DE10116594A1 - Künstliche Chromosomen, die EHV-Sequenzen umfassen - Google Patents

Künstliche Chromosomen, die EHV-Sequenzen umfassen

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Abstract

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gesundheit von Tieren, insbesondere Pferdekrankheiten, welche durch den Pferde-Herpesvirus (EHV) verursacht werden. Die Erfindung betrifft künstliche Chromosomen, umfassend das Genom von Pferde-Herpesviren, Verfahren zur Herstellung von abgeschwächten oder virulenten EHV mit oder ohne Insertion von fremden Genen, EHV, die mit diesen Verfahren erhältlich sind, und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese Viren umfassen.

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gesundheit von Tieren, insbesondere Pferde­ krankheiten, welche durch einen Pferde-Herpesvirus (EHV) verursacht werden. Die Erfindung betrifft künstliche Chromosomen, umfassend das Genom von Pferde- Herpesviren, Verfahren zur Produktion abgeschwächter EHV-Viren, EHV-Viren, welche mit diesen Verfahren erhältlich sind, und pharmazeutische Zusammen­ setzungen, welche diese Viren umfassen.
Hintergrund der Erfindung
Pferde-Herpesvirus 1 (EHV-1), ein Vertreter der Alphaherpesvirinae, ist die Haupt­ ursache von Virus-induzierten Fehlgeburten bei Equidae und verursacht Atemwegs- und neurologische Erkrankungen. Die gesamte DNA-Sequenz des EHV-1-Stammes Ab4p wurde bestimmt (Telford, E. A. R. et al., 1992). Nur wenige Gene und Genprodukte wurden hinsichtlich ihrer Relevanz für die Virulenz oder Immunogenizi­ tät von EHV-1 charakterisiert, da die Herstellung viraler Mutanten immer noch auf der Erzeugung rekombinanter Viren durch homologe Rekombination zwischen dem viralen Genom und der jeweiligen fremden DNA, welche in kultivierte Säugerzellen inseriert werden soll, basiert.
Zur Bekämpfung von EHV-1-Infektionen werden zwei verschiedene Ansätze verfolgt. Erstens wurden modifizierte Lebendvakzine (MLV), einschließlich des Stammes RacH (Mayr, A. et al., 1968; Hübert, P. H. et al., 1996), welcher in großem Umfang in Europa und den Vereinigten Staaten eingesetzt wird, entwickelt. Zweitens wurden inaktivierte Vakzine und unabhängig exprimierte, virale Glykoproteine hinsichtlich ihres Immunogenizitäts- und Schutzpotentials untersucht. Unter den Glykoproteinen, welche mit Hilfe rekombinanter Baculoviren exprimiert wurden, sind die Glyko­ proteine (g) B, C, D und H, welche einen partiellen Schutz gegen eine anschließende EHV-1-Herausforderungsinfektion in einem Maus-Modell induzierten (Awan, A. R. et aL, 1990; Tewari, D. et al., 1994; Osterrieder, N. et al., 1995; Stokes, A. et al., 1996). Der Einsatz von MLV hat jedoch Vorteile gegenüber Tod- und Spaltvakzinen. MLV sind hocheffizient bei der Induktion von zellvermittelten Immunreaktionen, welche höchstwahrscheinlich für den Schutz vor einer Erkrankung verantwortlich sind (Allen, G. P. et al., 1995; Mumford, J. A. et al., 1995).
Herpesvirus-Glykoproteine sind in den frühen Stadien der Infektion, bei der Freisetzung von Virionen aus Zellen und bei der direkten Zell-Zell-Verbreitung von Virionen durch Fusion von Nachbarzellen entscheidend beteiligt. Bisher wurden 11 Herpes-simplex-Virustyp 1 (HSV-1)-kodierte Glykoproteine identifiziert und erhielten die Bezeichnungen gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL und gM. HSV-1-Mutanten, denen gC, gE, gG, gI, gJ und gM fehlen, sind lebensfähig, was anzeigt, daß diese Gene zur Replikation in kultivierten Zellen entbehrlich sind. Ein Vergleich der HSV-1- und Pferde-Herpesvirus-1-Nukleotidsequenzen offenbarte, daß alle bekannten HSV- 1-Glykoproteine in EHV-1 konserviert sind. Gemäß der gegenwärtigen Nomenklatur werden diese Glykoproteine mit den Namen ihrer HSV-1-Homologen bezeichnet. Darüber hinaus wurden ein weiteres Hüllprotein mit der Bezeichnung gp1/2 und ein Tegument-Protein, das VP13/14-Homologe von HSV-1, im Falle von EHV-1 als glykosyliert beschrieben (Überblick in Osterrieder et al., 1998). Es ist bekannt, daß EHV-1-gC, -gE, -gI und -gM für das Wachstum in Zellkultur nicht essentiell sind, wohingegen gB und gD für das Viruswachstum in kultivierten Zellen essentiell zu sein scheinen. Die Beiträge anderer EHV-1-Glykoproteine zur Replikation in kultivier­ ten Zellen sind unbekannt (Neubauer et al., 1997; Flowers et al., 1992).
Das gp1/2-Glykoprotein wird von dem Gen 71 kodiert (Wellington et al., 1996; Telford et al., 1992) und wurde ebenfalls befunden, für das Viruswachstum in vitro nicht essentiell zu sein (Sun et al., 1996). Darüber hinaus war eine Virusmutante, die eine IacZ-Insertion im offenen Leserahmen des Gens 71 trug, bei einem Maus-Modell der Infektion nicht pathogen, jedoch immer noch in der Lage, gegen eine anschließende Herausforderungsinfektion zu schützen (Sun et al., 1996; Marahal) et al., 1997). Darüber hinaus beherbergt der KyA-Stamm von EHV-1 eine größere Deletion in den kodierenden Sequenzen des Gens 71 (Colle et al., 1996).
Das technische Problem, das dieser Erfindung zugrunde lag, bestand darin, ein neues Hilfsmittel und Verfahren zur Erzeugung abgeschwächter Pferde-Herpesviren definierter Spezifität bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Das oben genannte, technische Problem wird durch die in den Ansprüchen und der Beschreibung charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Die Erfindung betrifft künstliche Chromosomen, umfassend das Genom von EHV, Verfahren zur Produktion abgeschwächter EHV, EHV, die mit diesen Verfahren erhältlich sind, und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese Viren umfassen.
LEGENDEN ZU DEN FIGUREN
Fig. 1 Klonierungsstrategie zur Einführung von Mini-F-Plasmidsequenzen in das RacH- Genom (A). Es wurde eine PCR-Amplifizierung von Fragmenten durchgeführt, die an das Gen 71 angrenzen, welches in dem US-Bereich des Genoms (B) lokalisiert ist, und die resultierenden BamHI-KpnI- und SalI-SphI-Fragmente wurden nacheinander in den Vektor pTZ18R kloniert (C). Mini-F-Plasmidsequenzen wurden aus dem rekombinanten Plasmid pHA2 (Adler et al., 2000) mit PacI freigesetzt und kloniert, um das rekombinante Plasmid p71-pHA2 zu ergeben (D). Dieses Plasmid wurde mit RacH-DNA in RK13-Zellen kotransfiziert, und fluoreszierende Virusnachkommen­ schaft wurde ausgewählt. Virale DNA aus grün fluoreszierender Virusnachkommen­ schaft wurde eingesetzt, um Escherichia-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, aus denen infektiöses RacH-BAC isoliert wurde. Restriktionsenzymstellen und Maßstäbe (in kbp) sind angegeben.
Fig. 2 Restriktionsenzym-Verdauungen von RacH und RacH-BAC. Nach Auftrennung durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel wurden die Fragmente auf eine Nylonmembran (Pharmacia-Amersham) überführt und mit einer markierten pHA2-Sonde hybridisiert (siehe Fig. 1). Reaktive Fragmente, welche aufgrund der Insertion von Mini-F-Plasmidsequenzen vorhanden sind, sind durch Sternchen angezeigt. Der Molekulargewichtsmarker ist die 1-kb-Leiter (Gibco-BRL). Die verwendeten Restriktionsenzyme sind angezeigt.
Fig. 3 Plaquegrößen von RacH und RacH-BAC. Die Plaquegrößen wurden auf RK13- Zellen durch Messen der Durchmesser von jeweils 150 Plaques bestimmt. Die Plaquegrößen von RacH wurden auf 100% festgesetzt, und die Plaquegrößen von Virusnachkommenschaft, die aus BAC rekonstituiert worden war, wurden mit den­ jenigen des Stammvirus verglichen. Standardabweichungen sind angegeben.
Fig. 4 Prinzip der Deletion der Gene, welche für gD (a) oder gM (b) kodieren, in RacH-BAC durch Ersatz der offenen Leserahmen durch das Kanamycin-Resistenzgen (kan®) unter Anwendung von E/T-Klonierung. Das kan®-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung der in Tabelle 1 aufgelisteten Primer amplizifiert und das Amplikon in DH10B-Zellen, enthaltend RacH-BAC und das Plasmid pGETrec, welches die für die E/T-Klonierung nach Arabinose-Induktion erforderlichen Enzyme exprimiert (Schumacher et al., 2000), mittels Elektroporation eingeführt. Kanamycin-resistente Kolonien wurden gepickt, DNA wurde isoliert und einer Southern-Blot-Analyse unter Verwendung einer kan®-spezifischen Sonde unterworfen. Sowohl bei gD-negativen RacH-BAC (c) als auch gM-negativen RacH-BAC (d) reagierten Fragmente der erwarteten Größen (gD: 20,4 kpb; gM: 9,3 kpb) spezifisch mit der kan®-Sonde.
BESCHREIBUNG
Vor den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist festzuhalten, daß die hier und in den beigefügten Ansprüchen gebrauchten Singularformen "ein", "eine" und "der, die, das" den Plural einschließen, soweit der Kontext nicht eindeutig etwas anderes bestimmt. So beinhaltet beispielsweise der Verweis auf "einen Virus" eine Mehrzahl solcher Viren; der Verweis auf die "Zelle" ist ein Verweis auf eine oder mehrere Zellen und Äquivalente davon, die Fachleuten bekannt sind, usw. Soweit nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselben Bedeutungen, wie sie normalerweise von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, aufgefaßt werden. Obwohl beliebige Verfahren und Materialien, die den hier beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, bei der Ausführung oder Prüfung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, werden nun die bevorzugten Verfahren, Vorrichtungen und Materialien beschrieben. Alle hier genannten Veröffentlichungen sind hier durch Inbezugnahme mit eingeschlossen zum Zwecke der Beschreibung und Offenbarung der in den Veröffentlichungen angegebenen Zellinien, Vektoren und Methoden, welche in Zusammenhang mit der Erfindung eingesetzt werden könnten. Nichts davon ist als Zugeständnis zu verstehen, daß der Erfindung gegenüber einer solchen Offenbarung nicht als frühere Erfindung der Vorrang zukommt.
Die Erfindung betrifft einen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß er im wesentlichen das gesamte Genom eines EHV- Stammes umfaßt, von dem infektiöse Nachkommenschaft nach Transfektion in eine permissive Zelle rekonstituiert werden kann.
Mit den Vektoren auf Basis eines künstlichen Chromosoms gemäß der vorliegenden Erfindung können sichere EHV-Vakzine, umfassend EHV mit definierten Abschwächungen, erzeugt werden. Solche Viren eignen sich zur Herstellung eines sicheren Lebendvakzins zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder Behandlung von EHV-Infektionen (siehe unten). Die Erfindung bietet die Möglichkeit für eine schnelle und effiziente Manipulation des EHV-Genoms, welches für eukaryotische Zellen voll infektiös bleibt oder zu einem Replikations-defizienten Virus modifiziert wird. Es bestand auf diesem Gebiet seit langem Bedarf für ein solches Hilfsmittel zur Handhabung und Manipulation des riesigen Genoms von EHV. Zuletzt kann die EHV-Nukleinsäure als Polynukleotid-Vakzin eingesetzt werden, welches entweder topisch oder systemisch nicht-vorbehandelten oder geprimten Pferden verabreicht wird und auch in utero eingesetzt werden kann.
Die vorliegende Erfindung wird in Beispiel 1 erläutert, welches die Klonierung des vollständigen Genoms von EHV-1 als infektiöses Mini-F-Plasmid ("künstliches Bakterienchromosom", BAC) in Escherichia coli zeigt. Die Erzeugung dieses BAC war nicht trivial und mit vielen Schwierigkeiten verbunden, einschließlich der Herstellung und Extraktion ausreichender Mengen an zirkulärer DNA. Die zirkularisierte Form von rekombinanter, viraler DNA war erforderlich, um DH10B- Zellen mit der rekombinanten DNA zu transformieren, um die Mini-F-Plasmid- klonierte EHV-DNA herzustellen. Zum Erhalt ausreichender Mengen an zirkulärer, viraler DNA wurde die frühe, virale Transkription durch die Zugabe von 100 µg pro ml Cycloheximid nach Infektion der Zellen blockiert. Virale DNA wurde dann hergestellt und zur Transformation von DH10B-Zellen eingesetzt. Nur von Zellen, die mit Cycloheximid behandelt worden waren, war es möglich, ausreichende Mengen an zirkulärer DNA zu extrahieren und DH10B-Klone zu erhalten, welche das vollständige RacH-Genom enthielten.
"Essentiell" bedeutet, daß das EHV-Genom vollständig ist, mit Ausnahme dessen, daß es eine Mutation wie im folgenden dargelegt tragen kann.
"Künstliches Chromosom" bezieht sich auf beliebige bekannte, künstliche Chromosomen, wie z. B. künstliche Hefe- oder vorzugsweise Bakterien­ chromosomen.
Vorzugsweise ist ein künstliches Bakterienchromosom (BAC) gemäß der Erfindung ein Vektor, der zur Klonierung großer DNA-Fragmente (100-300 kb Insertgröße) in Escherichia-coli-Zellen eingesetzt wird, welcher auf dem natürlich vorkommenden F- Faktor-Plasmid basiert, das in dem Bakterium E. coli gefunden wird (Shizuya, H., B. Birren, U. J. Kim et al., 1992. "Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair- fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based-vector. Proceedings National Academy of Science", 89: 8794-8797). Der Vektortyp basiert vorzugsweise auf einem F-Plasmid-Replikon, enthaltend den Replikationsursprung (oriS) und dessen eigene DNA-Polymerase (repE) sowie die Gene parA und parB, welche an der Erhaltung seiner Kopienzahl auf einem Niveau von 1 oder 2 pro E. coli beteiligt sind. Der Antibiotikaresistenzmarker ist vorzugsweise Cm-Resistenz.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß der EHV EHV-1 ist.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß der EHV EHV-4 ist.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß der EHV-Stamm RacH ist.
Gemäß der Erfindung kann jeder Mutationstyp in der EHV-Genom eingeführt wer­ den, um einen Replikations-defizienten und/oder abgeschwächten EHV-Virus zu erhalten. Solche Mutationen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf jede beliebige Mutation (z. B. Deletion, Insertion, Substitution), welche die Glykoproteine gB, gC, gD, gE, gG, gI, gJ, gL und gM, gp1/2 und eine beliebige Kombination davon betrifft. Vorzugsweise sind die Mutationen Deletionsmutationen, d. h., die jeweiligen Glykoproteine, wie z. B. gM, sind vollständig deletiert.
Somit betrifft die Erfindung vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gB fehlt.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gC fehlt.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gD fehlt.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gE fehlt.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gG fehlt.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gH fehlt.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gI fehlt.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gK fehlt.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gL fehlt.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gM fehlt.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gp1/2 fehlt.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß das künstliche Chromosom ein künstliches Bakterienchromosom (BAC) ist. Diese BAC können in einem beliebigen Bakterium, das dem Fachmann bekannt ist, z. B. und vorzugsweise in Escherichia coli, vermehrt werden.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß das künstliche Chromosom ein künstliches Hefechromosom (YAC) ist.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms, RacH-BAC, dadurch gekennzeichnet, daß das künstliche Chromosom unter der Hinterlegungsnummer ECACC 01032704 bei der ECACC in Porton Down, Vereinigtes Königreich (European Collection of Cell-Cultures, CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK) hinterlegt ist.
Eine weitere, wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Poly­ nukleotid-Vakzin, kodierend für einen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms oder einen darin enthaltenen EHV gemäß der Erfindung.
Eine noch weitere, wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Vektors auf Basis eines künstlichen Chromosoms zur Herstellung von infektiösem EHV.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines infektiösen EHV, dadurch gekennzeichnet, daß ein erfindungsgemäßer Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms zur Infektion einer geeigneten Zellinie eingesetzt wird und der ausgeschüttete Virus gewonnen und gereinigt wird.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines abgeschwächten EHV, dadurch gekennzeichnet, daß die EHV-Sequenz, die in einem erfindungsgemäßen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms enthalten ist, durch molekularbiologische Techniken speziell modifiziert wird.
Diese Modifikationen können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren, z. B. stellengerichtete Mutagenese, durchgeführt werden, siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Ferner betrifft die Erfindung einen EHV, der nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist.
Eine weitere, sehr wichtige Ausführungsform ist eine pharmazeutische Zusammen­ setzung, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid und gegebenenfalls pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder Exzipienten umfaßt. Ein solches, erfindungsgemäßes Polynukleotid kann auch in einer pharmazeutischen Zusammensetzung im Rahmen dieser Erfindung, z. B. für DNA-Impfung, eingesetzt werden.
Ein Beispiel eines gezielten Verabreichungssystems, z. B. für erfindungsgemäße Polynukleotide, ist ein kolloidales Dispersionssystem. Kolloidale Dispersionssysteme umfassen makromolekulare Komplexe, Nanokapseln, Mikrokügelchen und Lipid- basierte Systeme, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, gemischte Mizellen und Liposomen oder Liposomen-Formulierungen. Liposomen sind das bevorzugte, kolloidale System gemäß der Erfindung. Liposomen sind künstliche Membranvesikel, welche sich als Träger in vitro und in vivo eignen. Diese Formulie­ rungen können eine kationische, anionische oder neutrale Ladung tragen. Es wurde gezeigt, daß große, unilamellare Vesikel (GUV) im Größenbereich von 0,2-4,0 µm einen größeren Teil einer wäßrigen Pufferlösung mit großen Makromolekülen ein­ schließen können. RNA, DNA und intakte Virionen können in der wäßrigen Phase im Innern eingeschlossen werden und in einer biologisch aktiven Form zum Target transportiert werden (Fraley, R. et al., 1981, "Trends Biochem Sci.", 6, 77-80). Zusätzlich zu Säugerzellen haben sich Liposomen auch für den zielgerichteten Transport von Nukleotiden in Pflanzen-, Hefe- und Bakterienzellen als geeignet erwiesen. Um einen effizienten Gentransfer-Träger darzustellen, sollten die folgenden Eigenschaften vorhanden sein: 1. die Gene sollten mit hoher Effizienz eingeschlossen werden, ohne deren biologische Aktivität zu verringern; 2. es sollte eine bevorzugte und substantielle Bindung an die Targetzelle im Vergleich mit Nicht- Target-Zellen vorliegen; 3. die wäßrige Phase des Vehikels sollte mit hoher Effizienz in das Zytoplasma der Targetzelle überführt werden, und 4. die genetische Information sollte genau und effizient exprimiert werden (Mannino, R. J. et al., 1988, "BioTechniques", 6, 682-690).
Die Zusammensetzung der Liposomen besteht gewöhnlich aus einer Kombination von Phospholipiden, insbesondere Phospholipiden mit einer hohen Phasenüber­ gangstemperatur, z. B. in Kombination mit Steroiden, wie Cholesterin. Andere Phospholipide oder andere Lipide können ebenfalls eingesetzt werden. Die physika­ lischen Eigenschaften der Liposomen hängen von dem pH-Wert, der Ionenkonzen­ tration und der Anwesenheit zweiwertiger Kationen ab.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann auch einen erfindungsgemäßen Vektor, z. B. einen BAC-Vektor, umfassend ein EHV-Genom, wie oben beschrieben, als nackten "Genexpressionsvektor" enthalten. Dies bedeutet, daß der erfindungsgemäße Vektor nicht mit einem Adjuvans für zielgerichtete Verab­ reichung (z. B. Liposomen, kolloidale Teilchen etc.) assoziiert ist. Ein Hauptvorteil von nackten DNA-Vektoren ist die Abwesenheit von jeglicher Immunreaktion, die durch den Vektor selbst veranlaßt wird.
Die EHV-Nukleinsäure kann als Polynukleotid Vakzin (siehe pharmazeutische Zusammensetzung, supra) eingesetzt werden, welches entweder topisch (z. B. intranasal) oder systemisch nicht-vorbehandelten oder geprimten Pferden verabreicht wird und auch in utero angewandt werden kann.
Eine weitere, sehr wichtige Ausführungsform ist eine pharmazeutische Zusammen­ setzung, die einen EHV-Virus gemäß der Erfindung und pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder Exzipienten umfaßt.
Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger kann physiologisch annehmbare Verbin­ dungen enthalten, welche beispielsweise zur Stabilisierung oder zur Erhöhung der Absorption dienen oder einen Teil einer Formulierung des erfindungsgemäßen EHV- Virus oder Polynukleotids zur verzögerten Freisetzung bilden. Solche physiologisch annehmbaren Verbindungen schließen beispielsweise Kohlenhydrate, z. B. Glucose, Sucrose oder Dextrane; Antioxidationsmittel, wie z. B. Ascorbinsäure oder Glutathion, Chelatbildner, Proteine mit niedrigem Molekulargewicht oder andere Stabilisatoren oder Exzipienten ein (siehe auch z. B. "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1990), 18. Aufl., Mack Publ., Easton). Ein Fachmann würde wissen, daß die Wahl eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers, einschließlich einer physiologisch annehmbaren Verbindung, beispielsweise vom Verabreichungsweg der Zusammen­ setzung abhängt.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids zur Herstellung eines Vakzins zur Prophylaxe und/oder Behandlung von EHV-Infektionen.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen EHV-Virus zur Herstellung eines Vakzins zur Prophylaxe und/oder Behandlung von EHV- Infektionen.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der BAC-Technologie zur Etablierung eines hochvirulenten und genetisch gut charakterisierten EHV, welcher für Immuni­ sierungs- und Herausforderungsstudien zur Verwendung bei z. B. Vakzin-Wirksam­ keitsstudien eingesetzt werden kann.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen EHV-BACs zur Erzeugung von Mutanten-BACs, welche unter Berücksichtigung auftretender genetischer oder antigenetischer Varianten von EHV erzeugt werden. Dies bezieht sich auf eine oder mehrere Mutation(en), die in "neuen Varianten" von EHV vorliegt/en, welche unschwer in das existierende EHV-BAC eingeführt werden können.
Das folgende Beispiel soll das Verständnis der Erfindung erleichtern und sollte in keiner Weise als Beschränkung des Umfangs der Erfindung betrachtet werden.
BEISPIEL 1 Konstruktion eines künstlichen EHV-1-Bakterienchromosoms
Es wurde eine genetisch einheitliche Population von RacH (256. Passage) isoliert. Mit RacH, Passage 257, wurden RK13-Zellen infiziert und ein Stammpool etabliert. Virus von einer zusätzlichen Passage durch RK13-Zellen wurde zur Infektion von RK13-Zellen eingesetzt, woraus virale DNA hergestellt wurde. 10 Mikrogramm (µg) viraler DNA wurden mit 10 µg Plasmid p71-pHA2 (Fig. 1) in RK13-Zellen kotransfi­ ziert. Zur Konstruktion des Plasmids p71-pHA2 wurden 2,0- und 2,4-kbp-Fragmente auf jeder Seite des EHV-1-Gens 71 (Fig. 1; Tabelle 1) mittels Polymeraseketten­ reaktion (PCR) unter Verwendung von Primern, die geeignete Restriktionsenzym­ stellen enthielten (Tabelle 1), amplifiziert. Beide Fragmente wurden anschließend in pTZ18R (Pharmacia-Amersham) kloniert, um das Plasmid p71 (Fig. 1) zu erhalten. Ein BAC-Vektor (pHA2; Messerle et al., 1997), enthaltend die Eco-gpt und GFP (grünes Fluoreszenzprotein)-Gene unter der Kontrolle des "immediate early"- Promotors von HCMV (Human-Cytomegalovirus), wurde als PacI-Fragment aus dem Plasmid pHA2 freigesetzt und in die PacI-Stellen des in p71 klonierten 2,0- und 2,4- kbp-Fragments inseriert (Fig. 1; Tabelle 1). Virusnachkommenschaft wurde geerntet, und individuelle Plaques, die das grüne Fluoreszenzprotein (GFP) exprimierten, wurden isoliert und drei Runden einer Plaquereinigung unterworfen, bis die Virus­ nachkommenschaft unter dem Fluoreszenzmikroskop eine homogene, grüne Farbe ergab (Seyboldt et al., 2000). Gleichermaßen wurden Kotransfektionen von p72- pHA2 und DNA des EHV-1-Stammes Kentucky A (KyA) durchgeführt und der rekom­ binante Virus bis zur Homogenität gereinigt. DNA des rekombinanten Virus wurde präpariert (Schumacher et al., 2000) und mittels Elektroporation in den Escherichia- coli-Stamm DH10B eingeführt (Messerle et al., 1997; Schumacher et al., 2000). Elektrokompetente Bakterien wurden, wie beschrieben, vorbereitet (Muyrers et al., 1999; Narayanan et al., 1999; Zhang et al., 1998) und die Elektroporation in 0,1-cm- Küvetten bei 1250 V, einem Widerstand von 200 Ω und einer Kapazität von 25 µF (Easyject electroporation-system, Eurogenentec) durchgeführt. Transformierte Bakterien wurden in 1 ml Luria-Bertani(LB)-Medium (28), ergänzt mit 0,4% Glucose, 1 h lang bei 37°C inkubiert und dann auf LB-Agar, enthaltend 30 µg/ml Chlor­ amphenicol, ausplattiert. Einzelkolonien wurden in flüssiges LB-Medium gepickt und Präparationen von BAC-DNA in kleinem Maßstab durch alkalische Lyse von Escherichia coli vorgenommen (Schumacher et al., 2000). Eine großmaßstäbliche Präparation von BAC-DNA wurde mittels Affinitätschromatographie auf Silicabasis unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits (Qiagen, Macherey & Nagel) erreicht.
Von den Chloramphenicol-resistenten Bakterienkolonien wurde jeweils eine Kolonie, welche das EHV-1-RacH-Genom enthielt, ausgewählt und als RacH-BAC bezeichnet. RacH-BAC-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI, EcoRI und HindIII gespalten, und die Restriktionsenzymmuster wurden mit denjenigen der viralen Ausgangs-DNA verglichen (Schumacher et al., 2000). Die berechneten und erwarteten Änderungen in den Bandenmustern nach Insertion des Mini-F-Plasmids in den Gen-71-Locus wurden in RacH-BAC beobachtet. Im Gegensatz dazu waren keine anderen Unterschiede in den Restriktionsenzymmustern im Vergleich zu dem Ausgangsvirus ersichtlich (Fig. 2). Nach Reinigung von RacH-BAC-DNA unter Anwendung von Affinitätschromatographie wurden RK13-Zellen mit 1 µg rekombinanter DNA transfiziert. Einen Tag nach der Transfektion waren Foci von grün fluoreszierenden Zellen sichtbar, welche sich an den folgenden Tagen nach der Infektion zu Plaques entwickelten (Fig. 3). Aus diesen Ergebnissen schlossen wir, daß der RacH-Stamm von EHV-1 als infektiöse, virale DNA vollständiger Länge in Escherichia coli kloniert wurde. Die Deletion des Gens 71 in RacH-BAC führte zu einer weniger als 10%igen Verringerung der Plaquegröße (Fig. 3).
TABELLE 1
Mutagenese von EHV-1-BACs
Zur Mutagenese von RacH-BAC-DNA in Escherichia coli wurden recE- und recT- katalysierte Reaktionen, welche die homologe Rekombination zwischen linearen DNA-Fragmenten fördern, auch als E/T-Klonierung bezeichnet, durchgeführt (Muyrers et al., 1999; Zhang et al., 1999). Das Plasmid pGETrec (eine freundliche Gabe von Dr. Panos Ioannou, Murdoch Institute, Melbourne, Australien), welches das recE-, recT- und Bakteriophagen-λ-gam-Gen (Narayanan et al., 1999) beherbergte, wurde in RacH-BAC-enthaltende DH10B-Zellen transformiert. Nach Induktion von recE, recT und garn durch Zugabe von 0,2% Arabinose wurden elektrokompetente Zellen im wesentlichen, wie beschrieben (Muyrers et al., 1999), präpariert. Zur Deletion des gD- und gM-Gens in RacH-BAC wurde das Kanamycin- Resistenzgen (kan®) des Plasmids pACYC177 (Stratagene) mittels PCR amplifiziert. Die konstruierten Primer enthielten 50-Nukleotid-Homologie-Arme, welche die gewünschte Deletion in gD oder gM begrenzten, und 20 Nukleotide für die Ampli­ fizierung von kan® (Tabelle 1). Das resultierende 0,95-kbp-Fragment wurde aus einem Agarosegel (Qiagen) gereinigt und in pGETrec-enthaltende RacH-BAC-Zellen mittels Elektroporation eingeführt. Kolonien, welche die cam®- und kan®-Gene beherbergten, wurden auf Platten identifiziert, die beide Antibiotika enthielten.
H-BACΔgD- und H-BACΔgM-DNA wurde aus Escherichia coli mittels Chromato­ graphie isoliert und einer Restriktionsenzymverdauung und Southern-Blot-Analyse unterworfen (Fig. 4). Transfektionsstudien wurden durchgeführt. Während RacH- BAC und H-BACΔgM in der Lage waren, virale Plaques auf RK13-Zellen zu induzie­ ren, war H-BACΔgD nur in der Lage, Plaques bei Zellen zu induzieren, die gD in trans exprimierten. Die gD-Zellen exprimierten vorübergehend EHV-1-gD nach Transfektion eines rekombinanten Plasmids, in dem gD unter der Kontrolle des "immediate early"-Promotors/Enhancers von HCMV steht. Diese Beobachtungen deuteten darauf hin, daß EHV-1-gD für das Viruswachstum in vitro essentiell ist.
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Claims (28)

1. Vektor auf Basis eines künstlichen Bakterienchromosoms, dadurch gekennzeichnet, daß er im wesentlichen das vollständige Genom eines EHV- Stammes umfaßt.
2. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der EHV EHV-1 ist.
3. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der EHV EHV-4 ist.
4. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der EHV-Stamm RacH ist.
5. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er der Vektor mit der Hinterlegungsnummer ECACC 01032704 ist.
6. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gB fehlt.
7. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gC fehlt.
8. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gD fehlt.
9. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gE fehlt.
10. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gG fehlt.
11. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gH fehlt.
12. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gI fehlt.
13. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gK fehlt.
14. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gL fehlt.
15. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gM fehlt.
16. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß dem EHV-Stamm das Glykoprotein gp1/2 fehlt.
17. Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das künstliche Chromosom unter der Hinterlegungsnummer Q4297 bei der ECACC hinterlegt ist.
18. Polynukleotid, kodierend für einen Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms oder einen darin enthaltenen EHV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17.
19. Verwendung eines Vektors auf Basis eines künstlichen Chromosoms oder eines Polynukleotids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18 zur Erzeugung von infektiösem EHV.
20. Verfahren zur Erzeugung von replizierendem EHV, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 dazu verwendet wird, eine geeignete Zellinie zu infizieren und der ausgeschüttete Virus gewonnen und gereinigt wird.
21. Verfahren zur Erzeugung eines abgeschwächten EHV, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die in einem Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17 enthaltene EHV-Sequenz durch molekularbiologische Techniken speziell modifiziert wird.
22. Verfahren zur Klonierung und Erzeugung eines abgeschwächten EHV, dadurch gekennzeichnet, daß die in einem Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17 enthaltene EHV- Sequenz durch molekularbiologische Techniken speziell modifiziert wird und eine fremde Sequenz eines anderen viralen, bakteriellen oder parasitischen Pathogens enthält.
23. Verfahren zur Klonierung und Erzeugung eines virulenten EHV, dadurch gekennzeichnet, daß die in einem Vektor auf Basis eines künstlichen Chromosoms nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17 enthaltene EHV- Sequenz durch molekularbiologische Techniken speziell modifiziert wird.
24. EHV, erhältlich durch ein Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 20 bis 23.
25. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polynukleotid nach Anspruch 18 und pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder Exzipienten.
26. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen EHV-Virus nach Anspruch 24 und pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder Exzipienten.
27. Verwendung eines Polynukleotids nach Anspruch 18 bei der Herstellung eines Vakzins zur Prophylaxe und/oder Behandlung von EHV-Infektionen.
28. Verwendung eines EHV-Virus nach Anspruch 24 bei der Herstellung eines Vakzins zur Prophylaxe und/oder Behandlung von EHV-Infektionen.
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