HRP20020249A2 - Immunostimulatory nucleic acids - Google Patents

Description

Dosadašnje spoznaje

Bakterijska DNA, ali ne DNA kralježnjaka, ima izravni imunostimulira-jući učinak na periferne mononuklearne krvne stanice (PBMC) in vitro (Krieg et al., 1995). Bakterijska DNA ima imunostimulirajući učinak na aktivne B stanice i na stanice prirodne ubojice, a DNA kralježnjaka nema učinak (Tokunaga T. et al., 1988, Jpn. J. Cancer Res 79:682-686; Tokunaga T. et al., 1984, JNCI 72:955-962; Messina J. P. et al. 1991, J. Immunol. 147:1759-1764; i pregled u Krieg, 1998 u :Applied Oligonucletode Technology, C. A. Stein u A. M. Krieg, (Izd.) John Wiley Sons, Inc, New York, NY, str 431-448). Sada se podrazumijeva da su ti imunostimulirajući efekti bakterijske DNA rezulat prisutnosti određenog udjela baza nemetiliranih CpG dinukleotida (CpG motivi) koji su uobičajeni u bakterisjkoj DNA, ali su metilirani i u smanjenoj količini (CpG supresija, 1/50 do 1/60) u DNA verterbata (Krieg et al., 1995 Nature 374:546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321:1-10). Imunostimulirajući efekt bakterijske DNA se može imitirati sitetskim oligonukleotidima (ODN) koji sadrže te CpG motive. Vjerojatno je da brza imuna aktivacija odgovora na CpG DNA može biti izazvana kao jedna komponenta urođenog mehanizma imune obrane koja prepoznaje obrazac specifičan za molekule mikroba.

CpG ODN ima velike stimulirajuće efekte na humane leukocite i one od laboratorijskih glodavaca, uključujući proliferaciju skoro svih (>95%) B stanica i povećanje izlučivanja imunoglobulina (Ig); izlučivanje citokina, litičku aktivnost prirodnih ubojica (NK) i izlučivanje IFN-γ; te aktivaciju dendričnih stancia (DC) i ostalih stanica koje ispoljavaju antigen za ekspresiju kostimulatornih molekula i izlučivanje citokina, posebice citokina poput Th1 koji su važni u pokretanju odgovora T stanica sličnih Th1. Aktivacija B stanice s CpG DNA je neovisna o T stanici i nije specifilčna na antigen. Međutim, aktivacija B stanice s niskim koncetracijama CpG DNA pokazuj, a za proliferaciju B stanice i izlučivanje Ig (Krieg et al. 1995). Ta jaka sinergija između puta signalizacije B stanica, potaknutu preko receptora antigena B stanice i CpG DNA, pokreće imuni odgovor specifičan na antigen. Uz izravni efekt na B stanice, CpG DNA također izravno aktivira monocite, makrofage i dendrične stanice za izlučivanje različitih citokina uključujući visoke razine IL-12 (Klinman et al. 1996; Halpern et al., 1996; Cowdery et al., 1996). Ti citokini stimuliraju stanice prirodne ubojice (NK) da izulučuju g-interferon (IFN-γ) i imaju povećanu litičku aktivnost (Klima, et al.1996, supra; Cowdery et al. 1996 supra; Yamamoto et al., 1992; Ballas et al. 1996). Ukupno, CpG DNA inducira produkciju citokina poput Th1 dominiranu s IL-12 i IFN-γ i s malim izlučivanjem Th2 citokina (Klinman et al, 1996). Jaki izravni efekti (neovisno o T stanici) CpG DNA B stanice, kao i indukcija citokina koja može imati indirektne efekte na B-stanice putem pomoći T-stanica, ukazuje na upotrebu CpG DNA u obliku ODN kao adjuvansa vakcini. (Vidi PCT Patentnu aplikaciju br.: WO98/40100.)

Ti stimulatori imunog efekta prirodnog fosfodiesterskog skeleta CpG ODN su visoko specifični na CpG, tako da efekti u osnovi nestaju kada je CpG motiv metiliran, promjenjen u GpC ili na drugi način eliminiran ili promjenjen (Krieg et al., 1995 Nature 374:546-549; Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9305-10). Fosfodiester CpG ODN se može formulirati u lipidima, alumu ili ostalim tipovima vehikula sa svoijstvima za snabdjevanje ili poboljšanim prihvatom stancia, a da se poveća imunostimiulirajući efekti (Yamamoto et al., 1994 Microbiol. imunol. 38:831-836; Gramzinski et al., 1998 Mol. Med. 4:109-118).

U ranim istraživanjima je mišljeno da imunostimulirajući CpG motiv slijedi nakon formule purin-purin-CpG-pirimidin-pirimidin (Krieg et al., 1995 Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156:421-423; Hacker et al., 1998 EMBO J. 17:6230-6240; Lipford et al., 1998 Trend in Microbiol. 6:496-500). Međutim, sada je jasno da mišjih hemociti odgovaraju dobro na fosfodiesterske CpG motive koji ne slijede tu "formulu" (Yi et al., 1998 J. Immunol. 160:5898-5906), a isto vrijedi i za humane B stanice i dendrične stancie (Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liand, 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129).

Nekoliko prošlih istraživača su istraživali da li sadržaj nukleotida ODN može imati neovisan efekt na sekvenciju ODN. Interesantno, nađeno je da je antisens ODN općenito bogat sadržajem GC, CCC, CC, CAC i CG sekvencija, dok je smanjena učestalost TT ili TCC nukleotidnih sekvencija u usporedbi s očekivanom kad bi baze bile korištene slučajno (Smetsers et al., 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Development 6:63-67). Time se povećava mogućnost da prekomjerno eksprimirane sekvencije mogu sadržavati preferirane ciljane elemente antisens oligonukleotida ili obrnuto. Jedan razlog da se izbjegne upotreba timinom bogatog ODN za antisens eksperimente je što se degradacijom ODN pomoću nukleoaze prisutne u stanicama oslobađa slobodni timidin koji kompetira s 3H-timidinom koji se često koristi za eksperimente da se utvrdi proliferacija stanice (Matson et al., 1992 Antisens Research and Development 2:325-330).

Sažetak izuma

Ovaj izum odnosi se dijelom na pirimidinom bogate (Py-obogaćen) i u nekim cjelinama timidinom (T) bogate imunostimulirajuće nukleinske kiseline koji ne zahtjevaju prisutnost CpG motiva. Ovaj izum se također djelomično odnosi na otkriće da su nukleinske kiseline koje sadrže TG dinukleotidni motiv također imunostimulatori. Izum se zasniva dijelom na nočekivanom otkriću da su sekvencije nukleinskih kiselina koje je sadrže CpG motive imunostimulatori. To je otkriveno nakon analize imunostimulacijskih svojstava mnogih sekvencija nukleinskih kiselina, a te sekvencije mogu biti obogaćene Py, npr. obogaćene T ili mogu sadržavati TG motive. Također je otkriveno da te sekvencije prvenstveno aktiviraju imune staice koje nisu od glodavaca. S Py obogaćeme i TG sekvencije su samo malo imunostimulirajuće svojstvo prema imunim stanicama glodavaca, a u usporedbi sa imunim stanicama neglodavaca. Stoga je moguće pema metodama iz izuma inducirati imuni odgovor u subjektu koji nije glodavac, a davanjem s Py obogaćene ili TG imunostimulaorskih nukleinskih kiselina. Py obogaćene ili TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline iz izuma mogu uključivati CpG motive. Ta otkrića imaju važnu primjenu za klinički razvoj imunostimulirajuće CpG koji sadrže nukleinske kiseline koje ne sadrže CpG.

U jednom aspektu izuma obuhvaćen je farmaceutski pripravak koji sadrži učinkovitu količinu za stimuliranje imunog odgovora izoliranih s Py-obogaćenih ili TG imunostimulirajućih nukleinskih kiselina i na famraceutski prihvatljive nosače. U drugim aspektima izum je pripravak tvari koji sadrži izoliranu Py-obogaćenu ili TG imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu. U drugim cjelinama imunostimulirajuća nukleinska kiselina može biti T-obogaćena. U daljnjim cjelinama imunostimulirajuća nukleinska kiselina može biti T-obogaćena i također ima najmanje TG motiv.

Preferirano Py-obogaćena nukleinska kiselina je T-obogaćena nukleinska kiselina. U nekim cjelinama T-obogaćena imunostimulirajuća nukleinska kiselina je poli T nukleinska kiselina koja sadrži 5'TTTT3'. U sljedećim cjelinama nukleinska kiselina je poli T nukleinska kiselina koja sadrži 5'X1X2TTTTX3X43', pri čemu su X1, X2, X3 i X4 nukleotidi. U nekim cjelinama X1X2 je TT i/ili X3X4 je TT. U drugim cjelinama X1X2 je odabran iz skupine koju čine TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA i GC, te X3X4 je odabrano iz skupine koju čine: TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA i GC.

T-obogaćena imunostimulirajuća nukleinska kiselina može imati jedan poli T motiv ili može imati više poli T motiva. U nekim cjelimnama T-oboga-ćena imunostimulirajuća nukleinska kiselina sadrži najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, ili najmanje 8 CpG motiva. U preferiranim cjelinama pomiješano je više CpG motiva i poli T motiva.

U sljedećim cjelimnama barem jedna od više pojedinih poli T motiva sadrži najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8 ili najmanje 9 uzastopnih T nukleotidnih ostataka. U drugim cjelinama broj poli T motiva je najmanje 3 motiva pri čemu najmanje 3 motiva sadrži najmanje 3 uzastopna T nukleotidna ostatka ili više poli T motiva je barem 4 motiva, pri čemu barem 4 motiva sadrži najmanje 3 uzastopna T nukleotidna ostatka.

U nekin slučajevima T-obogaćena imunostimulirajuća nukleinska kiselina može biti bez poli T motiva, ali zato u sastavu može imati više od 25% T nukleotida. U drugim cjelinama T-obogaćena imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima poli T motive, ali također u sastavu ima više od 25% T. U preferiranim cjelinama T-obogaćena imunostimulirajuća nukleinska kiselina sadrži više od 35% T, više od 40% T, više od 50% T, više od 60% T, više od 80% T ili više od 90% T.

T-obogaćene i TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline imaju bilo koju duljinu veću od 7 nukleotida. U preferiranim cjelinama T-obogaćena imunostimulirajuća nukleinska kiselina sadrži barem 20 nukleotida, najmanje 24 nukleotida, najmanje 27 nukleotida ili najmanje 30 nukleotida. U preferiranim cjelinama TG imunostimulirajuća nukleinska kiselina duga je između 15 i 25 nukleotida. T-obogaćena i TG imunostimulirajuća nukleinska kiselina može biti jednolančana ili dvolančana. T-obogaćenu regiju smještenu u sredini (t.j. okružuje ih približno jednak broj nukleotida prema 5' i 3' krajevima).

T-bogata nukleinska kiselina odabrana je i skupine koju čine: SEQ ID NO: 59- 63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908, te 910-913. U drugim cjelinama T-obogaćene nukelinske kiseline imaju sekvenciju odabranu iz skupine koju čine SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 25 8, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411413, 429-432, 434,435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890, te 891.

U drugim cjelinama Py-obogaćena imunostimulirajuća nukleinska kiselina je C-obogaćena nukleinska kiselina. Imunostimulirajuća C-obogaćena nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja ima barem jednu a preferirano najmanje dvije poli C-regije ili koja ima više od 50% C nukleotida.

Py-obogaćena TG imunostimulirajuća nukleinska kiselina može imati jedan ili više CpG motiva. Motivi mogu biti metilirani ili nemetilirani. U drugim cjelinama Py-obogaćene i TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline nemaju jedan ili više CpG dinukleotida.

U drugim cjelinama Py-obogaćene i TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline također imaju poli-A, poli G i/ili poli C motive. U sljedećim cjelinama Py-obogaćene TG imunostimulirajuća nukleinska kiselina nema dvije poli C sekvencije s najmanje 3 susjedna C nukleotidna ostatka ili nema dvije poli A sekvencije s najmanje 3 susjedna A nukleotidna ostatka. U drugim cjelinama Py obogaćen ili TG imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima sadržaj C veći od 25% ili sadržaj A veći od 25%. U sljedećim cjelinama Py obogaćena ili TG imunostimulatorna nukleinska kiselina nema poli-C sekvencije, poli-G sekvencije ili poli-A sekvencije.

Poli-G nukleinska kiselina u nekim cjelinama odabrana je iz skupine koju čine SEQ ID NO: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936, te 938. U drugim cjelinama poli G nukleinska kiselina ima sekveciju odabranu iz skupine koju čine SEQ ID NO: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329,434, 435, 475, 519, 521-524, 526, 527, 535, 554, 565, 609, 628, 660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926, 927, 932, te 937.

Prema sljedećem aspektu izuma imunostimulirajuće nukleinske kiseline mogu biti definirane kao one koje imaju TG motiv, koje su ovdje navedene kao TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline. TG nukleinske kiseline u jednoj cjelini sadrže najmanje TG dinukleotid koji ima sekvenciju koja uključuje najmanje sljedeće formule: 5'N1X1TGX2N23'. U odgovarajućim cjelinama, N1 je sekvencija nukleinske kiseline koja se sastoji od broja nukleotida koji se kreće od (11-N2) do (21-N2), a N2 je sekvencija nukleinske kiseline koja se sastoji od broja nukleotida u rasponu od (11-N1) do (21-N1). U preferiranoj cjelini X2 je timidin.

U drugim cjelinama, TG nukleinska kiselina ima najmanje sljedeću formulu: 5'N1X1X2TGX2X3'. U sljedećoj cjelini TG nukleinska kiselina sadrži sljedeću sekvenciju: 5'N1X1X2TGX2X3N23'. U odgovarajućim cjelinama, N1 je sekvencija nukleinske kiseline koja se sastoji od broja nukleotida koji je u rasponu od (9-N2) do (19-N2), a N2 je sekvnecija nukleinske kiseline koja se sastoji od broja nukleotida u rasponu od (9-N1) do (19-N1). U jednoj preferiranoj cjelini X2 je timidin. X1X2 su nukleotidi koji mogu biti odabrani od skupine koju čine: GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG TA I TT, a X3X4 su nukleotidi koji mogu biti odabrani od skupine koju čine; TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA i CA. U nekim preferiranim cjelinama X3 je timidin. U nekim preferiranim cjelinama X3X4 su nukleotidi koji su odabrani od skupine koju čine; TT, TC, TA, TG. U sljedećim cjelinama X1 i X2 su oba purini, a X3 i X4 su oba pirimidini ili X1X2 su GpA, a X3 i X4 su oba pirinidini. U jednoj cjelini X2 je T a X3 je pirimidin.

U jednoj cjelini 5'X1X2TGX2X3' sekvencija TG nukleinske kiseline cijele duljine ili nekog fragmenta TG nukleinske kiseline je ne-palindromska sekvencija, a u drugoj cjelini je palidromska sekvencija.

U nekim preferiranom cjelinama TG nukleinska kiselina je također T-obogaćena.

Py-obogaćene i TG inumostimulirajuće nukleinske kiseline u nekim cjelinama imaju nukleotidni skelet koji uključuje njamanje jednu modifikaciju skeleta kao što je fosfotionatna modifikacija. Nukleotidni skelet može biti kimerni ili je preferirano nukleotidni kostur kompletno modificiran. U jednoj preferiranoj cjelini imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima poli-T motiv i forsforotioatni skelet.

U sljedećem aspektu izuma je pripravak imunostimulirajuće nukleinske kiseline u obliku obogaćenom Py ili TG nukleinske kiseline, te antigen, pri čemu je nukleinska kiselina bez nemetiliranih CpG motiva.

Sljedeći pripravak iz izuma je obogaćenom Py ili TG nukleinska kiselina i antinikrobno sredstvo, pri čemu Py-obogaćena i TG nukleinska kiselina nema nemetiliranih CpG motiva. Preferirano antimirobno sredstvo je odabrano od skupine koju čine: antivirusno sredstvo, antiparazitsko sredstvo, antibakterijsko sredstvo i sredstvo protiv gljivica.

Prema sljedećem aspektu izuma prikazan je pripravak s napravom za odgođeno oslobađanje koji uključuje Py obogaćenu ili TG imunostimulirajuću nukleinske kiselinu, pri čemu su Py obogaćene i/ili TG nukleinske kiselina bez nemetiliranih CpG motiva.

Izum također uključuje nutricijske suplemente Py obogaćene ili TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline u napravi za isporuku koja je odabrana od skupine koju čine: kapsule, pilule ili sublingvalne tablete, pri čemu su Py obogaćenu ili TG nukleinske kiseline bez nemetiliranih CpG motiva.

Valje razumjeti da kada je korisno davanje Py obogaćene, npr. poli-T, T-obogaćene, C-obogaćene ili TG oligonukleotida i CpG oligonukleotida, može biti također istovremeno davni Py-obogaćeni ili TG oligonukleotidi zajedno s fizički odijeljenim CpG, Py obogaćenim ili TG oligonukleotidom. Alternativno, CpG, Py-obogaćena ili TG motiv može biti prisutan na istoj nukleinskoj kiselini kao Py-obogaćen ili TG oligonukleotid. U sljedećoj cjelini, sve ili neke kombinacije Py-obogaćene, TG i CpG nukleinskih kiselina se mogu istovremeno davati na odvojenoj nukleinskoj kiselini ili istoj molekuli nukleinske kiseline. Istovremenim davanjem je namjera da nukleinske kiseline daju u gotovo isto vrijeme da se postigne kombinirana korisnost obaju oligonukleotida, preferirano više nego koja bi se korist postigla davanjem svakog oligonukleotida samog u istoj dozi.

CpG oligonukleotidi imaju općenito formulu 5'X1X2TGX3X43', pri čemu su X1, X2, X3, te X4 nukleotidi i pri čemu je najmanje C od CpG nemetiliran. Preferirano su CpG oligonukleotidi dugi od 8-100 nukleotida i imaju modificirani skelet. Određene strukture su prikazane detaljno u PCT aplikacijoma U.S. aplikacijama i tamo navedenim referencijama, a ti prikazi su ugrađeni ovdje referencijom ugrađeni u cijelosti. U jednoj cjelini CpG oligonukleotidi nemaju poli-T i TRG motive i nije T-obogaćen.

U drugim cjelinama CpG oligonukleotidi imaju sekvencije odabrane od skupine kaju čine: SEQ ID NO: 1, 3, 4, 14-16, 18-24, 28, 29, 3346, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-87, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227-240, 242-256, 258, 260-265, 270-273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302,.305-307, 309-312, 314-317, 320-327, 329, 335, 337-341, 343-352, 354, 357, 361-365, 367-369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 399, 401-404, 406-426, 429433, 434-437, 439, 441-443, 445, 447, 448, 450, 453-456, 460-464, 466-469, 472- 475, 477, 478, 480, 483-485, 488, 489, 492, 493, 495-502, 504-505, 507-509, 511, 513- 529, 532-541, 543-555, 564-566, 568-576, 578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615, 617, 619-622, 625-646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711-716, 718- 732, 736, 737, 739-744, 746, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785- 786, 7900792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855- 859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904, te 909-913.

U sljedećoj cjelini Py obogaćeni ili TG oligonukleotid je bez CpG motiva. Ta cjelina izuma također obuhvaća farmaceutske pripravke i kitove koji sadrže CpG oligonukleotide (koji mogu biti bez poli-T i TG motiva i ne biti T-obogaćeni) i Py-obogaćeni i/ili TG oligonukleotidi fizički su odvojeni od CpG oligonukleotida. Farmaceutski pripravci su u učinkovitim količinama i tipično uključuju farmaceutsko prihvatljive nosače, sve kao što je ovdje prikazano detaljno za Py-obogaćene i TG oligonukleotide. Kitovi uključuju najmanje jedan spremnik koji sadrži oligonukleotid koji je Py-obogaćen ili TG oligonukleotid (ili neku njihovu kombinaciju). Isti spremnik ili u drugoj cjelini drugi spremnik, može sadržavati oligonukleotid s CpG motivom koji može biti bez Py-obogaćenih i/ili TG motiva. Kit također sadrži upute za davanje oligonukleotida subjektu. Kit također može sadržavati spremnik koji sadrži otapalo ili razrjeđivač.

Ukupno, kako je ovdje ponovo navedeno, ovdje su opisani CpG oligonukleotidi koji su fizički odijeljeni od Py-obogaćenih i TG oligonukleotida u metodama, pripravcima i produktima.

Izum se odnosi na druge aspekte imunostimulirajućih oligonukleotida koji imaju kimerni skelet i koji ne zahtjevaju prisutnost CpG motiva. Izum je zasnovan djelomično na otkriću da su sekvencije nukleinskih kiselina koje ne sadrže CpG motive imunostimulatori, a one koje imaju kimerni skelet su neočekivano povećavale imunostimulirajuća svojstva. Stoga se izum u jednom aspektu odnosi na pripravke oligonukleotida koji imaju formulu: 5'Y1N1ZN2Y23', pri čemu su Y1 i Y2 neovisno jedan od drugoga molekule nukleinskih kiselina koje imaju između 1 i 10 nukleotida, pri čemu Y1 uključuje najmanje jednu modificiranu oligomukleotidnu vezu a Y2 uključuje najmanje jednu modificiranu internukleotidnu vezu, a pri čemu su N1 i N2 molekule nukleinskih kiselina koje neovisno jedna od druge imaju između 0 i 5 nukleotida, ali pri čemu N1ZN2 ima ukupno najmanje 6 nukleotida i pri čemu nukleotidi N1ZN2 imaju fosfodiesteski skelet, te pri čemu je Z motiv imunostimulirajuće nukleinske kiseline ali ne uključuje CG. U jednoj cjelini Z je sekvencija nukleinske kiseline odabrane iz skupine koju čine TTTT, TG i sekvencija u kojoj je najmanje 50% baza sekvencije T.

U nekim cjelinama Y1 i/ili Y2 imaju između 3 i 8 nukleotida. U drugim cjelinama Y1 i/ili Y2 sadrže najmanje tri G, najmanje četiri G, najmanje sedam G ili sve G. U drugim cjelinama, Y1 i/ili Y2 su odabrani iz skupine koju čine TCGTCG, TCGTCGT i TCGTCGTT (SEQ ID NO: 1145). U sljedećim cjelinama Y1 i/ili Y2 uključuju najmanje jedan, dva, tri, četiri ili pet poli-A, poli-T ili poli-C sekvencija.

Centralni nukleotidi (N1ZN2) formule Y1N1ZN2Y2 imaju fosfodiesterske interlukleotidne veze i Y1 i Y2 imaju najmanje jednu modificiranu internukleotidnu vezu. U nekim cjelinama Y1 i/ili Y2 imaju najmanje dvije modificirane internukleotidne veze. U ostalim cjelinama Y1 i/ili Y2 imaju između dviju i pet modificiranih internukleotidnih veza. U sljedećim cjelinama Y1 ima dvije modificirane internukleotidne veze, a Y2 ima pet modificiranih internukleotidnih veza ili Y1 ima pet modificiranih internukleotidnih veza a Y2 ima dvije modificirane internukleotidne veze. Modificrana internukleotidna veza u nekim cjelinama je fosforotioatna modificirana veza, fosfoditionatna modificirana veza ili p-etoksi modificirana veza.

Dijelovi formule Y1N1ZN2Y2 mogu biti palindromi. Stoga su u nekim cjelinama nukleotidi N1ZN2 iz palindroma. U nekim cjelinama palindrom nije izravno ponavljanje. U sljedećim cjelinama nukleotidi N1ZN2 ne tvore palindrom.

Prema ostalim cjelinama N1ZN2 imaju sekvencije nukleotida odabranih iz skupine koja se sastoji od: GATTTTATCGTC (SEQ ID NO: 1098), TCGATTTTTCGA (SEQ ID NO: 1099); TCATTTTTATGA (SEQ ID NO: 1100); GTTTTTTACGAC (SEQ ID NO: 1101); TCAATTTTTTGA (SEQ ID NO: 1102); ACGTTTTTACGT (SEQ ID NO: 1103); TCGTTTTTACGA (SEQ ID NO: 1104); TCGATTTT-FACGTCGA (SEQ ID NO: 1105); AATTTTTTAACGTT (SEQ ID NO: 1106); TCGTTTTTTAACGA (SEQ ID NO: 1107); ACGTTTTTTAACGT (SEQ ID NO: 1108); GATTTTTATCGTC (SEQ ID NO: 1109); GACG ATTTTTCGTC (SEQID NO: 1110); GATTTTAGCTCGTC (SEQ ID NO: 1111); GATTTTTACGTC (SEQ ID NO: 1112); ATTTTATCGT (SEQ ID NO: 1113); AACGATTTTTCGTT (SEQ ID NO: 1114); TCACTTTTGTGA (SEQ ID NO: 1115); TCGTATTTTA (SEQ ID NO: 1116); ACTTTTGTACCGGT (SEQ ID NO: 1117); TCGATTTTTCGACGTCGA (SEQ ID NO: 1118); ACGATTTTTCGT (SEQ ID NO: 1119); GATGATCGTC (SEQ ID NO: 1120); TCGATGTCGA (SEQ ID NO: 112 1); TCATGTATGA (SEQ ID NO: 1122); GTGTTACGAC (SEQ ID NO: 1123); TCAATGTTGA (SEQ ID NO: 1124); ACGTGTACGT (SEQ ID NO: 1125); TCGTGTACGA (SEQ ID NO: 1126); TCGATGTACGTCGA (SEQ ID NO: 1127); AATGTTAACGTT (SEQ ID NO: 1128); TCGTGTTAACGA (SEQ ID NO: 1129); ACGTGTTAACGT (SEQ ID NO: 113 0); GATGTATCGTC (SEQ ID NO: 113 1); GACGATGTCGTC (SEQ ID NO: 1132); GATGAGCTCGTC (SEQ ID NO: 113 3); GATGTACGTC (SEQ ID NO: 1134); ATGATCGT (SEQ ID NO: 113 5); AACGATGTCGTT (SEQ ID NO: 113 6); TCACTGGTGA (SEQ ID NO: 113 7); TCGTATGA (SEQ ID NO: 113 8); ACTGGTACCGGT (SEQ ID NO: 1139); TCGATGTCGACGTCGA (SEQ ID NO: 1140); te ACGATGTCGT (SEQ ID NO: 114 1).

Pripravak može uključivati farmaceutski nosač i/ili biti formuliran u napravi za isporuku. U nekim cjelinama naprava za isporuku je odabrana iz skupine koju čine: kationski lipidi, stanični propusni proteini i naprave za odgođeno oslobađanje. U jednoj preferiranoj cjelini naprava za odgođeno oslobađanje je biorazgradni polimer. U sljedećoj cjelini naparava za osgođeno oslobađanje je mikročestica.

U sljedećem aspektu izum je pripravak imunostimulirajućih oligonukleotida formule Y1N1ZN2Y2 i antigen.

Sljedeći pripravak iz izuma je imunostimulirajući oligonukleotid koji ima formulu Y1N1ZN2Y2 i antimikronno terapijsko sredstvo. Preferirano je antimikrobno terapijsko sredstvo odabrano iz skupine koju čine: antivirusno sredstvo, antiparazitsko sredstvo, antibakterijsko sredstvo i sredstvo protiv gljivica.

Pripravak naprave za odgođeno oslobađanje, uključujući amunostimulirajući oligonukleotid formule Y1N1ZN2Y2, prikazan je prema drugom aspektu izuma.

Izum također uključuje nutricijske suplemente imunostimulirajućeg nukleotida formule Y1N1ZN2Y2 u napravi za isporuku koja ja odabrana kapsule, sublingvalne tablete i pilule.

U sljedećem aspektu gore opisani pripravci također uključuju imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu koja ima nemetilirani CG dinukleotid, TG dinukleotid ili Py obogaćenu sekvenciju u kojoj imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima nemetilirani CG dinukleotid, TG dinukleotid ili Py obogaćenu sekvenciju koja ima različitu sekvenciju od oligonukleotida koji sadrži 5'Y1N1ZN2Y23'.

U nekim cjelinama imunostimulirajuća nukleinska kiselina koja ima nemetilirani CG dinukleotid, TG dinukleotid ili Py-obogaćenu sekvenciju ima kompletno fosfodiestrski skeleta, druge cjeline imunostimulirajuće nukleinske kiselina koja ima nemetilirani CG dinukleotid, TG dinukleotid ili Py-obogaćenu sekvenciju imaju modificirani skelet koji može imati internukleotidne veze odabrane od skupine koju čine fosforotioat, fosfoditionat i p-etoksi.

U jednoj cjelini imunostimulirajuća nukleinska kiselina koja ima nemetilirani CG dinukleotid ima formulu 5'X1X2CGX3X43', a X1, X2, X3 i X4 nukleotidi. U drugim cjelinama sekvencija imunostimulirajuće nukleinske kiseline uključuje najmanje sljedeću formulu: 5'TCNTX1X2CGX3X43', pri čemu je N sekvencija nukleinske kiseline sastavljena od oko 0-25 nukleotida i pri čemu je barem jedan nukleotid modificiran internukleotidnom vezom, te pri čemu nukleinska kiselina ima manje ili jednako 100 nukleotida. Prema istim cjelinama X1X2 su nukleotidi odabrani od skupine koju čine: GT, GG, GA i AA, a X3X4 su nukleotidi odabrani od skupine koju čine: TT, CT illi GT. U preferiranoj cjelini X1X2 su GA a X3X4 su TT.

U sljedećoj cjelini sekvencija imnuostimulirajuće nukleinske kiseline ima nemetilirani CG dinukleotid koji uključuje barem jednu od sljedećih sekvencija: ATCGACTCTCGAGCGTTCTC (SEQ ID No. 15); TCCATGTCGGTCCTGCTGAT (SEQ ID No. 32); TCCATGTCGGTZCTGATGCT (SEQ ID No. 3 1); ATCGACTCTCGAGCGTTZTC (SEQ ID No. 18); TCCATGTCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 28); GGGGGG (SEQ ID No. 12); TCCATGACGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 35); TCCATGGCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 34); TCCATGACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 7); TCCATGTCGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 38); GGGGTCAGTCTTGACGGGG (SEQ ID No. 41); TCCATGTCGCTCCTGATGCT (SEQ ID No. 37); TCCATGTCGATCCTGATGCT (SEQ ID No. 36); TCCATGCCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 33); TCCATAACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 3); TCCATGACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 7); TCCATGACGTCCCTGATGCT (SEQ ID No 39); TCCATCACGTGCCTGATGCT (SEQ ID No. 48); TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No. 10); ATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No. 70); TCTCCCAGCGCGCGCCAT (SEQ ID No. -72); TCCATGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID No. 73); TCCATAGCGTTCCTAGCGTT (SEQ ID No. 74); TCCTGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No. 76); TCCTGTCGTTCCTGTCGT7 (SEQ ID No. 77); TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT (SEQ ID No. 52); TCCTTGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID No 121); TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT (SEQ ID No. 208); TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT (SEQ ID No. 120); TCCATGCGTTGCGTTGCGTT (SEQ ID No. 8 1); TCCACGACGTTTTCGACGTT (SEQ ID No. 82); TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 47); TCGTCGTTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID No. 46); TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID No. 49); GCGTGCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 56); TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT (SEQ ID No. 48); TGTCGTTGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 84); TGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 50); TCGTCGTCGTCGTT (SEQ ID No. 5 1); te TGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 85). U sljedećoj cjelini imnuostimulirajuća nukleinska kiselina ima Py-obogaćenu ili TG sekvenciju u nukleinskoj kiselini kao što je gore opisano.

U sljedećem aspektu izum se odnosi na farmaceutske pripravke i kitove koji sadrže oligonukleotid formule Y1N1ZN2Y2 i CpG oligonukleotid (koji može biti bez poli-T i TG motiva i ne biti Py-obogaćen), Py-obogaćen i/ili TG oligonukleotid fizički odvojen od oligonukleotida koji ima formulu Y1N1ZN2Y2. Farmaceutski pripravci u učinkovitim količinama i tipično uključuju farmaceutski prihvatljive nosače, sve koji su ovdje prikazani detaljno. Kitovi uključuju barem jedan spremnik koji sadrži oligonukleotide koji imaju formulu Y1N1ZN2Y2. Isti spremnik ili u drugim cjelinama drugi spremnik, može sadržavati oligonukleotide s CpG motivom koji može biti bez Py-obogaćenog i/ili TG motiva i/ili Py-obogaćenog ili TG oligonukleotida (ili neke njihove kombinacije). Kit također sadrži spremnik koji sadrži otapalo ili razrjeđivač.

Ukupno, kako je ovdje ponovo navedeno, u metodama su ovdje opisani pripravci i produkti oligonukleotida koji imaju formulu Y1N1ZN2Y2 koji su fizički odijeljeni od CpG, Py-obogaćenim, TG oligonukleotidima u metodama, pripravcima i produktima.

U sljedećem aspektu izum se odnosi na farmaceutski pripravak koji uključuje najmanje dva oligonukleotida iz izuma, pri čemu najmanje dva oligonukleotida imaju dvije sekvencije koje se razlikuju jedna od druge, te farmaceutski prihvatljiv nosač.

Formulacija vakcine je prikazana prema sljedećem aspektu izuma. Vakcina uključuje bilo koje pripravke iz izuma u kombinaciji s antigenom.

Prema sljedećem aspektu izuma prikazana je metoda stimulacije imunog odgovora. Metoda obuhvaća davanje Py-obogaćene ili TG imunostimulirajuću nukleinske kiseline subjektu koji nije glodavac, a u učinkovitoj količini da se inducira imuni odgovor u subjektu koji nije glodavac. Preferirano je da se Py-obogaćena ili TG imunostimulirajuća nukleinska kiselina daje oralno, lokalno, u napravi za odgođeno oslobađanje, mukosalno na površini sluznice, sustavno, parenteralno ili intramuskularno. Kada se Py-obogaćena ili TG imunostimulirajuća nukleinska kiselina daje na površini sluznice može se isporučiti u učinkovitoj količini za indukciju imunog odgovora sluznice ili sistemskog imunog odgovora. U preferiranim cjelinama površina sluznice odabrana je od skupine koju čine oralna, nazalna, rektalna, vaginalna i okularna površina.

U nekim cjelinama metoda uključuje izlaganje subjekta antigenu pri čemu je imuni odgovor specifičan na antigen. Antigen može biti kodiran vektorom nukleinske kiseline koji može biti isporučen subjektu. U nekim cjelinama antigen je odabran iz skupine koja se sastoji od tumorskog antigena, virusnog antigena, bakterijskog antigena, parazitskog antigena i peptidnog antigena.

Py-obogaćene ili TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline su sposobne izazvati širok spektar imunog odgovora. Primjerice te imunostimulirajuće nukleinske kiseline se mogu koristiti za usmjeravanje Th2 u Th1 imunog odgovora. Py-obogaćene ili TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline se mogu koristiti za aktiviranje imunih stanica kao što su leukociti, dendrične stanice i NK stanice. Aktivacija se može izvesti in vivo, in vitro ili ex vivo, t.j. izoliranjem imune stanice iz subjekta, dovođenje u kontakt imune stanice s učinkovitom količinom Py-obogaćenih ili TG imunostimulirajućih nukleinskih kiselina da se aktivira imuna stanica, te ponovnim davanjem aktivirane imune stanice subjektu. U nekim cjelinama dendrične stanice eksprimiraju antigen karcinoma. Dendrične stanice mogu biti izložene antigenu karcinoma ex vivo.

Imuni odgovor Py-obogaćene ili TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline može rezultirati indukcijom produkcije citokina, npr produkcijom IL-6, IL.12, IL-18 TNF, IFN-α i IFN-γ.

U sljedećoj cjelini Py-obogaćene ili TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline korisne su za tretman karcinoma. Py-obogaćene ili TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline su također korisne prema ostalim aspektima izuma u prevenciji karcinoma (npr. smanjivanjem rizika od razvitka karcinoma) u subjektu koji je rizičan na razvitak karcinoma. Karcinom se može odabrati iz skupine koju čine karcinom žučnog kanala, karcinom dojke, karcinom cerviksa, koriokarcinom, karcinom debelog crijeva, endometrijalni karcinom, karcinom želuca, intraepitelne neoplazme, limfomi, karcinom jetre, karcinom pluća (malih i ne-malih stanica), melanom, neuroblastomi, karcinom jajnika, karcinom pankreasa, karcinom prostate, karcinom rektuma, sarkom, karcinom tiroidne žljezde, karcinom bubrega kao i drugi karcinomi i sarkomi. U nekim važnim cjelinama, karcinom je odabran iz skupine koja se sastoji od karcinoma kosti, karcinoma mozga i CNS, karcinoma vezivnog tkiva, karcinoma jednjaka, karcinoma oka, Hodgkinova limfoma, karcinoma grla, karcinoma oralne šupljine, karcinoma kože i karcinoma testisa.

Py-obogaćene ili TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline se također mogu koristiti za povećanje odgovora stanica karcinoma na kancerogenu terapiju (npr. antikancerogena terapija), a Py-obogaćene ili TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline se mogu davati skupa s antkancerogenom terapijom. Antikancerogena terapija može biti kemoterapija, vakcina (npr in vitro pripravljene klice vakcine dendričnih stanica ili vakcine antigena karcinoma) ili na antitijelima zasnovana terapija. Ta zadnja terapija može također obuhvaćati davanje antitijela specifičnih za antigene stanične površine, primjerice, stanica karcinoma, pri čemu imuni odgovor rezultira o antigenu ovisnoj staničnoj citotoksičnosti (ADCC). U jednoj cjelini antitijelo se može izabrati iz skupine koju čine Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2138, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-2 10, MDX-11, NMX-22, OV 103, 3 622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CNlA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egfr3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART I D 10 Ab, SMART ABL 364 Ab i ImmuRAIT-CEA.

Stoga, prema nekim aspektima izuma, osobi koja ima karcinom ili je rizična na karcinom se daje imunostimulirajuća nukleinska kiselina i antikancerogena terapija. U nekim cjelinama, antikancerogena terapija je odabrana iz skupine koja se sastoji od kemoterapijskih sredstava, imunoterapijskih sredstava i vakcine karcinoma. Kemoterapijsko sredstvo može biti odabrano iz skupine koju čine: metotreksat, vinkristin, adriarmicin, cisplatin, kloretilnitrouree koje ne sadrže šećer, 5-fluoruracil, mitomicin C, bleomicin, doksorubicin, dakarbazin, taksol, fragilin, Meglamine GLA, valrubicin, karmustain i poliferposan, MM1270, BAY 12-9566, inhibitor RAS farnezil transferaze, inhibitor famezil transferaze, MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI- 994, TNP-470, Hycamtin/Topotecan, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrone/Mitroksan-tron, Metaret/Suramin, Batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9AC, AG3340, AG3433, InceINX-710, VX-853, ZDOIOI, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32Nalrubicin, derivati Metastron/stroncija, Temodal/Temozolomide, Evacet/liposomalni doksorubicin, Yewtaxan/Placlit-axel, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabine, Furtulon/Doxifluridine, Cyclopax/oral paclitaksel, Oral Taxoid, SPU-077/Cisplatin, HNM 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/RAS oncogeni inhibitor, BMS-182751/oralna platina, UFT(Tegafur/Uracil), Ergamisol/Levamisole, Eniluracil/776C85/5FU enhancer, Carnpto/Levamisole, Camptosar/Irinotecan, Tumodex/Ralitrexed, Leustatin/Cladribine, Paxex/Paclitaxel, Doxil/liposomal doxorubicin, Caelyx/liposomalni doksorubicin, Fludara/Fludarabine, Pharmarubicin/Epirubicin, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/Bis-Naphtalimide, LU 103793/Dolastdin, Caetyx/liposomal doxorubicin, Gemzar/Gemcitabine, ZD 0473/Anormed, YM 116, klice joda, inhibitori CDK4 i CDK2, inhibitori PARP, D4809/Dexifosamide, Ifes/Mesnex/Ifosainide, Vumon/Teniposide, Paraplatin/Carboplatin, Plantinol/cisplatin, Vepeside/Etoposide, ZD 9331, Taxotere/Docetaxel, prolijek gvanin arabinoze, analog Taxana, nitrozouree, sredstva za alkiliranje kao što je melfelan i ciklofosfamide, Aminoglutethimide, Asparaginase, Busulfan, Carboplatin, Chlorombucil, Cytarabine HCI, Dactinomycin, Daunorubicin HCI, Estramustine natrijev fosfat, Etoposide (VP 16- 213), Floxuridine, Fluorouracil (5-FU), Flutainide, Hydroxyurea (hidroksikarbamid), Ifosfamide, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b, Leuprolide acetate (LIMH-releasing factor analogue), Lomustine (CCN- U), Mechlorethamine HCI (nitrogen mustard), Mercaptopurine, Mesna, Mitotane (o.p'-DDD), Mitoxantrone HCI, Octreotide, Plicamycin, Procarbazine HCI, Streptozocin, Tamoxifen citrat, Thioguanine, Thiotepa, Vinblastine sulfat, Amsacrine (m-AMSA), Azacitidine, Erthropoietin, Hexamethylmelamine (HMM), Interleukin 2, Mitoguazone (methyl-GAG; metil glioksal bis-guanilhidrazone; MGBG), Pentostatin (2'deoksikoformicin), Semustine (metil-CCN-LJ), Teniposide (VM-26) te Vindesine sulfat, ali nije na njih ograničeno.

Imunoterapijska sredstva se mogu odabrati iz skupine koju čine: Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M 195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-2 10, MDX- 11, MDX-22, OV 103, 3 622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX- 220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab- H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.6, ior 0, BABS, anti- FLK-2, NMX-260, ANA Ab, SMART I D 10 Ab, SMART ABL 364 Ab i ImmuRAIT-CEA, ali nije na njih ograničeno.

Vakcina karcinoma se može odabrati iz skupine koju čine: EGF antiidiotipična vakcina karcinoma, Gp75 antigen, vakcina GMK melanoma, vakcina MGV gangliozidnog konjugata, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL teratop, BLP25 (MUC-1), liposomalna idioidiotipska vakcina, Melacine, vekcine peptidnog antigena, vakcine toksin/antigena, na MVAzasnovana vakcina, PACIS, vakcina BCG, TA-HPV, TA-CIN, DISC-virus te ImmuCyst/TheraCys, ali nije na njih ograničeno.

U sljedećoj cjelini metode su upućene na prevenciju ili tretman karcinoma subjektu, a kojem se nadalje može davati interferon-α.

Izum se u drugim aspektima odnosi na metode prevencije bolesti kod subjekta. Metoda obuhvaća davanje osobi Py-obogaćene ili TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline redovito, a da se pokrene odgovor imunog sustava kojim se sprječava bolest kod subjekta. Primjeri bolesti ili uvjeta koje treba spriječiti upotrebom profilaktičkih metoda iz izuma uključuju infekcije mikroorganzmima (npr. seksulano prenosive bolesti) i anafilaktički šok od alergije izazvane hranom.

U drugim aspektima, izum je metoda indukcije urođenog imunog odgovora davanjem subjektu Py-obogaćene ili TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline u učinkovitoj količini za aktiviranje urođenog imunog odgovora.

Prema sljedećem aspektu iz izuma, prikazana je metoda za tretman ili prevenciju virusne ili retrovirusne infekcije. Metoda obuhvaća davanje subjektu koji ima ili je rizičan na virusnu ili retrovirusnu infekciju učinkovite količine bilo kojeg pripravka iz izuma, a za tretman ili prevenciju virusne ili retrovirusne infekcije. U nekim cjelinama virus je uzrokovan virusom hepatitisa, HIV, hepatitisa B, hepatitisa C, herpesa ili papilomavirusa.

Metoda za tretman ili prevenciju bakterijske infekcije prikazana je prema drugom aspektu izuma. Metoda obuhvaća davanje subjektu koji ima ili je rizičan na bakterijsku infekciju učinkovite količine bilo kojeg pripravka iz izuma, a za tretran ili prevenciju bakterijske infekcije. U nekim cjelinama bakterijska infekcija potječe od intracelularne bakterije.

U sljedeći aspekt izuma je metoda za tretman ili prevenciju infekcije parazitom davanjem subjektu koji ima ili je rizičan na infekciju parazitom učinkovite količine bilo kojeg pripravka iz izuma, a za tretran ili prevenciju infekcije parazitom. U sljedećoj cjelini infekcija parazitom potječe od parazita koji nije crijevna glista.

U nekim cjelinama subjekt je čovjek, a u drugim cjelinama subjekt je kralježnjak koji nije čovjek a odabran je iz skupnie koju čine: pas, mačka, konj, krava, svinja, koza, riba, majmun, pile i ovca.

U sljedećem aspektu izum je metoda za tretman ili prevenciju astme davanjem subjektu koji ima ili je rizičan na astmu učinkovite količine bilo kojeg pripravka iz izuma, a za tretman ili prevenciju astme. U jednoj cjelini astma je alergijska astma.

U sljedećem aspektu izum je metoda za tretman ili prevenciju alergije. Metoda obuhvaća davanje subjektu koji ima ili je rizičan na alergiju učinkovite količine bilo kojeg pripravka iz izuma, a za tretman ili prevenciju astme.

Metoda za tretman ili prevenciju imune deficijencije prikazana je u sljedećem aspektu izuma. Metoda obuhvaća davanje subjektu koji ima ili je rizičan na imunu deficijenciju učinkovite količine bilo kojeg pripravka iz izuma, a za tretman ili prevenciju astme.

U sljedećem aspektu izum se odnosi na metodu indukcije TH1 imunog odgovora davanjem subjektu bilo kojeg pripravka iz izuma u učinkovitoj količini koja izaziva TH1 imuni odgovor.

U jednoj cjelini metoda izum obuhvaća davanje oligonukleotida formule 5'Y1N1ZN2Y23' i imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu koja ima nemetilirani CG dinukleotid i TG dinukleotid ili T-obogaćenu sekvenciju. U cjelini oligonukleotid koji sadrži 5'Y1N1ZN2Y23' je dan odvojeno od imunostimulirajuće nukleinske kiseline. U nekim cjelinama oligonukleotid koji sadrži 5'Y1N1ZN2Y23' i imunostimulirajuća nukleinska kiselina alternirani su tjedno, a u drugoj cjelini oligonukleotid koji sadrži 5'Y1N1ZN2Y23' i imunostimulirajuća nukleinska kiselina dani su alternativno dvotjedno.

Izum u drugom aspektu prikazuje pripravak koji sadrži imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu i antikancerogenu terapiju, fromulirano u farmaceutski prihvatljivom nosaču te u učinkovitoj količini za tretman karcinoma ili za smanjivanje rizika od razvitka karcinoma. U važnim cjelinama, imunostimulirajuća nukleinska kiselina je odabrana iz skupnie koju čine T-obogaćena nukleinska kiselina, TG nukleinska kiselina i C-obogaćena nukleinska kiselina.

Izum nadalje prikazuje kit koji sadrži prvi spremnik u kojem je imunostimulirajuća nukleinska kiselina i najmanje jedan spremnik (npr. drugi spremnik) u kojem je antikancerogena terapija, te upute za primjenu. U jednoj cjelini, kit nadalje sadrži interferon-α koji može biti smješten odvojeno i još jedan spremnik (npr. treći spremnik). U važnoj cjelini, kit sadrži vehikul za odgođeno oslobađanje imunostimulirajuće nukleinske kiseline i najmanje jedan spremnik u kojem je antekancetrogena terapija i upute za određivanje vremena davanja antikancerogene terapije. Imunostimulirajuća nukleinska kiselina može biti odabrana iz skupine koju čine Py-obogaćena nukleinska kiselina, TG nukleinska kiselina i CpG nukleinska kiselina, pri čemu CpG nukleinska kiselina ima nukleotidnu sekvenciju koja sadrži SEQ ID NO: 246.

Izum nadalje prikazuje metodu za prevenciju ili tretman astme ili alergije, a koja sadrži davanjem imunostimulirajuće nukleinske kiseline i lijek protiv astme/alergije u učinkovitoj količini za tretman ili prevenciju astme ili alergije. U važnim cjelinama, imunostimulirajuća nukleinska kiselina je odabrana iz skupine koju čine T-obogaćena nukleinska kiselina, TG nukleinska kiselina i C-obogaćena nukleinska kiselina.

U jednoj cjelini imunostimulirajuća nukleinska kiselina je T-obogaćena nukleinska kiselina. U srodnoj cjelini T-obogaćena nukleinska kiselina ima nukleotidnu sekvenciju odabranu od skupine koju čine: SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301,.304, 330, 342, 358, 370- 372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908, te 910-913. U drugim cjelinama T-obogaćena nukleinska kiselina ima sekvenciju odabranu od skupine koju čine SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498- 501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890, te 891.

U sljedećoj srodnoj cjelini T-obogaćena nukleinska kiselina nije TG nukleinska kiselina. U još jednoj cjelini T-obogaćena nukleinska kiselina nije CpG nukleinska kiselina.

U jednoj cjelini imunostimulirajuća nukleinska kiselina je CpG nukleinska kiselina, pri čemu nukleotidna sekvencija sadrži SEQ ID NO: 246.

U sljedećoj cjelini lijek protiv astme/alergije je odabran iz skupine koju čine PDE-4 inhibitor, bronhodilatator/beta-1 agonist, otvarač K+ kanala, VLA-4 antagonist, antagonist Neurokina, TXA2 inhibitor sinteze, Xanthanin, antagonist arkidonske kiseline, inhibitor 5 lipoksigenaze, antagonist Thromoxin A2 receptora, antagonistThromboxane A2, inhibitor 5-lipox aktivacijskig proteina, te inhibitor proteaze, ali nije na njih ograničen. U nekim važnim cjelinama, lijek protiv astme/alergije je agonist bronhodilatator/beta-2 odabran iz skupine koja se sastoji od: salmeterol, salbutamol, terbutalin, D2522/formoterol, fenoterol i orciprenalin.

U sljedećoj cjelini lijek protiv astme/alergije je lijek odabran iz skupine koju čine antihistamini i oni koji induciraju prostaglandin. U jednoj cjelini antihistamin je odabran iz skupine koju čine: loratidin, cetirizin, biclizin, analozi ceterizina, feksofenadin, terfenadin, desloratadin, norastemizol, epinastin, ebastin, astemizol, levokabastin, azelatin, transilast, terfenadin, mizolastin, betatastin, CS560, te HSR 609. U sljedećoj cjelini sredstvo za indukciju prostaglandina je S-5751.

U sljedećoj cjelini lijek protiv astme/alergije je odabran iz skupine koju čine steroidi i imunomodulatori. Imunomoduilatori mogu biti odabrani iz skupine koju čine: antiinflamatorna sredstva, antagonisti leukotriena, IL4 muteini, topljivi Fc fuzijski proteini IL-4 receptora, anti-IL-4 antitijela, antagonisti IL-4, anti-IL-4 antitijela, topljivi Fc fuzijski proteini IL-13 receptora, anti-IL-9 antitijela, antagonisti CCR3, antagonisti CCR5, inhibitori VLA-4, sredstva za smanjivanje IgE, ali nisu na njih ogranićni. U jednoj cjelini sredstvo za smanjivanje IgE je anti-IgE.

U jednoj cjelini su steroidi odabrani iz skupine koju čine: beklometazon, flutikazon, tramcinolon, te budesonid. U daljnjoj cjelini, imnunorespresivno sredstvo je peptidna vakcina.

U jednoj cjelini, imunostimulirajća nukleinska kiselina je dana istovremeno s lijekom protiv astme/alergije. U sljedećoj cjelini, subjekt je imunokompromizirajući subjekt.

Imunostimulirajća nukleinska kiselina je dana subjektu prema ovdje prikazanim metodama koje se odnose na prevenciju i tretman astme/alergije, a kao što je opisane za ostale aspekte metoda iz izuma.

I sljedećem aspektu, izum prikazuje kit koji sadrži prvi spremnik u kojem je imunostimulirajuća nukleinska kiselina i najmanje jedan spremnik (npr. drugi spremnik) u kojem je lijek protiv astme/alergije, te upute za primjenu. Imunostimulirajuća nukleinska kiselina korisna u kitu je ona ovdje opisana. U važnoj cjelini imunostimulirajuća nukleinska kiselina je odabran iz skupine koju čine: T-obogaćena nukleinska kiselina, TG nukleinska kiselina i C-obogaćena nukleinska kiselina. U sljedećoj cjelini kit sadrži vehikul za odgođeno oslobađanje imunostimulirajuće nukleinske kiseline i najmanje jedan spremnik u kojem je lijek protiv astme/alergije, upute za određivanje vremena davanje lijeka protiv astme/alergije. Lijek protiv astme/alergije se može odabrati iz skupine opisanih lijekova protiv astme/alergije opisanih u prethodnim metodama upućenim za prevenciju ili tretman astme/alergije.

U daljnjem aspektu, izum prikazuje pripravak koji sadrži imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu i lijek protiv astme/alergije, formulirano u farmaceutski prihvatljivom nosaču te u učinkovitoj količini za prevenciju tretman imunog odgovora povezanog s izlaganjem medijatoru astme ili alergije. Imunostimulirajuća nukleinska kiselina može biti odabrana iz skupine imunostimulirajućih nukleinskih kiselina opisanih u prethodnim metodama i pripravcima. U važnim cjelinama, imunostimulirajuća nukleinska kiselina je odabrana iz skupine koju čine T-obogaćena nukleinska kiselina, TG nukleinska kiselina i C-obogaćena nukleinska kiselina. Lijek protiv astme/alergije može biti odabran iz skupine koja se sastoji od lijekova protiv astme i alergije kao što je opisano u prethodnim metodama i pripravcima.

U sljedećem aspektu izum prikazuje pripravak koji sadrži imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu odabranu iz skupine koju čine: SEQ ID NO: 95-136, SEQ ID NO: 138-152, SEQ ID NO: 154-222, SEQ ID NO: 224-245, SEQ ID NO: 247-261, SEQ ID NO: 263-299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303-409, SEQ ID NO: 414-420, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 426-947, SEQ ID NO: 959-1022, SEQ ID NO: 1024-1093, te farmaceutski prihvatljiv nosač. Preferirano, imunostimulirajuća nukleinska kiselina prisutna je u pripravku u učinkovitoj količini. U jednoj cjelini, imunostimulirajuća nukleinska kiselina prisutna je u učinkovitoj količini da izazove imuni odgovor. U sljedećoj cjelini, imunostimulirajuća nukleinska kiselina je prisutna u učinkovitoj količini za prevenciju i tretman karcinoma. U sljedećoj cjelini, imunostimulirajuća nukleinska kiselina je prisutna u učinkovitoj količini za prevenciju ili tretman astme/alergije. Izum također prikazuje kitove koji sadrže pripravak od bilo koje prethodne imunostimulirajuće nukleinske kiseline i upute za upotrebu.

U sljedećem aspektu izum uključuje prirpavak imunostimulirajuće nukleinske kiseline koja se u osnovi sastoji os 5' M1TCGTCGTTM23', pri čemu najmanje jedan od Cs nije metiliran, pri čemu je M1 nukleinska kiselina koja ima najmanje jedan nukleotid, te pri čemu imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima manje od 100 nukleotida.

U drugim aspektima izum se odnosi na farmaceutski pripravak imunostimulirajuće nukleinske kiseline koja sadrži: 5' TCGTCGTT 3', pri čemu najmanje jedan od Cs nije metiliran, te pri čemu imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima manje od 100 nukleotida i fosfodiesterski skelet i napravu za odgođeno oslobađanje. U nekim cjelinama naprava za odgođeno oslobađanje je mikročestica. U ostalim cjelinama pripravak uključuje antigen.

Svako od ograničenja izuma može sadržavati različite cjeline izuma. Stoga se očekuje da svako ograničenje izuma koje obuhvaća bilo koji element ili kombinaciju elemenata može biti uključeno u svaki aspekt izuma.

Kratki opis slika

Slika 1A je histogram ekspresije CD86 (Y-os) CD19+ stanicama nakon izlaganja tih stanica oligonukleotidima prikazanih na X-osi pri koncentraciji od 0.15 μL/mL.

Slika 1B je tablica podataka iz Slike 1A.

Slika 1C je histogram ekspresije CD86 (Y-os) CD19+ stanicama nakon izlaganja tih stanica oligonukleotidima prikazanih na X-osi pri koncentraciji od 0.30 μL/mL.

Slika 1D je tablica podataka iz Slike 1C.

Slika 2 je graf koji uspoređuje sposobnosti ODN 2137, ODN 2177, ODN 2200 i ODN 2202 da stimuliraju proliferaciju B stanica pri koncentracijama u rasponu od 0.2 μg/mL do 20 μg/mL.

Slika 3 je graf koji uspoređuje sposobnosti ODN 2188, ODN 2189, ODN 2190 i ODN 2182 da stimuliraju proliferaciju B stanica pri koncentracijama u rasponu od 0.2 μg/mL do 20 μg/mL.

Slika 4 je graf koji opisuje o dozi ovisnu aktivaciju B stanica induciranu ne-CpG ODN. PBMC davatelja krvi je inkubiran s naznačenom koncentracijom ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 5126 (SEQ ID NO: 1058), te 5162 (SEQ ID NO: 1094 i bojano je s mAb za CD19 (marker B stanice) i CD86 (aktivacijski marker B stanice, B7-2). Ekspresija je mjerena protočnom citometrijom.

Slika 5 je graf koji opisuje stimulaciju B stanica različitim ne-CpG ODN. PBMC jedno predstavnika davatelja je stimulirana s 0.4 μg/mL, 1.0 μg/mL ili 10 μg/mL sljedećih ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 2196 (SEQ ID NO: 913), 2194 (SEQ ID NO: 911), 5162 (SEQ ID NO: 1094), 5163 (SEQ ID NO: 1095), 5168 (SEQ ID NO: 1096), te 5169 (SEQ ID NO: 1097), a ekspresija aktivacijskog markera CD86 (B7-2( na CD-19 pozitivnim B stanicama je mjerena protočnom citometrijom.

Slika 6 je graf koji opisuje aktivaciju B stanica s ne-CpG ODN 1982 i 2041. PBMC je inkubiran s naznačenom koncentracijom ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 1982 (SEQ ID NO: 225), te 2041 (SEQ ID NO: 282) a aktivacija B stanica (ekspresija aktivacijskog markera CD86) je mjerena protočnom citometrijom.

Slika 7 je graf koji opisuje NK stanice aktivirane s ne-CpG ODN. PBMC je inkubiran s 6 μg/mL sljedećih ODN: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 911), te 5126 (SEQ ID NO: 1058) i bojano je s mAb za CD3 (marker T stanice), CD56 (marker NK stanice) i CD69 (rani aktivacijski marker). Ekspresija je CD69 na CD56-pozitivnim NK stanicama mjerena je protočnom citometrijom.

Slika 8 je graf povećanje s NK posredovane citotoksičnosti s ne-CpG ODN. PBMC s 6 μg/mL ODN: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2194 (SEQ ID NO: 911), te 5126 (SEQ ID NO: 1058).

Slika 9 je graf koji opisuje NKT stanice koje se mogu aktivirati s ne-CpG ODN. PBMC jednog donora je inkubiran s 6 μg/mL ODN: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 911), te 5126 (SEQ ID NO: 1058) kroz 24 sata i aktivacija NKT stanica je mjerena protočnom citometrijom nakon bojanja stanica s mAb za CD3 (marker T stanice), CD56 (marker NK stanice).

Slika 10 je graf koji opisuje stimulaciju monocita s ne-CpG ODN. PBMC je inkubiran s 6 μg/mL sljedećih ODN: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2178 (SEQ ID NO: 428), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 911), 5126 (SEQ ID NO: 1058) , te 5163 (SEQ ID NO: 1095) i bojano je za CD14 (marker monocita) CD80 (B7-1, aktivacijski marker). Ekspresija je mjerena protočnom citometrijom.

Slika 11 je graf koji opisuje oslobađanje TNFα nakon kultiviranja humanih stanica s ne-CpG ODN. PBMC je kultiviran kroz 24 h s ili bez 6 μg/mL navedenog ODN ili 1 μg/mL LPS kao pozitivne kontrole a TNFα je mjerena s ELISA.

Slika 12 je graf koji opisuje oslobađanje IL-6 nakon kultiviranja humanih stanica s ne-CpG ODN i ima isti oblik kao za TNFα. PBMC je kultiviran s navedenom ODN (1.0 μg/mL) a IL-6 je mjeren s ELISA.

Detaljni opis

Izum se u jednom aspektu odnosi na otkriće da su pirimidinom (Py) bogate, te preferirano timidimom (T) bogate nukleinske kiseline kao i nukleinske kiseline koje sadrže TG dinukleotidni motiv učinkovite u posredovanju imnuostimulirajućeg efekta. Bilo je prethodno poznato da nukleinske kiseline koje sadrže CpG su terapijski i profilaktički pripravci koji stimuliraju imuni sustav u tretmanu karcinoma, infekcijskih bolesti, alergije, astme i ostalih poremećaja, te da pomažu u zaštiti protiv oportunističkih infekcija koje slijede kemoterapije karcinoma. Jaki ali balansirani stanični i humorlani imuni odgovori koji potječu od stimulacije CpG ukazuju na vlastitu obranu tijela od patogena i stanica karcinoma. Sekvencija CpG, koje su relativno rijetke u humanoj DNA se učestlo nalaze u DNA infekcijskih organizama kao što su bakterije. Humani imuni sustav je očito izazvan da prepozna CpG sekvencije kao rani znak upozorenja na infekciju, te iniciraju trenutni i jaki imuni odgovor na napadajuće patogene bez uzrokovanja nepogodnih reakcija koje su često viđene s ostalim stimulirajućim sredstvima. Stoga se nukleinske kiseline koje sadrže CpG, a oslanjaju se na taj urođeni mehanizam obrane, mogu koristiti jedinstven i prirodni put za imunu terapiju. Efekt CpG nukleinskih kiselina na modulaciju imunog odgovora je otkrivena od izumitelja ove patenne aplikacije i detaljno je opisana u istovremenoj patentnim aplikacijama kao što je U.S: Patentna aplikacija serijski br: 08/386,063 prijavljena 07/02/95 (i odgovarajući PCT US95/01570); 08/738,652 prijavljen 30/10/96; 08/960,774 prijavljeno 10/30/97 (i srodan PCT/IJS97/19791, WO 98/18810); 09/191,170 prijavljen 13/11/98; 09/030,701 prijavljeno 25/02/98 (i odgovarajući PCT/US98/03678; 09/082,649 prijavljen 20/05/98 (i odgovarajući PCT/US98/10408); 09/325,193 prijavljen 03/06/99 (te odgovarajući PCTIUS98/04703); 09/286,098 prijavljen 02/04/99 (te odgovarajući PCT/US99/07335); 09/306,281 prijavljen 06/05/99 (te odgovarajući PCT/US99/09863). Cijeli sadržaj od tih patenata i patentnih aplikacija je ovdje ograđen citatom.

Pronalasci iz ovog izuma su primjenjivi za sve gore opisane upotrebe nukleinskih kiselina koje sadrže CpG kao i za bilo koji drugi upotrebu poznatu za korištenje CpG nukleinske kiseline. Izum obuhvaća u jednom aspektu otkriće da Py-obogaćena i preferirano T-obogaćena i TG nukleinske kiseline imaju slična imunostimulirajuća svojstva na CpG oligonukleotide bez obzira da li je CpG motiv prisutan. Stoga je izum koristan za bilo koju metodu za stimuliranje imunog sustava korištenjem Py-obogaćene ili TG nukleinske kiseline. Pronađeno je, iznenađujuće, da prema izumu kimerni oligonukleotidi koji nemaju CpG motiv su imunostimulatori i imaju mnoge iste profilaktičke i terapijske aktivnosti kao CpG oligonukleotidi.

Py-obogaćena je T-obogaćena ili C-obogaćena imunomodulirajuća nukleinska kiselina. U nekim cjelinama T-obogaćene nukleinske kiseline su preferirane. T-obogaćena nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja uključuje najmanje jednu poli-T sekvenciju i/ili koja ima sastav nukleotida koji ima više od 25% T nukleotidnih ostataka. Nukleinska kiselina koja ima koja ima poli-T sekvenciju uključuje najmanje četiri T u nizu, kao što je 5'TTTT3'. Preferirano T-obogaćena nukleinska kiselina uključuje više od jedne poli-T sekvencije. U preferiranim cjelinama T-obogaćena nukleinska kiselina može imati 2,3,4 itd. poli-T sekvencije, kao što su oligonukleotidi br. 2006 (SEQ ID NO: 246). Jedna od vrlo snažnih imunostimulirajućih T-obogaćenih oligonukleotida otkrivenih prema izumu je nukleinska kiselina koja je cijela sastavljena od T nukleotidnih ostataka, npr. oligonukleotidi br. 2183 (SEQ ID NO: 443). Ostale T-obogaćene nukleinske kiseline prema izumu imaju nukleotidni sastav koji ima više od 25% T nukleotidnih ostataka, ali nije neophodno da uključuje poli T sekvenciju. U tim T-obogaćenim nukleinskim kiselinama T nukleotidni ostaci mogu biti odijeljeni jedan od drugog ostalim tipovima nukleotidnih ostataka npr. G, C, te A. U nekim cjelinama T-obogaćene nukleinske kiseline imaju sastav u kojem je više od 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% i 99% T nukleotidnih ostataka i svaki cijeli broj % između navedenih. Preferirano T-obogaćene nukleinske kiseline imaju najmanje jednu poli-T sekvneciju, te u sastavu nukleotida više od 25% T nukleotidnih ostataka.

Otkriveno je prema ovom izumu da sadržaj T od ODN ima dramatični efekt na imunostimulirajući efekt ODN koji je T-obogaćen ODN, a koji može aktivirati višestruke tipove humanih imunih stanica u odsutnosti bilo kojeg CpG motiva. Oligonukleotid koji ima 3' poli T regiju i 2 5' CG, npr. ODN 2181(SEQ ID NO: 431) je snažni imunostimulator. Oligonukleotid slične duljine, ODN 2116 (SEQ ID NO: 357) koji sadrži dva dunukleotida na 5' kraju i poli-C regiju na 3' kraju je također imunostimulator ali slabiji od T-obogaćenog oligonukleotida, a prema standardnim eksperimentalnim uvjetima. Stoga, mada C i R imaju skoro identične strukture, njihov efekt na imuna svojstva ODN varira. Oba su sposobna inducirati imuni odgovor ali do različite razine. Stoga su T-obogaćeni i C-obogaćeni oligonukleotidi korisni prema izumu, ali su T-obogaćeni oligonukleotidi preferirani. Nadalje, ako je sadržaj T ODN smanjen ugradnjom drugih baza kao što je G, A ili C, tada su imunostimulirajući efekti smanjeni (ODN br. 2188 (SEQ ID NO: 905), 2190 (SEQ ID NO: 907), 2191 (SEQ ID NO: 908), te 2193 (SEQ ID NO: 910)).

C-obogaćena nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja ima najmanje jednu ili preferirano najmanje dvije poli-C regije ili koja je sastavljena od najmanje 50% C nukleotida. Poli C regija je najmanje četiri C ostatka u nizu. Stoga je poli-C regija prikazana formulom 5'CCCC3'. ostale C-obogaćene nukleinske kiseline prema izumu imaju u sastavu nukleotida više od 50% C nukleotidnog ostatka, ali u sastavu ne uključuju neophodno poli-C sekvenciju. U tim C-obogaćenim nukleinskim kiselinama C nukleotidni ostaci mogu biti odijeljeni jedan od drugog ostalim tipovima nukleotidnih ostataka, npr. G, T, te A. U nekim cjelinama C-obogaćene nukleinske kiseline imaju sastav u kojem je više od 60%, 70%, 80%, 90% i 99% C nukleotidnih ostataka i svaki cijeli broj % između navedenih. Preferirano C-obogaćene nukleinske kiseline imaju najmanje jednu poli-C sekvneciju i u sastavu nukleotida više od 50% C nukleotidnih ostataka, te su u nekim cjelinama također T-obogaćeni.

Kao što je prikazano u Primjerima, nekoliko ODN, za koje se vjerovalo da su ne-imunostimulatori, uključujući dvije ODN SEQ ID NO: 225 i SEQ ID NO: 282 prethodno opisane da su ne-stimulatorne i uglavnom korištene kao kontrole ODN (Takahashi, T et al. 2000, J. Immunol. 164:4458) je nađeno da su imunostimulatori. Naši eksperimenti pokazuju da ti ODN mogu stimulirati B stanice, mada pri višim koncentracijama u usporedbi s CpG ODN (Slika 6). Duga poli-T ODN (30 mer), barem u nekim eksperimentima je inducirala usporedivo jaku aktivaciju B stanica, a prema jednoj od najjačih CpG ODN aktivatora B stanica. Ti eksperimenti također pokazuju iznenađujuća otkriće da čak poli-C ODN može voditi stímulaciji B stanica.

Imunostimulirajuća aktivnost tih ODN, međutim, nije bila ograničena na humane B stanice. Različiti eksperimentalni testovi su jasno pokazali da uz monocite, NK stanice čak i NKT stanice mogu biti aktivirane takvim ne-CpG ODN (Slike 7-10). Nasuprot poli-T i poli-C sekvencijama, imunostimulirajuće poli-A sekvencije (najmanje za monocite, B i NK stanice) nisu dostignute. Interesantno da je nađeno a uvođenje CpG motiva u SEQ ID No÷ 225 povećava imunostimulirajuću aktivnost dok produljenje s poli T ne povećava imunostimulaciju. To ukazuje da CpG i T-obogaćeni ODN mogu djelovati preko različitih mehanizama ili puteva. Također je moguće da insercija poli-T motiva u različite položaje SEQ ID NO: 225 može promjeniti imuno-stimulirajuća svojstva.

"TG nukleinska kiselina" ili "TG imunostimulirajuća nukleinska kiselina" kako se ovdje koristi je nukleinska kiselina koja sadrži barem jedan TpG dinukleotid (timidin-gvanidin dinukleotidnu sekvneciju, t.j. "TG DNA" ili DNA koja sadrži 5' timidin nakon koje slijedi 3' gvanozin i vezani su fosfatnom vezom) i aktivira komponentu imunog sustava.

U jednoj cjelini izum prikazuje TG nukleinsku kiselinu predstavljenu najmanje formulom:

5'N1X1TGX2N23'.

pri čemu X1 i X2 jesu nukleotidi a N je bilo koji nukleotid , te N1 i N2 jesu sekvencije nukleinskih kiselina bilo kojeg broja N, s tim da je suma ukupnog N1 i N2 u rasponu od 11 do 21. Kao primjer, kada N1 jeste 5, tada N2 može biti 6 ( vodeći ukupnoj duljini oligonukleotida od 15 nukleotida). TG može biti smješten bilo gdje unutar oligonukleotidnog lanca, uključujući 5' kraj, centar i 3' kraj. Stoga N1 može biti od nula do uključujući 21 s tim da je N2 pogodno odabran i daje sumu od N2 i N1 jednaku od 11 do uključujući 21. Slično, N2 može biti od nula do uključujući 21, U nekim cjelinama, X1 je adenin, gvanin ili timidin, a X2 je citozin, adenin ili timidin. U jednoj preferiranoj cjleini, X2 je timidin. U drugim cjelinama X1 je citozin i/ili X2 jeste gvanin. U drugim cjelinama, kao što je ovdje diskutirano, nukleinska kiselina može obuhvaćati druge motive s tim da je dovoljno dug za to.

U drugim cjelinama TG nukleinska kiselina predstavljena je najmanje formulom:

5'N1X1X2TGX3X4N23'

pri čemu X1, X2, X3 i X4 jesu nukleotidi. U nekim cjelinama X1X2 jesu nukleotidi odabrani iz skupine koju čine: GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA,TpA I TpT; X3X4 jesu nukleotidi odabrani iz skupine koju čine TpT, CpT, ApT, ApG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA I CpA; N je bilo koji nukleotid , te N1 i N2 jesu sekvencije nukleinskih kiselina bilo kojeg broja N s tim da je suma ukupnog N1 i N2 u rasponu od 9 do 19. U nekim cjelinama, X1X2 jesu GpA ili GpT, X3X4 su TpT. U sljedećim cjelinama X1 i X2 su purini, a X3 ili X4 pirimidini ili X1X2 jesu GpA, a X3 ili X4 oba jesu pirimidini. I jednoj preferiranoj cjelini X3X4 su nukleotidi odabrani iz skupine koju čine: TpT, TpC i TpA.

Imunostimulirajuća nukleinska kiselina može biti bilo koje veličine (t.j. duljine) s tim da je od najmanje 4 nukleotida. U važnim cjelinama imunostimulirajuće nukleinske kiseline imaju duljinu koja je u rasponu između 6 i 100. U još drugim cjelinama duljina je u rasponu ozmeđu 8 i 35 nukleotida. Preferirano TG nukleotidi su u rasponu od 15 do 25 nukleotida.

Veličina (tj. broj nukleotidnih ostataka u nukleinskoj kiselini) imunostimulirajuće nukleinske kiseline može također doprinijeti stimulatornoj aktivnosti nukleinske kiseline. Iznenađujuće je otkriće da čak kod jake imunostimulirajuće nukleinske kiseline duljina nukleinske kiseline utječe na jakost imunostimulacije koja se može postići. Pokazano je da povećanje duljine T-obogaćene nukleinske kiseline do 24 nukleotida uzrokuje povećanje imune stimulacije. Eksperimenti prikazani u primjerima pokazuju da kada je duljina T-obogaćene nukleinske kiseline povećana s 18 do 27 nukleotida, sposobnost nukleinske kiseline da stimulira imuni odgovor je značajno povećana (usporedi ODN br. 2194, 2183 i 2196 kojima se smanjuje veličina s 27 -18 nukleotida). Povećanjem duljine nukleinske kiseline do 30 nukleotida ima dramatični učinak na biološka svojstva nukleinske kiseline, ali povećavanje duljine preko 30 nukleotida ne utječe dalje na imunostimulirajući efekt (npr. usporedi ODN 2179 do 2006).

Pokazano je da TG nukleinske kiseline raspona duljine od 15 o 25 nukleotida mogu pokazivati povećanu imunostimulaciju. Stoga u jednom aspektu izum prikazuje oligonukleotide duljine 15-27 nukleotida (t.j. oligonukleotid koji je 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, ili 27 nukleotida) koja može biti T-obogaćena nukleinska kiselina ili može biti TG nukleinska kiselina. U jednoj cjelini, oligonukleotid nije T-obogaćeni oligonukleotid niti je TG nukleinska kiselina. U drugim cjelinama oligonukleotidi nemaju CG motiv. Izum slično prikazuje oligonukleotide koji imaju duljinu od 15-27 nukleotida, oligonukleotide koji imaju duljinu od 18-25 nukleotida, oligonukleotide koji imaju duljinu od 20-23 nukleotida, te oligonukleotide koji imaju duljinu od 23-25 nukleotida. Bilo koja prethodna cjelina odnosi se na oligonukleotide u tom rasponu duljina. Izum nadalje obuhvaća upotrebu tih prethodnih oligonukleotida u ovdje navedenim metodama.

Mada je maksimalna razina imune stimulacije dostignuta s nekim T-obogaćenim nukleinskim kiselinama kada nukleinska kiselina ima duljinu od 24-30 nukleotidnih ostataka, kao i neke TG nukleinske kiseline čija je duljina u rasponu od 15 do 25 nukleotida, kraće ili dulje imunostimulirajuće nukleinske kiseline se također mogu koristiti prema metodama iz izuma. Za olakšavanje prihvata u stanice imunostimulirajuće nukleinske kiseline preferirano imaju minimalnu duljinu od 6 nukleotidnih ostataka. Nukleinske kiseline bilo koje duljine veće od 6 nukleotida (čak mnogo kb duge) su sposobne inducirati imuni odgovor prema izumu, a ako su prisutni imunostimulirajući motivi, jer se veće nukleinske kiseline degradiraju unutar stanice. Imunostimulirajuće nukleinske kiseline preferirano jesu u rasponu između 8 i 100, a u nekim cjelinama T-obogaćene imunostimulirajuće nukleinske kiseline su između 24 i 40 nukleotida duljine, a TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline su duljine između 15 i 25 nukleotida.

U jednoj cjelini T-obogaćena nukleinska kiselina predstavljena je najmanje formulom:

5'X1X2TGX3X43'.

pri čemu X1, X2, X3 i X4 jesu nukleotidi. U jednoj cjelini X1X2 je TT i/ili X3X4 jesu TT. U sljedećoj cjelini X1X2 jesu bilo koji od sljedećih nukleotida: TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA i GC, te X3X4 jesu bilo koji od sljedećih nukleotida: TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA i GC.

U nekim cjelinama je preferirano da imunostimulirajuće nukleinske kiseline ne sadrže poli-C (CCCC) ili poli-A (AAAA). U drugim cjelinama je preferirano da imunostimulirajuće nukleinske kiseline imaju poli-C, poli-A, poli-G (GGGG) ili višestruke GG. Upravo poli-G ili višestruki GG motivi imaju dramatični učinak na neke imunostimulirajuće nukleinske kiseline. Efekt tih ne-T sekvencija ovisi dijelom o statusu skeleta nukleinske kiseline. Primjerice, ako nukleinska kiselina ima fosfodiesterski kimerni skelet, uključivanje tih sekvencija u nukleisku kiselinu će imati samo minimalni učinak na biološku aktivnost nukleinske kiseline. Ako je skelet kompletno fosforotioatni (ili druge fosfatne modifikacije) ili u značajnoj mjeri fosfotionatni, tada uključivanje tih sekvencija može imati veći utjecaj na biološku aktivnost ili kinetiku biološke aktivnosti, uzrokujući smanjivanje mogućnosti T-obogaćenih i TG imunostimulirajućig nukleinskih kiselina.

Mada je za C-obogaćene nukleinske kiseline pokazano da imaju imunostimularajuća svojstva, insercija poli-C sekvencije u T-obogaćenu nukleinsku kiselinu može imati negativni učinak na nukleinsku kiselinu. Mada prijavitelji nizu vezani predloženim mehanizmom, vjeruje se da imuni sustav razvija mehanizam za razlikovanje nukleinskih kiselina koje imaju različita nukleotidna svojstva, moguće zbog različitih skupina vezanih proteina koji prepoznaju različite sekvencije ili specifičnih vezanih proteina koji prepoznaju sve imunostimulirajuće sekvencije ali s različitim afinitetima. Općenito, nukleinske kiseline koje uključuju nemetilirane CpG motive su najbolji imunostimulatori, nakon kojih slijede T-obogaćene nukleinske kiseline, TG nukleinske kiseline i C-obogaćene nukleinske kiseline. Ova generalizacija, međutim ima mnogo izuzetaka. Primjerice znatno T-obogaćena nukleinska kiselina kao što je SEQ ID NO: 886 je jači imunostimulator prema nekim testovima nego neke nukleinske kiseline koje sadrže CpG (npr. fosforotioatna CpG nukleinska kiselina koja sadrži jedan CpG motiv).

Također je otkriveno da dodatak poli-A repa na imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu može povećati aktivnost nukleinske kiseline. Otkriveno je da modifikacija dodatkom poli-A repa (AAAAAA) ili poli-T repa (TTTTTT) na jako imunostimulirajuću CpG nukleinsku kiselinu (SEQ ID NO: 246) povećava imnuostimulirajuću aktivnost. Sposobnost poli-A repa ili poli-T repa da poveća imunostimulirajuća svojstva oligonukleotida je vrlo slična. SEQ ID NO: 246 je T-obogaćen oligonukleotid. Vjerojatno je da bi dodatak poli-A i poli-T repova na nukleinsku kiselinu, a koja nije T-obogaćena, imao veći učinak na imunostimulirajuću sposobnost nukleinske kiseline. Kako je poli-T dodan u nukleinsku kiselinu koja je već znatni T-obogaćena, imunostimulirajuće svojstvo dodatkom poli-T je nešto smanjeno, mada ne potpuno. Ti pronalasci imaju važnu posljedicu za upotrebu poli-A regija.

Neke imunostimulirajuće nukleinske kiseline iz izuma uključuju jedan ili više motiva. Prisutnost CG motiva u imunostimulirajućim nukleinskim kiselinama također ima utjecaj na biološku aktivnost nukleinskih kiselina. Kako je ukupna duljina imunostimulirajuće nukleinske kiseline 20 nukleotidnih ostataka ili manja, tada su CpG motivi važni u određivanju imunog efekta nukleinske kiseline i metiliranje tih motiva smanjuje mogućnost imunostimulirajućeg efekta nukleinske kiseline. Ako je duljina imunostimulrajuće nukleinske kiseline povećana na 24, tada imunostimulirajući efekti nukleinske kiseline postaju ovisni o CpG motivima i nisu više nestali zbog metiliranja CpG motiva ili njihovim inverznim GC dinukleotidima, s tim da su prisutna ovdje opisana ostala imunostimulirajuća svojstva.

Primjerice, ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) je jaki stimulator T-obogaćene nukleinske kiseline duljine od 24 nukleotidna ostatka s četiri CpG dinukleotida. Međutim, ODN 2117 (SEQ ID NO: 358), u kojem su CpG motivi metilirani je također jak imunostimulator. ODN 2137 (SEQ ID NO: 886), u kojem su CpG motivi ODN 2006 pretvoreni u GpC, a koji kao rezultat posjeduje šest TG dinukleotida je također imunostimulator. Imunostimulirajući efekti nukleinskih kiselina kao što je ODN 2117 i 2137 su regulirani njihovim T i TG sadržajem. Svaka od tih triju nukleinskih kiselina je T-obogaćena, a ODN 2137 je dodatno TG-obogaćen. Ako je njihov sadržaj T smanjen insertiranjem drugih baza kao što je A (ODN 2117 (SEQ ID NO: 358)) ili je njihov sadržaj TG smanjen supstitucijom TG s AG, tada su imunostimulirajući efekti nešto smanjeni. U sljedećem primjeru, nukleinska kiselina duljine 24 nukleotida u kojoj su svi položaju slučajni ima samo mali imunostimulirajući efekt (ODN 2182 (SEQ ID NO:432)). Slično, nukleinska kiselina duljine 24 nukleotida s drugim nukleotidnim sastavom ima promjenjljive imunostimulrajuće efekte, ovismo o sadržaju T (ODN 2188 (SEQ ID NO:905),2189 (SEQ ID NO: 906),2190 (SEQ ID NO:907),2191 (SEQ ID NO:908),2193 (SEQ ID NO: 910),2183 (SEQ ID NO:433), te 2178 (SEQ ID NO:428)). ODN 2190 koji sadrži TGT motive je jači imunonstimulator od ODN 2202 koji sadrži TGG motive. Stoga su u nekim cjelinama preferirani TGT motivi. U drugim cjelinama broj TG motiva je važan zato što povećava broj TG motiva što vodi povećanju imunostimulacije. Neke preferirane TG nukleinske kiseline sadrže najmanje tri TC motiva.

Primjeri CpG nukleinskih kiselina uključuju, ali nisu na njih ograničeni prikazane u Tablici A, kao što su: SEQ ID NO: 1, 3, 4, 14-16, 18-24, 28, 29, 33-46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-87, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 190-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227240, 242-256, 258, 260-265, 270-273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-312, 314-317, 320-327, 329, 335, 337-341, 343-352, 354, 357, 361- 365, 367-369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 399, 401-404, 406-426, 429-433, 434437, 439, 441-443, 445, 447, 448, 450, 453-456, 460-464, 466-469, 472-475, 477, 478, 480, 483-485, 488, 489, 492, 493, 495-502, 504-505, 507-509, 511, 513-529, 532- 541, 543-555, 564-566, 568-576, 578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615, 617, 619- 622, 625-646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711-716, 718-732, 736, 737, 739-744, 746, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 7900792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904, te 909-913.

U nekim cjelinama izuma, imunostimulirajuća nukleinska kiselina uključuje CpG dinukleotid a u drugim cjelinama imunostimulirajuća nukleinska kiselina nema CpG dinukleotid. CpG dinukleotid može biti metiliran ili nemetiliran. Nukleinska kiselina koja sadrži barem jedan nemetilirani CpG dinukleotid je molekula nukleinske kiseline koja sadrži nemetiliranu dinukleotidnu sekvneciju citozin-gvanin (.j. "CpG DNA" ili DNA koja sadrži nemetilirani 5' citozin nakon kojeg slijedi 3' gvanozina i vezani su fosfatnom vezom) i aktivira imuni sustav. Nukleinska kiselina koja sadrži barem jedan metilirani CpG dinukleotid je nukleinska kiselina koja sadrži metiliranu dinukleotidnu sekvenciju citozin-gvanin (tj. metilirani 5' citozin nakon kojeg slijedi 3' gvanozina i vezani su fosfatnom vezom).

Primjeri T-obogaćenih nukleinskigh kiselina koji nemaju CpG nukleinske kiseline uključuju, ali nisu na njih ograničeni oni prikazani na Tablici A, kao što je: SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 49 1, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908.1 te 910-913. Primjeri T-obogaćenih nukleinskih kiselina koje uključuju CpG nukleinske kiseline jesu ali bez ograničenja oni prikazane na Tablici A, kao što je SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890, te 891.

Imunostimulirajuća nukleinska kiselina može biti dvolančana ili jednolančana. Općenito, dvolančane molekule su stabilnije in vivo, dok jednolančane molekule imaju povećanu imunu aktivnost. Stoga u jednom aspektu izuma preferirano je da nukleinska kiselina bude jednolančana, a u drugom aspektu preferirano je da nukleinska kiselina bude dvolančana.

Termin T-obogaćena nukleinska kiselina i TG nukleinska kiselina, kako je ovdje korišteno odnosi se na imunostimularajuću T-obogaćenu nukleinsku kiselinu, odnosno na imunostimularajuću TG nukleinska kiselinu, osim kad nije drugačije naznačeno. Sekvencije T-obogaćene nukleinske kiseline iz izuma su one opširno opisane gore kao i nukleinske kiseline prikazane na Tablici A koje imaju barem jedan poli-T motiv i/ili imaju u sastavnu više od 25% T ili preferirano više od 35% nukleotidnih ostataka. C-obogaćene nukleinske kiseline su one koje imaju najmanje jednu a preferirano barem dvije poli-C regije. TG nukleinske kiseline iz izuma su one detaljno opisane gore, kao i specifične nukleinske kiseline prikazane na Tablici A koje imaju TG motiv.

Nukleinske kiseline iz izuma mogu, ali nije neophodno također imati poli-G nukleinske kiseline kao imunostiulatore. Razne referencije, uključujući Pisetsky i Reich, 1993 Mol. Biol. Reports, 18:217-221; Krieger i Herz, 1994, Ann. Rev. Biochem., 63:601-637; Macaya et al., 1993, PNAS, 90:3745-3749; Wyatt et al., 1994, PNAS, 91:1356-1360; Rando i Hogan, 1998, In Applied Antisense Oligonucleotide Technology, ed. Krieg te Stein, str. 335-352; te Kimura et al., 1994, J Biochem. 116, 991-994 također opisuju imuno-stimulirajuća svojstva poli-G nukleinskih kiselina.

Poli-G nukleinska kiselina je preferirano nukleinska kiselina predstavljena sljedećim formulama:

5'X1X2GGGX3X43'.

pri čemu X1, X2, X3 i X4 jesu nukleotidi. U preferiranoj cjelini barem jedan X3 jeste G. U sljedećim cjelinama X3 i X4 jesu G. U sljedećim cjelinama preferirana formula je 5'GGGNGGG3' ili 5'GGGNFFFNFFF3' pri čemu N predstavlja između 0 i 20 nukleotida. U sljedećim cjelinama poli G nukleinskaki kisellina nema nemetilirane CG dinukleotide, kao što su primjerice dolje prikazane nukleinske kiseline kao: SEQ ID NO: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288, 297-299, 3 55, 359, 386, 387, 444, 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936, te 938. U drugim cjelinama poli-G nukleinska kiselina ima barem jedan nemetilirani CG dinukleotid, kao što su primjerice gore prikazane nukleinske kiseline kao: SEQ ID NO: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329, 434,435,475, 519, 521-524, 526, 527, 535, 554, 565, 609, 628, 660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926, 927, 932, te 937.

Termini "nukleinska kiselina" i "oligonukleotid" se upotrebljavaju naizmjenično i označavaju višestruke nukleotide (tj. molekule koje sadrže šećer (npr. ribozu ili deoksiribozu) povezane fosfatnom skupinom i različite organske baze koje su supstituirani pirimidini (npr. citozin (C), timidin (T) ili uracil (U)) ili supstituirane purine (npr. adenin (A) ili gvanin (G)). Kako je ovdje korišteno, termin se odnosi na oligoribonukleotide kao i na oligodeoksiribo-nukleotide. Termini će također uljučivati polinukleotide (t.j. polinukleotid minus fosfat) i bilo koju drugu organsku bazu koja sadrži polimer. Molekule nukleinske kiseline se mogu dobiti iz postojećih izvora nukleinskih kiselina (npr. genomne ili cDNA) ili su preferirano sintetske (npr. pripravljene sintezom nukleinske kiseline). Termin nukleinska kiselina i oligonukleotid također obuhvaća nukleinske kiseline ili oligonukleotide sa supstitucijama ili modifikacijama, kao što su baze i/ili šećeri. Primjerice, oni uključuju nukleinske kiseline koje imaju šećere u skeletu koji su kovalentno povezani na organsku skupinu male molekulske mase koja nije hidroksilna skupina na 3', te skupinu koja nije fosfatna na 5' položaju. Modificirane nukleinske kiseline mogu uključivati 2'-O-alkiranu riboznu skupinu. Uz to, modificirane nukleinske kiseline mogu uključivati šećere kao što je arabinoza umjesto riboze. Stoga nukleinske kiseline mogu biti heterogenog sastava skeleta i stoga imati bilo koju moguću kombinaciju polimernih jedinica povezanih zajedno kao što su peptid-nukleinske kiseline (koji imaju aminokiselinski skelet s nukleinskim bazama). U nekim cjelinama nukleinske kiseline su homogenog sastava skeleta. Nukleinske kiseline također uključuju supstituirane purine i pirimidine kao što su C-5 propinom modificirane baze (Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996). Purini i pirimidini uključuju, ali bez ograničenja, adenin, citozin, gvanin, timidin, 5-metilcitozin, 2-aminopurin, 2-amino-6-klorpurin, 2,6-diaminopurin, hipoksantin i ostali sintetski nukleoblati, suptituirani ili nesupstituirani aromatski dijelovi. Druge takve modifikacije su dobro poznate stručnjacima.

Za upotrebu ovog izuma, nukleinske kiseline iz izuma mogu biti sintetizirane de novo korištenjem bilo kojeg broj postupaka dobro poznatih u struci. Primjerice, b-cianoetil fosforoamiditna metoda (Beaucage, S. L., i Caruthers, M.H., Tet. Let. 22:1859, 198 1); nukleozide H-fosfonatna metoda (Garegg et al., Tet. Let. 27:4051-4054, 1986; Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399- 5407, 1986, ; Garegg et al. Tet. Let. 27:4055-4058, 1986, Gaffney et al., Tet. Let 29:2619-2622, 1988). Te kemijske promjene se mogu izvesti u različitim automatiziranim napravama za sintezu koje postoje na tržištu. Te nukleinske kiseline su navedene kao sintetske. Alternativno, T-obogaćeni i/ili TG T-dinukleotidi se mogu pripraviti u velikim količinama u plazmidima (vidi Sambrook, T., et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989) i odijeliti na manje dijelove ili davati cijele. Nukleinske kiseline se mogu pripraviti iz postojećih sekvnecija nukleinskih kiselina (npr., genomne ili cDNA) upotrebom poznatih tehnika kao što su one koje koriste restrikcijske enzime, egzonukleaze ili enonukleaze. Nukleinske kiseline pripravljene na ovaj način su navedene kao izolirane nukleinske kiseline. Izolirana nukleinska kiselina se općenito odnosi na nukleinsku kiselinu koja je odijeljena od komponenata s kojima je normalno povezana u prirodi. Kao primjer izolirane nukleinske kiseline može biti ona izdvojena iz stanice, iz jezgre, iz mitohodrija ili iz kromatina. Termini Py-obogaćene nukleinske kiseline i TG nukleinske kiseline.

Za in vivo upotrebu, Py-obogaćene i TG nukleinske kiseline mogu biti relativno rezistentne na degradaciju (npr su stabilizirane). "stabilizirana molekula nukleinske kiseline" će značiti molekulu nukleinske kiseline koja je relativno rezistentna na in vivo degradaciju (npr. preko egzo- ili endo-nukleaze). Stabilizacija može biti ovisna o duljini ili sekundarnoj strukturi. Nukleinske kiseline koje su deset do stotinu kb duge su relativno rezistentne na in vivo degradaciju. Za kraće nukleinske kiseline sekundarna struktura se može stabilizirati i povećati efekt. Primjerice, kada 3' kraj nukleinska kiselina ima komplementarnu sekvenciju uzvodno tako da se može saviti i tvoriti neku vrstu petljaste strukture, tada nukleinska kiselina postaje stabilizirana i stoga pokazuje veću aktivnost.

Alternativno, stabilizacija nukleinske kiseline se može kompletirati preko modifikacije fosfatnog skeleta. Pokazano je da modifikacija skeleta nukleinske kiseline dovodi do povećane aktivnosti Py-obogaćene i RG nuikleinskih kiselina kada su dane in vivo. Te stabilizirane strukture su preferirane jer Py-obogaćene ili TG molekule iz izuma imaju barem djelomično modificirani skelet. Py-obogaćeni u TG konstruktu koji imaju fosforotianatne veze imaju maksimlanu aktivnost i štite nukleinsku kiselinu od degradacije intracelularnim egzo- i endo-nukleazama. Ostale modificirane nukleinske kiseline uključuju fosfodiesterom modificiane nukleinske kiseline, kombinacije fosfodiestera i fosforodirioata, p-metoksi i njihove kombinacije. Svaka od tih kombinacija i njihovi određeni efekti na imune stanice su diskutirani detaljnije, a prema CpG nukleinskim kiselinama i PCT publiciranim patentnim aplikacijama PCTIUS95/01570 (WO 96/02555) i PCT/US97/19791 (WO 98/18810) traženih prioriteta U.S. serijskih br. 08/386,063 te 08/960,774, prijavljeni 7. veljače, 1995 odnosno 30. listopada 1997, a cijeli sadržaj je ovdje ugrađen citatom. Vjeruje se da te modificirane nukleinske kiseline mogu pokazivati stimulatorsku aktivnost zbog povećane rezistencije nukleaze, povećanog staničnog prihvata i povećanog vezivanja proteina i/ili promjenjene stanične lokalizacije.

Pripravci iz izuma mogu biti kimerni oligonukleotidi. Kimerni oligonukleotidi su oligonukleotidi koji imaju formulu 5'YN1YN2Y23'. Y1 i Y2 jesu molekule nukleinske kiseline koje imaju između 1 i 10 nukleotida. Svaka Y1 i Y2 uključuje najmanje jednu modificiranu intranukleotidnu vezu. Kako najmanje 2 nukleotida kimernih oligonukleotida imaju skelet dobiven modifikacijom, te nukleinske kiseline su primjeri jednog tipa "stabiliziranih imunostimulirajućih nukleinskih kiselina".

Što se tiče kimernih oligonukleotida, Y1 i Y2 se smatraju neovisnim jedan od drugoga. To znači da svaki Y1 i Y2 može ali ne mora imati različite sekvencije i različit skeletne veze u istoj molekuli. Sekvencija varira, ali u nekim slučajevima Y1 i Y2 imaju poli-G sekvenciju. Poli-G sekvencija se odnosi na najmanje 3G u nizu. U drugim cjelinama poli-G sekvencija se odnosi na najmanje 4, 5, 6, 7, ili 8 G u nizu. U drugim cjelinama, Y1 i Y2 mogu biti TCGTCG, TCGTCGT, ili TCGTCGTT (SEQ ID NO: 1145). Y1 i Y2 mogu također imati poli-C, poli-T ili poli-A sekvenciju. U nekim cjelinama Y1 i/ili Y2 imaju između 3 i 8 nukleotida.

N1 i N2 su molekule nukleinskih kiselina koje imaju između 0 i 5 nukleotida dok N1ZN2 ima najmanje ukupno 6 nukleotida. Nukleotidi N1ZN2 imaju fosfodiesterski skelet i ne uključuju nukleinske kiseline s modificiranim skeletom.

Z je motiv imunostimulirajuće nukleinske kiseline ali ne uključuje CG. Primjerice, Z može biti nukleinska kiselina T-obogaćene sekvencije, npr. uključujući TTTT motiv ili sekvenciju u kojoj je barem 50% baza sekvencije jesu T ili Z može biti TG sekvnecija.

Srednji nukleotidi (N1ZN2) formule Y1N1ZN2Y2 imaju fosfodiesterske internukleotidne veze, a Y1 i Y2 imaju barem jedan ali mogu imati više od jednog ili čak mogu imati sve modificirane internukletidne veze. U preferiranim cjelinama Y1 i/ili Y2 imaju barem dvije ili između dvije i pet modificiranih internukleotidnih veza ili Y1 ima dvije modificirane internukleotidne veze, a Y2 ima pet modificiranih internukleotidnih veza ili Y1 ima pet modificiranih internukleotidnih veza a Y2 ima dvije modificirane internukleotidne veze. Modificirana internukleotidna veza u nekim cjelinama je fosforotioatna modificirana veza, fosforoditioatna modificirana veza ili p-etoksi modificirana veza.

Modificirani skeleti kao što su fosforotioati mogu biti sintetizirani korištenjem automatiziranih tehnika korištenjem fosforoamidata ili H-fosfonatne kemije. Arilni i alkilni fosfonati se mogu pripraviti, npr. kao što je opisano u U. S. Patentu br. 4,469,863; alkilfosfotioesteri (u kojima je nabijeni kisik alkiliran kao što je opisano u U. S. Patentu br. 5,023,243 i Europskom Patentu Br 092,574) se može pripraviti automatiziranom sintezom na čvrstoj fazi upotrebom komercijlano pristupačnih reagensa. Metode za pripravu drugih modifikacija skeleta DNA i supstitucija su opisani ranije (Uhlam, E. i Peyman, A. Chem. Rev. 90:544,1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165,1990).

Ostale stabilizirane nukleinske kiseline uključuju neionske analoge DNA kao što su alkilni i arilni fosfati (u kojima je nabijeni fosfonatni kisik zamijenjen alkilnom ili arilnom skupinom), fosfodiester i alkilfosfotrietsti u kojima je nabijeni kisik alkiliran. Za nukleinske kiseline koje sadrže diol, kao što je tetraetilenglikol ili heksaetilenglikol, na jednom ili oba kraja je pokazano da su značajno rezistentni na degradaciju nukleoazom.

U slučaju kada je Py-obogaćena ili Tg nukleinska kiselina dana skupa s antigenom koji je kodiran u vektoru nukleinske kiseline, preferirano je da skelet Py-obogaćene ili TG nukleinske kiseline bude kimerna kombinacije fosfodiestera i fosforotioata (ili druge fosfatne modifikacije). Stanica može imati poteškoća pri prihvatu vektora plazmida u prisutnosti kompletno fosfotionatno povezanom nukleinskom kiselinom. Stoga kada su vektor i nukleinska kiselina isporučeni u subjektu, preferirano je da nukleinska kiselina ima kimerni sklet ili ima fosforotioatni skelet, ali da je plazmid povezan s vehikulom koji isporučuje izravno u stanicu, pa tako izbjegavajući potrebu za prihvatom u stanicu. Takvi vehikuli poznati u struci uključuju, primjerice, liposome i genske pištolj.

Ovdje opisane nukleinske kiseline kao i različite kontrolne nukleinske kiseline prikazane su dolje u Tablici A

Tablica A

Dok su CpG efekti u miševima dobro karakterizirani, informacije koje se tiču humanog sustava su ograničene. CpG fosforotioatni oligonukleotidi s jakom stimulatornom aktivnosti u mišjem sustavu pokazuju nižu aktivnost kod humanih i drugih imunih stanica koje nisu od glodavaca. U primjerima je opisan razvitak potetnog humanog CpG motiva i karakterizacija njihovih efekata i mehanzima djelovanja na humane primarne B-stanice. DNA koja sadrži CpG motiv jako stimulira proliferaciju primarnih humanih B-stanica, produciraju IL-6 i ekspresiju povećane razine CD96, CD40, CD54 i MHCII. To je povećalo aktivnost vezivanja DNA transkripcijskih faktora NF�B i AP-1, kao i fosforilaciju i stresom aktivirane protein kinaze JNK i p38, te transkripcijski faktror ATF-2. Signalizacijski put B-stanice aktiviran CpG DNA je različit od onih aktiviranih receptorom B-stanice, a koji aktivirn ERK i drugim izoform JNK, ali ne aktivira p38 i ATF-2. Općenito su podaci o CpG s DNA inicirane signalne transdukcije u skladu s onim dobivenim od miševa (Hacker H. et al. 1998, Embo J. 17:6230, Yi A. K. i Krieg A. M. 1998 J. immunol 161:4493).

Preferiani motiv koji nije od glodavca je 5'TCGTCGTT3'. Bazna izmjena u najpotetnijim 8-merom CpG motivu (5'TCGTCGTT3') smanjuje aktivnost oligonukleotida. Timidini na položajima 5' i 3' tog motiva su važniji nego timidini na srednjem položaju. Adenin ili gvanozim na srednjem položaju dovodi do smanjivanja aktivnosti.

Valja napomenuti da naša istraživanja pokazuju da je humani CpG motiv unutar fosfodiesterskog oligonukleotida (2080) dovoljan za produkciju maksimalnog efekta i da daljni CpG motivi (2059) ne povećavaju aktivnost dalje. Oligonukleotid s 8-mernim motivom 5'TCGTCGTT3' (2080) koji sadrži dva CpG dinukleotida pokazuje najveću aktivnost u istraživanjima. Zamjenom baza koje okružuju dva CpG dinukleotida (5' položaj, srednji položaj, 3' položaj) smanjuje se aktivnost te sekvnecije. Oba CpG dinukleotida unutar 8-mernog CpG motiva zahtjevaju optimalnu aktivnost (2108, 2106). Metiliranjem citidina CpG dinukleotida (2095) gubi se aktivnost 2080, dok se metiliranjem neovisnog citidina (2094) ne gubi. Adicija dvaju CpG motiva u sekvenciju 2080 dajući 2059, ne povećava dalju aktivnost fosfodiesterskog oligonukleotida. Sekvencija 2080 s fosforotioatnim skeletom (2116) pokazuje manju aktivnost, ukazujući da su dodatni CpG motivi preferirani za jaki fosfotioatni oligonukleotid.

Nađeno je prema izumu da imunostimulirajuće nukleinske kiseline imaju dramatični imunostimulirajući efekt na humane stanice kao što su NK stanice, B-stanice i DC in vitro. Pokazano je da in vitro testovi ovdje korišteni predviđaju in vivo učinkovitost kao adjuvansa vakcini u verterbratama koji nisu glodavci (Primjer 12), ukazujući da su imunostimulirajuće nukleinske kiseline učinkovita terapijska sredstva za humanu vakcinaciju, imunoterapiju karcinoma, imunoterapiju astme, opće povećanje imune funkcije, povećanje hematopoietičnosti nakon radijacije ili kemoterapije i ostale imunomodulirajuće primjene.

Stoga su imunostimulirajuće nukleinske kiseline korisne u nekim aspektima izuma kao profilaktičke vakcine za tretman subjekta koji ima rizik od razvijanja infekcije s infektivnim orgnizmomm ili karcinom u kojem je na karcinom specifični antigen identificiran, ili alergije ili astme pri čemu je poznata predispozicija na alergen ili na astmu. Imunostimulrajuće nukleinske kiseline mogu također biti dane bez antigena ili alergena za kratkotrajnu zaštita od infekcije, alergije ili karcinoma. U tom slučaju ponovljene doze će dozvoliti zaštitu na dulji period. Subjekt koji je rizičan, a kako je ovjde korišteno je subjekt koji ima rizik od izlaganja infekciji uzrokovanoj patogenima ili karcinom ili alergen ili ima rizik od razvijanja karcinoma. Primjerice, subjekt koji ima rizik može biti subjekt koji planira putovati u dijelove gdje postoje određeni tipovi infekcijskih sredstava ili može biti subjekt koji je tijekom života ili medicinskog postupka izložen tjelesnim tekućinama koji sadrže infekcijske organizme ili su direktno izloženi organzimima ili čak bilo koji subjekt koji živi u dijelu u kojem su identificirani infekcijski organizmi ili alergeni. Subjekt koji je rizičan za razvitak infekcije također obuhvaća opću populaciju kojoj medicinske ustanove savjetuju vakcinaciju s antigenom određenog infekcijskog organizma. Ako je antigen alergen i subjekt razvija alregijske odgovore na taj odgovarajući antigen i subjekt razvija alergijski odgovor na taj određeni antigen, te subojek može biti izložen antgenu, t.j. tijekom sezone polena, tada je taj subjekt rizičan na izlaganje antigenu. Subjekt koji je rizičan da razvije alergiju na astnu uključuje one subjekte koji su identificirani kao oni koji imaju alergiju ili astmu, ali nemaju aktivnu bolest tijekom tretmana imunostimulirajućom nukleinskom kiselinom kao i subjekti koji se smatraju rizični na razvitak tih bolesti zbog genetičkog i okolišnog faktora.

Subjekt koji je rizičan za razvijanje karcinoma je onaj koji ima veliku vjerojatnost z razvitak karcinoma. Ti subjekti uključuju primjerica subjekte koji imaju genetsku abnormalnost, za što je pokazano da korelira s većom vjerojatnosti razvitka karcnoma i subjekti koji su izloženi sredstvima koji uzrokuju karcinom kao što je duhan, azbest ili drugi toksini ili subjek koji je prethodno bio tretian protiv karcinoma pa je došlo do reminisije. Kada je subjekt rizičan na razvita karcinoma, tretiran je antigenom specifičnim na tip karcinoma na koji je subjekt rizičan i imunostimulirajućom nukleinskom kiselinom, subjekt može biti sposoban ubiti stanice karcinoma kako se razvijaju. Ako se tumor počinje stvarati u subjeku, on će razviti specifični imuni odgovor na antigen tumora.

Uz to što se imunostimulirajuće nukleinske kiseline koriste za profilaktički tretman, izum također obuhvaća upotrebu imunostimultirajućih nukleinskih kiselina za tretman subjekta koji ima infekciju, alergiju, astmu ili karcinom.

Subjekt koji ima infekciju je subjekt koji je izložen infekcijskim patogenima i ima akutnu ili kroničnu razinu patogena u organizmu koja se može detektirati. Imunostimultirajuće nukleinske kiseline se mogu koristiti s antigenom da podignu na antigen specifičan sustav ili mukozni imuni odgovor koji je sposoban smanjiti razinu ili iskorijeiti infekcijski patogen. Infekcijska bolest, kako je ovdje korišteno, je bolest koja potječe od prisutnosti stranog mikroorganzima u tijelu. Vrlo je važno da se razvije učinkovita vakcinska strategija i tretmani da bi se zaštitile površine sluznice tijela, a koji su priparma mjesta ulaska patogena.

Subjekt koji ima alergiju je subjekt koji ima ili je rizičan da se razvije alergijska reakcija kao odgvor na alergen. Alergija se odnosi na stečenu hipersenzitivnost na tvar (alergen). Alergični uvjeti uključuju ali nisu na njih ograničeni, ekcem, alergijski rinitis, peludnu groznicu, konjunktivitis, bronhialnu astmu, utrikariju ili alergije na hranu i ostale atopične uvjete.

Sada se alergijske bolesti općenito tretiaju injekcijom malih doza antigena nakon postupnog porasta doze antgena. Vjeruje se da taj postupak inducira toleranciju na alergen da bi se spriječile daljnje alergijske reakcije. Tim metodama, međutim, može proči nekoliko godina prije nego što počnu djelovati, te su metode povezane s rizičnim nuzefektima kao što je anafilatički šok. Metodama iz izuma su izbjegnuti ti problemi.

Alergije su općenito uzrokovane generiranjem IgE antitijela protiv neštetnih alergena. Citokini koji su induicirani sistemskim ili mukoznim davanjem imunostimulirajućih nukleinskih kiselina su uglavnom iz klase koja se zove Th1 (primjer su IL-12 i IFN-γ) i ti induciraju humoralni i stanični imuni odgovore. Tipovi antitijela povezanih s Th1 odgovorom su općenito više zaštitni jer imaju veliku neutralizacijsku i opsonizaciju sposobnost. Drugi glavni tip imunog odgvora koji je povezan s produkcijom IL-4, IL-5 i IL-10 citokinima je zaustavljen Th2 imuni odgovor. Th2 odgovori obuhvaćaju uglavnom antitijela i ona iamju manji zaštitni efekt protiv infekcije i nekih Th2 izotipova (npr. IgE) povezani su s alergijom. Općenito, izgleda da su alergijske bolesti posredovane Th2 tipom imunog odgvora, dok su Th1 odgovori povezani s autoimunom bolesti. Na osnovu sposobnosti imunostimulirajućih nukleinskih kiselina da pomaknu imuni odgovor u osobi s Th2 (koji je povezan s produkcijom IgE antitijela i alergije) na Th1 ogovor (koji je zaštita protiv alergijskih reakcija), može se davati učinkovita doza za indukciju imunog odgovora imunostimulirajućih nukleinskih kiselina subjetu, a za tretman ili prevenciju alergije.

Stoga imunostimulirajuće nukleinske kiseline imaju značajnu terapijsku primjenu u tretmanu alergijskih ili nealergijskih uvjeta kao što je astma. Razina Th2 citokina, posebice IL-4 i IL-5 je podignuta u dišnim putevima subjelata s astmom. Ti citokini pokeću važne aspekte asmatičnih upalnih odgovora, uključujući IgE izotopnu izmjenu, eozinofilnu kemotakciju i aktivaciju rasta mast stamica. Th1 citokini, posebno IFN-γ i IL-12 mogu spriječiti nastajanje Th2 klonova i produkciju Th2 citokina. Astma se odnosi na poremećaj respiratornog sustava krakteriziran upalom, sužavanjem dišnih puteva i povećanom reaktivnosti dišnog puta s inhaliranim sredstvima. Astma je učestalo, mada ne ekskluzivno, povezana a atopičnim ili alergijskim simptomima.

Subjekt koji ima karcinom je subjekt koji ima stanice karcinoma koje se mogu detektirati. Karcinom može biti maligni ili nemaligni. Karcinmomi ili tumori uključuju, ali nisu na njih ograničeni, karcinom žučnog kanala, karcinom mozga, karcinom dojke, karcinom cerviksa, koriokarcinom, karcinom debelog crijeva, endomeritalni karcinom, karcinom jednjaka, karcinom želuca, intraepitelne neoplazme, limfome, karcinom jetre, karcinom pluća (malin i ne-malih stanica), melanom, neuroblastome, karcinom usta, karcinom jajnikam, karcinom pankreasa, karcinom prostate, karcinom rektuma, sarkome, karcinom kože, karcinom testisa, karcinom tiroidne žljezde, karcinom bubrega kao i drugi karcinomi i sarkomi. U jednoj cjelini, karcinom je leukemija vlaknastih stanica, kronična mielogena leukemija, leukemija kutalnih T-stanica, multipla mieloma, folikularni limfom, maligni melanom, karcinom skvamoznih stanica, karcinom bubrežnih stanica, karcinom prostate, karcinom stanica mjehura ili karcinom debelog crijeva.

Stoga izum može također biti korišten za tretman karcinoma i tumora kod subjelata koji nisu ljudi. Karcinom je jedna od vodećih uzroka smri u domaćim životinjama (t.j. mačke i psi). Kacinom obično pogađa starije životinje koji u slučaju kućnih ljubimaca su integrirani u obitelj. Vjerojatno je da će 45% pasa starijih od 10 godina dobiti bolest. Najuobičajeniji tretman uključuje operaciju, kemoterapiju i radijacijsku terapiju. Ostali tretmani koji se koriste s nekim uspjehom su laserska terapija, krioterapija, hipertermija i imunoterapija. Izbor tretmana ovisi o tipu karcinoma i stupnju zahvaćenosti. Dok je maligni rast zadržan na male dijelove tijela, teško je ukloniti samo maligne stanice bez djelovanja na normalne stanice.

Maligni poremećaji dijagnosticirani kod pasa i mačaka uključuju, ali bez ograničnejna, limfosarcom, osteosarkom, tumore miječne žljezde, mastocitom, tumor mozga, melanom, adenoskvamozni, karcinoidni tumor pluća, tumor bronhialne žljezde, bronhiolarni adenokarcinom, fibrom, miksohondrom, plućni sarkom, neurosarckom, osteom, papilom, retinoblastom, Ewingov sarckom, Wilmov tumor, Burkittov limphom, microgliom, neuroblastom osteoklastom, oralna neoplazija, fibrosarkom, osteosarkom, te rabdomosarkom. Ostale neoplazije kod pasa uključuju karcinom genitalnih skvamoznih stanica, prijenosti veneralni turnor, tumor testisa, seminom, tumor Sertoli sstanica, hemangiopericitom, histiocitomia, klorom (granulocitični sarkom), komealni papilom, karcinom komealnih skvamoznih stanica, hemangiosarkom, tumor pleuralnih mezotelnih bazalinih stanica, timom, tumor želuca, karcinom adrenalne žljezde, oralna papilomatoza, hemangioendoteliom te cistadenom. Dodatne maligne bolesti dijagnosticirane u mački uključuju: folicularni limfom, probavni limfosarkom, fibrosarkom i karcinom plućnig skvamoznih stanica. Kod kućnog tvora koji je još popočarniji kućni ljubimac razvija se inzulinom, limfom, sarkom, neurom, tumor stanica pankreasa, želučani MALT limfom i želiučani adenokarcinom.

Neoplazija koja pogađa životinje u poljprivredi uključuje leukemiju, hemangiopericitom i goveđu okularnu neoplasiju (kod stoke); preputialni fibrosarkom, karcinom skvamoznih stanica ulcera, preputialni karcinom, neoplaziju vezivnog tkiva i mastocitom (kod konja); hepatocellularni karcinom (kod svinja); limfom i plućnu adenomatzu (kod ovaca; plućni sarkom, limfom, Rousov sarkom, retikulendottelozu, fiibrosarkom, nefroblastom, limfom B-stanica i limfoidnu leukozu (kod ptica); retinoblastom, hepatični neoplaziju, limphosarkom (limfoblastični limfom, plazmacitoidnu leukemiju i mjehura za plivanje (kod riba), caseous lumfadenitis (CLA): kronične, infektivne, zarazne bolesti ovaca i koza uzrokovena bakteirjsom Corynebacterium pseudotuberculosis, i zarazni tumor pluća kod ovaca uzrokovan jaagsiekte.

Subjekt je izložen antigenu. Kako je ovdje korišteno, termin izložen odnosi se na aktivni korak kontakta subjekta s antigenom ili pasivno izlaganje subjekta antigenu in vivo. Metode aktivnog izlaganja subjekta antgenu dobro su poznate u struci. Općenito, antigen je dan direktno subjektu na bilo koji način, kao što je intravenozno, intramuskularno, oralno, transdermalno, mukosalno, intranazalno, intratrahealno ili subkutalno. Antigen može biti dan sistemski ili lokalno. Metode davanja antigena i imunostimulirajuće nukleinske kiseline su niže deljano opisane. Subjekt je pasivno izložen antigenu kad antigen postaje raspoloživ za izlaganje imunim stanicama u tijelu. Subjekt može biti pasivno izložen antigenu, primjerice ulaskom stanog patogena u tijelo ili razvitokom tumorne stanice, a eksprimiranjem stranog antigena na njegovoj površini.

Metode u kojima je subjekt pasivno izložen antigenu mogu biti vrlo ovisne o vremenu davanja imunostimulirajućih nukleinskih kiselina. Primjerice, kod subjekta koji je rizičan na razvijanje karcinoma ili infektivne bolesti ili alergije ili astmatskog odgovora, može mu se dati imunostimulirajuća nukleinska kiselina regularno kada je rizik najveći, t.j. tijekom sezone alergije ili nakon izlaganja sredstvu koje uzrokuje karcinom. Uz to, imunostimulirajuća nukleinska kiselina se može davati putnicima prije puta u strane zemlje kada postoji rizik od izlaganja infekcijskim sredstvima. Slično, imunostimulirajuća nukleinska kiselina se može dati vojnicima ili civilima koji su rizični na izlaganje biološkom oružju, a da se izazove sistemski ili muklozni imuni odgovor na antigen, a ako je subjet izložen.

Antigen, kako je ovdje korišten, je molekula koja je sposobna izazvati imuni odgovor. Antigeni uključuju, ali nisu na njih ograničeni, stanice, ekstrakte stanica, proteine, polipeptide, peptide, polisaharide, polisaharidne konjugate, peptidne i nepetidne imitacije polisaharida ili drugih molekula, male molekule, lipide, glikolipide, ugljikohidrate, viruse i virusne ekstrakte i višestanične organizme kao što su paraziti i alergeni. Termin antigen široko uključuje bilo koji tip molekule koja je prepoznata kao strana od imunog sustava domaćina. Antigeni uključuju, ali nisu oganičeni, antigene karcinoma, mikrobiloških sredstava i alergena.

Antigen karcinoma, kako je ovdje korišten, kao što je peptid ili protein, povezan je sa staničnim površinama tumora ili karcinoma i sposoban je izazvati imuni odgovor kada je eksprimiran na površini stanice koja ispoljava sadržaj MHC molekule. Antigeni karcinoma se mogu pripraviti iz stanica karcinoma pripravom sirovog ekstrakta stanica karcinoma, primjerice kao što je opisano u Cohen et al., 1994 Cancer Research, 54:1055 djelomičnim pročišćavanjem antigena, rekombinatnom tehnologijom ili de novo sintezom poznatih antigena. Antigeni karcinoma uključuju, ali nisu na njih ograničeni, antigene koji su rekombinantno eksprimirani, njihov imunogenski dio ili od cijele stanice karcinoma. Takvi antigeni mogu biti izolirani ili pripravljeni rekombinantno ili ostalim načinima poznatim u struci.

Mikrobiološki antigen kako je ovdje korišteno, je antigen mikroorganizma i uključuje, ali nije na njih ograničen, virus, bakterije, parazite i gljivice. Takvi antigeni uključuju cijeli mikroorganzima kao i njihove prirodno izloirane fragmente ili derivate, a također i sintetske spojeve koji su identični ili slični prirodnim antigenima mikroorganizma i induciraju imuni odgovor specifičan za taj mikroorganzam. Takvi antigeni se koriste rutinski u struci i dobro su poznati stučnjacima u području.

Primjeri virusa koji su nađeni u ljudima uključuju ali nisu na njih ograničeni: Retroviridae (npr. humane imunodeficijentne viruse kao HIV- I (također naveden kao HTLV-III, LAV ili HTLV-III/LAV, ili MV-III; te ostale izolirane, kao što je HIV-LP; Picornaviridae (npr. polio virusi, virus hepatitisa A; enterovirusi, humani Coxsackie virusi, rinovirusi, ehovirusi); Calciviridae (npr. vrste koje uzrokuju gastroenteritis); Togaviridae (npr. virusi encefalitisa, virusi rubele); Flaviridae (npr. virusi encefalitisa, virusi žute groznice); Coronoviridae (npr. coronavirusi); Rhabdoviradae (npr. virusi vezikularnog stomatitisa); Coronaviridae (npr. koronavirusi); Rhabdoviridae (npr. virusi vezikularnog stomatitisa, virusi bjesnoće); Filoviridae (npr. virusi ebole); Paramyxoviridae (npr. virusi parainfluence, virus mumsa, virus ospica, respiratorni sincitialni virus); Orthomyxoviridae (npr. influenza virusi); Bungaviridae (npr. Hantaan virusi, bunga virusi, phleboviruses te Nairo virusi); Arena viridae (hemoragični virusi groznice); Reoviridae (npr. reovirusi, orbiviursi i rotavirusi); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus hepatitisa B); Parvovirida (parvovirusi); Papovaviridae (papiloma virusi, polioma virusi); Adenoviridae (većina adenovirusa); Herpesviridae (herpes simpleksx virus (HSV) I i 2, varičela zoster virus, citomegalovirus (CMV), virus herpesa; Poxviridae (virusi variole, virusi vakcirna, pox virusi); te Iridoviridae (npr. virus groznice afričke svinje); te neklasificirani virusi (npr. the etiološka sredstva Spongiform encephalopathies, the sredstvo delta hepatitisa (mišljeno da bude defektivni satelit virusa hepatitisa B), sredstva ne-A, ne-B hepatitisa (klasa I = interno prenosivi; klasa 2 = parenteralno prenosivi (t.j. Hepatitis ); Norwalk i odgovarajući virusi, te astrovirusi).

Gram negativnee o grarn pozitivne bakterije služe kao antigeni u vertebrata. Takve gram positivne bakterije uključuju, ali nisu na njih ograničene, vrste Pasteurella, vrste Staphylococci, te vrsteStreptococcus. Gram negativne bakterije uključuju, ali nisu na njih ograničene, Escherichia coli, vrste Pseudomonas, te vrste Salmonella. Specifičlni primjeri indekcijskih bakterija uključuju, ali nisu na njih ograničene Heliobakter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionellapneumophilia, Mycobacteria sps (npr. M. tuberculosis, M avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcuspyogenes (grupa A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (grupa B Streptococcus), Streptococcus (viridans grupa), Streptococcusf aecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobne sps.), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, te A clinomyces israelli.

Primjeri gljivica uključuju Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.

Ostali infekcijski organzimi (t.j. protitis) uključuju Plasmodium spp. kao što su Plasmodiumfalciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, te Plasmodium vivax i Toxoplasma gondii. Paraziti rođeni u krvi i tkivu uključuju Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense te Trypanosoma rhodesiense (afrička bolest spavanja), Trypanosoma cruzi (Chagasova bolest), te Toxoplasma gondii.

Ostali medicinski relevantni mikroorganizmi su opisani naširoko u literaturi, npr. vidi C. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Velika Britanija 1983, i cijeli sadržaj koji je ovdje ugrađen citatom.

Mada se mnogi gore opisani miokrobiološki antigeni odnose na humane poremećaje, izum je također koristan za tretman drugih vertebrate koji nisu ljudi. Vertebrate koje nisu ljudi su također sposobni razviti infekcije koje mogu biti spriječene ili tretirane ovdje prikazanom imunostimulirajućim nukleinskim kiselinama. Primjerice, uz tretman infekcijskih humanih bolest, metode iz izuma su korisne za tretman infekcija kod životinja.

Kako je ovdje korišteno, termin tretirati, tretiran ili tretirajući kada se koristi za infektivnu bolest odnosi se na pofilaktički tretman koji povećava reziztenciju subjekta (subjek je rizičan na infekciju) na infekciju s patogenom, ili drugim riječima smanjuje se vjerojatnost da subjekt postane inficiran patogenom kao i tretman nakon što je subjekt (inficirani subjekt) postao inficiran, a da se bori protiv infekcije, npr. za smanjivanje ili eliminaciju da infekcija postane lošija.

Mnoge vakcine za tretman vertebata koji nisu ljudi prikazani su u Bennett, K. Compendium of Veterinary Products, 3. izd. North American Compendiums, Inc., 1995. Kako što je gore diskutirano, antigeni uključuju infekcije mikroorganizme kao što su virusi, paraziti, bakterije i gljivice, te njihove fragmente izvedeni iz prirodinh izvora ili sintetski. Infekcijski virusi za humane i ne-humane verterbate uključuju retroviruse, RNA viruse i DNA viruse. Ta skupina retrovirusa uključuje jednostvne retroviruse ili kompeksne retroviruse. Jednostavni retrovirusi uključuju podgrupe retrovirusa tipa B, retroviruse tipa C, retroviruse tipa D. Primjer retrovirusa tipa B je mišji tumor mliječne željeze (MMTV). Retrovirusi C tipa uključuju podgrupe grupa A C tipa (uključujući Rous sarkoma virus (RSV), ptičji virus leukemije (ALV), te ptičji virus mieloblastoze (AMV)) te C tip grupe B (uključujući virus mačje leukemije (FeLV), virus leukemije gibona (GALV), virus nekroze slezene (SNV), virus retikuloendotelioze (RV) te virus majmunskog sarkoma (SSV)). Retrovirusi D-tipa uključuju Mason-Pfizer virus majmuna (MPMV) i majmunski retrovirus tipa I (SRV- 1). The kompleksni retrovirusi uključuju podgrupu lentivirusa, viruse karcnoma T-stanica i pjenaste viruse. Lentivirusi uključuju HIV-1, ali također uključuju HIV-2, SIV, Visna virus, mačji virus imunodeficijencije (FIV), te konjsku infekciju anemia virusom (EIAV). Virus leukemije T-stanica uključuje HTLV- 1, HTLV-II, virus leukemijeT-stanica majmuna (STLV), te virus leukemije goveda (BLV). Konjski pjenasti virusi uključuju humani pjenasti virus (HFV), majmunski pjenasti virus (SFV) i goveđi pjenasti virus (BFV).

Primjeri ostalih RNA virusa koji su antigeni u vertebratama uključuju, ali nisu na njih ograničeni, članove obitelni Reoviridae, uključujući rod Orthoreovirus (višestruki serotip retrovirusa sisavaca i ptica), rod Orbivirus (Bluetongue virus, Eugenangee virus, Kemerovo virus, virus afričke bolesti konja, te virus jake Colorado groznice), the rod Rotavirus (humani rotavirus, virus diareje teleta iz Nebraske, majmunski rotavirus, goveđi rotavirus, ptičji rotavirus); obitelje Picomaviridae, uključujući rod Enterovirus (poliovirus, Coxsackie virus A i B, enterični citoplastični human (ECHO) virusi, virus hepatitisa A, majmunski enterovirusi, virusi encephalomielitis (ME) glodavaca, Poliovirus muris, goveđi enterovirusi, svinjski enterovirusi, rod Cardiovirus (virus encefalomiokarditisa (EMC), mengovirus), rod Rhinovirusa (Humani rinovirusi uključujući majmanje 113 podtipova; ostali rinovirusi), rod Apthovirus (slinavka i šap (FMDV); obitelj Calciviridae, uključujući Vesicular exanthema svinjskig virusa, virus San Miguel morskog lava, mačji pikomavirus i Norwalk virus; the obitelj Togaviridae, uključujući the rod Alphavirus (Uskršnji virus encefalitisa, virus Semliki šume, Sindbis virus, Chikungunya virus, O'Nyong- Nyong virus, virus Ross rijeke, Venecuelanski virus konjskih encefalitisa, zapadni virus konjskih encefalitisa), the rod Flavirius (virus žute groznie rođen u komarcu, denga virus, japanski virus encefalitisa, St. Louis virus encefalitisa, Murray Valley virus encefalitisa, virusWest Nile, Kunjin virus, srednjoeuropski virus zadebljanja kosti, virus zadebljanja kosti iz dalekog istoka, Kyasanur šumski virus, Louping III virus, Powassan virus, virus hemoragične groznice iz Omska), rod Rubivirus (Rubella virus), rod Pestivirus (virusne bolesti sluznice, Hog virus kolere, virus Borderove bolesti); obitelj Bunyaviridae, uključujući rod Bunyvirus (Bunyamwera i povezani virusi, grupa virusa kalifornijskog encefalitisa), rod Phlebovirus (virus siciliske pješčane groznice, virus groznice iz Rift Valley), rod Nairovirus (Crimean-Congo virus hemoragične groznice, virus bolesti Nairobi ovaca) te rod Uukuvirus (Uukuniemi i slični virusi); obitelj Orthomyxoviridae, uključujući rod virusa Influenza (virus influence tipe A, mnogi humani podtipovi; svinjskivirus influence, te ptički i konjski virusi influence; influenca tipa B (mnogi humani podtipovi), te influenca tipa C (moguće drugi rod); obitelj paramyxoviridae, uključujući rod Paramyxovirus (virus parainfluence ttipa 1, Sendai virus, Hemadsorption virus, Parainfluenza virusi tipova 2 do 5, virus Newcastle bolesti, virus mumpsa), rod Morbillivirus (virus ospica, virus subacutne sklerotičnog panencefalitisa, virus zlovolje, Rinderpest virus), rod Pneumovirus (virus respiratorne sincicijski (RSV), virus goveđi respiratorni sincicijski i virus upale pluća); obitelj Rhabdoviridae, uključujući rod Vesiculovirus (VSV), Chandipura vims, Flanders-Hart Park virus), rod Lyssavirus (Rabies virus), riblji Rhabdovirusi, te dva vjerojatna Rhabdovirusa (virus Marburga i virus Ebole); obitelj Arenaviridae, uključujući virus limfocitnog koriomenegitisa (LCM), virus Tacaribe kompleksa, te Lassa virus; the obitelj Coronoaviridae, uključujući infekcije Bronchitis Virusom (IBV), virusom Hepatitisa, humani entero i corona virus, te mačji infektivni peritonitis (mačji coronavirus).

Ilustrativnoi su DNA virusi koji su antigeni u kralježnjacima uključujći, bez ograničnja, obitelj Poxviridae, uključujući rod Orthopoxvirus (Variola major, Variola minor, majmunski pox Vaceinia, Cowpox, Buffalopox, Rabbitpox, Ectromelia), rod Leporipoxvirus (Myxoma, Fibroma), rod Avipoxvirus (Fowlpox, ptičji pox virus), rod Capripoxvirus (ovčiji pox, kozji pox), rod Suipoxvirus (svinjski pox), rod Parapoxvirus (zarazni virus postular nog dermatitisa, pseudogoveđi pox, virus goveđeg papularnog stomatitisa); obitelj Iridoviridae (virus groznice afričke svinje, žablji viruses 2 i 3, virus ribljeg limfocistisa); obitelj Herpesviridae, uključujući α-Herpesviruse (Herpes Simplex tipovi i 2, Varicella-Zoster, konjski virus abortusa, konjski virus herpesa 2 i 3, pseudorabies virus, virus infektiivnog ketokonjunktivisa, virus infekcije goveđeg rhinotracheitisa, virus infekcije mačjeg rhinotracheitisa, virus infectivnog laryngotracheitisa) the β-herpesvirusi (humani cytomegalovirus i svinjski i majmunski cytomegalovirusi); γ-herpesvirusi (Epstein-Barr virus (EBV), virus Marekove bolesti, Herpes saimiri, Herpesvirus ateles, Herpesvirus silvilagus, herpes virus zamorca, virus Lucke tumora); obitelj Adenoviridae, uključujući rod Mastadenovirusa (humane podgrupe A,B,C,D,E i negrupirani; majmunski adenovirusi (najmanje 23 serotipova), infektivni pseći hepatitis, te adenoviruses of koza, svinja, ovaca, žćaba i mnogih drugih vrsta, rod Aviadenovirus (Avian adenovirusi); te adenovirusi koji se ne mogu kultivirati; obitelj Papoviridae uključujući rod Papillomavirusa (humani papilloma virusi, goveži papilloma virusi, Shope zečji papilloma virus, te različiti patogeni papilloma virusi drugih vrsta), rod Polyomavirus (polyomavirus, majmunski vacuolirajuće sredstvo (SV-40), zečje vacuolirajuće sredstvo (RKV), K virus, BK virus, JC virus, i polioma viruses ostalih primata kao što je Lymphotrophic papilloma virus); obitelj Parvoviridae uključujući rod Adeno-povezanih virusa, rod Parvovirus (mačji panleukopenia virus, bovine parvovirus, pseći parvovirus, virus bolesti Aleutian kezna, itd). Konačno, DNA viruses mogu ukljućivati viruse koji ne spadaju u gornje obitelji kao što je virusi Kuru i Creutzfeldt-Jacobova bolest disease i kronične infekcije neuropatičnih sredstava (CHINA virus).

Svaka od prethodnih listi je ilustrativna i nije namjera da bude ograničavajuća.

Uz upotrebu imunostimulrajućih nukleinskih kiselina za indukciju na antigen specifičnog imunog odgovora kod ljudi, metode iz preferiranih cjelina su posebno dobro postavljene za tretman ptica kao što su pilići, purice, patke, guske, prepelica i fazana. Ptice su primarni ciljevi za mnoge tipove infekcija.

Izlegnute ptice su izložene patogenim mikroorganizmima odmah nakon rođenja. Mada su te ptice početno zaštićene protiv patogena antigenima nasljeđenim od majke, zaštita je samo privremena i vlastiti imuni odgovor ptice mora započeti da zaštiti ptice protiv patogena. Često je poželjno sriječiti infekciju mladih ptica koje su najprijemčivije. Također je poželjno da se spriječi infekcija u starijim pticama, posebice kada su ptice čuvane u zatvorenim kvartovima, što vodi brzom širenju bolesti. Stoga je poželjno da se daje imunostimulirajuća nukleinska kiselina iz izuma i adjuvnas koji nije nukleinska kiselina da se poveća na antigen specifični odgovor, a kada je antigen prisutan.

Primjeri uobičajenih infekcija kod pilića je infektivna pileća infekcija virusom anemija (CIAV). CIAV je prvo izoliran u Japanu 1979 tijekom iztraživanja Marekpve bolesti (Yuasa et al., 1979, Avian Dis. 23:366-385). Kako je u to vrijeme CIAV nađen kod komercijalne živine u svim zemljama koji su veliki prizvođeči živine, (van Bulow et al., 1991, pp.690-699) u Diseases of Poultry, 9, izd. Iowa State University Press).

CIAV infekcija rezultira kliničkom bolesti koja je karakterizirana anemijom, hemoragijom i imunosupsresijom mladih pilića. Atrofija timusa i koštane srži i konzistentne lezije su također karakteriskrike infekcije s CIAV. Iscrpljenjem limfocita iz timusa i povremeno u burza Fabricius, rezultira imunosupresijom i povećanom mogućnosti sekundarne, bakterijske ili virusne infekcije koja tada otežava tijek bolesti. Imunosupresija može uzrokvati pogoršanje bolesti nakon infekcije s jednim ili više virusa marekove bolesti (MDV), infektivne virusne bolesti burze, virusne retikuloendoteliolize, adenovirusa ili reovirusa. Pokazanoj je da je patogeneza MDV povećana CIAV (DeBoer et al., 1989, str. 28 i Procecdings of the 38th Westem Poultry Diseases Conference, Tempe, Ariz.). Nadalje, pokazano je da CIAV pogoršava znakobe infekcije burze, bolesti burze i znakova infekcije bolesti burze (Rosenberger et al., 1989, Avian Dis. 33:707- 713). Pilići razvijajau vremenom rezistenciju na eksperimentalno izazvane bolesti zbog CAA. To se u suštini završeno do 2 tjedna, ali starije životinje su još uvjek prijemčive za infekciju (Yuasa, N. et al., 1979 supra; Yuasa, N. et al., Arian Di'seases 24, 202-209, 1980). Međutim, ako su pilići dvostruko zaraženi s CAA i ako imunosupresivnim sredstvaima (IBDV, MDV etc.), rezistencija prema bolesti će biti odgođena (Yuasa, N. et al., 1979 i 1980 supra; Bulow von V. et al., J. Veterinary Medicine 33, 93-116, 1986). Karakterisktike CIAV koje mogu povećati transmisiju bolesti uključuju visoku rezistentciju na okolične inaktvacije u nekom uobičajenim dezinfektima. Ekoomski učinak infekcije CIAV ina industiju uzgoja živine je jasna iz ćinjenice da 10% doi 30% ptiva ugine koje dobiju infkeciju.

Vakcinacija ptica kao i ostalih kralježnjaka se može izvesti pri bilo kojoj starosti. Normalno se vakcijacija izvodi do 12 tjedana starosti sa živim mikroorganzmima i između 14 i 18 tjedana s inaktiviranim mikroorganzima ili druge tipove vakcina. In vivo vakcinacija se može izvesti u zadnjem kvartalu razvoja embrija. Vakcina se može dati subkutano, sprejem, oralno, intraokularno, intrakatehalno, nazalno ili durgim metodama ovdje opisanih isporuka u sluznicu. Stoga se imunostimulirajuće nukleinske kiseline iz izuma mogu davati pticama i drugim kralježnjacima koji nisu ljudi upotrebom rutinskih rasporeda vakcinacije, a antigen se može davati nakon odgovrarajućeg perioda, kao što je ovdje opisano.

Stoka također može dobiti infekciju. Bolesti koje pogađaju te životinje uzrokuju veliki ekonomski gubitak. Metode iz izuma se mogu koristiti da zaštite stoku kao što su goveda, konji, svinje, ovce i koze.

Goveda mogu biti inficirana goveđim virusima. Virus goveđe diareje (BVDV) je mali virus s omotačem koji sadrži RNA pozitivnog smjera i klasificiran je skupa s virusom svinjske kolere (HOCV) i ovčijom pograničnom bolesti (BDV) i rodu pestivirusa. Mada su petivirusi prethodno klasificirani u obitelj Togavirdae, neka istraživanja ukazuju da ih treba smjestiti unutar obitelji Flaviviridae skupa s flavivrusom i virusom hepatitisa C (HCV) (Francki et al., 1991).

BVDV koji je važan patogen kod stoke se može razlikovati na osnovi analize stanične kulture u citopatogenim (CP) i necitopatogenim (NPC) biotipovima. NPC biotip je rašireniji, mada se oba biotipa mogu naći kod stoke. Ako trudna krava postane inficirana s NCP vrstom, krava može okotiti trajno inficirano i specijalno imunotolerantno tele koje će širiti virus tijekom života. Stalno inficirana stoka može dobiti bolest sluznice i oba biotipa se tada mogu izolirati iz životinje. Klinička manifestacija može uključivati abortus, tetragenezu, respiratorne probleme, bolest sluznice i blagi proljev. Uz to, ozbiljna trombocitopenija povezana s epidemijom stada koja rezultira ugibanjem životinja koje su opisane, a vrste koje su povezane s bolesti su smrtnije nego klasični BVDV.

Konjski virusi herpesa (EHV) sadrže skpinu antigenski različitih bioloških sredstava koji uzrokuju različite infekcije u konjima u rasponu od sublingvalne do fatalne bolesti. To uključuje konjski herpesvirus-1 (EHV-1), patogen u konjima. EHV-1 je povezan s epidemijom abortusa, bolesti respiratornog trakta i poremećajima cerebralnog nervog sustava. Primarna infekcija u gornjem respiratornom traktu mladih konja je rezultat groznice koja traje od 8 do 10 dana. Imunološka slabost može izazvati ponovnu infekciju preko respiratornog trakta bez da bolest postane očita, tako da do abortusa dolazi bez najave. Neurološki sindrom je povezan s respiratorom bolesti ili abortusom i može djelovati na životinje bilo kojeg spola u bilo kojoj dobi, vodeći nedostatku koordinacije, slabosti i naknadno paralizi (Telford, E. A. R. et al. Virology 189, 304-316, 1992). Ostali EHV uključuju EHV-1 ili konjski citomegalovirus, EHV-3, virus konjske koitalne eksanteme, te EHV-4 prethodno klasificiran kao podtpi 2 EHV-1.

Ovce i koze mogu biti zaražene raznim opasnim mikroorganizmima uključujući visna-maedi.

Primati kao što su majmuni se mogu inficirati virusom majmunske imunodeficijencije. Prikazani su inaktivirani stanični virus i majmunske imunodeficijenten vakcine bez stanica kojima se dobiva zaštita majmuna (Stott et al. (1990) Lancet 36:1538-1541; Desrosiers et al. PNAS USA (1989) 86:6353-6357; Murphey-Corb et al. (1989) Science 246:1293-1297; te Carlson et al. (1990) AIDS Res. Human Retroviruses 6:1239-1246). Pokazano je da rekombinantna HIV gp120 vakcina dovodi do zaštite čimpanzi (Berman et al. (1990) Nature 345:622-625).

Mačke, domaće i divlje lako se inficiraju različitim mikroorganizmima. Primjerice mačji infektivni perionitis je bolest koja se događa u domaćim i divljim mačkama, kao što su lavovi, leopardi, gepardi i jaguari. Kada je poželjno da se spriječi infekcija s tim i drugim patogenim organizmima u mačaka, za vakcinaciju mačke i zaštu od infekcije se mogu koristiti metode iz izuma.

Domaće mačke se mogu inficirati s nekoliko retrovirusa uključujući, ali bez ograničenja, virus mačje leukemije (FeLV), mačji sarkoma virus (FeSV), konkomavirus endogenog tipa (RD-1 14), mačji sincicijsku virus (FeSFV). Od tih je FeLV najznačajniji patogen koji uzrokuke različite simptome uključujući limforetikularne i mieloidne neoplazme, anemije, imuno-posredovane poremećaje, i sindrom imunodeficijencije koji je sličan humanom sindromu imunodeficijencije (AIDS). Nedavno određeni replikacijski defektni mutant FeLV označen kao FeLV-AIDS je vrlo jako povezan s imunosupresivnim svojstvima.

Otkriće mačjeg T-limfotropičnog lentivirusa (koji se također navodi kao mačja imunodeficijencija) je prvi put prikazano od Pedersen et al. (1987) Science 23 5:790-793. Karakteristike FIVsu prikazane u Yamamoto et al. (1988) Leukemia, December Supplement 2:204S-215S; Yamamoto et al. (1988) Am. J. Vet. Res. 49:1246-1258; te Ackley et al. (1990) J. Virol. 64:5652-5655. Kloniranje i sekvencijska analiza FIV je prikazana u Olmsted et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2448-2452 te 86:4355-4360.

Mačji infektivni peritonitis (FIP) je sporadična bolest koja se zbiva nepredvidivo u domaćnim i divljim mačkama. Dok je FIP primarno bolest domaćih mačaka, dijagnosticirana je i u lavovima, leopardima, gepardima i jaguarima. Manje divlje mačke koje su zaražene FIP uključuju risa. Kod domaćih mačaka bolest se uglavom pojavljue kod mladih životinja, mada je mogu dobiti mačke svake dobi. Najviše se pojavljuje u dobi od 6 do 12 mjeseci. Smanjivanje pojavljivanja bolesti je zabilježeno od 5 do 13 godina starosti, nakon čega slijedi povećano povjavljivanja kod mačaka starih 14 do 15 godina.

Virusne, bakterijske i parazitske bolesti riba i školjaka i ostalih vodenih životinja tvore ozbiljan problem za industiju akvakulture. Zbog vellike gustoće životinja u bazenima ili zatvorenim morskim prostorima za uzgoj, infekcijske bolesti se mogu razoriti veliki dio uzgoja, primjerice riba, školjaka ili drugih vodenih životinja. Prevencija od bolesti je poželjniji način od tretmana životinja već kad se bolest pojavila. Vakcinacija riba je jedina preentivna metoda koja može pobuditi dugotrajnu zaštitu preko imuniteta. Vakcinacije zasnovena na nukleinskim kiselina opisane su u U.S. Patentu br. 5,780.488 izdano Davisu.

Imuno sustav ribe ima mnoge karakteristike imunog sustava sisavaca, kao što je prisutnost B-stanica, T-stanica, limfokina, komplementa i imunoglobulina. Ribe imaju podklase limfocita s ulogom koja izgleda slična onim od B- i T-stanica sisavaca. Vakcine mogu biti dane uranjanjem ili oralno.

Vrste akvakulture uključuju, ali nisu ograničene na ribe, školjke i druge vodene životinje. Ribe uključuju sve ribe kralježnjake koje mogu imati kosti ili hrskavicu, kao što su primjerice salmonidi, šaran, som, te arbun. Salmonidi su obitelj riba koji uključuju pastrvu i losos. Primjeri školjaka i rakova uključuju ali nisu na njih ograničeni lisanku, jastoga, kozicu, rakovicu i kamenice. Ostale vodene životinje ukljuičuju, ali nisu na njih ograničeni jegulju, sipu i hobotnice.

Polypeptides virusnih vodenih patogena uključuju, ali nisu na njih ograničeni, glikoprotein (G) ili nukleoprotein virusne hemoragije virusa septicemija (VHSV); G ili N proteini virusa infektivne hematopoietičke nekroze (IHNV); VP 1, VP2, VP3 ili N strukturni proteini virusa infektivne nekroze pankreasa (IPNV); G protein proljetne viroze šarana (SVC); te protien povezan s membranom, teguminski ili kapsidni protein ili glikoprotein virusa soma (CCV).

Tipični paraziti koji inficiraju konje su: Gasterophilus spp.; Eimeria leuckarti, Giardia spp.; Tritrichomonas equi; Babesia spp. (RBC's), Theileria equi; Trypanosoma spp.; Klossiella equi; Sarcocystis spp.

Tipični paraziti koji infivciraju svinje uključuju: Eimeria bebliecki, Eimeria scabra, Isospora suis, Giardia spp.; Balantidium coli, Entamoeba histolytica; Toxoplasma gondii i Sarcocystis spp., te Trichinella spiralis.

Glavni paraziti u mliječnim proizvodima, te kod goveda jesu: Eimeria spp., Cryptosporidium spp., Giardia spp.; Toxoplasma gondii; Babesia bovis (RBC), Babesia bigemina (RBC), Trypanosoma spp. (plasma), Theileria spp. (RBC); Theileriaparva (limfociti); Tritrichomonasfoetus; te Sarcocystis spp.

Glavni paraziti u grabežljivaca uključuju: Trichomonas gallinae; Coccidia (Eimeria spp.); Plasmodium relictum, Leucocytozoon danilewskyi (sove), Haemoproteus spp., Trypanosoma spp.; Histomonas; Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium baileyi, Giardia, Eimeria; Toxoplasma.

Tipični paraziti koji inficiraju ovce i koze jesu: Eimeria spp., Cryptosporidium sp., Giardia sp.; Toxoplasma gondii; Babesia spp. (RBC), Trypanosoma spp. (plasma), Theileria spp. (RBC); te Sarcocystis spp.

Tipične infekcije parazitima kod živine uključuju kokodiozu uzrokovanu: Eimeria acervulina, E necatrix, E. tenella, Isospora spp. te Eimeria truncata; histomoniyu, uzrokovanu Histomonas meleagridis i Histomonas gallinarum; trihomonijazu uzrokovanu Trichomonas gallinae; te heksamitiju uzrokovanu Hexamila meleagridis. Živina može također biti zaražena Emeria maxima, Emeria meleagridis, Eimeria adenoeides, Eimeria meleagrimitis, Cryptosporidium, Eimeria brunetti, Emeria adenoeides, Leucocytozoon spp., Plasmodium spp., Hemoproteus meleagridis, Toxoplasma gondii i Sarcocystis.

Metode iz izuma se također mogu primjeniti na tretman i/ili prevenciju infekcija parazitima kod pasa, mačaka, ptica i riba. Tipični paraziti kod riba su: Trichomonas gallinae; Eimeria spp., Isospora spp., Giardia; Cryptosporidium; Sarcocystis spp., Toxoplasma gondii, Haemoproteus/Parahaemoproteus, Plasmodium spp., Leucocytozoon/Akiba, Atoxoplasma, Trypanosoma spp. Tipični paraziti koji inficiraju pse jesu: Trichinella spiralis; Isopora spp., Sarcocystis spp., Cryptosporidium spp., Hammondia spp., Giardia duodenalis (canis); Balantidium coli, Entamoeba histolytica; Hepatozoon canis; Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Babesia canis; Leishmania amastigotes; Neospora caninum.

Tipični paraziti koji inficiraju mačje vrste jesu Isospora spp., Toxoplasrna gondii, Sarcocystis spp., Hammondia hammondi, Besnoitia spp., Giardia spp.; Entamoeba histolytica; Hepatozoon canis, Cytauxzoon sp., Cytauxzoon sp., Cytauxzoon sp. (crvene stanice, RE stanice).

Tipični parziti koji inficiraju ribe jesu Hexamita spp., Eimeria spp.; Cryptobia spp., Nosema spp., Myxosoma spp., Chilodonella spp., Trichodina spp.; Plistophora spp., Myxosoma Henneguya; Costia spp., Ichthyophithirius spp., te Oodinium spp.

Tipični parziti u divljim životinjama jesu Giardia spp. (camivores, herbivores), Isospora spp. (camivores), Eimeria spp. (camivores, herbivores); Theileria spp. (herbivores), Babesia spp. (carnivores, herbivores), Trypanosoma spp. (carnivores, herbivores); Schistosoma spp. (herbivores); Fasciola hepatica (herbivores), Fascioloides magna (herbivores), Fasciola gigantica (herbivores), Trichinella spiralis (camivores, herbivores).

Parazitne infekcija u zoološkim vrtovima također mogu stvarati ozbiljni problem. Tipični paraziti u obitelji bovidae je Eimeria spp. Tipični parazit u obiteji pinnipedae (foka, morski lav) je Eimeriaphocae. Tipični parazit u obitelji camelidae (deve, lame) je Eimeria spp. Tipični parazit u obitelji giraffidae fainily (žirafe) je Eimeria spp. Tipični parazit u obitelji elephantidae (afrički i azijski) je Fasciola spp. Tipični parazit iu nižih primata (čimpanze, orangutani, babuni, majnuni) jesu Giardia sp.; Balantidium coli, Entamoeba histolytica, Sarcocystis spp., Toxoplasma gondii; Plasmodim spp. (RBC), Babesia spp. (RBC), Trypanosoma spp. (plazma), Leishmania spp. (makrofagi).

Polipeptidni bakterijski patogeni uljučuju ali nisu na njihh ograničeni željzom regulirane proteine s vanjske membrane (IROMP) i proteine s unutrašnje membrane (OMP) i A-protein Aeromonis salminicida koja uzrokuje furunkulozu, p57 protein od Renibacterium salmoninarum koji uzrokuje bakterijsku bolst bubrega (BKD), antigen povezan s glvanom površinom (msa), površinski eksprimiran citotoksin (mpr), površinski eksprimiran hemolizin (ish), te flagelarni antigen of Yersinioze; vanstanični protein (ECP), željzom regulirane proteine s vanjske membrane (IROMP), te strukturni protein od Pasteurellosis; OMP i flagelarni protein od Vibrosis anguillarum i V. ordalii; flagelarni protein, OMP protein, aroA i purA of Edwardsiellosis ictaluri te E.

Polipeptidi parazitskog patogena pokazuju ali nisu na njih ograničeni površinske antigene Ichthyophthirius.

Alergen se odnosi na tvar (antigen) koja može inducirati alergijski ili asmatski odgovor u osobi. Lista alergena je ogromna i može uključlivati polene, otrov insekata, životinjsku prašinu, spore glivica i lijekove (npr. penicilin). Primjeri prirodnih životinjskih i biljnih alergena jesu, ali nisu na njih ograničeni specifični proteini na sljedeće rodove: Canine (Canisfamiliaris); Dermatophagoides (e.g. Dermatophagoidesfarinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (e.g. Lolium perenne or Lolium multiflorum) Cryptomeria (Cryptomeriajaponica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (e.g. Plantago lanceolata); Parietaria (e.g. Parietaria officinalis or Parietariajudaica); Blattella (e.g. Blattella germanica); Apis (e.g. Apis multiflorum); Cupressus (e.g. Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica iCupressus macrocarpa); Juniperus (e.g. Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis iJuniperus ashei); Thuya (e.g.Thuya orientalis); Chamaecyparis (e.g. Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (e.g. Periplaneta americana); Agropyron (e.g. Agropyron repens); Secale (e.g. Secale cereale); Triticum (e.g. Triticum aestivum); Dactylis (e.g. Dactylis glomerata); Festuca (e.g. Festuca elatior); Poa (e.g. Poapratensis or Poa compressa); Avena (e.g. Avena sativa); Holcus (e.g. Holcus lanatus); Anthoxanthum (e.g. Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (e.g. Arrhenatherum elatius); Agrostis (e.g. Agrostis alba); Phleum (e.g. Phleum pratense); Phalaris (e.g. Phalaris arundinacea); Paspalum (e.g. Paspalum notatum); Sorghum (e.g. Sorghum halepensis); te Bromus (e.g. Bromus inermis).

Antigen može biti antigen koje je kodiran od vektora nukleinske kiseline. U prethodnom slučaju vektor nukleinske kiseline je dan subjektu i antigen je eksprimiran in vivo. U drugom slučaju antigen može biti dan izravno subjeltu. Antigen ne kodira vektor nukleinske kiseline i kako je ovdje korišteno odnosi se na bilo koji tip antigena koji nije nukleinska kiselina. Primjerice, u nekomaspektima izuma, antigen koji nije kodiran u vektoru nukleinske kiseline je polipeptid. Male modifikacije primarne aminokiselinske sekvnecije polipeptidnog antigena mogu rezultirati polipeptidnom koji ima uglavnom istu antigensku aktivnost, a u usporedbi s nemodificiranim polipetdinim partnerom. Takve modifikacije mogu biti namjerne, kao što je na mjestu dirigiranom mutagenezom, ili mogu biti spontane. Svi polipeptidi producirani tim modifikacijmama su ovdje uključeni, a ako antigenost i dalje postoji.

Termin značajno pročišćen kako je ovdje korišten odnosi se na polipeptid koji je gotovo potpuno bez drugih proteina, lipida, ugljikohidrata ili drugih materijala kojim su prirodno povezani. Stručnjak može pročistiti virusne ili bakterijske polipeptide koristeći standardne tehnike za pročišćavanje proteina. Dovoljno čist polipeptid će često davati jednu glavnu vrpcu na nereducirajućem poliakrilnom gelu. U slučaju djelomično glikoliziranih polipeptida ili tih koji imaju nekoliko početnih kodona može postojati nekoliko vrpci na nereducirajućem poliakrilnom gleu, ali će oni tvoriti prepoznatljive oblike za taj polipeptid. Čistoća virusnog ili bakteirjskog polipeptida može također biti određena amino-terminlanom sekvencijskom analizom. Ostali tipovi antigena nekodiranih od vektora nukleinske kiseline, kao što su polisaharidi, male molekule, imitacije itd su gore opisanu i uključenu u izum.

Izum također koristi polinukleotide koji kodiraju antigenske polipeptide. Objašnjeno je da se atigen može isporučiti subjektu u molekuli nukleinske kiseline koja kodira antigen, tako da antigen mora biti eksprimiran in vivo. Takvi antigeni isporučeni u subjekt u vektoru nukleinske kiseline su navedeni kao antigeni kodirani vektorom nukleinske kiseline. Nukleinska kiselina koja kodira antigen je operativno vezana na sekvneciju ekspresijskog gena koji usmjerava ekspresiju antigena nukleinske kiseline unutar eukariotske stanice. Sekvencija ekspresijskog gena je bilo koja regulacijska nukleotina sekvencija, kao što je promotorska sekvencija ili kombinacija promotora-pojačivača, što olakšava učinkovitu transkripciju i translaciju antigenske nukleinske kiseline na koju je operativno vezan. Sekvencija ekspresijskog gena može, primjerice, biti promotor sisavaca ili virsa, kao što je konstitutivni ili inducibilni promotor. Konstitutivni promotori sisavaca uključuju, ali nisu na njih ograničeni, sljedeće promotore gena: hipoksantil fosforibozil transfetaza (HPTR), adenozin deaminaza, piruvat kinaza, promotor b-aktin i ostali konstiturivni promotori. Primjer virusnih promotora koji djeluje konstitutivno u eukariotskim stanicama uključuje, primjerice promotore iz citomegalovirusa (CMV), majnunskog virusa (npr. SV40), papiloma virusa, adenovirusa, virusa humane imunodeficijencije (HIV), Rus sarkoma virusa, citomegalovirusa, dugo terminalno ponavljanje (LTR) virusa Moloneyove lukemije i ostalih retrovirusa, te promotor timidin kinaze virusa herpes simpleksa. Ostali konstitutivni promotori su poznati stručnjacima. Promotori korisni kao ekspresijke sekvnecija gena iz izuma također uključuju inducibilne pormotore. Inducibilni pormotori su eksprimirani u prisutnosti sredstva za indukciju. Primjerice, metalotioneinski promotor je induciran da promovira transkripciju i translaciju u prisutnosti nekih metalnih iona. Ostali inducibilni promotori poznati su stručnjaku u struci.

Općenito, ekspresijska sekvencija gena će inducirati, ako je neophodno 5' ne-transkribirajuće i 5' ne-translatirajuće sekvencije obuhvaćene inicijacijom transkripcije i translacije, kao što je TATA kutija, pokrivajuća sekvencija, CAAT sekvnecija i slično. Posebice, kao 5' ne-transkribirajuće sekvencije će uključivati promotorsku regiju koja uključuje promotorsku sekvneciju za transkripcijsku kontrolu operabilno vezane antigenske nukleinske kiseline. Sekvencija ekspresijskog gena može ugljučivati pojačivačku sekvneciju ili uzvodni aktivator sekvnecija, a ako je poželjno.

Antigenska nukleinska kiselina je operativno vezana na ekspresijsku sekvenciju gena. Kako je ovdje korišteno, za sekvenciju antigenske nukleinske kiseline i ekspresijske sekvencije gene je rečeno da su operativno vezani kada su kovaletno vezani na taj način da smjeste ekspresijsku ili transkripcijsku i/ili translacijsku sekvenciju koju kodira antigen pod utjecajem ili kontrolom ekspresijske sekvencije gena. Za dvije DNA sekvnecije je rečeno da su operativno vezane kada indukcija promotora u 5' ekspresijskoj sekvenciji gena rezultira transkripcijom antigenske sekvnecije, te ako priroda veze između dvije DNA ne (1) rezultira uvođenjem mutacija pomaka čitajućeg okvira, (2) interferira sa sposobnosti promotorske regije da usmjeri transkripciju antgenske kiseline, ili (3) interferira sa sposobnosti odgovarajućeg RNA transkripa da bude translatiran u protein. Stoga, bi ekspresijska sekvencija gena bila operabilno vezana na sekvneciju antgenske nukleiske kiseline ako je ekspresijska sekvencija gena sposobna utjecati na transkripciju sekvnecije antgenske nukleiske kiseline, tako da je nastali transkript translatiran u željeni protein ili polipeptid.

Antigenska nukleinska kiselina iz izuma može biti isporučena u imuni sustav sam ili skupa s vektorom. U najširem smislu, vektor je bilo koji vehikul koji je sposoban olakšati prijenos antigenske nukleinske kiseline u stanice imunostg sustava tako da antigen može biti eksprimiran i prezentiran na porvšini imune stanice. Vektor općenito transportira nukleinsku kiselinu u imune stanice sa smanjenom degradacijom relativno prema stupnju degradacije do koje bi došlo u odsutnosti vektora. Vektor može uključivati gore opisane ekspresijske sekvencije gena da se poveća ekspresija antigenske nukleinske kiseline u imunom stanicama. Općenito, vektori korisni u izumu uključuju, ali nisu na njih ograničeni, plazmide, fagemide, viruse, ostale vehikule izvedene iz virusnih ili akterijskih izvora koji su manipulirani insercijom ili ugradnjom antigenske skevnecije nukleinske kiseline. Virusni vektori u prefeirani tip vektora i uljučuju, ali bez ograničenja na njih, sekvencije nukleinske kiseline iz sljedećih virusa: retrovirusi kao što je virus Moloneyeve leukemije glodavca, virus Herveyevog sarkoma glodavca, virus tumora mlliječne žljezde glodavca, virus Rous sarkoma, adenovirus, virus povezan adenovirusom, SV40 tip virusa, virusi polioma, Epstein-Barrovi virusi, papiloma virusi, virusi vakcinije, te RNA virus kao što je retrovirus. Mogu se koristiti i ostali neimenovani vektori poznati u struci.

Preferirani virusni vektori su zasnovani na necitopatskim eukariotskim virusima čiji su neesencijalni geni zamjenjeni genom od interesa. Necitopastski virusi uključuju retroviruse, čiji životni ciklus obuhvaća reverznu transkripciju genomne virusne RNA u DNA nakon čega slijedi provirusna integracija u staničnu DNA domaćina. Retrovirusi su odobreni u humanoj genskoj terapiji. Korisniji su oni retrovirusi koji su replikacijski deficijentni (t.j. sposobni usmjeravati sintezu željenih proteina ali nisu sposobni proizvesti infektivne čestice. Takvi genetički promijenjeni retrovirusni ekspresijski vektori imaju opću upotrebu za transdukciji gena visoke učinkovitosti in vivo. Standardni protokoli za produkciju replikacijski deficijentnog retrovirua (uključujući korake ugradnje egzogenog genetičkog materijala u plazmid, transfekciju pakirane stanice povezane s plazmidom, produkciju rekombinantnig retrovirusa pakiranjem stanične linije, sakupljanje virusnih čestica iz medija za kulturi tkiva i infekciju ciljanih stanica s virusnim čestica-ma) prikazani su u Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual W. H. Freeman C. O. New York (12990) i Murry, E. J. methods in Molecular Biology, vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey (1991).

Preferirani virus za neku aplikaciju je virus povezan s adenovirusom, je dvolančani DNA virus. Virus povezan s adenovirusom može biti modificiran inženjerstvom da bude replikatorno deficijantan i sposoban inficirati široki raspon tipova stanica i čestica. On dalje ima prednosti kao što su stabilnosti na toplinu i otapalo, velika frekvencija trandsukcije u stanicama različitih bioloških linija uključujući hemopoietičke stanice, nedostatak inhibicije superinfekcije što dozvoljava višestruku seriju transdukcije. Virus povezan s adnovirusom može biti integriran u humanu staničnu DNA na specifičnom mjestu i čime je na najmanju mjeru smanjena mogućnost insercijske mutageneze i varijabilosti ekspresijskih karakteristika insertiranog gena retrovirusne infekcije. Uz to, divlji tip virusne infekcije povezne s adenovirusonom je praćen u staničnoj kulturi za veći broj od 100 prolaza u odsutnosti selektivog tlaka, pokazujući da je genomska integracija relativno slaba u virusima sličnim adenovirusima.

Ostali vektori uključuju vektore plazmida. Vektori plazmida su iscrpno opisani u struci i dobro su poznati stručnjacima. Vidi npr. Sambrook et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1090. U zadnjih nekoliko godina vektori plazmida su nađeni posebno pogodnim za isporuku gena u stanice in vivo zbog njihove nesposobnosti da se repliciraju i integriraki u genom domaćina. Ti plazmidi, međutim, imaju promotor kompatibilan sa stanicom domaćina, pa mogu eksprimirati peptide iz gena operativno kodiranog unutar plazmida. Neki uobičajeno korišteni plazmidi su pBR322, pUC18, pUC19, PRC/CMV, SV400 i pBlueScript. Ostali plazmidi su dobro poznati stručnjacima u području. Nadalje, plazmidi mogu biti dizajnirani korištenjem restrikcijskih enzima i reakcijom ligacije da se uklone i dodaju specifični fragemnti DNA.

Nedavno je otkriveno da gen koji nosi plazmide može biti isporučen u imuni sustav korištenjem bakterije. Modificirani oblici bakterija kao što je Salmonella mogu biti transficirani plazmidom i korišteni kao vehikuli za isporuku. Bakterijski vehikuli za isporuku mogu biti dani domaćinu oralno ili na bilo koji drugi način. Bakterija isporučuje plazmid u imunu stanicu, npr. B-stanice, dendrične stanice koje vjerojatno prolaze preko stomačne barijere. Tom metodologijom je utvrđena visoka razina imune zaštite. Takve metode isporuke su korisne za aspelte izuma, a koriste sistemsku isporuku antigena, imunostimulirajuće nukleinske kiseline i/ili drugog terapijskog sredsva.

Stoga su imunostimulirajuće nukleinske kiseline korisne kao adjuvansi vakcini. Prethodno je ustanovljheno da su CpG oligonukleotidi izvrsni adjuvansi vakcini. Također je pokazano, međutim, da su CpG oligonukleotidi izvrsni adjuvansi vakcini. Međutim, također je pokazano da CpG ODN koji je izvrsni adjuvans kod miševa nije preferiran kod životijna koje nisu glodavci. Da bi se identificirala najbolja imunostiulirajuća nukleinske kiseline za upotrebu kad adjuvasa u humanu vakcinu i ostalih životinja koji nisu glodavci, provedeno je in vivo probiranje različith nukleinskih kiselina za tu svrhu. Nekoliko in vivo testova je procjenjeno u miševima prema njihovoj predvid-ljivoj vrijednosti aktinvosti adjuvansa u miševima. Tijekom tog istraživanja, utvrđen je in vitro test koji je predviđa in vivo efikasnost. Nađeno je da, iznenađujuće, aktivacija B-stanica i NK stanica korelira posebno dobro sa sposobnošću imunostimulrajuće nukleinske kiseline da se poveća in vivo imuni odgovor na antigen.

Ispravno predvidljiva vrijednost aktivacije B-stanice za in vivo aktivnost adjuvansa je najvjerojatnije povezana s centralnom ulogom B-stanica u utvrđivanju specifičnog imunog odgovora. Poliklonalna proliferacija B-stanice (inducirana imunostimulirajućim nukleinskim kiselinama) povećava vjerojatnost na slaganja s na antigen specifičnih B-stanica/T-pomoćnih stanica. Nadalje, povećana ekspresija kostimulirajuće molekule CD86 na poliklonalne proširene B-stanice aktivira antigen specifilčne T-pomoćne stanice. B-stanice također povećavaju ekspresiju CD40 kao odgovor na imunostimulrajuće nukleinske kiseline, poboljšavajući sposobnost CD40L eksprimiranih aktiviranih T-pomoćnih stanica da stimuliraju B-stanice. Povećana ICAM-1 sinteza na B-stanicama olakšava kontakt stanice na stanicu. Stoga aktivacijski status poliklonalnih B-stanica ima kritičnu ulogu tijekom započinjanja specifičnih odgovora antitijela.

Doprinos aktivnost NK stanica da bi se utvrdila specifična antitijela je, međutim, iznenađujući. NK stancie su djelomice urođeni dio imunog sustava i kao takve obuhvaćene su u prvoj linij obrane protiv patogena. Najvjerojatnije je obrazac citokina produciran NK stanicama nakon aktivacije blisko povezan s inicijacijom specifičnog imunog odgovora. Stoga u jednom aspektu izum se odnosi na metode identifikacije adjuvansa, a detekcijom aktivacije NK stanica. Test aktivacije NK stanica se može izvesti kao što je opisano u donjim Primjerima ili korištenjem drugih poznatih testova aktivnosti NK stanica. Preferirano je, međutim, da je korištena miješana populacija stanica, kao što je PBMC, jer je vjerojatno da je aktivacija NK stanica indirektni efekt. Test je preferirano koristan za identifikaciju imunostimulrajućih nukleinskih kiselina koje su korisni adjuvansi za ljude i ostale životinje koji nisu glodavci.

Pokazano je da je indukcija citokina također važna najava in vivo aktvnosti adjuvansa. Kako je to 2 log viša osjetljivost humanog endotoksina nego mišjih primarnih monocita, neki oprez je, međutim, potreban da bi se izbjegla kontaminacija endotoksinom imunostimulrajućih nukleinskih kiselina ovdje korištenih za testiranja humanog sustava (Hartmann G., i Krieg A. M. 1999 Gene Therapy 6:893). Kako su TNF-α, IUL-6 i IL-12 producirani od humanih monocita kao odgovor na čak male količine endotoksina, njihova vrijednost za visoki prolaz in vitro probiranja je ograničena. S druge strane humane B-stanice i NK stanice pokazuju samo malu aktivaciju endotoksinom i stoga su znatno korisnije u testiranju imunostimulatoske aktivnosti.

Stimulacija stanične funkcije u NK ili B-stanicama (t.j. litička aktivnost, proliferacija) zahtjeva jaču imunostimulrajuću nukleinsku kiselinu nego što je indukcija aktivacijskih markera na njihovoj površini (CD69, CD86). Za oba tipa stanica upotreba aktivacijskih markera sa stanične površine pokazuje višu nespecifičnu bazu koja se može pripisati fosforotioatnom skeletu uspoređenom sa funkcionalnim testom. Velika osjetljivost površinskih markera zahtjeva upotrebu imunostimulirajuće nukleinske kiseline male koncetracije za optimalno razlikovanje između imunostimulrajućih nukleinskih kiselina sličnih aktivnosti. Stoga upotreba površinskih markera dozvoljava usporedbu imunostimulrajućih nukleinskih kiselina slabe aktivnosti, dok je funkcionalni test preferiran za usporedbu imunostimulrajućih nukleinskih kiselina velike aktivnosti. Treba naznačiti da su optimalne koncetracije imunostimulirajuće nukleinske kiselina za stimuliranje B-stanica i NK stanica različite. Dok 0.6 μL/mL ODN već maksimalno stimulira C stanice, optimalna aktivacija NK stanica može zahtjevati 6 μL/mL ODN. Aktivacija B-stanice i funkcionalna aktivnost NK stanice je mjerena unutar svježe izoliranog PBMC. Prethodno je nađeno da su visoko pročišćene primarne humane B-stanice aktivirane s CpG DNA. Postojanje direktnog efekta CpG DNA na NK stanice je manje jasna, te sekundarni mehanizam posredovan drugim tipom stanica unutar PBMC može doprinijeti funkcionalnoj aktinvosti NK stanica induciranih CpG.

Nukleinske kiseline iz izuma se mogu dati subjektu skupa s antimikrobnim sredstvom. Antimikrobno sredstvo, kako je ovdje korišteno, odnosi se na prirodne i sintetske spojeve koji su sposobni ubiti ili inhibirati infekcijske mikroorganizme. Tip antimirobnih sredstava korisnih prema izumu će ovisiti o tipu mikroorgnaizma s kojim je subjet inficiran ili o riziku da postane inficiran. Antimikrobna sredstva uključuju ali nisu na njih ograničena, antibakterijska sredstva, antivirusna sredstva, antifungalna sredstva, te sredstva protiv parazita. Fraze kao što su "antibakterijsko sredstvo", "antivirusno sredstvo", "antifungalno sredstvo", te "sredstvo protiv parazita" imaju dobro ustanovljena značenja za stručnjake u području i definirani su standardnim medicinskim tekstovima. Ukratko, antibakterijska sredstva ubijaju ili inhibiraju bakterije, i uključuju antibiotike kao i ostale sintetske ili prirodne spojeve koji imaju sličnu funkciju. Antibiotici su molekule male molekulske mase koji su producirani kao sekundarni metaboliti od stanica, kao što su mikroorganizmi. Općenito, antibiotici interferiranju s jednom ili više bakterijskih funkcija ili struktura koje su specifične za mikroorganizme i koji nisu prisutni u stanicama domaćina. Antivirusna sredstva se mogu izolirati iz prirodnih izvora ili sintetizirati i korisni su za ubijajanje ili inhibiciju virusa. Antifungalna sredstva se koriste za tretman površinskih gljivičnih infekcija kao i oportunistilčkih i primarnih sistemskih gljivičnih infekcija. Sredstva protiv parazita ubijaju ili inhibiraju parazite.

Primjeri sredstava protiv parazita, koji su također navedeni kao paraziticidi korisni za humano davanje uključuju, ali nisu na njih ograničeni: albendazol, amfotericin B, benznidazol, bitionol, chloroquine HCI, chloroquine fosfat, clindamycin, dehydroemetine, diethylcarbamazine, diloxanide furoate, eflomithine, furazolidaone, glucocorticoids, halofantrine, iodoquinol, iverme-ctin, mebendazole, mefloquine, meglumine antimoniate, melarsoprol, metrif-onate, metronidazole, niclosarnide, nifurtimox, oxamniquine, paromomycin, pentamidine isethionate, piperazine, praziquantel, primaquine fosfat, proguanil, pyrantel pamoate, pyrimethamnine sulfonamidi, pyrimethamnine- sulfadoxine, kinakrine HCI, kinin sulfate, kinidin glukonat, spiramycin, stibogluconate natrij (natijev kositreni glukonate), suramin, tetaciklin, doxycycline, thiabendazole, tinidazole, trimethroprim-sulfamethoxazole, te tryparsamide od kojih su neki korišteni sami ili u kombinaciji.

Paraziticidi korišteni kod subjekata koji nisu ljudi uključuju: piperazin, dietilkarbamazin, tiabendazol, fenbendazol, albendazol, oksfendazol, oksi-bendazol, febantel, levamisol, pirantel tartrate, piyrantel parnoate, diklorvos, ivenektin, doramektik, milbemicin-oksim, iprinomektin, moksidektin, N-butil-klorid, toluen, higromicin B tiacetarsekao što je fenbendazol, albendazol, oksendazol, klorsulon, albendazol, amprolium; decokvinat, lasalocid, monensin sulfadimethoksine; sulfainetazin, sulfakvinoksaline, metronidazol.

Paraziticidi korišteni kod konja uključuju mebendazol, oksifendazol, febantel, pirantel, diklorvos, triklorfon, ivermectin, piperazine; za S. westeri: ivermectin, benzimiddazols kao što je tiabendazol, kambendazol, oksibendazol i fenbendazol. Korisni paraziticidi kod pasa ukljukombinaciju ivennectina i pirantela. Tretman parazitsa kod svinja može uključivati: levamisol, piperazine, pirantel, tiabendazol, diklorvos i fenbendazol. Kod ovaca i koza sredstva uključuju levamisol ili ivermectin. Kaparsolate pokazuje neku učinkovitost u tretmanu D. immitis (glista) kod mačaka.

Antibakterijska sredstva ubijaju ili inhibiraju rast ili funkciju bakterija. Velika klasa antibakteriskih sredstava su antibiotici. Antibiotrici koji su učinkoviti u ubijanju ili inhibiciji širokog raspona bakaterija su navedeni kao antibiotici širkokog spektra. Ostali tipovi antibiotika su uglavnom učinkoviti protiv bakteirja klase gram pozitivnih ili gram negativnih. Ti tipovi antibiotika su navedeni kao antibiotici uskog spektra. Ostali antibiotici koji su učinkoviti protiv jednog orgnanizma ili bolesti a ne protiv ostalih tipova bakterija su navedeni kao antibiotici ograničenog spektra. Antibakterijska sredstva su ponekad klasificirana na osnovu njihovog primarnog djelovanja. Općenito, antibakterijska sredstva su inhibitori sinteze staničnih stjenki, inhibitori stanične membrane inhibitori sinteze proteina, inhibitori sinteze i funkcije nukleinske kiseline, te kompetitivni inhibitori.

Antibakterijska sredstva korisna u izumu uključuju ali nisu na njih ograničena prirodne peniciline, polusintetnske peniciline, klavulansku kiselinu, cefalolsporine, bakitracin, ampicilin, karbenicilin, oksacilin, azlocilin, mezlocilin, piperacilin, methicilin, dicloksacilin, nafcilin, cefalotin, cefapirin, cefaleksin, cefarnandol, cefaklor, cefazolin, cefuroksine, cefoksitin, cefotak-sime, cefsulodin, cefetamet, cefiksime, ceftriaksone, cefoperazone, ceftazi-dine, moksalactam, carbapenems, imipenems, monobactems, euztreonam, vancomicin, polimiksin, amfotericin B, nistatin, imidazoli, clotrimazol, micona-zol, ketokonazol, itraconazol, fluconazol, rifampins, etambutol, tetraciclini, koramfenicol, makrolidi, aminoglikozidi, streptomicin, kanamicin, tobramicin, amikacin, gentainicin, tetracicline, minocikline, doksicikline, klortetracikline, eritromicin, roksitromicin, klaritromicin, oleandomicin, azitromicin, chloram-fenikol, kinoloni, kotrimoksazol, norfloksacin, ciprofloksacin, enoksacin, nalidiklična kiselina, temafloksacin, sulfonamidi, gantrisin, te trimetoprim; Acedapsone; Acetosulfone Sodium; Alamecin; Alexidine; Amdinocillin; Amdinocillin Pivoxil; Amicycline; Amifloxacin; Amifloxacin Mesylate; Amikacin; Amikacin Sulfate; Aminosalicylic acid; Aminosalicylate sodium; Amoxicillin; Amphomycin; Ampicillin; Ampicillin Sodium; Apalcillin Sodiwn; Aprainycin; Aspartocin; Astromicin Sulfate; Avilamycin; Avoparcin; Azithromycin; Azlocillin; Azlocillin Sodium; Bacampicillin Hydrochloride; Bacitracin; Bacitracin Methylene Disalicylate; Bacitracin Zinc; Bamberinycins; Benzoylpas Calcium; Berythromycin; Betamicin Sulfate; Biapenem; Biniramycin; Biphenarnine Hydrochloride; Bispyrithione Magsulfex; Butikacin; Butirosin Sulfate; Capreomycin Sulfate; Carbadox; Carbenicillin Disodium; Carbenicillin Indanyl Sodium; Carbenicillin Phenyl Sodium; Carbenicillin Potassium; Carumonam Sodium; Cefaclor; Cefadroxil; Cefamandole; Cefainandole Nafate; Cefamand-ole Sodium; Cefaparole; Cefatrizine; Cefazaflur Sodium; Cefazolin; Cefazolin Sodium; Cefbuperazone; Cefdinir; Cefepime; Cefepime Hydrochloride; Cefetecol; Cefixime; Cefmenoxime Hydrochloride; Cefrnetazole; Cefmetazole Sodium; Cefonicid Monosodium; Cefonicid Sodium; Cefoperazone Sodium; Ceforanide; Cefotaxime Sodium; Cefotetan; Cefotetan Disodium; Cefotiam Hydrochloride; Cefoxitin; Cefoxitin Sodium; Cefpimizole; Cefpimizole Sodium; Cefpiramide; Cefpirainide Sodium; Cefpirome Sulfate; Cefpodoxime Proxetil; Cefprozil; Cefroxadine; Cefsulodin Sodium; Ceftazidime; Ceftibuten; Ceftizoxime Sodium; Ceftriaxone Sodium; Cefuroxime; Cefuroxime Axetil; Cefuroxime Pivoxetil; Cefuroxime Sodium; Cephacetrile Sodium; Cephalexin; Cephalexin Hydrochloride; Cephaloglycin; Cephaloridine; Cephalothin Sodium; Cephapirin Sodium; Cephradine; Cetocycline Hydrochloride; Cetophenicol; Chlorarnphenicol; Chloramphenicol Palmitate; Chlorampheni-col Pantothenate Complex Chloramphenicol Sodium Succinate; Chlorhexidine Phosphanilate; Chloroxylenol; Chlortetracycline Bisulfate ; Chlortetracycline Hydrochloride ; Cinoxacin; Ciprofloxacin; Ciprofloxacin Hydrochloride; Cirolemycin; Clarithromycin; Clinafloxacin Hydrochloride; Clindamycin; Clindainycin Hydrochloride; Clindamycin Palmitate Hydro-chloride; Clindamycin Phosphate; Clofazimine ; Cloxacillin Benzathine; Cloxacillin Sodium; Cloxyquin; Colistimethate Sodium; Colistin Sulfate; Coumerinycin; Coumennycin Sodium; Cyclacillin; Cycloserine; Dalfopristin; Dapsone; Daptomycin; Demeclocycline; Demeclocycline Hydrochloride; Demecycline; Denofumgin ; Diaveridine; Dicloxacillin; Dicloxacillin Sodium; Dihydrostreptomycin Sulfate; Dipyrithione; Dirithromycin; Doxycycline; Doxycycline Calcium; Doxycycline Fosfatex; Doxycycline Hyclate; Droxacin Sodium; Enoxacin; Epicillin; Epitetracycline Hydrochloride; Erythromycin; Erythromycin Acistrate; Erythromycin Estolate; Erythromycin Ethylsuccinate; Erythromycin Gluceptate; Erythromycin Lactobionate; Erythromycin Propionate; Erythromycin Stearate; Ethambutol Hydrochloride; Ethionamide; Fleroxacin; Floxacillin; Fludalanine; Flumequine; Fosfomycin; Fosfomycin Tromethainine; Fumoxicillin; Furazolium Chloride; Furazolium Tartrate; Fusidate Sodium; Fusidic Acid; Gentamicin Sulfate; Gioximonam; Gramicidin; Haloprogin; Hetacillin; Hetacillin Potassium; Hexedine; lbafloxacin; Imipenem; Isoconazole; Isepamicin; Isoniazid; Josamycin; Kanamycin Sulfate; Kitasamycin; Levofuraltadone; Levopropylcillin Potassium; Lexithromycin; Lincomycin; Lincomycin Hydrochloride; Lomefloxacin; Lomefloxacin Hydrochloride; Lomefloxacin Mesylate; Loracarbef; Mafenide; Meclocycline; Meelocycline Sulfosalicylate; Megalomicin Potassium Phosphate; Mequidox; Meropenem; Methacycline; Methacycline Hydrochloride; Methenainine; Methenamine Hippurate; Methenwnine Mandelate; Methicillin Sodium; Metioprim; Metronidazole Hydrochloride; Metronidazole Phosphate; Mezlocillin; Mezlocillin Sodium; Minocycline; Minocycline Hydrochloride; Mirincamycin Hydrochloride; Monensin ; Monensin Sodium; Nafcillin Sodium; Nalidixate Sodium; Nalidixic Acid; Natamycin; Nebrarnycin; Neomycin Palmitate; Neomycin Sulfate; Neomycin Undecylenate ; Netilmicin Sulfate; Neutramycin; Nifuradene; Nifuraldezone; Nifuratel ; Nifuratrone; Nifurdazil; Nifurimide; Nifurpirinol; Nifurquinazol; Nifuuthiazole; Nitrocycline; Nitrofurantoin; Nitromide; Norfloxacin; Novobiocin Sodium; Ofloxacin; Ormetoprim; Oxacillin Sodium; Oximonam; Oximonam Sodium; Oxolinic Acid; Oxytetracycline; Oxytetracycline Calcium; Oxytetracycline; Hydrochloride; Paldimycin; ParacWorophenol; Paulomycin; Pefloxacin; Pefloxacin Mesylate; Penamecillin; Penicillin G Benzathine; Penicillin G Potassium; Penicillin G Procaine; Penicillin G Sodium; Penicillin V; Penicillin V Benzathine; Penicillin V Hydrabamine; Penicillin V Potassium; Pentizidone Sodium; Phenyl Aminosalicylate; Piperacillin Sodium; Pirbenicillin Sodium; Piridicillin Sodium; Pirlimycin Hydrochloride; Pivampicillin HydrocWoride; Pivampicillin Pamoate; Pivampicillin Probenate; Polymyxin B Sulfate; Porfiromycin ; Propikacin; Pyrazinamide; Pyrithione Zinc; Quindecamine Acetate; Quinupristin; Racephenicol; Ramoplanin; Ranimycin; Relomycin; Repromicin; Rifabutin; Rifametane; Rifamexil; Rifamide; Rifampin; Rifapentine; Rifaximin; Rolitetracycline; Rolitetracycline Nitrate; Rosaramicin; Rosaramicin Butyrate; Rosaramicin Propionate; Rosarainicin Sodium Phosphate; Rosaramicin Stearate; Rosoxacin; Roxarsone; Roxithromycin; Sancycline; Sanfetrinem Sodium; Sarmoxicillin; Sarpicillin; Scopafungin; Sisomicin; Sisomicin Sulfate; Sparfloxacin; Spectinomycin Hydrochloride; Spiramycin; Stallimycin Hydroc-hloride; Steffimycin; Streptomycin Sulfate; Streptonicozid; Sulfabenz; Sulfa-benzamide; Sulfacetamide; Sulfacetamide Sodium; Sulfacytine; Sulfadiazine; Sulfadiazine Sodium; Sulfadoxine; Sulfalene; Sulfamerazine; Sulfameter; Sulfamethazine; Sulfamethizole; Sulfamethoxazole; Sulfamonomethoxine; Sulfamoxole; Sulfanilate Zinc; Sulfanitran Sulfasalazine; Sulfasomizole; Sulfathiazole; Sulfazamet; Sulfisoxazole; Sulfisoxazole Acetyl; Sulfisoxazole Diolamine; Sulfomyxin; Sulopenem; Sultamicillin; Suncillin Sodium; Talampicillin Hydrochloride; Teicoplanin; Temafloxacin Hydrochloride; Temocillin; Tetracycline; Tetracycline Hydrochloride; Tetracycline Phosphate Complex; Tetroxoprim; Thiainphenicol; Thiphencillin Potassium; Ticarcillin Cresyl Sodium; Ticarcillin Disodium; Ticarcillin Monosodium; Ticlatone; Tiodonium CWoride; Tobramycin; Tobramycin Sulfate; Tosufloxacin; Trimethoprim; Trimethoprim Sulfate; Trisulfapyrimidines; Troleandomycin; Trospectomycin Sulfate; Tyrothricin; Vancomycin; Vancomycin Hydrochloride; Virginiamycin; te Zorbamycin.

Anivirusna sredstva su spojevi koji sprječavaju infekciju stanica virusima ili replikaciju virusa unutar stanice. Postoje mnogo manje antivirusnih lijekova nego antibakterijskih lijekova jer je proces virusne replikacije blisko vezan s replikacijom DNA unutar stanice domaćina, tako da bi nepsecifična antivirnsa sredstva često bila toksična kod domaćina. Postoje nekoliko stupnjava procesa virsne infekcije koje se mogu blokirati ili inhibirati antivirusnim sredstvima. Ti stupnjevi uključuju spajanje virusa na stanicu domaćina (imunoglobulinom ili vezujućim peptidima), virusa bez omotača (npr. adamantinom), sintezu ili translaciju virusne mRNA (npr. interferonom), replikaciju virusne RNA ili DNA (npr. analozima nukleotida), sarijevanje novih virusnih proteina (npr. inihbitorima proteaze) i zametanje i oslobađanje virusa.

Analozi nukleotida su sinteski spojevi koji su slični nukleotidima ali koji imaju nekompletnu ili abnormalnu deoksiriboznu ili riboznu skupinu. Kad su jedanput analozi nukleotida u stanici, oni su fosforilirani, produciraju trifosfate koji kompetiraju s normalnim nukleotidima za ugradnju u virusnu DNA ili RNA. Kad je jedanput trifosfatni oblik nukleotidnog analoga ugrađen u rastući lanac nukleinske kiseline, uzrokuje ireverzibilo povezivanje s virusnom polimera-zom i stoga uzrokuje terminaciju lanca. Analozi nukleotida uključuju, ali nisu na jinh ograničeni acilovir (koristan za tretman citomegalovirusa), idoksiridin, ribavirin (koristan za tretman respiratornog sincitlanog virusa), dideoksiinozin, dideoksicitidin, te zidovulin (azodiitimidin).

Interferoni su citokini koji se izlučuju iz virusom inficiranih stanica kao i imunih stanica. Interferoni djeluju vezanjem na specifične receptore na stanicu susjednu inficiranoj stanici uzrokujući promjene koje je zaštićuju od infekcije virusom. α- i β-interferon također inducira ekspresiju Klase I i Klase II MHC molekula na površini inficiranih stanica čime je povećano ispoljavanje za prepoznavanje imune stanice domaćina. α- i β-interferoni se mogu dobiti kao rekombinantni oblici i korišteni su za tretman kroničnog hepatitisa B i C infekcije. Pri dozama koje su učinkovite za antivirusnu terapiju, interferon ima ozbiljne nuzefekte kao što je temperatura, slabost i gubitak težine.

Terapija imunoglobulinom je ovdje korištena za previeciju virusne infekcije. Terapija imunoglobulinom za virusne infekcije je različita nego za bakterijske infekcije jer umjesto da je specifična na antigen, imunoglobulinska terapija funkcionira vezivanjem na vanstanični virion i sprječava od napada i ulaska u stanicu koje mogu dobiti virusnu infekciju. Terapija je korisna za prevenciju virusne infekcije u periodu vremena u kojem su antitijela prisuna u domaćinu. Općenito postoje dva tipa imunoglobilinske terapije, normalna imunoglobulinska terapija i hiper-imunoglobulinska terapija. Normalna imunoglobulinska terapija koristi produkte antitijela koji su priprvaljeni iz sakupljenih seruma normalnih donora krvi. Ti sakupljeni produkti imaju niski titar antitijela prema visokog raspona humanih virusa, kao što je hepatitis A, parvovirus, anterovirus (posevno naonati), humani imunoglobuilin za bjesnoću (koristan nakon izlaganja profilaksi subjekta kojeg je ugrizka bijesna životinja) imunoglobulin hepatitisa B (koristna za prevenciju virusa hepatitisa B posebno kod subjekata izloženih virusu), te RSV imunoglobulin (koristan za tretman repsiratornih sincitalnih virusnih infekcija).

Sljedeći tip imunoglobulinske terapije je aktivna imunizacija. To obuhvaća davanje antitijela ili fragmenata antitijela virusnim površinskim proteinima. Dva tipa vakcina koja su na raspolaganju za aktivnu imunizaciju hepatitisom B uključuju iz seruma doobivena antitijela protiv hepatitisa B i rekombiantna antitijela prtov hepatitisa B. Oba su pripravljena iz HBsAg. Antitijela su dana u trima dozama subjektima koji su visoko rizični na infekciju s virrusom hepatitisa B, kao što su zdravstveni radnici, seksulani partneri kroničnih nosača i pomoci.

Stoga, antivirusna sredstva korisna u izumu jesu, ali bez ograničenja, imunoglobulini, amantadin, interferon, analozi nukleozida i inihbitori proteaze. Specifilčni primjeri antivirrusnig sredstava jesu, ali bez ograničenja: Acemannan; Acyclovir; Acyclovir Sodium; Adefovir; Alovudine; Alvircept Sudotox; Amantadine Hydrochloride; Aranotin; Arildone; Atevirdine Mesylate; Avridine; Cidofovir; Cipamfylline; Cytarabine Hydrochloride; Delavirdine Mesylate; Desciclovir; Didanosine; Disoxaril; Edoxudine; Enviradene; Enviroxime; Famciclovir; Famotine Hydrochloride; Fiacitabine; Fialuridine; Fosarilate; Foscamet Sodium; Fosfonet Sodium; Ganciclovir; Ganciclovir Sodium; Idoxuridine; Kethoxal; Lamivudine; Lobucavir; Memotine Hydrochloride; Methisazone; Nevirapine; Pencielovir; Pirodavir; Ribavirin; Rimantadine Hydrochloride; Saquinavir Mesylate; Somantadine Hydro-chloride; Sorivudine; Statolon; Stavudine; Tilorone Hydrochloride; Trifluridine; Valacyclovir; Hidrochloride; Vidarabine; Vidarabine Phosphate; Vidarabine Sodium Phosphate; Viroximin; Zalcibatin;, Zidvovudin; te Zinviroxim.

Sredstva protiv gljivica se ponekad klasificiraju po njihovom mehanizmu djelovanja. Neka antifungalna sredstva djeluju kao inhibitori stanične stjenke, a inhibicijom sintetaze glukoze. Ti uključuju, ali nisu na njih ograničeni, basiungin/ECB. Ostala antifungalna sredstva djeluju destabilizira-njem membranske cjelovitosti. Oni uključuju, ali nisu na njih ograničeni, imidazole, kao što je klotrimazol, sertakonzol, flukonazol, itrakonazol, ketokonazol, mikonazol, te voriconakol, kao i FK 463, amfotericin B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicin, UK 292, butenafin, te terbinafin. Ostala antifungalna sredstva djeluju razbijanjem hitina (npr. hitinaze) ili imunosupresijom (501 cream). Neki primjeri komercijalno pristupačnih sredstava prikazani su na Tablici B.

[image]

Stoga antifungalna sredstva korisna u izumu uključuju, ali nisu na njih ograničeni imidazole, FK 463, amfotericin B, BAY 3 8-9502, MK 99 1, pradimicin, UK 292, butenafin, hitinazu, 501 Cream, Acrisorein; Ambruticin; Amorolfine, Amphotericin B; Azaconazole; Azaserine; Basifumgin; Bifonazole; Biphenamine Hydrochloride; Bispyrithione Magsulfex; Butoconazole Nitrate; Calcium Undecylenate; Candicidin; Carbol-Fuchsin; Chlordantoin; Ciclopirox; Ciclopirox Olamine; Cilofungin; Cisconazole; Clotrimazole; Cuprimyxin; Denofungin; Dipyrithione; Doconazole; Econazole; Econazole Nitrate; Enilconazole; Ethonam Nitrate; Fenticonazole Nitrate; Filipin; Fluconazole; Flucytosine; Fungimycin; Griseofulvin; Hamycin; Isoconazole Itraconazole; Kalaftmgin; Ketoconazole; Lomofumgin; Lydimycin; Mepartricin Miconazole; Miconazole Nitrate; Monensin; Monensin Sodium; Naftifine Hydrochloride; Neomycin Undecylenate; Nifuratel; NifurTnerone; Nitralamine Hydrochloride; Nystatin; Octanoic Acid; Orconazole Nitrate; Oxiconazole Nitrate; Oxifumgin Hydrochloride; Parconazole Hydrochloride; Partricin; Potassium Iodide Proclonol; Pyrithione Zinc; Pyrrolnitrin; Rutamycin; Sanguinarium Chloride Saperconazole; Scopafungin; Selenium Sulfide; Sinefimgin; Sulconazole Nitrate; Terbinafine; Terconazole; Thiram; Ticlatone; Tioconazole; Tolciclate; Tolindate; Tolnaftate; Triacetin; Triafungin; Undecylenic Acid; Viridofulvin; Zinc Undecylenate; te Zinoconazole Hydrochloride.

Imunostimulirajuće nukleinske kiseline se mogu kombinirati s ostalim terapijskim sredstvima kao što su adjuvansi koji povećavaju imuni odgovor. Imunostimulirajuća nukleinska kiselina i drugo terapijski sredstvo se mogu dati istovremeno ili jedna za drugim. Kada se terapijsko srestvo daje istovrmeno mogu biti dani u istoj ili odvojenoj formulacji, ali dani istovremeno. Druga terapijska sredstva se daju jedan za drugim s drugom imunostimulirajućom nukleinskom kiselinom, a kada je davanje drugih terapijskih sredstava i imunostimulirajće nukleinske kiseline privremno odvojeno. Vrijeme između davanja tih spojeva mogu biti minute ili dulje. Ostala terapijska sredstva uključuju ali nisu na njih ograničena adjuvanse, citokine, antitijela, antigene itd.

Imunostimulrajuće nukleinske kiseline su korisne kao adjuvansi za indukciju sistemskog imunog odgovora. Stoga se mogu isporučiti osobi izloženoj antigenu da produciraju ili povećaju imuni odgovor antigena.

Uz imunostimulrajuće nukleinske kiseline, pripravci iz izuma mogu također biti dani s adjuvansima koji nisu nukleinske kiseline. Adjuvans koji nije nukleinska kiselina je bilo koja molekula ili spoj osim imunostimulirajućih nukleinskih kiselina ovdje opisanih, a koje mogu stimulirati humoralni i/ili celularni iimuni odgovor. Adjuvansi koji nisu nukleinske kiseline uključuju, primjerice adjuvans koji stvara depo efekt, imunostimulirajući adjuvans, imunostimulirajući adjuvans koji stvara depo efekt.

Adjuvans koji stvara depo efekt kako je ovdje korišteno može uzrokovati da se antigen polako oslobađa i stoga produžiti izlaganje imunih stanica antigenu. Ta klasa adjuvansa uključuje, ali nije na njih ograničena, alum (npr. aluminijev hidroksid, aluminijev fosfat) ili na emulziji zasnovane formulacije uključujući mineralna ulja, ulja koja nisu mineralna, vodu-u-ulju ili ulje-u-vodi emulzije, ulje-u-vodi emulziju kao što je Seppic ISA serija Montanide adjuvanda (npr. Montanide ISA 720, AirLiquide, Pariz, Francuska); MF-59 (a skvalen-u-vodi emulzija stabilizirana sa Span 85 i Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA; te PROVAX (ulje-u-vodi emulzija koja sadrži stabilizirajući deteđent i sredstvo za stvaranje micela; IDEC, Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA).

Imunostimulirajući adjuvans je adjuvans koji uzrokuje aktivaciju stanica imunog sustava. Može, primjerice u imunom sustavu uzrokovati izlučivanje citokina. Ta klasa adjuvansa uključuje, ali nije na jinh ograničena saponine pročišćene od drva Q. saponaria, kao što je QS21 (glikolipid koji je eluiran u 21. signalu HPLC frakcioniranjem; Aquila Biophannaceuticals, Inc., Worcester, MA); poli[di(karboksilatofenoksi)fosfazene (PCPP polimer; Virus Research Institute, USA); derivati lipopolisaharida kao što je monofosforilni lipid A (MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), muramil dipeptid (MOP; Ribi) te treonil-muramil dipeptide (t-MDP; Ribi); OM-174 (glukozamine disaharid sličan lipidu A; OM Pharma SA, Meyrin, Švicarska); te Leishmania factor produljivanja (pročišćen Leishmania protein; Corixa Corporation, Seattle, WA).

Adjuvanski koji tvore depo efekt i stimuliraju imuni sustav su oni spojevi koji imaju obje gore navedene funkcije. Ta klasa spojeva adjuvansa uključuje ali bez ograničenja ISCOMS (imunostimulrajuće komplekse koji sadrže miješane saponine, lipide i iz virusa dobivene čestice s porama koji mogu biti antigeni; CSL, Melbourne, Australia); SB-AS2 (SmithKline Beecham sustav adjuvansa br. 2 koji je ulje-u-vodi emulzija sadrži MPL i QS21: SmithKline Beecham Biologicals [SBB], Rixensart, Belgija); SB-AS4 (SmithKline Beecham sistem adjuvansa br.4 koji sadrži alum i MPL; SBB, Belgija); neionski blok kopolimeri koji tvore micele kao što je CRL 1005 (oni sadrže linearni lanac hidrofobnih polipropilena okruženih lancima polietilena; Vaxcel, Inc., Norcross, GA); i Syntex Adjuvant Formulation (SAF, ulje-u-vodi emulzija koja sadrži Tween 80 i neionski blok kopolimer, Syntex Chemicals, Inc. Boulder, CO).

Imunostimulirajuće nukleinske kiseline su također korisne kao mukozni adjuvansi. Prethodno je otkriveno da su sistemska i mukosalna imunost inducirani isporukom CpG nukleinskih kiselina u sluznicu. Sistemska imunost inducirana kao odgovor na CpG nukleinske kiseline uključuje humoralno i stanično posredovane odgovore na specifične antigene koji nisu sposbni inducirati sistemsku imunost kada se daju sami mukozno. Nadalje, CpG nukleinskim kiselimama i toksinom kolere (CT, mukozni adjuvans koji inducira odgovor poput Th-2) inuciraju CTL. To je iznenađujuće jer je sistemskom imunizacijom prisutnost antitijela sličnih Th-2 normalno povezana s nedostatkom CTL (Schirmbeck et al., 1995). Zasnovano na ovdje predstavljenim rezultatima, očekuje se da će imunostimulirajuće nukleinske kiseline funkcionirati na sličan način.

Uz to, imunostimulirajuće nukleinske kiseline iduciraju mukozni odgovor u lokalnim (npr plućima) i udaljenom (niži probavni trakt) mukoznim mjestima. Značajne razine IgA antitijela su inducirana na dalekim mjestima u sluznici imunostimulirajućim nukleinskim kiselinama. CT se općenito smatra vrlo učinkovitim mukoznim adjuvansom. Kako je prethodno pokazano (Snider 1995), CT inducira uglavnom IgG1 izotip antitijela koji ukazuju na Th-2 tip odgovora. Nasuprot tome, imunostimulirajuće nukleinske kiseline su više Th1 s uglavnom IgG2 antitielima, posebno nakon pomoći ili kad su dva adjuvnsa kombinirana. Th1 tip antitijela opećnito ima bolju neutralizacijsku sposobnost i nadalje, Th2 odgovor u plućima je vrlo nepoželjan jer je povezan s astmom (Kay, 1996, Hogg, 1997). Stoga se upotrebom imnuostimulirajućih nukleinskih kiselina kao mukoznih adjuvansa postiže ono što drugi mukozni adjuvnasi ne mogu postići. Imunostimulirajuće nukleinske kiseline iz izuma su također korisne kao mukozni adjuvansi za uvođenje sistemskog i mukoznog imunog odgovora.

Mukozni adjuvnasi koji se navode kao mukozni adjuvasi koji nisu nukleinske kiseline, mogu se dati s imunostimulirajućim nukleinskim kiselinama. Mukozni adjuvans koji nije nukleinska kisliena koji se navodi kao mukozni adjuvasi koji nije imunostimulirajuća nukleinske kiselina je onaj koji je sposoban inducirati imuni odgovor kod subjekta kada je dan na površinu sluznice skupa s antigenom. Mukozni adjuvnasi uključuju, ali nisu na njih ogranični: bakterijske toksine npr. toksin kolere (CT), CT derivate ujljučujući ali bez ograničenja, CT B podjedinice (CTB) (Wu et al., 1998, Tochikubo et al., 1998); CTD53 (Val do Asp) (Fontana et al., 19 95); CTK97 (Val do Lys) (Fontana et al., 1995); CTK 104 (Tyr do Lys) (Fontana et al., 1995); CTD53/K63 (Val do Asp, Ser do Lys) (Fontana et al., 1995); CTH54 (Arg do His) (Fontana et al., 1995); CTN 107 (His do Asn) (Fontana et al., 1995); CTE 114 (Ser do Glu) (Fontana et al., 1995); CTE I 12K (Glu do Lys) (Yamamoto et al., 1997a); CTS61F (Ser do Phe) (Yamamoto et al., 1997a, 1997b); CTS106 (Pro do Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995); te CTK63 (Ser do Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995), Zonula occludens toksin, zot, Escherichia coli termolabilni enterotoksin, Labile Toxin (LT), LT derivate ukjljučujući ali bez ograničenja LT B podjedinice (LTB) (Verweij et al., 1998); LT7K (Arg do Lys) (Komase et al., 1998, Douce et al., 1995); LT61F (Ser do Phe) (Komase et al., 1998); LT I 12K (Glu do Lys) (Komase et al., 1998); LT1 18E (Gly do Glu) (Komase et al., 1998); LT146E (Arg do Glu) (Komase et al., 1998); LT I 92G (Arg do Gly) (Komase et al., 1998); LTK63 (Ser do Lys) (Marchetti et al., 1998, Douce et al., 1997, 1998, Di Tommaso et al., 1996); te LTR72 (Ala do Arg) (Giuliani et al., 1998), Pertussis toksin, PT. (Lycke et al., 1992, Spangler BD, 1992, Freytag i Clemments, 1999, Roberts et al., 1995, Wilson et al., 1995) uključujući PT9K/129G (Roberts et al., 1995, Cropley et al., 1995); derivate toksina (vidi dolje) (Holmgren et al., 1993, Verweij et al., 1998, Rappuoli et al., 1995, Freytag i Clements, 1999); derivati lipida A (npr., monofosforil lipid A, MPL) (Sasaki et al., 1998, Vancott et al., 1998; derivati murarnil dipeptida (MDP) (Fukushima et al., 1996, Ogawa et al., 1989, Michalek et al., 1983, Morisaki et al., 1983); bakterijski proteini vanjske membrane (npr. protein A vanjske površine (OspA) lipoprotein od Borrelia burgdorferi, vanjski membranski proteins od Neisseria meningitidis) (Marinaro et al., 1999, Van de Verg et al., 1996); ulje-iu-vvodi emulzije (e.g., MF59) (Barchfield et al., 1999, Versehoor et al., 1999, O'Hagan, 1998); Alurninurn salts (Isaka et al., 1998, 1999); te Saponins (npr. QS21) Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worster, MA) (Sasaki et al., 1998, MacNeal et al., 1998), ISCOMS, MF-59 (skvalen-u-vodi emulzija stabilizirana sa Span 85 i Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA); the Seppic ISA serije Montanide adjuvansa (e.g., Montanide ISA 720; AirLiquide, Paris, France); PROVAX (ulje-u-vodi emulzija koja sadrži stabilizirajući detergent i tvari koje tvore micele, IDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA); Syntext Adjuvant Formulation (SAF; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, CO); poli [di(karboksilatophenoksi)fosfazene (PCPP polimer; Virus Research Institute, USA) i Leishmania factor produljenja (Corixa Corporation, Seattle, WA).

Imuni odgovori se također mogu iducirati ili povećati istovremenim davanjem kolinearnih ekspresijskih citokina (Bueler & Mulligan, 1996; Chow et al., 1997; Geissler et al., 1997; Iwasaki et al., 1997; Kim et al., 1997) ili B-7 kostimulirajuće molekule (Iwasaki et al., 1997; Tsuji et al., 1997) imunostimulirajućim nukleinskim kiselinama. Citokini se mu davati direktno s imunostimulirajućim nukleinskim kiseliama ili mogu biti dani u obliku vektora nukleinske kiseline koji kodira citokin, tako da citokin može biti eksprimiran in vivo . U jednoj cjelini je citokin dan u obliku plazmida ekspresijskog vektora. Termin citokin je ovdje korišten kao generičko ime za raličite skupine topljivih proteina i peptida koji djeluju kao humoralni regulatori pri nano do pikomolarnih koncetracija pri kojima u normalnim ili patološkim uvjetima moduliraju funkcionalnu aktivnost pojedinih stanica i tkiva. Ti proteini također direktno posreduju u interakciji stanica i reguliraju procese koji se odvijaju u vanstaničnoj okolini. Primjeri citokina uključuju, ali nisu na njih ograničeni IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL12, IL-15, IL-18, stimulirajući faktor kolonija granulocitnih makrofaga (GM-CSF), stimulirajući faktor kolonija granulocita (G-CSF), interferon-γ (γ-IFN), IFN-α, faktor tumorne nekroze (TNF), TGF-β, FLT-3 ligand, te CD40 ligand.

Citokini imaju ulogu u usmjeravanju odgovora T-stanice. Položne (CD4+) T-stanice upravljaju imunim odgovorm kod sisavaca produkcijom topljivih faktora koji djeluju na druge stanice imunog sustava, uključujući T-stanice. Najzrelije CD4+ T pomoćne stanice mogu eksprimirati jedan od dva citokinska profila; Th1 ili Th2. Th1 podgrupa potiče hipersenzitivnost odgođe-nog tipa, stanicama posredovanu imunost, te promjenu klase imunoglobulina u IgG2a. Podgrupa Th2 inducira humoralnu imunosti aktiviranjem B-stanica, pokretanjem podukcije antitijela i indukcijom klase koja se mijanja u IgG1 i IgE. U nekim cjelinama preferirano je da je citokin Th1 citokin.

Nukleinske kiseline su također korisne u usmjeravajnu imunog odgovora iz Th2 u Th1 imuni odgovor. Usmjeravanje imunog odgovora iz Th2 u Th1 imuni odgovor se može utvrditi mjerenjem razine citokina produciranog kao odgovor na nukleinsku kiselinu (npr. inducijom monocitnih stanica i ostalih stanica da produciraju Th1 citokine, uključujući IL-12, IFN-γ i GM-CSF). Usmjeravanje ili rebalans imunog odgovora s Th2 u Th1 odgovor je posebno korisan za tretman ili prevenciju astme. Primjerice, učinkovita količina za tretman astme može biti količina korisna za usmjeranjanje Th2 tipa imunog odgovora koji je povezan s asmom na Th1 tip odgovora. Th2 citokini, posebno IL-4 i IL-5 su podignuti u dišnim putevima subjekata koji imaju astmu. Ti citokini pokreću važne aspekte astmatičnog upalnog odgovora uključujući primjenu IgE izotipa, eozinofiulnu kemotaksiju i aktivaciju rasta mast stanica. Th1 citokini, posebno IFN-γ i IL-12 mogu spriječiti tvorbu Th2 klonova i produkciju Th2 citokina. Imunostimulirajuće nukleinske kiseline iz izuma uzrokuju povećanje Th1 citokina što pomaže rebalansu imunog sustava, prevenciju smanjivanja nepovoljnih efekata povezanih s uglavnom Th2 imunom odgovorom.

Nukleinske kiseline su također korisne u poboljšanju preživljavanja, diferencijacije, aktivacije i sazrijevanja dendričnih stanica. Imunostimulirajuće nukleinske kiseline imaju jedinstvenu sposobnost da pokrenu stanično preživljavanje, diferencijaciju, aktivaciju i sazrijevanje dendričnih stanica. Prekursori dendrične stanice izolirani su iz krvi sortiranjem imunomagnetskih stanica razvijaju morfoliške i funkcionalne karakteristike dendričnih stanica tijekom dva dana inkubacije s GM-CSF. Bez GM-CSF te stanice podliježu aptozi. Imunostimulirajuće nukleinske kiseline su bolje od GM-SCF za poboljšanje preživljavanja i diferencijacije dendričnih stanica (MHC II ekspresija,veličina stanice, granuliranost). Imunostimulirajuće nukleinske kiseline također induciraju sazrijevanje dendričninh stanica. Kako dendrične stanice povezuju urođeni i stečeni imuni sustav, ispoljavanjem antigena kao i njihovom ekspresijom prepoznavajućih receptora koji detektiraju mikrobne molekule kao što je LPS i njihova lokalna okolina, sposobnost za aktiviranje dendričnih stanica s imunostimulirajućim nukleinskim kiselinama podupire upotrebu tih imunostimulirajućih nukleinskih kiselina za strategije in vivo i ex vivo imunoterapiju protiv poremećaja kao što je karcinom i alergijske ili infektivne bolesti. Imunostimulirajuće nukleinske kiseline također povećavaju litičku aktivnsot prirodnih stanica ubojica i o antitijelima ovisnu staničnu citotoksičnost (ADCC). ADCC se može izvesti upotrebom imunostimulirajuće nukleinske kiseline u kombinaciji s antitijelom koji je specifičan na ciljnu stanicu, kao što je stanica karcinoma. Kada je imunostimulirajuća nukleinska kiselina dana subjetu skupa s antitijelom, subjektov imuni sustav je induciran da uboje stniacu tumora. Antitijela korisna u postupku ADCC uključuju antitijela koji stupaju u interakciju sa stanicama tijela. Mnoga takva antitijela specifična na ciljane stanične su opisana u struci i mnogi su komercijalno pristupačni. Primjeri tih antitijela su prikazani dolje među popisom imunoterapije karcinoma.

Imunostimulirajuće nukleinske kiseline se mogu također dati skupa s antikancerogenom terapijom. Antikancerogene terapije uključuju lijekove protiv karcinoma, zračenje i kiruške postupke. Kako je ovdje korišteno "lijek protiv karcinoma" odnosi se na sredstvo koje je dano subjeku za svrhe tretmana karcinoma. Kako je ovdje korišteno "tretirani karcinom" uključuje prevenciju razvitka karcinoma, smanjivanje simtoma karcinoma i/ili inhibiciju rasta utvrđenog karcinoma. U drugim aspektima, lijek protiv karcinoma je dan subjektu koje je rizičan na razvitak karcinoma, a za svrhe smanjivanja rizika od razvijanja karcinoma. Ovdje su opisani različiti tipovi lijekova za tretman karcinoma. Za svrhe tih specifikacija, lijekovi protiv karcinoma su klasificirani kao kemoterapijska sredstva, imunterapijska sredstva, vakcine protiv karcinoma, hormonske terapije i modifikatore biološkog odgovora.

Kako je ovdje korišteno "lijek protiv karcinoma" odnosi se na sredstvo koje je dano subjektu za svrhe tretmana karcinoma. Kako je ovdje korišteno "tretirani karcinom" uključuje prevenciju razvitka karcinoma, smanjivanje simptoma karcinoma i/ili inhibiciju rasta utvrđenog karcinoma. U drugim aspektima, lijek protiv karcinoma je dan subjektu koje je rizičan na razvitak karcinoma, a za svrhe smanjivanja rizika od razvijanja karcinoma. Ovdje su pisani različiti tipovi lijekova za tretman karcinoma. Za svrhe tih specifikacija, lijkovi protiv karcinoma su klasificirani kao kemoterapijska sredstva, imuno-terapisjka sredstva, vakcine protiv karcinoma, hormonske terapije i modifikatore biološkog odgovora. Uz to, namjera je da metode iz izuma obuhvate upotrebu više od jednog lijeka protiv karcinoma skupa s imuno-stimulirajućim nukleinskim kiselinama. Kao primjer, imunostimulirajuće nukleinske kiseline se mogu dati s kemoterapijskim sredstvom i imunoterapij-skih sredstvom. Alternativno lijek protiv karcinoma obuhvaća imunoterapijsko sredstvo i vakcinu protiv karcinoma, ili kemoterapijsko sredstvo i vakcinu protiv karcinoma, ili kemoterapijsko sredstvo, imunoterapijsko sredstvo i vakcinu protiv karcinoma, svi dani jednom subjektu za svrhe tretmana subjekta koji ima karcinom ili je rizičan na razvitak karcinoma.

Lijekovi protiv karcinoma djeluju na različite načine. Neki lijekovi protiv karcinoma ciljaju fiziološki mehnazim koji je specifičan tumorskim stanicama. Primjeri uključuju ciljanje specifičnih gena i njihovih genskih produkata (t.j. prvenstveno proteina) koji su mutirani u karcinomu. Takvi geni uključuju ali nisu na njih ograničeni onkogene (npr. Ras, Her2, bcl-2), gene supresore tumora (npr. EGF, p53, Rb) i one koji ciljaju stanični ciklus (npr. CDK4, p21, telomeraza). Lijekovi protiv karcinoma mogu alternativno ciljati put prijenosa signala i molekulski mehanizam koje je primjenjen u stanicama karcinoma. Ciljanje stanica karcinoma preko epitopa eksprimiranih na njihovoj provšini i završeno upotrebom monoklonalnih antitijela. Taj kasniji tip lijeka protiv karcinoma je općenito preferiran ovdje za imunoterapiju.

Ostali lijekovi protiv karcinoma ciljaju stanice koje nisu stanice karcinoma. Primejrice, neki lijekovi potaknu imuni sustav da napadne stanice tumora (t.j. vakcine protiv karcinoma). Drugi lijekovi koji se zovu inhibitori angiogeneze, djeluju napadom na snadjevanje s krvi u čvrstim tumorima. Kako je većina malignih karcinoma sposobna da metastazira (t.j. postoji u primarnom mjestu tumora i započinje u daljnjem tkivu i time tvori sekundarne tumore), lijekovi koji spriječe tu metastazu su također korisni u tretmannu karcinoma. Posrednici angiogeneze uključuju FGF, VEGF, angiopoietine, angiostatin, endostatin, TNF-α, TNP-470, trombospondin-1, faktor leukocita 4, CAI, te neki broj protiena iz obitelji integrina. Jedna kategorija tog tipa lijekova je inhibitor metraloproteinaze koji inhibira enzime korištene od stanica karcinoma da postoje kao primarni tumotska mjesta i unose u drugo tkivo.

Neke stanice karcinoma imaju antigenska svojstva pa mogu biti ciljani imunim sustavom. U jednom aspektu, kombinirano davanje imunostimulira-jućih nukleinskih kiselina u lijekova protiv karcinoma, posebno onih koji su klasificirani kao imunoterapijska sredstva protiv karcinoma, je korisno za stimuliranje specifičnog imunog odgovora protiv antigena karcinoma. "Antigen karcinoma" kako je ovdje korišten je spoj kao što je peptid, povezan s tumorom ili površinom stanice karcinoma i koji je sposoban izazvati imuni odgovor kada je eksprimiran na površini antigena koji ispoljava stanicu u konekstu MHC molekule. Antigen karcinoma, kao što su oni prikazani u vakcinama protiv karcinoma ili oni koji se koriste za prirpavu imunoterapije protiv karcinoma, se mogu pripraviti iz sirovih staničnih ekstrakta karcinoma kao što je opisno u Cohen et al., 1994, Cancer Research, 54:1055, ili djelomično pročišćenih antigena korištenjem rekombinantne tehnologije ili de novo sintezom poznatih antigena. Antigeni karcinoma se mogu koristiti u obliku imunogenih dijelova određenih antigena ili u nekim slučajevima se može kao antigen koristiti cijela stanica ili tumorna masa. Takvi antigeni se mogu izolirati ili pripraviti rekombinantno ili bilo kojim načinom poznati u struci.

Teorija imunog nadziranja koja začinje funkciju imunog sustava je da se detektiraju i eliminiraju neoplastične stanice prije oblika tumora. Osnovni princip te teorije je da su stanice karcinoma antigenske različite od normlanih stanica i stoga izazivaju imunu reakciju koja je slična onima koje uzrokuju odbijanje imunološki inkompatibilnih alografta. Istraživanja su potvrdila da se tumori razlikuju kvalitativno ili kvantiativno prema ekspresiji njihovog antigena. Primjerice, "tumorno specifični antigeni" su antigeni koji su specifično povezani s tumorskim stanicama ali nisu normlne stanice. Primjer tumorski specifičnih antigena su virusni antigeni u tumorima iduciranim virusima DNA ili RNA. "S tumorom povezani" antigeni predstavljaju tumorske stanice i normalne stanice ali su prisutni u različitm količinama ili razičitim oblicima u tumorskim stanicama. Primjeri takvih antigena su onkofetalni antigeni (npr. karcionembrionski antigeni), diferiencijski antigeni (npr. T i Tn antigeni), te onkogeni produkti (npr. HER/neu).

Različiti tipovi stanica koje mogu ubiti tumorske ciljeve in vitro i in vivo su: prirodne stanice ubojice (NK stanice), citolitički T-mfociti (CTL), limfokinom aktivirane stanice ubojice (LK), te aktivirani makrofagi. NK stanice mogu ubiti stanice tumora bez da su prethodno senzitizirane na speicifični antigen, te aktivnosti ne zahtjeva prisutnost klase I antigena kodiranih s glavnim kompeksom hisotkompatibilnosti (MHC) ili ciljnih stanica. Mišljeno je da NK stanice sudjeluju u kontroli nascentnih tumora i u kontroli rasta metastaze. Za razliku od NK stanicaa, CTL mogu ubiti tumorske stanice samo nakon što su senzitirane na tumorske antigene i kada je ciljni antigen eksprimiran na tumorskim stanicama koje također eksprimiraju MHC klasu I. Mišljeno je da CTL budu stanice efektori u odbacivanju transplantiranih tumora uzrokovanih virusima DNA. LAK stanice su podgrupa nukleukocita koji su različiti od NK i CTL populacije. Aktivirani makrofagi mogu ubiti stanice tumora na način koji nije ovisan o antigenu niti je MHC djeluje restriktivno, a kad su jednaput aktivirani. Mišljeno je da aktivirani makrofagi smanje rast tumora u koje se infiltriraju. In vitro testovi su pokazali druge imune mehnazime kao što je o antitijelu ovisne stanicom posredovane citotoksilne reakcije i liza pomoću antitijela plus komplementa. Međutim, ti imunoefektorski mehanizmi su mišljeni da budu manje važni in vivo nego funkcija NK, CTL, LAK i makrofaga in vivo (za pregledni rad vidi Piessens W. F. i Danid. J., "Tumor Immunology" u: Scientific American Meidicine, vol. 2, Scientific American Books, N. Y. str. 1-13, 1996.

Cilj imunoterapije je da poveća pacijentov imuni odgovor na ustanovljeni tumor. Jedna metoda imunoterapije uključuje upotrebu adjuvnasa. Adjuvans se izvodi iz mikroorgnizama kao što je bacillus Callmette-Guerin, poveća imuni odgovor i poveća otpornost na tumore kod životinja.

Imunoterapijska sredstva su lijekovi koji se izvode iz antitijela ili fragmenata antitijela koji se specifično vežu ili reorganiziranju antigen karcinoma. Kako je ovdje korišteno, antigen karcinoma je prema široj definiciji antigeni koji eksprimira stanica karcinoma. Prefeirnao stanica karcinoma eksprimira antigen na površini stanice. Prefriranije je da je antigen onaj koji nije eksprimiran od normalnih stanica, ili barem nije eksprimiran na istoj razini kao u stanicama karcinoma. Na antitijelu zasnovana terapija može djelovati vezivanjem na staničnu površinu stanice karcinoma i stoga stimulirati endogeni imuni sustav da napadne stanicu karicnoma. Drugi način na koji djeluje na antitijelu zasnovana terapija je isporuka sustava za specifične ciljane toksične tvari u stanice karcinoma. Antitijela su obično povezana s toksinima kao što je ricin (iz sjemenki ricinusa), kaliheamicin i majtansinoidi, do radioaktivnih izotopa kao što je jod-131 i itrij-90, do kemterapijskih sredstava (kako je ovdje opisano) ili na modifikatore biološkog odgovora. Na taj načn, toksične tvari se mogu sakupiti u regijama karcinoma i nespecifična toksičnost na normalne stanice može biti svedena na najmanju mjeru. Uz upotrebu antitijela koja su specifilčna na antigen karcinoma, antitijela koja se vežu na vaskulature kao što su ona koja se vezuju na endotelne stanice su također korisni u izumu. To je zbog toga što je općenito preživljavanje čvrstih tumora ovisno i novonastalim krvnim sudovima pa je većina tumora sposobna ojačati i stimulirati rast novih krvnih sudova. Kao rezultat, jedna strategija od mnogih lijekova protiv karcinoma je da napradne krvne sudove koji hrane tumor i/ili vezna tikva (ili stroma) koji podupiru krvne sudove.

Upotreba imunostimulirajućih sredstava kao što su monoklonalna antitijela su sposobna povećati dugotrajno preživljavanje preko brojnih mehanziama uključujući značajno povećanje ADCC (kako je gore diskutirano), aktivaciju stanica prirodnih ubojica (NK) i povećanje razine ITNα. Kada se nukleinske kiseline koriste u kombinaciji s monoklonalnim antitijelima, služe za smanjivanje doze antitijela potrebnih da se postigne biološki rezultat.

Primjeri imunoterapije karicnoma koji su sada korišteni ili koji su razvijeni su navedeni u Tabllici C.

Tablica C

[image] [image] [image]

Sljedeći tip kemoterapijskih sredstava koji se mogu koristiti prema izumu uključuju Aminoglutethimide, Asparaginase, Busulfan, Carboplatin, Chlorombucil, Cytarabine HCI, Dactinomycin, Daunorubicin HCI, natrijev Estramustine fosfat, Etoposide (VP 16-213), Floxuridine, Fluorouracil (5-FU), Flutamide, Hydroxyurea (hidroksikarbamid), Ifosfamide, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b, Leuprolide acetat (analog LHRH faktora oslobađanja), Lomustine (CCNTJ), Mechlorethamine HCI (dušikov mustard), Mercaptopurine, Mesna, Mitotane (o.p'-DDD), Mitoxantrone HCI, Octreotide, Plicarnycin, Procarbazine HCI, Streptozocin, Tamoxifen citrate, Thioguanine, Thiotepa, Vinblastine sulfate, Amsacrine (m-AMSA), Azacitidine, Erthropoietin, Hexamethyl-melarnine (HMM), Interleukin 2, Mitoguazone (metil-GAG; metilni glikosak bis-gvanilhidroazon; MGBG), Pentostatin (2'deooksikofomicin), Semustine (metil-CCNTJ), Teniposide (VM-26) te Vindesine sulfat.

Namjera je da vakcine protiv karcinoma stimuliraju endogeni imuni odgovor protiv stanica karcinoma. Danas proizvedene vakcine uglavnom aktiviraju humoralni imunosustav (t.j. o antitijelu ovisan imuni odgovor). Ostale vakcine koje se danas razvijaju su usmjerene na aktiviranje imunog odgovora posredovanog stanicom, uključujući citotoksične T-limfocite koji su sposobni ubiti tumorske stanice. Vakcine protiv karcinoma općenito pojačavaju ispoljavanje antigena karcinoma u stanicama koje prezentiraju antigen (npr. makrofagi i dendrične stanice) i/ili druge stanice imunog sustava kao što su T-stanice, B-stanice i NK stanice.

Mada vakcine protiv karcinoma mogu imati nekoliko oblika, kao što je diskutiorano infra, njihova svrha je da isporuče antigene karcinoma i/ili s karcinomom povezane antigene do stanica koje prezentiraju antigen (APC) da bi olakšale endogeno djelovanje takvih antigena pomoću APC i konačno ispoljavanje antigena na površini stanice u kontekstu MHC klase I molekula. Jedan oblik vakcine protiv karcinoma je vakcina cijele stanice koja je pripravljena od stanica karcinoma koje su uklonjene iz subjeta, tretirane ex vivo i zatim ponovo unešene kao cijele stanice u subjeta. Lizati tumorskih stanica se također mogu koristiti kao vakcine protiv karcinoma da se izazove imuni odgovor. Drugi oblik vakcine protiv karcinoma je peptidna vakcina koja koristi na karcinom specifične s karcinomom povezane male proteine za aktivaciju T-stanica. Proteini povezani s karcinomom su proteini koji nisu antigeni). Međutim, ekspresija s karcinomom povezanih antigenima je općenito usklađeno povišena s karcinomima određenog tipa. Sljedeći oblik vakcine protiv karcinoma je vakcina dendričnih stanica koje uključuju cijele dendrične stanice koje su in vitro izložene antigenu karcinoma ili antigenu povezanom s karcinomom. Lizati ili membranske frakcije dendričnih stanica mogu također biti korištene kao vakcine protiv karcinoma. Vakcine dendričnih stanica su sposobne aktivirati izravno stanice koje ispoljavaju antigen. Ostale vakcine protiv karcinoma uključuju gangliozidne vakcine, vakcine s proteinom nakon toplotnog šoka, virusne i bakterijske vakcine i vakcine nukleinske kiseline.

Upotreba imunostimulirajućih nukleinskih kiselina skupa s vakcinama protiv karcinoma dovodi do poboljšanog na antigen specifičnog humoralno i stanično posredovanog imunog odgovora, a uz aktivaciju NK stanica i endogenih dendrilčnih stanica i povećanje razine IFNα. To povećanje dozvoljava da se vakcina koristi sa smanjenom dozom antigena, a čime se postiže isti ulčinak. U nekim slučajevima vakcine protiv karcinoma se mogu koristiti skupa s adjuvansom kao što su oni gore opisane.

Kako je ovdje korišteno termini "antigen karcinoma" i "antigen tumora" se koriste alternativno i odnose se na antigene koji su različlito ekprimirani od stanica karcinoma i stoga mogu biti korišteni da bi se ciljale stanice karcinoma. Antigeni karcinoma su antigeni koji mogu stimulirati imune odgovore specifične na tumor. Neki od tih antigena su kodirani, mada ne i obavezno eksprimirani u normalnim stanicama. Ti antigeni se mogu karakterizirati kao oni koji su normalno tihi (t.j. nisu eksprimirani) u normalnim stanicama, oni koji su eksprimirani samo u nekim stupnjevima diferencijacije i oni koji su privremeno eksprimirani kao što su embrionalni ili fetalni antigeni. Ostali antigeni karcinoma su kodirani mutantnim staničnim genima, kao što su onkogeni (npr. aktivirani ras onkigeni), geni supresori (npr. mutant p53), fuzijski proteini nastali iz internih delecija ili kromosomskih translacija. Drugi antigeni karcioma se mogu kodirati virusnim genima kao oni nošeni na RNA i DNA tumorskim virusima.

Ostale vakcine uzimaju oblik dendričnih stanica koje su izložene antigenima karcinoma in vitro, imaju procesuirane antigene i sposbni su eksprimirati antigene na njihovoj staničnoj provšini u kontkstu MHC molekula za efektivno ispoljavanje antigena na ostale stanice imunog sustava.

Imunostimulirajuće nukleinske kiseline su u jednom aspektu izuma korištene skupa s vakcinama protiv karcinoma koje su zasnovane na dendričnim stanicama. Dendrična stanica je profesionalna stanica koja ispoljava antigen. Dendrične stanice tvore vezu između urođenog i stečenog imunog sustava, a ispoljavanjem antigena i putem njihove ekspresije receptora koji prepoznaju oblik koji detektira mikrobnu molekulu kao što je LPS i lokalnom okruženju. Dendrične stanice učinkovito unošenjem procesuiraju i ispoljavaju topljive specifične antigene kojima su izloženi. Proces unošenja i ispoljavanja antigena uzrokuje brzo povećanje ekspresije glavnoog histokompatibilnog kompeksa (MHC) i kostimuliranje molekule, produkciju citokina i migraciju prema limfatičnim organzima u kojima se vjeruje da su obuhvaćeni u aktivaciji T-stanice.

Tablica D nabraja različite vakcine protiv karcinoma koji su sada koriste ili su u razvoju.

Tablica D

[image]

Kako je ovdje korišteno, kempterapijska sredstva obuhvaćaju sve ostale oblike lijekova protiv karcinoma koji ne spadaju u kategoriju imunoterapijskih sredstava ili vakcina protiv karcinoma. Kempterapijska sredstva, kako je ovdje korišteno, obuhvaćaju kemijska i biološka sredstva. Funkcija tih sredstava je da inihbiraju staničnu aktivnost o kojoj ovisi preživljavanje stanice karcinoma. Kategorije kemoterapeutika uključuju alkilirajuća ili alkoksirajuća sredstva, antimetabolite, hormone i analoge hormona, te razne antineoplastične lijekove. Većina, ako ne i sva ta sredstva su direktno toksična za stanice karicnoma i ne trebaju imunu stimulaciju. Davanje kombinacije kemoterapeutika i imunostimulirajućih nukleinskih kiselina povećava maksimalnu tolerarianu dozu kemoterapije.

Sredstva za kemoterapiju koja su sada u razvoju ili u upotrebi u kkliničkim slučajevima prikazani su na Tablici E.

Tablica E

[image] [image] [image]

U jednoj cjelini metode iz izuma koriste imunostimulirajuće nukleinske kiseine kao zamjenu za IFNα terapiji u tretmanu karcinoma. Danas se u nekim protokolima tretmana poziva na upotebu IFNα. Kako je IFNα�produciran nakon davanja nekin imunostimulirajućih nukleinskih kiselina, te nukleinske kiseline se mogu koristiti za generiranje endogenog IFNα.

Izum također uključuje metode indukcije na antigen nespecifične aktivancije urođenog imuniteta i široki spektar otpora prema infekcijama korištenjem imunostimulirajućih nukleinskih kiselina. Termin antigen nepspecifična aktivancija urođenog imuniteta kako je ovdje korišten odnosi se na aktivaciju imunih stanica koje nisu B-stanice i primjerice mogu uključivati aktivaciju NK stanica, T-stanica ili ostalih imunih stanica koje daju odgovor neovisan o antigenu ili nekim kombinacijama tih stanica. Široki spektar otpora na infekcije je induciran jer su imune stanice u aktivnom obliku i začete su da odgovore bilo kojem invazivnom spoju ili mikroorganzimu. Stanice ne moraju biti specifično začete protiv određenog antigena. To je posebno korisno u biološkom ratovanju i ostalim gore opisanim uvjetima, kao što je kod putnika.

Stimulacjski indeks odeđene imunostimulirajuće nukleinske kiseline se može testirati u različitim testovima imunosti stanice. Preferirano stimulacijski indeks imunostimulirajuće nukleinske kiseline prema proliferaciji B-stanici jeste barem oko 5, preferirano barem oko 10, preferiranije barem oko 15 i najpreferiranije barem oko 20, a kako je određeno ugradnjom 3H uridina u B staničnu kulturu glodavca, kojoj je dodano 20 μM nukleinske kiseline kroz 20h pri 37 _C i pulsirano je s 1 μCi 3H uridina, sakupljena i brojana 4 h nakon, a kako je opisano detaljno u PCT Published Patent Appliations PCT/US95/01570 (WO 96/02555) i PCT/US97/19791 (WO 98/18810) prioriteta prema U.S. Seriskim br. 08/386,063 i 08/960,744 prijavljeno 7. veljače 1995 i 30. listopada 1997. Za upotrebu in vivo, primjerie, važno je da su imunostimulirajuće nukleinske kiseline sposobne učinkovito inducirati imuni odgovor kao što je, primjerice produkcija antitijela.

Imunostimulirajuće nukleinske kiseline su učinkovite u veterbatama koji nisu glodavci. Različite imunostimulrajuće nukleinske kiseline mogu uzrokovati optimalnu imunu stimulaciju ovisno o tipu subjekta i sekvenciji imunostimulirajuće nukleinske kiseline. Glodavci, međutim, odgovaraju različito na nukleinske kiseline. Kako je ovdje pokazano, imunostimulirajuće nukleinske kiseline koje uzrokuju optimalnu simulaciju kod ljudiopćenito ne uzrokuju optimalnu stimulaciju kod miša i obrnuto. Imunostimulirajuća nukleinska kiselina koja uzrokuje optimalnu stimulaciju kod ljudi često, međutim, uzrokuje optimalnu stimulaciju kod ostalih životinja kao što su krave, konji, ovce itd. Stručnjak može identificirati optimalne sekvencije nukleinskih kiselina korisnih za određenu vrstu od interesa, korištenjem ovdje opisanih rutinskih testova i/ili poznatih testova u struci, a korištenjem ovdje prikazanih uputa.

Imunostimulirajuće nukleinske kiseline se mogu izravno dati subjektu ili mogu biti dane skupa s kompleksom za isporuku nukleinske kiseline. Kompleks za isporuku nukleinske kiseline će značiti molekulu nukleinske kiseline povezane s (npr ionski ili kovalentno i kapsulirano unutar) sustavom za ciljanje (npr. molekula koja rezultira većim afinitetom vezanja na ciljane stanice npr. površinu B-stanice i/ili povećanim prihvatom od ciljanih stanica). Primjeri kompelksa za isporuku nukleinske kiseline uključuju nukleinske kiseline povezane sa sterolom (npr. kolesterolom), lipidom (npr. kationski lipid, virosom ili liposomom) ili specifično sredstvo za vezivanje na ciljanu stanicu (npr. ligand prepoznat od specifilčnog receptora ciljane stanice). Preferirano kompleksi mogu biti dovoljno stabilni in vivo da spriječe značajno kidanje veze prije prihvata od ciljane stanice. Mešutim, kompleks mora biti takav da se može cijepati pod odgovarajućim uvjetima unutar stanice tako da se nukleinska kiselina oslobađa u funkcionalnom obliku.

Opisani su vehikuli za isporuku ili naprave za isporuku antigena i nukleinskih kiselina na površinu. Imunostimulirajuća nukleinska kkselina i/ili antigen i/ili ostali terapeutici se mogu dati sami (npr u fiziološkoj otopini ili puferu) upotrebom vehikula poznatih u struci. Primjerice opisani su sljedeći vehikuli za isporuku: Cochleates (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); Emulsomes (Vancott et al., 1998, Lowell et al. 1997); ISCOMs (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et., 1998, Morein et al., 1999); Liposomes (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); živi bakterijski vektori (e.g., Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatte-guerin, Shigella, Lactobacillus) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); živi virusni vektori (e.g., Vaccinia, adenovirus, Herpes Simplex) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); Microspheres (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); vakcine nukleinske kiseline (Fynan et al., 1993, Kuklin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997); Polymers (e.g. karboksimetilceluloza, kitosan) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); polimerni prsteni (Wyatt et al., 1998); proteosomi (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); natrijev fluorid (Hashi et al., 1998); transgenične biljke (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); virosomi (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); čestice poput virusa (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998). Ostali vehikyuli za isporuku su poznati u struci i neki dodatni primjeri prikazani su ispod u diskusiji o vektorima.

Termin učinkovita količina imunostimulirajuće nukleinske kiseline odnosi se na količinu neophodnu ili dovoljnu da se postigne željeni biološki učinak. Primjerice, učinkovita količina imunostimulirajuće nukleinske kiseline za indukciju mukoznog imuniteta je količina neophodna da uzrokuje razvitak IgA kao odgovor na antigen nakon izlaganja antigenu, dok je ta količina potrebna za indukciju sistemske imunosti uporavo količina neophodna da uzrokuje razvitak IgG kao odgovor na antigen nakon izlaganja antigenu. U kombinaciji s ovim ovdje prikazanim, izborom među raznim aktivnim spojevima, te ovisno o faktorima za procjenu kao što je mogućnost, relativna bioraspoloživost, tjelesna težina pacijenta, ozbiljnost nepovoljnih nuzefekata i preferirani načini davanja, te efektivni profilaktički ili terapijski režim tretman, se može planirati koja doza ne uzrokuje znatnu toksičnost a ipak je efektivna u tretmanu određene bolesti. Učinkovita količina za određenu primjenu se može mijenjati ovisno o faktorima kao što je bolest i uvjeti koji se tretiraju, o datoj imunostimulirajućoj nukleinskoj kiselina, o antigenu, o veličini subjekta ili ozbiljnosti bolesti ili uvjeta. Stručnjak u području može empirijski odrediti učinkovitu količinu određene imunostimulirajuće nukleinske kiseline i/ili antigen i/ili drugog terapijskog sredstva bez nepotrebnog eksperimentiranja.

Doze spojeva subjektima za mukoznu ili lokalnu isporuku su u rasponu od oko 0.1 μg do 10 mg po davanju, a koja ovisi o aplikaciji koja može biti dana dnevno, tjedno ili mjesečno te u drugim rasponima vremena. Tipičnije mukozne ili tipične doze su u rasponu od oko 10 μg do 5 mg po davanju, a najtipičnije od oko 100 μg do 1 mg s 2-4 davanja između kojih prođu dani ili tjedni. Tipičnije, doza imunostimulnta je u rasponu od 1 μg do 10 mg po davanju, a najtipičnije 10 μg do 1 mg uz dnevno ili tjedno davanje. Doze spojeva ovdje opisane za parenteralno davanje za svrhe indukcije na antigen specifičnog imunog odgovora, pri čemu su spojevi izporučeni s antigenom ali ne drugim terapijskim sredstvom su tipično 5 do 10000 puta više od učinkovite mukozne doze za adjuvans vakcine ili imunostimulirajućom aplikacijom, tipičnije 10 do 1000 puta više, a najtipičnije 20 do 100 puta više. Doze ovdje opisanih spojeva za parenteralnu isporuku za svrhe indukcije urođenog imunog odgovora ili za povećanje ADCC ili za indukciju na antigen specifičnog odgovora, a kada su imunistimulirajuće nukleinske kiseline dane u kombinaciji s drugim terapijskim sredstvima ili u specijaliziranim vehikulima za isporuku, su tipično u rasponu od oko 0.1 μg do 10 mg po davanju, koji ovisi o toma da li se aplikacija daje dnevno, tjedno ili mjesečno ili u nekim drugim vremenskim rasponima između ovih. Tipičnije se parenterlane doze za te svrhe kreću u rasponu od oko 10 μg do 5 mg po davanju, a najtipičnije od oko 100 μg do 1 mg s 2-4 davanja odijeljena danima ili tjednima. U nekim cjelinama, međutim, parenteralne doze se za te svrhe mogu koristiti u rasponu od 5 do 10000 puta veće nego gore opisane tipične doze.

Za bilo koji spoj ovdje opisan, terapijski učinkovita količina može biti početno određena za životinjske modele. Terapijski učinkovita doza može također biti određena prema podatke za CpG oligonukleotide kod ljudi koji su testirani na ljudima (klinička istraživanja na ljudima su započela) i za spojeve koji su poznati da imaju slične farmakološke aktivnosti, kao što su ostali mukozni adjuvansi, npr. LT i ostali antigeni za svrhe vakcinacije, a za mukozno ili lokalno davanje. Za parenteralno davanje su potrebne visoke doze. Primjenjena doza može biti podešena na osnovi bioraspoloživosti i potentnosti danog spoja. Podešavanje doze da se postigne maksimalne učinkovitost je zasnovana na gore opisanim metodama i ostalim metodama dobro poznatim u području, a što je unutar sposobnosti običnog stručnjaka.

Formulacije iz izuma su dane u farmaceutski prihvatljivim otopinama koje rutinski mogu sadržavati farmaceutski prihvatljve koncentracije soli, sredstva za puferiranje, prezervative, kompatibilne nosača, adjuvanse i mogu biti drugi terapijski sastojci.

Za upotrebu u terapiji, učinkovita količina imunostimulirajuće nukleinske kiseline može biti dana subjektu na bilo koji način koji ispručuje nukleinsku kiselinu na željenu površinu, npr. mukozno, sistemski. Davanje farmaceutskog pripravka iz ovog izuma može se izvesti na bilo koji način poznat stučnjacima. Preferirani načini davanja uključuju, ali nisu na njih ograničeni, parenteralno, intramuskularno, intranazalno, intratrahealno, inhalacijom, okularno, vaginalno i rektalno.

Za oralno davanje spojevi (npr. imunostimulirajuće nukleinske kiseline, antigeni i ostala terapijska sredstva) mogu biti lako formulirani spajanjem aktivnog spoja (spojeva) s farmaceutski prihvatljivim nosačima poznatim u struci. Takvi nosači omogućuju spojevima iz izuma da se formuliraju kao tablete, pilule, dražeje, kapsule, tekućine, gelovi, sirupi, smjese, suspenzije i slično, a za oralnu razgradnju u tretiranom subjektu. Farmaceutski pripravci za oralno davanje se mogu dobiti kao čvrsti ekcipijensi, smjesa može biti usitnjena i procesuirana da se dobiju granule, nakon dodatka pogodnih pomoćnih sredstava, te po želji, a da se dobiju tablete i jezgra dražeje. Pogodni ekscipijensi su punila kao što su šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol ili sorbitol; prirpavci s celulozom kao što je primjerice kukuruzni škrob, pšenični škrob, krumpirov škrob, želatina, guma tragaklant, metilna celuloza, hidroksipropilmeti-celuloza, natrijeva karbiksimetilceluloza i/ili polivinil-pirolidon. (PVP). Ako je poželjno, može se dodati dizintegrirajuće sredstvo, kao što je umreženi polivinil-pirolidin, agar ili alginska kiselina ili njena sol, kao što je natrijev alginat. Oralne formulacije mogu biti također formulirane u fiziološkoj otopini ili puferima za neutralizaciju kiselinh uvjeta ili mogu biti dani bez nosača.

Jezgre dražeja presvučene su s pogodnim sredstvom za presvlačenje. Za te svrhe, mogu se koristiti koncetrirane otopine šečera koje mogu sadržavati gumu arabiku, talk, polivinil-pirolidon, karbopol gel, polietilen glikol, i/ili titanov dioksid, otopine laka i pogodna organska otapala ili smjese otapala. U tablete ili dražeje se mogu dodati boje ili pigmenti, a za identifikaciju ili karakterizaciju različitih kombinacija doza aktivnog spoja.

Farmaceutski prirpavci koji se koriste oralno uključuju kapsule načinjene od želatine koje se pritiskaju, kao i meke zataljene kasule načinjene od želatine i plastifikatora kao što je glicerol ili sorbitol. Kasule mogu sadržavati aktivne sastojke i smjesi s punilom kao što je laktoza, veziva kao što su škrobovi i/ili lubirkante kao što je talk ili magnezijev stearat, te može biti prisutan stabilizator. U mekim kapsulama aktivni spojevi se mogu otopiti ili suspendirati u pogodnim tekućinama kao što su masne kiseline, tekući parafin ili tekući polietilenglikoli. Uz to se mogu dodati stabilizatori. Mogu se također koristiti mikrosfere formulirane za oralno davanje. Takve mikrosfere su dobro definirane us struci. Sve formulacije za oralno davanje trebaju biti u dozama pogodnim za takvo davanje.

Za buklano davanje se pripravci mogu uzeti u obliku tableta ili lonzeta formuliranih na uobičajeni način.

Za davajne inhlalcijom spoj koji se koristi se prema ovom izumu se može pogodno isporučiti u obliku aerosolbog spreja iz paketa pod tlakom, a upotrebom pogodnog propelanta, npr. diklordifluormetana, triklorfluormetana, triklortetrafluoretana, ugljičnog dioksida ili drugih pogodnih plinova. U skučaju aerosola pod tlakom, jedinica doze može biti određena ventilom za ispruku mjerene količine. Kapsule i spremnici npr. želatine za upotrebu inhalatora ili insuflatora se mogu formulirati da sadrže smjesu prašaka spoja i pogodni prašak za osnovu kao što je laktoza ili škrob.

Ako je poželjna sistemska isporuka, spojevi se mogu formulirati za parenteralno davanje npr. bolus injekcija ili kontinuirana infuzija. Formulacije za injekciju mogu biti prisutne u obliku jedinice doze, npr. u ampulama ili spremicima s višestrukom dozom, a s dodanim prezervativom. Pripravci mogu biti u obliku suspenzija, otopina ili emulzija u ulju ili vodenih vehikula, te mogu sadržavati sredstva za formulaciju kao što su ona za suspendiranje, stabiliziranje i/ili disperziju.

Pripravci se mogu biti u oblicima kao što je otopina aktivnih spojeva u obliku koji je topljiv u vodi. Uz to, suspenzije aktivnih spojeva se mogu pripraviti kao pogodne uljne injekcije suspenzija. Pogodni lipofilna otapala ili vehikuli uključuju masna ulja kao što je sezamovo ulje ili sintetske masne estere, kao što je etilni oleat ili trigliceridi, ili liposomi. Vodene injekcije suspenzija mogu sadržavati tvari koje povećavaju viskoznost suspenzije, kao što je natrijeva karboksimetil-celuloza, sorbitol ili dekstran. Suspenzije također mogu sadržavati stabilizatore ili sredstva koja povećavaju topljivost spojeva da se dozvoli prirpava otopina velike koncetracije.

Alternativno aktivni spojevi mogu biti u obliku prašaka za pripavu s pogodnim vehikulima, npr. sterilnom vodom bez pirogena, a prije upotrebe.

Spojevi također mogu biti formulirani kao rektalni i vaginalni pripravci kao što su supozitoriji ili klistiri s odgođenim djelovanjem, koji npr. sadrže uobičajene baze za supozitorije kako što je kako maslac ili ostali gliceridi.

Uz prethodno opisane formulacije, spojevi također mogu biti formulirani kao depo pripravci. Takve fromulacije koje dugo djeluju se mogu formulirati s pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (primjerice kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili smoli za ionsku izmjenu, ili kao umjereno topljvi derivati, primjerice kao umjereno topljive soli.

Farmacetuski pripravci također mogu sadržavati pogodne nosače ili ekscipijese u čvrstoj fazi ili u gelu. Primjeri takvih nosača su ekscipijensi koji uključuju, ali bez ograničenja, kalcijev karbonat, kalcijev fosfat, različite šećere, škrobove, derivate celuloze, želatinu i polimere kao što je polietilen glikol.

Pogodni tekući ili farmacetuski oblici pripravaka su primjerice, vodene ili fiziološke otopine za inhalaciju, mikrokapsulirane, presvučene na mikroskopske zlatne čestice, sadržane u liposomima, raspršene, aerosoli, u obliku za implantaciju pod kožu ili sušene na oštrom predmetu da bi bile unešene grebanjem kožu. Farmaceutski pripravci također uključuju granule, praške, talbete, presvučene tablete, mikro(kapsule), supozitorije, sirupe, emulzije, suspenzije, kreme, kapi ili prirpavke s produljenim oslobađanjem altivnih spojeva u čijoj pripravi su korišteni ekcipijensi i aditivi i/ili pomoćna sredstva, kao što su sredstva za dezintegraciju, veziva, sredstva za presvlačenje, sredstva za bubrenje, lubrikanti, sredstva za poboljšanje okusa, zaslađivači ili solubilizatori. Farmaceutski prirpavci su pogodni za upotrebu u različitim sustavima za isporuku. Za kratki prikaz metoda isporuke lijekova vidi Langer, Science 249:1527-1533, 1990, a koji je ovdje ugrađen citatom.

Imunostimulirajuće nukleinske kiseline, a po potrebi i drugi terapeutici i/ili antigeni se mogu davati per se (sami) ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli. Kada se koriste u medicini, soli trebaju biti farmaceutski prihvatljive ali se mogu koristiti soli koje nisu farmaceutski prihvatljive, a da bi se prirpavile odgovarajuće farmaceutski prihvatljive soli. Takve soli uključujum, ali bez ogranićenje, one pripravljene iz sljedećih kiselina: klorovodična, bromovo-dična, sumporna, dušična, fosforna, jabučna, octena, salicilna, p-toluensul-fonska, vinska, limnuska, metnasulfonska, mravlja, malonska, jantarna, naftalen-2-sulfonska, te benzen sulfonska.

Pogodna sredstva za puferiranje uključuju sljedeće: octena kiselina i sol (1-2% w/v), borna kiselina i sol (0.5-2.5% w/v), te fosforna kiselina i sol (0.8-2% w/v). Pogodni prezervativi uključuju benzalkonijev klorid (0.003-0.03% w/v), klorbutanol (0.3-0.9% w/v), parabene (0.01-0.25% w/v), te timerosal (0.004-0.02% w/v).

Farmaceutski pripravci iz izuma sadrže ulinkovitu količinu imunostimulirajuće nukleinske kiseline i antigene i/ili ostala terapijska sredstva uključena u farmacetuski prihvatljiv nosač. Termin farmaceutski prihvatljiv nosač označuje jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tekućih punila, razrjeđivača ili tvari za kapusliranje koje su pogodne za davanje ljudima ili ostalim kralježnjacima. Termin nosač odnosi se na organski sastojak, prirodni ili sintetski, s kojim je aktivni sastojak spojen da se olakša primjena. Komponente farmacetuskih pripravaka su također mogu miješati sa spojevima iz izuma i jedan s drugim na takav način da ne postoji interakcija koja bi značajno pokvarila željenu farmaceutsku efekasnost.

Imunostimulirajuće nukleinske kiseline korisne iz izuma mogu bit isporučene u smjesi s dodatnim adjuvansom(ima), drugim terapeuticima ili antgenom(ima). Smjesa može sadržavati nekoliko adjuvansa uz imunostimulirajuću nukleinsku kisleinu ili nekoliko anigena ili ostalih terapeutika.

Na raspolaganju su različiti načini davanja. Određeni način koji je odabran će ovisiti, naravno o određenom adjuvansu i odabranom antigenu, određenim uvjetima koji su pod tretmanom i potrebnoj dozi za učinkovitu terapiju. Metode iz izuma, općenito govoreći, mogu biti prakticirane upotrebom načina davanja koji je medicinski prihvatljiv, što znači svaki način koji producira učinkovite razine imunog odgovora bez uzrokovanja klinički neprihvatljivog nepovoljnih efekata. Preferirani načini davanja su oni gore diskutirani.

Pripravci mogu pogodno biti u jedinici doze ili mogu biti pripravljeni bilo kojom metodom dobro poznatoj u farmacetuskoj struci. Sve meotde uključuju korak spajanja spojeva s nosačem koji je načinjen od jednog ili više sastojaka. Općenito, pripravci su prirpavljeni jednoliko raspoređenim i bliskim vezivanjem spojeva s tekućim nosačem, s fino podijeljenim čvrstim nosačem ili oba, a zatim ako je potrebno oblikvanje produkta. Tekuće jedinice doze su u bočicama ili ampulama. Čvrste jedinice doze su tablete, kasule i supozitoriji. Za tretman pacijenata, a ovisno o aktivnosti spoja, način davanja, svrha imunizacije (t.j. profilaktički ili terapijski), priroda i ozbiljnost poremećaja, godine i tjelesna težina pacijenta, mogu biti potrebne različte doze. Davanje dane doze se može izvesti jednim davanjem u obliku jednične doze ili nekoliko manjih jedinica doze. Višestuko davanje doza u specifičnim intervalima tjedana ili mjeseci je obično za izazivanje na antigen specifičnih odgovora.

Ostali sustavi za isporuku mogu uključivati odgođeno oslobađanje i zadržano oslobađanje. Takvi sustavi mogu izbjeći ponovljeno davanje spojeva, i učiniti davanje subjektu i liječniku pogodnijim. Mnogi tipovi sustava za oslobađanje su poznati stručnjacima. Oni uključuju na polimerima zasnovane sustave kao što je poli(laktid-glikolid), kopolioksalat, polikaprolaktoni, polisteramidi, poliortoesteri, polihidroksimaslačna kiselina, te polianhgidridi. Mikrokapsule prethodnih polimera koje sadrže lijek su opisane primjerice u U. S. Patent 5,075,109. Sustav za isporuku također uključuje sustav koji nije polimer kao što su: lipidi uključujući sterole kao što je kolesterol, esteri kolesterola i masne kiseline ili neutralne masti kao što je mono-, di- te trigliceridi, hidrogel oslobađajući sustav, silatični sustav, sustav zasnovan na peptidima, presvlačenje voskom, komprimirane tablete korištenjem uobičajenih veziva i ekscipijensa, djelomično fuzionirani inplanti i slično. Specifični primjeri uključuju, ali nisu na njih ograničeni: (a) erozijske sustave u kojem sredstvo iz izuma sadržano unutar matrice kao što su one opisane u U. S. Patentima br. 4,452,755, 4,675,189, te 5,736,152, te (b) difuzijski sustavi u kojima aktivna komponenta prodire pri kontroliranoj brzini iz polimera kao što je opisano u U. S. Patenima br. 3,854,480, 5,133,974, te 5, 407,686. Uz to, može se koristiti na pumpi zasnovani sustav isporuke, od kojih su neki prilagođeni za implantaciju.

Ovaj izum je dalje ilustriran sljedećim Primjerima, koji ni na koji način nisu ograničavajući. Cijeli sadržaj svih referencija (uključujući literaturne referencije, izdane patente, publicirane patente aplikacije i istovremene patentne aplikacije) navedne kroz cijelu ovu aplikaciju i stoga su odmah ugrađeni citoatom.

Primjeri

Materijali i metode

Oligonukleotidi: Fosfodiesterski i fosforotioatno modificirani ODN je kupljen od Operon Technologies (Alaineda, CA) i Hybridon Specialty Products (Milford, MA). ODN je tesiran na endotoksin korištenjem LAL-testa (LAL-assay BioWittaker, Walkersville, MD; donja granica detekcije 0. 1 EU/mL). Za in vitro test, ODN je razrijeđen u TE puferu (10 mM Tris, pH 7.0, 1 mM EDTA), te čuvani pri -20 _C. Za in vivo upotrebu, ODN je razrijeđen u fosfatnoj puferiranoj fiziološkoj otopini (0. 1 M PBS, pH 7.3) i čuvano je pri 4 _C. Sva razrjeđenja su izvedena korištenjem otapala bez pirogena.

Izolacija humanih PBMC i stanične kulture: Mononuklearne stanice periferne krvi (PBMC) su izolirane krvi zdravih volontera uz centrifugiranje Ficoll-Paque gradijenta gustoće (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kao što je opisano (Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10). Stanice su suspendirane u RPMI 1640 mediju za kulturu kojem je dodano 10% (v/v) toplinom aktiviranih (56 _C, 1 h) FCS (HyClone, Logan, UT), 1.5 mM L-glutamine, 100 U/mL penicilina i 100 μg/mL streptomicina (svi od Gibco BRL, Grand Island, NY) (kompletni medij). Stanice (končana koncntracija 1x106 stanica/mL) su kultivirane u kompletnom mediju u 5% CO2 vlažnom inkubatoru pri 37 _C. ODN i LPS (iz Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ili anti-IgM su korišten kao stimulansi. Za mjerenje litičke aktivnosti humanih NK, PBMC je inkubiran na at 5 x 106/jažici na ploči s 24 jažica. Kulture su sakupljene nakon 24 sata i stanice su korištene kao efektori u standardnom 4 satnom testu oslobađanja 51Cr prema K562 ciljanim stanicama, kao što je prethodno opisano (Ballas et al., 1996 J. Immunol. 157:1840-1845). Za proliferaciju B-stanica, 1 μCi of 3H timidina je dodano 18 sati prije sakupljanja i količina ugradnje 3H timidina je određena scintillacijskim brojanjem dana 5. Standardna devijacija trostrukih mjerenja je bila < 5%.

Protočna citometrija na humanim PBMC: Površina antigena na PBMC je bojana kao što je prije opisano (Hartmann et al., 1998 J. Pharinacol. Exp. Ther. 285:920928). Monoklonalna antitijela CD3 (UCHT1), CD14 (WE2), CD19 (1343), CD56 (B 159), CD69 (FN50) te CD86 (2331 [FLN-1 ]) su kupljena od Pharmingen, San Diego, CA. IgG1,� (MOPC-21) i IgG2b,� (Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:93 05 -10) su korišten za kontrolu nespecifičnog bojanja. NK stanice su identificirane ekspresijom CD56 na CD3, CD14 i CD19 negativnim stanicama, dok su B-stanice identificirane ekspresijom na CD 19. Podaci protočne citometrije od 10000 stanica po uzorku su ispitani na FACScan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Pogodnost stanica unutar FSC/SSC vrata korištena za analizu je ispitana bojanjem s propidium jodidom (2 μg/mL) i nađeno ih je da je više od 98%. Podaci su analizirani korištenjem kompjutorskog programa FlowJo (verzija 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA).

Rezultati:

Primjer 1: Stimulacija humanih B-stanica ovisna o CpG ovisi o metiliranju i duljini ODN

Humane PBMC su dobiveme od normalnih donora i kultivirane su pet dana pri 2 x 105 stanica/jažici s naznačenom koncetracijom i pokazanim sekvencijama ODN. Kako je pokazano u Tablici F, humane PBMS proliferiraju preko osnovnog signala kada su kultivirani s različitim CpG ODN, ali također pokazuju proliferaciju čak i ODN koji ne sadrži CpG motive. Važnost nemetiliranih CpG motiva u donošenju otimalne imune stimulacije s tim ODN je pokazana činjenicom da ODN 1840 (SEQ ID NO. 83) inducira 56,603 brojanja ugradnje 3H-timidina dok isti T-obogaćen ODN s metiliranim CpG motivima (ne-CpG) 1979 (SEQ ID NO. 222), inducira niži ali još uvijek povećanu aktivnost preko basne (izbrojano samo 18618) pri istoj koncentraciji od 0.6 μg/mL. Smanjena proliferacija pri višim ODN koncentracijama može biti artefakt jer stanice postaju iscrpljene pod tim eksperimentalnim uvjetima ili mogu reflektirati neku toksičnost viših ODN koncetracija. Interesantno je da kraći ODN koji sadrže CpG motive kao što su 13-14 meri 2015 i 2016, su slabiji stimularoti usprkos činjenici da bi njihova molarna koncetracija bila u stvari viša jer je ODN dodan na osnovu mase a ne molariteta. To pokazuje da duljina ODN može također biti važna odrednica za imunie efekte ODN. Ne-CpG ODN ali blago T-obogaćen ODN (oko 30% T), 1982 (SEQ ID NO. 225) uzrokuje samo malu količinu stanične proliferacije prema baznoj vrijednosti.

Tablica F

[image]

Brojevi predstvljaju cpm ugradnje 3H-timidina za kulturu humanih PBMC prirpavljenih kao što je gore prikazano.

Primjer 2. O koncentraciji ovisna aktivacija aktivnosti humanih NK stanica s timidinom obogaćenim ODN.

Humane PBMC su kultivirane 24 sata s raznim CpG ili ne-CpG ODN pri dvijema različitim koncetraacijama, te je testrirana njihova sposobnost ubijanja NK ciljnih stanica kao što je ranije opisano (Ballas et al., 1996 J. Immunol. 157:1840-1845). Ubijanje je mjereno kao litička jedinica ili L.U. Humani donori korišteni u ovom eksperimentu su imali baznu razinu od 3.69 L.U. koja je povećana na 180.36 L.U. korištenjem pozitivne kontrole, IL-2. A CpG oligo, 2006 (SEQ ID NO. 246), inducirana je visoka razine NK litičke funkcije pri niskoj koncentaciji od 0.6, i nižoj koncetraciji od 6.0. Iznenađujuće, T-obogaćen ODN u kojem su CpG motivi od 2006 metilirani (ODN na 2117 (SEQ ID NO. 358)) ili invertirani u GpCs (ODN 2137 (SEQ ID NO. 886)) su zadržali jaku imunostimulirajuću funkciju pri višim koncetracijama ODN, kao što je prikazano u Tablici G. Ti o koncetraciji ovisni imunostimulirajući efekti nisu opće svojstvo fosforotioatnog skeleta jer niže opisani eksprimenti pokazuju da je poly-A ODN nestimulirajući iznad bazne razine. Neka je stimulacija viđena s ODN duljine od 24 baze u kojem su sve bazne pozicije slučajne, tako da će se A, C, G i T pojavljivati u frekvenciji od po 25% u svakom položaju baze (ODN 2182 (SEQ ID NO. 432)). Međutim, stimulirajući efekt takvnog ODN s 24 baze je uveliko povećan ako je čisti poly-T, a u kojem slučaju je stimulacija također viđena kod nižih koncetracija od 0.6 μg/mL (ODN 2183 (SEQ ID NO. 433)). Ustvari, stimulatroska aktivnsot ODN SEQ ID NO. 433 pri tako niskoj koncetraciji je viša nego bilo kojeg drugog testiranog ODN pri toj niskoj koncetraciji uz optimalnu imunostimulaciju kod ljudi s ODN of SEQ ID NO. 246. U stvari više koncetracije ODN SEQ ID NO. 433 više stimuliraju aktivnsot NK nego bilo kojeg drugog fosforotioatnog ODN osim za jaku CpG ODN 2142 (SEQ ID NO. 890), koja je neznatno viša. Ako je sadržaj G ODN SEQ ID NO. 246 povećan relativno prema sadržaju T, a dodatkom više G, pa stoga rezultira smanjivanje umjera T nukleotida, smanjuje se imunostimulirajući efekt ODN (vidi ODN 2132 (SEQ ID NO. 373)). Stoga, sadržaj T u ODN je važna odrednica njegovog imunostimulirajućeg efekta. Mada je poli-T ODN najviše stimulirajući od ne-CPG ODN, ostale baze su također važne u određivanju imunostimulirajućeg efekta na ne-CpG ODN. ODN 2131 (SEQ ID NO. 372) u kojem je malo više od polovice baza T i u kojem nema G, je imunostimulator pri koncentraciji od 6 pμg/mL ali je manje aktivan od ostalih T-obogaćenih ODN. Ako su 6 A u ODN 2131 (SEQ ID NO. 372) zamjenjeni s 6G, imunostimulrajući efekt ODN može biti povećan (vidi ODN 2130 (SEQ ID NO. 371)).

Tablica G

[image]

Primjer 3: Indukcija proliferacije B-stanica pomoću T-obogaćenim ne-CpG ODN

Da bi se procjenila sposobnot T-obogaćenog ODN da aktivira proliferaciju B-stanica, humani PBMC su bojani s citoplazmatskom bojom CSFE, inkubirani pet dana s navedenim ODN pri 0.15 ili 0.30 μg/mL, te je analizirano protočnom citometrijom. B-stanice su identificirane na stanice pozitivnim linijama markera CD19. CpG ODN 2006 je jaki induktor proliferacije B i taj efekt je smanjen kad su CpG motivi metilirani ili prevedeni u GpC, a kako je prikazano na Slikama 1A, B, C i D pri koncetraciji ODN od 0.3 μg/mL. Izgleda da je sastav baza ODN važan za određivanje imunostimulirajućeg efekta. Smanjivanje sadržaja T u ODN značajno smanjuje imunostimulirajkući efekt, kao u primjeru ODN 2177 (SEQ ID NO. 427) u kojem je 6 prisutnih T u ODN 2137 (SEQ ID NO. 886) promjenjeno u A pri čemu je znatno smanjen imunostimulirajući efekt. Važnost T u imunostimulirajućem efektu ODN je prikazana usporedbom of ODN 2116 (SEQ ID NO. 357) i 2181 (SEQ ID NO. 431), koji se razlikuju u 3' kraju ODN. ODN 2181, u kojem je 3' kraj poli-T je više imunostimulirajući od ODN 2116 u kojem je 3' kraj poli-C, bez obzira na činjenicu da obje ODN imaju TCGTCG na 5' kraju.

Primjer 4: Proliferacija inducirana pomoću TG oligonukleotida

Stimulirajući efekti TG motiva su prikazani na Slici 2. ODN 2137 ima identični sastav baza kao ODN 2006, ali su CG motivi prevedeni u GC čime je dobivena nukleinska kiselina bez CG. ODN, međutim, sadrži 6 TG dinukleotida. U ODN 2177, svi TG dinukleotidi od ODN 2137 su pormjenjeni u AG. Mada ODN 2177 sadrži samo 6 adenina, on ne pokazuje stimulaciju pri koncetraciji od 0.2 μg/mL. Za usporedbu, ODN koji ima duljinu od 24 baze a u svakom položaju može slučajno biti bilo koja baza (ODN 2182) inducira >12% proliferacije B-stanica pri koncetraciji od 0.2 μg/mL. Ti rezultati pokazuju da stimulatorni efekt ODN 2137 nije jednostavno taj od fosfotioatnog skeleta, nego se odnosi na prisutnosti TG dinukleotida.

Da bi se odredio efekt promjenjljivog broja TG dinukleotidnih motiva, ODN 2200 i ODN 2202 su uspoređeni, kao što pokazuje slika 2. Oba ODN sadrže 18 T i 6 G, ali su kod ODN 2202 svi G jedan za drugim, tako da nema ni jednog TG dinukleotida, dok su u ODN 2202 G razdvojeni kao GG dinukleotidi u cijelom ODN tako da ima tri TG. ODN 2202 je znatni bolji imunostimulator od ODN 2200, što je u skladu s modelom prema kojem su potrebna barem tri TG motiva u ODN za optimalni stimulirajući efekt. Vjerojatno je da čak više razine stimulacije mogu biti postignute ako je TG motiv optimiziran, a kako je prije pokazano.

Primjer 4: Proliferacija inducirana pomoću TG oligonukleotida

Slika 3 prikazuje rezultate eksperimenata izvedenih iz istraživanja sadržaja TG prema realtivnim razinama T prema G, a što se odnosi na stimulirajuće efekte ODN. Slika pokazuje da ODN u kojem su sve baze slučajno T ili G (ODN 2188 (SEQ ID NO. 905)) nisu stimulirajuće pri koncetraciji od 0.2 μg/mL slično ODN u kojem su sve baze slučajno raspoređeni A ili G (ODN 2189 (SEQ ID NO. 906)). Međutim, pri višoj koncetraciji od 2 μg/mL, slučajno smješteni T/G ODN 2188 je znatni više imunostimulatorni. Ta zadnja razina stimulacije je još niža nego koja se događa s potpuno slučajnim ODN (ODN 2182 (SEQ ID NO. 432)). Najviša stimulacija pri niskoj koncentraciji je viđena s ODN u kojem je polovica baza fiksirana na T, a ostala polovica baza su slučajni T ili G (ODN 2190 (SEQ ID NO. 907)). Kako je svaka od tih baza fiksirana da je T, ne može biti TG motiva. Podaci na Slici 3 pokazuju da povećanje sadržaja TG u ODN poboljšava stimulatronu aktivnost.

U drugim eksperimentima, a čiji rezultati nisu prikazani dijagramom, ODN 2190 (SEQ ID NO. 907) pokazuje stimulaciju aktivnosti NK u uspredbi s ODN 2188 (SEQ ID NO. 905) ili ODN 2189 (SEQ ID NO. 906).

Primjeri 6-8:

Uvod:

Gore smo pokazali da su poli-T sekvencije sposobne povećati stimulaciju B i NK stanica. Ovdje i niže smo ispitivali efekt različith ne-CpG T-obogaćenih ODN kao i poli-C ODN, a prema njihovoj sposobnosti da stimuliraju humane B-stanice, NK stanice i monocite.

Materijali i metode:

Oligunukleotidi: Fosforotioatom modificirani ODN je kupljen od ARK Scientific GmbH (Darmstadt, Gennany). Korištene sekvencije su: 1982: 5'tccaggacftctctcaggtt-3' (SEQ ID NO.: 225), 2006: 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3' (SEQ ID NO.: 246), 2041: 5'-ctggtctttctggtttttttctgg-3' (SEQ ID NO.: 282), 2117: 5'tzgtzgttttgtgtzgttttgtzgtt-3' (SEQ ID NO.: 358), 2137: 5'-tgctgcttttgtgcttttgtgctt- 3' (SEQ ID NO.: 886), 2183: 5'-ttttttttttttttttttttt-3' (SEQ ID NO.: 433), 2194: 5'tttttttttttttttttttttttttt -3' (SEQ ID NO.: 911), 2196: 5'-tttttttttttttt -3' (SEQ ID NO.: 913), 5126: 5'-ggttcttttggtccttgtct-3' (SEQ ID NO.: 1058), 5162: 5'tttttttttttttttttttttttttttttt-3' (SEQ ID NO.: 1094), 5163:

5'aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaanaaaa-3' (SEQ ID NO.: 1095), 5168: 5'cccccccccccccccccccccccccccccc-3' (SEQ ID NO.: 1096) te 5169: 5'cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcg- 3' (SEQ ID NO.: 1097). Većina ODN je testirana na sadržaj LPS korištenjem LAL testa (BioVWhlittaker, Belgium) (donja granica detekcije 0.1 EU/mL), a što je ovdje također opisano. Za sve testove je ODN razrijeđen u TE puferu u čuvan pri -20 _C. Sva razrjeđenja su provedena upotrebom reagenasa bez pirogena.

Priprava stanice i stanične kulture: Humani PBMC je izoliran iz periferne krvi zdravih volontera, dobiveno od Njemačkog Crvenog križa (Ratingen, Germany), kako je gore opiosano u Primjeru 1, ali su svi materijali kupljeni od Life Technologies, Njemačka i testirani su edotoksinom. Za sve testove B-stanice, NK stanice i aktivaciju monocita, PBMC je kultiviran u kompeltnom mediju pri koncetraciji od 2x106 stanica/mL u 200 μM na ploči s 96 jažica s okruglim dnom, u vlažnom inkubatoru pri 37 _C. Različiti ODN LPS (Sigma) ili IL-2 (R&D Systems, USA) su korišteni za stimulaciju. U navedeno vrijeme su stanice sakupljene za protočnu citometriju.

Protočna citometrija: MAbs korišteni za bojanje antigena jesu: CD3, CD14, CD19, CD56, CD69, CD80 i CD86 (svi dobiveni od Phariningen/Becton Dickinson, Njemačka). Za monocite Fc blokirani su receptori upotrebom humanog IgG (Myltenyi, Njemačka) kao što je ranije opisano (Bauer, M et al 1999 Immunology 97:699). Podaci protočne citometrije za barem 1000 stanica specificirane podpopulacije (B-stanice, monociti, NK stanice, NKT-stanice or T-stanice) su doobiveni na FACSCalibur (Becton Dickinson). Podaci su analizirani upotrebom programa CeIlQuest (Becton Dickinson).

Citotoksičnost posredovana s NK: PBMC su kultivirane preko noći sa ili bez 6 μg/mL ODN ili 100 U/mL IL-2 pri 37 _C, 5% CO2. Sljedeće jutro su ciljane K-562 stanice obilježene fluorescetntnom bojom CFSE, kao što je prethodno opisano za humane B-stanice (Hartmann, G. i A. M. Krieg, 2000 J. Immunol. 164:944). PBMC su dodane u različitim omjerima (5 0:1, 25:1 i 12.5: 1) u 2x105 ciljanih stanica i inkubirano je 4h pri 3 7 _C. Stanice su sakupljene i inkubirane s DNA-specifičnom bojom 7-AAD (Pharmingen) za detekciju apoptičkih stanica. Rezultati su mjereni protočnom citometrijom.

ELISA: PBMC (3x106 stanica/mL) su kultivirane sa specifičnim koncetracijama ODN ili LPS kroz 24h (IL-6, IFNγ i TNFα) ili 8h (IL-1β) na ploči s 48 jažica u vlažnoj atmosferi pri 37 _C. Supernatanti su sakupljeni i citokini su mjereni upotrebom OPTeia ELISA Kits (Pharrningen) za IL-6, IFNγ i TNFα ili Elipair ELISA testom (Hoelzel, NJemačka) za IL-1β prema protokolu proizvođača.

Primjer 6: Aktivacija B-stanica inducirana s OND kojima nedostaju CpG motivi

U gore opisanim eksperimentima u Primjeru 3 smo pokazali da je T-obogaćen ODN sposoban aktiviranti B-stanice. Mi smo ovdje proširili istraživanja korištenjem dodatnih ODN i različitih stanica i izvore reagensa. U prvoj skupini eksperimenata smo usopredili aktivacijski potencijal različith ne-CpG T-obogaćenih ODN sa svakim poznatim potentnim CpG ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246). PBMC (2x106 stanica/mL) krvi donora (n=2) su inkubirani s naznačenim koncetracijama ODNs 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 5126 (SEQ ID NO.: 1058), te 5162 (SEQ ID NO.: 1094). Stanice su inkubirane kroz 48h at 37 _C kao što je gore opisano i bojane s mAb for CD19 (marker B-stanice) i CD86 (aktivator markera B-stanica, B7-2). Ekspresija je mjerena protočnom citometrijom.

Koristeći razne ODNs, mi smo pokazali (Fig. 4) da T-obogaćeni ODN bez CpG motiva mogu inducirati stimulaciju humanih B-stanica. ODN 5126 (SEQ ID NO.: 1058) koji sadrži samo jednu poli-T sekvenciju ali ima više od 50% T, uzrokuje visoku razinu aktivacije humanih B-stanica. Mada ppostoje sličnosti sa SEQ ID NO.: 246 (npr. više od 80% sadržaja T/G), tom ODN jasno nedostaje bilo koji poznati imunostimulrajući CpG motiv. Iznenađujuće je da je za sve testirane T-obogaćene ODN najviši indeks stimuliranja dobiven pri koncetracijama između 3 i 10 μg/rnL. Najviši indeks stimuliranja testiranih ODN je postignut s CpG/T-obogaćenim ODN SEQ ID NO.: 246 pri 0.4 μg/mL. Interesantno, aktivnost opada pri visokim koncetracijama.

Poli-A, poli-C i poli-T sekvencije sitetizirane su i testirana je njihova biološka aktivnost. PBMC (2x106 stanica/mL) jednog predstavnika donora (n=3) je stimulirana kao što je gore opisano, a s 0.4 μg/mL, 1.0 μg/mL ili 10.0 μg/mL sljedećih ODN: 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2196 (SEQ ID NO.: 913) (poli-T, 18 baza), 2194 (SEQ ID NO.: 911) (poli-T, 27 baza), 5162 (SEQ ID NO.: 1094) (poli-T, 30 baza), 5163 (SEQ ID NO.: 1095) (poli-A, 30 baza), 5168 (SEQ ID NO.: 1096) (poli-C, 30 baza) i 5169 (SEQ ID NO.: 1097) (poli-CG, 30 baza). Ekspresija aktivacijskih markera CD86 (137-2) na CD 19-positivnim B-stanicama je mjerena protočnom citometrijom.

Slika 5 prikazuje da duljina sekvencije, barem za poli-T ODN ima važni utjecaj na aktivnost. Pokazalo se da poli-T sekvnecija koja sadrži samo 18 baza (SEQ ID NO.: 913) ja manje stimulirajuća od one s 27 baza (SEQ ID NO.: 911) ili 30 baza (SEQ ID NO.: 1094) s jasno rangiraon stimulacijom: SEQ ID NO.: 1094> SEQ ID NO.: 91 1> SEQ ID NO.: 913. Poly A (SEQ ID NO.: 1095) ili poli-CG (SEQ ID NO.: 1097) sekvencije, nasuprot tome ne induciraju aktivaciju humanih B-stanica. Iznenađujuće je otkriće da poli-C sekvencije (SEQ ID NO.: 1096) mogu aktivirati humane B-stanice barem pri visokim koncetracijama (10 μg/mL) (Slika 5).

Dva druga T-obogaćena ODN, poimence 1982 (SEQ ID NO.: 225) i 2041 (SEQ ID NO.: 282) kojima nedostaju CpG motivi su testirani prema njihovom efektu na humane B-stanice. PBMC (n=2) je inkubiran s naznačenom koncetracijom ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), 1982 (SEQ ID NO.: 225) i 2041 (SEQ ID NO.: 282) kao što je gore opisano. Aktivacija B-stanica (ekspresija aktivacijskih markera CD86) je mjerena protočnom citometrijom.

Slika 6 pokazuje da je T-obogaćen ne-CpG ODN imunostimulator pri koncetracijama većim od 1 μg/mL. Ugradnja CpG motiva u 1982 povećala je imunostimulirajuću aktivnost. Produljenje s poli-T sekvencijom ne povećava imunostimulirajuću aktivnost. tog već T-obogaćenog ODN, nego lagano smanjuje aktivacijski potencijal.

Primjer 7: Imunostimulacija ne-CpG ODN se očituje u povećanjoj aktivaciji NK, citotoksičnosti NK i aktivaciji monocita

Testirani su odgovori NK stanica i monocita na ne-CpG ODN. PBMC (2x106 stanica/mL) su inkubiran s 6 μg/mL sljdećih ODN (n=4): 2006 (SEQ ID NO.: 246),2117 (SEQ ID NO.: 358),2137 (SEQ ID NO.: 886),2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 911) i 5126 (SEQ ID NO.: 1058). Nakon 24 sata kultiviranja pri 37 _C, stanice su sakupljene i bojane s mAb za CD3 (marker T-stanice), CD56 (marker NK stanice) i CD69 (marker rane aktivacije) kao što je gore opisano Ekspresija CD69 na CD56-pozitive NK stanice je mjerena protočnom citometrijom.

Slika 7 pokazuje da se za poli-T ODN mogu opaziti slični efekti kao što je opisano na Slici 5. Na stimulaciju NK stanica, kao i B-stanica se može utjecati duljinom ODN. S ODN 2183 (SEQ ID NO.: 433) (21 baza) inducirana aktivacija NK stanica ali do manje mjere nego dulji ODN 2194 (SEQ ID NO.: 911) (27 baza), a kako je mjerena pojačanom ekspresijom ranih aktivacijskih markera CD69. ODN 5126 (SEQ ID NO.: 1058) je također pokazano da aktivira humane NK stanice (Slika 7).

Vjeruje se da se antitumorska aktivnost CpG ODNs može procjeniti sposobnošću ODN da povećaju s NK posredovanu in vitro citotoksičnost. Za ODN koji sadrže na 5' i 3' krajevima lance poli-G je pokazano da rezultiraju najvišom indukcijom citotoksičnosti (Ballas, Z. K., et al. 1996 J. Immunol. 157:1840). Da se ispita utjecaj ne-CpG T-obogaćenog ODN na NK citotoskičnost, analizitran je efekt ODN 2194 (SEQ ID NO.: 911) i 5126 (SEQ ID NO.: 1058) na lizu posredovane s NK (Slika 8). S NK posredovana liza K-562 ciljanih stanica je mjerena nakon inkubcije PBMC preko noći s 6 μh/mL ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), SEQ ID NO.: 911 (SEQ ID NO.: 911 ) (poli-T, 27 baza) i 5126 (SEQ ID NO.: 1058) kao što je gore opisano. SEQ ID NO.: 1058 je pokazla malo povećanje lize u humanim NK stanicama u usporedbi s uzorkom bez ODN. SEQ ID NO.: 911 i SEQ ID NO.: 246 povećali su citotoksičnost humanih NK stanica čak do veće mjere.

Prethodni prikazi su pokazali da ne samo NK stanice nego i NKT-stanice posreduju u citotoksičnim odgovorima tumornih stanica (14). Mi smo stoga ispitali potencijalnu aktivaciju humanih NKT-stanica s T-obogaćenim ne-CpG ODN. PBMC jednog predstavnika donora (n=2) je inkubirana s 6μg/mL ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 913) i 5126 (SEQ ID NO.: 1058) za 24h kao što je gore opisano. Aktivacija NKT-stanice je mjerena protočnom citometrijom nakon bojanja s mAb for CD3 (marker T-stanice), CD56 (marker NK stanice) i CD69 (marker rane aktivacije). Pokazana je ekspresija D69 na CD3 i CD56 dvostruko pozitivnim stanicama (NKT-stanice).

Na Slici 9, SEQ ID NO.: 911 kao i SEQ ID NO.: 1058 je nađeno da stimuliraju NKT-stanice. Slično NK stanicama SEQ ID NO.: 911 (poli-T) je aktivniji od SEQ ID NO. 1058. Uz to, kako je gore opisano za B-stanice i NK stanice, duljina ODN ima utjecaja na imunostiulirajući potencijal, s tim da dulji ODN imaju jaći efekt na NKT-stanice. Slični rezultati su opaženi za humane T-stanice.

Sljedeći tip stanica obuhvaćenig u imnuom sustavu za borbu protiv infekcija su monociti. Te se stanice oslobađaju nakon aktivacije različitih citokina i mogu sadrijeti u dendrične stanice (DC), profesionalne stanice koje ispoljavaju antigen (Roitt, I., J. Brostoff i D. Male. 1998. Immunology. Mosby, London). Slika 10 pokazuje aktivaciju humanih monocita nakon kultiviranja PBMC s različitim ODNs. PBMC (2x106 stanica/mL) su inkubirane s 6 μg/rnL 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 3 5 8), 213 7 (SEQ ID NO.: 886), 2178 (SEQ ID NO.: 1096), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 911), 5126 (SEQ ID NO.: 1058) i 5163 (SEQ ID NO.: 1095) preko noći pri 37 _ kao što je gore opiosano (n=3). Stanice su sakuljene i bojane za CD14 (marker monocita) i CD80 (B7-1, marker aktivacije). Ekspresija je mjerena protočnom citometrijom.

Kao što je gore pokazano za NK i B-stanice, T-obogaćene sekvencije (npr. SEQ ID NO.: 433, SEQ ID NO.: 911) različite duljine induciraju stimulaciju monocita ali imju različite razine aktivnosti, npr. SEQ ID NO.: 433> SEQ ID NO.: 911. Poli-A (SEQ ID NO.: 1095) kao i poli-C (SEQ ID NO.: 1096 (2178) sekvencije, nasuprot tome ne vode aktivaciji monocita (mjereno povećanje CD80 pri koncetraciji od 6 μg/mL ODN).

Primjer 8: Indukcija citokina otpuštenih od ne-CpG ODN

Sljedeće je ispitana sposobnost različitih T-obogaćenih ODN da utječu na citokine. PBMC (3x106 stanica/mL) su kultivirane 24 sa ili bez 6 μg/mL navedenog ODN 1 μg/mL LPS kao pozitivna kontrola (n=2). Nakon inkubacije supernatanti su sakupljeni i TNFα je mjeren s ELISA kao što je gore opisano i rezultati su prikazani na Slici 11. PBMC je kultiviran s naznačenim ODN (1.0 μg/mL) kao što je prikazano na Slici 11, a IL-6 je mjeren u supernatantima s ELISA i rezultati su prikazani na Slici 12.

Slike 11 i 12 pokazuju da T-obogaćeni ne-CpG i T-obogaćeni/CpG mogu inducirati izlučivanje proupalnih citokina TNFα i IL-6. Za oba citokina, ODN 5126 (SEQ ID NO.: 1058) je u većini testova nađeno da su potentni kao ODN 2194 (SEQ ID NO.: 911). Poznato je da CpG ODN utječu na balans Th1/Th2 tako da induciraju Th1 citokine (Krieg, A. M. 1999 Biochemica et Biophysica Acta 93321:1). Da se testira da li T-obogaćen ODN uzrokuje sličan pomak prema Th1 citokinima, mjerena je produkcija IFNγ u PBMC. U prvoj skupini eksperimenata je pokazano, a kao što je opisano za IL-6 i TNFα, ODN SEQ ID NO.: 1058 i SEQ ID NO.: 911 inducira oslobađanje usporedove količine tog Th1 cirokina IFNγ. Uz to, pokazano je da je drugi proupalni citokin, IL-1β, oslobođen nakon kultiviranja PBMC s tim dvama ODN. Mada je količina tih citokina inducirana s T-obogaćenim ODN kojem nedostaju CpG motivi bila manja nego kad je korišten CpG ODN SEQ ID NO.: 246 količina induciranog T-obogaćenog ODN je značajno viša od kontrole.

Primjeri 9-11

Uvod:

Ovdje je opisan optimalni CpG motiv za aktivaciju imunoh sustava kod kralježnjaka koji nisu glodavci. Nađeno je da fosfodiesterski oligonukleotid koji koji sadrži taj motiv jako stimulira ekspresiju CD86, CD40, CD54 i MHC II, sintezu IL-6 i proliferaciju primarnih humanih B-stanica. Ti efekti zahtjevaju uvođenje oligonukleotida i edosomsko sazrijevanje. Taj CpG motiv je povezan sa suzdržanim oslobađanjem NF�B p50/p65 heterodimera i od kompleksa transkripcijskog faktora koji aktivira protien-1 (AP-1). Aktivacija transkripcijskog faktora s CpG DNA je prethodila povećanoj fosforilaciji stresnih kinaza c-jun NH2 terminalne kinaze (JNK) i p38, te od aktiviranja transkripcijskig faktora-2 (ATF-2). Nasuprot CpG, signalizacija preko receptora B-stanice vodi aktivaciji vanstaničnog receptora kinaze (ERK) i fosforilaciji različitih izoforma JNK.

Materijali i metode:

Oligodeoksidinukleotidi: Nemodificirani (fosfodiester, PE) i modificirani na nukleazu rezistentni (fosforotioat, PS) ODN su kupljeni od Operon Technologies (Alameda, CA) i Hybridon Specialty Products (Milford, MA). Sekvencije koje su korištene su prokazane u Tabilci H. E. coli DNA i DNA iz telećeg timusaje kupljena od Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Uzorci genomske DNA su pročišćeni ekstrakcijom s fenil-klorogom-izoamilnim alkoholom (25/24/1) i taloženi etanolom. DNA je pročišćena iz endotoksima ponovljenom ekstreakcijom s triton x-114 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i testirani su za endotoksin korištenjem LAL-testa (LAL-assay BioWhittaker, Walkersville, NM; donja granica detekcije 0.1 EU/mL) i testom visoke osjetljivosti na endotoksin opisan ranije (donja granica detekcije 0.0014 EU/mL) (Hartmann G. i Krieg A. M. 1999. CpG DNA and LPS iinduce distinct patterns of activation in human monocytes. Gene Therapy 6:893). Sadržaj endotoksina uzorkak DNA je bio ipod 0.0014 U/mL. DNA E. coli i DNA telećeg timusa su imaju jedan lanac prije upotrebe, a zagrijavajnem uz vrenje 10 minuta, nakon čega slijedi hlađenje na ledu 5 minuta. DNA uzorci su razrijeđeni u TE puferu upotrebom reagensa bez pirogena.

Tablica H: Prikaz korištenih oligonukleotida1

[image] 1 PE, fosfodiester; PS, fosforotioat; masna slova, izmjena baze; masno Z, metilirani citidin; povučeno, CpG dinukleotidi.

Priprava stanica i stanične kulture: Humane mononuklearne stanice perifrne krvi (PBMC) su izolirane iz periferne krvi zdravih volontera pomoću Ficoll-Paque centrifuge gradijenta gustoće (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kao što je opisano (Hartmann G., et al 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:29 1)). Stanice su suspendirane u RPMI 1640 mediju za kulturu uz dodatak 10 % (v/v) toplinom inaktiviranog (56 _C, 1 h) FCS (HyClone, Logan, UT), 1.5 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina i 100μg/mL streptomicina (sve od Gibco BRL, Grand Island, NY) (kompletni medij). Svi kupljeni spojevi su testirani na endotoksin. Pogodnost je određena prije inkubacije i nakon inkubacije s ODN izlučivanjem "trypan blue" (uobičajena mikroskopija) ili uzlučivanjem propidij jodida (analiza protočnom citometrijom). U svim eksperimentima je bilo 96 % do 99 % pogodnih PBMC. Stanice (konačna koncentracija 1x106 stanica/mL) su kultivirane u kompletnom mediju u 5 % CO2 vlažnom inkubatoru pri 37 _C. Različiti oligonukleotidi (vidi tablicu I, koncetracije su navedene u legendama slike), LPS (od salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ili anti-IgM su korišteni kao stimulatori. Chloroquine (5 μg/mL; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) je kokrištena za blokiranje endosomalnog sazrijevanja/ zakiseljavanja. Kod naznačenih točaka su stanice skaupljene za protočnu citometriju kao što je dolje opsiano.

Za istraživanja singalne transdukcije humane prirparne B-stanice su izolirane imunomagnetskim sortiranjem stanice upotrebom tehnike VARIOMACS (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA) kao što je opisano od proizvođača. Ukratko, PBMC dobivene od zdravih davatelja (Elmer L. DeGowin Blood Center, University of Iowa) su inkubirani s antitijelima vezanim na mikrozrna CD19 i prošli su preko pozitivne kolone. Čistoća B-stanica je bila veća od 95%. Nakon stimluacije su za istraživanje transdukcije pripravljeni cijeli ekstrakti stanica (Westem blot) i ekstraktui jezgre (EMSA).

Za istraživanje proteina koji se vezuju na CpG, Ramos stanice (humane Burkitt B stanična linija limfoma, ATCC CRL-1923 ili CRL-1596; Intervirology 5: 319-334,1975) su rasle u kompletnom mediju. Netretirane stanice su sakupljene i ekstrakti citosolnog proteina su pripravljeni i analizirani na prisustvo vezanih proteina na CpG oligonukleotide s EMSA i UV-ukrštenjem, kao što je niže opisano.

Protočna citometrija: Bojanje površine antigena je izvedeno kao što je prethodno opisano (Hartmann G. et al. 1998 J Pharmacol Exp Ther 285:920). Monoklonalna antitijela na HLA-DR su kupljena od Immunotech, Marseille, Francuska. Sva ostala antitijela su kupljena od Phanningen, San Diego, CA: mABs do CD 19 (B43), CD40 (50), CD54 (HA58), CD86 (2331 (FUN-1)). IgG1� (MOPC-21) i IgG2b,� su korišteni kao kontrola za specifično bojanje. Bojanje intracelularnog citokina za IL-6 je izvedeno kao što je opsaino (Hartmann G. i Krieg A. M. 1999. CpG DNA i LPS induciraju različitu aktivaciju humanih monocita, Gene Therapy 6:893). Ukratko, PBMC (konačna koncentracija 1x106 stanica/mL) su inkubirane u prisutnosti brefeldin A (konačna koncentracija 1 μg/mL, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Nakon inkubacije su stanice sakupljene i bojane upotrebom FITC-obilježenog mAB do CD19 (1343), PE-obilježenim štakorskim anti-humanim IL-6 mAb (MQ2-6A3, Pharmingen) i Fix i Perm Kit (Caltag Laboratories, Burlingame, CA). Podaci protočne citometrije od 5000 stanica po uzorku su dobiveni na FACScan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Nepogodne stanice su isključene iz analize s bojanjem propidijevim jodidom (2 μg/mL). Podaci su analizirani upotrebom kompjutorskog programa FlowJo (vezija 2.5. 1, Tree Star, Inc., Stanford, CA).

Test proliferacije: CFSE (5-(i-6-) karboksifluorescein diacetat sukcinimidilni ester, Molecular Probes, USA) je iz fluoresceina izvedena intracelularni fluorescentna oznaka koja se jednako razdijeli između stanica kćeri nakon diobe. Bojanje stanica s CFSE dozvoljava kvantifikaciju i imunofenotipizaciju (phycoerythrinom obilježena antitijela) proliferacije stanica u suspenziji miješanih stanica. Ukratko, PBMC je pran dva puta u PBS, ponovo suspendiran u PBS koji sadrži CFSE pri konačnoj koncetraciji od 5 μM, te je inkubiran pri 37 _C kroz 10 minuta. Stanice su prane tri puta s PBS i inkubirane pet dana, kao što je pokazano u legendi slike. Proliferacija CD19-pozitivnih B-stanica je identificirana smanjivanjem sadržaja CFSE, a upotrebom protočne citometrije.

Priprava cijelih stanica, ekstrakata protiena jezgre i citoplazme: Za Westem blot analizu su priravljeni ekstrakti cijele stanice. Prvo je na B-stanice djelovano medijem, fosfodiesterskim oligonukleotidom 2080 (SEQ ID NO.: 32 1) ili 2078 (SEQ ID NO.: 319) pri 30 μg/mL, ili anti-IgM (10 μg/mL). Stanice su sakupljene, prane dva puta s ledenom PBS koja sadrži 1 mM Na3VO4, ponovo su suspendirane u puferu za lizu (150 mM NaCl, 10 mM TRIS pH 7.4, 1 % NP40, I mM NNa3VO4, 50 mM NaF, 30 mg/mL leupeptin, 50 mg/mL a proteinin, 5 mg/mL antipain, 5 mg/mL pepstatia, 50 μg/mL fenilmetilsulfonifluorid (PMSF)), inkubirane kroz 15 minuta na ledu i rotirane pri 14000 rpm kroz 10 min. Supernatant je zaleđen kod -80 _C. Za pripravu ekstrakata su primarne B-stanice ponovo suspendirane u hipotoničnom puferu (10 mM HEPES/KOH (pH 7.9), 10 mM KCI, 0.05 % NP40,1.5 mM MgCl2, 0.5 mM ditiotreitol (DTT), 0.5 mM PMSF, 30 mg/mL leupeptin, 50 mg/mL a proteinin, 5 mg/mL antipain, 5 mg/mL pepstatin). Nakon 15 minuta inkubacije na ledu, suspenzija je centrifugirana pri 1000 x g kroz 5 minuta. Jezgre su ponovo suspendirane u ekstrakcijskom puferu (20 mM HEPES (pH 7.9), 450 mM NaCl, 50 mM NaF, 20% glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 30 mg/mL leupeptin, 50 mg/mL a proteinin, 5 mg/mL antipain, 5 mg/mL pepstatin) i inkubirane su na ledu jedan sat. Suspenzija jezgre je centrifugirana kroz 10 minuta pri 16000 g pri 4 _C. Supernatanti su sakupljeni i čuvani pri -80 _C. Ekstakti citoplazme za istraživanja CpG vezujućih proteina su pripravljeni iz nestimuliranih Rainos stanica, koje su podvrgnute lizi s hipotoničnim puferom opisanom za prirpavu ekstrakta jezgre. Nakon centrifugiranja supernatant je uklonjen kao citoplazmatska frakcija i čuvano je pri c -80 _C. Koncetracija proteina je mjerena korištenjem proteinskog testa po Bradfordu (Bio-Rad, Hercules, CA), a prema proizvođaču.

Western blot analiza: Jednake koncetracije proteinskog ekstrakta cijelih stanica (25 μg/liniji) su zagrijavane uz vrenje sa SDS uzorkom pufera (50 mM Tris-Cl, pH 6.8; 1% β-merkaptoetanol; 2% SDS; 0.1% bromfenil-plavo; 10% glicerol) kroz 4 min prije podvrgavanja elektroforezi na 10 % poliakrilamidnom gelu koji sadrži 0.1 % SDS (SDSPAGE). Nakon eletroforeze su proteini prenešeni na Immobilion-P prijenosnu membranu (Millipore Corp. Bedford, MA). Blotovi su blokirani s 5 % nemasnim suhim mlijekom. Korištena su specifična antitijela protiv fosforiliranog oblika ekstracelularnog receptora kinaze (ERK), c-jun NH2-terminalne kinaze (JNK), p38, te aktivirajućeg transkripcijskog faktora-2 (ATF-2) (New England BioLabs, Beverly, MA). Blotovi su razvijeni i pojačani kemiluminiscencijskom reagensom (ECL; Amersham Intemational, Aylesbury, U.K.) a prema postupku preporučenom od proizvođača.

Test pomaka pokretljivosti pri eletroforezi (EMSA): Da bi se detektirala aktivnost vezivanja DNA aktivatora transkricijskog faktora proteina-1 (AP-1) i NF�B, ekstrakti jezgre (1 μ/liniji) su analizirani s EMSA korištenjem dsODNs 5' GAT CTA GTG ATG AGT CAG CCG GAT C 3' (SEQ ID NO.: 83 8) koji sadrži AP-1vezujući sekvenciju, te NF�B URE od from the c-myc promotorske regije 5' TGC AGG AAG TCC GGG TTT TCC CCA ACC CCC C 3' (SEQ ID NO.: 1142) kao probe. ODNs su obilježeni s T4-polinukleotidnom kinazom (New England Biolabs) i (γ-32P) ATP (Amersham, Arlington Heights, IL). Reakcije vezivanja su izvedene s 1 μg ekstrakta proteina iz jezgre u DNA-vezujućem puferu (10 mM Tris-HCI (pH 7.5), 40 mM MgCl2, 20 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, 8% glicerol i 100-400 ng poli (dI-dC) s 20.000-40.000 cpm obilježenim ODN u 10 μL ukupnog volumena. Specifičnost NFKB vrpci je potvrđena kompeticijskim istraživanjima s hladnim oligonukleotidima iz mjesta vezivanja nesrodnog transkripcijskog faktora (10-100 ng). Za test superpoaka, 2 μg specifičnih antitijela za c-Rel, p50 i p65 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) su dodani u reakcijsku smjesu kroz 30 minuta prije dodatka radiobilježavanja. Nakon inkubiranja kroz 30 minuta pri sobnoj temperaturi dodan je pufer za nanošenje i izvedena je elektroforeza na 6% poliakrilamidunom gelu u Tris-borat-EDTA puferu (90 mM Tris, 90 mM borna kiselina, 2 mM EDTA, pH 8.0). Gelovi su usšeni te su autoradiografirani.

UV-unakrsno povezivanje i denaturirajuća elektroforeza proteina: Ekstrakti jezgre su inkubirani s obilježenim fosfodiesterskim oligomukleotidom kao što je opisano za EMSA. Kompleksi DNA-proteina su unakrsno povezani UV-svjetlom u Stratalinker (Stratagene) kroz 10 minuta. Probe su miješane s puferom SDS-uzorka, zagrijavane 10 minuta uz vrenje i nanešene na 7.5% SDS-PAGE. Gel je sušen na Whatman papiru i aurografiran. Krivulja ovisnosti razmaka prema malekulskoj masi proteinskog markera je dala standardnu krivulji koja je korištena za izračunavanje odgovrajuće molekulske mase unakrsno povezanog kompleksa proteina-ODN. The Molekulska masa oligonukleotida je odbijena od te vrijednosti da se dobije veličina.

Primjer 9: Identifikacija optimalnog CpG motiva za upotrebu samog ili u kombinaciji s T-obogaćenim ODN

Fosforotioatni oligonukleotidi koji imaju CpG motiv glodavca GACGTT (SEQ ID NO.: 1143) (primjerice 1826 (SEQ ID NO.: 69)) te su korišteni pri koncetracijama su aktivni u B-stanicama glodavaca (Yi A. K., Chang M., Peckham D. W., Krieg A. M. i Ashman R. F. 1998. CpG oligodeoxyribo-nucleotides rescue mature spleen B cells from spontaneous apoptosis and promote cell cycle entry. J Immunol 160:5898), su pokazali malu ili nikakvu imunostimulirajuću aktivnost na humanim imunim stanicama. Pri višim koncentracijama je nađeno da taj ODN ima neki imunostimulirajući efekt na B-stanice.

U ranim istraživanjima aktivacije B-stanica kod miševa je nađeno da je CpG dinukleotid koji je okružen s dva 5' purina i dva 3' pirimidina i preferirano je 6-merni motiv 5' GACGTT 3' (SEQ ID NO: 1143) optimalni da fosfodiesterski oligonukleotid bude aktivan (Krieg A. M., et al. 1995 Nature 374:546, Yi A. K., Chang M., et al. 1998 J Immunol 160:5898).

Da bi se identificirao optimalni motiv za stimulaciju imunog odgovora u humanim kralježnjacima koji nisu glodavci, testirana je aktivnost serija ODN. Prvo smo pripravili 20-merni fosfodiesterni oligonukleotid s TC dinukleotidom na5' kraju prije optimalnog CpG motiva glodavca 5' GACGTT 3' (SEQ ID NO.: 1143) a nakon toga slijdi poli-T rep (2079: 5'TCG ACG TTC CCC CCC CCC CC 3'(SEQ ID NO.: 320)). Taj oligonukleotid je dodan u humane primarne B-stanice pod istim uvjetima, te je nađeno je da je optimalno za DNA E. coli (ponovljena dodavanje pri 0 sati, 4 sata i 18 sati; 30 μg/rnL za svaku točku) stimulirao visoku razinu ekspresije CD86 humanih primarnih B-stanica nakon dva dana. Da se odredi odnos strukture i funkcije CpG motiva mi smo zamjenili susjedne baze u CpG ndinukleotidima, a održavali smo dva CpG dinukleotida unutar sekvencije. Izmjena adenina smještenog između obaju CpG dinukleotida timidinom (2080 (SEQ ID NO.: 321)) je imala kao rezultat blago veću aktivnost. Zamjena gvanozina (2100 (SEQ ID NO.: 34 1)) ili citidina (2082 (SEQ ID NO.: 3 23)) na tom položaju nije pokazala glavne promjene u usporebi s 2079 (SEQ ID NO.: 320). Nasuprot tome, zamjena timidina 3' za drugi CpG dinukleotid s purinskim gvanozinom (2099 (SEQ ID NO.: 340)) ili adeninom (2083 (SEQ ID NO.: 324)) kao razultat ima značajan pad aktivnosti oligonukleotida, dok je pirimidinski citidin uzrokovao samo malo smanjenje. Timidin odmah na 5' prema prvom CpG dinukleotidu je također bio važan. Zamjena timidina bilo kojom drugom bazom (2105 (SEQ ID NO.: 346), gvanozimon; 2107 (SEQ ID NO.: 348), adeninom; 2104 (SEQ ID NO.: 345), citidinom) vodi smanjivanju aktivnosti markera oligonukleotida. Eliminacijom prvog (2108 (SEQ ID NO.: 3 )49)) ili drugog (2106 (SEQ ID NO.: 347)) CpG dinukleotida također se djelomično smanjuje aktivnost.

Dodatak više 5' GTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1144) CpG motiva fodiesterskom oligonukleotidu koji sadrži 8-merni dupleks CpG motiva (5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1145), 2080 (SEQ ID NO.: 32 1)) ne povećava dalje CD86 ekspresiju na B-stanicama (2059 (SEQ ID NO.: 300)). Oligonukleotid s istom sekvencijom kao 2080 (SEQ ID NO.: 321) ali s fosforotioatnim skeletom ne pokazuje aktivnost iznad osnovne (2116 (SEQ ID NO.: 357)). To je bilo iznenađujuće jer je pokazano da fosforotioatni skelet dobro stabilizira oligonukleotide i povećava s CpG induciranu stimulaciju (Krieg A. M., Yi A. K., Matson S., Waldschmidt T. J., Bishop G. A., Teasdale R., Koretzky G. A. i Klinman D. M. 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 374:546). Mi smo stoga izveli daljnju analizu strukture i funkcije fosforotioatnih oligonukleotida koji sadrže 5' GTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1144) i 5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1145) motive, što pokazuje da dodatni CpG motivi (2006 (SEQ ID NO.: 246)) imaju tendenciju povećanja aktivnosti fosforotioatnih oligonukleotida.

Pročišćene B-stanice izolirane iz periferne krvi imunomagnetskim sortiranjem su aktivirane s CpG DNA do iste mejre kao nepročišćene B-stanice s PBMC. Stoga je aktivacija B-stanica primarni odgovor a ne sekundarni efekt uzrokovan izlučivajnem citokina od drugih stanica.

Uz kostimulaciju molekule CD86, funkcijski stupanj B-stanica je karakteriziran drugim površinskim markerima. Primjerice, aktivirane T pomoćne stanice stimuliraju B-stanice ligacijom CD40, intracelularna adhezijska molekula-1 (ICAM-1, CD54) posreduje vezivajnem na ostale imune stanice i glavni histokompatibilni komples II (MHC 11) je odgovoran za prezentaciju antigena. Našli smo da je ekspresija B-stanice CD40, CD54 i MHC II povećana CpG oligonukleotidom 2080 (SEQ ID NO.: 3 2 1). Ne-CpG kontrolni oligonukleotid 2078 (SEQ ID NO: 319) nije pokazao aktivnost u uspredbi sa samim medijem.

Kada su PBMC inkubirane 5 dana u prisutnosti 2080 (SEQ ID NO.: 321) (dodano 0 sata, 4 sata, 18 sata i svako sljedeće jutro), bilo je intrignantno da je u podpopulaciji limfocita povećana veličina stanica (FSC) i porasle su granulacije (SSC). Da bi se ispitala podpooulacija predstavljena proliferacijom B-stanica, mi smo bojali svježe izolirani PBMC s CFSE (5-(i-6-) karboksifluorescein diacetat sukcinimidilni ester) dana 0 i inkubirali ih kroz 5 dana s 2080 (SEQ ID NO.: 321) 145, a kao gore. CFSE je fluorescentna molekula koja se ireverzibilno vezuje na proteine stanice. Dioba svake stanice smanjuje CFSE za 50 %. Za stanice koje se slabo boje s CFSE (proliferirane stanice) je nađeno da su uglavnom CD19-pozitivne B-stanice. Oligonukleotid 2080 (SEQ ID NO.: 321) inducira proliferaciju 60 do 70 % D19 pozitivnih B-stanica, a unutar 5 dana. Kontrolni oligonukleotid 2078 (SEQ ID NO.: 319) inducira proliferaciju manje od 5 %B-stanica. Proliferirajuće B-stanice (CFSE niski) su veće (FSC) i više granulirane.

Proliferirane B-stanice eksprimiraju veće razine CD86 nego neproliferirajuće stanice (nije pokazano). U skladu s tim pronalaskom da su gore testirani oligonuleotidi za indukciju ekspresije CD86 imali kao rezlutat gotovo isti oblik proliferacije B-stanica. Zamjena 3' timidina smanjuje aktivnost više nego što zamjena timidina u srednjem položaju.

Primjer 10: Aktivacija B-stanica zahtjeva ensosomalno sazrijevanje/zakseljavanje

Prije je pokazano da klorokin, inhibitor endosomalnog zakiseljavanja blokira s CpG posredovanu stimulaciju stanica koje prezentiraju antigen glodavca i B-stanice, dok ne djeluju na efekte posredovane s LPS (Hacker H., et al 1998 Embo J 17:6230, Yi A. K et al 1998 J Immunol 160:4755, Macfarlane D. E. i Manzel L. 1998 J lmmunol 160:1122). Mi smo našli da dodatak 5 μg/mL klorkina kompletno blokira indukciju ekspresije CD86 posredovane s CpG DNA, a na primarnim B-stanicama (MFI CD86: 2006 (SEQ ID NO.: 246), 4.7 vs 1.4; E. coli DNA, 3.4 vs. 1.4; sam medij, 0.9; n=4). Nadalje, klorkin je kompletno inhibirao indukciju proliferacije B-stanica s fosforotioatnim oligonukleotidom 2006 (SEQ ID NO.: 246) mjereno testom proliferacije CFSE kao standardom. Ti rezultati pokazuju da je sa stanicama glodavaca aktivacija humanih B stanica s CpG DNA zahtjeva prihvat DNA u endosome, te endosomalno zakiseljavanje.

Primjer 11: Analiza substaničnih događaja do kojih dolazi nakon stimulacije B-stanica s optimalnim humanim ODN

Kako je zahtjev za CpG motivom za maksimalnu aktivaciju B-stanica većinom različita između miša (GACGTT) (SEQ ID NO: 1143) i ljudi (TCGTCGTT) (SEQ ID NO: 1145), bilo smo zainteresirani iztražiti jesu li osnovni događaji intracelularne signalizacije usporedivi. Brza indukcija aktivnosti vezivanja NFKB je ranije nađena kod B-stanica glodavaca i makrofaga (Stacey K. J., et al 1996 J Immunol 157:2116, Yi A. K et al 1998 J Immunol 160:4755). Da se istraži odgovor NF�B na CpG DNA kod ljudi, humane priprarne B-stanice su izolirane iz periferne krvi imunomagnetskim sortiranjem stanica i inkubirane su s CpG oligonukleotidom 2080 (SEQ ID NO.: 321), ne-CpG kontrolnim oligonukleotidom 2078 (SEQ ID NO.: 319), ili medijem. Kod naznačenog vremena su stanice sakupljene i prirpavljen je ekstrakt jezgre. U prisutnosti CpG oligonukleotida povećana je aktivnost vezivanja NF�B, a unutar jednog sata i održavana je do 18 sati (vrijeme zadnje ispitivane točke). Ne-CpG kontrolni oligonukleotid 2078 (SEQ ID NO.: 319) nije pokazivao povećani aktivnost NF�B u usporedbi sa stanicama inkubiranim samo u mediju. Vrpca NF�B koja je identificirana hladnom kompeticijom, kao što je pokazano testom superpomaka, sastoji se od p50 i p65 podjedinica.

Transkripcijski faktor aktivirajućeg proteina (AP-1) je obuhvaćen u regulaciji ranih gena i ekspresiji citokina (Karin M. 1995. The regulation of API activity by mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem 270:16483). U B-stanicama glodavaca AP-1 vezujuća aktivnost je inducirana u odgovoru na CpG DNA (Yi A. K., i Krieg A. M. 1998. Rapid induction of mitogen-activated protein kinases by immune stimulatory CpG DNA. J Immunol 161:4493). Da se odredi bi li taj transkripcijski faktor također bio induciran od CpG DNA u ljudima, mi smo ispitivali AP-1 DNA vezujuću aktivnost u humanim primarnim B-stanicama. Stanice su inkubirane s CpG oligonukleotidom 2080 (SEQ ID NO.: 321) ili kontrolnim oligonukleotidom 2078 (SEQ ID NO.: 319). Ekstrakti jezgre su pripravljeni i AP-1 vezujuća aktivnost je analizirana s EMSA. AP-1 vezujuća aktivnost je povećana unutar jednog sata i povećavala se 18 sati (vrijeme zadnje isptivane točke), pokazujući zadržani odgovor.

Kako je AP-1 aktivnost inducirana mnogim stimulanima (Angel P. i Karin M. 1991. The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation. Biochim Biophys Acta 1072:129), mi smo bili zainteresirani za put signalne transdukcije uzvodno od AP-1. Kompleks transkripcijskog faktora AP-1 povezuje različite mitogene puteve aktivirane protein kinaze (MAPK) (Karin M. 1995. The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem 270:16483). Westem blotovi su porevedni korištenjem ekstrakta cijelih stanica iz primarnih B-stanica inkubiranih s CpG oligonukleotidom 2080 (SEQ ID NO.: 321), kontrolom 2078 (SEQ ID NO.: 319), ili samim medijem. Korištena su specifična antitijela na fosforilirani oblik JNK, p38, ATF-2 i ERK. Jaka indukcija fosforilacije JNK je našena 30 min i 60 min nakon izlaganja CpG-DNA, dok ne-CpG oligonukleotid nije pokazivao aktivnost iznad osnovne. Protein kinaza p38, druga stresom aktivirana protein kinaza (SAPK), je također fosforilirana u odgovoru na CpG DNA unutar 60 min. ATF-2, supstrat za p38 i JNK (Gupta S., Campbell D., Derij ard B. i Davis R. J. 1995. Transcription factor ATF2 regulation by the JNK signal transduction pathway. Science 267:389) i komponenta AP-1 kompleksa, pokazuje slabu fosforilaciju nakon 30 minuta koja se poveća nakon 60 minuta. CpG DNA ne inducira znatniju fosforilaciju ERK. Nasuprot tome, anti-IgM, stimulrajući receptor B-stanica, pokreće fosforilaciju ERK. Anti-IgM aktivira različite izoforme JNK nego CpG DNA.

Primjer 12: Test za in vivo aktivnost adjuvansa

Razvijen je test in vitro probiranja da se identificira ODN koristan kao adjuvans in vivo kod ljudi i ostalih životinja koje nisu glodavci. Kako nismo vidjeli samo kvalitativnu već kvantitativnu razliku aktivnosti različith CpG ODN kod miševa, prvo smo probrali skupinu CG i ne-CpG ODN na stanicama miša i našli in vitro testove s pouzdanom i jakom kolelacijom in vivo aktivnost adjuvansa s B površinskim antigenom hepatitisa (HBsAg). Zatim smo sistematski testirali skupinu više od 250 ODN u odgovarajućim humanim testovima da se identificiraju in vitro sekvencije imunostimulirajuće aktivnosti. Sljedeće smo ispitivali da li ODN s najvećom aktivnosti u tim humanim testovima također aktiviraju proliferaciju B-stanica čimpazna i majmuna i konačno da li aktiviraju kao adjuvansi s HBsAg u čimpanzama i cimolognim majmunima in vivo. Ta istraživanja su pokazala da sekvencija, broj i mjesto pojedinog CpG motiva doprinosi imunostimulirajućoj aktivnosti CpG fosfototioatnog ODN. ODN s TC dinukleotidom na 5 kraju za tri 6-metnim CpG motivima (5' GTCGTT 3') razdvojen s TT dinukleotidom konzistentno pokazuje najvišu aktivnost kod leukocita ljudi, čimpanzi i rhesus majnumna. Čimpanze i majmuni vakcinirani jedanput protiv hepatitisa B s CpG ODN adjuvansom su razvili 15 puta veću titar anti-HB antitijela nego oni koji su primili samu vakcinu.

Materijali i metode

Oligonukleotidi: Fosforotioatno modificirani ODN je kupljen od Operon Technologies (Alaineda, CA) i Hybridon Specialty Products (Milford, MA). ODN je tesiran na endotoksin korištenjem LAL-testa (LAL-assay BioWittaker, Walkersville, MD; donja granica detekcije 0. 1 EU/mL). Za in vitro test, ODN je razrijeđen u TE puferu (10 mM Tris, pH 7.0, 1 mM EDTA), i čuvan je pri -20 _C. Za in vivo upotrebu, ODN je razrijeđen u fosfatnoj puferiranoj fiziološkoj otopini (0. 1 M PBS, pH 7.3) i čuvano je pri 4 _C. Sva razrjeđenja su izvedena korištenjem otapala bez pirogena.

Stanične kulture mišje slezene: Slezene su uklonjene iz 6-12 tjedana starih ženki BALB/c (The Jackson Laboratory), 2 x 106 splenocita je kultivirano s 0.2 μM ODN kroz 4 hours (TNF-α) ili 24 hours (IL-6, IFN-γ, IL- 12), te su citokini detektirani s ELISA kao što je prethodno opisano (Yi A. K., Klimnan D. M., Martin T. L., Matson S. i Krieg A. M. 1996. Rapid immune activation by CpG motifs in bacterial DNA. Systemic induction of IL-6 transcription through an antioxidant-sensitive pathway. J lmmunol 157:5394). Da se procjeni proliferacija B-stanica inducirana s CpG, stanice slezene su odvojene od T stanica s anti-Thy-1.2 i komplementom, te su centrifugirane preko lympholyte M???? (Cedarlane Laboratories, Homby, ON, Canada), kultivirane 44 sata s naznačenim ODN, te su pulsirane 4 sata s 1 μCi 3H timidina kao što je ranije opisano (Krieg A. M., Yi A. K., Matson S., Waldschmidt T. J., Bishop G. A., Teasdale R., Koretzky G. A. i Klinman D. M. 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 374:546). Da se istraži litička aktivnost NK stanica, stanicama slezene glodavaca su uklonjene B-stanice korištenjem magnetsko presvlačenje s kozjim anti-mišjim Ig, kao što je prethodno detaljno pokazno (Ballas Z. K. i Rasmussen W. 1993. Lymphokine-activated killer cells. VII. IL-4 induces an NK1.1+CD8 α+β-TCR-αβ B220+ lymphokine-activated killer subset. J Immunol 150:17). Stanice su kultivirane na 5 x 106/jažici na ploči s 24 jažica i sakupljene sa sata 18 za upotrebu kao efektorske stanice u standardnom 4 stanom testu oslobađanja 51Cr na YAC-1 ciljane stnaice. Jedinica (LU) je definirana kao broj stanica potrebnih da djeluje na 30% specifičnih liza.

Imunizacija miševa protiv HBsAg i procjena humoralnog odgovora: Grupe od 6-8 tjedana starih ženki miševa BALB/c mice (n = 5 ili 10, Charles River, Montreal, QC) su imunizirane protiv HBsAg kao što je prethodno opisano (Davis H. L., et al 1998 J lmmunol 160:870). Ukratko, svaki miš je primio jednu IM injekciju 50 μL PBS koji sadrži 1 μg recombinant HBsAg (Medix Biotech, Foster City, CA) i 10 μg CpG ODN ili ne-CpG ODN kao jedini adjuvans ili kombiniran s alumom (Alhydrogel "85", Superfos Biosector, Vedbaek, Demnark; 25 mg Al3+/mg HBsAg). Kontrolni miševi su imunizirani s HBsAg bez adjuvansa ili s alumom. Plazma je uzeta od miševa u različlitim vremenima nakon imunizacije i Abs specifičan na HBsAg (anti-HBs) je kvantificiran ELISA testom završnog razrjeđenja (u triplikatu) kao što je prethodno opisano (Davis H. L et al 1998 J Immunol 160:870). Završni titri su određeni kao najviše razrjeđenje plazme čiji je rezultat dva puta veća vrijednost apsorbancije (OD450) nego ona od neimune plazme, a s odrezanom vrijednosti od 0.05.

Izolacija PBMC primata i staične kulture: Mononuklearne stanice periferne krvi (PBMC) su izolirane iz periferne krvi zdravih volontera, čimpanzi ili rhesus majmuna Ficoll-Paque centrifugiranjem gradijenta gustoće (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kao što je opisano (Hartmann G., et al 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:29 1)). Stanice su suspendirane u RPMI 1640 mediju za kulturu uz dodatak 10 % (v/v) toplinom inaktiviranog (56 _C, 1 h) FCS (HyClone, Logan, UT), 1.5 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina i 100μg/mL streptomicina (svo od Gibco BRL, Grand Island, NY) (kompletni medij). Stanice (konačna koncentracija 1x106 stanica/mL) su kultivirane u kompletnom mediju u 5 % CO2 vlažnom inkubatoru pri 37 _C. ODN i LPS (od Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ili anti-IgM su korišteni kao stimulatori. Za mjerenje litičke aktivnosti NK, PBMC su inkubirani pri 5 x 106/jažici na ploči s 24 jažice. Kulture su sakupljene nakon 24 sata i stanice su koirštene kao efektori u standardnom 4 stanom testu oslobađanja 51Cr na K562 ciljane stanice, kao što je ranije opisano. (Ballas Z. K., Rasmussen W. L. i Krieg A. M. 1996. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA. J lmmunol 157:1840; Ballas Z. K. i Rasmussen W. 1993. Lymphokine-activated killer cells. VII. IL- 4 induces an NK1.1+CD8 α+β-TCR-αβ B220+ lymphokine-activated killer subset. J Immunol 150:17). Za proliferaciju B-stanice 1 μCi 3H timidina je dodano 18 sati prije sakupljenja i ugradnja 3H timidina je određena scintilacijskim brojanjem dana 5. Standerdna devijacija kažic u triplikati je <5%.

Protočna citometrija PBMC primata: Površinski antigeni na PBMC primata su bojani kao što je prethodno opisano (Hartmann G et al 1998 J Pharmacol Exp Ther 285:920). Monoklonalna antitijela na CD3 (UCHTI), CD14 (M5E2), CD19 (B43), CD56 (B159), CD69 (FN50) i CD86 (2331 (FUN-1)) su kupljena od Pharmingen, San Diego, CA. IgG1,� (MOPC-21) i IgG2b,� (Hartmann G et al 1999 PNAS 96:9305) su korišteni za kontrolu nespecifičnog bojanja. NK stanice su identificirane CD56 ekspresijom na CD3, CD14 i CD19 negativnim stanicama, dok su B-stanice identificirane ekspresijom CD19. Podaci protočne citometrije od 10000 stanica po uzorku su dobiveni na FACScan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Pogodnost stanica unutar FSC/SSC vrata korištena za analizu je ispirano bojanjem s propidium jodidom (2 μg/mL) i nađeno je da je više od 98%. Podaci su analizirani korištenjem kompjutorskog programa FlowJo (verzija 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA).

Imunizacija čimpanzi i cimolognih majnuna protiv HBsAg i procjena humoralnog odgovora: Četrnaest cimolognih majmuna je imunizirano s pedijatrijskom dozom Engerix-B (SmithKline Beecham Biologicals, Rixensart, BE) koji sadrži 10 μg HBsAg adsorbiran na alum (25 mg Al3+/Mg HBsAg). To je dano samo (n=5), ili kombinirano s CpG ODN 1968 (n=5, 500 μg) ili CpG ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) (n=4, 150 μg). Četiri čimpanze (10-20 kg) su imunizirane na isti način primanjem kontrolne vakcine (samo Engerix-B) te dvije primanjem eksperimentalne vakcine (Engerix-B plus 1 mg CpG ODN 2006). Sva vacine su dane IM u desni but u ukupnom volumenu od 1 mL. Miševi su čuvani u Primate Research Center (Bogor, Indonesia) i čimpanze su čuvane u Bioqual (Rockville, NM). Specijalisti za životinje su ih pratili svaki dan. Nisu zapaženi simptomi opće bolesti niti lokalne nepovoljne reakcije na mjestu injektiranja. Plazma je izloirana IV punktiranjem prije, te pri raznim vremenima nakon imunizacije i čuvana je zamrznuta (-20 _C) do testa antitijela. Anti-HBs antitijela su detektirana upotrebom komercijalnog ELISA kita (Monolisa Anti-HBs; Sanofi-Pasteur, Montreal, QC) i titri su izraženi u mIU/mL zasnovano na usporedbi s standardima definiranom od WHO (Monolisa Anti-HBs Standards; SanofiPasteur).

Rezultati

Identifikacija CpG ODN s različitim profilima in vitro imune aktinvosti: Naša istraživanja su pokazala da određene baze na 5' i 3' stranama CpG dinukleotidea unutar CpG motiva mogu imati utjecaj na razinu imune aktivacije sintetskog ODN, ali nije bilo jasno da li različiti CpG motivi mogu pokazati različite imune efekte. Da se procjeni ta mogućnost, mi smo testirali panel CpG ODN a prema njihovoj sposobnosti indukcije litičke aktivnosti NK, proliferacije B-stanica, te stimulaciju sinteze TNF-α, IL-6, IFN-γ i IL-12 u stanicama slezene glodavca. Imunostimulirajuća aktivnost ODN bez CpG motiva (ODN 1982 (SEQ ID NO.: 225), ODN 1983 (SEQ ID NO.: 226)) je negativna ili slaba u uspredbi s CpG ODN. ODN s motivom koji nije optimalni CpG (ODN 1628 (SEQ ID NO.: 767), ODN 1758 (SEQ ID NO.: 1)) je bio manje aktivan od ODN koji sadrži CpG motiv okružen dvama 5' purinima i trima 3' pirimidinima (ODN 1760 (SEQ ID NO.: 3), ODN 1826 (SEQ ID NO.: 69), ODN 1841 (SEQ ID NO.: 84)). ODN 1826 koji sadrže dva optimalna motiva glodavca CpG (5' GACGTT 3') (SEQ ID NO: 1143) su imali najvišu aktivnost za 5 od 6 mjerenih završnih točaka. Osim za ODN 1628, svi ODN su općenito pokazali sličan oblik aktivnosti (liza posredovana NK stanicama, proliferacija B-stanica, IL-12, IL-6, TNFα, IFN-γ). Treba zabilježiti da ODN 1628, koji je jedinstven u toj skupini jer ima dvije G-obogaćene regije, je pokazao preferentnu indukciju sinteze IFN-γ ali relativno malu stimulaciju ostalih aktivnosti.

Identifikacija in vitro testa koji korelira s in vivo aktivnosti adjuvansa: Kako je aktivnost adjuvansa in vivo završna točka, nas je zanimalo identificirati in vitro test koji će predvidjeti aktivnost adjuvansa CpG ODN in vivo. Isti ODN korišten za in vitro završne točke je testiran prema aktivnosti adjuvasna u imunizaciji miševa protiv HBsAg. To je izvedeno sa samim ODN i ODN kombinirano s alumom jer su ranija istraživanja pokazala jaku sinergiju za CpG ODN i alum kao adjuvans (PCT Publicirana patentna aplikacija W098/40100).

BALB/c miševi imunizorani s HBsAg bez adjuvansa su imali samo niske titre anti-HBs od 4 tjedna, i na to nije utjecao dodatak kontrolnog ODN. Nasuprot tome, dodatak CpG ODN je povećao anti-HBs titre za 5 do 40 puta, ovisno o korištenoj sekvneciji. Kada je dodan alum, titri anti-HBs su bili približno 6 puta veći od samog HBsAg. Specifično, kontrolni ODN nije imao efekt, pa su različiti CpG ODN povećali su te titre za 2 do 36 puta. Rezultati dobiveni s različitim samim ODN korelirali su vrlo dobro (r = 0.96) s onima dobivenom sa samim ODN plus alum. Kada je izvedena linerna regresija, nađen je vrlo visoki stupanj korelacije između nekih in vitro testova i in vivo povećanja anti-HBs titara. Od svih ispitivanih završnih titara, inducija litičke aktivnosti NK je pokazala najbolju korleaciju s in vivo aktivnosti adjunasa (bez aluma, r = 0.98; s alumom, r = 0.95; p < 0.0001). Dobivena je također dobra korelacija koja se tiče aktivnosti adjuvnasa za stimulaciju B-stanica (r=0.84 i 0.7), kao i izlučivanje TNF-α (r=0.9 i 0.88), IL-12 (r=0.88 i 0.86) i IL-6 (r=0.85 i 0.91). Jedini in vitro test koji nije korelirao dobro s in vivo rezultatima je izlučivanje IFN-γ (r=0.57 i 0.68). Ti poaci pokazuju da in vitro testovi za litičku aktivnost NK, aktivaciju B-stanica i produkciju production of TNFα, IL-6 i IL- 12 pokazuju vrijedne informacije in vitro da bi predvidio aktivnost danog ODN in vivo.

Probiranje skupine fosforotioatnih ODN na aktivaciju NK stanica: U prethodnim istraživanjem smo našli da je sinteza upalnih citokina u humanim PBMC inducirana pri izrazito malim količinama endotoksina (inducirano izlučivanje TNF-α se može detektirati sa sako 6 pg/mL ndotoksina, 2 log osjetiviji od imunih stanica glovaca). Nasuprot tome, aktivacija humanih B-stanica i indukcija litičke aktvnosti humanih NK s endotoksinom je niska čak pri visokim koncetracjama endotoksina. Zasnovano na tim rezultatima smo odabrali aktivaciju NK stanica (litička aktvnost ekspresije CD69) i B-stanica (proliferacija ekspresije CD86) kao vrlo specifični i resproduktivni testovi s niskom raznolikosti među subjetima i koristili smo ih za in vitro probiranje grupe ODN.

Prvo smo ispitivali efekt fosfotioatnog ODN koji sadrži različite kombinacije i permutacije CpG motiva NK stanicama posredovane lize ciljanih stanica. Da bi bila jasna i da bi se olakšala prezentacija, pokazani su razultati samo s odabranim predstavnicima CpG i kontrolnom ODN. Humane PBMC su inkubirane s različitim fosforotioatinim ODN (6 μg/mL) korz 24 hours i testirana je njihova sposobnost lize 51Cr obilježenih K562 stanica. ODN s dva 6-merna CpG motiva (5' GACGTT 3' (SEQ ID NO.: 1143) ili 5' GTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1144)) u kombinaciji s TpCna 5' kraju ODN (ODN 1840 5'TCCATGTCGTTCCTGTCGTT 3'(SEQ ID NO.: 83), ODN 18515' TCCTGACGTTCCTGACGTT 3' (SEQ ID NO.: 94) ili s najmanje tri 6-merna motiva bez TpC na 5' kraju (ODN 2013 (SEQ ID NO.: 253)) pokazuju srednju aktivnost. Nađena je visoka aktivnost 5' TpC koji je izravno prije 6-mernog humanog CpG motiva (5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1145)) kojeg prate dva 6-merna motiva (ODN 2005 (SEQ ID NO.: 245), ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) i ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247)). Najbolji rezultati su dobiveni kada su 6-merni CpG motivi odijeljeni jedan od drugog i od 5' 8-mernog CpG motiva s TpT (ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246)).

Ekspresija aktivacije markera CD69 je brzo povećana na površini NK stanica nakon stimullacije. Da se potvrde rezultati lize NK stanica, PBMC su inkubirane 18 sati s ODN (2 μg/mL). Ekspresija CD69 je ispitana na 56 pozitivnim NK staicama (CD3, CD14 i CD19 negative). Mada je indukcija ekspresije CD69 bila manje sekvnecijski spriječena nego stimulacija funkcionalne aktivnosti NK stanica, kontrolni ODN (ODN 1982, ODN 2116, ODN 2117, ODN 2010) su pokazali samo malu aktivnost sličnu baznoj razini. ODN s dva humana CpG motiva odvojeni s 5' TTTT 3' (ODN 1965 (SEQ ID NO.: 208)) ili četiri humana CpG motiva bez odvajanja (ODN 2013 (SEQ ID NO.: 253)) su relativno aktivniji pri indukciji ekspresije CD69 nego stimulira-juća litička aktivnost NK stanica. Optimalna funkcionalna aktivnost NK stanica kao i ekspresija CD69 je dobivena s ODNs koji sadrže TpC dinukleotide koji prethodi humanom CpG motif, i dodatnom humanom motivu unutar sekvencije (ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247)).

Aktivnost fosfotioatnog ODN za stimuliranje humanih B-stanica: U preliminarnim eksperimentima smo našli da je postotak proliferacije B stanica (test CFSE, vidi dio o metodama) korelira s površinskom ekspresijom kostimulirajuće CD86 na B-stanice, a mjereno protočnom citometrijom. Stoga smo koristili ekspresiju CD86 na B-stanice za probiranje skupine ODN prema imunostimulirajućoj aktivnosti. PBMC su inkubirani s 0.6 μg/mL ODN. Ekspresija CD86 (srednja vrijednost fluorescentnog intenziteta, MFI) je ispitana na CD19 pozitivnim B-stanicama. Poli-C ODN (ODN 2017 (SEQ ID NO.: 257)) ili ODN bez CpG dinukleotida (ODN 1982 (SEQ ID NO.: 225)) nisu stimulirali humane B-stanice pod ovim eksperimentalnim uvjetima. Fosforitioatni ODN (ODN 2116 (SEQ ID NO.: 256)) s jednim optimalnim CpG motivom kojem prethodi TpC (5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1145)) je imao nisku aktivnost. Prisutnost jednog humanog 6-mernog CpG mmotiva (5' GTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1144)) nije imao aktivirajući utjecaj. Dva od ta CpG motiva unutar sekvencije nisu pokazali aktivnosti (ODN 1960 (SEQ ID NO.: 203), ODN 2016 (SEQ ID NO.: 256)) ili su pokazali srednju aktivnost (ODN 1965 (SEQ ID NO.: 208)), a ovisnu o sadržaju sekvencije. Kada je ODN bio sastavljen od četiri kopije tog motiva (ODN 2012 (SEQ ID NO.: 252), ODN 2013 (SEQ ID NO.: 253), ODN 2014 (SEQ ID NO.: 254)), mogla se detektirati srednja aktivnosti na B-stanice. Kombinacija humanog 8-mernog CpG motiva na 5' kraju ODN s dva 6-merna CpG motiva (ODN 2005 (SEQ ID NO.: 245), ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247), ODN 2102 (SEQ ID NO.: 343), ODN 2103 (SEQ ID NO.: 344)) vodi značajnom povećanju sposobnosti ODN da stimulira B-stanice. Razmak između jednog motiva je kritičan. Odvajanje CpG motiva s TpT je preferirano (ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246)) u uspredbi s neodvojenom CpG motivom (ODN 2005 (SEQ ID NO.: također usporedi ODN 1965 (SEQ ID NO.: 208) s ODN 1960 (SEQ ID NO.: 203)). Humani 6-merni CpG motiv (5' GTCGTT 3') je bolji od optimalnog mišjeg 6-mernog CpG motiva (5' GACGTT 3' (SEQ ID NO.: 246)) kada se kombinira s humanim 8-mernim CpG motivom na 5' kraju (ODN 2006 vs. ODN 2102 (SEQ ID NO.: 343) i ODN 2103 (SEQ ID NO.: 344)). A (TCG)poli ODN je inaktivan ili samo slabo aktivan, kao što je bio ODN koji sadrži CpG dinukleotide koji okružuju gvanine ili druge CpG dinukleotide (ODN 20 10 (SEQ ID NO.: 250)). Uzeto zajedno, pronalasci za NK stanice i B-stanice konzistentno pokazuju da od testiranih ODN, ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) ima najviši imunostimlirajuću aktivnost na humane imune stanice.

Komparativna analiza mogućnosti CpG fosforotioiatnih ODN u različitim primatima: Različiti CpG motivi su optimalni za aktivaciju imunih stanica ljudi i glodavaca. Nadalje, broj i mjesto CpG motiva unutar aktivnog fosforoatnog ODN je različita u miševima i ljudima. Nas je interesiralo da li CpG fosforotioatni ODN pokazuje sličnu aktivnost među različitim vrstama primata. Usporedili smo grupu CpG ODN prema njihovoj sposobnosti da induciraju proliferaciju B-stanica kod ljudi, čimpanza i rhesus ili cinomolginh majmuna. Spsobnost ODN da stimuliraju proliferaciju humanih B-stanica (Tablica J) daje dobru korelaciju s njihovom spsobnosti da induciraju ekspresiju CD86 B-stanica. ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), koji pokazuje najvišu aktivnost u humanim B stanicama i NK stanicama je također najaktivniji u stimuliranju proliferacije B-stanica čimpanzi i rhesus majmuna (Tablica J). ODN 1968 (SEQ ID NO.: 211) i ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) daju najvišu aktivaciju B-stanica cinomolgnih majnuna in vitro (SI od 25 odnosno 29 pri 6 μg ODN/mL). Iznenađujuće, CpG ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247), koji pokazuje sličnu visoku aktivnosti kao optimalni ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) u humanim stanicama, ne stimulraju proliferaciju B-stanica Resus majmuna ili čimpanze, te ODN 1968 (SEQ ID NO.: 211) spokazuju nisku aktivnost. CpG ODN originalno izdvojeni zbog velike aktivnsoti kod miševa (ODN 1760 (SEQ ID NO.: 3), ODN 1826 (SEQ ID NO.: 69)) su pokazali malu aktivnost od majmuna (Tablica J).

Tablica J: Poliferativni odgovor PBMC na fosforotioatne CpG ODN kod primata

[image]

PBMC su prirpavljeni iz periferne krvi i inkubirani s ODN (0.6 μg/mL) kao što je naznačeno za pet dana. Proliferacija je mjerena prihvatom 3H/timidina (cpm/1000) tijekom zadnjih 18 sati. Više od 95% proliferiranih stanica su B-stanice određene CFSE testom. Testirane su četiri humane provrpce, šest od čimpanzi i dvije od rhesus majmuna.

In vivo aktivnost adjuvansa od CpG ODN u čimpazama i cinomolgnim mamunima: Da bi se odredilo da li CpG ODN s jakim in vitro stimulirajućim efektima na stanicama primata imaju aktivnost adjuvansa in vivo koja se može detektirati, cinomolgni majmuni i čimpanze su imunizirani s Engerix B, koji sadržiHBsAg adsorbiran na alum sam ili s dodoatkom ODN 1968 (500 μg) odnosno ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) (1 μg). U uspredbi s kontrolom koja nije primila CpG ODN, anti-HBs titri 4 tjedna iza početka i 2 nakon stimulacije su bili 66 odnosno 16 puta viši kod majmuna, te 15 i 3 puta viši kod čimpanzi (Tablica K). Stoga je jasno da je viđen efekt adjuvansa CpG ODN, a to je bilo posebno izračeno nakon jedne imunizacije.

Tablica K: Anti-HBs odgovori kod primata imuniziranih protiv HBsAg s CpG ODN3

[image] 3 Životinje su imunizorane IM injekcijom Engerix B koja sadrži 10 μg HBsAg adsorbirane na alum, sam ili dodan s CpG ODN. Cinomolgni majmuni su stimulirani nakon 10 tjedana a čimpazne su stimulirane nakon 4 tjedana. Anti-HBs je određen ELISA testom; vrijednosti majmunima su GMT ± SEM (n=5) dok su prikazane pojedine vrijednosti kod čimpazna svake skupine.

Claims (116)

1. Metoda stimulacije imunog odgovora, naznačeno time da sadrži davanje Py-obogaćene nukleinske kiseline subjektu koji nije glodavac u učinkovitoj količini koja inducira imuni odgovor u subjektu koji nije glodavac, pri čemu T-obogaćena nukleinska kiselina sadrži više od 60% T i sadrži CpG dinuleotid.

2. (opozvan)

3. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da je T-obogaćena imunostimulirajuća nukleinska kiselina poli-T nukleinska kiselina koja sadrži 5' TTTT 3'.

4. Metoda iz patentnog zahtjeva 3, naznačeno time da poli-T nukleinska kiselina sadrži 5' X1X2TTTTX3X4 3', pri čemu su X1, X2, X3 i X4 nukleotidi.

5. Metoda iz patentnog zahtjeva 3, naznačeno time da T-obogaćena imunostimulirajuća nukleinska kiselina sadrži više motiva poli-T nukleinske kiseline.

6. Metoda iz patentnog zahtjeva 4, naznačeno time da X1X2 jeste TT.

7. Metoda iz patentnog zahtjeva 4, naznačeno time da X3X4 jeste TT.

8. Metoda iz patentnog zahtjeva 4, naznačeno time da je X1X2 odabran iz skupine koju čine: TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA i GC.

9. Metoda iz patentnog zahtjeva 4, naznačeno time da X3X4 odabran iz skupine koju čine: TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA i GC.

10. (opozvan)

11. (opozvan)

12. (opozvan)

13. (opozvan)

14. (opozvan)

15. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da je u sastavu T-obogaćene imunostimulirajuće nukleinske kiseline više od 80% T.

16. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina sadrži barem 20 nukleotida.

17. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina sadrži barem 24 nukleotida.

18. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima nukleotidni skelet koji uključuje barem jednu modifikaciju skeleta.

19. Metoda iz patentnog zahtjeva 18, naznačeno time da je modifikacija skeleta fosforotiatna modifikacija.

20. Metoda iz patentnog zahtjeva 18, naznačeno time da je nukleotidni skelet kimeran.

21. Metoda iz patentnog zahtjeva 18, naznačeno time da je nukleotidni skelet kompletno modificiran.

22. (opozvan)

23. (opozvan)

24. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina ne sadrži CpG dinukleotide.

25. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina ne sadrži poli-C sekvenciju.

26. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina uključuje poli-A sekvenciju.

27. Metoda iz patentnog zahtjeva 20, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina uključuje poli-G sekvenciju.

28. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima u nukleotidnom sastavu više od 25% C.

29. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima u nukleotidnom sastavu više od 25% A.

30. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da je imunostimulirajuća nukleinska kiselina dana oralno.

31. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da je imunostimulirajuća nukleinska kiselina dana lokalno.

32. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da je imunostimulirajuća nukleinska kiselina dana u napravi za odgođeno oslobađanje.

33. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da je imunostimulirajuća nukleinska kiselina dana mukozno na površinu sluznice.

34. Metoda iz patentnog zahtjeva 33, naznačeno time da je imuni odgovor mukozni imuni odgovor .

35. Metoda iz patentnog zahtjeva 33, naznačeno time da je imuni odgovor sistemski imuni odgovor .

36. Metoda iz patentnog zahtjeva 33, naznačeno time da je površina sluznice odabrana iz skupine koju čine: oralna, nazalna, rektalna, vaginalna ili okularna površina.

37. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da dalje sadrži izlaganje subjekta antigenu, te da je imuni odgovor na antigen specifičan odgovor.

38. Metoda iz patentnog zahtjeva 37, naznačeno time da je subjektu dan vektor nukleinske kiseline koja kodira antigen, te da je nukleinska kiselina odovojena od imunostimulirajuće nukleinske kiseline.

39. Metoda iz patentnog zahtjeva 37, naznačeno time da je antigen peptidni antigen.

40. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da dalje sadrži izolaciju imune stanice iz subjekta, dovođenje u kontakt imune stanice s učinkovitom količinom imunostimulirajuće nukleinske kiseline za aktiviranje imune stanice, te ponovnim davanjem aktivirane imune stanice subjektu.

41. Metoda iz patentnog zahtjeva 40, naznačeno time da je imuna stanica leukocit.

42. Metoda iz patentnog zahtjeva 41, naznačeno time da dalje sadrži dovođenje u kontakt imune stanice s antigenom.

43. Metoda iz patentnog zahtjeva 40, naznačeno time da je antigen odabran iz skupine koju čine: tumorski antigen, virsuni antigen, bakterijski antigen i antigen parazita.

44. Metoda iz patentnog zahtjeva 40, naznačeno time da je imuna stanica dendrična stanica.

45. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da subjekt ima astmu ili je rizičan na razvitak astme, a metoda je metoda tretmana ili prevencije astme kod subjekta.

46. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da je subjekt ima alergiju ili je rizičan na razvitak alergije, a metoda je metoda tretmana ili prevencije alergije.

47. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da je subjekt ima karcinom, a metoda je metoda tretmana karcinoma.

48. Metoda iz patentnog zahtjeva 47, naznačeno time da je karcinom odabran iz skupine koju čine: karcinom žučnog trakta, karcinom mozga, karcinom dojke, karcinom cerviksa, koriokarcinom, karcinom CNS, karcinom debelog crijeva, karcinom vezivnog tkiva, endometrijalni karcinom, karcinom oka, karcinom želuca, intraepitelne neoplazme, karcinom grla, limfomi, Hodgkinov limfom, karcinom jetre, karcinom pluća (npr. malih i ne-malih stanica), melanom, neuroblastomi, oralni karcinom, karcinom usne šupljine, karcinom jajnika, karcinom pankreasa, karcinom prostate, karcinom rektuma, sarkomi, karcinom tiroidne žljezde, karcinom bubrega kao i drugi karcinomi i sarkomi.

49. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da je karcinomodabran iz skupine koju čine: karcinom kosti, karcinom mozga i CNS, karcinom konektivnog tkiva, ezofagealni karcinom, karcinom oka, Hodgkinov limfom, karcinom grla, karcinom usne šupljine, karcinom kože i karcinom testisa.

50. Metoda iz patentnog zahtjeva 47, naznačeno time da dalje sadrži davanje antikancerogene terapije.

51. Metoda iz patentnog zahtjeva 50, naznačeno time da je antikancerogena terapija antitijelo.

52. Metoda iz patentnog zahtjeva 47, naznačeno time da je subjekt čovjek.

53. Metoda iz patentnog zahtjeva 47, naznačeno time da je subjekt odabrani iz skupine koju čine: pas, mačka i konj.

54. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da dalje sadrži davanje antitijela specifična na antigen sa stanične površine, te da je rezultat imunog odgovora o antigenu ovisna stanična citotoksičnost (ADCC).

55. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da je subjekt ima infektivnu bolest ili je rizičan na razvitak infektivne bolesti, a metoda je metoda tretmana ili prevencije infektivne bolesti.

56. Metoda iz patentnog zahtjeva 54, naznačeno time da je subjekt čovjek.

57. Metoda iz patentnog zahtjeva 54, naznačeno time da dalje sadrži davanje antigena subjektu.

58. Metoda iz patentnog zahtjeva 57, naznačeno time da je antigen odabran iz skupine koju čine: bakterijski antigen, virsuni antigen, antigen parazita i fungalni antigen.

59. Metoda iz patentnog zahtjeva 56, naznačeno time da je subjekt odabrani iz skupine koju čine: pas, mačka, konj, govedo, svinja, koza, pile, majmun i riba.

60. Metoda iz patentnog zahtjeva 59, naznačeno time da dalje sadrži davanje antigena subjektu.

61. Metoda iz patentnog zahtjeva 59, naznačeno time da je antigen izveden iz mikrooganizama koji su odabrani iz skupine koju čine: herpesviridae, retroviridae, orthomyrovirdae, toxoplasma, haemophilus, campylobacter, clostridium, E. coli, te staphylococcus.

62. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina dalje sadrži TG motiv.

63. Metoda iz patentnog zahtjeva 62, naznačeno time da TG nukleinska kiselina sadrži 5'N1X1TGX2N23'.

64. Metoda iz patentnog zahtjeva 62, naznačeno time da TG nukleinska kiselina sadrži 5'N1X1X2TGX3X4N23'.

65. Metoda iz patentnog zahtjeva 63, naznačeno time da je sekvencija N1 nukleinske kiseline sastavljena od broja nukleotida koji se kreće od (11-N2) do (21-N2).

66. Metoda iz patentnog zahtjeva 63, naznačeno time da je sekvencija N2 nukleinske kiseline sastavljena od broja nukleotida koji se kreće od (11-N1) do (21-N1).

67. Metoda iz patentnog zahtjeva 64, naznačeno time da je sekvencija N1 nukleinske kiseline sastavljena od broja nukleotida koji se kreće od (9-N2) do (19-N2).

68. Metoda iz patentnog zahtjeva 64, naznačeno time da je sekvencija N2 nukleinske kiseline sastavljena od broja nukleotida koji se kreće od (9-N1) do (19-N1).

69. Metoda iz patentnog zahtjeva 63, naznačeno time da X2 jeste timidin.

70. Metoda iz patentnog zahtjeva 64, naznačeno time da X3 jeste timidin.

71. Metoda iz patentnog zahtjeva 64, naznačeno time da su X1X2 nukleotidi odabran iz skupine koju čine: GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA i TT.

72. Metoda iz patentnog zahtjeva 64, naznačeno time da su X3X4 nukleotidi odabran iz skupine koju čine: TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA o CA.

73. Metoda iz patentnog zahtjeva 63, naznačeno time da su X3X4 nukleotidi odabran iz skupine koju čine: TT, TC, TA i TG.

74. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da je subjekt rizičan na razvitak karcinoma, a metoda je metoda prevencije karcinoma.

75. Metoda iz patentnog zahtjeva 50, naznačeno time da je antikancerogena terapija odabrana iz skupine koju čine: kemoterapijsko sredstvo, imunoterapijsko sredstvo i vakcina protiv karcinoma.

76. Metoda prevencije bolesti kod subjekta, naznačeno time da sadrži: davanje subjektu imunostimulirajuće nukleinske kiseline redovito, a da se spriječi bolest kod subjekta, pri čemu je imunostimulirajuća nukleinska kiselina odabrana iz skupine koju čine: T-obogaćena nukleinska kiselina koja sadrži više od 60% T i sadrži CpG dinukleotid, TG nukleinska kiselina koja nema CpG dinukleotide, te T-obogaćena nukleinska kiselina koja sadrži između 25% T i 60% T i nema CpG dinukleotid.

77. Metoda indukcije urođenog imunog odgovora, naznačeno time da sadrži: davanje subjektu imunostimulirajuće nukleinske kiseline u učinkovitoj količini koja aktivira urođeni imuni odgoovor, pri čemu je imunostimulirajuća nukleinska kiselina odabrana iz skupine koju čine: T-obogaćena nukleinska kiselina koja sadrži više od 60% T i sadrži CpG dinukleotid, TG nukleinska kiselina koja nema CpG dinukleotide, te T-obogaćena nukleinska kiselina koja sadrži između 25% T i 60% T i nema CpG dinukleotid.

78. Pripravak, naznačeno time da sadrži: napravu za odgođeno oslobađanje koja sadrži imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu, pri čemu imunostimulirajuća nukleinska kiselina nema nemetiliranih CpG motiva i odabrana je iz skupine koju čine T-obogaćena nukleinska kiselina i TG nukleinska kiselina.

79. Pripravak iz patentnog zahtjeva 78, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina sadrži polidiesterski skelet.

80. Pripravak dodatka hrani, naznačeno time da sadrži imuno-stimulirajuću nukleinsku kiselinu u napravi za isporuku koja je odabrana iz skupine koju čine: kapsule, pilule i sublingvalne tablete, pri čemu imunostimulirajuća nukleinska kiselina nema nemetiliranih CpG motiva i odabrana je iz skupine koju čine T-obogaćena nukleinska kiselina i TG nukleinska kiselina.

81. Pripravak iz patentnog zahtjeva 80, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina sadrži polidiesterski skelet.

82. Pripravak, naznačeno time da sadrži imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu i antigen pri čemu imunostimulirajuća nukleinska kiselina nema nemetiliranih CpG motiva i odabrana je iz skupine koju čine TG imunostimulirajuća nukleinska kiselina koja sadrži sekvenciju 5'N1X1X2TGX2X3N23' pri čemu su X1X2 je odabrani iz skupine koju čine TA, TG, TC, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GG, GA i GC, te su X3X4 je odabrano iz skupine koju čine: AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA i GC, te sekvenciju 5'X1X2TTTTX3X43' pri čemu je X1X2 je odabran iz skupine koju čine TA, TG, TC, AA, AG, AC, CC, CA, GG, GA i GC, te je X3X4 odabran iz skupine koju čine: AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA i GC.

83. Pripravak, naznačeno time da sadrži: imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu i antimikrobno sredstvo, pri čemu imunostimulirajuća nukleinska kiselina nema nemetiliranih CpG motiva i odabrana je iz skupine koju čine T-obogaćena nukleinska kiselina i TG nukleinska kiselina.

84. Pripravak iz patentnog zahtejeva 83, naznačeno time da je antimikrobno sredstvo odabrano iz skupine koju čine: antivirusni sredstvo, antifungalno sredstvo, sredstvo protiv parazita i antibakterijsko sredstvo.

85. Pripravak iz patentnog zahtejeva 5, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina sadrži najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, ili najmanje 8 poli-T motiva.

86. Pripravak iz patentnog zahtejeva 5, naznačeno time da najmanje dva motiva od više motiva poli-T nukleinskih kiselina sadrži najmanje tri uzastopna T nukleotidna ostatka.

87. Pripravak iz patentnog zahtejeva 5, naznačeno time da je najmanje dva motiva poli-T nukleinske kiseline sadrži najmanje četiri uzastopna T nukleotidna ostatka.

88. Pripravak iz patentnog zahtejeva 5, naznačeno time je više poli-T motiva najmanje 3 motiva poli-T nukleinske kiseline, pri čemu svaka od najmanje 3 poli-T nukleinske kiseline sadrži najmanje 3 uzastopna T nukleotidna ostatka.

89. Pripravak iz patentnog zahtejeva 5, naznačeno time je više poli-T motiva najmanje 4 motiva poli-T nukleinske kiseline, pri čemu svaka od najmanje 4 poli-T nukleinske kiseline sadrži najmanje 3 uzastopna T nukleotidna ostatka.

90. Pripravak iz patentnog zahtejeva 5, naznačeno time da više motiva poli-T nukleinske kiseline sadrži 5, najmanje 6, najmanje 7, ili najmanje 8 uzastopnih T nukleotdnih ostataka.

91. (opozvano)

92. (opozvano)

93. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina sadrži najmanje dvoje poli-C sekvnecije s najmanje 3 uzastopna C nukleotidna ostatka.

94. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina nema poli-A sekvencije od najmanje 3 uzastopna A nukleotdna ostatka.

95. Farmaceutski pripravak, naznačeno time da sadrži učinkovitu količinu izolirane imunostimulrajuće nukleinske kiseline za stuimulaciju imunog odgovora, a iz patetnog zahtjeva 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 40, 41, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 93, ili 94, te farmaceutski prihvatljiv nosač.

96. Pripravak tvari, naznačeno time da sadrži izoliranu imunostimulrajuću nukleinsku kiselinu iz patetnog zahtjeva 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 40, 41, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 93, ili 94, te farmaceutski prihvatljiv nosač.

97. Metoda iz patentnog zahtjeva 90, naznačeno time da nukleinska kiselina dalje sadrži više CpG motiva, pri čemu više jeste najmanje 3 motiva, najmanje 4 motiva i pri čemu svaki od najmanje 4 motiva sadrži najmanje 3 uzastopna T nukleotidna ostatka.

98. Metoda iz patentnog zahtjeva 97, naznačeno time da su više CpG motiva i poli-T motivi razasuti.

99. Pripravak, naznačeno time da sadrži: imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu i antikancerogenu terapiju, formulirane s farmaceutski prihvatljivim nosačem, a u učinkovitoj količini za tretman karcinoma ili za smanjenje rizika od razvitka karcinoma, pri čemu je imunostimulirajuća nukleinska kiselina odabrana iz skupine koju čine: T-obogaćena nukleinska kiselina koja sadrži više od 60% T i sadrži CpG dinukleotid, TG nukleinska kiselina koja nema CpG dinukleotide, te T-obogaćena nukleinska kiselina koja sadrži između 25% T i 60% T i nema CpG dinukleotid.

100. Pripravak, naznačeno time da sadrži: imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu i lijek protiv astme/alergije, formuliran s farmaceutski prihvatljivim nosačem, a u učinkovitoj količini za prevenciju ili tretman imunog odgovora povezanog s izlaganjem medijatoru astme lli alergije, pri čemu je imunostimulirajuća nukleinska kiselina odabrana iz skupine koju čine: T-obogaćena nukleinska kiselina koja sadrži više od 60% T i sadrži CpG dinukleotid, TG nukleinska kiselina koja nema CpG dinukleotide, te T-obogaćena nukleinska kiselina koja sadrži između 25% T i 60% T i nema CpG dinukleotid.

101. Pripravak, naznačeno time da sadrži: imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu odabranu iz skupine koju čine: SEQ ID NO:95-119, SEQ ID NO: 121-136, SEQ ID NO: 13 )8-152, SEQ ID NO: 154-210, SEQ ID NO:212-222, SEQ ID NO:224-244, SEQ ID NO:247-260, SEQ ID NO:26' )-272, SEQ ID NO:274-299, SEQ ID NO:301, SEQ ID NO:303-409, SEQ ID NOA14-420, SEQ ID NO:424, SEQ ID NO:427-758, SEQ ID NO:760-947, SEQ ID NO:959-963, SEQ ID NO:968-1022, te SEQ ID NO: 1024-1093, te farmaceutsko prihvatljivi nosač.

102. Pripravak, naznačeno time da sadrži imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu koja se suštinski sastoji od 5' M1TCGTCGTTM23', pri čemu najmanje jedan od Cs nije metiliran, te pri čemu je M1 nukleinska kiselina koja ima najmanje jedan nukleotid, te pri čemu je M2 nukleinska kiselinakoja ima između 0 i 50 nukleotida, te pri čemu imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima manje od 100 nukleotida.

103. Farmaceutski pripravak, naznačeno time da sadrži imunostimulirajuću nukleinsku kiselinu koja sadrži 5' TCGTCGTT3', pri čemu najmanje jedan od Cs nije metiliran, te pri čemu imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima manje od 100 nukleotida i fosfodiesterski kostur, te napravu za odgođeno oslobađanje.

104. Farmaceutski pripravak iz patentnog zahtjeva 103, naznačeno time da je naprava za odgođeno oslobađanje mikročestica.

105. Farmaceutski pripravak iz patentnog zahtjeva 103, naznačeno time da dalje sadrži antigen.

106. Metoda stimulacije imunog odgovora, naznačeno time da sadrži davanje TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline subjektu koji nije glodavac, a u učinkovitoj količini da inducira imuni odgovor kod subjekta koji nije glodavac, pri čemu TG imunostimulirajuća nukleinska kiselina nema CpG dinukleotid.

107. Pripravak, naznačeno time da sadrži oligonukleotid koji ima sekvenciju nukleinske kiseline TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT (SEQ ID NO- 343).

108. Metoda tretmana ili prevencije od alergije ili astme, naznačeno time da sadrži davanje pripravka iz patentnog zahtjeva 107 subjektu koji nije glodavac a ima potrebu za učinkovitom količinom za tretman ili prevenciju alergije ili astme.

109. Metoda tretmana ili prevencije od alergije ili astme, naznačeno time da sadrži davanje TG imunostimulirajuće nukleinske kiseline subjektu koji nije glodavac, a u učinkovitoj količini da inducira imuni odgovor kod subjekta koji nije glodavac, pri čemu nukleinska kiselina sadrži sekvenciju 5'N1X1X2TGX2X3N23' pri čemu je X1X2 odabrani iz skupine koju čine TA, TG, TC, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GG, GA i GC, te je X3X4 je odabran iz skupine koju čine: AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA i GC, te pri čemu nukleinska kiselina nema CpG dinukleotid.

110. Metoda stimuliranja imunog odgovora, naznačeno time da sadrži davanje Py-obogaćene imunostimulirajuće nukleinske kiseline subjektu koji nije glodavac, a u učinkovitoj količini da inducira imuni odgovor kod subjekta koji nije glodavac, pri čemu nukleinska kiselina sadrži sekvenciju 5'X1X2TTTTX3X43' pri čemu je X1X2 je odabran iz skupine koju čine TA, TG, TC, AA, AG, AC, CC, CA, GG, GA i GC, te je X3X4 odabran iz skupine koju čine: AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA i GC, te pri čemu nukleinska kiselina nema CpG dinukleotid.

111. Metoda iz patentnog zahtjeva 106, naznačeno time da je nukleinska kiselina T-obogaćena nukleinska kiselina.

112. Metoda iz patentnog zahtjeva 111, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima u nukleotidnom sastavu više od 25% T.

113. Metoda iz patentnog zahtjeva 111, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima u nukleotidnom sastavu više od 35% T.

114. Metoda iz patentnog zahtjeva 111, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima u nukleotidnom sastavu više od 40% T.

115. Metoda iz patentnog zahtjeva 111, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima u nukleotidnom sastavu više od 50% T.

116. Metoda iz patentnog zahtjeva 111, naznačeno time da imunostimulirajuća nukleinska kiselina ima u nukleotidnom sastavu više od 60% T.