CN104302319B - 包含突变的糖蛋白c的重组马疱疹病毒-1疫苗及其用途 - Google Patents

包含突变的糖蛋白c的重组马疱疹病毒-1疫苗及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN104302319B
CN104302319B CN201380023248.3A CN201380023248A CN104302319B CN 104302319 B CN104302319 B CN 104302319B CN 201380023248 A CN201380023248 A CN 201380023248A CN 104302319 B CN104302319 B CN 104302319B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ehv
strain
restructuring
gene
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380023248.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104302319A (zh
Inventor
J-C·奥多奈特
J·M·明科
N·奥斯特雷德尔
马光刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Original Assignee
Merial Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merial Inc filed Critical Merial Inc
Publication of CN104302319A publication Critical patent/CN104302319A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104302319B publication Critical patent/CN104302319B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16761—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/16762—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了包含引发动物中抗马疱疹病毒的免疫反应的重组EHV‑1的组合物或疫苗，包括包含所述重组EHV‑1的组合物，抗马疱疹病毒接种方法以及用于这样的方法和组合物的试剂盒。

Description

包含突变的糖蛋白C的重组马疱疹病毒-1疫苗及其用途
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年3月20日提交的美国临时申请号61/613,151的利益。
发明领域
本发明涉及用于防治动物中的马疱疹病毒感染的组合物或疫苗。具体地，本发明提供了包含在动物中引发抗马疱疹病毒的免疫反应的重组HV-1的组合物或疫苗，包括包含所述重组EHV-1的组合物，抗马疱疹病毒的疫苗接种方法和用于这样的方法和组合物的试剂盒。
发明背景
马疱疹病毒1型(EHV-1)是世界上最重要和最流行的马科动物群体的病原体之一(Ma等人,J.of General Virology 91,1817-1822,2010)。EHV-1与其近亲水痘带状疱疹病毒、牛疱疹病毒1型、假性狂犬病病毒一起形成了疱疹病毒目疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科的水痘病毒属(Davison等人,The order Herpesvirales.Arch Virol 154,171-177,2009)。由EHV-1引起的疾病范围包括从怀孕母马的轻度鼻肺炎和流产至在受影响的马中通常是致命的神经系统疾病(Allen等人,Prog Vet Microbiol Immunol 2,78-144,1986；Carroll等人,Aust Vet J 62,345-346,1985；Crabb等人,Adv Virus Res 45,153-190,1995)。EHV感染的发病机制非常复杂。自然感染通过传染性病毒的吸入或摄入而发生。在数天内，可在白细胞中发现病毒，其在所述白细胞中得到保护而免受免疫系统识别和攻击。病毒通过细胞相关病毒血症散播至第二复制部位(secondary sites of replication)(Allen等人,Proceedings 8th Equine Infectious Disease Conference,Dubai 23-26,pp 129-146,1998)。
EHV-1具有在株间高度保守的150kb双链DNA基因组。神经致病性 株Ab4(GenBank登录号AY665713)和非神经致病性株V592(GenBank登录号AY464052)已被详尽表征，并且显示约0.1％的核苷酸变异率(Nugent等人,J.Virol 80,4047-4060,2006)。已发现尽管所有株系可引起呼吸性疾病和流产，仅少数EHV-1株能够诱导神经系统障碍(Mumford等人,J.Reprod Fertil Suppl 35,509-518,1987；Ostlund,Vet Clin North Am Equine Pract 9,283-294,1993；Wilson,Vet Clin North Am Equine Pract 13,53-72,1997)。最近，流行病学以及反向遗传学研究已显示编码病毒DNA聚合酶(Pol)的开放阅读框架30(ORF30)的位置2254上的单核苷酸多态性(G/A2254)会导致氨基酸位置752上的变异(D/N752)，该变化与病毒的神经致病性潜能相关(Goodman等人,J Biol Chem 281,18193-18200,2007；Van de Walle等人,J.Infect Dis 200,20-25,2009；Smith等人,Vet.Microbiol.,141,5-11,2010)。已显示EHV-1的必需Pol中的残基752不是病毒生长所需要的，并且该N752突变给所述病毒赋予药物敏感性表型(Ma等人,2010)。
显示EHV-1的糖蛋白C(gC)在病毒体(virion)的早期感染步骤和释放中起着重要作用(Osterrieder,Virus Research 2,165,1999)。EHV-1的糖蛋白C对于病毒生长来说不是必需的。它介导初期粘附，是病毒在原代马细胞中高效复制所需要的(Osterrieder,1999)。
常规灭活疫苗仅提供部分抗呼吸道感染的临床和病毒学保护作用，但不预防细胞相关病毒血症。鉴于动物(包括人)对疱疹病毒的易感性，预防疱疹病毒感染和保护动物的方法是必需的。因此，存在于抗疱疹病毒的有效疫苗的需要。
本申请中任何文献的引用或列明不是承认这样的文献可作为本发明的现有技术。
发明概述
本发明提供了包含重组马疱疹病毒-1(EHV-1)的组合物或疫苗。具体地，本发明提供了包含非功能性的突变糖蛋白C(gC)基因的重组EHV-1。重组EHV-1的gC基因可被缺失。gC基因可编码突变的gC蛋白，其中gC蛋白的N末端区域被缺失。重组EHV-1还可包含编码在氨基酸位 置752具有天冬酰胺(N)的Pol的DNA聚合酶(Pol)基因。重组EHV-1可包含编码在氨基酸位置752上具有天冬酰胺(N)的Pol的DNA聚合酶(Pol)基因。EHV-1可以是EHV-1RacL株。
本发明提供了用于诱导抗EHV-1的免疫原性或保护性反应的方法，以及用于预防EHV-1或由EHV-1引起的疾病状态的方法，包括施用本发明的组合物或疫苗。本发明还提供了接种动物的方法，包括所述组合物或重组EHV-1的至少一次施用。
这些和其它实施方案由下文的发明详述公开、或根据下文的发明详述是很显然的，并且被下文的发明详述涵盖。
附图概述
可结合附图(通过引用并入本文)来理解下文的发明详述，这些详述是以举例方式给出的，无意将本发明限定于所述的特定实施方案，在附图中：
图1是显示分配给多核苷酸和蛋白质序列的对应SEQ ID NO的表。
图2A-2C描述了克隆示意图。图2D显示EHV-1聚合酶中的氨基酸突变。
图3A-3B显示了RK13-Pol和RK13的间接免疫荧光分析(indirect immunofluorescence assay，IFA)。
图4A-4B描述了在RK13-Pol中的L11-_ΔPol EYFP相对于在RK13中L11-_ΔPol EYFP的生长。
图5A-5F描述了使用抗-EHV-1gC MAb进行的RacL11、L11_D752NΔgC和L11_D752NΔgC rev的IFA。
图6描述了通过粘附分析(attachment assay)测量的RacL11、L11_D752N、L11_D752NΔgC和L11_D752NΔgC rev的体外生长。
图7描述了通过比较菌斑尺寸(plaque s izes)确定的RacL11、L11_D752N、L11_D752NΔgC和L11_D752NΔgC rev的体外生长。
图8描述了通过细胞外和细胞内滴度测定的RacL11、L11_D752N、L11_D752NΔgC和L11_D752NΔgC rev的生长动力学。
图9A和9B描述了用RacL11、L11_D752N、L11_D752NΔgC、L11_D752N ΔgC rev2和PBS(对照)感染的肺在感染后(p.i.)2和4天、攻击后(p.c.)2和4天的平均病毒滴度。
图10描述了用RacL11、L11_D752N、L11_D752NΔgC、L11_D752NΔgC rev感染的小鼠的肺在感染后第2天的组织病理学变化。
图11A-11B描述了使用补体结合(complement fixation，CF)和病毒中和(virus nuetralization，VN)测试的抗EHV-1血清学。
图12描述病毒血症在接种的马中的持续时间。
图13描述来自接种的马的鼻拭子中脱落的病毒。
图14A-14C显示EHV-1DNA聚合酶的多核苷酸和蛋白质序列比对。
图15A-15B显示EHV-1糖蛋白C的多核苷酸和蛋白质序列比对。
图16显示DNA和蛋白质序列。
发明详述
应当指出的是，在本发明的公开内容中，特别是在权利要求中，术语例如“包含(comprises)”、“包括(comprised)”、“含有(comprising)”等可具有美国专利法中赋予其的含义；例如，它们可以指“包括(includes)”、“包含(included)”、“含有(including)”等；以及术语例如“基本上由……组成的(consisting essentially of)”和“基本上由…….组成(consists essentially of)”具有美国专利法中赋予它们的含义，例如，它们允许未被明确引用的要素，但不包括在现有技术中发现的或影响本发明的基础或新型特征的要素。
除非另有所指，否则根据常规用法来使用技术术语。分子生物学中的常用术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V.由Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
除非上下文明确另有所指，否则单数术语“一个/一种(a)”、“一 个/一种(an)”和“所指物(the)”包括复数所指物。类似地，除非上下文明确另有所指，否则单词“或(or)”意欲包括“和(and)”。单词“或(or)”是指特定列表的任何一个成员并且还包括该列表的成员的任意组合。
如本文中所用，术语“EHV-1N株”是指在其DNA聚合酶的氨基酸位置752上具有天冬酰胺(N)的任何EHV-1株。EHV-1N株可以是包含DNA聚合酶的野生型株，所述DNA聚合酶在氨基酸位置752上包含天冬酰胺(N)。EHV-1N株可以是突变的或重组EHV-1株，其中DNA聚合酶经工程化在氨基酸位置752上具有天冬酰胺(N)。
如本文中所用，术语“EHV-1D株”是指在其DNA聚合酶的氨基酸位置752上具有天冬氨酸(D)的任何EHV-1株。EHV-1D株可以是包含DNA聚合酶的野生型株，所述DNA聚合酶在氨基酸位置752上包含天冬氨酸(D)。EHV-1D株可以是突变的或重组EHV-1株，其中DNA聚合酶经工程化在氨基酸位置752上具有天冬氨酸(D)。
“动物”是指哺乳动物、人、禽类等。动物可选自由以下动物组成的组：马类(例如，马、斑马、驴)、犬类(例如，狗、狼、狐狸、山狗、豺)、猫类(例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其它大型猫以及其它猫类，包括猎豹和山猫)、羊类(例如，绵羊)、牛类(例如，牛、母牛、水牛)、猪类(猪)、禽类(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、驼鸟、鸸鹋和鹤鸵)、灵长类(例如，狐猴、跗猴、猴、长臂猿、人猿)和鱼类。术语“动物”还包括所有发育阶段(包括胚胎期和胎儿期)的个体动物。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指连续氨基酸残基的聚合物。
术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”是指RNA或DNA及其衍生物，例如包含修饰主链的那些RNA或DNA。应当理解的是，本发明提供了包含与本文中描述的多核苷酸序列互补的序列的多核苷酸。根据本发明的多核苷酸可以以不同方式(例如通过化学合成、通过基因克隆等)来制备，并且可采取各种形式(例如，直链或支链的，单链或双链的， 或其杂交体，引物，探针等)。
术语“基因”被广泛地用于指与生物功能相关的多核苷酸的任何区段。因此，基因或多核苷酸包括内含子和外显子(如在基因组序列中)，或仅编码序列(如在cDNA中)，例如开放阅读框架(ORF)(始于起始密码子(甲硫氨酸密码子)并终于终止信号(终止密码子))。基因和多核苷酸还可包括调节它们的表达例如转录起始、翻译和转录终止的区域。因此，还包括的是启动子以及核糖体结合区(通常，这些调控元件位于编码序列或基因的起始密码子上游约60至250个核苷酸之间；Doree S M等人；Pandher K等人；Chung J Y等人)、转录终止子(通常，终止子位于编码序列或基因的终止密码子下游约50个核苷酸内；Ward C K等人)。基因或多核苷酸还指这样的核酸片段，所述核酸片段表达mRNA或功能性RNA，或编码特定蛋白质，并且所述核酸片段包含调控序列。
如本文中所用，术语“抗原”或“免疫原”是指诱发宿主动物的特定免疫反应的物质。抗原可包括完整生物体(灭活的、减毒的或活的)；生物体的亚单位或部分；包含表达具有免疫原性性质的表位、多肽、肽、蛋白质或其片段的插入物的重组载体；能够在呈递给宿主动物后诱发免疫反应的核酸的碎片或片段；蛋白质、多肽、肽、表位、半抗原或其任意组合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。
根据定义，表位为在一旦给宿主施用、其能够诱发体液(B细胞)和/或细胞类型(T细胞)的免疫反应的意义上具有免疫活性的抗原决定簇。这些表位是分子上具有抗原性的特定化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽上的特定抗原性表位。表位的特定的、非限定性的例子包括多肽中的四肽或五肽序列，多糖中的三糖苷或五糖苷序列。在动物中，大多数抗原会同时呈现数个或甚至许多抗原决定簇。这样的多肽也可有资格成为免疫原性多肽，并且可如进一步描述的鉴定表位。
“分离的”生物组分(例如核酸或蛋白质或细胞器)是指已与所述组分天然存在于其中的生物体的细胞中的其它生物组分，例如其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器大体上分离的或从其纯化出来的组分。已“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化法纯化的核酸和 蛋白质。术语还包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。
如本文中所用，术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反地，其是指相对术语。因此，例如，纯化的多肽制剂是其中多肽比在其天然环境中的多肽更富集的制剂。多肽制剂是大体上纯化的，这样所述多肽代表至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的制剂总多肽含量的几个实施方案。这同样适用于多核苷酸。本文中公开的多肽可通过本领域已知的任何方法来纯化。
本发明提供了包含重组病毒载体马疱疹病毒-1(EHV-1)的组合物或疫苗。在一个方面，本发明提供了包含突变的糖蛋白C(gC)基因的重组EHV-1。在另一个方面，本发明提供了包含在氨基酸位置752上具有天冬酰胺(N)的DNA聚合酶的重组EHV-1。在另一个方面，本发明提供了重组EHV-1，其中EHV-1为EHV-1N株。重组EHV-1N株可包含突变的gC基因。在又一个方面，重组EHV-1包含突变的gC基因和在氨基酸位置752具有天冬酰胺(N)的DNA聚合酶。本发明的组合物或疫苗还可包含药学上或兽医学上可接受的载体(vehicle)、稀释剂、佐剂或赋形剂。
术语“组合物”包含任何疫苗或免疫组合物，一旦其已被注射入宿主，包括犬类、猫类、马类和人类，便可诱发宿主的免疫反应，和/或保护宿主免受白血病，和/或可防止寄生虫的植入，和/或可防止受感染的受试者的疾病进展，和/或可限制失控寄生虫至内脏的扩散。这可在根据本发明的接种后，通过细胞因子分泌、特别是IFN-γ分泌的诱导来实现(以IFN-γ分泌的测量方法为例，可使用来自R&D Sys tems Inc.的免疫分析(目录号#CAIF00)(Djoba Siawaya JF等人))。
本发明提供了包含在氨基酸位置752具有天冬酰胺(N)的DNA聚合酶的重组EHV-1。EHV-1DNA聚合酶的多肽的同源物意欲包括在本发明的范围内。如本文中所用，术语“同源物”包括直系同源物、类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或相似功能，但分别在不相关生物体中进化的两个多核苷酸或多肽。术语“直系同源物”是指来自不同物种但通过物种形成从共同祖先基因进化而来的两个多核苷酸或多肽。通常，直系同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物” 是指通过基因组内的复制相关的两个多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可以是相关的。野生型多肽的类似物、直系同源物和旁系同源物可与野生型多肽相异在于翻译后修饰、在于氨基酸序列差异或在于这两者。具体地，本发明的同源物通常显示与野生型多肽或多核苷酸序列的全部或部分具有至少80-85％、85-90％、90-95％或95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且将显示相似的功能。
在本发明的一个方面，重组EHV-1包含在多肽的氨基酸位置752或等同位置上含有天冬酰胺(N)的EHV-1DNA聚合酶，所述聚合酶与SEQ ID NO:2、4、6、37、13、14或15具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性。在另一个方面，本发明提供了EHV-1DNA聚合酶的片段和变体，其可容易地由本领域技术人员使用公知的分子生物学技术来制备。变体是与SEQ ID NO:2、4、6、37、13、14或15所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一性的氨基酸序列的同源多肽。变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”是指包含多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致蛋白质的氨基酸序列的变化并且存在于天然群体(例如，病毒物种或变种)内。这样的天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽的1-5％的变异。等位基因变体可通过测定许多不同物种的目标核酸序列的序列来鉴定，这可通过使用鉴定那些物种中的相同基因座的杂交探针来容易地进行。作为天然等位基因变异的结果并且不改变目标基因的功能活性的任何和所有这样的核酸变异以及所得的氨基酸多态性或变异意欲包括在本发明的范围内。
如本文中所用，术语“衍生物”或“变体”是指这样的多肽或编码多肽的核酸，所述多肽具有一个或多个保守氨基酸变异或其它少量修饰，使得(1)当与野生型多肽相比较时，对应的多肽具有大体上等同的功能或(2)针对所述多肽产生的抗体与野生型多肽发生免疫反应。这些变体或衍生物包括具有EHV-1DNA聚合酶一级氨基酸序列的少量修饰的 多肽，所述修饰可导致相较于未修饰对应多肽大体上等同的活性的肽。这样的修饰可以是有意而为的(如通过定点诱变)，或者可以是自发的。术语“变体”还涉及对序列的缺失、添加和置换，只要多肽有功能产生如本文中定义的免疫反应。修饰可以是SEQ ID NO:2、4、6、37、13、14或15的除位置752外的氨基酸位置上的任何氨基酸变化。
术语“保守变异”是指另一个生物学上相似的残基对氨基酸残基的替代，或这样的核酸序列中的核苷酸替代，其使得编码的氨基酸残基不改变或为另一个生物学上相似的残基。在这一点上，特别优选的置换通常在性质上是保守的，即，在一个氨基酸家族内发生的那些置换。例如，氨基酸通常被分成4个家族：(1)酸性—天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性—赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性—丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性—甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨酸。保守置换的例子包括一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸对另一个疏水残基的置换，或一个极性残基对另一个极性残基的置换，例如精氨酸对赖氨酸的置换，谷氨酸对天冬氨酸的置换或谷氨酰胺对天冬酰胺的置换等；或用对生物活性没有重大影响的结构上相关的氨基酸对氨基酸的相似保守置换。因此，具有与参照分子大体上相同的氨基酸序列但具有少量不显著影响蛋白质的免疫原性的氨基酸置换的蛋白质包括在参照多肽的定义内。所有由这些修饰产生的多肽包括在本文中。术语“保守变异”还包括使用取代的氨基酸替代未取代的亲代氨基酸，只要针对取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。
确定多肽的片段和表位的方法例如产生重叠肽文库(Hemmer B.等人)、Pepscan(Geysen H.M.等人,1984；Geysen H.M.等人,1985；Van der Zee R.等人；Geysen H.M.)和算法(De Groot A.等人；Hoop T.等人；Parker K.等人)可用于本发明的实践，而无需过度实验。通常，抗体特异性结合特定抗原表位。表位的特定的、非限定性的例子包括多肽中的四肽至五肽序列，多糖中的三糖苷至五糖苷序列。在动物中，大多 数抗原会同时呈现数个或甚至许多抗原决定簇。优选地，其中表位是更大分子的蛋白质片段，其具有与完整蛋白质大体上相同的免疫活性。
在一个方面，本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码EHV-1DNA聚合酶，所述聚合酶包括在氨基酸位置752上或等同位置上包含天冬酰胺(N)的与SEQ ID NO:2、4、6、37、13、14或15具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性的多肽、这些多肽之一的保守变体、等位基因变体、同源物或包含至少8个或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段，或这些多肽的组合。
在另一个方面，本发明提供了具有SEQ ID NO:1、3、5或36所示的核苷酸序列的多核苷酸或其变体。在又一个方面，本发明提供了与SEQ ID NO:1、3、5或36具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性的多核苷酸或其变体。
本发明公开的多核苷酸包括因遗传密码而简并，例如特定宿主的最优化密码子的序列。如本文中所用，“最优化的”是指经基因工程改造而增加其在给定物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码EHV-1DNA聚合酶的最优化的多核苷酸，EHV-1DNA聚合酶基因的DNA序列可被修饰来1)包含被特定物种中的高表达基因偏爱的密码子；2)在核苷酸碱基组成上包含与在所述物种中大体上发现的A+T或G+C含量相同的A+T或G+C含量；3)形成所述物种的初始序列；或4)消除引起RNA的去稳定性、不适当的多腺苷酸化、降解和终止或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。EHV-1DNA聚合酶在所述物种中的增加的表达可通过利用真核生物和原核生物或特定物种中的密码子用法的分布频率来实现。术语“优选密码子用法的频率”是指由特定宿主细胞展示的、在指定给定的氨基酸的核苷酸密码子用法上的偏爱性。存在20种天然氨基酸，其大部分由多于一个密码子指定。因此，所有简并核苷酸序列包括在本发明的公开内容中，只要由核苷酸序列编码的EHV-1DNA聚合酶的氨基酸序列在功能上不发生变化。
在一个方面，本发明提供了包含突变的糖蛋白C(gC)基因的重组EHV-1。术语“突变的gC基因”是指被改变的或工程化的EHV-1的gC基因，其在表达后导致非功能性gC蛋白。gC基因的改变或工程化包括对于功能性gC蛋白的表达所必需的gC基因的区段的突变或缺失。gC基因的缺失可以是编码gC蛋白的氨基末端区域的多核苷酸缺失。gC蛋白的缺失的氨基末端区域可以是任何长度，例如1-10个氨基酸，或11-20个氨基酸，或21-30个氨基酸、或31-40个氨基酸、或41-60个氨基酸、或61-90个氨基酸、或91-120个氨基酸、或121-160个氨基酸的区域。术语“突变的gC基因”还包括其中gC蛋白不被表达的EHV-1完整gC基因的缺失。
在一个方面，本发明提供了其中天然(野生型)EHV-1基因组中编码gC蛋白的糖蛋白C(gC)基因被缺失的重组EHV-1。术语“糖蛋白C(gC)基因”包括编码EHV-1的糖蛋白C(gC)以及其同源物、片段或变体的任何基因或多核苷酸。gC基因可编码与SEQ ID NO:8、10或12具有至少75％、80％、85％、90％、95％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性的gC蛋白或其变体。与SEQ ID NO:7、9或11具有至少75％、80％、85％、90％、95％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性的gC基因也包括在本发明中。在另一个方面，本发明提供了重组EHV-1，其中天然(野生型)EHV-1基因组中编码gC蛋白的糖蛋白C(gC)基因被改变或工程化，从而导致突变的gC蛋白。在又一个方面，工程化gC基因编码其中gC蛋白的N末端区域被缺失的突变的gC蛋白。
两个氨基酸序列之间的序列同一性可使用标准参数(参见，例如，可在“美国国家生物技术信息中心”(NCBI,Bethesda,Md.,USA)服务器上以及Altschul等人中获得的BLAST或BLASTX算法)，通过NCBI(美国国家生物技术信息中心)配对blast和blosum62矩阵来确定；并因此，本发明通过术语“blasts”谈及使用算法或BLAST或BLASTX和BLOSUM62矩阵。
可选择地或另外地，术语“同一性”，例如，针对核苷酸或氨基酸序列，可表示两个序列之间的同源性的定量测量。序列同源性百分比可计算为：(Nref-Ndif)*100/Nref，其中Ndif是当比对时两个序列中的不相同的残基的总数，其中Nref是序列之一中的残基的数目。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC具有75％的序列同一性(Nref＝8；Ndif＝2)。
可选择地或另外地，针对序列的“同一性”可指具有相同核苷酸或氨基酸的位置的数目除以两个序列的较短者中的核苷酸或氨基酸数目，其中两个序列的比对可以按照例如Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman)，使用窗口大小为20个核苷酸、字长为4个核苷酸和缺口罚分为4来确定，包括比对的序列数据的计算机辅助分析和解释可使用市售程序(例如，IntelligeneticsTM Suite,Intelligenetics Inc.CA)来方便地进行。当RNA序列被认为与DNA序列相似或具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列包括在本发明的范围内，并且可通过将DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)来从DNA序列衍生。
两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或两个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包(Invitrogen,1600Faraday Ave.,Carlsbad,CA)来确定。
本文中公开的重组载体可包括编码多肽、其变体或其片段的多核苷酸。重组载体可包括质粒和病毒载体，并可用于体外或体内表达。重组载体还可包括信号肽。信号肽是短的肽链(长3-60个氨基酸)，其指导蛋白质(所述蛋白质是在胞质溶胶中合成的)至特定细胞器例如细胞核、线粒体基质、内质网、叶绿体、质外体和过氧化物酶体的翻译后运输。通常，天然存在的EHV-1蛋白可被翻译成前体，其具有N末端信号肽序列和“成熟”蛋白结构域。信号肽可以是切割的EHV-1蛋白或来自分泌性蛋白的肽信号，例如来自组织型纤溶酶原激活蛋白(tPA)特别是人tPA的信号肽(S.Friezner Degen等人；R.Rickles等人；D.Berg.等人)，或来自胰岛素样生长激素1(IGF1)，特别是马类IGF1(K.Otte等人)、 犬类IGF1(P.Delafontaine等人)、猫类IGF1(WO03/022886)、牛类IGF1(S.Lien等人)、猪类IGF1(M.Muller等人)、鸡IGF1(Y.Kajimoto等人)、火鸡IGF1(GenBank登录号AF074980)的胰岛素样生长激素1的信号肽。来自IGF1的信号肽可以是天然的或最优化的(这可通过除去隐蔽剪接位点和/或通过调整密码子使用实现)。翻译后，未加工的多肽可在切割位点被切割，从而导致成熟多肽。切割位点可使用Von Heijne(1986)的方法来预测。
质粒可包括DNA转录单元，例如允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起始点(原核或真核的)。质粒还可包括一个或多个选择标记基因和本领域已知的其它遗传元件。质粒的环状和线性形式包括在本发明的公开内容中。
在其它方面，本发明涉及包含多核苷酸序列的体内表达载体，所述载体包含EHV-1抗原、多肽和/或其变体或片段并且在宿主中体内表达所述抗原、多肽和/或其变体或片段。
体内表达载体可包含任何转录单元，所述转录单元包含目标多核苷酸或基因以及用于其体内表达的那些必需元件。这些表达载体可以是质粒或重组病毒载体。对于体内表达，启动子可以是病毒或细胞来源的。在一个实施方案中，启动子可以是巨细胞病毒(CMV)早期启动子(CMV-IE启动子)、SV40病毒早期或晚期启动子或劳斯肉瘤病毒LTR启动子、细胞骨架基因的启动子，例如结蛋白启动子(Kwissa M.等人),或肌动蛋白启动子(Miyazaki J.等人)。当几个基因存在于相同质粒中时，它们可以设置在相同的转录单元或不同的转录单元中。
如本文中所用，术语“质粒”可包括任何DNA转录单元，所述转录单元包含根据本发明的多核苷酸和其在期望的宿主细胞中或靶细胞中体内表达所必需的元件；并且，在这一点上，应当指出的是，超螺旋或非超螺旋环状质粒以及线性形式意欲包括在本发明的范围内。质粒还可包含其它转录调控元件例如内含子类型的稳定化序列。在几个实施方案中，质粒可包含CMV-IE(WO 89/01036)的第一内含子、兔β-珠蛋白基因(van Ooyen等人)的内含子II、由组织型纤溶酶原激活物(tPA； Montgomery等人)编码的蛋白质的信号序列和/或多腺苷酸化信号(polyA)，特别是牛生长激素(bGH)基因的polyA(US 5,122,458)或兔β-珠蛋白基因或SV40病毒的polyA。
使用的药学上可接受的载体或稀释剂或赋形剂或佐剂是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版(1975),描述了适合用于本文中公开的多肽、质粒、病毒载体的药物递送的组合物和制剂。一般而言，载体或赋形剂的性质取决于所采用的特定的施用模式。例如，胃肠外制剂通常包含可注射液体，所述液体包含药学上和生理上可接受的液体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、含水葡萄糖、甘油等作为载体。对于固体组合物(例如，冻干锭剂、粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规无毒固体载体或稀释剂或赋形剂或佐剂可包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性的载体或稀释剂或赋形剂或佐剂以外，待施用的免疫原性组合物还可包含少量无毒辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯。
根据本发明的组合物或疫苗可包括编码上述根据本发明的任何多肽或抗原的重组载体。
可使用不同的插入位点或使用相同的插入位点在相同载体中进行多个插入。当使用相同的插入位点时，每一个多核苷酸插入物(其可以是上述本发明的任何多核苷酸)可被插入在相同和/或不同启动子的控制之下。可以尾-对-尾、头-对-头、尾-对-头或头-对-尾地进行插入。IRES元件(内核糖体进入位点，参见EP 0803573)还可用于分隔和表达可操作地连接至相同和/或不同启动子的多个插入物。
更常见地，本发明包括体内表达载体，所述载体包括含有上述EHV-1多肽、变体或片段的多核苷酸或基因和其体内表达所必需的元件并且在宿主中体内表达其的任何质粒(EP-A2-1001025；Chaudhuri P.)。
在一个特定的、非限定性的实例中，pVR1020或pVR1012质粒(VICAL Inc.；Luke C.等人；Hartikka J.等人)、pVR2001-TOPA(或 pVR2001-TOPO)(Oliveira F.等人)或pAB110(US 6,852,705)可用作用于插入多核苷酸序列的载体。pVR1020质粒来源于pVR1012并且包含人tPA信号序列。pVR1020是可从Vical,Inc.,(San Diego,CA)获得的质粒骨架，其先前已被使用，参见，例如，美国专利号6,451,769和7,078,507。如在Oliveira等人中描述的，质粒pVR2001-TOPO(或pVR2001-TOPA)为通过添加拓扑异构酶修饰的pVR1020，所述拓扑异构酶侧翼连接克隆位点并且包含编码增加产生分泌性蛋白的概率(Oliveira F.等人)的信号分泌肽(例如纤溶酶原型激活物信号肽(tPA))。
每一个质粒可包含或含有有效于连接于启动子或处于启动子的控制之下或依赖于启动子的根据本发明的多核苷酸或基本上由所述多核苷酸组成，其中启动子可有利地与期望其表达的多核苷酸相邻。一般而言，有利的是使用在真核细胞中具有功能的强启动子。有用的启动子的一个例子可以是人或鼠来源的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，或其可任选地具有另一个来源例如来自大鼠或豚鼠。CMV-IE启动子可包含实际启动子部分，所述部分可以与或者不与增强子部分连接。可参考EP 260 148、EP 323 597、US 5,168,062、5,385,839和4,968,615以及WO 87/03905。CMV-IE启动子可有利地为人CMV-IE(Boshart M.等人)或鼠CMV-IE。在更一般的术语中，启动子可具有或病毒或细胞来源。除CMV-IE外的可有用地用于本发明的实践的强病毒启动子为SV40病毒的早期/晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可有用地用于本发明的实践的强细胞启动子为细胞骨架基因的启动子，例如结蛋白启动子(Kwissa M.等人)或肌动蛋白启动子(Miyazaki J.等人)。这些启动子的功能性子片段，即这些启动子的维持足够启动子活性的部分包括在本发明内，例如根据WO 98/00166或US 6,156,567的截短的CMV-IE启动子，并且可用于本发明的实践。用于本发明的实践的启动子因而可包括全长启动子的衍生物和/或子片段，所述衍生物和/或子片段维持充足的启动子活性，从而用作启动子，并且可有利地具有与所述衍生物和/或子片段所源自的实际或全长启动子的启动子活性大体上相似的启动子活性，例如与US 6,156,567的截短的CMV-IE启动子的活性与全长CMV-IE启 动子的活性类似。因此，本发明的实践中的CMV-IE启动子可包含全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分，以及其衍生物和/或子片段，或基本上由其组成或由其组成。
有利地，质粒包含其它表达控制元件或基本上由所述元件组成。特别有利地包含稳定化序列，例如内含子序列，例如，hCMV-IE的第一内含子(WO 89/01036)、兔β-珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等人)。关于质粒和除痘病毒外的病毒载体的多腺苷酸化信号(polyA)，可使用牛生长激素(bGH)基因的poly(A)信号(参见US 5,122,458)，或兔β-珠蛋白基因的poly(A)信号或SV40病毒的poly(A)信号。
更常见地，本发明包括体内表达载体，其包括含有编码一个或多个上述EHV-1多肽、变体或片段的多核苷酸或基因，包含其在体内表达所必需的任何元件的任何重组病毒载体。
重组病毒载体可以是疱疹病毒，例如上述马疱疹病毒-1(EHV-1)。EHV-1载体可来源于RacH株、RacL株、Ab4株、V592株、Kentucky D株(TACC号VR-700)、438/77株(ATCC号VR-2229)、AB69株(ATCC号VR-2581)、EHV-1NY03株或者EHV-1RacH或RacL株的组合。在一个实施方案中，待表达的多核苷酸被插入在于真核细胞中具有功能的启动子(有利地为CMV-IE启动子(鼠或人))的控制下。poly(A)序列和终止子序列可被插入在待表达的多核苷酸例如牛生长激素或兔β-珠蛋白基因多腺苷酸化信号的下游。
在一个实施方案中，病毒载体可以是新城疫病毒(US2012/052089)。在另一个实施方案中，病毒载体可选自例如痘病毒，特别是鸟痘病毒，例如鸡痘病毒或金丝雀痘病毒。在一个实施方案中，鸡痘病毒为TROVAC(参见WO 96/40241)。在另一个实施方案中，金丝雀痘载体为ALVAC。这些重组病毒载体的使用和目标多核苷酸或基因的插入详尽地描述于US 5,174,993；US 5,505,941和US 5,766,599(对于鸡痘)和US 5,756,103(对于金丝雀痘)中。病毒基因组中超过一个插入位点可用于插入多个目标基因。
对于基于痘病毒载体的重组载体，可使用痘苗病毒或减毒痘苗病毒 (例如，MVA，在Ankara疫苗株于鸡胚成纤维细胞上传代超过570代后获得的改良的Ankara株；参见Stickl&Hochstein-Mintzel；Sutter等人；可获得为ATCC VR-1508；或NYVAC，参见US 5,494,807和美国专利号5,494,807，该专利论述了NYVAC的构建，以及从哥本哈根株痘苗病毒基因组缺失的额外ORF的NYVAC的变异，以及异源编码核酸分子至该重组体的位点的插入以及还有匹配启动子的使用；也参见WO 96/40241)、鸟痘病毒或减毒鸟痘病毒(例如，金丝雀痘、鸡痘、鸠痘(dovepox)、鸽痘、鹌鹑痘、ALVAC或TROVAC；参见，例如，美国专利号5,505,941、5,494,807)。减毒金丝雀痘病毒描述于US 5,756,103(ALVAC)和WO 01/05934。也参考US5,766,599，其涉及减毒鸡痘株TROVAC。可参考在登录号VR-111下从ATCC获得的金丝雀痘。许多鸡痘病毒接种株也是可获得的，例如由MERIAL市售的DIFTOSEC CT株和由INTERVET市售的NOBILIS VARIOLE疫苗。关于用于产生其重组体和如何施用其重组体的方法的信息，本领域技术人员可参考本文中引用的文献和WO 90/12882，例如关于痘苗病毒，除其它以外，提及美国专利号4,769,330、4,722,848、4,603,112、5,110,587、5,494,807和5,762,938；关于鸡痘，除其它以外，提及美国专利号5,174,993、5,505,941和5,766,599；关于金丝雀痘，除其它以外，提及美国专利号5,756,103。当表达载体为痘苗病毒时，待表达的多核苷酸的插入位点有利地在胸苷激酶(TK)基因或插入位点、血凝素(HA)基因或插入位点、编码A型包涵体(ATI)的区域。在金丝雀痘的情况下，有利地插入位点为ORF C3、C5和/或C6。在鸡痘的情况下，有利地插入位点为ORFF7和/或F8。MVA的插入位点有利地如各种出版物(包括Carroll M.W.等人；Stittelaar K.J.等人；Sutter G.等人)中所述的；在这一点上，还指出完全MVA基因组描述于Antoine G.,Virology中，其使得本领域技术人员能够使用其它插入位点或其它启动子。有利地，待表达的多核苷酸被插入在特定痘病毒启动子例如痘苗启动子7.5kDa(Cochran等人)、痘苗启动子I3L(Riviere等人)、痘苗启动子HA(Shida)、牛痘启动子ATI(Funahashi等人)、痘苗启动子H6(Taylor J.等人；Guo P. 等人J.；Perkus M.等人)的控制之下。
本文中公开的任何多核苷酸可通过DNA转移或表达载体至适当的宿主细胞内来体外表达。宿主细胞可以是原核或真核细胞。术语“宿主细胞”还包括所述受试宿主细胞的任何后代。稳定转移(是指将外来多核苷酸持续地维持在宿主细胞中)的方法在本领域是已知的。宿主细胞可包括细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))、酵母、昆虫细胞和脊椎动物细胞。在真核细胞中表达DNA序列的方法在本领域是公知的。作为用于体外表达的方法，可将重组杆状病毒载体(例如，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV))与本文中公开的核酸一起使用。例如，可将多角体蛋白启动子与昆虫细胞(例如，草地贪夜蛾细胞，如可在登录号CRL 1711下在ATCC获得的Sf9细胞，或Sf21细胞)一起使用(参见例如，Smith等人；Pennock等人；Vialard等人；Verne A.；O'Reilly等人；Kidd I.M.&Emery V.C.；EP 0370573；EP 0265785；US 4,745,051)。为了表达，可使用来自Pharmingen(Becton Dickinson)的BaculoGold启动包(Cat#21001K)。作为用于体外表达的方法，可将重组大肠杆菌与载体一起使用。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用诱导型启动子如阿拉伯糖启动子、噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂交启动子)等。利用重组DNA对宿主细胞的转化可通过本领域技术人员公知的常规技术来进行。当宿主细胞是原核细胞例如大肠杆菌时，可从在指数生长期后收获，随后使用本领域公知的方法通过CaCl2法处理的细胞制备能够摄入DNA的感受态细胞。或者，可使用MgCl2或RbCl。还可通过电穿孔进行转化。当宿主是真核生物时，可使用这样的DNA的转导法如磷酸钙共沉淀、常规机械法例如显微注射、电穿孔、包装在脂质体中的质粒或病毒载体的插入。真核细胞还可利用L.Iongipalpis多核苷酸序列和编码可选择表型的第二外来DNA分子例如单纯疱疹-胸腺激酶基因来共转化。另一个方法是使用真核病毒载体(参见上文)(例如疱疹病毒或腺病毒(例如，犬腺病毒2))来瞬时转导真核细胞并表达蛋白质(Gluzman EA)。此外，可使用转染剂，例如二油酰基-磷脂酰-乙醇胺(DOPE)。
可通过常规方法包括制备层析法(例如，尺寸排阻层析、离子交换层 析、亲和层析)、选择性沉淀和超滤来进行重组表达的多肽的分离和纯化。可使用的现有技术的例子(但不限于其)可见于“Protein Purification Applications”,第二版,由Simon Roe编辑和可从Oxford University Press获得。这样的重组表达的多肽是本发明公开内容的部分。还包括用于产生上述根据本发明的的任何多肽的方法，特别是包含根据本发明公开内容的多核苷酸的重组表达载体和宿主细胞的使用。
可有利地利用稳定剂冷冻干燥包含根据本发明的重组病毒载体的疫苗。可按照公知的标准冷冻干燥法进行冷冻干燥。药学上或兽医学上可接受的稳定剂可以是糖类(例如山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、海藻糖)、谷氨酸钠(Tsvetkov T等人；Israeli E等人)、蛋白质例如蛋白胨、白蛋白、乳清蛋白或酪蛋白、含蛋白质试剂例如脱脂乳(Mills C K等人；Wolff E等人)以及缓冲剂(例如磷酸盐缓冲剂、碱金属磷酸盐缓冲剂)。佐剂可用于使冻干制剂可溶。
根据本发明的任何疫苗组合物还可有利地包含一种或多种佐剂。
基于质粒的疫苗可利用阳离子脂质，有利地利用DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧)-1-丙烷铵(propanammonium)；WO96/34109)(并有利地与中性脂质例如DOPE(二油酰-磷脂酰-乙醇胺缔合)；Behr J.P.)缔合以形成DMRIE-DOPE)来配制。在一个实施方案中，临时制备混合物，并在其施用之前，等待约10min至约60min，例如约30min，以进行适当的混合是有利的。当使用DOPE时，DMRIE/DOPE的摩尔比可为95/5至5/95，有利地为1/1。质粒/DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂的重量比为例如50/1至1/10、10/1至1/5或1/1至1/2。
任选地，可将细胞因子添加至组合物，尤其是GM-CSF或诱导Th1的细胞因子(例如IL12)。可将这些细胞因子以编码细胞因子蛋白的质粒的形式添加至组合物。在一个实施方案中，细胞因子来自犬来源，例如基因序列已保藏于GenBank数据库(登录号S49738)的犬GM-CSF。该序列可用于以与在WO 00/77210中进行的方式相似的方式产生所述质粒。
可将基于重组病毒载体的疫苗与fMLP(N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸；US 6,017,537)和/或卡波姆佐剂(Phameuropa第8卷,第2期， 1996年6月)组合。本领域技术人员还可参考US 2,909,462，其描述了与多羟基化合物交联的这样的丙烯酸类聚合物，所述多羟基化合物具有至少3个羟基，有利地不超过8个，至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基替代。例如，所述不饱和脂烃基是包含2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它乙烯基型不饱和基团。不饱和基团本身可包含其它取代基例如甲基。在名称下销售的产品(BF Goodrich,Ohio,USA)是合适的。将产物与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。其中，可有利地提及974P、934P和971P。
在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物当中，作为马来酸酐与乙烯的共
聚物的(Monsanto)(线性的或交联的，例如与二乙烯醚交联的)是有利的。可参考J.Fields等人。
例如，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物和共聚物由下式的基本单元形成，其中：
-R1和R2可相同或不同，代表H或CH3
-x＝0或1，优选地x＝1
-y＝1或2，并且x+y＝2
对于共聚物x＝0并且y＝2。对于卡波姆，x＝y＝1。
这些聚合物在水中的溶解导致酸溶液，该酸溶液被中和(有利地至生理pH)，以提供向其中掺入疫苗本身的佐剂溶液。聚合物的羧基从而部分以COO-形式存在。
在一个实施方案中，有利地在氯化钠存在的情况下，在蒸馏水中制备佐剂，特别是卡波姆(Pharmeuropa,第8卷,第2期,1996年6月)的溶液，获得的溶液处于酸性pH。通过将其同时在几个部分中添加至期 望的量(以获得期望的终浓度)，或其大部分的含NaCl的水，有利地生理盐水(NaCl 9g/l)中来稀释溶液，与之同时或随后有利地利用NaOH进行中和(pH 7.3至7.4)。该生理pH的溶液用于与疫苗混合，可特别地将其以冻干、液体或冷冻的形式贮存。
最终疫苗组合物中的聚合物浓度可以为0.01％至2％w/v，0.06至1％w/v或0.1至0.6％w/v。
可将亚单位疫苗与佐剂，如基于矿物油和/或植物油的水包油、水包油包水乳剂和非离子型表面活性剂例如嵌段共聚物组合。这样的乳剂明显是“Vaccine Design—The Subunit and Adjuvant Approach”,Pharmaceutical Biotechnology,1995的第147页中描述的那些乳剂，或TS乳剂，特别是TS6乳剂，和LF乳剂，特别是LF2乳剂(关于TS和LF乳剂，参见WO 04/024027)。其它适当的佐剂是例如维生素E、皂苷类和(Noveon；参见WO 99/51269；WO 99/44633)、氢氧化铝或磷酸铝(“Vaccine Design,The subunit and adjuvant approach”,Pharmaceutical Biotechnology,第6卷,1995)、生物佐剂(即C4b,特别是鼠C4b(Ogata R T等人)或马C4b、GM-CSF，特别是马GM-CSF(US 6,645,740))、毒素(即霍乱毒素CTA或CTB，大肠杆菌不耐热毒素LTA或LTB(Olsen C W等人；Fingerut E等人；Zurbriggen R等人Peppoloni S等人)和CpG(即CpG#2395(参见Jurk M等人)、CpG#2142(参见EP 1,221,955中的SEQ.ID.NO:890)。
还可将组合物或疫苗与至少一种EHV-1抗原例如灭活的EHV-1结合。在一个特定实施方案中，EHV-1株可以是RacH株、RacL株、Ab4株、V592株、Kentucky D株(TACC号VR-700)、438/77株(ATCC号VR-2229)、AB69株(ATCC号VR-2581)、EHV-1NY03或者EHV-1RacH或RacL株的组合。可通过化学或物理方法灭活EHV-1的这些株。化学法特别是BPL、甲醛。物理法可特别是超声处理。可将灭活的EHV-1疫苗与佐剂如先前针对亚单位疫苗描述的那些佐剂组合。
本发明的另一个方面涉及使用本文中公开的疫苗或组合物对宿主进行抗EHV-1疫苗接种的方法。
宿主可以是任何动物。在一个实施方案中，宿主是马科动物。
施用途径可以是例如肌内(IM)或真皮内(ID)或经皮肤(TD)或皮下(SC)途径。施用方法可以是例如有针注射器或无针装置，或与电转移(ET)处理偶联的有针注射器，或与ET处理偶联的无针装置。
对于基于质粒的疫苗，有利的施用途径可以是ID或IM。该施用可通过使用有针注射器或利用无针装置如Dermojet或Biojector(Bioject,Oregon,USA)或VetjetTM(Merial)或VitajetTM(Bioject Inc.)来进行，参见US 2006/0034867。剂量可以是每种质粒50μg至500μg。当添加DMRIE-DOPE时，可利用每种质粒100μg。当使用GM-CSF或其它细胞因子时，编码该蛋白的质粒可以约200μg至约500μg的剂量存在，并可以为200μg。剂量的体积可以为0.01ml至0.5ml，例如0.25ml。可通过多点注射进行施用。
或者，基于质粒的疫苗可通过偶联于电转移(ET)处理的IM途径来施用。使用用于电转移的装置和制造商的说明书(即Sphergen G250发生器(Sphergen SARL,Evry Genopole,France)；DNA电穿孔系统(Innovio Biomedical Corporat ion,San Diego,Cal ifornia,USA))来进行ET处理。
对于基于重组病毒载体的疫苗，施用途径可以有利地是SC、IM、TD或ID。该施用可通过有针注射器或利用无针装置如Dermojet或Biojector(Bioject,Oregon,USA)或VetjetTM(Merial)或VitajetTM(Bioject Inc.)来进行。剂量可以为每种重组EHV载体约104pfu至约109pfu。剂量的体积可以为约0.01ml至0.2ml，有利地为0.1ml。施用可以包含多点注射。
对于IM途径，提供的疫苗的体积可以为0.2至2ml，具体地约0.5至1ml。对于本发明的任何载体，使用相同剂量。
对于亚单位疫苗，施用途径可有利地通过SC或IM或TD或ID。该施用可通过有针注射器或无针装置如Dermojet或Biojector(Bioject,Oregon,USA)或VetjetTM(Merial)或VitajetTM(Bioject Inc.)来进行。剂量可以为约50至约500μg，具体地约50至约150μg，更具体地约 50至约100μg。提供的亚单位疫苗的体积为0.2至2ml，具体地约0.5至1ml。
在一个方面，本发明涉及疫苗策略，该策略基于初免-加强施用方案，其中初免-施用和加强-施用利用包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂、佐剂或载体以及本发明的重组EHV-1的组合物。在另一个方面，本发明涉及给对EHV-1易感的受试者或宿主接种的方法，包括初免-加强施用方案。
初免-加强方案包括使用至少一种共同抗原和/或其变体或片段的至少一次初免-施用和至少一次加强施用。用于初免-施用的疫苗在性质上可与用作随后的加强疫苗的疫苗不同。还应指出，初免-施用和加强-施用都可包含本发明的重组EHV-1。初免-施用可包括一次或多次施用。类似地，加强-施用可包括一次或多次施用。
施用途径、剂量和体积如本文中先前公开的。
初免-加强施用可间隔2至6周，例如间隔约4周进行。根据一个实施方案，还设想了半年一次加强或一年一次加强。
在一个实施方案中，初免-加强施用方案包括本发明的重组EHV-1疫苗或组合物的至少一次初免-施用和包含EHV-1抗原的灭活病毒疫苗、或表达EHV-1抗原的基于质粒的疫苗、或包含EHV-1抗原的亚单位疫苗、或其组合的至少一次加强-施用。
在另一个实施方案中，初免-加强施用方案包括包含EHV-1抗原的灭活病毒疫苗、或表达EHV-1抗原的基于质粒的疫苗、或包含EHV-1抗原的亚单位疫苗、或其组合的至少一次初免-施用，和本发明的重组EHV-1疫苗或组合物的至少一次加强-施用。
本发明的另一个方面涉及用于根据本发明的初免-加强接种的试剂盒。试剂盒可包含至少2个小瓶：包含用于根据本发明的初免-接种的疫苗的第一小瓶，和包含用于根据本发明的加强-接种的疫苗的第二小瓶。试剂盒可有利地包含用于另外的初免-接种或另外的加强-接种的另外的第一或第二小瓶。
在一个实施方案中，试剂盒可包含2个小瓶，一个小瓶包含用于根 据本发明的初免-接种的基于质粒的疫苗，另一个小瓶包含用于根据本发明的加强接种的基于重组病毒载体的疫苗。
***
本发明现通过下列非限定性的实施例来进一步描述。
实施例
无需进一步详细说明，据信，通过使用前述描述，本领域技术人员可以实施本发明至其最完全的程度。下列详细的实施例将仅被解释为举例说明性的，而绝不以任何方式限制前述公开内容。本领域技术人员将迅速地识别在反应物以及反应条件和技术上与所述方法的适当变化。
使用由J.Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989)中描述的标准分子生物学技术进行DNA插入物、质粒和重组病毒载体的构建。使用“Geneclean”试剂盒(BIO 101Inc.,La Jolla,Calif.)分离用于本发明的所有限制性片段。
实施例1 细胞系RK13_Pol的构建
细胞和病毒
将兔肾(RK13)细胞维持在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(1％Pen/Strep)的Ear le’s最小必需培养基(EMEM)中。将马科动物皮肤成纤维细胞系(NBL6)维持在补充有10％FBS、29mg/ml L-谷氨酸盐、1％Pen/Strep和1％非必需氨基酸(Gibco BRL)的EMEM中。在新鲜RK13细胞上生长EHV-1株RacL11和NY03。具有DNA聚合酶的非神经学形式(N752Pol)的NY03是在2003年从来自纽约的农场的流产马驹分离的。
细胞系 RK13_Pol 的构建
为了支持Pol-阴性RacL11突变体的生长，首先产生称为RK13_Pol的表达聚合酶非神经学形式(N752)的兔肾细胞系。从病毒基因组DNA扩增NY03的完整聚合酶开放阅读框，所述基因组DNA提取自病毒感染的 RK13细胞。使用Accuprime DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和引物对PN1/PN2(表1)进行聚合酶链式反应(PCR)。将在5’末端侧翼连接有HindIII限制性位点和在3’末端侧翼连接有BamHI位点以及HA标记的扩增子克隆入质粒pCDNA3以产生pCDNA3-Pol。在用PvuI消化后，将4μg的重组质粒pCDNA3-Pol线性化，随后使用Lipofectamine2000(Invitrogen)将其转染入在6孔板中生长的RK13细胞。在含有10％FBS和1.2mg/ml G418(Merck)的EMEM中增殖转染的细胞。选择其中通过间接免疫荧光分析(IFA)显示每一个细胞表达DNA聚合酶的单个细胞克隆，将其称为RK13_Pol。通过使用抗-HA MAb的IFA，可证实聚合酶在RK13_Pol中的表达(图3)，并显示所述表达在10次传代中是稳定的。
表1 引物序列
实施例2 质粒和病毒诱变
病毒突变体的产生
将常规同源重组策略用于所有遗传操作。使用热稳定性Pfu聚合酶(Promega)和引物对P1/P2和P3/P4从RacL11基因组扩增DNA聚合酶的任一侧上的两个1.7kbp侧翼片段。另两个引物对P5/P6和P7/P8用于从质粒pEYFP-N1分别扩增HCMV(人巨细胞病毒)启动子和EYFP(增强的黄色荧光蛋白)基因。引物P2和P5、P3和P8以及P6和P7的5’末端具有21-23bp的同源序列。利用使用P5和P8的重叠PCR，融合HCMV启动子与EYFP基因，将其克隆进入质粒pCR2.1-Topo(Invitrogen)，从而产生pCES1。对于穿梭质粒pCR-Topo-P1P4的构建，使用引物P1/P4通过重叠PCR将上述两个同源物臂和EYFP表达盒组合在pCES1中，将其克隆入pCR2.1-Topo。使用pCES1(作为模板)和引物对P9/P10，扩增侧翼连接有SacII和NheI限制性位点以及LoxP序列上游和下游的EYFP盒，将其克隆入pCR2.1-Topo，从而产生质粒pCES2。为了产生质粒pCR-Topo-gC，将使用引物gC-1和gC-2从RacL11基因组扩增的5.87kbp含gC片段克隆入pCR2.1-Topo。在用SacII和NheI消化后，从pCES2释放EYFP盒，将其转移至pCR-Topo-gC以替换gC基因，重组穿梭质粒称为Topo-ΔgC-EYFP。通过消化鉴定质粒pCES1、pCES2、pCR-Topo-P1P4和Topo-ΔgC-EYFP，并对其进行测序。克隆方案描述于图2中。
对于DNA聚合酶的突变，通过磷酸钙沉淀将1μg的RacL11病毒DNA和10μg的质粒pCR-Topo-P1P4共转染入6孔板中的RK13_Pol细胞。转染后2天，在荧光显微镜(Axiovert 25,Zeiss)下观察到绿色噬斑。在2轮冻融后收获完整病毒，将其在感染后1小时覆盖有在EMEM-2％FBS中的1.5％甲基纤维素的新鲜RK13_Pol细胞上生长。在3次纯化后，产生均一的Pol-阴性RacL11突变体(称为L11_ΔPol EYFP)，使用限制性片段长度多态性(RFLP)分析对其进行鉴定。为了恢复(res tore)N752Pol，使用Accuprime Tag聚合酶和引物P1/P4从EHV-1NY03基因组扩增称为p1p4pol的7kbp片段。通过将1μg的L11_ΔPol EYFP病毒DNA和4μg的p1p4pol PCR产物共转染至RK13细胞，再次使用同源重组引 入N752Pol变体，获得RacL11突变体L11_D752N。通过使用测序引物poly1和poly2对从L11_D752N扩增的780bp Pol片段进行测序来确认聚合酶中的D752至N752的突变(图2D)。
随后的步骤是从L11_D752N缺失gC开放阅读框。简而言之，将1μg的L11_D752N病毒DNA和10μg的转移质粒Topo-ΔgC-EYFP共转染进入RK13细胞。利用EYFP盒替代gC基因中的SacII/NheI片段(长度上为1.2kbp)，从而导致重组病毒L11_D752NΔgC EYFP的产生。通过在将L11_D752NΔgC EYFP和质粒pCAGGS-NLS/Cre共转染入RK13细胞后表达Cre重组酶来切割EYFP选择标记。纯化白色噬斑，最终工程化产生gC阴性、非神经学RacL11突变体L11_D752NΔgC。通过L11_D752NΔgC EYFP病毒DNA与质粒pCR-Topo-gC之间的同源重组，修复gC基因，从而产生gC回复突变型L11_D752NΔgC rev(图2)。使用引物对gC-1/gC-2和ΔgC-1/ΔgC-2，通过PCR鉴定、测序以及间接免疫荧光分析(IFA)来确认gC基因的缺失和gC蛋白的不存在。
用于质粒构建和测序的所有引物列于表1中。
间接免疫荧光分析 (IFA)
为了检测在RK13_Pol细胞中表达的DNA聚合酶，使用针对HA标记的单克隆抗体(MAb)(H3663,Sigma)。利用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤6孔板中生长的RK13_Pol细胞，将其在室温(RT)于PBS中的3.5％多聚甲醛中固定1h，随后于包含30mM甘氨酸的PBS中温育5min，然后于PBS中的0.1％Triton X-100中再另外透化5min。在用PBS洗涤后，在RT用PBS-3％牛血清白蛋白(BSA)封闭细胞30min。随后在RT用于PBS-3％BSA中以1:10000稀释的一抗温育细胞1h，随后用PBS充分洗涤。添加于PBS-3％BSA中以1:2000稀释的二抗(缀合有Alexa Fluor568的山羊抗-小鼠IgG,Invitrogen)，并在RT温育1h。在充分洗涤3次(每次10分钟)后，在倒置荧光显微镜(Axiovert 25,Zeiss)下观察荧光信号。
为了确认gC蛋白的不存在，将RK13细胞接种于6孔板中，以0.0001的感染复数(MOI)用野生型RacL11、突变体L11_D752NΔgC或gC回复突变型L11_D752NΔgC rev感染所述细胞。感染后1小时，去除病毒， 用EMEM-2％FBS中的1.5％甲基纤维素覆盖感染的细胞。在于37℃温育48h后，固定细胞，并如上所述封闭细胞。将分别以1:100和1:200稀释的针对EHV-1gC蛋白的MAb 1G4和针对EHV-1gM蛋白的B8用作一抗。在用二抗(缀合有Alexa Fluor568的山羊抗-小鼠IgG)温育1h后，洗涤细胞，观察噬斑。
病毒突变体的表征
通过将RacL11病毒DNA和穿梭质粒pCR-Topo-P1P4共转染至RK13_Pol，用EYFP替代正宗的聚合酶基因，产生Pol-阴性病毒突变体L11_ΔPol EYFP。发现L11_ΔPol EYFP仅能够在RK13_Pol中、而不能在非互补型(non-complementing)RK13细胞中生长(图4)，这确认了DNA聚合酶是EHV-1的体外病毒生长所必需的。随后通过将EHV-1NY03的非神经学聚合酶基因恢复至L11_ΔPol EYFP来实现从神经学D752基因型向非神经学N752基因型的突变。此单氨基酸变化通过测定来自突变体L11_D752N的780bp扩增子的序列来确认。基于L11_D752N，用EYFP替代gC基因中的代表1222bp片段(从核苷酸位置94至1315)的SacII/NheI区域，从而产生gC-阴性中间体L11_D752NΔgC EYFP。通过表达Cre，最终切割EYFP盒，在工程化突变体L11_D752NΔgC中在SacII与NheI限制性位点之间留下一个拷贝的LoxP序列(34bp)。为了确认gC基因中的缺失，进行PCR。使用引物对gC-1/gC-2和ΔgC-1/ΔgC-2可从亲代突变体L11_D752N扩增5.87kbp和1.6kbp的片段，而从L11_D752NΔgC扩增到4.68kbp和410bp的片段(图2)，这表明gC基因中存在1.2kbp的缺失。通过使用抗-EHV-1gC MAb的IFA，可显示gC蛋白在用RacL11或回复突变型L11_D752NΔgC rev感染的细胞中是可检测的，但在用L11_D752NΔgC感染的细胞中，gC蛋白的表达被消除(图5)。从而成功地产生了gC-阴性和非神经学RacL11突变体。
实施例3 体外病毒生长的表征
病毒粘附分析
如Sun等人(J Gen Virol 77,493-500,1996)中所述，加以少许改进，进行病毒粘附分析。将接种在6孔板中的RK13细胞的单层在4℃ 冷却1h，以400个噬斑形成单位(PFU)/孔的MOI用RacL11、L11_D752N、L11_D752NΔgC或L11_D752NΔgC rev感染所述细胞单层。使病毒在4℃粘附不同的时间长度(0,15,30,60,120,240min)。在各时间点上，用PBS洗涤感染的细胞3次，用含2％FBS和1.5％甲基纤维素的EMEM覆盖所述细胞。在于37℃温育3天后，用10％甲醛固定细胞，用0.3％结晶紫进行染色。对噬斑进行计数，相对于被设置为100％粘附的时间点240min计算每一个时间点上的病毒粘附的百分比。
噬斑尺寸和单步骤生长动力学
为了比较噬斑尺寸，用RacL11野生型和突变型L11_D752N、L11_D752NΔgC或L11_D752NΔgC rev以0.0001的MOI感染6孔板中生长的RK13细胞，在2hpi用含2％FBS的EMEM中的1.5％甲基纤维素覆盖所述细胞。感染后3天，使用抗-EHV-1gM MAb B8通过IFA显现噬斑。对于每一种病毒，拍摄50个噬斑，使用ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)测量平均噬斑面积。RacL11诱导的噬斑面积被设置为100％。从3个独立的实验计算平均百分比和标准差。对于单步骤生长动力学测定，以MOI为3感染接种在24孔板中的RK13细胞。使病毒在4℃粘附1h，随后在37℃进行1.5h的渗入步骤。在用PBS洗涤2次后，用冰冷的柠檬酸盐缓冲液(CBS,pH 3.0)处理感染的细胞3分钟，以除去表面上的病毒。在不同时间点(0,4,8,12,24,36,48hpi)上，分别收集上清液和细胞。使用常规噬斑测定法测定细胞外病毒滴度和细胞结合的病毒滴度。从3个独立的实验计算单步骤生长曲线。
体外生长性质
分析培养细胞中各种病毒突变体的体外生长性质。为了研究gC缺失对L11_D752NΔgC对靶细胞的结合能力的影响，进行粘附分析。如所预期的，当与野生型RacL11、亲代病毒L11_D752N或回复突变型L11_D752NΔgC rev相比较时，L11_D752NΔgC显示以更低的效率结合RK13细胞(图6)。L11_D752NΔgC在细胞间扩散的能力通过比较噬斑尺寸来确定。虽然在野生型、亲代病毒和gC回复突变型之间未观察到显著差异，但是，由L11_D752NΔgC形成的相对噬斑面积比其它的面积大 10％(p<0.0001)，这表明在gC不存在的情况下，EHV-1的细胞间扩散甚至更高效。关于生长动力学，L11_D752NΔgC的体外复制不太有效，如通过相对于野生型、亲代病毒或gC回复子而言细胞外和细胞内滴度分别减少至约1/20和1/10所证实的(图8)。用野生型RacL11、亲代病毒L11_D752N或修复的L11_D752NΔgC rev感染的细胞培养上清液中的病毒滴度达到感染后约12小时时的细胞内滴度的值。然而，在L11_D752NΔgC感染的细胞中，由细胞外滴度超过感染后16-18小时时的细胞内滴度观察到感染性后代的延迟释放。根据这些结果，可得出L11_D752NΔgC的体外生长在病毒结合和流出(egress)方面受损，尽管其可形成略微更大的噬斑。
实施例4 小鼠的接种
通过以27,000rpm超速离心1h来纯化野生型RacL11以及突变体L11_D752N、L11_D752NΔgC和L11_D752NΔgC rev。将沉淀重悬于PBS中，在新鲜RK13细胞上对其进行滴定，将其等分并于-70℃贮存直至使用。将3周龄雌性BALB/c小鼠(Harlan)随机分配入5个组(每组16只小鼠)，让其在2级生物安全设施(Biosafety Level-2facility)中相互适应1周。第0天，将所有小鼠称重，将其用0.1mL/10g赛拉嗪/氯胺酮麻醉，以20μL PBS中1x105PFU的剂量用每一种病毒鼻内(IN)接种4个组。最后一组用作阴性对照，接受20μL的PBS。检查每一只小鼠的体重直至接种后(p.i.)第14天。在第2和4天安乐死处死每组的3只小鼠。取出肺，将其部分匀浆，并通过在RK13细胞进行标准滴定将其用于病毒滴度的确定，其余部分用10％甲醛固定，随后处理以进行组织病理学分析。在第28天，通过鼻内途径以1x105PFU的剂量用野生型RacL11攻击小鼠。收集个体体重的数据，进行2周。在攻击后(p.c.)第2和4天，将每组3只小鼠安乐死处死以取出肺。在匀浆后在新鲜RK13细胞上确定肺组织中的病毒滴度。
在接种后第2天，用RacL11、L11_D752N或L11_D752NΔgC rev感染的肺中的平均病毒滴度分别达到5366PFU/mg、3450PFU/mg和4800PFU/mg(图9)，其间未观察到统计上显著的差异(p≥0.442)。该结果表 明DNA聚合酶中从D752至N752的单氨基酸变化未削弱EHV-1在小鼠中的体内生长，这与先前的发现(Goodman等人,2007)一致。相反，gC-阴性突变体L11_D752NΔgC的体内复制明显更低效(p<0.001)，肺组织中的平均病毒滴度仅为0.45PFU/mg。在接种后第4天，未从L11_D752NΔgC感染的小鼠回收到病毒。对于接种后第2天的组织病理学变化，用或野生型RacL11或聚合酶突变型L11_D752N感染的小鼠的肺显示轻微化脓性肺炎，伴随嗜中性粒细胞浸润、增加的血管周水肿以及淋巴管和血管周区域中增加的炎症细胞(主要为淋巴细胞)数目，而在感染了L11_D752NΔgC和PBS的肺中未检测到异常(图10)。作为炎症反应的结果，直至接种后第3天，观察到感染了RacL11、L11_D752N或回复突变型病毒L11_D752NΔgC rev的小鼠的连续体重减轻。然而，感染了L11_D752NΔgC的小鼠的体重未显示明显的减轻。在接种后第28天，用RacL11鼻内攻击所有小鼠。攻击后(p.c.)2天，RacL11在模拟物接种的小鼠的肺中复制至2100PFU/mg的滴度，但在L11_D752NΔgC组中仅复制至18.8PFU/mg的滴度(图9)。接种了RacL11、L11_D752N或L11_D752NΔgC rev的小鼠的肺中的病毒滴度在攻击后第2天甚至更低(0.5、0.9和1.3PFU/mg，图9)，然而，这是以牺牲高生长效率和体内致病性为代价的。在攻击后第4天，从L11_D752NΔgC组再分离病毒是不成功的。基于这些结果，我们得出gC-阴性、非神经学突变体L11_D752NΔgC对于小鼠是严重减毒和无致病性的，但可赋予保护性免疫力。
实施例5 马的接种
将马(6至8月龄的马驹)分成3组：A、B和C。A组利用gC基因被缺失的活减毒EHV-1病毒(L11_D752NΔgC)来处理。B组利用活减毒EHV-1病毒(RacL11)来处理。C组为对照组。按照表2中显示的方案进行接种和取样。
表2
两种疫苗都被马驹良好地耐受。疫苗病毒株不能通过病毒分离在任何样品中被检测到。对照马直至攻击时未发生血清转化，如通过针对EHV-1的SN和CF抗体滴度的不存在所证明的。来自A组和B组的马产生了对第一次接种的SN反应，该反应在第二次接种后得到加强。两组马中的CF抗体滴度在第一次接种后都保持较低/不可检测，在第二次接种后得到增强，但从未达到高水平(图11)。
在攻击后，对照马的临床体征包括三阶段发热反应和特征为中度至严重流涕的呼吸性疾病。相反，仅在马的两组接种组中零星发现过热，流涕在严重程度和持续时间上减少。接种的显著作用是来自第1组和第2组的5/8的马在攻击后完全不存在病毒血症(图12)。相较于对照马，病毒血症的持续时间在接种的马中也缩短了。图13显示A组在鼻拭子中具有显著减少的病毒脱落，而B组马中的鼻脱落变化更大，但相较于对照马而言有减少。
实施例6 RacL11 gC基因的测序
对RacL11的gC基因进行测序，其DNA和蛋白质序列分别如SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35所示。
很明显，可对所述方法的精确细节进行改变或修饰而不背离所述公开内容的精神。我们要求保护落在下列权利要求的范围和精神内的所有这样的修饰和改变。
本文中引用或提及的所有文献(“本文中引用的文献”)和本文中引用的文献中引用或提及的所有文献以及与本文中和由本文中的参考文献包含的任何文献中提及的任何制造商的说明书、描述、产品说明、规格说明均通过引用并入本文，并且可用于本发明的实践。

Claims (18)

1.一种包含重组马疱疹病毒-1(EHV-1)的组合物，其中所述EHV-1内的糖蛋白C(gC)基因被缺失。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述重组EHV-1包含在氨基酸位置752上含有天冬酰胺(N)的DNA聚合酶(Pol)。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述EHV-1来源于选自RacH株、RacL株、Ab4株、V592株、Kentucky D株、438/77株、AB69株、EHV-1 NY03株及其组合的EHV-1株。
4.权利要求1或2所述的组合物，其中所述EHV-1来源于EHV-1RacL株，并且其中RacL的DNA聚合酶(Pol)在氨基酸位置752上包含天冬酰胺(N)。
5.权利要求1或2所述的组合物，其还包含药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂。
6.权利要求1或2所述的组合物，其还包含药学上或兽医学上可接受的稀释剂。
7.权利要求1或2所述的组合物，其还包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂。
8.权利要求1或2所述的组合物，其是疫苗。
9.一种重组EHV-1，其中所述重组EHV-1中的gC基因被缺失。
10.权利要求9所述的重组EHV-1，其中所述重组EHV-1包含编码在氨基酸位置752上含有天冬酰胺(N)的Pol的DNA聚合酶(Pol)基因。
11.权利要求9或10所述的重组EHV-1，其中所述EHV-1来源于选自RacH株、RacL株、Ab4株、V592株、Kentucky D株、438/77株、AB69株、EHV-1 NY03株及其组合的EHV-1株。
12.权利要求11所述的重组EHV-1，其中所述EHV-1来源于EHV-1RacL株。
13.权利要求1-8中任一项所述的组合物或者权利要求9－12中任一项所述的重组EHV-1在制备用于接种动物的药物中的用途。
14.权利要求13所述的用途，其中所述接种包括初免-加强施用方案。
15.权利要求1-8中任一项所述的组合物或者权利要求9－12中任一项所述的重组EHV-1在制备用于引发动物中的抗疱疹病毒的保护性反应的药物中的用途。
16.权利要求13－15中任一项所述的用途，其中所述动物是马科动物。
17.一种分离的多核苷酸，其编码氨基酸序列与SEQ ID NO:35相同的多肽。
18.一种分离的多核苷酸，其与SEQ ID NO:34序列相同。
CN201380023248.3A 2012-03-20 2013-03-15 包含突变的糖蛋白c的重组马疱疹病毒-1疫苗及其用途 Active CN104302319B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261613151P 2012-03-20 2012-03-20
US61/613,151 2012-03-20
PCT/US2013/032491 WO2013142371A1 (en) 2012-03-20 2013-03-15 Recombinant equine herpesvirus-1 vaccine containing mutated glycoprotein c and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104302319A CN104302319A (zh) 2015-01-21
CN104302319B true CN104302319B (zh) 2016-08-24

Family

ID=48193269

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380023248.3A Active CN104302319B (zh) 2012-03-20 2013-03-15 包含突变的糖蛋白c的重组马疱疹病毒-1疫苗及其用途

Country Status (16)

Country Link
US (2) US8916371B2 (zh)
EP (1) EP2827897B1 (zh)
JP (1) JP6201166B2 (zh)
CN (1) CN104302319B (zh)
AR (2) AR090450A1 (zh)
AU (1) AU2013235423B2 (zh)
BR (1) BR112014023414B1 (zh)
CA (1) CA2867893C (zh)
ES (1) ES2711878T3 (zh)
HK (1) HK1201205A1 (zh)
HU (1) HUE042396T2 (zh)
MX (1) MX355443B (zh)
NZ (1) NZ700470A (zh)
SG (1) SG11201405847SA (zh)
UY (1) UY34695A (zh)
WO (1) WO2013142371A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2899203B1 (en) * 2008-05-08 2019-07-10 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Leishmania vaccine using sand fly salivary immunogen
US20130195918A1 (en) * 2011-08-08 2013-08-01 Dennis J. O'Callaghan Equine Herpesvirus 1 Vaccine and Vector and Uses Thereof
WO2015073507A1 (en) * 2013-11-13 2015-05-21 Cornell University Stimulation of neonatal immunity
WO2015123307A1 (en) 2014-02-11 2015-08-20 University Of Miami Methods and compositions for transgene expression in a herpesvirus vector system
AU2015343369B2 (en) 2014-11-03 2018-11-22 Georgia Tech Research Corporation Methods of using microneedle vaccine formulations to elicit in animals protective immunity against rabies virus
RU2736472C2 (ru) * 2016-11-18 2020-11-17 Общество с ограниченной ответственностью "ЭКСИФАРМ" Химерный белок, синтетическая днк, кодирующая указанный белок, экспрессионный вектор, штамм-продуцент синтетической днк и способ получения плазмидной днк
US11447562B2 (en) 2017-01-01 2022-09-20 Chi-Yu Gregory Lee RP215 chimeric antigen receptor construct and methods of making and using same
US11084272B2 (en) 2017-05-31 2021-08-10 General Electric Company Test structure for additive manufacture and related method for emitter alignment

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4963481A (en) 1985-12-18 1990-10-16 Genetics Institute Inc Promoter system
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
IE872455L (en) 1986-09-12 1988-03-12 Lanstrase Ltd Improved recombinant expression
IL84154A0 (en) 1986-10-16 1988-03-31 Microgenesys Inc Polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected insect cells and vaccines against acquired immune deficiency syndrome containing the same
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
DE3743138A1 (de) 1987-12-18 1989-09-14 Mayr Christian Gmbh & Co Kg Schleifringlose, elektromagnetische ueberlastkupplung
CA2003300A1 (en) 1988-11-21 1990-05-21 Franklin Volvovitz Skin test and test kit for aids
JP3602530B2 (ja) 1991-03-07 2004-12-15 ヴァイロジェネティクス コーポレイション 遺伝子操作したワクチン菌株
US5843456A (en) 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
DE69417717T2 (de) * 1993-12-20 1999-10-07 Akzo Nobel Nv Impstoff zum Schutze von Pferden gegen Pferdeherpesvirus-Infektionen
JPH11504631A (ja) 1995-04-25 1999-04-27 バイカル インコーポレイテッド Ｄｎａ／脂質複合体の単一バイアル製剤
EP0803573A1 (en) 1996-04-25 1997-10-29 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Polycistronic expression construct with cytokines for multivalent vaccines
US5846946A (en) 1996-06-14 1998-12-08 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Compositions and methods for administering Borrelia DNA
US6156567A (en) 1996-07-03 2000-12-05 Merial Truncated transcriptionally active cytomegalovirus promoters
JP2002512501A (ja) 1996-07-03 2002-04-23 メリアル インコーポレイテッド 外来性ｄｎａを含む組換えイヌアデノウィルス（ｃａｖ）
GB9625968D0 (en) * 1996-12-13 1997-01-29 Univ Glasgow Vaccine
FR2775601B1 (fr) 1998-03-03 2001-09-21 Merial Sas Vaccins vivants recombines et adjuves
FR2776928B1 (fr) 1998-04-03 2000-06-23 Merial Sas Vaccins adn adjuves
TWI224107B (en) 1998-10-22 2004-11-21 Pfizer Prod Inc Novel proteins from actinobacillus pleuropneumoniae
US6017537A (en) 1998-12-18 2000-01-25 Connaught Laboratories, Inc. Formyl methionyl peptide vaccine adjuvant
US6645740B1 (en) 1999-06-10 2003-11-11 Merial Limited Nucleic acids encodings equine GM-CSF
FR2796397B1 (fr) 1999-07-16 2006-09-01 Merial Sas Genes de calicivirus felin et vaccins notamment vaccins recombines
RS50325B (sr) 1999-09-25 2009-09-08 University Of Iowa Research Foundation, Imunostimulatorne nukleinske kiseline
US6852705B2 (en) 2000-01-21 2005-02-08 Merial DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines
MXPA03000823A (es) * 2000-07-27 2003-09-10 Res Corp Technologies Inc Vacunas para el virus del herpes simple equino del tipo 1: mutaciones de los viruses que se refugian dentro del gen precoz inmediato.
US20030059934A1 (en) * 2001-04-03 2003-03-27 Nikolaus Osterrieder Artificial chromosomes comprising EHV sequences
DE10116594A1 (de) * 2001-04-03 2002-10-10 Boehringer Ingelheim Vetmed Künstliche Chromosomen, die EHV-Sequenzen umfassen
FR2829498B1 (fr) 2001-09-11 2003-11-28 Merial Sas Igf-1 comme adjuvant de vaccin felin, notamment contre les retrovirus felins
US7078507B2 (en) 2001-11-09 2006-07-18 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Synthetic genes for malarial proteins and methods of use
AU2003245416A1 (en) 2002-06-07 2004-04-30 University Of Florida Endodontic files made using bulk metallic glasses
AR040601A1 (es) 2002-07-19 2005-04-13 Boehringer Ingelheim Vetmed Mutantes ehv negativos de gm sin elementos heterologos
WO2004011677A2 (en) * 2002-07-26 2004-02-05 Animal Health Trust Viral marker
EP1394258A1 (en) * 2002-08-30 2004-03-03 Geneart GmbH Non-human herpesviruses as vectors
EP1765387B1 (en) 2004-06-04 2013-01-09 Merial Limited NEEDLE-FREE ADMINISTRATION OF FeLV VACCINES
US8986706B2 (en) 2010-08-31 2015-03-24 Merial, Inc. Newcastle disease virus vectored herpesvirus vaccines

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Analysis of equid herpesvirus 1 strain variation reveals a point mutation of the DNA polymerase strongly associated with neuropathogenic versus nonneuropathogenic disease outbreaks";J.Nugent et al.;《Journal of Virology》;20060401;第80卷(第8期);Table7 *
"Construction and characterization of an equine herpesvirus 1 glycoprotein C negative mutant";Nikolaus Osterrieder et al.;《Virus Research》;19990201;第59卷(第2期);摘要，Fig 1和3.7 *
"Isolation of equine herpesvirus-1 lacking glycoprotein C from from a dead neonatal foal in Japan";R.Kirisawa et al.;《Arch Virol》;20051201;第150卷(第12期);第2553页Nucleotide sequence accession number *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104302319A (zh) 2015-01-21
HUE042396T2 (hu) 2019-06-28
AU2013235423B2 (en) 2017-03-30
US20130251747A1 (en) 2013-09-26
US20150190502A1 (en) 2015-07-09
JP2015512395A (ja) 2015-04-27
MX355443B (es) 2018-04-18
US8916371B2 (en) 2014-12-23
AR124928A2 (es) 2023-05-17
BR112014023414A8 (pt) 2022-07-05
BR112014023414A2 (pt) 2017-07-11
CA2867893C (en) 2022-09-20
CA2867893A1 (en) 2013-09-26
HK1201205A1 (zh) 2015-08-28
EP2827897B1 (en) 2018-10-31
AR090450A1 (es) 2014-11-12
BR112014023414B1 (pt) 2022-08-30
NZ700470A (en) 2016-04-29
AU2013235423A1 (en) 2014-10-16
ES2711878T3 (es) 2019-05-08
US9555101B2 (en) 2017-01-31
UY34695A (es) 2013-10-31
JP6201166B2 (ja) 2017-09-27
EP2827897A1 (en) 2015-01-28
SG11201405847SA (en) 2014-10-30
MX2014011281A (es) 2015-05-11
WO2013142371A1 (en) 2013-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104302319B (zh) 包含突变的糖蛋白c的重组马疱疹病毒-1疫苗及其用途
JP6368725B2 (ja) 豚ヘルペスウイルス遺伝子欠失株、ワクチン組成物及びその製造方法と応用
EP3230305B1 (en) Cytomegalovirus antigens
CN110551695A (zh) 非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株及其应用
WO2017106736A1 (en) Pseudorabies virus (prv) vector expressing heterologous polypeptides
CN111825768B (zh) 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及流感疫苗和制备方法
KR20150036057A (ko) 재조합체 ｂｔｖ 및 ａｈｓｖ 백신
CN105018433A (zh) 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
EP0538299A1 (en) Equine herpesvirus-4 tk?- vaccine
CN103957932B (zh) 包含最优化的猫白血病病毒包膜基因的重组猫白血病病毒疫苗
WO1994003628A1 (en) Recombinant equine herpesviruses
CN105018436B (zh) 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CA3202140A1 (en) Genomic deletion in african swine fever vaccine allowing efficient growth in stable cell lines
EP0668355A1 (en) Vaccine for the protection of horses against equine herpesvirus infection
SG183282A1 (en) Method for producing recombinant virus
US10434165B2 (en) FCV recombinant vaccines and uses thereof
CN103739697A (zh) 抵抗猪伪狂犬病毒增殖的重组蛋白及其应用
MXPA02002904A (es) Vacuna de virus de laringotraqueitis infecciosa recombinante.

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: MERIAL

Free format text: FORMER OWNER: MERIAL LIMITED

Effective date: 20150413

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20150413

Address after: Georgia, USA

Applicant after: Merial

Address before: Georgia, USA

Applicant before: Merial Ltd.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20190712

Address after: Georgia

Patentee after: Bollinger Ingham Animal Health USA

Address before: Georgia

Patentee before: Merial