ES2711878T3 - Vacuna contra el virus del herpes equino 1 recombinante que contiene glicoproteína C mutada y usos de la misma - Google Patents

Abstract

Composición o vacuna que comprende un virus del herpes equino 1 recombinante (EHV-1), en el que el EHV-1 comprende un gen mutado que codifica una glicoproteína C (gC) no funcional, en el que los nucleótidos en las posiciones 94 a 1315 inclusives del gen de gC de SEQ ID NOs. 7, 9 o 11 están suprimidos.

Description

DESCRIPCION

Vacuna contra el virus del herpes equino 1 recombinante que contiene glicoprotelna C mutada y usos de la misma

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos n° de serie 61/613151 presentada el 20 de marzo del 2012.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a composiciones o vacunas para combatir infecciones por virus del herpes equino en animales. Especlficamente, la presente invencion proporciona composiciones o vacunas que contienen un EHV-1 recombinante que provocan una respuesta inmunitaria en animales contra el virus del herpes equino, incluyendo composiciones que comprenden dicho EHV-1 recombinante, procedimientos de vacunacion contra el virus del herpes equino, y kits para su uso con tales procedimientos y composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El virus del herpes equino tipo 1 (EHV-1) es uno de los patogenos mas importantes y prevalentes de poblaciones equinas en todo el mundo (Ma et al., J. of General Virology 91, 1817-1822, 2010). Junto con sus virus parientes cercanos de la varicela-zoster, virus del herpes bovino tipo 1, virus de la pseudorrabia y EHV-4, EHV-1 forma el genero Varicellovirus en la subfamilia Alphaherpesvirinae de la familia Herpesviridae del orden Herpesvirales (Davison et al., The order Herpesvirales Arch. Virol 154, 171-177, 2009). Las enfermedades causadas por EHV-1 varlan de rinopneumonitis suave y aborto en yeguas prenadas a enfermedad neurologica que es frecuentemente letal en los caballos afectados (Allen et al, Prog Vet Microbiol Immunol 2, 78-144, 1986; Carroll et al, Vet Aust J 62, 345-346, 1985; Crabb et al, Adv Virus Res 45, 153-190, 1995). La patogenesis de la infeccion por EHV es muy complejo. La infeccion natural tiene lugar a traves de la inhalacion o ingestion del virus infeccioso. A los pocos dlas de que el virus se pueda encontrar en los leucocitos, donde este protegido de reconocimiento y ataque por el sistema inmunitario. El virus se disemina a traves de viremia asociada a las celulas a sitios secundarios de replicacion (Allen et al., Proceedings 8th Equine Infectious Disease Conference, Dubai 23-26, pag. 129-146, 1998).

EHV-1 alberga un genoma de ADN de doble cadena de 150kb que esta altamente conservado entre las cepas. Se caracterizaron ampliamente una cepa neuropatogenica Ab4 (GenBank N° de acceso AY665713) y una cepa no neuropatogenica C592 (GenBank N° de acceso AY464052) y mostraron una tasa de variacion de nucleotidos de aproximadamente el 0,1% (Nugent et al., J. Virol 80, 4047-4060, 2006). Se encontro que solo una minorla de cepas de EHV-1 eran capaces de inducir trastornos neurologicos, aunque todas las cepas pueden causar enfermedad respiratoria y aborto (Mumford et al, J. Reprod Fertil Suppl 35, 509-518, 1987; Ostlund, Vet Clin North Am Equine Practice, 9, 283-294, 1993; Wilson, Vet Clin North Am Equine Practice, 13, 53-72, 1997). Recientemente, estudios epidemiologicos, as! como estudios de genetica inversa, han demostrado que un polimorfismo de un solo nucleotido en la posicion 2254 (G/A2254) del marco de lectura abierto 30 (ORF30), que codifica la ADN polimerasa viral (Pol), dara lugar a una variacion en el la posicion de aminoacido 752 (D/N752), que se asocia con el potencial neuropatogenico del virus (Goodman et al, J Biol Chem 281, 18193-18200, 2007; Van de Walle y otros, J. Infect Dis 200, 20- 25, 2009; Smith y otros, Vet Microbiol, 141, 5-11, 2010). Se ha demostrado que el residuo 752 en el Pol esencial de EHV-1 no es necesario para el crecimiento del virus y que la mutacion N752 confiere un fenotipo sensible a los farmacos al virus (Ma et al., 2010).

La glicoprotelna C (gC) de EHV-1 ha demostrado jugar un papel importante en las primeras etapas de la infeccion y en la liberacion de viriones (Osterrieder, Virus Research 2, 165 , 1999). La glicoprotelna C de EHV-1 no es esencial para el crecimiento de virus. Media la union primaria y es necesaria para la replicacion del virus eficiente en las celulas equinas primarias (Osterrieder, 1999).

Las vacunas inactivadas convencionales proporcionan solo proteccion cllnica y virologica parcial contra las infecciones respiratorias, pero no impiden la viremia asociada a las celulas. Considerando la susceptibilidad de los animales, incluyendo seres humanos, a virus del herpes, un medio de prevencion de la infeccion por virus del herpes y la proteccion de los animales es esencial. En consecuencia, existe una necesidad de una vacuna eficaz contra el virus del herpes.

La cita o identificacion de cualquier documento en esta solicitud no es una admision de que dicho documento esta disponible como tecnica anterior a la presente invencion.

Osterrieder (1999) da a conocer un virus del herpes equino-1 mutante de la cepa RacL11 que lleva un casete de expresion (3-gal en lugar del marco de lectura abierto que codifica la glicoprotelna C (que carece de este modo de los codones 46-440 de la glicoprotelna C), que es apatogena en ratones.

El documento US 5.674.499 da a conocer un EHV-1, en el que la glicoprotelna C se ha mutado para hacer que el gen inactivo y la cepa resultante se utilicen como una vacuna.

DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION

En un primer aspecto, la invencion proporciona una composicion o vacuna que comprende un virus del herpes equino 1 recombinante (EHV-1), en el que el EHV-1 comprende un gen mutado que codifica una glicoproteina C (gC) no funcional, en el que se suprimen los nucleotidos en las posiciones 94 a 1315 inclusives del gen de gC de SEQ ID NOs: 7, 9 o 11.

En un segundo aspecto, la invencion proporciona un EHV-1 recombinante que comprende un gen de gC mutado, en el que los nucleotidos en las posiciones 94 a 1315 inclusives del gen de gC de SEQ ID NOs: 7, 9 o 11 estan suprimidos.

En un tercer aspecto, la invencion proporciona una composicion o un EHV-1 recombinante de acuerdo con la invencion para usar en un procedimiento de vacunacion de un animal, en el que la composicion o EHV-1 recombinante se administra al menos una vez.

En un cuarto aspecto, la invencion proporciona una composicion o un EHV-1 recombinante de acuerdo con la invencion para usar en un procedimiento para producir una respuesta protectora en un animal contra el virus del herpes equino, que comprende administrar al animal la composicion o EHV-1 recombinante y un portador, adyuvante, excipiente o vehiculo farmaceuticamente o veterinariamente aceptable.

La invencion proporciona una composicion o vacuna que contiene un virus del herpes equino 1 recombinante (EHV-1). El EHV-1 recombinante puede comprender ademas un gen de ADN polimerasa (Pol) que codifica una Pol que tiene una asparagina (N) en la posicion de aminoacido 752. El EHV-1 recombinante puede comprender un gen de ADN polimerasa (Pol) que codifica una Pol tiene una asparagina (N) en la posicion de aminoacido 752. El EHV-1 puede ser la cepa RacL de EHV-1.

La invencion proporciona procedimientos para inducir una respuesta inmunogenica o de proteccion contra el EHV-1, asi como procedimientos para prevenir EHV-1 o estados patologicos causados por EHV-1, que comprende administrar la composicion o vacuna de la presente invencion. La invencion tambien proporciona procedimientos de vacunacion de un animal que comprende al menos una administration de la composicion o EHV-1 recombinante.

La invencion se define por las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La siguiente description detallada, proporcionada a modo de ejemplo, puede entenderse en combination con las figuras que se acompanan, en las cuales:

La Figura 1 es la tabla que muestra la correspondiente SEQ ID NO asignada a secuencias de polinucleotidos y proteinas.

Las figuras 2A-2C muestran el esquema de donation. La Figura 2D muestra la mutation de aminoacidos en la polimerasa de EHV-1.

Las figuras 3A-3B muestran el ensayo de inmunofluorescencia indirecto (IFA) de RK13-Pol y RK13.

Las figuras 4A-4B representan el crecimiento de L11-_APol EYFP en RK13-Pol v. L11-_APol EYFP en RK13.

Las figuras 5A-5F representan el IFA de RacL11, L11_D752NAgC y L11_D752NAgC rev utilizando mAb anti-gC de EHV-1.

La Figura 6 representa el crecimiento in vitro de RacL11, L11_D752N, L11_D752NAgC y L11_D752NAgC rev medido mediante el ensayo de union.

La Figura 7 representa el crecimiento in vitro de RacL11, L11_D752N, L11_D752NAgC y L11_D752NAgC rev determinado mediante la comparacion de tamanos de placa.

La Figura 8 representa la cinetica de crecimiento de RacL11, L11_D752N, L11_D752NAgC y L11_D752NAgC rev mediante titulos extracelulares e intracelulares.

Las Figuras 9A y 9B representan los titulos de virus promedio en los pulmones infectados con RacL11, L11_D752N, L11_D752NAgC, L11_D752N AgC rev 2 y PBS (control) 2 y 4 dias despues de la infection (p.i.), 2 y 4 dias despues de la estimulacion (p.c.).

La Figura 10 representa los cambios histopatologicos de los pulmones de ratones infectados con RacL11, L11_D752N, L11_D752NAgC, L11_D752N AgC rev en el dia 2 p.i.

Las Figuras 11A-11B representan la serologia contra EHV-1 utilizando los ensayos de fijacion del complemento (CF) y de neutralization de virus (VN).

La Figura 12 representa la duration de la viremia en los caballos vacunados.

La Figura 13 representa la elimination del virus en muestras nasales de los caballos vacunados.

Las Figuras 14A-14C muestran las alineaciones de secuencias de polinucleotidos y proteinas de ADN polimerasa de EHV-1.

Las Figuras 15A-15B muestran las alineaciones de secuencias de polinucleotidos y proteinas de glicoprotema C de EHV-1.

La Figura 16 muestra las secuencias de ADN y proteinas.

DESCRIPCION DETALLADA

Cabe indicar que en esta descripcion y particularmente en las reivindicaciones, los terminos tales como "comprende" "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se le atribuye en la ley de Patentes de Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye", y similares; y que terminos tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de Estados Unidos, por ejemplo, permiten elementos no citados de manera expllcita, pero excluyen elementos que se encuentran en la tecnica anterior o que afectan una caracterlstica basica o novedosa de la invencion.

A menos que se indique lo contrario, los terminos tecnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de terminos comunes en biologla molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes V. publicadas por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Desk Comprehensive Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Los terminos singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La palabra "o" significa cualquier miembro de una lista en particular y tambien incluye cualquier combinacion de los miembros de esa lista.

El termino "cepa N de EHV-1", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier cepa de EHV-1 que tiene una asparagina (N) en la posicion de aminoacido 752 de su ADN polimerasa. La cepa N de EHV-1 puede ser una cepa de tipo salvaje que comprende una ADN polimerasa que comprende una asparagina (N) en la posicion de aminoacido 752. La cepa N de e HV-1 puede ser una cepa de EHV-1 mutada o recombinante en la que la ADN polimerasa se modifica para tener una asparagina (N) en la posicion de aminoacido 752.

El termino "cepa D de EHV-1", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier cepa de EHV-1 que tiene un acido aspartico (D) en la posicion de aminoacido 752 de su ADN polimerasa. La cepa D de EHV-1 puede ser una cepa de tipo salvaje que comprende una ADN polimerasa que comprende un acido aspartico (D) en la posicion de aminoacido 752. La cepa D de EHV-1 puede ser una cepa de EHV-1 mutada o recombinante en la que la ADN polimerasa se modifica para tener un acido aspartico (D) en la posicion de aminoacido 752.

Por "animal" se entiende mamlferos, humanos, aves y similares. El animal puede seleccionarse del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballo, cebra, burro), canino (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domesticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos incluyendo guepardos y lince), ovino (por ejemplo, ovejas), bovino (por ejemplo, ganado, vaca, bufalo), porcino (cerdo), aviar (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisan, loro, pinzones, halcon, cuervo, avestruz, emu y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tarsero, mono, gibon, simio), y pescado. El termino "animal" tambien incluye un animal individual en todas las etapas del desarrollo, incluyendo etapas embrionarias y fetales.

Los terminos "polipeptido" y "protelna" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a un pollmero de residuos de aminoacidos consecutivos.

El termino "acido nucleico", "nucleotido", y "polinucleotido" se refiere a ARN o ADN y sus derivados, tales como los que contienen cadenas principales modificadas. Se debe entender que la invencion proporciona polinucleotidos que comprenden secuencias complementarias a las descritas en el presente documento. Los polinucleotidos de acuerdo con la invencion se pueden preparar de diferentes maneras (por ejemplo, mediante slntesis qulmica, mediante clonacion de genes, etc.) y pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, lineal o ramificado, de cadena simple o doble, o un hlbrido de los mismos, cebadores, sondas, etc.).

El termino "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleotido asociado con una funcion biologica. Por lo tanto, los genes o polinucleotidos incluyen intrones y exones como en la secuencia genomica, o solo las secuencias de codificacion como en ADNc, tal como un marco de lectura abierto (ORF), empezando por el codon de iniciacion (codon de metionina) y terminando con una senal de terminacion (codon de parada). Los genes y polinucleotidos tambien pueden incluir regiones que regulan su expresion, tal como el inicio de la transcripcion, traduccion y terminacion de la transcripcion. Por lo tanto, tambien se incluyen los promotores y regiones de union a ribosoma (en general, estos elementos reguladores se encuentran aproximadamente entre 60 y 250 nucleotidos en direccion 5' del codon de inicio de la secuencia codificante o gen; Doree SM et al.; Pandher K et al.; Chung JY et al), terminadores de la transcripcion (en general el terminador se encuentra dentro de aproximadamente 50 nucleotidos en direccion 3' del codon de parada de la secuencia codificante o gen; Ward, CK et al). Un gen o polinucleotido tambien se refiere a un fragmento de acido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una protelna especlfica, y que incluye secuencias reguladoras.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "antlgeno" o "inmunogeno" significa una sustancia que induce una respuesta inmunitaria especlfica en un animal huesped. El antlgeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o parte de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto que expresa un epltopo, polipeptido, peptido, protelna o fragmento de la misma con propiedades inmunogenicas; una pieza o fragmento de acido nucleico capaz de inducir una respuesta inmunitaria tras la presentacion a un animal huesped; una protelna, un polipeptido, un peptido, un epltopo, un hapteno, o cualquier combinacion de los mismos. Alternativamente, el inmunogeno o antlgeno puede comprender una toxina o antitoxina.

Por definicion, un epltopo es un determinante antigenico que es inmunologicamente activo en el sentido de que una vez administrado al huesped, es capaz de evocar una respuesta inmunitaria de tipo humoral (celulas B) y/o tipo celular (celulas T). Son grupos qulmicos o secuencias de peptidos particulares sobre una molecula que son antigenicos. Un anticuerpo se une especlficamente a un epltopo antigenico particular sobre un polipeptido. Ejemplos especlficos, no limitativos, de un epltopo incluyen una secuencia de tetrapeptido a pentapeptido en un polipeptido, una secuencia de triglicosido a pentaglicosido en un polisacarido. En el animal, la mayorla de los antlgenos presentaran varias o incluso muchos determinantes antigenicos simultaneamente. Dicho polipeptido tambien puede ser calificado como un polipeptido inmunogenico y el epltopo puede ser identificado como se describe adicionalmente.

Un componente biologico "aislado" (tal como un acido nucleico o protelna u organulo) se refiere a un componente que se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biologicos en la celula del organismo en el que se produce naturalmente el componente, por ejemplo, otro ADN y ARN cromosomico y extracromosomico, protelnas y organulos. Los acidos nucleicos y protelnas que han sido "aislados" incluyen acidos nucleicos y protelnas purificados mediante procedimientos de purificacion estandar. El termino tambien abarca acidos nucleicos y protelnas preparados mediante tecnologla recombinante, as! como slntesis qulmica.

El termino "purificado", tal como se usa en el presente documento, no requiere pureza absoluta; en cambio, se pretende como un termino relativo. De este modo, por ejemplo, una preparacion de polipeptido purificada es aquella en el que el polipeptido esta mas enriquecido que el polipeptido en su medio natural. Una preparacion de polipeptido esta sustancialmente purificada de manera que el polipeptido representa varias formas de realizacion al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98%, del contenido total de polipeptido de la preparacion. Lo mismo se aplica a los polinucleotidos. Los polipeptidos descritos en este documento se pueden purificar mediante cualquiera de los medios conocidos en la tecnica.

La presente invencion proporciona una composition o vacuna que comprende un vector viral recombinante de Virus del herpes equino-1 (EHV-1). En un aspecto, la presente invencion proporciona un EHV-1 recombinante que comprende un gen de Glicoprotelna C (gC) mutado. En otro aspecto, la presente invencion proporciona un EHV-1 recombinante que comprende una ADN polimerasa que tiene una asparagina (N) en la position de aminoacido 752. Se describe en el presente documento un EHV-1 recombinante en el que el EHV-1 es una cepa N de EHV-1. La cepa N de EHV-1 recombinante puede comprender un gen de gC mutado. En aun otro aspecto, el EHV-1 recombinante comprende un gen de gC mutado y una ADN polimerasa que tiene una asparagina (N) en la posicion de aminoacido 752. La composicion o vacuna de la presente invencion puede comprender ademas uno vehlculo diluyente, adyuvante o excipiente farmaceuticamente o veterinariamente aceptable.

El termino "composicion" comprende cualquier vacuna o composicion inmunologica, que una vez que se ha inyectado a un huesped, incluyendo caninos, felinos, equinos y seres humanos, induce una respuesta inmunitaria en el huesped, y/o protege al huesped de la leucemia, y/o puede impedir la implantation del parasito, y/o puede prevenir la progresion de la enfermedad en sujetos infectados, y/o puede limitar la difusion de parasitos fugitivos a los organos internos. Esto se puede lograr tras la vacunacion segun la presente invencion a traves de la induction de la secretion de citoquinas, en particular la secretion de IFN-gamma (como ejemplo de un procedimiento de medicion de la secrecion de IFN-gamma, podrla utilizarse el inmunoensayo Quantikine® de R & D Systems Inc. (numero de catalogo # CAIF00) (Djoba Siawaya JF et al.)).

La presente invencion proporciona un EHV-1 recombinante que comprende una ADN polimerasa que tiene una asparagina (N) en la posicion de aminoacido 752. Los homologos de polipeptidos de ADN polimerasa de EHV-1 se entiende que estan dentro del alcance de la presente invencion.

En un aspecto de la presente invencion, el EHV-1 recombinante comprende una ADN polimerasa de EHV-1 que comprende una asparagina (N) en la posicion de aminoacido. Las variantes incluyen variantes alelicas. El termino "variante alelica" se refiere a un polinucleotido o un polipeptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoacidos de una protelna y que existen dentro de una poblacion natural (por ejemplo, una especie o variedad de virus). Dichas variaciones alelicas naturales pueden dar lugar tlpicamente a una varianza del 1-5% en un polinucleotido o un polipeptido. Las variantes alelicas pueden identificarse por secuenciacion de la secuencia de acido nucleico de interes en un conjunto de diferentes especies, que pueden llevarse a cabo facilmente utilizando sondas de hibridacion para identificar el mismo locus genetico en esas especies.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "derivado" o "variante" se refiere a un polipeptido, o un acido nucleico que codifica un polipeptido, que tiene una o mas variaciones conservativas de aminoacidos u otras modificaciones menores, tales que (1) el polipeptido correspondiente tiene una funcion sustancialmente equivalente cuando se compara con el polipeptido de tipo salvaje o (2) un anticuerpo generado contra el polipeptido es inmunorreactivo con el polipeptido de tipo salvaje. Estas variantes o derivados incluyen polipeptidos que tienen modificaciones menores de secuencias de aminoacidos primarias de ADN polimerasa de EHV-1 que pueden dar lugar a peptidos que tienen una actividad sustancialmente equivalente en comparacion con el polipeptido homologo sin modificar. Tales modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagenesis dirigida al sitio, o pueden ser espontaneas. El termino "variante" contempla ademas deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipeptido funcione para producir una respuesta inmunologica, tal como se define en este documento. Las modificaciones pueden ser cualquier cambio de aminoacido en las posiciones de aminoacido distintas de la posicion 752 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 37, 13, 14, o 15.

El termino "variacion conservativa" se refiere a la sustitucion de un residuo de aminoacido por otro residuo biologicamente similar, o la sustitucion de un nucleotido en una secuencia de acido nucleico de tal manera que el residuo de aminoacido codificado no cambia o es otro residuo biologicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas seran generalmente de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoacidos. Por ejemplo, los aminoacidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) acidos - aspartato y glutamato; (2) basicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polares sin carga -glicina, asparagina, glutamina, cistelna, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptofano y la tirosina se clasifican a veces como aminoacidos aromaticos. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitucion de un resto hidrofobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrofobo, o la sustitucion de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitucion de arginina por lisina, acido glutamico por acido aspartico, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitucion conservativa similar de un aminoacido con un aminoacido estructuralmente relacionado que no tendra un efecto importante en la actividad biologica. Las protelnas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoacidos que la molecula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoacidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la protelna estan, por lo tanto, dentro de la definicion del polipeptido de referencia. Todos los polipeptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El termino "variacion conservativa" tambien incluye el uso de un aminoacido sustituido en lugar de un aminoacido parental no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipeptido sustituido tambien inmunorreaccionen con el polipeptido no sustituido.

Los procedimientos para determinar fragmentos de polipeptido y epltopo, tal como, la generacion de bibliotecas de peptidos superpuestos (Hemmer B. et al.), Pepscan (Geysen HM et al, 1984; Geysen HM et al, 1985; Van der Zee R. et al.; Geysen HM) y algoritmos (de Groot A. et al.; Hoop T. et al.; Parker K. et al), se pueden utilizar en la practica de la invencion, sin gran experimentacion. Generalmente, los anticuerpos se unen especlficamente a un epltopo antigenico particular. Ejemplos especlficos, no limitativos, de los epltopos incluyen una secuencia de tetrapeptido a pentapeptido en un polipeptido, una secuencia de triglicosido a pentaglicosido en un polisacarido. En los animales, la mayorla de los antlgenos presentaran varios o incluso muchos determinantes antigenicos simultaneamente. Preferilemente, en el que el epltopo es un fragmento de protelna de una molecula mas grande, tendra sustancialmente la misma actividad inmunologica que la protelna total.

Se describe en el presente documento un polinucleotido que codifica una ADN polimerasa de EHV-1 que comprende una asparagina (N) en la posicion de aminoacido 752 o una posicion equivalente de un polipeptido que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, 4 , 6, 37, 13, 14, o 15, o una variante conservativa, una variante alelica, un homologo o un fragmento inmunogenico que comprende al menos ocho o al este diez aminoacidos consecutivos de uno de estos polipeptidos, o una combination de estos polipeptidos.

Se describe en el presente documento un polinucleotido que tiene una secuencia de nucleotidos como se expone en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, o 36, o una variante del mismo. En aun otro aspecto, la presente invencion proporciona un polinucleotido que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 36, o una variante del mismo.

Los polinucleotidos de la description incluyen secuencias que son degeneradas como resultado del codigo genetico, por ejemplo, el uso de codones optimizado para un huesped especlfico. Como se usa en el presente documento, "optimizado" se refiere a un polinucleotido que se modifica geneticamente para incrementar su expresion en una especie determinada. Para proporcionar polinucleotidos optimizados que codifican una ADN polimerasa de EHV-1, la secuencia de ADN del gen de la ADN polimerasa de EHV-1 se puede modificar para 1) comprender codones preferidos por genes altamente expresados en una especie particular; 2) comprender un contenido de A T o G C en la composition de bases de nucleotidos con el que sustancialmente se encuentra en dicha especie; 3) formar una secuencia de initiation de dicha especie; o 4) eliminar secuencias que causan la desestabilizacion, poliadenilacion inapropiada, degradation y termination de ARN, o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de ARN. El aumento de expresion de ADN polimerasa de EHV-1 en dicha especie se puede lograr mediante la utilization de la frecuencia de distribution de uso de codones en celulas eucariotas y procariotas, o en una especie particular. El termino "frecuencia de uso codones preferido" se refiere a la preferencia exhibida por una celula huesped especifica en el uso de codones de nucleotidos para especificar un aminoacido determinado. Hay 20 aminoacidos naturales, la mayoria de los cuales estan especificados por mas de un codon. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleotidos degeneradas estan incluidas en la description siempre que la secuencia de aminoacidos de la ADN polimerasa de EHV-1 codificada por la secuencia de nucleotidos este funcionalmente inalterada.

En un aspecto, la presente invention proporciona un EHV-1 recombinante que contiene un gen mutado de Glicoprotema C (gC). El termino "gen de gC mutado" se refiere al gen de gC de EHV-1 que se altera o modifica que se da lugar a una proteina gC no funcional despues de la expresion, en el que se suprimen los nucleotidos en las posiciones 94 a 1315 inclusives del gen de gG de las SEQ. ID Nos: 7, 9 y 11.

Se describe en el presente documento un EHV-1 recombinante en el que se elimina el gen de la glicoprotema C (gC) en el genoma de EHV-1 nativo (de tipo salvaje) que codifica la proteina gC. El termino "gen de glicoprotema C (gC)" incluye cualquier gen o polinucleotido que codifica la glicoprotema C (gC) de EHV-1, y homologos, fragmentos o variantes del mismo. El gen de gC puede codificar una proteina gC que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8, 10, o 12, SEQ ID NO: 7, 9, o 11. En otro aspecto, la presente invencion proporciona un EHV-1 recombinante en el que el gen de la glicoprotema C (gC) en el genoma de EHV-1 nativo (de tipo salvaje) que codifica la proteina gC se altera o modifica dando lugar a una proteina gC mutada.

La identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoacidos puede establecerse mediante “blast” en parejas y la matriz BLOSUM62 de NCBI (National Center for Biotechnology Information), utilizando los parametros estandar (vease, por ejemplo, algoritmo BLAST o BLASTX disponible en el "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, Md., EE.UU.) servidor), asi como en Altschul et al .; y por lo tanto, este documento habla de utilizar el algoritmo o el BLAST o BLa StX y la matriz BLOSUM62 mediante el termino "blasts".

Alternativamente o adicionalmente, el termino "identidad", por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleotidos o aminoacidos, puede indicar una medida cuantitativa de homologia entre dos secuencias. El porcentaje de homologia de secuencias puede calcularse como: (N^{re r} - N^{d f})*100/N^{re r}, en la que N^{d r} es el numero total de residuos no identicos en las dos secuencias cuando se alinean y en la que N^{re r} es el numero de residuos en una de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendra una identidad de secuencia del 75% con la secuencia AATCAATC (N^{re r} = 8; N^d<r = 2).

Alternativa o adicionalmente, la "identidad" con respecto a secuencias puede referirse al numero de posiciones con nucleotidos o aminoacidos identicos dividido por el numero de nucleotidos o aminoacidos en la mas corta de las dos secuencias en que la alineacion de las dos secuencias puede determinarse de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman), por ejemplo, usando un tamano de ventana de 20 nucleotidos, una longitud de palabra de 4 nucleotidos y una penalization por hueco de 4, y se puede realizar convenientemente un analisis asistido por ordenador e interpretation de los datos de secuencia que incluyen alineacion utilizando programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Cuando se dice que las secuencias de ARN son similares o tienen un grado de identidad u homologia de secuencia con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN estan dentro del alcance de la descripcion y pueden derivarse de secuencias de ADN, considerandose timidina (T) en la secuencia de ADN igual a uracilo (U) en las secuencias de ARN.

La identidad de secuencia o similitud de secuencia de dos secuencias de aminoacidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleotidos se puede determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

Los vectores recombinantes descritos en este documento pueden incluir un polinucleotido que codifica un polipeptido, una variante del mismo o un fragmento del mismo. Los vectores recombinantes pueden incluir plasmidos y vectores virales y se pueden usar para la expresion in vitro o in vivo. Los vectores recombinantes pueden incluir ademas un peptido senal. Los peptidos senal son cadenas cortas de peptido (3-60 aminoacidos de longitud) que dirigen el transporte posterior a la traduction de una proteina (que se sintetizan en el citosol) a ciertos organulos, tales como el nucleo, la matriz mitocondrial, reticulo endoplasmico, cloroplasto, apoplasto y peroxisomas. Tipicamente, las proteinas de EHV-1 natural pueden traducirse como precursores, que tienen una secuencia de peptido senal N-terminal y un dominio de proteina "madura". El peptido senal puede ser proteina de EHV-1 escindida o un peptido senal de una proteina secretada, por ejemplo, el peptido senal de la proteina de activador de plasminogeno tisular (tPA), en particular el tPA humano (S. Friezner Degen et al.; R. Rickles et al.; D. Berg. et al.), o el peptido senal del factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF1), en particular el IGF1 equino (K. Otte et al.), el IGF1 canino (P. Delafontaine et al.), el IGF1 felino (WO03/022886), el IGF1 bovino (S. Lien et al.), el IGF1 porcino (M. Muller et al.), el IGF1 de pollo (Y. Kajimoto et al.), el IGF1 de pavo (GenBank numero de acceso AF074980). El peptido senal de IGF1 puede ser natural o optimizado que puede conseguirse mediante la elimination de los sitios de empalme cripticos y/o mediante la adaptation del uso de codones. Tras la traduccion, el polipeptido no procesado se puede escindir en un sitio de escision para dar lugar al polipeptido maduro. El sitio de escision puede predecirse utilizando el procedimiento de Von Heijne (1986).

Un plasmido puede incluir una unidad de transcripcion de ADN, por ejemplo, una secuencia de acido nucleico que le permite replicarse en una celula huesped, tal como un origen de replicacion (procariota o eucariota). Un plasmido tambien puede incluir uno o mas genes marcadores seleccionables y otros elementos geneticos conocidos en la tecnica. Las formas circulares y lineales de plasmidos estan abarcados por la presente descripcion.

Se describe en el presente documento un vector de expresion in vivo que comprende una secuencia de polinucleotidos, que contiene y expresa in vivo en un huesped el antlgeno, polipeptidos y/o variantes o fragmentos de los mismos de EHV-1.

El vector de expresion in vivo puede incluir cualquier unidad de transcripcion que contiene un polinucleotido o un gen de interes y aquellos elementos esenciales para su expresion in vivo. Estos vectores de expresion pueden ser plasmidos o vectores virales recombinantes. Para la expresion in vivo, el promotor puede ser de origen viral o celular. En una realizacion, el promotor puede ser el promotor temprano de citomegalovirus (CMV) (promotor CMV-IE), el promotor temprano o tardlo de virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous, un promotor de un gen del citoesqueleto, tal como el promotor de desmina (Kwissa M. et al.), o el promotor de actina (Miyazaki J. et al.). Cuando varios genes estan presentes en el mismo plasmido, se pueden proporcionar en la misma unidad de transcripcion o en diferentes unidades.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "plasmido" puede incluir cualquier unidad de transcripcion de ADN que comprende un polinucleotido de acuerdo con la invencion y los elementos necesarios para su expresion in vivo en una celula o celulas del huesped o diana deseados; y, en este sentido, cabe indicar que un plasmido circular, superenrollado o no superenrollado, as! como una forma lineal, se pretende que esten dentro del alcance de la invencion. Los plasmidos tambien pueden comprender otros elementos reguladores de la transcripcion, tales como, por ejemplo, secuencias de estabilizacion de tipo intron. En varias realizaciones, los plasmidos pueden incluir el primer intron de CMV-IE (WO 89/01036), el intron II del gen de beta-globina de conejo (van Ooyen et al.), la secuencia senal de la protelna codificada por el activador de plasminogeno tisular (tPA; Montgomery et al.), y/o una senal de poliadenilacion (poliA), en particular la poliA del gen de la hormona de crecimiento bovino (bGH) (US 5.122.458) o la polyA del gen de beta-globina de conejo o del virus SV40.

Los vehlculos o diluyentes o excipientes o adyuvantes farmaceuticamente aceptables de uso son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a Edicion (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administracion farmaceutica de los polipeptidos, plasmidos, vectores virales descritos en el presente documento. En general, la naturaleza del vehlculo o excipiente dependera del modo de administracion particular empleado. Por ejemplo, las formulaciones parenterales normalmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmaceutica y fisiologicamente aceptables, tales como agua, solucion salina fisiologica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehlculo. Para las composiciones solidas (por ejemplo, formas de pastillas liofilizadas, polvo, plldora, comprimido o formas capsula), los vehlculos o diluyentes o excipientes o adyuvantes solidos no toxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmaceuticos de manitol, lactosa, almidon, o estearato de magnesio. Ademas de los vehlculos o diluyentes o excipientes o adyuvantes biologicamente neutros, las composiciones inmunogenicas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no toxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes de tamponamiento de pH y similares, por ejemplo acetato de sodio o monolaurato de sorbitan.

Las composiciones o vacunas descritas en el presente documento pueden incluir vectores recombinantes que codifican cualquier polipeptido o antlgeno de acuerdo con la presente invencion, tal como se describe anteriormente.

Se pueden realizar multiples inserciones en el mismo vector utilizando diferentes sitios de insercion o utilizando el mismo sitio de insercion. Cuando se utiliza el mismo sitio de insercion, cada inserto de polinucleotido, que puede ser cualquier polinucleotido de la presente invencion mencionado anteriormente, se puede insertar bajo el control del mismo y/o diferentes promotores. La insercion se puede hacer cola a cola, de cabeza a cabeza, cola a cabeza o de cabeza a cola. Los elementos IRES (sitio interno de entrada al ribosoma, vease el documento EP 0.803.573) tambien se puede utilizar para separar y expresar multiples insertos unidos operativamente a los mismos y/o diferentes promotores.

Mas en general, se describen en el presente documento vectores de expresion in vivo que incluyen cualquier plasmido (EP-A2-1001025; Chaudhuri P.) que contiene y expresa in vivo en un huesped, el polinucleotido o gen de polipeptido de EHV-1, variante o fragmento, tal como se describe anteriormente, y los elementos necesarios para su expresion in vivo.

En un ejemplo no limitativo especlfica, el plasmido pVR1020 o pVR1012 (VICAL Inc.; Lucas C. et al.; Hartikka J. et al.), PVR2001-TOPA (o pVR2001-TOPO) (Oliveira F. et al.) o pAB110 (US 6.852.705) se pueden utilizar como un vector para la insercion de una secuencia de polinucleotidos. El plasmido pVR1020 deriva de pVR1012 y contiene la secuencia de senal de tPA humano. El pVR1020 es un esqueleto de plasmido disponible de Vical, Inc., (San Diego, CA) que se ha utilizado previamente, vease, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.451.769 y 7.078.507. Tal como se describe en Oliveira et al, el plasmido pVR2001-TOPO (o pVR2001-TOPA) es pVR1020 modificado por la adicion de topoisomerasas que flanquean el sitio de clonacion y que contienen la codificacion y la expresion de un peptido senal de secrecion, por ejemplo, el peptido senal de activador de plasminogeno tisular (tPA), que aumenta la probabilidad de producir una protelna secretada (Oliveira F. et al.).

Cada plasmido puede comprender o contener o consistir esencialmente en, el polinucleotido de acuerdo con la presente invencion, unido operativamente a un promotor o bajo el control de un promotor o dependiente de un promotor, en el que el promotor puede estar ventajosamente adyacente al polinucleotido para el que se desea la expresion. En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte que sea funcional en celulas eucariotas. Un ejemplo de un promotor util puede ser el promotor de citomegalovirus temprano inmediato (CMV-IE) de origen humano o murino, o puede tener opcionalmente otro origen, tal como de rata o conejillo de indias. El promotor CMV-IE puede comprender la parte del promotor real, que puede o no estar asociada con la parte potenciadora. Se puede hacer referencia a los documentos EP 260 148, EP 323 597, US 5.168.062, 5.385.839, y 4.968.615, as! como al documento WO 87/03905. El promotor CMV-IE puede ser ventajosamente un CMV-IE de ser humano (Boshart M. et al.) o CMV-IE murino. En terminos mas generales, el promotor puede tener un origen viral o un origen celular. Un promotor viral fuerte distinto del CMV-IE que puede emplearse utilmente es el promotor temprano/tardlo del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Un promotor celular fuerte que se puede emplear de manera util es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como el promotor de desmina (Kwissa M. et al.) o el promotor de actina (Miyazaki J. et al.). Los subfragmentos funcionales de estos promotores, es decir, partes de estos promotores que mantienen actividad promotora adecuada, estan incluidos, por ejemplo, promotores de CMV-IE truncados segun los documentos WO 98/00166 o US 6.156.567. Un promotor, en consecuencia, puede incluir derivados y/o subfragmentos de un promotor de longitud completa que mantienen una actividad promotora adecuada y por lo tanto, funcionan como un promotor, y que pueden tener ventajosamente actividad promotora que es sustancialmente similar a la del promotor real o de longitud completa de la que deriva el derivado o subfragmento, por ejemplo, similar a la actividad de los promotores CMV-IE truncados de US 6.156.567 en comparacion con la actividad de promotores CMV-IE de larga duracion. Por lo tanto, un promotor CMV-IE en la practica de la invencion puede comprender o consistir esencialmente en o consistir en la porcion de promotor del promotor de longitud completa y/o la porcion de potenciador del promotor de longitud completa, as! como derivados y/o subfragmentos de los mismos.

Ventajosamente, los plasmidos comprenden o consisten esencialmente en otros elementos de control de la expresion. Es especialmente ventajoso incorporar una secuencia o secuencias de estabilizacion, por ejemplo, una secuencia o secuencias de intron, por ejemplo, el primer intron del hCMV-IE (WO 89/01036), el intron II del gen de pglobina de conejo (van Ooyen et al.). En cuanto a la senal de poliadenilacion (poliA) para los plasmidos y vectores virales distintos de poxvirus, puede utilizarse la senal de poli(A) del gen de hormona de crecimiento bovina (bGH) (vease el documento US 5.122.458), o la senal de poli(A) del gen de p-globina de conejo o la senal de poli(A) del virus SV40.

En el presente documento se describen vectores de expresion in vivo que incluyen cualquier vector viral recombinante que contiene un polinucleotido o gen que codifica uno o mas polipeptidos de EHV-1, variantes o fragmentos, tal como se describe anteriormente, incluyendo cualquier elemento necesario para su expresion in vivo.

El vector viral recombinante puede ser un virus del herpes, tal como un virus del herpes equino 1 (EHV-1), tal como se describe anteriormente. El vector de EHV-1 puede derivar de la cepa RacH, la cepa RacL, la cepa Ab4, la cepa V592, la cepa Kentucky D (TACC No. VR-700), la cepa 438/77 (ATCC No. VR-2229), la cepa AB69 (ATCC No. VR-2581), la cepa de EHV-1 NY03, o una combinacion de las cepas RacH o RacL de EHV-1. En una realization, el polinucleotido a expresar se introduce bajo el control de un promotor funcional en celulas eucariotas, ventajosamente un promotor CMV-IE (murino o humano). Se pueden insertar una secuencia de poli (A) y una secuencia terminadora en direction 3' del polinucleotido a expresar, por ejemplo, hormona del crecimiento bovina o una senal de poliadenilacion del gen de p-globina de conejo.

En una realizacion, el vector viral podrla ser virus de la enfermedad de Newcastle (US2012/052089). En otra realizacion, el vector viral podrla seleccionarse de, por ejemplo, los poxvirus, especialmente virus de avipox, tal como virus de la viruela aviar o virus de la viruela de canario. En una realizacion, el virus de la viruela aviar es un TROVAC (vease el documento WO 96/40241). En otra realizacion, el vector de la viruela del canario es un ALVAC. El uso de estos vectores virales recombinantes y la insertion de polinucleotidos o genes de interes se describen completamente en el documento US 5.174.993; US 5.505.941 y ^uS 5.766.599 para la viruela aviar, y US 5.756.103 para la viruela del canario. Se podrla usar mas de un sitio de insercion dentro del genoma viral para la insercion de multiples genes de interes.

Para los vectores recombinantes basados en un vector de poxvirus, se pueden utilizar un virus vaccinia o un virus vaccinia atenuado, (por ejemplo, MVA, una cepa Ankara modificada obtenida despues de mas de 570 pasajes de la cepa de la vacuna Ankara en fibroblastos de embrion de pollo; ver Stickl y Hochstein-Mintzel; Sutter et al.; disponible como ATCC VR-1508; o NYVAC, vease el documento uS 5.494.807, y la Patente de Estados Unidos No. 5.494.807 que describen la construction de NYVAC, as! como las variaciones de NYVAC con ORF adicionales eliminados del genoma del virus vaccinia de la cepa Copenhagen, as! como la insercion de moleculas de acidos nucleicos codificantes heterologas en los sitios de este recombinante, y tambien, el uso de promotores emparejados; vease tambien el documento WO 96/40241), un virus avipox o un virus avipox atenuado (por ejemplo, viruela del canario, viruela aviar, viruela de tortola, viruela de la paloma, viruela de codorniz, ALVAC o TROVAC;. veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos No. 5.505.941, 5.494.807). Los virus del canario atenuado se describen en US 5.756.103 (ALVAC) y el documento WO 01/05934. Tambien se hace referencia a US 5.766.599 que pertenece a la atenuada TROVAC cepa de la viruela aviar. Se hace referencia a la viruela del canario disponible en la ATCC bajo el numero de acceso VR-111. Numerosas cepas de vacunacion del virus de la viruela aviar tambien estan disponibles, por ejemplo, la cepa TC DIFTOSEC comercializada por Merial y la vacuna NOBILIS VARIOLE comercializada por INTERVET. Para obtener information sobre el procedimiento utilizado para generar recombinantes de las mismas y como administrar recombinantes de las mismas, el experto en la materia puede referirse a documentos citados en la presente memoria y al documento WO 90/12882, por ejemplo, en cuanto al virus vaccinia, se hace mention de las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.769.330, 4.722.848 , 4.603.112, 5.110.587, 5.494.807 y 5.762.938, entre otras; con respecto a la viruela aviar, se hace mencion a las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.174.993, 5.505.941 y 5.766.599, entre otras; con respecto a la viruela del canario, se hace mencion a la patente de Estados Unidos N° 5.756.103, entre otras. Cuando el vector de expresion es un virus vaccinia, el sitio o sitios de insertion para el polinucleotido o los polinucleotidos a expresar estan ventajosamente en el gen o sitio de insercion de timidina quinasa (TK), el gen o sitio de insercion de hemaglutinina (HA), la region que codifica el cuerpo de inclusion del tipo A (ATI). En el caso de la viruela del canario, ventajosamente el sitio o sitios de insercion son ORF(s) C3, C5 y/o C6. En el caso de la viruela aviar, ventajosamente el sitio o sitios de insercion son ORFs F7 y/o F8. El sitio o sitios de insercion para el virus MVA son ventajosamente como en varias publicaciones, incluyendo Carroll M.W. et al.; Stittelaar KJ et al.; Sutter G. et al.; y, en este sentido cabe indicar tambien que el genoma de MVA completo se describe en Antoine G., Virology, que permite que el experto en la tecnica use otros sitios de insercion u otros promotores. Ventajosamente, el polinucleotido a expresar se inserta bajo el control de un promotor especlfico de poxvirus, por ejemplo, el promotor de vaccinia de 7,5 kDa (Cochran et al.), el promotor de vaccinia I3L (Riviere et al.), el promotor de vaccinia HA (Shida), el promotor de la viruela de vaca ATI (Funahashi et al.), el promotor de de vaccinia H6 (Taylor J. et al.; Guo P. et al. J.; Perkus M. et al.).

Cualquiera de los polinucleotidos descritos en el presente documento puede expresarse in vitro por transferencia de ADN o vectores de expresion en una celula huesped adecuada. La celula huesped puede ser procariota o eucariota. El termino "celula huesped" tambien incluye cualquier progenie de la celula huesped en cuestion. Los procedimientos de transferencia estable, lo que significa que el polinucleotido exogeno se mantiene continuamente en la celula huesped, son conocidos en la tecnica. Las celulas huesped pueden incluir bacterias (por ejemplo, Escherichia coli), levaduras, celulas de insectos y celulas de vertebrados. Los procedimientos para expresar secuencias de ADN en celulas eucariotas son bien conocidos en la tecnica. Como procedimiento para la expresion in vitro, se pueden utilizar vectores de baculovirus recombinantes (por ejemplo, Virus de la Polihedrosis Nuclear de Autographa californica (AcNPV)) con los acidos nucleicos descritos en este documento. Por ejemplo, los promotores de polihedrina se pueden utilizar con celulas de insectos (por ejemplo, celulas de Spodoptera frugiperda, como las celulas Sf9 disponibles en la ATCC bajo el numero de acceso CRL 1711, o celulas Sf21) (ver por ejemplo, Smith et al.; Pennock et al.; Vialard et al.; Verne A.; O'Reilly et al.; Kidd IM & Emery V.C.; EP 0370573; EP 0265785, US 4745051). Para la expresion, se puede utilizar el paquete BaculoGold Starter (Cat # 21001K) de Pharmingen (Becton Dickinson). Como un procedimiento para la expresion in vitro, se puede utilizar E. coli recombinante con un vector. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles, tales como el promotor de arabinosa, pL del bacteriofago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor hlbrido ptrp-lac) y similares. La transformation de una celula huesped con ADN recombinante puede llevarse a cabo mediante tecnicas convencionales conocidas para los expertos en la tecnica. Cuando el huesped es procariota, tal como E. coli, las celulas competentes que son capaces de la captation de ADN se pueden preparar a partir de celulas recogidas despues de la fase de crecimiento exponencial y tratadas posteriormente mediante el procedimiento con CaCl2 usando procedimientos bien conocidos en la tecnica. Alternativamente, se pueden utilizar MgCl2 o RbCl. La transformacion tambien puede llevarse a cabo mediante electroporation. Cuando el huesped es un eucariota, se pueden utilizar dichos procedimientos de transduction de ^a Dⁿ como coprecipitados con fosfato de calcio, procedimientos mecanicos convencionales, tales como microinyeccion, electroporacion, insercion de un plasmido encerrado en liposomas o vectores de virus. Las celulas eucariotas tambien pueden cotransformarse con secuencias de polinucleotidos de L. longipalpis, y una segunda molecula de ADN exogeno que codifica un fenotipo seleccionable, tal como el gen de la timidina quinasa del herpes simple. Otro procedimiento es usar un vector viral eucariota (ver anteriormente), tal como un virus del herpes o adenovirus (por ejemplo, adenovirus canino 2), para transducir de forma transitoria celulas eucariotas y expresar la protelna (Gluzman EA). Ademas, se puede utilizar un agente de transfection, tal como dioleoil-fosfatidil-etanolamina (DOPE).

El aislamiento y purification de polipeptido expresado recombinantemente pueden llevarse a cabo por medios convencionales que incluyen cromatografla preparativa (por ejemplo, exclusion por tamano, intercambio ionico, afinidad), precipitation selectiva y ultrafiltracion. Ejemplos de tecnicas en el estado de la tecnica que se pueden utilizar, pero no limitada a las mismas, se pueden encontrar en "Protein Purification Applications", segunda edition, editado por Simon Roe y disponible en Oxford University Press. Dicho polipeptido expresado de forma recombinante es parte de la presente description. Los procedimientos para la production de cualquier polipeptido de acuerdo con la presente invention, como se ha descrito anteriormente, tambien estan incluidos, en particular, el uso de un vector de expresion recombinante que comprende un polinucleotido de acuerdo con la descripcion y de una celula huesped.

Las vacunas que contienen vectores virales recombinantes de acuerdo con la presente invencion se pueden liofilizar, de manera ventajosa con un estabilizante. La liofilizacion puede realizarse de acuerdo con procedimientos de liofilizacion convencionales bien conocidos. Los estabilizantes farmaceutica o veterinariamente aceptables pueden ser carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, manitol, lactosa, sacarosa, glucosa, dextrano, trehalosa), glutamato de sodio (Tsvetkov T et al.; Israeli E et al.), protelnas, tales como peptona, albumina, lactoalbumina o caselna, agentes que contienen protelnas, tales como leche desnatada (Mills C K et al.; Wolff E et al.), y tampones (por ejemplo, tampon fosfato, tampon fosfato de metal alcalino). Se puede utilizar un adyuvante para hacer solubles las preparaciones liofilizadas.

Cualquier composicion de vacuna segun la invencion puede tambien contener ventajosamente uno o mas adyuvantes.

Las vacunas basadas en plasmidos pueden formularse con llpidos cationicos, ventajosamente con DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N, N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanamonio; WO96/34109), y ventajosamente en asociacion con un llpido neutro, por ejemplo DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr JP), con el fin de formar DMRIE-DOPE. En una realizacion, la mezcla se hace de forma extemporanea, y antes de su administration, es ventajoso esperar de aproximadamente 10 min a aproximadamente 60 min, por ejemplo, aproximadamente 30 min, para la mezcla apropiada. Cuando se utiliza DOPE, la relation molar de DMRIE/DOPE puede ser de 95/5 a 5/95 y es ventajosamente 1/1. La relacion en peso de plasmido/DMRIE o adyuvante DMRIE-DOPE es, por ejemplo, de 50/1 a 1/10, de 10/1 a 1/5 o de 1/1 a 1/2.

Opcionalmente, se puede anadir una citoquina a la composicion, especialmente GM-CSF o citoquinas que inducen Th1 (por ejemplo IL12). Estas citoquinas se pueden anadir a la composicion como un plasmido que codifica la protelna de citoquina. En una realizacion, las citoquinas son de origen canino, por ejemplo, GM-CSF canino, cuya secuencia del gen ha sido depositada en la base de datos GenBank (numero de acceso S49738). Esta secuencia se puede utilizar para crear dicho plasmido de una manera similar a la que se hizo en el documento WO 00/77210. La vacuna basada en vector viral recombinante puede combinarse con fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; US 6.017.537) y/o adyuvante Carbomer (Phameuropa Vol 8, No. 2, junio de 1996). Los expertos en la tecnica tambien pueden hacer referencia a US 2909462, que describe dichos pollmeros acrllicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, ventajosamente no mas de 8, estando los atomos de hidrogeno de al menos tres hidroxilos reemplazados por radicales alifaticos insaturados que tienen al menos 2 atomos de carbono. Por ejemplo, los radicales son los que contienen de 2 a 4 atomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilenicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener por si mismos otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos que se venden bajo el nombre CARBOPOL® (BF Goodrich, Ohio, Estados Unidos) son apropiados. Los productos se reticulan con una alil sacarosa o con alilpentaeritritol. Entre ellos, se pueden citar ventajosamente CARBOPOL® 974P, 934P y 971P.

Entre los copollmeros de anhldrido maleico y derivado alquenilo, los copollmeros

EMA® (Monsanto) que son copollmeros de anhldrido maleico y etileno, lineal o reticulado, por ejemplo reticulado con divinil eter, son ventajosos. Se puede hacer referencia a J. Fields et al.

Los pollmeros de acido acrllico o metacrllico y los copollmeros EMA® estan formados, por ejemplo, de unidades basicas de la formula siguiente en la que:

- R¹ y R², que son identicos o diferentes, representan H o CH³

- x = 0 o 1, preferiblemente x = 1

- y = 1 o 2, con x y = 2

Para los copollmeros EMA®, x = 0 e y = 2. Para los carbomeros, x = y = 1.

La disolucion de estos pollmeros en agua conduce a una solution acida, que se neutraliza, ventajosamente a pH fisiologico, a fin de proporcionar la solucion adyuvante en la que se incorpora la vacuna en si. Los grupos carboxilo del pollmero estan entonces parcialmente en forma de COO'.

En una realization, una solution de adyuvante, especialmente de carbomero (Pharmeuropa, volumen 8, N° 2, junio de 1996), se prepara en agua destilada, de manera ventajosa en presencia de cloruro de sodio, estando la solution obtenida a un pH acido. Esta solution madre se diluye mediante la adicion a la cantidad deseada (para obtener la concentration final deseada), o una parte sustancial de la misma, de agua cargada con NaCl, ventajosamente solution salina fisiologica (NaCl 9 g/l) de una vez en varias porciones con neutralization concomitante o subsiguiente (pH 7,3 a 7,4), ventajosamente con NaOH. Esta solution a pH fisiologico se utiliza para la mezcla con la vacuna, que puede almacenarse especialmente en forma liofilizada, llquida o congelada.

La concentration de pollmero en la composition de vacuna final puede ser de 0,01% a 2% p/v, de 0,06 a 1% p/v, o de 0,1 a 0,6% p/v.

La vacuna de subunidad se puede combinar con adyuvantes, como emulsiones de aceite-en-agua, agua-en-aceiteen-agua a base de aceite mineral y/o aceite vegetal y tensioactivos no ionicos, tales como copollmeros de bloque, TWEEN®, SPAN®. Tales emulsiones son, en particular, los descritos en la pagina 147 de "Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, 1995, o emulsiones TS, en particular, la emulsion TS6 y emulsiones LF, en particular, la emulsion LF2 (para ambas emulsioness TS y LF, vease el documento WO 04/024027). Otros adyuvantes adecuados son, por ejemplo, vitamina E, saponinas y CARBOPOL® (Noveon; vease el documento WO 99/51269; WO 99/44633), hidroxido de aluminio o fosfato de aluminio ("Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, 1995), adyuvantes biologicos (es decir, C4b, en particular C4b murino (Ogata RT et al.) o C4b equino, GM-CSF, en particular GM-CSF equino (US 6.645.740)), toxinas (es decir, toxinas de colera CTA o CTB, toxinas termolabiles de Escherichia coli LTA o LTB (Olsen CW et al.; Fingerut e et al.; Zurbriggen R et al. Peppoloni S et al.), y CpG (es decir CpG # 2395 (ver Jurk M et al.), CpG # 2142 (ver SEQ ID NO: 890 en el documento EP 1221955).

La composition o vacuna tambien pueden estar asociados con al menos un antlgeno de EHV-1, por ejemplo EHV-1 inactivado. En una realization particular, la cepa de EHV-1 puede ser la cepa RacH, la cepa RacL, la cepa Ab4, la cepa V592, la cepa Kentucky D (TACC No. VR-700), la cepa 438/77 (ATCC No. VR-2229), la cepa AB69 (ATCC No. v R-2581), EHV-1 NY03, o una combination de las cepas RacH o RacL de EHV-1. Estas cepas de EHV-1 pueden ser inactivadas por procedimientos qulmicos o flsicos. Los procedimientos qulmicos son, en particular, BPL, formaldehldo. Los procedimientos flsicos pueden ser, en particular, sonicacion. La vacuna inactivada de EHV-1 puede combinarse con adyuvantes, como los descritos anteriormente para las vacunas de subunidades.

Se describen en el presente documento procedimientos de vacunacion de un huesped frente a EHV-1 usando las vacunas o composiciones descritas en este documento.

El huesped puede ser cualquier animal. En una realization, el huesped es un equino.

Las vlas de administration pueden ser, por ejemplo, intramuscular (IM) o intradermica (ID) o transdermica (TD) o subcutanea (SC). Los medios de administration pueden ser, por ejemplo, una jeringa con una aguja, o un aparato sin aguja, o una jeringa con una aguja acoplada a tratamiento por electrotransferencia (ET), o un aparato sin aguja acoplado a tratamiento ET.

Para las vacunas basadas en plasmidos, las rutas ventajosas de administration pueden ser ID o IM. Esta administration puede ser a traves del uso de una jeringa con una aguja o con un aparato sin aguja como Dermojet o Biojector (Bioject, Oregon, EE.UU.) o Vetjet™ (Merial) o Vitajet™ (Bioject Inc.), vease US 2006/0034867. La dosificacion puede ser de 50 mg hasta 500 mg por plasmido. Cuando se anade DMRIE-DOPE, se pueden utilizar 100 mg por plasmido. Cuando se utilizan GM-CSF u otras citoquinas, el plasmido que codifica esta protelna puede estar presente en una dosis de aproximadamente 200 mg a aproximadamente 500 mg y puede ser de 200 mg. El volumen de dosis puede ser de entre 0,01 ml y 0,5 ml, por ejemplo, 0,25 ml. La administration puede proporcionarse en multiples puntos de inyeccion.

Alternativamente, las vacunas basadas en plasmidos pueden administrarse por via IM acoplado a tratamiento por electrotransferencia (ET). El tratamiento ET puede realizarse utilizando un aparato para electrotransferencia y las especificaciones del fabricante (es decir, generador Sphergen G250 (Sphergen ^sA^r L, Evry Genopole, Francia); sistema de electroporation de ADN MedPulser® (Innovio Biomedical Corporation, San Diego, California, EE.UU.)).

Para las vacunas basadas en vectores virales recombinantes, las vlas de administration pueden ser, ventajosamente, SC, IM, TD, o ID. Esta administration puede realizarse por una jeringa con una aguja o con un aparato sin aguja como Dermojet o Biojector (Bioject, Oregon, EE.UU.) o Vetjet™ (Merial) o Vitajet™ (Bioject Inc.). La dosis puede ser de aproximadamente 104 UFP a aproximadamente 109 UFP por vector de EHV recombinante. El volumen de dosis puede ser de aproximadamente 0,01 ml a 0,2 ml, y es ventajosamente de 0,1 ml. La administration puede comprender multiples puntos de inyeccion.

Para la via IM el volumen de la vacuna proporcionada puede ser de 0,2 a 2 ml, en particular de aproximadamente 0,5 a 1 ml. Las mismas dosis se utilizan para cualquiera de los vectores de la presente invention.

Para las vacunas con subunidades, la via de administracion puede ser, ventajosamente, a traves de SC o IM o TD o ID. Esta administracion puede realizarse mediante una jeringa con una aguja o con un aparato sin aguja como Dermojet o Biojector (Bioject, Oregon, EE.UU.) o Vetjet™ (Merial) o Vitajet™ (Bioject Inc.). La dosis puede ser de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mg, en particular de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 mg, y mas particularmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 mg. El volumen de la vacuna con subunidades proporcionado es de 0,2 a 2 ml, en particular de aproximadamente 0,5 a 1 ml.

En un aspecto, la presente invencion se refiere a una estrategia de vacunas, que se basa en un regimen de administracion de sensibilizacion-refuerzo, donde la administracion de la sensibilizacion y la administracion de refuerzo utilizan una composicion que comprende un excipiente, diluyente, adyuvante, o vehlculo farmaceuticamente veterinariamente aceptable, y el EHV-1 recombinante de la presente invencion. En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento de vacunacion de un sujeto o huesped susceptible a EHV-1 que comprende un regimen de administracion de sensibilizacion-refuerzo.

Un regimen de sensibilizacion-refuerzo comprende al menos una administracion de sensibilizacion y al menos una administracion de refuerzo usando al menos un antlgeno comun y/o variantes o fragmentos del mismo. La vacuna utilizada en la administracion de sensibilizacion puede ser de naturaleza diferente a las utilizadas como vacuna de refuerzo posterior. Se observa ademas que tanto la administracion de sensibilizacion como la administracion de refuerzo pueden comprender el EHV-1 recombinante de la presente invencion. La administracion de sensibilizacion puede comprender una o mas administraciones. Del mismo modo, la administracion de refuerzo puede comprender una o mas administraciones.

Las vlas de administracion, las dosis y los volumenes son como se describen anteriormente en el presente documento.

Las administraciones de sensibilizacion-refuerzo pueden llevarse a cabo con de 2 a 6 semanas de diferencia, por ejemplo, con aproximadamente 4 semanas de diferencia. De acuerdo con una realizacion, tambien se preve un refuerzo semianual o un refuerzo anual.

En una realizacion, el regimen de administracion de sensibilizacion-refuerzo comprende al menos una administracion de sensibilizacion de una vacuna o composicion de EHV-1 recombinante de la presente invencion y al menos una administracion de refuerzo de una vacuna viral inactivada que comprende el antlgeno de EHV-1, o una vacuna basada en un plasmido que expresa el antlgeno de EHV-1, o una vacuna de subunidades que comprende el antlgeno de EHV-1, o una combinacion de las mismas.

En otra realizacion, el regimen de administracion de sensibilizacion-refuerzo comprende al menos una administracion de sensibilizacion de una vacuna viral inactivada que comprende el antlgeno de EHV-1, o una vacuna basada en plasmido que expresa el antlgeno de EHV-1, o una vacuna de subunidades que comprende el antlgeno de EHV-1, o una combinacion de las mismas y al menos una administracion de refuerzo de una vacuna o composicion de EHV-1 recombinante de la presente invencion.

Otro aspecto de la descripcion se refiere a un kit para la vacunacion de sensibilizacion-refuerzo de acuerdo con la presente invencion. El kit puede comprender al menos dos viales: un primer vial que contiene una vacuna para la vacunacion de sensibilizacion de acuerdo con la presente invencion, y un segundo vial que contiene una vacuna para la vacunacion de refuerzo segun la presente invencion. El kit puede contener ventajosamente primeros o segundos viales adicionales para vacunaciones de sensibilizacion adicionales o vacunaciones de refuerzo adicionales.

El kit puede comprender dos viales, uno que contiene una vacuna basada en plasmido para la vacunacion de sensibilizacion de acuerdo con la presente invencion, el otro vial que contiene una vacuna basada en vector viral recombinante para la vacunacion de refuerzo segun la presente invencion.

La invencion se describira ahora adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS

Sin mas elaboracion, se cree que un experto en la tecnica puede, usando las descripciones anteriores, poner en practica la presente invencion en su extension mas completa. Los siguientes ejemplos detallados deben interpretarse como meramente ilustrativos y sin limitaciones de la descripcion precedente en modo alguno. Los expertos en la tecnica reconoceran rapidamente las variaciones apropiadas de los procedimientos en cuanto a reactivos y en cuanto a las condiciones y tecnicas de reaccion.

La construccion de insertos de ADN, plasmidos y vectores virales recombinantes se llevo a cabo utilizando las tecnicas estandar de biologla molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). Todos los fragmentos de restriccion utilizados para la presente invencion se aislaron usando el kit "Geneclean" (BIO 101 Inc., La Jolla, Calif.).

Ejemplo 1 Construccion de la ifnea celular RK13_Pol

Celulas y virus

Se mantuvieron celulas de rinon de conejo (RK13) en medio mlnimo esencial de Earle (EMEM) complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS), 100 U/ml de penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina (1% Pen/Strep). Se mantuvo la llnea celular de fibroblastos de piel equina (NBL6) en EMEM complementado con FBS al 10%, 29 mg/ml de L-glutamato, 1% de Pen/Strep y 1% de aminoacidos no esenciales (Gibco BRL). Las cepas de EHV-1 RacL11 y NY03 se desarrollaron en celulas RK13 frescas. NY03, que alberga una forma no neurologica de ADN polimerasa (N752 Pol), se aislo de un potro abortado de una granja en Nueva York en 2003.

Construccion de la linea celular RK13 Pol

Para apoyar el crecimiento de mutante RacL11 Pol-negativo, se genero primero una llnea celular de rinon de conejo designada RK13_Pol que expresaba la forma no neurologica de la polimerasa (N752). El marco de lectura abierto completo de la polimerasa de NY03 se amplifico a partir de ADN genomico viral, que se extrajo de celulas RK13 infectadas con virus. La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) se realizo utilizando ADN polimerasa AccuPrime (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y el par de cebadores PN1/PN2 (Tabla 1). El amplicon, flanqueado con un sitio de restriction Hindlll en el extremo 5' y un sitio BamHI, as! como una etiqueta HA en el extremo 3', se clono en el plasmido pCDNA3 para generar pCDNA3-Pol. Despues de la digestion con PvuI, se linealizaron 4 mg de plasmido recombinante pCDNA3-Pol y se transfectaron en celulas RK13 cultivadas en placas de seis pocillos usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las celulas transfectadas se propagaron en EMEM que contenla FBS al 10% y 1,2 mg/ml de G418 (Merck). Un clon de una sola celula en el que se mostro que cada celula expresaba ADN polimerasa mediante un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA) se selecciono y se denomino RK13_Pol. Mediante IFA utilizando MAb anti-HA, se pudo demostrar la expresion de la polimerasa en RK13_Pol (Figura 3) y demostro ser estable en diez veces los pasajes.

Tabla 1 Secuencias de cebadores

Nombre SEQ Secuencia

del ID

cebador NO:

PN1 16 5'-CCCAAGCTTgagATGGCGGCGCGCGAACAGGCCA-3'

PN2 17 5'-CGCGGATCCTTAAGCGTAGTCT GGGACGTCGTAT GGGTAGCTTT GAT GGGGAGCT GCTTCT -3'

P1 18 5'-GCCTGCGT GGAGGAGT ATT GGG-3'

P2 19 5'-TAATTGATTACTATTAATAACTATTACACCGGAGGAAGAAAGTCG-3'

P3 20 5'-CAAACT CAT CAAT GT AT CTT AAGGT CT GT GT AAATTT AAAGT GCGA-3'

P4 21 5'-CAAAGGTGCCAGCGTCACATCG-3'______________________________________________

P5 22 5'-ACGACTTTCTTCCTCCGGTGTAATAGTTATTAATAGTAATCAATT-3'

P6 23 5'-CCCTTGCTCACCATGGTGGCGGATCTGACGGTTCACTAAACC-3'

P7 24 5'-GGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGG-3'

P8 25 5'-CGCACTTTAAATTTACACAGACCTTAAGATACATTGATGAGTTTG-3'

P9 26 5'-TCCCCGCGGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTAGTTATT AAT AGT AAT CAAT -3'

P10 27 5'-CTAGCTAGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGATACATTGATGAGTT-3'

gC-1 28 5'-GACTCTGTCGACGGCCACCGCCGAC- 3'

gC-2 29 5'-CCTGGATCCAGACTCTATTCCCATG-3'

DgC-1 30 5'-TTGGCCTATGCGGACGACTT-3'

DgC-2 31 5'-CCCTTTGGT GCAT GGT AT GT-3'

Poli1 32 5'-TCTGG AACTA TCGGC GGTGG C-3'

Poli2 33 5'-CGGGT CTTGA GGAGC ATGTC G-3'

Ejemplo 2 Plasmidos y mutagenesis viral

Generation de mutantes de virus

Se utilizo una estrategia convencional de recombination homologa para todas las manipulaciones geneticas. Dos fragmentos de 1,7 kbp flanqueantes a cada lado de la ADN polimerasa fueron amplificados utilizando UFP polimerasa termoestable (Promega) y los pares de cebadores P1/P2 y P3/P4 del genoma de RacL11. Se utilizaron otros dos pares de cebadores P5/P6 y P7/P8 para amplificar el promotor de HCMV (citomegalovirus humano) y el gen de EYFP (protelna amarilla fluorescente mejorada) del plasmido EYFP pEYFP-N1, por separado. Los extremos 5' de los cebadores P2 y P5, P3 y P8, as! como P6 y P7, llevan secuencias homologas de 21-23 pb. Con una PCR de solapamiento utilizando P5 y P8, el promotor de HCMV y el gen de EYFP se fusionaron y se clonaron en el plasmido pCR2.1-Topo (Invitrogen), dando lugar a pCES1. Para la construccion del plasmido lanzadera pCR-Topo-P1P4, los dos brazos homologos anteriores y el casete que expresa EYFP en pCES1 se combinaron mediante la PCR de solapamiento usando los cebadores P1/P4 y se clonaron en pCR2.1-Topo. Usando pCES1 como plantilla y el par de cebadores P9/P10, el casete de EYFP flanqueado con los sitios de restriccion Sacll y Nhel, as! como secuencias de LoxP en direccion 5' y 3', se amplifico y se clono en pCR2.1-Topo ando lugar al plasmido pCES2. Para generar el plasmido pCR-Topo-gC, un fragmento de 5,87kbp que contenla gC, que se amplifico a partir del genoma de RacL11 usando los cebadores gC-1 y gC-2, se clono en pCR2.1-Topo. Despues de la digestion con Sacll y Nhel, el casete de EYFP se libero de pCES2 y se transfirio a pCR-Topo-gC para sustituir el gen de gC y el plasmido lanzadera recombinante se denomino Topo-AgC-EYFP. Los plasmidos pCES1, pCES2, pCR-Topo-P1P4 y Topo-AgC-EYFP se identificaron mediante digestion y secuenciacion. El esquema de clonacion se representa en la Figura 2.

Para la mutacion de la ADN polimerasa, se cotransfectaron 1 mg de ADN viral de RacL11 y 10 mg del plasmido pCR-Topo-P1P4 en celulas RK13_Pol en una placa de 6 pocillos mediante precipitacion con fosfato de calcio. Dos dlas despues de la transfeccion, se observaron placas verdes bajo el microscopio de fluorescencia (Axiovert 25, Zeiss). Se recogio el virus completo despues de 2 ciclos de congelacion-descongelacion y se hizo crecer en celulas RK13_Pol frescas que se cubrieron con metilcelulosa al 1,5% en EMEM-FBS al 2% a la hora despues de la infeccion. Despues de 3 veces de purification, se genero el mutante de RacL11Pol-negativo homogeneo, denominado L11_APol EYFP, y se identifico usando analisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccion (RFLPs). Para restaurar N752 Pol, se amplifico un fragmento de 7 kpb, denominado p1p4pol, a partir del genoma de EHV-1 NY03 utilizando la Tag polimerasa AccuPrime y los cebadores P1/P4. Mediante la cotransfeccion de 1 mg de ADN viral de L11_APol EYFP y 4 mg de producto de PCR p1 p4pol en celulas RK13, se utilizo de nuevo la recombination homologa para introducir la variante N752 Pol y se obtuvo el mutante de RacL11 L11_D752N. La mutacion de D752 a N752 en polimerasa se confirmo (Figura 2D) mediante la secuenciacion de un fragmento de 780 pb Pol que se amplifico a partir L11_D752N usando cebadores de secuenciacion poli 1 y poli2.

Los siguientes pasos fueron borrar el marco de lectura abierto de gC del mutante L11_D752N. Brevemente, se cotransfectaron 1 mg de ADN viral de L11_D752N y 10 mg de plasmido de transferencia Topo-AgC-EYFP en celulas RK13. El fragmento Sacll/Nhel (1,2 kpb de longitud) en el gen de gC se reemplazo por el casete de EYFP lo que condujo a la generation del virus recombinante L11_D752N AgC EYFP. El marcador de selection EYFP se escindio mediante la expresion de recombinasa Cre tras la cotransfeccion de L11_D752N AgC EYFP y plasmido pCAGGS-NLS/Cre en celulas RK13. Se purificaron placas blancas y finalmente se diseno un mutante de Racl11 gC-negativo no neurologico L11_D752N AgC. Mediante la recombinacion homologa entre el ADN viral de L11_D752N AgC EYFP y el plasmido pCR-Topo-gC, se reparo el gen de gC, dando lugar a una gC revertiente L11_D752N AgC rev (Figura 2). La deletion del gen gC y la ausencia de la protelna Gc se confirmaron mediante identification por PCR usando los pares de cebadores gC-1/gC-2 y AgC-1/AgC-2, la secuenciacion, as! como el ensayo de inmunofluorescencia indirecta (lFA).

Todos los cebadores utilizados para la construccion de plasmidos y secuenciacion se enumeran en la Tabla 1.

Ensayo de inmunofluorescencia indirecta (lFA)

Para la detection de la ADN polimerasa que se expreso en celulas RK13_Pol, se utilizo un anticuerpo monoclonal (MAb) dirigido contra una etiqueta de HA (H3663, Sigma). Las celulas RK13_Pol cultivadas en una placa de 6 pocillos se lavaron con solution salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en paraformaldehldo al 3,5% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente (TA), seguido de una incubation de 5 minutos en PBS que contenla glicina 30 mM y una permeation de otros 5 min en Triton X-100 al 0,1% en PBS. Despues de lavar con PBS, las celulas se bloquearon con PBS-albumina de suero bovina al 3% (BSA) durante 30 min a TA. Las celulas fueron incubadas a continuation con el anticuerpo primario a una dilution 1:10.000 en PBS-BSA al 3% durante 1 hora a TA y se lavaron extensamente con PBS. Se anadio el anticuerpo secundario (lgG de cabra anti-raton conjugada con Alexa Fluor568, lnvitrogen) con una dilucion de 1:2000 en PBS-BSA al 3% y se incubo durante 1 hora a TA. Despues de un lavado a fondo durante 3 veces 10 min, la senal de fluorescencia se inspecciono bajo el microscopio de fluorescencia invertido (Axiovert 25, Zeiss).

Para confirmar la ausencia de la protelna gC, las celulas RK13 se sembraron en una placa de 6 pocillos y se infectaron con RacL11 de tipo salvaje, mutante L11_D752N AgC o gC revertiente L11_D752N AgC rev a una multiplicidad de infeccion (MOl) de 0,0001. Una hora despues de la infeccion, los virus se eliminaron y las celulas infectadas se cubrieron con metilcelulosa al 1,5% en EMEM-FBS al 2%. Despues de 48 h de incubacion a 37°C, las celulas se fijaron y se bloquearon como se describio anteriormente. Se utilizaron MAb 1G4 dirigido contra la protelna gC de EHV-1 y B8 contra la protelna gM de EHV-1 como los anticuerpos primarios con una dilucion de 1:100 y 1:200, por separado. Despues de la incubacion con el anticuerpo secundario (IgG de cabra anti-raton conjugada con Alexa Fluor568) durante 1 h, las celulas se lavaron y se observaron placas.

Caracterizacion de mutantes de virus

Un mutante de virus Pol-negativo L11_APol EYFP se genero sustituyendo el gen de la polimerasa autentico por EYFP a traves de la cotransfeccion de ADN viral de RacL11 y el plasmido lanzadera pCR-Topo-P1P4 en RK13_Pol. Se encontro que L11_APol EYFP era capaz de crecer solo en RK13_Pol pero no en celulas RK13 no complementarias (figura 4), lo que confirma que la ADN polimerasa es esencial para el crecimiento del virus de EHV-1 in vitro. La mutacion del genotipo de D752 neurologico a N752 no neurologico se logro a continuacion mediante la restauracion del gen de la polimerasa no neurologica de EHV-1 NY03 en L11_APol EYFP. La variacion de un solo aminoacido se confirmo mediante la secuenciacion de un amplicon de 780 pb del mutante L11_D752N. Basandose en L11_D752N, la region Sacll/Nhel que representa un fragmento de 1222 pb (desde la posicion de nucleotido 94 a 1315) en el gen de gC se reemplazo por EYFP, dando lugar a un intermedio negativo de gC L11_D752N AgC EY. Mediante la expresion de Cre, el casete de EYFP finalmente se escindio, dejando una copia de la secuencia LoxP (34 pb) entre los sitios de restriccion Sacll y Nhel en el mutante disenado L11_D752N AgC. Para confirmar la eliminacion en el gen de gC, se realizo PCR. Si bien desde el mutante parental L11_D752N, se podlan amplificar fragmentos de 5,87 kpb y 1,6 kpb usando el par de cebadores gC-1/gC-2 y AgC-1/AgC-2, a partir de L11_D752N AgC, sin embargo, se amplificaron los fragmentos de 4,68 kpb y 410 pb (Figura 2), lo que sugiere que estaba presente una delecion de 1,2 kpb en el gen de gC. Mediante lFA utilizando MAb anti-gC de EHV-1, se pudo demostrar que la protelna gC era detectable en celulas infectadas con RacL11 o el revertiente L11_D752N AgC rev, pero en celulas infectadas con L11_D752N AgC, la expresion de la protelna gC fue abolida (Figura 5). De este modo, se genero satisfactoriamente un mutante RacL11 gC-negativo y no neurologico.

Ejemplo 3 Caracterizacion de crecimiento del virus in vitro

Ensayo de union del virus

El ensayo de union del virus se llevo a cabo como se describe en Sun et al. (J Gen Virol 77, 493-500, 1996) con ligeras modificaciones. Se enfriaron monocapas de celulas RK13 sembradas en placas de 6 pocillos durante 1 hora a 4°C y se infectaron con RacL11, L11_D752N, L11_D752N AgC o L11_D752N AgC rev con una MOl de 400 unidades formadoras de placas (UFP) por pocillo. Los virus se dejaron que se unieran durante varios periodos de tiempo (0, 15, 30, 60, 120, 240 min) a 4°C. En varios puntos de tiempo, las celulas infectadas se lavaron tres veces con PBS y se cubrieron con EMEM que contenla FBS al 2% y metilcelulosa al 1,5%. Despues de la incubacion durante 3 dlas a 37°C, las celulas se fijaron con formaldehldo al 10% y se tineron con violeta cristal al 0,3%. Las placas se contaron y se calculo el porcentaje de union del virus en cada punto de tiempo, con relacion al punto de tiempo de 240 min que se establecio en 100% de union.

Tamano de la placa y cinetica de crecimiento de una etapa

Para comparar los tamanos de placa, las celulas RK13 cultivadas en placas de 6 pocillos fueron infectadas con RacL11 tipo salvaje y los mutantes L11_D752N, L11_D752N AgC o L11_D752N AgC rev a una MOl de 0,0001 y se recubrieron con metilcelulosa al 1,5% en EMEM que contenla FBS al 2% a 2hpi. Tres dlas despues de la infeccion, las placas se visualizaron mediante lFA utilizando MAb anti-gM de EHV-1 B8. Para cada virus, se fotografiaron 50 placas y se midieron las areas de placa promedio mediante el uso de software lmageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Los tamanos de placa inducidos por RacL11 se fijaron a 100%. Se calcularon el porcentaje promedio y la desviacion estandar a partir de tres experimentos independientes. Para los ensayos cineticos de crecimiento en una etapa, las celulas RK13 sembradas en 24 placas se infectaron a una MOl de 3. Los virus se dejaron unir durante 1 hora a 4°C, seguido de una etapa de penetracion de 1,5 h a 37°C. Despues de lavar dos veces con PBS, las celulas infectadas se trataron con solucion salina tamponada con citrato enfriada en hielo (CBS, pH 3,0) durante 3 min para eliminar los virus en la superficie. En diferentes puntos de tiempo (0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 hpi), se recogieron por separado los sobrenadantes y las celulas. Se determinaron los tltulos virales extracelulares y asociados a celulas usando ensayos de placa convencionales. Las curvas de crecimiento de una sola etapa se calcularon a partir de tres experimentos independientes.

Propiedades de crecimiento in vitro

Se analizaron las propiedades de crecimiento in vitro de diversos mutantes de virus en celulas cultivadas. Para investigar el impacto de la delecion de gC en la capacidad de union de L11_D752N AgC a celulas diana, se realizo un ensayo de union. Como era de esperar, L11_D752N AgC mostro que se unla menos eficientemente a las celulas RK13 cuando se comparo con RacL11 de tipo salvaje, virus parental L11_D752N o el revertiente L11_D752N AgC rev (Figura 6). La capacidad de L11_D752N AgC de propagarse de celula a celula se determino mediante la comparacion de los tamanos de placa. Mientras que no se pudo observar ninguna diferencia significativa entre el tipo salvaje, virus parental y revertiente gC, el area de la placa relativa formada por L11_D752N AgC, sin embargo, fue un 10% mas grande (p <0,0001) que las de los otros (Figura 7), lo que indica que con la ausencia de gC, la propagacion de celula a celula del EHV-1 es aun mas eficiente. Con respecto a la cinetica de crecimiento, la replicacion in vitro de L11_D752N AgC fue menos eficaz, tal como se demuestra por los tltulos extracelulares e intracelulares que se redujeron en aproximadamente 20 veces y 10 veces, respectivamente, en relacion con el tipo salvaje, el virus parental o el revertiente gC (Figura 8). Los tltulos de virus en los sobrenadantes de cultivo de celulas infectadas con RacL11 tipo salvaje, virus parental L11_D752N o el L11_D752N AgC rev reparado alcanzaron el valor de tltulos intracelulares en aproximadamente 12 horas despues de la infeccion. En las celulas infectadas con L11_D752N AgC, sin embargo, se observo una liberacion retardada de la progenie infecciosa porque el tltulo extracelular se cruzo con el tltulo intracelular a las 16-18 horas despues de la infeccion. A partir de estos resultados, se puede concluir que el crecimiento in vitro de L11_D752N AgC se vio afectado en la union del virus y la salida aunque se pudieron formar placas ligeramente mas grandes.

Ejemplo 4 Vacunacion de ratones

Se purificaron RacL11 de tipo salvaje, as! como los mutantes L11_D752N, L11_D752N AgC y L11_D752N AgC rev mediante ultracentrifugacion durante 1 h a 27.000 rpm. Los sedimentos se suspendieron en PBS, se titularon en celulas RK13 frescas, se dividieron en allcuotas y se almacenaron a -70°C hasta su uso. Se asignaron al azar ratones BALB/c hembra (Harlan) de tres semanas de edad en cinco grupos de 16 ratones cada uno y se dejaron aclimatarse entre si durante una semana en las instalaciones de nivel de bioseguridad 2. En el dla 0, todos los ratones se pesaron, se anestesiaron con 0,1 ml/10 g de xilazina/cetamina y se inocularon cuatro grupos por via intranasal (IN) con cada virus en una dosis de 1x105 UFP en 20 ml de PBS. El ultimo grupo se uso como control negativo y recibio 20 ml de PBS. Se inspeccionaron los pesos corporales de cada raton hasta el dla 14 despues de la inoculacion (p.i.). Tres ratones de cada grupo fueron sacrificados el dla 2 y dla 4. Se extrajo el pulmon, parte del cual se homogeneizo y se utilizo para la determinacion de los tltulos de virus mediante titulacion estandar sobre celulas RK13 y el resto se fijo con formaldehldo al 10% y se proceso para analisis histopatologico. En el dla 28, los ratones fueron estimulados con RacL11 tipo salvaje a una dosis de 1x105 UFP mediante ruta intranasal. Se recogieron los datos de los pesos corporales individuales durante dos semanas. En el dla 2 y dla 4 despues de la estimulacion (p.c.), tres ratones de cada grupo fueron sacrificados para extraer el pulmon. Los tltulos de virus en los tejidos pulmonares se determinaron en celulas RK13 frescas despues de la homogeneizacion.

En el dla 2 p.i., los tltulos promedio de virus en los pulmones infectados con RacL11, L11_D752N o L11_D752N AgC rev alcanzaron 5.366 UFP/mg, 3.450 UFP/mg y 4.800 UFP/mg, respectivamente (figura 9), entre los que no se observo ninguna diferencia estadlsticamente significativa (> p 0,442). Este resultado indico que la variacion de un solo aminoacido de D752 a N752 en la ADN polimerasa no perjudica al crecimiento in vivo de EHV-1 en ratones, que fue consistente con los resultados anteriores (Goodman et al., 2007). En cambio, la replicacion in vivo de los mutantes gC-negativo L11_D752N AgC fue significativamente menos eficaz (p <0,001), con un tltulo de virus promedio de solamente 0,45 UFP/mg en los tejidos pulmonares. En el dla 4 p.i., ningun virus pudo recuperarse de ratones infectados con L11_D752N AgC. Con respecto a los cambios histopatologicos en dla 2 p.i., los pulmones de ratones infectados con RacL11 de tipo salvaje o la polimerasa mutante L11_D752N mostraron neumonla supurativa leve acompanada por infiltracion neutrofllica, edema perivascular aumentado y un numero aumentado de celulas inflamatorias (linfocitos predominantemente) en los vasos linfaticos y el area perivascular, mientras que no se detecto ninguna anormalidad en los pulmones infectados con L11_D752N AgC y PBS (Figura 10). Como resultado de la respuesta inflamatoria, se observo una perdida de peso corporal continua de los ratones infectados con RacL11, L11_D752N o el virus rescuant L11_D752N AgC rev hasta el dla 3 p.i. El peso corporal de los ratones infectados con L11_D752N AgC, sin embargo, no mostraron reduccion aparente. En el dla 28 p.i., todos los ratones se estimularon por via intranasal con RacL11. Dos dlas despues de la estimulacion (p.c.), RacL11 se replico a un tltulo de 2.100 UFP/mg en los pulmones de ratones inoculados de forma simulada, pero solo 18,8 UFP/mg en el grupo L11_D752N AgC (Figura 9). Los tltulos de virus en los pulmones de los ratones inoculados con RacL11, L11_D752N o L11_D752N AgC rev fueron incluso inferiores (0.5, 0,9 y 1,3 UFP/mg, Figura 9) en el dla 2 p.c., que era, sin embargo, a expensas de una alta eficiencia de crecimiento y patogenicidad in vivo. En el dla 4 p.c., el reaislamiento del virus del grupo L11_D752N AgC no tuvo exito. En base a estos resultados concluimos que el mutante L11_D752N AgC gC-negativo, no neurologico, esta severamente atenuado y apatogeno para ratones, pero puede conferir inmunidad protectora.

Ejemplo 5 Vacunacion de caballos

Se agruparon caballos (potros de 6 a 8 meses de edad) en tres grupos A, B y C. El grupo A se trato con virus EHV-1 atenuado vivo que tiene el gen de gC suprimido (L11_D752N AgC). El grupo B se trato con virus EHV-1 atenuado vivo (RacL11). El grupo C fue el grupo de control. La vacunacion y muestreos se realizaron de acuerdo con el esquema mostrado en la Tabla 2.

Tabla 2

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Composicion o vacuna que comprende un virus del herpes equino 1 recombinante (EHV-1), en el que el EHV-1 comprende un gen mutado que codifica una glicoprotema C (gC) no funcional, en el que los nucleotidos en las posiciones 94 a 1315 inclusives del gen de gC de SEQ ID NOs. 7, 9 o 11 estan suprimidos.

2. Composicion o vacuna, segun la reivindicacion 1, en la que el EHV-1 recombinante comprende una ADN polimerasa (Pol) que comprende una asparagina (N) en la posicion de aminoacido 752.

3. Composicion o vacuna, segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que el EHV-1 deriva de una cepa de EHV-1 seleccionada del grupo que consiste en la cepa RacH, la cepa RacL, la cepa Ab4, la cepa V592, la cepa Kentucky D, la cepa 438/77, la cepa AB69, la cepa NY03 de EHV-1, y una combinacion de las mismas.

4. Composicion o vacuna, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el EHV-1 deriva de la cepa RacL de EHV-1, y en la que la ADN polimerasa (Pol) de RacL comprende una asparagina (N) en la posicion de aminoacido 752.

5. Composicion o vacuna, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende ademas un vehiculo, diluyente, adyuvante o excipiente farmaceutica o veterinariamente aceptable.

6. EHV-1 recombinante que comprende un gen de gC mutado, en el que los nucleotidos en las posiciones 94 a 1315 inclusives del gen de gC de SEQ ID NOs: 7, 9 o 11 estan suprimidos.

7. EHV-1 recombinante, segun la reivindicacion 6, en el que el EHV-1 recombinante comprende un gen de la ADN polimerasa (Pol) que codifica una Pol que comprende una asparagina (N) en la posicion de aminoacido 752.

8. EHV-1 recombinante, segun la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7, en el que el EHV-1 deriva de una cepa de EHV-1 seleccionada del grupo que consiste en la cepa RacH, la cepa RacL, la cepa Ab4, la cepa V592, la cepa Kentucky D, la cepa 438/77, la cepa AB69, la cepa NY03 de EHV-1, y una combinacion de las mismas.

9. EHV-1 recombinante, segun la reivindicacion 8, en el que el EHV-1 deriva de la cepa RacL de EHV-1.

10. Composicion o EHV-1 recombinante, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para usar en un procedimiento de vacunacion de un animal, en el que la composicion o EHV-1 recombinante se administra al menos una vez.

11. Composicion o EHV-1 recombinante para usar, segun la reivindicacion 10, en el que la composicion o EHV-1 recombinante se administra segun un regimen de sensibilizacion-refuerzo.

12. Composicion o EHV-1 recombinante, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para usar en un procedimiento para producir una respuesta protectora en un animal contra el virus del herpes equino, que comprende administrar al animal la composicion o EHV-1 recombinante y un portador, adyuvante, excipiente o vehiculo farmaceutica o veterinariamente aceptable.

13. Composicion o EHV-1 recombinante para usar, segun cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que el animal es equino.