JP2016531545A - 豚ヘルペスウイルス遺伝子欠失株、ワクチン組成物及びその製造方法と応用 - Google Patents
豚ヘルペスウイルス遺伝子欠失株、ワクチン組成物及びその製造方法と応用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
gI/gE/11K/28Kタンパク質の不活性化は本技術分野の公知の手段を利用することがでる。その遺伝子は上記のタンパク質の機能性断片を発現するヌクレオチド配列を欠失し、その遺伝子はORF全体を欠失し、或いはその遺伝子は、一つ或いは複数のヌクレオチドを欠失、除去或いは付加することで、機能性タンパク質を正常に発現できなくなり、或いは発現されたタンパク質が本来の機能を有しておらず、または機能が極めて低いことを含む。
また、本発明の一実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株ゲノムにおいて、gI/gE/11K/28KのORFの全長を欠失させた。
本発明の一実施形態として、上記のヘルペスウイルス変異株は、gEタンパク質配列がSEQ ID NO.5であり、又は、それと95%以上の配列相同性を有するウイルス株である。好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス変異株は、分離されたものであり、上記の豚ヘルペスウイルス変異株による感染を再現する時に、従来の遺伝子欠失ヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚にも、高熱、意気消沈、食欲不振或いは絶食症状が現れるウイルス株である。より好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス変異株は、上記の豚ヘルペスウイルス変異株による感染を再現する時に、従来のgE、TK、gI遺伝子の一つ以上を欠失させたヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚は依然として豚オーエスキー病を感染し、かつ上記の豚ヘルペスウイルス変異株は9〜10日齢の子ブタに意気消沈と食欲不振をおこすウイルス株である。
また、本発明の一実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株は更にTKタンパク質を不活性化させ、好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株ゲノムにおいて、TK部位のヌクレオチド配列がSEQ.NO.4のアミノ酸配列をコードして発現する。
本発明の好ましい実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株ゲノムにおいて、TK部位のヌクレオチド配列がSEQ.NO.3のヌクレオチド配列である。
また、本発明の好ましい実施形態として、本発明はgI/gE/11K/28K/TK遺伝子を欠失させるヘルペスウイルス遺伝子工学的弱毒株を提供する。
「gEタンパク質」という用語は、US8によってコードされ、577個のアミノ酸を含み、ORFが123502〜125235の間に位置することを意味する。
「11K」という用語は、US9によってコードされ、98個のアミノ酸を含み、ORFが125293〜125589の間に位置することを意味する。
「28K」という用語は、US2によってコードされ、256個のアミノ酸を含み、ORFが125811〜126581の間に位置することを意味する。
「TK」という用語は、「チミジンキナーゼ」とも呼ばれ、UL23によってコードされ、320個のアミノ酸を含み、ORFが59512〜60474の間に位置することを意味する。
本発明の「gI/gE/11K/28K」及び「gI/gE/11K/28K/TK」という用語は、gI、gE、11K及び28Kを意味し、その記号「/」は本発明において「及び」という意味であり、たとえば「gI/gE/11K/28Kタンパク質を不活性化させる」とは、gI、gE、11K、28Kの四つのタンパク質を全て失活させることを意味する。
特に記載しない限り、本発明の「PRV−gI−gE−11K−28K−TK−」という用語は、gI、gE、11K、28K遺伝子を欠失させることを意味する。
本発明の好ましい実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株は、gI/gE/11K/28Kを欠失させたHN1201株、HN1202株、JS−2012株、豚ヘルペスウイルスHeN1株、NVDC−PRV−BJ株、NVDCPRV−HEB株或いはNVDC−PRV−SD株を含む。
本発明の好ましい実施形態として、上記のヘルペスウイルス弱毒株は、遺伝子工学によってgI/gE/11K/28K遺伝子を欠失させる豚ヘルペスウイルスHN1201株(Pseudorabies virus,strain HN1201)であり、当該豚ヘルペスウイルスHN1201株の受託番号がCCTCC NO.V 201311であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は2013年5月20日である。
本発明の他の一態様は、免疫量の上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原とベクターを含み、好ましくは、豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原の含有量>106.0TCID50/頭であるワクチン組成物に関する。
本発明の好ましい実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原が生きている上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株であり、上記のワクチン組成物は更に凍結乾燥保護剤を含む。
本発明の実施形態として、上記のワクチン組成物は、免疫量の上記のgI/gE/11K/28K遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株変異株の弱毒化ワクチンとベクターを含む。
本発明の好ましい実施形態として、上記のワクチン組成物は、免疫量の上記のgI/gE/11K/28K/TK遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株変異株の弱毒化ワクチンとベクターを含む。
本発明の好ましい実施形態として、上記のワクチン組成物は、免疫量の上記のgI/gE/11K/28K/TK遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株変異株HN1201株、HN1202株、JS−2012株、豚ヘルペスウイルスHeN1株、NVDC−PRV−BJ株、NVDCPRV−HEB株或いはNVDC−PRV−SD株、PRV TJ株或いはPRV−ZJ01株の弱毒化ワクチンとベクターを含む。
好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原が生きている豚ヘルペスウイルス弱毒株であり、上記のワクチン組成物は更に凍結乾燥保護剤を含む。
本発明の一実施形態として、上記のワクチン組成物は、gI/gE/11K/28K遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株の生きている弱毒化ワクチンである。
従って、好ましい実施形態においては、本発明に係る生きている弱毒化ワクチンはアジュバントを含む。
本発明に用いられる薬学的に許容される担体又は希釈剤の他の具体例には、SPGA、糖類(例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン)、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳などのタンパク質含有物質及びバッファー(例えば、リン酸バッファー)などの安定化剤を含む。
特にこのような安定化剤をワクチンに混入する時に、ワクチンは冷凍乾燥に非常に適する。従って、より好ましい実施形態において、生きている弱毒化ワクチンは冷凍乾燥品である。
本発明の一実施形態として、上記のワクチンは、更に、不活性化させた病原体或いは抗原組成成分を含み、好ましくは、上記の抗原は豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原及び/又はブタパラインフルエンザ菌抗原或いは豚肺炎マイコプラズマ抗原である。
好ましくは、上記のワクチン組成物は更に、媒体、アジュバント、賦形剤を含有する。
本発明に係わるワクチン組成物は、媒体、アジュバント及び/又は賦形剤をさらに含有してもよい。生理食塩水或いは蒸留水を媒体として使用できる。
本発明の他の一形態は、豚オーエスキー病を予防・治療する、上記のワクチン組成物の医薬品の製造への応用に関する。
本発明の一実施形態として、上記の豚オーエスキー病は豚ヘルペスウイルス変異株による豚オーエスキー病である。
本文に用いられる「豚ヘルペスウイルスに起因する疾病」という用語は、以下の症状を示す意味として用いられることがあり、即ち、どんな年齢の豚でも感染することがある。豚群において水平伝播可能であり、潜伏期間が短く(1〜2日)、発病率は10%〜100%の範囲であり、発病した豚の死亡率は10%〜100%の範囲であり(子豚の死亡率は100%と高い)、感染した豚は、高熱(40〜42℃、3日以上続く)、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、最後に消耗により死に至る。また、種雄豚では精液の質が低下し、妊娠する母豚では流産(35%と高い)、早産、死産、弱い子豚産出(弱い子豚が14日齢になる前に全部死亡)するなどの生殖障害症状が出るが、それに限定されない。
本文に用いられる用語「予防」とは本発明のワクチン組成物を投与することで、豚ヘルペスウイルスの感染を抑制し、又は発病を遅延させるいずれの行為である。「治療」という用語とは、本発明に係るワクチン組成物を投与することで、豚ヘルペスウイルス感染による症状を緩和し又は良くするいずれの行為である。
本発明における用語「頭分」とは、豚に対して1頭当たりのワクチン注射量である。
本発明に記載されている「TCID50」(50%tissue culture infective dose)は、細胞培養物の50%を感染させることができるウイルス量であり、ウイルス感染力を表す方式の一つである。
MEM液体培地(液)はアメリカLife Technologies会社から購入したMEM乾燥粉末培地を用いて、明細書により調製したものである。
本発明のDMEM培地は、GB/T18641−2002付録Aの調製方法により調製したものである。
本発明に記載される「PBS」とはリン酸塩緩衝液(Phosphate Buffer Saline)の英語イニシャルであり、本発明では、0.01mM PBS(pH 7.4)を用い、《分子クローン》第三版により調製された。
本実施例に用いられる豚ヘルペスウイルスHN1202株(Pseudorabies virus,strain HN1202)は、受託番号がCCTCC NO.V 201335であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日が2013年8月26日である。
PRVは豚ヘルペスウイルス(Pseudorabies virus)の英語の略語である。
以下の具体的な実施形態において、それぞれ、豚ヘルペスウイルス変異株PRV HN1201株、NVDC−PRV−BJ株、NVDCPRV−HEB株とNVDC−PRV−SD株、HN1202株を例として本発明を説明する。
1.1PRV HN1201GFP組換えウイルス導入ベクターの構築
欠失しようとするUSセグメント(gI/gE/11K/28K)の配列によって、その両端にそれぞれホモロジーアーム、即ちUSAとUSBを設計した。USAとUSBをpUC19ベクターにクローンして、pUCUSABと名づけた。次に、GFP遺伝子をpUCUSABにクローンして、組換えウイルス導入ベクターを獲得して、pUCUSA−GFP−Bと名づけた。導入ベクターにおいて、ホモロジーアームはUS両側の配列であるため、組換えて得られた組換えウイルスはgI/gE/11K/28KのUSセグメントを欠失した。組換え導入ベクター構築の概略図を図1に示し、図2はゲノム上のUSAとUSBホモロジーアームの位置を示す。
1.1.1.1プライマーの設計とテンプレートの制作
HN1201ウイルスの遺伝子配列によって、二対のプライマーを設計し、欠失セグメントの両側のホモロジーアームを増幅した。
左側のホモロジーアームUSAの上下流のプライマーは、それぞれ
USAF:CCGGAATTCTCGTCGTGGGCATCGTCATCAT(下線がEcoR I制限酵素切断サイトである)、
USAR:CTATCTAGAataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatCGGTACTGCGGAGGCTACGGAC(下線がXba I制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがloxpサイトである)である。
右側のホモロジーアームUSBの上下流のプライマーは、それぞれ
USBF:ACATGCATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatACGGCAGGATCTCTCCGCGTCCC(下線がSphI制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがloxpサイトである)、
USBR:CCCAAGCTTAGGAGGGGGCGGGGAGCGCGAGC(下線がHind III制限酵素切断サイトである)である。
PRV HN1201でvero細胞を感染し、細胞の80%以上が病変を認められた後、上澄みの一部を取り、Geneaid Viral Nucleic Acid Extractionキットを利用して、ウイルスゲノムDNAを抽出し、ホモロジーアームを増幅するためのテンプレートとする。
TAKARAのPrimeSTARを利用して、PCRを行って、以下の体系及び条件でUSA、USBを増幅させた。
PCRにより増幅されたUSAとUSB断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した後、ゲル回収キット(天根社製)を使用して目的断片を回収した。USA断片とpUC19ベクターをそれぞれEcoR IとXbaIで二重消化(double digestion)した後、目的断片を回収し、T4 DNA リガーゼ結合した後、DH5αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、37℃で一晩培養する。モノクローナルを選別し、酵素消化によって正確であると勘定したプラスミドをpUCUSAと名づけた。pUCUSAとUSBをそれぞれ SalIとHindIIIで二重消化した後、目的断片を回収し、T4 DNA リガーゼ結合した後、DH5αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、37℃で一晩培養した。モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをpUCUSABと名づけた。
1.1.2.1 GFPベクターpAcGFP−C1マルチプルクローニングサイトの除去
pAcGFP−C1プラスミド(Clontechから購入し、型番632470)をBgl IIとSma Iで二重消化した後、線状化されたベクターを回収し、DNA Polymerase I Large(Klenow)Fragmentにより平滑化し、T4 DNA Ligase結合した後、DH5αコンピテントセルの形質転換を行い、MCSを除去したGFPプラスミドを獲得し、pAcGFPΔMCSと名づけた。
1.1.2.2 GFP遺伝子の増幅
pAcGFP−C1ベクター配列に基づき、GFPを増幅するためのプライマーを設計した。
<上流プライマー>
CMVU:ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(下線がSalI制限酵素切断サイトである)
<下流プライマー>
SV40R:ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC(下線がSph I制限酵素切断サイトである)
プラスミドpAcGFPΔMCSをテンプレートとして、以下の体系及び条件でGFP遺伝子を増幅した。
電気泳動によって目的バンドを回収し、次の結合を行った。
GFPをSal IとSph Iで二重消化した後、目的断片を回収し、同様に二重消化したpUCRRABプラスミドと結合し、DH5αコンピテントセルの形質転換を行い、モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをpUCUSA−GFP−Bと名づけた。
1.2 GFPを含む組換えウイルスの獲得
1.2.1 導入ベクターとHN1201 DNAでVero細胞を共トランスフェクションして組換えウイルスを獲得する
リポソーム法でVero細胞を共トランスフェクションし、Lipofectamine 2000(Invitrogen、型番11668030)に付属する明細書の工程によって、3ug PRV−HN1201ウイルスゲノムDNAと5ug導入ベクターpUCUSA−GFP−Bをトランスフェクションした。37℃で5%CO2を含む培養箱に培養した。トランスフェクションしてから36〜48時間後に、細胞病変が生じて、且つ病変部に蛍光が認められたら、細胞の上澄みをP0世代組換えウイルスとして回収し、rPRV−GFP−US−と名づけた。
1.2.2 組換えウイルスのプラークの精製
得られたP0世代組換えウイルスrPRV−GFP−US−でVero細胞を感染した後、2%の低融点アガロースを敷き、48時間後、細胞に明らかな病変と蛍光が認められた後、緑色蛍光のプラークを選別して、−70℃で3回凍結融解した後、10倍段階希釈してVero細胞を敷いておいた6ウェルプレートに接種し、引き続いて緑色蛍光プラークを選別して精製し、プラーク精製を8循環で行って、精製された野生型ウイルスHN1201を含まないgI/gE/US9/US2欠失の組換えウイルスrPRV−GFP−US−を得た。
Cre酵素を発現するpBS185プラスミド(addgeneから購入し、Cre酵素はホモロジーアームUSA下流とUSB上流のloxPサイトを認識し、二つのloxpサイトの間の配列を除去する)と組換えウイルスrPRV−GFP−US−ゲノムDNAにより、vero細胞の共トランスフェクションを行った結果、トランスフェクションしてから24時間後、比較的に明らかな病変が現れ、しかも単独な蛍光がより多かった。獲得したP0世代ウイルスを段階希釈した後、接種して、プラークを選別し、蛍光を発しないプラークを選別して、次の精製を行った。2回選別・精製して、蛍光を発しないウイルスを獲得して、vPRV−US−と名づけた。精製ウイルスゲノムDNAを抽出し、PCR同定によって、gI/gE/US9/US2セグメントが欠失され、且つGFP標識遺伝子もすでに除去されたことが分かった。GFP標識遺伝子を含まないgI/gE/US9/US2セグメント欠失ウイルスの精製が成功したことを明らかにした。
1.4 PRV HN1201株USセグメント欠失ウイルス株の確認
gI/gE/US9/US2セグメント欠失ウイルスと野生型ウイルスのウイルスゲノムを抽出し、PCR同定を行い、プライマーは下記の通りであった。
USDCF:TACATCGTCGTGCTCGTCTTTGGC
USDCR:AGCTCGTGCGTCTCGGTGGTG
野生型ウイルスで増幅したPCR産物のサイズが6286bpであり、gI/gE/U S9/US2セグメント欠失ウイルスで増幅したPCR断片のサイズが1960bpであった。
PCR実験の結果から、gI/gE/US9/US2セグメントORFをすでに完全に欠失させたことを証明した。
2.1 PRV HN1201 GFP組換えウイルス導入ベクターの構築
欠失しようとするTK遺伝子の配列によって、その両端にそれぞれホモロジーアーム、即ちTKAとTKBを設計した。TKAとTKBをpUC19ベクターにクローンして、pUCTKABと名づけた。次に、GFP遺伝子をpUCTKABにクローンして、組換えウイルス導入ベクターを獲得し、pUCTKA−GFP−Bと名づけた。導入ベクターにおいて、ホモロジーアームはTK両側の配列であるため、組換えて得られた組換えウイルスはTK遺伝子を欠失した。組換え導入ベクター構築の概略図を図1に示し、図2はゲノム上のTKAとTKBホモロジーアームの位置を示す。
2.1.1.1 プライマーの設計とテンプレートの製造
HN1201ウイルスの遺伝子配列によって、二対のプライマーを設計し、TK遺伝子の両側のホモロジーアームを増幅した。
左側のホモロジーアームTKAの上下流のプライマーは、それぞれ
TKAF: CCGGAATTCGTAGTGCCGGTTGCCCACGTACA(下線がEcoR I制限酵素切断サイトである)
TKAR:CTAGTCTAGAataacttcgtatagtacacattatacgaagttatCGCTCAGGCTGCCGTTCTGC(下線がXba I制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがloxpサイトである)である。
右側のホモロジーアームTKBの上下流のプライマーは、それぞれ
TKBF:ACATGCATGCataacttcgtataatgtgtactatacgaagttatAACGACGACGGCGTGGGAGG(下線がSph I制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがloxpサイトである)
TKBR:CCCAAGCTTAGGGCGACGGCGAAGAAGAGC(下線がHind III制限酵素切断サイトである)である。
PRV HN1201でvero細胞を感染し、細胞の80%以上が病変を認められた後、上澄みの一部を取り、Geneaid Viral Nucleic Acid Extractionキットを利用して、ウイルスゲノムDNAを抽出し、ホモロジーアームを増幅するためのテンプレートとする。
TAKARAのPrimeSTARを利用して、PCRを行って、以下の体系及び条件でTKA、TKBを増幅させた。
PCRにより増幅されたTKAとTKB断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した後、ゲル回収キット(天根社製)を使用して目的断片を回収する。TKA断片とpUC19ベクターをそれぞれEcoR IとXbaIで二重消化した後、目的断片を回収し、T4 DNA リガーゼ結合した後、DH5αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、37℃で一晩培養した。モノクローナルを選別し、酵素消化によって正確であると勘定したプラスミドをpUCTKAと名づけた。pUCTKAとTKBをそれぞれ SalIとHindIIIで二重消化した後、目的断片を回収し、T4 DNA リガーゼ結合した後、DH5αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、37℃で一晩培養した。モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをpUCTKABと名づけた。
2.1.2.1 GFPベクターpAcGFP−C1マルチプルクローニングサイトの除去
pAcGFP−C1プラスミド(Clontechから購入し、型番632470)をBgl IIとSma Iで二重消化した後、線状化されたベクターを回収し、DNA Polymerase I Large(Klenow)Fragmentにより平滑化し、T4 DNA Ligase結合した後、DH5αコンピテントセルの形質転換を行い、MCSを除去したGFPプラスミドを獲得し、pAcGFPΔMCSと名づけた。
2.1.2.2 GFP遺伝子の増幅
pAcGFP−C1ベクター配列に基づき、GFPを増幅するためのプライマーを設計した。
<上流プライマー>
CMVU:ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(下線がSalI制限酵素切断サイトである)
<下流プライマー>
SV40R:ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC(下線がSph I制限酵素切断サイトである)
プラスミドpAcGFPΔMCSをテンプレートとして、以下の体系及び条件でGFP遺伝子を増幅した。
電気泳動によって目的バンドを回収し、次の結合を行った。
GFPをSal IとSph Iで二重消化した後、目的断片を回収し、同様に二重消化したpUCTKABプラスミドと結合し、DH5αコンピテントセルの形質転換を行い、モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをpUCTKA−GFP−Bと名づけた。
2.2 GFPを含む組換えウイルスの獲得
2.2.1 導入ベクターとvPRV−gI−gE−11K−28K− DNAでVero細胞を共トランスフェクションして組換えウイルスを獲得する
リポソーム法でVero細胞を共トランスフェクションし、Lipofectamine 2000(Invitrogen、型番11668030)に付属する明細書の工程によって、3μg vPRV−gI−gE−11K−28K−ウイルスゲノムDNAと5μg導入ベクターpUCTKA−GFP−Bをトランスフェクションした。37℃で5%CO2を含む培養箱に培養した。トランスフェクションしてから36〜48時間後に、細胞病変が生じて、且つ病変部に蛍光が認められたら、細胞の上澄みをP0世代組換えウイルスとして回収し、rPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−と名づけた。
2.2.2 組換えウイルスrPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−のプラークの精製
得られたP0世代組換えウイルスrPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−でVero細胞を感染した後、2%の低融点アガロースを敷き、48時間後、細胞に明らかな病変と蛍光が認められた後、緑色蛍光のプラークを選別して、−70℃で3回凍結融解した後、10倍段階希釈してVero細胞を敷いておいた6ウェルプレートに接種し、引き続いて緑色蛍光プラークを選別して精製し、プラーク精製を11循環で行って、精製された、PRV−gI−gE−11K−28K−ウイルスを含んでおらず、四つの遺伝子を欠失させた組換えウイルスrPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−を得た。
Cre酵素を発現するpBS185プラスミド(addgeneから購入し、Cre酵素はホモロジーアームTKAの下流とTKBの上流の変異型loxPサイトを認識し、二つのloxpサイトの間の配列を除去する)と組換えウイルスrPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−ゲノムDNAにより、vero細胞の共トランスフェクションを行った結果、トランスフェクションしてから24時間後、比較的に明らかな病変が現れ、しかも単独な蛍光がより多かった。獲得したP0世代ウイルスを段階希釈した後、接種して、プラークを選別し、蛍光を発しないプラークを選別して、次の精製を行った。2回選別・精製して、蛍光を発しないウイルスを獲得して、PRV−gI−gE−11K−28K−TK−と名づけた。精製ウイルスゲノムDNAを抽出し、PCR同定によって、TK遺伝子が欠失され、且つGFP標識遺伝子もすでに除去されたことが分かった。GFP標識遺伝子を含まないgI−gE−11K−28K−TK−欠失ウイルスの精製が成功したことを表明した。
2.4 PRV HN1201株gE/gI/11K/28K/TK欠失ウイルス株の確認
gE/gI/11K/28K遺伝子欠失の同定プライマーは上記と同じである。
gE/gI/11K/28K/TK欠失ウイルスと野生型ウイルスのウイルスゲノムを抽出し、PCR同定を行い、プライマーは下記の通りであった。
TKDCF:cctacggcaccggcaagagca
TKDCR:cgcccagcgtcacgttgaagac
図5に示すように、野生型ウイルスで増幅したPCR産物のサイズが1566bpであり、TK欠失ウイルスで増幅したPCR断片のサイズが742bpである。
CN103756977Aの実施例1の方法を参照して、PRV HN1201 gI/gE欠失株を製造した。
豚ヘルペスウイルス抗原抗体が陰性である7日齢の子ブタ25頭を5頭/群でランダムに5群(A、B、C、Dと空白対照群)に分け、群分けと攻撃(ウィルスチャレンジ)状況を表1に示す。
5.1、ワクチンウイルスの増殖
実施例1で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K欠失株、実施例2で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株、実施例3で製造したPRV HN1201 gI/gE欠失株のウイルス種を5×104倍で希釈した後、単層に成長したST細胞へ接種し、1時間吸着した後、2%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液1000mlを混入し、37℃の温室に6回転/時間の回転速度で回転培養した。80%の細胞が病変した後、2回凍結融解し、ウイルスを獲得し、ウイルス力価を測定した。ウイルス液を低温で保存した。
5.2、保護剤の調製
100ml脱イオン水に対して、ショ糖40g、ゼラチン8gを添加し、充分に溶解した後、高圧蒸気滅菌(121℃、30min)を行った。
5.3、ワクチンウイルス混濁液の配合
5.1で製造して保存していたウイルス液と5.2で製造した保護剤を1:1(体積比)で混合し、2.6 ml/ボットルで、滅菌したアンプールに分注し、凍結乾燥した。ワクチンは細菌や外来ウイルスにより汚染されるかどうかとチェックした結果、凍結乾燥前のウイルス含有量にほぼ一致する。実施例1で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K欠失株のバッチ番号は、20140501であり、実施例2で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号は20140502であり、実施例3で製造したPRV HN1201 gE/gI欠失株バッチ番号は、20140503である。
9日齢のPRV抗原抗体が陰性である子ブタ25頭を5頭/群でランダムに5群に分け、表3に従って、実施例5で製造したワクチンを接種し、対照ワクチン群は、スペインLABORATORIOS HIPRA, S.A.製の豚ヘルペスウイルス生ワクチン(Bartha K−61株、バッチ番号:42RH)を明細書の使用量に従って使用し、対照群は、1ml/頭でDMEM培地を接種した。免疫してから28日後攻撃し、攻撃量がHN1201株豚ヘルペスウイルス1×107.0 TCID50/頭であり、攻撃後、毎日、子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察し(結果を表3に示す)、攻撃前、それぞれ試験群と対照群の子ブタを採血した。
それぞれ、NVDC−PRV−BJ株、NVDCPRV−HEB株とNVDC−PRV−SD株(Xiuling Yu,Zhi Zhou,Dongmei Hu,et al.Pathogenic PseudorabiesVirus,China,2012 EmergingInfectious Diseases、www.cdc.gov/eid ol.20,No.1,January 2014)(出願者は、特許審査指南の規定により、特許出願日から公衆に20年配布することを承諾する)、HN1202株(寄託番号:CCTCC NO.V 201335、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日が2013年8月26日である)をウイルス親株として、実施例1、2の方法を参照して、gI/gE/11K/28K及びgI/gE/11K/28K/TK遺伝子を欠失させて製造した弱毒株をそれぞれNVDC−PRV−BJ gI/gE/11K/28K/TK欠失株、NVDCPRV−HEB gI/gE/11K/28K/TK欠失株、NVDC−PRV−SD gI/gE/11K/28K/TK欠失株、PRVHN1202 gI/gE/11K/28K/TK欠失株と名づけ、PCRでウイルス親株と照合することにより、遺伝子欠失を証明した。
実施例5.1の方法により、実施例7で製造した各弱毒ワクチン株を増殖し、体積比1:1で保護剤(100ml脱イオン水に対してショ糖40g、ゼラチン8gを混入し、十分に溶解した後、高圧蒸気滅菌(121℃で30min)を行って得られるもの)を混入し、凍結乾燥させた。NVDC−PRV−BJ gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号がQ01であり、NVDCPRV−HEB gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号がQ02であり、NVDC−PRV−SD gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号がQ03であり、PRVHN1202 gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号がQ04である。
実施例4の方法により病原性試験を行い、実験豚を5頭/群で5群に分け、それぞれ、実施例7で製造したNVDC−PRV−BJ gI/gE/11K/28K/TK欠失株、NVDCPRV−HEB gI/gE/11K/28K/TK欠失株、NVDC−PRV−SDTK gI/gE/11K/28K/TK欠失株、PRVHN1202 gI/gE/11K/28K/TK欠失株を1ml(107.0 TCID50/ml)で点鼻接種した結果、各群の豚は何れも生存し、体温が正常し、臨床症状が出なかった。これは、TK/gE/gI/11K/28K遺伝子を欠失させことにより、変異ヘルペスウイルス株の毒性が低減したことを証明する。
実施例6の試験方法及び接種量により、実施例8で製造したワクチンに対して免疫原性試験を行い、同時に対照ワクチンである豚ヘルペスウイルス生ワクチンHB−98株(バッチ番号:1308011−1、中牧実業株式会社成都薬械厂)を接種し、免疫28日後攻撃し、攻撃量が豚ヘルペスウイルスHN1201株1×107.0 TCID50/頭であり、臨床症状と死亡状況を観察し、攻撃した後、毎日、子ブタの体温を測定して臨床症状を観察し、その結果を表6に示す。
約13日齢のPRV抗原抗体が陰性である豚15頭を使用し、体重によって、5頭/群でランダムに3群に分けた。第1群〜第3群は、それぞれ、実施例5で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッチ番号20140502)のワクチン、スペインLABORATORIOS HIPRA, S.A.製の豚オーエスキー病生ワクチン(Bartha K−61、バッチ番号66KR)とベーリンガーインゲルハイム動物保健(アメリカ)有限公司製の豚オーエスキー病生ワクチン(K−61、バッチ番号195−B59B)を、1ml/頭の免疫量(商品化ワクチンは明細書の剤量により免疫し、1頭分/頭であり;PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株は106.0 TCID50/頭である)で免疫した。免疫後8日目、10日目、12日目、14日目、21日目に採血し、血清を分離した後、gB ELISA抗体検出キットの明細書(Biochek会社、バッチ番号FS5763、有効期限:2015.01.07)に基づき、gB抗体測定を行い、詳しい検出結果を下記表7に示す。
チ番号20140502)のワクチン
註2.PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッチ番号20140502)のワクチン
注:判定基準:陰性S/P値≦0.499、陽性S/P値≧0.500
(結論):
抗体検出結果から分かるように、PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株で免疫してから12日後、gB抗体は全部陽性に変わったが、比較例のワクチンで免疫してから21日に、抗体はまだ全部陽性に変わっていなかった。PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株は早めに免疫保護を生じることが可能なことが証明された。
約13日齢のPRV抗原抗体が陰性である豚15頭を使用し、体重によって、5頭/群でランダムに3群に分けた。第1群〜第3群は、それぞれ、実施例5で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッチ番号20140502)のワクチン、スペインLABORATORIOS HIPRA, S.A.製の豚オーエスキー病生ワクチン(Bartha K−61、バッチ番号66KR)とベーリンガーインゲルハイム動物保健(アメリカ)有限公司製の豚オーエスキー病生ワクチン(K−61、バッチ番号195−B59B)を、1ml/頭の免疫量(商品化ワクチンは明細書の剤量により免疫し、1頭分/頭であり;本発明のPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株の免疫量は106.0 TCID50/頭である)で免疫した。免疫後21日目に攻撃し、PRV HN1201を使用して攻撃し、攻撃量が107.0 TCID50/頭、1ml/頭であり、攻撃後の7日目〜14日目毎日採血し、血清を分離した後、gE ELISA抗体検出キットの明細書(IDEXX会社、バッチ番号AK650、有効期限:2015.06.13)に基づき、gE抗体測定を行った結果、実施例5で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッチ番号20140502)のワクチン免疫群の豚は攻撃後14日目にgE抗体が依然として陰性である(S/N値が0.60以下であれば、サンプルをPRV gE抗体陽性と判定すべきである)が、商品化ワクチンで免疫した免疫群の豚は、攻撃後gE抗体が異なる程度で陽性に変わった。詳しい検出結果を下記表8に示す。
註2.PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッチ番号20140502)のワクチン
gI/gE/11K/28Kタンパク質の不活性化は本技術分野の公知の手段を利用することがでる。その遺伝子は上記のタンパク質の機能性断片を発現するヌクレオチド配列を欠失し、その遺伝子はORF全体を欠失し、或いはその遺伝子は、一つ或いは複数のヌクレオチドを欠失、除去或いは付加することで、機能性タンパク質を正常に発現できなくなり、或いは発現されたタンパク質が本来の機能を有しておらず、または機能が極めて低いことを含む。
また、本発明の一実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株ゲノムにおいて、gI/gE/11K/28KのORFの全長を欠失させた。
本発明の一実施形態として、上記のヘルペスウイルス変異株は、gEタンパク質配列がSEQ ID NO.5であり、又は、それと95%以上の配列相同性を有するウイルス株である。好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス変異株は、分離されたものであり、上記の豚ヘルペスウイルス変異株による感染を再現する時に、従来の遺伝子欠失ヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚にも、高熱、意気消沈、食欲不振或いは絶食症状が現れるウイルス株である。より好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス変異株は、上記の豚ヘルペスウイルス変異株による感染を再現する時に、従来のgE、TK、gI遺伝子の一つ以上を欠失させたヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚は依然として豚オーエスキー病を感染し、かつ上記の豚ヘルペスウイルス変異株は9〜10日齢の子ブタに意気消沈と食欲不振をおこすウイルス株である。
また、本発明の一実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株は更にTKタンパク質を不活性化させ、好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株ゲノムにおいて、TK部位のヌクレオチド配列がSEQ.NO.4のアミノ酸配列をコードして発現する。
本発明の好ましい実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株ゲノムにおいて、TK部位のヌクレオチド配列がSEQ.NO.3のヌクレオチド配列である。
また、本発明の好ましい実施形態として、本発明はgI/gE/11K/28K/TK遺伝子を欠失させるヘルペスウイルス遺伝子工学的弱毒株を提供する。
「gEタンパク質」という用語は、US8によってコードされ、577個のアミノ酸を含み、ORFが123502〜125235の間に位置することを意味する。
「11K」という用語は、US9によってコードされ、98個のアミノ酸を含み、ORFが125293〜125589の間に位置することを意味する。
「28K」という用語は、US2によってコードされ、256個のアミノ酸を含み、ORFが125811〜126581の間に位置することを意味する。
「TK」という用語は、「チミジンキナーゼ」とも呼ばれ、UL23によってコードされ、320個のアミノ酸を含み、ORFが59512〜60474の間に位置することを意味する。
本発明の「gI/gE/11K/28K」及び「gI/gE/11K/28K/TK」という用語は、それぞれ「gI、gE、11K及び28K」および「gI、gE、11K、28KおよびTK」を意味し、その記号「/」は本発明において「及び」という意味であり、たとえば「gI/gE/11K/28Kタンパク質を不活性化させる」とは、gI、gE、11K、28Kの四つのタンパク質を全て失活させることを意味する。
特に記載しない限り、本発明の「PRV−gI−gE−11K−28K−TK−」という用語は、gI、gE、11K、28KおよびTK遺伝子を欠失させることを意味する。
本発明の好ましい実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株は、gI/gE/11K/28Kを欠失させたHN1201株、HN1202株、JS−2012株、豚ヘルペスウイルスHeN1株、NVDC−PRV−BJ株、NVDCPRV−HEB株或いはNVDC−PRV−SD株を含む。
本発明の好ましい実施形態として、上記のヘルペスウイルス弱毒株は、遺伝子工学によってgI/gE/11K/28K遺伝子を欠失させる豚ヘルペスウイルスHN1201株(Pseudorabies virus,strain HN1201)であり、当該豚ヘルペスウイルスHN1201株の受託番号がCCTCC NO.V 201311であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は2013年5月20日である。
本発明の他の一態様は、免疫量の上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原とベクターを含み、好ましくは、豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原の含有量>106.0TCID50/頭であるワクチン組成物に関する。
本発明の好ましい実施形態として、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原が生きている上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株であり、上記のワクチン組成物は更に凍結乾燥保護剤を含む。
本発明の実施形態として、上記のワクチン組成物は、免疫量の上記のgI/gE/11K/28K遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株変異株の弱毒化ワクチンとベクターを含む。
本発明の好ましい実施形態として、上記のワクチン組成物は、免疫量の上記のgI/gE/11K/28K/TK遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株変異株の弱毒化ワクチンとベクターを含む。
本発明の好ましい実施形態として、上記のワクチン組成物は、免疫量の上記のgI/gE/11K/28K/TK遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株変異株HN1201株、HN1202株、JS−2012株、豚ヘルペスウイルスHeN1株、NVDC−PRV−BJ株、NVDCPRV−HEB株或いはNVDC−PRV−SD株、PRV TJ株或いはPRV−ZJ01株の弱毒化ワクチンとベクターを含む。
好ましくは、上記の豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原が生きている豚ヘルペスウイルス弱毒株であり、上記のワクチン組成物は更に凍結乾燥保護剤を含む。
本発明の一実施形態として、上記のワクチン組成物は、gI/gE/11K/28K遺伝子を欠失させた豚ヘルペスウイルス株の生きている弱毒化ワクチンである。
従って、好ましい実施形態においては、本発明に係る生きている弱毒化ワクチンはアジュバントを含む。
本発明に用いられる薬学的に許容される担体又は希釈剤の他の具体例には、SPGA、糖類(例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン)、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳などのタンパク質含有物質及びバッファー(例えば、リン酸バッファー)などの安定化剤を含む。
特にこのような安定化剤をワクチンに混入する時に、ワクチンは冷凍乾燥に非常に適する。従って、より好ましい実施形態において、生きている弱毒化ワクチンは冷凍乾燥品である。
本発明の一実施形態として、上記のワクチンは、更に、不活性化させた病原体或いは抗原組成成分を含み、好ましくは、上記の抗原は豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原及び/又はブタパラインフルエンザ菌抗原或いは豚肺炎マイコプラズマ抗原である。
好ましくは、上記のワクチン組成物は更に、媒体、アジュバント、賦形剤を含有する。
本発明に係わるワクチン組成物は、媒体、アジュバント及び/又は賦形剤をさらに含有してもよい。生理食塩水或いは蒸留水を媒体として使用できる。
本発明の他の一形態は、豚オーエスキー病を予防・治療する、上記のワクチン組成物の医薬品の製造への応用に関する。
本発明の一実施形態として、上記の豚オーエスキー病は豚ヘルペスウイルス変異株による豚オーエスキー病である。
本文に用いられる「豚ヘルペスウイルスに起因する疾病」という用語は、以下の症状を示す意味として用いられることがあり、即ち、どんな年齢の豚でも感染することがある。豚群において水平伝播可能であり、潜伏期間が短く(1〜2日)、発病率は10%〜100%の範囲であり、発病した豚の死亡率は10%〜100%の範囲であり(子豚の死亡率は100%と高い)、感染した豚は、高熱(40〜42℃、3日以上続く)、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、最後に消耗により死に至る。また、種雄豚では精液の質が低下し、妊娠する母豚では流産(35%と高い)、早産、死産、弱い子豚産出(弱い子豚が14日齢になる前に全部死亡)するなどの生殖障害症状が出るが、それに限定されない。
本文に用いられる用語「予防」とは本発明のワクチン組成物を投与することで、豚ヘルペスウイルスの感染を抑制し、又は発病を遅延させるいずれの行為である。「治療」という用語とは、本発明に係るワクチン組成物を投与することで、豚ヘルペスウイルス感染による症状を緩和し又は良くするいずれの行為である。
本発明における用語「頭分」とは、豚に対して1頭当たりのワクチン注射量である。
本発明に記載されている「TCID50」(50%tissue culture infective dose)は、細胞培養物の50%を感染させることができるウイルス量であり、ウイルス感染力を表す方式の一つである。
MEM液体培地(液)はアメリカLife Technologies会社から購入したMEM乾燥粉末培地を用いて、明細書により調製したものである。
本発明のDMEM培地は、GB/T18641−2002付録Aの調製方法により調製したものである。
本発明に記載される「PBS」とはリン酸塩緩衝液(Phosphate Buffer Saline)の英語イニシャルであり、本発明では、0.01mM PBS(pH 7.4)を用い、《分子クローン》第三版により調製された。
本実施例に用いられる豚ヘルペスウイルスHN1202株(Pseudorabies virus,strain HN1202)は、受託番号がCCTCC NO.V 201335であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日が2013年8月26日である。
PRVは豚ヘルペスウイルス(Pseudorabies virus)の英語の略語である。
以下の具体的な実施形態において、それぞれ、豚ヘルペスウイルス変異株PRV HN1201株、NVDC−PRV−BJ株、NVDCPRV−HEB株とNVDC−PRV−SD株、HN1202株を例として本発明を説明する。
1.1PRV HN1201GFP組換えウイルス導入ベクターの構築
欠失しようとするUSセグメント(gI/gE/11K/28K)の配列によって、その両端にそれぞれホモロジーアーム、即ちUSAとUSBを設計した。USAとUSBをpUC19ベクターにクローンして、pUCUSABと名づけた。次に、GFP遺伝子をpUCUSABにクローンして、組換えウイルス導入ベクターを獲得して、pUCUSA−GFP−Bと名づけた。導入ベクターにおいて、ホモロジーアームはUS両側の配列であるため、組換えて得られた組換えウイルスはgI/gE/11K/28KのUSセグメントを欠失した。組換え導入ベクター構築の概略図を図1に示し、図2はゲノム上のUSAとUSBホモロジーアームの位置を示す。
1.1.1.1プライマーの設計とテンプレートの制作
HN1201ウイルスの遺伝子配列によって、二対のプライマーを設計し、欠失セグメントの両側のホモロジーアームを増幅した。
左側のホモロジーアームUSAの上下流のプライマーは、それぞれ
USAF:CCGGAATTCTCGTCGTGGGCATCGTCATCAT(下線がEcoR I制限酵素切断サイトである)、
USAR:CTATCTAGAataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatCGGTACTGCGGAGGCTACGGAC(下線がXba I制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがloxpサイトである)である。
右側のホモロジーアームUSBの上下流のプライマーは、それぞれ
USBF:ACATGCATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatACGGCAGGATCTCTCCGCGTCCC(下線がSphI制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがloxpサイトである)、
USBR:CCCAAGCTTAGGAGGGGGCGGGGAGCGCGAGC(下線がHind III制限酵素切断サイトである)である。
PRV HN1201でvero細胞を感染し、細胞の80%以上が病変を認められた後、上澄みの一部を取り、Geneaid Viral Nucleic Acid Extractionキットを利用して、ウイルスゲノムDNAを抽出し、ホモロジーアームを増幅するためのテンプレートとする。
TAKARAのPrimeSTARを利用して、PCRを行って、以下の体系及び条件でUSA、USBを増幅させた。
PCRにより増幅されたUSAとUSB断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した後、ゲル回収キット(天根社製)を使用して目的断片を回収した。USA断片とpUC19ベクターをそれぞれEcoR IとXbaIで二重消化(double digestion)した後、目的断片を回収し、T4 DNA リガーゼ結合した後、DH5αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、37℃で一晩培養する。モノクローナルを選別し、酵素消化によって正確であると勘定したプラスミドをpUCUSAと名づけた。pUCUSAとUSBをそれぞれ SalIとHindIIIで二重消化した後、目的断片を回収し、T4 DNA リガーゼ結合した後、DH5αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、37℃で一晩培養した。モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをpUCUSABと名づけた。
1.1.2.1 GFPベクターpAcGFP−C1マルチプルクローニングサイトの除去
pAcGFP−C1プラスミド(Clontechから購入し、型番632470)をBgl IIとSma Iで二重消化した後、線状化されたベクターを回収し、DNA Polymerase I Large(Klenow)Fragmentにより平滑化し、T4 DNA Ligase結合した後、DH5αコンピテントセルの形質転換を行い、MCSを除去したGFPプラスミドを獲得し、pAcGFPΔMCSと名づけた。
1.1.2.2 GFP遺伝子の増幅
pAcGFP−C1ベクター配列に基づき、GFPを増幅するためのプライマーを設計した。
<上流プライマー>
CMVU:ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(下線がSalI制限酵素切断サイトである)
<下流プライマー>
SV40R:ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC(下線がSph I制限酵素切断サイトである)
プラスミドpAcGFPΔMCSをテンプレートとして、以下の体系及び条件でGFP遺伝子を増幅した。
電気泳動によって目的バンドを回収し、次の結合を行った。
GFPをSal IとSph Iで二重消化した後、目的断片を回収し、同様に二重消化したpUCRRABプラスミドと結合し、DH5αコンピテントセルの形質転換を行い、モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをpUCUSA−GFP−Bと名づけた。
1.2 GFPを含む組換えウイルスの獲得
1.2.1 導入ベクターとHN1201 DNAでVero細胞を共トランスフェクションして組換えウイルスを獲得する
リポソーム法でVero細胞を共トランスフェクションし、Lipofectamine 2000(Invitrogen、型番11668030)に付属する明細書の工程によって、3ug PRV−HN1201ウイルスゲノムDNAと5ug導入ベクターpUCUSA−GFP−Bをトランスフェクションした。37℃で5%CO2を含む培養箱に培養した。トランスフェクションしてから36〜48時間後に、細胞病変が生じて、且つ病変部に蛍光が認められたら、細胞の上澄みをP0世代組換えウイルスとして回収し、rPRV−GFP−US−と名づけた。
1.2.2 組換えウイルスのプラークの精製
得られたP0世代組換えウイルスrPRV−GFP−US−でVero細胞を感染した後、2%の低融点アガロースを敷き、48時間後、細胞に明らかな病変と蛍光が認められた後、緑色蛍光のプラークを選別して、−70℃で3回凍結融解した後、10倍段階希釈してVero細胞を敷いておいた6ウェルプレートに接種し、引き続いて緑色蛍光プラークを選別して精製し、プラーク精製を8循環で行って、精製された野生型ウイルスHN1201を含まないgI/gE/US9/US2(すなわち、gI/gE/11K/28K)欠失の組換えウイルスrPRV−GFP−US−を得た。
Cre酵素を発現するpBS185プラスミド(addgeneから購入し、Cre酵素はホモロジーアームUSA下流とUSB上流のloxPサイトを認識し、二つのloxpサイトの間の配列を除去する)と組換えウイルスrPRV−GFP−US−ゲノムDNAにより、vero細胞の共トランスフェクションを行った結果、トランスフェクションしてから24時間後、比較的に明らかな病変が現れ、しかも単独な蛍光がより多かった。獲得したP0世代ウイルスを段階希釈した後、接種して、プラークを選別し、蛍光を発しないプラークを選別して、次の精製を行った。2回選別・精製して、蛍光を発しないウイルスを獲得して、vPRV−US−と名づけた。精製ウイルスゲノムDNAを抽出し、PCR同定によって、gI/gE/US9/US2(すなわち、gI/gE/11K/28K)セグメントが欠失され、且つGFP標識遺伝子もすでに除去されたことが分かった。GFP標識遺伝子を含まないgI/gE/US9/US2(すなわち、gI/gE/11K/28K)セグメント欠失ウイルスの精製が成功したことを明らかにした。
1.4 PRV HN1201株USセグメント欠失ウイルス株の確認
gI/gE/US9/US2(すなわち、gI/gE/11K/28K)セグメント欠失ウイルスと野生型ウイルスのウイルスゲノムを抽出し、PCR同定を行い、プライマーは下記の通りであった。
USDCF:TACATCGTCGTGCTCGTCTTTGGC
USDCR:AGCTCGTGCGTCTCGGTGGTG
野生型ウイルスで増幅したPCR産物のサイズが6286bpであり、gI/gE/U S9/US2(すなわち、gI/gE/11K/28K)セグメント欠失ウイルスで増幅したPCR断片のサイズが1960bpであった。
PCR実験の結果から、gI/gE/US9/US2(すなわち、gI/gE/11K/28K)セグメントORFをすでに完全に欠失させたことを証明した。
2.1 PRV HN1201 GFP組換えウイルス導入ベクターの構築
欠失しようとするTK遺伝子の配列によって、その両端にそれぞれホモロジーアーム、即ちTKAとTKBを設計した。TKAとTKBをpUC19ベクターにクローンして、pUCTKABと名づけた。次に、GFP遺伝子をpUCTKABにクローンして、組換えウイルス導入ベクターを獲得し、pUCTKA−GFP−Bと名づけた。導入ベクターにおいて、ホモロジーアームはTK両側の配列であるため、組換えて得られた組換えウイルスはTK遺伝子を欠失した。図4はゲノム上のTKAとTKBホモロジーアームの位置を示す。
2.1.1.1 プライマーの設計とテンプレートの製造
HN1201ウイルスの遺伝子配列によって、二対のプライマーを設計し、TK遺伝子の両側のホモロジーアームを増幅した。
左側のホモロジーアームTKAの上下流のプライマーは、それぞれ
TKAF: CCGGAATTCGTAGTGCCGGTTGCCCACGTACA(下線がEcoR I制限酵素切断サイトである)
TKAR:CTAGTCTAGAataacttcgtatagtacacattatacgaagttatCGCTCAGGCTGCCGTTCTGC(下線がXba I制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがloxpサイトである)である。
右側のホモロジーアームTKBの上下流のプライマーは、それぞれ
TKBF:ACATGCATGCataacttcgtataatgtgtactatacgaagttatAACGACGACGGCGTGGGAGG(下線がSph I制限酵素切断サイトであり、小文字のアルファベットがloxpサイトである)
TKBR:CCCAAGCTTAGGGCGACGGCGAAGAAGAGC(下線がHind III制限酵素切断サイトである)である。
PRV HN1201でvero細胞を感染し、細胞の80%以上が病変を認められた後、上澄みの一部を取り、Geneaid Viral Nucleic Acid Extractionキットを利用して、ウイルスゲノムDNAを抽出し、ホモロジーアームを増幅するためのテンプレートとする。
TAKARAのPrimeSTARを利用して、PCRを行って、以下の体系及び条件でTKA、TKBを増幅させた。
PCRにより増幅されたTKAとTKB断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した後、ゲル回収キット(天根社製)を使用して目的断片を回収する。TKA断片とpUC19ベクターをそれぞれEcoR IとXbaIで二重消化した後、目的断片を回収し、T4 DNA リガーゼ結合した後、DH5αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、37℃で一晩培養した。モノクローナルを選別し、酵素消化によって正確であると勘定したプラスミドをpUCTKAと名づけた。pUCTKAとTKBをそれぞれ SalIとHindIIIで二重消化した後、目的断片を回収し、T4 DNA リガーゼ結合した後、DH5αの形質転換を行い、アンピシリンを含むプレートへ塗布し、37℃で一晩培養した。モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをpUCTKABと名づけた。
2.1.2.1 GFPベクターpAcGFP−C1マルチプルクローニングサイトの除去
pAcGFP−C1プラスミド(Clontechから購入し、型番632470)をBgl IIとSma Iで二重消化した後、線状化されたベクターを回収し、DNA Polymerase I Large(Klenow)Fragmentにより平滑化し、T4 DNA Ligase結合した後、DH5αコンピテントセルの形質転換を行い、MCSを除去したGFPプラスミドを獲得し、pAcGFPΔMCSと名づけた。
2.1.2.2 GFP遺伝子の増幅
pAcGFP−C1ベクター配列に基づき、GFPを増幅するためのプライマーを設計した。
<上流プライマー>
CMVU:ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(下線がSalI制限酵素切断サイトである)
<下流プライマー>
SV40R:ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC(下線がSph I制限酵素切断サイトである)
プラスミドpAcGFPΔMCSをテンプレートとして、以下の体系及び条件でGFP遺伝子を増幅した。
電気泳動によって目的バンドを回収し、次の結合を行った。
GFPをSal IとSph Iで二重消化した後、目的断片を回収し、同様に二重消化したpUCTKABプラスミドと結合し、DH5αコンピテントセルの形質転換を行い、モノクローナルを選別して、プラスミドを抽出し、酵素消化と配列決定によって正確であると勘定したプラスミドをpUCTKA−GFP−Bと名づけた。
2.2 GFPを含む組換えウイルスの獲得
2.2.1 導入ベクターとvPRV−gI−gE−11K−28K− DNAでVero細胞を共トランスフェクションして組換えウイルスを獲得する
リポソーム法でVero細胞を共トランスフェクションし、Lipofectamine 2000(Invitrogen、型番11668030)に付属する明細書の工程によって、3μg vPRV−gI−gE−11K−28K−ウイルスゲノムDNAと5μg導入ベクターpUCTKA−GFP−Bをトランスフェクションした。37℃で5%CO2を含む培養箱に培養した。トランスフェクションしてから36〜48時間後に、細胞病変が生じて、且つ病変部に蛍光が認められたら、細胞の上澄みをP0世代組換えウイルスとして回収し、rPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−と名づけた。
2.2.2 組換えウイルスrPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−のプラークの精製
得られたP0世代組換えウイルスrPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−でVero細胞を感染した後、2%の低融点アガロースを敷き、48時間後、細胞に明らかな病変と蛍光が認められた後、緑色蛍光のプラークを選別して、−70℃で3回凍結融解した後、10倍段階希釈してVero細胞を敷いておいた6ウェルプレートに接種し、引き続いて緑色蛍光プラークを選別して精製し、プラーク精製を11循環で行って、精製された、PRV−gI−gE−11K−28K−TK−ウイルスを含んでおらず、五つの遺伝子を欠失させた組換えウイルスrPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−を得た。
Cre酵素を発現するpBS185プラスミド(addgeneから購入し、Cre酵素はホモロジーアームTKAの下流とTKBの上流の変異型loxPサイトを認識し、二つのloxpサイトの間の配列を除去する)と組換えウイルスrPRV−GFP−gI−gE−11K−28K−TK−ゲノムDNAにより、vero細胞の共トランスフェクションを行った結果、トランスフェクションしてから24時間後、比較的に明らかな病変が現れ、しかも単独な蛍光がより多かった。獲得したP0世代ウイルスを段階希釈した後、接種して、プラークを選別し、蛍光を発しないプラークを選別して、次の精製を行った。2回選別・精製して、蛍光を発しないウイルスを獲得して、PRV−gI−gE−11K−28K−TK−と名づけた。精製ウイルスゲノムDNAを抽出し、PCR同定によって、TK遺伝子が欠失され、且つGFP標識遺伝子もすでに除去されたことが分かった。GFP標識遺伝子を含まないgI−gE−11K−28K−TK−欠失ウイルスの精製が成功したことを表明した。
2.4 PRV HN1201株gI/gE/11K/28K/TK欠失ウイルス株の確認
gI/gE/11K/28K遺伝子欠失の同定プライマーは上記と同じである。
gI/gE/11K/28K/TK欠失ウイルスと野生型ウイルスのウイルスゲノムを抽出し、PCR同定を行い、プライマーは下記の通りであった。
TKDCF:cctacggcaccggcaagagca
TKDCR:cgcccagcgtcacgttgaagac
図5に示すように、野生型ウイルスで増幅したPCR産物のサイズが1566bpであり、TK欠失ウイルスで増幅したPCR断片のサイズが742bpである。
CN103756977Aの実施例1の方法を参照して、PRV HN1201 gI/gE欠失株を製造した。
豚ヘルペスウイルス抗原抗体が陰性である7日齢の子ブタ25頭を5頭/群でランダムに5群(A、B、C、Dと空白対照群)に分け、群分けと攻撃(ウィルスチャレンジ)状況を表1に示す。
5.1、ワクチンウイルスの増殖
実施例1で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K欠失株、実施例2で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株、実施例3で製造したPRV HN1201 gI/gE欠失株のウイルス種を5×104倍で希釈した後、単層に成長したST細胞へ接種し、1時間吸着した後、2%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液1000mlを混入し、37℃の温室に6回転/時間の回転速度で回転培養した。80%の細胞が病変した後、2回凍結融解し、ウイルスを獲得し、ウイルス力価を測定した。ウイルス液を低温で保存した。
5.2、保護剤の調製
100ml脱イオン水に対して、ショ糖40g、ゼラチン8gを添加し、充分に溶解した後、高圧蒸気滅菌(121℃、30min)を行った。
5.3、ワクチンウイルス混濁液の配合
5.1で製造して保存していたウイルス液と5.2で製造した保護剤を1:1(体積比)で混合し、2.6 ml/ボットルで、滅菌したアンプールに分注し、凍結乾燥した。ワクチンは細菌や外来ウイルスにより汚染されるかどうかとチェックした結果、凍結乾燥前のウイルス含有量にほぼ一致する。実施例1で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K欠失株のバッチ番号は、20140501であり、実施例2で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号は20140502であり、実施例3で製造したPRV HN1201 gI/gE欠失株バッチ番号は、20140503である。
9日齢のPRV抗原抗体が陰性である子ブタ25頭を5頭/群でランダムに5群に分け、表3に従って、実施例5で製造したワクチンを接種し、対照ワクチン群は、スペインLABORATORIOS HIPRA, S.A.製の豚ヘルペスウイルス生ワクチン(Bartha K−61株、バッチ番号:42RH)を明細書の使用量に従って使用し、空白対照群は、1ml/頭でDMEM培地を接種した。免疫してから28日後攻撃し、攻撃量がHN1201株豚ヘルペスウイルス1×107.0 TCID50/頭であり、攻撃後、毎日、子ブタの体温を測定し、臨床症状と死亡状況を観察し(結果を表3に示す)、攻撃前、それぞれ試験群と対照群の子ブタを採血した。
それぞれ、NVDC−PRV−BJ株、NVDCPRV−HEB株とNVDC−PRV−SD株(Xiuling Yu,Zhi Zhou,Dongmei Hu,et al.Pathogenic PseudorabiesVirus,China,2012 EmergingInfectious Diseases、www.cdc.gov/eid ol.20,No.1,January 2014)(出願者は、特許審査指南の規定により、特許出願日から公衆に20年配布することを承諾する)、HN1202株(寄託番号:CCTCC NO.V 201335、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日が2013年8月26日である)をウイルス親株として、実施例1、2の方法を参照して、gI/gE/11K/28K及びgI/gE/11K/28K/TK遺伝子を欠失させて製造した弱毒株をそれぞれNVDC−PRV−BJ gI/gE/11K/28K/TK欠失株、NVDCPRV−HEB gI/gE/11K/28K/TK欠失株、NVDC−PRV−SD gI/gE/11K/28K/TK欠失株、PRVHN1202 gI/gE/11K/28K/TK欠失株と名づけ、PCRでウイルス親株と照合することにより、遺伝子欠失を証明した。
実施例5.1の方法により、実施例7で製造した各弱毒ワクチン株を増殖し、体積比1:1で保護剤(100ml脱イオン水に対してショ糖40g、ゼラチン8gを混入し、十分に溶解した後、高圧蒸気滅菌(121℃で30min)を行って得られるもの)を混入し、凍結乾燥させた。NVDC−PRV−BJ gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号がQ01であり、NVDCPRV−HEB gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号がQ02であり、NVDC−PRV−SD gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号がQ03であり、PRVHN1202 gI/gE/11K/28K/TK欠失株のバッチ番号がQ04である。
実施例4の方法により病原性試験を行い、実験豚を5頭/群で5群に分け、それぞれ、実施例7で製造したNVDC−PRV−BJ gI/gE/11K/28K/TK欠失株、NVDCPRV−HEB gI/gE/11K/28K/TK欠失株、NVDC−PRV−SDTK gI/gE/11K/28K/TK欠失株、PRVHN1202 gI/gE/11K/28K/TK欠失株を1ml(107.0 TCID50/ml)で点鼻接種した結果、各群の豚は何れも生存し、体温が正常し、臨床症状が出なかった。これは、TK/gE/gI/11K/28K遺伝子を欠失させことにより、変異ヘルペスウイルス株の毒性が低減したことを証明する。
実施例6の試験方法及び接種量により、実施例8で製造したワクチンに対して免疫原性試験を行い、同時に対照ワクチンである豚ヘルペスウイルス生ワクチンHB−98株(バッチ番号:1308011−1、中牧実業株式会社成都薬械厂)を接種し、免疫28日後攻撃し、攻撃量が豚ヘルペスウイルスHN1201株1×107.0 TCID50/頭であり、臨床症状と死亡状況を観察し、攻撃した後、毎日、子ブタの体温を測定して臨床症状を観察し、その結果を表6に示す。
約13日齢のPRV抗原抗体が陰性である豚15頭を使用し、体重によって、5頭/群でランダムに3群に分けた。第1群〜第3群は、それぞれ、実施例5で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッチ番号20140502)のワクチン、スペインLABORATORIOS HIPRA, S.A.製の豚オーエスキー病生ワクチン(Bartha K−61、バッチ番号66KR)とベーリンガーインゲルハイム動物保健(アメリカ)有限公司製の豚オーエスキー病生ワクチン(K−61、バッチ番号195−B59B)を、1ml/頭の免疫量(商品化ワクチンは明細書の剤量により免疫し、1頭分/頭であり;PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株は106.0 TCID50/頭である)で免疫した。免疫後8日目、10日目、12日目、14日目、21日目に採血し、血清を分離した後、gB ELISA抗体検出キットの明細書(Biochek会社、バッチ番号FS5763、有効期限:2015.01.07)に基づき、gB抗体測定を行い、詳しい検出結果を下記表7に示す。
チ番号20140502)のワクチン
註2.PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッ
チ番号20140502)のワクチン
注:判定基準:陰性S/P値≦0.499、陽性S/P値≧0.500
(結論):
抗体検出結果から分かるように、PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株で免疫してから12日後、gB抗体は全部陽性に変わったが、比較例のワクチンで免疫してから21日に、抗体はまだ全部陽性に変わっていなかった。PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株は早めに免疫保護を生じることが可能なことが証明された。
約13日齢のPRV抗原抗体が陰性である豚15頭を使用し、体重によって、5頭/群でランダムに3群に分けた。第1群〜第3群は、それぞれ、実施例5で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッチ番号20140502)のワクチン、スペインLABORATORIOS HIPRA, S.A.製の豚オーエスキー病生ワクチン(Bartha K−61、バッチ番号66KR)とベーリンガーインゲルハイム動物保健(アメリカ)有限公司製の豚オーエスキー病生ワクチン(K−61、バッチ番号195−B59B)を、1ml/頭の免疫量(商品化ワクチンは明細書の剤量により免疫し、1頭分/頭であり;本発明のPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株の免疫量は106.0 TCID50/頭である)で免疫した。免疫後21日目に攻撃し、PRV HN1201を使用して攻撃し、攻撃量が107.0 TCID50/頭、1ml/頭であり、攻撃後の7日目〜14日目毎日採血し、血清を分離した後、gE ELISA抗体検出キットの明細書(IDEXX会社、バッチ番号AK650、有効期限:2015.06.13)に基づき、gE抗体測定を行った結果、実施例5で製造したPRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッチ番号20140502)のワクチン免疫群の豚は攻撃後14日目にgE抗体が依然として陰性である(S/N値が0.60以下であれば、サンプルをPRV gE抗体陽性と判定すべきである)が、商品化ワクチンで免疫した免疫群の豚は、攻撃後gE抗体が異なる程度で陽性に変わった。詳しい検出結果を下記表8に示す。
註2.PRV HN1201 gI/gE/11K/28K/TK欠失株(バッチ番号20140502)のワクチン
Claims (10)
- gI/gE/11K/28Kタンパク質を不活性化させた豚ヘルペスウイルス株であり、好ましくは、豚ヘルペスウイルス変異株である豚ヘルペスウイルス弱毒株。
- ゲノムにおいてgI/gE/11K/28KのORFの全長を欠失させた請求項1に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株。
- 前記豚ヘルペスウイルス変異株は、gEタンパク質配列がSEQ ID NO.07であり、或いは、それと95%以上の配列相同性を有するウイルス株であり、好ましくは、前記豚ヘルペスウイルス変異株は、分離されたものであり、前記豚ヘルペスウイルス変異株による感染を再現した場合に、従来の遺伝子欠失ヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚にも、高熱、意気消沈、食欲不振或いは絶食症状が現れるウイルス株であり、より好ましくは、前記豚ヘルペスウイルス変異株は、前記豚ヘルペスウイルス変異株による感染を再現した場合に、従来のgE、TK、gI遺伝子のうち一つ以上を欠失させたヘルペスウイルス弱毒化ワクチンを接種した豚は依然として豚オーエスキー病に感染し、かつ前記豚ヘルペスウイルス変異株は9〜10日齢の子ブタに意気消沈と食欲不振をおこさせるウイルス株である請求項1に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株。
- 前記豚ヘルペスウイルス株はHN1201株、HN1202株、JS−2012株、豚ヘルペスウイルスHeN1株、NVDC−PRV−BJ株、NVDCPRV−HEB株或いはNVDC−PRV−SD株、PRV TJ株或いはPRV−ZJ01株である請求項1に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株。
- 更にTKタンパク質を不活性化し、好ましくは、ゲノムにおいて、TKサイトのヌクレオチド配列がSEQ.NO.4のアミノ酸配列をコードして発現する請求項1〜4のいずれか一項に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株。
- 免疫量の請求項1〜5のいずれか1項に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原とベクターを含み、好ましくは、豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原の含有量が106.0TCID50/頭以上であるワクチン組成物。
- 前記豚ヘルペスウイルス弱毒株抗原が生きている前記豚ヘルペスウイルス弱毒株であり、更に凍結乾燥保護剤が含まれる請求項6に記載のワクチン組成物。
- 更に、不活性化させた病原体或いは抗原組成成分を含み、好ましくは、前記抗原は豚コレラウイルス抗原、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原及び/又はブタパラインフルエンザ菌抗原或いは豚肺炎マイコプラズマ抗原である請求項6に記載のワクチン組成物。
- ワクチン組成物の製造方法であって、(1)請求項1〜5のいずれか一項に記載の豚ヘルペスウイルス弱毒株を増幅培養する工程と、(2)前記増幅培養した豚ヘルペスウイルス弱毒株に凍結乾燥保護剤を混入する工程と、を含むワクチン組成物の製造方法。
- 請求項6〜7のいずれか一項に記載のワクチン組成物の豚オーエスキー病を予防・治療する医薬品の製造への応用、好ましくは、前記の豚オーエスキー病は請求項3に記載の豚ヘルペスウイルス変異株による豚オーエスキー病である。
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