірус жовтої лихоманки, що переноситься москітами, вірус бо денге, вірус японського енцефаліту, вірус енцефаліту ЗІ. Гошів, вірус енцефаліту Митау Маїїеу, вірус УМеві

Ме, вірус Кипійп, вірус, що переноситься центрально-європейським кліщем, вірус, що переноситься далекосхідним кліщем, вірус лісу Куазапиг, вірус Іоиріпуд І, вірус Ромжаззап, вірус омської геморагічної лихоманки), рід Кибімігиз (вірус корової краснухи), рід Резіїмігиз (вірус хвороби слизових, вірус холери свиней, вірус прикордонного стану), сімейство Випуамігідае, включаючи рід Випумігиз (Виопуатуега і віруси, що 65 відносяться до нього, група вірусів каліфорнійського енцефаліту), рід РНІеромігиз (сицилійський вірус лихоманки, що переноситься піщаною мухою, вірус лихоманки рифтової долини), рід Маїгомігив (вірус геморагічної лихоманки Стітеап-Сопдо, вірус хвороби овець в Найробі) і рід Шикимігиз (Шикипіеті і віруси, що відносяться до цього); сімейство Оппотухомігідає, включаючи рід вірусу грипу (вірус грипу типу А, багато підтипіу людини); вірус грипу свиней і віруси грипу овець і коней; вірус грипу типу В (багато підгипіу людини) і грипу типу С (можливо окремий рід); сімейство Рагатухомігідае, включаючи рід Рагатухомігиз (вірус парагрипу типу 1, вірус Сендай, вірус гемадсорбції, віруси парагрипу типів з 2 по 5, вірус хвороби Ньюкасла, вірус свинки), рід МогріШмігиз (вірус кору, вірус підгострого склерозуючого паненцефаліту, вірус собачої чуми, вірус чуми рогатої худоби), рід Рпештомігивз (вірус дихального синцитію (КМ), вірус дихального синцитію корів і вірус пневмонії); сімейство Кпардомігідає, включаючи рід Мезісціомігиз (МОМ), вірус Спапаїрига, вірус 7/0 Ніапдеге-Наг Рагк), рід Гуззамігиз (вірус сказу), рабдовіруси риб і два вірогідних рабдовіруси (вірус

Марбурга і вірус Ебола); сімейство Агепамігідае, включаючи вірус лімфоцитного хоріоменінгіту (СМ), комплекс вірусів Тасагіре і ласавірус; сімейство Согопомігідає, включаючи вірус інфекційного бронхіту (ІВМ), вірус гепатиту, коронавірус кишечнику людини і вірус інфекційного перитоніту котячих (коронавірус котячих).

Приклади ДНК-ових вірусів, які є антигенами у хребетних тварин, включають, але не обмежуються цим, сімейство Рохмігідае, включаючи рід Огіпорохмігиз (віспа велика, віспа мала, рох Массіпіа мавп, віспа корів, віспа буйволів, віспа кроликів, Есіотеїйа), рід Іерогірохмігиз (міксома, фіброма), рід Амірохмігиз (віспа домашнього птаха, інші поксвіруси птахів), рід Саргірохмігиз (віспа овець, віспа кіз), рід З!йірохмігив (віспа свиней), рід Рагарохмігиз (вірус інфекційного розіцшаг дерматиту, псевдовіспа корів, вірус папулезного стоматиту корів); сімейство |Ігідомігідає (вірус африканської лихоманки свиней, віруси жаб 2 і 3, вірус 2о лімфоцисти риб); сімейство Негрезмігідае, включаючи віруси герпеса альфа (простого герпеса типів 1 і 2, оперізувальної вітряної віспи, вірус аборту коней, вірус герпеса коней 2 і 3, вірус псевдосказу, вірус інфекційного кератокон'юнктивіту корів, вірус інфекційного ринотрахеїту корів, вірус ринотрахеїту котячих, вірус інфекційного ларинготрахеїту), віруси герпеса-бета (цитомегаловірус людини і цитомегаловіруси свиней і мавп); віруси герпеса-гамма (вірус Епштейна-Барра (ЕВУМ), вірус хвороби Магека, герпес заїтігі, вірус герпеса сч сов аїеіез, вірус сгерпеса зуїмпадив, вірус герпеса морських свинок, вірус пухлини ГискКе); сімейство

Адепомігідае, включаючи рід Мавіадепомітив (підгрупи людини А, В, С, О, Е ії незгруповані; аденовіруси (8) мавпячих (щонайменше, 23 серотипи), вірус інфекційного гепатиту собачих і аденовіруси великої рогатої худоби, свиней, овець, жаб і багато яких інших видів, рід Ауіадепомігиз (аденовіруси птахів) і непіддатливі культивуванню аденовіруси; сімейство Раромігідає, включаючи рід Раріїотамігиз (віруси папіломи людини, с зо Віруси папіломи корів, вірус папіломи кроликів Зпоре і віруси різних патогенних папілом інших видів), рід

Роїуотамігиз (вірус поліоми, вакуолізуючий агент мавпячих (ЗМ-40), вакуолізуючий агент кролячих (ККУ), о

К-вірус, ВК-вірус, УС-вірус і інші віруси поліоми приматів, такі як вірус лімфотрофічної папіломи); сімейство «-

Рагмомігідає, включаючи рід адено-асоційованих вірусів, рід Рагмуомігиз (вірус панлейкопенії котячих, парвовірус корів, парвовірус собачих, вірус хвороби алеутських нірок і т.д.). Нарешті, ДНК-ові віруси можуть ї-

Зв Включати віруси, які не потрапляють у вказані вище сімейства, такі як віруси хвороби Киги і Стеці7еїдідасор ї- і хронічні інфекційні нейропатичні агенти (Китайський вірус).

Кожний з вказаних вище переліків є ілюстративним і не розглядається як лімітуючий. На додаток до застосування імуностимулюючих нуклеїнових кислот для індукції антиген-специфічної імунної відповіді у людини способи перевалених здійснень особливо добре підходять для лікування птахів, таких як кури, курчата, індички, «

Качки, гусаки, перепели і фазани. Птахи є першорядними мішенями для багато яких типів інфекцій. з с Птахи, що вилупилися, піддаються дії патогенних організмів незабаром після народження. Хоча дані птахи спочатку захищені від патогенів антитілами, одержаними від матері, даний захист є тільки тимчасовим, і власна ;» незріла імунна система птахів повинна почати захищати птаха від патогенів. Часто є бажаним запобігання інфекції у молодих птахів, коли вони найбільш сприйнятливі. Бажаним є також запобігання інфекції у старих птахів. Особливо, коли птахи утримуються в закритих приміщеннях, що веде до швидкого розповсюдження -І захворювання. Таким чином, бажано вводити імуностимулюючу нуклеїнову кислоту і ад'ювант згідно винаходу, що не є нуклеїновою кислотою, птахам для збільшення антигенспецифічної імунної відповіді, коли антиген

Ш- присутній. - Прикладом звичайної інфекції в курчат є вірус інфекційної анемії курчат (СІАМ), СІАМ першим був виділений 5р В Японії в 1979 році при дослідженні перерв вакцинації при хворобі Магека (Уцаза еї аї!., 1979, Аміап бів. о 23:366-385). З того часу СІАМ був знайдений у домашньому птаху, що продається, у всіх країнах, головних

Ге виробниках домашнього птаха (мап Виом/ еї аіІ., 1991, рр.690-699) іп Оізеазез Роцгу, 9 еаййоп, Іжа Зіайе

Опімегайу Ргевзв).

Інфікування СІАМ приводить до клінічного захворювання, що характеризується анемією, геморагією і дв імуносупресією у молодих схильних курчат. Характерним для інфекції СІАМ є також атрофія тимусу і кісткового мозку і супутні пошкодження у СІАМ-інфікованих курчат. Зниження лімфоцитів в тимусі і іноді у фабрицієвій

Ф) сумці веде до імуносупресії і збільшення схильності до вторинних вірусних, бактеріальних або грибкових ка інфекцій, які потім ускладнюють перебіг хвороби. Іммуносупресія може викликати загострення захворювання після інфікування одним або більше вірусами хвороби Магека (МОМ), вірусом інфекційного бурситу, вірусом бо ретикулоендотеліозу, аденовірусом або рєовірусом. Було знайдено, що патогенез МОМ посилюється під дією

СІАМ (ОеВоег еї ап, 1989, р.28Іп Ргосеедіпдз УУевіегп Рошігу Оізеазез Сопіегесе Тетре, Агі2.). Більш того, було показано, що СІіАМ поглиблюєознаки інфекційного бурситу (Козепрегдег еї аї.,, 1989, Аміап Оів. 33:707-713). У курчат розвивається вікова стійкість до експериментально індукованого захворювання, обумовленого САА. Вона по суті закінчується до 2-х тижневого віку, але старі птахи є все ще чутливими до 65 інфекції (Уцаза, М. еї аїЇ.,, 1979 вище; Миаза, М. еї аіІ., Агіап Оізеазез 24, 202-209, 1980). Проте якщо курчат двічі інфікувати САА і імуносупресорним агентом (ІВОМ, МОМ і т.п.), вікова стійкість проти захворювання знижується (Уцаза, М. еї аїЇ.,, 1979 і 1980 вище; Виомж/ моп М. еї аїЇ., У. Мейегіпагу Меадісіпе 33, 93-116, 1986). Характеристики СІАМ, які можуть посилити передачу хвороби, включають високу стійкість до інактивації у навколишньому середовищі і деяких звичайних дезинфікуючих агентів. Економічний вплив інфекції СІАМ на виробництво птаха ясний з того факту, що від 1095 до 3090 інфікованих птахів при спалахах захворювання вмирає.

Вакцинація птахів, також як інших хребетних тварин, може бути здійснена у будь-якому віці. Звичайно вакцинації проводять до віку 12 тижнів у разі живих мікроорганізмів і між 14-18 тижнями у разі інактивованого мікроорганізму або іншого типу вакцини. У разі вакцинації в яйце вакцинацію можна проводити в останню 7/0 Четверть ембріонального розвитку. Вакцина може бути введена підшкірно, за допомогою спрею, перорально, у навколоочний простір, внутрішньотрахеально, інтраназально або за допомогою описаних тут способів доставки через інші слизові. Таким чином, імуностимулюючі нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можна вводити птахам і іншим хребетним, що не є людиною, із застосуванням звичайних схем вакцинації, і антиген може бути введений після відповідного періоду часу, як тут описано.

Велика рогата худоба і худоба також схильна інфекції. Захворювання, які вражають даних тварин, можуть викликати важку економічну втрату, особливо у разі великої рогатої худоби. Способи згідно з винаходом можуть бути застосовані для захисту від інфекції худоби, такої як корови, коні, свині, вівці і кози.

Корови можуть інфікуватися вірусами корів. Вірус діареї корів (ВМОМ) є вірусом з позитивним ланцюгом РНК і невеликою оболонкою і класифікується як такий, що відноситься разом з вірусом холери свиней (НОСУ) і

Вірусом суміжного стану овець (ВОМ) до роду пестивірусів. Хоча пестивіруси раніше класифікувалися як такі, що відносяться до сімейства Тодамігідає, в деяких дослідженнях пропонується змінити їх класифікацію і віднести до сімейства Ріамімігідае разом з групами флавівірусу і вірусу гепатиту С (НСУ) (Егапскі, еї а/!., 1991).

ВМОМ, який є важливим патогеном великої рогатої худоби, може бути розділений на основі аналізу клітинної культури на цитопатогенний (СР) і нецитопатогенний (МОР) біотипи. Біотип МСР більш широко поширений, хоча сч обидва біотипи можуть бути знайдені у великої рогатої худоби. Якщо вагітна корова стає інфікованою штамом

МЕР, корова може народити постійно інфікованого і специфічно імунотолерантного теляти, яке буде поширювати і) вірус протягом свого життя. Постійно інфікована велика рогата худоба може стати жертвою хвороби слизових і потім обидва біотипи можуть бути виділені у тварини. Клінічні прояви можуть включати викидня, тератогенез і проблеми з дихальними шляхами, захворювання слизових і легку діарею. Крім того, описана важка с зо тромбоцитопенія, пов'язана з епідемією стада, яка може приводити до смерті тварини, і штами, пов'язані з даним захворюванням, очевидно більш вірулентні, ніж класичні ВМОМ. що)

Віруси герпеса коней (ЕНМ) включають групу різних за антигенами біологічних агентів, які викликають «- множина інфекцій в коней від субклінічних форм до смертельних захворювань. Вони включають вірус герпеса-1 коней (ЕНМ-1), повсюдний патоген у коней. ЕНМУ-1 пов'язаний з епідеміями викиднів, захворюванням дихальних в. шляхів і порушеннями центральної нервової системи. Первинна інфекція верхніх дихальних шляхів молодих ї- коней веде до гарячкового стану, який продовжується протягом періоду від 8 до 10 днів. Імунологічно зрілі кобили можуть повторно інфікуватися через дихальні шляхи без явного вияву хвороби, так що викидень звичайно наступає без застережних обставин. Неврологічний синдром пов'язаний із захворюванням дихальних шляхів або викиднем і може вражати тварин будь-якої статі у будь-якому віці, що веде до втрати координації, « слабкості і паралічу задньої частини тіла |Тейога, Е.. МК. еї аї., Мігоюду 189, 304-316, 1992). Інші ЕНМ - с включають ЕНМ-2 або цитомегаловірус коней, ЕНМ-3, вірус коїтального висипу, і ЕНМ-4, раніше класифікований як підтип 2ЕНМ-1. ;» Вівці і кози можуть інфікуватися множиною небезпечних мікроорганізмів, включаючи мізпа-таеаі.

Примати, такі як мавпи і макаки, можуть інфікуватися вірусом імунодефіциту мавпячих. Вакцини з

Інактивованих клітин з вірусом і безклітинні вакцини вірусу імунодефіциту мавпячих, як знайдено, в змозі -І створити захист у макак |ЗОШ еї аі/ (1990) Іапсеї 36:1538-1541; Юевговіегз еї ам. РМАБ ИШБА (1989) 86:6353-6357; Мигрпеу-Согр еї аЇ. (1989) Зсіепсе 246:1293-1297; апа Сагізоп еї аІ. (1990) АІЮО5 Кез. Нитап

Ш- Кеїгомігизев 6:1239-1246). Вакцина рекомбінантного ВІЛ др 120, як знайдено, створює захист у шимпанзе - ІВегтап еї аї. (1990) Майте 345:622-625).

Кішки, як домашні, так і дикі, сприйнятливі до інфікування множиною мікроорганізмів. Наприклад, 1 інфекційний перитоніт котячих є захворюванням, яке виникає як у домашніх, так і у диких кішок, таких як леви,

Ге леопарди, гепарди і ягуари. Коли бажано запобігти інфекції даним або іншими типами патогенних організмів у кішок, можуть бути застосовані способи винаходу для вакцинації кішок для захисту їх від інфекції.

Домашні кішки можуть інфікуватися декількома ретровірусами, включаючи, але не обмежуючись цим, вірус лейкозу котячих (Бе! М), вірус саркоми котячих (Безм), ендогенний тип конкорнавірусу (КО-114) і синцитій-створюючого вірусу котячих (ГезЕМ). Серед них найбільш істотним патогеном є Ре! М, що викликає

Ф) різноманітні симптоми, включаючи лімфоретикулярну і мієлоїдну неоплазію, анемії, порушення, які ка опосередковуються імунною системою і синдром імунодефіциту, який схожий з синдромом надбаного імунодефіциту людини (СНІД). Нещодавно знайдено, що особливий мутант Ре! М з дефектом реплікації, що бо позначається як Ге М-АІрз, більш тісно пов'язаний з імуносупресивними властивостями.

Відкриття Т-лімфотропного лентивірусу котячих (що позначається також як вірус імунодефіциту котячих) було вперше продемонстровано (|Редеггеп еї а!. (1987) 5сіепсе 235:790-793). Характеристики РІМ |описані Хататою ег а). (1988) ІешКкетіа, ЮОесетрег Зирріетепі 2:2045-2155; Матагаоіо еї а). (1988) Ат. 9. Меї. Кев. 49:1246-1258; і АсКіеу ей а). (1990) у. МігоЇ. 64:5652-5655). Клонування і аналіз послідовностей БМ 65 (описаний ОіІптзвієвс еї а). (1989) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 86:2448-2452 і 86:4355-43601.

Інфекційний перитоніт котячих (РІР) представляє собою спорадичне захворювання, що непередбачувано вражає домашніх і диких Реїдае. Не дивлячись на те, що РІР є в першу чергу захворюванням домашніх кішок, він діагностований у левів, леопардів, гепардів і ягуарів. Більш дрібні дикі кішки, які страждають від РМ, включають рись і степову рись, піщану кішку і манула. У домашніх кішок захворювання виникає переважно у

Молодих тварин, хоча схильні кішки всіх віків. Максимум випадків припадає на вік від б до 12 місяців.

Зниження випадків помічено у віці від 5 до 13 років, потім слідує збільшення випадків у кішок у віці від 14 до 15 років.

Вірусні, бактеріальні і паразитарні захворювання у плавникових риб, молюсків або інших водних форм життя складають серйозну проблему для промисловості, переробляючої водні організми. Через високу густину тварин 7/0 У садіннях-водоймищах або відгороджених зонах морського фермерського господарства, інфекційні захворювання можуть вражати велику частину стада, наприклад, легко вражати плавникових риб, молюсків або інші водні форми. Профілактика захворювання є більш бажаним засобом лікування риб, ніж втручання в той час, коли хвороба вже почалася. Вакцинація риб є тільки способом профілактики, який може створити тривалий імунний захист. Вакцинації на основі нуклеїнових кислот описуються |в патенті США Мо5780448), виданому на 7/5 ім'я Оамів.

Імунна система риб має багато характеристик, схожих з імунною системою ссавців, таких як присутність

В-клітин, Т-клітин, лімфокінів, комплементу і імуноглобулінів. Риби мають підкласи лімфоцитів, роль яких здається у багатьох відношеннях схожою з такою В- і Т-клітин ссавців. Вакцини можуть бути введені шляхом занурення (в них) або перорально.

Водні промислові види включають, але не обмежуються цим, плавникових риб, молюсків і інших водних тварин. Плавникові риби включають риб-хребетних, які можуть бути костистими або хрящовими рибами, таких, наприклад, як лососеві, короп, сомові, жовтохвіст, морський лящ і морський окунь. Лососеві є сімейством плавникових риб, яке включає форель (включаючи райдужну форель), лосося і арктичну струмкову форель.

Приклади молюсків включають, але не обмежуються цим, морського молюска, омара, креветку, краба і устрицю. с ов Інші водні промислові види, але не обмежуються цим, вугра, кальмара і восьминогів.

Поліпептиди вірусних патогенів водних промислових видів включають, але не обмежуються цим, глікопротеїн і) (б) або нуклеопротеїн (М) вірусу вірусного геморагічного сепсису (МНОЗМ); С або М білки вірусу інфекційного геморагічного некрозу (ІНММ); МРТ МР2, МРЗ або М структурні білки вірусу інфекційного панкреатичного некрозу (ІРММ); С білок весняної віремії коропа (ЗМО); і пов'язаний з мембраною білок, білок оболонки або с зо капсідний білок глікопротеїну вірусу канальних сомів (ССМ).

Типові паразити, що інфікують коней, представляють собою Савзіегорпййз5 зрр.,; Еітегіа Іеискагії, Сіагаїа о зрр.; Тійгіспотопаз едиї; Вабезіа зрр. (ВВС), ТНеїйегіа едиї; Тгурапозота зрр., КіоззіеЇІа едиї; Загсосузіїв зрр. «-

Головні паразити, що інфікують свиней, представляють собою Еїтегіа Бребііескі, Еітегіа зсабга, Ізозрога зців, Сіагаіа зрр.; Ваіапіідіит соїї; Епіатоеба Пізіоїуіса; Тохоріазта допаії і Загсосувзіїв зрр., і ТгіспіпейІа зрігаїїв. ї-

Головні паразити молочної і м'ясної великої рогатої худоби включають Еїтегіа зрр. Сгуріозрогідіит гр. ї-

Сіагаіа врр.; Тохоріазта допай; Вабезіа ромів (КВС), Вабрезіа Бідетіпа (КВС), Тгтурапозота зрр. (плазма),

Твейегіа зрр. (КВС); ТНеїйегіа рагула (лімфоцити); Тгтйгіспотопаз їоейив; і Загсосувіїв зрр.

Головні паразити хижаків включають Тгіспотопаз даїїйїпае; Соссідіа (Еітегіа врр.); Ріазтодіцт геїїсішт,

І еисосуїогооп дапіємуеКуі (сови), Наеторгоїеиз зрр., Тгурапозота зрр.; Нівіотопавз; Стгуріозрогідійт « теїеадгіаів, Стурюзрогіаїт бБаїеуї, Сіагаіа, Еітегіа; Тохоріазта. з с Типові паразити, що інфікують овець і кіз, включають Еїітегіа зрр., Стгуріозрогідішт зр., Сіагайа зр.;

Тохоріазта допаїї; Вабрезіа зрр. (КВС), Ттуурапозота зрр. (плазма), Тпеїйегіа зрр. (КВС); і Загсосузвіїв зрр. ;» Типові паразитарні інфекції домашнього птаха включають кокцидіоз, що викликається Еїтегіа асегуціїпа, Е.

Месаїйгіх Е. (епеМа, Ізозрога зрр. і Еітегіа ігипсайа; гістомоніаз, що викликається Нівіотопаз тегеадпаіїз і Нівіютопаз даїїйпагит; трихомоніаз, що викликається Тпіспотопаз даїЇйпае; і гексамітіаз, що викликається -І Нехатійїа теїіІеадпаів. Домашній птах може бути також інфікований Етегіа тахіта, Етегіа теіеадпаїв, Еітегіа адепоеїдез, Еїтегіа теїіІеадптійв, Стуріозропадішт, Еїітегіа Бгопейці, Етегіа адепоеїдез5, І еисосуїогооп 2рр.,

Ш- Ріазтодішт грр., Неторгоїеивз тепіеадпаїйв, Тохоріазта допаії і Загсосузіїів. - Способи згідно з винаходом можуть бути також застосовані до лікування та/або профілактики паразитарних інфекцій у собак, кішок, птахів, риб і тхорів. Типові паразити птахів включають Тгіспотопаз адаїїпае; Еітегіа о зрр., Івозрога зрр., Сіагаїа; Стуріозрогіаіт; зЗагсосувіів зрр., Тохоріазта допап,

Ге Наеторгоїеив/Рагапаеторгоїеиз, Ріазтодіцт зрр., І еисосуїогооп/Акіра, Аохоріазта, Турапозота зрр. Типові паразити, що інфікують собак, включають ТпспПіпеїІа зрігаїйв; Ізорога зрр., Загсосузіїв зрр., Стгуріозропаїт зрр., Наттопаїйа зрр., Сіагаіа диодепаїїз (собачі); Ваїапіідішт соїї, Епіатоера Пізіоіміса; Нераїогооп сатвв; в Тохоріазта допап, Тгурапозота сгигі; Варезіа сапв; І еівптапіа атазіідоїез; Меоврога сапіпит.

Типові паразити, що інфікують види котячих, включають в себе Ізозрога зрр., Тохоріазта допди, Загсосузіїв

Ф) зрр., Наттопаїа паттопаї; Везпойіа зрр., Сіагаіа зрр.; Епіатоера Півіоїуїса; Нераїогооп сатв, Суїаихгооп ка зр., Суївихгооп зр., Суїаихгооп зр. (ерітроцити, КЕ клітини).

Типові паразити, що інфікують риб, включають Нехатіїа зрр., Еітегіа зрр.; Стгуріобіа зрр., Мозета згрр., бо Мухозота зрр. СпйодопеМйа зрр. Тпсподіпа зрр.; Ріївюрнога зрр., Мухозота Неппедциуа; Сова зрр.,

Іспіпуорпйпігіов врр. і Осодіпічт врр.

Типові паразити диких ссавців включають Сіагайїа врр. (м'ясоїдні, травоїдні), Ізозрога зрр. (м'ясоїдні),

Еітегіа взрр. (м'ясоїдні, травоїдні); ТПейега зрр. (травоїдні), Вабревзіа врр. (м'ясоїдні травоїдні),

Тгурапозота зрр. (м'ясоїдні, травоїдні); Зспівіозвота зрр. (травоїдні); Равзсіоїа Пераїйфса (травоїдні), 65 ЕРазсіоісїдез тадпа (травоїдні), Разсіоїа дідапіїса (травоїдні), Тгіспіпеїа зрігаїїз (м'ясоїдні, травоїдні).

Паразитарні інфекції в зоопарках також можуть складати серйозні проблеми. Типові паразити сімейства

Вомідае (білолобий бубал, антилопа, бантенг, канна, гаур, антилопа пала, антилопа-стрибун, лісова антилопа, газель) включають ЕїЇтегіа зрр. Типові паразити сімейства Ріппіредае (тюлень, морський лев) включають Еітегіа рпосає. Типові паразити сімейства Сатеїїдає (верблюди, лами) включають Еітегіа зрр. Типові паразити сімейства Сігайідае (жирафи) включають Рітегіа зрр. Типові паразити сімейства ЕІерпапіійдає (африканських і азіатських) включають Разсіоїа зрр. Типові паразити низьких приматів (шимпанзе, орангутанга, мавпи, бабуїни, макаки, мавпи) включають Сіагайа зр. Ваїапійдішт соїї, Епіатоера Пізіоїуїса, Загсосувіїв врр., Тохоріазта допди; Ріазтодіт зрр. (КВС), Вабезіа зрр. (КВС), Тіурапозота зрр. (плазма), І еізптапіа зрр. (макрофаги).

Поліпептиди бактеріальних патогенів включають, але не обмежуються цим, регульований залізом білок 7/0 Зовнішньої мембрани (ІКОМР), білок зовнішньої мембрани (ОМР) і А-белок Аеготопіз заІтопісіда, який викликає фурункульоз, білок р57 Кепірасієегійт заіІгаопіпагит, який викликає бактеріальне захворювання нирок (ВКО), головний асоційований з поверхнею антиген (тва), цитотоксин (трг), що експресуєтсья на поверхні, гемолізин (іп), що експресуєтсья на поверхні, і джгутиковий антиген МУегзіпіозіз; позаклітинний білок (ЕСР), регульований залізом білок зовнішньої мембрани (ІКОМР), і структурний білок РазіешгеїЇІовів; ОМР і джгутиковий білок Мібгозіз апоцШагит і М. огааіп; джгутиковий білок, білок ОМР, агоА і ригА ЕдмагазієїІовіз ісіа|шгі і

Е. їагда; і антиген поверхні Іспійуорпїйпіпив; і структурний і регуляторний білок Суїорпада соЇштпагі; і структурний і регуляторний білок КісКейвзіа.

Поліпептиди паразитарного антигена включають, але не обмежуються цим, антигени поверхні

Іспіпуорпігійв.

Алергеном називають речовину (антиген), яка може викликати алергічну або астматичну відповідь у сприйнятливого суб'єкта. Перелік алергенів є величезним і може включати пилок, отрути комах, небезпечний тваринний пил, спори грибів і ліки (наприклад, Пеніцилін). Приклади природних тварин і рослинних антигенів включають, але не обмежуються цим, білки специфічні для наступних родів: Сапіпе (Сапіз Татіїагів);

Оегтайрпадоіїдез (наприклад, Юегтайорпадоідез Тагіпае); Реїїв (Реїїв дотевіїсив); Атрбговіа (Атрбговіа сч ов апетизвіоїйа; ІГоїйст (наприклад, Гоїїшт регеппе або І от тийкШогит); Стгуріотегіа (Стгуріотегіа |аропіса);

АйЦегпагіа (АМегпагіа аМегпайа); АїЇдег; АІпиз (АІпиз диКіпоаза); Веїша (Веїша меггисова); Опцегсив і) (Оцегсиз аіра); ОіІеа (ОІеа епйгора); Апетівзіа (Агіетівіа миЇдагів); Ріапіддо (наприклад, Ріапіадо

Іапсеоіаїа); Рагіейага (наприклад, Рагієїага ойПісіпайв або Рагієїага |даіса); ВіацеМа (наприклад,

Віацейа одегтапіса); Аріз (наприклад, Арів тиКШогит); Сиргеввиз (наприклад, Сиргеззив зветрегмігеп5, су зо Сиргезвиз агігопіса і Сиргезвиз тасгосафа); ЧУипірегив (наприклад, ипірегив забіпоіїдев, дипірегиз мігдіпіапа,

Уцпірегиз соттипів і ипірегиз азпеї); Тпуа (наприклад, Тпшуа огіепіаіів); Спатаесурагіз (наприклад, о

Спатаесурагів оріиза); Регіріапеїа (наприклад, Регіріапега атегісапа); Адгоругоп (наприклад, Адгоругоп о/р герепз); Зесаіе (наприклад, Зесае сегеаІе); Тійісит (наприклад, Тгйісит аевіїмит); Расцуїїв (наприклад,

ОБасіуїїз діогаегайа); Резіиса (наприклад, Ревійса еїайог); Роа (наприклад, Роа ргаїепзіз або Роа сотргезза); ї-

Амепа (наприклад, Амепа заїїма); НоЇсиз (наприклад, Ноїсив Іапайшв); Апіпохапіпит (наприклад, Апіпохапійит ї- одогаїшт); Агтпепаїйтегит (наприклад, Аггпепаїйегит еїайив); Адговіїв (наприклад, ЛАадговіїв аїЇра); Рнеит (наприклад, РІїеит ргагепзе); РІаїагіз (наприклад, РпПаїагів агопаіпасеа); Разраїшт (наприклад, РазраЇшт поїашт); Зогдапит (наприклад, Зогапит Наїіерепвів); і Вготив (наприклад, Вготиз іпегтів).

Антиген може бути антигеном, який кодується вектором нуклеїнової кислоти, або він може не кодуватися « Вектором нуклеїнової кислоти. В першому випадку вектор нуклеїнової кислоти вводять суб'єкту і антиген з с експресується іп мімо. В іншому випадку антиген може бути введений прямо суб'єкту. Вживаний тут термін "антиген, не кодований вектором нуклеїнової кислоти", відноситься до будь-якого типу антигена, який не є з нуклеїновою кислотою. Наприклад, в деяких варіантах винаходу антиген, не кодований вектором нуклеїнової кислоти, є поліпептид. Мінорні модифікації первинних амінокислотних послідовностей поліпептидних антигенів

Можуть також давати поліпептид, який по суті має еквівалентну антигенну активність у порівнянні з -І немодифікованим початковим поліпептидом. Такі модифікації можуть бути навмисними, як у разі сайт-спрямованого мутагенезу або можуть бути спонтанними. Всі поліпептиди, одержувані в результаті даних - модифікацій, включені в даний винахід, якщо все ще існує антигенність. Поліпептид може бути, наприклад, - вірусним поліпептидом.

Вживаний тут термін "по суті очищений" відноситься до поліпептиду, який по суті вільний від інших білків, 1 ліпідів, вуглеводів або інших матеріалів, з якими він зв'язаний в природних умовах. Фахівець в даній області

Ге техніки може очистити вірусні або бактеріальні поліпептиди із застосуванням стандартних способів очищення білка. По суті, чистий поліпептид часто дає вихід у вигляді єдиної головної смуги на непоновлюючому поліакриламідному гелі. У разі частково очищених глікозильованних поліпептидів або тих, які мають декілька в стартових кодонів, може виявлено декілька смуг на непоновлюючому поліакриламідному гелі, але вони повинні бути характерними для даного поліпептиду. Чистота вірусного або бактеріального поліпептиду може також (Ф) визначатися за допомогою аналізу аміно-кінцевої послідовності амінокислот. Інші типи антигенів, не кодовані ка вектором нуклеїнової кислоти, такі як полісахариди, невеликі молекули, міметики і т.п. описані вище і включені у винахід. во У винаході також застосовують полінуклеотиди, кодуючі антигенні поліпептиди. Представляється, що антиген може бути доставлений суб'єкту в молекулі нуклеїнової кислоти, яка є кодуючою антиген, так що антиген може експресуватися іп мімо. Такі антигени, що доставляються суб'єкту у векторі нуклеїнової кислоти, відносяться до антигенів, кодованих вектором нуклеїнової кислоти. Нуклеїнова кислота, що кодує антиген, оперативно пов'язана з експресуючою ген послідовністю, яка управляє експресією нуклеїнової кислоти антигена в 65 еукаріотичній клітині. Послідовність, яка експресує ген, представляє собою будь-яку регулюючу нуклеотидну послідовність, таку як промоторна послідовність, або поєднання промотору і енхансера, яка прискорює ефективну транскрипцію і трансляцію нуклеїнової кислоти антигену, до якої вона оперативно приєднана.

Послідовність, яка експресує ген, може, наприклад, бути промотором вірусу або ссавця, таким як конститутивний або індуцибельний промотор. Конститутивні промотори ссавців включають, але не обмежуються цим, промотори наступних генів: гіпоксантинфосфорибозилтрансферази (НРТК), аденозиндезамінази, піруваткінази, промотор р-актину та інші конститутивні промотори. Приклади вірусних промоторов, які функціонують в еукаріотичних клітинах як конститутивні, включають, наприклад, промотори цитомегаловірусу (СМУ), вірусу мавпячих (наприклад, 5М40), вірусу папіломи, аденовірусу, вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), вірусу саркоми

Рауса, цитомегаловірусу, довгі кінцеві повтори (ІТК) вірусу лейкозу МоІопеу та інші ретровіруси, а також 70 промотор тимідинкінази вірусу простого герпеса. Інші конститутивні промотори відомі фахівцям в даній області техніки. Промотори, придатні як послідовності, що експресують ген, також включають індуцибельні промотори.

Індуцибельні промотори експресуються у присутності індукуючого агента. Наприклад, металотіонеїновий промотор індукується для стимуляції транскрипції і трансляції у присутності певних іонів металу. Інші індуцибельні промотори відомі фахівцям в даній області техніки.

В цілому послідовність, яка експресує ген, повинна включати як необхідні елементи 5'-сетранскрибовані і 5-нетрансльовані послідовності, які залучені в ініціацію транскрипції і трансляції, відповідно, такі як ТАТА бокс, кепуюча послідовність, СААТ послідовність і тому подібне. Зокрема, щоб такі 5'-ч-етранскрибовані послідовності включали промоторну область, яка містить промоторну послідовність для транскрипційного контролю оперативно зв'язаної нуклеїнової кислоти антигену. Послідовності, що експресують ген, необов'язково включають, якщо необхідно, енхансерні послідовності або вищенаведені активаторні послідовності.

Нуклеїнова кислота антигена оперативно пов'язана з послідовністю, що експресує ген. У винаході говориться, що послідовність нуклеїнової кислоти антигену і послідовність, що експресує ген, оперативно зв'язані, коли вони ковалентно зв'язані таким чином, що експресія або транскрипція та/або трансляція послідовності, що кодує антиген, вміщена під вплив або контроль послідовності, що експресує ген. Говориться, Га що дві послідовності ДНК оперативно зв'язані, якщо індукція промотору в 5- експресуючій ген послідовності веде до транскрипції послідовності антигену і якщо природа зв'язку між двома послідовностями ДНК (1) не веде і) до введення мутації зсуву рамки зчитування, (2) не втручається в здатність промоторної області управляти транскрипцією послідовності антигену або (3) не втручається в здатність відповідного транскрипта РНК транслюватися в білок. Таким чином, послідовність, що експресує ген, повинна бути оперативно пов'язана з Ге послідовністю нуклеїнової кислоти антигена, якщо послідовність, що експресує ген, здатна впливати на транскрипцію даної послідовності нуклеїнової кислоти антигена таким чином, що одержаний транскрипт юю транслюється в бажаний білок або поліпептид. «--

Нуклеїнова кислота антигена згідно з винаходом може бути доставлена до імунної системи одна або в асоціації з вектором. В найширшому сенсі вектор представляє собою будь-який носій, здатний прискорювати - перенесення нуклеїнової кислоти антигена в клітини імунної системи, так, щоб антиген міг експресуватися і був ч- представлений на поверхні імунної клітини. Вектор звичайно транспортує нуклеїнову кислоту до імунних клітин із зниженою деградацією у порівнянні із ступенем деградації, яка повинна бути у відсутності вектора. Вектор необов'язково включає описану вище послідовність, що експресує ген, для посилення експресії нуклеїнової « кислоти антигену в імунних клітинах. В цілому, вектори, вживані у винаході, включають, але не обмежуються цим, плазміди, фагеміди, віруси, інші носії, що походять з вірусних або бактеріальних джерел, якими можна - с маніпулювати за допомогою вставки або включення послідовностей нуклеїнових кислот антигенів. Вірусні ц вектори є переважним типом векторів і включають, але не обмежуються цим, послідовності нуклеїнових кислот з "» наступних вірусів: ретровірусу, такого як вірус лейкозу мишей Моіопеу, вірус саркоми мишей Нагуеу, вірус пухлини молочної залози мишей і вірус саркоми Рауса; аденовірусу, адено-асоційованого вірусу; вірусів типу

ЗМ40; вірусів поліоми; вірусів Епштейна-Барр; вірусів папіломи; вірусу герпеса; вірусу вакцинації; вірусу -І віспи корів; поліовірусу; і РНК-ових вірусів, таких як ретровірусє. Кожний з легкістю може застосовувати інші вектори, не названі, але відомі в даній області техніки.

Переважні вірусні вектори засновані на нецитопатичних еукаріотних вірусах, в яких неїістотні гени замінені - на ген, що цікавить. Нецитопатичні віруси включають ретровіруси, життєвий цикл яких включає зворотну транскрипцію геномної вірусної РНК в ДНК з подальшою провіральною інтеграцією, в клітинну ДНК хазяїна. і-й Ретровіруси схвалені для випробувань при генній терапії людини. Найбільш корисними є ті ретровіруси, які є

ІЗ дефіцитними за реплікацією (тобто здатні управляти синтезом бажаних білків, але не здатні виробляти інфекційні частинки). Такі генетично змінені ретровірусні експресійні вектори характеризуються загальною застосовністю для високоефективної трансдукції генів іп мімо. Стандартні прописи одержання дефіцитних за реплікацією ретровірусів (включаючи стадії включення екзогенного генетичного матеріалу в плазміду, трансфекції плазмідою, що упаковує лінії клітин, продукції рекомбінантних ретровірусів упаковувальною лінією о клітин, відбору вірусних частинок з тканинного культурального середовища та інфікування клітин-мішеней ко вірусними частинками) представлені |в Кгіедіег, М., Сепе Тгапеїег апа Ехргеззіоп, І арбогаїгу Мапиа! МУ. Н.

Егеетап СО., Мем Могк (1990) і Мипту, Е.)У. Меїйодз іп Моїесшаг Віоіоду, моЇ. 7, Нитапа Ргевзв, Іпс., 6о Стоп, Мем дегзеу (1991))|.

Переважним вірусом для певних застосувань є адено-асоційований вірус, вірус з двоспіральною ДНК.

Адено-асоційований вірус може бути конструйований у вигляді дефіцитного відносно реплікації і здатного до інфікування широкого діапазону клітинних типів і видів. Він має додаткові переваги, такі як стабільність відносно нагрівання і ліпідних розчинників; висока частота трансдукції в клітинах різноманітних ліній, 65 Включаючи гемопоетичні клітини; і відсутність гальмування при суперінфікуванні, що дозволяє проводити множинні серії трансдукції. За повідомленнями адено-асоційований вірус може інтегруватися в клітинну ДНК -БО0-

людини сайт-специфічним способом, що мінімізує можливість мутагенезу при вставках і варіабельність вставлених характеристик ретровірусних інфекцій, що експресують ген. Крім того, інфекції, адено-асоційованим вірусом дикого типу, проводили в тканинних культурах більше, ніж через 100 пасажів у відсутності селекційної дії що має на увазі що геномна інтеграція адено-асоційованого вірусу є досить стабільною.

Адено-асоційований вірус може також функціонувати екстрахромосомним способом.

Інші вектори включають плазмідні вектори. Плазмідні вектори широко описані в даній області техніки і добре відомі фахівцям. Дивися, |наприклад, Затбгоок еї а!., МоїІесшціаг Сіопіпд: І арогаїгу Мапиаї, Зесопа

Еайоп, Соїй Зргіпд Нагрог І арогаїогу Ргезз, 1989). В останні декілька років було знайдено, що плазмідні /о вектори особливо вигідні для доставки генів до клітин іп мімо через їх здатність в них реплікуватися і інтегруватися в геном хазяїна. Дані плазміди, проте, маючи промотор, порівнянний з клітиною-хазяїном, можуть експресувати пептид з гена, оперативно кодованого в плазміді. Деякі звичайно вживані плазміди включають рвКкз322, рОсС18, руОсС19, рКС/СММ, 5М40 і рВіпезсгірі. Інші плазміди добре відомі фахівцям в даній області техніки. Крім того, плазміди можуть бути спроектовані за замовленням із застосуванням рестрикційних /5 ферментів і реакцій лігування для видалення і додавання конкретних фрагментів ДНК.

Нещодавно було відкрито, що плазміди, які несуть гени, можуть бути доставлені в імунну систему із застосуванням бактерій. Модифіковані форми бактерій, таких як ЗаІтопеїйа, можуть бути трансфіковані плазмідою і застосовані як носії для доставки. Бактеріальні системи доставки можна вводити суб'єкту-хазяїну перорально або за допомогою інших способів введення. Бактерії доставляють плазміду до імунних клітин, 2о наприклад, В-клітин, дендритних клітин, ймовірно, проходячи через бар'єр шлунково-кишкового тракту. При застосуванні даної методології виявлені високі рівні імунного захисту. Такі способи доставки корисні для варіантив винаходу, що застосовують системну доставку антигену, імуностимулюючої нуклеїнової кислоти та/або іншого терапевтичного агента.

Таким чином, імуностимулюючі нуклеїнові кислоти корисні як ад'юванти вакцин. Раніше було встановлено, що сч дов Сро-олігонуклеотиди є чудовими ад'ювантами вакцин. Було також показано, проте, що Сро ОДН, які є чудовими адювантами вакцин у мишей, не є переважними ад'ювантами у тварин, що не є гризунами. Для того, щоб і) ідентифікувати найкращі імуностимулюючі нуклеїнові кислоти для застосування як ад'юванта вакцин у людини і інших тварин, що не є гризунами, був проведений скринінг різних нуклеїнових кислот іп мімо для даної цілі.

Було розроблено декілька тестів іп міго для мишей для прогнозу їх цінності як ад'ювантної активності у мишей с зо іп мімо. Під час проведення даного дослідження був ідентифікований тест іп міго для прогнозу їх ефективності іп мімо. Достатньо несподівано було відкрито, що активація як В-клітин, так і МК-клітин особливо добре що) корелювала із здатністю імуностимулюючої нуклеїнової кислоти збільшувати імунну відповідь проти антигену іп п мімо.

Добрий ступінь прогнозу активації В-клітин за активністю ад'юванта вакцини іп мімо найбільш ймовірно ї- пов'язаний з центральною роллю В-клітин в організації специфічної імунної відповіді. Поліклональна ї- проліферація В-клітин (індукована імуностимулюючими нуклеїновими кислотами) збільшує вірогідність появи поєднання антиген-специфічних В-клітин/І-хелперних клітин. Більш того, збільшена експресія ко-стимулюючої молекули СО 86 на В-клітинах, що піддалися поліклональній експансії, активує антиген-специфічні Т-хелперні клітини. В-клітини у відповідь на імуностимулюючі нуклеїнові кислоти збільшують також свою експресію СО40, « поліпшуючи здатність активованих Т-хелперних клітин, що експресують СО40Ї, стимулювати В-клітини. Ше) с Збільшений синтез ІСАМ-1 на В-клітинах спріяє міжклітинним контактам. Таким чином, статус активності В-клітин грає вирішальну роль при ініціації специфічної відповіді антитіл. ;» Внесок активності МК-клітин в утворення специфічних антитіл виявився, проте, несподіваним. МК-клітини є частиною природної імунної системи і залучені як такі в передову лінію захисту від патогенів. Найбільш ймовірно, що патерн цитокінів, продукованих МК-клітинами при активації, тісно пов'язаний з ініціацією -І специфічної імунної відповіді. Таким чином, в одному варіанти винахід відноситься до способу ідентифікації ад'юванта за допомогою визначення активації МК-клітин. Тестування активації МК-клітин може бути проведено як - описано нижче в прикладах або із застосуванням інших відомих способів визначення активності МК-клітин. - Переважно, проте, щоб застосовувалася змішана популяція клітин, така як РВМС, через вірогідність того, що 5р активація МК-клітин є непрямим ефектом. Тестування корисно переважно для ідентифікації імуностимулюючих о нуклеїнових кислот, які придатні як ад'юванти у людини і інших тварин, що не є гризунами.

Ге Було також встановлено, що важливим у прогнозі активності ад'юванта іп мімо є індукція цитокінів. Хоча чутливість до ендотоксинів первинних моноцитів у людини на 2 порядки вище, ніж у миші, вимагається, проте, деяка обережність для уникнення забруднення ендотоксинами імуностимулюючих нуклеїнових кислот, вживаних дв для тестів в системах людини |Нагтапп б., апа Кпед А.М 1999. бепе Тпегару 6:893). Оскільки ТМЕ-сс, ІЛ-6 ї

ІЛ-12 продукуються моноцитами людини у відповідь навіть на низьку кількість ендотоксину, їх цінність для (Ф) тестів високоефективного скринінгу іп міго обмежена. З іншого боку, В-клітини і МК-клітини людини піддаються ка тільки мінорній активації ендотоксином і, таким чином, набагато більш корисні для тестування імуностимулюючої активності. во Стимуляція клітинної функції або МК, або В-клітин (тобто літичної активності, проліферації) вимагає більш сильної імуностимулюючої нуклеїнової кислоти, ніж індукція на їх поверхні маркерів активації (СО69, СО86).

Для обох клітинних типів застосування маркерів активації клітинної поверхні показало більш високий неспецифічний фон, обумовлений фосфортіоатним остовом, у порівнянні з функціональними тестами. Така висока чутливість маркерів поверхні вимагає застосування низьких концентрацій імуностимулюючих нуклеїнових б5 КИСЛОТ для оптимальної дискримінації активності між імуностимулюючими нуклеїновими кислотами з схожою активністю. Таким чином, застосування маркерів поверхні дає можливість порівнювати імуностимулюючі нуклеїнові кислоти із слабою активністю, тоді як функціональні тести переважні для порівняння імуностимулюючих нуклеїнових кислот з високою активністю. Слід зазначити, що оптимальні концентрації імуностимулюючих нуклеїнових кислот для стимуляції В-клітин і МК-клітин розрізняються. Тоді як концентрація в

О,бмкг/мл ОДН вже максимальна для стимуляції В-клітин, оптимальна активація МК-клітин може вимагати бмкг/мл ОДН. Як активацію В-клітин, так і функціональну активність МК-клітин виміряли з свіжовиділеними РВМС.

Раніше було знайдено, що високоочищені первинні В-клітини людини активуються за допомогою Сро-днКк.

Існування прямого ефекту СроО-ДНК на МК-клітини менш очевидно і в Сро-індуковану функціональну активність

МК-клітин може вносити внесок вторинний механізм, опосередкований іншим типом клітин в межах РВСМ. 70 Нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можна вводити суб'єкту з антимікробним агентом. Вживаний тут термін "антимікробний агент" відноситься до існуючої в природі або синтетичної сполуки, яка здатна знищувати інфекційні мікроорганізми або інгібувати їх дію. Тип антимікробного агента, корисного відповідно до винаходу, повинен залежати від типу мікроорганізму, яким суб'єкт інфікований або ризикує інфікуватися. Антимікробні агенти включають, але не обмежуються цим, антибактеріальні агенти, противірусні агенти, протигрибкові агенти /5 | антипаразитарні агенти. Такі вирази, як "антиінфекційний агент", "антибактеріальний агент", "противірусний агент", "протигрибковий агент", "антипаразитарний агент" і "агент, що руйнує паразитів", є добре відомими для фахівців в даній області техніки і визначені в стандартному медичному керівництві. Коротко антимікробні агенти знищують бактерії або інгібують їх активність і включають антибіотики, також як і інші синтетичні або природні сполуки, що мають схожі функції. Антибіотики є молекулами з низькою молекулярною масою, які продукуються як повторні метаболіти такими клітинами, як мікроорганізми. Загалом, антибіотики втручаються в одну або більшу бактеріальних функцій або структур, які специфічні для мікроорганізму і які не присутні в клітинах хазяїна. Противірусні агенти можуть бути виділені з природних джерел або синтезовані і є корисними для знищення вірусів або інгібування їх активності. Протигрибкові агенти застосовують для лікування поверхневих грибкових інфекцій, а також інфекцій, що викликаються умовно-патогенними грибами, і первинних сч об системних грибкових інфекцій, протипаразитарні агенти знищують паразитів або інгібують їх активність.

Приклади антипаразитарних агентів, що також позначаються як агенти, що руйнують паразитів, застосовних і) для введення людині, включають, але не обмежуються цим, албендазол, амфотеріцин В, бензнідазол, бітіонол, хлороквін, НСІ, хлороквін фосфат, кліндаміцин, дегідроеметин, діетилкарбамазин, ділоксанід, фуранкарбонової кислоти, ефлорнітин, фуразолідаон, глюкокортикоїди, галофантрин, йодогідрохінон, івермектин, мебендазол, с зо мефлохін, меглумін, антимоніат, меларсопрол, метріфонат, метронідазол, ніклозамід, ніфуртимокс, оксамніхін, паромоміцин, пентамідин, ізотіонат, піперазин, празихантел, прімахін фосфат, прогуаніл, пірантель памоат, о піриметанмін-сульфонаміди, піриметанмін-сульфадоксини, хінакрин НСЇ, хінін сульфат, хінідин глюконат, "пе спіраміцин, стибоглюконат натрію (глюкуронат натрію-сурми), сурамін, тетрациклін, доксициклін, тіабендазол, тинідазол, триметроприм-сульфаметооксазол і трипарсамід, деякі з яких застосовуються окремо або в поєднанні - з іншими. ї-

Агенти, що руйнують паразитів, вживані у суб'єктів, що не є людиною, включають піперазин, діетилкарбамазин, тіабендазол, фенбендазол, албендазол, оксфендазол, оксибендазл, фебантел, левамізол, пірантел тартрат, пірантел памоат, дихлорвоз, івермектин, дорамектик, мілбеміцин оксим, іприномектин, моксидектин, хлорид н-бутилу, толуол, тіацетарсемідна натрієва сіль гігроміцину В, меларсомін, празиквантел, « епсипрантел, бенімідазоли, такі як фенбендазол, албендазол, оксфендазол, клорсулон, албендзол, ампроліум; /- с декохінат, ласалоїд, сульфадиметоксин; сульфаметазин, сульфахіноксалін, метронідазол. . Агенти, що руйнують паразитів, вживані у коней, включають мебендазол, оксфендазол, фебантел, пірантел, и? дихлорвоз, трихлорфон, івермектин, піперазин; для 5. уевзіегі: івермектин бензимідазоли, такі як тіабендазол, камбендазол, оксибендазол і фенбендазол. Корисні агенти, що руйнують паразитів, вживані у собак, включають мілбеміцин оксин, івермектин, пірантел памоат і поєднання івермектину і пірантелу. Лікування паразитів у -І свиней може включати застосування левамізолу, піперазину, пірантелу, тіабендазолу, дихлорвозу і фенбендазолу. У овець і кіз протигельмінтні агенти включають левамізол або івермектин. Капарсолат

Ш- продемонстрував деяку ефективність при лікуванні 0. іттійз (гельмінта, паразитуючого в серці) у кішок. - Антибактеріальні агенти знищують або інгібують зростання або функції у бактерій. Великим класом антибактеріальних агентів є антибіотики. Антибіотики, які ефективні відносно знищення або інгібування о активності широкого діапазону бактерій, відносяться до широкого спектру антибіотиків. Інші типи антибіотиків

Ге ефективні переважно проти бактерій класу грам-позитивних або грам-негативних. Дані типи антибіотиків відносяться до вузького спектру антибіотиків. Інші типи антибіотиків, які ефективні проти одного організму або захворювання і не направлені проти інших типів бактерій, відносяться до обмеженого спектру антибіотиків.

Антибактеріальні агенти іноді класифікують на основі їх первинного способу дії. В цілому, антибактеріальні агенти є інгібіторами синтезу клітинної стіни, інгібіторами клітинних мембран, інгібіторами синтезу білка,

Ф) інгібіторами синтезу нуклеїнових кислот або інгібіторами функцій і конкурентними інгібіторами. ка Антибактеріальні агенти, вживані у винаході, включають, але не обмежуються цим, природні пеніциліни, напівсинтетичні пеніциліни, клавуланову кислоту, цефалолспорини, біцитрацин, ампіцилін, карбеніцилін, бо оксацилін, азлоцилін, мезлоцилін, піперацилін, метицилін, циклоксацилін, нафцилін, цефалотин, цефапірин, цефалексин, цефандол, цефаклор, цефазолін, цефуроксин, цефокситин, цефотаксим, цефсулодин, цефетамет, цефиксим, цефтриаксон, цефоперазон, цефтазидин, моксалактам, карбапенеми, іміпенеми, монобактеми, еузтреонам, ванкоміцин, поліміксин, амфотеріцин В, ністатин, імідазоли, клодержазол, міконазол, кетоконазол, ітраконазол, флуконазол, ріфампіни, етамбутол, тетрациклін, хлорамфенікол, макроліди, аміноглікозиди, 65 стрептоміцин, канаміцин, тобраміцин, амікацин, гентаміцин, тетрациклін, миноциклін, доксициклін, хлортетрациклін, еритроміцин, рокситроміцин, кларітроміцин, олеандоміцин, азитроміцин, хлораміфенікол,

хінолони, ко-тримоксазол, норфлоксацин, ципрофлоксацин, еноксацин, налідиксинова кислота, темафлоксацин, сульфонаміди, гантрисин, триметоприм; ацедапсон; ацетосульфон натрію; аламецин; алексидин; амдиноцилін; амідиноциліну пивоксил; аміциклін; аміфлоксацин; аміфлоксацину мезилат, амікацин; амікацину сульфат; аміносаліцилову кислоту; аміносаліцилат натрію; амоксицилін; амфоміцин; ампіцилін; аміпіциліну натрієву сіль; апалцилін; апалциліну натрієву сіль; апраміцин; аспартоцин; астроміцину сульфат; авіламіцин; авопарцин; азитроміцин; азлоцилін; азлоциліну натрієву сіль; бакампіциліна гідрохлорид; бацитрацин; метилендисаліцилат бацитрацину; бацитрацин-цинк; бамберміцини; бензоїлпас кальцію; беритроміцин; бетаміцину сульфат; біапенем; бініраміцин; біфенаміну гідрохлорид; біспіритіону максульфекс; бутикацин; бутиросину сульфат; /о Капреоміцину сульфат; карбадокс; карбеніциліну двонатрієву сіль; карбеніциліну інданілнатрій; карбенициліну фенілнатрій; карбеніциліну калієву сіль; карумонаму натрієву сіль; цефаклор; цефадроксил; цефамандол; цефамандолу нітрат; цефамандолу натрієву сіль; цефапарол; цефатризин; цефазафлуру натрієву сіль; цефазолін; цефазоліну натрієву сіль; цефбуперазон; цефдирін; цефепім; цефепіму гідрохлорид; цефетекол; цефіксим; цефменоксиму гідрохлорид; цефметазол; цефметазолу натрієву сіль; цефоніциду однозаміщену /5 Натрієву сіль; цефоніциду натрієву сіль; цефоперазону натрієву сіль; цефоранід; цефотаксиму натрієву сіль; цефотетан; цефотетану двонатрієву сіль; цефотіаму гідрохлорид; цефокситин; цефокситину натрієву сіль; цефпімізол; цефпімізолу натрієву сіль; цефпірмід; цефпіраміду натрієву сіль; цефпірому сульфат; цефподоксиму проксетил; цефпрозил; цефроксадин; цефсулодину натрієву сіль; цефтазидим; цефтибутен; цефтизоксиму натрієву сіль; цефтриаксону натрієву сіль; цефуроксим; цефуроксиму окситил; цефуроксиму півоксетил; 2о цефуроксиму натрієву сіль; цефацетрилу натрієву сіль; цефалексин; цефалексину гідрохлорид; цефалогліцин; цефалорідин; цефалотину натрієву сіль; цефапірину натрієву сіль; цефрадин; цетоцикліну гідрохлорид; цетофенікол; хлорамфенікол; хлорамфеніколу пальмітат; хлорамфенікол-пантотенатний комплекс; хлорамфенікол сукцинат натрію; хлоргексидину фосфанілат; хлороксиленол; хлортетрацикліну бісульфат; хлортетрацикліну гідрохлорид; циноксацин; ципрофлоксацин; ципрофлоксацину гідрохлорид; циролеміцин; с ов Кларітроміцин; клінафлоксацину гідрохлорид; кліндаміцин; кліндаміцину гідрохлорид; кліндаміцину пальмітат гідрохлорид; кліндаміцину фосфат; клофазимін; клоксациліну бензатин; клоксациліну натрієву сіль; клоксихін; і) колістиметату натрієву сіль; коліситину сульфат; коумерміцин; коумерміцину натрієву сіль; циклацилін; циклосерин; далфопристин; дапсон; даптоміцин; демеклоцилін; демеклоциліну гідрохлорид; демециклін; денофунгін; діаверидин; диклоксацилін; диклоксациліну натрієву сіль; дигідрострептоміцину сульфат; су зо дипіритіон; дирітроміцин; доксициклін; доксицикліну кальцієва сіль; доксициклін фосфатекс; доксициклін гіклат; дроксацину натрієву сіль; еноксацин; епіцилін; епітетрацикліну гідрохлорид; еритроміцин; еритроміцин о ацистрат; еритроміцин естолат; еритроміцин етилсукцинат; еритроміцин глуцептат; еритроміцин лактобіонат; -" п еритроміцину пропіонат; еритроміцину стеарат; етамбутолу гідрохлорид; етіонамід; флероксацин; флоксацилін; флудаланін; флумехін; фосфоміцин; фосфоміцин трометамін; фумоксицилін; фуразолію хлорид; фуразолію ї- зв тартрат; фусидату натрієву сіль; фусидова кислота; гентаміцину сульфат; глоксимонам; граміцидин; галопрогін; ї- гетацилін; гетациліну калієву сіль; гекседин; ібафлоксацин; іміпенем; ізоконазол; ізепаміцин; ізоніазид; жозаміцин; канаміцину сульфат; кітазаміцин; левофуралтадон; левопропілциліну натрієву сіль; лекситроміцин; линкоміцин; лінкоміцину гідрохлорид; ломефлоксацин; ломефлоксацину гідрохлорид; ломефлоксацину мезилат; лоракарбеф; мафенід; меклоциклін; меклоцикліну сульфосаліцилат; мегаломіцин фосфат калію; мехідокс; « Меропенем; метациклін; метацикліну гідрохлорид; метенамін; метенаміну гіпурат; метенаміну манделат; Ше с метициліну натрієву сіль; метіоприм; метронідазолу гідрохлорид; метронідазолу фосфат; мезлоцилін; мезлоциліну натрієву сіль; міноциклін; міноцикліну гідрохлорид; міринкаміцину гідрохлорид; моненсин; ;» моненсину натрієву сіль; нафциліну натрієву сіль; налідиксату натрієву сіль; налідиксову кислоту; натаміцин; небраміцин; неоміцину пальмітат; неоміцину сульфат; неоміцину ундециленат; нетилміцину сульфат;

Неутраміцин; ніфураден; ніфуралдезон; ніфурател; ніфуратрон; ніфурдазил; ніфуримід; ніфурпіринол; -І ніфурхіназол; ніфуртіазол; нітроциклін; нітрофурантоїн; нітромід; норфлоксацин; новобіоцину натрієву сіль; офлоксацин; орметоприм; оксациліну натрієву сіль; оксимонам; оксимонаму натрієву сіль; оксолінова кислота;

Ш- окситетрациклін; окситетрацикліну кальцієва сіль; окситетрацикліну гідрохлорид; палмідицин; парахлорфенол; - пауломіцин; пефлоксацин; пефлоксацину мезилат; пенамецилін; Пеніциліну з бензатин; Пеніциліну С калієва 5о біль; Пеніцилін З прокаїн; Пеніцилін С натрієву сіль; Пеніциліну. М бензатин; Пеніциліну М гідрабамін; о Пеніциліну М калієва сіль; пентизидону натрієву сіль; феніламіносаліцилат; піперациліну натрієву сіль;

Ге пірбеніциліну натрієву сіль; піридициліну натрієву сіль; пірлиміцину гідрохлорид; піваміпіциліну гідрохлорид; піваміпіциліну памаоат; піваміпіциліну пробенат; поліміксину В сульфат; порфіроміцин; пропікацин; піразинамід; піритіон-цинк; хіндекаміну ацетат; хінупристин; рацефенікол; рамопланін; раніміцин; реломіцин; репроміцин; ріфабутин; ріфаметан; ріфамексил; ріфамід; ріфампін; ріфапентин; ріфаксимін; ролітетрациклін; ролітетрацикліну нітрат; розараміцин; розараміцину бутират; розараміцину пропіонат; розараміцин фосфат (Ф, натрію; розараміцину стеарат; розоксацин; роксарзон; рокситроміцин; санциклін; санфетринему натрієву сіль; ка сармоксицилін; сарпіцилін; скопафунгін; сизоміцин; сизоміцину сульфат; спарфлоксацин; спектиноміцину гідрохлорид; спіраміцин; сталіміцину гідрохлорид; стефіміцин; стрептоміцину сульфат; стрептонікозид; во сульфабенз; сульфабензамід; сульфацетамід; сульфацетаміду натрієву сіль; сульфацитин; сульфадіазин; сульфадіазину натрієву сіль; сульфодоксин; сульфален; сульфамеразин; сулфаметер; сульфаметазин; сульфаметизол; сульфаметоксазол; сульфамонометоксин; сульфамоксол; сульфанілат-цинк; сульфанітран; сульфасалазин; сульфазомізол; сульфатіазол; сульфазамет; сульфізоксазол; ацетилсульфізоксазол; сульфізоксазолдіоламін; сульфоміксин; сулопенем; султаміцилін; сунциліну натрієву сіль; талампіциліну 65 гідрохлорид; тейкопланін; темафлоксацину гідрохлорид; темоцилін; тетрациклін; тетрацикліну гідрохлорид; тетрациклін-фосфатний комплекс; тетроксоприм; тіамфенікол; тіфенциліну калієву сіль; тикарцилін крезилнатрій;

тикарциліну двонатрієву сіль; тикарциліну однозаміщену натрієву сіль; тиклатон; тіодонію хлорид; тобраміцин; тобраміцину сульфат; тосульфоксацин; триметоприм; триметоприму сульфат; трисульфапіримідини; тролеандоміцин; троспектоміцину сульфат; тиротрицин; ванкоміцищ ванкоміцину гідрохлорид; віргініаміцин і зорбаміцин.

Противірусні агенти є сполуками, які запобігають інфікуванню клітин вірусами або реплікацію вірусів в клітині. Існує набагато менше противірусних ліків у порівнянні з антибактеріальними ліками, оскільки процес реплікації вірусів настільки тісно пов'язаний з реплікацією ДНК в клітині хазяїна, що неспецифічні антивірусні агенти часто можуть бути токсичними для хазяїна. Існує декілька стадій процесу інфікування 7/о Вірусом, які можуть бути блоковані або інгібовані за допомогою антивірусних агентів. Дані стадії включають прикріплення вірусу до клітини хазяїна (імуноглобуліни або зв'язуючі пептиди), декапсидацію вірусу (наприклад, амантадин), синтез або трансляцію вірусної мРНК (наприклад, інтерферон), реплікацію вірусних РНК або ДНК (наприклад, аналоги нуклеозидів), дозрівання нових вірусних білків (наприклад, інгібітори протеаз) і активну реплікацію вірусу і вивільняється вірусу.

Нуклеотидні аналоги представляють собою синтетичні сполуки, які схожі з нуклеотидами, але які мають неповну або незвичайну дезоксирибозну або рибозну групу. Як тільки нуклеотидні аналоги поступають в клітину, вони фосфорилюються з одержанням трифосфатних форм, які конкурують з нормальними нуклеотидами за включення у вірусну ДНК або РНК. Як тільки трифосфатна форма нуклеотидного аналога включається в ланцюг нуклеїнової кислоти, що росте, це викликає необоротну асоціацію з вірусною полімеразою і в результаті цього 2о подовження ланцюга закінчується. Нуклеотидні аналоги включають, але не обмежуються цим, ацикловір (вживаний для лікування інфекцій вірусом простого герпеса і вірусом вітряної віспи) ганцикловір (вживаний для лікування інфекцій цитомегаловірусом), ідоксуридин, рибавірин (вживаний для лікування інфекцій вірусом дихального синцитію), дидезоксіїнозин, дидезоксицитидин і зидовудин (азидотимідин).

Інтерферони є цитокіни, які секретуються клітинами, інфікованими вірусом, а також імунними клітинами. сч ов інтерферони діють в результаті зв'язування із специфічними рецепторами на клітинах, що примикають до інфікованих клітин, викликаючи зміни в клітині, які захищають її від інфікування вірусом, о- і Д-інтерферон також і) індукує експресію молекул МНС класу | і класу І на поверхні інфікованих клітин, що веде до збільшення презентації антигену для пізнавання імунними клітинами хазяїна, о- і р-інтерферони доступні у вигляді рекомбінантних форм і застосовуються для лікування інфекцій при хронічних гепатитах В і С. В дозуваннях, які сі ефективні для противірусної терапії, інтерферони мають важкі побічні ефекти, такі як лихоманка, нездужання і втрата ваги. що

Терапію імуноглобулінами використовують для профілактики вірусної інфекції. Терапія імуноглобулінами -- вірусних інфекцій відрізняється від такої для бактеріальних інфекцій, тому що, будучи швидше специфічною до антигену, терапія імуноглобулінами діє шляхом зв'язування з позаклітинними вірионами і захищає їх від - 3з5 зв'язування з клітинами і проникнення в клітини, які сприйнятливі до вірусної інфекції. Терапія корисна для ч- профілактики вірусної інфекції протягом періоду часу, коли антитіла присутні у хазяїна. В цілому існує два типи терапії імуноглобулінами, терапія імуноглобулінами, присутніми в нормі, і терапія гіперпродукованими імуноглобулінами. При терапії імуноглобулінами, присутніми в нормі, використовується антитільний продукт, « який одержаний із з'єднаної сироватки крові нормальних донорів. Даний з'єднаний продукт містить низькі титри антитіл до широкого спектру вірусіу людини, таких як віруси гепатиту А, парвовірус, ентеровірус (особливо у -д с новонароджених). При терапії гіперпродукованими імуноглобулінами використовують антитіла, які одержують з ц сироватки індивідуумів, які мають високі титри антитіла до конкретного вірусу. Дані антитіла потім "» використовують проти конкретного вірусу. Приклади гіперпродукованих імуноглобулінами включають імуноглобулін опоясуючого лишаю (вживаний для профілактики вітряної віспи у дітей і новонароджених з імунодефіцитом), імуноглобулін сказу людини (вживаний при постконтактній профілактиці суб'єкта, атакованого -І скаженою твариною), імуноглобулін гепатиту В (вживаний при профілактиці зараження вірусом гепатиту В, особливо у суб'єкта що контактував з вірусом) і імуноглобулін К5М (вживаний при лікуванні інфекцій, викликаних вірусом дихального синцитію). - Іншим типом терапії імуноглобулінами є активна Імунізація. Вона включає введення антитіл або фрагментів антитіл проти білків поверхні вірусу. Два типи вакцин, які доступні для активної імунізації відносно гепатиту і-й В, включають в себе ті, що походять з сироватки антитіла гепатиту В, і рекомбінантні антитіла гепатиту В.

ІЗ Обидва одержують з НрзАд. Антитіла вводять у вигляді трьох доз суб'єктам з високим ризиком інфікування вірусом гепатиту В, таким як працівники охорони здоров'я, статеві партнери хронічних носіїв і діти.

Таким чином, противірусні агенти, застосовні у винаході, включають, але не обмежуються цим, імуноглобуліни, амантадин, інтерферон, аналоги нуклеозидів і інгібітори протеаз. Конкретні приклади противірусних засобів включають, але не обмежуються цим, ацеманан; ацикловір; ацикловір натрій; адефовір; і) аловудин; алвірсепт судотокс; амантадин гідрохлорид; аранотин; арилдон; атевірдин; атевірдин мезилат; ко аврідин; цидофовір; ципамфілін; цитарабін гідрохлорид; делавірдин мезилат; десцикловір; диданозин; дисоксарил; едоксудин; енвіраден; енвіроксим; фамцикловір; фамотин гідрохлорид; фіацитабин; фіалуридин; бо фосарилат; фоскарнет натрій; фосфонет натрій; ганцикловір; ганцикловір натрій; ідоксуридин; кетоксал; ламівудин; лобукавір; мемотин гідрохлорид; метисазон; невірапин; пенцикловір; піродавір; рибавірин; римантадин гідрохлорид; сахінавір мезилат; сомантадин гідрохлорид; соривудин; статолон; ставудин; тилорон гідрохлорид; трифлуридин; валацикловір гідрохлорид; видарабін фосфат; видарабін фосфат натрію; віроксим; залцитабін; зидовудин і зинвіроксим. 65 Протигрибкові агенти корисні для лікування і профілактики інфікування грибами. Протигрибкові агенти іноді класифікують за механізмом їх дії. Деякі протигрибкові агенти діють як інгібітори клітинної стіни за -Б4-

допомогою гальмування глюкозосинтази. Вони включають, але не обмежуються цим, базиунгін/ЕСВ. Інші протигрибкові агенти діють шляхом дестабілізації цілісності мембрани. Вони включають, але не обмежуються цим, імідазоли, такі як клодержазол, сертаконзол, флуконазол, ітраконазол, кетоконазол, міконазол і Вориконасол, а також ЕК 463, амфотерицин В, ВАМ 38-9502, МК 991, прадиміцин, ОК 292, бутенафін і тербінафін.

Інші протигрибкові агенти діють шляхом руйнування хітину (наприклад, хітинази) або імуносупрессії (мазь 501).

Деякі приклади наявних у продажу агентів представлені у таблиці В. а

ОРОУОНМ інгібітор синтази глюкози і лІПОСОМНИЙ " лІПОСОМНИЙ сч » о 48) сч зо ю - т зв м міцелекс «

ОоНІХОМІКОЗ 70 Таким чином, протигрибкові агенти, придатні в даному винаході, включають, але не обмежуються цим, не с імідазоли, ЕК 463, амфотеріцин В, ВАМ 38-9502, МК 991, прадиміцин, ОК 292, бутенафін, хітиназу, крем 501, з Акрісорцин, Амбрутицин, Аморолфін, Амфотеріцин В; Азаконазол; Азасерін; Базифунгін; Біфоназол; Біфенаміну гідрохлорид; Біспіритіонін магсуфлекс; Бутоконазолу нітрат; Ундециленат кальцію; Кандицидин; Карбол-фучсин;

Хлордантоїн; Циклопірокс; Циклопірокс оламін; Циклофунгін; Цисконазол; Клотримазол; Куприміксин; -1 Денофунгін; Дипіритіон; Доконазол; Еконазол; Еконазолу нітрат; Енілконазол; Етонаму нітрат; Фентиконазолу нітрат; Філіпін; Флуконазол; Флуцитозин; Фунгіміцин; Грізеофульвін; Гаміцин; Ізоконазол; Утраконазол; -І Калафунгін; Кетоконазол; Ломофунгін; Лідиміцин; Мепатріцин; Міконазол; Міконазолу нітрат; Моненсин; -з Моненсин натрію; Нафтифіну гідрохлорид; Неоміцину ундециленат; Ніфурател; Ніфурмерон; Нітраламіну гідрохлорид; Ністатін; Капрілову кислоту; Орконазолу нітрат; Оксиконазолу нітрат; Оксифунгіну гідрохлорид; с 50 Парконазолу гідрохлорид; Партрицин; Йодний калій; Проклонол; Піритіон-цинк; Піролнітрин; Рутаміцин;

Кз Сангінарій хлористий; Суперконазол; Скопафунгін; Сірчистий селен; Синефунгін; Сульконазолу нітрат;

Тербінафін; Терконазол; Тирам; Тіклатон; Тіоконазол; Толциклат; Толіндат; Толнафтат; Триацетін; Тріафунгін;

Ундециленову кислоту; Віридофульвін; Ундециленат цинку і Зиноконазолу гідрохлорид.

Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти можуть бути з'єднані з іншими терапевтичними агентами, такими як 59 ад'юванти, для посилення імунних відповідей. Імуностимулюючу нуклеїнову кислоту і інший терапевтичний агент

ГФ) можна вводити одночасно або роздільно. Коли інші терапевтичні агенти вводять одночасно, їх можна вводити в т тих же або окремих складах, але вони вводяться в той же час. Інші терапевтичні агенти вводять послідовно один за іншим і з імуностимулюючою нуклеїновою кислотою, коли введення інших терапевтичних агентів та імуностимулюючої нуклеїнової кислоти розділено в часі. Розділення в часі між введенням даних сполук може бо вимірюватися хвилинами або великим терміном. Інші терапевтичні агенти включають, але не обмежуються цим, ад'юванти, цитокіни, антитіла, антигени і т.д.

Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти придатні як ад'юванти для індукції системної імунної відповіді. Тому будь-яка з них може бути введена суб'єкту, експонованому з антигеном, для стимуляції посиленої імунної відповіді на антиген. бо На додаток до імуностимулюючих нуклеїнових кислот, композиції даного винаходу можуть вводитися також з ад'ювантами, відмінними від нуклеїнових кислот. Відмінний від нуклеїнової кислоти ад'ювант представляє собою будь-яку молекулу або сполуку, виключаючи описані тут імуностимулюючі нуклеїнові кислоти, яка може стимулювати гуморальну та/або клітинну імунну відповідь.

Відмінні від нуклеїнової кислоти ад'юванти включають, наприклад, ад'юванти, створюючі ефект депо, імуностимулюючі ад'юванти, ад'юванти, створюючі ефект депо і стимулюючі імунну систему.

Ад'ювант, створюючий ефект депо, застосовують тут як ад'ювант, забезпечуючий повільне вивільнення антигену в організм, що тим самим пролонгує експозицію імунних клітин з антигеном. Даний клас ад'ювантів включає, але не обмежується цим, галун (наприклад, гідроксид алюмінію, фосфат алюмінію); або склади на 7/0 основі емульсії, включаючи мінеральне масло, немінеральне масло, емульсію води в маслі і емульсію масла у воді в маслі, емульсії масла у воді, такі як ряд ад'ювантів Мопіапіде берріс ІЗА (наприклад, Мопіапіде ІЗА 720, Айпідціде, Рагіз, Франція); МЕ-59 (емульсія сквалену у воді, стабілізована Зрап 85 і твін 80; Спігоп

Согрогайоп, Етегумійе, СА; і РКОМАХ (емульсія масла у воді, що містить стабілізуючу поверхнево-активну речовину і утворюючий міцели агент; ІЕС, РпагтасеціїсаІз Согрогайоп, Зап Оіедо, СА).

Імуностимулюючий ад'ювант є адювант, що викликає активацію клітини імунної системи. Він може, наприклад, викликати продукцію і секрецію клітиною цитокінів. Даний клас ад'ювантів включає, але не обмежується цим, сапоніни, очищені з кори дерева 0). Заропагіа, такі як 0521 (гліколіпід, який елююється в 21-му пікі при фракціонуванні ВЕРХ; Адиїйа Віорпагтаасешісав Іпс., УУогсезіег, МА); полі(ди(карбоксилатофенокси)фосфазен (РСРР полімер; Мігиз Кезеагсй Іпвійцшіе, США); похідні ліпополісахаридів, такі як монофосфорилліпід (МРІ; Кірі ІгптпипоСпет Кезеагси, Іпс., Натійоп, МО, мурамілдипептид (МОР; Ківі) і треоніл-мурамілдипептид (-МОР; Ківі); ОМ-174 (глюкозаміндисахарид, пов'язаний з ліпідом А; ОМ РІагта ЗА, Меугіп, Швейцарія); і фактор елонгації І еізптапіа (очищений білок І еізптапіа);

Согіха Согрогайоп, ЗеаШе, УА).

Ад'юванти, створюючі ефект депо і стимулюючі імунну систему, представляють собою такі сполуки, які сч ов ВОЛОДІЮТЬ обома визначеними вище функціями. Даний клас ад'ювантів включає, але не обмежується цим,

ІЗСОМЗ5 (імуностимулюючі комплекси, які містять змішані сапоніни, ліпіди і утворюють частинки розміру вірусів і) з порами, які можуть утримувати антиген; С5І,, Меїрошигпе, Австралія); ЗВ-АБ2 (ЗтіййКіїпе Вееспат ад'ювантна система 2, що є емульсією масла у воді, що містить МРІ і 90521: ЗтййКіїпе Вееспат Віоіодісаів (5ВВІ,

Кіхепзагі, Бельгія); 5В-АБА (ЗтіїйКіїпе Вееспат ад'ювантна система 544, що містить галун і МРІ; 5ВВ, Бельгія); с

Зо Неїонні блок-співполімери, створюючі міцели, такі як СК! 1005 (який містить лінійний ланцюг гідрофобного поліокспропілену, фланкований ланцюгами поліоксіетилену; Махсеї, Іпс., Могсгоз5, (ЗА); і Зупіех Аашмапі о

Еоптиіайоп (ЗАЕР, емульсія масла у воді, що містить твін 80 і неіонний блок-співполімер; Зупіех Спетісаї!в, «-

Іпс., Воцідег, СО).

Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти придатні також як мукозні ад'юванти. Раніше було знайдено, що при ї- мукозній доставці Ср нуклеїнових кислот індукується як системний, так і мукозний імунітет. Індукований у ї- відповідь на Сро нуклеїнові кислоти системний імунітет включав як гуморальну, так і опосередковану клітинами відповідь на специфічні антигени, які самі по собі при нанесенні на слизову були не здатні індукувати системний імунітет. Більш того, СТІ. індукували як Сро нуклеїнові кислоти, так і холерний токсин (СТ, мукозний ад'ювант, індукуючий Тп2-подобну відповідь). Це було дивно, оскільки при системній імунізації присутність «

Тп2-подобних антитіл звичайно пов'язана з відсутністю СТІ. (Зспігтбеск еї а!., 1995). На основі уявлених тут з с результатів очікується, що імуностимулюючі нуклеїнові кислоти повинні діяти схожим чином. Крім того, імуностимулюючі нуклеїнові кислоти індукують відповідь слизової як локально (наприклад, в легенях), так і ;» дистантно (наприклад, в нижній частині травного тракту). Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти індукують значний рівень антитіл ІдА в дистантно розташованих ділянках слизової. СТ звичайно розглядають як високоефективний мукозний ад'ювант. Як повідомлялося раніше (Зпідег 1995), СТ індукує переважно антитіла ізотипу ІДС, які -І служать індикатором відповіді Тп2-типа. Навпаки, імуностимулюючі нуклеїнові кислоти більшою мірою адресуються до Тп1 з переважаючими антитілами ІдсСг2а, особливо після підтримуючої імунізації або при - поєднанні двох ад'ювантів. Антитіла Тп1-типу в цілому володіють кращою нейтралізуючою активністю, і, отже, - відповідь ТП2 в легенях вкрай небажана, оскільки вона асоційована з астмою (Кау, 1996, Нодао, 1997). Таким чином, застосування імуностимулюючих нуклеїнових кислот має переваги, які недосяжні для інших мукозних 1 ад'ювантів. Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти згідно з винаходом придатні також як мукозні ад'юванти для

Ге індукції як системної, так і мукозної імунної відповіді.

Мукозні ад'юванти, що позначаються як мукозні ад'юванти, відмінні від нуклеїнових кислот, можуть також вводитися разом з імуностимулюючими нуклеїновими кислотами. Вживаний тут відмінний від нуклеїнових кислот мукозний ад'ювант є ад'ювант, відмінний від імуностимулюючої нуклеїнової кислоти, який здатний індукувати мукозну імунну відповідь у суб'єкта при нанесенні на поверхню слізистої разом з антигеном. Мукозні ад'юванти (Ф) включають, але не обмежуються цим, бактеріальні токсини, наприклад, холерний токсин (СТ), похідні СТ, ка включаючі, але не обмежені цим, субодиницю В СТ (СТВ) (Ми еї аї., 1998, Тоспікибо еї аї,, 1998); СТО53З (Маї на Авр) |Бопіапа еї аї., 1995); СТКУ7 (МаїЇ на І ув) (Ропіапа еї аї., 1995); СТК104 (Туг на Гув) |(Бопіапа еї во аї. 19951; СТО53/К63 (Ма на Авр, Зег на Гуз) |Ропіапа еї аї., 1995); СтТН5Ба (Агу на Ніз) |(Ропіапа еї! аї., 1995); СТМ107 (Ніз на Азп) |Ропіапа еї аї., 1995); СТЕ114 (бег на Сім) (Ропіапа еї аї, 1995); СТЕ112К (Сім на

Їув) (Мататоїйо еї аї., 1997а); СТ561Е (Зег на Рпе) |ататоїйо еї аіІ., 1997а, 19978); СТ5106 (Рго на (ув),

ІОоисе еї аї., 1997, Ропіапа еї аїЇ., 1995); і СТКбЗ (бЗег на І ув) |Ооисе еї аїЇ, 1997, Ропіапа еї аї., 1995), токсин 7опшца оссіцдепе 20ї, термолабільний ентеротоксин ЕзспПегіспіа соїї, лабільний токсин (ІТ), похідні /Т 65 Включаючи, але не обмежуючись цим, субодиницю В ІТ (І ТВ), |Мегмеї| еї а!., 19981; ГТ7К (Аго на Гуз) |Котазе еї аі., 1998, Юоисе еї аї., 1995); ГТ61Е (бЗег на Ріпє) (Котавзе еїаї., 1998); ГТ112К (Сім на І ув) (Котазе еї -58в-

аІ., 1998); І Т118Е (Су на Сім) (Котавзе еї аї., 1998); І Т146Е (Агд на Сім) (Котавзе еї аї!., 1998); 711925 (Ага на Су) І(Котазе еї аї., 1998); ІТКб3 (бег на уз) І(Магспейці еї аїЇ., 1998, Юоисе еї аї., 1997, 1998, бі

Тоттазо еї аї., 19961; і ЇТКк72 (Аїа на Ага), |Сішіапі еї аЇ,, 1998), коклюшний токсин, РТ. (УусКе еї аї., 1992, Зрапдієг ВО, 1992, Егеуїад апа Іеттепів, 1999, Кобегів еї аЇ, 1995, УМівоп еї аї., 1995), включаючи

РТ-9К/12905 |Кобегіз еї аЇ, 1995, Сторіеу еї аїЇ.,, 1995); похідні токсину (дивися нижче) |НоіІтодгеп еї аї., 1993, Мегмеї| еї аЇ.,, 1998, Карриоїї еї аіЇ., 1995, Ргеуїад апа СіІетепів, 1999); похідні ліпіду А (наприклад, монофосфорильований ліпід, МРІ) ІЗазакі еї аї., 1998, Мапсой еї аї., 1998); похідні мурамілдипептиду (МОР) (Гокизпіта еї аІ.,, 1996, Одамжа еї аїЇ., 1989, Міснаек еї аї., 1983, Могізакі еї аїЇ., 19831; білки зовнішньої 70 мембрани бактерій (наприклад, білок А зовнішньої поверхні (ОзрА) ліпопротеїн Воїтеїйа Бигоддогпегі, білок зовнішньої мембрани Меїіззегіа тепіпойаів) (Магіпаго еї аіІ., 1999, Мап де Мегу еї аї., 1996); емульсії масла у воді (наприклад, МЕ59) (|Вагсийей еї аїЇ.,, 1999, Мегвепоог еї аіІ., 1999, О'Надап, 1998); солі алюмінію вака еї аїЇ., 1998, 1999); і сапоніни (наприклад, 0521) Аадцйа ВіорпагтасецшіісаІв, Іпс., МУУогеїег, МА)

Ізазакі еї аї., 1998, Масмеаї| еї аї., 1998), ІЗСОМ5, МЕ-59 (емульсія сквалену у воді, стабілізована Зрап 85 і 7/5 тВін 80; Спігоп Согроганоп, Етегумійе, СА); серія Зерріс ІЗА ад'ювантів Мопіапіде (наприклад, Мопіапіде ІЗА 720; Аїгі ідціде, Рагіз, Франція); РКОМАХ (емульсія масла у воді, що містить стабілізуючу поверхнево-активну речовину і утворюючий міцели агент; ІОЕС РНагтасеціїсаіє Согрогайоп, Зап Оіедо, СА); ад'ювантний склад

Зупіехі (ЗАЕ; Зупіех Спетісаї!5, Іпс., Воцідег, СО); полііди(карбоксилатфенокси)фосфазен (РСРР полімер; Мігиз

Кезеагсі Іпвійше, О5А) і фактор елонгації І еїізптапіа (Согіха Согрогайоп, Зеаше, МА).

Імунні відповіді також можуть бути індуковані або посилені шляхом сумісного з імуностимулюючими нуклеїновими кислотами введення або паралельної експресії цитокінів |Виеіег 8: Миїйїдап, 1996; Спом еї аї, 1997; СеїіззвіІег еї аії, 1997; Імазакі еї аїЇ., 1997; Кігп еї аІ., 1997) або костимулюючих молекул В-7 (м/азакі еї а!., 1997; Твції еї аі. 1997). Цитокіни можна вводити прямо з імуностимулюючими нуклеїновими кислотами або у вигляді вектора нуклеїнової кислоти, що кодує цитокін, внаслідок чого цитокін може бути експресований іп сч ов Ммо. В одному здійсненні цитокін вводять у формі плазмідного експресійного вектора. Термін "цитокін" застосовується тут як родового найменування для неоднорідної групи розчинних білків і пептидів, діючих як і) гуморальні регулятори в концентраціях від нано- до пікомолярних, і які в нормальних або патологічних ситуаціях модулюють функціональну активність окремих клітин і тканин. Дані білки також прямо опосередковують взаємодії між клітинами і регулюють процеси, які відбуваються у позаклітинному оточенні. с зо Приклади цитокінів включають, але не обмежуються цим, ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-4 ІЛ-Б5, ІЛ-б6, ІЛ-7, ІЛ-10, ІЛ-12, ІЛ-15,

ІЛ-18, колонієстимулюючий фактор гранулоцитів-макрофагів (ЗМ-С5ЗЕ) колонієстимулюючий фактор о гранулоцитів (5-СЗЕ), інтерферон-у (ІЕМ), ІРМ-о, фактор некрозу пухлин (ТМЕ), ТОР-ВД ліганд РІТ-З і ліганд (де сра40.

Цитокіни грають важливу роль у спрямованості Т-клітинної відповіді. Хелперні Т-клітини (СО4к) - організовують імунну відповідь ссавців за допомогою утворення розчинних факторів, які діють на інші клітини ї- імунної системи, включаючи інші Т-клітини. Велика частина зрілих СО4- хелперних Т-клітин експресує один з двох профілів цитокінів: ТИ7 або Тп2. Підгрупа ТАИ1 стимулює гиперчутливість сповільненого типу, клітинний імунітет і перемикання на імуноглобуліни класу ІдсС оса. Підгрупа Тп2 індукує гуморальний імунітет шляхом активації В-клітин, стимуляції утворення антитіл і індукції перемикання на утворення ІдсС 4 і ІДЕ. В деяких «

Здійсненнях переважно, щоб цитокін представляв собою цитокін ТН1. шщ с Нуклеїнові кислоти придатні також для перемикання спрямованості імунної відповіді з ТН2 імунної відповіді й на ТА1 імунну відповідь. Переорієнтацію імунної відповіді з ТИ2 на ТИ1 імунну відповідь можна визначити «» шляхом вимірювання рівня цитокінів, продукованих у відповідь на нуклеїнову кислоту (наприклад, шляхом індукції продукції цитокінів ТАТ, включаючи ІЛ-12, ІРМ-у і М-СЗЕ, моноцитами і іншими клітинами). Перемикання спрямованості або зміна балансу імунної відповіді з ТИ2 на ТА1 відповідь особливо корисно для лікування або -І профілактики астми. Наприклад, ефективна для лікування астми кількість може бути такою кількістю, яка придатна для перемикання Тп2-імунної відповіді, яка асоційована з астмою, на Тп1-тип відповіді. Рівень 7 цитокінів ТА2, особливо ІЛ-4 і ІЛ-5Б, підвищений в дихальних шляхах суб'єктів, страждаючих астмою. Дані - цитокіни викликають основні елементи астматичної запальної відповіді, включаючи індукцію ізотипу ЧЕ, Ххемотаксис еозинофілів і активацію і зростання огрядних клітин. Цитокіни ТА1, особливо ІЄМ-7 і ІЛ-12, можуть і-й приглушувати утворення клонів Тп2 і продукцію цитокінів Тп2. Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти згідно з

ІЗ винаходом викликають підвищення цитокінів ТА1, які спріяють зміні балансу імунної системи, запобігаючи або знижуючи неспріятливі ефекти, пов'язані з домінуванням Тп2-імунної відповіді.

Нуклеїнові кислоти придатні також для поліпшення виживає, диференціювання, активації і дозрівання дендритних клітин. Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти володіють унікальною здатністю стимулювати виживання, диференціювання, активацію і дозрівання дендритних клітин.

Ф, Попередники дендритних клітин, виділені з крові за допомогою імуномагнітного сортингу клітин, проявляють ко морфологічні і функціональні властивості дендритних клітин під час дводенної інкубації з ЗМ-С5ЗЕ. Без ОМ-С5Е дані клітини піддаються апоптозу. Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти перевершують СМ-С5Е у стимуляції 60 виживання і диференціювання дендритних клітин (експресія МСН ІІ, розмір клітин, гранулярність).

Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти також індукують дозрівання дендритних клітин. Оскільки дендритні клітини формують зв'язок між природженою і придбаною імунною системою шляхом презентації антигенів, а також за допомогою експресії ними рецепторів взнаючих патерн, які визначають мікробні молекули типу І/РЗ в їх локальному оточенні, здатність імуностимулюючих нуклеїнових кислот активувати дендритні клітини сприяє 65 застосуванню даної, заснованій на застосуванні імуностимулюючих нуклеїнових кислот, стратегії для імунотерапії іп мімо і ех мімо таких захворювань, як рак і алергічні або інфекційні захворювання.

Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти також придатні для активації і індукції дозрівання дендритних клітин.

Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти також підвищують літичну активність клітин-природніх кілерів і залежну від антитіла клітинну цитотоксичність (АЮОСС). АОСС може бути досягнута із застосуванням імуностимулюючої нуклеїнової кислоти в поєднанні з антитілом, специфічним відносно клітини-мішені, такої як ракова клітина.

Коли імуностимулюючу нуклеїнову кислоту вводять суб'єкту разом з антитілом, відбувається стимуляція імунної системи суб'єкта для знищення пухлинної клітини. Антитіла, придатні для процедури АОСС, включають антитіла, які взаємодіють з клітиною в організмі. Багато які з таких антитіл, специфічних відносно клітин-мішеней, були описані в даній області техніки і багато з них є у продажу. Приклади таких антитіл перераховані нижче в /о переліку засобів імунотерапії рака.

Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти можна також вводити разом з протираковою терапією. Засоби протиракової терапії включають протиракові ліки, опромінювання і хірургічні процедури. Вживаний тут термін "протиракові ліки" відносяться до агента, який вводять суб'єкту з ціллю лікування рака. Вживаний тут термін "лікування рака" включає профілактику розвитку рака, придушення симптомів рака та/або гальмування зростання /5 вже наявного рака. В інших варіантах протиракові ліки вводять суб'єкту, що має ризик розвитку рака, з ціллю зниження небезпеки розвитку рака. Нижче описані різні типи ліків для лікування рака. Для цілей даного опису протиракові ліки класифікують як хіміотерапевтичні агенти, імунотерапевтичні агенти, ракові вакцини, гормонну терапію і модулятори біологічної відповіді.

Вживаний тут термін "протиракові ліки" відносяться до агента, який вводять суб'єкту з ціллю лікування 2о рака. Вживаний тут термін "лікування рака" включає профілактику розвитку рака, придушення симптомів рака та/(або гальмування зростання вже наявного рака. В інших варіантах протиракові ліки вводять суб'єкту, що має ризик розвитку рака, з ціллю зниження небезпеки розвитку рака. Нижче описані різні типи ліків для лікування рака. Для цілей даного опису протиракові ліки класифікують як хіміотерапевтичні агенти, імунотерапевтичні агенти, ракові вакцини, гормонну терапію і модулятори біологічної відповіді. Крім того, способи винаходу сч ов призначені для включення застосування більше одних протираковрих ліків разом з імуностимулюючими нуклеїновими кислотами. Наприклад, коли це показано, імуностимулюючі нуклеїнові кислоти можна вводити як з і) хіміотерапевтичним агентом, так і з імунотерапевтичним агентом. В іншому варіанти протиракові ліки можуть включати імунотерапевтичний агент і ракову вакцину або хіміотерапевтичний агент і ракову вакцину або хіміотерапевтичний агент, імунотерапевтичний агент і ракову вакцину, які всі разом вводять одному суб'єкту з с зо Чіллю лікування суб'єкта, який страждає раком або має ризик розвитку рака.

Протиракові ліки діють багато якими шляхами. Деякі протиракові ліки направлені на фізіологічні механізми, о специфічні для пухлинних клітин. Приклади включають направлену дію на специфічні гени і продукти даних генів -/- по (тобто головним чином, білки), які мутують при раку. Такі гени включають, але не обмежуються цим, онкогени (наприклад, Кавз, Нег2, БсіІ-2), гени супресорів пухлин (наприклад, ЕСЕ, р5З3, КБ) і мішені клітинного циклу ї- (наприклад, СОКА4, р21, теломераза). В іншому варіанти протиракові ліки можуть бути направлені на шляхи ї- проведення сигналу і молекулярні механізми, які змінюються в ракових клітинах. Застосування моноклональних антитіл забезпечує спрямованість на ракові клітини за допомогою епітопів, які експресуються на поверхні таких клітин. Останній тип протиракових ліків звичайно згадується тут як імунотерапія.

Інші протиракові ліки призначені для клітин, відмінних від ракових. Наприклад, деякі ліки примують імунну « бистему для атаки пухлинних клітин (тобто ракові вакцини). Ще один тип ліків, названий інгібіторами з с ангіогенезу, діє шляхом пошкодження постачання кров'ю солідних пухлин. Оскільки більшість злоякісних раків . здібні до метастазування (тобто існування в місці первинної пухлини і розсіювання у віддалені тканини, з и?» формуванням тим самим вторинної пухлини), ліки, перешкоджаючі такому метастазуванню, також придатні для лікування рака. Посередники ангіогенезу включають основний ЕСЕ, МЕОСР, ангіопоетини, ангіостатин, ендостатин, ТМЕРо, ТМР-470, тромбосподин-1, фактор тромбоцитів 4, САЇ і деякі члени сімейства інтєгринових -і білків. Однією з категорій даного типу ліків є інгібітор металопротеїназ, який інгібує ферменти, вживані пухлинними клітинами для підтримки існування первинної пухлини і переходу в іншу тканину.

Ше Деякі ракові клітини є антигенними і, таким чином, можуть бути об'єктом дії імунної системи. В одному - варіанти сумісне введення імуностимулюючих нуклеїнових кислот і протиракових ліків, особливо тих, які 5р класифікують як протиракові імунотерапевтичні засоби, придатна для стимуляції специфічної імунної відповіді іні проти антигену рака. Вживаний тут термін "раковий антиген" відноситься до сполуки, такої як пептид, з асоційованої з поверхнею пухлинної або ракової клітини, і яка здатна провокувати імунну відповідь при експресії на поверхні антиген-презентуючої клітини в контексті молекули МНС. Ракові антигени, такі як представлені в ракових вакцинах або ті, які застосовують для одержання протиракових Імунотерапевтичних

Засобів, можна одержати з сирих екстрактів ракових клітин, (як описано Соспеп, еї а!., 1994, Сапсег Кезеагсі, 54:1055), або шляхом часткового очищення антигенів із застосуванням рекомбінантної технології або синтезу де іФ) помо відомих антигенів. Ракові антигени можуть бути застосовані у формі імуногенних частин конкретного ко антигену, або в деяких випадках як антиген може бути застосована ціла клітина або пухлинна маса. Такі антигени можуть бути виділені або одержані рекомбінантним способом або будь-якими іншими способами, бо Відомими в даній області техніки.

Теорія імунного нагляду полягає в тому, що первинною функцією імунної системи є виявлення і знищення неопластичних клітин до утворення пухлини. основоположний принцип даної теорії полягає в тому, що ракові клітини антигенний відрізняються від нормальних клітин і, таким чином, викликають імунні реакції, схожі з тими, які викликають відторгнення імунологічно несумісних алотрансплантатів. Дослідження підтвердили те, що б5 пухлинні клітини відрізняються, якісно або кількісно, за експресією антигенів. Наприклад, "специфічні для пухлини антигени" є антигенуми, специфічно асоційованими з пухлинними клітинами, але не з нормальними клітинами. Прикладами специфічних для пухлин антигенів є вірусні антигени в пухлинах, індуковані ДНК- або

РНК-вірусами. "Асоційовані з пухлинами" антигени є як в пухлинних, так і в нормальних клітинах, але в пухлинних клітинах представлені в іншій кількості або в іншій формі. Прикладами таких антигенів є онкофетальні антигени (наприклад, карциноембріональний антиген), антигени диференціювання (наприклад, антигени Т і ТН) і продукти онкогенів (наприклад, НЕК/пеи).

Були ідентифіковані різні типи клітин, здатних викликати загибель пухлин-мішеней іп мйго і іп мімо: клітини-природні кілери (МК-клітини), цитолітичні Т-лімфоцити (СТІ), клітини-кілери (ГАК), що активуються лімфокінами, і активовані макрофаги. МК-клітини здатні викликати загибель пухлинних клітин без попередньої /о бенситизації до специфічних антигенів, і для цієї активності не потрібна присутність антигенів класу І, кодованих головним комплексом гістосумісності (МНС), на клітинах-мішенях. Вважають, що МК-клітини беруть участь у контролі пухлин, що зароджуються, і контролі метастатичного зростання. На відміну від МК-клітин, СТІ. можуть викликати загибель пухлинних клітин тільки після їх сенсибілізації до пухлинних антигенів тоді, коли антиген-мішень експресується на пухлинній клітині, яка експресує і МНС класу І. Вважають, що СТІ служать 7/5 ефекторними клітинами при відторгненні трансплантованих пухлин і пухлин, викликаних ДНК-вірусами. Клітини

ГАК є підгрупою лімфоцитів нуль, відмінну від популяцій МК і СТІ. Активовані макрофаги здатні викликати загибель клітин таким чином, що після активації це не залежить ні від антигену, ні від МНС. Вважається, що активовані макрофаги знижують швидкість росту пухлин, в які вони інфільтруються. В аналізах іп міго виявлені і інші імунні механізми, такі як залежні від антитіла цитотоксичні реакції, що опосередковуютсья клітинами, і лізис під дією антитіла плюс комплемент. Проте, як вважають, дані імунні еффекторні механізми менш важливі іп мімо у порівнянні з функціями МК, СТІ, ГАК і макрофагів іп мімо (як огляд дивися Ріеззепз, МУ.Р., апа Оаміа,

У., "Титог Іттипоіоду", іп: Зсіепійіс Атегісап Меадісіпе, МоІ.2, Зсіепійс Атегісап ВоокКв, М.У., рр.1-13,1996).

Ціллю імунотерапії є підвищення Імунної відповіді хворого на вже наявний рак. Один із способів імунотерапії включає застосування ад'ювантів. Ад'ювантні речовини, одержані з мікроорганізмів, таких як сч бацила СаІтейе-опцегіп, посилюють імунну відповідь і підвищують стійкість до пухлин в тварин.

Імунотерапевтичні агенти є ліками, що беруть початок від антитіл або фрагментів антитіл, які специфічно і) зв'язують або впізнають раковий антиген. Вживаний тут термін "раковий антиген" в широкому сенсі слова визначається як антиген, що експресується раковою клітиною. Переважно, щоб антиген експресувався на клітинній поверхні ракової клітини. Ще більш переважно, щоб антиген був таким, який не експресується с зо Нормальними клітинами або щонайменше не експресується на тому ж рівні, що і в ракових клітинах. Засновані на антитілах імунотерапевтичні засобу можуть діяти шляхом зв'язування з клітинною поверхнею ракової клітини, о стимулюючи тим самим атаку ендогенної імунної системи проти ракової клітини. Іншим шляхом, яким діє «- заснований на антитілах терапевтичний засіб, є система специфічної направленої доставки токсичних речовин до ракових клітин. Антитіла звичайно кон'югують з токсинами, такими як рицина (наприклад, з касторових - бобів), каліхеаміцин і майтансиноїди, радіоактивними ізотопами, такими як йод-131 і ітрій-90, з ча хіміотерапевтичними агентами (як описано тут) або з модуляторами біологічної відповіді. При даному способі токсичні речовини можуть бути сконцентровані в області рака, а неспецифічна токсичність по відношенню до нормальних клітин може бути зведена до мінімуму. Окрім застосування антитіл, які специфічні відносно ракових антигенів, у винаході придатні також антитіла, які зв'язуються з судинною сіттю, такі як антитіла, що « зв'язуються з ендотеліальними клітинами. Це виправдано, оскільки звичайно виживання солідних пухлин з с залежить від кровоносних судин, що заново формуються, і тому більшість пухлин здатна рекрутувати і стимулювати зростання нових кровоносних судин. В результаті однією із стратегій багато яких протиракових ;» ліків служить атака на постачання пухлини кровоносними судинами та/або сполучні тканини (або строму), що підтримують такі кровоносні судини.

Застосування імуностимулюючих нуклеїнових кислот в поєднанні Імунотерапевтичними агентами, такими як -І моноклональні антитіла, здатне підвищувати довготривале виживання за допомогою ряду механізмів, включаючи значне посилення АЮОСС (як обговорювалося вище), активацію клітин-природних кілерів (МК) і

Ш- підвищення рівня ІЕМ з Нуклеїнові кислоти при їх застосуванні в поєднанні з моноклональними антитілами - служать для зниження дози антитіла, необхідної для досягнення біологічного результату.

Приклади протиракових імунотерапевтичних засобів, які застосовуються в даний час або які знаходяться у іні стадії розробки, перераховані в таблиці С.

Ко) з

ІОЕС/Сепепіеси, Іпс. /Нойтапп-ІаКосне (перше Рітуксантм (рітуксимаб, мабтера) Не-ходжкинська лімфома

Я ен сс НИШНИИ лікування рака в США) анти-СВ20 Маб) з 60 агент антитіло) (Оикев-С) моноклональное антитіло) залози, яєчників 65 ІЕС ІОЕС-У288 (мишаче анти-СО20 Мар, мічене | Не-ходжкинська лімфома ітрієм-90)

ІтСіопе Зувіет5 ВЕС (анти-ідіотипічне Марб, імітує епітоп Дрібноклітинний рак легені 03) (з ВСО)

ІтптСіопе Зувівтв5 С225 (гібридне моноклональне антитіло Рак клітин нирок проти рецептора епідермального фактора зростання (ЕСЕГ))

Тесппісіопе Іпіегпайопа!/АІрна Тпегарецшісв Онколім (Гут-1 моноклональне антитіло, Не-ходжкинська лімфома сполучене з йодом-131)

Ргоївіп Оевідп І ар5 ЗМАКТ МІ 95 АБ, наближене до людського

Тесппісіопе Согрогайоп/Сатьгідде Апійроду 181) УМ-1 (онколімтм)

Теснпоїо чу

Агопех Рпагтасеціїіса!в, Іпс. АТКАСЕМОУ Гострий промієлоцитний лейкоз

ІтптСіопе Зувівтв5 С225 (гібридне моноклональне антитіло Рак голови і шиї, недрібноклітинний рак проти ЕСЕг) « цисплатин або опромінювання |легені

Айагех, Канада Оварекс (843.13, анти-ідіотипічне СА125, Рак яєчників мишаче Маб) 19 Соцег Рнагта (клінічні результати були Бексксар (анти-СО20 Маб, мічене 1311) Не-ходжкинська лімфома позитивними, але була встановлена пов'язана з ліками значна токсичність відносно кісткового мозку)

ІЕС РНагтасеціісаІ5 Согр./Зепегесп Рітуксантм (Мав проти СО20) рап-В АБ в В-клітинна лімфома упаковці з хіміотерапією

Геикозйе/Ліех Опсоіоду ГОР-03, пиМАБ проти лейкоцитпого антигену (Хронічний лімфоцитарний лейкоз (СІ)

САМРАТН

Сепівег Моїесціаг Іттипоіоду іог 16 (анти-СОб, мишаче Маб) СТО.

Медагех/Ммомапів МОХ-210 (наближене до людського Рак молочної залози, яєчників с анти-НЕК-2 біспецифічне антитіло) 29 Медагех/Ммомапів МОХ-210 (наближене до людського Рак передміхурової залози, Ге) анти-НЕК-2 біспецифічне антитіло) недрібноклітинний рак легені, рак підшлункової залози, молочної залози

Медагех МОХ-11 (комплемент - активуючий рецептор (Гострий мієлогенний лейкоз (АМІ) (САК) моноклональне антитіло) Ге

Меадагех/Мо маг ів МОХ-210 (наближене до людського Рак нирок і товстої кишки анти-НЕК-2 біспецифічне антитіло) І в)

Медагех МОХ-11 (комплемент-активуючий рецептор |Очищення кісткового мозку ех мімо при й й пд ч- (САК) моноклональне антитіло) гострому мієлогенному лейкозі (АМІ)

Медагех МОХ-22 (наближене до людського Гострий мієлоїдний лейкоз у біспецифічне антитіло, кон'югати Маб) 3Б (активатори каскаду комплементу) у доле Риаптасеітів; те АТААСЕМО «

Сіахо М/еїЇсоте ріс 3622794 МаБб, яке зв'язується з ЕСРАО Недрібноклітинний рак легені, рак (17-4А) антигеном панкарциноми на простати (ад'ювант) шщ с аденокарциномах

Сепепівесп Анти-МЕОЕ, КпПиМАБ (гальмує ангіогенез) Рак легені, молочної залози, :з» передміхурової залози, колоректальний рак

Ргоївіп Оевідп І аре Зенапакс (ЗМАКТ анти-Тас (рецептор ІЛ-2) Лейкоз, лімфома

Ар," наближене до людського)"

Ргоївіп Оевідп І ар5 ЗМАКТ МІ 95 АБ, наближене до людського Гострий промієлоцитний лейкоз - ІтптСіопе Зувівтв5 С225 (гібридне анти-Естг моноклонально Рак молочної залози -1 антитіло) ї таксол

ІтСіопе Зувіетв (ліцензія від КРК) С225 (гібридне анти-ЕСЕг моноклонально Рак передміхурової залози шк антитіло) к доксорубіцин

ІтптСіопе Зувівтв5 С225 (гібридне анти-Естг моноклонально Рак передміхурової залози 1 антитіло) к адріаміцин з ІтСіопе Зувіет5 ВЕС (анти-ідіотипічне Марб, імітує епітоп Меланома 03)

Медагех МОХ-230О (наближене до людського Рак анти-НЕК-2 біспецифічне антитіло)

Медагех МОХ-220 (біспецифічне для пухлин, які Рак легені, товстої кишки, передміхурової о експресують ТАС-72) залози, яєчників, ендометрію, підшлункової залози і шямку ке Медагех/юМомагів МОХ-210 (наближене до людського Рак передміхурової залози анти-НЕК-2 біспецифічне, антитіло) 60 Медагех/Мегск Кдаад МОХ-447 (наближене до людського Раки, асоційовані з рецептором ЕСЕ біспецифічне антитіло проти рецептора ЕСЕ) (голови і шиї, передміхурової залози, легкого, сечового міхура, шийки матки, яєчників)

Медагех/юМомагів МОХ-210 (наближене до людського Комбінована з -С5Е терапія різних раків, анти-НЕК-2 біспецифічне антитіло) особл. - молочної залози 65 ІЕС МЕСІММИМЕ-2 (терапевтична вакцина Меланома мишачого моноклонального антитіла)

ІЕС МЕСІММИМЕ-1 (терапевтична вакцина Меланома мишачого. мог9О-нального антитіла)

Іттітотеаісв, Іпс. СЕАСІОЕ тм (1-131) Колоректальний рак і інші панкарциноми) ;

Тесппоіоду антигенів) антигенів) дпвюєу теятеюу 11100 170 людських Абрвз) 2) : антитіла) залози

Сепівег Моїесціаг Іттипоіоду іог ед/"З (анти-ЕСБ-К наближене до Радіоїмунотерапія до 0000 дет радіоіїмунотерапії антитіла) білки Ге » фетальної печінкової кінази-2 (РІ К-2)) о

Мабр/малих ліків см з ю е- ча

Інші типи хіміотерапевтичних агентів, які можуть бути астосовані відповідно до винаходу, включають

Зо аміноглутетимід, аспарагіназу, бусульфан, карбоплатин, хлоромбуцил, цитарабін НС, дактиноміцин, - даунорубіцин НОСІ, естрамустинфосфат натрію, етопосид (МР16-213), флоксуридин, фторурацил (5-)), флутамід, гідроксисечовину (гідроксикарбамід), іфосфамід, інтерферон альфа-2а, альфа-2р0, леупроліду ацетат (аналог

ЛГРГ-рилізинг-фактора), ломустин (ССМ), мехлоретамін НСЇ (гірчичний азот), меркаптопурин мєсна, мітотан « (о.п-ДДД), мітоксантрон НОЇ, октреолід, плікаміцин, прокарбазин НСЇ, стрептозоцин, тамоксифену цитрат, 7 70 тіогуанін, тіотепу, вінбластину сульфат, амсакрин (АМ5А), азацитидин, ертропоетин, гексаметилмеламін (НММ), с інтерлейкін 2, мітогуазон (метил-САО; метилгліоксальбіс-гуанілгідразон; Мово), пентостатин з (2'дезоксикоформіцин), семустин (метил-ССМИ), теніпосид (ММ-26) і віндесину сульфат.

Ракові вакцини представляють собою лікарські засоби, призначені для стимуляції ендогенної імунної відповіді проти ракових клітин. Вироблювані в даний час вакцини переважно активують гуморальну імунну -1 75 систему (тобто залежну від антитіл імунну відповідь). Інші вакцини, що знаходяться в даний час у стадії розробки, направлені на активацію опосередкованої клітинами імунної системи, включаючи цитотоксичні - І Т-лімфоцити, які здатні викликати загибель пухлинних клітин. Ракові вакцини звичайно підвищують презентацію -з ракових антигенів як для антиген-презентуючих клітин (наприклад, макрофагів і дендритних клітин), так та/або для інших імунних клітин, таких як Т-клітини, В-клітини і МК-клітини. 1 50 Хоча ракові вакцини можуть приймати одну з декількох форм, як обговорюється нижче, їх призначення полягає в доставці ракових антигенів та/або антигенів, асоційованих з раком, до антиген-презентуючих клітин їз (АРС) для полегшення ендогенного процесингу таких антигенів АРС і остаточної презентації антигенної презентації на клітинній поверхні в контексті молекул МНС класу І. Однією з форм ракової вакцини є вакцина з цілих клітин, яка є препаратом ракових клітин, які були виділені з суб'єкта, оброблені ех мімо і потім знов 59 введені суб'єкту у вигляді цілих клітин. Як ракові вакцини для виклику імунної відповіді можуть бути також

ГФ) застосовані лізати пухлинних клітин. ІнШЮюЮ формою ракової вакцини є пептидна вакцина, в якій для активації т Т-клітин застосовують специфічні для рака або асоційовані з раком малі білки. Асоційовані з раком білки є білками, які експресуються не тільки раковими клітинами (тобто інші нормальні клітини також можуть експресувати дані антигени). Проте експресія асоційованих з раком антигенів звичайно стійко підвищується при 60 раках певного типу. Ще однією формою ракової вакцини є вакцина з дендритних клітин, яка включає цілі дендритні клітини, які були експоновані з раковим антигеном або асоційованим з раком антигеном іп міго. Як ракові вакцини також можуть бути застосовані лізати фракцій дендритних клітин мембран. Вакцини з дендритних клітин здатні прямо активувати антиген-презентуючі клітини. Інші ракові вакцини включають гангліозидні вакцини, вакцини білків теплового шоку, вірусні і бактеріальні вакцини і вакцини нуклеїнових кислот. бо Застосування імуностимулюючих нуклеїнових кислот в поєднанні з раковими вакцинами забезпечує поліпшений специфічний для антигену гуморальну і опосередковану клітинами імунну відповідь на додаток до активації МК-клітин і ендогенних дендритних клітин і підвищення рівня ІЕМ у. Дане підвищення дозволяє застосовувати вакцину зі зниженою дозою антигену для досягнення такої ж сприятливої дії. В деяких випадках ракові вакцини можна застосовувати разом з ад'ювантами, такими як описані вище.

Вживані тут терміни "раковий антиген' і "пухлинний антиген" використовуються взаємозамінно для позначення антигенів, які диференціально експресуються раковими клітинами і завдяки цьому можуть бути застосовані для направленої дії на ракові клітини. Ракові антигени є антигени, потенційно здатні стимулювати очевидно специфічні відносно пухлини імунні відповіді. Деякі з даних антигенів кодуються, хоча не обов'язково 7/0 експресуються нормальними клітинами. Дані антигени можуть бути охарактеризовані як такі, які звичайно мовчать (тобто не експресуються) в нормальних клітинах, які експресуються лише на певних стадіях диференціювання і які тимчасово експресуються, такі як ембріональні і фетальні антигени. Інші ракові антигени кодуються клітинними генами мутантів, такими як онкогени (наприклад, активований онкоген газ), супресорні гени (наприклад, мутант ро3), генами гібридних білків, що виникають через внутрішні делеції або хромосомні 75 транслокації. Ще одні ракові антигени кодуються вірусними генами, такими, які переносяться. РНК. і

ДНК-пухлинними вірусами.

Інші вакцини приймають форму дендритних клітин, які були експоновані з раковими антигенуми іп мійго, піддали антигени процесингу і здатні експресувати ракові антигени на своїй клітинній поверхні в контексті молекул МНС для ефективної презентації антигену іншим клітинам імунної системи.

В одному варіанти винаходу імуностимулюючі нуклеїнові кислоти застосовують в поєднанні з раковими вакцинами, заснованими на дендритних клітинах. Дендритна клітина представляє собою спеціалізовану на презентації антигену клітину. Дендрітні клітини утворюють зв'язок між природженою і придбаною імунною системою шляхом презентації антигенів | за допомогою експресії ними рецепторів розпізнавання латерна, які визначають мікробні молекули, подібні ІРБ5, в їх місцевому оточенні. Дендрітні клітини ефективно с інтерналізують, піддають процесингу і презентують розчинний специфічний антиген, з яким вони експонуються.

Процес інтерналізації і презентації антигену викликає швидке підвищення експресії головного комплексу о гістосумісності (МНО) і костимулюючих молекул, утворення цитокінів і міграцію у напрямі лімфатичних органів, де вони, як вважають, беруть участь у активації Т-клітин.

В таблиці О перерахована множина ракових вакцин, які або застосовуються в даний час, або знаходяться у Га зо стадії розробки. ою - в зв ща пенні 00000 Ще вакцина 5

Зіоап-КеНегіпд Сапсег Сепіег

І 7 с Зіоап-КеНегіпд Сапсег Сепіег щ рак, рак легень й -І яєчників в. - я. я

ГЯ6) колоректальний рак ж ліпосомальний ІЛ-2 п й дв - й й

Віотіга Іпс. Ліпосомальна ідіотипічна вакцина Лімфома, злоякісне я І п нен з щ

Ароїоп Іпс. Геневакс-ТСК Т-клітинна лімфома б5

Іпвійше Ад/5

Массіпе

Саітеце-Сцегіп/Соппацоно), для внутрішньоміхурового лікування поверхневого 70 рака сечового міхура

Вживані тут хіміотерапевтичні агенти охоплюють всі інші форми протиракових ліків, які не підпадають під категорії імунотерапевтичних агентів або ракових вакцин. Вживані тут хіміотерапевтичні агенти включають як хімічні, так і біологічні агенти. Дія даних агентів направлена на гальмування клітинної активності, від якої /5 залежить тривале виживання ракової клітини. Категорії хіміотерапевтичних агентів включають в себе алкілуючі/алкалоїдні агенти антиметаболіти, гормони або гормонні аналоги і різноманітні антинеопластичні ліки. Більшість, якщо не всі з даних агентів, є прямо токсичними відносно ракових клітин і не потребують імунної стимуляції. Поєднання хіміотерапії з введенням імуностимулюючої нуклеїнової кислоти підвищує максимальну переносиму дозу хіміотерапії.

Химіотерапевтичні агенти, які в даний час розробляються або застосовуються в клінічних умовах, представлені в таблиці Е. сч ж о сч зо й -

Вгівіо! Муеге Інгібітор Інгібітор Рак ун в ву о М зв щ фарнезилтрансферази фарнезилтрансферази легень, молочної залози) « й - с ї» їв -

ЗтіїйКіїпе Хікамтін Топотекан Метастатичний рак яєчників

ПД нин іно нон - а залози й рак/ рак МЗС. зв о т во бо 7епеса 200101 (іп)) 200101 Солідні пухлини

Мматегтатюен РО ває 00000000РОлЕаОЄ 111 о

Атегнат ї

Атегнат »

Атегнат зацір стадії, МЗСІ С сч і 9

Оріонп см зо ю -

М

Вгізуо! Муегв вм5-182751 Пероральна платина Рак (легені, яєчників) вот ОО зацір « доппвоп 4 З с доппвоп г»

Оріонп з ь -і доппвоп - спо "

Оріонп зв о м 60 молочної залози, сечового міхура і яєчників

Атегнат 5

Сковсіюто (рію 000000 Деконфосямя бу

Вгізуо! Муегв ОРЕТ (тегафур/урацил) ОРЕТ (тегафур/урацил) Солідні пухлини зацір зацір зацір зацір 70 зацір зацір зацір й зацір

В одному здійсненні в способах згідно з винаходом застосовують імуностимулюючі нуклеїнові кислоти як заміни застосування терапії ІЕМ ож у лікуванні рака. В даний час деякі схеми лікування передбачають застосування ІЕМо, Оскільки ІРМо, утворюється після введення деяких імуностимулюючих нуклеїнових кислот, дані нуклеїнові кислоти можуть бути застосовані для ендогенного утворення ІЕМа. с

Винахід також включає спосіб індукції неспецифічної відносно антигену природженої імунної активації і (3 виклику стійкості широкого спектру до інфекцій із застосуванням імуностимулюючих нуклеїнових кислот.

Вживаний тут термін неспецифічна відносно антигена природжена імунна активація відноситься до активації імунних клітин, відмінних від В-клітин, і може, наприклад, включати активацію МК-клітин, Т-клітин або інших імунних клітин, які можуть відповідати незалежно від антигену, або деякі поєднання даних клітин. Виклик сч 3о стійкості широкого спектру до інфекцій індукується завдяки тому, що імунні клітини знаходяться в активній ІС о) формі і примовані до відповіді на будь-яку неправильну сполуку або мікроорганізм. Клітини не повинні бути специфічно примовані проти конкретного . антигена. Це особливо цінно при біологічній війні і інших описаних -- вище обставинах, таких як подорожі. -

Індекс стимуляції конкретної імуностимулюючої нуклеїнової кислоти може бути визначений за допомогою різних тестів з імунними клітинами. Переважно, щоб індекс стимуляції імуностимулюючої нуклеїнової кислоти - відносно проліферації В-клітин дорівнював щонайменше приблизно 5, переважно щонайменше приблизно 10, більш переважно щонайменше приблизно 15, і найбільш переважно щонайменше приблизно 20, при визначенні за включенням ЗН уридину в мишачі В-клітини в культурі, які контактували з 20мкМ нуклеїнової кислоти « протягом 20 годин при З72С, потім одержували пульсову мітку 1мкКі ЗН уридину; збиралися і використовувалися з с для рахунку радіоактивності через 4 години, як детально описано в РСТ Опублікованих (патентних заявках

РСТ/ЛІБОБ/О1570 (МО 96/02555) і РСТУИБО7/19791 (МО 98/18810) з пріоритетом заявок США, порядкові Мов. ;» 08/386063 і 08/960774 зареєстрованих 7 лютого 1995р. і 30 жовтня 1997р., відповідно). Для застосування іп мімо, наприклад, важливо, щоб імуностимулюючі нуклеїнові кислоти були здатні ефективно індукувати імунну відповідь, такий як, наприклад утворення антитіла. -І Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти ефективні у хребетних, відмінних від гризунів. Різні імуностимулюючі нуклеїнові кислоти можуть викликати оптимальну імунну стимуляцію залежно від типу суб'єкта і послідовності

Ш- імуностимулюючої нуклеїновой кислоти. Було знайдено, що багато хребетних згідно з винаходом чутливі до - одного і того ж класу імуностимулюючих нуклеїнових кислот, іноді згадуваних як специфічні для людини 5р імуностимулюючі нуклеїнові кислоти. Гризуни, проте, відповідають на інші нуклеїнові кислоти. Як показано тут, о імуностимулююча нуклеїнова кислота, що викликає оптимальну стимуляцію у людини, звичайно може не

Із викликати оптимальну стимуляцію у миші, і навпаки. Імуностимулююча нуклеїнова кислота, що викликає оптимальну стимуляцію у людини, проте, часто викликає оптимальну стимуляцію у інших тварин, таких як корова, кінь, вівця і ін. Фахівець в даній області техніки може визначити оптимальні послідовності нуклеїнової кислоти, придатні для конкретних видів, що цікавлять, за допомогою звичайних аналізів, описаних тут та/або відомих в техніці, із застосуванням запропонованого тут керівництва. (Ф, Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти можна прямо вводити суб'єкту або можна вводити разом з комплексом ка доставки нуклеїнової кислоти. Комплекс доставки нуклеїнової кислоти буде позначити молекулу нуклеїнової кислоти, асоційовану (наприклад, зв'язану неіонно або ковалентно; або інкапсульовану всередині) із засобами бо направленої доставки (наприклад, молекулою, що забезпечує зв'язування з клітиною-мішенню з більш високою спорідненістю (наприклад, поверхнями В-клітин) та/або підвищене захоплення клітинами-мішенями). Приклади комплексів доставки нуклеїнової кислоти включають нуклеїнові кислоти, асоційовані з стерином (наприклад, холестерином), ліпідом (наприклад, катіонним ліпідом, віросомою або ліпосомою) або специфічно зв'язується з клітиною-мішенню агентом (наприклад, лігандом, впізнанним специфічним рецептором клітини-мішені). 65 Переважні комплекси можуть бути значною мірою стабільними іп мімо для запобігання значного розпаду до інтерналізації клітиною-мішенню. Проте комплекс може бути розщеплюваним при відповідних умовах в клітині,

внаслідок чого нуклеїнова кислота виділяється у функціональній формі.

Засоби доставки або пристрою доставки антигена і нуклеїнових кислот до поверхонь були описані.

Імуностимулююча нуклеїнова кислота та/або антиген та/або інші терапевтичні агенти можуть вводитися окремо (наприклад, в сольовому розчині або буфері) або із застосуванням будь-яких засобів доставки, відомих в техніці. Наприклад, були описані наступні засоби доставки: кохлеати |Соціа-Родегпіе еї аїЇ.,, 1994, 19961; емульсоми (Мапсоїй еї аїЇ., 1998, І омжеїЇ еї аіЇ., 1997); ІЗСОМ» |Моумаї еї ай, 1993, Сагізвоп еї аї., 1991, Ни еї, 1998, Могеїп еї аі., 1999); ліпосоми |Спідеге еї аї.,, 1999, Міснаек еї аїЇ.,, 1989, 1992, де Наап 1995а, 199565); живі бактеріальні вектори (наприклад, ЗаїЇтопейПйа, ЕвсПегіспіа соїї, Васійз саітайне-диегіп, 70 ЗПпідеПйа, асо расійшв) ІНопе еї аїЇ.,, 1996, Рошмжеїв еї аї.,, 1998, Спанієїй еї аїЇ., 1993, 5Юмег еї аї., 1991, Мидепі еї аїЇ., 1998); живі вірусні вектори (наприклад, вірус коров'ячої віспи, аденовірус, Негрев5

Зітріех) І|Саїйснап еї аї.,, 1993, 1995 Мозз еї аїЇ., 1996, Мидепі еї аЇ., 1998, Ріехпег еї аїЇ.,, 1988, Моітожм еї а, 1999); мікросфери |Сиріа еї аїЇ. 1998, допез еї аіЇ., 1996, МаїЇоу еї аіЇ., 1994, Мооге еї аї., 1995,

О'Надап еї аї., 1994, ЕїІдгдде еї аї., 1989); вакцини нуклеїнових кислот |(Бупап еї аї.,, 1993, КикКіп еї аї., 1997, Зазакі ей аі),, 1998, ОКада ей аїЇ, 1997, Івпїї ег аїЇ, 1997); полімери (наприклад, карбоксиметилцелюлоза, хітозан) |Натаїдіта еї аї., 1998, Чарьаї-СЇЇЇ еї аІ., 1998); полімерні кільця (МуУуай еї аІ,, 1998); протеосоми |Мапсоїй еї аЇ., 1998, І оуеїЇ еї аІ.,, 1988, 1996, 1997); фтористий натрій ІНазпі еї аі!., 1998); трансгенні рослини |Таскеї еї аЇ., 1998, Мазоп еї аїЇ., 1998, Над еї аї., 19951; віросоми (Сіиск еї а, 1992, Мепадіагаії еї аїЇ., 1995, Стгу; ей ап, 1998); вірусоподібні частинки МШіапу еї аї., 1999, І еїрі еї 2о аї 1998). В техніці відомі й інші засоби доставки, і нижче при обговоренні векторів пропонуються додаткові приклади.

Термін ефективна кількість імуностимулюючої нуклеїнової кислоти відноситься до кількості, необхідної або достатньої для реалізації бажаного біологічного ефекту. Наприклад, ефективна кількість імуностимулюючої нуклеїнової кислоти для індукції мукозного імунітету є кількістю, необхідною для індукції появи ІДА у сч відповідь на антиген після експозиції з антигеном, тоді як кількість, необхідна для індукції системного імунітету, є кількістю, потрібною для індукції появи дО у відповідь на антиген після експозиції з антигеном, і)

На основі поєднання запропонованих тут вказівок, вибору з різних активних сполук і зважування таких факторів як ефективність, біологічна доступність, маса тіла хворого, серйозність несприятливих побічних ефектів і переважний спосіб введення, може бути спланований ефективний режим профілактики або терапевтичного с зо лікування, який не викликає істотної токсичності і в той же час повністю ефективний для лікування конкретного хворого. Ефективна кількість будь-якого конкретного застосування може варіювати залежно від таких факторів о як захворювання або стан, що підлягає лікуванню, конкретна імуностимулююча нуклеїнова кислота, що підлягає «- введенню, антиген, розміри суб'єкта, важкість захворювання або стани. Звичайний фахівець в даній області техніки може емпірично визначити ефективну кількість конкретної імуностимулюючої нуклеїнової кислоти та/або ї- з5 антигена та/або терапевтичного агента без необхідності недоречного експериментування. ча

Дози описаних тут сполук для мукозної або локальної доставки суб'єкту звичайно варіюють приблизно від

О,1мкг до 1Омг на введення, залежно від нанесення, яке можна давати щодня, щонеділі або щомісячно і будь-якого Іншого проміжку часу між введеннями. Більш типово мукозні або локальні дози варіюють приблизно від 1Омкг до 5мг на введення, і найбільш типово приблизно від 10Омкг до 1мг при 2-4 введеннях, відокремлених «

ОДИН від одного днями або тижнями. Більш типовими є дози стимулятора в діапазоні від їмкг до 1Омг на з с введення, і найбільш типово - від 1Омкг до їмг при щоденному або щотижневому введенні. Дози описаних тут сполук для парентеральної доставки суб'єкту з ціллю індукції специфічного відносно антигену імунної з відповіді, коли сполуку вводяться разом з антигеном, але без іншого терапевтичного агента, звичайно в 5-10000 разів ефективної мукозної дози вакцинного ад'юванта або стимулятора імунітету, яка вище вводиться, більш

Типово - від 10 до 1000 разів вище, і найбільш типово - від 20 до 100 разів вище. Дози описаних тут сполук -І для парентеральної доставки з ціллю індукції природженої імунної відповіді або для підвищення АОСС або для індукції специфічної відносно антигену імунної відповіді, коли імуностимулюючі нуклеїнові кислоти вводять в ш- поєднанні з іншими терапевтичними агентами або в спеціальних засобах доставки, звичайно варіюють - приблизно від О,1мкг до 10мг на введення, залежно від можливості щоденного, щотижневого або щомісячного 5р нанесення і будь-якого іншого проміжку часу між введеннями. Більш типово, коли парентеральні дози для даних 1 цілей варіюють приблизно від 1Омкг до Б5мг на введення, і найбільш типово - приблизно від 10О0мкг до 1мг при

Ге 2-4 введеннях, відокремлених один від одного днями або тижнями. В деяких здійсненнях, проте, парентеральні дози для даних цілей можуть застосовуватися в діапазоні від 5 до 10000 разів перевищуючих описані вище звичайні дози.

Для будь-якої описаної тут сполуки терапевтично ефективна кількість може бути початково визначена, виходячи з моделей на тваринах. Терапевтично ефективна доза може бути також визначена на основі даних,

Ф) одержаних на людині для Сро-олігонуклеотидів, які тестували на людях (були початі клінічні випробування на ка людині), і для сполук, для яких відомо, що вони володіють схожою фармакологічною активністю, таких як мукозні ад'юванти, наприклад, І Т та інші антигени для цілей вакцинації, для мукозного або місцевого введення. Для бо парентерального введення потрібні великі дози. Доза, що вводиться, може бути підібрана на основі відносної біологічної доступності і ефективності сполуки, що вводиться. Підбір дози для досягнення максимальної ефективності на основі описаних вище способів і інших способів, таких які добре відомі в даній області техніки, насправді знаходиться в компетенції звичайного досвідченого фахівця.

Склади винаходу вводять у фармацевтично прийнятних розчинах, які звичайно можуть містити 65 фармацевтично прийнятні концентрації солі, забуферюючих агентів, консервантив сумісних носіїв, ад'ювантів і необов'язково інших терапевтичних інгредієнтів.

Для застосування в терапії ефективна кількість імуностимулюючої нуклеїнової кислоти може бути введена суб'єкту будь-яким способом, який забезпечує доставку нуклеїнової кислоти до бажаної поверхні, наприклад, мукозним, системним. Введення фармацевтичної композиції даного винаходу може здійснено способами,

Відомими досвідченому фахівцю. Переважні шляхи введення включають, але не обмежуються цим, пероральне, парентеральне, внутрішньом'язове, інтраназальне, інтратрахеальне, інгаляційне, очне, вагінальне і ректальне.

Для перорального введення сполуки (тобто імуностимулюючі нуклеїнові кислоти, антигени і інші терапевтичні агенти) можуть бути легко складеш шляхом поєднання активної сполуки(сполук) з фармацевтично прийнятними носіями, добре відомими в техніці. Такі носії забезпечують можливість складання сполук винаходу у вигляді 70 таблеток, пілюль, драже, капсул, рідин, гелів, сиропів, тесту, суспензій і тому подібне для перорального споживання суб'єктом, що підлягає лікуванню. Фармацевтичні препарати для перорального застосування можуть бути одержані у вигляді твердого наповнювача з необов'язковим перемелюванням одержаної суміші і обробки суміші гранул після додавання відповідних допоміжних речовин, якщо це бажано, для одержання таблеток або вмісту драже. Відповідними наповнювачами є, зокрема, такі наповнювачі як цукор, включаючи лактозу, сахарозу, /5 маніт або сорбіт; препарати целюлози, такі як, наприклад, кукурудзяний крохмаль, пшеничний крохмаль, рисовий крохмаль, картопляний крохмаль, желатин, трагакантова камедь, метилцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза, карбоксиметилцелюлоза натрію та/або полівінілпіролідон (РУР). Якщо це бажано, можуть бути додані розпушуючі агенти, такі як поперечнозшитий полівінілпіролідон, агар або альгінова кислота, або їх солі, такі як альгінат натрію. Пероральні склади можуть бути необов'язково складені в сольовому розчині або буферах для нейтралізації внутрішніх кислих умов або можуть вводитися без яких-небудь носіїв.

Вміст драже пропонується з відповідними покриттями. Для даної цілі можуть бути застосовані концентровані розчини цукру, які необов'язково можуть містити аравійську камедь, тальк, полівінілпіролідон, карбополовий гель, поліетиленгліколь та/або двоокис титану, розчини глазурі і відповідні органічні розчинники або суміші сч г розчинників. До таблеток або оболонок драже можуть бути додані фарбники або пігменти для пізнавання або о для характеристики різних поєднань доз активної сполуки.

Фармацевтичні препарати, які можуть застосовуватися перорально, включають пристосовані для проштовхування капсули, зроблені з желатину, а також м'які запаяні капсули, зроблені з желатину або пластифікатора, такого як гліцерин або сорбіт. Проштовхувані капсули можуть містити активні інгредієнти в с зо суміші з наповнювачем, таким як лактоза, зв'язуючими, такими як крохмалі, талабо змащуючими агентами, такими як тальк або стеарат магнію, і, необов'язково, стабілізаторами. У м'яких капсулах активні сполуки о можуть бути розчинені або суспендовані у відповідних рідинах, таких як жирні масла, рідкий парафін або рідкі «- поліетиленгліколи. Крім того, можуть бути додані стабілізатори. Можуть бути також застосовані мікросфери, складені для перорального введення. Такі мікросфери були добре охарактеризовані в техніці. Всі склади для ї- з5 перорального введення повинні знаходитися у формах доз, придатних для такого введення. ча

Для защічного введення композиції можуть бути складені у вигляді таблеток або коржиків, складених традиційним способом.

Для введення шляхом інгаляції сполуки, що підлягають застосуванню згідно з даним винаходом, можуть бути традиційно доставлені у формі подачі аерозольного спрею з упаковки під тиском або розпилювача із « застосуванням відповідного газу-витіснювача, наприклад, дихлордифторметану, трихлорфторметану, в с дихлортетрафторетану, двоокису вуглецю або іншого відповідного газу. У разі аерозоля під тиском одиниця дози може бути визначена забезпеченням клапаном для виділення певної кількості. Капсули і ампули, наприклад, з ;» желатину для застосування в інгаляторі або вдувачі можуть бути складеш виді порошкової суміші сполуки і відповідної порошкової основи, такої як лактоза або крохмаль.

Коли бажана системна доставка сполук, вони можуть бути складені для парентерального введення шляхом -І ін'єкції, наприклад, болюсної ін'єкції або тривалої інфузії. Склади для ін'єкції можуть бути представлені у формі одиниці дози, наприклад, в ампулах або контейнерах з множиною доз, з доданим консервантом.

Ш- Композиції можуть бути представлені у вигляді суспензій, розчинів або емульсій в масляних або водних - розчинниках і можуть містити складові агенти, такі як суспендуючі, стабілізуючі та/або диспергуючі агенти.

Фармацевтичні склади для парентерального введення включають водні розчини активних сполук у о водорозчинній формі. Крім того, суспензії активних сполук можуть бути одержані у вигляді відповідних для

Ге ін'єкції масляних суспензій. Відповідні ліпофильні розчинники або носії включають жирні масла, такі як кунжутне масло, або синтетичні складні ефіри жирних кислот, такі як етилолеат або тригліцериди, або ліпосоми.

Водні суспензії для ін'єкції можуть містити речовини, які підвищують в'язкість суспензії, такі як карбоксиметгощелюлоза натрію, сорбіт або декстран. Суспензія також може необов'язково містити відповідні стабілізатори або агенти, які підвищують розчинність сполук для забезпечення одержання (Ф, висококонцентрованих розчинів. ка В іншому варіанти активні сполуки можуть знаходитися у формі порошку для сполуки з відповідним носієм наприклад, стерильній, вільній від пірогену водою, перед застосуванням. во Сполуки можуть бути також складені в ректальних або вагінальних композиціях, таких як супозиторії або утримувані клізми, наприклад, що містять традиційні основи супозиторіїв, такі як масло какао або інші гліцериди.

Окрім описаних вище складів, сполуки можуть бути також складені у вигляді депонованого препарату. Такі довгодіючі склади можуть бути складені із застосуванням відповідних полімерних або гідрофобних матеріалів (наприклад, у вигляді емульсії у прийнятному маслі) або іонообмінних смол або погано-розчинних похідних, 65 наприклад, у вигляді погано-розчинної солі.

Фармацевтичні композиції можуть також включати відповідні твердофазні або носії гелів або наповнювачі.

Приклади таких носіїв або наповнювачів включають, але не обмежуються цим, карбонат кальцію, фосфат кальцію, різні цукри, крохмалі, похідні целюлоза, желатин і полімери, такі як полієтиленгліколи.

Відповідними рідкими або твердими формами фармацевтичного препарату є, наприклад, водні або сольові

Возчини для інгаляції, укладені в мікрокапсули, мікроспіралі, нанесені на мікроскопічні частинки золота, що містяться в ліпосомах, розпилені, у вигляді аерозоля кругляків для імплантації в шкіру або висушені на гострому предметі для вчосування в шкіру. Фармацевтичні композиції також включають гранули, порошки, таблетки, таблетки в оболонці, (мікро)капсули, супозиторії, сиропи, емульсії, суспензії, креми, краплі або препарати з тривалим виділенням активних сполук, в яких звичайно застосовують наповнювачів і добавки та/або 7/0 допоміжні компоненти, такі як розпушувачі, зв'язуючі, покриваючі агенти, агенти набухання, змащуючі матеріали, аромати, підсолоджувані або солюбілізатори, як описано вище. Фармацевтичні композиції придатні для застосування у множині систем доставки ліків. Для короткого огляду способів доставки ліків дивися І апдег,

Зсіепсе 249:1527-1533, 1990, статтю, яка включена тут як посилання.

Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти і необов'язково інші лікарські засоби та/або антигени можуть вводитися /5 Як такі (в чистому вигляді) або у вигляді фармацевтично прийнятної солі. Вживані в медицині солі повинні бути фармацевтично прийнятними, але для одержання їх фармацевтично прийнятних солей можуть застосовуватися відповідні фармацевтично неприйнятні солі. Такі солі включають, але не обмежуються цим, такі, які одержують з наступних кислот: соляної, бромистоводневої, сірчаної, азотної, фосфорної, малеїнової, оцтової, саліцилової, пара-толуолсульфокислоти, винної, лимонної, метансульфокислоти, мурашиної, малонової, янтарної, 2о нафталін-2-сульфокислоти і бензолсульфокислоти. Крім того, такі солі можуть бути одержані у вигляді солей лужних або лужноземельних металів кислоти.

Відповідні буферні агенти включають: оцтову кислоту і сіль (1-295 мас./об.); лимонну кислоту і сіль (1-390 мас./об.); борну кислоту і сіль (0,5-2,595 мас./об.); і фосфорну кислоту і сіль (0,8-295 мас./об.). Відповідні консерванти включають хлорид бензалконію (0,003-0,0395 мас./об.); хлорбутанол (0,3-0,995 мас./об.); парабени сч (0,01-0,25мас./об.) і тимеросал (0,004-0,029о мас./об.).

Фармацевтичні композиції згідно з винаходом містять ефективну кількість імуностимулюючої нуклеїнової і) кислоти і - необов'язково - антигени та/або інші терапевтичні агенти, необов'язково включені у фармацевтично прийнятний носій. Термін "фФармацевтично прийнятний носій" означає один або більше твердих або рідких наповнювачів, розріджувачів або інкапсулюючих речовин, які придатні для введення людині або іншій хребетній с зо тварині. Термін носій означає органічний або неорганічний інгредієнт, природний або синтетичний, з яким сполучають активний інгредієнт для полегшення нанесення. Компоненти фармацевтичних композицій здатні юю також змішуватися із сполуками згідно з винаходом і один з одним таким чином, що не відбувається взаємодії, «- яка могла 6 істотно знизити бажану фармацевтичну ефективність.

Придатні у винаході імуностимулюючі нуклеїнові кислоти можуть бути доставлені в сумішах з іншим(и) ї- додатковим(и) ад'ювантом(ад'ювантами), іншими терапевтичними засобами або антигеном(антигенами). Суміш ї- може складатися з декількох ад'ювантів на додаток до імуностимулюючій нуклеїнової кислоті або декількох антигенів або інших терапевтичних засобів.

Для введення придатна множина шляхів. Вибір конкретного способу повинен залежати, звичайно, від конкретних вибраних ад'ювантів або антигена, конкретного стану, що підлягає лікуванню, і дозування, « необхідного для ефективності терапії. Способи даного винаходу, взагалі кажучи, можуть здійснюватися із з с застосуванням будь-якого способу введення, який прийнятний з позицій медицини, що означає, що будь-який

Й спосіб, який викликає ефективний рівень імунної відповіді без індукції клінічно неприйнятних побічних и?» ефектів. Переважні способи введення обговорюються вище.

Композиції можуть бути традиційно представлені в дозованій лікарській формі і можуть бути одержані будь-якими способами, відомими в техніці фармації. Всі способи включають стадію введення сполук в контакт з -І носієм, який включає один або більше допоміжних інгредієнтів. В цілому, композиції одержують шляхом рівномірного і тісного введення сполук в зв'язок з рідким носієм, тонкоподрібненим твердим носієм або обома з

Ш- подальшим, якщо це необхідно, формуванням продукту. Рідкі одиниці дози є пухирцями або ампулами. Тверді - одиниці дози є таблетки, капсули або супозиторії. Для лікування хворого можуть бути потрібні різні дози, 5р залежно від активності сполуки, способу введення, цілі імунізації (профілактичної або лікувальної), природи і 1 важкості захворювання, віку і маси тіла хворого. Введення даної дози може вироблятися як шляхом

Ге однократного введення у вигляді індивідуальної одиниці дози, так і у вигляді декількох менших дозувань.

Множинне введення доз, розділене певними інтервалами часу, які складають тижні або місяці, є звичайним для підтримки специфічних відповідей на антиген. 5Б Інші системи доставки можуть включати системи доставки з вивільненням за часом, затриманим вивільненням або постійним вивільненням. Такі системи можуть дозволити уникнення повторних введень сполук,

Ф) підвищуючи зручність для суб'єкта і лікаря. Доступні і відомі фахівцям в даній області техніки багато які ка типи систем доставки з вивільненням. Вони включають системи на полімерній основі, такі як полі(лактид-гліколід), співполіоксалати, полікапролактони, поліефіраміди, поліортоефіри, полігідроксимасляну бо Кислоту і поліангідриди. Мікрокапсули вказаних вище полімерів, що містять ліки, описані, (наприклад, в патенті США 5075109). Системи доставки включають також неполімерні системи, якими є: ліпіди, включаючи стерини, такі як холестерин, складні ефіри холестерину і жирних кислот і нейтральні жири, такі як моно-, ди- і тригліцериди; гідрогелеві системи вивільнення; силастикові системи; системи на основі пептидів; воскові покриття; пресовані таблетки із застосуванням традиційних зв'язуючих і наповнювачів; імплантати з обмеженою 65 розчинністю; і тому подібне. Конкретні приклади включають, але не обмежуються цим, (а) ерозійні системи, в яких агент винаходу міститься у формі, що знаходиться у матриксі, такому як описані |в патентах США Мов.

4452775, 4675189 і 57361571, і (Б) дифузійні системи, в яких активний компонент проникає з контрольованою швидкістю з полімеру, такого як описані |в патентах США Мов. 3854480, 5133974 і 5407686). Крім того, можуть бути застосовані засновані на насосах технічні системи доставки, деякі з яких пристосовані для імплантації.

Даний винахід далі ілюструється наступними прикладами, які ніяким чином не повинні тлумачитися як додаткове обмеження. Повний зміст всіх посилань (включаючи літературні посилання, опубліковані патенти, опубліковані патентні заявки і патентні заявки у стадії розгляду), цитованих в даній заявці, таким чином, чітко включений як посилання.

Приклади 70 Матеріали і способи:

Олігодезоксинуклеотиди: природні фосфодіефірні і фосфотіолатні похідні ОДН були одержані від Орегон

Тесппоіодіез (АІатеда, СА) і Нубгідоп Зресіаійу Ргодисів (Мійкога, МА). ОДН тестували на ендотоксин за допомогою тесту ГАЇ (ГАЇ -аззау ВіомупічЧакег, УУаІКегазмійе, МО; нижня межа визначення 0,1 ЄШ/мл). Для аналізів іп міго ОДН розводили в буфері ТЕ (10ММ трис, рН7,0, 1мМ ЕДТА) і зберігали при -2020. Для застосування іп 75 Мімо ОДН розводили в забуференому фосфатом фізіологічному розчині (0,1М ЗФР, рН7,3) і зберігали при 420.

Всі розведення виробляли із застосуванням реагентів, позбавлених пірогенної активності.

Виділення РВМС людини і клітинна культура:

Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) виділяли з периферичної крові здорових добровольців за допомогою центрифугування у градієнті РісоІ-Радне (Нізіорадце-1077, Зідта Спетіса! Со., 5. І оців, МО) як було описано |Нагітапп еї аїЇ.,, 1999 Ргос. Май. Асай. Зсі БА 096:9305-10),. Клітини суспендували у культуральному середовищі КРМІ 1640 з добавкою 10905 (об./об.) інактивованої нагріванням (562, 1 година)

ЕС5 (фетальної телячої сироватки) (НусСіопе, І одап, ОТ), 1,5мМ І -глутаміну, 100од./мл пеніциліну і 10Омкг/мл стрептоміцину (всі від Сібсо ВК, Огапа Івіапа, ММ) (повне середовище). Клітини (кінцева концентрація 1х105клітин/мл) культивували в повному середовищі у зволожуваному СО» інкубаторі при 372С. Як стимули СМ застосовували ОДН і ЛПС (ліпополісахарид) (з ЗаІтопейа (уУрпітигічт, бідта Спетіса! Со., 5. Гоців, МО) або г) анти-І9М. Для вимірювання літичної активності МК (природних кілерів) людини РВМС інкубували в кількості

Бх105/ямку в 24-ямкових планшетах. Культури збирали через 24 години, і клітини застосовували як ефектори в стандартному 4-годинному тесті виділення 9Сг проти клітин мішеней К562, як описано раніше (ВаїІав еї аї|., с зо 1996 9. Іттипої. 157:1840-1845). Для оцінки проліферації В-клітин за 18 годин до збору додавали 1мкКі

Н-тимідіну, і кількість включеного ЗН-тимідину виміряли за допомогою сцинтиляційного рахунку на день 5. юю

Стандартні відхилення в трьох ямках складали «5905. «-

Проточна цитометрія РВМС людини: антигени поверхні РВМС приматів фарбували, як описано раніше

ІНагітапп еї аї., 1998 3). Рпагтасої. Ехр, Тег. 285:920-928). Моноклональні антитіла проти СО (ОСНТІ), СО14 -

Зв (М5Е2), СО19 (843), СО56 (8159), СО69 (РМ50) і СО86 (2331 (РОМ-1)) були одержані від Рпагтіпдеп, Зап Оіедо, р.

СА. Для контролю неспецифічного забарвлення застосовували до 4жк (МОРС-21) і ІдОор,к (Нагітапп еї аї., 1999 Ргос. Май). Асад. сі ОБА 96:9305-10). Клітини МК ідентифікували за експресією СО56б на негативних за

СОо3, ср14 і 6019 клітинах, а В-клітини ідентифікували за експресією СО 19. Дані проточної цитометрії для 10000 клітин на зразок одержували за допомогою ГАСзсап (ВесКіоп Ббіскіпвоп Іттипосуїотейгу Зувіетв, Зап « 720 чЧове, СА). Життєздатність клітин в селекторі ЕЗС/55С, вживаному для аналізу, оцінена за допомогою шщ с забарвлення йодним пропідієм (2мкг/мл), виявилася вище 9895. Результати аналізували за допомогою й комп'ютерної програми Ріомлдо (версія 2.5.1, Тгее аг, Іпс., Фапіога, СА). "» Результати:

Приклад 1: Залежна від Сро стимуляція В-клітин людини залежить від метилювання і довжини ОДН.

РВМС людини одержували від здорових донорів і культивували протягом п'яти днів в кількості -і 2х10Зклітин'ямку з вказаними концентраціями вказаних ОДН послідовностей. Як показано в таблиці Е, - проліферація РВМС людини перевищує базальний рівень при культивуванні з багатьма вміщуючими Сро ОДН, а також деяку проліферацію навіть у присутності ОДН, що не містять ніяких мотивів Сро. Важливість - неметильованих мотивів Сро для забезпечення оптимальної імунної стимуляції даними ОДН демонструється с 20 тим, що ОДН 1840 (ЗЕО ІО МО. 83) індукує включення 56603 імпульсів "Н-тимідину, тоді як така ж збагачена Т

ОДН з метильованими мотивами Сро (не-Сро) 1979 (ЗЕО ІЮ МО. 222), індукує меншу, хоча все ще перевищуючу г» базальний рівень, активність (лише 18618 імпульсів) при тій же концентрації, що дорівнює 0,бмкг/мл) Знижена проліферація при великих концентраціях ОДН може бути артефактом клітин, виснажених при даних експериментальних умовах, або може відображати деяку цитотоксичність великих концентрацій ОДН. Цікаво, що 29 більш короткі ОДН мотиви Сро, що містять, такі як 13-14-членні 2015 і 2016, надають меншу стимулюючу дію, не

ГФ) дивлячись на те, що їх молярна концентрація насправді була вищою, оскільки ОДН додавали на основі маси, а не молярності. Це свідчить про те, що довжина ОДН може бути важливою детермінантою в імунних ефектах де ОДН. Не-Сро ОДН, за винятком збагаченого Т ОДН (приблизно 3095 Т) 1982 (ЗЕО ІЮО МО. 225), викликали лише слабке підвищення проліферації клітин над базальним рівнем. 60 бо 1840 (ЗЕО ІЮ МО.83) 574А 56603 | 31787

Числа представляють кількість їмп/хв. включення ЗН-тимідину для культур РВМС людини, які вели, як описано вище.

Приклад 2. Залежна від концентрації стимуляція активності МК клітин людини збагаченими тимідином ОДН.

РВМС з людини культивували протягом 24 годин з набором різних Сро- і Не-Сро-ОДН в двох концентраціях, 75 після чого тестували на їх здатність викликати загибель клітин-мішеней для МК, як описано раніше (Оаїйаз еї а!І., 1996 3). Іттипої. 157:1840-1845). Загибель виражали в одиницях лізису, або І.О. В донора, використаного в даному експерименті, базальний рівень складав 3,69 |.00., який зростав до 180,36 І.О. при застосуванні позитивного контролю, ІЛ-2. СрО-олігонуклеотид 2006 (ЗЕО ІЮ МО. 246) індукував найбільше зростання лізисної функції МК при низькій концентрації, рівній 0,6, і у меншій мірі - при концентрації 6,0. Несподівано виявилося, Що збагачений Т ОДН, в якому мотиви Сро 2006 були метильовані (ОДН 2117 (5ЕО ІО МО. 358) або звернуті в СрС (ОДН 2137 (5ЕО ІЮО МО. 886)), зберігає сильну імуностимулюючу функцію при більш високих концентраціях ОДН, як показано в таблиці б. Дані залежні від концентрації імуностимулюючі ефекти не є загальною властивістю фосфортіоатного остову, оскільки описані нижче експерименти показують, що полі-А

ОДН не викликає стимуляції, що перевищує базальний рівень. Деяка стимуляція спостерігається з ОДН с завдовжки в 24 основи, в яких всі положення основ рандомізовані таким чином, що А, С, б і Т виявляються з частотою 2595 в кожному з положень основ (ОДН 2182 (ЗЕО ІЮ МО. 432)). Разом з тим, стимулююча дія такого о 24--лпенного ОДН значно зростає, якщо він є чистим полі-Т, причому в останньому випадку стимуляція спостерігається також при найменшій концентрації 0,бмкг/мл (ОДН 2183 (5ЕО ІЮ МО. 433)). Дійсно, стимулююча активність ОДН ЗЕО ІЮО МО. 433 при такій низькій концентрації є більш високою, ніж активність будь-когоіншого су

ОДН, що тестується при даній низькій концентрації виключаючи оптимальний у відношенні людини імуностимулюючий ОДН 5ЕО ІЮО МО. 246. Дійсно, при більш високій концентрації ОДН 5ЕО І МО. 433 о стимулював велику активність МК, ніж будь-який інший фосфортіоатний ОДН, за винятком сильного Срео-ЮднН «-- 2142 (5ЕО ІЮ МО. 890), активність якого була злегка вищою. Якщо вміст 5 ОДН ЗЕО ІО МО. 246 зростає щодо вмісту Т за рахунок введення додаткових С, то це приводить до зниження імуностимулюючої дії ОДН, -

Відповідного зниження частки Т-нуклеотидів (дивися ОДН 2132 (5ЕО ІЮ МО. 373)). Таким чином, вміст Т в ОДН є ча важливою детермінантою імуностимулюючої дії. Хоча з Не-СрО-ОДН полі-"" ОДН є найбільш сильним стимулятором, інші основи також важливі для імуностимулюючої дії Не-Сро-оОдн. ОДН 2131 (5ЕО ІЮО МО. 372), в якому трохи більше половини основ представлена Т і в якому відсутня 0, є імуностимулятором при концентрації « бмкг/мл, але його активність значно нижче, ніж активність збагаченого Т ОДН. Якщо замінити 6 А в ОДН 2131 0 («ЗЕО Ю МО. 372) 6-у С, то імуностимулююча дія ОДН може зрости (дивись ОДН 2130 (ЗЕО ІЮ МО. 371)). 8 с ;» -І -І - с 50

Ко)

Ф) іме) 60 б5

ИН ко косі кни жо о вто КЕ кв свои ни ев м кн вані с кв вк с Мн ЕМ Коси т мія тих

Ек нм осн и В А

ПОН. НЯ

ЗИ ЕКК.. и аа ЖАш 0 свв НД ОО з сш КІЗ ні я МЕН с сотням

Приснився ЖИ етх тя я тив ет пад М сов сийни З

ДІЛЕННЯ нки БІ Де тех

ПЕН НА НИН 0сх ск, Іо: ея коп . . : зх піддон вче Я ТИНУ : пика сен тирі неп щу : ТИКИ З СН Та Лю ЗАМКИ пес т й. г. Ще М НТШ р. - - хи я сим їн я растений з, С ВН уколи Есе Клднео сяк хай... а г. -- пл 1.7 - Е --40 щш пера ' жа: ИНА: Шен ВНВ

Вин тс "х пе ЖлелАдайНн Мекка ши Деко слегя іі оо КИ й: -- зхгидктст зважену основні пла спрях : секде свою Жббну щеуни сан: рони фа: пишне

Міг едюлім клю й зані ННЯ СО с: Сн НН 0 КОНЯ

За Ме шт ПНІ ТМ ОХ МН лет; ЗМ я БАНТ, пива ел Ме: нку й нн: Гішай пу сл. БАКУ . Ей й : КА ВД нн

Нед ан ри еще: Сжкін шк: Моне ел УхНвр

Мія Кесуетоя ЗИ сяйна як: А

Меюя ЯК Ж сне пам ЗИСКМИЄ: МНК ЗВ

ЗМЕН

М ніннростя с ек ваги, дат ся икнх св зд тен паж Я Пани сЕх ЕНН е НИ 00 Же че пеША БЕ КИ аа тв ті

Бест со З й 2 вето нкувнвнзнвю уки хо сгдасвшенля

ЗОБІ і Е Квт і:

Даня ї ї плати. т шо. и тя - м,

УНН ня. . -- . . . 4. щи ТАЙ що ДЕ ато п Ед тет давати т Пібає жи сей ши КИ Ох є. А У М

ЧИНИИКМ - кг Ек, ян й нан. ЖЕН фан: шенже з ан ек я Яви МО Це ЯОЄ БІЯ за ї- «ВИ г --я Бяж ЗЕНМ СЯИН: ІОЖ ж

ДІЯ а те ення 7 Ка ко Зкашк з сід рено» вв з

БУ: г: й

ХНИ « талі. міх ок. - НК шт ліг к-т

ЗИ; ее, писав: неЛрен Зеавак УВУ с ШК сля р: ВН сна: ЕН Са НЯ

ПЕ ТННН

«пи от-- пил себдятят. ОСТЧІЕЕЕ ттсишят овал 72 г" Хлтта СН я НН: 0 ННІ а рани синий ке пелет НН: НИ чну пса

М сно шк с? 60 65

- ! ет п. Ше

Аня ке т, вх ща

Де клон яд ще ко : щих Е; шт. 0і-; в шк со ВК лиса т-

Бєси ян ЕЕ й ой 5 ГДК АН Я вести їв ій деня зай ль і де: ВВЕ ен : й мі НЯ ї пл" Вони йщАЄ "дн сто т рт, ще й з итЕе Кі Мне МУ п еінде я тов й МВВ иа Ор Же діл: Яни й Е еко я ННЯ ЕЕ сяк жи ІК леВи тет і лу

КІ ЕЕ БЕ імя «Ви ще вай свй пр но ех: М НЕ в. й : «ВХ Босий з. и ас ; | ответ | не | дек є й й їй сі лу АТ "р, й | | і о я тя ен а На о хе,

В. жо іон че У с" ве, з Я! Я чо кан

ЕЛЕ; І ло й Й у

ЗИНЯ одн : Б. те Ін ВА ли іа: ке пе и - ий ПЕВНУ іш аж -- аа Є вда с яка: Мк: 5 ще в ча ї; до МННЯ є с ее тя т х щу КЕ т: й ще ща ча ній | Як ТТ Я ри З. . хе Її: яз ж ие вки --е ; | я ячна їн щі я палю АК ж і

ЯН дя зна ан в. | як

ЩІ а я свй. с ще яти т

Я М Я чи: зи ЛИХ зва яикия Кін ДВА сх моя

Беру зу пуй СН УА : еле й Ум . міні й ЯК ре Кк ж

Ки й Щі ч соя тій . : . Мч зв док

ІЙ ШИ А он шен сум

ЕК з й "; з ве г : ок СК се с угстивіс й : Го)

Дт іти С Й ж днк і с пе і -

М ен ка й щи іс п ЕвеНи їн да ей з З ще стрнвн М «ИКНЕ те

В екв тіс ВЕ п БА АХ жена й Кн душ ШО ввсксн тв ки І. зишнизря . ша ло яд: "Я Й етан пог ств ся Де дссвся Про -ї НІ я жк г - ще го тер І: се, ей : й Це. ува:

Ве вд А НН Шо Із у шИАЯЦЕ тост БЖ В я ящ у о ; й і МЕРКЯ й Бітитя іх

Ем пре МОУ : ЕЕ

УЗН: в- СНІ | тав Є Я Дж ї сект в т гія . п Ту -- шалі тих вгг. Ян: Мн ї , і ся НАЙ ЗОВНІ шия питан і сл

МАЯК слой як НІ п Писеее п ВН м тні й

ЗКНІЯ ах вій Е їк-. ти З грЕкв пиши й й їх

КЕрквн в ТИ: Не зов стуе би й вищ я й у г На. ін кад МК щи ща а в м х ЩЕ й й ЧИ:

Кіт Кетрін ес ще ня | | ; | то щ Ох ї Ж п ах. кт лілійлони ! ле їх ре ія п тн мо я щит .

Й с й се її НЯ рн й вк ТУ Ер " яко ДР ще а. кі ох здшниж в тк. т з со ЕЕ і; і . «Жде ля М т «ИН дама Ж т

БІ не ел ї с: Я ноу, зле з Мт їх лк тні пил я ч - ше . а. і ; за | ) и т ШИЯ - ж з: хтів я шк кан нак. ТЕ! в Я ; я вк сіна їй лі Тбялит": толхиУ З У Ел и Я : ї жна г ке К яти та ". Тіт. 7 З Не І росій сс ст ИЙ 35 : ДЕ ие, ОА ож с й й Я т ру ТИ іі, пи. - й бо В й ПЕ ше Та ней вин тик й вне ІЙ їй: я Я НК ЗБ дай вн: -І КЕ рння вка ФЛ ех ек: я ій кекіннй : Х ! я с. з БЕ ки їх т пед ДАКДНННЯ Як й со

Тепле в . о СМЛИН ОС ї іш й -! ви З ОП : днз леж ли Я ще

ЄТЕХ І Б Й тру зав олеч: я Бе шо Е икнех ЯКА Шви : же я г ж

НА

60 б5 с шо Б-ку брову Єшетає Мене снееиь. Чітне 0 ОКВІВЕЮЯ: «А: ВЕ о у

МИ М бля | МЕТІ Со млини Стр; Тож пк їй цей Ва Я Ехо . вет і-й Бон зад: ЙФЕ КК Ж І, З сл У рт х й ей і і | | с. й г й й щі

Мне зе дет Й до! «веж. зал; Ка Бе ЯНА сей кишить

ЕІ. з я вив й я іонних 2 ВНУ й кб НН Бе Ве ЗБІЙ

НИ

Приклад 3: Індукція проліферації В-клітин збагаченим Т не-Сро-ОНН. Для оцінки здатності збагачених Т ОДН активувати проліферацію В-клітин РВМС людини фарбували фарбником цитоплазми С5ЕЕ, інкубували протягом і) п'яти днів з вказаним ОДН в концентрації 0,15 або О,Змкг/мл, і потім аналізували за допомогою проточної цитометрії. В-клітини ідентифікували селекцією клітин, позитивних відносно маркера лінії СО19). СрО-ОДН 2006 був сильним індуктором проліферації В-клітин, і дана дія знижувалася при метилюванні мотивів Сро або при їх с зо обертанні в срсС, як показано на Фіг1А, В, С і О при концентрації ОДН 0,Змкг/мл. Склад основ ОДН, мабуть, важливий для визначення імуностимулюючої дії. Зниження вмісту Т в ОДН істотно знижує імуностимулюючу дію, о як це ілюстровано на прикладі ОДН 2177 (ЗЕО ІЮ МО. 427), в якому 6 Т, що є в ОДН 2137 (ЗЕО ІО МО. 886),були -" де замінені на А, внаслідок чого імуностимулююча дія була значно знижена. Важливість Т для імуностимулюючої дії

ОДН виявляється також при порівнянні ОДН 2116 (5ЕБО ІО МО. 357) і ОДН 2181 (5ЕО ІЮО МО. 431), які ї- розрізняються за 3-кінцем ОДН. ОДН 2181, в якому 3-кінець є полі-Т, є більш сильним стимулятором у ї- порівнянні з ОДН 2116, в якому 3-кінець є полі-С, не дивлячись на те, що обидва ОДН містять ТСОТСО на 5'-кінці.

Приклад 4: Проліферация В-клітин, індукована олігонуклеотидами ТО Стимулююча дія мотивів ТО показана на Фіг.2. ОДН 2137 володіє ідентичним з ОДН 2006 складом основ, але мотиви СО були інвертовані в ОС, що « 0 дало СО нуклеїнову кислоту, що не містить. Проте, ОДН містить б-динуклеотидів тб. В ОДН 2177 всі У с динуклеотиди ТО ОДН 2137 були замінені на АС. Хоча ОДН 2177 містить лише 6 аденінів, він практично не . надає стимулюючої дії в концентрації О0,2мкг/мл. Для порівняння, ОДН завдовжки в 24 основи, в яких кожне и?» положення рандомізоване відносно будь-якого з чотирьох основ (ОДН 2182) індукує проліферацію 21290

В-клітин при концентрації 0,2мкг/мл. Дані результати вказують на те, що стимулюючі ефекти ОДН 2137 не є просто ефектами фосфортіоатного остову, а пов'язані з наявністю динуклеотидів То. -І Для того, щоб визначити вплив зміни кількості динуклеотидних мотивів ТО, порівнювали ОДН 2200 і ОДН 2202, як показано на Фіг.2. Обидва ОДН містять 18 Т і 6 С, але в ОДН 2200 всі С розташовані послідовно, так - що є лише один динуклеотид ТО, тоді як в ОДН 2202 0 розділені у вигляді динуклеотидів СО за всім ОДН, - внаслідок чого є три динуклеотиди ТО. ОДН 2202 надає значно більшу стимулюючу дію у порівнянні з ОДН 2200, 5о що відповідає моделі, згідно якої для оптимальної стимулюючої активності необхідно щонайменше три мотиви о ТО в ОДН. Ймовірно, навіть ще більший рівень стимуляції міг би бути одержаний, якби мотиви ТО були

Із оптимізовані таким чином, як цьому навчають тут.

Приклад 5: Порівняння дії ТТ і мотивів ТО.

На Фіг.3 показані результати експериментів, проведених для вивчення зв'язку між вмістом ТО в плані відношення рівня Т до рівня б і стимулюючою дією ОДН. На Фіг.показано, що ОДН, в якому всі основи рандомізовані між Т і 5 (ОДН 2188 (5ЕО ІО МО. 905)), не надає стимулюючої дії при концентрації О,2мкг/мл, як

Ф) і ОДН, в якому всі основи рандомізовані між А і з (ОДН 2189 (5ЕО ІЮО МО. 906)). Проте при більшій ка концентрації, яка дорівнює 2мкг/мл, рандомізований Т/3 ОДН 2188 надає значно більшу стимулюючу дію. Рівень стимуляції останнім все ще нижче, ніж той, який має місце з повністю рандомізованим ОДН (ОДН 2182 (ЗЕ ІЮ 6о МО. 432)). Найбільша стимуляція при низьких концентраціях спостерігається з ОДН, в якому половина основ фіксована як Т, а друга половина основ рандомізована між Т і 5 (ОДН 2190 (ЗЕО ІО МО. 907)). Оскільки кожна друга основа фіксована як Т, ніяких мотивів ТО виникати не може. Дані фігури З показують, що підвищення вмісту ТО в ОДН поліпшує стимулюючу активність.

В інших експериментах, результати яких не представлені тут у вигляді графіків, ОДН 2190 (5ЕО І МО.907) 65 проявляв стимулюючу МК активність, ранцомизированний, співставну з такою ОДН 2188 (5ЕО ІЮ МО.905) або

ОДН 2189 (5ЕО ІЮО МО.906).

Приклади 6-8

Введення:

Вище заявники показали, що послідовності полі-Т здатні підвищувати стимуляцію В- і МК-клітин. Тут

Заявники досліджують дію множини не-Сро, збагачених Т ОДН, а також полі-С ОДН на предмет їх здатності стимулювати В-клітини, МК-клітини і моноцити людини.

Матеріали і способи:

Олігонуклеотиди: Модифіковані фосфортіосатом ОДН були одержані від АКК Зсіепіййс ЗтрЬН (Оагтвіаді,

Німеччина). Застосовували послідовності: 1982: 5-іссаддаснНсісісаддан-3 (5ЕБО 0 МО. 225), 2006: /о Засдісонноїсонноїсон-я (ЗБО 10 МО 246), 2041: 5-сіюдісшсюонншсюд-3 (ЗЕ 10 МО.282), 2117: 5'-Ігдігойноїдігойноїгон-З (ЗЕО 10 МО.С358), 2137: 5-іІдсідсншоїдснноюси-5' (ЗЕО 10 МО.:886), 2183: 5-3" (ЗЕО ІО МО.:433), 2194: 5-ітпіттштітт-3" (ЗЕО ІО МО.:911), 2196: 5-ЩНННННН-3 0 (ЗЕБО 10 0 МО.С913), 5126: 5-одНнснНодіссноїсьЗУ (5БО 10 0 МО.С1058), 5162: 5-НШЩННННННННННННН-У (ЗБЕО 10 0 МО.1094), 5163; 5-аааааааааааааааааааааааааааааа-3, (ЗЕО І 75 МО.:1095), 5168: Б'-сссссссссссссссссссссссссссссо-3 (ЗЕО ІО МО.:1096) і 5169; 5-сдсдсдсдсдсдсдсодсодсосососососа-3 (5ЕО ІЮ МО.:1097). Більшість ОДН тестували на вміст Р5 за допомогою аналізу ГАЇ. (ВіоууУпічакКег, Бельгія) (нижня межа детекції 0,1 ЕМШ/мл), як тут описано. Для всіх аналізів ОДН розводили в буфері ТІ і зберігали при - 2020. Всі розведення проводили із застосуванням позбавлених пірогену реагентів.

Проліферация клітин і клітинна культура: РВМС людини виділяли з периферичної крові здорових добровольців, одержаної Німецьким Червоним Хрестом (Каїїпдеп, Німеччина), як описано в прикладі 1, але всі матеріали були одержані від І їе Тесппоіодіез, Німеччина, і були перевірені на ендотоксин. Для аналізу активації В-клітин, МК-клітин і моноцитів, РВМС культивували в повному середовищі при концентрації 2х109 клітин/мл в 200мкл в 9б-ямкових круглодонних планшетах в зволожуваному інкубаторі при 372С. Як стимули ЄМ додавали різні ОДН, І Р5 (Зідта) або ІЛ-2 (КО Зувіетвз, США). У вказані моменти часу клітини збирали для о проточної цитометрії.

Проточна цитометрія: Для забарвлення поверхневих антигенів застосовували МАбБе проти: СОЗ, СО14, СО19, сСОо56, с2069, СО80 і СО86 (всі одержано від РІагтіпдеп/Весіоп ОісКіпзоп, Німеччина). У разі моноцитів рецептори Ес блокували за допомогою ІДС людини (МугГепуї, Німеччина), як описано раніше |Вацег, М еї аї., с 1999 |пттипоіоду 97:699). Результати проточної цитометрії для щонайменше 1000 клітин заданої популяції ю (В-клітин, моноцитів, МК-клітин, МКТ-клітин або Т-клітин) одержували за допомогою ЕАСсзсСаїриг (Весіоп

Оіскіпгоп). Дані аналізували за допомогою програми СеїПОпевзі (Весіоп БісКіпвоп). «-

Опосередкована МК цитотоксичністьх РВМС культивували протягом ночі у відсутності або у присутності їм бмкг/мл ОДН або 1Обод/мл ІЛ-2 при 372С, 590 СО». На наступний ранок клітини-мішені К-562 мітили флуоресцентним фарбником СЕЗЕ, як описано раніше для В-клітин людини ІНагітапп, 0., апа. М. Кгпієд. 2000 3. в.

Іттипої. 164:944). РВМС додавали в різних співвідношеннях (50:1, 25:1 і 12,5:1) до 2 х10Уклітин-мішеней та інкубували протягом 4 годин при 372С. Клітини збирали і інкубували із специфічним відносно ДНК фарбником 7-ААО (Рпагтіпдеп) для визначення апоптотичних клітин. Результати виміряли за допомогою проточної « цитометрії. - 70 ТІФА: РВМС (Зх10клітин/мл) культивували з вказаними концентраціями ОДН або І Р5 протягом 24 годину с (ІЛ-6, ІРМУу ії ТМЕРо;) або 8 година (ЗЛ-1р) в 48-ямкових планшетах у зволожуваній атмосфері при 372С. Збирали :з» супернатанти, і цитокіни виміряли за допомогою ОРтТеїа наборів ТіФА (Ріагтіпдеп) для ІЛ-6, ІРМ у і ТМЕо, або

Еїї-раїг ТІФА (Ноеї2еї, Німеччина) для ІЛ-1В відповідно до протоколів виробника.

Приклад 6: активація В-клітин, індукована ОДН, що не містять мотивів Сро. -І В описаних вище експериментах прикладу З заявники продемонстрували, що збагачені Т ОДН здатні активувати В-клітини. Тут дані експерименти були розширені із застосуванням додаткових ОДН і різних джерел - клітин і реагентів. В першій серії експериментів заявники порівняли активуючий потенціал різних не-Сро, - збагачених Т ОДН з відомим дуже сильним Ср ОДН 2006 (ЗЕО І МО.:246). РВМС (2х105клітин/мл) донора

Крові (п-2) інкубували з вказаними концентраціями ОДН 2006 (ЗЕ ІЮ МО.:246), 2117 (ЗЕО ІО МО.:358), 2137 о (ЗЕО ІО МО.:886), 5126 (ЗЕО ІЮ МО.:1058) і 5162 (5ЕО ІЮ МО.:1094). Клітини інкубували протягом 48 годин при з 372С, як описано вище, і фарбували тАб проти СО19 (маркера В-клітин) і СО86 (маркера активації В-клітин,

В7-2). Експресію виміряли за допомогою проточної цитометрії.

Застосовуючи різні концентрації ОДН, автори винаходу показали (Фіг.4), що збагачених Т ОДН, що не містять мотиву Сро, можуть індукувати стимуляцію В-клітин людини. ОДН 5126 (ЗЕО ІЮО МО.:1058), який містить лише одну послідовність полі-Т, але в якому вміст Т вище 5095, викликав високий рівень активації В-клітин людини.

Ф) Хоча даний ОДН має деяку схожість з ЗЕО ІЮ МО.:246 (наприклад, більше 8095 вміст Т/5), він точно не містить ко будь-який з відомих імуностимулюючих мотивів Сро. Несподівано виявилося, що для всіх тестованих збагачених

Т ОДН найбільший показник стимуляції виявляється при концентраціях між З і 1їОмкг/мл. З тестованих ОДН бо найбільший індекс стимуляції досягався з Сро/- збагаченим Т ОДН ЗЕО ІО МО.:246 при 0,4мкг/мл. Цікаво, що активність знижувалася при високих концентраціях.

Були синтезовані і тестуються на біологічну активність послідовності полі-А, полі-С і полі- ТТ. РВМС (2х10бклітин/мл) від одного типового донора (п-3) стимулювали, як описано вище, 0,4мкг/мл, 1,О0мкг/мл або 10,Омкг/мл наступних ОДН: 2006 (5ЕО ІЮО МО.:246), 2196 (5ЕО ІЮО МО.:913) (полі-Т, 18 основ), 2194 (ЗЕО І 65 МО.:911) (полі-Т, 27 основ), 5162 (5ЕБО ІЮО МО.:1094) (полі-Т, ЗО основ), 5163 (5ЕБЕО ІЮ МО.:1095) (полі-А, 30 основ), 5168 (ЗЕО ІЮ МО.:1096) (полі-С, ЗО основ) і 5169 (5ЕО ІЮО МО.:1097) (полі-СО, ЗО основ). Експресію маркера активації СО86 (87-2) на СВ19-позитивних В-клітинах виміряли проточною цитометрією.

На Фіг.5 показано, що довжина послідовності щонайменше для ОДН полі-Т, вносить істотний внесок в їх активність. Послідовність полі-Т, що містить лише 18 основ (ЗЕО ІЮ МО.:913), як було показано, надає меншу стимулюючу дію у порівнянні з послідовністю з 27 основ (ЗЕО ІЮ МО. С911) або з 30 основ (5БЕО ІЮ МО.:1094) при чіткому ранжуванні стимуляції: 5ЕО ІЮ МО.:1094256О ІЮ МО.:91125Б6О0 ІЮО МО.:913. Послідовності полі-А (ЗЕО ІЮ

МО.:1095) або полі-СО (ЗЕО І МО.:1097), навпаки, не індукують активацію В-клітин людини. Несподівано було також знайдено, що послідовності полі-С (ЗЕО І МО.:1096) можуть активувати В-клітини людину при високих концентраціях (1Омкг/мл) (Фіг.5). 70 Два інших збагачених Т ОДН, а саме, 1982 (З5ЕО ІО МО.:225) і 2041 (5ЕО ІО МО.:282), що не містять мотивів

Сро, тестували на предмет їх впливу на В-клітини людини. РВМС (п-2) інкубували з вказаними концентраціями

ОДН 2006 (5ЕО ІЮО МО.:246), 1982 (ЗЕБЕО ІЮО МО.:225) і 2041 (5ЕО ІЮО МО.:282), як описано вище. Активацію

В-клітин (експресію маркера активації СО86) виміряли проточною цитометрією.

На Фіг.б6 продемонстровано, що збагачені Т не-Сро ОДН є імуностимуляторами при концентраціях вище 7/5 мкг/мл. Включення мотиву Сро в 1982 підвищувало імуностимулюючу активність. Подовження за допомогою полі-Т не збільшувало імуностимулюючу активність даного, вже збагаченого Т ОДН, і, навпаки, злегка знижувало активуючий потенціал.

Приклад 7: Імуностімуляція не-Сро ОДН відображається в підвищенні активації МК. цитотоксичності МК і активації моноцитів.

МК-клітини, а також моноцити тестували на їх відповідь на не-Сро ОДН. РВМС (2х10Єклітин/мл) інкубували з бмкг/мл наступних ОДН (п-4): 2006 (5ЕО ІЮО МО.:246), 2117 (ЗЕО ІЮ МО.:358), 2137 (ЗЕО ІЮ МО.:886), 2183 (ЗЕО ІО МО.:433), 2194 (5ЕО ІЮО МО.:911) і 5126 (ЗЕО ІО МО.:1058). Через 24 години культивування при 372 клітини збирали і фарбували тАБ проти СОЗ (маркера Т-клітин), СО56 (маркера МК-клітин) і СО69 (маркера ранньої активації), як описано вище. Експресію СО6О на СО5б-позитивних МК-клітинах виміряли проточною Ге

Ццитометрією. о

На Фіг.7 показано, що для полі-Т можуть бути одержані ефекти, схожі з описаними на Фіг.5. На стимуляцію

МК-клітин, як і В-клітин, може робити вплив довжина ОДН. За наслідками вимірювання підвищення експресії маркера ранньої активації СО69, ОДН 2183 (5ЕО ІЮ МО.:433) (21 основа) індукував активацію МК-клітин, але у меншій мірі, ніж більш довгий ОДН 2194 (ЗЕО І МО.:911) (27 основ). ОДН 5126 (5ЕО ІО МО.:1058),як було СІ показано, також активує МК-клітини людини (Фіг.7).

Вважають, що протипухлинна активність Ср ОДН може бути оцінена за здатністю ОДН підвищувати о опосередковану МК цитотоксичність іп мйго. Було показано, що ОДН, що містять на 5- і 3-кінцях ділянки - полі-с, викликають найбільшу індукцію цитотоксичності |ОаНав, 7. К., еї аІ. 1996 9. Іттипої. 157:1840). Для дослідження впливу не-Сро, збагачених Т ОДН на цитотоксичність МК заявники аналізували дію ОДН 2194 (ЗЕО - 10 МО.:911) і 5126 (ЗЕБО ОО МО.:1058) на опосередкований МК лізис (Фіг.8). Опосередкований МК лізис /|Їч« клітин-мішеней К-562 виміряли після інкубації протягом ночі РВМС з бмкг/мл ОДН 2006 (ЗЕО ІЮО МО.:246), БЕО ІЮ

МО.:911 (ЗЕО ІЮО МО.:911) (полі-Т, 27 основ) апа 5126 (ЗЕО ІО МО.:1058), як описано вище. 5ЕО ІЮ МО.:1058 викликав невелике збільшення лізису під дією МК-клітин людини, у порівнянні із спостережуваною у відсутності «

ОДН. 5ЕО ІО МО.:911 і ЗЕО І МО.:246 підвищували цитотоксичність МК-клітин людини навіть більшою мірою.

В попередніх повідомленнях було показано, що не тільки МК-клітини, але і МКТ-клітини служать провідниками - с цитотоксичних відповідей на пухлинні клітини (14). Тому заявники перевірили посилення активації МКТ-клітин ц людини під дією збагачених Т, не-Сро ОДН. РВМС від одного типового донора (п-2) інкубували з бмкг/мл ОДН "» 2006 (5ЕО ІЮО МО.:246), 2117 (ЗЕО ІЮО МО.:358), 2137 (ЗЕБО ІЮО МО.:886), 2183 (5ЕО ІО МО.:433), 2194 (5ЕО І

МО.:913) ї 5126 (5БО ІЮО МО.:1058) протягом 24 годин, як описано вище. Активацію МКТ-клітин виміряли проточною цитометрією після фарбування клітин тАбБ проти СОЗ (маркера Т-клітин), СО56 (маркера МК-клітин) і - І СОб69 (маркера ранньої активації). Показання є експресією СОб6О на СОЗ3- і СО56-двічі позитивних клітинах (МКТ-клітинах). ї Як показано на Фіг.9, 5ЕБЕО І МО.:911, як і ЗЕО 0 МО.1058 стимулювали МКТ-клітини. Як і у разі - МК-клітин, ЗЕО ІЮ МО.:911 (полі-Т) був активнішим, ніж ЗЕО ІЮ МО.:1058.

Крім того, також як це було описано вище для В-клітин і МК-клітин, довжина ОДН робить певний вплив на і-й імуностимулюючий потенціал, причому більш довгий ОДН надає більш сильну дію на МКтТ-клітини. Схожі

Що) результати спостерігалися для Т-клітин людини.

Іншим типом клітин імунної системи, що беруть участь в боротьбі з інфекціями, є моноцити. Дані клітини після активації виділяють множину цитокінів і можуть розвиватися в дендритні клітини (ОС), що спеціалізуються як антиген-представляючі клітини (Ко, !., У. Вговіої, апа О. Маїе. 1998. Іттипоіоду. Могбу, Іопадоп). На о Фіг.10 показана активація моноциту людини після культивування РВМС з різними ОДН. РВМС (2 х10клітин/мл) інкубували з бмкг/мл 2006 (5ЕО ІЮ МО.:246), 2117 (5ЕО ІО МО.:358), 2137 (5ЕО 30 ІЮ МО.:886), 2178 (ЗЕО ІЮ іме) МО.:1096), 2183 (ЗЕО ІЮ МО.:433), 2194 (5ЕО ІЮО МО.:911), 5126 (ЗЕО ІЮ МО.:1058) і 5163 (5ЕО ІЮО МО.:1095) протягом ночі при 372С, як описано вище (п-3). Клітини збирали і фарбували на СО14 (маркер моноцитів) і СО8О 60 (87-1, маркер активації). Експресію виміряли проточною цитометрією.

Як і в показаних вище випадках МК- і В-клітин, збагачені Т-послідовності (наприклад, ЗЕО ІЮ МО.:433, ЗЕО

І МО.:911) різної довжини індукують стимуляцію моноцитів, але володіють іншими рівнями активності, наприклад, ЗЕО ІЮ МО.:433»25ЕО ІЮ МО.:911. Послідовності полі-А (ЗЕО ІЮО МО.:1095), як і полі-С (5ЕО ІЮ

МО.:1096 (2178), навпаки, не викликали активації моноцитів (виміряній за стимуляцією СО8О при концентрації 65 ОДН бмкг/мл).

Приклад 8: Індукція виділення цитокінів під дією не-Сро ОДН

Після цього досліджували здатність різних збагачених Т ОДН впливати на цитокінове оточення. РВМС (Зх10бклітин/мл) культивували протягом 24 годин у відсутності або у присутності бмкг/мл вказаних ОДН або 1мкг/мл ГРБ5 як позитивного контролю (п-2). Після інкубації збирали супернатанти, і ТМЕРа виміряли за допомогою ТІФА, як описано вище, і результати показані на Фіг.11. РВМС культивували з вказаними ОДН (1,Омкг/мл) як описано на Фіг.11, і ІЛ-Є виміряли в супернатантах за допомогою ТІФА, як описано вище, і результати показані на Фіг.12.

На Фіг.11 і 12 показано, що збагачені Т, не-СроО і збагачені Т/Ср ОДН можуть індукувати секрецію прозапальних цитокінів ТМЕо, і ІЛ-6. В більшості аналізів було знайдено, що відносно обох цитокінів ОДН 5126 70 (ЗБОЮ МО.:1058) є таким же ефективним, як і ОДН 2194 (5ЕО ІО МО.:911). Відомо, що Сро ОДН впливають на співвідношення ТИ1/Тп2 за рахунок переважної індукції цитокінів ТА1 (Кгігд. М. 1999 Віоспетіса еї Віорпузіса

Асіа 93321:1). Для визначення того, чи викликають збагачені Т ОДН схожий зсув у бік ТИ1 цитокінів, виміряли продукцію РВМСО ІЕМУу. В першій серії експериментів було показано, що, як і у випадках, описаних для ІЛ-6б і ТМЕо,

ОДН 5ЕО ІО МО.:1058 і ЗЕО ІЮО МО.:911 індукують виділення схожих кількостей даного ТАТ цитокіну ІРМУу. Крім 72 того, було показано, що інший прозапальний цитокін, ІЛ-1Д, виділяється при культивуванні РВМС з даними двома

ОДН. Хоча кількість даних цитокінів, індукованих збагаченими Т ОДН, що не містять мотивів Сро, була нижче, ніж при застосуванні Сро ОДН 5ЕО ІО МО.:246, індуковані збагаченими Т ОДН кількості були значно вищими, ніж в контролі.

Приклади 9-11

Введення:

Тут описується мотив Сро, оптимальний для активації імунної системи у хребетних, відмінних від гризунів.

Було знайдено, що фосфодіефірний олігонуклеотид, що містить даний мотив, сильно стимулює експресію СО86, ср40, СО54 і МНС Ії, синтез ІЛ-6 і проліферацію первинних В-клітин людини. Для даних ефектів необхідна інтерналізація олігонуклеотиду і дозрівання в ендосомах. Даний мотив Ср пов'язаний з тривалою індукцією с гетеродимеру МЕкВ роО/рб5 і білком-ї, що активує комплекс транскрипційних факторів (АР-1). Активації (3 транскрипційних факторів під дією СроО-ДНК передує підвищене фосфорилювання стресових кіназ с-|чп, МН 2 кінцевої кінази (МК) і р38 і активуючого транскрипційного фактора-2 (АТЕ-2). На відміну від Сро, сигналізація через рецептор В-клітин веде до активації кінази позаклітинного рецептора (ЕКК) і фосфорилюванню іншої ізоформи УМК. с

Матеріали і способи: юю

Олігонуклеотиди: Немодифіковані (фосфодіефірні, РЕ) і модифіковані, стійкі до нуклеаз (фосфортіоатні, Р)

ОДН були одержані від Орегон Тесппоодіез (АіІатеда, СА) і Нубгідоп Зресіанйу Ргодисів (Мімкога, МА). -

Застосовані послідовності представлені в таблиці Н. ДНК Е. соїї і ДНК тимусу телят одержані від Зідта ч-

Спетіса! Со., 5. І оців, МО. Зразки геномної ДНК очищали екстракцією сумішшю фенол-хлороформ-ізоаміловий спирт (25/24/1) і осадженням етанолом. ДНК очищали від ендотоксину повторною екстракцією тритоном Х-114 - (бБідта СПпетіса! Со., 5ї. Іоців, МО) і тестували на ендотоксин за допомогою аналізу ГАЇ (ГАЇ -аззау

Віомупійбакег, УМаїЇКегеміїє, МО; нижня межа детекції ОД ЕШ/мл) і високочутливого аналізу ендотоксину, описаного раніше (нижня межа детекції 0,0014 ЕШ/мл) (Нагптапп 0., апа Кгіегд А. М. 1999. Сро ОМА апа г РБ « іпдисе дівііпсі рацегпз асіїмайоп іп питап топосуїез. Сепе ТПегару 6:893). Вміст ендотоксину у зразках ДНК З т0 був нижче 0,0014од./мл. ДНК Е. соїї і тимусу телят перед застосуванням робили одноланцюговими шляхом с кип'ятіння протягом 10 хвилин з подальшим охолоджуванням на льоду протягом 5 хвилин. Зразки ДНК "з розводили в буфері ТЕ із застосуванням позбавлених пірогену реагентів. -І -І - с 50

Ко)

Ф) іме) 60 б5 й ш Що п а нн ни п о с

Одержання клітин і клітинна культура: Мононуклеарні клітини периферичної крові людини (РВМС) виділяли з периферичної крові здорових добровольців шляхом центрифугування в градієнті густини РісоіП-Радце -і (Нівюорадце-1077, Зідта Спетіса! Со., 5. Гоців, МО), як було описано |Наггаапп 0., еї аї., 1996 Апіізепзе - Мисіеїс Асії Огид ЮОем 6:2911). Клітини суспендували в культуральному середовищі КРМІ 1640 з добавкою 1090 (об./06.) інактивованої нагріванням (562, 1 година) ЕС5 (НусСіопе, І одап, ОТ), 1,5мММ І-глутаміну 100 Ш/мл -й пеніциліну їі 10Омкг/мл стрептоміцину (всі від Сібсо ВК, Сгапа Івіапа, МУ) (повне середовище). Всі сполуки сл 50 одержували перевіреними на ендотоксин. Життєздатність визначали до і після інкубації з ОДН за виключенням трипанового синього (традиційна мікроскопія) або виключенням йодного пропідію (аналіз проточною

Із цитометрією). У всіх експериментах від 9695 до 99956 РВМС були життєздатними. Клітини (кінцева концентрація 1х105клітин/мл) культивували в повному середовищі в 595 СО» у зволожуваному інкубаторі при 372С. Як стимули застосовували різні олігонуклеотиди (дивись таблицю І, при концентрації, вказаній в підписах до фігур), ЛІС 29 (з заІтопейа їурпітигішт, Зідта Спетіса! Со., 5. -Ї оців, МО) або анти-І9ОМ. Для блокування ендосомального

ГФ) дозрівання/закисляння застосовували хлорокін (мкг/мл; Зідта Спетіса! Со., 5. І оців, МО). У вказані моменти юю часу клітини збирали для проточної цитометрії, як описано нижче.

Для вивчення проведення сигналу первинні В-клітини людини виділяли за допомогою імуномагнітного сортування клітин із застосуванням апарату МАКІОМАС5 (Мійепуі Віоїес Іпс., А!Їцригп, СА), як описано 60 виробником. Коротко, РВМС, одержані з світлого шара кров'яних згустків крові здорових донорів (ЕІтег Ї.

Оебоміп Віоод Сепіег, Опімегейу Іжа), інкубували мікросферами, кон'югованими з антитілом проти СО19, і пропускали через колонку позитивної селекції. Чистота В-клітин перевищувала 9595. Після стимуляції одержували екстракти цільних клітин (для імуноблотингу) і ядерні екстракти (для ЕМ5ЗА) для дослідження проведення сигналу. бо Для вивчення зв'язування Сро білками клітини Катоз (лінія клітин В-клітинної лімфоми людини Вигкік, АТС

СТІ -1923 або СКІ -1596; Іпіегмігоїоду 5: 319-334, 1975) вирощували в повному середовищі. Збирали необроблені клітини, одержували екстракти цитозольного білка і аналізували на наявність білків, що зв'язують Сро, за допомогою ЕМ5А і поперечного зшивання УФ, як описано нижче.

Проточна цитометрія: антигени визначали, як описано раніше (Нагітапп 0. еї аі!., 1998) Рпагтасої Ехр Тег 285:920). Моноклональні антитіла проти НІ А-ОК були одержані від Іттипоїесі, Магзейе, Франція. Вся решта антитіл одержувала від Ріагтіпдеп, Зап Оіедо, СА: тАВ проти СО19 (843), 2040 (523), СО54 (НАБ5В8В), СО86 (2331 (РОМ-1)). Іде к (МОРС-21) і ІдО2ьк застосовували для контролю специфічності фарбування, Фарбування внутрішньоклітинного цитокіну для ІЛ-6 проводили, як описано (Нагітапп 0., апа Кгігд. М. 1999. Сро ОМА апа 7/0 ІРЗ іпацсе аїзіпсї рабегоз асіманоп іп питап топосуїез. Сепе ТПпегару 6:893). Коротко, РВМС (кінцева концентрація 1 х1Обклітин/мл) інкубували у присутності брефелдину А (кінцева концентрація мкг/мл, Зідта

Спетіса! Со., ЗІ. Гоців, МО). Після інкубації клітини збирали і фарбували за допомогою міченого РІТС тАВ проти СО 19 (В43), міченого РЕ тАВ криси проти ІЛ-6 людини (МО2-6АЗ, РНнагтіпдеп) і набору Ріх апа Регт Кії (Саї(ад І арогаюгіез, Вигіпдате, СА). Результати проточної цитометрії для 5000 клітин на зразок оцінювали на 75 ЕАСбЗсап (Вескіоп Оіскіпвоп Іттипосуїотейу Зувіетв, Зап дове, СА). Нежиттєздатні клітини виключали з аналізу забарвленням йодним пропідієм (2мкг/мл). Дані аналізували за допомогою комп'ютерної програми

Еіомло (версія 2.5.1, Тгее 5іаг, Іпс., їаптога, СА).

Аналіз проліферації: СЕБЕ (5-(і 6-) карбоксифлуоресцеїну діацетату сукцинимідильний ефір, Моіесшаг

Ргорез, США) представляє собою внутрішньоклітинну флуоресцентну мітку - похідне флуоресцеїну, яка рівномірно розподіляється між дочірніми клітинами при клітинному розподілі. Забарвлення клітин СЕЗЕ забезпечує як кількісну оцінку, так і імунофенотипування (мічені фікоеритрином антитіла) проліферуючих клітин у змішаній клітинній суспензії. Коротко, РВМС двічі промивали у ЗФР, ресуспендували у ЗФР, що містить СЕБЕ в кінцевій концентрації 5мкМ, і інкубували при 372С протягом 10 хвилин. Клітини промивали тричі ЗФР і інкубували протягом п'яти днів, як вказано в підписах до Фіг. СО19-позитивш В-клітини, які проліферували, ідентифікували Ге за зниженим вмістом СЕБЕ проточною цитометрією. о

Одержання білкових екстрактів цілих клітин, ядер і цитозолю: Для Імуноблотінгу одержували екстракти цілих клітин. Первинні В-клітини обробляли середовищем, фосфодіефірними олігонуклеотидами 2080 (5ЕО ІЮ

МО.:321) або 2078 (5ЕО ІО МО.:319) в концентрації ЗОмкг/мл або анти-І9М (1Омкг/мл). Клітини збирали, двічі промивали охолодженим на льоду ЗФР, що містить ТММ МазуО,, ресуспєндували в буфері для лізису (15ОММ с

Масі, 10ММ трис рН7,4, 195 МРА0О, 1мМ МазМО,, 50мМ Мак, ЗОмг/мл леупептину, 50мг/мл апротиніну, 5мг/мл антипаїну, 5мг/мл пепстатину, 5Омкг/мл фенілметилсульфонілфториду (РМ5БЕ)), інкубували протягом 15хв. на о льоду і центрифугували при 14000об./хв. протягом 10хв. Супернатант заморожували при -802С. Для одержання - ядерних екстрактів первинні В-клітини ресуспєндували в гіпотонічному буфері (Л10ММ НЕРЕЗ/КОН (рН? 9), 10ММ м

КСІ 0,596 МР40, 1,5мММ Мосі», О,5ММ дитіотреїтол (ОТ), 0,5ММ РМ5БЕ, ЗОмг/мл леупептину, 5Омг/мл апротиніну, 5мг/мл антипаїну, бмг/мл пепстатину). Через 15 хвилин інкубації на льоду суспензію центрифугували при їх 1000х9 протягом 5 хвилин. Осаджені ядра ресуспєндували в буфері для екстракції (20ММ НЕРЕЗ (рН7-9), 45ОММ масі, 50мМ Макв, 2095 гліцерину, їмМ ЕДТА, їмММ ЕГТА, їмМ дитиотреїтол (ОТ), їМмМ РМ5БЕ, ЗОмг/мл леупептину, 5О0мг/мл апротиніну, 5мг/мл антипаїну, 5мг/мл пепстатину) і інкубували на льоду протягом однієї « години. Ядерну суспензію центрифугували протягом 10 хвилин при 160009 при 42С. Супернатант збирали і зберігали при -802С. Цитозольні екстракти для досліджень зв'язуючих Сро білків одержували з нестимулюючих З с клітин Катоз, які лізували за допомогою гіпотонічного буфера, як описано для одержання ядерного екстракту. "» Після центрифугування супернатант відділяли як цитоплазматичну фракцію і зберігали при -802С. Концентрацію " білка виміряли за допомогою аналізу білка за Вгадоога (Віо-Кад, Негсиціез, СА) відповідно до інструкції виробника.

Імуноблотінг: Білкові екстракти цілих клітин з рівною концентрацією (25мкг/доріжку) кип'ятили в буфері 35 для зразка в ДЦО-Ма (5ОММ трис-НСІ, рНб,8; 195 В-меркаптоетанолу; 295 ДДОС-Ма; 0,196 бромфенолового - синього; 1095 гліцерину) протягом 4хв. перед проведенням електрофорезу в 1095 поліакриламідному гелі, що -І містить 0,196 ДДОС-Ма (ДДС-Ма-ПААГ). Після електрофорезу білки переносили на ІітоБбійоп-Р переносні з мембрани (МіПіроге Согр. Ведтога, МА). Відбитки блокували 595 знежиреним сухим молоком. Застосовували специфічні антитіла проти фосфорильованої форми кінази позаклітинних рецепторів (ЕКК), МН2-кінцевої кінази с 20 с-їмп (МК), рЗ38 і активуючого транскрипційного фактора-2 (АТЕ-2) (Мем Епдіапа Віоїарз, Вемепу, МА).

Відбитки проявляли в посиленому хемолюмінесцентному реагенті (ЕСІ; Атегепат Іпіегпайопаї!, АуІезригу, ї» Великобританія) відповідно до процедури, що рекомендується виробником.

Аналіз зміни електрофоретичної рухомості (ЕМ5А):

Для визначення ДНК-зв'язуючої активності транскрипційного фактора активуючого білка-1 (АР-1) і МЕ/ кВ 59 ядерні екстракти (1мкг/доріжку) аналізували за допомогою ЕМ5А із застосуванням ДОДН 5 САТ СТА СТО АТО

ГФ) АСТ САС ССО АТ С 3 (5ЕО ІЮ МО.:838), що містить зв'язуючу АР-1 послідовність, і МЕ/КВ ОКЕ з промоторної

ГІ області с--пус 5 ТОС АСО АдОо ТСС ооо ТТ ТСС ССА АС ССС С 3 (5ЕО І МО.:1142) як зондів. ОДН мітили за допомогою Т4-полінуклеотидкінази (Мем Епдіапа Віоїарв) і (у-?р) АТФ (Атегепат, Агіпдіоп Неїднів, І. бо Реакції зв'язування проводили з 1мкг білка ядерного екстракту в буфері для зв'язування ДНК (10мММ трис-НСЇІ рН7,5), 40мММ МосСі», 20мММ ЕДТА, мМ дитіотрейтолу, 895 гліцерину і 100-40Онг полі (дІ-4С) з 20000-40000бімп/хв. міченого ОДН в сумарному об'ємі 1Омкл. Специфічність смуг МЕ/КВ підтверджували дослідженнями конкуренції з неміченими олігонуклеотидами, відповідними сайтам зв'язування неродинного транскрипційного фактора (10-10О0нг). Для аналізу суперзсуву в реакційну суміш додавали 2мкг специфічних 65 антитіл проти с-Кеї, ро і рб5 (Запіа Сти2 Віобїесппоіоду, Іпс., Запіа Сти7, СА) за ЗОхв. до додавання радіоактивно міченого зонда. Після інкубації протягом 30 хвилин при кімнатній температурі додавали буфер для нанесення, і зразки піддавали електрофорезу в 695 поліакриламідному гелі в трис-борат-ЕДТА буфері для розділення (90мМ трис, 90мММ борна кислота, 2ММ ЕДТА, рНВ,0). Гелі сушили і потім піддавали авторадіографії.

Поперечне зшивання УФ і денатуруючий електрофорез білка: Ядерні екстракти інкубували з міченим фосфодіефірним олігонуклеотидом, як описано для ЕМ5БА. Комплекси ДНК-білок поперечний зшивали з допомогою УФ опромінювання в апараті ЗігайарйпКег (Зігабадепе) протягом 10 хвилин. Зразки змішували з

ДДО-Ма-буфером для зразків, кип'ятили протягом 10 хвилин і наносили на 7,595 ДЦО-Ма-ПААГ для електрофорезу. Гель сушили на папері МУпайтап і авторадіографували. Шляхом відкладання відстані проти молекулярної маси маркерних білків одержували стандартну криву, яку застосовували для розрахунку 70 приблизної молекулярної маси поперечний зшитих комплексів білок-ОДН. Для одержання розміру з даної величини віднімали молекулярну масу олігонуклеотиду.

Приклад 9: Визначення оптимального Сро-мотиву для застосування окремо або в поєднанні із збагаченим Т

ОДН

На імунних клітинах людини фосфортіоатні олігонуклеотиди, що містять специфічний для миші мотив Сро 7/5 ЗАСОТТ (ЗЕО ІЮ МО.:1143) (наприклад, 1826 (ЗЕО ІО МО.:69)) і застосовані в концентраціях, активних відносно

В-клітин миші (Жі А. к., Спапд М., РесКпат 0. МУ., Кгтіед. М., апа Авптап КК. Р. 1998. Сро оЇїдодеохугірописіеоіїідез гевзсце тайшге зрієеп В сеїЇїв їйот зропіапеоиз ароріозів апа рготоїе сеїЇ сусіе епігу. У Іттипо! 160:5898), показали слабку імуностимулюючу активність або відсутність такої. При великих концентраціях даний олігонуклеотид проявляв деяку стимулюючу дію на В-клітини людину.

В попередніх роботах за активацією В-клітин миші було знайдено, що Сро-динуклеотид, фланкований двома 5 пуринами і двома В піримідинами, і переважно б-членний мотив 5 СЗАСОСТТ 3 (5ЕБЕО ІЮ МО:1143) є оптимальним для активності фосфодіефірного олігонуклеотиду |Кгіед. М., еї аІ. 1995 Майте 374:546, Хі А. К.,

Спапо М. еї аї., 1998 У) Іттипої 160:58981.

Для виявлення оптимального мотиву для стимуляції імунної відповіді у людини і хребетних, відмінних від сч ов гризунів, заявники створили ряд ОДН і провели тестування їх активності. По-перше, заявники створили 20--ленний фосфодіефірний олігонуклеотид з динуклеотидом ТС з 5-кінця оптимального мотиву Сро миші і)

САСОСТТ 3 (5ЕО ІО МО.:1143) і подальшим полі С хвостом (2079: 5 ТСОо АСОо То сосС сс сс сс (ЕІ

МО.:320)). Якщо даний олігонуклеотид додавали до первинних В-клеткам людини при тих же умовах, які, як було знайдено, є оптимальними для ДНК Е. соїї (повторне додавання Через 0 годин, 4 години і 18 годин; ЗОмкг/мл для с

Зо Кожної тимчасової точки), то він стимулював високий рівень експресії СО8б на первинних В-клітинах людини через два дні. Для визначення зв'язку між структурою і функцією мотивів Сро заявники замінювали основи, о суміжні з СрО-динуклеотидами при збереженні в послідовності двох СрО-динуклеотидів. Заміна аденіну, «- розташованого між двома СрОо-динуклеотидами, на тимідин (2080 (ЗЕО ІЮО МО.:321)) призводила до невеликого підвищення активності. Заміна гуанозином (2100 (ЗЕО ІЮ МО.:341)) або цитидином (2082 (5ЕО ІО МО.:323)) в ї- зв даному положенні не викликала помітних змін у порівнянні з 2079 (ЗЕО ІЮО МО.:320). В той же час заміна ї- тимідину з З-кінця від другого Срі-динуклеотиду пуринами гуанозином (2099 (ЗЕО ІЮО МО.:340)) або аденіном (2083 (5ЕО ІЮО МО.:324)) приводила до істотного падіння активності олігонуклеотиду, тоді як піримідин цитидин викликав лише невелике зниження. Важливий був також тимідин, безпосередньо примикаючий до 5'-кінця першого Сро-динуклеотиду. Заміна тимідину на будь-яку іншу основу (2105 (5ЕО ІЮО МО.:346), гуанозин; 2107 « (5ЕБЕО ІЮ МО.:348), аденін; 2104 (5ЕБО ІЮ МО.:345), цитидин) приводила до значного зниження активності з с олігонуклеотиду. Видалення першого (2108 (ЗЕО ІО МО.:349)) або другого (2106 (5ЕБО ІЮ МО.:347))

Й Сро-динуклеотиду також частково знижувало активність. и?» Додавання додаткових 5 ТС 3 (5ЕО ІЮ МО.:1144) мотивів Сро до фосфодіефірного олігонуклеотиду містить 8--ленний дуплексний Сро-мотив (5 ТСОТСОТТ 3 (ЗЕБЕО ІЮ МО:1 145), 2080 (ЗЕО ІЮО МО.:321)), не

Викликало додаткового підвищення експресії СО8б на В-клітинах (2059 послідовністю, що і 2080 (ЗЕО ІО -І МО.:321), але з фосфортісатним остовом, не проявляв активності, що перевищує фонову (2116 (5ЕО ІЮ

МО.:357)). Це було несподіваним оскільки, як повідомлялося, фосфортіоатний остов значно стабілізує

Ш- олігонуклеотиди і підвищує індуковану СрО стимуляцію (Кгтіед. М., Мі А. К., Маї зоп 5., МУаідзсптіа Т. 9., - Вівпор О.., Теаздаіе К., Когеї2Ку с., апа Кіптап ОО. М 1995. СрО поїв іп Басіегіаї ОМА Гіддег аїгесі 5о В-сеї! асіїманйоп. Майте 374:546). Тому заявники провели додатковий структурно-функціональний аналіз о фосфортіоатних олігонуклеотидів, що містять 5 ЗТСОТТ 3 (ЗБО ІО МО:1144) і 5 ТСОТСОТТ У (5ЕБЕО І

Ге МО:1145) мотиви, який показав що додаткові мотиви Сро (2006 (ЗЕБЕО І МО.:246)) сприяють підвищенню активності фосфортісатних олігонуклеотидів.

Очищені В-клітини, виділені з периферичної крові за допомогою імуномагнітного сортування клітин, ов активували Сро-ДНК до такого ж ступеня, як і неочищені В-клітини в РВМС. Таким чином, активація В-клітин є первинною відповіддю, а не вторинною відповіддю, викликаною цитокінами, секретованими іншими клітинами.

Ф) Окрім ко-ссамулюючої молекули СО86, функціональну стадію В-клітин характеризують й інші поверхневі ка маркери. Наприклад, активовані хелперні Т-клітини стимулюють В-клітини лігуванням СО40, молекула 1 міжклітинної адгезії (ІСАМ-1, СОБ54) опосередкуватиме зв'язування з іншими імунними клітинами, а головний бо Комплекс І! гістосумісності (МНС 1) відповідальний за презентацію антигена. Заявники знайшли, що експресія сСр40, сСО054 і МНС І В-клітинами стимулюється СрО-олігонуклеотидом 2080 (ЗЕБЕО 10 МО.:321).

Не-Сро-контрольний олігонуклеотид 2078 (5ЕО ІО МО.:319) не проявляв активності у порівнянні з активністю одного середовища.

Коли РВМС інкубували протягом 5 днів у присутності 2080 (ЗЕО ІО МО.:321) (що додається через 0 годин, 4 65 Години, 18 годин і кожного подальшого ранку), на превеликий подив виявилося, що субпопуляція лімфоцитів збільшується у розмірі клітин (ЕС) і стає більш гранулярною (З5С). Для вивчення питання про те, чи не представляє собою дана популяція проліферуючі клітини, заявники фарбували свіжовиділені РВМС за допомогою СЕЗЕ (5-(і 6-) карбоксифлуоресцеїну діацетату сукцинимідильним ефіром) в день 0 і інкубували їх протягом 5 днів з 2080 (5ЕО ІЮ МО.:321), як описано вище. СЕБЕ представляє собою флуоресцентну молекулу, яка необоротно зв'язується з клітинними білками. Кожний клітинний розподіл знижує забарвлення СЕЗЕ на 5096.

Було знайдено, що слабопофарбовані СЕЗЕ клітини (проліферуючі клітини) представляють собою головним чином СО19-позитивні В-клітини. Олігонуклеотид 2080 (ЗЕО ІЮ МО.:321) індукував проліферацію від 60 до 7090

СО 19-позитивних В-клітин в межах 5 днів. Контрольний олігонуклеотид 2078 (ЗЕБЕО ІЮ МО.:319) індукував проліферацію менше 595 В-клітин. Проліферуючі В-клітини (з низьким рівнем СЕЗЕ) володіли великим розміром 7/0 клітин (ЕЗО) Її більшою грану лярністью.

Проліферуючі В-клітини експресували СО8б на більш високому рівні у порівнянні з непроліферуючими клітинами (не показано). Відповідно до даного спостереження набір олігонуклеотидів, що тестується вище на предмет індукції експресії СО86, викликав майже ідентичний патерн проліферації В-клітин. Заміна 3' тимідину знижувала активність більшою мірою, ніж заміна тимідину в середньому положенні.

Приклад 10: Для активації В-клітин необхідне дозрівання/закислення ендосом.

Раніше було показано, що хлорохін, інгібітор закислення ендосом, блокує опосередковану Сро стимуляцію мишачих антиген-представляючих клітин і В-клітин, але не впливає на опосередковані І Р5 ефекти |НаскКег Н., еї а! 1998 Етбро . 17:6230, Хі. К. еї аІ 1998 3 Іттипо! 160:4755, Мастапапе 0. Е., апа Мап?геї І. 1998 9) Іттипої 160:1122). Заявники знайшли, що додавання 5мкг/мл хлорохіну повністю блокує опосередковану Сро-індукцію експресії СО86 на первинних В-клітинах (МЕРІ СО86: 2006 (5ЕО ІЮО МО.:246), 4,7 проти 1,4; ДНК ЕЕ. сої, 3,4 проти 1,4; одне середовище, 0,9; п-4). Більш того, хлорохін повністю інгібував індукцію проліферації В-клітин під дією фосфортіоатного олігонуклеотиду (ЗЕО ІЮ МО.:246), виміряну за допомогою аналізу проліферації із застосуванням СЕЗЕ, а також стандартним способом. Дані результати дозволяють припускати, що, як і у разі мишачих клітин, для активації В-клітин людини під дією Сро-ДНК необхідне захоплення ДНК у ендосоми і сч ге подальше закислення ендосом.

Приклад 11: Аналіз субклітинних подій, що відбуваються після стимуляції В-клітин людини оптимальним ОДН і) людини.

Оскільки вимоги до СроО-мотиву для максимальної активації В-клітин істотно розрізняються для миші (САСОТТ) (ЗЕО ІЮ МО:1143) і людини (ТСОТСОТТ) (5ЕО ІО МО:1145), заявників зацікавило, чи порівнянні с зо основні внутрішньоклітинні події проведення сигналу. Раніше у мишачих В-клітинах і макрофагах була знайдена швидка індукція зв'язуючої активності МЕ кВ |Зіасеу К. у., еї аіЇ.,, 1996 9. Іттипо!ї 157:2116, Мі А. К еї аї., що) 1998 у). Іттипо!ї 160:4755). Для дослідження відповіді МЕ «КВ на СрО-ДНК у людини первинні В-клітини людини «-- виділяли з периферичної крові за допомогою імуномагнітного сортування клітин і інкубували з

Сро-олігонуклеотидом 2080 (ЗЕО ІЮ МО.:321), Не-Сро-контрольним олігонуклеотидом 2078 (5ЕО ІЮ МО.:319) - з5 або середовищем. У вказані моменти часу клітини збирали, і одержували ядерні екстракти. У присутності ч-

Сро-олігонуклеотиду зв'язуюча активність МЕКВ зростала протягом однієї години і залишалася підвищеною до 18 годин (найбільш віддалений досліджений момент часу). Не-Сро-контрольний олігонуклеотид 2078 (ЗЕО І

МО.:319) не показав підвищення активності МЕКВ у порівнянні з клітинами, інкубованими з одним середовищем. «

Смугу МЕКВ ідентифікували за допомогою конкуренції неміченого зонда і за допомогою суперзсуву було показано, що вона складається з субодиниць р5Бо і рб5. - с Транскрипційний фактор, що активує білок-1 (АР-1), бере участь в регуляції негайних ранніх генів і и експресії цитокінів |Кагіп М. 1995. Кедшайоп АР-1 асімйу Бу тйодеп-асіїмаїе(й ргоївіп Кіпазев5. .). Віо! є» Спет 270:16483). У мишачих В-клітинах зв'язуюча активність АР-1 індукується у відповідь на Сро-ДНК Мі А. к., апа Кгіегд. М. 1998. Карій іпайскіоп тйодеп-асіїмайей ргоївеіп Кіпазев Бу іттипе зітшайюгу Сро ОМА. /) |ттипої! 161:4493). Для визначення того, чи індукується даний транскрипційний фактор під дією СроО-ДНК також і -і у людини, заявники перевірили ДНК-зв'язуючу активність АР-1 в первинних В-клітинах людини. Клітини інкубували з СроО-олігонуклеотидом 2080 (ЗЕО ІЮО МО.:321) або з контрольним олігонуклеотидом 2078 (ЗЕО ІЮ

МО.: 319). Одержували ядерні екстракти, і зв'язуючу активність АР-1 аналізували за допомогою ЕМ5А. Зв'язуюча -- активність АР-1 зростала в межах однієї години і підвищувалася до 18 годин (найбільш віддалений досліджений сл 50 момент часу), що свідчить про тривалу відповідь.

Оскільки активність АР-1 індукується багато якими стимулами |Аподеї Р., апа Кагіп М. 1991. Коїе дип, Боз що) апа АР-1 сотріех іп сеїП-ргоІШегайоп апа (гапвіогтайоп. Віоспіт Віорпуз Асіа 1072:129), заявники зацікавилися шляхами проведення сигналу, розташованими вище АР-1.

Транскрипційний фактор АР-1 інтегрує різні шляхи активованої мітогеном протеїнкінази (МАРК) (Кагіп М. 1995. Кедшайоп АР-1 асімйу ру тіодеп-асіїмаєгеай ргоївіп Кіпазев. 3). Віої! Спет 270:16483). Імуноблотінг о проводили із застосуванням екстрактів цільних клітин з первинних В-клітин, інкубованих з Сро-олігонуклеотидом 2080 (5ЕО ІЮО МО.:321), контролем 2078 (5ЕО ІЮ МО.:319), або одним середовищем. Застосовували специфічні їмо) антитіла проти фосфорильованої форми МК, р38, АТЕ-2 і ЕКК. Через ЗОхв. і бОхв. експозиції з СрО-ДНК знайдена сильна індукція фосфорилювання МК, тоді як Не-СрОо-олігонуклеотид не проявив активності, що 60 перевищує фонову. Протеїнкіназарз38, інша активована стресом протеїнкіназа (ЗАРК), також фосфорилювалась у відповідь на СрО-ДНК в межах бохв. АТЕ-2, субстрат як для р38, так і для МК |Сиріа 5., Сатррбеї! 0.,

Оегпіага В. апа ЮОамів К. 9. 1995. Тгапзсгіріоп Тасіог АТЕ2 гедшайоп ру МК взідпа! (гапздисіоп раїпжау.

Зсіепсе 267:389| і компонент комплексу АР-1, проявив слабке фосфорилювання через 30 хв. і підвищення фосфорилювання через бОхв. СроО-ДНК не індукувала істотного фосфорилювання ЕКК. Навпаки, анти-Ідм, 65 стимулююче рецептор В-клітин, запускало фосфорилювання ЕКК. Анти-ІДМ активувало ізоформи МК, відмінні від тих, що активуються СрО-ДНК.

Приклад 12: Аналіз ад'ювантної активності іп мімо

Був розроблений скринінговий аналіз іп мйго для виявлення ОДН, придатного як ад'юванта іп мімо у людини і інших, відмінних від гризунів тварин. Оскільки заявники спостерігали не тільки кількісні, але і якісні відмінності у активності різних СроО ОДН у миші, заявники спочатку піддали скринінгу набір Сро і

Не-СроО-контрольних ОДН на мишачих клітинах для виявлення способів аналізу іп мйго з явною і сильною кореляцією з ад'ювантною активністю іп мімо із застосуванням поверхневого антигена гепатиту В (НеЬзАд). Після цього заявники систематично тестували набір із понад 250 ОДН у відповідних аналізах для людини для виявлення послідовностей з імуностимулюючою активністю іп міго. Потім заявники перевіряли, чи активують 70 ОДН, володіючі найбільшою активністю в даних тестах на людині, проліферацію В-клітин у шимпанзе і мавп, і, нарешті, чи проявляють вони активність як ад'юванти з НозАд у шимпанзе і білячої мавпи іп мімо. Дані дослідження показали, що на імуностимулюючу активність Ср фосфортіоатних ОДН впливають послідовність, кількість і спейсинг окремих мотивів Сро. ОДН з динуклеотидом ТС на 5--кінці і подальшими трьома б--ленними мотивами Сро (5 ТС 3), розділеними динуклеотидами ТТ, постійно демонстрували найбільшу активність 7/5 Відносно лейкоцитіу людини, шимпанзе і макаки резус. В шимпанзе або мавп, одного разу вакцинованих проти гепатиту В ад'ювантом Сро ОДН, розвивалися титри антитіл проти НВ, в 15 разів більш високі, ніж у тих, які одержували тільки вакцину.

Матеріали і методи

Олігонуклеотиди: Модифіковані фосфортідсатом ОДН одержували від Орегон Тесппоіодіеєз (АІатеда, СА) і НуУбгідоп Зресіанку Ргодисів (Мійога, МА). ОДН тестували на ендотоксин за допомогою аналізу ГА. (І А!--аззау

Віомупібакег, УУаїКегзмійе, МО; нижня межа визначення 0,1 ЕМШ/мл). Для аналізів іп міго ОДН розводили в буфері ТІ (10мММ трис, рН7,0, їмМ ЕДТА) і зберігали при -202С. Для застосування іп мімо ОДН розводили в сольовому розчині, забуференому фосфатом (0,1М ЗФР, рнН?7,3) і зберігали при 42С. Всі розведення проводили із застосуванням вільних від пірогенів реагентів. Га

Культури клітин селезінки миші: Селезінки видаляли у 6-12-тижневих самок ВАЇ В/с (дасквоп І арогаїйогу), о 2,106 спленоцитів культивували з 0,2МмкМ ОДН протягом 4 годин (ТМЕ о) або 24 годин (ІЛ-б, ІЕМ-у, ІЛ-12), їі цитокіни визначали за допомогою ТІФА, як описано раніше ГМі А. К., Кіптап О. М., Магіп Т. Ї., Маївоп 5., апа Кгпіед. М. 1996. Карій іттипе асімайоп Бу СроО тоїйв іп бБасіегаі! ОМА. Зувіетіс іпдисіоп 1-6 ігапезсгірйоп (йпгоцдй ап апііохідапі-зепеййме раїмау. 9. Іттипо! 157:5394)1. Для оцінки індукованої Сро с проліферації В-клітин з клітин селезінки видаляли Т-клітини за допомогою анти-ТНу-1,2 і комплементу і ю центрифугування на ІуМтрпоїуЇе МО (Седагіапе І арогагіез, Ногпру, ОМ, Сапада), культивували протягом 44 годин з вказаними ОДН, після чого промічували пульсовою міткою 1мкКі зн тимідину протягом 4 годин, як - описано раніше |Кгіед А. м., Мі. К., Маївоп 5., УУаіїдзсптійє Т. 9., Вівпор О.., Теазада|е К., Когеї2кКу 0.., апа ча

Кіптап О. М. 1995. СроО тоїйїв іп расіегіаї ОМА (гіддег адігесі В-сеї! асіїмайоп. Майте 374:546)|. Для оцінки 32 дітичної активності МК-клітин з клітин селезінки миші видаляли В-клітини за допомогою магнітних кульок, - покритих козиними антитілами проти Ід миші, як детально описано раніше І|ОаїІаз 7. К., апа Казтивззеп МУ. 1993.

Ї утріокКіпе-асіїмаїей КіПег сеїїв. МІ. І/-4 іпдисев ап МК1.1-С2О08 ой ТОК-О0 8220" ІутрПоКіпе-асіїмаїей КіПег зибрзеї. / Іттипої! 150:17). Клітини культивували в кількості 5х10б/ямку в 24-ямкових планшетах і збирали через « 18 годин для застосування як ефекторних клітин в стандартному 4-годинному тесті виділення "Сг проти клітин -о с мішеней МАС-1. За одну одиницю (І) приймали кількість клітин, необхідних для індукції 30956 специфічного лізису. :з» Імунізація мишей проти НрзАа і оцінка гуморальної відповіді: Групи 6-8-тижневих самок мишей ВАЇ В/с (п-5 або 10, Спапевз Кімег, МопігеаІ, ОС) імунізували проти НЬзАд, як описано раніше |Оамів Н. Г.., еї аї., 1998 3).

Іттипої 160:870). Коротко, кожна миша одержувала однократну ін'єкцію б5Омкл ЗФР, що містить мкг -І рекомбінантного НеЬзАд (Меаіїх Віоїесі, Ровіег СПУ, СА) і 10мкг Сро ОДН або не-Сро ОДН як єдиного ад'юванта або в поєднанні з галуном (АІнуагоде! "85", Зирепоз Віозесіог, Медбаєек, Данія; 25мг АІ"/мг НВзАд). Контрольних і мишей імунізували НеЬзАд без адюванта або галуна. Через різні періоди часу після імунізації від мишей - одержували плазму, і АТ, специфічні до НеЬзАд (анти-НВз), кількісно визначали за кінцевим розведенням за допомогою ТІФА (в трьох паралелях), як описано раніше |Оаміз Н. І. еї а! 1998 9. Іттипо! 160:870). Кінцеві і-й титри визначали як найбільше розведення плазми, що забезпечує величину поглинання (0П450), вдвічі

Кз перевищуючу таку неімунної плазми, при величині 0,05, що відсікається.

Виділення РВМС приматів і клітинна культура: Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) виділяли з периферичної крові здорових добровольців, шимпанзе і білячих мавп за допомогою центрифугування в градієнті

Густини РіоіІ-пурадне (Нізіорадие-1077, Зідта Спетіса! Со., ЗІ. Гоців, МО), як описано |(Нагітапп ., еї аї., 1996 Апіїзепзе Мисієвїс Асіа Огид ЮОем 6:291). Клітини суспендували в культуральному середовищі КРМІ 1640 з

Ф, добавкою 1095 (об./об,) інактивованої нагріванням (56 С, 1 година) ЕС5 (НуСіопе, Годап, ОТ), 1,5мММ ко ІЇ-глутаміну, 1Обод./мл пеніциліну і їООмкг/мл стрептоміцину (всі - від Сбірсо ВК, ОСгапа Ізіапа, МУ) (повне середовище). Клітини (кінцева концентрація 1 х1Обклітин/мл) культивували в повному середовищі у бо зволожуваному інкубаторі при 595 СО» і 372С. Як стимули застосовували ОДН і ГРЗ (з ЗаІтопеїйа (Урпітигіт,

Зідта Спетіса! Со., 5. І оців, МО) або анти-ІЗОМ. Для вимірювання літичної активності МК людини РВМС інкубували в кількості 5х1Об/ямку в 24-ямкових планшетах. Культури збирали через 24 години, і клітини використовували як ефектори в стандартному 4-годинному тесті виділення УСг проти клітин мішеней К5б2, як описано раніше |ВаїЇйаз 27. К., Казтиввеп МУ. Ї., апа Кгіегд. М. 1996. Іпдисіоп МК асіїмйу іп тигіпе апа питап 62 сеїв ру СроО тоїйв іп оїїдодеохуписіеоїйдез апа бБасіегіаї ОМА. 9. Іттипо! 157:1840; Вайавз 7. К., апа

Казтиввзеп МУ. 1993. І утрпоКіпе-асіїмаєей КіПШег сеїв. МІ. 1/-4 іпдисев ап МКІ1.1-СО8 о вТСК-о,в В220ж

ІутрпоКіпе-асіїмаєей Кійег звирвеї 3. Іттипо! 150:17). Для проліферації В-клітин за 18 годин до збору додавали 1мкКі ЗН-тимідину, і кількість включеного ЗН тимідину визначали за допомогою сцинтиляційного рахунку на день 5. Стандартні відхилення в трьох паралельних ямках складали «5905.

Проточна цитометрія РВМС приматів; Поверхневі антигени РВМС приматів фарбували, як описано раніше

ІНагітапп о еї аї., 1998 у. Рпагтасо! Ехр Тег 285:920). Моноклональні антитіла проти СОЗ (СНТІ), 2014 (М5Е2), СО19 (В43), СО56 (8159), СО69 (ЕМ50) ї СО86 (2331 (РОМ-1)) були одержані від РНагіпіпдеп, Зап Оіедо,

СА. Ідсік (МОРОС-21) і ІдОбоьк |Нагптапп с еї аї., 1999 РМАБЗ 96:9305)| застосовували для контролю 70 неспецифічного фарбування. МК-клітини ідентифікували за експресією СО56 на негативних по СОЗ, СО14 і СО19 клітинах, а В-клітини ідентифікували за експресією СО19. Дані проточної цитометрії для 10000 клітин на зразок одержували за допомогою ГАСзсап (Вескіоп біскіпгоп Іттипосуюгпеїгу Зувіетв, Зап дове, СА). Життєздатність клітин в застосованому для аналізу сортері ЕЗ2С/55С визначали забарвленням йодним пропідієм (2мкг/мл), і вона виявилася вище 9895. Результати аналізували із застосуванням комп'ютерної програми Ріомло (мегвіоп 2.51, Тгее Ваг, Іпс., Запіога, СА).

Імунізація шимпанзе і білячих мавп проти НрзАа і оцінка гуморальної відповіді: Чотирнадцять білячих мавп (2,0-3,5кг) імунізували дитячою дозою Епдегіх-В (ЗтіїйКіІїпе Вееспат Віоіодісаів, Кіхепвзагі, ВЕ), що містить 10мкг НьзАд, адсорбованого на галуні (25мг А1'/мг НВвзАд). Одержане вводили самостійно (п-5), або в поєднанні з Сро ОДН 1968 (п-5, 500мкг) або Сро ОДН 2006 (ЗЕО ІЮ МО.:246) (п-4, 150мкг). Чотирьох шимпанзе (10-20кг) імунізували таким же чином, причому двоє одержували контрольну вакцину (тільки Епдегіх-В), а двоє одержували експериментальну вакцину (Епдегіх-В плюс їмг Ср ОДН 2006). Всі вакцини вводили в/м в праве переднє стегно в сумарному об'ємі їмл. Мавп утримували в умовах для тварин Ргітай(е Кезеагсп Сепіег (Водог,

Індонезія), а шимпанзе утримувались в Віодцаї! (КосКміїе, МО). Тварин щодня контролювали фахівці за вмістом тварин. Не було знайдено симптомів загального погіршення здоров'я або місцевих побічних реакцій в місці с ін'єкції. Плазму одержували в/в пункцією до і через різні проміжки часу після імунізації і зберігали Ге) замороженій (-202С) до проведення аналізу на антитіла. Антитіла проти Нбз визначали за допомогою наявного у продажу набору ТІФА (Мопоїїза Апіі-НВв; Запоїїі-Равіециг, Мопігеаі, ОС), і титри виражали в МіІШ/мл на основі порівняння із стандартами, визначеними ВОЗ (Могоїїза Апіі-НВве 5іапаагав; Запоїі-30 Равіеиг).

Результати с

Ідентифікація Сро ОДН з різними профілями імунної активності іп міго: Дослідження заявників показали, що ю конкретні основи на 5- і 3і-кінцях динуклеотиду СроО в мотиві Ср можуть робити істотний вплив на рівень імунної активації синтетичного ОДН, але залишалося неясним, чи можуть різні мотиви Сро викликати різніімунні (87 ефекти. Для вивчення цього питання заявники тестували набір мотивів Сро ОДН на предмет їх здатності ч- індукувати літичну активність МК, проліферацію В-клітин і стимулювати синтез ТМЕРо, ІЛ-6, ІЕМ-у ії ІЛ-12 в клітинах селезінки миші. Імуностимулююча активність ОДН, що не містять мотивів Ср (ОДН 1982 (5ЕО ІЮ в

МО.:225), ОДН 1983 (З5ЕБЕО І МО.:226)) була негативною або слабкою у порівнянні з СрОо ОДН. ОДН з неоптимальними мотивами Сро (ОДН 1628 (5ЕО ІЮ МО.:767), ОДН 1758 (ЗЕО ІО МО.:1)) були менш активні, ніж

ОДН, що містять мотиви Сро, фланковані двома 5-пуринами і двома З3'-піримідинами (ОДН 1760 (ЗЕО ІО МО.: 3), «

ОДН 1826 (ЗЕО ІО МО.: 69), ОДН 1841 (5ЕО ІО МО.:84)). ОДН 1826, що містить два оптимальні мишачі мотиви З

Сро (5 САСОТТ 3) (5ЕО ІЮ МО:1143), володів найбільшою активністю відносно 5 з 6 кінцевих параметрів, що с вимірювалися. За винятком ОДН 1628, всі ОДН проявляли в цілому схожий профіль активності

Із» (опосередкований МК-клітинами лізис, проліферація В-клітин, ІЛ-12, ІЛ-6, ТМЕ, ІЄМ-у). Слід зазначити, що ОДН 1628, що є унікальним в даному наборі за наявністю двох збагачених С областей проявляв переважну індукцію синтезу ІЕМ-у і відносно низьку стимуляцію інших активностей. - 75 Виявлення аналізів іп мійго, які корелюють з ад'ювантною активністю іп мімо; Оскільки ад'ювантна активність є кінцевим ефектом іп мімо, заявники були зацікавлені у виявленні тестів іп міго, які передбачали -і б ад'ювантну активність Сро ОДН іп мімо. Тому ті ж самі ОДН, які застосовували для кінцевих ефектів іп міго, - тестували на предмет їх ад'ювантної активності для імунізації проти НЬзАд. Даний аналіз проводили як з одним

ОДН, так і з ОДН в поєднанні з галуном, оскільки в попередніх роботах був показаний виразимий синергізм для 1 50 Сро ОДН і галуновими ад'ювантами (опублікована патентна заявка РСТ УМО 98/40100).

Миші ВАЇВ/с, імунізовані НЬзАд без ад'юванта, давали лише низькі титри анти-НВз до 4 тижнів, і

Ко) їй - . контрольний ОДН не впливав на даний показник. Навпаки, додавання Сро ОДН підвищувало титри анти-НВз» в 5-40 разів, залежно від використаної послідовності. При додаванні галуна титри анти-НВз були приблизно в 6 раз вище, ніж при застосуванні тільки НорзАа. Істотно, що дані титри не змінювалися у присутності контрольного

ОДН і підвищувалися в 2-36 разів різними Сро ОДН. Результати, одержані з різними ОДН, взятими окремо, дуже

ГФ) добре корелювали (г-0,96) з результатами, одержаними з тими ж ОДН плюс галун. Коли була проведена лінійна 7 регресія, був знайдений дуже високий ступінь кореляції між певними аналізами іп міїго і підвищенням анти-НВ5 титрів іп мімо. Зі всіх аналізованих кінцевих ефектів іп міго найбільшу кореляцію з ад'ювантною активністю іп мімо показала індукція літичної активності МК (без галуна, г-0,98; з галуном, г-0,95; р «0,0001). Добра 60 кореляція відносно ад'ювантної активності була одержана також для стимуляції В-клітин (/-0,84 і 0,7), а також секреції ТМЕ-о (1-0,9 ї 0,88), ІЛ-12 (г1-0,88 і 0,86) і ІЛ-б6 (ї-0,85 і 0,91). Єдиний аналіз іп мійго, який не корелював добре з результатами іп мімо, був секрецією ІЄМ-у (г-0,57 і 0,68). Дані результати показують, що аналізи іп міо літичної активності МК, активації В-клітин і продукції ТМЕ-о, ІЛ-6 і ІЛ-12 дають цінну інформацію 65 іп міго для прогнозу ад'ювантної активності даного ОДН іп мімо.

Скринінг набору фосфортіоатних ОДН відносно активації МК-клітин людини: В попередніх дослідженнях заявники знайшли, що синтез запальних цитокінів РВМС людини індукується надзвичайно низькими кількостями ендотоксину (індукована секреція ТМЕ- о, виявляється вже при бпг/мл ендотоксину, чутливість на 2 порядки більш висока, ніж чутливість імунних клітин миші). В той же час активація В-клітин людини і індукція літичної активності МК-клітин людини ендотоксином низька навіть при високих концентраціях ендотоксину. Грунтуючись на даних результатах, заявники вибрали активацію МК-клітин (літична активність і експресія СЮОб69) і В-клітин (проліферація і експресія СО86б) як найбільш високоспецифічних і відтворних аналізів з низькою міжсуб'єктною варіабельністю і застосували дані аналізи для скринінгу іп міго набору ОДН.

Перш за все заявники досліджували дію фосфортіосатних ОДН, що містять різні поєднання і перестановки 7/0 мотивів Сро, на опосередкований МК-клітинами лізис клітин-мішеней. Для ясності і простоти уявлення показані лише дані з окремими типовими Сро і контрольними ОДН. РВМС людини інкубували з різними фосфортіоатними

ОДН (бмкг/мл) протягом 24 годин і тестували на їх здатність лізувати мічені "Сг клітини К562. ОДН з двома б-членними мотивами Сро (або 5 БАСОСТТ 3 (5ЕБЕО ІО МО.:1143), або 5 БТСОТТ У (5ЕБЕО ІЮ МО.:1144)) в поєднанні з ТрС на 5-кінці ОДН (ОДН 1840 5 ТССАТОТСОТТССТОТСОТТ 3 (БО Ю МО. 83), ОДН 1851 5 75 ТССТОАСОСТТССТОАСОТТ 3 (5ЕО ІЮО МО.:94) або з щонайменше трьома б--ленними мотивами без Трос на 5-кінці (ОДН 2013 (ЗЕО ІЮО МО.:253)) показали помірну активність. Висока активність була знайдена, коли 5'

ТрС безпосередньо передував б-ч-ленному мотиву Ср людини (5 ТСОТСОТТ 3 (ЗЕБЕО І МО.:1145)) і супроводився двома б--ленними мотивами (ОДН 2005 (5ЕО І МО.:245), ОДН 2006 (З5ЕО ІЮ МО.:246) і ОДН 2007 (ЗЕО ІЮ МО.:247)). Якнайкращі результати були одержані, коли б--ленні мотиви Сро були відокремлені один від одного і від 5 8--ленного мотиву Сро за допомогою Трт (ОДН 2006 (5ЕО ІО МО.:246)).

Експресія маркера активації СО6О швидко підвищується на поверхні МК-клітин після стимуляції. Для одержання результатів, одержаних на основі аналізу лізиса МК-клітинами, РВМС інкубували протягом 18 годин з

ОДН (2мкг/мл). Експресію СО6О визначали на позитивних по СО5б МК-клітинах (негативних по СОЗ, СО14 і сСОр19). Хоча індукція експресії СО6О була у меншій мірі обмежена послідовністю у порівнянні із стимуляцією Ге функціональної активності МК-клітин, контрольні ОДН (ОДН 1982, ОДН 2116, ОДН 2117, ОДН 2010) проявляли о лише низьку активність, схожу з фоновими значеннями. ОДН з двома мотивами Сро людини, розділеними 5-ТТТТ-3 (ОДН 1965 (ЗЕО ІЮО МО.:208)), або чотирма мотивами Сро людини без спейсингу (ОДН 2013 (ЗЕО ІЮ

МО.:253)) були відносно активнішими в індукції експресії СО69 у порівнянні із стимуляцією літичної активності

МК-клітин. Оптимальна функціональна активність МК-клітин, а також експресія СО6О була одержаназ ОДН, що є містять динуклеотид ТрС, попередній мотиву Сро людини, і додаткові мотиви людини в послідовності (ОДН 2006 (ЗЕО ІЮ МО.:246) ОДН 2007 (ЗЕО ІЮО МО.:247)). о

Активність фосфортіоатних ОДН відносно стимуляції В-клітин людини: В попередніх експериментах заявники че знайшли, що відсоток проліферуючих В-клітин (аналіз СЕЗЕ, дивися розділ способів) корелює з поверхневою експресією костимулюючого СО86 на В-клітинах, виміряною проточній цитометрією. Тому заявники застосували - експресію СО8б6 на В-клітинах для скринінгу набору ОДН відносно їх імуностимулюючої активності. РВМС їч- інкубували з О,бмкг/мл ОДН. Експресію СО86б (середня інтенсивність флуоресценції, МЕ!) визначали на позитивних за СО 19 В-клітинах. Полі-С ОДН (ОДН 2017 (ЗЕО ІО МО.:257)) або ОДН без динуклеотидів Сро (ОДН 1982 (ЗЕБЕО ІЮО МО.:225)) були нездатні стимулювати В-клітини людину при даних експериментальних « умовах. Фосфортіосатний ОДН (ОДН 2116 (ЗЕО ІЮО МО.:256)) з одним оптимальним мотивом Сро людини, що 70 передує ТрО (5-ТСОТСеттТ-3 (5ЕБЕО ІЮО МО.:1145)), володів низькою активністю. Наявність одного б--ленного - с мотиву Сро людини (5-5ТС0511-3 (БО ІЮО МО.:1144)) не надавала активуючої дії. Два таких мотиву Сро в ц послідовності не проявляли (ОДН 1960 (ЗЕО ІЮ МО.:203), ОДН 2016 (5ЕБЕО ІЮО МО.:256)) або проявляли ,» помірковану (ОДН 1965 (ЗЕО ІЮ МО.:208)) активність залежно від контексту послідовності. Якщо ОДН був побудований з трьох або чотирьох копій даного мотиву (ОДН 2012 (ЗЕБЕО ІЮ МО.252), ОДН 2013 (5ЕО ІЮ МО.:253), ОДН 2014 (5ЕО ІО МО.:254)), можна було знайти помірковану активність на В-клітинах. Поєднання - І 8--ленного мотиву Сро людини на 5-кінці ОДН з двома б--ленними мотивами Сро (ОДН 2005 (5ЕО ІЮО МО.:245),

ОДН 2006 (ЗЕО ІЮО МО.:246), ОДН 2007 (ЗЕО ІЮ МО.:247)) ОДН 2102 (ЗЕО ІЮО МО.:343), ОДН 2103 (З5ЕО ІЮ ї МО.:344)) вело до значного підвищення здатності ОДН стимулювати В-клітини. Важливий був спейсинг між - окремими мотивами. Розділення мотивів Сро за допомогою ТртТ було переважним (ОДН 2006 (ЗЕО ІЮО МО.:246) ) у порівнянні з нешділеними мотивами Сро (ОДН 2005 (ЗЕО ІО МО.:); порівняй також ОДН 1965 (З5ЕО ІЮ МО.:208) і-й з ОДН 1960 (5ЕО ІО МО.:203)). б--ленний мотив Сро людини (5-3ТСОТ1-3) був краще оптимального б--ленного

Що) мотиву Сро миші (5-САСОТТ-3 (5ЕО ІО МО.:246)) при поєднанні з д--ленним мотивом Сро людини на 5'-кінці (ОДН 2006 проти ОДН 2102 (5ЕО ІЮО МО.:343) і ОДН 2103 (ЗЕО ІЮ МО.:344)). ОДН (ТСС)роді був неактивний або лише малоактивний, як і ОДН, що містять динуклеотиди Сро, фланковані гуанінами або іншими динуклеотидами

Сро (ОДН 2010 (5ЕО ІО МО.:250)). Взяті разом, результати для МК-клітин і В-клітин чітко показали, що з тих, о що тестуються ОДН найбільшою імуностимулюючою активністю на імунних клітинах людини володіє ОДН 2006 (ЗЕО ІЮО МО.:246). ко Порівняльний аналіз ефективності Ср фосфортіоатних ОДН у різних приматів: Різні мотиви Сро є оптимальними для активації імунних клітин миші і людини. Більш того, у миші і людини різна кількість і 60 локалізація мотивів Ср в активному фосфортіоатному ОДН. Заявники зацікавилися питанням про те, чи проявляють Ср фосфортіоатні ОДН схожу активність у різних видів приматів. Заявники порівняли набір Сро

ОДН за їх здатністю індукувати проліферацію В-клітин у людини, шимпанзе і резусу або білячої мавпи. Здатність

ОДН стимулювати проліферацію В-клітин (таблиця .)) добре корелювала з їх здатністю індукувати експресію

СО86 на В-клітинах. ОДН 2006 (ЗЕО ІО МО.:246), який проявляв найбільшу активність на В-клітинах і МК-клітинах 65 людини, був найбільш активним у стимуляції проліферації В-клітин шимпанзе і макаки-резус (таблиця .)). ОДН 1968 (ЗЕО ІЮО МО.: 211) ії ОДН 2006 (ЗЕО ІО МО.: 246) викликали найбільшу активацію В-клітин білячої мавпи іп мійго (51 25 і 29, відповідно, при бмкг ОДН/мл). Несподівано виявилося, Ср ОДН 2007 (5ЕО ІО МО.: 247), який проявляв схожу з оптимальним ОДН 2006 (5ЕО ІО МО.:246) високу активність в клітинах людини, не стимулює проліферацію В-клітин макаки-резус або шимпанзе, а ОДН 1968 (5ЕО ІЮО МО.:211) проявляє низьку активність. бро ОДН, початково виявлені за високою активністю у миші (ОДН 1760 (ЗЕО 10 МО.:3), ОДН 1826 (ЗЕО І

МО.:69)), проявляли низьку активність у мавп (таблиця .)).

РВМС на фосфортіоатні Сро ОДН у приматів о 00010101 Людина Шимпанзе Макакрезус. ів

РВМС одержували з периферичної крові і інкубували з ОДН (0,бмкг/мл), як вказано, протягом п'яти днів.

Проліферацію виміряли за включенням ЗН/гимідину (імп./хв./1000) протягом останніх 18 годин. За даними, одержаним за допомогою аналізу СЕБЕ, більше 9595 проліферувавших клітин були В-клітини. Тестували чотирьох пробандів людини, шістьох шимпанзе і двох мавпа-резус.

Ад'ювантна активність Сро ОДН іп мімо у шимпанзе і білячих мавп: Для оцінки того, чи володіють СРО ОДН з. 0 СМ високою стимулюючою дією іп міїго на клітини приматів вимірною ад'ювантною активністю іп МІМО, білячих мавп і о шимпанзе імунізували Епдегіх В, який включає НВзАад, адсорбовані на галуні, окремо або з доданим ОДН 1968 (500мкг) або ОДН 2006 (5ЕО ІО МО.:246) (мг), відповідно. У порівнянні з контрольними тваринами, що не одержували Сро ОДН, анти-НВзг-титри через 4 тижні після примування і 2 тижні після повторної імунізації були, відповідно, в 6б і 16 разів вище у мавп і в 15 і З рази вище у шимпанзе (таблиця К). Таким чином, с спостерігався чіткий ад'ювантний ефеїсг Сроз ОДН, і це було особливо виражене після однократної імунізації. ю - ща лину з м 5 ОДН 1968 (500Ммкг) (ЗЕ 1О 99541309 76449-42094

МО.211)

Шимпанзе 2 Немає 6,11 3712,4706 « 2 ОДН 2006 (1мг) (ЗЕО І МО. 125,135 9640,16800 246) З с й п мавп повторно імунізували через 10 тиж., а шимпанзе повторно імунізували через 4 тиж. після примування. Анти-НВ:2 визначали аналізом

ТІФА; величини для мавп являють собою СМТ ЗЕМ (п-5), а у випадку двох шимпанзе в кожній групі представлені індивідуальні величини. -І -І

Claims (17)

Формула винаходу -

1.Спосіб стимуляції імунної відповіді, що включає в себе введення збагаченої піримідином імуностимулюючої 1 50 нуклеїнової кислоти суб'єкту, відмінному від гризунів, у кількості, ефективній для індукції імунної відповіді "з у суб'єкта, відмінного від гризунів, в якому нуклеїнова кислота являє собою тимідин (Т)-збагачену нуклеїнову кислоту, яка містить більше 6095 Т і містить динуклеотид Сро.

2.Спосіб за п.1, де Т-збагачена імуностимулююча нуклеїнова кислота являє собою полі-Т-нуклеїнову кислоту, що містить 513. й й . й

З.Спосіб за п.2, де полі-Т-нуклеїнова кислота містить ГФ) 5Х1Х2ТТТТХзХуУ, 7 де Ху, Хо, Хз і Хі являють собою нуклеотиди.

4.Спосіб за п.3, де ХіХо являє собою ТТ.

5.Спосіб за п.3, де ХаХ. являє собою ТТ. бо

6.Спосіб за п.3, де Х/Хо вибраний з групи, що складається з ТА, ТО, ТС, АТ, АА, АС, АС, СТ, СС, СА, СТ, бо, БА і Ос.

7.Спосіб за п.3, де ХаХ; вибраний з групи, що складається з ТА, ТО, ТС, АТ, АА, АС, АС, СТ, СС, СА, СТ, бо, БА і Ос.

8.Спосіб за п.1, де Т-збагачена імуностимулююча нуклеїнова кислота має нуклеотидний склад, який більше бо ніж на 8095 складається з Т.

9.Спосіб за п.1, який додатково включає в себе експозицію суб'єкта з антигеном і в якому імунна відповідь являє собою специфічну відносно антигену імунну відповідь.

10.Спосіб за п.1, де у суб'єкта є астма або існує небезпека розвитку астми, і спосіб є способом лікування або профілактики астми у суб'єкта.

11.Спосіб за п.17, де у суб'єкта є алергія або існує небезпека розвитку алергії, і спосіб є способом лікування або профілактики алергії.

12.Спосіб за п.1, де у суб'єкта є рак, і спосіб є способом лікування раку.

13.Спосіб за п.1, де імуностимулююча нуклеїнова кислота додатково включає в себе ТО-мотив. 70

14.Композиція, що містить олігонуклеотид, який має нуклеїнову кислоту з послідовністю ТСО ТО ТТ ТОА СОТ ТТ ОТО ОТ (5ЕО ІЮ МО: 343).

15.Спосіб лікування або профілактики алергії або астми, який включає в себе введення композиції за п.14 суб'єкту, відмінному від гризунів, який має в цьому потребу, в кількості, ефективній для лікування або профілактики алергії або астми.

16. Спосіб лікування раку, що включає введення потребуючому цього суб'єкту імуностимулюючого олігонуклеотиду, який має нуклеотидну послідовність зХЕО ІЮ МО: 246 (5 Со тоОо тт тот сот оте От 3), карбоплатину і паклітакселу у кількості, ефективній для лікування раку.

17. Спосіб за п.16, який відрізняється тим, що рак являє собою недрібноклітинний рак легень. с о с ю «- ї- ч- ші с ;» -І -І - с 50 Ко) Ф) іме) 60 б5