JP6201166B2 - 変異糖タンパク質cを含む組換えウマヘルペスウイルス‐1ワクチン及びその使用 - Google Patents
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Description
本出願は米国仮特許出願61/613,151(2012年3月20日出願)の優先権を主張する。
EHV-1は、株間で高度に保存される150kbの二本鎖DNAゲノムを保有する。神経病原性株Ab4(GenBankアクセッション番号AY665713)及び非神経病原性株V592(GenBankアクセッション番号AY464052)は徹底的に特徴が調べられ、約0.1%のヌクレオチド変異率を示した(Nugent et al., J. Virol 80, 4047-4060, 2006)。EHV-1株のうち少数のものだけが神経学的異常を誘発できるが、ただし全ての株が呼吸器疾患及び流産を引き起こし得ることが見出された(Mumford et al., J. Reprod Fertil Suppl 35, 509-518, 1987;Ostlund, Vet Clin North Am Equine Pract 9, 283-294, 1993;Wilson, Vet Clin North Am Equine Pract 13, 53-72, 1997)。最近、オープンリーディングフレーム30(ORF30)(ウイルスDNAポリメラーゼ(Pol)をコードする)の2254位の1ヌクレオチド多形性(G/A2254)が、アミノ酸752位の変異をもたらすことが、疫学研究及び逆遺伝学研究によって示された(前記アミノ酸の位置は、該ウイルスの神経病原性潜在能力と密接に関係する)()。HEV-1にとって必須のPolの残基752はウイルス増殖にとって必要ではないこと、及びN752変異は該ウイルスに薬剤感受性表現型を付与することが示された(Ma et al., 2010)。HEV-1の糖タンパク質C(gC)は、感染の初期工程及びビリオンの放出において重要な役割を果たすことが示された(Osterrieder, Virus Research 2, 165, 1999)。EHV-1の糖タンパク質Cはウイルス増殖にとって必須ではない。前記は初期吸着を媒介し、初代ウマ細胞における効率的なウイルス複製に必要である(Osterrider, 1999)。
通常の死菌ワクチンは、呼吸器感染に対して部分的な臨床的及びウイルス学的防御しか提供せず、細胞結合ウイルス血症を防御しない。ヘルペスウイルスに対する動物(人間を含む)の感受性を考慮すると、ヘルペスウイルス感染を予防し動物を防御する手段は欠くべからざるものである。したがって、ヘルペスウイルスに対する有効なワクチンが希求される。
本明細書におけるいずれの文書類の引用又は特定も、そのような文書類が本発明の先行技術として利用可能であると容認するものではない。
本発明は、EHV-1に対して免疫原性又は防御性応答を誘発する方法、および、EHV-1又はEHV-1によって引き起こされる症状を予防する方法を提供し、前記方法は、本発明の組成物又はワクチンを投与する工程を含む。本発明はまた動物をワクチン免疫する方法を提供し、前記方法は該組成物又は組換えEHV-1の少なくとも1回の投与を含む。
これらの実施態様及び他の実施態様は、以下の詳細な説明によって開示され又は前記説明から明白であり、さらに前記説明に包含される。
詳細な説明
以下の詳細な説明(例示として提供され、記載する特定の実施態様に本発明を限定しようとするものではない)は、参照として本明細書に含まれる添付の図面と一緒にして理解されよう。前記図面は以下のとおりである。
本開示及び特に特許請求の範囲では以下に留意されたい:例えば“comprises”、“comprised”、“comprising”などの用語は、米国特許法でそれらに帰属する意味を有し、例えばそれら用語は“includes”、“included”、“including”などを意味することができる。さらに、例えば“consisting essentially of”、及び“consists essentially of”のような用語は、米国特許法でそれらが帰属する意味を有し、例えばそれらは、はっきりと列挙されていない成分を許容するが、先行技術で見出されるか又は本発明の基本的若しくは新規な特徴に影響を与える成分を排除する。
特段の記載がなければ、技術用語は通常的使用にしたがって用いられる。分子生物学における一般的な用語の定義は以下で見出され得る:Benjamin Lewin, Genes V., Oxford University Press, 1994(ISBN0-19-854287-9);Kendrew et al.(eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994(ISBN 0-632-02182-9);及びRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995(ISBN 1-56081-569-8)。
単数用語の“a”、“an”及び“the”は、文脈が明らかにそうでないことを示さないかぎり複数の対応語を含む。同様に、“or”という語も、文脈が明らかにそうでないことを示さないかぎり“and”を含むことが意図される。“or”という語は具体的な列挙物の任意の1つのメンバーを意味し、当該列挙物の任意の組み合わせもまた含む。
本明細書で用いられる“EHV-1 D株”という用語は、そのDNAポリメラーゼのアミノ酸752位にアスパラギン酸(D)を有する任意のEHV-1株を指す。該EHV-1 D株は、アスパラギン酸(D)をアミノ酸752位に含むDNAポリメラーゼを含む野生型株でもよい。該EHV-1 D株は、そのDNAポリメラーゼがアミノ酸752位にアスパラギン酸(D)を有するように操作された変異又は組換えEHV-1株でもよい。
“動物”によって、哺乳動物、人間、鳥類などが意図される。該動物は、ウマ科の動物(例えばウマ、シマウマ、ロバ)、イヌ科の動物(例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル)、ネコ科の動物(例えばライオン、トラ、イエネコ、野生ネコ、他の大型のネコ類、及び他のネコ科の動物(チーター及びオオヤマネコを含む))、ヒツジ類(例えばヒツジ)、ウシ科の動物(例えばウシ、乳牛、バッファロー)、ブタ類(例えばブタ)、鳥類(例えばニワトリ、アヒル、ガン、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミュー、及びヒクイドリ)、霊長類(例えば原猿類、メガネザル、有尾猿類、テナガザル、無尾猿類)、及び魚類から成る群から選択できる。“動物”という用語にはまた、全ての発育段階(胚性期及び胎児期を含む)の個々の動物が含まれる。
“核酸”、“ヌクレオチド”及び“ポリヌクレオチド”という用語はRNA又はDNA及び前記の誘導体(例えば改変骨格を含むもの)を指す。本発明は、本明細書に記載したポリヌクレオチドに相補的な配列を含むポリヌクレオチドを提供することは理解されよう。本発明のポリヌクレオチドは、種々の方法で(例えば化学的合成、遺伝子クローニングなどによって)調製でき、さらに多様な形態(例えば直鎖状若しくは分枝状、一本鎖若しくは二本鎖、又はそのハイブリッド、プライマー、プローブなど)をとることができる。
“遺伝子”という用語は広く用いられ、生物学的機能と結びついたポリヌクレオチドの任意のセグメントを指す。したがって、遺伝子又はポリヌクレオチドは、ゲノム配列におけるイントロン及びエクソン、又はcDNAにおけるコード配列そのもの、例えばオープンリーディングフレーム(ORF)(開始コドン(メチオニンコドン)から始まり終了シグナル(停止コドン)で終わる)を含む。遺伝子及びポリヌクレオチドはまた、それらの発現を調節する領域(例えば転写開始、翻訳及び転写終了領域)を含むことができる。したがってまたプロモーター及びリボソーム結合領域(概ね、これら調節エレメントはコード配列又は遺伝子の開始コドンの上流約60から250ヌクレオチドの間に存在する(Dorees S M et al.;Pandher K et al.;Chung J Y et al.))、転写ターミネーター(概ね、該ターミネーターはコード配列又は遺伝子の停止コドンの下流約50ヌクレオチド内に配置される(Ward C K et al.))が含まれる。遺伝子又はポリヌクレオチドはまた、mRNA又は機能的RNAを発現するか、又は特異的タンパク質をコードする核酸フラグメントを指し、前記は調節配列を含む。
定義すれば、エピトープは、いったん宿主に投与されたら液性タイプ(B細胞)及び/又は細胞性タイプ(T細胞)の免疫応答を引き起こすことができるという意味で免疫学的に活性な抗原決定基である。これらは、抗原性を有する分子上の特定の化学基又はペプチド配列である。抗体はポリペプチド上の特定の抗原性エピトープと特異的に結合する。エピトープの具体的な非限定的な例には、ポリペプチド中のテトラペプチドからペンタペプチド配列、多糖類中のトリグリコシドからペンタグリコシドの配列が含まれる。動物では、大半の抗原が数個の又は多くの抗原決定基を同時に提示するであろう。そのようなポリペプチドもまた免疫原性ポリペプチドとみなされ、そのエピトープはさらに別に説明するように同定することができる。
本明細書で用いられる“精製された”という用語は完璧な純度を必要とせず、むしろ前記は相対的用語を意図する。したがって、例えば精製されたポリペプチド調製物は、当該ポリペプチドがその天然の環境に存在するよりも当該ポリペプチドがより濃縮されている調製物である。あるポリペプチド調製物のポリペプチドは、いくつかの実施態様では当該調製物の総ポリペプチド含有量の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%又は、少なくとも98%を占めるように、当該ポリペプチド調製物は実質的に精製される。同じことがポリヌクレオチドにも適用される。本明細書に開示のポリペプチドは当業界で公知の手段のいずれかで精製され得る。
“組成物”という用語は、いったん宿主(イヌ、ネコ、ウマ及びヒトを含む)に注入されたら、該宿主で免疫応答を誘発する、及び/又は該宿主を白血病から防御する、及び/又は寄生虫の移植を予防できる、及び/又は感染対象動物で疾患の進行を予防できる、及び/又は逃避寄生虫の内部器官への拡散を制限できる任意のワクチン又は免疫学的組成物を含む。前記は、サイトカイン分泌、特にIFN-ガンマ分泌の誘発中に本発明にしたがってワクチン免疫を実施するときに達成できる(IFN-ガンマ分泌の測定方法の例として、Quantikine(商標)(R&D Systems Inc.;カタログ番号#CAIF00)を用いることができよう(Djoba Siawaya JH et al.))。
1つ以上の保存的アミノ酸変異又は他のマイナーな改変を有する。これらの変種又は誘導体には、EHV-1 DNAポリメラーゼの一次アミノ酸配列にマイナーな改変を有するポリペプチドが含まれる(そのようなマイナーな改変は、対応する非改変ポリペプチドと比較したとき実質的に等価の活性を有するペプチドを生じ得る)。そのような改変は、部位指定変異誘導による場合のように意図的であっても、又は偶発的であってもよい。“変種”という用語はさらに、前記ポリペプチドが機能して本明細書に規定する免疫学的応答を生じるかぎり、当該配列への欠失、付加及び置換を含む。該改変は、配列番号:2、4、6、37、13、14又は15の752位以外のアミノ酸の位置における任意のアミノ酸変化であり得る。
ある特徴では、本発明は、配列番号:2、4、6、37、13、14又は15と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は99.9%の配列同一性を有するポリペプチド、保存的変種、対立遺伝子変種、ホモローグ、又はこれらポリペプチドの1つの連続する少なくとも8又は少なくとも10アミノ酸を含む免疫原性フラグメント、又はこれらポリペプチドの組合せのアミノ酸752位又は等価の位置にアスパラギン(N)を含むEHV-1 DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の特徴では、本発明は、配列番号:1、3、5又は36に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド又はその変種を提供する。さらにまた別の特徴では、本発明は、配列番号:1、3、5又は36と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は99.9%の配列同一性を有するポリヌクレオチド又はその変種を提供する。
ある特徴では、本発明は、該gCタンパク質をコードする本来の(野生型の)EHV-1ゲノムの糖タンパク質C(gC)遺伝子が欠失している組換えEHV-1を提供する。“糖タンパク質C(gC)遺伝子”という用語は、EHV-1の糖タンパク質C(gC)、及びそのホモローグ、フラグメント又は変種をコードする任意の遺伝子又はポリヌクレオチドを含む。該gC遺伝子は、配列番号:8、10又は12と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は99.9%の配列同一性を有するgCタンパク質又はその変種をコードすることができる。配列番号:7、9又は11と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は99.9%の配列同一性を有するgC遺伝子もまた本発明に包含される。別の特徴では、本発明は、該gCタンパク質をコードする本来の(野生型の)EHV-1ゲノムの糖タンパク質C(gC)遺伝子が改変又は操作され変異gCタンパク質を生じる組換えEHV-1を提供する。さらにまた別の特徴では、該操作gC遺伝子は、gCタンパク質のN-末端領域が欠失した変異gCタンパク質をコードする。
また別に或いは前記に付け加えれば、例えばヌクレオチド又はアミノ酸配列に関して、“同一性”という用語は2つの配列間の相同性の量的測定値を示すことができる。パーセント配列相同性は以下のように計算できる:(Nref−Ndif)x100/Nref、式中Ndifはアラインメントを実施した2つの配列中の非同一残基の総数であり、Nrefは該配列の一方の残基数である。したがって、DNA配列AGTCAGTCは、配列AATCAATCと75%の配列同一性を有するであろう(Nref=8;Ndif=2)。
2つのアミノ酸配列の配列同一性若しくは配列類似性又は2つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、Vector NTIソフトウェアパッケージ(Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA)を用いて決定できる。
さらに別の特徴では、本発明はポリヌクレオチド配列を含むin vivo発現ベクターに関し、前記ヌクレオチド配列は、EHV-1抗原、ポリペプチド及び/又はその変種若しくはフラグメントを含み、さらに宿主で前記をin vivoで発現する。
該in vivo発現ベクターは、関心のあるポリヌクレオチド又は遺伝子及びそのin vivo発現に必須のエレメントを含む任意の転写ユニットを含むことができる。これらの発現ベクターはプラスミド又は組換えウイルスベクターであり得る。in vivo発現のためには、プロモーターはウイルス又は細胞起源であり得る。ある実施態様では、プロモーターはサイトメガロウイルス(CMV)初期プロモーター(CMV-IEプロモーター)、SV40ウイルス初期若しくは後期プロモーター、又はラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター、細胞骨格遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター(Kwissa M et al.)又はアクチンプロモーター(Miyazaki J et al.)であり得る。いくつかの遺伝子が同じプラスミドに存在するとき、それらは同じ転写ユニット又は別個のユニットで提供できる。
複数の挿入を別個の挿入部位を用いるか又は同じ挿入部位を用いて実施することができる。同じ挿入部位を用いるときは、それぞれのポリヌクレオチド挿入物(上記の本発明の任意のポリヌクレオチドであり得る)は、同じ及び/又は別個のプロモーターの制御下に挿入され得る。前記挿入は尾対尾、頭対頭、尾対頭、又は頭対尾で実施できる。IRESエレメント(内部リボソーム進入部位、EP0803573参照)もまた利用して、同じ及び/又は別個のプロモーターに作動できるように連結された複数の挿入物を分離させ発現させることができる。
より広く、本発明は、上記のEHV-1ポリペプチド、変種又はフラグメントのポリヌクレオチド又は遺伝子及び前記のin vivo発現に必要なエレメントを含み、宿主でin vivoにて発現させる任意のプラスミド(EP-A2-1001025;Chaudhuri P.)を含むin vivo発現ベクターを包含する。
より広く言えば、本発明は、上記の1つ以上のEHV-1ポリペプチド、変種又はフラグメントをコードするポリヌクレオチド又は遺伝子を入れた任意の組換えウイルスベクター(前記のin vivo発現に必要な任意のエレメントを含む)を含むin vivo発現ベクターを包含する。
該組換えウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、例えば上記のウマヘルペスウイルス-1(EHV-1)であり得る。該EHV-1ベクターは、RacH株、RacL株、Ab4株、V592株、ケンタッキーD株(TACC No. VR-700)、438/77株(ATCC No. VR-2229)、AB69株(ATCC No. VR-2581)、EHV-1 NY03株、又はEHV-1 RacH若しくはRacL株の組合せから誘導できる。ある実施態様では、発現されるべきポリヌクレオチドは、真核細胞で機能するプロモーター(有利にはCMV-IEプロモーター(ネズミ又はヒト)の制御下に挿入される。ポリ(A)配列(例えばウシ成長ホルモン又はウサギβ-グロビン遺伝子ポリアデニル化シグナル)及びターミネーター配列を発現されるべきポリヌクレオチドの下流に挿入できる。
ポックスウイルスベクター系組換えベクターのためには、ワクシニアウイルス又は弱毒ワクシニアウイルス(例えばMVA(ニワトリ胚線維芽細胞でアンカラ(Ankara)ワクチン株の570回を超える継代後に得られた改変アンカラ株)(以下を参照されたい:Stickl & Hochstein-Mintzel;Sutter et al)、ATCC VR-1508として入手できる;又はNYVAC(US 5,494,807及び米国特許5,494,807号を参照されたい(前記文献は、NYVACの構築、さらにコペンハーゲン株ワクシニアウイルスゲノムから欠失したORFが追加されたNYVACの変種、さらにこの組換え体の挿入部位への異種コード核酸分子の挿入、さらにまた適合プロモーターの使用について考察する)、さらにWO96/40241を参照されたい))、アビポックスウイルス又は弱毒アビポックスウイルス(例えばカナリアポックス、鶏痘、鳩痘(dovepox)、ピジョンポックス、ウズラポックス、ALVAC又はTROVAC(例えば米国特許5,505,941号、5,494,807号を参照されたい)を用いることができる。弱毒カナリアポックスウイルスはUS 5,756,103(ALVAC)及びWO 01/05934に記載されている。弱毒鶏痘株TROVACに関するUS5,766,599も参照できる。アクセス番号VR-111でATCCから入手できるカナリアポックスを照会できる。多数の鶏痘ウイルスワクチン株もまた利用できる。前記は、例えばMERIALから市販されているDIFTOSEC CT株及びINTERVETから市販されているNOBILIS VARIOLEである。その組換え体を作製するために用いられる方法、及びその組換え体の投与の仕方に関する情報については、当業者は、本明細書に引用した文書類及びWO90/12882を参照できる。例えばワクシニアウイルスに関しては、とりわけ米国特許4,769,330号、4,722,848号、4,603,112号、5,110,587号、5,494,807号及び5,762,938号が挙げられ、鶏痘に関しては、とりわけ米国特許5,174,993号、5,505,941号及び5,766,599号が挙げられる。該発現ベクターがワクシニアウイルスであるとき、発現されるべき1つのポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドの1つの挿入部位又は複数の挿入部位は、有利にはチミジンキナーゼ(TK)遺伝子又は挿入部位、ヘマグルチニン(HA)遺伝子又は挿入部位、A型封入体(ATI)をコードする領域にある。カナリアポックスの事例では、1つの挿入部位又は複数の挿入部位は、有利にはORF C3、C5及び/又はC6である。MVAウイルスの1つの挿入部位又は複数の挿入部位は、有利には多様な刊行物(以下が含まれる:Carroll M. W. et al.;Stittelaar K. J. et al.;Sutter G. et al.)に記載されているとおりである。これに関しては、完全なMVAゲノムはAntoineの論文(Antoine G., Virology)に記載されていることもまた特記する。前記論文は当業者が他の挿入部位又は他のプロモーターを使用することを可能にする。有利には、発現されるべきポリヌクレオチドは、特定のポックスウイルスプロモーター、例えばワクシニアプロモーター7.5kDa(Cochran et al.)、ワクシニアプロモーターI3L(Riviere et al.)、ワクシニアプロモーターHA(Shida)、牛痘プロモーターATI(Funahashi et al.)、ワクシニアプロモーターH6(Taylor J. et al.;Guo P. et al. J.;Perkus M. et al.)の制御下に挿入される。
本発明の組換えウイルスベクターを含むワクチンは、有利には安定剤とともに凍結乾燥できる。凍結乾燥は、周知の標準的な凍結乾燥手順にしたがって実施できる。医薬的に又は獣医的に許容できる安定化剤は、炭水化物(例えばソルビトール、マンニトール、ラクトース、シュクロース、グルコース、デキストラン、トレハロース)、グルタミン酸ナトリウム(Tsvetkov T et al.;Israeli E et al.)、タンパク質(例えばペプトン、アルブミン、ラクトアルブミン又はカゼイン)、タンパク質含有物質(例えば脱脂乳)(Mills C K et al.;Wolff E et al.)及び緩衝剤(例えばリン酸緩衝剤、アルカリ金属リン酸緩衝剤)であり得る。補助剤を用いて凍結乾燥調製物を可溶化することができる。
プラスミド系ワクチンは、陽イオン脂質、有利にはDMRIE(N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシロキシ)-1-プロパンアンモニウム;WO96/34109)とともに、さらに有利には中性脂質(例えばDOPE(ジオレオイル-ホスファチジル-アタノールアミン;Behr J. P.))と一緒に処方して、DMRIE-DOPEを形成することができる。ある実施態様では、前記混合物は即席かつ投与前に作成され、適切な混合物とするために有利には約10分から約60分、例えば約30分置くことができる。DOPEを用いるときは、DMRIE/DOPEの比率は95/5から5/95であり、有利には1/1である。プラスミド/DMRIE又はDMRIE-DOPEアジュバントの重量比は、例えば50/1から1/10、10/1から1/5、又は1/1から1/2である。
場合によって、サイトカイン(特にGM-CSF)又はサイトカイン誘発Th1(例えばIL12)を該組成物に添加することができる。これらのサイトカインは、サイトカインをコードするプラスミドとして該組成物に添加してもよい。ある実施態様では、サイトカインはイヌ起源であり、例えば、その遺伝子配列がGenBankデータベースに寄託されてあるGM-CSF(アクセッション番号S49738)である。前記の配列を用いて、WO00/77210で作製されたプラスミドと同様な態様で前記プラスミドを作製することができる。
無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマーのうち、下記のコポリマーEMA(商標)(Monsanto)が有利であり、
アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー及びコポリマーEMA(商標)は、例えば下記式の基本ユニットから形成され、ここで、
−R1及びR2(前記は同一又は別個であり、H又はCH3である);
−x=0又は1で、好ましくはx=1であり;
−y=1又は2で、x+y=2である。
コポリマーEMA(商標)については、x=0及びy=2である。カルボマーについては、x=y=1である。
ある実施態様では、アジュバント、特にカルボマーの溶液(Pharmeuropa, vol. 8, No.2, June 1996)は、蒸留水で有利には塩化ナトリウムの存在下で調製され、得られた溶液は酸性pHにある。このストック溶液は、前記をNaCl添加水(有利には生理学的食塩水(NaCl 9g/L))の所望の量又はその実質的な部分に(所望の最終濃度を得るために)いくつかの部分ごとに一気に添加することによって稀釈され、同時に又は引き続いて有利にはNaOHにより中和される(pH7.3から7.4)。生理学的pHの前記文献は参照により本明細書に含まれる溶液がワクチンとの混合に用いられ、前記は特に凍結乾燥形、液体形又は凍結形で保存される。
最終ワクチン組成物のポリマー濃度は0.01%から2%w/v、0.06%から1%w/v、又は0.1%から0.6%w/vであり得る。
該組成物又はワクチンはまた、少なくとも1つのEHV-1抗原、例えば不活化EHV-1と結合させることができる。ある具体的な実施態様では、EHV-1株は、RacH株、RacL株、Ab4株、V592株、ケンタッキーD株(TACC No. VR-700)、438/77株(ATCC No. VR-2229)、AB69株(ATCC No. VR-2581)、EHV-1NY03株、又はEHV-1 RacH若しくはRacL株の組合せである。EHV-1のこれらの株は化学的又は物理的方法によって不活化できる。化学的方法は特にBPL、ホルムアルデヒドである。物理的方法は特に超音波処理であり得る。不活化EHV-1ワクチンは、アジュバント(例えばサブユニットワクチンについて先に記載したもの)と混合することができる。
該宿主は任意の動物である。ある実施態様では、宿主はウマである。投与ルートは、例えば筋肉内(IM)又は皮内(ID)又は経皮(TD)又は皮下(SC)であり得る。投与手段は、例えば有針注射筒、又は無針装置、又はエレクトロトランスファー(ET)処置と結合させた有針注射筒、又はET処置と結合させた無針装置であり得る。
プラスミド系ワクチンについては、有利な投与ルートはID又はIMであり得る。この投与は有針注射筒又は無針装置の使用によることができ、前記は、例えばデルモジェット(Dermojet)又はバイオジェクター(Biojector)(Bioject, Oregon, USA)、又はベトジェット(商標)(VetjetTM)(Merial)又はビタジェット(商標)(VitajetTM)(Bioject Inc.)である(US2006/0034867を参照されたい)。投薬量は50μgから500μg/プラスミドであり得る。DMRIE-DOPEが添加されるときは、100μg/プラスミドを用いることができる。GM-CSF又は他のサイトカインが用いられるときは、このタンパク質をコードするプラスミドは、約200μgから約500μgの投薬量で存在でき、200μgでもよい。用量体積は0.01mLから0.5mLで、例えば0.25mLであり得る。投与はマルチポイント注射により提供できる。
また別には、プラスミド系ワクチンは、エレクトロトランスファー(ET)処置と結合させたIMにより投与され得る。該ET処置は、エレクトロトランスファーのための装置及び製造業者(すなわちSphergen G250 generator(Sphergen SARL, Evry Genopole, France);MedPulser(商標) DNA electroporation system (Innovio Biomedical Corporation, San Diego, California, USA))の仕様書を用いて実施できる。
IMルートのためには、提供されるワクチンの体積は0.2から2mL、特に約0.5から1mLであり得る。同じ投薬量が本発明のベクターのいずれにも利用される。
サブユニットワクチンについては、投与ルートは有利にはSC又はIM又はTD又はIDであり得る。この投与は有針注射筒又は無針装置を用いて実施でき、前記は、例えばデルモジェット又はバイオジェクター(Bioject, Oregon, USA)、又はベトジェット(商標)(Merial)又はビタジェット(商標)(Bioject Inc.)である。投薬量は約50から500μg、特に約50から約150μg、より好ましくは約50から約100μgであり得る。提供されるサブユニットワクチンの体積は0.2から2mL、特に約0.5から1mLである。
プライム-ブースト投与スケジュールは、少なくとも1つの共通の抗原及び/又はその変種又はフラグメントを用いる、少なくとも1回のプライム投与及び少なくとも1回のブースト投与を含む。プライム投与に用いられるワクチンは後のブースターワクチンとして用いられるものと性質が異なっていてもよい。さらにまた、プライム投与及びブースト投与の両方が本発明の組換えEHV-1を含み得ることを特記する。プライム投与は1回以上の投与を含むことができる。同様に、ブースト投与も1回以上の投与を含むことができる。
投与ルート、用量及び体積は先に本明細書で開示されている。
該プライム-ブースト投与は、2から6週間離して、例えば4週間離して実施できる。ある実施態様にしたがえば、1年に2回のブースター又は1年に1回のブースターもまた想定される。
別の実施態様では、プライム-ブースト投与スケジュールは、EHV-1抗原を含む不活化ウイルスワクチン、又はEHV-1抗原を発現するプラスミド系ワクチン、又はEHV-1抗原を含むサブユニットワクチン、又は前記の組合せの少なくとも1回のプライム投与、及び本発明の組換えEHV-1ワクチン又は組成物の少なくとも1回のブースト投与を含む。
本発明の別の特徴は、本発明のプライム-ブーストワクチン免疫のためのキットに関する。該キットは少なくとも2つのバイアルを含み、第一のバイアルは本発明のプライムワクチン免疫用ワクチンを入れ、さらに第二のバイアルは本発明のブーストワクチン免疫用ワクチンを入れる。該キットは、有利には追加のプライムワクチン免疫用又は追加のブーストワクチン免疫用の追加された第一又は第二のバイアルを含むことができる。
ある実施態様では、該キットは2つのバイアルを含むことができ、1つは本発明のプライムワクチン免疫用プラスミド系ワクチンを入れ、他方のバイアルは本発明のブーストワクチン免疫用組換えウイルスベクター系ワクチンを入れる。
本発明をこれから下記の非限定的な実施例の方法によってさらに説明する。
先行する説明を用いて、当業者は、更なる骨折りを行うことなく本発明を完全に実施し得ると考える。以下の詳細な実施例は単なる例示であり、どのような態様であっても先行する開示を限定するものと解されるべきではない。当業者は、反応物質、反応条件及び技術のいずれに関しても前述の方法から適切な変型をたちどころに認識し得よう。
DNA挿入物、プラスミド及び組換えウイルスベクターの構築は、J. Sambrookらが記載した標準的な分子生物学の技術を用いて実施した(J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)。本発明に用いた全ての制限フラグメントは、“ジーンクリーン”(“Geneclean”)キット(BIO 101 Inc., La Jolla, Calif.)を用いて単離された。
細胞及びウイルス:
ウサギ腎(RK13)細胞は、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100U/mLペニシリン及び0.1mg/mLストレプトマイシン(1%Pen/Strep)を補充したアール最少必須培養液(Earle’s minimum essential medium;EMEM)で維持した。ウマ皮膚線維芽細胞株(NBL6)は、10%FBS、29mg/mLのL-グルタミン、1%Pen/Strep及び1%非必須アミノ酸(Gibco BRL)を補充したEMEMで維持した。EHV-1株RacL11及びNY03は新鮮なRK13細胞で増殖させた。NY03(非神経性DNAポリメラーゼ型(N752Pol)を保有する)は、2003年にニューヨークの農場で流産した仔ウマから単離された。
細胞株RK13_Polの構築:
Pol陰性RacL11変異体の増殖を支援するために、非神経性ポリメラーゼ型(N752)を発現するRK13_Polと称されるウサギ腎細胞株を先ず初めに作製した。NY03のポリメラーゼオープンリーディングフレーム全体、をウイルス感染RK13細胞から抽出したウイルスゲノムDNAから増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)はアキュプライム(Accuprime)DNAポリメラーゼ(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)及びプライマー対PN1/PN2(表1)を用いて実施した。アンプリコン(5’末端でHindIII制限部位とフランキングし、さらに3’末端でBamHI部位及びHAタグとフランキングする)をプラスミドpCDNA3でクローニングしてpCDNA3-Polを作製した。PvuIで消化した後、4μgの組換えプラスミドpCDNA3-Polを線状化し、6ウェルプレートで増殖させたRK13にリポフェクタミン(Lipofectamine 2000;Invitrogen)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を10%FBS及び1.2mg/mLのG418(Merck)を含むEMEMで増殖させた。各細胞が間接免疫蛍光アッセイ(IFA)でDNAポリメラーゼの発現を示す一細胞クローンを選別し、RK13_Polと名付けた。抗HA MAbを用いたIFAによって、RK13_Polにおけるポリメラーゼの発現が示され(図13)、さらに10回の継代で安定であることが示された。
ウイルス変異体の作製:
全ての遺伝子操作に通常の相同性組換え方法を利用した。DNAポリメラーゼのどちらかの側の2つの1.7kbフランキングフラグメントを、熱安定性Pfuポリメラーゼ(Promega)及びプライマー対P1/P2及びP3/P4を用いてRacL11ゲノムから増幅させた。別の2つのプライマー対P5/P6及びP7/P8を用いて、HCMV(ヒトサイトメガロウイルス)プロモーター及びEYFP(強化黄色蛍光タンパク質)遺伝子をプラスミドpEYFP-N1から別々に増幅させた。P2及びP5、P3及びP8、並びにP6及びP7の5’末端は21−23bpの相同な配列を保持する。P5及びP8を用いたオーバーラップPCRにより、HCMVプロモーター及びEYFP遺伝子を融合させ、pCR2.1-Topo(Invitrogen)でクローニングしてpCES1を得た。シャトルプラスミドpCR-Topo-P1P4の構築のために、上記2つのホモローグアーム及びpCES1のEYFP発現カセットを、プライマーP1/P4を用いたオーバーラップPCRによって結合させ、pCR2.1-Topoでクローニングした。pCES1を鋳型として、さらにプライマー対P9/P10を用いて、SacII及びNheI制限部位にフランキングされるEYFPカセット、および、上流と下流のLoxP配列を増幅し、pCR2.1-TopoでクローニングしてプラスミドpCES2を得た。プラスミドpCR-Topo-gCを作製するために、5.87kbpのgC含有フラグメント(プライマーgC-1及びgC-2を用いてRacL11ゲノムから増幅させた)をpCR2.1-Topoでクローニングした。SacII及びNheIで消化した後、EYFPカセットをpCES2から遊離させ、さらにpCR-Topo-gCに移してgC遺伝子と置き換え、この組換えシャトルプラスミドをTopo-ΔgC-EYFPと名付けた。プラスミドpCES1、pCES2、pCR-Topo-P1P4及びTopo-ΔgC-EYFPは消化及びシークェンシングによって同定した。このクローニングの模式図は図2に示されている。
プラスミドの構築及びシークェンシングに用いた全てのプライマーは表1に列挙した。
RK13_Pol細胞で発現されたDNAポリメラーゼの検出のために、HA Tagに対するモノクローナル抗体(MAb)(H3663, Sigma)を用いた。6ウェルプレートで増殖させたRK13_Pol細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、PBS中の3.5%パラホルムアルデヒドで室温(RT)にて1時間固定し、続いて30mMグリシン含有PBSに5分インキュベートし、PBS中の0.1%トリトンX-100をさらに5分浸透させた。PBSで洗浄した後、細胞をPBS-3%ウシ血清アルブミン(BSA)で30分、室温でブロッキングした。続いて細胞をPBS-3%BSAで1:10000に稀釈した一次抗体と1時間 RTでインキュベートし、さらにPBSで十二分に洗浄した。PBS-3%BSAで1:2000に稀釈した二次抗体(Alexa Fluor568-結合ヤギ抗マウスIgG, Invitrogen)を添加し、RTで1時間インキュベートした。10分間ずつ3回十分に洗浄した後、蛍光シグナルを倒立蛍光顕微鏡(Axiovert 25, Zeiss)下で精査した。
gCタンパク質の欠如を確認するために、RK13細胞を6ウェルプレートに播種し、野生型RacL11、変異体L11_D752NΔgC又はgC復帰体L11_D752NΔgCrevを0.0001の感染多重度(MOI)で感染させた。感染1時間後に、ウイルスを除去し、感染細胞にEMEM-2%FBS中の1.5%メチルセルロースを重層した。37℃で48時間インキュベートした後、細胞を固定し、上記のようにブロッキングした。EHV-1 gCタンパク質に対するMAb 1G4及びEHV-1 gMタンパク質に対するMAb B8を一次抗体としてそれぞれ1:100及び1:200の稀釈で用いた。二次抗体(Alexa Fluor568-結合ヤギ抗マウスIgG)と1時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、プラークを観察した。
RacL11ウイルスDNA及びシャトルプラスミドpCR-Topo-P1P4をRK13_Polに共同トランスフェクトすることによって、真性ポリメラーゼ遺伝子をEYFPで置き換えてPol陰性ウイルス変異体L11_ΔPol EYFPを作製した。L11_ΔPol EYFPはRK13_Polでのみ増殖できるが、非補完性RK13細胞では増殖できないことが見出された(図4)。このことは、DNAポリメラーゼはEHV-1のin vitroウイルス増殖に必須であることを立証する。続いて、神経性D752から非神経性N752遺伝子型への変異を、EHV-1 NY03の非神経性ポリメラーゼ遺伝子のL11_ΔPol EYFPへ復帰によって達成した。一アミノ酸変更は、変異体L11_D752Nの780bpアンプリコンのシークェンシングによって確認した。L11_D752Nをもとにして、gC遺伝子の1222bpフラグメント(ヌクレオチド94位から1315位)を表すSacII/NheI領域をEYFPで置き換え、gC陰性中間体L11_D752NΔgC EYFPを得た。Creの発現によって、最終的にEYFPカセットを切り出し、当該操作変異体L11_D752NΔgCのSacIIとNheI制限部の間に1コピーのLoxP配列(34bp)を残した。gC遺伝子内の当該欠失を確認するために、PCRを実施した。親変異体L11_D752Nから、プライマー対gC-1/gC-2及びΔgC-1/ΔgC-2を用いて5.87kbp及び1.6kbpフラグメントを増幅できたが、しかしながらL11_D752NΔgCからは4.68kbp及び410bpフラグメントが増幅され(図2)、gC遺伝子内に1.2kbpの欠失が存在することを示唆した。抗EHV-1gCモノクローナル抗体を用いたIFAによって、gCタンパク質は、RacL11又は復帰体L11_D752NΔgCrevに感染した細胞で検出できるが、L11_D752NΔgC感染細胞では検出できず、gCタンパク質の発現が停止したことを示すことができた(図5)。gC陰性で非神経性RacL11変異体の作製はしたがって成功した。
ウイルス吸着アッセイ:
ウイルス吸着アッセイは、Sunらの記載にわずかな改変を加えて実施した(Sun et al., J Gen Virol 77, 493-500, 1996)。6ウェルプレートに播種したRK13細胞単層を4℃で1時間冷却し、RacL11、L11_D752N、L11_D752NΔgC又はL11_D752NΔgCrevをウェル当たり400プラーク形成単位(PFU)のMOIで感染させた。種々の時間にわたって(0、15、30、60、120、240分)吸着させるために、ウイルスは4℃でそのままにした。種々の時点で、感染細胞をPBSで3回洗浄し、2%FBS及び1.5%メチルセルロースを含むEMEMを重層した。3日間37℃でインキュベートした後、細胞を10%ホルムアルデヒドで固定し、0.3%のクリスタルバイオレットで染色した。プラークを数え、240分の時点(100%吸着と設定)と比較した各時点でのウイルス吸着パーセンテージを計算した。
プラークサイズ及び一段階増殖カイネティクス:
プラークサイズを比較するために、6ウェルプレートに増殖させたRK13細胞にRacL11野生型及び変異体L11_D752N、L11_D752NΔgC又はL11_D752NΔgCrevを0.0001のMOIで感染させ、感染2時間後に、2%FBS含有EMEM中の1.5%メチルセルロースを重層した。感染3日後に、抗EHV-1 gMモノクローナル抗体B8を用いIFAによってプラークを可視化させた。各ウイルスについて、50プラークを撮影し、平均プラーク面積をイメージJソフト(http://rsb.info.nih.gov/ij/)を用いて測定した。RacL11によって生じたプラークサイズを100%に設定した。平均パーセンテージ及び標準偏差を3つの独立した実験から計算した。一段階増殖カイネティクスアッセイのために、24枚のプレートに播種したRK13細胞を3のMOIで感染させた。ウイルスを4℃で1時間吸着させ、その後37℃で1.5時間の侵入工程が続いた。PBSで2回洗浄した後、感染細胞を氷冷クエン酸緩衝食塩水(CBS;pH3.0)で3分間処理して表面のウイルスを除去した。種々の時点(感染後0、4、8、12、24、36、48時間)で、上清及び細胞を別々に収集した。通常のプラークアッセイを用いて、細胞外及び細胞結合ウイルス力価を決定した。
in vitro増殖特性:
種々のウイルス変異体の培養細胞におけるin vitro増殖特性を分析した。L11_D752NΔgCの標的細胞との結合能力におけるgC欠失の影響を精査するために、吸着アッセイを実施した。予想したように、L11_D752NΔgCは、野生型RacL11、親ウイルスL11_D752N又は復帰体L11_D752NΔgCrevと比較したとき、RK13細胞に対してより低い効率の結合を示した(図6)。細胞から細胞へ拡散するL11_D752NΔgCの能力はプラークサイズの比較によって決定した。野生型、親ウイルス及びgC復帰体間で顕著な相違は認められなかったが、しかしながらL11_D752NΔgCによって形成される相対的プラーク面積は他のものの面積よりも10%大きく(p<0.0001)、gCの欠如によりHEV-1の細胞から細胞への拡散はより効率的でさえあることを示唆している。増殖カイネティクスに関しては、L11_D752NΔgCのin vitro複製は、野生型、親ウイルス又はgC復帰体と比較した細胞外力価及び細胞内力価(それぞれ約20倍及び10倍低下した)によって示されるように効率が低下した(図8)。野生型RacL11、親ウイルスL11_D752N又は修復されたL11_D752NΔgCrevに感染した細胞培養上清のウイルス力価は、感染後約12時間で細胞内力価の値に達した。しかしながら、L11_D752NΔgC感染細胞では、感染性子孫の放出の遅れは、感染の16−18時間後に細胞外力価が細胞内力価を超えるということによって認められた。これらの結果から、L11_D752NΔgCはわずかに大きなプラークを形成できるが、そのin vitro増殖はウイルス結合及び放出において損なわれていると結論することができよう。
野生型RacL11並びに変異体L11_D752N、L11_D752NΔgC及びL11_D752NΔgCrevを27,000rpmで1時間超遠心分離によって精製した。ペレットをPBSに懸濁し、新鮮なRK13細胞で滴定し、適量に小分けして使用まで-70℃で保存した。3週齢の雌のBALB/cマウス(Harlan)をそれぞれ16匹ずつ5グループにランダムに割り当て、互いに環境に順応させるために、生物安全性レベル2の施設で1週間維持した。0日目に全マウスの体重を測定し、0.1mL/10gのキシラジン/ケタミンで麻酔し、4グループの鼻内(IN)に20μLのPBS中に1x105 PFUの用量の各ウイルスを接種した。最後のグループは陰性コントロールとして用い、20μLのPBSを投与した。各マウスの体重を接種後(p.i.)14日まで調べた。各グループから3匹のマウスを2日目及び4日目に安楽死させた。肺を取り出し、その一部分を均質化してRK13細胞での標準的な滴定によるウイルス力価の決定に用い、残りを10%ホルムアルデヒドで固定し、組織病理学的分析のために処理した。28日目に、鼻内ルートによりマウスを1x105 PFUの用量の野生型RacL11でチャレンジした。個々の体重データは2週間収集した。チャレンジ後(p.c.)2日目及び4日目に、各グループの3匹のマウスを安楽死させ、肺を取り出した。均質化後に肺組織のウイルス力価を新鮮なRK13細胞で決定した。
接種後2日目に、RacL11、L11_D752N又はL11_D752NΔgCrev感染肺の平均ウイルス力価は、それぞれ5366 PFU/mg、3450 PFU/mg及び4800 PFU/mgに達し(図9)、前記力価間に統計的に有意な相違は認められなかった(pは0.442以上)。この結果は、DNAポリメラーゼにおけるD752からN752への一アミノ酸変更はマウスのEHV-1のin vivo増殖を損なわないことを示し、これは以前の発見(Goodman et al., 2007)と一致した。対照的に、gC陰性変異体L11_D752NΔgCのin vivo複製の効率は有意に低下し(p<0.001)、平均ウイルス力価は肺組織でわずかに0.45 PFU/mgであった。接種後4日目には、L11_D752NΔgC感染マウスからウイルスは回収できなかった。接種後2日目の組織病理学的変化に関しては、野生型RacL11又はポリメラーゼ陰性変異体L11_D752N感染マウスの肺は軽度の化膿性肺炎を示し、好中球浸潤、血管周囲浮腫の亢進並びにリンパ管及び血管周囲領域の炎症性細胞(主としてリンパ球)数の増加を伴ったが、L11_D752NΔgC感染肺及びPBS肺では異常は検出されなかった(図10)。炎症応答の結果として、RacL11、L11_D752N又は救済ウイルスL11_D752NΔgCrev感染マウスの持続的な体重減少が接種後3日まで観察された。しかしながら、L11_D752NΔgC感染マウスの体重は明白な減少を示さなかった。接種後28日目に、RacL11を全マウスの鼻内にチャレンジした。チャレンジ2日後、RacL11は偽接種マウスの肺で2100PFU/mLの力価まで複製したが、L11_D752NΔgCグループではわずかに18.8PFU/mLであった(図9)。チャレンジ後2日目のRacL11、L11_D752N又はL11_D752NΔgCrev接種マウスの肺におけるウイルス力価はさらに低くかったが(0.5、0.9及び1.3PFU/mL、図9)、しかしながら前記は高い増殖効率及びin vivo病原性の代償であった。4日目に、L11_D752NΔgCグループからのウイルスの再単離は不成功であった。これらの結果から、我々は、gC陰性、非神経性変異体L11_D752NΔgCは極めて弱毒化され、マウスで非病原性であるが、防御免疫を付与できると結論した。
ウマ(6から8カ月齢の仔ウマ)をA、B及びCの3グループに分けた。グループAは、gC遺伝子を欠失させた生弱毒EHV-1ウイルス(L11_D752NΔgC)で処置した。グループBは生弱毒EHV-1ウイルス(RacL11)で処置した。グループCはコントロールグループであった。ワクチン接種及びサンプル採取は表2に示すスケジュールにしたがって。
コントロールのウマのチャレンジ後の臨床徴候には、三相発熱応答及び中等度から重度の鼻汁排出を特徴とする呼吸器症状が含まれた。対照的に、高熱が両ワクチングループのウマで単に偶発的に見出され、鼻汁排出は重篤さと持続期間において軽減された。ワクチン接種の顕著な効果は、グループ1及び2の両グループでチャレンジ後の5/8のウマにおけるウイルス血症の完全な欠如であった(図12)。さらにまた、コントロールのウマと比較して、ワクチン接種グループでウイルス血症の持続期間が短縮された。図13は、グループAは鼻拭き取り検体でウイルス排出を顕著に軽減するが、グループBにおける鼻のウイルス排出はより変動性であり、しかしながらコントロールのウマと比較してウイルス排出は減少することを示している。
RacL11のgC遺伝子のシークェンシングを実施し、それぞれDNA及びタンパク質配列のための配列番号:34及び配列番号:35によって提示される。
記載した方法の厳密な細目は、本開示の範囲を逸脱することなく変更及び改変し得ることは明白であろう。我々は、下記の特許請求の範囲及び趣旨に含まれる全ての改変及び変更を特許請求する。
本明細書で引用及び参照した全ての文書類(“本明細書の引用文書類”)及び本明細書の引用文書類中に引用又は参照されている全ての文書類は、本明細書に記載した任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、明細書、製品仕様書、及び製品明細書、並びに本明細書に参照により含まれる一切の文書類と併せて参照により本明細書に含まれ、さらに本発明の実施に用いることができる。
Claims (11)
- 組換えウマヘルペスウイルス-1(EHV-1)を含む組成物又はワクチンであって、前記組換えEHV-1において糖タンパク質C(gC)遺伝子が欠失しており、前記組換えEHV-1がさらにアミノ酸752位にアスパラギン(N)を含むDNAポリメラーゼ(Pol)を含む、前記組成物又はワクチン。
- EHV-1が、RacH株、RacL株、Ab4株、V592株、ケンタッキーD株、438/77株、AB69株、EHV-1 NY03株及び前記の組合せから成る群から選択されるEHV-1株から誘導される、請求項1に記載の組成物又はワクチン。
- EHV-1がEHV-1 RacL株から誘導され、該RacL株のDNAポリメラーゼ(Pol)がアミノ酸752位にアスパラギン(N)を含む、請求項1または2に記載の組成物又はワクチン。
- さらに、医薬的に又は獣医的に許容できるベヒクル、希釈剤、アジュバント又は賦形剤を含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の組成物又はワクチン。
- gC遺伝子が欠失しており、さらにアミノ酸752位にアスパラギン(N)を含むDNAポリメラーゼ(Pol)を含む、組換えEHV-1。
- EHV-1が、RacH株、RacL株、Ab4株、V592株、ケンタッキーD株、438/77株、AB69株、EHV-1 NY03株及び前記の組合せから成る群から選択されるEHV-1株から誘導される、請求項5に記載の組換えEHV-1。
- EHV-1がEHV-1 RacL株から誘導される、請求項6に記載の組換えEHV-1。
- 非ヒト動物をワクチン免疫する方法であって、請求項1から7のいずれか1項に記載の組成物又は組換えEHV-1の少なくとも1回の投与を含む、前記方法。
- プライム-ブースト投与スケジュールを含む、請求項8に記載の方法。
- 非ヒト動物でヘルペスウイルスに対する防御応答を誘引する方法であって、請求項1から4のいずれか1項に記載の組成物若しくはワクチンまたは請求項5から7のいずれか1項に記載の組換えEHV-1を非ヒト動物に投与することを含む、前記方法。
- 動物がウマ科の動物である、請求項8から10のいずれか1項に記載の方法。
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