ES2866108T3 - Vectores poxvirales recombinantes que expresan proteínas de la rabia y OX40 y vacunas fabricadas a partir de los mismos - Google Patents

Vectores poxvirales recombinantes que expresan proteínas de la rabia y OX40 y vacunas fabricadas a partir de los mismos Download PDF

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Abstract

Vector de ALVAC que comprende un polinucleótido que codifica: a) dos polipéptidos G de la rabia que tienen cada uno al menos un 90% de identidad con la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1, en el que cada uno de los polipéptidos G de la rabia es codificado por una parte del polinucleótido insertado en un locus C5 del vector: y (b) un polipéptido OX40L que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia establecida en las SEQ ID NO: 12, 63, 64, 65, 66, 67, 70 o 71, en el que el polipéptido OX40L es codificado por una parte del polinucleótido insertado en el locus C6 del vector.

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores poxvirales recombinantes que expresan proteínas de la rabia y OX40 y vacunas fabricadas a partir de los mismos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere en general a vacunas virales y procedimientos de uso de las mismas. Más particularmente, la presente invención se refiere a vectores virales que pueden comprender uno o más adyuvantes genéticos, lo que da lugar a una mayor respuesta inmunitaria a un antígeno expresado por un gen en un vector, ventajosamente un vector viral.
ANTECEDENTES
La rabia es una enfermedad que puede aparecer en todas las especies de sangre caliente y es causada por el virus de la rabia. La infección por el virus de la rabia seguido por el brote de las características clínicas en casi todos los casos da lugar a la muerte de las especies infectadas. El virus de la rabia es un virus de ARN de cadena negativa no segmentada de la familia Rhabdoviridae. Los viriones del virus de la rabia se componen de dos componentes estructurales principales: una nucleocápside o ribonucleoproteína (RNP), y una envoltura en forma de una membrana bicapa que rodea el núcleo de RNP. El componente infeccioso de todos los Rhabdovirus es el núcleo de RNP que consiste en el genoma de ARN encapsidado por la proteína de la nucleocápside (N) en combinación con dos proteínas menores, es decir, ARN-polimerasa (L) dependiente de ARN y la fosfoproteína (P). La membrana que rodea el núcleo de RNP consiste en dos proteínas: una glucoproteína transmembrana (G) y una proteína de matriz (M) situada en el sitio interior de la membrana.
La proteína G, también referida como proteína “spike”, es responsable de la unión celular y de fusión de membranas en virus de la rabia y, además, es la principal diana para el sistema inmunitario del huésped. La región de aminoácidos en la posición 330 a 340 (referida como sitio antigénico III) de la proteína G se ha identificado como responsable de la virulencia del virus, en particular, el residuo Arg en la posición 333. Todas las cepas de virus de la rabia tienen este sitio antigénico III determinante de la virulencia en común. Las vacunas contra la rabia convencionales para animales de compañía comprenden la rabia inactivada más adyuvantes, que son bien conocidos en la técnica, son de naturaleza diversa. Los adyuvantes pueden, por ejemplo, consistir en sales inorgánicas insolubles en agua, liposomas, micelas o emulsiones, es decir, adyuvante de Freund. Otros adyuvantes se pueden encontrar en Vogel y Powell, 1995, mencionado anteriormente. Aunque no existe un mecanismo único de acción adyuvante, una característica esencial es su capacidad de aumentar significativamente la respuesta inmunitaria a un antígeno de vacuna en comparación con la respuesta inducida por el antígeno de vacuna solo (Nossal, 1999, supra; Vogel y Powell, 1995, supra). En este sentido, algunos adyuvantes son más eficaces para aumentar la respuesta inmunitaria humoral; otros adyuvantes son más eficaces en el aumento de respuestas inmunitarias mediadas por células (Vogel y Powell, 1995, supra); y aún otro grupo de adyuvantes aumentan tanto las respuestas inmunitarias humorales como las mediadas por células contra antígenos de vacuna (Vogel y Powell, 1995, supra). En suma, los adyuvantes generalmente parecen ejercer sus efectos en al menos una de las cinco maneras: 1) facilitar la captación, el transporte y la presentación de antígenos en los ganglios linfáticos, 2) prolongar la presentación de antígenos, 3) señalar receptores de reconocimiento de patógenos (PRR) expresados en células inmunitarias innatas, 4) causar daño o estrés a las células, lo que indica una respuesta inmunitaria, y 5) inducir una respuesta preferencial Th1 o Th2 (Schijns VE et al. 2007). La inmunogenicidad de los antígenos también puede aumentar mediante el uso de adyuvantes genéticos, tales como ligandos para los receptores que residen en las membranas celulares inmunitarias. Los adyuvantes genéticos para las vacunas de ADN han sido revisados (véase, por ejemplo, Calarota y Weiner, Expert Rev Vaccines, Agosto 2004; 3 (4 Supl.): 135-49 S, Calarota y Weiner, Immunol Rev. 2004 Jun; 199: 84-99 y Kutzler y Weiner, J Clin Invest 2004 Nov; 114 (9): 1241-4), sin embargo, adyuvantes genéticos para las vacunas virales, especialmente para las vacunas virales basadas en poxvirus o virus de la viruela, siguen siendo menos estudiados.
Varios miembros de la superfamilia de factor de necrosis tumoral (TNFSF) y sus correspondientes receptores (TNFRSF) han demostrado para proporcionar señales coestimuladoras críticas para la respuesta inmunitaria (Watts Th Annu Rev Immunol 2005; 23:. 23-68). OX40 ligando (OX40L), también conocida como gp34, CD252, CD134L o TNFSF4, es un miembro de la superfamilia de TNF. OX40L humana comparte 46% de identidad de secuencia de aminoácidos con su homólogo de ratón. Similar a otros miembros de la superfamilia del TNF, unida a la membrana OX40 Ligando existe como un homotrímero. OX40L se une a OX40 (CD134), un miembro de la superfamilia de receptores TNF. OX40 se expresa en células T activadas, mientras que su ligando, OX40L es inducida en células activadas presentadoras de antígeno (APCs), tales como células B, y células dendríticas (DCs) [Watts TH. 2005 supra, Sugamura K, et al, Nat Rev Immunol 2004; 4 (6): 420-31]. La interacción OX40 OX40L puede promover la proliferación, la diferenciación, y especialmente la supervivencia de las células T CD4 (Rogers PR, et al, Inmunidad 2001; 15 (3):.. 445-55; Canción J, et al, Nat Immunol 2004; 5 (2): 150-8). La ligación de OX40 se ha demostrado para mejorar ex vivo respuestas de memoria de células humanas T CD8 contra los virus, incluyendo el VIH-1, virus de Epstein-Barr (EBV), y virus de la gripe (Serghides L, et al, J Immunol 2005;.. 175 (10): 6368-77;). Co­ inmunización de ratones con OX40L-expresión de la viruela del canario y la vacuna de la viruela del canario VIH-1, vCP1452, aumentado las respuestas específicas de células T CD8 en términos de frecuencia y la expresión de citoquinas (Liu J. et al, Vaccine 2009 1 VIH-;.. 275077 a 5084). Sin embargo, OX40L no mejoró las respuestas de anticuerpos producidas por la vacuna de viruela del canario VIH-1, lo que sugiere que, los vectores de canario que expresa OX40L pueden mejorar la inmunogenicidad humoral celular pero no de vacunas contra el VIH-1 del canario. Liu J. et al., 2009, supra).
En la presente descripción, el OX40L es coexpresado junto con G de la rabia por el mismo recombinante en comparación con trabajos previos por Serghides L, et al., 2005, supra, donde se utilizó OX40L expresado en adenovirus en combinación con péptidos de la gripe en estudios in vitro o el trabajo descrito por Liu J. et al., 2009, donde la viruela del canario que expresa OX40L y la viruela de canario que expresa VIH-1 fueron coadministradas. Sorprendentemente, este coexpresión de OX40L resultó en un incremento de 2 a 3 veces en máximos de títulos de anticuerpos neutralizantes contra la rabia en oposición a la ausencia de mejora en la inmunogenicidad humoral en el trabajo desarrollado por Liu J. et al., 2009, supra.
Una vacuna contra la rabia con adyuvante genético para animales de compañía sería muy deseable, ya que podría evitar o reducir las consecuencias negativas asociadas actualmente con las vacunas con adyuvante químico convencional (por ejemplo, reacciones en el lugar de la inyección, malestar, dolor, respuestas inmunes no específicas, mayor riesgo de cáncer, etc.). Por ejemplo, en gatos, se han descrito sarcomas asociados a la vacuna para desarrollar en asociación con la administración de algunas vacunas con adyuvante. Por lo tanto, hay una necesidad de una vacuna viral eficaz y segura, especialmente con respecto a la expresión de un antígeno, epítopo, inmunógeno, péptido o polipéptido de interés diana en una cantidad suficiente para provocar una respuesta protectora.
CN20101213205 da a conocer la necesidad de vacunar contra el HBV, y como una solución para este problema describe además vacunas que comprenden secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido del virus (HBcAg), y un polipéptido OX40L, separado por un IRES.
US6309647 da a conocer constructos basados en ALVAC y que comprenden glicoproteína G del virus de la rabia.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
En una realización, la presente invención se refiere a un vector de ALVAC que comprende un polinucleótido que codifica:
a) dos polipéptidos G de la rabia que tienen cada uno al menos un 90% de identidad con la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1,
en le que cada uno de los polipéptidos G de la rabia es codificado por una parte del polinucleótido insertado en un locus C5 del vector: y
(b) un polipéptido OX40L que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia establecida en las SEQ ID NO: 12, 63, 64, 65, 66, 67, 70 o 71,
en el que el polipéptido OX40L es codificado por una parte del polinucleótido insertado en el locus C6 del vector.
En otra realización, la presente invención también se refiere a una composición que comprende:
a) el vector de la presente invención; y
b) un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable.
En otra realización, la presente invención se refiere además a dicha composición para usar en un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica o protectora contra la rabia que comprende administrar dicha composición.
Un objetivo de esta divulgación puede ser cualquiera o todos de proporcionar de vectores recombinantes o virus, así como procedimientos para fabricar dichos virus, y proporcionar composiciones y/o vacunas, así como composiciones para usar en procedimientos para el tratamiento y la profilaxis de la infección.
En el presente documento se describe un vector recombinante, tal como un virus recombinante, por ejemplo, un poxvirus recombinante, que contiene y expresa al menos una molécula de ácido nucleico exógena y, dicha al menos una molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una molécula de ácido nucleico que codifica un inmunógeno o epítopo de interés de la rabia, tal como G de rabia.
Se describen en el presente documento multitud de antígenos que se han expresado con éxito in vivo en un huésped animal, para provocar una respuesta inmunológica y/o inmunológica protectora, utilizando un poxvirus u otro vector de expresión viral adecuado, incluyendo adenovirus, virus adeno-asociado (AAV), paramixovirus, virus de la enfermedad de Marek (MDV), virus de la enfermedad de Newcastle, (NDV), virus infeccioso de la bursitis (IBDV), virus de la bronquitis infecciosa (IBV), etc. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a virus del moquillo canino, virus de la enfermedad de fiebre aftosa (FMDV, US7527960 de Merial), gripe (US7384642, US7910112, US6713068, y US7507416, cada uno de Merial), virus de la lengua azul (BTV, US7862821 de Merial), circovirus porcino de tipo II (PCV2, US6497883 de Merial), virus Nipah (US7803612 de Merial), virus Hendra, virus del nilo del oeste (WnV, US7740863 de Merial), virus de la leucemia felina (FeLV, US7582302 de Merial), Leishmania canina (US7794736 de Merial), calicivirus felino (FCV, US6914134 de Merial), virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV, US6096535 de Merial), virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), virus de la peste equina africana (AHSV, US2010/0119546A1 de Merial) y virus de la estomatitis vesicular (US8008268 de Merial).
En particular, se describe en el presente documento un vector recombinante, tal como un virus recombinante, por ejemplo, un poxvirus recombinante, que contiene y expresa al menos una molécula de ácido nucleico exógena y, dicha al menos una molécula de ácido nucleico exógena puede comprender cualquier antígeno adecuado, incluyendo polipéptidos G de la rabia y/o variantes o fragmentos de los mismos.
En el presente documento se describe un vector recombinante, tal como un poxvirus recombinante, que contiene un primer polinucleótido que codifica un polipéptido G de la rabia y/o variante o fragmento del mismo y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido de unión al receptor de TNFa y/o variante o fragmento del mismo.
Se describen en el presente documento composiciones o vacunas que comprenden dicho vector de expresión o el producto o productos de expresión de dicho vector de expresión.
También se describen en el presente documento procedimientos para inducir una respuesta inmunológica (o inmunógena) o protectora contra la rabia, así como en procedimientos para la prevención o tratamiento de la rabia o estado o estados de la enfermedad causados por la rabia, que comprende administrar el vector de expresión o un producto de expresión del vector de expresión, o una composición que comprende el vector de expresión, o una composición que comprende un producto de expresión del vector de expresión.
Se describen también en el presente documento productos de expresión del virus, así como anticuerpos generados a partir de los productos de expresión o la expresión de los mismos in vivo y usos para tales productos y anticuerpos, por ejemplo, en aplicaciones de diagnóstico.
También se describen en el presente documento kits que comprenden al menos un polipéptido de la rabia o un fragmento o variante del mismo e instrucciones de uso.
La presente invención también se basa, en parte, en el resultado inesperado y sorprendente de que los vectores poxvirales que coexpresan in vivo en un animal huésped genes que codifican antígenos de patógenos, incluyendo, pero no limitado a, la rabia, y un adyuvante genético de ligando TNFa R, incluyendo, pero no limitado a, OX40L, pueden provocar en el animal una inmunidad protectora de larga duración contra la rabia. En particular, el OX40L puede ser homólogo a la especie que se vacuna, por ejemplo, OX40L canino (cOX40L) puede combinarse eficazmente con G de la rabia en una vacuna canina contra la rabia.
Estos y otras realizaciones se describen o son obvios a partir de y están abarcadas por la siguiente descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Una descripción completa y práctica de la presente invención, incluyendo el mejor modo de la misma, para un experto normal en la técnica, se expone más particularmente en el resto de la memoria descriptiva, incluyendo referencia a las figuras adjuntas, en las que:
La figura 1 proporciona un esquema para la construcción del plásmido donante P397-G de rabia sint. Se muestra la localización de cebadores de secuenciación utilizados para verificar la secuencia de los brazos C3 flanqueantes, así como G de rabia sintética;
la figura 2 proporciona una representación esquemática de la organización genómica de vCP3006, que porta G de rabia sintética en el sitio de C3 y G de rabia clásica en el sitio C5;
la figura 3 es una imagen de ADN genómico aislado de ALVAC de tipo salvaje y vCP3006, que había sido digerido con HindIII, BamHI o XbaI, y se separó mediante electroforesis en gel de agarosa;
la figura 4 presenta una transferencia Southern del gel representado en la figura 3 (ADN genómico de ALVAC de tipo salavaje y vCP3006), que había sido hibridada con una sonda específica de G de rabia sintética;
la figura 5 presenta un análisis de transferencia Western de la expresión de vCP3006. Una banda correspondiente a G del virus de la rabia sólo pudo ser detectada en granulares celulares infectados con vCP3006 (izquierda). Se cargaron diferentes cantidades de muestras de células infectadas de células infectadas con MOI similar de vCP3006 o vCP65a para la comparación de la expresión de proteína G (a la derecha);
la figura 6 proporciona un dibujo esquemático dela región C3 de vCP3006 que muestra localizaciones de cebadores;
la figura 7 proporciona la secuencia de vCP3006 que cubre los brazos C3 flanqueantes, el promotor I3L, así como la G de rabia sintética (la secuencia completa es como se expone en SEQ ID NO: 2);
la figura 8 presenta la secuencia de aminoácidos predicha de glicoproteína G de virus de rabia optimizado de codones sintética (SEQ ID NO: 1);
la figura 9 es un diagrama de clonación esquemática del plásmido donante p397-cOX40L;
la figura 10 es una representación esquemática de la organización genómica de vCP3015, que porta G del virus de la rabia clásica en el sitio C5 y cOX40L en el sitio C6;
la figura 11 es una imagen en gel de agarosa que presenta la separación de ADN genómico digerido con NruI en electroforesis en gel (derecha) y la hibridación de transferencia Southern usando la sonda cOX40L;
la figura 12 es una imagen en gel de agarosa que presenta la separación de ADN genómico digerido con NruI (izquierda) y la hibridación de transferencia Southern usando sonda de G del virus de la rabia clásica (derecha). Esta sonda abarca la proteína G de la rabia clásica y 389 pb del brazo derecho C5, debido a la unión a la sonda de 389 pb hay una señal de hibridación débil con el genoma de ALVAC parental, (carril 3), pero con un tamaño de banda diferente del de vCP3015.
la figura 13 es un análisis de transferencia Western de vCP3015. Una banda correspondiente a G del virus de la rabia sólo pudo ser detectada en el gránulo de células infectadas con vCP3015;
la figura 14 es un dibujo esquemático de la región C6 de vCP3015 que muestra las localizaciones de cebadores; la figura 15 es la secuencia de vCP3015 que cubre los brazos C6 flanqueantes, el promotor 42K, así como la cOX40L sintética (colectivamente como se expone en SEQ ID NO: 7)
la figura 16 es la secuencia de aminoácidos predicha de cOX40L sintética (SEQ ID NO: 12, 63, 64, 65, 66, o 67); la figura 17 un dibujo esquemático de la región C5 de vCP3015 que muestra las localizaciones de los cebadores; la figura 18 es la secuencia de vCP3015 que cubre el brazo flanqueante C5, el promotor H6, así como G del virus de la rabia clásica (colectivamente como se expone en SEQ ID NO: 13)
la figura 19 es la secuencia de aminoácidos predicha de G del virus de la rabia clásica (SEQ ID NO: 1). Las secuencias de aminoácidos predicha de G clásica y G optimizada de codones (SEQ ID NO: 1) son 100% idénticas; la figura 20 es una representación esquemática de la organización genómica de vCP3012, que porta G del virus de la rabia clásica en el sitio C5, G del virus de la rabia sintética optimizada de codones en el sitio C3 y cOX40L en el sitio C6;
la figura 21 representa la separación de ADN genómico digerido con PmeI en electroforesis en gel e hibridación por transferencia Southern utilizando sonda de G del virus de la rabia clásica;
la figura 22 representa la separación de ADN genómico digerido con BamHI en electroforesis en gel e hibridación por transferencia Southern utilizando sonda de G del virus de la rabia sintética;
la figura 23 representa la separación de ADN genómico digerido con NruI en electroforesis en gel e hibridación por transferencia Southern utilizando sonda G del virus de la rabia clásica;
la figura 24 es un análisis de transferencia Western de vCP3012. Una banda correspondiente a G del virus de la rabia era detectable en gránulos celulares infectados;
la figura 25 es un dibujo esquemático de la región C6 de vCP3012 que muestra localizaciones de cebadores;
la figura 26 presenta la secuencia de vCP3012 que cubre los brazos C6 flanqueantes, el promotor 42K, así como la cOX40L sintética (colectivamente como se expone en SEQ ID NO: 17);
la figura 27 es un dibujo esquemático de la región C3 de vCP3012 que muestra localizaciones de cebadores;
la figura 28 presenta la secuencia de vCP3012 que cubre los brazos C3 flanqueantes, el promotor I3L, así como la G de la rabia sintético (colectivamente como se expone en SEQ ID NO: 20);
la figura 29 presenta un diagrama esquemático de un fragmento de vCP3012, desde C5R a C5L (es decir, G del virus de la rabia y las regiones flanqueantes);
la figura 30 presenta la secuencia de vCP3012 de C5R a C5L que abarca el gen G de la rabia (colectivamente como se expone en SEQ ID NO: 23). Los aminoácidos predichos de G del virus de la rabia clásica (SEQ ID NO: 1) y G del virus de la rabia sintética (SEQ ID NO: 1) son 100% idénticos y son los mismos que los descritos para vCP3006 o vCP3015;
la figura 31 es un gráfico de GMT y el intervalo de confianza del 95% (CI) para el día 14;
la figura 32 es un gráfico de GMT y el intervalo de confianza del 95% (CI) para el día 21;
la figura 33 es un gráfico de GMT y el intervalo de confianza del 95% (CI) para el día 28;
la figura 34 es un gráfico de GMT y el intervalo de confianza del 95% (CI) para el día 48;
la figura 35 es un gráfico que presenta los títulos de grupo;
la figura 36 es una descripción de SEQ ID NOs: 1-24, 63-67;
la figura 37 es una descripción de SEQ ID NOs: 25-62;
la figura 38 presenta una alineación de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 12, 63-67 (es decir, péptidos OX40L seleccionados). La tabla adjunta indica el porcentaje de identidad entre las secuencias.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se proporcionan composiciones que comprenden un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la rabia y fragmentos y variantes del mismo que provocan una respuesta inmunogénica en un animal. El vector de expresión que comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido de la rabia o fragmentos o variantes se puede formular en vacunas o composiciones farmacéuticas y se usan para provocar o estimular una respuesta protectora en un animal. En una realización, el polipéptido de la rabia es un polipéptido G de la rabia o un fragmento activo o variante del mismo.
Se proporcionan composiciones que comprenden un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido G de la rabia o fragmentos activos o variantes del mismo y un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L o fragmentos activos o variantes del mismo. En particular, el OX40L es un OX40L canino (cOX40L).
Se reconoce que los polipéptidos descritos en el presente documento pueden ser polipéptidos de longitud completa o fragmentos activos o variantes de los mismos. Por "fragmentos activos" o "variantes activas" se entiende que los fragmentos o variantes conservan la naturaleza antigénica del polipéptido. Por lo tanto, en este documento se describe cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de la rabia que provoca una respuesta inmunogénica en un animal. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de la rabia puede ser cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de la rabia, tal como, pero no limitado a, una proteína, péptido o fragmento o variante del mismo, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal, como un ave.
Un polipéptido de la rabia particular de interés es la glicoproteína de la rabia (G). G de la rabia se refiere a un tipo de glicoproteína que se encuentra en la superficie del virus de la rabia. Es una glucoproteína antigénica y es responsable de la unión del virus a la célula que se está infectando. Se entiende que se pueden usar los precursores de cualquiera de estos antígenos.
Los polipéptidos antigénicos de la descripción son capaces de proteger contra la rabia. Es decir, que son capaces de estimular una respuesta inmunitaria en un animal. Por "antígeno" o "inmunógeno" significa una sustancia que induce una respuesta inmunitaria específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o parte de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmunitaria a la presentación a un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno, o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.
Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "fragmento de polipéptido" se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y puede estar interrumpido por restos químicos distintos de aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo la formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje o bioactivo.
El término "polipéptido o polinucleótido de G la rabia” se refiere a cualquier polipéptido o polinucleótido de G de la rabia nativo u optimizado, y sus derivados y variantes.
El término "polipéptido o polinucleótido de OX40L " se refiere a cualquier polipéptido o polinucleótido o OX40L nativo u optimizado, y sus derivados y variantes.
El término "polipéptido inmunogénico o antigénico", como se usa en el presente documento incluye polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que una vez que se administra al huésped, es capaz de evocar una respuesta inmune de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por lo tanto, un fragmento de proteína tal como se describe en el presente documento comprende o consiste esencialmente en o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma, o fragmentos inmunogénicos de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y de este modo provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Tales fragmentos pueden ser identificados usando cualquier técnica de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando simultáneamente gran cantidad de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos están todavía unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en el sector y se describen en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos. No. 4.708.871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. De manera similar, los epítopos conformacionales son fácilmente identificados mediante la determinación de la conformación espacial de aminoácidos, tales como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Los procedimientos especialmente aplicables a las proteínas de T. parva se describen completamente en el documento PCT/US2004/022605.
En el presente documento se describen fragmentos activos y variantes del polipéptido antigénico. Por lo tanto, el término "polipéptido inmunogénico o antigénico" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones a la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica tal como se define en este documento. El término "variación conservativa" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos - aspartato y glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado que no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.
El término "epítopo" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al cual responden células B y/o células T específicas. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.
Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Normalmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped mostrará tanto una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, tal que la resistencia a una nueva infección se verá aumentada y/o la gravedad clínica de la enfermedad se verá reducida. Dicha protección se demostrará por una reducción o ausencia de síntomas normalmente mostrados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral disminuido en el huésped infectado.
Por "animal" se entienden mamíferos, aves, y similares. Animal o huésped tal como se usa en el presente documento incluye mamíferos y humanos. El animal puede seleccionarse del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos incluyendo guepardos y lince), ovino (por ejemplo, ovejas), bovino (por ejemplo, ganado), porcino (por ejemplo, cerdo), aves (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emu y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tarsero, mono, gibón, mono), hurones, focas, y pescado. El término “animal” también incluye un animal individual en todas sus fases de desarrollo, que incluyen fase embrionaria y fetal.
A menos que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Los términos singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Cabe señalar que en esta divulgación y, en particular, en las reivindicaciones y/o párrafos, términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de patentes de los Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye" y similares; y que términos tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de EE. UU., por ejemplo, permiten elementos que no se mencionan explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en el estado de la técnica o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.
Composiciones
Se describe en el presente documento una vacuna contra la rabia o la composición que puede comprender un vector recombinante o de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de la rabia y un portador, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. El polipéptido antígeno, epítopo o inmunógeno de la rabia puede ser cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de la rabia, tal como, pero no limitado a, una proteína, péptido o fragmento de los mismos, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal.
En el presente documento se describe una vacuna contra la rabia o la composición que puede comprender un vector recombinante o de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido G de la rabia y un portador, excipiente o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. En una realización, el vector de expresión puede comprender además un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L.
En otra realización, el portador, excipiente, o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una emulsión de agua-en-aceite. En aún otra realización, la emulsión agua-en-aceite puede ser una emulsión triple de agua/aceite/agua (W/O/W). En aún otra realización, el portador, excipiente o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable puede ser una emulsión aceite-en-agua.
En una realización, el polipéptido de la rabia, antígeno o fragmento o variante del mismo comprende un polipéptido G de la rabia o fragmento o variante del mismo. En un aspecto de esta realización, el polipéptido G de la rabia o fragmento o variante del mismo es un polipéptido recombinante producido por un gen de G de la rabia. En el presente documento se decribe el gen de G de la rabia que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 5 o 16. En el presente documento se describe que el polipéptido G de la rabia o fragmento o variante del mismo tiene al menos 80% de identidad con la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1.
En otra realización, el polipéptido, antígeno o fragmento o variante de OX40L es un polipéptido recombinante producido por un gen de OX40L. En el presente documento se describe el gen de OX40L tiene al menos 70% de identidad con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 10. Se describe además en el presente documento, el polipéptido OX40L o un fragmento o variante del mismo que tiene una identidad de al menos 80% con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 12, 63, 64, 65, 66, o 67.
En en presente documento se describe una nueva vacuna contra la rabia con adyuvante genético, para uso no exclusivo en animales de compañía, tales como gatos, perros y hurones, que comprende un vector de poxvirus recombinante, que contiene y expresa G de la rabia y OX40L. En otra realización, el vector puede comprender una viruela de canario recombinante. En el presente documento se describe que el gen de la glicoproteína de la superficie de la rabia puede codificar la glicoproteína G de la rabia, que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, y la OX40L tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 12, 63, 64, 65, 66, o 67.
Los antígenos sintéticos también se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, poliepítopos, epítopos flanqueantes, y otros antígenos recombinantes o derivados sintéticamente. Véase, por ejemplo, Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. Los fragmentos inmunogénicos, para los propósitos de la presente invención, incluirán generalmente al menos aproximadamente 3 aminoácidos, al menos aproximadamente 5 aminoácidos, al menos aproximadamente 10-15 aminoácidos, o aproximadamente 15-25 aminoácidos o más aminoácidos, de la molécula. No hay límite superior crítico para la longitud del fragmento, que puede comprender casi la longitud completa de la secuencia de la proteína, o incluso una proteína de fusión que comprende al menos un epítopo de la proteína.
Por consiguiente, una estructura mínima de un polinucleótido que expresa un epítopo es el que comprende o consiste esencialmente en o consiste en nucleótidos que codifican un epítopo o determinante antigénico de un polipéptido de la rabia. Un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido de la rabia puede comprender o consistir esencialmente en o consistir en un mínimo de 15 nucleótidos, aproximadamente 30-45 nucleótidos, aproximadamente 45-75, o al menos 57, 87 o 150 nucleótidos consecutivos o contiguos de la secuencia que codifica el polipéptido. Los procedimientos de determinación de epítopo, tales como, la generación de bibliotecas de péptidos que se solapan, Pepscan (Geysen et al, 1984 (Hemmer et al., 1998); Geysen y col., 1985; Van der Zee. R. et al, 1989; Geysen., 1990; Multipin.RTM Peptide Synthesis Kits de Chiron) y algoritmos (de Groot et al, 1999; PCT/US2004/022605) se pueden utilizar en la práctica de la invención. Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) y algoritmos (De Groot et al., 1999; PCT/US2004/022605) se pueden utilizar en la práctica de la presente invención.
El término "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refiere a ARN o ADN que es lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario, o un híbrido de los mismos. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de unión, tales como fluororibosa y tiolato, y ramas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación, con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son los agentes de bloqueo, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, y la introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes de marcaje, otros polinucleótidos o soporte sólido. Los polinucleótidos se pueden obtener por síntesis química o derivados de un microorganismo.
El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o sólo las secuencias de codificación como en ADNc y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Por ejemplo, el gen también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.
En cuanto a las variaciones de la OX40L, un "fragmento funcional o variante de OX40L" se define aquí como un péptido que actúa como adyuvante/aumenta la respuesta inmunitaria provocada por un péptido inmunogénico a través del mismo mecanismo, y en un grado comparable, en comparación con el OX40L de la presente descripción. Por ejemplo, si un OX40L felino, cuando se co-expresa con G de la rabia en un perro huésped, da lugar a una respuesta inmunitaria contra la rabia que es mayor que la provocada por un vector de expresión de G de la rabia por sí solo, y el OX40L felino está actuando a través del mismo mecanismo (por ejemplo, unión al receptor de TNF), entonces el OX40L felino se considera que es un "fragmento funcional o variante" de OX40L canino ejemplificado en este documento. Del mismo modo, las versiones polimórficas de OX40L canino que son capaces de aumentar una respuesta inmunitaria son también "fragmentos de función o variantes" de cOX40L. Finalmente, si una versión truncada de OX40L actúa como adyuvante/aumenta una respuesta inmunitaria en un grado comparable al correspondiente OX40L de longitud completa, la versión truncada se considera que es un "fragmento funcional o variante de OX40L".
Se describe además en el presente documento una hebra complementaria a un polinucleótido que codifica un antígeno, epítopo o inmunógeno de la rabia o a un polinucleótido que codifica un antígeno, epítopo o inmunógeno de OXL40. La hebra complementaria puede ser polimérica y de cualquier longitud y puede contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier combinación.
Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico o proteína u orgánulo) se refiere a un componente que se ha separado sustancialmente o purificado de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que se produce naturalmente el componente, por ejemplo, otro de ADN y ARN, proteínas y orgánulos cromosómicos y extracromosómicos. Los ácidos nucleicos y proteínas que han sido "aislados" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante procedimientos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados por tecnología recombinante, así como síntesis química.
El término "purificado" como se usa en el presente documento no requiere pureza absoluta; más bien, se pretende como un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación de polipéptido parcialmente purificado es una en la que el polipéptido está más enriquecido que el polipéptido está en su medio natural. Es decir el polipéptido se separa de los componentes celulares. Por "sustancialmente purificado" se entiende de manera que al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98%, o más de los componentes o materiales celulares se han eliminado. Del mismo modo, un polipéptido puede estar parcialmente purificado. Por "parcialmente purificado" se entiende que se elimina menos del 60% de los componentes o materiales celulares. Lo mismo se aplica a los polinucleótidos. Los polipéptidos descritos en este documento se pueden purificar por cualquiera de los medios conocidos en la técnica.
Por otra parte, homólogos de polipéptidos y homólogos de polipéptidos OX40L G de la rabia se describen en este documento. Como se usa aquí, el término "homólogos" incluye ortólogos, análogos y parálogos. Los TEM "análogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen la misma o similar función, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. El término "ortólogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos de diferentes especies, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos que tienen las mismas o similares funciones. El término "parálogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos usualmente tienen diferentes funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas. Por ejemplo, análogos, ortólogos, y parálogos de un polipéptido de la rabia de tipo salvaje pueden diferir del polipéptido de la rabia de tipo salvaje por modificaciones posteriores a la traducción, por diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambos. En particular, los homólogos descritos en este documento generalmente exhibirán al menos 80-85%, 85-90%, 90-95%, o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia, con la totalidad o parte de la polipéptido de tipo salvaje de la rabia o secuencias de polinucleótidos, y exhibirán una función similar.
Se describe además en el presente documento un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1. Además se describen en el presente documento son fragmentos y variantes de los polipéptidos de la rabia o polipéptidos OX40L identificados anteriormente (SEQ ID NO: 1 o 12, 63-67), que fácilmente se pueden preparar por un experto en la técnica usando técnicas de biología molecular bien conocidas.
Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos tal como se expone en la SEQ ID NO: 1 o 12, 63-67.
Las variantes incluyen variantes alélicas. El término "variante alélica" se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o variedad de virus). Tales variaciones alélicas naturales pueden dar lugar típicamente al 1-5% de la variación en un polinucleótido o un polipéptido. Las variantes alélicas pueden identificarse por secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en un conjunto de diferentes especies, que puede llevarse a cabo fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el locus genético del mismo gen en estas especies. Cualquiera y todas de dichas variaciones de ácido nucleico y los polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional del gen de interés, se decriben en el presente documento.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "derivado" o "variante" se refiere a un polipéptido, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que tiene una o más variaciones conservativas de aminoácidos u otras modificaciones menores, tales que (1) el polipéptido correspondiente tiene una función sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido de tipo salvaje o (2) un anticuerpo generado contra el polipéptido es inmunorreactivo con el polipéptido de tipo salvaje. Estas variantes o derivados incluyen polipéptidos que tienen modificaciones menores de las secuencias de aminoácidos primarias del polipéptido de la rabia u OX40L que pueden dar lugar a péptidos que tienen una actividad sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido homólogo sin modificar. Tales modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser espontáneas. El término "variante" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica tal como se define en este documento.
El término "variación conservativa" indica el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, tal como se describe anteriormente.
Un fragmento inmunogénico de un polipéptido de la rabia o polipéptido OX40L incluye al menos 8, 10, 13, 14, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, al menos 21 aminoácidos, al menos 23 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, o al menos 30 aminoácidos de un polipéptido G de la rabia que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, o variantes del mismo, o de un polipéptido OX40L tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 12, 63, 64, 65, 66, o 67, o variantes de los mismos.
En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido G de la rabia, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 5 o 16. Además se describe en el presente documento un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos.
En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 12, 63, 64, 65, 66 o 67. Además se describe en el presente documento un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 12, 63, 64, 65, 66, o 67, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos.
En el presente documento se describe un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 5, 10, o 16, o una variante del mismo. Se describe además en el presente documento un polinucleótido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con uno de un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 5, 10, o 16, o una variante del mismo.
Los polinucleótidos de la descripción incluyen secuencias que son degeneradas como resultado del código genético, por ejemplo, el uso de codones optimizados para un huésped específico. Tal como se usa en el presente documento, "optimizado" se refiere a un polinucleótido que se modifica mediante ingeniería genética para incrementar su expresión en una especie determinada. Para proporcionar polinucleótidos optimizados que codifican polipéptidos G de la rabia o polipéptidos OX40L, la secuencia de ADN del gen de G de la rabia o el gen de OX40L se puede modificar para 1) comprender codones preferidos por genes altamente expresados en una especie particular; 2) comprender un contenido de A T o G C en la composición de bases de nucleótidos con el hallado sustancialmente en dicha célula huésped; 3) formar una secuencia de iniciación de dicha especie; o 4) eliminar secuencias que causan la desestabilización, poliadenilación inapropiada, la degradación y terminación de ARN, o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de ARN. El aumento de la expresión de la proteína G de la rabia o proteína OX40L en dicha especie se puede lograr mediante la utilización de la frecuencia de distribución del uso de codones en eucariotas y procariotas, o en una especie particular. El término "frecuencia de uso de codones preferidos" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido determinado. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales son especificados por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas están incluidas en la descripción, siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido G de la rabia o el polipéptido OX40L codificado por la secuencia de nucleótidos esté funcionalmente inalterada.
La identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos puede establecerse por el “blas” por parejas del NCBI (Centro Nacional de Información sobre Biotecnología) y la matriz BLOSUM62, utilizando los parámetros estándar (véase, por ejemplo, el algoritmo BLAST o BLASTX disponible en el servidor del "Centro Nacional de Información sobre Biotecnología" (NCBI, Bethesda, Md., EE.UU.), así como en Altschul et al.; y por lo tanto, este documento habla de utilizar el algoritmo o BLAST o BLASTX y la matriz BLOSUM62 por el término “blasts”).
La "identidad" con respecto a secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en las que la alineación de las dos secuencias puede determinarse según el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman), por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una penalización por hueco de 4, y el análisis asistido por ordenador y la interpretación de los datos de secuencia que incluye la alineación se pueden realizar convenientemente utilizando programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Intelligenetics® Suite, Intelligenetics Inc. CA). Cuando las secuencias de ARN se dice que son similares o tienen un grado de identidad u homología de secuencia con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la invención y pueden derivarse de secuencias de ADN, considerando la timidina (T) en la secuencia de ADN igual a uracilo (U) en las secuencias de ARN.
La identidad de secuencia o similitud de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).
Los siguientes documentos proporcionan algoritmos para comparar la identidad u homología relativa de secuencias, y adicionalmente o alternativamente con respecto a lo anterior, las enseñanzas de estas referencias pueden utilizarse para determinar el porcentaje de homología o identidad: Needleman SB y Wunsch CD; Smith TF y Waterman MS; Smith TF, Waterman mS y Sadler JR; Feng DF y Dolittle RF; Higgins DG y Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG y Gibson TJ; y, Devereux J, Haeberlie P y Smithies O. Y, sin demasiada experimentación, el experto puede consultar muchos otros programas o referencias para determinar el porcentaje de homología.
Las reacciones de hibridación se pueden realizar bajo condiciones de diferente "rigurosidad". Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son bien conocidos. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al, 1989).
En el presente documento se decribe el polinucleótido de la rabia o el polinulcéotido de OX40L o ambos contenidos en una molécula de vector o un vector de expresión y unidos operativamente a un elemento promotor y opcionalmente a un potenciador.
Un "vector" se refiere a un plásmido o virus con ADN o ARN recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo para liberarse a una célula diana, ya sea in vitro o in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para los fines de prevención o terapia, y opcionalmente puede estar en forma de un casete de expresión. Tal como se usa en este documento, un vector no necesita ser capaz de replicación en la célula diana o sujeto final. El término incluye vectores de clonación y vectores virales.
El término "recombinante" significa un polinucleótido de origen semisintético o sintético que, o bien no se produce en la naturaleza o está ligado a otro polinucleótido en una disposición no encontrada en la naturaleza.
"Heterólogo" significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad a la que se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido puede colocarse mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente, y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor eliminado de su secuencia codificante nativa y unido operativamente a una secuencia codificante distinta de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.
Los polinucleótidos de la invención pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias adicionales de codificación dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control, tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control del mismo promotor o diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión, recombinación homóloga y transformación de una célula huésped, y cualquier constructo según pueda ser deseable para proporcionar realizaciones de esta invención.
Los elementos para la expresión de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de de G de la rabia o un polipéptido OX40L están presentes ventajosamente en un vector de la invención. De una manera mínima, éste comprende un codón de iniciación (ATG), un codón de terminación y un promotor, y opcionalmente también una secuencia de poliadenilación para ciertos vectores, tales como vectores plásmidos y ciertos vectores virales, por ejemplo, vectores virales distintos del virus de los poxvirus. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de polipéptido, por ejemplo, un polipéptido G de la rabia, ventajosamente, en el vector, un ATG se coloca en 5' del marco de lectura y un codón de parada se coloca en 3'. Pueden estar presentes otros elementos de control de la expresión, tales como secuencias potenciadoras, secuencias estabilizantes, tales como secuencias de intrones y secuencias señal que permiten la secreción de la proteína.
Se describen en el presente documento preparaciones que comprenden vectores, tales como vectores de expresión, por ejemplo, composiciones terapéuticas. Las preparaciones pueden comprender uno o más vectores, por ejemplo, vectores de expresión, tales como vectores de expresión in vivo, que comprenden y expresan uno o más polipéptidos, antígenos, epítopos o inmunógenos de G de rabia o OX40L. En una realización, el vector contiene y expresa un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica y/o expresa un antígeno, epítopo o inmunógeno de G de la rabia, en un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. Por lo tanto, según un aspecto descrito en el presente documento, el otro vector o vectores en la preparación comprenden, consisten esencialmente en o consisten en un polinucleótido que codifica, y bajo circunstancias apropiadas, el vector expresa una o más proteínas de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de G de la rabia (por ejemplo, hemaglutinina, neuraminidasa, nucleoproteína) o un fragmento de los mismos.
Según otra realización, el vector o vectores en la preparación comprenden, o consisten esencialmente en, o consisten en un polinucleótido o polinucleótidos que codifican una o más proteínas o fragmento o fragmentos de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de G de la rabia o un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de OX40L, o una combinación de los mismos. La preparación comprende uno, dos o más vectores que comprenden polinucleótidos que codifican y expresan, ventajosamente in vivo, un polipéptido G de la rabia, antígeno, proteína de fusión o un epítopo del mismo. En el presente documento se describen mezclas de vectores que comprenden polinucleótidos que codifican y expresan diferentes polipéptidos, antígenos, epítopos, proteína de fusión o inmunógenos de G de la rabia, por ejemplo, un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de G de la rabia de diferentes especies tales como, pero no limitado a, humanos, cerdos, vacas o ganado, perros, gatos y aves.
En el presente documento se describe que el vector de expresión es un vector plásmido, en particular un vector de expresión in vivo. En un ejemplo no limitativo específico, se puede utilizar el plásmido pVR1020 o 1012 (VICAL Inc.; Lucas et al, 1997; Hartikka et al, 1996, véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 5.846.946 y 6.451.769) como un vector para la inserción de una secuencia de polinucleótido. El plásmido pVR1020 se deriva de pVR1012 y contiene la secuencia señal tPA humana. La señal tPA humana comprende desde el aminoácido M (1) al aminoácido S(23) en el Genbank bajo el número de acceso HUMTPA14. En otro ejemplo no limitativo específico, el plásmido utilizado como un vector para la inserción de una secuencia de polinucleótidos puede contener la secuencia de péptido señal de IGF1 equino desde el aminoácido M(24) al aminoácido A(48) en el Genbank con número de acceso U28070. Información adicional sobre plásmidos de ADN que pueden consultarse o emplear en la práctica se encuentra, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N° 6.852.705; 6.818.628; 6.586.412; 6.576.243; 6.558.674; 6.464.984; 6.451.770; 6.376.473 y 6.221.362.
El término plásmido cubre cualquier unidad de transcripción de ADN que comprende un polinucleótido según la invención y los elementos necesarios para su expresión in vivo en una célula o células del huésped o diana deseados; y, en este sentido, se observa que un plásmido circular, superenrollado o no superenrollado, así como una forma lineal, están descritos en el presente documento.
Cada plásmido comprende o contiene o consiste esencialmente en, además del polinucleótido que codifica un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de G de rabia, opcionalmente fusionado con una secuencia, variante, análogo o fragmento de péptido heterólogo, unido operativamente a un promotor o bajo el control de un promotor o dependiente de un promotor. En general, es ventajoso emplear un promotor funcional fuerte en células eucariotas. El promotor fuerte puede ser, pero no limitado a, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV-IE) de origen humano o murino, o que tiene opcionalmente otro origen, tal como la rata o cobaya.
En términos más generales, el promotor tiene un origen viral o un origen celular. Un promotor viral fuerte distinto del CMV-IE que puede emplearse de forma útil en la práctica de la invención es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Un promotor celular fuerte que puede emplearse de forma útil en la práctica de la invención es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como por ejemplo el promotor de desmina (Kwissa et al., 2000), o el promotor de actina (Miyazaki et al., 1989).
En cuanto a la señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y vectores virales distintos de poxvirus, puede usarse la señal poli(A) del gen de la hormona de crecimiento bovina (bGH) (véase el documento US 5.122.458), o la señal poli(A) del gen de beta-globina de conejo o la señal poli(A) del virus SV40.
Una "célula huésped" se refiere a una célula procariota o eucariota que ha sido alterada genéticamente, o es capaz de ser alterada genéticamente mediante la administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Cuando se hace referencia a células genéticamente modificadas, el término se refiere tanto a la célula originalmente alterada como a la progenie de la misma.
Procedimientos de uso y artículo de fabricación
En el presente documento se describen las siguientes ralizaciones del procedimiento. En una realización, se describe un procedimiento de vacunación de un animal que comprende administrar una composición que comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido G de la rabia o fragmento o variante del mismo y un portador, vehículo o excipiente veterinaria o farmacéuticamente aceptable a un animal. En un aspecto de esta realización, el animal es un ave, un equino, un canino, un felino, un hurón, una foca o un porcino.
En el presente documento se describe que se puede emplear un régimen de sensibilización-refuerzo, que se compone de al menos una administración primaria y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido común, antígeno, epítopo o inmunógeno. Típicamente, la composición inmunológica o vacuna utilizada en la administración primaria es de naturaleza diferente de los utilizados como refuerzo. Sin embargo, se observa que la misma composición se puede utilizar como la administración primaria y la administración de refuerzo. Este protocolo de administración se llama " sensibilización-refuerzo".
En el presente documento se describe un vector viral recombinante que se utiliza para expresar una secuencia que codifica la rabia o fragmentos de la misma que codifican un polipéptido de la rabia o un fragmento o variante del mismo. Específicamente, el vector viral puede expresar una secuencia de la Rabia, más específicamente un gen G de la rabia o un fragmento del mismo que codifica un polipéptido antigénico. Los vectores virales descritos en este documento incluyen, pero no se limitan a, virus de la viruela [por ejemplo, virus vaccinia o virus vaccinia atenuado, virus de la viruela aviar o virus de la viruela aviar atenuado (por ejemplo, viruela del canario, viruela aviar, dovepox, viruela de la paloma, quailpox, ALVAC, TROVAC; véase, por ejemplo, US 5.505.941, US 5,494,8070), virus de la viruela del mapache, virus de la viruela porcina, etc.], adenovirus (por ejemplo, adenovirus humano, adenovirus canino), herpesvirus (por ejemplo, herpesvirus canino, herpesvirus felino, herpesvirus bovino, virus del herpes porcina), baculovirus, retrovirus, etc . En otra realización, el vector de expresión de la viruela aviar puede ser un vector de viruela del canario, tal como, ALVAC. En el presente documento se describe que el vector de expresión de la viruela aviar puede ser un vector de la viruela aviar, tal como, TROVAC. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de la rabia pueden ser una rabia G. El vector de poxvirus que comprende la rabia G puede ser vectores como se describe en el documento US 5.756.102. El polipéptido de la rabia G o antígeno de la invención que se expresa se inserta bajo el control de un promotor de poxvirus específico, por ejemplo, el promotor de vaccinia 7.5 kDa (Cochran et al., 1985), el promotor de vaccinia I3L (Riviere et al., 1992 ), el promotor vaccinia G (Shida, 1986), el promotor de la viruela vacuna ATI (Funahashi et al, 1988), el H6 promotor de vaccinia (Taylor et al, 1988b; Guo et al, 1989; Perkus et al, 1989), entre otros.
Un régimen de sensibilización-refuerzo comprende al menos un prime-administración y al menos una administración impulso usando al menos un polipéptido común y/o variantes o fragmentos de los mismos. La vacuna utilizada en prime-administración puede ser de naturaleza diferente a los utilizados como una vacuna de refuerzo posterior. El prime-administración puede comprender una o más administraciones. Del mismo modo, la administración de impulso puede comprender una o más administraciones.
En un aspecto del protocolo de sensibilización-refuerzo o régimen descrito en este documento, un protocolo de sensibilización-refuerzo puede comprender la administración de una composición que comprende un vector vírico recombinante que contiene y expresa un polipéptido, antígeno de la rabia G y/o variantes o fragmentos de los mismos in vivo seguido de la administración de un polipéptido de G de la rabia recombinante o antígeno de la invención. Del mismo modo, un protocolo de sensibilización-refuerzo puede comprender la administración de una composición que comprende un antígeno de la rabia G de la invención seguido de la administración de un vector viral recombinante que contiene y expresa un polipéptido de la rabia G o antígeno y/o variantes o fragmentos de los mismos in vivo. Se observa además que tanto la primaria y las administraciones secundarias pueden comprender el vector viral recombinante que contiene y expresa un polipéptido de la rabia G de la invención. Por lo tanto, el vector viral de la rabia recombinante de la invención puede administrarse en cualquier orden con un antígeno de la rabia recombinante o alternativamente se puede usar solo ya que tanto las composiciones primarias y secundarias.
En otro aspecto del protocolo de sensibilización-refuerzo descrito en el presente documento, una composición que comprende un vector vírico recombinante que contiene y expresa un polipéptido, antígeno de la rabia G y/o variantes o fragmentos de los mismos in vivo de la invención se administra seguido por la administración de una vacuna inactivada composición o vacuna viral que comprende el polipéptido de la rabia o antígeno. Del mismo modo, un protocolo de sensibilización-refuerzo puede comprender la administración de una composición viral inactivada o una vacuna seguido de la administración de un vector viral recombinante que contiene y expresa un polipéptido, antígeno G de la rabia y/o variantes o fragmentos de los mismos in vivo descritos en el presente documento.
En aún otro aspecto del protocolo de sensibilización-refuerzo descrito en el presente documento, el protocolo de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización de una composición a base de vector viral recombinante y al menos una administración de refuerzo de una composición de base plasmídica. Asimismo, el primer impulso puede comprender al menos una administración de sensibilización de una composición de base plasmídica y al menos una administración de refuerzo de una composición a base viral-vector recombinante.
El volumen de dosis de composiciones de las especies objetivo que son mamíferos, por ejemplo, el volumen de dosis de composiciones perro, basados en vectores virales, por ejemplo, composiciones a base de vectores virales no poxvirus, es generalmente de entre aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,0 ml, entre aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 ml, y entre aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1,0 ml.
La eficacia de las vacunas puede ser probada después de la última inmunización los animales desafiantes, tales como perro, con una cepa virulenta de la Rabia. En general, los animales se anestesian y el material de 1,0 ml desafío se administra a través de inyección IM (0,5 ml en cada frontalis y/o músculo masetero). La dosis diana es de aproximadamente 3,8 log10LD 50/ml, y un desafío de vuelta de titulación en ratones se lleva a cabo para verificar la dosis inoculada real. Siete días antes de la exposición perros están aclimatados a jaulas individuales y se mantuvieron en jaulas individuales hasta el final del estudio. Los animales son alimentados con una dieta disponible en el mercado y estar provistos de agua ad libitum. SAS ® Guía V9.1 Software de la empresa se puede usar para producir una tabla de aleatorización para la vivienda. En D0, la cepa de exposición se puede preparar mediante la dilución de la suspensión desafío de stock inicial 1: 100 en suero de ternera PBS 2% fetal. El material de desafío diluida puede ser colocado en una solución estéril, sellado y vial tapado, etiquetado en consecuencia y se mantuvieron en hielo hasta su uso. A la mañana antes de la exposición, es aconsejable administrar analgésico/antiinflamatorio, por ejemplo, firocoxib 5 mg/kg (dosis calculada en incrementos de media tableta) si los animales son perros. Los animales deben observarse al día durante al menos 30 días después de la estimulación de la mortalidad o de signos neurológicos indicativos de infección de la rabia.
Los animales con signos neurológicos progresivos serán sacrificados humanitariamente acuerdo con los procedimientos aceptados. Muestras de cerebro básicos se cosecharon inmediatamente después de la muerte o la eutanasia de todos los animales. La recogida de sangre después de la exposición puede ser recogida en el momento de la eutanasia bajo anestesia, a través de stick intracardiaca. La sangre puede ser procesado para el suero, dividido en dos partes alícuotas (2-3 ml/cada uno) y el suero almacenado congelado (~ -20 ° C) hasta que las pruebas. Una muestra del núcleo de la médula oblonga puede ser recogida de todos los animales que mueren o son sacrificados durante el período de post-desafío y cualquier animales supervivientes sacrificados al final del estudio. Las muestras pueden ser enviadas fresco en hielo o se congelaron en hielo se
pruebas. Serum título de anticuerpos de la rabia se puede cuantificar usando un Fluorescent Focus Prueba Inhibition Test (RFFIT) o Fluorescent Antibody Virus Neutralization (FAVN), y el tejido cerebral de los animales de estudio se puede someter a dirigir la tinción de inmunofluorescencia de anticuerpo monoclonal anti-rabia.
Se debe entender por un experto en la técnica que la presente descripción se proporciona a modo de ejemplo y la presente invención no se limita a la misma. A partir de la descripción de este documento y el conocimiento en la técnica, el experto en la materia puede determinar el número de administraciones, la vía de administración, y las dosis a utilizar para cada protocolo de inyección, sin gran experimentación.
La presente invención contempla al menos una administración a un animal de una cantidad suficiente de la composición terapéutica producida según la invención. El animal puede ser macho, hembra, hembra embarazada y recién nacido. Esta administración puede ser a través de diversas rutas incluyendo, pero no limitado a, inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID), intraperitoneal (IP) o subcutánea (SC) o mediante administración intranasal o por vía oral. La composición terapéutica según la invención también se puede administrar mediante un aparato sin aguja (como, por ejemplo, con un Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, EE.UU.), aparato Vetjet o Vitajet (Bioject, Oregon, EE.UU.)). Otro enfoque para la administración de composiciones de plásmidos es usar electroporación (véase, por ejemplo Tollefsen et al, 2002; Tollefsen et al, 2003; Babiuk et al, 2002; solicitud PCT No. WO99/01158). En otra realización, la composición terapéutica se administra al animal mediante pistola de genes o bombardeo de partículas de oro. En una realización ventajosa, el animal es un perro, hurón o foca.
En una realización, la descripción proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación para la liberación y expresión de un antígeno o epítopo de la rabia en una célula diana. La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz es experimentación rutinaria para un experto ordinario en la técnica. En una realización, la formulación comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa un antígeno o epítopo de la rabia y un portador, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. En otra realización, el portador, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable facilita la transfección o la infección y/o mejora la conservación del vector o proteína en un huésped.
En el presente documento se describe un kit para realizar un procedimiento de producir o inducir una respuesta inmunológica o protectora contra la rabia en un animal que comprende una composición inmunológica o de vacuna de G de la rabia recombinante y las instrucciones para realizar el procedimiento de liberación en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.
En una realización, la materia dada a conocer en el presente documento se refiere a un kit para realizar un procedimiento de producir o inducir una respuesta inmunitaria que puede comprender cualquiera de las composiciones o vacunas recombinantes de la rabia, composiciones o vacunas de la rabia inactivadas, composiciones virales o vacunas de la rabia recombinantes, o composiciones o vacunas de la rabia basadas en plásmido, e instrucciones para realizar el procedimiento.
En el presente documento también se describe un kit para realizar un procedimiento de inducir una respuesta inmunológica o protectora contra la rabia en un animal que comprende una composición o vacuna que comprende un polipéptido o antígeno de la rabia y una composición viral o de vacuna de la rabia recombinante, e instrucciones para realizar el procedimiento de liberación en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.
En el presente documento también se describe un kit para realizar un procedimiento de inducir una respuesta inmunológica o protectora contra la rabia en un animal que comprende una composición o vacuna que comprende un vector viral de la rabia recombinante de la invención y una composición inmunológica o vacuna de la rabia inactivada, e instrucciones para realizar el procedimiento de liberación en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.
En el presente documento se describe un kit para realizar un procedimiento de inducir una respuesta inmunológica o protectora contra la rabia en un animal que comprende una composición o vacuna que comprende un vector viral de la rabia de recombinante de la invención y una composición o vacuna de la rabia basada de plásmido, e instrucciones para realizar el procedimiento de liberación en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.
También se describe en el presente documento un kit para la vacunación de sensibilización-refuerzo según la presente divulgación tal como se describe anteriormente. El kit puede comprender al menos dos viales: un primer vial que contiene una vacuna o composición para la vacunación de sensibilización según la presente divulgación, y un segundo vial que contiene una vacuna o composición para la vacunación de refuerzo según la presente invención. El kit puede contener ventajosamente primeros o segundos viales adicionales para vacunas de sensibilización adicionales o vacunas de refuerzo adicionales.
En el presente documento se describe la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación para la administración y expresión de un polipéptido o antígeno o epítopo de G de la rabia en una célula diana. La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz es experimentación rutinaria para un experto ordinario en la técnica. En una realización, la formulación comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa un polipéptido o antígeno o epítopo de G de la rabia y portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. En otra realización, el portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable facilita la transfección o la infección y/o mejora la conservación del vector o proteína.
Los portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, un portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una solución de NaCl al 0,9% (por ejemplo, solución salina) o un tampón fosfato. Otros portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que se pueden utilizar para los procedimientos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. Los portadores o vehículos o excipientes farmacéutic o veterinariamente aceptables pueden ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que faciliten la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vector de la invención in vitro); ventajosamente, el portador, vehículo o excipiente puede facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector (o proteína). Las dosis y volúmenes de dosis se describen en el presente documento en la descripción general y también se pueden determinar por el experto en la materia a partir de esta descripción en relación con el conocimiento en la técnica, sin gran experimentación.
Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario que son ventajosamente, pero no exclusivamente, adecuados para plásmidos, son ventajosamente aquellos que tienen la siguiente fórmula:
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en la que R1 es un radical alifático de cadena lineal saturado o insaturado que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene 2 o 3 átomos de carbono y X es un grupo amina o hidroxilo, por ejemplo, DMRIE. En otra realización, el lípido catiónico puede estar asociado con un lípido neutro, por ejemplo DOPE.
Entre estos lípidos catiónicos, se da preferencia a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N, N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propano amonio; WO96/34109), ventajosamente asociado con un lípido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoilfosfatidil-etanol amina; Behr, 1994), para formar DMRIE-DOPE.
Cuando DOPE está presente, la relación molar DMRIE:DOPE es ventajosamente de aproximadamente 95:aproximadamente 5 a aproximadamente 5:aproximadamente 95, más ventajosamente de aproximadamente 1:aproximadamente 1, por ejemplo, 1:1.
Entre los polímeros adyuvantes de tipo (1), se da preferencia a polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulado, especialmente reticulado por polialquenil éteres de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos son conocidos bajo el nombre de carbómero (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, junio de 1996). Un experto en la técnica también puede hacer referencia a US 2909462, que proporciona tales polímeros acrílicos reticulados por un compuesto polihidroxílico que tiene al menos tres grupos hidroxilo, preferiblemente no más de ocho de tales grupos, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres grupos hidroxilo sustituidos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados también pueden contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son especialmente adecuados. Se reticulan por alil sacarosa o por alilpentaeritritol. Entre ellos, se hace referencia a Carbopol 974P, 934P y 971P.
En cuanto a los copolímeros derivados de anhídrido maleico-alquenilo, se da preferencia a EMA (Monsanto), que son copolímeros de etileno-anhídrido maleico de cadena lineal o reticulados y están, por ejemplo, reticulados por divinil éter. También se hace referencia a J. Fields et al., 1960.
Con respecto a la estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y EMA están formados preferentemente por unidades básicas que tienen la siguiente fórmula:
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en la que:
- R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan H o CH3
- x = 0 o 1, preferiblemente x = 1
- y = 1 o 2, con x y = 2.
Para EMA, x = 0 e y = 2 y para carbómeros x = y = 1.
Estos polímeros son solubles en agua o solución salina fisiológica (20 g/l NaCl) y el pH se puede ajustar a de 7,3 a 7,4, por ejemplo, mediante sosa (NaOH), para proporcionar la solución adyuvante en la que se puede incorporar el vector o vectores de expresión. La concentración de polímero en la composición inmunológica o de vacuna final puede oscilar entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1,5% p/v, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1% p/v, y de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,4% p/v.
Otras citoquinas que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), interferón a (IFNa), interferón p (IFN-P), interferón y (IFN-y), interleuquina-1a (IL-1a), interleuquina-1p (IL-1P), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-3 (IL-3), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-5 (IL-5), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-7 (IL-7), interleuquina-8 (IL-8), interleuquina-9 (IL-9) , interleuquina-10 (IL-10), interleuquina-11 (IL-11), interleuquina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral a (TNF-a), factor de necrosis tumoral p (TNF-P), y factor de crecimiento transformante p (TGF-P). Se entiende que las citoquinas se pueden coadministrar y/o administrar secuencialmente con la composición inmunológica o de vacuna de la presente invención. Por tanto, por ejemplo, la vacuna de la presente invención puede también contener una molécula de ácido nucleico exógena que expresa in vivo una citoquina adecuada, por ejemplo, una citoquina emparejada a este huésped a vacunar o en el que debe provocarse una respuesta inmunológica (por ejemplo, una citoquina canina para las preparaciones a administrar a canino). La invención se describirá a continuación adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplo 1 - Construcción de vCP3006 recombinante, que expresa cuatro copias de glicoproteína de virus de la rabia
Se produjo un virus recombinante ALVAC en el que un gen de G de la rabia sintética ha sido insertado en el loci C3 (2 copias) en la base de vCP65a que lleva un G del virus de la rabia clásica en el loci C5 (2 copias).
Resumen. Un virus de la rabia con codones optimizados sintética G (SEQ ID NO: 1) se insertó en el loci C3 de un virus de la viruela del canario parental (ALVAC CP65a [como se describe completamente en el documento US 5.843.456, a Virogenetics], que tiene un título de 6.1x10E7 pfu/mL, se resuspendieron en tampón de 1 ml de Tris pH 9). Parental ALVAC, que se usó para producir el CP65a, se depositó el 14 de noviembre de 1996 bajo los términos del Tratado de Budapest en la ATCC, número de acceso VR-2547. Así, una persona experta en la técnica está totalmente espera que sea capaz de realizar y utilizar la CP65a de US5843456, o un sustituto razonable/funcional del mismo. La secuencia de proteína de virus de la rabia con codones optimizados G era 100% idéntica a GenBank ACR15154.1 (SEQ ID NO: 1). El plásmido donante comprendido gen G de la rabia sintético (SEQ ID NO: 5) y el promotor I3L (SEQ ID NO: 4) en C3 plásmido loci (P397-Syn rabia G, Fig. 1). El plásmido donante se hace tomando un ~1.6 kb XhoI-XmaI con el fragmento G de la rabia PCR I3L-sintético y la clonación en pHM606.1 (PC3), generando P397-Syn G de la rabia (PC3 I3Lp Syn G de la rabia, la Fig. 1). Se llevó a cabo recombinación in vitro en el pollo primario fibroblastos de embrión de células (1 ° CEF).
Generación de vCP3006 recombinante. Para iniciar una recombinación in vitro (IVR), primero 1 ° células CEF fueron transfectadas con 20 ug de digerido con No plásmido P397-Syn G de la rabia usando el reactivo FuGENE-6® (Roche). Las células transfectadas se infectaron posteriormente con ALVAC CP65a Stock a MOI de 10. Después de 24 horas, se recogieron las células infectadas transfectadas, se sonicaron y se usaron para el cribado de virus recombinante. Las placas recombinantes se cribaron basan en el procedimiento de hibridación de elevación de placas usando un par 140 de bases (pb) de la sonda I3L único (Fig. Y) marcado con North2South Biotina Random Primer Labeling Kit (Thermo Scientific # 17075) y se detectaron con North2South quimioluminiscente La hibridación y el kit de detección (Thermo Scientific, n° 17097). Después de cinco rondas secuenciales de purificación en placa, se generó un recombinante designado como vCP3066.4.1.3.1.1.3. Una sola placa se selecciona de entre el 6 ' ronda de purificación en placa y se amplió para P1 (1x T25), P2 (1 pocillo en una placa de 6 pocillos), P3 (1 pocillo en una placa de 6 pocillos), P4 (1xT75 matraz ), y P5. Se recogieron las células infectadas de las botellas de rodillos P5 y se concentró para producir vCP3006 de valores. Una representación esquemática de la generación de vCP3006 se muestra en la figura. 2.
Análisis de vCP3006. La verificación de la pureza genética se realizó en la población de P5 utilizando sondas sitio sintéticos G de la rabia y C3 para la hibridación. Para la hibridación de transferencia de Southern, el ADN genómico fue extraído de vCP3006 P5, se digirió con Xba I, Hind III, y BamHI, y se separó por electroforesis en agarosa. El ADN genómico digerido se transfirió a una membrana de nylon y se sometió a análisis de transferencia Southern mediante el sondeo con una sonda específica sintético G de la rabia. Primers RabG.1F (SEQ ID NO: 52) y RabG.1R (SEQ ID NO: 53) se utilizaron para amplificar la sonda de la rabia G-específica sintético.
Transferencia Western. Las células CEF primarias se infectaron con P5 acciones en MOI de 4,5 y se incubaron a 37°C durante 24 hrs. Para la comparación del nivel de G expresión, las células también fueron infectadas con el vCP65a parental usando la misma multiplicidad de infección. A continuación, se recogieron las células y sobrenadante de cultivo. Las proteínas de la muestra se separaron en un gel SDS-PAGE al 10%, se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se incubó con el ratón anti-rabia G MAb (Chemicon # MAB8727) a una dilución de 1: 500 seguido por fosfatasa alcalina anticuerpo anti-ratón conjugado.
Análisis de secuencia. Un análisis más detallado del ADN genómico P5 de stock se realizó mediante amplificación por PCR y análisis de la secuencia de los brazos flanqueantes del locus C3 y el inserto de la rabia G sintética. Primers C3R.3F (SEQ ID NO: 44) y C3L.1R (SEQ ID NO: 47), situado en los brazos del locus C3 en el genoma de ALVAC, se utilizaron para amplificar el fragmento completo C3L-Syn rabia G-C3R (SEQ ID NO: 2), y cebadores que se muestran en la figura. 37 se utilizaron después para secuenciar el fragmento.
Resultados. La homogeneidad de la P5 social de vCP3006 se confirmó por hibridación como 100% positivo para el sintético rabia G y 100% negativo para el sitio C3. El título del virus P5 Stock vCP3006 fue de 1,88 x 109 pfu/ml. La integridad genómica de vCP3006 recombinante también se verificó mediante análisis de transferencia de Southern después de la separación de la enzima de restricción digiere el ADN genómico en una electroforesis en gel (Fig. 3). El análisis de transferencia de Southern usando la sonda específica sintético rabia G reveló bandas de tamaños esperados (14322bp y 5248bp BamHI, 17367bp HindIII, y 6293 pb XbaI; Fig. 4), demostrando la inserción correcta de sintético G de la rabia en el locus C3. Las dos bandas en el carril 5 (Fig. 4) también confirma la inserción de G de la rabia sintético en ambos sitios de C3 (14322bp para el sitio C3 izquierda y 5248bp para el sitio C3 derecha).
Para el análisis de expresión de G del virus de la rabia, las células CEF primarias se infectaron con P5 social de vCP3006 o vCP65a a MOI de 4,5. El sobrenadante así como las muestras de células infectadas se procesaron y se sometieron a análisis de transferencia Western. Como se muestra en la figura. 5, virus de la rabia G era detectable en sedimento celular infectado, pero no en muestras de sobrenadante, lo que sugiere que G no se incorpora a los viriones de ALVAC en un nivel detectable (Fig. 5 a la izquierda). A medida que el monoclonal anti-rabia reconoce tanto el G clásico y el G optimizado-codón adicional en vCP3006, se hizo un intento de comparar la cantidad de G expresó vCP65a a la de vCP3006. Para este propósito, las células se infectaron a MOI similares y diferentes cantidades de los lisados de células totales fueron sometidos a análisis de transferencia Western (Fig. 5, a la derecha). La comparación de los carriles respectivos cargados con 2 l de lisados celulares, parece que la banda G de vCP3006 es más abundante que el carril respectivo de vCP65a. Esto sugiere que, vCP3006 expresa más G que hace vCP65a. Una cubierta de producto de PCR brazos flanqueantes del locus C3 y el inserto de la rabia G sintético fue secuenciado usando cebadores que se muestran en la figura. 6 (descripciones completas de los cuales se presentan en la Fig. 37). El análisis de la secuencia demostró que las secuencias de las regiones sintéticas G de la rabia y C3L y C3R fueron los esperados (Fig. 7), y todo el C3L a fragmento C3R tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2. La predicho Rabia sintética secuencia de péptido G se presenta en la figura. 8 (SEQ ID NO: 1), y es idéntica a la de tipo salvaje secuencia de péptido G de la rabia.
Ejemplo 2 - Construcción de vCP3015 recombinante, que coexpresa la glicoproteína del virus de la rabia y OX40L
Resumen. Generación y caracterización recombinante ALVAC en el que un canino OX40 ligando (cOX40L) ha sido insertado en el locus C6 (una copia) en el fondo de vCP65a que lleva un virus clásico de la rabia G en el loci C5 (2 copias). A canino sintética con codones optimizados OX40 ligando (cOX40L, miembro de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral 4-like) se insertó en el locus C6 de virus parental ALVAC CP65a (título 6.1xl0e7 pfu/ml, se resuspendieron en tampón de 1 ml de Tris pH 9). El plásmido donante era P397-cOX40L (pC6 42 Kp cOX40L) un cOX40L sintético con 42K promotor en C6 locus, y fue producido mediante la adopción de un EcoRI ~ 0,6 kb -. XmaI fragmento OX40L canino sintético con 42K promotor y la clonación en pC6L (figura 9 ). En la recombinación in vitro se llevó a cabo en células primarias 1 ° CEF, según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. La selección de las placas recombinantes se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 utilizando una sonda de 551 pb cOX40L-específico. Después de cuatro rondas secuenciales de purificación en placa, se generó el recombinante designado como vCP3015.9.2.1.2. Placas individuales fueron seleccionados de la 4 ' ronda de purificación en placa, y se expandieron para obtener P1 (T-25 frasco), P2 (T-75 frasco) y P3 (4 botellas de rodillos) de vCP3015.9.2.1.2. P3 se cosechó, CEF infectadas se sedimentaron, y el sobrenadante eliminado. Los CEF infectadas se resuspendieron en Tris 1 mM, pH 9,0, se sonicó y se concentró para producir stock de virus de vCP3015. Una representación esquemática de la generación de vCP3015 se muestra en la figura. 10.
Análisis de vCP3015. Se extrajo ADN genómico a partir de P3 de vCP3015, se digirió con NruI, y por duplicado en un gel de agarosa al 0,8%. El NruI ADN genómico digerido se transfirió a membrana de nylon y el análisis de Southern Blot se llevó a cabo esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 mediante el sondeo, ya sea con cOX40L o sondas clásicos G de la rabia. PCR primers OX40L.1F (SEQ ID NO: 61) y OX40L.1R (SEQ ID NO: 62) se utilizaron para amplificar una sonda de cOX40L, y los cebadores CP65.2R (SEQ ID NO: 39) y C5R.3F (SEQ ID No : 30) se utilizaron para amplificar virus de la rabia clásica sonda G.
Transferencia Western. Las células CEF primarias se infectaron con P3 social de vCP3015 a MOI de 10 y se incubaron a 37°C durante 26 hrs. a continuación, se recogieron las células y sobrenadante de cultivo. Las proteínas de la muestra se separaron en un gel SDS-PAGE al 10%, se transfirieron a una membrana de PVDF y se sondaron con un anticuerpo monoclonal anti-G de la rabia (Chemicon # MAB8727) a una dilución de 1: 500 seguido de fosfatasa alcalina de anticuerpo anti-ratón conjugado.
Análisis de secuencia. Para el clásico G de la rabia en el sitio C5, un análisis detallado de la ADN genómico P3 de stock se realizó mediante amplificación y análisis de secuencias por PCR del locus C5 que contiene el inserto clásico G de la rabia. Primers 7635CXL.R (SeC ID NO: 35) y 7635CXL.F (SEQ ID NO: 36), situados en el extremo de los brazos del locus C5 se utilizaron para amplificar el fragmento completo de la rabia G-C5L C5R-clásico. El fragmento fue entonces secuenciado usando los cebadores enumerados en la figura. 37. Para cOX40L a C6, un análisis detallado de la ADN genómico P3 de stock se realizó mediante amplificación y análisis de secuencias por PCR del locus C6 que contiene el inserto cOX40L. Primers C6R.1F (SEQ ID NO: 57) y C6L.1R (SEQ ID NO: 60), situado en el extremo de los brazos del locus C6 se usaron para amplificar el fragmento completo C6R-cOX40L-C6L. El fragmento se secuenció usando los cebadores enumerados en la figura. 37.
Resultados. La homogeneidad de la P3 social de vCP3015 se confirmó por hibridación como 100% positivo para el cOX40L insertar y 100% negativo para el sitio C6 vacía. El título del virus P3 Stock vCP3015 era 8,5 x 10 A 9 pfu/ml. La integridad genómica de vCP3015 recombinante también se verificó por transferencia de Southern. Para cOX40L, la sonda detecta un fragmento de 151 858 pb (Fig. 11) y para clásico G de la rabia, la sonda detecta un fragmento de 72175 pb para el sitio C5 izquierdo, un fragmento de 23014 pb para el sitio C5 derecha, y un fragmento de 806 pb para ambos sitios C5 (Fig. 12).
Para el análisis de expresión de virus clásico de la rabia G, las células CEF primarias infectadas con P3 social de vCP3015 a MOI de 10. El sobrenadante así como las muestras de células infectadas se procesaron y se sometieron a análisis de transferencia Western. Como se muestra en la figura. 13, virus de la rabia G era detectable en sedimento celular infectado en el tamaño esperado, pero no en muestras de sobrenadante. Una cubierta de producto de PCR brazos flanqueantes del locus C6 y el inserto cOX40L se secuenció usando cebadores que se muestran en la figura. 14. El análisis de la secuencia demostró que las secuencias de las regiones C6L y C6R cOX40L y son como se esperaba (Fig. 15). Una cubierta de producto de PCR brazos flanqueantes del locus C5 y el G inserto de virus clásico de la rabia se secuenció usando cebadores que se muestran en la figura. 17. La secuencia resultante se muestra en la figura. 18 (SEQ ID NO: 13).
Ejemplo 3 - Construcción de vCP3012 recombinante, que coexpresa G del virus de la rabia clásica, G del virus de la rabia con codones optimizados y OX40L
Resumen. Generación y caracterización recombinante ALVAC en el que un canino OX40 ligando (cOX40L) ha sido insertado en el locus C6 (una copia) en el fondo de vCP3006 llevar a virus de la rabia clásico G en el loci C5 (2 copias) y virus de la rabia con codones optimizados G en el loci C3 (2 copias). Secuencia OX40L canino sintético optimizado-Codon (dirigido por 42K promotor) se insertó en el locus C6 de ALVAC vCP3006 virus parental P5 (Stock título fue de 1,88 x 109 pfu/ml). El plásmido donante 397-cOX40L (pC642 Kp cOX40L) fue idéntica a la usada en el Ejemplo 2 en la figura. 9, así como el procedimiento de recombinación in vitro.
El cribado de las placas recombinantes se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 utilizando una sonda-cOX40L específica 551 pb. Después de 4 rondas secuenciales de purificación en placa, se generó el recombinante designado como vCP3012.9.2.1.3. placas individuales fueron seleccionados de la ronda final de purificación en placa, y se expandieron para obtener P1 (placa de 6 pocillos), P2 (T-75 frasco) y P3 (botella de rodillos) las existencias para amplificar vCP3012.9.2.1.3. Las células infectadas así como el sobrenadante de cultivo de las botellas de rodillos se recogió y se sedimentaron. Después de retirar el sobrenadante, el sedimento se sonica y se concentró para producir vCP3012 stock de virus.
Análisis de vCP3012. ADN genómico fue extraído de vCP3012 (P3), se digirió con PmeI, NruI, y BamHI, y se separó por electroforesis en agarosa. El ADN genómico digerido se transfirió a una membrana de nylon y análisis de transferencia Southern se realizó esencialmente como se describe en el ejemplo 1 mediante el sondeo con cOX40L, la rabia sintético G, y las sondas de G de la rabia clásicos. PCR primers OX40L.1F (SEQ ID NO: 61) y OX40L.1R (SEQ ID NO: 62) se utilizaron para amplificar la sonda cOX40L, cebadores CP65.2R (SEQ ID NO: 39) y C5R.3F (SEQ ID NO: 30) se utilizaron para amplificar la sonda G virus de la rabia clásica, y cebadores RabG.1R (SEQ ID NO: 53) y RabG.1F (SEQ ID NO: 52) se utilizaron para amplificar virus de la rabia sintético.
Transferencia Western. Las células CEF primarias se infectaron con P3 social de vCP3012 a MOI de 10 y se incubaron a 37 ° C durante 24 hrs. a continuación, se recogieron las células y sobrenadante de cultivo. Las proteínas de la muestra se separaron en un gel SDS-PAGE al 10%, se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se incubó con un anticuerpo monoclonal anti-G de la rabia (Chemicon # MAB8727) a una dilución de 1: 500 seguido por fosfatasa alcalina anticuerpo anti-ratón conjugado.
Análisis de secuencia. Para cOX40L en C6, el análisis del ADN genómico P3 de stock se realizó mediante amplificación por PCR y análisis de secuencias del locus C6 que contiene el inserto cOX40L. Primers C6R.1F (SEQ ID NO: 57) y C6L.1R (SEQ ID NO: 60), situado en el extremo de los brazos del locus C6 se usaron para amplificar el fragmento completo C6R-cOX40L-C6L. El fragmento se secuenció usando los cebadores enumerados en la figura. 37. Para sintético G de la rabia en C3, el análisis del ADN genómico P3 de stock se realizó mediante amplificación por PCR y análisis de la secuencia de los brazos flanqueantes del locus C3 y el inserto de G de la rabia sintético. Primers C3R.2F (SEQ ID NO: 43) y C3L.1R (SEQ ID No : 47) situado en los brazos del locus C3 se utilizaron para amplificar la entera C3R- Syn rabia G insert-C3L fragmento. Para clásico G de la rabia en C5, análisis de la P3 de stock ADN genómico se realizó mediante amplificación y análisis de secuencias por PCR del locus C5 que contiene el inserto clásico G de la rabia. Primers 7635CXL.R (SEC ID NO: 35) y 7635CXL.F (SEQ ID NO: 36), situados en el extremo de los brazos del locus C5 se utilizaron para amplificar el fragmento completo de la rabia G-C5L C5R-clásico. El fragmento se secuenció usando los cebadores enumerados en la figura. 37.
Resultados. La homogeneidad de la P3 social de vCP3012 se confirmó por hibridación como 100% positivo para el cOX40L insertar y 100% negativo para el sitio C6 vacía. El título de la P3 de stock de virus vCP3012 fue de 4 x 10 A 9 pfu/ml. La integridad genómica de vCP3012 recombinante también se verificó por transferencia de Southern. Para cOX40L, la sonda detecta un fragmento de 200.362 pb (figura 21.); para la rabia sintético G, 14322 pb para el sitio C3 izquierda y 5248 pb para el sitio C3 derecha (figura 22.); y para clásico G de la rabia 806 pb para ambos sitios, 72436 pb para el sitio C5 izquierda y 23275 pb para el sitio C5 derecha (Fig. 23). Estos tamaños esperados indican la correcta inserción de cOX40L en el locus C6, rabia sintético G en los loci C3, y clásico G de la rabia en los loci C5. Para el análisis de expresión de clásica, así como virus de la rabia sintético G, las células CEF primarias infectadas con P3 social de vCP3012 a MOI de 10. El sobrenadante así como las muestras de células infectadas se procesaron y se sometieron a análisis de transferencia Western. Como se muestra en la figura. 24, virus de la rabia G era detectable en sedimento celular infectado en el tamaño esperado.
Una producto de PCR que cubría los brazos flanqueantes del locus C6 y el inserto cOX40L se secuenció usando cebadores que se muestran en la figura. 25. El análisis de la secuencia demostró que las secuencias de las regiones C6L y C6R cOX40L y son como se esperaba (Fig. 26). Una cubierta de producto de PCR brazos flanqueantes del locus C3 y el G inserto de virus de la rabia sintético fue secuenciado usando cebadores que se muestran en la figura. 27. La secuencia resultante se muestra en la figura. 28 (SEQ ID NO: 20). Los resultados mostraron que las secuencias de la inserción sintética G de la rabia y el C3 brazos izquierdo y derecho de todo el G inserto rabia sintético en vCP3012 fueron los esperados. Una cubierta de producto de PCR brazos flanqueantes del locus C5 y el G inserto de virus clásico de la rabia se secuenció usando cebadores que se muestran en la figura. 29. La secuencia resultante se muestra en la figura. 30 (SEQ ID NO: 23). Los resultados mostraron que las secuencias de la inserción de la rabia G clásico y el C5 brazos izquierdo y derecho de todo el inserto de G de la rabia clásica en vCP3012 fueron los esperados.
Ejemplo 4 - Evaluación de la eficacia de tres nuevas vacunas recombinantes de viruela de canario en comparación con vCP65A mediante la vacunación y la serología en perros
Para este estudio, todos los perros fueron asignados aleatoriamente a cinco grupos de tratamiento diferentes (6 perros en cada grupo) con el factor de ID de camada. Los perros de los diferentes grupos de vacuna fueron asignados aleatoriamente a jaulas con grupos de vacuna mezclados dentro de la misma jaula. Los perros fueron asignados a jaulas segregados por sexo. Los perros en el grupo de control serán alojados en una jaula diferente de los vacunados durante el período de preestimulación. Se usó SAS ® Software V9.1 Enterprise Guide para producir la tabla de aleatorización. Los perros fueron vacunados en el día 0 con vacunas experimentales (Tabla 1). Las muestras de sangre se tomaron en el día 0, 7, 14, 21, 28, 48, 70 y 90 y los títulos de anticuerpos contra la rabia se determinaron por RFFIT.
Tabla 1. Grupos de tratamiento
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Los títulos de RFFIT de las medias geométricas y los intervalos de confianza del 95% se calcularon para cada grupo (A, B, C, y D) y día. El pico de anticuerpos parece ser en el día 21. Los resultados se muestran en la Tabla 2. En el día 14, vCP3012 los vacunados tienen títulos marcadamente más altos que todos los demás grupos. El día 21, los dos grupos vacunados con un vector que contiene cOX40L del canario tienen una mayor respuesta de neutralización que otros grupos vacunados. Por lo tanto, un inicio más temprano de la inmunidad y los picos más altos títulos se ve claramente en los grupos vacunados con un vector que expresa cOX40L. Después del día 21 y hasta el final del estudio, vCP3012 vacunados mantiene títulos marcadamente más altos que todos los demás grupos. En el Día 90, todos los perros vacunados con vCP3012 tenían títulos mayores de 0,5 UI/ml, un título generalmente considerado como protector en la rabia experimentos de desafío virulentas. Por lo tanto, la expresión cOX40L mejora la duración de la inmunidad de la vacuna de la rabia del canario vectorizada.
Conclusión. En comparación con el vCP65a parental, la adición de cOX40L en la cadena principal de cualquiera de vCP65a o vCP3006 mejora claramente la aparición de la inmunidad anti-rabia, tal como se mide por los anticuerpos neutralizantes contra la rabia; aumenta el máximo de títulos de anticuerpos neutralizantes contra la rabia, así como prolonga la duración de la inmunidad anti-rabia durante al menos 90 días (la última fecha de muestreo de sangre).
Tabla 2. Título de media geométrica e intervalo de confianza del 95%
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
Ejemplo 5 - Evaluación de la inmunogenicidad de las tres nuevas vacunas recombinantes de la viruela del canario mediante estimulación virulenta en los perros
Se asignaron al azar treinta (30) beagles criados a propósito, de dos a tres meses, en uno de los cinco grupos de tratamiento (n = 6), utilizando ID de camada como el factor de aleatorización primario. En el Día 0 todos los perros fueron vacunados de acuerdo con la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3. Esquema de vacunación
Figure imgf000021_0002
Los animales fueron controlados durante una hora después de la vacunación para las reacciones sistémicas agudas. Los sitios de inyección fueron examinados y se registraron las temperaturas rectales al día durante 3 días a partir de entonces. Se recogió sangre para los títulos de anticuerpos de la rabia, tal como se mide mediante Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT) antes de, y a intervalos regulares después de la vacunación. En base a una respuesta serológica favorable, los perros del grupo C (vCP3015) fueron sometidos a una estimulación de la rabia virulenta aproximadamente un año después de la vacunación (día 397). El material de estimulación (New York Strain 142.90 a una dilución de 1:100) se administró bajo anestesia por vía intramuscular, en los músculos frontalis izquierod y derecho (0,5 ml en cada músculo). La retrotitulación del material de estimulación se realizó de acuerdo con QCD-CM-030. Después de la estimulación, se observaron los perros durante 30 días para la mortalidad o la evidencia de signos neurológicos progresivos. El suero se obtuvo de todos los perros inmediatamente después de la eutanasia para las pruebas RFFIT. Ambos hemisferios del cerebro se recogieron en la necropsia y el hemisferio derecho se presentó para la detección de virus de la rabia usando inmunofluorescencia directa.
Todos los análisis estadísticos se realizaron con SAS, Cary, Carolina del Norte (SAS Versión 9.1, Enterprise Guide). Todas las pruebas fueron de dos vías y la significación estadística se declaró en un valor P de 0,05 o menos. La variable principal fue el título de anticuerpos de la rabia en suero medido mediante Rapid Fluorescent Focus Inhibition Assay (RFFIT). La seroconversión se definió como un cambio de un título de anticuerpo negativo (bajo umbral de detección, es decir, < 0,2 Ul/ml) a un título positivo de anticuerpos de la rabia (> 0,2 lU/ml). Todos los perros fueron seronegativos para la rabia antes de la vacunación a excepción de un perro en el Grupo A (vCP3006) que presentó un título de la rabia bajo de 0,3 UI/ml y un valor de 0,5 UI/ml en una repetición de la prueba. Tres perros del grupo E (grupo de control negativo) demostraron títulos bajos de anticuerpos dentro de los 30 días siguientes al inicio del estudio. Para el día 48, todos los perros en el grupo E fueron seronegativos y permanecieron negativos durante todo el estudio. Los títulos bajos de la rabia fueron casi seguramente debido a los anticuerpos maternos residuales. El título de anticuerpos de RFFIT del promedio geométrico del grupo después de la vacunación para los Grupos A, B, C y D se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4. Título promedio geométrico de Ab de rabia en suero (IU/ml) por grupo después de la vacunación
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Se observó seroconversión de todos los perros en el Grupo B (vCP3012) y 5/6 perros en los grupos A (vCP3006), C (vCP3015) y D (vCP65A) siete días después de la vacunación. Los perros vacunados con vCP3012 demostraron una significativa e impredeciblemente título de la rabia más alto en comparación con el grupo A (vCP3006) y el grupo de la vacuna de referencia D (vCP65A) del Día 14 hasta el Día 90. El GMT de la rabia para el grupo C (vCP3015) fue significativamente más alto que el grupo de la vacuna de referencia D (vCP65A) en los días 21, 48, 70 y 90. Los perros vacunados con vCP3006 no mostraron una diferencia significativa en los títulos de rabia en comparación con el grupo de la vacuna de referencia D (vCP65A), excepto para el día 90.
Aproximadamente un año después de la vacunación, los perros del Grupo C (vCP3015) fueron sometidos a una estimulación de la rabia virulenta. Los perros restantes del grupo B y E permanecieron bajo el número actual de estudio hasta la finalización del estudio en una fecha posterior. El 50% de la dosis letal calculada en ratón (MLD50) del virus de estimulación administrada fue de 2,2 log10 (158,5 MLD50) en 0,03 ml. Como se administró 1 ml a cada perro, la dosis del perro fue de 3,96 log10 MLD50. Los títulos de RFFIT antes y después de la estimulación, y los resultados de anticuerpos fluorescentes de la rabia después de la estimulación y los datos de morbilidad/mortalidad se muestran en la Tabla 5 a continuación.
Tabla 5. Resumen de resutados
Figure imgf000022_0002
**El día de preestimulación con CBCCTX, CBDCCE y CBDCCY fue el día 752_______________________________
Ninguno de los perros del Grupo C demostró ninguna anormalidad clínica hasta 30 días después de la inoculación. Todos los perros en el grupo de control negativo desarrollaron signos clínicos compatibles con la infección de la rabia canina entre los días 12 y 17, como el cambio en el comportamiento, letargo, salivación, tics facial, dificultad para tragar, y parálisis de las extremidades. Todos los perros sacrificaron hasta 17 días después del desafío fueron positivos para la prueba de anticuerpos de la rabia fluorescente y el resto de los perros sacrificaron al final del estudio fueron negativos para la prueba de anticuerpos fluorescentes de la rabia en el tejido cerebral. Además, no se observaron reacciones locales lugar de inyección (inflamación difusa, hinchazón firme, dolor a la palpación o prurito) ni elevaciones clínicamente significativas en la temperatura rectal después de la vacunación.
Discusión. Basándose en los resultados de titulación antes de la vacunación, el volumen final de cada vacuna de ensayo se ajustó para alcanzar un título de objetivo de aproximadamente 1059 TCID 50/ml. En consecuencia, un menor volumen se administró a la vacunación para vCP3012 (Grupo B) que tenía un mayor título de pre-vacunación en comparación con las otras vacunas de prueba. La selección de los animales sometidos a desafío de la rabia uno o dos años después de la vacunación se basa en la rabia geométrico título medio serología durante un período de 3 meses en comparación con la vacuna de referencia (Grupo D vCP65A). Grupo A (vCP3006) no cumplía con los criterios de desafío, por lo tanto perros pertenecientes a ese grupo fueron puestos en libertad a partir del estudio en el Día 151. Los grupos B y C cumplen claramente los criterios de desafío. Duración de uno y dos años de evaluación inmunidad fue seleccionado para vCP3015 y vCP3012, respectivamente. La selección de los cuales vacuna de prueba para evaluar primero se basó en los resultados de la serología y el constructo con el número más bajo de G de la rabia copias de genes. Puesto que el constructo vCP3015 contiene 2 copias y el vCP3012 contiene 4 copias, vCP3015 se selecciona de este modo para ser evaluado primero. La duración de dos años de la evaluación de a inmunidad se llevará a cabo en perros vacunados con vCP3012 y en comparación con el grupo de referencia (vCP65A).
Estos resultados demostraron los constructos VCP eran seguros cuando se administran una vez por vía subcutánea en perros. Los perros vacunados por vía subcutánea con una dosis única de una construcción que contiene 2 copias del gen G de la rabia y el OX40L inmunomodulador (vCP3015) a 10587 TCID 50/ml estaban protegidos frente a un desafío de la rabia virulenta 1 año después de la vacunación. vCP3012, que contiene 4 copias del gen G de la rabia y OX40L, indujo una respuesta de anticuerpos de la rabia antes y más fuerte en comparación con todos los demás vCP construye, y será evaluado por desafío de la rabia a los 2 años después de la vacunación.
Ejemplo 6 - Otras combinaciones eficaces de antígeno/OX40L
Los inventores prevén que muchas otras combinaciones de antígeno y OX40L darán lugar a vacunas vectorizadas de poxvirus que tienen una eficacia mejorada sobre poxvirus que expresan el mismo antígeno solas. La Tabla 3 presenta una lista no limitante de combinaciones de antígeno y OX40L, donde se selecciona el OX40L en base a su probable capacidad de funcionar como un adyuvante genético eficaz en el animal diana. La figura 38 presenta la alineación de OX40L conocido/putativo de una variedad de diferentes especies. Una persona experta entenderá que las proteínas OX40L también pueden variar algo dentro de un solo género o especie animal (por ejemplo Canis familiaris). Así, las proteínas OX40L que tienen suficiente homología con SEQ ID NO: 12 también deben funcionar como adyuvantes genéticos eficaces en canino, y están abarcados por la presente invención. Además, los inventores prevén que es probable alcanzar resultados similares usando otros vectores, incluyendo vectores virales, para expresar in vivo en un huésped animal genes que codifican un antígeno y un OX40L adyuvante. Por ejemplo, los vectores virales incluyen, pero no se limitan a: virus de ADN, virus de ARN, virus del herpes, adenovirus, virus de tipo adeno, virus de la leucemia, virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), virus de la bronquitis infecciosa (IBV), virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV), virus de la enfermedad de Marek (MDV, SB1, y HVT), etc.
Tabla 3 - Combinaciones de antígeno y OX40L, que se prevén que funcionan como composiciones de vacuna eficaces de forma adyuvante genéticamente
Figure imgf000023_0001

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Vector de ALVAC que comprende un polinucleótido que codifica:
a) dos polipéptidos G de la rabia que tienen cada uno al menos un 90% de identidad con la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1,
en el que cada uno de los polipéptidos G de la rabia es codificado por una parte del polinucleótido insertado en un locus C5 del vector: y
(b) un polipéptido OX40L que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia establecida en las SEQ ID NO: 12, 63, 64, 65, 66, 67, 70 o 71,
en el que el polipéptido OX40L es codificado por una parte del polinucleótido insertado en el locus C6 del vector.
2. Vector de la reivindicación 1, en el que los polipéptidos G de la rabia tienen cada uno al menos un 95% de identidad con la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1.
3. Vector de la reivindicación 2, en el que los polipéptidos G de la rabia tienen cada uno la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1.
4. Vector de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que cada polipéptido G de la rabia es codificado por la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 5.
5. Vector de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el polipéptido OX40L tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia establecida en las SEQ ID NO: 12, 63, 64, 65, 66, 67, 70 o 71.
6. Vector de la reivindicación 5, en el que el polipéptido OX40L tiene la secuencia establecida en las SEQ ID NO: 12, 63, 64, 65, 66, 67, 70 o 71.
7. Vector de la reivindicación 6, en el que el polipéptido OX40L tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 12.
8. Vector de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el vector comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 23.
9. Composición que comprende:
a) el vector de cualquiera de las reivindicaciones 1-8; y
b) un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable.
10. Composición de la reivindicación 9 para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica o protectora contra la rabia que comprende administrar dicha composición.
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