JP6368725B2 - 豚ヘルペスウイルス遺伝子欠失株、ワクチン組成物及びその製造方法と応用 - Google Patents
豚ヘルペスウイルス遺伝子欠失株、ワクチン組成物及びその製造方法と応用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6368725B2 JP6368725B2 JP2015563126A JP2015563126A JP6368725B2 JP 6368725 B2 JP6368725 B2 JP 6368725B2 JP 2015563126 A JP2015563126 A JP 2015563126A JP 2015563126 A JP2015563126 A JP 2015563126A JP 6368725 B2 JP6368725 B2 JP 6368725B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- strain
- swine
- herpesvirus
- antigen
- attenuated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16721—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16761—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2710/16762—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16771—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20071—Demonstrated in vivo effect
Description
gI/gE/11K/28Kタンパク質の不活性化は本技術分野の公知の手段を利用することがでる。その遺伝子は上記のタンパク質の機能性断片を発現するヌクレオチド配列を欠失し、その遺伝子はORF全体を欠失し、或いはその遺伝子は、一つ或いは複数のヌクレオチドを欠失、除去或いは付加することで、機能性タンパク質を正常に発現できなくなり、或いは発現されたタンパク質が本来の機能を有しておらず、または機能が極めて低いことを含む。
また、本発明の一実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株ゲノムにおいて、gI/gE/11K/28KのORFの全長を欠失させた。
本発明の一実施形態として、上記のヘルペスウイルス変異株は、gEタンパク質配列がSEQ ID NO.5であり、又は、それと95%以上の配列相同性を有するウイルス株である。好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス変異株は、分離されたものであり、上記の豚ヘルペスウイルス変異株による感染を再現する時に、従来の遺伝子欠失ヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚にも、高熱、意気消沈、食欲不振或いは絶食症状が現れるウイルス株である。より好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス変異株は、上記の豚ヘルペスウイルス変異株による感染を再現する時に、従来のgE、TK、gI遺伝子の一つ以上を欠失させたヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚は依然として豚オーエスキー病を感染し、かつ上記の豚ヘルペスウイルス変異株は9〜10日齢の子ブタに意気消沈と食欲不振をおこすウイルス株である。
また、本発明の一実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株は更にTKタンパク質を不活性化させ、好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株ゲノムにおいて、TK部位のヌクレオチド配列がSEQ.NO.4のアミノ酸配列をコードして発現する。
本発明の好ましい実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株ゲノムにおいて、TK部位のヌクレオチド配列がSEQ.NO.3のヌクレオチド配列である。
また、本発明の好ましい実施形態として、本発明はgI/gE/11K/28K/TK遺伝子を欠失させるヘルペスウイルス遺伝子工学的弱毒株を提供する。
「gEタンパク質」という用語は、US8によってコードされ、577個のアミノ酸を含み、ORFが123502〜125235の間に位置することを意味する。
「11K」という用語は、US9によってコードされ、98個のアミノ酸を含み、ORFが125293〜125589の間に位置することを意味する。
「28K」という用語は、US2によってコードされ、256個のアミノ酸を含み、ORFが125811〜126581の間に位置することを意味する。
「TK」という用語は、「チミジンキナーゼ」とも呼ばれ、UL23によってコードされ、320個のアミノ酸を含み、ORFが59512〜60474の間に位置することを意味する。
本発明の「gI/gE/11K/28K」及び「gI/gE/11K/28K/TK」という用語は、それぞれ「gI、gE、11K及び28K」および「gI、gE、11K、28KおよびTK」を意味し、その記号「/」は本発明において「及び」という意味であり、たとえば「gI/gE/11K/28Kタンパク質を不活性化させる」とは、gI、gE、11K、28Kの四つのタンパク質を全て失活させることを意味する。
特に記載しない限り、本発明の「PRV−gI−gE−11K−28K−TK−」という用語は、gI、gE、11K、28KおよびTK遺伝子を欠失させることを意味する。
本発明の好ましい実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株は、gI/gE/11K/28Kを欠失させたHN1201株、HN1202株、JS−2012株、豚ヘルペスウイルスHeN1株、NVDC−PRV−BJ株、NVDCPRV−HEB株或いはNVDC−PRV−SD株を含む。
本発明の好ましい実施形態として、上記のヘルペスウイルス弱毒株は、遺伝子工学によってgI/gE/11K/28K遺伝子を欠失させる豚ヘルペスウイルスHN1201株(Pseudorabies virus,strain HN1201)であり、当該豚ヘルペスウイルスHN1201株の受託番号がCCTCC NO.V 201311であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は2013年5月20日である。
本発明の他の一態様は、免疫量の上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原とベクターを含み、好ましくは、豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原の含有量>106.0TCID50/頭であるワクチン組成物に関する。
本発明の好ましい実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原が生きている上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株であり、上記のワクチン組成物は更に凍結乾燥保護剤を含む。
本発明の実施形態として、上記のワクチン組成物は、免疫量の上記のgI/gE/11K/28K遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株変異株の弱毒化ワクチンとベクターを含む。
本発明の好ましい実施形態として、上記のワクチン組成物は、免疫量の上記のgI/gE/11K/28K/TK遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株変異株の弱毒化ワクチンとベクターを含む。
本発明の好ましい実施形態として、上記のワクチン組成物は、免疫量の上記のgI/gE/11K/28K/TK遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株変異株HN1201株、HN1202株、JS−2012株、豚ヘルペスウイルスHeN1株、NVDC−PRV−BJ株、NVDCPRV−HEB株或いはNVDC−PRV−SD株、PRV TJ株或いはPRV−ZJ01株の弱毒化ワクチンとベクターを含む。
好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原が生きている豚ヘルペスウイルス弱毒株であり、上記のワクチン組成物は更に凍結乾燥保護剤を含む。
本発明の一実施形態として、上記のワクチン組成物は、gI/gE/11K/28K遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株の生きている弱毒化ワクチンである。
従って、好ましい実施形態においては、本発明に係る生きている弱毒化ワクチンはアジュバントを含む。
本発明に用いられる薬学的に許容される担体又は希釈剤の他の具体例には、SPGA、糖類(例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン)、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳などのタンパク質含有物質及びバッファー(例えば、リン酸バッファー)などの安定化剤を含む。
特にこのような安定化剤をワクチンに混入する時に、ワクチンは冷凍乾燥に非常に適する。従って、より好ましい実施形態において、生きている弱毒化ワクチンは冷凍乾燥品である。
本発明の一実施形態として、上記のワクチンは、更に、不活性化させた病原体或いは抗原組成成分を含み、好ましくは、上記の抗原は豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原及び/又はブタパラインフルエンザ菌抗原或いは豚肺炎マイコプラズマ抗原である。
好ましくは、上記のワクチン組成物は更に、媒体、アジュバント、賦形剤を含有する。
本発明に係わるワクチン組成物は、媒体、アジュバント及び/又は賦形剤をさらに含有してもよい。生理食塩水或いは蒸留水を媒体として使用できる。
本発明の他の一形態は、豚オーエスキー病を予防・治療する、上記のワクチン組成物の医薬品の製造への応用に関する。
本発明の一実施形態として、上記の豚オーエスキー病は豚ヘルペスウイルス変異株による豚オーエスキー病である。
本文に用いられる「豚ヘルペスウイルスに起因する疾病」という用語は、以下の症状を示す意味として用いられることがあり、即ち、どんな年齢の豚でも感染することがある。豚群において水平伝播可能であり、潜伏期間が短く(1〜2日)、発病率は10%〜100%の範囲であり、発病した豚の死亡率は10%〜100%の範囲であり(子豚の死亡率は100%と高い)、感染した豚は、高熱(40〜42℃、3日以上続く)、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、最後に消耗により死に至る。また、種雄豚では精液の質が低下し、妊娠する母豚では流産(35%と高い)、早産、死産、弱い子豚産出(弱い子豚が14日齢になる前に全部死亡)するなどの生殖障害症状が出るが、それに限定されない。
本文に用いられる用語「予防」とは本発明のワクチン組成物を投与することで、豚ヘルペスウイルスの感染を抑制し、又は発病を遅延させるいずれの行為である。「治療」という用語とは、本発明に係るワクチン組成物を投与することで、豚ヘルペスウイルス感染による症状を緩和し又は良くするいずれの行為である。
本発明における用語「頭分」とは、豚に対して1頭当たりのワクチン注射量である。
本発明に記載されている「TCID50」(50%tissue culture infective dose)は、細胞培養物の50%を感染させることができるウイルス量であり、ウイルス感染力を表す方式の一つである。
MEM液体培地(液)はアメリカLife Technologies会社から購入したMEM乾燥粉末培地を用いて、明細書により調製したものである。
本発明のDMEM培地は、GB/T18641−2002付録Aの調製方法により調製したものである。
本発明に記載される「PBS」とはリン酸塩緩衝液(Phosphate Buffer Saline)の英語イニシャルであり、本発明では、0.01mM PBS(pH 7.4)を用い、《分子クローン》第三版により調製された。
本実施例に用いられる豚ヘルペスウイルスHN1202株(Pseudorabies virus,strain HN1202)は、受託番号がCCTCC NO.V 201335であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日が2013年8月26日である。
PRVは豚ヘルペスウイルス(Pseudorabies virus)の英語の略語である。
以下の具体的な実施形態において、それぞれ、豚ヘルペスウイルス変異株PRV HN1201株、NVDC−PRV−BJ株、NVDCPRV−HEB株とNVDC−PRV−SD株、HN1202株を例として本発明を説明する。
1.1PRV HN1201GFP組換えウイルス導入ベクターの構築
欠失しようとするUSセグメント(gI/gE/11K/28K)の配列によって、その両端にそれぞれホモロジーアーム、即ちUSAとUSBを設計した。USAとUSBをpUC19ベクターにクローンして、pUCUSABと名づけた。次に、GFP遺伝子をpUCUSABにクローンして、組換えウイルス導入ベクターを獲得して、pUCUSA−GFP−Bと名づけた。導入ベクターにおいて、ホモロジーアームはUS両側の配列であるため、組換えて得られた組換えウイルスはgI/gE/11K/28KのUSセグメントを欠失した。組換え導入ベクター構築の概略図を図1に示し、図2はゲノム上のUSAとUSBホモロジーアームの位置を示す。
1.1.1.1プライマーの設計とテンプレートの制作
HN1201ウイルスの遺伝子配列によって、二対のプライマーを設計し、欠失セグメントの両側のホモロジーアームを増幅した。
左側のホモロジーアームUSAの上下流のプライマーは、それぞれ
USAF:CCGGAATTCTCGTCGTGGGCATCGTCATCAT(下線がEcoR I制限酵素切断サイトである)、
USAR:CTATCTAGAataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatCGGTACTGCGGAGGCTACGGAC(下線がXba I制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがloxpサイトである)である。
右側のホモロジーアームUSBの上下流のプライマーは、それぞれ
USBF:ACATGCATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatACGGCAGGATCTCTCCGCGTCCC(下線がSphI制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがloxpサイトである)、
USBR:CCCAAGCTTAGGAGGGGGCGGGGAGCGCGAGC(下線がHind III制限酵素切断サイトである)である。
PRV HN1201でvero細胞を感染し、細胞の80%以上が病変を認められた後、上澄みの一部を取り、Geneaid Viral Nucleic Acid Extractionキットを利用して、ウイルスゲノムDNAを抽出し、ホモロジーアームを増幅するためのテンプレートとする。
TAKARAのPrimeSTARを利用して、PCRを行って、以下の体系及び条件でUSA、USBを増幅させた。
PCRにより増幅されたUSAとUSB断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した後、ゲル回収キット(天根社製)を使用して目的断片を回収した。USA断片とpUC19ベクターをそれぞれEcoR IとXbaIで二重消化(double digestion)した後、目的断片を回収し、T4 DNA リガーゼ結合した後、DH5αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、37℃で一晩培養する。モノクローナルを選別し、酵素消化によって正確であると勘定したプラスミドをpUCUSAと名づけた。pUCUSAとUSBをそれぞれ SalIとHindIIIで二重消化した後、目的断片を回収し、T4 DNA リガーゼ結合した後、DH5αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、37℃で一晩培養した。モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをpUCUSABと名づけた。
1.1.2.1 GFPベクターpAcGFP−C1マルチプルクローニングサイトの除去
pAcGFP−C1プラスミド(Clontechから購入し、型番632470)をBgl IIとSma Iで二重消化した後、線状化されたベクターを回収し、DNA Polymerase I Large(Klenow)Fragmentにより平滑化し、T4 DNA Ligase結合した後、DH5αコンピテントセルの形質転換を行い、MCSを除去したGFPプラスミドを獲得し、pAcGFPΔMCSと名づけた。
1.1.2.2 GFP遺伝子の増幅
pAcGFP−C1ベクター配列に基づき、GFPを増幅するためのプライマーを設計した。
<上流プライマー>
CMVU:ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(下線がSalI制限酵素切断サイトである)
<下流プライマー>
SV40R:ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC(下線がSph I制限酵素切断サイトである)
プラスミドpAcGFPΔMCSをテンプレートとして、以下の体系及び条件でGFP遺伝子を増幅した。
電気泳動によって目的バンドを回収し、次の結合を行った。
GFPをSal IとSph Iで二重消化した後、目的断片を回収し、同様に二重消化したpUCRRABプラスミドと結合し、DH5αコンピテントセルの形質転換を行い、モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをpUCUSA−GFP−Bと名づけた。
1.2 GFPを含む組換えウイルスの獲得
1.2.1 導入ベクターとHN1201 DNAでVero細胞を共トランスフェクションして組換えウイルスを獲得する
リポソーム法でVero細胞を共トランスフェクションし、Lipofectamine 2000(Invitrogen、型番11668030)に付属する明細書の工程によって、3ug PRV−HN1201ウイルスゲノムDNAと5ug導入ベクターpUCUSA−GFP−Bをトランスフェクションした。37℃で5%CO2を含む培養箱に培養した。トランスフェクションしてから36〜48時間後に、細胞病変が生じて、且つ病変部に蛍光が認められたら、細胞の上澄みをP0世代組換えウイルスとして回収し、rPRV−GFP−US−と名づけた。
1.2.2 組換えウイルスのプラークの精製
得られたP0世代組換えウイルスrPRV−GFP−US−でVero細胞を感染した後、2%の低融点アガロースを敷き、48時間後、細胞に明らかな病変と蛍光が認められた後、緑色蛍光のプラークを選別して、−70℃で3回凍結融解した後、10倍段階希釈してVero細胞を敷いておいた6ウェルプレートに接種し、引き続いて緑色蛍光プラークを選別して精製し、プラーク精製を8循環で行って、精製された野生型ウイルスHN1201を含まないgI/gE/US9/US2(すなわち、gI/gE/11K/28K)欠失の組換えウイルスrPRV−GFP−US−を得た。
Cre酵素を発現するpBS185プラスミド(addgeneから購入し、Cre酵素はホモロジーアームUSA下流とUSB上流のloxPサイトを認識し、二つのloxpサイトの間の配列を除去する)と組換えウイルスrPRV−GFP−US−ゲノムDNAにより、vero細胞の共トランスフェクションを行った結果、トランスフェクションしてから24時間後、比較的に明らかな病変が現れ、しかも単独な蛍光がより多かった。獲得したP0世代ウイルスを段階希釈した後、接種して、プラークを選別し、蛍光を発しないプラークを選別して、次の精製を行った。2回選別・精製して、蛍光を発しないウイルスを獲得して、vPRV−US−と名づけた。精製ウイルスゲノムDNAを抽出し、PCR同定によって、gI/gE/US9/US2(すなわち、gI/gE/11K/28K)セグメントが欠失され、且つGFP標識遺伝子もすでに除去されたことが分かった。GFP標識遺伝子を含まないgI/gE/US9/US2(すなわち、gI/gE/11K/28K)セグメント欠失ウイルスの精製が成功したことを明らかにした。
1.4 PRV HN1201株USセグメント欠失ウイルス株の確認
gI/gE/US9/US2(すなわち、gI/gE/11K/28K)セグメント欠失ウイルスと野生型ウイルスのウイルスゲノムを抽出し、PCR同定を行い、プライマーは下記の通りであった。
USDCF:TACATCGTCGTGCTCGTCTTTGGC
USDCR:AGCTCGTGCGTCTCGGTGGTG
野生型ウイルスで増幅したPCR産物のサイズが6286bpであり、gI/gE/U S9/US2(すなわち、gI/gE/11K/28K)セグメント欠失ウイルスで増幅したPCR断片のサイズが1960bpであった。
PCR実験の結果から、gI/gE/US9/US2(すなわち、gI/gE/11K/28K)セグメントORFをすでに完全に欠失させたことを証明した。
2.1 PRV HN1201 GFP組換えウイルス導入ベクターの構築
欠失しようとするTK遺伝子の配列によって、その両端にそれぞれホモロジーアーム、即ちTKAとTKBを設計した。TKAとTKBをpUC19ベクターにクローンして、pUCTKABと名づけた。次に、GFP遺伝子をpUCTKABにクローンして、組換えウイルス導入ベクターを獲得し、pUCTKA−GFP−Bと名づけた。導入ベクターにおいて、ホモロジーアームはTK両側の配列であるため、組換えて得られた組換えウイルスはTK遺伝子を欠失した。図4はゲノム上のTKAとTKBホモロジーアームの位置を示す。
2.1.1.1 プライマーの設計とテンプレートの製造
HN1201ウイルスの遺伝子配列によって、二対のプライマーを設計し、TK遺伝子の両側のホモロジーアームを増幅した。
左側のホモロジーアームTKAの上下流のプライマーは、それぞれ
TKAF: CCGGAATTCGTAGTGCCGGTTGCCCACGTACA(下線がEcoR I制限酵素切断サイトである)
TKAR:CTAGTCTAGAataacttcgtatagtacacattatacgaagttatCGCTCAGGCTGCCGTTCTGC(下線がXba I制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがloxpサイトである)である。
右側のホモロジーアームTKBの上下流のプライマーは、それぞれ
TKBF:ACATGCATGCataacttcgtataatgtgtactatacgaagttatAACGACGACGGCGTGGGAGG(下線がSph I制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがloxpサイトである)
TKBR:CCCAAGCTTAGGGCGACGGCGAAGAAGAGC(下線がHind III制限酵素切断サイトである)である。
PRV HN1201でvero細胞を感染し、細胞の80%以上が病変を認められた後、上澄みの一部を取り、Geneaid Viral Nucleic Acid Extractionキットを利用して、ウイルスゲノムDNAを抽出し、ホモロジーアームを増幅するためのテンプレートとする。
TAKARAのPrimeSTARを利用して、PCRを行って、以下の体系及び条件でTKA、TKBを増幅させた。
PCRにより増幅されたTKAとTKB断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した後、ゲル回収キット(天根社製)を使用して目的断片を回収する。TKA断片とpUC19ベクターをそれぞれEcoR IとXbaIで二重消化した後、目的断片を回収し、T4 DNA リガーゼ結合した後、DH5αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、37℃で一晩培養した。モノクローナルを選別し、酵素消化によって正確であると勘定したプラスミドをpUCTKAと名づけた。pUCTKAとTKBをそれぞれ SalIとHindIIIで二重消化した後、目的断片を回収し、T4 DNA リガーゼ結合した後、DH5αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、37℃で一晩培養した。モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをpUCTKABと名づけた。
2.1.2.1 GFPベクターpAcGFP−C1マルチプルクローニングサイトの除去
pAcGFP−C1プラスミド(Clontechから購入し、型番632470)をBgl IIとSma Iで二重消化した後、線状化されたベクターを回収し、DNA Polymerase I Large(Klenow)Fragmentにより平滑化し、T4 DNA Ligase結合した後、DH5αコンピテントセルの形質転換を行い、MCSを除去したGFPプラスミドを獲得し、pAcGFPΔMCSと名づけた。
2.1.2.2 GFP遺伝子の増幅
pAcGFP−C1ベクター配列に基づき、GFPを増幅するためのプライマーを設計した。
<上流プライマー>
CMVU:ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(下線がSalI制限酵素切断サイトである)
<下流プライマー>
SV40R:ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC(下線がSph I制限酵素切断サイトである)
プラスミドpAcGFPΔMCSをテンプレートとして、以下の体系及び条件でGFP遺伝子を増幅した。
電気泳動によって目的バンドを回収し、次の結合を行った。
GFPをSal IとSph Iで二重消化した後、目的断片を回収し、同様に二重消化したpUCTKABプラスミドと結合し、DH5αコンピテントセルの形質転換を行い、モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをpUCTKA−GFP−Bと名づけた。
2.2 GFPを含む組換えウイルスの獲得
2.2.1 導入ベクターとvPRV−gI−gE−11K−28K− DNAでVero細胞を共トランスフェクションして組換えウイルスを獲得する
リポソーム法でVero細胞を共トランスフェクションし、Lipofectamine 2000(Invitrogen、型番11668030)に付属する明細書の工程によって、3μg vPRV−gI−gE−11K−28K−ウイルスゲノムDNAと5μg導入ベクターpUCTKA−GFP−Bをトランスフェクションした。37℃で5%CO2を含む培養箱に培養した。トランスフェクションしてから36〜48時間後に、細胞病変が生じて、且つ病変部に蛍光が認められたら、細胞の上澄みをP0世代組換えウイルスとして回収し、rPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−と名づけた。
2.2.2 組換えウイルスrPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−のプラークの精製
得られたP0世代組換えウイルスrPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−でVero細胞を感染した後、2%の低融点アガロースを敷き、48時間後、細胞に明らかな病変と蛍光が認められた後、緑色蛍光のプラークを選別して、−70℃で3回凍結融解した後、10倍段階希釈してVero細胞を敷いておいた6ウェルプレートに接種し、引き続いて緑色蛍光プラークを選別して精製し、プラーク精製を11循環で行って、精製された、PRV−gI−gE−11K−28K−TK−ウイルスを含んでおらず、五つの遺伝子を欠失させた組換えウイルスrPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−を得た。
Cre酵素を発現するpBS185プラスミド(addgeneから購入し、Cre酵素はホモロジーアームTKAの下流とTKBの上流の変異型loxPサイトを認識し、二つのloxpサイトの間の配列を除去する)と組換えウイルスrPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−ゲノムDNAにより、vero細胞の共トランスフェクションを行った結果、トランスフェクションしてから24時間後、比較的に明らかな病変が現れ、しかも単独な蛍光がより多かった。獲得したP0世代ウイルスを段階希釈した後、接種して、プラークを選別し、蛍光を発しないプラークを選別して、次の精製を行った。2回選別・精製して、蛍光を発しないウイルスを獲得して、PRV−gI−gE−11K−28K−TK−と名づけた。精製ウイルスゲノムDNAを抽出し、PCR同定によって、TK遺伝子が欠失され、且つGFP標識遺伝子もすでに除去されたことが分かった。GFP標識遺伝子を含まないgI−gE−11K−28K−TK−欠失ウイルスの精製が成功したことを表明した。
2.4 PRV HN1201株gI/gE/11K/28K/TK欠失ウイルス株の確認
gI/gE/11K/28K遺伝子欠失の同定プライマーは上記と同じである。
gI/gE/11K/28K/TK欠失ウイルスと野生型ウイルスのウイルスゲノムを抽出し、PCR同定を行い、プライマーは下記の通りであった。
TKDCF:cctacggcaccggcaagagca
TKDCR:cgcccagcgtcacgttgaagac
図5に示すように、野生型ウイルスで増幅したPCR産物のサイズが1566bpであり、TK欠失ウイルスで増幅したPCR断片のサイズが742bpである。
CN103756977Aの実施例1の方法を参照して、PRV HN1201 gI/gE欠失株を製造した。
豚ヘルペスウイルス抗原抗体が陰性である7日齢の子ブタ25頭を5頭/群でランダムに5群(A、B、C、Dと空白対照群)に分け、群分けと攻撃(ウィルスチャレンジ)状況を表1に示す。
5.1、ワクチンウイルスの増殖
実施例1で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K欠失株、実施例2で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株、実施例3で製造したPRV HN1201 gI/gE欠失株のウイルス種を5×104倍で希釈した後、単層に成長したST細胞へ接種し、1時間吸着した後、2%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液1000mlを混入し、37℃の温室に6回転/時間の回転速度で回転培養した。80%の細胞が病変した後、2回凍結融解し、ウイルスを獲得し、ウイルス力価を測定した。ウイルス液を低温で保存した。
5.2、保護剤の調製
100ml脱イオン水に対して、ショ糖40g、ゼラチン8gを添加し、充分に溶解した後、高圧蒸気滅菌(121℃、30min)を行った。
5.3、ワクチンウイルス混濁液の配合
5.1で製造して保存していたウイルス液と5.2で製造した保護剤を1:1(体積比)で混合し、2.6 ml/ボットルで、滅菌したアンプールに分注し、凍結乾燥した。ワクチンは細菌や外来ウイルスにより汚染されるかどうかとチェックした結果、凍結乾燥前のウイルス含有量にほぼ一致する。実施例1で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K欠失株のバッチ番号は、20140501であり、実施例2で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号は20140502であり、実施例3で製造したPRV HN1201 gI/gE欠失株バッチ番号は、20140503である。
9日齢のPRV抗原抗体が陰性である子ブタ25頭を5頭/群でランダムに5群に分け、表3に従って、実施例5で製造したワクチンを接種し、対照ワクチン群は、スペインLABORATORIOS HIPRA, S.A.製の豚ヘルペスウイルス生ワクチン(Bartha K−61株、バッチ番号:42RH)を明細書の使用量に従って使用し、空白対照群は、1ml/頭でDMEM培地を接種した。免疫してから28日後攻撃し、攻撃量がHN1201株豚ヘルペスウイルス1×107.0 TCID50/頭であり、攻撃後、毎日、子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察し(結果を表3に示す)、攻撃前、それぞれ試験群と対照群の子ブタを採血した。
それぞれ、NVDC−PRV−BJ株、NVDCPRV−HEB株とNVDC−PRV−SD株(Xiuling Yu,Zhi Zhou,Dongmei Hu,et al.Pathogenic PseudorabiesVirus,China,2012 EmergingInfectious Diseases、www.cdc.gov/eid ol.20,No.1,January 2014)(出願者は、特許審査指南の規定により、特許出願日から公衆に20年配布することを承諾する)、HN1202株(寄託番号:CCTCC NO.V 201335、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日が2013年8月26日である)をウイルス親株として、実施例1、2の方法を参照して、gI/gE/11K/28K及びgI/gE/11K/28K/TK遺伝子を欠失させて製造した弱毒株をそれぞれNVDC−PRV−BJ gI/gE/11K/28K/TK欠失株、NVDCPRV−HEB gI/gE/11K/28K/TK欠失株、NVDC−PRV−SD gI/gE/11K/28K/TK欠失株、PRVHN1202 gI/gE/11K/28K/TK欠失株と名づけ、PCRでウイルス親株と照合することにより、遺伝子欠失を証明した。
実施例5.1の方法により、実施例7で製造した各弱毒ワクチン株を増殖し、体積比1:1で保護剤(100ml脱イオン水に対してショ糖40g、ゼラチン8gを混入し、十分に溶解した後、高圧蒸気滅菌(121℃で30min)を行って得られるもの)を混入し、凍結乾燥させた。NVDC−PRV−BJ gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号がQ01であり、NVDCPRV−HEB gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号がQ02であり、NVDC−PRV−SD gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号がQ03であり、PRVHN1202 gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号がQ04である。
実施例4の方法により病原性試験を行い、実験豚を5頭/群で5群に分け、それぞれ、実施例7で製造したNVDC−PRV−BJ gI/gE/11K/28K/TK欠失株、NVDCPRV−HEB gI/gE/11K/28K/TK欠失株、NVDC−PRV−SDTK gI/gE/11K/28K/TK欠失株、PRVHN1202 gI/gE/11K/28K/TK欠失株を1ml(107.0 TCID50/ml)で点鼻接種した結果、各群の豚は何れも生存し、体温が正常し、臨床症状が出なかった。これは、TK/gE/gI/11K/28K遺伝子を欠失させことにより、変異ヘルペスウイルス株の毒性が低減したことを証明する。
実施例6の試験方法及び接種量により、実施例8で製造したワクチンに対して免疫原性試験を行い、同時に対照ワクチンである豚ヘルペスウイルス生ワクチンHB−98株(バッチ番号:1308011−1、中牧実業株式会社成都薬械厂)を接種し、免疫28日後攻撃し、攻撃量が豚ヘルペスウイルスHN1201株1×107.0 TCID50/頭であり、臨床症状と死亡状況を観察し、攻撃した後、毎日、子ブタの体温を測定して臨床症状を観察し、その結果を表6に示す。
約13日齢のPRV抗原抗体が陰性である豚15頭を使用し、体重によって、5頭/群でランダムに3群に分けた。第1群〜第3群は、それぞれ、実施例5で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッチ番号20140502)のワクチン、スペインLABORATORIOS HIPRA, S.A.製の豚オーエスキー病生ワクチン(Bartha K−61、バッチ番号66KR)とベーリンガーインゲルハイム動物保健(アメリカ)有限公司製の豚オーエスキー病生ワクチン(K−61、バッチ番号195−B59B)を、1ml/頭の免疫量(商品化ワクチンは明細書の剤量により免疫し、1頭分/頭であり;PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株は106.0 TCID50/頭である)で免疫した。免疫後8日目、10日目、12日目、14日目、21日目に採血し、血清を分離した後、gB ELISA抗体検出キットの明細書(Biochek会社、バッチ番号FS5763、有効期限:2015.01.07)に基づき、gB抗体測定を行い、詳しい検出結果を下記表7に示す。
チ番号20140502)のワクチン
註2.PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッ
チ番号20140502)のワクチン
注:判定基準:陰性S/P値≦0.499、陽性S/P値≧0.500
(結論):
抗体検出結果から分かるように、PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株で免疫してから12日後、gB抗体は全部陽性に変わったが、比較例のワクチンで免疫してから21日に、抗体はまだ全部陽性に変わっていなかった。PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株は早めに免疫保護を生じることが可能なことが証明された。
約13日齢のPRV抗原抗体が陰性である豚15頭を使用し、体重によって、5頭/群でランダムに3群に分けた。第1群〜第3群は、それぞれ、実施例5で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッチ番号20140502)のワクチン、スペインLABORATORIOS HIPRA, S.A.製の豚オーエスキー病生ワクチン(Bartha K−61、バッチ番号66KR)とベーリンガーインゲルハイム動物保健(アメリカ)有限公司製の豚オーエスキー病生ワクチン(K−61、バッチ番号195−B59B)を、1ml/頭の免疫量(商品化ワクチンは明細書の剤量により免疫し、1頭分/頭であり;本発明のPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株の免疫量は106.0 TCID50/頭である)で免疫した。免疫後21日目に攻撃し、PRV HN1201を使用して攻撃し、攻撃量が107.0 TCID50/頭、1ml/頭であり、攻撃後の7日目〜14日目毎日採血し、血清を分離した後、gE ELISA抗体検出キットの明細書(IDEXX会社、バッチ番号AK650、有効期限:2015.06.13)に基づき、gE抗体測定を行った結果、実施例5で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッチ番号20140502)のワクチン免疫群の豚は攻撃後14日目にgE抗体が依然として陰性である(S/N値が0.60以下であれば、サンプルをPRV gE抗体陽性と判定すべきである)が、商品化ワクチンで免疫した免疫群の豚は、攻撃後gE抗体が異なる程度で陽性に変わった。詳しい検出結果を下記表8に示す。
註2.PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッチ番号20140502)のワクチン
Claims (13)
- gI/gE/11K/28Kタンパク質のみを不活性化させた不活性化タンパク質を有する豚ヘルペスウイルス株である豚ヘルペスウイルス弱毒株であって、
前記豚ヘルペスウイルス株の野生株は、HN1201株(受託番号:CCTCC V201311)、又は、HN1202株(受託番号:CCTCC V201335)であることを特徴とする豚ヘルペスウイルス弱毒株。 - ゲノムにおいてgI/gE/11K/28KのORFの全長を欠失させた請求項1に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株。
- 前記豚ヘルペスウイルス弱毒株は、gEタンパク質配列がSEQ ID NO.5であり、或いは、それと95%以上の配列相同性を有するウイルス株である請求項1に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株。
- gI/gE/11K/28K/TKタンパク質のみを不活性化させた不活性化タンパク質を有する豚ヘルペスウイルス株である豚ヘルペスウイルス弱毒株であって、
前記豚ヘルペスウイルス株の野生株は、HN1201株(受託番号):CCTCC V201311)、又は、HN1202株(受託番号:CCTCC V201355)であることを特徴とする豚ヘルペスウイルス弱毒株。 - ゲノムにおいて、TKサイトのヌクレオチド配列がSEQ.NO.4のアミノ酸配列をコードして発現する請求項4に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株。
- 免疫量の請求項1〜5のいずれか1項に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株の抗原と薬学的に許容される担体を含むワクチン組成物。
- 前記豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原の含有量が106.0TCID50/頭以上である請求項6に記載のワクチン組成物。
- 前記豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原が生きている前記豚ヘルペスウイルス弱毒株であり、更に凍結乾燥保護剤が含まれる請求項6に記載のワクチン組成物。
- 更に、不活性化させた病原体或いは抗原組成成分を含む請求項6に記載のワクチン組成物。
- 前記抗原は豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原及び/又はブタパラインフルエンザ菌抗原或いは豚肺炎マイコプラズマ抗原である請求項6に記載のワクチン組成物。
- ワクチン組成物の製造方法であって、(1)請求項1〜5のいずれか一項に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株を増幅培養する工程と、(2)前記増幅培養した豚ヘルペスウイルス弱毒株に凍結乾燥保護剤を混入する工程と、を含むワクチン組成物の製造方法。
- 請求項6〜8のいずれか一項に記載のワクチン組成物の豚オーエスキー病を予防・治療する医薬品の製造への応用。
- 前記の豚オーエスキー病は請求項3に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株による豚オーエスキー病である、請求項12記載のワクチン組成物の豚オーエスキー病を予防・治療する医薬品の製造への応用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410418379.8A CN104250640A (zh) | 2014-08-22 | 2014-08-22 | 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用 |
CN201410418379.8 | 2014-08-22 | ||
PCT/CN2015/070221 WO2016026264A1 (zh) | 2014-08-22 | 2015-01-06 | 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016531545A JP2016531545A (ja) | 2016-10-13 |
JP6368725B2 true JP6368725B2 (ja) | 2018-08-01 |
Family
ID=52185894
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015563126A Active JP6368725B2 (ja) | 2014-08-22 | 2015-01-06 | 豚ヘルペスウイルス遺伝子欠失株、ワクチン組成物及びその製造方法と応用 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10548972B2 (ja) |
EP (1) | EP3012322B1 (ja) |
JP (1) | JP6368725B2 (ja) |
CN (2) | CN104250640A (ja) |
DK (1) | DK3012322T3 (ja) |
TW (1) | TW201612316A (ja) |
WO (1) | WO2016026264A1 (ja) |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104250640A (zh) | 2014-08-22 | 2014-12-31 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用 |
CN105087506B (zh) * | 2015-03-20 | 2020-06-30 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用 |
CN106282132A (zh) * | 2015-05-11 | 2017-01-04 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 伪狂犬病毒变异株的弱毒株及其应用 |
CN106310248B (zh) * | 2015-06-18 | 2019-12-20 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 猪伪狂犬病病毒活疫苗组合物用于治疗猪伪狂犬病的用途 |
CN108251382B (zh) * | 2016-12-29 | 2021-08-20 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用 |
CN107828741B (zh) * | 2017-11-07 | 2021-01-12 | 江苏省农业科学院 | 伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株及其应用 |
CN108553641A (zh) * | 2018-05-15 | 2018-09-21 | 贵州都匀市黔昌畜牧发展有限责任公司 | 一种伪狂犬病免疫方法 |
CN109337874B (zh) * | 2018-12-10 | 2020-05-12 | 畜科生物工程有限公司 | 一种重组猪伪狂犬病毒及其应用和重组猪伪狂犬病活疫苗 |
CN109609468B (zh) * | 2018-12-10 | 2020-06-30 | 畜科生物工程有限公司 | 一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法 |
CN109750005A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-05-14 | 河南农业大学 | 一种猪伪狂犬病重组病毒株及其构建方法 |
CN109750007A (zh) * | 2019-02-01 | 2019-05-14 | 华南农业大学 | 双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株及其构建和应用 |
CN110241090B (zh) * | 2019-05-07 | 2023-10-13 | 江苏南农高科技股份有限公司 | 一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法 |
CN110257345B (zh) * | 2019-07-18 | 2021-07-16 | 河南农业大学 | 一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法 |
CN110527669B (zh) * | 2019-09-06 | 2021-07-06 | 中牧实业股份有限公司 | 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株及其构建方法和应用 |
CN112831477A (zh) * | 2019-11-25 | 2021-05-25 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心) | 表达猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒Cap蛋白的重组伪狂犬病病毒株及其构建方法和用途 |
CN111154733A (zh) * | 2020-01-09 | 2020-05-15 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种伪狂犬病毒弱毒株及应用 |
CN111748529B (zh) * | 2020-06-19 | 2022-01-11 | 国药集团动物保健股份有限公司 | 猪伪狂犬病病毒毒株及其应用 |
CN112342201B (zh) * | 2020-11-04 | 2023-01-03 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种通过CRISPR/Cas9制备的猪伪狂犬病弱毒株及其应用 |
CN112501133B (zh) * | 2020-12-01 | 2022-05-24 | 山东信得科技股份有限公司 | 一种伪狂犬病毒qd株三基因缺失致弱株 |
CN115216451A (zh) * | 2021-04-16 | 2022-10-21 | 硕腾服务有限责任公司 | 伪狂犬病病毒疫苗 |
CN113444697A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-09-28 | 温氏食品集团股份有限公司 | 重组猪伪狂犬病毒及其制备方法和应用 |
CN113957171A (zh) * | 2021-10-26 | 2022-01-21 | 苏州药明检测检验有限责任公司 | 一种组织半数感染法染色测定伪狂犬病毒滴度的方法 |
CN116064557A (zh) * | 2022-09-15 | 2023-05-05 | 华中农业大学 | 激活猪的ogfod2基因表达的制剂在制备猪抗伪狂犬病毒感染药物中的应用 |
CN116790509B (zh) * | 2023-06-28 | 2024-02-02 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心) | 一种分泌抗猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株及其应用 |
CN117384863B (zh) * | 2023-10-18 | 2024-04-05 | 武汉科前生物股份有限公司 | 猪伪狂犬病病毒自然传代弱毒变异株js18-150及其应用 |
CN117126818B (zh) * | 2023-10-25 | 2024-02-02 | 江西农业大学 | 利用ABE构建gE基因缺失PRV毒株的方法和应用 |
CN117106736B (zh) * | 2023-10-25 | 2024-02-20 | 江西农业大学 | 利用cbe构建三基因缺失prv毒株的方法和应用 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE8205892D0 (sv) | 1982-10-18 | 1982-10-18 | Bror Morein | Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin |
US4514497B1 (en) | 1983-12-30 | 1998-02-24 | Novagene Inc | Modified live pseudorabies viruses |
TW289731B (ja) * | 1992-07-09 | 1996-11-01 | Akzo Nv | |
FR2781159B1 (fr) | 1998-07-06 | 2000-10-06 | Merial Sas | Vaccin circovirus et parvovirus porcin |
CN100354414C (zh) * | 2005-09-29 | 2007-12-12 | 华中农业大学 | 一种伪狂犬病gEˉ/gIˉ基因缺失毒株、含有该毒株的灭活疫苗及应用 |
CN101489589A (zh) | 2006-05-19 | 2009-07-22 | 沃尔特及伊莱萨霍尔医学研究院 | 免疫原性组合物 |
CN101186902B (zh) * | 2006-07-04 | 2010-11-10 | 四川农业大学 | 伪狂犬病病毒sa215和伪狂犬病毒多基因缺失疫苗及其制备方法 |
ME01156B (me) | 2007-12-21 | 2013-03-20 | Zoetis Services Llc | Postupci i kompozicije za imunizaciju svinja protiv svinjskog cirkovirusa |
WO2009143865A1 (en) | 2008-05-30 | 2009-12-03 | Xigen S.A. | Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases |
WO2012163258A1 (en) * | 2011-05-27 | 2012-12-06 | Sinovet (Beijing) Biotechnology Co.,Ltd | Combined vaccines for prevention of porcine virus infections |
CN102994458B (zh) | 2012-11-26 | 2014-04-02 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 猪伪狂犬病病毒强毒株、其基因缺失疫苗株及其应用 |
CN103756977B (zh) | 2013-12-11 | 2016-01-06 | 姜平 | 猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株及其应用 |
CN103627678B (zh) | 2013-12-19 | 2016-03-02 | 姜平 | 一种猪伪狂犬病病毒变异株prv-zj01及应用 |
CN105368791A (zh) * | 2014-02-21 | 2016-03-02 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用 |
CN103981153B (zh) | 2014-05-29 | 2017-07-07 | 中国兽医药品监察所 | 伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒的构建 |
CN104250640A (zh) * | 2014-08-22 | 2014-12-31 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用 |
-
2014
- 2014-08-22 CN CN201410418379.8A patent/CN104250640A/zh active Pending
-
2015
- 2015-01-06 CN CN201510004421.6A patent/CN104862286B/zh active Active
- 2015-01-06 US US14/901,981 patent/US10548972B2/en active Active
- 2015-01-06 WO PCT/CN2015/070221 patent/WO2016026264A1/zh active Application Filing
- 2015-01-06 DK DK15808317.0T patent/DK3012322T3/da active
- 2015-01-06 JP JP2015563126A patent/JP6368725B2/ja active Active
- 2015-01-06 EP EP15808317.0A patent/EP3012322B1/en active Active
- 2015-08-21 TW TW104127275A patent/TW201612316A/zh unknown
-
2016
- 2016-02-26 US US15/054,404 patent/US20160279232A1/en not_active Abandoned
- 2016-07-19 US US15/213,662 patent/US10201605B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104862286B (zh) | 2018-09-11 |
TW201612316A (en) | 2016-04-01 |
CN104250640A (zh) | 2014-12-31 |
EP3012322A4 (en) | 2016-07-20 |
US20160279232A1 (en) | 2016-09-29 |
EP3012322A1 (en) | 2016-04-27 |
WO2016026264A1 (zh) | 2016-02-25 |
US20160281065A1 (en) | 2016-09-29 |
US20160317650A1 (en) | 2016-11-03 |
DK3012322T3 (da) | 2019-10-07 |
JP2016531545A (ja) | 2016-10-13 |
CN104862286A (zh) | 2015-08-26 |
US10548972B2 (en) | 2020-02-04 |
EP3012322B1 (en) | 2019-08-28 |
US10201605B2 (en) | 2019-02-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6368725B2 (ja) | 豚ヘルペスウイルス遺伝子欠失株、ワクチン組成物及びその製造方法と応用 | |
JP6325106B2 (ja) | ヘルペスウイルス弱毒化方法及びその弱毒化ウイルス株、ワクチン組成物と応用 | |
US10240131B2 (en) | Type II pseudorabies virus attenuated strain, its preparation method and application | |
JP6236144B2 (ja) | 豚ヘルペスウイルス、ワクチン組成物及びその製造方法と応用 | |
JP6475741B2 (ja) | ヘルペスウイルスサブユニットワクチン及びその製造方法と応用 | |
CN111019910B (zh) | F基因型腮腺炎病毒减毒株及构建方法和应用 | |
CN105018433B (zh) | 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
CN110387355B (zh) | 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒株、疫苗及其制备方法和应用 | |
WO2022007742A1 (zh) | 一种重组的伪狂犬病病毒及其疫苗组合物 | |
WO2022080413A1 (ja) | ベータコロナウイルス低温馴化株及びワクチン | |
WO2022027749A1 (zh) | 耐热表型稳定遗传、携带负标记的重组口蹄疫病毒无毒株及o/a型口蹄疫二价灭活疫苗 | |
CN108251382B (zh) | 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用 | |
CN105802921B (zh) | 表达猪瘟病毒e2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株及其构建方法和应用 | |
EP3852797A1 (en) | Modified pedv spike protein | |
CN105018436B (zh) | 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
Yan et al. | Better immune efficacy triggered by the inactivated gI/gE-deleted pseudorabies virus with the additional insertion of gC gene in mice and weaned pigs | |
CN106929519B (zh) | 一种核苷酸序列、表达的蛋白、毒株及其制备的疫苗组合物和应用 | |
JP2024500225A (ja) | 安定細胞株において効率的な増殖を可能にする、アフリカ豚熱ワクチンにおけるゲノム欠失 | |
Yaru et al. | Generation of New Live Attenuated Vaccine Strains of Duck Plague Virus and Evaluation of Duck Immune Efficacy | |
MXPA99005452A (en) | Recombinant equine herpesvirus type 1 (ehv-1) comprising a dysfunctional gene 71 region and use thereof as a vaccine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160205 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160205 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20160205 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20160802 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160823 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161116 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20170110 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170510 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170517 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170523 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20170612 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170829 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171129 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180129 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171129 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180515 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180615 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180626 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180709 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6368725 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |