ES2248126T3 - Acidos nucleicos inmunoestimuladores. - Google Patents

Acidos nucleicos inmunoestimuladores.

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ES2248126T3 ES00965433T ES00965433T ES2248126T3 ES 2248126 T3 ES2248126 T3 ES 2248126T3 ES 00965433 T ES00965433 T ES 00965433T ES 00965433 T ES00965433 T ES 00965433T ES 2248126 T3 ES2248126 T3 ES 2248126T3
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Arthur M. Krieg
Christian Schetter
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Coley Pharmaceutical GmbH
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Abstract

Un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py, que es un ácido nucleico rico en T, que es mayor que el 60% en T y contiene un dinucleótido CpG, para usar en un método de estimulación de una respuesta inmune que comprende la administración del ácido nucleico inmunoestimulador a un sujeto no roedor en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune en un sujeto no roedor.

Description

Ácidos nucleicos inmunoestimuladores.
Antecedentes del invento
El ADN bacteriano, pero no el ADN de vertebrados, tiene efecto inmunoestimulador directo sobre las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) in vitro (Krieg y otros, 1995). El ADN bacteriano tienen efectos inmunoestimuladores para activar las células B y las células asesinas naturales, pero el ADN de vertebrados no (Tokunaga, T., y otros, 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79:682-686; Tokunaga, T., y otros, 1984, JNCI 72:955-962; Messina, J.P., y otros, 1991, J. Immunol. 147:1759-1764; y revisado en Krieg, 1998, en: Applied Oligonucleotide Technology, C.A Stein y A.M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, NY, pp 431-448). Se entiende ahora que estos efectos inmunoestimuladores del ADN bacteriano son un resultado de la presencia de dinucleótidos CpG sin metilar en contextos de bases particulares (motivos CpG), que son comunes en el ADN bacteriano, pero metilados y poco representados (supresión CpG, 1/50 a 1/60) en ADN de vertebrados (Krieg y otros, 1995 Nature 374:546-549; Krieg, 1999 Biochem. Biophys. Acta 93321:1-10). Los efectos inmunoestimuladores del ADN bacteriano pueden ser imitados con oligodesoxinucleótidos (ODN) sintéticos que contienen estos motivos CpG. Parece probable que la rápida activación inmune en respuesta a ADN CpG puede evolucionar como un componente de los mecanismos de defensa inmune innatos que reconocen patrones estructurales específicos para moléculas microbianas.
Los ODN para CpG tienen efectos altamente estimuladores en leucocitos humanos y murinos, induciendo proliferación de casi todas (>95%) las células B y aumenta la secreción de inmunoglobulina (Ig); secreción de citoquinas; actividad lítica de células asesinas naturales (NK) y secreción de IFN-\gamma; y activación de células dendríticas (DCs) y otras células presentadoras de antígenos para expresar moléculas coestimuladoras y secretar citoquinas, especialmente las citoquinas del tipo Th1 que son importantes en promover el desarrollo de las respuestas de células T de tipo Th1. La activación de células B por ADN CpG es independiente de células T y no específica de antígeno. Sin embargo, la activación de células B por bajas concentraciones de ADN CpG tiene una fuerte sinergia con las señales liberadas a través del receptor del antígeno de células B tanto para la proliferación de células B como para la secreción de Ig (Krieg y otros, 1995). Esta fuerte sinergia entre las rutas de señalización de células B generadas a través del receptor del antígeno de células B y por el ADN CpG promueve las respuestas inmunes específicas de antígeno. Además de sus efectos directos sobre las células B, el ADN CpG también activa directamente monocitos, macrófagos, y células dendríticas para secretar una variedad de citoquinas, incluyendo elevados niveles de IL-12 (Klinman y otros, 1996; Halpern y otros, 1996; Cowdery y otros, 1996). Estas citoquinas estimulan las células asesinas naturales (NK) para secretar interferón-\gamma (IFN-\gamma) y tienen una actividad lítica aumentada (Klinman y otros, 1996, supra; Cowdery y otros, 1996, supra; Yamamoto y otros, 1992; Ballas y otros, 1996). En general, el ADN CpG induce un patrón de producción de citoquinas de tipo Th1 dominado por IL-12 y IFN-\gamma con una pequeña secreción de citoquinas Th2 (Klinman y otros, 1996). Los efectos directos fuertes (independientes de células T) de ADN CpG sobre las células B, así como la inducción de citoquinas que pueden tener efectos indirectos sobre las células B vía rutas T-ayudantes, sugieren la utilidad del ADN CpG en la forma de ODN como una vacuna adyuvante (véase la solicitud de patente PCT de Nº de publicación: WO98/40100.)
Los efectos inmunoestimuladores del esqueleto fosfodiéster nativo de ODN para CpG son altamente específicos para CpG en cuanto a que los efectos son esencialmente abolidos si el motivo CpG está metilado, cambiado a un GpC, o eliminado o alterado de otro modo (Krieg y otros, 1995 Nature 374:546-549; Hartmann y otros, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10). El ODN de CpG fosfodiéster puede ser formulado en lípidos, aluminio, u otro tipo de vehículos con propiedades de depósito o con una ingesta celular mejorada para potenciar los efectos inmunesestimuladores (Yamamoto y otros, 1994 Microbiol. Immunol. 38:831-836; Gramzinski y otros, 1998 Mol. Med. 4:109-118).
En estudios anteriores, se pensaba que el motivo CpG inmunoestimulador seguía la fórmula purina-purina-CpG-pirimidina-pirimidina (Krieg y otros, 1995 Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156:421-423; Hacker y otros, 1998 EMBO J. 17:6230-6240; Lipford y otros, 1998 Trends in Microbiol. 6:496-500). Sin embargo, ahora está claro que los linfocitos de ratón responden bastante bien a los motivos CpG fosfodiéster que no siguen esta "fórmula" (Yi y otros, 1998 J. Immunol. 160:5898-5906) y lo mismo es verdad para células B y células dendríticas humanas (Hartmann y otros, 1999 Proc. Natal. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129).
Varios investigadores anteriores han buscado si el contenido nucleotídico de ODN puede tener efectos independientemente de las secuencias de ODN. Interesantemente, se ha encontrado que los ODN antisentido están generalmente enriquecidos en el contenido de secuencias GG, CCC, CC, CAC, y CG, mientras que tienen una reducida frecuencia de secuencias nucleotídicas TT o TCC comparado con lo que se esperaría si el uso de las bases fuera al azar (Smetsers y otros, 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Develop. 6:63-67). Esto generó la posibilidad de que las secuencias sobrerepresentadas puedan comprender elementos diana preferidos para los oligonucleótidos antisentido o viceversa. Una razón para evitar el uso de ODN ricos en timidina para experimentos antisentido es que la degradación de los ODN por nucleasas presentes en las células libere timidina libre que compita con la 3H-timidina, que se usa frecuentemente en experimentos para evaluar proliferación celular (Matson y otros, 1992 Antisense Research and Development 2:325-330).
Sumario del invento
El presente invento se refiere en parte a ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en pirimidina (ricos en Py) y en algunas realizaciones ricos en timidina (T), que no requieren la presencia de un motivo CpG. El presente invento también se refiere en parte al descubrimiento de que los ácidos nucleicos que contenían un motivo de dinucleótidos de TG fueran también inmunoestimuladores. El invento se basa en parte en el hallazgo inesperado de que las secuencias de ácidos nucleicos, que no contienen motivos CpG son inmunoestimuladoras. Se descubrió tras un análisis de las propiedades de inmuneestimulación de muchas secuencias de ácidos nucleicos que estas secuencias pueden ser ricas en Py, por ejemplo, ricas en T o que pueden contener motivos TG. Se descubrió también que estas secuencias activan preferencialmente células inmunes que no son de roedores. Las secuencias ricas en Py y TG son sólo mínimamente inmunoestimuladoras con respecto a células inmunes de roedores, comparadas con células inmunes de no roedores. Así, es posible según los métodos del invento, inducir una respuesta inmune en un sujeto no roedor administrando ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en Py o TG. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en Py y TG del invento pueden incluir opcionalmente motivos CpG. Estos hallazgos tienen importantes implicaciones para el desarrollo clínico de ácidos nucleicos inmuno-estimuladores que contienen CpG y que no contienen CpG.
En un aspecto el invento es una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmune de ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en Py o TG, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otros aspectos el invento es una composición de materia, que comprende un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py o TG. En otras realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador puede ser rico en T. En aún otras realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador puede ser rico en T y también tener al menos un motivo TG.
Preferiblemente el ácido nucleico rico en Py es un ácido nucleico rico en T. En algunas realizaciones el ácido nucleico inmunoestimulador rico en T es un ácido nucleico poli T que comprende 5' TTTT 3'. En aún otras realizaciones el ácido nucleico poli T comprende 5' X_{1}X_{2}TTTTX_{3}X_{4} 3' en el que X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos. En algunas realizaciones X_{1}X_{2} es TT y/o X_{3}X_{4} es TT. En otras realizaciones X_{1}X_{2} se selecciona del grupo que consiste en TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA, y GC; y/o X_{3}X_{4} se selecciona del grupo que consiste en TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA, y GC.
El ácido nucleico inmunoestimulador rico en T puede tener sólo un motivo poli T único o puede tener una pluralidad de motivos de ácidos nucleicos poli T. En algunas realizaciones el ácido nucleico inmunoestimulador rico en T comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, o al menos 8 motivos T. En otras realizaciones comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, o al menos 8 motivos CpG. En las realizaciones preferidas la pluralidad de motivos CpG y motivos poli T están intercalados.
En aún otras realizaciones al menos una de la pluralidad de los motivos poli T comprende al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, o al menos 9 residuos nucleotídicos T contiguos. En otras realizaciones la pluralidad de motivos poli T es al menos 3 motivos y en las que cada uno de los 3 motivos comprende al menos 3 residuos nucleotídicos T contiguos o la pluralidad de motivos poli T es al menos 4 motivos y en el que al menos los 4 motivos comprenden cada uno al menos 3 residuos nucleotídicos T contiguos.
En algunos casos el ácido nucleico inmunoestimulador rico en T puede estar libre de motivos poli T pero puede comprender en su lugar una composición nucleotídica de más del 25% en T. En otras realizaciones los ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en T tienen motivos poli T y también comprenden una composición nucleotídica de más del 25% en T. En realizaciones preferidas el ácido nucleico inmunoestimulador rico en T comprende una composición nucleotídica de más del 35% en T, de más del 40% en T, de más del 50% en T, de más del 60% en T, de más del 80% en T, o de mas del 90% en residuos nucleotídicos T. En unas realizaciones importantes, el ácido nucleico es al menos 50% T.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en T y TG pueden tener cualquier longitud mayor de 7 nucleótidos, pero en algunas realizaciones puede ser entre 8 y 100 residuos nucleotídicos de longitud. En realizaciones preferidas el ácido nucleico inmunoestimulador rico en T comprende al menos 20 nucleótidos, al menos 24 nucleótidos, al menos 27 nucleótidos, o al menos 30 nucleótidos. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico inmunestimulador TG es entre 15 y 25 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en T y TG pueden ser de hebra única o de hebra doble.
En una realización preferida, el ácido nucleico inmunoestimulador tiene una región rica en T localizada en la mitad de su longitud (es decir, un número aproximadamente igual de núcleotidos flanquea la región rica en T en los extremos 5' y 3').
El ácido nucleico rico en T en algunas realizaciones se selecciona del grupo que consiste en la SEQ IN Nº: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269,282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908, y 910-913. En otras realizaciones los ácidos nucleicos ricos en T son secuencias seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID Nº: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890, y 891.
En otras realizaciones el ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py es un ácido nucleico rico en C. Un ácido nucleico rico en C es un ácido nucleico que incluye al menos una y preferiblemente al menos 2 regiones poli-C o que incluye 50% o más nucleótidos C.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en Py y en TG pueden incluir uno o más motivos CpG. Los motivos pueden estar metilados o sin metilar. En otras realizaciones los ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en Py y TG están libres de uno o más dinucleótidos CpG.
En otras realizaciones los ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en Py y TG también incluyen motivos poli-A, poli G, y/o poli C. En aún otras realizaciones los ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en Py o TG están libres de dos secuencias poli C de al menos 3 residuos nucleotídicos C contiguos o están libres de dos secuencias poli A de al menos 3 residuos nucleotídicos A contiguos. En otras realizaciones los ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en Py o TG comprenden una composición nucleotídica de más del 25% en C o más del 25% en A. En aún otras realizaciones los ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en Py o TG están libres de secuencias poli-C, secuencias poli-G o secuencias poli-A.
Un ácido nucleico poli G en algunas realizaciones es seleccionado a partir del grupo que consiste en la SEQ ID Nº: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936, y 938. En otras realizaciones el ácido nucleico poli G incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID Nº: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329, 434, 435, 475, 519, 521-524, 526, 527, 535, 554, 565, 609, 628, 660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926, 927, 932, y 937.
Según otro aspecto del invento, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser definidos como aquellos que poseen un motivo TG, referidos aquí como ácidos nucleicos inmunoestimuladores TG. El ácido nucleico TG en una realización contiene al menos un dinucleótido TG que tiene una secuencia que incluye al menos la siguiente fórmula: 5'N_{1}X_{1}TGX_{2}N_{2}3'. En realizaciones relacionadas, el N_{1} es una secuencia de ácidos nucleicos compuesta de un número de nucleótidos que oscila desde (11-N_{2}) a (21-N_{2}) y N_{2} es una secuencia de ácidos nucleicos compuesta de un número de nucleótidos que oscila desde (11-N_{1}) a (21-N_{1}). En una realización preferida, X_{2} es timidina.
En otras realizaciones, el ácido nucleico TG tiene al menos la siguiente fórmula: 5'X_{1}X_{2}TGX_{3}X_{4}3'. En aún otra realización, el ácido nucleico TG comprende la siguiente secuencia 5'N_{1}X_{1}X_{2}TGX_{3}X_{4}N_{2}3'. En una realización relacionada, N_{1} es una secuencia de ácidos nucleicos compuesta de un número de nucleótidos que oscila desde (9-N_{2}) hasta (19-N_{2}) y N_{2} es una secuencia de ácidos nucleicos compuesta de un número de nucleótidos que oscilan desde (9-N_{1}) a (19-N_{1}). En una realización preferida, X_{3} es timidina. X_{1}X_{2} son nucleótidos que pueden ser seleccionados a partir del grupo que consiste en GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA, y TT, y X_{3}X_{4} son nucleótidos que pueden ser seleccionados a partir del grupo que consiste en TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA, y CA. En algunas realizaciones preferidas, X_{3} es una timidina. En realizaciones importantes, X_{3}X_{4} son nucleótidos seleccionados a partir del grupo que consiste en TT, TC, TA y TG. En otras realizaciones X_{1}X_{2} son GA o GT y X_{3}X_{4} son TT. En otras realizaciones X_{1} o X_{2} o ambas son purinas y X_{3} o X_{4} son ambas pirimidinas o X_{1}X_{2} son GpA y X_{3} o X_{4} o ambas son pirimidinas. En una realización X_{2} es una T y X_{3} es una pirimidina.
En una realización la secuencia 5'X_{1}X_{2}TGX_{3}X_{4}3' del ácido nucleico TG o la longitud entera o algún fragmento del mismo del ácido nucleico TG es una secuencia no palindrómica, y en otras realizaciones es una secuencia palindrómica.
En algunas realizaciones preferidas, el ácido nucleico TG es también rico en T.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en Py y en TG en algunas realizaciones tienen un esqueleto nucleotídico que incluye al menos una modificación del esqueleto, tal como una modificación fosforotioato. El esqueleto nucleotídico puede ser quimérico, o preferiblemente el esqueleto nucleotídico está completa-mente modificado. En una realización preferida, el ácido nucleico inmunoestimulador tiene un motivo poli T y un esqueleto fosforotioato.
En otro aspecto el invento es una composición de un ácido nucleico inmunoestimulador, en la forma de un ácido nucleico rico en Py o TG, y un antígeno, en el que el ácido nucleico está libre de motivos Cpg sin metilar.
Otra composición del invento es un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py o Tg y un agente antimicrobiano, en el que el ácido nucleico rico en Py o Tg está libre de motivos CpG sin metilar. Preferiblemente el agente antimicrobiano se selecciona a partir del grupo que consiste en un agente antiviral, un agente antiparasítico, un agente antibacteriano y un agente antifúngico.
Una composición de un dispositivo de liberación sostenida que incluye un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py y/o TG, en el que el ácido nucleico rico en Py y/o TG está libre de motivos CpG sin metilar, se proporciona según otro aspecto del invento.
El invento también incluye suplementos nutricionales de un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py o TG en un dispositivo de liberación seleccionado a partir de un grupo que consiste en una cápsula, una píldora, y una tableta sublingual, en el que el ácido nucleico rico en Py o Tg está libre de motivos CpG sin metilar.
Debería entenderse que cuando es útil administrar un oligonulceótido rico en Py por ejemplo, poli T, rico en T, rico en C u oligonucleótido TG y un oligonucleótido CpG, puede ser también deseable coadministrar un oligonucleótido rico en Py o un oligonucleótido TG junto con un oligonucleótido CpG, rico en Py o TG separados físicamente. Alternativamente, el motivo CpG, rico en Py o TG puede estar presente en el mismo ácido nucleico contiguo como el oligonucleótido rico en Py o TG. En aún otra realización adicional, todos o alguna combinación de ácidos nucleicos ricos en Py, TG y CpG puede ser coadministrada tanto en ácidos nucleicos separado como en la misma molécula de ácidos nucleicos. Mediante coadministración se pretende que los ácidos nucleicos sean administrados lo suficientemente cerca en el tiempo entre sí para lograr un beneficio combinado de ambos oligonucleótidos, preferiblemente más que el beneficio logrado administrando cada uno de los oligonucleótidos solos a la misma dosis.
Los oligonucleótidos CpG tienen, en general, la fórmula 5'X_{1}X_{2}TGX_{3}X_{4}3', en la que X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos y en la que al menos el C de CpG está sin metilar. Los oligonucleótidos CpG preferidos son de 8-100 nucleótidos de longitud y tienen esqueletos modificados. Las estructuras particulares están detalladas en la solicitud de patente publicada PCT, solicitudes de patentes americanas y referencias citadas aquí, las descripciones de las cuales están aquí incorporadas en su plenitud. En una realización, el oligonucleótido CpG está libre de motivos poli T y TG y no es rico en T.
En otras realizaciones, el oligonucleótido CpG tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID Nº: 1, 3, 4, 14-16, 18-24, 28, 29, 33-46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-87, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227-240, 242-256, 258, 260-265, 270-273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-312, 314-317, 320-327, 329, 335, 337-341, 343-352, 354,357, 361-365, 367-369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 399, 401-404, 406-426, 429-433, 434-437, 439, 441-443, 445, 447, 448, 450, 453-456, 460-464, 466-469, 472-475, 477, 478, 480, 483-485, 488, 489, 492, 493, 495-502, 504-505, 507-509, 511, 513-529, 532-541, 543-555, 564-566, 568-576, 578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615, 617, 619-622, 625-646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711-716, 718-732, 736, 737, 739-744, 746, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 790-792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904, y 909-913.
En otra realización, el oligonucleótido rico en Py o TG está libre de un motivo CpG. Esta realización del invento también implica composiciones farmacéuticas y kits que contienen tanto un oligonucleótido CpG (que puede estar libre de motivos poli T y TG y no ser rico en T) y un oligonucleótido rico en Py y/o TG físicamente separado del oligonucleótido CpG. Las preparaciones farmacéuticas están en cantidades eficaces y típicamente incluyen vehículos farmacéuticamente aceptables, todo ello como se expone en detalle aquí con respecto a los oligonucleótidos ricos en Py y TG. Los kits incluyen al menos un contenedor que contiene un oligonucleótido, que es un oligonucleótido rico en Py o TG (o alguna combinación del mismo). El mismo contenedor, o en otras realizaciones, un segundo contenedor, puede contener un oligonucleótido con un motivo CpG, que puede estar libre de motivos ricos en Py y/o TG. El kit también contiene instrucciones para administrar los oligonucleótidos a un sujeto. Los kits también pueden incluir un contenedor que contiene un disolvente o un diluyente.
En resumen, como si se enumerara aquí por completo, se puede usar un oligonucleótido CpG físicamente separado del oligonucleótido rico en Py o TG junto con los oligonucleótidos ricos en Py o TG en los métodos, composiciones y productos descritos anteriormente.
El invento se refiere en otros aspectos a oligonucleótidos inmunoestimuladores, que tienen esqueletos quiméricos y, que no requieren la presencia de un motivo CpG. El invento se basa en parte en el descubrimiento de que las secuencias de ácidos nucleicos, que no contenían motivos CpG eras inmunoestimuladoras, y que aquellas que tienen esqueletos quiméricos tienen propiedades inmuno-estimuladoras inesperadamente potenciadas. Así, el invento en un aspecto se refiere a una composición de un oligonucleótido que tiene una fórmula: 5'Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2}3', en la que Y_{1} e Y_{2} son, independientes la una de la otra, moléculas de ácidos nucleicos que tienen entre 1 y 10 nucleótidos, en los que Y_{1} incluye al menos una unión internucleotídica modificada e Y_{2} incluye al menos una unión internucleotídica modificada y en la que N_{1} y N_{1} son moléculas de ácidos nucleicos, cada una independiente de la otra, que tienen entre 0 y 5 nucleótidos, pero en las que N_{1}ZN_{2} tiene al menos 6 nucleótidos en total y en la que los nucleótidos de N_{1}ZN_{2} tienen un esqueleto fosfodiéster, y en la que Z es un motivo de ácido nucleico inmunoestimulador pero no incluye un CG. En una realización Z es una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada a partir del grupo que consiste en TTTT, TG, y una secuencia en la que al menos 50% de las bases de la secuencia son Ts.
En algunas realizaciones Y_{1} y/o Y_{2} tienen entre 3 y 8 nucleótidos. En otras realizaciones Y_{1} y/o Y_{2} están comprendidas de al menos tres Gs, al menos cuatro Gs, al menos siete Gs, o todas Gs. En otras realizaciones Y_{1} y/o Y_{2} se seleccionan del grupo que consiste en TCGTCG, TCGTCGT, y TCGTCGTT (SEQ IN Nº: 1145). En aún otras realizaciones Y_{1} y/o Y_{2} incluyen al menos una, dos, tres, cuatro, o cinco secuencias poli-A, poli-T, o poli-C.
Los nucleótidos centrales (N_{1}ZN_{2}) de la fórmula Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2} tienen uniones internucleotídicas fosfodiéster y Y_{1} e Y_{2} tienen al menos una unión internucleotídica modificada. En algunas realizaciones Y_{1} y/o Y_{2} tienen al menos dos uniones internucleotídicas modificadas. En otras realizaciones Y_{1} y/o Y_{2} tienen al menos entre dos y cinco uniones internucleotídicas modificadas. En aún otras realizaciones Y_{1} tiene dos uniones internucleotídias modificadas e Y_{2} tiene cinco uniones internucleotídicas modificadas o Y_{1} tienen cinco uniones internucleotídicas modificadas e Y_{2} tiene dos uniones internucleotídicas modificadas. La unión modificada, en algunas realizaciones es una unión fosforotioato modificada, una unión fosforoditioato modificada o una unión p-etoxi modificada.
Las porciones de la fórmula Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2} pueden opcionalmente formar un palíndromo. Así, en algunas realizaciones los nucleótidos de N_{1}ZN_{2} forman un palíndromo. En algunas realizaciones el palíndromo no es una repetición directa. En aún otras realizaciones los nucleótidos de Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2} no forman un palíndromo.
Según otras realizaciones N_{1}ZN_{2} tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en GATTTTATCGTC (SEQ ID Nº: 1098), TCGATTTTTCGA (SEQ ID Nº: 1099); TCATTTTTATGA (SEQ ID Nº: 1100); GTTTTTTACGAC (SEQ ID Nº: 1101); TCAATTTTTTGA (SEQ ID Nº: 1102), ACGTTTTTACGT (SEQ ID Nº: 1103); TCGTTTTTACGA (SEQ ID Nº: 1104); TCGATTTTTACGTCGA (SEQ ID Nº: 1105); AATTTTT
TAACGTT (SEQ ID Nº: 1106); TCGTTTTTTAACGA (SEQ ID Nº: 1107); ACGTTTTTTAACGT (SEQ ID Nº: 1108); GATTTTTATCGTC (SEQ ID Nº: 1109); GACGATTTTTCGTC (SEQ ID Nº: 1110); GATTTTAGCTCGTC (SEQ ID Nº: 11111); GATTTTTACGTC (SEQ ID Nº: 1112); ATTTTATCGT (SEQ ID Nº: 1113); AACGATTTTTCGTT (SEQ ID Nº: 1114); TCACTTTTGTGA (SEQ ID Nº: 1115); TCGTATTTTA (SEQ ID Nº: 1116); ACTTTTGTACCGGT (SEQ ID Nº: 1117); TCGATTTTTCGACGTCGA (SEQ ID Nº: 1118); ACGATTTTTCGT (SEQ ID Nº: 1119); GAT
GATCGTC (SEQ ID Nº: 1120); TCGATGTCGA (SEQ ID Nº: 1121); TCATGTATGA (SEQ ID Nº: 1122); GTGT
TACGAC (SEQ ID Nº: 1123); TCAATGTTGA (SEQ ID Nº: 1124); ACGTGTACGT (SEQ ID Nº: 1125); TCGTG
TACGA (SEQ ID Nº: 1126); TCGATGTACGTCGA (SEQ ID Nº: 1127); AATGTTAACGTT (SEQ ID Nº: 1128); TCGTGTTAACGA (SEQ ID Nº: 1129); ACGTGTTAACGT (SEQ ID Nº: 1130); GATGTATCGTC (SEQ ID Nº: 1131); GACGATGTCGTC (SEQ ID Nº: 1132); GATGAGCTCGTC (SEQ ID Nº: 1133); GATGTACGTC (SEQ ID Nº: 1134); ATGATCGT (SEQ ID Nº: 1135); AACGATGTCGTT (SEQ ID Nº: 1136); TCACTGGTGA (SEQ ID Nº: 1137); TCGTATGA (SEQ ID Nº: 1138); ACTGGTACCGGT (SEQ ID Nº: 1139); TCGATGTCGACGTCGA (SEQ ID Nº: 1140); y ACGATGTCGT (SEQ ID Nº: 1141).
La composición puede opcionalmente incluir un vehículo farmacéutico y/o estar formulada en un dispositivo de suministro. En algunas realizaciones el dispositivo de suministro se selecciona del grupo que consiste en lípidos catiónicos, proteínas permeantes de las células, y dispositivos de liberación sostenida. En una realización preferida el dispositivo de liberación sostenida es un polímero biodegradable. En otra realización el dispositivo de liberación sostenida es una micropartícula.
En otro aspecto el invento es una composición de un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene la fórmula Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2} y un antígeno.
Otra composición del invento es un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene la fórmula Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2} y un agente terapéutico antimicrobiano. Preferiblemente el agente terapéutico antimicrobiano se selecciona del grupo que consiste en un agente antiviral, un agente antiparasítico, y un agente antibacteriano, o un agente antifúngico.
Una composición de un dispositivo de liberación sostenida incluye un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene la fórmula Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2} se proporciona según otro aspecto del invento.
El invento también incluye suplementos nutricionales de un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene la fórmula Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2} en un dispositivo de suministro seleccionado del grupo que consiste en una cápsula, una tableta sublingual, y una píldora.
En otro aspecto las composiciones descritas anteriormente también incluyen un ácido nucleico inmunoestimulador TG o una secuencia rica en Py, en la que el ácido nucleico inmunoestimulador que tiene un dinucleótido CG sin metilar, un dinucleótido TG o una secuencia rica en Py tiene una secuencia diferente que el oligonucleótido que comprende 5'Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2}3'.
En algunas realizaciones el ácido nucleico inmunoestimulador que tiene un dinucleótido CG sin metilar, un dinucleótido TG o una secuencia rica en Py tiene un esqueleto completamente fosfodiéster y en otras realizaciones el ácido nucleico inmunoestimulador que tiene un dinucleótido CG sin metilar, un dinucleótido TG o una secuencia rica en Py tiene un esqueleto modificado, que puede tener opcionalmente uniones internucleotídicas seleccionadas a partir del grupo que consiste en fosforotioato, fosforoditioato, y p-etoxi.
En una realización el ácido nucleico inmunoestimulador que tiene un dinucleótido CG sin metilar tiene una fórmula que comprenden; 5'X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3' en la que X_{1}, X_{2}, X_{3}, y X_{4} son nucleótidos. En otras realizaciones la secuencia de ácidos nucleicos incluye al menos la siguiente fórmula: 5'TCNTX_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3' en la que N es una secuencia de ácidos nucleicos compuesta por al menos alrededor de 0-25 nucleótidos, en la que al menos un nucleótido tiene una unión internucleotídica modificada, y en la que el ácido nucleico tiene menos o igual que 100 nucleótidos. Según algunas realizaciones X_{1}X_{2} son nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en: GT, GG, GA y AA y X_{3}X_{4} son nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en: TT, CT o GT. En una realización preferida X_{1}X_{2} son GA y X_{3}X_{4} son TT.
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En otra realización la secuencia de ácidos nucleicos inmunoestimuladora tiene un dinucleótido CG sin metilar que incluye al menos una de las siguientes secuencias:
ATCGACTCTCGAGCGTTCTC (SEQ ID Nº: 15); TCCATGTCGGTCCTGCTGAT (SEQ ID Nº: 32); TCCATGTCGGTZCTGATGCT (SEQ ID Nº: 31); ATCGACTCTCGAGCGTTZTC (SEQ ID Nº: 18); TC
CATGTCGGTCCTGATGCT (SEQ ID Nº: 28); GGGGGG (SEQ ID Nº: 12); TCCATGACGGTCCTGATGCT (SEQ ID Nº: 35); TCCATGGCGGTCCTGATGCT (SEQ ID Nº: 34); TCCATGACGTTCCTGATGCT (SEQ ID Nº: 7); TCCATGTCGTTCCTGATGCT (SEQ ID Nº: 38); GGGGTCAGTCTTGACGGGG (SEQ ID Nº: 41); TCCATGTCGCTCCTGATGCT (SEQ ID Nº: 37); TCCATGTCGATCCTGATGCT (SEQ ID Nº: 36); TCCATGCCGGTCCTGATGCT (SEQ ID Nº: 33); TCCATAACGTTCCTGATGCT (SEQ ID Nº: 3); TC
CATGACGTTCCTGATGCT (SEQ ID Nº: 7); TCCATGACGTCCCTGATGCT (SEQ ID Nº: 39); TCCAT
CACGTGCCTGATGCT (SEQ ID Nº: 48); TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID Nº: 10); ATGACGTTCCT
GACGTT (SEQ ID Nº: 70); TCTCCCAGCGCGCGCCAT (SEQ ID Nº: 72); TCCATGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID Nº: 73); TCCATAGCGTTCCTAGCGTT (SEQ ID Nº: 74); TCCTGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID Nº: 76); TCCTGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID Nº: 77); TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT (SEQ ID Nº: 52); TCCTTGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID Nº: 121); TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT (SEQ ID Nº: 208); TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT (SEQ ID Nº: 120); TCCATGCGTTGCGTTGCGTT (SEQ ID Nº: 81); TCCACGACGTTTTCGACGTT (SEQ ID Nº: 82); TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID Nº: 47); TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID Nº: 46); TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID Nº: 49); GCGTGCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID Nº: 56); TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT (SEQ ID Nº: 48); TGTCGTTGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID Nº: 84); TGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID Nº: 50); TCGTCGTCGTCGTT (SEQ ID Nº: 51); y TGTCGTTGTCGTT (SEQ ID Nº: 85). En otra realización el ácido nucleico inmunoestimulador que tiene una secuencia rica en Py o TG es un ácido nucleico como se describe anteriormente.
En otro aspecto el invento se refiere a composiciones farmacéuticas y kits que contienen tanto un oligonucleótido que tiene la fórmula Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2} como un oligonucleótido CpG (que opcionalmente puede estar libre de motivos poli T y TG y no ser rico en Py), un oligonucleótido rico en Py y/o TG físicamente separado del oligonucleótido que tiene la fórmula Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2}. Las preparaciones farmacéuticas están en cantidades eficaces e incluyen típicamente vehículos farmacéuticamente aceptables, todo como se expone aquí en detalle. Los kits incluyen al menos un contenedor que contiene un oligonucleótido que tiene la fórmula Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2}. El mismo contenedor, o en otras realizaciones, un segundo contenedor, puede contener un oligonucleótido con un motivo CpG, que opcionalmente puede estar libre de motivos ricos en Py y/o TG y/o un oligonucleótido rico en Py o TG (o alguna combinación el mismo). Este kit también contiene instrucciones para administrar los oligonucleótidos a un sujeto. Los kits pueden también incluir un contenedor que contiene un disolvente o un diluyente.
En resumen, como si se enumerara completamente aquí, un oligonucleótido que tiene la fórmula Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2}, que está físicamente separado del oligonucleótido CpG, rico en Py o TG puede ser usado junto con los oligonucleótidos CpG, ricos en Py, TG, en los métodos, composiciones y productos aquí descritos.
En otro aspecto el invento se refiere a una composición farmacéutica que incluye al menos dos oligonucleótidos del invento, en el que al menos dos oligonucleótidos tienen diferentes secuencias entre sí y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se proporciona una formulación en vacuna según otro aspecto del invento. La vacuna incluye cualquiera de las composiciones del invento en combinación con un antígeno.
Según otro aspecto del invento, se proporciona un método para estimular una respuesta inmune. El método implica administrar un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py o TG a un sujeto no roedor en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune en el sujeto no roedor. Preferiblemente el ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py o TG es administrado oralmente, localmente, en un dispositivo de liberación sostenida, mucosalmente a una superficie mucosa, sistémicamente, parenteralmente, o intramuscularmente. Cuando el ácido nucleico inmuno-estimulador rico en Py o TG es administrado a la superficie mucosa puede ser liberado en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune mucosa o una respuesta inmune sistémica. En realizaciones preferidas la superficie mucosa se selecciona del grupo que consiste en una superficie oral, nasal, rectal, vaginal, y ocular.
En algunas realizaciones el método incluye exponer el sujeto a una antígeno en el que la respuesta inmune es una respuesta inmune específica de antígeno. El antígeno puede estar codificado por un vector de ácido nucleico, que puede ser liberado a un sujeto. En algunas realizaciones el antígeno se selecciona a partir del grupo que consiste en un antígeno tumoral, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno parasítico y un antígeno peptídico.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en Py y TG son capaces de provocar una respuesta inmune de amplio espectro. Por ejemplo, estos ácidos nucleicos inmuno-estimuladores pueden ser usados para redirigir una respuesta inmune Th2 a una Th1. Los ácidos nucleicos ricos en Py y TG pueden también ser usados para activar una célula inmune, tal como un leucocito, una célula dendrítica, y una célula NK. La activación puede ser realizada in vivo, in vitro, o ex vivo, es decir, aislando una célula inmune a partir del sujeto, poner en contacto la célula inmune con una cantidad eficaz para activar la célula inmune del ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py o TG y volver a administrar la célula inmune activada al sujeto. En algunas realizaciones la célula dendrítica expresa un antígeno cancerígeno. La célula dendrítica puede ser expuesta al antígeno cancerígeno ex vivo.
La respuesta inmune producida por los ácidos nucleicos ricos en Py o TG pueden también dar como resultado una inducción de la producción de citoquinas por ejemplo, producción de IL-6, IL-12, IL-18, TNF, IFN-\alpha y IFN-\gamma.
En aún otra realización, los ácidos nucleicos ricos en Py y TG son útiles para tratar el cáncer. Los ácidos nucleicos ricos en Py y TG son también útiles según otro de los aspectos del invento para prevenir el cáncer (por ejemplo, reducir un riesgo de desarrollar cáncer) en un sujeto con riesgo de desarrollar cáncer. El cáncer puede ser seleccionado a partir del grupo que consiste en cáncer del tracto biliar, cáncer de mama, cáncer cervical, coriocarcinoma, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer gástrico, neoplasmas intraepiteliales, linfomas, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo de células pequeñas y células no pequeñas), melanoma, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer rectal, sarcomas, cáncer de tiroides, y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas. En algunas realizaciones importantes, el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en cáncer de huesos, cerebro y cáncer del SNC, cáncer del tejido conectivo, cáncer esofágico, cáncer de ojo, linfoma de Hodgkin, cáncer de laringe, cáncer de la cavidad oral, cáncer de piel, y cáncer testicular.
Los ácidos nucleicos ricos en Py y TG pueden también ser usados para aumentar la capacidad de respuesta de una célula cancerígena a una terapia del cáncer (por ejemplo, una terapia anticáncer), opcionalmente cuando el ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py o TG es administrado junto con una terapia anticáncer. La terapia anticáncer puede ser una quimioterapia, una vacuna (por ejemplo, una vacuna de células dendríticas activadas in vitro o una vacuna de antígeno cancerígeno) o una terapia basada en anticuerpos. Esta última terapia puede también implicar la administración de un anticuerpo específico para un antígeno de superficie celular de, por ejemplo, una célula cancerígena, en la que la respuesta inmune da como resultado una citotoxicidad celular dependiente de antígeno (ADCC). En una realización, el anticuerpo puede ser seleccionado a partir del grupo que consiste en Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab y ImmuRAIT-CEA.
Así, según algunos aspectos del invento, a un sujeto que tiene cáncer o riesgo de padecer un cáncer se le administra un ácido nucleico inmunoestimlador y una terapia anticancerígena. En algunas realizaciones, la terapia anticáncer es seleccionada a partir del grupo que consiste en un agente quimoterapéutico, un agente inmunoterapéutico y una vacuna para el cáncer. El agente quimioterapéutico puede ser seleccionado a partir ddel grupo que consiste en metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatino, cloroetilnitosoureas que no contienen azúcar, 5-fluoro-uracilo, mitomicina C, bleomicina, doxurobicina, dacarbazina, taxol, fragilina, Meglamina GLA, valrubicina, carmustaina, y poliferposan, MM1270, BAY 12-9566, inhibidor de la RAS farnesil transferasa, inhibidor de la RAS farnesil transferasa, MMP, MTA/LY231514, LY 264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hycamtin/Topotecan, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrone/Mitroxantrone, Metaret/Suramin, Batismastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG 3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32/Valrubicina, Metastron/derivado de estroncio, Temodal/Temozolomida, Evacet/doxurobicina liposomal Yewtaxan/Paclitaxel, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabine, Furtulon/Dosifluridina, Cyclopax/Paclitaxel oral, Taxoide oral, SPU-077/Cisplatino, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/egfr, cp-609 (754)/inhibidor del oncogén RAS, BMS-182751/platino oral, UFT (Tegafur/Uracilo), Ergamisol/Levamisole, Eniluracilo/776C85/potenciador 5FU, Campto/Levamisol, Camptosar/Irinotecan, Tumodex/Ralitrexed, Leustatina/Cladribina, Paxex/Paclitaxel, Doxil/Doxurobicina liposomal, Fludara/Fludarabine, Pharmarubicin/Epirubicin, DepoCyt, ZD 1839, LU 79553/Bis-Naftalimida, LU 103793/Dolastain, Caetyx/doxurobicina liposomal, Gemzar/Gemcitabina, ZD0473/Anormed, YM 116, semillas de yodo, inhibidores de CDK4 y CDK2, inhibidores de PARP, D4809/Dexifosamida, Ifes/Mesnex/Ifosamida, Vumon/Tenipósido, Paraplatino/Carboplatino, Plantinol/cisplatino, Vepeside/Etopósido, ZD 9331, Taxotere/Docetaxel, profármaco de guanina arabinósido, Análogo de Taxano, nitrosoureas, agentes alquilantes tales como melphelan y ciclofosfamida, Aminoglutetimida, Asparaginasa, Busulfan, Carboplatino, Clorombucil, Cytarabine HCI, Dactinomicina, Daunorubicina HCI, Estramustina fosfáto sódico, Etopósido (VP16-213), Floxuridina, Fluoruracilo (5-FU), Flutamida, Hidroxiurea (Hidroxicarbamida), Ifosfamida, Interferón Alfa-2a, Alfa-2b, Leuprolido acetato (análogo del factor liberador de LHRH), Lomustina (CCNU), Mecloroetamina HCl (mostaza nitrogenada), Mercaptopurina, Mesna, Mitotano (o.p'-DDD), Mitoxantrona HCl, Octreotide, Plicamicina, Procarbazina HCl, Estreptozocina, citrato de Tamoxifén, Tioguanina, Tiotepa, sulfato de Vinblastina, Amsacrina (m-AMSA), Azacitidina, Ertropoietina, Hexametilmelamina (HMM), Interleukina 2, Mitoguazona (metil-GAG; metilglioxal bis-guanilhidrazona; MGBG), Pentostatina (2' desoxi-coformicina), Semustina (metil-CCNU), Tenipósido (VM-26) y Vindesina sulfato, pero no es tan limitado.
El agente inmunoterapéutico puede ser seleccionado a partir del grupo que consiste en Ributaxina, Herceptina, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Glimab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab y ImmuRAIT-CEA, pero no es tan limitado.
La vacuna para el cáncer puede ser seleccionada a partir del grupo que consiste en EGF, vacunas para el cáncer antiidiotípicas, antígeno Gp75, vacuna para el melanoma GMK, vacuna conjugada con gangliósido MGV, Her2/Neu, Ovarex, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL teratopo, BLP25 (MUC-1), vacuna idiotípica liposomal, Melacina, vacunas de antígeno peptídico, vacunas toxina/antígeno, vacuna basada en MVA, PACIS, vacuna BCG, TA-HPV, TA, CIN, DISC-virus y ImmuCyst/TheraCys, pero no es tan limitado.
En aún otra realización de los métodos dirigidos para impedir o tratar el cáncer, el sujeto puede ser administrado además con interferón-\alpha.
El invento en otros aspectos se refiere a métodos para impedir la enfermedad en un sujeto. El método implica administrar al sujeto un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py o TG en una base regular para promover la respuesta del sistema inmune para impedir la enfermedad en el sujeto. Ejemplos de enfermedades o estados investigados para ser prevenidos usando los métodos profilacticos del invento incluyen infecciones microbianas (por ejemplo enfermedades trasmitidas sexualmente) y shock anafiláctico a partir de alergias alimentarias.
En otros aspectos, el invento es un método para inducir una respuesta inmune innata administrando al sujeto un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py o TG en una cantidad eficaz para activar una respuesta inmune innata.
Según otro aspecto del invento, se proporciona un método para tratar o prevenir una infección viral o retroviral. El método implica administrar a un sujeto que padece o tiene riesgo de padecer una infección viral o retroviral, una cantida eficaz de cualquiera de las composiciones del invento para tratar o impedir la infección viral o retroviral. En algunas realizaciones el virus es causado por un virus de hepatitis, VIH, hepatitis B, hepatitis C, virus del herpes, o papilomavirus.
Se proporciona un método para tratar o prevenir una infección bacteriana según otro aspecto del invento. El método implica administrar a un sujeto que padece o tiene riesgo de padecer una infección bacteriana, una cantidad eficaz para tratar o prevenir la infección bacteriana de cualquiera de las composiciones del invento. En una realización la infección bacteriana es debida a una bacteria intracelular.
En otro aspecto el invento es un método para tratar o prevenir una infección parasitaria administrando a un sujeto que padece o tiene riesgo de padecer una infección parasitaria, una cantidad eficaz para tratar o prevenir la infección parasitaria de cualquiera de las composiciones del invento. En una realización la infección parasitaria es debida a un parásito intracelular. En otra realización, la infección parasitaria es debida a un parásito no helmíntico.
En algunas realizaciones el sujeto es un humano y en otras realizaciones el sujeto es un vertebrado no humano seleccionado a partir del grupo que consiste en un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, cabra, pez, mono, pollo, y oveja.
En aún otro aspecto, el invento es un método para tratar o prevenir asma, administrando a un sujeto que padece o tiene riesgo de padecer asma, una cantidad eficaz para tratar o prevenir el asma de cualquiera de las composiciones del invento. En una realización el asma es asma alérgico.
En otro aspecto el invento se refiere a un método para tratar o prevenir la alergia. El método implica administrar a un sujeto que padece o tiene riesgo de padecer alergia, una cantidad eficaz para tratar o prevenir la alergia de cualquiera de las composiciones del invento.
Se proporciona un método para tratar o prevenir una deficiencia inmune según otro aspecto del invento. El método implica administrar a un sujeto que padece o tiene riesgo de padecer una inmunodeficiencia, una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones del invento para tratar o prevenir la deficiencia inmune.
En otro aspecto el invento se refiere a un método para inducir una respuesta inmune TH1 administrando a un sujeto cualquiera de las composiciones del invento en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune TH1.
En una realización los métodos del invento implican administrar un oligonucleótido de fórmula 5'Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2}3' y un ácido nucleico inmunoestimulador que tiene un dinucleótido CG sin metilar, un dinucleótido TG o una secuencia rica en T. En una realización el oligonucleótido que comprende 5'Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2}3' es administrado separadamente del ácido nucleico inmunoestimulador. En algunas realizaciones el oligonucleótido que comprende 5'Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2}3' y el ácido nucleico inmunoestimulador son administrados en un horario semanal alternante y en otras realizaciones el oligonucleótido que comprende 5'Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2}3' y el ácido nucleico inmunoestimulador son administrados en un horario bisemanal alternante.
El invento proporciona en otro aspecto una composición, que comprende un ácido nucleico inmuno-estimulador y una terapia anti cancerígena, formulada en un vehículo aceptable farmacéuticamente y en una cantidad eficaz para tratar un cáncer o para reducir el riesgo de desarrollar cáncer. En realizaciones importantes, el ácido nucleico inmunoestimulador es seleccionado a partir del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en T, un ácido nucleico TG y un ácido nucleico rico en C.
El invento proporciona además un kit que comprende un primer contenedor que almacena un ácido nucleico y al menos otro contenedor (por ejemplo, un segundo contenedor) que almacena una terapia anticancerígena, e instrucciones para el uso. En una realización, el kit comprende además interferón-\alpha, que puede ser almacenado separadamente en aún otro contenedor (por ejemplo, un tercer contenedor). En una realización importante, el kit comprende un vehículo de liberación sostenida que contiene un ácido nucleico inmunoestimulador, y al menos un contenedor que almacena una terapia anticancerígena, e instrucciones para dosificar en el tiempo la administración de la terapia anticancerígena. El ácido nucleico inmunoestimulador puede ser seleccionado a partir del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en Py, un ácido nucleico TG y un ácido nucleico CpG, en el que el ácido nucleico CpG tiene una secuencia nucleotídica que comprende la SEQ ID Nº: 246.
El invento proporciona además un método para prevenir o tratar el asma o la alergia, que comprende administrar un ácido nucleico inmunoestimulador y un medicamento para el asma/alergia en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el asma o la alergia. En realizaciones importantes, el ácido nucleico inmunoestimulador se selecciona a partir del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en T, un ácido nucleico TG y un ácido nucleico rico en C.
En una realización el ácido nucleico inmunoestimulador es un ácido nucleico rico en T. En una realización relacionada, el ácido nucleico rico en T tiene una secuencia nucleotídica seleccionada a partir del grupo de SEQ ID Nº: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908, y 910-913. En otras realizaciones los ácidos nucleicos ricos en T son secuencias seleccionadas a partir del grupo que consiste en SEQ ID Nº: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890, y 891.
Aún en una realización adicional relacionada, el ácido nucleico rico en T no es un ácido nucleico TG. En aún otra realización, el ácido nucleico rico en T no es un ácido nucleico CpG.
En una realización, el ácido nucleico inmunoestimulador es un ácido nucleico TG. En una realización adicional relacionada, el ácido nucleico TG no es un ácido nucleico rico en T. En otra realización relacionada, el ácido nucleico TG no es un ácido nucleico CpG.
En una realización, el ácido nucleico inmunoestimulador es un ácido nucleico CpG, en la que el ácido nucleico CpG tiene una secuencia nucleotídica que comprende SEQ ID Nº: 246.
En otra realización, el medicamento para el asma/alergia es un medicamento seleccionado a partir del grupo que consiste en el inhibidor PDE-4, Broncodilatador/agonista beta-2, abridor de canal de K+, antagonista VLA-4, Antagonista Neurokin, inhibidor de la síntesis de TXA2, Xantanina, antagonista del ácido araquidónico, inhibidor de la 5 lipooxigenasa, antagonista del receptor de la Tromboxina A2, antagonista del Tromboxano A2, inhibidor de la proteína de activación 5-lipox, y el inhibidor de proteasa, pero no es tan limitado. En algunas realizaciones importantes, el medicamento para el asma/alergia es un broncodilatador/agonista beta-2 seleccionado a partir del grupo que consiste en salmeterol, salbutamol, terbutaline, D2522/formoterol, fenoterol, y orciprenalina.
En otra realización, el medicamento para el asma/alergia es un medicamento seleccionado a partir del grupo que consiste en antihistamínicos e inductores de prostaglandinas. En una realización, la antihistamina se selecciona del grupo que consiste en loratidine, cetirizina, buclizina, análogos de ceterizina, fexofenadina, terfenadina, desloratadine, norastemizol, epinastina, ebastina, ebastina, astemizol, levocabastina, azelastina, tranilast, terfenadina, mizolastina, betastatina, CS 560, y HSR 609. En otra realización, el inductor de prostaglandina es S-5751.
En aún otra realización, el medicamento para el asma/alergia se selecciona a partir del grupo que consiste en esteroides e inmunomoduladores. Los inmunomoduladores pueden ser seleccionados a partir del grupo que consiste en agentes antiinflamatorios, antagonistas de leukotrienos, muteinas IL4, receptores IL-4 solubles, inmunosupresores, anticuerpos anti IL-4, antagonistas IL-4, anticuerpos anti-IL5, proteínas de fusión receptor de IL-13-Fc solubles, anticuerpos anti IL-9, antagonistas CCR3, antagonistas CCR5, inhibidores VLA-4, y eliminadores de la expresión de IgE, pero no son tan limitados. En una realización, el eliminador de la expresión de IgE es un anti-IgE.
En otra realización, el esteroide se selecciona a partir del gupo que consiste en beclometasona, fluticasona, tramcinolona, budesonide, y budesonide. En aún una realización adicional, el inmunosupresor es una vacuna con péptido Tolerizante.
En una realización, el ácido nucleico inmunoestimulador es administrado al mismo tiempo que el medicamento para el asma/alergia. En otra realización, el sujeto es un sujeto inmunocomprometido.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores que han de ser administrados a un sujeto en los métodos descritos aquí en relación a la prevención y tratamiento del asma/alergia son como se describen para otros aspectos del método del invento.
En otro aspecto, el invento proporciona un kit que comprende un primer contenedor que almacena un ácido nucleico inmunoestimulador, y al menos otro contenedor (por ejemplo, un segundo contenedor) que almacena un medicamento para el asma/alergia, e instrucciones para su uso. El ácido nucleico inmunoestimulador útil en el kit es como está aquí descrito. En realizaciones importantes, el ácido nucleico inmunoestimulador se selecciona a partir del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en T, un ácido nucleico TG y un ácido nucleico rico en C. En otra realización importante, el kit comprende un vehículo de liberación sostenida que contiene un ácido nucleico inmunoestimulador, y al menos un contenedor que almacena un medicamento para el asma/alergia, e instrucciones para dosificar en tiempo la administración del medicamento para el asma/alergia. El medicamento para el asma/alergia puede ser seleccionado a partir del grupo de medicamentos para el asma/alergia descritos en los métodos precedentes dirigidos hacia la prevención o tratamiento del asma/alergia.
En aún otro aspecto, el invento proporciona una composición, que comprende un ácido nucleico inmunoestimulador y un medicamento para el asma/alergia, formulado en un vehículo farmacéuticamente aceptable y en una cantidad eficaz para prevenir o tratar una respuesta inmune asociada con la exposición a un mediador de asma o alergia. El ácido nucleico inmunoestimulador puede ser seleccionado a partir del grupo de ácidos nucleicos inmunoestimuladores descritos por los métodos y composiciones precedentes. En realizaciones importantes, el ácido nucleico inmunoestimulador es seleccionado a partir del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en T, un ácido nucleico TG y un ácido nucleico rico en C. El medicamento para el asma/alergia puede ser seleccionado a partir del grupo que consiste en medicamentos para el asma y medicamentos para alergia como se describe en los métodos y composiciones precedentes.
En aún un aspecto adicional, el invento proporciona una composición que comprende un ácido nucleico inmunoestimulador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nº: 95-136, SEQ ID Nº: 138-152, SEQ ID Nº: 154-222, SEQ ID Nº: 224-245, SEQ ID Nº: 247-261, SEQ ID Nº: 263-299, SEQ ID Nº: 301, SEQ ID Nº: 303-4109, SEQ ID Nº: 414-420, SEQ ID Nº: 424, SEQ ID Nº: 426-947, SEQ ID Nº: 959-1022, SEQ ID Nº: 1024-1093, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente el ácido nucleico inmuno-estimulador está presente en la composición en una cantidad eficaz. En una realización, el ácido nucleico inmuno-estimulador está presente en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune. En otra realización, el ácido nucleico inmunoestimulador está presente en una cantidad eficaz para prevenir o tratar el cancer. En aún otra realización adicional, el ácido nucleico inmunoestimulador está presente en una cantidad eficaz para prevenir o tratar el asma/alergia. El invento también proporciona kits que comprenden cualquier de las composiciones de ácidos nucleicos inmunoestimuladores precedentes, e instrucciones para el uso.
En otro aspecto el invento incluye una composición de un ácido nucleico inmunoestimulador que consiste esencialmente en: 5'M_{1}TCGTCGTTM_{2}3' en la que al menos uno de los Cs está sin metilar, en la que M_{1} es un ácido nucleico que tiene al menos un nucleótido, en la que M_{2} es un ácido nucleico que tiene entre 0 y 50 nucleótidos, y en la que el ácido nucleico inmunoestimulador tiene menos de 100 nucleótidos.
En aún otros aspectos el invento está relacionado con una composición farmacéutica de un ácido nucleico inmunoestimulador que comprende: 5'TCGTCGTT3' en la que al menos uno de los Cs está sin metilar, en la que el ácido nucleico inmunoestimulador tiene menos de 100 nucleótidos y un esqueleto fosfodiéster, y un dispositivo de liberación sostenida. En algunas realizaciones el dispositivo de liberación sostenida es una micropartícula. En otras realizaciones la composición incluye un antígeno.
Cada una de las limitaciones del invento puede abarcar varias realizaciones del invento. Se anticipa por lo tanto, que cada una de las limitaciones del invento que implica uno cualquiera de los elementos o combinaciones de elementos puede ser incluido en cada aspecto del invento.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A es un histograma de la expresión de CD86 (eje Y) por las células CD19+ seguido de la exposición de estas células a los oligonucleótidos mostrados en el eje X a una concentración de 0,15 \mug/ml.
La Figura 1B es un histograma de la expresión de CD 86 (eje Y) por las células CD19+ que sigue a la exposición de estas células a los oligonucleótidos mostrados sobre el eje X a una concentración de 0,30 \mug/ml.
La Figura 2 es una gráfica que compara las capacidades del ODN 2137, ODN 2177, ODN 2200 y ODN 2202 para estimular la proliferación de células B a concentraciones que oscilan desde 0,2 \mug/ml hasta 20 \mug/ml.
La Figura 3 es una gráfica que compara las capacidades del ODN 2188, ODN 2189, ODN 2190 y ODN 2182 para estimular la proliferación de células B a concentraciones que oscilan desde 0,2 \mug/ml hasta 20 \mug/ml.
La Figura 4 es una gráfica de barras que describe la activación de las células B dependiente de dosis inducida por ODN no CpG. Los PBMC de sangre de un donante fueron incubados con las concentraciones indicadas de ODNs 2006 (SEQ ID Nº: 246), 2117 (SEQ ID Nº: 358), 2137 (SEQ ID Nº: 886), 5126 (SEQ ID Nº: 1058) y 5162 (SEQ ID Nº: 1094) y teñidos con mAb para CD19 (marcador de célula B) y CD86 (marcador de activación de célula B, B7-2). La expresión fue medida por citometría de flujo.
La Figura 5 es una gráfica de barras que describe la estimulación de las células B por un grupo diverso de ODNs no CpG. Los PBMC de un donante representativo fueron estimulados por 0,4 \mug/ml, 1,0 \mug/ml ó 10,0 \mug/ml de los siguientes ODNs: 2006 (SEQ ID Nº: 246), 2196 (SEQ ID Nº: 913), 2194 (SEQ ID Nº: 911), 5162 (SEQ ID Nº: 1094), 5163 (SEQ ID Nº: 1095), 5168 (SEQ ID Nº: 1096) y 5169 (SEQ ID Nº: 1095), 5168 (SEQ ID Nº: 1096) Y 5169 (SEQ ID Nº: 1097) y la expresión del marcador de activación CD86 (B7-2) sobre las células B positivas para CD19 fue medida por citometría de flujo.
La Figura 6 es una gráfica de barras que describe la activación de células B por ODNs no CpG 1982 y 2041. Los PBMC fueron incubados con las concentraciones indicadas de ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246), 1982 (SEQ ID Nº: 225) y 2041 (SEQ ID Nº: 282) y la activación de células B (expresión del marcador de activación CD86) fue medida por citometría de flujo.
La Figura 7 es una gráfica de barras que describe que las células NK son activadas por ODNs no CpG. Los PBMC fueron incubados con 6 \mug/ml de los siguientes ODNs: 2006 (SEQ ID Nº: 246), 2117 (SEQ ID Nº: 358), 2137 /SEQ ID Nº: 433), 2194 (SEQ ID Nº: 911) y 5126 (SEQ ID Nº: 1058) y teñidos con mAb para CD3 (marcador de células T), CD56 (marcador de células NK) y CD69 (marcador de activación temprana). La expresión de CD69 sobre las células NK positivas para CD56 fue medida por citometría de flujo.
La Figura 8 es una gráfica de barras que describe que la citotoxicidad mediada por NK está potenciada por ODN no CpG. La lisis mediada por NK de las células diana K-562 fue medida después de una incubación durante toda la noche de PBMC con 6 \mug/ml de los ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246), 2194 (SEQ ID Nº: 911) y 5126 (SEQ ID Nº: 1058).
La Figura 9 es una gráfica de barras que describe que las células NKT pueden ser activadas por ODN no CpG. Los PBMC de un donante representativo fueron incubados con 6 \mug/ml de ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246), 2117 (SEQ ID Nº: 358), 2137 (SEQ ID Nº: 886), 2183 (SEQ ID Nº: 433), 2194 (SEQ ID Nº: 911) y 5126 (SEQ ID Nº: 1058) durante 24 h y la activación de las células NKT fue medida por citometría de flujo después de teñir las células con mAb para CD3 (marcador de células T), CD56 (marcador de células NK) y CD69 (marcador de activación temprana).
La Figura 10 es una gráfica de barras que describe la estimulación de los monocitos por diferentes ODN CpG y no CpG. Los PBMC fueron incubados con 6 \mug/ml de 2006 (SEQ ID Nº: 246), 2117 (SEQ ID Nº: 358), 2137 (SEQ ID Nº: 886), 2178 (SEQ ID Nº: 428), 2183 (SEQ ID Nº: 443), 2194 (SEQ ID Nº: 911), 5126 (SEQ ID Nº: 1058) y 5163 (SEQ ID Nº: 1095) y teñidos para CD14 (marcador de monocitos) y CD80 (B7-1, marcador de activación). La expresión fue medida por citometría de flujo.
La Figura 11 es una gráfica de barras que describe la liberación de TNF\alpha tras cultivo de células humanas con ODN no CpG. Los PBMC fueron cultivados durante 24 h con o sin 6 \mug/ml de los ODNs indicados o LPS 1 \mug/ml como testigo negativo y TNF\alpha medido mediante ELISA.
La Figura 12 es una gráfica de barras que describe que la liberación de IL-6 tras el cultivo con ODNs no CpG muestra el mismo patrón que para TNF\alpha. Las PBMC fueron cultivadas con los ODNs indicados (1,0 \mug/ml) y la IL-6 fue medida en los sobrenadantes mediante ELISA.
Descripción detallada
El invento en un aspecto implica el hallazgo de que los ácidos nucleicos ricos en pirimidina (Py) y preferiblemente ricos en timidina (T) así como los ácidos nucleicos que contienen motivos dinucleotídicos TG son eficaces en mediar los efectos inmunoestimuladores. Se conocía en la técnica anterior que los ácidos nucleicos que contienen CpG son composiciones terapéuticas y profilácticas que estimulan el sistema inmune para tratar el cáncer, las enfermedades infeccionas, la alergia, el asma y otros trastornos y ayudan a proteger frente a infecciones oportunistas que siguen a las quimioterapias del cáncer. Las fuertes aunque equilibradas, respuestas inmune celular y humoral que resultan de la estimulación por CpG reflejan el sistema de defensa natural del propio cuerpo frente a los patógenos invasores y células cancerosas. Las secuencias CpG, aunque son relativamente raras en el ADN humano se encuentran comúnmente en el ADN de organismo infecciosos tales como bacterias. El sistema inmune humano aparentemente ha evolucionado para reconocer secuencias CpG como un señal de alerta temprana de infección, y para iniciar una respuesta inmune inmediata y poderosa frente a patógenos invasores sin causar reacciones adversas frecuentemente observadas con otros agentes inmunoestimuladores. Así, los ácidos nucleicos que contienen CpG, que cuentan con este mecanismo de defensa inmune innata, pueden utilizar una ruta única y natural para inmunoterapia. Los efectos de los ácidos nucleicos CpG sobre la modulación inmune fueron descubiertos por el inventor de la solicitud de patente instantánea y han sido descritos ampliamente en las solicitudes de patente copendientes, tales como las solicitudes de patente norteamericanas de Nºs de serie: 08/386,063 archivada el 02/07/95 (y el documento relacionado PCT US95/01570); 08/738,652 archivada el 10/30/96; 08/960,774 archivada el 10/30/97 (y el documento relacionado PCT/US97/19791, WO 98/18810); 09/191,170 archivada el 10/30/97 (y el documento relacionado PCT/US97/19791, WO 98/18810); 09/191,170 archivada el 11/13/98; 09/030, 701 archivada el 02/25/98 (y el documento relacionado PCT/US98/03678; 09/082, 649 archivado el 05/20/98 (y el documento relacionado PCT/US98/10408); 09/325,193 archivada el 06/03/99 (y el documento PCT/US98/04703); 09/286,098 archivada el 04/02/99 (y el documento relacionado PCT/US99/07335); 09/306, 281 archivada el 05/06/99 (y el documento relacionado PCT/US99/09863). El contenido completo de cada una de estas patentes y solicitudes de patente está aquí incorporado mediante
referencia.
Los hallazgos del invento instantáneo son aplicables a todos los usos descritos anteriormente de ácidos nucleicos que contienen CpG así como cualquier otro uso para ácidos nucleicos CpG. El invento implica, en un aspecto, el descubrimiento que los ácidos nucleicos ricos en Py y preferiblemente ricos en T y Tg tienen propiedades inmunoestimuladoras similares a los oligonucleótidos Cpg sin importar si un motivo CpG está presente. Así, el invento es útil para cualquier método para estimular el sistema inmune usando ácidos nucleicos ricos en Py o TG. Sorprendentemente se descubrió también según el invento que los oligonucleótidos quimeras que carecen de un motivos CpG son inmunoestimuladores y tienen muchas de las mismas actividades profilácticas y terapéuticas como un oligonucleótido CpG.
Un ácido nucleico rico en Py es un ácido nucleico inmunoestimulador rico en T o rico en C. En algunas realizaciones se prefieren ácidos nucleicos ricos en T. Un ácido nucleico rico en T es un ácido nucleico que incluye al menos una secuencia poli T y/o que tiene una composición nucleotídica mayor del 25% en residuos nucleotídicos T. Un ácido nucleico que tiene una secuencia poli T incluye al menos cuatro Ts seguidos, tal como 5'TTTT3'. Preferiblemente el ácido nucleico rico en T incluye más de una secuencia poli T. En las realizaciones preferidas el ácido nucleico rico en T puede tener 2, 3, 4 etc secuencias poli T, tales como el oligonucleótido nº 2006 (SEQ ID Nº: 246). Uno de los oligonucleótidos ricos en T más altamente inmunoestimuladores descubierto según el invento es un ácido nucleico compuesto completamente de residuos nucleotídicos T, por ejemplo, el oligonucleótido nº 2183 (SEQ ID Nº: 433). Otros ácidos nucleicos ricos en T según el invento tienen una composición nucleotídica de más del 25% en residuos nucleotídicos T, pero no necesariamente incluyen una secuencia poli T. En estos ácidos nucleicos ricos en T los residuos nucleotídicos T pueden ser separados entre sí por otros tipos de residuos nucleotídicos, es decir, G, C, y A. En algunas realizaciones los ácidos nucleicos ricos en T tienen una composición nucleotídica de más del 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, y 99%, en residuos nucleotídicos T y cada número % entero intermedio. Preferiblemente los ácidos nucleicos ricos en T tienen al menos una secuencia poli T y una composición nucleotídica de más del 25% de residuos nucleotídicos T.
Se descubrió según el invento que el contenido en T de un ODN tiene un efecto dramático sobre el efecto inmunoestimulador del ODN y que el ODN rico en T puede activar múltiples tipos celulares inmunes humanos en ausencia de cualquier motivo CpG. Un oligonucleótido que tiene una región 3' poli T y 2 5' GCs por ejemplo, ODN 2181 (SEQ ID Nº: 431) es altamente inmunoestimulador. Un oligonucleótido de longitud similar, ODN 2116 (SEQ ID Nº: 357) que contiene dos dinucleótidos CG en el extremo 5' y una región poli C en el extremo 3' fue también inmunoestimulador pero en menor medida que el oligonucleótido rico en T que usa condiciones experimentales estándar. Así, aunque C y T tienen estructuras casi idénticas, sus efectos sobre las propiedades inmunes de un ODN son variados. Ambos son capaces de inducir una respuesta inmune pero en diferente medida. Así, tanto los oligonucleótidos ricos en T como los ricos en C son útiles según el invento, pero los oligonucleótidos ricos en T son preferidos. Además, si el contenido en T de los ODN se reduce por la incorporación de otras bases tales como T, A, o C, entonces los efectos inmunoestimuladores se reducen (ODN Nº 2188 (SEQ ID Nº: 905), 2190 (SEQ ID Nº: 907), 2191 (SEQ ID Nº: 908), y 2193 (SEQ ID Nº: 910)).
Un ácido nucleico rico en C es una molécula de ácido nucleico que tiene al menos una o preferiblemente al menos dos regiones poli C o que está compuesto de al menos por un 50% de nucleótidos C. Una región poli C es al menos cuatro residuos C seguidos. Así una región poli C está abarcada por la fórmula 5'CCCC3'. En algunas realizaciones se prefiere que la región poli C tenga la fórmula 5'CCCCCC3'. Otros ácidos nucleicos ricos en C según el invento tienen una composición nucleotídica de más del 50% de nucleótidos C, pero no necesariamente incluye una secuencia poli C. En estos ácidos nucleicos ricos en C los residuos nucleotídicos C pueden ser separados entre sí por otros tipos de residuos nucleotídicos, es decir, G, T, y A. En algunas realizaciones los ácidos nucleicos ricos en C tienen una composición nucleotídica de más del 60%, 70%, 80%, 90% y 99% en residuos nucleotídicos C y cada número % intermedio. Preferiblemente los ácidos nucleicos ricos en C tienen al menos una secuencia poli C y una composición nucleotídica de más del 50% de residuos nucleotídicos C, y en algunas realizaciones son también ricas en T.
Como se muestra en los Ejemplos, varios ODN que se creía previamente que no eran inmunoestimuladores, incluyendo dos ODNs SEQ ID Nº: 225 y SEQ ID Nº: 282 que se había descrito previamente que no eran estimuladores y usados principalmente como ODNs testigos (Takahashi, T y otros 2000 J. Immunol. 164:4458) se encontró que eran inmunoestimuladores. Los experimentos de los autores, demostratron que estos ODNs pueden estimular células B, aunque a concentraciones superiores comparadas con ODNs CpG (Fig. 6). Un ODN poli T largo (30 mer) indujo, al menos en algunos experimentos, una fuerte activación de células B comparable a una de los ODN CpG activadores más fuertes de células B. Estos experimentos también revelaron el hallazgo sorprendente que aún los ODNs poli C pueden llevar a la estimulación de células B.
Sin embargo, la inmunoestimulación por estos ODNs, no se limitó a células B humanas. Diferentes ensayos experimentales demostraron además claramente que los monocitos, células NK e incluso células NKT pueden ser activadas por tales ODNs no CpG (Fig. 7-10). Al contrario que las secuencias poli T y poli C, no se logró la inmunoestimulación por las secuencias poli A (al menos para monocitos, células B y NK). Interesantemente se encontró que la introducción de un motivo CpG en la SEQ ID Nº: 225 potenció la actividad inmunoestimuladora mientras que la elongación con una extensión poli T no potenció la inmunoestimulación. Esto sugiere que el ODN CpG y rico en T puede operar a través de diferentes mecanismos o rutas. Es posible también que la inserción de un motivo poli T en una posición diferente de la SEQ ID Nº: 225 puede resultar en un cambio en propiedades inmunoestimuladoras.
Un "ácido nucleico TG" o un "ácido nucleico inmunoestimulador TG" como se usa aquí es un ácido nucleico que contiene al menos un dinucleótido TpG (secuencia dinucleotídica timidina-guanina, es decir "ADN TG" o un ADN que contiene una 5' timidina seguido de 3' guanosina y unida por un enlace fosfato) y activa un componente del sistema inmune.
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En una realización el invento proporciona un ácido nucleico TG representado por al menos la fórmula:
5'N_{1}X_{1}TGX_{2}N_{2}3'
en la que X_{1} y X_{2} son nucleótidos y N es cualquier nucleótido y N_{1} y N_{2} son secuencias de ácidos nucleicos compuestas de cualquier número de N siempre que la suma total de N_{1} y N_{2} esté en el intervalo de 11 a 21. Como un ejemplo, si N_{1} es %, entonces N_{2} puede ser 6 (llevando a una longitud total para el oligonucleótido de 15 nucleótidos). El TG puede estar localizada en cualquier lugar dentro de la extensión, incluyendo el extremo 5', el centro y el extremo 3'. Así, N_{1} puede ser cero hasta 21, inclusive, siempre que N_{2} se elija apropiadamente para dar una suma de N_{2} y N_{1} igual a 11 hasta 21, inclusive. De modo similar, N_{2} puede ser cero hasta 21, inclusive, siempre que la suma total de N_{1} y N_{2} sea igual a 11 hasta 21, inclusive. En algunas realizaciones X_{1} es adenina, guanina, o timidina y X_{2} sea citosina, adenina, o timidina. En una realización preferida, X_{2} es timidina. En otras realizaciones X_{1} es citosina y/o X_{2} es guanina. En otras realizaciones, como se trata aquí, el ácido nucleico puede abarcar otros motivos, siempre que sea lo suficientemente largo para hacerlo.
En otras realizaciones el ácido nucleico TG está representado por al menos la fórmula:
5'N_{1}X_{1}X_{2}TGX_{3}X_{4}N_{2}3'
en la que X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos. En algunas realizaciones, X_{1}X_{2} son nucleótidos seleccionados a partir del grupo que consiste en: GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, TpA y TpT; y X_{3}X_{4} son nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en: TpT, CpT, ApT, ApG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, y CpA; N es cualquier nucleótido y N_{1} y N_{2} son secuencias de ácidos nucleicos compuestas por cualquier número de nucleótidos siempre que la suma total de N_{1} y N_{2} esté en el intervalo de 9 a 19. En algunas realizaciones, X_{1}X_{2} son GpA o GpT y X_{3}X_{4} son TpT. En otras realizaciones X_{1} o X_{2} o ambos son purinas y X_{3} o X_{4} o ambos son pirimidinas o X_{1}X_{2} son GpA y X_{3} o X_{4} o ambos son pirimidinas. En una realización preferida, X_{3}X_{4} son nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en: TpT, TpC y TpA.
El ácido nucleico inmunoestimulador puede ser de cualquier tamaño (es decir, longitud) siempre que sea de al menos 4 nucleótidos. En realizaciones importantes, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores tiene una longitud en el intervalo de entre 6 y 100. En aún otras realizaciones, la longitud está en el intervalo de entre 8 y 35 nucleótidos. Preferiblemente, los oligonucleótidos TG oscilan en tamaño entre 15 y 25 nucleótidos.
El tamaño (es decir, el número de residuos nucleotídicos a lo largo de la longitud del ácido nucleico) del ácido nucleico inmunoestimulador puede también contribuir a la actividad inmunoestimuladora del ácido nucleico. Se ha descubierto, sorprendentemente que aún para ácidos nucleicos inmunoestimuladores que estimulan en gran medida el sistema inmune, la longitud del ácido nucleico influencia la extensión de la inmunoestimulación que puede ser alcanzada. Se ha demostrado que aumentando la longitud de un ácido nucleico rico en T hasta 24 nucleótidos causa un aumento en la estimulación inmune. Los experimentos presentados en los ejemplos demuestran que cuando la longitud del ácido nucleico rico en T se aumenta desde 18 a 27 nucleótidos la capacidad del ácido nucleico para estimular una respuesta inmune aumenta significativamente (compárense ODN nº 2194, 2183, 2195, y 2196 disminuyendo en tamaños desde 27-18 nucleótidos). Aumentando la longitud del ácido nucleico hasta 30 nucleótidos tuvo un impacto dramático sobre las propiedades biológicas del ácido nucleico pero aumentando la longitud más allá de 30 nucleótidos no pareció influir adicionalmente en el efecto inmunoestimulador (por ejemplo, compárese ODN 2179 con
2006).
Se ha demostrado que los ácidos nucleicos TG que oscilan en tamaño desde 15 a 25 nucleótidos en longitud puede exhibir un aumento en la estimulación inmune. Así, en un aspecto, el invento proporciona un oligonucleótido que es 15-27 nucleótidos de longitud (es decir, un oligonucleótido que es 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, ó 27 nucleótidos de longitud) que puede ser un ácido nucleico rico en T o puede ser un ácido nucleico TG, o puede ser ambos, un ácido nucleico rico en T y un ácido nucleico TG. En una realización, los oligonucleótidos no tienen un motivo CG. El invento proporciona de modo similar oligonucleótidos que son 15-27 nucleótidos de longitud, oligonucleótidos que son 18-25 nucleótidos de longitud, oligonucleótidos que son 20-23 nucleótidos de longitud, y oligonucleótidos que son 23-25 nucleótidos en longitud. Cualquiera de las realizaciones precedentes que se refieren a los oligonucleótidos 15-27 de longitud también se refieren a los oligonucleótidos de estas diferentes longitudes. El invento abarca además el uso de cualquiera de los oligonucleótidos precedentes en los métodos enumerados
aquí.
Aunque se logra un nivel máximo de estimulación inmune con algunos ácidos nucleicos ricos en T cuando el ácido nucleico es 24-30 residuos nucleotídicos de longitud, así como con algunos ácidos nucleicos TG que oscilan desde 15 a 25 nucleótidos de longitud, ácidos nucleicos inmuno-estimuladores más cortos o más largos pueden ser usados según los métodos del invento. Para facilitar la ingesta en los ácidos nucleicos inmunoestimuladores preferiblemente tienen una longitud mínima de 6 residuos nucleotídicos. Los ácidos nucleicos de cualquier tamaño mayor de 6 nucleótidos (aún de muchas kb de longitud) son capaces de inducir una respuesta inmune según el invento si hay suficientes motivos inmunoestimuladores presentes, puesto que ácidos nucleicos más largos son degradados en el interior de la célula. Preferiblemente los ácidos nucleicos inmuno-estimuladores están en el intervalo de entre 8 y 100 y en algunas realizaciones que contienen ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en T están entre 24 y 40 nucleótidos de longitud y ácidos nucleicos inmunoestimuladores que contienen TG están entre 15 y 25 nucleótidos de
longitud.
En una realización, el ácido nucleico rico en T está representado por al menos la fórmula:
5'X_{1}X_{2}TTTTX_{3}X_{4}3'
en la que X_{1}, X_{2}, X_{3}, y X_{4} son nucleótidos. En una realización X_{1}X_{2} es TT y/o X_{3}X_{4} es TT. En otra realización X_{1}X_{2} son uno cualquiera de los siguientes nucleótidos TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA, y GC; y X_{3}X_{4} son uno cualquiera de los siguientes nucleótidos TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA, y GC.
En algunas realizaciones se prefiere que los ácidos nucleicos inmunoestimuladores no contengan poli-C (CCCC), o poli-A (AAAA). En otras realizaciones se prefiere que el ácido nucleico inmunoestimulador incluya poli-C, poli-A, poli-G (GGGG) o GGs múltiples. En particular motivos poli-G o GG múltiples tienen efectos dramáticos sobre algunos ácidos nucleicos inmunoestimuladores. El efecto de estas secuencias no T depende en parte del estado del esqueleto del ácido nucleico. Por ejemplo, si el ácido nucleico tiene un esqueleto fosfodiéster o un esqueleto quimérico la inclusión de estas secuencias en el ácido nucleico tendrá sólo un efecto mínimo si es que tiene alguno sobre la actividad biológica del ácido nucleico. Si el esqueleto es completamente fosforotioato (u otra modificación fosfato) o significativamente fosforotioato entonces la inclusión de estas secuencias puede tener más influencia sobre la actividad biológica o la cinética de la actividad biológica, causando una disminución en potencia de los ácidos nucleicos inmunoestimuladores ricos en T y TG.
Aunque se ha demostrado que los ácidos nucleicos ricos en C tienen propiedades inmunoestimuladoras, la inserción de secuencias poli-C en un ácido nucleico rico en T en una manera que reduciría la proporción relativa de nucleótidos T en el ácido nucleico puede tener un impacto negativo sobre el ácido nucleico. Aunque los de la solicitud no están unidos por un mecanismo propuesto, se cree que el sistema inmune ha desarrollado un mecanismo para distinguir ácidos nucleicos que tienen diferentes propiedades nucleotídicas, posiblemente resultantes de diferentes grupos de proteínas de unión, que reconocen diferentes secuencias o proteínas de unión específicas, que reconocen todas las secuencias inmunoestimuladoras pero con diferentes afinidades. En general, los ácidos nucleicos incluyendo los motivos CpG sin metilar son los más inmunoestimuladores, seguidos de los ácidos nucleicos ricos en T, ácidos nucleicos TG y ácidos nucleicos ricos en C. Esta generalización, sin embargo, tiene muchas excepciones, por ejemplo un ácido nucleico fuerte rico en T como la SEQ ID Nº: 886 es más inmunoestimulador en algunos ensayos que algunos ácidos nucleicos que contienen CpG (por ejemplo, un ácido nucleico CpG fosforotioato que contiene un único motivo
CpG).
También se ha descubierto que la adición de una cola poli A a un ácido nucleico inmunoestimulador puede potenciar la actividad del ácido nucleico. Se descubrió que cuando un ácido nucleico CpG altamente inmunoestimulador (SEQ ID Nº: 246) era modificado con la adición de una cola poli A (AAAAAA) o una cola poli T (TTTTTT), los oligonucleótidos resultantes aumentaban en actividad inmunoestimuladora. La capacidad de la cola poli A y la cola poli T para aumentar las propiedades inmuno-estimuladoras del oligonucleótido fue muy similar. La SEQ ID Nº: 246 es un oligonucleótido rico en T. Es probable que las colas poli-A y poli-T sean añadidas a un ácido nucleico que no sea rico en T, tendría un mayor impacto sobre la capacidad inmunoestimuladora del ácido nucleico. Puesto que la cola poli-T fue añadida a un ácido nucleico que ya era altamente rico en T las propiedades inmunoestimuladoras de la adición de poli T se diluyó un poco, aunque no completamente. Este hallazgo tiene importantes implicaciones para el uso de regiones poli A.
Así, en algunas realizaciones los ácidos nucleicos inmunoestimuladores incluyen una región poli A y en otras realizaciones no se incluyen.
Algunos de los ácidos nucleicos del invento incluyen uno o más motivos CG. La presencia de motivos CG en los ácidos nucleicos inmunoestimuladores también tiene una influencia sobre la actividad biológica de los ácidos nucleicos. Si la longitud total del ácido nucleico inmunoestimulador es 20 residuos nucleotídicos o menos, los motivos CpG son importantes para determinar el efecto inmune del ácido nucleico, y la metilación de estos motivos reduce la potencia de los efectos inmunoestimuladores del ácido nucleico. Si la longitud del ácido nucleico inmunoestimulador es aumentada a 24, entonces los efectos inmunoestimuladores del ácido nucleico se vuelven menos dependientes de los motivos CpG, y ya no se eliminan por metilación de los motivos CpG o por su inversión a dinucleótidos GC, siempre que las otras propiedades inmunoestimuladoras descritas aquí estén presentes.
Por ejemplo, el ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246) es un ácido nucleico rico en T altamente inmunoestimulador de 24 residuos nucleotídicos en longitud con cuatro dinucleótidos CpG. Sin embargo, el ODN 2117 (SEQ ID Nº: 358), en el que los motivos CpG están metilados es también altamente inmunomodulador. El ODN 2137 (SEQ ID Nº: 886), en el que los motivos CpG de ODN 2006 están invertido a GpC, y que como resultado poseen seis dinucleótidos TG es también inmunomodulador. Los efectos inmunoestimuladores de los ácidos nucleicos tales como ODN 2117 y 2137 están regulados por su contenido en T y TG. Cada uno de estos tres ácidos nucleicos es rico en T y el ODN 2137 es adicionalmente rico en TG. Si su contenido en T se reduce insertando otras bases tales como A (ODN 2117 (SEQ ID Nº: 358)) o si su contenido en TG se reduce sustituyendo TG con AG, entonces los efectos inmunoestimuladores se reducen un poco. En otro ejemplo, un ácido nucleico de 24 nucleótidos de longitud en el que todas las posiciones son al azar tiene sólo un modesto efecto inmunoestimulador (ODN 2182 (SEQ ID Nº: 432)). De igual modo, un ácido nucleico de 24 nucleótidos de longitud con otras composiciones nucleotídicos tiene variables efectos inmunoestimuladores, dependiendo de su contenido en T (ODN 2188 (SEQ ID Nº: 905), 2189 (SEQ ID Nº: 906), 2190 (SEQ ID Nº: 907), 2191 (SEQ ID Nº: 908), 2193 (SEQ ID Nº: 910), 2183 (SEQ ID Nº: 433), y 2178 (SEQ ID Nº: 428)). El ODN 2190 que contiene motivos TGT es más inmunomodulador que ODN 2202 que posee motivos TGG. Así, en algunas realizaciones, los motivos TGT son preferidos. En aún otras realizaciones, el número de motivos TG es importante en que un aumento en el número de motivos TG lleva a un aumento en la estimulación inmune. Algunos ácidos nucleicos TG preferidos contienen al menos tres motivos TG.
Ejemplos de ácidos nucleicos CpG incluyen pero no se limitan a los listados en la Tabla A, tales como SEQ ID Nº: 1, 3, 4, 14-16, 18-24, 28, 29, 33-46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-78, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227-240, 242-256, 258, 260-265, 270-2273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-312, 314-317, 320-327, 329, 335, 337-341, 343-352, 354, 357, 361-365, 367-369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 399, 401-404, 406-426, 429-433, 434-437, 439, 441-443, 445, 447, 448, 450, 453-456, 460-464, 466-469, 472-475, 477, 478, 480, 483-485, 488, 489, 492, 493, 495-502, 504-505, 507-509, 511, 513-529, 532-541, 543-555, 564-566, 568-576, 578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615, 617, 619-622, 625-646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711-716, 718-732, 736, 737, 739-744, 746, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 790-792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904, y 909-913.
En algunas realizaciones del invento los ácidos nucleicos inmunoestimuladores incluyen dinucleótidos CpG y en otras realizaciones los ácidos nucleicos estás libres de dinucleótidos CpG. Los dinucleótidos CpG pueden estar metilados o sin metilar. Un ácido nucleico que contiene al menos un dinucleótido CpG sin metila es una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia dinucleotídica citosina-guanina sin metilar (es decir "ADN CpG" o ADN que contiene una citosina 5' sin metilar seguida de 3' guanosina y unida por un enlace fosfato) y activa el sistema inmune. Un ácido nucleico que contiene al menos un dinucleótido CpG metilado es un ácido nucleico que contiene una secuencia dinucleotídica citosina-guanina metilada (es decir, una citosina 5' metilada seguida por una 3' guanosina y unida a un grupo fosfato).
Ejemplos de ácidos nucleicos ricos en T que están libres de ácidos nucleicos CpG incluyen pero no se limitan a los listados en la Tabla A, tales como SEQ ID Nº: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 2441, 267-269, 282, 301, 304, 330, 3442, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908, y 910-913. Ejemplos de ácidos nucleicos ricos en T que incluyen ácidos nucleicos CpG incluyen pero no se limitan a los listados en la Tabla A, tales como SEQ ID Nº: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890, Y 891.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser de doble hebra o de hebra única. Generalmente, las moléculas de doble hebra son más estables in vivo, mientras que las moléculas de hebra única tienen una actividad inmune aumentada. Así, en algunos aspectos del invento se prefiere que el ácido nucleico sea de hebra única y en otros aspectos se prefiere que el ácido nucleico sea de doble hebra.
El término ácido nucleico rico en T y ácido nucleico TG, como se usa aquí, se refiere a un ácido nucleico rico en T inmunoestimulador y a un ácido nucleico TG inmunoestimulador, respectivamente, a menos que se indique de otra manera. Las secuencias de ácidos nucleicos ricas en T del invento son aquellas ampliamente descritas anterior-mente así como los ácidos nucleicos mostrados en la Tabla A que tienen al menos un motivo poli T y/o una composición mayor de 25% o preferiblemente 35% en residuos nucleotídicos T. Los ácidos nucleicos ricos en C son aquellos que tienen al menos una y preferiblemente al menos dos regiones poli C. Los ácidos nucleicos TG del invento son aquellos ampliamente descritos anteriormente así como los ácidos nucleicos específicos mostrados en la Tabla A que tienen al menos un motivo TG.
Los ácidos nucleicos del invento pueden, pero no necesariamente, incluir también un motivo poli G. Los ácidos nucleicos que contienen poli G son también inmunoestimuladores. Una variedad de referencias, incluyendo Pisetsky y Reich, 1993 Mol. Biol. Reports, 18:217-221; Krieger y Herx, 1994, Ann. Rev. Biochem., 63:601-637; Macaya y otros, 1993, PNAS, 90:3745-3749; Wyatt y otros, 1994, PNAS, 91; 1356-1360; Rando y Hogan, 1998, en Applied Antisense Oligonucleiotide Technology, ed. Krieg y Stein, p. 335-352; y Kimura y otros, 1994, J. Biochem. 116, 991-994 también describen las propiedades inmuno-estimuladoras de los ácidos nucleicos poli G.
Los ácidos nucleicos poli G preferiblemente son ácidos nucleicos que tiene las siguientes fórmulas:
5'X_{1}X_{2}GGGX_{3}X_{4}3'
en la que X_{1}, X_{2}, X_{3}, y X_{4} son nucleótidos. En realizaciones preferidas al menos uno de X_{3} y X_{4} es una G. En otras realizaciones ambas X_{3} y X_{4} son una G. En aún otras realizaciones la fórmula preferida es 5'GGGNGGG3', o 5'GGGNGGGNGGG3' en la que N representa entre 0 y 20 nucleótidos. En otras realizaciones el ácido nucleico poli G está libre de dinucleótidos CG sin metilar, tales como, por ejemplo, los ácidos nucleicos listados a continuación como SEQ ID Nº: 5, 6, 73, 215, 267-282, 288, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 914-925, 928-931, 933-936, y 938. En otras realizaciones el ácido nucleico poli G incluye al menos un dinucleótido CG sin metilar, tal como, por ejemplo, los ácidos nucleicos listados a continuación como SEQ ID Nº: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329, 434, 435, 475, 519, 521-524, 526, 527, 535, 554, 565, 609, 628, 660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926, 927, 932, Y 937.
Los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan de modo intercambiable para significar múltiples nucleótidos (es decir, moléculas que comprenden un azúcar (por ejemplo ribosa o desoxiribosa) unidas a un grupo fosfato y a una base orgánica intercambiable, que es tanto una pirimidina sustituida (por ejemplo citosina (C), timidina (T) o uracilo (U)) o una purina sustituida (por ejemplo adenina (A) o guanina (G)). Como se usa aquí, los términos se refieren a oligoribonucleótidos así como a oligodesoxiribonucleótidos. Los términos incluirán también polinucleótidos (es decir un polinucleótido menos el fosfato) y cualquier otra base orgánica que contenga un polímero. Las moléculas de ácidos nucleicos pueden ser obtenidas a partir de fuentes de ácidos nucleicos existentes (por ejemplo, genómico o cADN), pero son preferiblemente sintéticas (por ejemplo, producidas por la síntesis de ácidos nucleicos).
Los términos ácido nucleico y oligonucleótido también abarcan ácidos nucleicos u oligonucleótidos con sustituciones o modificaciones, tales como en las bases y/o los azúcares. Por ejemplo, incluyen ácidos nucleicos que tienen esqueletos de azúcares que están unidos covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos al grupo hidroxilo en posición 3' y distinto de un grupo fosfato en posición 5'. Así, los ácidos nucleicos modificados pueden incluir un grupo ribosa 2-O-alquilado. Además, los ácidos nucleicos pueden incluir azúcares tales como arabinosa en lugar de ribosa. Así, los ácidos nucleicos pueden ser heterogéneos en la composición del esqueleto que contiene de ese modo cualquier posible combinación de unidades poliméricas unidas juntas tales como péptido-ácidos nucleicos (que tienen un esqueleto aminoacídico con bases de ácidos nucleicos). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos son homogéneos en la composición del esqueleto. Los ácidos nucleicos también incluyen purinas sustituidas y pirimidinas tales como bases modificadas propina C-5 (Wagner y otros, Nature Biotechnology 14:840-844, 1996). Las purinas y pirimidinas incluyen pero no se limitan a adenina, citosina, guanina, timidina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, y otras nucleobases presentes de manera natural y no natural, restos aromáticos sustituidos y sin sustituir. Otras modificaciones tales son bien conocidas para los profesionales con experiencia en la técnica.
Para usar en el invento instantáneo, los ácidos nucleicos del invento pueden ser sintetizados de novo usando cualquier número de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el método b-cianoetil fosforamidina (Beaucage, S.L., y Caruthers, M.H., Tet. Let. 22:1859, 1981); método nucleósido H-fosfonato (Garegg, y otros, Tet. Let. 27:4051-4054, 1986; Froehler y otros, Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407, 1986; Garegg y otros, Tet. Let. 27:4055-4058, 1986, Gaffney y otros, Tet. Let. 29:2619-2622, 1988).
Estas reacciones químicas pueden ser realizadas por una variedad de sintetizadores de ácidos nucleicos automatizados disponibles en el mercado. Estos ácidos nucleicos son referidos como ácidos nucleicos sintéticos. Alternativamente, los dinucleótidos ricos en T y/o TG pueden ser producidos a gran escala en plásmidos, (véase Sambrook, T, y otros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) y separados en piezas más pequeñas o administrados como un todo. Los ácidos nucleicos pueden ser preparados a partir de secuencias de ácidos nucleicos existentes (por ejemplo, genómico o cADN) usando técnicas conocidas, tales como las que emplean enzimas de restricción, exonucleasas o endonucleasas. Los ácidos nucleicos preparados de esta manera son referidos como ácidos nucleicos aislados. Un ácido nucleico aislado se refiere generalmente a un ácido nucleico que está separado de sus componentes, al cual está normalmente asociado por naturaleza. Como ejemplo, un ácido nucleico aislado puede ser uno que sea separado de una célula, a partir del núcleo, de mitocondria o de cromatina. Los términos ácidos nucleicos ricos en Py y ácidos nucleicos TG abarcan ambos ácidos nucleicos ricos en Py y ácidos nucleicos TG sintéticos y aislados.
Para usar in vivo, los ácidos nucleicos ricos en Py y TG pueden opcionalmente ser relativamente resistentes a degradación (por ejemplo, estar estabilizados). Una "molécula de ácido nucleico estabilizada" significará una molécula de ácido nucleico que es relativamente resistente a degradación in vivo (por ejemplo vía una exo- o endo-nucleasa). La estabilización puede ser una función de longitud o estructura secundaria. Los ácidos nucleicos son de decenas a cientos de kbs de longitud que son relativamente resistentes a degradación in vivo. Para ácidos nucleicos más cortos, la estructura secundaria puede estabilizar y aumentar su efecto. Por ejemplo, si el extremo 3' de un ácido nucleico tiene autocomplementariedad con una región aguas arriba, de modo que se pueda plegar y formar una especie de estructura en bucle de tallo, entonces el ácido nucleico se vuelve estable y por lo tanto exhibe más actividad.
Alternativamente, la estabilización de ácidos nucleicos puede ser realizada vía modificaciones del esqueleto fosfato. Los ácidos nucleicos estabilizados preferidos del invento instantáneo tienen un esqueleto modificado. Se ha demostrado que la modificación del esqueleto de ácidos nucleicos proporciona una actividad potenciada de los ácidos nucleicos ricos en Py y TG cuando se administran in vivo. Estas estructuras estabilizadas son preferidas porque las moléculas ricas en Py y TG del invento tienen al menos un esqueleto parcialmente modificado. Las construcciones ricas en Py y TG que tienen uniones fosforotioato proporcionan máxima actividad y protegen el ácido nucleico de la degradación por exo- y endo-nucleasas intracelulares. Otros ácidos nucleicos modificados incluyen ácidos nucleicos modificicados fosfodiéster, combinaciones de ácidos nucleicos fosfodiéster y fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, p-etoxi, y combinaciones de los mismos. Cada una de estas combinaciones y sus efectos particulares sobre las células inmunes se trata en mayor detalle con respecto a los ácidos nucleicos CpG en las Solicitudes de Patentes Publicadas PCT, PCT/US95/01570 (WO 96/02555) y PCT/US97/19791 (WO 98/18810) que reivindican prioridad a los documentos norteamericanos de Nºs de serie: 087386, 063 y 08/960, 774, archivados el 7 de Frebrero, 1995 y 30 de Octubre, 1997 respectivamente, el contenido completo del cual está por la presente incorporado mediante referencia. Se cree que estos ácidos nucleicos modificados pueden mostrar más actividad estimuladora debido a una resistencia a nucleasas potenciada, un ingesta celular aumentada, una unión a proteínas aumentada, y/o una localización intracelular alterada.
Las composiciones del invento pueden opcionalmente ser oligonucleótidos quiméricos. Los oligonucleótidos quiméricos son oligonucleótidos que tienen una fórmula:
5'Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2}3'.
Y_{1} e Y_{2} son moléculas de ácidos nucleicos que tienen entre 1 y 10 nucleótidos. Y_{1} e Y_{2} incluyen cada uno al menos una unión internucleotídica modificada. Puesto que al menos 2 nucleótidos de los oligonucleótidos quiméricos incluyen modificaciones del esqueleto estos ácidos nucleicos son un ejemplo de un tipo de "ácidos nucleicos inmunoestimuladores estabilizados".
Con respecto a los oligonucleótidos quiméricos, Y_{1} e Y_{2} se consideran independientes el uno del otro. Esto significa que cada uno de Y_{1} e Y_{2} puede o no tener secuencias diferentes y uniones al esqueleto diferentes entre sí en la misma molécula. Las secuencias varían, pero en algunos casos Y_{1} e Y_{2} tienen una secuencia poli-G. Una secuencia poli-G se refiere a al menos 3 Gs seguidas. En otras realizaciones la secuencia poli-G se refiere a al menos 4, 5, 6, 7 u 8 Gs seguidas. En otras realizaciones Y_{1} e Y_{2} pueden ser TCGTCG, TCGTCGT, o TCGTCGTT (SEQ ID Nº: 1145). Y_{1} e Y_{2} pueden también tener una secuencia poli-C, poli-T, o poli-A. En algunas realizaciones Y_{1} y/o Y_{2} tienen entre 3 y 8 nucleótidos.
N_{1} y N_{2} son moléculas de ácidos nucleicos que tienen entre 0 y 5 nucleótidos siempre que N_{1}ZN_{2} tenga al menos 6 nucleótidos en total. Los nucleótidos de N_{1}ZN_{2} tienen un esqueleto fosfodiéster y no incluyen ácidos nucleicos que tengan un esqueleto modificado.
Z es un motivo ácido nucleico inmunoestimulador pero no incluye un CG. Por ejempo, Z puede ser una secuencia de ácido nucleico rica en T, por ejemplo que incluya un motivo TTTT o una secuencia en la que al menos un 50% de las bases de la secuencia son Ts o Z puede ser una secuencia TG.
Los nucleótidos centrales (N_{1}ZN_{2}) de la fórmula Y_{1}N_{1}ZN_{2}Y_{2} tienen uniones internucleotídicas fosfodiéster e Y_{1} e Y_{2} tienen al menos una, pero pueden tener más de una o incluso pueden tener todas las uniones internucleotídicas modificadas. En realizaciones preferidas Y_{1} y/o Y_{2} tienen al menos dos o entre dos y cinco uniones internucleotídicas modificadas o Y_{1} tiene dos uniones internucleotídicas modificadas e Y_{2} tiene cinco uniones internucleotídicas modificadas o Y_{1} tiene cinco uniones internucleotídicas modificadas e Y_{2} tiene dos uniones internucleotídicas modificadas. Las uniones internucleotídicas modificadas, en algunas realizaciones es una unión fosforotioato modificada, una unión fosforoditioato modificada o una unión p-etoxi modificada.
Los esqueletos modificados tales como fosforotioatos pueden ser sintetizados usando técnicas automatizadas empleando tanto reacciones químicas fosforamidato o H-fosfonato. Los aril- y alquil-fosfonatos pueden ser hechos, por ejemplo, como se describe en la patente norteamericana Nº: 4.469.863; y los fosfotriésteres de alquilo (en los que el resto oxigenado cargado está alquilado como se describe en la Patente Norteamericana Nº 5.023.243 y en la Patente Europea Nº: 092.574) pueden ser preparados mediante síntesis en fase sólida automatizada usando reactivos disponibles comercialmente. Los métodos para hacer otras modificaciones y sustituciones en el esqueleto del ADN han sido descritos (Uhlmann, E. Y Peyman, A., Chem. Rev. 90:544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165,
1990).
Otros ácidos nucleicos estabilizados incluyen: análogos de ADN no iónicos, tales como alquil- y aril-fosfatos (en los que el oxígeno fosfonato cargado es reemplazado por un grupo alquilo o un grupo arilo), fosfodiéster y fosfotriésteres de alquilo, en los que el resto oxígeno cargado está alquilado. Los ácidos nucleicos que contienen diol, tales como tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en uno o en ambos extremos se ha demostrado también que son sustancialmente resistentes a degradación por nucleasas.
En el caso en el que el ácido nucleico rico en Py o TG es administrado en conjunción con un antígeno que está codificado en un vector de ácido nucleico, se prefiere que el esqueleto del ácido nucleico rico en Py o TG sea una combinación quimérica de fosfodiéster y fosforotioato (u otra modificación fosfato). La célula puede tener un problema incorporando una vector plasmídico en presencia de un ácido nucleico completamente fosforotioato. Así cuando tanto el vector como un ácido nucleico son suministrados a un sujeto, se prefiere que el ácido nucleico tenga un esqueleto quimérico o tenga un esqueleto fosforotioato pero que el plásmido esté asociado con un vehículo que lo libere directamente en la célula, evitando así la necesidad de una ingesta celular. Tales vehículos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, liposomas y pistolas génicas.
Los ácidos nucleicos descritos aquí así como diversos ácidos nucleicos testigos están presentes a continuación en la Tabla A.
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TABLA A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
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20
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23
Mientras que los efectos de CpG en ratones están bien caracterizados, la información que concierne al sistema humano es limitada. Los oligonucleótidos CpG fosforotioato con una fuerte actividad inmunoestimuladora en el sistema de ratón muestran una actividad más baja en células inmunes humanas y de otros no roedores. En los ejemplos se describe el desarrollo de un motivo CpG humano potente y la caracterización de sus efectos y mecanismos de acción en células B primarias humanas. El ADN que contiene este motivo CpG estimuló fuertemente células B humanas primarias para proliferar, para producir IL-6 y para expresar niveles aumentados de CD86, CD40, CD54 y MHC II. Aumentó la actividad de unión al ADN de los factores de transcripción NF\kappaB Y AP-1, así como la fosforilación de las proteínas kinasas activadas por estrés JNK y p38, y el factor de transcripción ATF-2. Las rutas de señalización de células B activadas por ADN CpG fueron diferentes de las activadas por el receptor de células B con ERK activado y una isoforma diferente de JNK, pero no activó p38 y ATF-2. En general, los datos de la transducción de señales iniciada por el ADN CpG son consistentes con las obtenidas en ratones (Hacker H., y otros, 1998. Embo J 17:6230, Yi A. K., y Krieg A. M. 1998. J. Immunol 161:4493).
El motivo preferido en organismos no roedores es 5'TCGTCGTT3'. El intercambio de bases dentro del motivo CpG de 8 mer más potente (5'TCGTCGTT3') disminuyó la actividad del oligonucleótido. Las timidinas en la posición 5' y 3' de este motivo fueron más importantes que la timidina en la posición media. Una adenina o guanosina en la posición media produjo una disminución en la actividad.
Nótese, que estos estudios demuestran que un motivo CpG humano dentro de un oligonucleótidos fosfodiéster (2080) es suficiente para producir el máximo efecto, y que los motivos CpG adicionales (2059) no potenciaron adicionalmente la actividad. El oligonucleótido con el motivo de 8 mer 5'TCGTCGTT 3' (2080) que contenía dos dinucleótidos CpG mostró la mayor actividad en estos estudios. El reemplazo de las bases que flanquean los dos dinucleótidos CpG (posición 5', posición media, posición 3') redujeron la actividad de esta secuencia. Ambos dinucleótidos CpG dentro del motivo CpG de 8 mer fueron requeridos para una actividad óptima (2108, 2106). La metilación en citidina de los dinucleótidos CpG (2095) abolió la actividad de 2080, mientras que la metilación de una citidina no relacionada (2094) no. La adición de dos motivos CpG en la secuencia de 2080 resultando en 2059 no aumento adicionalmente la actividad del oligonucleótido fosfodiéster. La secuencia de 2080 con un esqueleto fosforotioato (2116) demostró menos actividad, sugiriendo que los motivos adicionales CpG son preferidos para un oligonucleótido fosforotioato potente.
Se ha descubierto según el invento que los ácidos nucleicos inmunoestimuladores tienen efectos inmuno-estimuladores dramáticos sobre las células humanas tales como células NK, células B, y células DCs in vitro. Se ha demostrado que los ensayos in vitro usados aquí predicen la eficacia in vivo como vacuna adyuvante en vertebrados no roedores (Ejemplo 12), sugiriendo que los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son eficaces agentes terapéuticos para vacunación humana, inmunoterapia del cáncer, inmunoterapia del asma, potenciamiento general de la función inmune, potenciamiento de la recuperación hematopoyética tras radiación o quimioterapia, y otras aplicaciones inmunomoduladoras.
Así, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son útiles en algunos aspectos del invento como vacunas profilácticas para el tratamiento de un sujeto con riesgo de desarrollar una infección con un organismo infeccioso o un cáncer en el cual un antígeno específico del cáncer ha sido identificado u una alergia o asma en la que se conoce el alergeno o la predisposición al asma. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden también ser dados sin el antígeno o alergeno para una protección a más corto plazo frente a la infección, alergia o cáncer, y en este caso repetidas dosis permitirán una protección a más largo plazo. Un sujeto con riesgo como se usó aquí es un sujeto que tiene cualquier riesgo de exposición a una infección que causa un patógeno o un cáncer o un alergeno o un riesgo de desarrollar cáncer. Por ejemplo, un sujeto que tiene riesgo puede ser un sujeto que está planeando viajar a un área en la que se encuentra un tipo particular de agente infeccioso o puede ser un sujeto quien a través de su estilo de vida o procedimientos médicos está expuesto a fluídos corporales que pueden contener organismos infecciosos o directamente a los organismos o incluso a cualquier sujeto que viva en un área en la que un organismo infeccioso o un alergeno ha sido identificado. Los sujetos con riesgo de desarrollar una infección también incluyen poblaciones generales a las que las agencias médicas recomiendan la vacunación con un antígeno para un organismo infeccioso particular. Si el antígeno es un alergeno y el sujeto desarrolla respuestas alérgicas al antígeno particular y el sujeto puede ser expuesto al antígeno, es decir, durante la estación del polen, entonces el sujeto está en riesgo de exposición al antígeno. Un sujeto con riesgo de desarrollar una alergia hasta asma incluye aquellos sujetos que han sido identificados que tienen una alergia o asma pero que no tiene la enfermedad activa durante el tratamiento con ácido nucleico inmunoestimulador así como sujetos que se consideran que tienen riesgo de desarrollar estas enfermedades debido a factores genéticos o ambientales.
Un sujeto con riesgo de desarrollar un cáncer es una persona que es la que tiene una alta probabilidad de desarrollar cáncer. Estos sujetos incluye, por ejemplo, sujetos que tienen una anormalidad genética, la presencia de la cual se ha demostrado que tiene una relación correlativa con un mayor posibilidad de desarrollar un cáncer y sujetos expuestos a agentes causantes de cáncer tales como tabaco, asbestos, u otras toxinas químicas, o un sujeto que ha sido tratado previamente para el cáncer y está en aparente remisión. Cuando un sujeto con riesgo de desarrollar un cáncer es tratado con un antígeno específico para el tipo de cáncer al cual el sujeto está en riesgo de desarrollar y un ácido nucleico inmunoestimulador, el sujeto puede ser capaz de matar las células cancerígenas según se desarrollan. Si un tumor comienza a formarse en el sujeto, el sujeto desarrollará una respuesta inmune específica frente al antígeno
tumoral.
Además del uso de los ácidos nucleicos inmuno-estimuladores para tratamiento profiláctico, el invento también abarca el uso de ácidos nucleicos inmuno-estimuladores para el tratamiento de un sujeto que tiene una infección, una alergia, asma, o un cácer.
Un sujeto que tiene una infección es un sujeto que ha sido expuesto a un patógeno infeccioso y tiene niveles agudos o crónicos detectables del patógeno en el cuerpo. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser usados con un antígeno para montar una respuesta inmune sistémica o mucosal específica de antígeno que es capaz de reducir el nivel de o erradicar el patógeno infeccioso. Una enfermedad infecciosa, como se usa aquí, es una enfermedad que surge de la presencia de un microorganismo externo en el cuerpo. Es particularmente importante desarrollar estrategias de vacunación y tratamientos para proteger las superficies mucosas del cuerpo, que son los sitios primarios de entrada patogénica.
Un sujeto que tiene una alergia es un sujeto que padece o tiene riesgo de desarrollar una reacción alérgica en respuesta a un alergeno. Una alergia se refiere a una hipersensibilidad adquirida a una sustancia (alergeno). Los estados alérgicos incluyen pero no se limitan a eczemas, rinitis alérgica o coriza, fiebre del heno, conjuntivitis, asma bronquial, urticaria y alergias alimentarias, y otros estados no tópicos.
Actualmente, las enfermedades alérgicas son tratadas generalmente mediante la inyección de pequeñas dosis de antígeno seguido por una dosificación creciente subsiguiente del antígeno. Se cree que este procedimiento induce tolerancia al alergeno para impedir reacciones alérgicas adicionales. Estos métodos, sin embargo, pueden llevar varios años para ser eficaces y están asociados con el riesgo de efectos secundarios tales como un shock anafiláctico. Los métodos del invento evitan estos problemas.
Las alergias están causadas generalmente por la generación de anticuerpos IgE contra alergenos inofensivos. Las citoquinas que son inducidas por la administración sistémica o mucosal de ácidos nucleicos inmunoestimuladores son predominantemente de una clase llamada Th1 (ejemplos son IL-12 y IFN-\gamma) y estos inducen tanto la respuesta inmune humoral como celular. Los tipos de anticuerpos asociados con una resupesta Th1 son generalmente más protectores debido a que tienen unas capacidades de neutralización y opsonización elevadas. El otro tipo principal de respuesta inmune, que se asocia con la producción de citoquinas IL-4, IL-5 e IL-10, se llama una respuesta inmune Th2. Las respuestas Th2 implican predominantemente anticuerpos y estas tienen menos efecto protector contra la infección y algunos isotipos Th2 (por ejemplo, IgE) son asociados con alergia. En general, parece que las enfermedades alérgicas son mediadas por las respuestas inmunes de tipo Th2 minetras que las respuestas Th1 proporcionan la mejor protección contra la infección, aunque respuestas Th1 en exceso se asocian con enfermedades autoinmunes. En base a la capacidad de los ácidos nucleicos inmunoestimmuladores para desplazar la respuesta inmune en un sujeto desde una respuesta Th2 (que se asocia con la producción de anticuerpos IgE y alergia) a una respuesta Th1 (que es protectora contra las reacciones alérgicas), una dosis eficaz para inducir una respuesta inmune de un ácido nucleico inmunoestimulador puede ser administrada a un sujeto para tratar o prevenir una alergia.
Así, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores tienen una utilidad terapéutica significativa en el tratamiento de estados alérgicos y no alérgicos tales como asma. Las citoquinas Th2, especialmente IL-4 e IL-5 están elevadas en las vías respiratorias de los sujetos asmáticos. Estas citoquinas favorecen aspectos importantes de la respuesta inflamatoria asmática, incluyendo el cambio de isótipo IgE, quimotaxis eosinofílica y activación y crecimiento de células mastocíticas. Las citoquinas Th1, especialmente IFN-\gamma e IL-12, pueden suprimir la formación de clones Th2 y la producción de citoquinas Th2. El asma se refiere a un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por la inflamación, estrechamiento de las vías respiratorias y una reactividad aumentada de las vías respiratorias a agentes inhalados. El asma está frecuentemente, aunque no exclusivamente asociado con síntomas atópicos o alérgicos.
Un sujeto que tiene cáncer es un sujeto que tiene células cancerosas detectables. El cáncer puede ser un cáncer maligno o no maligno. Los cánceres o tumores incluyen pero no se limitan a cáncer del tracto biliar; cáncer cerebral; cáncer de mama; cáncer cervical; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer de endometrio; cáncer esofágico; cáncer gástrico; neoplasmas intraepiteliales; linfomas; cáncer hepático; cáncer de pulmón; (por ejemplo de células pequeñas y de células no pequeñas); melanoma; neuroblastomas; cáncer oral; cáncer de ovarios; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer rectal; sarcomas; cáncer de piel; cáncer testicular; cáncer del tiroides; y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas: en una realización el cáncer es leucemia de células pilosas, leucemia mielógena crónica, leucemia de células T cutánea, mieloma múltiple, linfoma folicular, melanoma maligno, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata, carcinoma de células de la vejiga, o carcinoma de
colon.
Un sujeto según el invento es un sujeto no roedor. Un sujeto no roedor significa un humano o animal vertebrado que incluye pero no se limita a un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, pollo, primate, por ejemplo, mono, y pez (especies de acuicultura), por ejemplo salmón, pero excluyendo específicamente roedores tales como ratas y ratones.
Así, el invento puede también ser usado para tratar cáncer y tumores en sujetos no humanos. El cáncer es una de las causas que encabeza las causas de muerte en animales de compañía (por ejemplo, gatos y perros). El cáncer generalmente afecta a animales viejos que, en el caso de mascotas caseras, se han integrado en la familia. Cuarenta y cinco % de los perros mayores de 10 años de edad, es probable que sucumban a la enfermedad. Las opciones de tratamiento mas comunes incluyen cirugía, quimioterapia y terapia por radiación. Otras modalidades de tratamiento que han sido usadas con algún éxito son la terapia del láser, crioterapia, hipertermia e inmunoterapia. La elección del tratamiento depende del tipo de cáncer y el grado de diseminación. A menos que el crecimiento maligno sea confinado a un área discreta en el cuerpo, es difícil eliminar sólo el tejido maligno sin afectar también a las células
normales.
Los trastornos malignos diagnosticados comúnmente en perros y gatos incluyen pero no se limitan a linfosarcomas, osteosarcoma, tumores mamarios, mastocistoma, tumor cerebral, melanoma, carcinoma adenoescamoso, tumor de pulmón carcinoide, tumor glandular bronquial, adenocarcinoma bronquiolar, fibroma, mixocondroma, sarcoma pulmonar, neurosarcoma, osteoma, papiloma, retinoblastoma, sarcoma de Ewing, tumor de Wilm, linfoma de Burkitt, microglioma, neuroblastoma, osteoclastoma, neoplasia oral, fibrosarcoma, osteosarcoma y rabdomiosarcoma. Otras neoplasias en perros incluyen carcinoma de células escamosas genitales, tumores venéreos transmisibles, tumor testicular, seminoma, tumor de células de Sertoli, hemangiopericitoma, histiocitoma, cloroma (sarcoma granulocítico), papiloma córneal, carcinoma de células escamosas de la córnea, hemangiosarcoma, mesotelioma pleural, tumor celular basal, timoma, tumor de estómago, carcinoma de glándula adrenal, papilomatosis oral, hemangioendotelioma y cistadenoma. Enfermedades adicionales diagnosticadas en gatos incluyen linfoma folicular, linfosarcoma intestinal, fibrosarcoma y carcinoma de células escamosas pulmonares. Se conoce que el hurón, una mascota casera aún más popular desarrolla insulinoma, linfoma, sarcoma, neuroma, tumor de células del islote pancreático, linfoma MALT gástrico y adenocarcinoma gástrico.
Las neoplasias afectan al ganado agricultural incluyendo leucemia, hemangiopericitoma y neoplasia ocular bovina (en bóvidos); fibrosarcoma prepucial, carcinoma de células escamosas ulcerativo, carcinoma prepucial, neoplasia del tejido conectivo y mastocitoma (en caballos); carcinoma hepatocelular (en cerdos); linfoma y adenomatosis pulmonar (en ovejas); sarcoma pulmonar, linfoma, sarcoma de Rous, reticulendoteliosis, fibrosarcoma, nefroblastoma, linfoma de células B y leucosis linfoide (en especies avícolas); retinoblastoma, neoplasia hepática, linfosarcoma (linfoma linfoblástico), leucemia plasmacitoide y sarcoma de la vejiga de flotación (en peces), linfadenitis caseosa (CLA): enfermedad contagiosa infecciosa crónica de las ovejas y cabras causada por la bacteria Corynebacterium pseudotuberculosis, y tumor de pulmón contagioso de oveja causado por jaagsiekte.
El sujeto es expuesto al antígeno. Como se usa aquí, el término expuesto se refiere tanto a la fase activa de poner en contacto al sujeto con un antígeno como a la exposición pasiva del sujeto al antígeno in vivo. Los métodos para la exposición activa de un sujeto a un antígeno son bien conocidas en la técnica. En general, un antígeno es administrado directamente al sujeto por cualquier medio tal como administración intravenosa, intramuscular, oral, transdérmica, mucosal, intranasal, intratraqueal, o subcutánea. El antígeno puede ser administrado sistémicamente o localmente. Los métodos para administrar el antígeno y el ácido nucleico inmunoestimulador están descritos con más detalle a continuación. Un sujeto es expuesto pasivamente a un antígeno si un antígeno llega a estar disponible para su exposición a las células inmunes en el cuerpo. Un sujeto puede ser expuesto pasivamente a un antígeno, por ejemplo, mediante la entrada de un patógeno extraño en el cuerpo o por el desarrollo de una célula tumoral que expresa un antígeno extraño en su superficie.
Los métodos en los que un sujeto es expuesto pasivamente a un antígeno pueden ser particularmente dependientes del tiempo de administración del ácido nucleico inmunoestimulador. Por ejemplo, en un sujeto con riesgo de desarrollar un cáncer o una enfermedad infecciosa o una alergia o una respuesta asmática, al sujeto se le puede administrar el ácido nucleico inmunoestimulador en una base regular cuando el riesgo es máximo, es decir, durante la estación alérgica o tras exposición a un agente que causa cáncer. Adicionalmente el ácido nucleico inmunoestimulador puede ser administrado a viajeros antes de que viajen a tierras extranjeras en las que hay riesgo de exposición a agentes infecciosos. De igual modo el ácido nucleico inmunoestimulador puede ser administrado a soldados o civiles con riesgo de exposición a armas biológicas para inducir una respuesta inmune sistémica o mucosal al antígeno cuando y si el sujeto está expuesto a ello.
Un antígeno como se usa aquí es una molécula capaz de provocar una respuesta inmune. Los antígenos incluyen pero no se limitan a células, extractos celulares, proteínas, polipéptidos, péptidos, polisacáridos, conjugados polisacáridos, péptidos y no péptidos que imitan polisacáridos y otras moléculas, moléculas pequeñas, lípidos, glicolípidos, carbohidratos, virus y extractos virales y organismos multicelulares tales como parásitos y alergenos. El término antígeno incluye amplicamente cualquier tipo de molécula que será reconocida por un sistema inmune hospedante como extraño. Los antígenos incluyen pero no se limitan a antígenos cancerígenos, antígenos microbianos, y
alergenos.
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Un antígeno cancerígeno como se usa aquí es un compuesto, tal como un péptido o una proteína, asociado con una superficie celular cancerígena o tumor y que es capaz de provocar una respuesta inmune cuando se expresa sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno en el contexto de una molécula MHC. Los antígenos cancerígenos pueden ser preparados a partir de células cancerígenas bien preparando extractos crudos de células cancerígenas, por ejemplo, como las descritas en Cohen, y otros, 1994, Cancer Research, 54:1055, o bien purificando parcialmente los antígenos, o bien por tecnología recombinante, o bien mediante síntesis de novo de antígenos conocidos. Los antígenos cancerígenos incluyen pero no se limitan a antígenos que se expresan de modo recombinante, una porción inmunogénica de, o un tumor completo o cáncer. Tales antígenos pueden ser aislados o preparados de modo recombinante o mediante cualquier otro medio conocido en la técnica.
Un antígeno microbiano como se usa aquí es un antígeno de un microorganismo e incluye pero no se limita a virus, bacterias, parásitos, y hongos. Tales antígenos incluyen el microorganismo intacto así como aislados naturales y fragmentos o derivados del mismo y también compuestos sintéticos que son idénticos a o similares a los antígenos de microorganismos presentes de manera natural e inducen una respuesta inmune específica para ese microorganismo. Un compuesto es similar a un microorganismo natural antigénico si induce una respuesta inmune (humoral y/o celular) a un antígeno de microorganismo presente de manera natural. Tales antígenos son usados rutinariamente en la técnica y son bien conocidos para aquellos con experiencia común en la técnica.
Ejemplos de virus que han sido encontrados en humanos incluyen pero no se limitan a: Retroviridae (por ejemplo virus de inmunodeficiencia humana, tales como HIV-1 (también referidos como HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV, o HIV-III; y otros aislados, tales como HIV-LP; Picornaviridae (por ejemplo virus de la polio, virus de hepatitis A; enterovirus, virus de Coxsackie humana, rinovirus, ecovirus); Calciviridae (por ejemplo cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo virus de la encefalitis equina, virus de la rubeola); Flaviridae (por ejemplo virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronoviridae (por ejemplo coronavirus);
Rhabdoviradae (por ejemplo virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo virus del ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo virus de parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio); Orthomyxoviridae (por ejemplo el virus de la gripe); Bungaviridae (por ejemplo virus Hantaan, virus bunga, flebovirus y virus Nairo); Arena viridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo reovirus, orbivirus y rotavirus), Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la Hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus);
Papovaviridae (papiloma virus, polioma virus); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simples (HSV) 1 y 2, virus de la varicela zoster, citomegalovirus (CMV), virus del herpes; Poxviridae (variola virus; virus de la vacuna, pox virus); e Iridoviridae (por ejemplo el virus de la fiebre porcina africana), y virus no clasificados (por ejemplo los agentes etiológicos de las encefalopatías espongiformes, el agente del delta hepatitis (que se pensaba que era un virus de la hepatitis B deficiente en satélite), los agentes de la hepatitis que no es ni A ni B (clase 1 = transmitido internamente; clase 2 = transmitido parenteralmente (es decir Hepatitis C); virus Norwalk y relacionados, y astrovirus).
Ambas bacterias gram negativas y gram positivas sirven como antígenos en animales vertebrados. Tales bacterias
gram positivas incluyen, pero no se limitan a, especie Pasteurella, especie Staphylococci, y especie Streptococcus. Las bacterias gram negativa incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli, especie Pseudomonas, y especie Salmonella. Ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen pero no se limitan a, Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (e.g. M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansaii, M. Gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus Grupo A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus Grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus Boris, Streptococcus (anaerobic sps.), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter patógeno sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteriodes spl., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, y Actinomyces israelli.
Ejemplos de hongos incluyen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.
Otros organismos infecciosos (por ejemplo, protistas) incluyen Plasmodium spp. Tal como Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, y Plasmodium vivax y Toxoplasma gondii. Parásitos de la sangre y/o tejidos incluyen Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense y Trypanosoma rhodesiense (enfermedad del sueño africana), Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas), y Toxoplasma gondii.
Otros microorganismos médicamente relevantes han sido descritos extensamente en la bibliografía, por ejemplo, véase C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Gran Bretaña 1983, el contenido entero del cual está en la presente incorporado mediante referencia.
Aunque muchos de los antígenos microbianos descritos anteriormente se refieren a trastornos humanos, el invento es también útil para tratar otros vertebrados no humanos. Los vertebrados no humanos son también capaces de desarrollar infecciones que pueden ser impedidas o tratadas con los ácidos nucleicos inmunoestimuladores descritos aquí. Por ejemplo, además del tratamiento de enfermedades humanas infecciosas, los métodos del invento son útiles para tratar infecciones de animales.
Como se usa aquí, el término tratar, tratado, o tratando cuando se usa con respecto a una enfermedad infecciosa se refiere a un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia de un sujeto (un sujeto con riesgo de infección) a una infección con un patógeno o, en otras palabras, disminuye la posibilidad de que el sujeto se infecte con el patógeno así como a un tratamiento después de que el sujeto (un sujeto que ha sido infectado) ha sido infectado para luchar contra la infección, por ejemplo, reducir o eliminar la infección o impedir que empeore.
Muchas vacunas para el tratamiento de vertebrados no humanos están descritas en Bennett, K. Compendium of Veterinary Products, 3rd ed. North American Compendiums, Incl., 1995. Como se trata anteriormente, los antígenos incluyen microbios infecciosos tales como virus, parásitos, bacterias y hongos y fragmentos de los mismos, derivados de fuentes naturales o sintéticas. Los virus infecciosos de vertebrados tanto humanos como no humanos, incluyen retrovirus, virus ARN y virus ADN. Este grupo de retrovirus incluye tanto retrovirus simples como retrovirus complejos. Los retrovirus simples incluyen los subgrupos de retrovirus tipo B, retrovirus tipo C y retrovirus tipo D. Un ejemplo de retrovirus tipo B es el virus del tumor mamario de ratón (MMTV). Loso retrovirus tipo C incluyen subgrupos del grupo A tipo C (incluyendo el virus del sarcoma de Rous (RSV), virus de la leucemia aviar (ALV), y virus de la mieloblastosis aviar (AMV)) y el grupo B de tipo C (incluyendo virus de la leucemia felina (FeLV), virus de la leucemia del mono gibón (GALV), virus de la necrosis del bazo (SNV), virus de la reticuloendoteliosis (RV) y virus del sarcoma del simio (SSV)). Los retrovirus de tipo D incluyen el virus del mono Mason-Pfizer (MPMV) y el retrovirus de simio tipo 1 (SRV-1). El retrovirus complejo incluye los subgrupos de lentivirus, virus de la leucemia de células T y el virus espumoso. Los lentivirus incluyen HIV-1, pero también incluyen HIV-2, SIV, virus Visna, virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), y el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV). Los virus de la leucemia de células T incluyen HTLV-1, HTLV-II, virus de la leucemia de las células T de simio (STLV), y el virus de la leucemia bovina (BLV). El virus espumoso incluye el virus espumoso humano (HFV), el virus espumoso de simio (SFV) y el virus espumoso bovino
(BFV).
Ejemplos de otros virus ARN que son antigénicos en animales vertebrados incluyen, pero no se limitan a, miembros de la familia de Reoviridae, incluyendo el género Orthoreovirus (serotipos múltiples de retrovirus tanto de mamífero como de aves), el género Orbivirus (virus de lengua azul, virus Eugenangee, virus Kemerovo, virus de la enfermedad equina africana, y virus de la fiebre de la garrapata del Colorado), el género Rotavirus (rotavirus humano, virus de la diarrea de los terneros de Nebrasca, rotavirus de simio, rotavirus bovino u ovino, rotavirus aviar); la familia de los Picornaviridae, incluyendo el género Enterovirus (poliovirus, virus Coxsackie A y B, virus entérico citopático humano huerfano (ECHO), virus de la hepatitis A, enterovirus de simio, virus de la encefalomielitis murina (ME), Poliovirus muris, enterovirus bovino, enterovirus porcino, el género Cardiovirus (virus de la Encefalomiocarditis (EMC), Mengovirus), el género Rhinovirus (rinovirus humano incluyendo al menos 113 subtipos; otros rinovirus), el género Aptovirus (enfermedad del pie y de la boca (FMDV); la familia Calciviridae, incluyendo el exantema vesicular del virus porcion, el virus del león marino de San Miguel, picornavirus felino y virus Norwalk, la familia de Togaviridae, incluyendo el género Alfavirus (virus de la encefalitis equina oriental, virus del Semliki forest, virus Sindbis, virus Chikungunya, virus O'Nyong-Nyong, virus del rio Ross, virus de la encefalitis equina de Venezuela, virus de la encefalitis equina occidental), el género Flavirius (virus de la fiebre amarilla del mosquito, virus del Dengue, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de St Louis, virus de la encefalitis del Murray Valley, virus de la fiebre del Nilo, virus Kunjin, virus transmitido por la garrapata centroeuropea, virus transmitido por la garrapata de Oriente, virus del bosque de Kyasanur, virus Louping III, virus Powassan, virus de la fiebre hemorrágica Omsk), el género Rubivirus (virus de la rubéola), el género Pestivirus (virus de la enfermedad de las mucosas, virus de la fiebre porcina, virus de la enfermedad Border); la familia Bunyaviridae, incluyendo el género Bunyvirus (virus Bunyamwera y relacionados, virus del grupo de encefalitis de California), el género Phlebovirus (virus de la fiebre siciliana de la mosca de la arena, virus de la fiebre del Rift Valley), el género Nairovirus (virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, virus de la enfermedad de la oveja de Nairobi), y el género Uukuvirus (virus Uukuniemi y relacionados); la familia Orthomyxoviridae, incluyendo el género del virus de la gripe (virus de la gripe tipo A, muchos subtipos humanos); virus de la gripe porcina, y virus de la gripe aviar y equina; virus de la gripe tipo B (muchos subtipos humanos), y virus de la gripe tipo C (posibles géneros separados); la familia de paramyxoviridae, incluyendo el género Paramyxovirus (el virus de la parainfluenza tipo 1, virus Sendai, virus Hemadsorption, virus Parainfluenza tipos 2 a 5, virus de la Enfermedad de Newcastle, virus de las paperas), el género Morbillivirus (virus del sarampión, virus de la panencefalitis esclerótica subaguda, virus del moquillo, virus Rinderpest), el género Pneumovirus (virus sincitial respiratorio (RSV), virus sincitial respiratorio y virus de la neumonía); la familia Rhabdoviridae, incluyendo el género Vesiculovirus (VSV), virus Chandipura, virus del Parque Flanders-Hart), el género Lyssavirus (virus de la rabia), rabdovirus del pez, y dos probables rabdovirus (virus Marburg y virus del ébola); la familia Arenaviridae, incluyendo el virus de la coriomeningitis (LCM), virus Tacaribe complejo, y virus Lassa; la familia Coronaviridae, incluyendo el virus de la bronquitis infecciosa (IBV), virus de la hepatitis, virus corona entérico humano, y la peritonitis infecciosa
(coronavirus felino).
Los virus ADN ilustrativos que son antígenos en animales vertebrados incluyen, pero no se limitan a, la familia Poxviridae, incluyendo el género Orthopoxvirus (Variola principal, Variola menor, pox vacuna del mono, pox de la vaca, pox del Búfalo, pox del conejo, Ectromelia), el género Leporipoxvirus (Myxoma, Fibroma), el género Avipoxvirus (pox del pollo, otros poxvirus aviales), el género Capripoxvirus (pox de la oveja, pox de la cabra), el género Suipoxvirus (pox del cerdo), el género Parapoxvirus (virus de la dermatitis postular contagiosa, pseudopox de la vaca, virus de la estomatitis papular bovina); la familia Iridoviridae (virus de la fiebre porcina africana, virus 2 y 3 de la rana, virus de linfocistis del pez); la familia Herpesviridae, incluyendo los alfa Herpesvirus (Herpes simples tipos 1 y 2, Varicela-zoster, virus del aborto equino, virus del herpes equino 2 y 3, virus de la pseudorabia, virus de la queratoconjuntivitis bovina infecciosa, virus de la rinotraqueítis bovina infecciosa, virus de la rinotraqueítis felina, virus de la laringotraqueítis infecciosa), los herpesvirus beta (citomegtalovirus humano y citomegalovirus del cerdo y los monos); los herpesvirus gamma (virus de Epstein-barr (EBV), virus de la enfermedad de Marek, herpes saimiri, Herpesvirus ateles, herpesvirus Sylvilagus, virus del herpes de la cobaya, virus del tumor de Lucke), la familia Adenoviridae, incluyendo el género Mastadenovirus (subgrupos humanos A, B, C, D, E y sin agrupar; adenovirus del simio (al menos 23 serotipos), hepatitis canina infecciosa, y adenovirus del ganado, cerdos, ovejas, ranas y muchas otras especies, el género Aviadenovirus (adenovirus aviar); y adenovirus no cultivables; la familia de Papoviridae, incluyendo el género Papillomavirus (virus del papiloma humano, virus del papiloma bovino, virus del papiloma de conejo Shope, y diversos virus de papiloma patogénicos de otras especies), el género Poliomavirus (poliomavirus, agente vacuolizante del simio (SV-40), agente vacuolizante del conejo (RKV), virus K, virus BK, virus JC, y otros virus polioma de primates tales como el virus del papiloma linfotrófico); la familia Parvoviridae incluyendo el género virus adenoasociados, el género Parvovirus (virus panleukopenia felina, parvovirus bovino, parvovirus canino, virus de la enfermedad del visón aleutiano, etc). Finalmente, los virus ADN pueden incluir virus que no encajan en las familias anteriores tales como el virus del Kuru y la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob y los agentes neuropáticos infecciosos crónicos
(virus CHINA).
Cada una de las listas precedentes es ilustrativa, y no pretenden ser limitantes.
Además del uso de los ácidos nucleicos inmunoestimuladores para inducir una respuesta inmune específica de antígeno en humanos, los métodos de las realizaciones preferidas son particularmente muy adecuadas para el tratamiento de pájaros tales como gallinas, pollos, pavos, patos, gansos, codornices, y faisanes. Los pájaros son las principales dianas para muchos tipos de infecciones.
Los pájaros que salen del cascarón están expuestos a microorganismo patógenos al poco de nacer. Aunque estos pájaros están protegidos inicialmente frente a patógenos mediante anticuerpos derivados maternalmente, esta protección es solo temporal, y el sistema inmune inmaduro del propio pájaro debe comenzar a proteger al pájaro frente a los patógenos. Con frecuencia se desea impedir la infección en pájaros jóvenes cuando son mas susceptibles. También se desea prevenir frente a la infección en pájaros adultos, especialmente cuando los pájaros están alojados en cuartos cerrados, llevando a la rápida diseminación de la enfermedad. Así, se desea administrar el ácido nucleico inmunoestimulador y el ácido no nucleico adyuvante del invento a los pájaros para potenciar una respuesta inmune específica de antígeno cuando el antígeno está presente.
Un ejemplo de una infección común en pollos es el virus de la anemia infecciosa del pollo (CIAV). El CIAV fue aislado por primera vez en Japón en 1979 durante una investigación de una interrupción de la vacunación de la enfermedad de Marek (Yuasa y otros, 1979, Avian Dis. 23:366-385). Desde ese tiempo, el CIAV ha sido detectado en aves comerciales en todos los principales países productores de aves (von Bulow y otros, 1991, pp. 690-699) en Diseases of Poultry, 9ª edición, Iowa State University Press).
La infección por CIAV tiene como resultado una enfermedad clínica, caracterizada por anemia, hemorragia e inmunosupresión, en pollos jóvenes susceptibles. La atrofia del timo y de la médula ósea y lesiones consistentes de pollos infectados con CIAV son también característicos de la infección por CIAV. La depleción linfocítica en el timo, y ocasionalmente en la bursa de Fabricius, da como resultado una inmunosupresión y una susceptibilidad aumentada a infecciones virales, bacterianas o fúngicas secundarias, que después complican el curso de la enfermedad. La inmunosupresión puede causar una enfermedad agraviada tras la infección con uno o más de los virus de la enfermedad de Marek (MDV), el virus de la enfermedad bursal infecciosa, el virus de la reticuloendoteliosis, adenovirus, o reovirus. Se ha documentado que la patogénesis del MDV es potenciada por CIAV (DeBoer y otros, 1989, p. 28 In Proceedings of the 38th Western Poultry Disease Conference, Tempe, Ariz.). Además, se ha documentado que el CIAV agrava los signos de la enfermedad bursal infecciosa (Rosenberger y otros, 1989, Avian Dis. 33:707-713). Los pollos desarrollan un resistencia con la edad a enfermedades inducidas experimentalmente debido a CAA. Esta se completa esencialmente a la edad de 2 semanas, pero pájaros mayores son aún susceptibles a infección (Yuasa, N. Y otros, 1979; Yuasa, N. Y otros., Arian Disease 24, 202-209, 1980). Sin embargo, si los pollos fueran infectados dualmente con CAA y un agente inmunosupresor (IBDV, MDV etc.) la resistencia de edad frente a la enfermedad se retrasa (Yuasa, N. Y otros, 1979 y 1980 supra; Bulow von V. y otros, J. Veterinary Medicine 33, 93-116, 1986). Las características del CIAV que pueden potenciar la transmisión de la enfermedad incluyen una elevada resistencia a inactivación medioambiental y algunos desinfectantes comunes. El impacto económico de la infección por CIAV en la industria avícola es clara desde el hecho que un 10% a 30% de los pájaros infectados durante los brotes de la enfermedad
mueren.
La vacunación de los pájaros, al igual que en otros animales vertebrados puede ser realizada a cualquier edad. Normalmente, las vacunaciones son realizadas hasta 12 semanas de edad para un microorganimos vivo y entre 14-18 semanas para un microorganismo inactivado u otro tipo de vacuna. Para vacunación in ovo, la vacunación puede ser realizada en el último cuarto del desarrollo embrionario. La vacuna puede ser administrada subcutáneamente, mediante aerosol, oralmente, intraocularmente, intratraquealmente, nasalmente, o mediante otros métodos de liberación mucosal descritos aquí. Así, los ácidos nucleicos inmuno-estimuladores del invento pueden ser administrados a pájaros y otros vertebrados no humanos usando programas de vacunación rutinarios y el antígeno puede ser administrado después de una período de tiempo apropiado como se describe aquí.
El ganado y animales de granja son también susceptibles de infección. Las enfermedades que afectan a estos animales pueden producir pérdidas económicas graves, especialmente entre el ganado. Los métodos del invento pueden ser usados para proteger frente a infecciones en animales de granja, tales como vacas, caballos, cerdos, ovejas, y cabras.
Las vacas pueden ser infectadas por virus bovinos. El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) es un virus ARN de hebra positiva recubierto pequeño y se clasifica, junto con el virus del cólera porcino (HOCV) y el virus de la enfermedad fronteriza de oveja (BDV), y el género pestivirus. Aunque los pestivirus fueron previamente clasificados en la familia Togaviridae, algunos estudios han sugerido su reclasificación dentro de la familia Flaviviridae junto con los grupos flavivirus y el del virus de la hepatitis C (HCV) (Francki, y otros, 1991).
El BVDV, que es un patógeno importante del ganado puede distinguirse, basándose en el análisis del cultivo celular, en biotipos citopatogénicos (CP) y nocitopatogénico (NCP). El biotipo NCP está más extendido aunque ambos biotipos pueden encontrarse en el ganado. Si una vaca preñada se infecta con una cepa NCP, la vaca puede dar a luz a un ternero infectado de modo persistente e inmunotolerante de modo específico que diseminará el virus a lo largo de toda su vida. El ganado infectado de modo persistente puede sucumbir a la enfermedad mucosal y ambos biotipos pueden ser aislados a partir del animal. Las manifestaciones clínicas pueden incluir aborto, teratogénesis, y problemas respiratorios, enfermedad de las mucosas y diarrea ligera. Además, trombocitopenia grave, asociada con epidemias de manadas, que pueden resultar en la muerte para el animal han sido descritas y las cepas asociadas con este enfermedad parecen más virulentas que el clásico BVDVs.
El virus del herpes equino (EHV) comprende un grupo de agentes biológicos distintos antigénicamente, que causan una variedad de infecciones en caballos que van desde la enfermedad subclínica hasta fatal. Estos incluyen el herpes virus equino-1 (EHV-1), un patógeno ubicuo en caballos. El EHV-1 está asociado con epidemias de abortos, enfermedades del tracto respiratorio, y trastornos del sistema nervioso central. La infección primaria del tracto respiratorio superior de caballos jóvenes da como resultado una enfermedad febril que dura de 8 a 10 días. Las yeguas inmunológicamente experimentadas pueden ser reinfectadas vía el tracto respiratorio sin que la enfermedad sea evidente, de modo que el aborto normalmente tiene lugar sin aviso. El síndrome neurológico está asociado con la enfermedad respiratoria o el aborto y puede afectar a animales de ambos sexos a cualquier edad, llevando a la falta de corodinación, debilidad y parálisis posterior (Telford, E.A.R. y otros, Virology 189, 304-316, 1992). Otros EHV incluyen EHV-2, o citomegalovirus equino, EHV-3, virus exantema coital equino, y EHV-4, previamente clasificado como EHV-1 subtipo 2.
Las ovejas y las cabras pueden ser infectadas por una variedad de microorganismos peligrosos incluyendo visna-maedi.
Los primates tales como monos, simios y macacos pueden ser infectados por el virus de la inmunodeficiencia en el simio. Las vacunas del virus celular inactivado y de la inmunodeficiencia en el simio entero libre de células han sido documentadas para permitir la protección en los macacos (Stott y otros, (1990) Lancet 36:1538-1541; Desrosiers y otros, PNAS USA (1989) 86:6353-6357; Murphey-Corb y otros (1989) Science 246:1293-1297; y Carlson y otros (1990) AIDS Res. Human Retrovirus 6:1239-1246). Una vacuna de VIH gp120 recombinante ha sido documentada para permitir la protección en chimpancés (Berman y otros (1990) Nature 345:622-625).
Los gatos, tanto domésticos como salvajes, son susceptibles de infección con una variedad de micro-organismos. Por ejemplo, la peritonitis infecciosa felina es una enfermedad que tiene lugar tanto en los gatos domésticos como en los salvajes, tales como leones, leopardos, guepardos, y jaguares. Cuando es deseable prevenir la infección por éste y otros tipos de organismos patógenos en gatos, los métodos del invento pueden ser usados para vacunar gatos para protegerlos frente a la infección.
Los gatos domésticos pueden infectarse con varios retrovirus, incluyendo pero no limitándose al virus de la leucemia felina (FeLV), virus del sarcoma felino (FeSV), Concornavirus de tipo endógeno (RD-114), y el virus formador de sincitios felino (FeSFV). De estos, el FeLV es el patógeno más significativo, que causa diversos síntomas incluyendo neoplasmas linforeticulares y mieloides, anemias, trastornos mediados por el sistema inmune, y un síndrome de inmunodeficiencia que es similar al síndrome de inmunodeficiencia humana adquirido (SIDA). Recientemente, un mutante particular FeLV defectivo en la replicación, designado FeLV-AIDS, ha sido más particularmente asociado con las propiedades inmunosupresoras.
El descubrimiento del lentivirus linfotrópico T felino (también referido como de inmunodeficiencia felina) fue documentado por primera vez en Pedersen y otros (1987) Science 235:790-793. Las características del FIV han sido documentadas en Yamamoto y otros (1988) Leukemia, Suplemento de Diciembre 2:204S-215S; Yamamoto y otros (1988) Am. J. Vet. Res. 49:1246-1258; y Ackley y otros (1990) J. Virol. 64:5652-5655. El clonaje y el análisis de secuencias de FIV han sido documentados en Olmsted y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2448-2452 y 86:4355-4360.
La peritonitis infecciosa felina (FIP) es una enfermedad esporádica que ocurre de modo impredecible en felinos domésticos y salvajes. Mientras que la FIP es principalmente una enfermedad de gatos domésticos, se ha diagnosticado en leones, leones de montaña, leopardos, guepardos, y jaguares. Gatos salvajes más pequeños que se han visto afectados con FIP incluyen el lince y el lince africano, el gato de las arenas, el gato de Pallas. En gatos domésticos, la enfermedad ocurre predominantemente en animales jóvenes, aunque los gatos de todas las edades son susceptibles. Una incidencia máxima se da entre 6 y 12 meses de edad. Se observa una disminución en la incidencia desde los 5 a los 13 años de edad, seguido por una incidencia aumentada en gatos de 14 a 15 años de edad.
Las enfermedades virales, bacterianas y parasíticas en peces aleteados, mariscos u otras formas de vida acuática plantean un serio problema para la industria de la acuicultura. Debido a la alta densidad de animales en los tanques de cría o en areas de granjas marinas cerradas, las enfermedades infecciosas pueden erradicar una gran proporción de las reservas en, por ejemplo, en una instalación de peces aleteados, de mariscos, o de otras formas de vida acuática. La prevención de enfermedades es un remedio más deseado para aquellas amenazas a los peces que la intervención una vez que la enfermedad está en progreso. La vacunación del pescado es el único método preventivo que puede ofrecer una protección a largo plazo a través de inmunidad. Las vacunaciones basadas en ácidos nucleicos está descritas en el documento de Patente norteamericana Nº: 5.780.448 publicada por Davis.
El sistema inmune del pez tiene muchas características similares al sistema inmune de mamífero, tal como la presencia de células B, células T, linfoquinas, complemento, e inmunoglobulinas. El pez tiene subclases de linfocitos con funciones que parecen similares en muchos aspectos a las de las células B y T de mamíferos. Las vacunas pueden ser administradas mediante inmersión u oralmente.
Las especies de acuicultura incluyen pero no se limitan a peces aleteados, mariscos, y otros animales acuáticos. Los peces aleteados incluyen todos los peces vertebrados, que pueden ser peces óseos o cartilaginosos, tales como por ejemplo, salmónidos, carpas, pez gato, jurel, dorada, lubina. Los salmónidos son una familia de peces aleteados que incluyen la trucha (incluyendo la trucha arcoiris), el salmón, y la trucha alpina. Ejemplos de mariscos incluyen, pero no se limitan a, almejas, langostas, gambas, cangrejo y ostras. Otros animales acuáticos cultivados incluyen, pero no se limitan a anguilas, calamar, y pulpo.
Los polipéptidos de patógenos de acuicultura virales incluyen pero no se limitan a glicoproteína (G) o nucleoproteína (N) de virus de septicemia hemorrágica viral (VHSV); proteínas G o N de virus de necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV); proteínas estructurales VP1, VP2, VP3 o N del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV); proteína G de la virema primaveral de la carpa (SVC); y una proteína asociada a membrana, tegumina o proteína de la cápside o glicoproteína del virus del pez gato de canal (CCV).
Los parásitos típicos que infectan caballos son Gasterophilus spp.; Eimeria Leuckarti, Giardia spp.; Tritrichomonas equi; Babesia spp. (RBCs), Theileria equi; Trypanosoma spp.; Klossiella equi; Sarcocystis spp.
Los parásitos típicos que infectan a los cerdos incluyen Eimeria bebliecki, Eimeria scabra, Isospora suis, Giardia spp; Balantidium coli, Entamoeba histolytica; Toxoplasma gondii y Sarcocystis spp.; y Trichinella spiralis.
Los principales parásitos de los productos lácteos y el ganado vacuno incluyen Eimeria spp., Cryptosporidium sp., Giardia spp.; Toxoplasma gondii; Babesia bovis (RBC),; Babesia bigemina (RBC), Trypanosoma spp. (plasma), Theileria spp. (RBC); Theileria parva (linfocitos); Tritrichomonas foetus; y Sarcocystis spp.
Los principales parásitos de las rapaces incluyen Trichomonas gallinae; Coccidia (Eimeria spp.); Plasmodium relictum, Leucocytozoon danilewskyi (búhos), Haemoproteus spp.; Trypanosoma spp.; Histomonas; Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium baileyi, Giardia, Eimeria; Toxoplasma.
Los parásitos típicos que infectan a ovejas y cabras incluyen Eimeria spp., Cryptosporidium sp., Giardia sp.; Toxoplasma gondii; Babesia spp. (RBC), Trypanosoma spp. (plasma); Theileria spp. (RBC); y Sarcocystis spp.
Los parásitos típicos de infecciones en aves incluyen la coccidiosis causada por Eimeria acervulina, E. Necatrix, E. Tenella, Isospora spp. Y Eimeria truncata; histomoniasis, causada por Histomonas meleagridis e Histomonas gallinarum; tricomoniasis causada por Trichomonas gallinae; y hexamitiasis causada por Hexamita meleagridis. Las aves pueden también ser infectadas por Eimeria maxima, Eimeria meleagridis, Eimeria adenoeides, Eimeria meleagrimitis, Crytosporidium, Eimeria brunetti, Eimeria adenoeides, Leucocytozoon spp., Plasmodium spp.; Hemoproteus meleagridis, Toxoplasma gondii y Sarcocystis.
Los métodos del invento pueden también ser aplicados al tratamiento y/o prevención de infección parasítica en perros, gatos, pájaros, peces y hurones. Los parásitos típicos de los pájaros incluyen Trichomonas gallinae; Eimeria spp.; Isospora spp.; Giardia; Cryptosporidium; Sarcocystis spp.; Toxoplasma gondii, Haemopreteus/Parahaemoproteus, Plasmodium spp., Leucocytozoon/Akiba, Atoxoplasma, Trypanosoma spp. Los parásitos típicos que infectan a los perros incluyen Trichinella spiralis; Isopora spp.; Sarcocystis spp.; Cryptosporidium spp., Hammondia spp., Giardia duodenalis (canis); Balantidium coli, Entamoeba histolytica; Hepatozoon canis; Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi; Babesia canis; Leishmania amastigotes; Neospora caninum.
Los parásitos típicos que infectan a las especies felinas incluyen Isospora spp.; Toxoplasma gondii, Sarcocystis spp.; Hammondia hammondi, Besnoitia spp., Giardia spp.; Entamoeba histolytica; Hepatozoon canis, cytauxzoon sp., Cytauxzoon sp., Cytauxzoon sp. (células rojas, células RE).
Los parásitos típicos que infectan a los peces incluyen Hexamita spp., Eimeria spp.; Cryptobia spp., Nosema spp., Myxosoma spp., Chilodonella spp., Trichodina spp.; Phistophora spp., Myxosoma henneguya; Costia spp., Ichthyophithirius spp., y Oodinium spp.
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Los parásitos típicos de mamíferos salvajes incluyen Giardia spp. (carnívoros, herbívoros), Isospora spp. (carnívoros), Eimeria spp. (carnívoros, herbívoros); Theileria spp. (herbívoros), Babesia spp. (carnívoros, herbívoros), Trypanosoma spp. (carnívoros, herbívoros); Schistosoma spp. (herbívoros); Fasciola hepatica (herbívoros), Fascioloides magna (herbívoros), Fasciola gigantita (herbívoros), Trichinella spiralis (carnívoros, herbívoros).
Las infecciones parasíticas en zoos pueden también plantear graves problemas. Los parásitos típicos de la familia de los bóvidos (blesbok, antílope, banteng (ganado de Bali), elang, gaur, impala, klipspringer, kudu, gacela) incluyen Eimeria spp. Los parásitos típicos en la familia de las pinnipedae (focas, leones marinos) incluyen Eimeria phocae. Los parásitos típicos en la famila de las camelidae (camellos, llamas) incluyen Eimeria spp. Los parásitos típicos en la familia de los elephantidae (Africanos y asiáticos) incluyen Fasciola spp. Los parásitos típicos de primates inferiores (chimpancés, orangutanes, simios, babuinos, macacos, monos) incluyen Giardia sp.; Balantidium coli, Entamoeaba histolytica, Sarcocystis spp., Toxoplamsa gondii; Plasmodium spp. (RBC), Babesia spp. (RBC), Trypanosoma spp. (plasma), Leishmania spp. (macrófagos).
Los polipéptidos de patógenos bacterianos incluyen pero no se limitan a una proteína de la membrana externa regulada por hierro, (IROMP), una proteína de la membrana externa (OMP), y una proteína A de Aeromonis salmonicida, que causa furunculosis, proteína p57 de Renibacterium salmoninarum, que causa enfermedad renal bacteriana (BKKD), antígeno asociado a la superficia principal (msa), una citotoxina expresada en superficie (mpr), una hemolisina expresada en superficie (ish), y un antígeno flagelar de Yersiniosis; una proteína extracelular (ECP), una proteína de la membrana externa regulada por hierro (IROMP), y una proteína estructural de Pasteurellosis; una OMP y una proteína flagelar de Vibrosis anguillarum y V. Ordalii; una proteían flagelar, una proteína OMP, aroA, y purA de Edwardsiellosis ictaluri y E. Tarda; y un antígeno de superficie de Ichthyophthirius; y una proteína estructural y reguladaor de Cytophaga columnari; y una proteína estructural y reguladora de Rickettsia.
Los polipéptidos de un patógeno parásito incluyen pero no se limitan a antígenos de superficie de Ichthyophthirius.
Un alergeno se refiere a una sustancia (antígeno) que puede inducir una respuesta alérgica o asmática en un sujeto susceptible. La lista de alergenos es enorme y puede incluir polen, insectos venenosos, polvo de caspa animal, esporas de hongos y fármacos (por ejemplo penicilina). Ejemplos de alergenos naturales, animales y vegetales incluyen pero no se limitan a proteínas específicas de los siguientes géneros: Canine (Canis familiaris); Cermatophagoides (por ejemplo, Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemisfolia); Lolium (por ejemplo, Lolium perenne o Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Agnus (Agnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea Europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (por ejemplo Plantago Lanceolada); Parietaria (por ejemplo Parietaria officinalis o Parietaria judaica); Blatella (por ejemplo Blatella germanica); Apis (por ejemplo Apis multiflorum); Cupressus (por ejemplo Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica y Curpessus macrocarpa); Juniperus (por ejemplo Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis y Juniperus ashei); Thuya (por ejemplo Thuya orientalis); Chamaecyparis (por ejemplo Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (por ejemplo Periplaneta americana); Agropyron (por ejemplo Agropyron repens); Secale (por ejemplo Secale cereale); Triticum (por ejemplo Triticum aestivum); Dactylis (por ejemplo Dactylis glomerata); Festuca (por ejemplo Festuca elatior); Poa (por ejemplo Poa pratensis o Poa compressa); Avena (por ejemplo Avena sativa); Holcus (por ejemplo Holcus lanatus); Anthoxanthum (por ejemplo Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (por ejemplo Arrhenatherum elatius); Agrostis (por ejemplo Agrostis alba); Phleum (por ejemplo Phleum pratense); Phalaris (por ejemplo Phalaris arundinacea); Paspalum (por ejemplo Paspalum notatum); Sorghum (por ejemplo Sorghum Halepensis); y Bromus (por ejemplo
Bromus inermis).
El antígeno puede ser un antígeno que está codificado por un vector de ácidos nucleicos o puede no estar codificado en un vector de ácidos nucleicos. En el primer caso el vector de ácidos nucleicos se administra al sujeto y el antígeno se expresa in vivo. En el último caso el antígeno puede ser administrado directamente al sujeto. Un antígeno no codificado en un vector de ácidos nucleicos como se usa aquí se refiere a cualquier tipo de antígeno que no es un ácido nucleico. Por ejemplo, en algunos aspectos del invento el antígeno no codificado en un vector de ácidos nucleicos es un polipéptido. Modificaciones menores de las secuencias aminoacídicas primarias de los antígenos polipeptídicos pueden también dar como resultado un polipéptido que tiene una actividad antigénica sustancialmente equivalente comparada con el polipéptido homólogo sin modificar. Tales modificaciones pueden ser deliberadas, como mutagénesis dirigida a un sitio, o puede ser espontánea. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones están aquí incluidos siempre que la antigenicidad aún exista. El polipéptido puede ser, por ejemplo, un polipéptido
viral.
El término sustancialmente purificado como se usa aquí se refiere a un polipéptido que es sustancialmente libre de otras proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que está normalmente asociado. Una persona experta en la técnica puede purificar polipéptidos virales o bacterianos usando técnicas estándar para purificación de proteínas. El polipéptido sustancialmente puro generará con frecuencia una banda principal única en un gel de poliacrilamida no reductor. En el caso de polipéptidos parcialmente glicosilados o los que tienen varios codones de iniciación, puede haber varias bandas en un gel de poliacrilamida no reductor, pero estas formarán un patrón distintivo para ese polipéptido. La pureza del polipéptido viral o bacteriano puede también determinarse mediante análisis de secuencia aminoacídica del amino terminal. Otros tipos de antígenos no codificados por un vector de ácidos nucleicos tales como polisacáridos, moléculas pequeñas, miméticos etc están descritos anteriormente, e incluídos dentro del invento.
El invento también utiliza polinucleótidos que codifican los polipéptidos antigénicos. Se prevé que el antígeno pueda ser suministrado al sujeto en una molécula de ácidos nucleicos que codifica para el antígeno de modo que el antíengo tenga que expresarse in vivo. Tales antígenos suministrados al sujeto en un vector de ácidos nucleicos son referidos como antígenos codificados por un vector de ácidos nucleicos. El ácido nucleico que codifica para el antígeno está unido operativamente a una secuencia de expresión génica que dirija la expresión del ácido nucleico antigénico en una célula eucariota. La secuencia de expresión génica es cualquier secuencia nucleotídica reguladora, tal como una secuencia promotora o combinación promotor-secuencia potenciadora, que facilite la transcripción y traducción eficaz del ácido nucleico antigénico a la cual está operativamente unida. La secuencia de expresión génica puede, por ejemplo, ser un promotor mamífero o viral, tal como un promotor constitutivo o inducible. Los promotores de mamíferos constitutivos incluyen, pero no se limitan a, los promotores para los siguientes genes: hipoxantina fosforibosil transferasa (HPTR), adenosina desaminasa, piruvato quinasa, promotor b-actina y otros promotores constitutivos. Los promotores virales de los ejemplos, que funcionan constitutivamente en células eucariotas incluyen, por ejemplo, promotores del citomegalovirus (CMV), virus del simio (por ejemplo, SV40), papilomavirus, adenovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), virus del sarcoma de Rous, citomegalovirus, las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Moloney y otros retrovirus, y el promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simplex. Otros promotores constitutivos son conocidos por aquellos con experiencia común en la técnica. Los promotores útiles como secuencias de expresión génica del invento también incluyen promotores inducibles. Los promotores inducibles se expresan en presencia de un agente inductor. Por ejemplo, el promotor de metalotioneína es inducido para promover la transcripción y traducción en presencia de ciertos iones metálicos. Otros promotores inducibles son conocidos por aquellos con experiencia
común en la técnica.
En general, la secuencia de expresión génica incluirá, según sea necesario, secuencias 5' no transcritas y secuencias 5' no traducidas implicadas con el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como la caja TATA, secuencia caperuza, secuencia CAAT, y similar. Especialmente, tales secuencias 5' no transcritas incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico antigénico unido operativamente. Las secuencias de expresión génica incluyen opcionalmente secuencias potenciadoras o secuencias activadoras aguas arriba según se desee.
El ácido nucleico antigénico está unido operativamente a la secuencia de expresión génica. Como se usa aquí, la secuencia de ácidos nucleicos antigénica y la secuencia de expresión génica se dice que están unidas operativamente cuando están unidas covalentemente de tal modo que se coloque la expresión o transcripción y/o traducción de la secuencia antigénica codificante bajo la influencia o control de la secuencia de expresión génica. Dos secuencias de ADN se dice que están operativamente unidas si la inducción de un promotor en la secuencia de expresión génica 5' da como resultado la transcripción de la secuencia antigénica y si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de ADN (1) no tienen como resultado la introducción de una mutación de desplazamiento del marco de lectura, (2) no interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de la secuencia antigénica, o (3) no interfiere con la capacidad del correspondiente ARN transcrito a ser traducido en una proteína. Así, una secuencia de expresión génica estaría unida operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos antigénica si la secuencia de expresión génica fuera capaz de efectuar la transcripción de tal secuencia de ácidos nucleicos antigénicos de tal modo que el transcrito resultante se tradujera en la proteína o polipéptido
deseado.
El ácido nucleico antigénico del invento puede ser liberado al sistema inmune solo o asociado con un vector. En el sentido más amplio, un vector es cualquier vehículo capaz de facilitar la transferencia del ácido nucleico antigénico a las células del sistema inmune de modo que el antígeno pueda ser expresado y presentado en la superficie de la célula inmune. El vector transporta generalmente el ácido nucleico a las células inmunes con una degradación reducida relativa a la extensión de la degradación que daría como resultado la ausencia del vector. El vector incluye opcionalmente la secuencia de expresión génica anteriormente descrita para potenciar la expresión del ácido nucleico antigénico en las células inmunes. En general, los vectores útiles en el invento incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagómidos, virus, otros vehículos derivados de las fuentes virales o bacterianas que han sido manipuladas mediante la inserción o incorporación de las secuencias de ácidos nucleicos antigénicas. Los vectores virales son un tipo preferido de vector e incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ácidos nucleicos a partir de los siguientes virus: retrovirus, tales como el virus de la leucemia murina de Moloney, virus del sarcoma murino Harvey, virus del tumor mamario murino, y virus del sarcoma de Rous; los adenovirus, virus adenoasociados; virus tipo SV40; virus polioma; virus Epstein-Barr; papilomavirus; herpes virus; virus vacuna; virus de la poli; y virus ARN tales como retrovirus. Uno puede emplear fácilmente otros vectores no nombrados pero conocidos en la
técnica.
Los vectores virales preferidos están basados en virus eucariotas no citopáticos en los que los genes no esenciales han sido reemplazados por el gen de interés. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus, el ciclo de vida de los cuales inplica la transcripción inversa del ARN viral genómico en ADN con integración proviral subsiguiente en el ADN celular hospedante. Los retrovirus han sido aprobados para ensayos de terapia génica humana. Más útiles son los retrovirus que son deficiencias en replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Tales vectores de expresión retroviral alterados genéticamente tienen una utilidad general para la transducción de alta eficiencia de los genes in vivo. Los protocolos estándar para producir retrovirus deficientes en replicación (incluyen las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, transfección de una célula empaquetadora alineada con el plásmido, la producción de los retrovirus recombinantes por la línea celular empaquetadora, colección de partículas virales a partir de medio de cultivo tisular, e infección de las células diana con partículas virales) se proporcionan en Kriegler, M., Gene Transfer and expression, A Laboratory Manual W. H. Freeman C.O., New York (1990) y Murry, E.J- Methods in Molecular Biology, vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey (1991).
Un virus preferido para ciertas aplicaciones es el virus adenoasociado, un virus ADN de doble hebra. El virus adenoasociado puede ser manipulado mediante ingeniería para que sea deficiente en replicación y que sea capaz de infectar un amplio intervalo de tipos celulares y especies. Tiene además ventajas tales como, estabilidad al calor y a disolventes lipídicos; elevada frecuencia de transducción en células de diversos linajes, incluyendo células hematopoyéticas; y una falta de inhibición por superinfección, permitiendo así múltiples series de transducciones. De modo documentado, el virus adenoasociado puede integrarse en ADN celular humano en una manera específica de sitio, minimizando de ese modo la posibilidad de mutagénesis insercional y variabilidad de expresión génica insertada característica de infección retroviral. Además, las infecciones por virus adenoasociados salvajes han sido seguidas en cultivo celular durante más de 100 pases en ausencia de presión selectiva, implicando que la integración genómica del virus adenoasociado es un evento relativamten estable. El virus adenoasociado puede también funcionar en una manera extracromosómica.
Otros vectores incluyen vectores plasmídicos. Los vectores plasmídicos han sido ampliamente descritos en la técnica y son bien conocidos para aquellos con experiencia en la técnica. Véase por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los últimos años, se ha encontrado que los vectores plasmídicos son particularmente ventajosos para suministrar genes a las células in vivo debido a su incapacidad de replicar dentro e integrarse en un genoma hospedante. Estos plásmidos, sin embargo, que tienen un promotor compatible con la célula hospedante, pueden expresar un péptido a partir de un gen operativamente codificado dentro del plásmidos. Algunos plásmidos usados generalmente incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40, y pBlueScript. Otros plásmidos son bien conocidos para aquellos con experiencia común en la técnica. Adicionalmente, los plásmidos pueden ser diseñados a medida usando enzimas de restricción y reacciones de ligación para eliminar y añadir fragmentos específicos de ADN.
Se ha descubierto recientemente que los plásmidos que llevan genes pueden ser suministrados al sistema inmune usando bacterias. Formas modificadas de bacterias tales como Salmonella pueden ser transfectadas con el plásmido y usadas para suministrar vehículos. Los vehículos suministrados por bacterias pueden ser administrados a un sujeto hospedante oralmente o mediante otros medios de administración. Las bacterias suministran el plásmido a las células inmunes, por ejemplo células B, células dendríticas, probablemente pasando a través de la barrera intestinal. Elevados niveles de protección inmune han sido establecidos usando esta metodología. Tales métodos de suministro son útiles para los aspectos del invento utilizando suministro sistémico del antígeno, ácidos nucleicos inmunoestimuladores y/u otros agentes terapéuticos.
Así, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son útiles como adyuvantes de vacunas. Se estableció previamente que los oligonucleótidos CpG son excelentes adyuvantes de vacunas. Se demostró también, sin embargo, que los ODN CpG, que son extraordinarios adyuvantes de vacunas en ratones no son adyuvantes preferidos en animales no roedores. Para identificar los mejores ácidos nucleicos inmunoestimuladores para usar como un adyuvante de vacuna en humanos y otros animales no roedores, se llevó a cabo para este propósito un cribado in vivo de diferentes ácidos nucleicos. Varios ensayos in vitro fueron evaluados en ratones para determinar su valor predictivo de la actividad adyuvante en ratones in vivo. Durante el transcurso de este estudio, un ensayo in vitro que es predictivo de eficacia in vivo fue identificado. Se descubrió, bastante sorprendentemente, que tanto la activación de las células B como de las células NK correlacionó particularmente bien con la capacidad de un ácido nucleico inmunoestimulador para potenciar una respuesta inmune in vivo frente a un antígeno.
El buen valor predictivo de activación de células B para una actividad adyuvante de vacuna in vivo está muy probablemente unido al papel central de las células B en el establecimiento de una respuesta inmune específica. La proliferación policlonal de células B (indicada por ácidos nucleicos inmunoestimuladores) aumenta la probabilidad de que un antígeno específico de células B/células T ayudantes encajen. Además, la expresión potenciada de la molécula coestimuladora CD86 en células B expandidas policlonalmente activa las células T ayudantes específicas de antígeno. Las células B también aumentan su expresión de CD40 en respuesta a ácidos nucleicos inmunoestimuladores mejorando la capacidad de las células T ayudantes activadas que expresan CD40L para estimular las células B. La síntesis aumentada de ICAM-1 en las células B facilita el contacto célula a célula. Así, el estado de activación de células B policlonales juega un papel crítico durante el inicio de una respuesta específica de anticuerpo.
La contribución de la actividad de células NK para el establecimiento de anticuerpos específicos fue, sin embargo, sorprendente. Las células NK son parte del sisteman inmune innato y como tales están implicadas en la primera línea de defensa frente a los patógenos. Más probable es que el patrón de citoquinas producido por las células NK tras activación esté íntimamente relacionado con el inicio de una respuesta inmune específica. Así, en un aspecto el invento se refiere a un método para identificar un adyuvante, mediante la detección de activación de células NK. El ensayo de activación de células NK pueden ser llevado a cabo como se describe en los Ejemplos a continuación o usando otros ensayos de actividad de células NK conocidos. Se prefiere, sin embargo que una población celular mixta tal como PBMC sea usada debido a la probabilidad de que la activación de células NK sea un efecto indirecto. El ensayo es preferiblemente útil para identificar ácidos nucleicos inmunoestimuladores que son útiles como adyuvantes en humanos y en otros animales no roedores.
La inducción de citoquinas fue también identificada como un predictor importante para la actividad adyuvante in vivo. Ya que hay una sensibilidad frente a endotoxinas 2 órdenes de magnitud superior en los monocitos primarios humanos que en los de ratón, alguna precaución sin embargo, es requerida para evitar la contaminación por endotoxinas de ácidos nucleicos inmunoestimuladores usados para ensayar en el sistema humano (Hartmann G., y Krieg A.M. 1999. Gene Therapy 6:893). Puesto que TNF-a, IL-6 e IL-12 son producidos por monocitos humanos en respuesta a cantidades aún menores de endotoxinas, su valor para ensayos de cribado in vitro de elevado rendimiento es limitado. Por otro lado, las células B y células NK humanas muestran sólo una activación mínima por endotoxina y así son más útiles para ensayar la actividad inmunoestimuladora.
La estimulación de la función celular en tanto células NK como células B (es decir, actividad lítica, proliferación) requiere un ácido nucleico inmuno-estimulador más fuerte que la inducción de los marcadores de activación en su superficie (CD69, CD86). Para ambos tipos celulares, el uso de marcadores de activación de superficie celular mostró un fondo inespecífico mayor atribuible al esqueleto fosforotioato comparado con los ensayos funcionales. Esta elevada sensibilidad de marcadores de superficie requiere el uso de concentraciones de ácidos nucleicos inmunoestimuladores para la discriminación óptima entre ácidos nucleicos inmuno-estimuladores de actividad similar. Así, el uso de marcadores de superficie permite la comparación de ácidos nucleicos inmunoestimuladores con una actividad débil, mientras que los ensayos funcionales son preferidos para comparar ácidos nucleicos inmunoestimuladores con elevada actividad. Nótese que las concentraciones de ácidos nucleicos inmunoestimuladores óptimas para estimular células B y células NK difiere. Mientras que 0,6 \mug/ml de ODN es ya máxima para estimular células B, la activación de células NK óptima puede requerir 0,6 \mug/ml de ODN. Tanto la activación de células B como la actividad funcional de células NK fue medida en PBMC recién aislados. Se encontró previamente que las células B primarias humanas altamente purificadas son activadas por ADN CpG. La existencia de un efecto directo de ADN CpG sobre las células NK es menos clara, y un mecanismo secundario mediado por otro tipo celular dentro de PBMC puede contribuir a la actividad funcional inducida por CpG de las células NK.
Los ácidos nucleicos del invento pueden ser administrados a un sujeto con un agente antimicrobiano. Un agente antimicrobiano, como se usa aquí, se refire a un compuesto presente de manera natural o sintético que es capaz de matar o inhibir a microorganismos infecciosos. El tipo de agente antimicrobiano útil según el invento dependerá del tipo de microorganismo con el que el sujeto está infectado o que tiene riesgo de ser infectado. Los agentes antimicrobianos incluyen pero no se limitan a agentes antibacterianos, agentes antivirales, agentes antifúngicos y agentes antiparasíticos. Frases tales como "agente antiinfeccioso", "agente antibacteriano", "agente antiviral", "agente antifúngico", "agente antiparasítico" y "parasiticida" tienen significados bien establecidos para aquellos con experiencia común el la técnica y están definidos en textos médicos estándar. Brevemente, los agentes antibacterianos matan o inhiben las bacterias, e incluyen antibióticos así como otros compuestos sintéticos o naturales que tienen funciones similares. Los antibióticos son moléculas de bajo peso molecular que son producidas como metabolitos secundarios por las células, tales como microorganismos. En general, los antibióticos interfieren con una o más funciones o estructuras bacterianas que son específicas para el microorganismo y que no están presentes en las células hospedantes. Los agentes antivirales pueden ser aislados a partir de fuentes naturales o sintetizados y son útiles para matar o inhibir virus. Los agentes antifúngicos son usados para tratar infecciónes fúngicas superficiales así como infecciones oportunistas o infecciones fúngicas sistémicas primarias. Los agentes antiparásitos matan o inhiben a los
parásitos.
Ejemplos de agentes antiparásitos, también referidos como parasiticidas útiles para la administración humana incluyen pero no se limitan a albendazol, anfotericina B, benznidazol, bitionol, cloroquina HCL, cloroquina fosfato, clindamicina, deshidroemetina, dietilcarbamazina, diloxánido furoato, eflornitina, furazolidaone, glucocorticoides, halofantrina, iodoquinol, ivermectina, mebendazol, mefloquina, meglumina antimoniato, melarsoprol, metrifonato, metronidazol, niclosamida, nifurtimox, oxamniquina, paromomicina, pentamidina isetionato, piperazina, praziquantel, primaquina fosfato, proguanil, pirantel pamoato, pirimetamina-sulfonamidas, pirimetamina, sulfadoxina, quinacrina HCl, quinina fosfato, quinidina gluconato, espiramicina, estibogluconato sódico (gluconato de antimonio sódico), suramina, tetraciclina, doxiciclina, tiabendazol, tinidazol, trimetoprim-sulfametoxazol, y triparsamida, algunos de los cuales se usan solos o en combinación con otros.
Los parasiticidas usados en sujetos no humanos incluyen piperazina, dietilcarbamazina, tiabendazol, fenbendazol, albendazol, oxfendazol, oxibendazol, febantel, levamisol, pirantel tartrato, pirantel pamoato, diclorvos, ivermectina, doramectic, milbemicin oxima, iprinomectina, moxidectina, cloruro de N-butilo, tolueno, higromicina B tiacetarsemida sódica, melarsomina, praziquantel, epsiprantel, benzimidazoles tales como fenbendazol, albendazol, oxfendazol, clorsulon, albendazole, amprolium; decoquinato, lasalocid, monesin sulfadimetoxina; sulfametazina, sulfaquinoxalina, metronidazol.
Parasiticidas usados en caballos incluyen mebendazol, oxfendazol, febantel, pirantel, diclorvos, trichlorfon, ivermectina, piperazina; para S. westeri: ivermectina, benzimidazoles tales como tiabendazol, cambendazol, oxibendazol y fembendazol. Los parasiticidas útiles en perros incluyen milbemicina oxina, ivermectina, pirantel pamoato y la combinación de ivermectina y pirantel. El tratamiento de parásitos en cerdos puede incluir el uso de levamisol, piperazina, pirantel, tiabendazol, diclorvos y fembendazol. En ovejas y cabras los agentes antihelmínticos incluyen levamisol o ivermectina. El Caparsolato ha mostrado alguna eficacia en el tratamiento de D. immitis (gusano del corazon) en
gatos.
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Los agentes antibacterianos matan o inhiben el crecimiento o la función de las bacterias. Una gran clase de agentes antibacteriano son los antibióticos. Los antibióticos, que son eficaces para matar o inhibir un amplio intervalo de bacterias, son referidos como antibióticos de amplio espectro. Otros tipo de antibióticos son predominantemente eficaces contra las bacterias de las clases gram-positiva o gram-negativa. Estos tipos de antibióticos son referidos como antibióticos de espectro estrecho. Otros antibióticos que son eficaces contra un organismo o enfermedad únicos y no contra otros tipos de bacterias, son referidos como antibióticos de espectro limitado. Los agentes antibacterianos son a veces clasificados basándose en su modo de acción primario. En general, los agentes antibacterianos son inhibidores de la síntesis de la pared celular, inhibidores de la membrana celular, inhibidores de la síntesis proteica, inhibidores de la síntesis o funcion de los ácidos nucleicos, e inhibidores competitivos.
Los agentes antibacterianos útiles en el invento incluyen pero no se limitan a penicilinas naturales, penicilinas semisintéticas, ácido clavulánico, cefalosporinas, bacitracina, ampicilina, carbenicilina, oxacilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina, meticilina, dicloxacilina, nafcilina, cefalocina, cefapirina, cefaliexina, cefamandole, cefaclor, cefazolina, cefuroxina, cefoxitina, cefotaxima, cefsulodina, cefetamet, cefixima, ceftriaxon, cefoperazona, ceftaxidina, moxalactama, carbapenems, imipenenms, monocatems, euztreonam, varicomicina, polimixina, anfotericina B, nistatina, imidazoles, clotrimazol, miconazol, cetoconazol, itraconazol, fluconazol, rifampinas, etambutol, tetracliclinas, cloramfenicol, macrólidos, aminoglicósidos, estreptomicina, kanamicina, tobramicina, amicacina, gentamicina, tetraciclina, minociclina, doxiciclina, clortetraciclina, eritromicina, roxitromicina, claritromicina, oleandomicina, azitromicina, cloranfenicol, quinolonas, co-trimoxazol, norfloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, ácido nalidíxico, temafloxacina, sulfonamidas, ganstrisina, y trimetoprim; Acedapsona; Acetosulfon sódico; Alamecina; Alexidina; amdinocilina; amdinocilin Pivoxil; Amiciclina; Amifloxacina; Amifloxacina Mesilato; Amicacina; Amicacin sulfato; ácidos aminosalicílico; Aminosalicilato sódico; Amoxicilina; Anfomicina; Ampicilina; Ampicilian sódica; Apalcilina sódica; Apramicina; Aspartocina; Astromicina sulfato; Avilamicina; Avoparcina; Azitromicina; Azlocilina; Azlocilina sódica; Hidrocloruro de Bacampicilina; Bacitracina; Bacitracina Metileno Disalicilato; Bacitracina de Zinc; Bambermicinas; Benzoilpas cálcico; Beritromicina; Betamicina sulfato; Biapenem; Biniramicina; Hidrocloruro de Bifenamina; Bispirition Magsulfex; Buticacina; Butirosin sulfato; capreomicina Sulfato; Carbadox; Carbenicilina Disódica; Carbenicilin Indanilo sódico; Carbenicilin fenil sódico; Carbenicilin potásico; Carumonam sódico; Cefaclor; Cefadoxil; Cefamandole; Cefamandol nafato; Cefamandol sódico; Cefaparol; Cefatrizina; Cefazaflur Sódico; Cefazolin; Cefazolin sódico; Defbuperazon; Cefdinir; Cefepime; hidrocloruro de Cefepime; Cefetecol; Cefixima; hidrocloruro de Cefmenoxima; Cefmetazol; Cefmetazol sódico; Cefonicid monosódico; Cefonicid sódico; Cefoperazon sódico; Ceforanida; Cefotaxima sódica; Cefotetan; Cefotetan disódico; Hidrocloruro de Cefotiam; Cefoxitina; Cefoxitina sódica; Cefpimizol; Cefpimizol sódico; Cefpiramida; Cefpiramida sódica; Cefpirom sulfato; Cefpodoxima proxetil; Cefprozil; Cefroxadina; Cefsulodin sódico; Ceftazidima; Ceftibuten; Ceftizoxima sódica; Ceftriazon sódico; Cefuroxima; Cefuroxima axetil; Cefuroxima Pivoxetil; Cefuroxima sódica; Cefacetrilo sódico; Cefalexina; Hidrocloruro de Cefalexima; Cefaloglicina; Cefaloridina; Cefalotina sódica; Cefapirina sódica; Cepradina; hidrocloruro de cetociclina; Cetofenicol; Cloranfenicol; Complejo Palmitato de Cloranfenicol; Succinato de cloranfenicol sódico; Fosfanilato de clorhexidina; Cloroxilenol; Bisulfato de clortetraciclina; hidrocloruro de tetraciclina; Cinoxacina; Ciprofloxacina; Hidrocloruro de Ciprofloxacina; Cirolemicina; Claritromicina; Hidrocloruro de Clinafloxacina; Clindamicina; Hidrocloruro de Clindamicina; Hidrocloruro de palmitato de Clindamicina; Fosfato de Clindamicina; Clofazimina; Cloxacilina Benzatine; Cloxacilina Sódica; Cloxiquina; Clistimetato sódico; Sulfato de Colistina; Coumermicina; Coumermicina sódica; Ciclacilina; Cicloserina; Dalfopristina; Dapsona; Daptomicina; Demeclociclina; Hidrocloruro de Demeclociclina; Demeciclina; Denofungina; Diaveridina; Dicloxacilina; Dicloxacilina sódica; Dihidrostreptomicina sulfato; Dipirition; Diritromicina; Doxiciclina; Doxiciclina cálcica; Doxiciclina fosfatex; Doxiciclina Hiclato; Droxacina sódica; Enoxacina; Epicilina; Hidrocloruro de Epitetraciclina; Eritromicina; Eritromicina Acistrato; Estolato de Eritromicina; Etilsuccinato de eritromicina; Gluceptato de eritromicina; Lactobionato de Eritromicina; Propionato de Eritromicina; Estearato de Eritromicina; Hidroclouro de Etambutol; Etionamida; Flexoracin; Floxacilina; Fludalanina; Flumequina; Fosfomicina; Fosfomicina Trometamina; Fumoxicilina; Cloruro de Furazolium; Tartrato de Furazolium; Fusidato sódico; Ácido fusídico; Gentamicina sulfato; Gloximonam; Gramicidina; Haloprogina; Hetacilina; Hetacilina potásica; Hexedina; Ibafloxacin; Imipenem; Isoconazol; Isepamicina; Isoniazid; Josamicina; Kanamicina sulfato; Kitasamicina; Levofuraltadone; Levopropilcilina potásica; Lexitromicina; Lincomicina; Hidrocloruro de Lincomicina; Lomefloxacina; Hidrocloruro de Lomefloxacina; Mesilato de Lomefloxacina; Loracarbef; Mafenide; Meclociclina; Sulfosalicilato de Meclociclina, Fosfato potásico de Megalomicina; Mequidox; Meropenem; Metaciclina; Hidrocloruro de Metaciclina; Metenamina; Hipurato de Metenamina; Mandeliato de Metenamina; Meticilina sódica; Metioprim; Hidrocloruro de Metronidazol; Metronidazol fosfato; Mezlocilina; Mezlocilina de sodio; Minociclina; Hidrocloruro de Minociclina; Hidrocloruro de Mirincamicina; Monensina; Monensina sódica; Nafcilina sódica; Nalidixato sódico; Ácido Nalidíxico; Natamicina; Nebramicina; Palmitato de Neomicina; Sulfato de Neomicina; Undecilenato de Neomicina; Sulfato de Netilmicina; Neutramicina; Nifuradeno; Nifuraldezona; Nifuratel; Nifuratrone; Nifurdazil; Nifurimida; Nifurpirinol; Nifurquinazol; Nifurtiazol; Niftrociclina; Nitrofurantoin; Nitromida; Norfloxacina; Novobiocina sódica; Ofloxacina; Ormetoprim; Oxacilina sódica; Oximonam; Oximonam sódico; Ácido Oxolínico; Oxitetraciclina; Oxitetraciclina cálcica; Hidrocloruro de Oxitetraciclina; Paldimicina; Paraclorofenol; Paulomicina; Pefloxacina; Mesilato de Pefloxacina; Penamecilina; penicilina G Benzatina; Penicilina G potáisca; Penicilina G procaina; Penicilina G sódica; Penicilina V; Penicilina V benzatina; Penicilina V Hidrabamina; Penicilina V potásica; Pentizidona sódica; Aminosalicilato de fenilo; Piperacilina sódica; Pirbenicilina sódica; Piridicilina sódica; Hidrocloruro de Pirlimicina; Hidrocloruro de Pivampicilina; Pamoato de Pivampicilina; Probenato de Pivampicilina; Polimixina B sulfato; Porfiromicina; Propikacina; Pirazinamida; Piritionato de Zinc; Acetato de Quindecamina; Quinupristina; Racefenicol; Ramoplanina; Ranimicina; Relomicina; Repromicina; Rifabutin; Rifametan; Rifaxemil; Rifamida; Rifampina; Rifapentina; Rifaximina; Rolitetraciclina; Nitrato de Rolitetraciclina; Rosaramicina; Butirato de Rosaramicina; Propionato de Rosaramicina; Fosfato sódico de Rosaramicina; Estearato de Rosaramicina; Rosoxacina; Roxarsona; Roxitromicina; Sanciclina; Sanfetrinem sódico; Sarmoxicilina; Sarpicilina; Escopafungina; Sisomicina; Sisomicina sulfato; Esparfloxacina; Hidrocloruro de Espectinomicina; Espiramicina; Cloruro de Estalimicina; Estefimicina; Estreptomicina sulfato; Estreptonicozid; Silfabenz; Sulfabenzamida; Sulfacetamida; Sulfacetamida sódica; Sulfacitina; Sulfadiazina; Sulfadiazina sódica; Sulfadoxina; Sulfaten; Sulfamerazina; Sulfameter; Sulfametrazina; Sulfametizol; Sulfametoxazol; Sulfa-menometoxina; Sulfamoxol; Sulfanilato de Zinc; Sulfanitran; Sulfasalizin; Sulfasomizol; Sulfatiazol; Sulfazamet; Sulfisoxazol; Sulfisoxazol Acetilo; Sulfisoxazol Diolamina; Sulfomixina; Sulopenem; Sultamicilina; Suncilin sódico; Hidrocloruro de Talampicilina; Teicoplanin; Hidrocloruro de Temafloxacina; Temocilina; Tetraciclina; Hidrocloruro de Tetracicilna; Complejo de tetraciclina fosfato; Tetroxoprim; Tianfenicol; Tifencilina potásica; Cresilato sódico de Ticarcilina; Ticarcilina disódica; Ticarcilina monosódica; Ticlaton; Cloruro de tiodonium; Tobramicina; Tobramicina sulfato; Tosufloxacina; Trimetoprim; Trimetoprim sulfato; Trisulfapirimidinas; Troleandomicina; Trospectomicina sulfato; Tirotricina; Vancomicina; Hidrocloruro de Vancomicina;
Virginiamicina; y Zorbamicina.
Los agentes antivirales son compuestos que impiden la infección de las células por virus o la replicación del virus dentro de la célula. Hay muchos menos fármacos antivirales que fármacos antibacterianos debido a que el proceso de replicación viral está tan íntimamente relacionada con la replicación del ADN dentro de la célula hospedante, que los agentes antivirales no específicos serían con frecuencia tóxicos para el hospedante. Hay varios estadíos dentro del proceso de infección viral que pueden ser bloqueados o inhibidos por agentes antivirales. Estos estadíos incluyen, unión del virus a la célula hospedante (inmunoglobulina o péptidos de unión), desenvoltura del virus (por ejemplo amantadina), síntesis o traducción del mARN viral (por ejemplo interferón), replicación del ARN o ADN viral (por ejemplo análogos nucleosídicos), maduración de nuevas proteínas víricas (por ejemplo inhibidores de proteasas), y gemación y liberación del virus.
Los análogos nucleotídicos son compuestos sintéticos que son similares a los nucleótidos, pero que tienen una desoxiribosa o un grupo ribosa incompletos o anormales. Una vez que los análogos nucleotídicos están en la célula, son fosforilados, produciendo el trifosfato formado que compite con los nucleótidos normales para la incorporación en el ADN o ARN viral. Una vez que la forma trifosfato del análogo nucleotídico se incorpora en la cadena del ácido nucleico en crecimiento, causa una asociación irreversible con la polimerasa viral y así la terminación de la cadena. Los análogos nucleotídicos incluyen, pero no se limitan a, aciclovir (usado para el tratamiento del virus del herpes simples y el virus varicela-zoster), ganciclovir (útil para el tratamiento del citomegalovirus), idoxuridina, ribavirina (útil para el tratamiento del virus sincitial respiratorio), didesoxiinosina, didesoxicitidina, y zidovudina (azidotimi-
dina).
Los interferones son citoquinas que son secretadas por células infectadas por virus así como células inmunes. Los interferones funcionan uniéndose a los receptores específicos sobre las células adyacentes a las células infectadas, causando el cambio en la célula que la protege frente a infecciones por el virus. El interferón \alpha y \beta también induce la expresión de las moléculas de Clase I y Clase II sobre la superficie de las células infectadas, dando como resultado una presentación antigénica aumentada para el reconocimiento de la célula inmune hospedante. Los interferones \alpha y \beta están disponibles como formas recombinantes y han sido usados para el tratamiento de la infección de la hepatitis B y C crónicas. En las dosificaciones que son eficaces para la terapia antiviral, los interferones tienen graves efectos secundarios como fiebre, malestar y pérdida de peso.
La terapia por inmunoglobulina es usada para la prevención de la infección viral. La terapia de la inmunoglobulina para las infecciones virales es diferente que las infecciones bacterianas, debido a que más que ser específica de antígeno, la terapia por inmunoglobulinas funciona uniéndose a viriones extracelulares e impide que se unan y entren en las células que son susceptibles a infección viral. La terapia es útil para la prevención de invecciones virales durante el período de tiempo que los anticuerpos estén presentes en el hospedante. En general hay dos tipos de terapias por inmunoglobulinas, una terapia por inmunoglobulinas y terapia por hiperinmunoglobulinas. Las terapias normales por inmunoglobulinas utilizan un producto de anticuerpos que se prepara a partir de suero de de sangre de donantes normales y mezclada. Este producto mezcla contiene concentraciones bajas de anticuerpos frente a un intervalo amplio de virus humanos, tales como hepatitis A, parvovirus, enterovirus (especialmente en neonatos). La terapia por hiperinmunoglobulina utiliza anticuerpos que se preparan a partir del suero de individuos que tienen concentraciones elevadas de un anticuerpo frente a un virus particular. Esos anticuerpos son después usados frente a un virus específico. Ejemplos de hiperinmuoglobulinas incluyen inmunoglobulinas zoster (útiles para la prevención de la varicela en niños y neonatos inmunocomprometidos), inmunoglobulinas de rabia humana (útiles en la profilaxis posterior a la exposición de un sujeto mordido por un animal rabioso), inmunoglobulinas de hepatitis B (útiles en la prevención del virus de la hepatitis B, especialmente en un sujeto expuesto al virus), e inmunoglobulinas RSV (útiles en el tratamiento de las infecciones del virus sincitial respiratorio).
Otro tipo de terapia de inmunoglobulinas es una inmunización activa. Esto implica la administración de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos frente a proteínas de la superficie viral. Dos tipos de vacunas que están disponibles para la inmunización activa de la hepatitis B incluyen anticuerpos de hepatitis B derivados de suero y anticuerpos de hepatitis B recombinante. Ambos están preparados a partir de HBsAg. Los anticuerpos son administrados en tres dosis a sujetos con elevado riesgo de infección con virus de hepatitis B, tales como trabajadores de cuidados sanitarios, parejas sexuales de portadores crónicos, y niños pequeños.
Así, los agentes antivirales útiles en el invento incluyen pero no se limitan a inmunoglobulinas, amantadin, interferón, análogos nucleotídicos, e inhibidores de proteasas. Ejemplos específicos de agentes antivirales incluyen pero no se limitan a Acemanan; Aciclovir; Aciclovir sódico; Adefovir; Alovudine; Alvircept Sudotox; Hidrocloruro de Amantadine, Aranotin; Arildone; mesilato de Atevirdine; Avridine; Cidofovir; Cipamfiline; Hidrocloruro de Citarabine; Mesilato de Delavirdine; Desciclovir; Didanosine; Disoxaril; Edoxudine; Enviradene; Enviroxime; Famciclovir; Hidrocloruro de Famotine; Fiacitabine; Fialuridine; Fosarilato; Foscarnet sódico; Fosfonet sódico; Ganciclovir; Ganciclovir sódico; Idoxuridina; Cetoxal; Lamivudine; Lobucavir; Hidrocloruro de Memotine; Metisazona; Nevirapine; Penciclovir; Pirodavir; Ribavirin;
Hidrocloruro de Rimantadine; Mesilato de Saquinavir;
Hidrocloruro de Somantadine; Sorivudine; Statolon; Stavudine; Hidrocloruro de Tiloron; Trifluridina; Hidrocloruro de Valaciclovir; Vidarabin; Vidarabin fosfato; Fosfato sódico de Vidarabin; Viroxime; Zalcitabine; Zidovudine; y Zinviroxime.
Los agentes antifúngicos son únicos para el tratamiento y prevención de hongos infecciosos. Los agentes antifúngicos se clasifican a veces por su mecanismo de acción. Algunos agentes antifúngicos funcionan como inhibidores de la pared celular inhibiendo la glucosa sintasa. Estos incluyen pero no se limitan a basiungin/ECB. Otros agentes antifúngicos funcionan desestabilizando la integridad de la membrana. Estos incluyen, pero no se limitan a, imidazoles, tales como clotrimazol, sertaconzol, fluconazo, itraconazol, cetoconazol, miconazol, y voriconacol, así como FK 463, anfotericina B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicina, UK 292, butenafina, y terbinafina. Otros agentes antifúngicos funcionan fraccionando la quitina (por ejemplo quitinasa) o mediante inmunosupresión (crema 501). Algunos ejemplos de agentes comercialmente disponibles se muestran en la Tabla B.
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TABLA B
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Así, los agentes antifúngicos útiles en el invento incluyen pero no se limitan a imidazoles, FK 463, anfotericina B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicina, UK 292, butenafina, quitinasa, crema 501, Acrisorcina; Ambruticina; Amorolfina, Anfotericina B; Azaconazo, Azaserina; Basifungina; Bifonazol; Hidrocloruro de Befenamina; Bispiritionato Magsulfex; Nitrato de Butoconazol; Undecilenato cálcico; Candicidina; Carbol-Fucsina; Clordantoina; Ciclopirox; Ciclopirox Olamina; Cilofungina; Cisconazol; Clotrimazol; Cuprimixina; Denofungina; Dipiritionato; Doconazol; Econazol; Nitrato de Econazol; Enilconazol; Nitrato de etonam; Nitrato de Fenticonazol; Filipin; Fluconazol; Flucitosina; Fungimicina; Griseofulvina; Hamicina; Isoconazol; Itraconazol; Kalafungina; Cetonazol; Lomofungina; Lydimicina; Mepartricina; Miconazol; Nitrato de Miconazol; Monensina; Monensina sódica; Hidrocloruro de Naftifina; Undecilato de Neomicina; Nifuratel; Nifurmerona; Hidrocloruro de Nitralamina; Nistatina; Ácido Octanoico; Nitrato de Orconazol; Nitrato de Oxiconazol; Hidrocloruro de Oxifungina; Hidrocloruro de Parconazol; Partricina; Yoduro potásico; Proclonol; Piritionato de Zinc; Pirrolnitrina; Rutamicina; Cloruro de Sanguinarium; Saperconazol; Escopafungina; Sulfuro de Selenio; Sinefungina; Nitrato de Sulconazol; Terbinafina; Terconazol; Thiram; Ticlatone; Tioconazol; Tolciclato; Tolindato; Tolnaftato; Triacetina; Triafungina; Ácido Undecilénico; Viridofulvina; Undecilenato de Zinc; e Hidrocloruro de Zinoconazol.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser combinados con otros agentes terapéuticos tales como adyuvantes para potenciar las respuestas inmunes. El ácido nucleico inmunoestimulador y otro agente terapéutico pueden ser administrados simultáneamente o secuencialmente. Cuando los otros agentes terapéuticos son administrados simultáneamente pueden ser administrados en la misma formulación o en formulaciones separadas, pero son administrados al mismo tiempo. Los otros agentes terapéuticos son administrados secuencialmente con otro y con un ácido nucleico inmunoestimulador, cuando la administración de los otros agentes terapéuticos y los ácidos nucleicos inmunoestimuladores están separados temporalmente. La separación en tiempo entre la administración de estos compuestos puede ser una cuestión de minutos o puede ser más larga. Otros agentes terapéuticos incluyen pero no se limitan a adyuvantes, citoquinas, anticuerpos, antígenos, etc.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son útiles como adyuvantes para inducir una respuesta inmune sistémica. Así, cada uno puede ser suministrado a un sujeto expuesto a un antígeno para producir una respuesta inmune potenciada al antígeno.
Además de los ácidos nucleicos inmunoestimuladores, las composiciones del invento pueden también ser administradas con adyuvantes que no son ácidos nucleicos. Un adyuvante que no es un ácido nucleico es cualquier molécula o compuesto excepto para los ácidos nucleicos inmunoestimuladores descritos aquí que pueden estimular la respuesta inmune humoral y/o celular. Los adyuvantes que no son ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, adyuvantes que crean un efecto depo, adyuvantes inmunoestimuladores, y adyuvantes que crean un efecto depo y estimulan el sistema inmune.
Un adyuvante que crea un efecto depo como se usa aquí es un adyuvante que causa que el antígeno sea liberado lentamente en el cuerpo, prolongando así la exposición de las células inmunes al antígeno. Esta clase de adyuvantes incluye pero no se limita a alumino (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato alumínico); o formulaciones basadas en emulsiones incluyendo aciete mineral, aceite no mineral, emulsiones de agua-en-aceite o aceite-en-agua-en-aceite tales como series Seppic ISA de adyuvantes Montanide (por ejemplo, Montanide ISA 720, AirLiquide, Paris, Francia); MF-59 (una emulsión de esqualeno-en-agua estabilizada con Span 85 y Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA; y PROVAX (una emulsión aceite-en-agua que contiene un detergente estabilizador y un agente de formación de micelas; IDEC, Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA).
Un adyuvante inmunoestimulador es un adyuvante que causa activación de una célula del sistema inmune. Puede, por ejemplo, causar que una célula inmune produzca y secrete citoquinas. Esta clase de adyuvante incluye pero no se limita a saponinas purificadas a partir de la corteza del arbol Q. Saponaria, tal como QS21 (un glicolípido que eluye en el pico 21 con el fraccionamiento HPLC; Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, MA); poli [di(carboxilatefenoxi)fosfaceno (polímero PCPP; Virus Research Institute, USA); derivados de lipopolisacáridos tales como lípido monofosforil A (MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), muramil dipéptido (MDP; Ribi) y treonil-miramil dipéptido (t-MDP; Ribi); OM-174 (un disacárido glucosamina relacionado con el lípido A; OM Pharma SA, Meyrin, Suiza); y el factor de elongación de Leishmania (una proteína de Leishmania purificada; Corixa Corporation, Seattle, WA).
Los adyuvantes que crean un efecto depo y estimulan el sistema inmune son aquellos compuestos que tienen ambas de las funciones anteriores identificadas. Esta clase de adyuvantes incluyen pero no se limita a ISCOMS (complejos inmunoestimuladores que contienen saponinas mixtas, lípidos y forman partículas del tamaño de un virus con poros que pueden portar el antígeno; CSL, Melbourne, Australia); SB-AS2 (sistema adyuvante # 2 SmithKline Beecham que es una emulsión aceite-en-agua que contiene MPL y QS21: SmithKline Beecham Biologicals [SBB], Rixensart, Bélgica); SB-AS4 (sistema adyuvante #4 SmithKline Beecham que contiene aluminia y MPL; SBB, Bélgica); copolímeros en bloque no iónicos que forman micelas tales como CRL 1005 (estas contienen una cadena lineal de polioxipropileno hidrofóbico flanqueado por cadenas de polioxietileno; Vaxcel, Inc., Norcross, GA); y Formulación adyuvante Syntex (SAF, una emulsión aceite-en-agua que contiene Tween 80 y copolímero en bloque no iónico; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, CO).
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son también útiles como adyuvantes de mucosas. Se ha descubierto previamente que tanto la inmunidad sistémica como mucosal están inducidas por la liberación mucosal de ácidos nucleicos CpG. La inmunidad sistémica inducida en respuesta a ácidos nucleicos CpG incluyó tanto respuestas humorales como mediadas por células frente a antígenos específicos que no fueron capaces de inducir una inmunidad sistémica cuando fueron administrados solos a la mucosa. Además, tanto los ácidos nucleicos CpG como la toxina colérica (CT), un adyuvante mucosal que induce una respuesta tipo Th2) indujeron CTL. Esto fue sorprendente puesto que con la inmunización sistémica, la presencia de anticuerpos tipo Th2 está normalmente asociada con una falta de CTL (Schirmbeck y otros, 1995). En base a los resultados presentados aquí, se espera que los ácidos nucleicos inmunoestimuladores funcionarán en una manera similar.
Adicionalmente, los ácidos nucleicos inmuno-estimuladores inducen una respuesta mucosal en sitios mucosales tanto locales (por ejemplo pulmón) como remotos (por ejemplo, tracto digestivo inferior). Niveles significativos de anticuerpos IgA son indicados en sitios mucosales distantes mediante ácidos nucleicos inmunoestimuladores. La CT está considerada generalmente como que es un adyuvante mucosal altamente eficaz. Como se ha documentado previamente (Snider 1995), la CT induce predominantemente anticuerpos de isotipo IgG1, que son indicativos de una respuesta tipo Th2. Por el contrario, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son más Th1 con anticuerpos predominantemente IgG2a, especialmente después de la inyección o cuando los dos adyuvantes se combinan. Los anticuerpos tipo Th1 en general tienen mejores capacidades neutralizadoras, y además, una respuesta Th2 en el pulmón no es nada deseable debido a que está asociada con el asma (Kay, 1996, Hogg, 1997). Así, el uso de ácidos nucleicos inmunoestimuladores como un adyuvante mucosal tiene beneficios que otros adyuvantes mucosales no pueden lograr. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores del invento son también útiles como adyuvantes mucosales para la inducción de una respuesta inmune tanto sistémica como mucosal.
Los adyuvantes mucosales referidos como adyuvantes mucosales que no son ácidos nucleicos pueden también ser administrados con los ácidos nucleicos inmunoestimuladores. Un adyuvante mucosal que no es ácido nucleico como se usa aquí es un adyuvante distinto de un ácido nucleico inmunoestimulador que es capaz de inducir una respuesta inmune mucosal en un sujeto cuando se administra a una superficie mucosal junto con un antígeno. Los adyuvantes mucosales incluyen pero no se limitan a toxinas bacterianas, por ejemplo, toxina colérica (CT), derivados de la CT incluyendo pero no se limitan a la subunidad B de TC (CTB)(Wu y otros, 1998, Tochikubo y otros, 1998); CTD53 (Val a Asp) (Fontana y otros, 1995); CTK97 (Val a Lys)(Fontana y otros, 1995); CTK104 (Tyr a Lys) (Fontana y otros 1995); CTK53/K63 (Val a Asp, ser a Lys) (Fontana y otros, 1995); CTH54 (Arg a His) (Fontana y otros, 1995); CTN107 (His a Asn)(Fontana y otros 1995); CTE114 (Ser a Glu)(Fontana y otros, 1995); CTE112K (Glu a Lys)(Yamamoto y otros, 1997a); CTS61F (Ser a Phe)(Yamamoto y otros, 1997a, 1997b); CTS106 (Pro a Lys) (Douce y otros, 1997, Fontana y otros 1995); y CTK63 (Ser a Lys)(Douce y otros, 1997, Fontana y otros, 1995), toxina Zonula occludens, zot, enterotoxina sensible al calor de Escherichia coli, Toxina lábil (LT), derivados de LT que incluyen pero no se limitan a la subunidad LTB (LTB) (Verweij y otros, 1998; LT7K (Arg a Lys)(Komase y otros, 1998, Douce y otros, 1995); LT61F (Ser a Phe)(Komase y otros 1998); LT112K (Glu a Lys)(Komase y otros, 1998); LT118E (Gly a Glu)(Komase y otros, 1998); LT146E (Arg a Glu)(Komase y otros, 1998); LT192G (Arg a gly) (Komase y otros, 1998); LTK 63 (Ser a Lys) Marchetti y otros, 1998, Douce y otros, 1997, 1998, Di Tommaso y otros, 1996); y LTR72 (Ala a Arg) (Giuliani y otros, 1998, toxina pertussis, PT (Lycke y otros, 1992, Spangler BD, 1992, Freytag y Clemments, 1998, Roberts y otros, 1995, Wilson y otros, 1995) incluyendo PT9K/129G (Roberts y otros, 1995, Cropley y otros, 1995); derivados de toxinas (véase a continuación) (Holmgren y otros, 1993, Verweij y otros, 1998, Rappuoli y otros, 1995, Freytag y Clements, 1999); Derivados del Lípido A (por ejemplo, lípido A monofosforilo, MPL) (Sasaki y otros, 1998, Vancott y otros, 1998; derivados del Dipéptido Muramilo (MDP)(Fukushima y otros 1996, Ogawa y otros, 1989, Michalek y otros, 1983, Morisaki y otros, 1983); proteinas de la membrana externa bacteriana (por ejemplo, proteína A de la superficie externa (OspA) lipoproteína de Borrelia burgdorferi, outer membrana protine of Neisseria meningitidis)(Marinaro y otros, 1999, Van de Verg y otros, 1996); emulsiones de aceite-en-agua (por ejemplo, MF59)(Barchfield y otros, 1999, Verschoor y otros, 1999, O'Hagan, 1998); sales de aluminio (Isaka y otros, 1998, 1999); y Saponinas (por ejemplo QS21) Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worster, MA (Sasaki y otros, 1998, MacNeal y otros, 1998), ISCOMS, MF-59 (una emulsión de esqualeno-en-agua estabilizada con Span 85 y Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA); las series Seppic ISA de adyuvantes Montánidos (por ejemplo Montanide ISE 720; AirLiquide, Paris, Francia); PROVAX (una emulsión de aceite-en-agua que contiene un detergente estabilizante y un agente formador de micelas; IDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA); Formulaciones adyuvantes Syntext (SAF; Syntex chemicals, Inc., Boulder, CO); poli[di(carboxilatofenoxi)fosfaceno(polímero PCPP; Virus Research Institute, USA) y factor de elongación de Leishmania (Corixa Corporation, Seattle, WA).
Las respuestas inmunes pueden también ser inducidas o aumentadas mediante la coadministración o expresión colineal de citoquinas (Bueler & Mulligan, 1996; Chow y otros, 1997; Geissler y otros, 1997; Iwasaki y otros, 1997; Kim y otros, 1997) o moléculas coestimuladoras B-7 (Iwasaki y otros, 1997; Tsuji y otros, 1997) con los ácidos nucleicos inmunoestimuladores. Las citoqinas pueden ser administradas directamente con ácidos nucleicos inmunoestimuladores o pueden ser administradas en la forma de un vector de ácidos nucleicos que codifica para la citoquina, tal que la citoquina se exprese in vivo. En una realización, la citoquina se administra en la forma de un vector de expresión plasmídico. El término citoquina se usa como un nombre genérico para un grupo diverso de proteínas solubles y péptidos que actúan como reguladores humorales a concentraciones de nano a picomolar y que, bien en condiciones normales o bien patológicas, modulan las actividades funcionales de células individuales y tejidos. Estas proteínas tambien median interaciones entre células directametne y regulan procesos que tienen lugar en el entorno extracelular. Ejemplos de citoquinas incluyen, pero no se limitan a IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, factor estimulador de formación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de formación de colonias de granulocitos (G-CSF), interferón-\gamma (\gamma-IFN), IFN-\alpha, factor de necrosis tumoral (TNF), TGF-\beta, ligando FLT-3, y ligando CD40.
Las citoquinas juegan un papel en dirigir la respuesta de las células T. Lás células T ayudantes (CD4+) orquestran la respuesta inmune de los mamíferos a través de la producción de factores solubles que actúan sobre otras células del sistema inmune, incluyendo otras células T. Las células T ayudantes CD4+ más maduras expresan uno de dos perfiles de citoquinas: Th1 o Th2. El subgrupo Th1 promueve hipersensibilidad del tipo retardada, inmunidad mediada por células, y la clase de inmunoglobulinas que cambian a IgG2a. El subgrupo de Th2 induce inmunidad humoral activando células B, promoviendo la producción de anticuerpos, e induciendo el cambio de clase a IgG1 e IgE. En algunas realizaciones, se prefiere que la citoquina sea una citoquina Th1.
Los ácidos nucleicos son también útiles para redirigir una respuesta inmune desde una respuesta inmune Th2 a una respuesta inmune Th1. La redirección de una respuesta inmune desde una respuesta inmune Th2 a una Th1 puede ser evaluada midiendo los niveles de citoquinas producidos en respuesta a ácidos nucleicos (por ejemplo, induciendo células monocíticas y otras células para producir citoquinas Th1, incluyendo IL-12, IFN-\gamma y GM-CSF). La redirección o reequilibrio de la respuesta inmune desde una respuesta Th2 a una Th1 es particularmente útil para el tratamiento o prevención del asma. Por ejemplo, una cantidad eficaz para tratar el asma puede ser esa cantidad; útil para redirigir una respuesta inmune tipo Th2 que está asociada con asma a una respuesta de tipo Th1. Las citoquinas Th2, especialmente IL-4 e IL-5 están elevadas en las vías respiratorias de sujetos asmáticos. Estas citoquinas promueven importantes aspectos de la respuesta inflamatoria asmática, incluyendo el cambio de isotipo IgE, quimotaxis eosinofílica y activación y crecimiento de células mastocíticas. Las citoquinas Th1, especialmente IFN-g e IL-2, pueden suprimir la formación de clones Th2 y producción de citoquinas Th2. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores del invento causan un aumento en las citoquinas Th1 que ayuda a reequilibrar el sistema inmune, impidiendo o reduciendo los efectos adversos asociados con una respuesta inmune predominantemente Th2.
Los ácidos nucleicos son también útiles para mejorar la supervivencia, diferenciación, activación y maduración de las células dendríticas. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores tienen la capacidad única de promover la supervivencia celular, diferenciación, activación y maduración de las células dendríticas. Las células precursoras dendríticas aisladas de la sangre mediante separación celular inmunomagnética desarrollan características morfológicas y funcionales de células dendríticas durante una incubación de dos días con GM-CSF. Sin GM-CSF estás células sufren apoptosis. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son superiores a GM-CSF en promover superviviencia y diferenciación de células dendríticas (expresión de MHC II, tamaño celular, granularidad). Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores también inducen maduración de células dendríticas. Puesto que las células dendríticas forman la unión entre el sistema inmune innato y el adquirido, mediante la presentación de antígenos, así como a través de su expresión de receptores de reconocimiento de patrones, que detectan moléculas microbianas como LPS en su entorno local, la capacidad para activar células dendríticas con ácidos nucleicos inmunoestimuladores apoyan el uso de estas estrategias basadas en ácidos nucleicos inmunoestimuladores para una inmunoterapia in vivo y ex vivo contra transtornos tales como cáncer y enfermedades alérgicas o infecciosas. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son también útiles para activar e inducir la maduración de células dendríticas.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores también aumentan la actividad lítica de las células asesinas naturales y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). La ADCC puede ser realizada usando un ácido nucleico inmunoestimulador en combinación con un anticuerpo específico para una diana celular, tal como una célula cancerígena. Cuando el ácido nucleico inmunoestimulador es administrado a un sujeto junto con el anticuerpo, el sistema inmune del sujeto es inducido a matar a la célula tumoral. Los anticuerpo útiles en el procedimiento de ADCC incluyen anticuerpos que interaccionan con una célula en el cuerpo. Muchos de tales anticuerpos específicos para dianas celulares han sido descritos en la técnica y muchos están disponibles comercialmente. Ejemplos de estos anticuerpos están listados a continuación entre la lista de inmunoterapias del cáncer.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden también ser administrados junto con una terapia anticáncer. Las terapias anticáncer incluyen medicamentos para el cáncer, radiación y procedimientos quirúrgicos. Como se usa aquí, un "medicamento para el cáncer" se refiere a un agente que es administrado a un sujeto para el propósito de tratar un cáncer. Como se usa aquí, "tratar el cáncer" incluye impedir el desarrollo de un cáncer, reducir los síntomas del cáncer, y/o inhibir el crecimiento de un cáncer establecido. En otros aspectos, el medicamento para el cáncer es administrado a un sujeto con riesgo de desarrollar un cáncer con el propósito de reducir el riesgo de desarrollar el cáncer. Diversos tipos de medicamentos para el tratamiento del cáncer están descritos aquí. Para el propósito de esta especificación, los medicamentos del cáncer se clasifican como agentes quimoterapéuticos, agentes inmunoterapéuticos, vacunas para el cáncer, terapia hormonal, y modificadores de la respuesta inmune.
Como se usa aquí, un "medicamento para el cáncer" se refiere a un agente que se administra a un sujeto con el propósito de tratar un cáncer. Como se usa aquí, "tratar el cáncer" incluye prevenir el desarrollo de un cáncer, reducir los síntomas del cáncer, y/o inhibir el crecimiento de un cáncer establecido. En otros aspectos, el medicamento del cáncer es administrado a un sujeto con riesgo de desarrollar un cáncer para el propósito de reducir el riesgo de desarrollar el cáncer. Diversos tipos de medicamentos para el tratamiento del cáncer están descritos aquí. Para el propósito de esta especificación, los medicamentos para el cáncer se clasifican como agentes quimoterapéuticos, agentes inmunoterapéuticos, vacunas para el cáncer, terapia hormonal, y modificadores de la respuesta biológica. Adicionalmente, los métodos del invento se pretende que abarquen el uso de más de un medicamento para el cáncer junto con los ácidos nucleicos inmunoestimuladores. Como ejemplo, donde sea apropiado, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser administrados tanto con un agente quimoterapéutico como con un agente inmunoterapéutico. Alternativamente, el medicamento para el cáncer puede abarcar un agente inmunoterapéutico y una vacuna para el cáncer, o un agente quimoterapéutico y una vacuna para el cáncer, o un agente quimoterapéutico, un agente inmunoterapéutico y una vacuna para el cáncer, todos administrados a un sujeto con el propósito de tratar a un sujeto que tiene un cáncer o que tiene riesgo de desarrollar un cáncer.
Los medicamentos para el cáncer funcionan en una variedad de maneras. Algunos medicamentos para el cáncer funcionan dirigiéndose a mecanismos fisiológicos que son específicos de células tumorales. Ejemplos incluyen la dirección a genes específicos y sus productos génicos (es decir, proteínas principalmente) que están mutadas en cánceres. Tales genes incluyen pero no se limitan a oncogenes (por ejemplo Ras, Her2, bcl-2), genes supresores de tumores (por ejemplo, EGF, p53, Rb), y dianas de ciclo celular (por ejemplo, CDK4, p21, telomerasa). Los medicamentos para el cáncer pueden dirigirse alternativamente a rutas de transducción de señales y mecanismos moleculares que están alterados en células cancerígenas. La dirección a células cancerígenas vía los epítopos expresados en su superficie celular se lleva a cabo a través del uso de anticuerpos monoclonales. Este ultimo tipo de medicamentos para el cáncer está referido generalmente aquí como inmunoterapia.
Otros medicamentos para el cáncer van dirigidos a otras células que no son células cancerígenas. Por ejemplo, algunos medicamentos activan el sistema inmune para atacar las células tumorales (por ejemplo, vacunas para el cáncer). Aún otros medicamentos, llamados inhibidores de angiogénesis, funcionan atacando el suministro de sangre a tumores sólidos. Puesto que la mayoría de los cánceres malignos son capaces de metastatizar (es decir, existe el sitio tumoral primario y alcanza un sitio distante, formando de ese modo un tumor secundario), los medicamentos que impiden esta metástasis son también útiles en el tratamiento del cáncer. Los mediadores angiogénicos incluyen FGF básico, VEGF, angiopoyetinas, angiostatina, endostatina, TNFa, TNP-470, trombospondina-1, factor 4 de plaquetas, CAI, y ciertos miembros de la familia de proteínas integrinas. Una categoría de este tipo de medicamento es un inhibidor de metaloproteinasa, que inhibe las enzimas usadas por las células cancerígenas para existir en el sitio de tumor primario y extravasar a otro tejido.
Algunas células cancerígenas son antegénicas y así pueden ser dirigidas al sisteman inmune. En un aspecto, la administración combinada de ácidos nucleicos inmuno-estimuladores y medicamentos para el cáncer, particulamente aquellos que se clasifican como inmunoterapias para el cáncer, es útil para estimular una respuesta inmune específica frente a un antígeno cancerígeno. Un "antígeno cancerígeno" como se usa aquí es un compuesto, tal como un péptido, asociado con un tumor o superficie de célula cancerígena y que es capaz de provocar una respuesta inmune cuando se expresa en la superficie de una célula presentadora de antígeno en el contexto de una molécula MHC. Los antígenos cancerígenos, tales como los presentes en las vacunas para el cáncer o los usados para preparar inmunoterapias del cáncer, pueden ser preparados a partir de extractos de células cancerígenas en bruto, como se describe en Cohen, y otros, 1994, Cancer Research, 54:1055, o purificando parcialmente los antígenos, usando tecnología recombinante, o síntesis de novo de antígenos conocidos. Los antígenos cancerígenos, pueden ser usados en la forma de porciones inmunogénicas de un antígeno particular o en algunos casos una célula entera o una masa tumoral pueden ser usados como el antígeno. Tales antígenos pueden ser aislados o preparados de modo recombinante o mediante cualquier otro medio conocido en la técnica.
La teoría de la vigilancia inmune es que una función activada del sistema inmune es detectar y eliminar células neoplásicas antes de que formen un tumor. Un principio básico de esta teoría es que las células cancerígenas son antigénicamente diferentes de células normales y así generar reacciones inmunes que son similares a las que causan rechazo de aloinjertos inmunológicamente incompatibles. Los estudios han confirmado que las células tumorales difieren, tanto cualitativamente como cuantitativamente, en su expresión de antígenos. Por ejemplo, los "antígenos específicos tumorales" son antígenos que están asociados específicamente con células tumorales pero no con células normales. Ejemplos de antígenos específicos tumorales son los antígenos virales en tumores inducidos por virus ADN o ARN. Los antígenos "asociados a tumores" están presentes tanto en células tumorales como en células normales pero están presentes en una cantidad diferente o en una forma diferente en células tumorales. Ejemplos de tales antígenos son antígenos oncofetales (por ejemplo, antígenos carcinoembrionarios) antígenos de diferenciación (por ejemplo antígenos T y Tn), y productos oncogénicos (por ejemplo HER/neu).
Los diferentes tipos de células que pueden matar dianas tumorales in vitro e in vivo han sido identificados: células asesinas naturales (células NK), linfocitos T citolíticos (CTLs), células asesinas activadas por linfoquinas (LAKs), y macrófagos activados. Las células NK pueden matar células tumorales sin haber sido previamente sensibilizadas frente a antígenos específicos, y la actividad no requiere la presencia de antígenos de clase I codificados por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en células diana. Las células NK se piensa que participan en el control de tumores nacientes y en el control del crecimiento metastático. A diferencia de las células NK, los CTLs pueden matar células tumorales sólo después de que han sido sensibilizados frente a antígenos tumorales y cuando el antígeno diana está expresado en las células tumorales que también expresan MHC de clase I. Los CTLs se piensan que son células efectoras en el rechazo de tumores transplantados y de tumores causados por virus ADN. Las células LAK son un subgrupo de linfocitos afuncionales diferentes de las poblaciones NK y CTL. Los macrófagos activados pueden matar células tumorales en una manera que no es dependiente de antígeno ni restringidos a MHC una vez activados. Los macrófagos activados se puensa que disminuyen la velocidad de crecimiento de los tumores que infiltran. Ensayos in vitro han identificados otros mecanismos inmunes tales como dependientes de anticuerpos, reacciones citotóxicas mediadas por células y lisis por anticuerpos mas complemento. Sin embargo, estos mecanismos efectores inmunes se piensa que son menos importantes in vitro que la función de NK, CTLs, LAK, y macrófagos in vivo (para revisiones véase Piessens, W.F., y David, J., "Tumor Immunology", en: Scientific American Medicine, Vol. 2, Scientific American Books, N.Y., pp. 1-13, 1996.
El objetivo de la inmunoterapia es aumentar la respuesta inmune de un paciente frente a un tumor establecido. Un método de inmunoterapia incluye el uso de adyuvantes. Las sustancias adyuvantes derivadas de microorganismos, tales como el bacilo Calmette-Guerin, eleva la respuesta inmune y potencia la resistencia a tumores en animales.
Los agentes inmunoterapéuticos son medicamentos que se derivan de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a o reconocen específicamente un antígeno cancerígeno. Como se usa aquí un antígeno cancerígeno está ampliamente definido como un antígeno expresado por una célula cancerígena. Preferiblemente, el antígeno se expresa en la superficie celular de la célula cancerígena. Aún más preferiblemente, el antígeno es uno que no es expresado por células normales, o al menos no expresado a los mismos niveles que en las células cancerígenas. Las inmunoterapias basadas en anticuerpos pueden funcionar uniéndose a la superficie celular de una célula cancerígena y de ese modo estimular el sistema inmune endógeno para atacar a las células cancerígenas. Otra manera en la que la terapia basada en anticuerpos funciona es como un sistema de suministro para la dirección específica de sustancias tóxicas a células cancerígenas. Los anticuerpos se conjugan normalmente con toxinas tales como ricino (por ejemplo de semillas de ricino), caliqueamicina y maytansinoides, a isótopos radioactivos tales como Yodo-131 e Ytrio-90, a agentes quimoterapéuticos (como se describe aquí), o a modificadores de la respuesta biológica. De esta manera, las sustancias tóxicas pueden concentrarse en la región del cáncer y la toxicidad no específica a células normales puede ser minimizada. Además del uso de anticuerpos que son específicos para antígenos cancerígenos, los anticuerpos que se unen a la vasculatura, tales como los que se unen a las células endoteliales, son útiles en el invento. Esto es debido a que generalmente los tumores sólidos son dependientes de los vasos sanguíneos que se forman nuevos para sobrevivir, y así la mayoría de los tumores son capaces de agrupar y estimular el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Como resultado, una estrategia de muchos medicamentos para el cáncer es atacar la nutrición por los vasos sanguíneos del tumor y/o el tejido conectivo (o estroma) que apoyan tales vasos
sanguíneos.
El uso de ácidos nucleicos inmunoestimuladores junto con agentes inmunoterapéuticos tales como anticuerpos monoclonales es capaz de aumentar la supervivencia a largo plazo a través de un número de mecanismos incluyendo el potenciamiento significativo de ADCC (como se trató anteriormente), de la activación de las células asesinas naturales (NK) y un aumento en los niveles de IFN\alpha. Los ácidos nucleicos cuando se usan en combinación con anticuerpos monoclonales sirven para reducir la dosis de anticuerpo requerida para lograr un resultado biológico.
Ejemplos de inmunoterapias del cáncer que están siendo usadas actualmente o que están en desarrollo están listadas en la Tabla C.
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TABLA C
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31 
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Aún otros tipos de agentes quimioterapéuticos que pueden ser usados según el invento incluyen Aminoglutetimida, Asparaginasa, Busulfano, Carboplatino, Clorombucil, Citarabina HCl, Dactinomicina, Daunorubicina HCl, Estramustina fosfato sódico, Etopósido (VP16-213), Floxuridina, Fluorouracilo (5-FU), Flutamida, Hidroxiurea (hidroxicarbamida), Ifosfamida, Interferón Alfa-2a, Alfa-2b, Acetato Leuprólido (análogo del factor de liberación de LHRH), Lomustina (CCNU), Mecloroetamina HCl, (mostaza nitrogenada), Mercaptopurina, Mesna, Mitotane (o.p'-DDD), Mitoxantron HCl, Octreótido, Plicamicina, Procarbazina HCl, Estreptozocina, citrato de Tamoxifén, Tioguanina, Tiotepa, sulfato de Vinblastina, Amsacrina (m-AMSA), Azacitidina, Eritropoietina, Hexametilmelamina (HMM), Interleuquina 2, Mitoguazone (metil-GAG; metil glioxal bis-guanilhidrazona; MGBG), Pentostatina (2' deoxicoformicina), Semustina (metial-CCNU), Tenipósido (VM-26) y sulfato de Vindesina.
Las vacunas para el cáncer son medicamentos que se prentende que estimulen una respuesta inmune endógena contra las células cancerígenas. Las vacunas producidas actualmente activan predominantemente el sistema inmune humoral (es decir, la respuesta inmune dependiente de anticuerpo). Otras vacunas actualmente en desarrollo están enfocadas a activar el sistema inmune mediado por células incluyendo los linfocitos T citotóxicos que son capaces de matar las células tumorales. Las vacunas para el cáncer generalmente potencian la presentación de antígenos cancerígenos a ambas células presentadoras de antígeno (por ejemplo, macrófagos y células dendríticas) y/o a otras células inmunes tales como células T, células B, y células NK.
Aunque las vacunas para el cáncer pueden tomar una de varias formas, como se trata infra, su propósito es suministrar antígenos cancerígenos y/o antígenos asociados al cáncer a células presentadoras de antígenos (APC) para facilitar el procesamiento endógeno de tales antígenos por APC y la presentación final de la presentación antigénica sobre la superficie celular en el contexto de moléculas MHC de clase I. Una forma de vacunas para el cáncer es una vacuna de células enteras, que es una preparación de células cancerígenas que han sido retiradas de un sujeto, tratadas ex vivo y después reintroducidas como células enteras en el sujeto. Los lisados de células tumorales pueden también ser usados como vacunas para el cáncer para generar una respuesta inmune. Otra forma de vacuna para el cáncer es una vacuna peptídica que usa proteínas pequeñas específicas de cáncer o asociadas a cáncer para activar las células T. Las proteínas asociadas al cáncer son proteínas que no son expresadas exclusivamente por las células cancerígenas (es decir, otras células normales pueden aún expresar estos antígenos). Sin embargo, los niveles de expresión de antígenos asociados al cáncer están generalmente aumentados de modo consistente con cánceres de un tipo particular. Aún otra forma de vacuna para el cáncer es una vacuna de células dendríticas que incluyen células dendríticas enteras que han sido expuesta a un antígeno cancerígeno o a un antígeno asociado al cáncer in vitro. Los lisados o fracciones de membrana de células dendríticas pueden también ser usados como vacunas para el cáncer. Las vacunas de células dendríticas son capaces de activar las células presentadoras de antígeno directamente. Otras vacunas para el cáncer incluyen vacunas de gangliósidos, vacunas de proteínas de choque térmico, vacunas virales y bacterianas, y vacunas de ácidos nucleicos.
El uso de ácidos nucleicos inmunoestimuladores junto con vacunas para el cáncer proporciona una respuesta inmune humoral específica de antígeno y una respuesta inmune mediada por células, junto con la activación de células NK y células dendríticas endógenas, y niveles aumentados de IFN\alpha. Este potenciamiento permite una vacuna con una dosis de antígeno reducida para ser usada para lograr los mismos efectos beneficiosos. En algunos casos, las vacunas para el cáncer pueden ser usadas junto con adyuvantes, tales como los descritos anteriormente.
Como se usa aquí, los términos "antígeno cancerígeno" y "antígeno tumoral" son usados de modo intercambiable para referirse a antígenos que se expresan de modo diferencial por las células cancerígenas y que pueden de ese modo ser usadas para dirigirse a las células diana. Los antígenos cancerígenos son antígenos que pueden potencialmente estimular claramente respuestas inmunes específicas de tumores. Algunos de estos antígenos están codificados, aunque no necesariamente expresados, por células normales. Estos antígenos pueden ser caracterizados como aquellos que normalmente son silentes (es decir, no expresados) en células normales, aquellos que se expresan sólo en ciertos estadíos de diferenciación y aquellos que se expresan temporalmente tales como antígenos embrionarios y fetales. Otros antígenos cancerígenos están codificados por genes celulares mutantes, tales como oncogenes (por ejemplo, encogen ras activado), genes supresores (por ejemplo p53 mutante), proteínas de fusión que resultan de deleciones internas o translocaciones cromosómicas. Aún otros antígenos cancerígenos pueden ser codificados por genes virales tales como los llevados en los virus ARN o ADN tumorales.
Otras vacunas toman la forma de células dendríticas que han sido expuestas a antígenos cancerígenos in vitro, tienen procesados los antígenos y son capaces de expresar los antígenos cancerígenos en su superficie celular en el contexto de moléculas MHC para presentación antigénica eficaz a otras células del sistema inmune.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son usados en un aspecto del invento junto con vacunas cancerígenas que se basan en células dendríticas. Una célula dendrítica es una célula presentadora de antígeno profesional. Las células dendríticas forman la unión entre el sistema inmune innato y el adquirido mediante la presentación de antígenos y a través de su expresión de receptores de reconocimiento del patrón que detectan moléculas microbianas como LPS en su entorno local. Las células dendríticas internalizan eficazmente, procesan y presentan antígenos específicos solubles a los cuales están expuestas. El proceso de internalización y presentación antigénica causa un rápido aumento de los niveles de expresión del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y moléculas coestimuladoras, de la producción de citoquinas, y de la migración hacia órganos linfáticos donde se cree que están implicados en la activación de células T.
La tabla D lista una variedad de vacunas para el cáncer que o bien están siendo actualmente usadas o bien están en desarrollo
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TABLA D
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Como se usa aquí, los agentes quimioterapéuticos abarcan todas las otras formas de medicamentos para el cáncer que no caen en las categorías de agentes inmunoterapéuticos o vacunas para el cáncer. Los agentes quimoterapéuticos como se usan aquí abarcan tanto agentes químicos como biológicos. Estos agentes funcionan inhibiendo una actividad celular de la que dependen las células cancerígenas para seguir sobreviviendo. Las categorías de agentes quimoterapéuticos incluyen agentes alquilantes/alcaloides, antimetabolitos, hormonas o análogos de hormonas, y fármacos antineoplásicos variados. La mayoría sino todos estos agentes son directamente tóxicos para las células cancerígenas y no requieren la estimulación inmunológica. La combinación de quimoterapia y la administración de ácidos nucleicos inmunoestimuladores aumentan la dosis máxima tolerable de quimoterapia.
Los agentes quimoterapéuticos que están actualmente en desarrollo o en uso en un marco clínico se muestran en la Tabla E.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA E
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En una realización, los métodos del invento usan ácidos nucleicos innmunoestimuladores como reemplazo al uso de terapia por IFN\alpha en el tratamiento del cáncer. Actualmente, algunos protocolos de tratamiento exigen el uso de IFN\alpha. Puesto que el IFN\alpha es producido tras la administración de algunos ácidos nucleicos inmuno-estimuladores, estos ácidos nucleicos pueden ser usados para generar IFN\alpha endógenamente.
El invento también incluye un método para inducir una activación inmune innata no específica de antígeno y una resistencia de amplio espectro a desafíos infecciosos usando los ácidos nucleicos inmunestimuladores. El término activación inmune innata no específica de antígeno como se usa aquí se refiere a la activación de células inmunes distintas de las céluals B y por ejemplo pueden incluir la activación de células NK, células T u otras células inmunes que pueden responder en una manera independiente de antígeno o alguna combinación de estas células. Una resistencia de amplio espectro a desafíos infecciosos es inducida debido a que las células inmunes están en la forma activa y están activadas para responder a cualquier compuesto o microorganimo invasor. Las células no tienen que estar activadas específicamente frente a un antígeno en particular. Esto es particularmente útil en la guerra biológica, y las otras circunstancias descritas anteriormente tales como para los viajeros.
El índice de estimulación de una ácido nucleico inmunoestimulador particular puede ser ensayado en diversos ensayos de células inmunes. Preferiblemente, el índice de estimulación del ácido nucleico inmunoestimulador con respecto a la proliferación de células B es al menos alrededor de 5, preferiblemetne al menos alrededor de 10, más preferiblemente al menos alrededor de 15 y más preferiblemente al menos alrededor de 20 como se determina mediante la incorporación de ^{3}H uridina en un cultivo de células B murinas, que ha sido puesto en contacto con 20 \muM de ácido nucleico durante 20 h a 37ºC y ha sido marcado con 1 \muCi de ^{3}H uridina; y cultivado y contado 4 horas más tarde como se describe en detalle en las solicitudes de patente PCT publicadas PCT/US95/01570 (documento de patente WO 96/02555) y PCT/US97/19791 (documento de patente WO 98/18810) que reivindica prioridad a los números de serie norteamericanos 08/386, 063 y 08/960,774, archivados el 7 de Febrero de 1995, y el 30 de Octubre de 1997 respectivamente. Para usar in vivo, por ejemplo, es importante que los ácidos nucleicos inmunoestimuladores sean capaces de inducir eficazmente una respuesta inmune, tal como, por ejemplo, la producción de anticuerpos.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son eficaces en vertebrados no roedores. Diferentes ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden causar una estimulación inmune óptima dependiente del tipo de sujeto y la secuencia del ácido nucleico inmunoestimulador. Se ha encontrado que muchos vertebrados responden, según el invento, a la misma clase de ácidos nucleicos inmunoestimuladores. Los roedores, sin embargo, responden a diferentes ácidos nucleicos. Como se muestra aquí un ácido nucleico inmunoestimulador que causa una estimulación óptima en humanos puede no causar generalmente una estimulación óptima en un ratón y viceversa. Un ácido nucleico inmunoestimulador que causa una estimulación óptima en humanos causa generalmente, sin embargo, una estimulación óptima en otros animales tales como vacas, caballos, ovejas, etc. Una persona con experiencia en la técnica puede identificar las secuencias de ácidos nucleicos óptimas útiles para una especie en particular de interés usando ensayos rutinarios descritos aquí y/o conocidos en la técnica, usando la guía aportada aquí.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser administrados directamente al sujeto o pueden ser administrados junto con un complejo de suministro de ácidos nucleicos. Un complejo de suministro de ácidos nucleicos indicará que una molécula de ácidos nucleicos asociada con (por ejemplo una unión iónica o covalente a; o encapsulado en) un medio de dirección (por ejemplo una molécula que da como resultado una unión de mayor afinidad a células diana (por ejemplo, superficies de células B y/o una ingesta celular aumentada por células diana). Ejemplos de complejos de suministro de ácidos nucleicos incluyen ácidos nucleicos asociados con esteroles (por ejemplo, colesterol), un lípido (por ejemplo, un lípido catiónico, virosoma o liposoma), o un agente de unión específico para células diana (por ejemplo, un ligando reconocido por un receptor específico de células diana). Complejos preferidos pueden ser suficientemente estables in vivo para impedir un desacoplamiento significativo previo a la internalización por la célula diana. Sin embargo, el complejo puede ser cortado en condiciones apropiadas dentro de la célula de modo que el ácido nucleico sea liberado en una forma funcional.
Los vehículos de suministro o dispositivos de suministro para liberar antígenos y ácidos nucleicos a superficies han sido descritos. El ácido nucleico inmunoestimulador y/o el antígeno y/u otras terapias pueden ser administrados solos (por ejemplo en salino o tampón) o usando cualquier vehículo de suministro conocido en la técnica. Por ejemplo los siguientes vehículos de suministro han sido descritos: Cocleatos (Gould-Fogerite y otros, 1994, 1996); Emulsomas (Vancott y otros, 1998, Lowell y otros, 1997); ISCOMs (Mowat y otros, 1993, Carlsson y otros, 1991, Hu y otros, 1998, Morein y otros, 1999); Liposomas (childers y otros, 1999, Michalek y otros, 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); vectores bacterianos vivos (por ejemplo, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatte-guerin, Shigella, Lactobacillus)(Hone y otros, 1996, Pouwels y otros, 1998, Chatfield y otros, 1993, Stover y otros, 1991, Nugent y otros, 1998); vectores virales vivos (por ejemplo, Vacinnia, adenovirus, Herpes Simplex)(Gallichan y otros, 1993, 1995, Moss y otros, 1996, Nugent y otros, 1998, Flexner y otros, 1998, Morrow y otros, 1999); Microesferas (Gupta y otros, 1998, Jones y otros, 1996, Maloy y otros, 1994, Moore y otros, 1995, O'Hagan y otros, 1994, Eldrigde y otros, 1989); vacunas de ácidos nucleicos (Fynan y otros, 1993, Kuklin y otros, 1997, Sasaki y otros, Okada y otros, 1997, Ishii y otros, 1997); Polímeros (por ejemplo carboximetilcelulosa, chitosán) (Hamajina y otros, 1998, Jabbal-Gill y otros, 1998); anillos poliméricos (Wyatt y otros, 998); proteo-somas (Vancott y otros, 998, Lowell y otros, 1988, 1996, 1997); Fluoruro sódico (Hashi y otros, 1998); Plantas transgénicas (Tacket y otros, 1998, Mason y otros, 1998, Haq y otros, 1995); Virosomas (Gluck y otros, 1992, Mengiardi y otros, 1995, Cryz y otros, 1998); partículas tipo virales (Jiang y otros, 1999, Leibl y otros, 1998). Otros vehículos de liberación son conocidos en la técnica y algunos ejemplos adicionales se proporcionan a continuación en la discusión de los vectores.
El término cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulador se refiere a la cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulador para inducir la inmunidad mucosal es la cantidad necesaria para causar el desarrollo de IgA en respuesta a un antígeno tras la exposición al antígeno, mientras que la cantidad requerida para inducir la inmunidad sistémica es la cantida necesaria para causar el desarrollo de IgG en respuesta a un antígeno tras la exposición al antígeno. En combinación con las enseñanzas proporcionadas aquí, eligiendo entre los diversos compuestos activos y sopesando factores tales como potencia, biodisponibilidad relativa, peso corporal del paciente, gravedad de los efectos secundarios adversos y modo de administración preferido, un profiláctico eficaz o régimen de tratamiento terapéutico puede ser planeado, el cual no cause una toxicidad sustancial y aún sea enteramente eficaz para tratar el sujeto en particular. La cantidad eficaz para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de tales factores como la enfermedad o estado a ser tratado, el ácido nucleico inmunoestimulador que es administrado, el antígeno, el tamaño del sujeto, o la gravedad de la enfermedad o estado. Una persona con experiencia común en la técnica puede determinar de modo empírico la cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulador y/o antígeno y/o agente terapéutico sin necesitar una experimentación indebida.
Las dosis a los sujetos de los compuestos descritos aquí para liberación mucosal o local oscilan típicamente desde alrededor de 0,1 \mug a 10 mg por administración, que dependiendo de la aplicación podrían ser dados diariamente, semanalmente, o mensualmente y cualquier otra cantidad de tiempo intermedia. Las dosis mucosales o locales más típicas oscilan desde alrededor de 10 \mug a 5 mg por administración, y más típicamente desde alrededor de 100 \mug a 1 mg, 2-4 administraciones espaciadas con días o semanas de diferencia. Más típicamente, las dosis inmuno-estimuladoras oscilan desde 1 \mug a 10 mg por administración, y más típicamente 10 \mug a 1 mg, con administraciones diarias o semanales. Las dosis a los sujetos de los compuestos descritos aquí para el suministro parenteral para el propósito de inducir una respuesta inmune específica de antígeno, en la que los compuesto se suministran con un antígeno pero no con ningún otro agente terapéutico son típicamente de 5 a 10.000 veces superiores a la dosis mucosal eficaz para adyuvante de vacunas o aplicaciones inmunoestimuladoras, y más típicamente de 10 a 1000 veces superior, y más típicamente de 20 a 100 veces superior. Las dosis de los compuestos descritos aquí para el suministro parenteral para el propósito de inducir una respuesta inmune innata o para aumentar el ADCC o para inducir una respuesta inmune específica de antígeno cuando los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son administrados en combinación con otros agentes terapéuticos o en vehículos de liberación especializados oscilan típicamente desde alrededor de 0,1 \mug a 10 mg por administración, que dependiendo de la aplicación podrían ser dados diariamente, semanalmente, o mensualmente y cualquier otra cantidad de tiempo intermedia. Las dosis parenterales más típicas para estos propósitos oscilan desde alrededor de 10 \mug a 5 mg por administración, y más típicamente desde alrededor de 100 \mug a 1 mg, siendo de 2-4 administraciones espaciadas con días o semanas de diferencia. En algunas realizaciones, sin embargo, las dosis parenterales para estos propósitos pueden ser usadas en un intervalo de 5 a 10000 veces superior que las dosis típicas descritas anteriormente.
Para cualquier compuesto descrito aquí la cantidad terapéuticamente eficaz puede ser determinada inicialmente a partir de modelos animales. Una dosis terapéuticamente eficaz puede también ser determinada a partir de datos humanos para oligonucleótidos CpG que han sido ensayados en humanos (se han iniciado ensayos clínicos en humanos) y para compuestos que se conoce que exhiben actividades farmacológicas similares, tales como otros adyuvantes de mucosas, por ejemplo, LT y otros antígenos para propósitos de vacunación, para la administración mucosal o local. Se requieren dosis más altas para administración parenteral. La dosis aplicada puede ser ajustada en base a la biodisponibilidad y potencia relativas de los compuestos administrados. El ajuste de la dosis para lograr una eficacia máxima en base a los métodos descritos anteriormente y otros métodos como los bien conocidos en la técnica están dentro de las capacidades de un profesional con experiencia común en la técnica.
Las formulaciones del invento son administradas en disoluciones aceptables farmacéuticamente, que pueden contener de modo rutinario concentraciones farmacéutica-mente aceptables de sal, agentes de tamponamiento, conservantes, vehículos compatibles, adyuvantes, y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.
Para usar en terapia, una cantidad eficaz del ácido nucleico inmunoestimulador puede ser administrada a un sujeto por cualquier modo que suministre el ácido nucleico a la superficie deseada, por ejemplo, mucosal, sistémica. La administración de la composición farmacéutica del presente invento puede ser llevada a cabo mediante cualquier método conocido por el profesional experto. Las rutas preferidas de administración incluyen pero no se limitan a administración oral, parenteral, intramuscular, intranasal, intratraqueal, inhalación, ocular, vaginal, y rectal.
Para administración oral, los compuestos (es decir, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores, antígenos y otros agentes terapéuticos) pueden ser formulados fácilmente combinando el compuesto(s) activo(s) con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten que los compuestos del invento sean formulados como tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, y similares, para ingestión oral para un sujeto que va a ser tratado. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse como excipiente sólido, moliendo opcionalmente una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir sustancias auxiliares, si se desea, para obtener núcleos de tabletas o grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenos tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, agentes desintegrantes pueden ser añadidos, tales como polivinilpirrolidona entrecruzada, agar, o ácido algínico o sal de la misma tal como alginato sódico. Opcionalmente las formulaciones orales pueden también ser formuladas en salino o tampones para neutralizar las condiciones ácidas internas o pueden ser administradas sin nungún vehículo.
Los núcleos de grageas son proporcionados con recubrimientos adecuados. Para este propósito, se pueden usar disoluciones de azúcar concentradas, que pueden opcionalmente contener goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilénglicol, y/o dióxido de titanio, disoluciones lacadas, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas disolventes. Tintes o pigmentos pueden ser añadidos a las tabletas o recubrimientos de grageas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden ser usadas oralmente incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos en mezcla con un relleno tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden ser disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Las microesferas formuladas para administración oral también pueden ser usadas. Tales microesferas han sido bien definidas en la técnica. Todas las formulaciones para administración oral deberían estar en las dosificaciones adecuadas para tal administra-
ción.
Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas en la manera convencional.
Para administración por inhalación, los compuestos para usar según el presente invento pueden ser suministrados convenientemente en la forma de una presentación en aerosol a partir de paquetes presurizados o en un nebulizador, con el uso del propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede ser determinada proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de por ejemplo gelatina para usar en un inhalador o inflador pueden ser formulados conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Los compuestos, cuando se desea suministrarlos sistémicamente, pueden ser formulados para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección en bolus o infusión contínua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en contenedores multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes formulatorios tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones de inyección oleosa adecuadas. Los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones para inyecciones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede también contener estabilizantes adecuados o agentes que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas.
Alternativamente, los compuestos activos pueden estar en forma en polvo para reconstituir con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.
Los compuestos pueden también estar formulados en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contengan bases supositorias básicas tales como mantequilla de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos pueden también estar formulados como preparaciones depósito. Tales formulaciones de larga duración pueden ser formuladas con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o en resinas de intercambio iónico, o como derivados muy poco solubles, por ejemplo, como una sal muy poco soluble.
Las composiciones farmacéuticas pueden también comprender vehículos o excipientes en fase sólida o gel adecuados. Ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen pero no se limitan a carbonato cálcico, fosfato cálcico, azúcares varios, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como polietilenglicoles.
Las formas de preparaciones farmacéuticas líquidas o sólidas adecuadas son, por ejemplo, disoluciones acuosas o salinas para inhalación, microencapsuladas, encocleadas, recubiertas con partículas de oro microscópicas, contenidas en liposomas, nebulizadores, aerosoles, precipitados para implantación en la piel, o secadas en un objeto en punta para ser introducidas mediante raspado en la piel. Las composiciones farmacéuticas también incluyen gránulos, polvos, tabletas, tabletas recubiertas, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gotas o preparaciones con liberación prolongada de compuestos activos, preparaciones en las que los excipientes y aditivos y/o sustancias auxiliares tales como desintegrantes, aglutinantes, agentes de recubrimiento, agentes de expansión, lubricantes, aromas, edulcorantes o solubilizantes son usados habitualmente como se describe anteriormente. Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para usar en una variedad de sistemas de liberación de fármacos. Para una breve revisión de los métodos para la liberación de fármacos, véase Langer, Science 249:1527-1533, 1990, que se incorpora aquí mediante referencia.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores y opcionalmente otras terapias y/o antígenos pueden ser administrados per se (sencillo) o en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Cuando se usan en medicina las sales deberían ser farmacéuticamente aceptables, pero las sales que nos son farmacéuticamente aceptables pueden ser usadas convenientemente para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. Tales sales incluyen, pero no se limitan a, las preparadas a partir de los siguientes ácidos: ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-toluensulfónico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftalen 2-sulfónico, y bencenosulfónico. También, tales sales pueden ser preparadas como sales alcalinometálicas o alcalinotérreas, tales como sales sódicas, potásicas, o cálcicas del grupo ácido carboxílico.
Los agentes tamponadores adecuados incluyen: ácido acético y una sal (1-2% p/v); ácido cítrico y una sal (1-3% p/v); ácido bórico y una sal (0,5-1,5% p/v); y ácido fosfórico y una sal (0,8-2% p/v). Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio (0,003-0,03% p/v); clorobutanol (0,3-0,9% p/v); parabenos (0,01-0,25% p/v) y timerosal (0,004-0,02% p/v).
Las composiciones farmacéuticas del invento contienen una cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulador y opcionalmente antígenos y/u otros agentes terapéuticos incluidos opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término vehículo farmacéuticamente aceptable significa uno o más rellenos sólidos o líquidos compatibles, diluyentes o sustancias encapsulantes que son adecuadas para la administración a un humano u otro animal vertebrado. El término vehículo indica un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que el ingrediente activo se combina para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de entremezclarse con los compuestos del presente invento, y entre sí, de manera tal que no hay interacción que perjudique la eficacia farmacéutica deseada.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores útiles en el invento pueden ser suministrados en mezclas con adyuvan-
te(s) adicional(es), otros agentes terapéuticos, o antígeno(s). Una mezcla puede consistir en varios adyuvantes además del ácido nucleico inmunoestimulador o varios antígenos u otros agentes terapéuticos.
Una variedad de rutas de administración están disponibles. El modo particular seleccionado dependerá, por supuesto, de los adyuvantes particulares o antígenos seleccionados, el estado a tratar en particular y la dosis requerida para una eficacia terapéutica. Los métodos de este invento, hablando de manera general, pueden ponerse en práctica usando cualquier modo de administración que sea aceptable médicamente, significando cualquier modo que produzca niveles eficaces de una respuesta inmune sin causar efectos adversos inaceptables clínicamente. Los modos de administración preferidos son tratados anteriormente.
Las composiciones pueden ser presentadas convenientemente en formas de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar los compuestos con un vehículo que consituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan asociando los compuestos uniforme- e íntimamente con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y después, si fuera necesario, dándole forma al producto. Las dosis unitarias líquidas son viales o ampollas. Las dosis unitarias sólidas son tabletas, cápsulas y supositorios. Para el tratamiento de un paciente, dependiendo de la actividad del compuesto, la manera de administración, el propósito de la inmunización (es decir, profiláctico o terapéutico), naturaleza y gravedad del trastorno, edad y peso corporal del paciente, diferentes dosis pueden ser necesarias. La administración de una dosis dada puede ser llevada a cabo tanto mediante una administración única en la forma de una dosis unitaria individual o también en varias dosis unitarias más pequeñas. La administración de múltiples dosis a intervalos específicos con semanas o meses de separación es normal para estimular las respuestas específicas de antígenos.
Otros sistemas de suministro pueden incluir sistemas de suministro de liberación a lo largo del tiempo, de liberación retardada o de liberación sostenida. Tales sistemas pueden evitar las administraciones repetidas de los compuestos, aumentando la conveniencia para el sujeto y el médico. Muchos tipos de sistemas de suministro de liberación están disponibles y son conocidos para aquellos con experiencia común en la técnica. Incluyen sistemas con base de polímeros tales como poli(lactálido-glicólido), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido polihidroxibutírico, y poli-anhídridos. Microcápsulas de los polímeros precedentes contienen fármacos que se describen en, por ejemplo, el documento de patente norteamericana 5.075.109. Los sistemas de suministro también incluyen sistemas no poliméricos que son: lípidos incluyendo esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono-di- y tr-iglicéridos; sistemas de liberación en hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; recubrimientos de cera; tabletas comprimidas usando aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fusionados; y similares. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a: (a) sistema erosional en el que un agente del invento es contenido en una forma dentro de una matriz tal como las descritas en los documentos de patentes norteamericanas Nºs: 4.452.775, 4.675.189, y 5.736.152, y (b) sistemas difusionales en los que un compuesto activo permea a una velocidad controlada a partir de un polímero tal como se describe en los documentos de patentes norteamericanas Nºs: 3.854.480, 5.133.974 y 5.407.686. Además, se pueden usar sistemas de suministro con un hardware basado en bombas, algunos de los cuales están adaptados para implanta-
ción.
El presente invento está además ilustrado mediante los siguientes Ejemplos, que de ningún modo deberían ser considerados como limitantes. El contenido entero de todas las referencias (incluyendo las referencias bibliográficas, artículos patentados, solicitudes de patentes publicadas, y solicitudes de patentes copendientes) citadas a través de esta solicitud son de este modo expresamente incorporadas mediante referencia.
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Ejemplos Materiales y Métodos
Oligodesoxinucleótidos: Los ODN nativos fosfodiéster y modificados con fosforotioato fueron adquiridos a partir de Operon Technologies (Alameda, CA) e Hibridon Specialty Products (Milford, MA). Los ODNs fueron ensayados en lo que respecta a endotoxinas usando el ensayo LAL (LAL-assay BioWhittaker, Walkersville, MD; límite de detección inferior 0,1 UE/ml). Para ensayos in vitro, los ODNs fueron diluídos en tampón TE (10 mM Tris, pH 7.0, EDTA 1 mM), y almacenados a -20ºC. Para el uso in vivo, los ODNs fueron diluidos en tampón salino fosfato (PBS 0,1 M, pH 7,3) y almacenados a 4ºC. Todas las diluciones fueron llevadas a cabo usando reactivos libres de pirógenos.
Aislamiento de PBMC humanos y cultivos celulares: Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron aisladas a partir de sangre periférica de voluntarios sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) como se describe (Hartmann y otros, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10). Las células fueron suspendidas en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10% (v/v) de FCS inactivado con calor (56ºC, 1h) (Hyclone, Logan, UT), 1,5 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de Estreptomicina (todo de Gibco BRL, Grand Island, NY) (medio completo). Las células (concentración final 1 x 10^{6} células/ml) fueron cultivadas en medio completo en un incubador humidificador de CO_{2} al 5% a 37ºC. ODN y LPS (a partir de Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) o anti-IgM fueron usados como estímulos. Para medidas de actividad lítica de células NK humanas, los PBMC fueron incubados a 5 x 10^{6}/pocillo en placas de 24 pocillos. Los cultivos fueron recogidos después de 24 horas, y las células fueron usadas como efectores en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr de 4 horas frente a células diana K562 como se ha descrito previamente (Ballas y otros, 1996 J. Immunol. 157:1840-1845). Para la proliferación de células B, se añadió 1 \muCi de ^{3}H timidina 18 horas antes de la recogida, y la cantidad de incorporación de ^{3}H timidina fue determinada mediante un contador de centelleo a día 5. Las desviaciones estándar de los pocillos triplicados fueron <5%.
Citometría de flujo en PBMC humanos: los antígenos de superficie en PBMC de primates fueron teñidos como se ha descrito previamente (Hartmann y otros, 1998 J. Pharmacol. Exp. Ther. 285:920-928). Los anticuerpos monoclonales para CD3 (UCHT1), CD14 (M5E2), CD19 (B43), CD56 (B159), CD69 (FN50) y CD86 (2331 [FUN-1]) fueron adquiridos de Pharmingen, San Diego, CA. IgG_{1},k (MOPC-21) e IgG_{2b},k (Hartmann y otros, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10) fueron usados como testigos para tinciones no específicas. Las células NK fueron identificadas mediante expresión de CD56 en células negativas para CD3, CD14 y CD19, mientras que las células B fueron identificadas mediante expresión de CD19. Los datos de citometría de flujo de 10000 células por muestra fueron adquiridas en un FACScan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). La disponibilidad de las células dentro de la ventana FSC/SSC usada para el análisis fue examinada mediante tinción de yoduro de propidio (2 \mug/ml) y se encontró que era superior al 98%. Los datos fueron analizados usando el programa informático Flowjo (versión 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA).
Resultados Ejemplo 1 La estimulación dependiente de CpG de células B humanas depende de la metilación y de la longitud del ODN
Los PBMC humanos fueron obtenidos a partir de donantes normales y cultivados durante cinco días a 2 x 10^{5} células/pocillo con las concentraciones indicadas de las secuencias ODN indicadas. Como se muestra en la Tabla F, los PBMCs humanos proliferan por encima del fondo cuando se cultivan con una variedad diferente de CpG ODN, pero también muestran alguna proliferación aún con el ODN que no contiene ningún motivos CpG. La importancia de los motivos CpG sin metilar en proporcionar una estimulación inmunológica óptima con estos ODN se demuestra por el hecho de que ODN 1840 (SEQ ID Nº. 83) induce 56.603 cuentas de incorporación de ^{3}H timidina mientras que los mismos ODN ricos en T con los motivos CpG metilados (no-CpG), 1979 (SEQ ID NO.222), induce una actividad inferior, aunque aún aumentada sobre el fondo (sólo 18.618 cuentas) a la misma concentración de 0,6 1 \mug/ml. La proliferación reducida a concentraciones de ODN superiores puede ser un artefacto de las células que se agotan en estas condiciones experimentales o que podrían reflejar alguna toxicidad de las concentraciones de ODN superiores. De modo interesante, ODN más cortos que contienen motivos CpG, tales como los 2015 y 2016 de 13-14 mers, son menos estimuladores pese al hecho de que su concentración molar sería en realidad mayor puesto que los ODNs son añadidos en base a la masa más que a la molaridad. Esto demuestra que la longitud de ODN puede también ser un determinante importante en los efectos inmunes del ODN. Un ODN no CpG pero ligeramente rico en T (alrededor de 30% T), 1982 (SEQ ID No. 225), causó sólo una pequeña cantidad de proliferación celular de fondo.
TABLA F
Concentración de oligos
ODN Nº 0,15 \mug/ml 0,6 \mug/ml 2\mug/ml
Solo células 648 837 799
1840 (SEQ ID Nº 83) 5744 56603 31787
2016 (SEQ ID Nº 256) 768 4607 20497
1979 (SEQ ID Nº 222) 971 18618 29246
1892 (SEQ ID Nº 135) 787 10078 22850
2010 (SEQ ID Nº 250) 849 20741 8054
2012 (SEQ ID Nº 252) 2586 62955 52462
2013 (SEQ ID Nº 253) 1043 47960 47231
2014 )SEQ ID Nº 254) 2700 50708 46625
2015 (SEQ ID Nº 255) 1059 23239 36119
Los números representan cpm de incorporación de ^{3}H timidina para cultivos de PBMCs humanos establecidos como se describen anteriormente.
Ejemplo 2 Activación dependiente de concentración de la actividad de células NK humanas con ODN ricos en timidina
Los PBMCs humanos fueron cultivados durante 24 horas con un panel de diferentes ODN CpG u ODN no CpG a dos diferentes concentraciones, y después ensayados en lo que se refiere a su capacidad para matar células diana de las NK como se describe previamente (Ballas y otros, 1996 J. Immunol. 157:1840-1845). La capacidad de matar se mide como unidades líticas, o U.L.. El donante humano usado en este experimento tiene un nivel de fondo de 3,69 U.L. que aumenta a 180,36 U.L. usando el testigo positivo, IL-2. Un oligo CpG, 2006 (SEQ ID Nº 246), indujo elevados niveles de función lítica NK a una concentración inferior de 0,6, y un nivel inferior a una concentración de 6.0. Sorprendentemente, un ODN rico en T en el que los motivos CPG de 2006 fueron metilados (ODN en 2117 (SEQ ID Nº 358)) o invertido a GpCs (ODN 2137 (SEQ ID Nº. 886) retuvieron una función inmunoestimuladora fuerte a las concentraciones de ODN más altas, como se muestra en la Tabla G. Estos efectos inmunoestimuladores dependientes de concentración no son una propiedad general del esqueleto fosforotioato puesto que los experimentos descritos a continuación demuestran que un ODN poli-A, es no estimulatorio por encima de los niveles de fondo anteriores. Se ve alguna estimulación con un ODN de 24 bases de longitud en la que todas las posiciones de las bases están al azar de modo que A, C, G, y T tendrán lugar con una frecuencia del 25% en cada una de las posiciones de las bases (ODN 2182 (SEQ ID Nº 432)). Sin embargo, el efecto estimulador de tal ODN de 24 bases está muy potenciado si es puro poli-T, en cuyo caso la estimulación también se observa a las concentraciones más bajas de 0,6 \mug/ml (ODN 2183 (SEQ ID Nº 433)). De hecho, la actividad estimuladora del ODN de SEQ ID Nº 433 a esta baja concentración es mayor que la de ningún otro ODN ensayado a esta baja concentración, aparte del ODN inmunoestimulador humano óptimo de SEQ EN Nº 246. De hecho, la concentración superior de ODN de SEQ ID Nº 433 estimuló más actividad NK que ningún otro ODN fosforotioaato excepto por el ODN CpG 2142 (SEQ ID Nº 890), que fue marginalmente superior. Si el contenido en G del ODN de SEQ ID Nº 246 es aumentado relativo al contenido en T por adición de más G, resultando así en una disminución de la proporción de nucleótidos T, el efecto inmunoestimulador de los ODN se reduce (véase ODN 2132 (SEQ ID Nº. 373)). Así, el contenido en T de un ODN es un determinante importante de su efecto inmunoestimulador. Aunque un ODN poli T es el más estimulador de los ODN no CpG, otras bases son también importantes en determinar el efecto inmunoestimulador de un ODN no CpG. El ODN 2131 (SEQ ID Nº 372), en el que ligeramente más de la mitad de las bases son T y en las que no hay Gs, es inmunoestimulador a una concentración de 6 \mug/ml pero tiene más actividad que otros ODN ricos en T. Si las 6 As en el ODN 2131 (SEQ ID Nº 372) son reemplazadas por 6 Gs, el efecto inmunoestimulador del ODN puede ser aumentado (véase ODN 2130
(SEQ ID Nº 371)).
TABLA G PBL humanos cultivados toda la noche con oligos
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Ejemplo 3 Inducción de la proliferación de células B por ODN no CpG ricos en T
Para evaluar la capacidad del ODN rico en T para activar la proliferación de células B, los PBMC humanos fueron teñidos con la tinción citoplásmica CSFE, fueron incubados durante cinco días con el ODN indicado, bien a 0,15 ó a 0,3 \mug/ml, y luego fueron analizados por citometría de flujo. Las células B fueron identificadas abriendo una ventana para las células positivas para el marcador de linaje CD19. El ODN CpG 2006 fue un inductor fuerte de proliferación de células B, y este efecto se redujo si los motivos CpG eran metilados o invertidos a GpC como se muestra en la Figura 1, en una concentración de ODN de 0,3 \mug/ml. La composición base del ODN parece ser importante en la determinación del efecto inmuno-estimulador. Reduciendo el contenido T de un ODN se reduce sustancialmente el efecto inmunoestimulador, como se ejemplifica por el ODN 2177 (SEQ ID Nº: 427) en el que 6 de las T presentes en el ODN 2137 (SEQ ID Nº: 886) se han cambiado a A, dando como resultado un efecto inmuno-estimulador bastante reducido. La importancia de las Ts en el efecto inmunoestimulador de un ODN se muestra también por comparación de ODN 2116 (SEQ ID Nº: 357) y 2181 (SEQ ID Nº: 431) que difiere en el extremo 3' del ODN. El ODN 2181, en el que el extremo 3' es poli T es más estimulador que el ODN 2116, en el que el extremo 3' es poli C, a pesar del hecho de que ambos ODN tienen un TCGTCG en el extremo 5'.
Ejemplo 4 Proliferación de células B inducidas por oligonucleótidos TG
Los efectos estimuladores de los motivos TG se muestran en la Figura 2. El ODN 2137 tiene la composición base idéntica al ODN 2006, pero los motivos CG han sido todos invertidos a GCs dando como resultado un ácido nucleico libre de CG. El ODN contiene sin embargo 6 dinucleótidos TG. En el ODN 2177, todos los dinucleótidos TG del ODN 2137 han sido cambiados a AG. Aunque el ODN 2177 contiene sólo 6 adeninas, es virtualmente no estimulador a una concentración de 0,2 \mug/ml. Para comparación, un ODN de 24 bases de longitud en el que cada posición es al azar para que sea cualquiera de las cuatro bases (ODN 2182) induce >12% de la proliferación de células B a una concentración de 0,2 \mug/ml. Estos resultados indican que los efectos estimuladores del ODN 2137 no son simplemente los de un esqueleto fosforotioato, sino que se refieren a la presencia de dinucleótidos TG.
Para determinar el efecto de variación del número de motivos dinucleótidos TG, se compararon el ODN 2200 y el ODN 2202, como se muestra en la Figura 2. Ambos ODN contienen 18 Ts y 6 Gs, pero en el ODN 2202 todos los de Gs son consecutivos, de manera que sólo hay un dinucleótido TG, mientras que en el ODN 2202, los Gs están separados como dinucleótidos GG a través del ODN de manera que hay tres TGs. El ODN 2202 es significativamente más estimulador que el ODN 2200, debido al modelo que al menos tres motivos TG en un ODN son requeridos para una actividad estimuladora óptima. Es probable que incluso niveles más altos de estimulación puedan ser alcanzados si los motivos TG han sido optimizados como se enseña aquí.
Ejemplo 5 Efectos de TTG versus motivos TTG
La Figura 3 muestra los resultados de los experimentos llevados a cabo para estudiar el contenido TG en términos de niveles relativos de Ts contra Gs, en lo que se refiere al efecto estimulador de un ODN. La Figura muestra que un ODN en el que todas las bases están al azar por ser bien T o G (ODN 2188 (SEQ ID Nº: 905)) no es estimulador a una concentración de 0,2 \mug/ml, al igual que un ODN en el que todas las bases están al azar por ser bien A ó G (ODN 2189 (SEQ ID Nº: 906)). Sin embargo, a una concentración más alta de 0,2 \mug/ml, el ODN 2188 T/G al azar es significativamente más estimulador. Este último nivel de estimulación es todavía menor que el que se produce con un ODN totalmente al azar (ODN 2182 (SEQ ID Nº: 432)). La más alta estimulación a bajas concentraciones se ve con un ODN en el que la mitad de las bases están fijadas a T y la otra mitad de las bases se ponen al azar para ser, bien T ó G (ODN 2190 (SEQ ID Nº: 907)). Puesto que cualquier otra base está fijada para ser T, no puede haber ningún motivo TG. Los datos en la Figura 3 muestran que el incremento del contenido TG de un ODN mejora su actividad estimuladora.
En aún otros experimentos, los resultados de los que no están aquí puestos en diagrama, el ODN 2190 (SEQ ID Nº: 907) exhibían una estimulación de actividad NK comparada con el ODN 2188 (SEQ ID Nº: 905) o el ODN 2189 (SEQ ID Nº 906).
Ejemplos 6-8
Introducción
Anteriormente, los autores demuestran que las secuencias Poli T son capaces de mejorar la estimulación de células B y NK. Aquí y a continuación investigan el efecto de una variedad de ODN no CpG ricos en T así como ODN poli C en lo que se refiere a su capacidad de estimular células B humanas, células NK y monocitos.
Materiales y métodos
Oligonucleótidos: Los ODN fosforotioato modificados fueron adquiridos a ARK Scientific GMBH (Darmstadt, Germany). Las secuencias usadas fueron: 1982: 5'-tccaggacttctctcaggtt-3' (SEQ ID Nº: 225), 2006:5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3' (SEQ ID Nº: 246), 2041:5'-ctggtctttctggtttttttctgg-3' (SEQ ID Nº: 282), 2117:5'-tzgtzgttttgtgtzgttttgtzgtt-3' (SEQ ID Nº: 358), 2137:5'-tgctgcttttgtgcttttgtgctt-3' (SEQ ID Nº: 886), 2183:5'-ttttttttttttttttttttt-3' (SEQ ID Nº: 433), 2194:5'-ttttttttttttttttttttttttttt-3' (SEQ ID Nº: 911), 2196:5'-tttttttttttttttttt-3' (SEQ ID Nº: 913), 5126:5'-ggttcttttggtccttgtct-3' (SEQ ID Nº: 1058), 5162:5'-tttttttttttttttttttttttttttttt-3' (SEQ ID Nº: 1094), 5163:5'-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3' (SEQ ID Nº: 1095), 5168:5'-cccccccccccccccccccccccccccccc-3' (SEQ ID Nº: 1096) y 5169:5'-cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcg-3' (SEQ ID Nº: 1097). La mayoría de los ODN fueron ensayados en lo que se refiere al contenido LPS usando el ensayo LAL (Bio Whittaker, Bélgica)(límite de detección inferior 0,1 UE/ml) también descrito aquí. Para todos los ensayos, los ODN fueron diluidos en tampones TE y almacenados a -20ºC. Todas las disoluciones fueron conducidas usando reactivos libres de pirógenos.
Preparación celular y cultivo celular: Los PBMC humanos fueron aislados de la sangre periférica de voluntarios sanos, obtenidos por medio de la Cruz Roja alemana (Ratingen, Alemania), como se describe en el Ejemplo 1 anterior, pero todos los materiales fueron comprados a Life Technologies, Germany y fueron ensayados en lo que se refiere a la presencia de endotoxinas. Para los ensayos de activación de células B, células NK y monocitos los PBMC fueron cultivados en un medio completo a una concentración de 2x10^{6} células/ml en 200 \mul en una placa de 96 pocillos de fondo redondo en una incubadora humidificada a 37ºC. Diferentes ODNs, LPS (Sigma) o IL-2 (R&D Systems, USA) fueron usados como estimuladores. En los puntos de tiempo indicados, las células fueron recogidas para citometría de flujo.
Citometría de flujo: los MAbs usados para teñir los antígenos de superficie fueron: CD3, CD14, CD19, CD56, CD69, CD80 y CD86 (todos obtenidos de Pharmingen/Becton Dickinson, Alemania). Para los monocitos los receptores Fc fueron bloqueados usando IgG humano (Myltenyi, Alemania) como se describe previamente (Bauer, M y otros 1999 Immunology 97:699). Los datos de citometría de flujo de al menos 1000 células de una subpopulación específica (células B, monocitos, células NK, células NKT o células T) fueron adquiridas en un FACSCalibur (Becton Dickinson). Los datos fueron analizados usando el programa CellQuest (Becton Dickinson).
Citotoxicidad mediada por NK: Los PBMC fueron cultivados durante la noche con o sin 6 \mug/ml de ODN o 100 U/ml de IL-2 a 37ºC, 5% CO_{2}. A la mañana siguiente, las células diana K-562 fueron marcadas con una tinción fluorescente, CFSE, como se describe previamente para las células humanas B (Hartmann, G., y A.M.Krieg. 2000 J. Immunol. 164:944). Los PBMC fueron añadidos en diferentes relaciones (50:1, 25:1 y 12,5:1) a las células diana 2x10^{5} e incubadas durante 4h a 37ºC. Las células fueron recogidas e incubadas con una tinción específica de ADN 7-AAD (Pharmingen) para la detección de células apoptóticas. Los resultados fueron medidos por citometría de flujo.
ELISA: Los PBMC (3x10^{6} células/ml) fueron cultivados con las concentraciones específicas de ODN o LPS durante 24h (IL-6, IFN© y TNF\alpha)u 8h (IL-1®) en una placa de microvaloración de 48 pocillos en una atmósfera humidificada a 37ºC. Los sobrenadantes fueron recogidos y las citoquinas fueron medidas usando kits ELISA OPTeia (Pharmingen) para IL-6, IFN© y TNF\alpha o un ensayo ELISA Elipair (Hoelzel, Alemania) para IL-1® según los protocolos de los fabricantes.
Ejemplo 6 Activación de células B inducida por ODNs que carecen de motivos CpG
En los experimentos descritos anteriormente en el ejemplo 3, los autores demuestran que los ODN ricos en T fueron capaces de activar las células B. Expanden estos estudios aquí usando ODN adicionales y diferentes células y fuentes de reactivos. En un primer grupo de experimentos, comparamos el potencial de activación de diferentes ODNs ricos en T no CpG con un conocido ODN 2006 CpG (SEQ ID Nº: 246) muy potente. Las PBMC (2x10^{6} células/ml) de un donante de sangre (n = 2) fueron incubadas con las concentaciones indicadas de ODNs 2006 (SEQ ID Nº: 246), 2117(SEQ ID Nº: 358), 2137 (SEQ ID Nº: 886), 5126 (SEQ ID Nº: 1058) y 5162 (SEQ ID Nº: 1094). Las células fueron incubadas durante 48h a 37ºC como se describe anteriormente y teñidas con mAb para CD19 (marcador de células B) y CD86 (marcador de activación de células B, B7-2). La expresión fue medida por citometría de flujo.
Usando diferentes concentraciones de ODNs, los autores mostraron (Fig. 4) que los ODNs ricos en T sin un motivo CpG, pueden inducir la estimulación de células B humanas. El ODN 5126 (SEQ ID Nº: 1058) que contiene sólo una secuencia simple poli T pero que es superior al 50% de T, produce niveles mayores de activación de células B humanas. Aunque hay algunas similitudes con la SEQ ID Nº: 246 (por ejemplo, más que el 80% del contenido T/G), este ODN carece claramente de cualquier motivo CpG inmunoestimulador conocido. Sorprendentemente, para todos los ODNs ensayados ricos en T, el índice estimulador más alto se obtuvo a concentraciones entre 3 y 10 \mug/ml. El índice estimulador más alto de los ODNs ensayados se consiguió por ODN CpG ricos en T SEQ ID Nº: 246 a 0,4 \mug/ml. Interesantemente, la actividad disminuyó a concentraciones altas.
Las secuencias Poli A, Poli C y Poli T fueron sintetizadas y ensayadas en lo que se refiere a la actividad biológica. Los PBMC (2x10^{6} células/ml) de un donante representativo (n = 3) fueron estimulados como se describe anteriormente por 0,4 \mug/ml, 1,0 \mug/ml o 10,0 \mug/ml de los siguientes ODNs: 2006 (SEQ ID Nº: 246), 2196 (SEQ ID Nº: 913)(Poli T, 18 bases), 2194 (SEQ ID Nº: 911) (Poli T, 27 bases), 5162 (SEQ ID Nº: 1094)(Poli T, 30 bases), 5163 (SEQ ID Nº: 1095)(Poli A, 30 bases), 5168 (SEQ ID Nº: 1096)(Poli C, 30 bases) y 5169 (SEQ ID Nº: 1097)(Poli CG, 30 bases). La expresión del marcador de activación CD86 (B7-2) en las células B CD19 positivas se midió por citometría de flujo.
La Figura 5 demuestra que la longitud de la secuencia, al menos para los ODNs Poli T, tiene un importante impacto en su actividad. Una secuencia Poli T que contiene sólo 18 bases (SEQ ID Nº: 913) resultó ser menos estimuladora que una con 27 bases (SEQ ID Nº: 911) o una con 30 bases (SEQ ID Nº: 1094) con un orden de estimulación claro SEQ ID Nº: 1094> SEQ ID Nº: 911> SEQ ID Nº: 913. Las secuencias Poli A (SEQ ID Nº: 1095) o Poli CG (SEQ ID Nº: 1097), por el contrario, no inducen la activación de células humanas B. Sorprendentemente, se descubrió también que las secuencias Poli C (SEQ ID Nº: 1096) pueden activar las células humanas B al menos a concentraciones altas (10 \mug/ml)(Fig. 5).
Dos otros ODNs ricos en T, especialmente 1982 (SEQ ID Nº: 225) y 2041 (SEQ ID Nº: 282) que carecen de motivos CpG fueron ensayados en lo que se refiere a sus efectos en células B humanas. Las PBMC (n = 2) fueron incubadas con las concentraciones indicadas de ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246), 1982 (SEQ ID Nº: 225) y 2041 (SEQ ID Nº: 282) como se describe anteriormente. La activación de células B (expresión del marcador de activación CD86) se midió por citometría de flujo.
La Fig. 6 muestra que los ODN no CpG ricos en T son inmunoestimuladores a concentraciones superiores a 1 \mug/ml. La incorporación de un motivo CpG en 1982 mejoró la actividad inmonoestimuladora. La prolongación con una secuencia Poli T no mejoró la actividad inmunoestimuladora del ya listo ODN rico en T sino que, más bien redujo ligeramente el potencial de activación.
Ejemplo 7 La inmunoestimulación de ODNs no CpG se refleja en la mejora de la activación NK, citotoxicidad NK y activación monocita
Las células NK, así como los monocitos, fueron ensayados por su respuesta a los ODNs no CpG. Los PBMC (2x10^{6} células/ml) fueron incubados con 6 \mug/ml de los siguientes ODNs (n = 4): 2006 (SEQ ID Nº: 246), 2117 (SEQ ID Nº: 358), 2137 (SEQ ID Nº: 886), 2183 (SEQ ID Nº: 433), 2194 (SEQ ID Nº: 911) y 5126 (SEQ ID Nº: 1058). Después de 24h de cultivo a 37ºC, las células fueron recogidas y teñidas con mAb para CD3 (marcador de célula T), CD56 (marcador de célula NK) y CD69 (marcador de activación temprana) como se describe anteriormente. La expresión de CD69 en células positivas NK CD56 se midió por citometría de flujo.
La Fig. 7 muestra que para los ODNs Poli T se pueden observar efectos similares como se describe en la Fig. 5. La estimulación de células NK, como las células B, puede ser influenciada por la longitud del ODN. El ODN 2183 (SEQ ID Nº: 433)(21 bases) indujo la activación de las células NK pero a una menor extensión que el ODN 2194 más largo (SEQ ID Nº: 911)(27 bases), como se midió por la expresión potenciada del marcador de activación temprano CD69. El ODN 5126 (SEQ ID Nº: 1058) demostró también activar las células humanas NK (Fig. 7).
Se cree que la actividad antitumoral de los ODNs CpG se puede evaluar mediante la capacidad del ODN de mejorar la citotoxicidad mediada por NK in vitro. Los ODNs que contienen en los extremos 5' y 3' extensiones de Poli G fueron mostrados por dar una muy alta inducción de citotoxicidad (Ballas, Z. K., y otros 1996 J. Immunol. 157:1840). Para investigar la influencia del ODN no CpG rico en T en la citotoxicidad NK, analizamos el efecto de los ODNs 2194 (SEQ ID Nº: 911) y 5126 (SEQ ID Nº: 1058) en la lisis mediada por NK (Fig. 8). La lisis mediada por NK de las células diana K-562 fue medida después de una incubación durante toda la noche de PBMC con 6 \mug/ml de los ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246), (SEQ ID Nº: 911) (Poli T, 27 bases) y 5126 (SEQ ID Nº: 1058) como se describe anteriormente. La secuencia SEQ ID Nº: 1058 demostró pequeños aumentos en la lisis por células humanas NK comparado con la ausencia de ODN. Las SEQ ID Nº: 911 y SEQ ID Nº: 246 potenciaron la citotoxicidad de las células humanas NK a una extensión incluso mayor.
Informes anteriores demostraron que no sólo las células NK sino que también las células NKT son mediadoras de las respuestas citotóxicas frente a células tumorales (14). Los autores, por tanto, buscaron el potencial de activación de células humanas NKT por ODN no CpG rico en T. Los PBMC de un donante representativo (n = 2) fueron incubados con 6 \mug/ml de ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246), 2117 (SEQ ID Nº: 358), 2137 (SEQ ID Nº: 886), 2183 (SEQ ID Nº: 433), 2194 (SEQ ID Nº: 913) y 5126 (SEQ ID Nº: 1058) durante 24h como se describe anteriormente. La activación de las células NKT se midió por citometría de flujo después de teñir las células con mAb para CD3 (marcador de células T), CD56 (marcador de células NK) y CD69 (marcador de activación temprana). Se muestra en la expresión de CD69 en CD3 y CD56 de células dobles positivas (células NKT).
En la Fig. 9, SEQ ID Nº: 911 así como la SEQ ID Nº: 1058 se encontró que estimulan las células NKT. Al igual que con las células NK la SEQ ID Nº: 911 (Poli T) fue más activa que la SEQ ID Nº: 1058. Además, como se describe anteriormente para las células B y las células NK, la longitud del ODN tiene alguna influencia en el potencial inmunoestimulador, con el ODN más largo, que tiene efectos más fuertes en las células NKT. Resultados similares se observaron para las células T humanas.
Otro tipo de células del sistema inmune implicadas en combatir las infecciones son los monocitos. Estas células liberarán tras activación una variedad de citoquinas y pueden madurar a las células dendríticas (DC), células que presentan un antígeno profesional (Roitt, I.,J. Brostoff, y D. Male. 1998. Immunology. Mosby, London). La Fig. 10 muestra la activación de monocitos humanos después del cultivo de PBMC con diferentes ODNs. Las PBMC (2x10^{6} células/ml) fueron incubadas con 6 \mug/ml 2006 (SEQ ID Nº: 246), 2117 (SEQ ID Nº: 358), 2137 (SEQ ID Nº: 886), 2178 (SEQ ID Nº: 1096), 2183 (SEQ ID Nº: 433), 2194 (SEQ ID Nº: 911), 5126 (SEQ ID Nº: 1058)y 5163 (SEQ ID Nº: 1095) durante la noche a 37ºC como se describe anteriormente (n = 3). Las células fueron recogidas y teñidas para CD14 (marcador de monocitos) y CD80 (B7-1, marcador de activación). La expresión se midió por citometría de flujo.
Como se demuestra anteriormente para las células NK y B, las secuencias ricas en T (por ejemplo, SEQ ID Nº: 433, SEQ ID Nº: 911) de diferente longitud inducen la estimulación de monocitos pero tienen diferentes niveles de actividad, por ejemplo, SEQ ID Nº: 433 > SEQ ID Nº: 911. Las secuencias Poli A (SEQ ID Nº: 1095), así como Poli C (SEQ ID Nº: 1096(2178)), por el contrario, no condujeron a la activación de monocitos (medidos mediante el aumento en los niveles de expresión de CD80 a una concentración de 6 \mug/ml de ODN).
Ejemplo 8 Inducción de la liberación de citoquinas por ODNs no CpG
A continuación se midió la capacidad de los diferentes ODNs ricos en T para influenciar el medio de citoquinas. Las PBMC (3x10^{6} células/ml) fueron cultivadas durante 24h con o sin 6 \mug/ml de los ODNs indicados o 1 \mug/ml de LPS como testigo positivo (n = 2). Después de la incubación fueron recogidos los sobrenadantes y el TNF\alpha medido mediante ELISA como se describe anteriormente y los resultados se muestran en la Fig. 11. Los PBMC fueron cultivados con los ODNs indicados (1,0 \mug/ml) como se describe en la Fig. 11 e IL-6 se midió en los sobrenadantes mediante ELISA y los resultados se muestran en la Fig. 12.
Las Fig. 11 y 12 demuestran que los ODNs no CpG ricos en T y los ODNs CpG ricos en T pueden inducir la secreción de las citoquinas pro-inflamatorias TNF\alpha e IL-6. Para ambas citoquinas, el ODN 5126 (SEQ ID Nº: 1058) se encontró en la mayoría de los ensayos que era tan potente como el ODN 2194 (SEQ ID Nº: 911). Es sabido que los ODNs CpG influyen el equilibrio Th1/Th2 induciendo preferiblemente las citoquinas Th1 (Krieg, A. M. 1999 Biochemica et Biophysica Acta 93321:1). Para ensayar si el ODN rico en T produjo un cambio similar en las citoquinas Th1, se midió la producción de IFN© en los PBMC. En un primer conjunto de experimentos, se demostró que, como se describe para IL-6 y TNF\alpha, los ODNs SEQ ID Nº: 1058 y SEQ ID Nº: 911 indujeron la liberación de cantidades comparables de esta citoquina Th1 IFN©. Además, se demostró que otra citoquina pro-inflamatoria, IL-1®, se liberó del cultivo de PBMC con estos dos ODNs. Aunque la cantidad de estas citoquinas inducidas por el ODN rico en T carentes de motivos CpG fue menor que cuando se usó el ODN CpG SEQ ID Nº: 246, las cantidades inducidas por el ODN rico en T fueron significativamente mayores que el testigo.
Ejemplos 9-11
Introducción
Un motivo CpG óptimo para la activación del sistema inmune en los vertebrados no roedores se describe aquí. Un oligonucleótido fosfodiéster que contiene este motivo se ha encontrado que estimula fuertemente la expresión de CD86, CD40, CD54 y MHC II, la síntesis de IL-6 y la proliferación de las células B humanas primarias. Estos efectos requieren la internalización del oligonucleótido y maduración endosomal. Este motivo CpG se asoció con la inducción sostenida del heterodímero NF_{k}B p50/p65 y del complejo del factor de transcripción de la proteína activadora 1 (AP-1). La activación de factores de transcripción por el ADN CpG fue precedida por la fosforilación aumentada de la quinasa activada por estrés c-jun NH_{2} terminal quinasa (JNK) y p38, y del factor de transcripción activador 2 (ATF-2). Al contrario que con el CpG, la señalización a través del receptor de célula B conduce a la activación de la quinasa del receptor extracelular (ERK) y a la fosforilación de una isoforma diferente de JNK.
Materiales y métodos
Oligodesoxinucleótidos: Los ODN no modificados (fotodiéster, PE) y modificados resistentes a las nucleasas (fosforotioato, PS) fueron adquiridos a Operon Tchnologies (Alameda, CA) y a Hybridon Specialty Products (Milford, MA). Las secuencias usadas se proporcionan en la Tabla H. El ADN de E. coli y ADN de timo de ternera fueron adquiridos a Sigma Chemical Co, St. Louis, MO. Las muestras de ADN genómico fueron purificadas mediante extracción con fenol-cloroformo-alcohol isoamilo (25/24/1) y precipitación con etanol. El ADN se purificó de endotoxinas mediante extracción repetida con tritón x-114 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y se ensayó en lo que se refiere a la presencia de endotoxinas usando el ensayo LAL (ensayo LAL Bio Whittaker, Walkersville, MD; límite de detección inferior 0,1 UE/ml) y el ensayo de alta sensibilidad para endotoxina descrito anteriormente (límite de detección inferior 0,0014 UE/ml)(Hartmann G., y Krieg A.M. 1999. El ADN CpG y el LPS inducen patrones de activación distintos en monocitos humanos. Gene Therapy 6:893). El contenido de endotoxina de las muestras de ADN estaba por debajo de 0,0014 U/ml. El ADN de E. coli y de timo de ternera fueron hechos hebras únicas antes de usarlos, hirviéndolos durante 10 minutos, seguidos de enfriamiento en hielo durante 5 minutos. Las muestras de ADN se disolvieron en tampones TE usando reactivos libres de pirógenos.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA H Panel de Oligonucleotido usado^{1}
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Preparación de células y cultivo de células: Las células mononucleares de sangre humana periférica fueron aisladas de la sangre periférica de voluntarios sanos por centrifugación de densidad de gradiente Ficoll-Paque (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) como se describe en (Hartmann G., y otros 1996 Antisense Nuclei Acid Drug Dev 6:291)). Las células fueron suspendidas en un medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10% (v/v) de FCS (HyClone, Logan, UT) inactivado por calor (56ºC, 1 h), L-glutamina 1,5 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina (todo de Gibco BRL, Grand Island, NY) (medio completo). Todos los compuestos fueron adquiridos ensayados en lo que se refiere a endotoxinas. La viabilidad se determinó antes y después de la incubación con ODN por exclusión de azul de tripan (microscopia convencional) o por exclusión de yoduro de propidio (análisis de citometría de flujo). En todos los experimentos, del 96% al 99% de los PBMC fueron viables. Las células (concentración final de 1x10^{6} células/ml) fueron cultivadas en un medio completo en un incubador humidificado con 5% de CO_{2} a 37ºC. Diferentes oligonucleótidos (véase la tabla I, la concentración es como se indica en las leyendas de la figura), LPS (de salmonela typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) o anti-IgM fueron usados como estímulo. Se usó cloroquina (5 \mug/ml; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) para bloquear la acidificación/maduración endosomal. En los puntos de tiempo indicados, las células fueron recogidas para citometría de flujo como se describe más adelante.
Para estudios de transducción de señal, las células B humanas primarias fueron aisladas mediante separación célular inmunomagnética usando la técnica VARIOMACS (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA) como se describe por el fabricante. Brevemente, los PBMC obtenidos a partir de "buffy coat" de donantes de sangre sanos (Elmer L. DeGowin Blood Center, Universidad de Iowa) fueron incubados con un anticuerpo conjugado a microesferas frente a CD19 y hechos pasar a través de una columna de selección positiva. La pureza de las células B fue mayor del 95%. Después de la estimulación, los extractos celulares completos (transferencia Western) y los extractos nucleares (EMSA) fueron preparados para estudios de transducción de señales.
Para los estudios de unión de CpG a las proteínas, las células Ramos (línea de células B de linfoma de Burkitt humano, ATCC CRL-1923 o CRL-1596; Intervirology 5:319-334, 1975) fueron cultivadas en un medio completo. Las células no tratadas fueron hechas crecer y los extractos de proteínas citosólicos fueron preparados y analizados en lo que se refiere a la presencia de proteínas de unión a oligonucleótidos CpG por EMSA y entrecruzamiento por UV como se describe más adelante.
Citometría de flujo: La tinción de los antígenos de superficie se realizó como se describe previamente (Hartmann G y otros 1998 J Pharmacol Exp Ther 285:920). Los anticuerpos monoclonales frente a HLA-DR fueron adquiridos a Immunotech, Marsella, Francia. Todos los demás anticuerpos fueron adquiridos a Pharmingen, San Diego, CA: mAbs frente a CD19 (B43), CD40 (5C3), CD54 (HA58), CD86 (2331 (FUN-1)). El IgG_{1},k (MOPC-21) e IgG_{2b},k fueron usados como testigos de tinción específica. La tinción de citoquinas intracelular para IL-6 se realizó como se describe (Hartmann G., y Krieg A.M.1999. El ADN CpG y LPS inducen patrones de activación distintos en monocitos humanos. Gene Therapy 6:893). Brevemente, los PBMC (concentración final 1x10^{6} células/ml) fueron incubados en presencia de bredelfina A (concentración final 1 \mug/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Después de la incubacion, las células fueron recogidas y teñidas usando un mAb marcado con FITC frente a CD19 (B43), un mAb de rata anti IL-6 humano marcado con PE (MQ2-6A3, Pharmingen) y el kit Fix and Perm (Laboratorios Caltag, Burlingame, CA). Los datos de la citometría de flujo de 5000 células por muestra fueron adquiridos en un FACScan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Las células no viables fueron excluidas del análisis por tinción de yoduro de propidio (2 \mug/ml). Los datos fueron analizados usando el programa informático FlowJo (versión 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA).
Ensayo de proliferación: el éster sucinimidilo diacetato de carboxifluoresceína CFSE (5-(y-6-), Molecular Probes, USA) es una marca fluorescente intracelular derivado de fluoresceína que se divide equitativamente entre las células hijas tras la división celular. La tinción de las células con CFSE permite tanto la cuantificación como el inmunofenotipado (anticuerpos marcados con ficoeritrina) de las células proliferantes en una mezcla de suspensión celular. Brevemente, los PBMC fueron lavados dos veces en PBS, resuspendidos en PBS que contenían CFSE a una concentración final de 5 \muM, e incubados a 37ºC durante 10 minutos. Las células fueron lavadas tres veces con PBS e incubadas durante cinco días como se indica en las leyendas de la figura. La proliferación de las células B CD19 positivas fueron identificadas por la disminución del contenido de CFSE usando citometría de flujo.
Preparación de extractos proteicos celulares completos, nucleares y citosólicos: para análisis de transferencia Western, se prepararon extractos celulares completos. Las células B primarias fueron tratadas con medio, los oligonucleotidos fosfodiéster 2080 (SEQ ID Nº: 321) o 2078 (SEQ ID Nº: 319) a 30 \mug/ml, o anti-IgM (10 \mug/ml). Las células fueron recogidas, lavadas dos veces con PBS enfriado en hielo, que contenía Na_{3}VO_{4} 1 mM, resuspendidas en tampón de lisis (NaCl150 mM, TRIS pH 7,4 10 mM, NP40 al 1%, Na_{3}VO_{4} 1 mM, NaF 50 mM, 30 mg/ml de leupeptina, 50 mg/ml de aprotinina, 5 mg/ml de antipaina, 5 mg/ml de pepstatina, 50 \mug/ml de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)), incubadas durante 15 min en hielo y centrifugadas a 14000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se congeló a -80ºC. Para la preparación de extractos nucleares, las células B primarias fueron resuspendidas en tampón hipotónico (HEPES/KOH 10 mM (pH 7,9), KCl 10 mM, NP40 al 0,05%, MgCl_{2}1,5 mM, ditiotreitol (DTT) 0,5 mM, PMSF 0,5 mM, 30 mg/ml de leupeptina, 50 mg/ml de aprotinina, 5 mg/ml de antipaina, 5 mg/ml de pepstatina). Después de 15 minutos de incubacion en hielo, la suspensión se centrifugó a 1000 x g durante 5 minutos. Los precipitados nucleares fueron resuspendidos en tampón de extracción (HEPES 20 mM (pH 7,9), NaCl 450 mM, NaF 50 mM, glicerol al 20%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, 30 mg/ml de leupeptina, 50 mg/ml de aprotinina, 5 mg/ml de antipaina, 5 mg/ml de pepstatina) e incubados en hielo durante una hora. La suspensión nuclear se centrifugó durante 10 minutos a 16.000 g a 4ºC. El sobrenadante se recogió y se almacenó a -80ºC. Los extractos citosólicos para los estudios de proteínas de unión CpG fueron preparados a partir de las células Ramos no estimuladas, que fueron lisadas con tampón hipotónico como se describe para la preparación del extracto nuclear. Después de la centrifugación, el sobrenadante se retiró como fracción citoplasmica y se almacenó a -80ºC. Las concentraciones de proteínas fueron medidas usando un ensayo de proteína Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) según el fabricante.
Análisis de transferencia Western: concentraciones iguales de extractos proteicos de células completas (25 \mug/carril) fueron hervidas en tampones de muestra SDS (Tris-Cl 50 mM, pH 6,8; 1% de ®-mercaptoetanol; 2% de SDS; 0,1% de azul de bromofenol; 10% de glicerol) durante 4 min antes de ser sometidas a electroforesis en gel poliacrilamida 10%, que contenía 0,1% SDS (SDS-PAGE). Después de la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a las membranas de transferencia P-inmobilon (Millipore Corp. Bedford, MA). Las membranas fueron bloqueadas con 5% de leche desnatada en polvo. Anticuerpos específicos contra la forma fosforilada de la quinasa del receptor extracelular (ERK), quinasa Terminal c-jun NH2 (JNK) y activación del factor 2 de transcripción (ATF-2) fueron usados (New England BioLabs, Beverly, MA). Las membranas fueron reveladas en reactivo quimiluminiscente potenciado (ECL; Amersham Internacional, Aylesbury, U.K.) según el procedimiento recomendado del fabricante.
Ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA): para detectar la actividad de unión al ADN del factor de transcripción de la proteína 1 activadora (AP-1) y NF\kappaB, los extractos nucleares (1 \mug/carril) fueron analizados por EMSA usando los dsODNs 5' GAT CTA GTG ATG AGT CAG CCG GAT C3' (SEQ ID Nº: 838) que contienen la secuencia de unión a AP-1, y el URE del NF\kappaB desde la región promotor c-myc 5' TGC AGG AAG TCC GGG TTT TCC CCA ACC CCC C3' (SEQ ID Nº: 1142), como sondas. Los ODNs fueron marcados en los extresmos con polinucleótido T4 quinasa (New England Biolabs) y (\gamma^{-32} P) ATP (Amersham, Arlington Heights, IL). Las reacciones de unión fueron realizadas con 1 \mug de extracto de proteína nuclear en un tampón de unión de ADN (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 40 mM MgCl_{2}, 20 mM EDTA, 1 mM de ditiotreitol, 8% de glicerol y 100-400 ng de poli (dI-dC) con 20,000-40,000 cpm de ODN marcado en 10 \mul del volumen total. La especificidad de las bandas NF\kappaB fue confirmada mediante los estudios de competición con oligonucleóticos fríos a partir de los sitios de unión del factor de transcripción no relacionados (10-100 ng). Para el ensayo de supermovilidad, 2 \mug de anticuerpos específicos para c-Rel, p50 y p65 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) fueron añadidos en la mezcla de la reacción durante 30 min antes de que la sonda radiomarcada fuera añadida. Tras una incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente se añadió el tampón de carga y las sondas fueron sometidas a electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% en tampón de electroforesis EDTA Tris-borato (Tris 90 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0). Los geles fueron secados y luego autoradiografiados.
Entrecruzamiento por UV y electroforesis de la proteína desnaturalizada: Los extractos nucleares fueron incubados con oligonucleótidos marcados con fosfodiéster como se describió para EMSA. Los complejos ADN-proteínas fueron entrecruzados con luz UV en un Stratalinker (Stratagene) durante 10 minutos. Las sondas fueron mezcladas con tampón de muestra-SDS, hervidas durante 10 minutos y cargadas en 7,5% de SDS-PAGE. El gel fue secado en papel Whatman y autoradiografiado. Representando la distancia frente al peso molecular de las proteínas marcadoras dió una curva estándar que se usó para calcular el peso molecular aproximado de los complejos ODN de proteína reticulada. El peso molecular del oligonucleótido se sustrajo a partir de este valor para dar el tamaño.
Ejemplo 9 Identificación de un motivo CpG óptimo para usar solo o en combinación con un ODN rico en T
Los oligonucleótidos fosforotioato que contienen el motivo CpG murino GACGTT (SEQ ID Nº: 1143) (por ejemplo 1826 (SEQ ID Nº: 69)) y usados en concentraciones que son activas en células B murinas (Yi A. K., Chang M., Peckham D. W., Krieg A. M., y Ashman R. F. 1998. CpG oligodeoxyribonucleotides rescue mature spleen B cells from spontaneous apoptosis and promote cell cycle entry. J Immunol 160:5898), han mostrado una actividad inmunoestimuladora pequeña o nula en las células inmunes humanas. A mayores concentraciones se demostró que este ODN demostraba algún efecto estimulador en las células humanas B.
En estudios anteriores en la activación de células B en ratones, se encontró que un dinucleótido CpG flanqueado por dos purinas en 5' y dos pirimidinas en 3' y preferiblemente el motivo de 6 mer 5' GACGTT 3' (SEQ ID Nº: 1143) fue óptimo para que un oligonucleótido fosfodiéster fuera activo (Krieg A. M., y otros 1995 Nature 374:546, Yi A. K., Chang M., y otros 1998 J Immunol 160:5898).
Para identificar un motivo óptimo para la estimulación de una respuesta inmune en humanos y no roedores vertebrados los autores diseñaron una serie de ODN y ensayaron su actividad. Primero diseñaron un oligonucleótido fosfodiéster de 20 mer con un dinucleótido TC en el extremo 5' precediendo al motivo CpG óptimo murino 5' GACGTT 3' (SEQ ID Nº: 1143) y seguido de una cola poli C (2079: 5' TCG ACG TTC CCC CCC CCC CC 3' (SEQ ID Nº: 320)). Este oligonucleótido si se añade a las células B primarias humanas en las mismas condiciones que se encontró que eran óptimas para el ADN de E.coli (adición repetida a 0 horas, 4 horas y 18 horas; 30 \mug/ml para cada punto de tiempo) estimuló altos niveles de expresión de CD86 en las células B primarias humanas después de dos días. Para determinar la relación estructura-función de los motivos CpG, los autores reemplazaron las bases adyacentes a los dinucleótidos CpG mientras que se mantuvieron los dos dinucleótidos CpG dentro de la secuencia. El cambio de la adenina situada entre ambos dinucleótidos CpG por la timidina (2080 (SEQ ID Nº: 321)) dio como resultado una actividad ligeramente mayor. El reemplazo por guanosina (2100 (SEQ ID Nº: 341)) o citidina (2082 (SEQ ID Nº: 323)) en esta posición no mostró mayores cambios comparado con 2079 (SEQ ID Nº: 320). Por el contrario, el reemplazo de la timidina 3' con respecto al segundo dinucleótido CpG por las purinas guanosina (2099 (SEQ ID Nº: 340)) o adenina (2083 (SEQ ID Nº: 324)) dio como resultado una mayor caída en la actividad del oligonucleótido, mientras que la pirimidina citidina causó sólo una disminución menor. La timidina inmediatamente 5' al primer dinucleótido CpG fue también importante. El reemplazo de la timidina por cualquier otra base (2105 (SEQ ID Nº: 346), guanosina; 2107 (SEQ ID Nº: 348), adenina; 2104 (SEQ ID Nº: 345), citidina) condujo a una disminución marcada en la actividad del oligonucleótido. La eliminación del primer (2108 (SEQ ID Nº: 349)) o del segundo (2106 (SEQ ID Nº: 347)) dinucleótido CpG redujo también parcialmente la actividad. La adición de más motivos CpG 5' GTCGTT 3' (SEQ ID Nº: 1144) al oligonucleótido fosfodiéster que contenía el motivo CpG dúplex de 8 mer (5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID Nº: 1145), 2080 (SEQ ID Nº: 321)) no potenció adicionalmente la expresión CD86 en las células B (2059 (SEQ ID Nº: 300)). Un oligonucleótido con la misma secuencia que el 2080 (SEQ ID Nº: 321) pero con un esqueleto fosforotioato no mostró actividad por encima del fondo (2116 (SEQ ID Nº: 357)). Esto ha sido sorprendente puesto que el esqueleto fosforotioato ha sido documentado que estabiliza ampliamente los oligonucleótidos y potencia la estimulación inducida CpG (Krieg A. M., Yi A.K., Matson S., Waldschmidt T. J., Bishop G. A., Teasdale R., Koretzky G. A., y Klinman D. M. 1995. Los motivos CpG en ADN bacterial disparan la activación directa de las células B. Nature 374:546). Los autores, sin embargo, realizaron análisis adicionales de estructura-función de los oligonucleótidos fosforotioato que contienen los motivos 5' GTCGTT 3' (SEQ ID Nº: 1144) y 5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID Nº: 1145) que mostraron que los motivos adicionales de CpG (2006 (SEQ ID Nº: 246)) tendían a aumentar la actividad de los oligonucleótidos fosforotioato.
Las células B purificadas aisladas de la sangre periférica mediante separación celular inmunomagnética fueron activadas por ADN CpG en la misma amplitud que las células B no purificadas dentro de los PBMC. Así, la activación de las células B es una respuesta primaria y no un efecto secundario causado por las citoquinas segregadas por otras células. Además de la molécula co-estimuladora CD86, el estadío funcional de las células B está caracterizado por otros marcadores de superficie. Por ejemplo, las células T ayudantes activadas estimulan las células B mediante unión a CD40, la molécula-1 de adhesión intracelular (ICAM-1, CD54) media la unión a otras células inmunes, y el complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC II) es responsable de la presentación del antígeno. Encontramos que la expresión de las células B de CD40, CD54 y MHC II fue aumentada de niveles por el oligonucleótido CpG 2080 (SEQ ID Nº: 321). El oligonucleótido testigo no CpG 2078 (SEQ ID Nº: 319) no mostró actividad comparado con medio solo.
Cuando los PBMC fueron incubados durante 5 días en presencia de 2080 (SEQ ID Nº: 321) (añadidos a 0 horas, 4 horas, 18 horas y cada mañana subsiguiente), fue interesante ver que una subpoblación de linfocitos aumentaron en tamaño celular y se volvieron más granulares (SSC). Para examinar si esta poblacióon representaba las células B proliferantes, los autores tiñeron PBMC recién aislados con CFSE éster (5-(y-6) carboxifluoresceín sucinimidil diacetato) a día 0 y lo incubamos durante 5 días con 2080 (SEQ ID Nº: 321) como anteriormente. La CFSE es una molécula fluorescente que se une irreversiblemente a las proteínas celulares. Cada división celular disminuye la tinción de CFSE al 50%. Las células con baja tinción con CFSE (células de proliferación) se encontró que eran principalmente células B positivas CD19. Los oligonucleótidos 2080 (SEQ ID Nº: 321) indujeron en un 60 a 70% la proliferación de las células B CD19 positivas durante 5 días. El oligonucleótido testigo 2078 (SEQ ID Nº: 319) indujo la proliferación en menos del 5% de las células B. Las células B proliferantes (CFSE bajo) mostraron un tamaño celular mayor (FSC) y una mayor granularidad.
Las células B proliferantes expresaron niveles mayores de CD86 que las células no proliferantes (no mostradas). De acuerdo con este descubrimiento, el panel oligonucleotídico ensayado anteriormente en lo que se refiere a la inducción de la expresión CD86 dio como resultado un patrón casi idéntico de proliferación de células B. El reemplazo de la timidina 3' redujo la actividad más que cambiar la timidina a la posición media.
Ejemplo 10 La activación de las células B requiere maduración/acidificación endosomal
Se ha demostrado previamente que la cloroquina, un inhibidor de la acidificación endosomal, bloquea la estimulación mediada por CpG de las células presentadoras de antígeno murinas, y células B, mientras que no influencia los efectos mediados por LPS (Hacker H., y otros 1998 Embo J 17:6230, Yi A. K. y otros 1998 J Immunol 160:4755, Macfarlane D. E., y Manzel L. 1998 J Immunol 160:1122). Encontramos que la adición de 5 \mug/ml de cloroquina bloqueó completamente la inducción mediada por ADN CpG de la expresión de CD86 en las células B primarias (MFI CD86:2006 (SEQ ID Nº: 246), 4,7 vs 1,4; ADN de E.coli, 3,4 vs. 1,4; medio único, 0,9; n = 4). Adicionalmente, la cloroquina inhibió completamente la inducción de la proliferación de las células B por el oligonucleótido fosforotioato 2006 (SEQ ID Nº: 246) medido con el ensayo de proliferación CFSE así como con el ensayo estándar. Estos resultados sugieren que al igual que con las células murinas, la activación de las células B humanas por ADN CpG requiere la ingesta del ADN en endosomas y la subsiguiente acidificación endosomal.
Ejemplo 11 Análisis de eventos subcelulares que resultan tras la estimulación de células B humanas con ODN humanos óptimos
Puesto que el requerimiento del motivo CpG para la activación máxima de células B es sustancialmente diferente entre ratones (GACGTT) (SEQ ID Nº: 1143) y humanos (TCGTCGTT) (SEQ ID Nº: 1145), los autores se interesaron en si los eventos de señalización intracelular básicos eran comparables. Una rápida inducción de la actividad de unión a NF\kappaB se ha encontrado anteriormente en células B murinas y macrófagos (Stacey K. J., y otros 1996 J Immunol 157:2116, Yi A. K y otros 1998 J Immunol 160:4755). Para investigar la respuesta de NF\kappaB al ADN CpG en humanos, las células B primarias humanas fueron aisladas de la sangre periférica mediante separación celular inmunomagnética e incubadas con el oligonucleótido 2080 CpG (SEQ ID Nº: 321), el oligonucleótido testigo 2078 no CpG (SEQ ID Nº: 319), o medio. En los puntos de tiempo indicados, las células fueron recogidas y los extractos nucleares preparados. En presencia del oligonucleótido CpG, la actividad de unión de NF\kappaB se incrementó en una hora y se mantuvo hasta 18 horas (último punto de tiempo examinado). El oligonucleótido testigo 2078 no CpG (SEQ ID Nº: 319) no mostró una actividad NF\kappaB potenciada comparado con las células incubadas con un medio único. La banda NF\kappaB se identificó por competición fría, y mostró que consistía en subunidades p50 y p65 por ensayos de superdesplazamiento.
El factor de trascripción de activación de la proteína 1 (AP-1) está implicado en la regulación de genes tempranos inmediatos y expresión de citoquinas (Karin M. 1995. The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem 270:16483). En las células B murinas, la actividad de unión AP-1 es inducida en respuesta al ADN CpG (Yi A. K., y Krieg A. M. 1998. Rapid induction of mitogen-activated protein kinases by immune stimulatory CpG DNA. J Immunol 161:4493). Para determinar si este factor de transcripción sería también inducido por ADN CpG en humanos, los autores examinaron la actividad de unión de AP-1 al ADN en las células B primarias humanas. Las células fueron incubadas con el oligonucleótido 2080 CpG (SEQ ID Nº: 321) o el oligonucleótido 2078 testigo (SEQ ID Nº: 319). Los extractos nucleares fueron preparados y la actividad de unión de AP-1 se analizó por EMSA. La actividad de unión AP-1 se potenció en una hora y se aumentó hasta 18 horas (último punto de tiempo examinado), mostrando una respuesta sostenida.
Puesto que la actividad AP-1 es inducida por muchos estímulos (Angel P., y Karin M. 1991. The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation. Biochim Biophys Acta 1072:129), los autores se interesaron en las rutas de transducción de señales aguas arriba de AP-1. El complejo del factor de transcripción AP-1 integra diferentes rutas de proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) (Karin M. 1995. The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem 270:16483). Las transferencias Western fueron realizadas usando extractos de células completas de las células B primarias incubadas con el oligonucleótido 2080 CpG (SEQ ID Nº: 321), el testigo 2078 (SEQ ID Nº: 319), o medio solo. Anticuerpos específicos para la forma fosforilada de JNK, p38, ATF-2 y ERK fueron usados. Una fuerte inducción de fosforilación de JNK se encontró 30 min y 60 min después de exposición al ADN CpG, mientras que el oligonucleótido no CpG no mostró actividad por encima del fondo. La proteína quinasa p38, otra proteína quinasa activada por estrés (SAPK), se fosforiló en respuesta al ADN CpG en 60 min. El ATF-2, un sustrato de ambos p38 y JNK (Gupta S., Campbell D., Derijard B., y Davis R. J. 1995. Transcription factor ATF2 regulation by the JNK signal transduction pathway. Science 267:389) y un componente del complejo AP-1, mostraron una débil fosforilación después de 30 min que aumentó después de 60 min. El ADN CpG no consiguió inducir la fosforilación sustancial de ERK. Por el contrario, el anti-IgM, que estimuló el receptor de células B, disparó la fosforilación de ERK. El anti-IgM activó diferentes isoformas de JNK que el ADN CpG.
Ejemplo 12 Ensayo para una actividad adyuvante in vivo
Se desarrolló un ensayo de cribado in vitro para identificar ODN útiles como un adyuvantes in vivo en humanos y otros animales no roedores. Puesto que se observaron diferencias no sólo cuantitativas sino también cualitativas en actividades de diferentes ODN CpG en ratones, se cribó primero un panel de ODN CpG y testigos no CpG en células de ratones para encontrar ensayos in vitro con una correlación fiable y fuerte a una actividad adyuvante in vivo con el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Después se ensayó sistemáticamente un panel de más de 250 ODN en ensayos humanos correspondientes para identificar secuencias con actividad inmuno-estimuladora in vitro. Luego se examinó si el ODN con la actividad más alta en estos ensayos humanos también activaba la proliferación de células B en chimpancés y monos y finalmente, si son activos como adyuvantes con HBsAg en chimpancés y monos cinomolgus in vivo. Estos estudios revelaron que la secuencia, número y espaciado de los motivos CpG individuales contribuyeron a la actividad inmunoestimulatoria de un ODN fosforotioato CpG. Un ODN con un dinucleótido TC en el extremo 5' seguido por tres motivos CpG de 6 mer (5'GTCGTT3') separados por dinucleótidos TT consistentemente mostraron la actividad máxima para leucocitos humanos, de chimpancés y de mono rhesus. Los chimpancés o monos vacunados una vez contra la hepatitis B con este ODN CpG adyuvante desarrollaron concentraciones de anticuerpos anti HBs 15 veces más altas que los que recibieron la vacuna sola.
Materiales y métodos
Oligodesoxinucleótidos: Los ODN fosforotioato modificados fueron adquiridos a Operon Technologies (Alameda, CA) e Hybridon Specialty Products (Milford, MA). Los ODN fueron ensayados en lo que se refiere a la presencia de endotoxina usando el ensayo LAL (ensayo LAL Bio Whittaker, Walkersville, MD; limite de detección inferior 0,1 UE/ml). Para los ensayos in vitro, los ODN fueron diluídos en tampón TE (Tris 10 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM), y almacenados a -20ºC. Para el uso in vivo, los ODN fueron diluídos en fosfato salino tamponado (PBS 0,1 M, pH 7,3) y almacenados a 4ºC. Todas las disoluciones se llevaron a cabo usando reactivos libres de pirógenos.
Cultivos de células de bazo de ratón: Los bazos fueron extraídos de hembras BALB/c de 6-12 semanas de vida (The Jackson Laboratory), 2x10^{6} esplenocitos fueron cultivados con 0,2 \muM de ODN durante 4 horas (TNF-\alpha) o 24 horas (IL-6, IFN-©, IL-12), y las citoquinas fueron detectadas por ELISA como se describe previamente (Yi A. K., Klinman D. M., Martin T. L., Matson S., y Krieg A. M. 1996. Rapid immune activation by CpG motifs in bacterial DNA. Systemic induction of IL-6 transcription through an antioxidant-sensitive pathway. J Immunol 157:5394). Para evaluar la proliferación de células B inducidas por CpG, las células de bazo fueron deplecionadas de células T con anti-Thy-1,2 y complemento y la centrifugación sobre lympholite M® (Cedarlane Laboratorios, Hornby, ON, Canadá), cultivados durante 44 horas con el ODN indicado, y después pulsadas durante 4 horas con 1 \muCi de timidina ^{3}H como se describe previamente (Krieg A. M., Yi A. K., Mattsson S., Waldschmidt T. J., Bishop G. A., Teasdale R., Koretzky G. A., y Klinman D. M. 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 374:546). Para examinar la actividad lítica de las células NK las células de bazo murinas fueron deplecionadas de células B usando bolas magnéticas revestidas con Ig de cabra anti ratón como se detalla previamente (Ballas Z. K., y Rasmussen W. 1993. Lymphokine-activated killer cells. VII. IL-4 induces an NK1,1^{+}CD8\alpha^{+}\beta^{-}TCR-\alpha\beta B220^{+} lymphokine-activated killer subset. J Immunol 150:17). Las células fueron cultivadas a 5x10^{6}/pocillo en placas de microvaloración de 24 pocillos y recogidas a las 18 horas para usar como células efectoras en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr de 4 horas frente a células diana YAC-1. Una unidad (UL) se definió como el número de células necesarias para efectuar un 30% de lisis específica.
Inmunización de ratones contra HBsAg y evaluación de la respuesta humoral: Grupos de ratones hembra BALB/c de 6-12 semanas de vida (n = 5 ó 10, Charles River, Montreal QC) fueron inmunizadas contra HBsAg como previamente se describe (Davis H. L., y otros 1998 J Immunol 160:870). Brevemente, cada ratón recibió una única inyección IM de 50 \mul de PBS que contenían 1 \mug de HBsAg recombinante (Medix Biotech, Foster City, CA) y 10 \mug de ODN CpG o de ODN no CpG como único adyuvante o combinado con aluminio (Alhydrogel "85", Superfos Biosector, Vedbaek, Dinamarca; 25 mg de Al^{3+}/mg HBsAg). Los ratones testigo fueron inmunizados con HBsAg sin adyuvante o con aluminio. El plasma fue recuperado de los ratones a diversos tiempos después de la inmunización y los Abs específicos para HBsAg (anti-HBs) fueron cuantificados mediante ensayo ELISA de disolución de punto final (en triplicado), como se describe previamente (Davis H.L. y otros 1998 J Immunol 160:870). Las concentraciones de punto final fueron definidas como las disoluciones de plasma más altas que resultaron en un valor de absorbancia (OD 450) dos veces superior al de plasma no inmune con un valor de corte de 0,05.
Aislamiento de PBMC de primate y cultivo celular: las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron aisladas de la sangre periférica de voluntarios sanos, chimpancés o monos rhesus o cinomolgus mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-hypaque (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) como se describe (Hartmann G., y otros 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:291). Las células fueron suspendidas en un medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con FCS 10% (v/v) inactivado por calor (56ºC, 1h) (HyClone, Logan, UT), L-glutamina 1,5 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina (todo de Gibco BRL, Grand Island, NY) (medio completo). Las células (concentración final de 1x10^{6} células/ml) fueron cultivadas en un medio completo en un incubador humidificado de 5% de CO_{2} a 37ºC. El ODN y LPS (de Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) o anti-IgM fueron usados como estímulo. Para medir la actividad lítica de NK humanas, los PBMC fueron incubados a 5x10^{6}/pocillo en placas de microvaloración de 24 pocillos. Los cultivos fueron recogidos después de 24 horas, y las células fueron usadas como efectoras en un ensayo estándar de liberación de ^{51}C de 4 horas frente a las células diana K562, como se describe previamente (Ballas Z. K., Rasmussen W. L., y Krieg A. M. 1996. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA. J Immunol 157:1840; Ballas Z. K., y Rasmussen W. 1993. Lymphokine-activated killer cells. VII. IL-4 induces a NK1,1^{+}CD8\alpha^{+}\beta^{-}TCR-\alpha\beta B220^{+} lymphokine-activated killer subset. J Immunol 150:17). Para la proliferación de las células B, se añadió 1 \muCi de ^{3}H timidina 18 horas antes de la recogida, y la incorporación de la cantidad de ^{3}H timidina se determinó mediante contador de centelleo a día 5. Las desviaciones estándar de los pocillos triplicados fueron <5%.
Citometría de flujo en las PBMC de primates: los antígenos de superficie en los PBMC de primates fueron teñidos como se describe previamente (Hartmann G y otros 1998 J Pharmacol Exp Ther 285:920). Los anticuerpos monoclonales para CD3 (UCHT1), CD14 (M5E2), CD19 (B43), CD56 (B159), CD69 (FN50) y CD86 (2331 (FUN-1)) fueron adquiridos a Pharmingen, San Diego, CA. IgG_{1},| (MOPC-21) e IgG_{2b},| (Hartmann G y otros 1999 PNAS 96:9305) fueron usados como control para la tinción no específica. Las células Nk fueron identificadas mediante la expresión CD56 en las células negativas para CD3, CD14 y CD19, mientras que las células B fueron identificadas por la expresión de CD19. Los datos de la citometría de flujo de las 10000 células por muestra fueron adquiridas en FACScan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). La viabilidad de las células dentro de la ventana FSC/SSC usada para el análisis se examinó mediante tinción de yoduro de propidio (2 \mug/ml) y mostró ser superior al 98%. Los datos fueron analizados usando el programa informático FlowJo (versión 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA).
La inmunización de chimpancés y monos cinomolgus contra HBsAg y evaluación de la respuesta humoral: catorce monos cinomolgus (2,0-3,5 kg) fueron inmunizados con una dosis pediátrica de Engerix-B (SmithKline Beecham Biologicals, Rixensart, BE) que contenía 10 \mug de HBsAg adsorbida a aluminio (25 mg Al^{3+}/mg HBsAg). Esto se administró solo (n = 5) o combinado con ODN CpG 1968 (n = 5, 500 \mug) u ODN CpG 2006 (SEQ ID Nº: 246) (n = 4, 150 \mug). Cuatro chimpancés (10-20 kg) fueron inmunizados en la misma forma, recibiendo dos de ellos vacunas testigo (Engerix-B solamente) y dos recibiendo vacunas experimentales (Engerix-B más 1 mg de ODN CpG 2006). Todas las vacunas fueron administradas IM en el muslo anterior derecho en un volumen total de 1 ml. Los monos fueron mantenidos en el almacén de animales del Primate Research Center (Bogor, Indonesia) y los chimpancés fueron alojados en Bioqual (Rockville, MD). Los animales fueron monitorizados diariamente por especialistas en cuidado animal. No se observaron síntomas de salud de enfermedad general o reacciones adversas locales en el sitio de la inyección. El plasma se recuperó mediante la punción IV previamente a y a diversos tiempo después de la inmunización y se almacenó congelado (-20ºC) hasta que se ensayó con los anticuerpos. Los anticuerpos Anti-HBs fueron detectados usando un kit ELISA comercial (Monolisa Anti-HBs; Sanofi-Pasteur, Montreal, QC) y las concentraciones fueron expresadas en mUI/ml basadas en comparación con los estándares WHO definidos (Monolisa Anti-HBs Standards; Sanofi-Pasteur).
Resultados
Identificación de ODN CpG con perfiles diferentes de actividades inmunes in vitro: los estudios de los autores mostraron que las bases precisas en los extremos 5' y 3' de un dinucleótido CpG dentro de un motivo CpG pueden tener un impacto en el nivel de activación inmune de un ODN sintético, pero no ha sido aclarado si diferentes motivos CpG pueden mostrar diferentes efectos inmunes. Para evaluar esta posibilidad, ensayamos un panel de ODN CpG por su capacidad de inducir actividad lítica NK, proliferación celular B, y para estimular la síntesis de TNF-\alpha, IL-6, IFN-© e IL-12 en células de bazo murinas. La actividad inmunoestimuladora de ODN sin motivos CpG (ODN 1982 (SEQ ID Nº: 225), ODN 1983 (SEQ ID Nº: 226)) fue negativa o débil comparada con el ODN CpG. Los ODN con motivos CpG no óptimos (ODN 1628 (SEQ ID Nº: 767), ODN 1758 (SEQ ID Nº: 1)) fueron menos activos que los ODN que contenían motivos CpG flanqueados por dos purinas 5' y dos pirimidinas 3' (ODN 1760 (SEQ ID Nº: 3), ODN 1826 (SEQ ID Nº: 69), ODN 1841 (SEQ ID Nº: 84)). El ODN 1826 que contenía dos motivos CpG murinos óptimos (5' GACGTT 3') (SEQ ID Nº: 1143) tuvo la actividad más alta para 5 de los 6 puntos finales. Excepto para el ODN 1628, todos los ODN mostraron un patrón de actividad generalmente similar (lisis mediada por células NK, proliferación de células B, IL-12, IL-6, TNFa, IFN-©). Nótese, el ODN 1628, que fue el único en este panel que contenía dos regiones ricas G, mostró una inducción preferencial de síntesis de IFN-\gamma pero relativamente baja estimulación de las otras actividades.
Identificación de los ensayos in vitro que se correlacionan con la actividad adyuvante in vivo: puesto que la actividad adyuvante es un punto final in vivo, los autores se interesaron en identificar ensayos in vitro que pudieran predecir la actividad adyuvante de un ODN CpG in vivo. Los mismos ODN usados para los puntos finales in vitro, sin embargo, fueron ensayados en lo que se refiere a su actividad adyuvante para inmunizar ratones contra HBsAg. Esto se llevó a cabo con ambos, con ODN único y con ODN combinado con aluminio, puesto que estudios anteriores han mostrado una fuerte sinergia para el ODN CpG y los adyuvantes de aluminio (Solicitud de Patente Publicada PTC WO98/40100). Los ratones BALB/c inmunizados con HBsAg sin adyuvante consiguieron sólo bajas concentraciones de anti-HBs durante 4 semanas, y esto no fue afectado por la adición de ODN testigo. Por el contrario, la adición de ODN CpG aumentó las concentraciones anti-HBs de 5 a 40 veces, dependiendo de la secuencia usada. Cuando se añadió el aluminio, las concentraciones de anti HBs fueron aproximadamente 6 veces mayores que con HBsAg único. Específicamente, el ODN testigo no tuvo efecto y varios ODN CpG aumentaron estas concentraciones de 2 a 36 veces. Los resultados obtenidos con el ODN diferente solo correlacionaron fuertemente (r = 0,96) con los obtenidos usando el mismo ODN mas aluminio. Cuando la regresión linear fue realizada, se encontró un gran grado de correlación entre algunos ensayos in vitro y un aumento in vivo de las concentraciones anti-HBs. De todos los puntos finales in vitro examinados, la inducción de actividad lítica de NK mostró la mejor correlación con la actividad adyuvante in vivo (sin alum, r = 0,98; con alum, r = 0,95; p<0,0001). Una buena correlación respecto a la actividad adyuvante se obtuvo también para la estimulación celular B (r = 0,84 y 0,7), así como para la secreción de TNF-\alpha (r = 0,9 y 0,88), IL-12 (r = 0,88 y 0,86) e IL-6 (r = 0,85 y 0,91). El único ensayo in vitro que no correlacionó bien con los resultados in vivo fue el de secreción IFN-© (r = 0,57 y 0,68). Estos resultados demostraron que los ensayos in vitro para la actividad lítica NK, la actividad celular B y la producción de TNF-\alpha, IL-6 y IL-12 proporcionan información valiosa in vitro para predecir la actividad de los adyuvante de un ODN dado in vivo.
El cribado de un panel de ODN fosforotioato para activar células humanas NK: En anteriores estudios se encontró que la síntesis de citoquinas inflamatorias por PBMC humanos es inducida por cantidades extremadamente bajas de endotoxina (la secreción de TNF-\alpha inducida es detectable justo con 6 pg/ml de endotoxina, 2 veces más sensible que las células inmune murinas). Por el contrario, la activación de células B humanas y la inducción de actividad lítica celular NK humana con endotoxina es baja incluso a concentraciones de endotoxina altas. Basado en estos resultados los autores seleccionaron la activación de las células NK (actividad lítica y expresión de CD69) y las células B (proliferación y expresión CD86) como los ensayos más altamente específicos y reproducibles con baja variabilidad entre sujetos y usaron estos ensayos para el cribado in vitro de una grupo de ODN.
Primero estudiaron el efecto del ODN fosforotioato que contiene varias combinaciones y permutaciones de motivos CpG sobre la lisis de células diana mediada por NK. Por claridad y facilidad de presentación, se muestran sólo los datos con CpG representativos seleccionados y ODN testigos. Los PBMC humanos fueron incubados con ODN fosforotioato diferentes (6 \mug/ml) durante 24 horas y ensayados en lo que se refiere a su capacidad para lisar células K562 marcadas con ^{51}Cr. Los ODN con dos motivos CpG de 6-mer (bien 5' GACGTT 3' (SEQ ID Nº: 1143) o bien, 5' GTCGTT 3' (SEQ ID Nº: 1144)) en combinación con un TpC en el extremo 5' del ODN (ODN 1840
5'TCCATGTCGTTCCTGTCGTT3' (SEQ ID Nº: 83), ODN 1851 5'TCCTGACGTTCCTGACGTT3' (SEQ ID Nº: 94) o con al menos tres motivos de 6-mer sin un TpC en el extremo 5' (ODN 2013 (SEQ ID Nº: 253)) mostraron actividad intermedia.
La actividad alta se encontró cuando el TpC 5' precedió directamente al motivo CpG humano de 6-mer (5'TCGTCGTT3' (SEQ ID Nº: 1145) y fue seguido por dos motivos de 6-mer (ODN 2005 (SEQ ID Nº: 245), ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246) y ODN 2007 (SEQ ID Nº: 247)). Los mejores resultados fueron obtenidos cuando los motivos de 6-mer CpG fueron separados el uno del otro y del motivo CpG 5' de 8-mer por TpT (ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246)).
La expresión del marcador de activación CD69 es rápidamente aumentada de niveles en la superficie de las células NK subsiguiente a la estimulación. Para confirmar los resultados del ensayo de lisis de células NK, los PBMC fueron incubados durante 18 horas con ODN (2 g/ml). La expresión de CD69 se examinó en las células NK positivas para CD56 (negativas para CD3, CD14 y CD19). Aunque la inducción de la expresión de CD69 fue menos restringida a la secuencia que la estimulación de la actividad funcional de las células NK, el ODN testigo (ODN 1982, ODN 2116, ODN 2117, ODN 2010) sólo mostró una actividad baja similar a los niveles de fondo. Los ODN con dos motivos humanos CpG separados por 5'TTTT3' (ODN 1965 (SEQ ID Nº: 208)) o cuatro motivos CpG humanos sin espacio (ODN 2013 (SEQ ID Nº: 53)) fueron relativamente más activos en inducir la expresión CD69 que en estimular una actividad lítica de células NK. La actividad funcional óptima de células NK, así como la expresión de CD69, se obtuvo con ODNs que contenían un dinucleótidos TpC precediendo al motivo CpG humano, y motivos humanos adicionales dentro de la secuencia (ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246), (ODN 2007 (SEQ ID Nº: 247)).
La actividad del ODN fosforotioato para estimular las células B humanas: en los experimentos preliminares los autores encontraron que el porcentaje de células B proliferantes (ensayo CFSE, véase la sección de métodos) correlacionaron con la expresión en superficie del CD86 coestimulador de las células B, como se midió por citometría de flujo. Así, usaron la expresión de CD86 en las células B para cribar un panel de ODN en lo que se refiere a su actividad inmunoestimuladora. Los PBMC fueron incubados con 0,6 \mug/ml de ODN. La expresión de CD86 (intensidad de fluorescencia media, MFI) fue examinada en células B CD19 positivas. Un ODN poli C (ODN 2017 (SEQ ID Nº: 257)) u ODN sin dinucleótidos CpG (ODN 2082 (SEQ ID Nº: 225)) no consiguieron estimular las células humanas B en estas condiciones experimentales. Un ODN fosforotioato (ODN 2116 (SEQ ID Nº: 256)) con un motivo CpG humano óptimo precedido por un TpC (5'TCGTCGTT3' (SEQ ID Nº: 1145)) tuvieron una actividad baja. La presencia de un motivo CpG de 6-mer humano (5'GTCGTT3' (SEQ ID Nº: 1144)) no tuvo ningún efecto activador. Dos de estos motivos CpG dentro de la secuencia no mostraron actividad (ODN 1960 (SEQ ID Nº: 203), (ODN 2016 (SEQ ID Nº: 256)) o mostraron una actividad intermedia (ODN 1965 (SEQ ID Nº: 208)) dependiente del contexto de la secuencia. Si el ODN estuviera compuesto de tres o cuatro copias de este motivo (ODN 2012 (SEQ ID Nº: 252), (ODN 2013 (SEQ ID Nº: 253), (ODN 2014 (SEQ ID Nº: 254)), se podría detectar la actividad intermedia en las células B. La combinación del motivo CpG humano de 8-mer en el extremo 5' del ODN con dos motivos CpG de 6-mer (ODN 2005 (SEQ ID Nº: 245), ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246), ODN 2007 (SEQ ID Nº: 247), ODN 2102 (SEQ ID Nº: 343), ODN 2103 (SEQ ID Nº: 344)) conduce a un aumento considerable en la capacidad del ODN de estimular las células B. El espaciado entre los motivos únicos fue crítico. La separación de los motivos CpG por el TpT fue preferible (ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246)) comparado con los motivos CpG no separados (ODN 2005 (SEQ ID Nº: ); también comparado con el ODN 1965 (SEQ ID Nº: 208) y el ODN 1960 (SEQ ID Nº: 203)). El motivo CpG de 6-mer humano (5'GTCGTT3') fue mejor que el motivo CpG de 6-mer óptimo de ratón (5' GACGTT 3' (SEQ ID Nº: 246)) cuando se combinó con el motivo CpG de 8-mer humano en el extremo 5' (ODN 2006 vs. ODN 2102 (SEQ ID Nº: 343) y ODN 2103 (SEQ ID Nº: 344)). Un ODN _{poly} (TCG) fue inactivo o sólo débilmente activo, como lo fueron los ODN que contenían dinucleótidos CpG flanqueados por guanina u otros dinucleótidos CpG (ODN 2010 (SEQ ID Nº: 250)). Tomados juntos, los descubrimientos para las células NK y células B mostraron consistentemente que uno de los ODN ensayados, el ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246) tiene la actividad inmunoestimuladora más alta en las células inmunes humanas.
Análisis comparativos de potencia de los ODNs fosforotioato CpG en diferentes primates: Diferentes motivos CpG son óptimos para activar las células inmunes murinas y humanas. Adicionalmente, el número y posición de los motivos CpG dentro de un ODN fosforotioato activo es diferente en ratones y humanos. Estábamos interesados en saber si los ODN fosforotioato CpG muestran una actividad similar entre las diferentes especies de primates. Comparamos un panel de ODN CpG en lo que se refiere a su capacidad para inducir la proliferación de células B en humanos, chimpancés y monos rhesus o cinomolgus. La capacidad del ODN para estimular la proliferación de células B humanas (Tabla J) correlacionó bien con su capacidad para inducir la expresión de CD86 en las células B. El ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246), que mostró la actividad más alta en las células humanas B y células NK, fue también la más activa en estimular la proliferación de células B en chimpancés y monos rhesus (Tabla J). El ODN 1968 (SEQ ID Nº: 211) y el ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246) dieron la activación más alta de las células B en monos cinomolgus in vitro (SI de 25 y 29 respectivamente a 6 \mug de ODN/ml). Sorprendentemente, el ODN CpG 2007 (SEQ ID Nº: 247), que mostró una actividad igualmente alta que el ODN 2006 óptimo (SEQ ID Nº: 246) en células humanas, no estimuló la proliferación de celulas B en monos Rhesus o chimpancés, y el ODN 1968 (SEQ ID Nº: 211) mostró baja actividad. El ODN CpG identificado originalmente con alta actividad en ratones (ODN 1760 (SEQ ID Nº: 3), ODN 1826 (SEQ ID Nº: 69)) mostró baja actividad en monos (Tabla J).
TABLA J Respuesta proliferativa de PBMC a ODN CpG fosforotioatos en primates
Humanos Chimpancés Monos
Rhesus
No adición 0,5 + - 0,1 0,5 + - 0,1 0,5 + - 0,0
ODN 1760 (SEQ ID Nº: 3) 23 + - 7 0,3 + - 0,1 0,5 + - 0,3
ODN 1826 (SEQ ID Nº: 69) 0,8 + - 0,1 0,4 + - 0,1 0,6 + - 0,1
ODN 1968 (SEQ ID Nº: 211) 35 + - 9 20,0 + - 3,8 1,9 + - 0,7
ODN 1982 (SEQ ID Nº: 225) 9,7 + - 1,1 2,5 + - 1,1 0,7 + - 0,1
ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246) 58 + - 8 27,4 + - 8,9 6,3 + - 3,3
ODN 2007 (SEQ ID Nº: 247) 47 + - 11 0,5 + - 0,1 0,4 + - 0,2
Los PBMC fueron preparadas de sangre periférica e incubados con ODN (0,6 \mug/ml) como se indicó durante cinco días. La proliferación se midió mediante ingesta de ^{3}H/timidina (cpm/1000) durante las ultimas 18 horas. Más del 95% de las células proliferantes fueron células B como se determinó usando el ensayo CFSE. Para las probandas humanas, se ensayaron seis chimpancés y dos monos rhesus.
La actividad adyuvante in vivo de ODN CpG en chimpancés y monos cinomolgus: para evaluar si el ODN CpG con efectos estimuladores fuertes en células de primates in vitro tenían actividad adyuvante detectable in vivo, los monos cinomolgus y los chimpancés fueron inmunizados con Engerix B, que comprende HBsAg adsorbido a aluminio, solo o con ODN 1968 (500 \mug) u ODN 2006 (SEQ ID Nº: 246) (1 mg) añadidos respectivamente. Comparado con los testigos que no reciben el ODN CpG, las concentraciones anti-HBs 4 semanas posterior a la activación y 2 semanas posterior a la inyección fueron 66 y 16 veces más altas respectivamente en los monos, y 15 y 3 veces más altas en los chimpancés (Tabla K). Así, se vio un efecto adyuvante claro del ODN CpG, y este fue particularmente destacable después de una inmunización única.
TABLA K Respuestas anti-HBs en primates inmunizados contra HBsAg con ODN^{3} CpG
Anti-HBs (mIU/ml)
Especies n ODN CpG 4 semanas 2 semanas
primates posterior a posterior a
la activación la inyección
Mono 5 Ninguno 15 \pm 44 4880 \pm 13113
cinomolgus 5 ODN 1968 995 \pm 1309 76449 \pm 42094
(500 \mug)
(SEQ ID Nº: 211)
Chimpancé 2 Ninguno 6.11 3712.4706
2 ODN 2006 125.135 9640.16800
(1 mg)
(SEQ ID Nº: 246)
^{3} \begin{minipage}[t]{140mm} Los animales fueron inmunizados mediante inyección IM de Engerix B que contenían 10 \mu g de HBsAg adsorbido al aluminio, solos o con ODN CpG añadido. Los monos cinomolgus fueron inyectados a 10 semanas y los chimpancés fueron inyectados a 4 semanas posterior a la activación. El Anti-HBs fue determinado mediante ensayo ELISA; los valores para los monos son GMT \pm SEM (n = 5) mientras que los valores individuales para los dos chimpancés en cada grupo se proporcionan.\end{minipage}
<110> University of Iowa Research Foundation
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\hskip-.1em\dddseqskip
Coley Pharmaceutical GmbH 
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Ácidos nucleicos inmunoestimuladores
\vskip1.000000\baselineskip
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<130> C1039/7035WO (HCL/MAT)
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/156,113
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<151> 1999-09-25
\vskip1.000000\baselineskip
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<150> US 60/156,135
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<151> 1999-09-27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/227,436
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2000-08-23
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<160> 1145
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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia sintética
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg tgcgccat 
\hfill
18 
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<210> 2
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ataatccagc ttgaaccaag 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ataatcgacg ttcaagcaag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taccgcgtgc gaccctct 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggagggt 
\hfill
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggagggg 
\hfill
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtgaggtg 
\hfill
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtngt tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctaccttag ngtga 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgangt tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcntgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagangtt agtgt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agctccatgg tgctcactg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccacgtcgac cctcaggcga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcacatcgtc ccgcagccga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcactcgtg gtacctcga 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttggataca ggccagactt tgttg 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gattcaactt gcgctcatct taggc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accatggacg aactgtttcc cctc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accatggacg agctgtttcc cctc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accatggacg acctgtttcc cctc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accatggacg tactgtttcc cctc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accatggacg gtctgtttcc cctc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accatggacg ttctgtttcc cctc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccactcacat ctgctgctcc acaag 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acttctcata gtccctttgg tccag 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgagct tcctgagtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaggaaggng nggangacgt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgaatncgt tcncgggnct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaaaa 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccccc 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtca 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtag 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtgg 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgtcgt 
\hfill
6 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 36
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\vskip0.400000\baselineskip
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tccatgtcgg tcctgagtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tccatgccgg tcctgagtct 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tccatgacgg tcctgagtct 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tccatgacgg tcctgagtct 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tccatgtcga tcctgagtct 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
20 
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tccatgtcgt tcctgagtct 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tccatgacgt tcctgagtct 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 44
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
20 
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<212> ADN
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\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 47
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgctgg tcctgagtct 
\hfill
20 
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<210> 48
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 48
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\vskip0.400000\baselineskip
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tccatgtngg tcctgagtct 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgcttcctc cagatgagct catgggtttc tccaccaag 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 50
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttggtggag aaacccatga gctcatctgg aggaagcgg 
\hfill
39 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccccaaaggg atgagaagtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agatagcaaa tcggctgacg 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggttcacgtg ctcatggctg 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg tgcgccat 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg tgcgccat 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taccgcgtgc gaccctct 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ataatccagc ttgaaccaag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ataatcgacg ttcaagcaag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgattt tcctgatttt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgttttttt gtttttttgt tttt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttttttgt ttttttgttt tt 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctgctttt gtgcttttgt gctt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctgcttgt gcttttgtgc tt 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcattcatca ggcgggcaag aat 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taccgagctt cgacgagatt tca 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcatgacgtt gagct 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacgttgagg ggcat 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgctgagac tggag 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgacgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcatgagctt gagctga 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcagcgtgcg cc 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgacgttcc tgacgtt 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttggggtt ttggggtttt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctaggcttt ttaggcttcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcatttttt aggccaccat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg tgcgtgcgcc at 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg ggcgcat 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg agcgccat 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg cgcgccat 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtgacgt tcagggggg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtccagc gtgcgccatg gggg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtgtcgt tcagggggg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtcgt tcctgtcgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatagcgt tcctagcgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgctgt ctccgcttct t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcatgacgtt gagct 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg tgcgccatat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgangt tcctgangtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcatgangtt gagct 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccagcgtgc gccata 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg tgcgccat 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgagct tcctgagtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcatgtcgtt gagct 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgacgtt cctgacgtt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcatgatgtt gagct 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcatttcgag gagct 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcatgtagct gagct 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaggacgt tcctagttct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaggagct tcctagttct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaggatgt tcctagttct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccagtctag gcctagttct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccagttcga gcctagttct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcatggcgtt gagct 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcatagcgtt gagct 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcattgcgtt gagct 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttgcgttg cgttt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg ttgcgccata t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg tgcgttatat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctccctgcg tgcgccatat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctgcgtgcg tgcgccatat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcctagcg tgcgccatat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg tgcgcctttt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a ó g ó c ó t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> d es a ó g ó t/u; no c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> h es a ó c ó t/u; not g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctandcghh agc 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgacgtt ccc 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaagacgtt aga 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgacgtt aga 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcagaccagc tggtcgggtg ttcctga 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaggaacac ccgaccagct ggtctga 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagtcgat agc 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagtcgct agc 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttgacgtc tagc 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttgacgtt tagc 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttgacgtc ago 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagacgtt tagc 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacat tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagacgtc tagc 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggctatgtcg ttcctagcc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggctatgtcg atcctagcc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcatgggtt tctccaccaa g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttggtggag aaacccatga g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctagttct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgcttcctc cagatgagct catg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catgagctca tctggaggaa gcgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccagatgagc tcatgggttt ctcc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggagaaaccc atgagctcat ctgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcatcagga acgacatgga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgacgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgcgcgcgc gcgcgcgcg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggccggcc ggccggccgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttccaatcag ccccacccgc tctggcccca ccctcaccct cca 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggagggtga gggtggggcc agagcgggtg gggctgattg gaa 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaaatgtgg gattttccca tgagtct 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agactcatgg gaaaatccca catttga 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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tgccaagtgc tgagtcacta ataaaga 
\hfill
27 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tctttattag tgactcagca cttggca 
\hfill
27 
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<212> ADN
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tgcaggaagt ccgggttttc cccaaccccc c 
\hfill
31 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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ggggggttgg ggaaaacccg gacttcctgc a 
\hfill
31 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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ggggactttc cgctggggac tttccagggg gactttcc 
\hfill
38 
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctctccat gacgttcctc tccatgacgt tcctc 
\hfill
45 
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
gaggaacgtc atggagagga acgtcatgga gaggaacgtc atgga 
\hfill
45 
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\hfill
20 
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tccatgacgt tcctgacgtt 
\hfill
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<212> ADN
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tccatgacgt tcctgacgtt 
\hfill
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tccaggactt tcctcaggtt 
\hfill
20 
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcttgcgatg ctaaaggacg tcacattgca caatcttaat aaggt 
\hfill
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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accttattaa gattgtgcaa tgtgacgtcc tttagcatcg caaga 
\hfill
45 
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tcctgacgtt cctggcggtc ctgtcgct 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tcctgtcgct cctgtcgct 
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19 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tcctgacgtt gaagt 
\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
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tcctgtcgtt gaagt 
\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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tcctggcgtt gaagt 
\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tcctgccgtt gaagt 
\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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tccttacgtt gaagt 
\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
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tcctaacgtt gaagt 
\hfill
15 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tcctcacgtt gaagt 
\hfill
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tcctgacgat gaagt 
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tcctgacggt gaagt 
\hfill
15 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tcctgacgta gaagt 
\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tcctgacgtc gaagt 
\hfill
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tcctgacgtg gaagt 
\hfill
15 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
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\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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\hfill
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgacgtt ccttc 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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\hfill
22 
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgacgtt cccctggcgg tcccctgtcg ct 
\hfill
32 
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tcctgtcgct cctgtcgctc ctgtcgct 
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28 
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tcctggcggg gaagt 
\hfill
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<220>
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\hfill
5 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 180
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcntgacgtt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 181
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctagcgtt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 182
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccagacgtt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 183
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgacggg gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 184
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctggcggt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 185
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggctccgggg agggaatttt tgtctat 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 186
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atagacaaaa attccctccc cggagcc 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 187
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgagct tccttgagtc t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 188
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgctgt ctccgcttct t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 189
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgctgt ctccgcttct t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 190
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgagacatt gcacaatcat ctg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 191
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagattgtgc aatgtctcga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 192
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtcgt tcctgatgcg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 193
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgatgtcgt tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 194
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgatgtcgt tcctgatgcg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 195
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtcgt tccgcgcgcg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 196
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtcgt tcctgccgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 197
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtcgt tcctgtagct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 198
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggcgggcg gcgcgcgccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 199
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 199
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcaggaacg tcatgggaag c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 200
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgagct tcctgagtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 201
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 202
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaagctt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 203
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgtcgtt cctgtcgtt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 204
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 204
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtcgt ttttgtcgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 205
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 205
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgtcgtt ccttgtcgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 206
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccttgtcgt tcctgtcgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 207
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 207
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccattccat gacgttcctg atgcttcca 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 208
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 208
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgtcgtt ttttgtcgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 209
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 209
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgctgt ctccgcttct t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 210
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgctgt ctgcccttct t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 211
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgctgt tgtcgtttct t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 212
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgtcgtt cctgtcgttg gaacgacagg 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 213
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgtcgtt cctgtcgttt caacgtcagg aacgacagga 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 214
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtctgtc gttttggggg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 215
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 215
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtctgtg cttttggggg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 216
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccggccgtt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 217
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccggacggt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 218
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcccgccgtt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 219
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccagacggt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 220
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcccgacggt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 221
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccagagctt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 222
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtngt tcctgtngtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 223
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgacgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 224
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 224
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggttgacg ttttgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 225
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaggactt ctctcaggtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 226
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 226
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttttttt tttttttttt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 227
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 227
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgccgt tcctgccgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 228
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatggcgg gcctggcggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 229
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 229
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgccgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 230
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 230
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctggcggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 231
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgcgttt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 232
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgg tcctgacggt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 233
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgcgtg cgtgcgtttt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 234
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgcgtt gcgttgcgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 235
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccattccat tctaggcctg agtcttccat 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 236
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatagcgt tcctagcgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 237
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtcgt tcctgtcgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 238
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatagcga tcctagcgat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 239
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccattgcgt tccttgcgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 240
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatagcgg tcctagcggt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 241
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgattt tcctgcagtt cctgatttt 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 242
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 242
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgcagtt cctgacgtt 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 243
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcggcggcg gcggcggcgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 244
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccacgacgt tttcgacgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 245
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 245
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgttgt cgttgtcgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 246
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 246
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 247
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 248
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 248
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgtgcgttg tcgttgtcgt t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 249
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cnggcnggcn gggcnccgg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 250
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggcgggcg gcgcgcgccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> base_modificada
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<223> I
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<221> base_modificada
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<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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agncccgnga acgnattcac 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
tgtcgtttgt cgtttgtcgt t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tcgtcgtcgt cgtt 
\hfill
14 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtcgttgtc gtt 
\hfill
13 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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cccccccccc cccccccccc 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tctagcgttt ttagcgttcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tgcatccccc aggccaccat 
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
23 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgttgt cgttgtcgtt 
\hfill
20 
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 
\hfill
22 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggagggag gaacttctta aaattccccc agaatgttt 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaacattctg ggggaatttt aagaagttcc tccctcccc 
\hfill
39 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgtttactt cttaaaattc ccccagaatg ttt 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaacattctg ggggaatttt aagaagtaaa cat 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgtttacta gacaaaattc ccccagaatg ttt 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaacattctg ggggaatttt gtctagtaaa cat 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaattgacg ttttaaaaaa 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 271
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccccttgacg ttttcccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 272
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttcgttgt ttttgtcgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 274
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 274
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgcagcctg ggac 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 275
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acccgtcgta attatagtaa aaccc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 276
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtacctgtg gggacattgt g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 277
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcaccgaac gtgagagg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 278
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 278
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgccgt tcctgccgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 279
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 279
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgg tcctgacggt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 280
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 280
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgccgg tcctgccggt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 281
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgcgcg tcctgcgcgt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 282
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctggtctttc tggttttttt ctgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 283
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 283
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaggggtgg ggggaacctt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 284
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 284
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgangt tcctagttct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 285
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 285
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgatgt tcctagttct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 286
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 286
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccgaagtca tttcctctta acctgg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 287
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 287
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaggttaag aggaaatgac ttcggg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 288
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctggnggg gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 289
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 289
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gnggngggng gngngngccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 290
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 290
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtgct tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 291
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtcct tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 292
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 292
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtcgt tcctagttct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 293
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 293
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaagtagt tcctagttct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 294
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtagt tcctagttct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 295
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 295
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcccgcgcgt tccgcgcgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 296
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 296
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctggcggt cctggcggtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 297
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 297
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctggaggg gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 298
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgggggg gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 299
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 299
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctggtggg gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 300
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 300
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 301
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 301
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctggtctttc tggttttttt ctgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 302
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgacgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 303
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 303
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaggactt ctctcaggtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 304
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 304
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tngtngtttt gtngttttgt ngtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 305
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 305
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgttttttt 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 306
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 306
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctatgacgt tccaaggg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 307
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 307
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 308
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 308
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaggactt tcctcaggtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 309
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 309
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctctctgtag gcccgcttgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 310
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 310
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctttccgttg gacccctggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 311
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 311
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtccgggcca ggccaaagtc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 312
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 312
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgcgcgcga gcccgaaatc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 313
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 313
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgangt tcctgangtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 314
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 314
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatagtcgcc ataacaaaac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 315
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 315
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatagtcgcc atggcggggc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 316
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 316
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttccatg tcgttcctga tgcttttt 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 317
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 317
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgtcgtt gaagtttttt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 318
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 318
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagcttta gagctttaga gctt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 319
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 319
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctgcttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 320
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgacgttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 321
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 322
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 323
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 323
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgccgttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 324
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 324
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgatcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 325
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 325
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgacgtt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 326
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 326
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgccgtt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 327
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgacggt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 328
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 328
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgagctt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 329
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 329
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctggcggg gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 330
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaatctgtg cttttaaaaa a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 331
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 331
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatccagtca cagtgacctg gcagaatctg gat 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 332
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 332
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatccagatt ctgccaggtc actgtgactg gat 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 333
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatccagtca cagtgactca gcagaatctg gat 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 334
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 334
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatccagatt ctgctgagtc actgtgactg gat 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 335
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 335
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgttcc cccccncccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 336
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 336
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tngtngttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 337
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 337
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tngtcgttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 338
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 338
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtngttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 339
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgctcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 340
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 340
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcggtcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 341
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 341
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcggcgttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 342
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 342
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggccttttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 343
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 343
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 344
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 344
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt gacgttttga cgtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 345
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 345
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgtcgttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 346
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 346
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgtcgttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 347
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 347
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcattcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 348
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgtcgttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 349
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtcgttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 350
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 350
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttcgtcg ttcccccccc cccc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 351
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 3' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 351
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 352
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 3' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 352
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 353
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 353
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccagttcct tcctcagtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 354
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tngtcgtttt gtcgttttgt cgtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 355
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 355
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctggaggg gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 356
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 356
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgaaaag gaagt 
\hfill
15 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 357
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgttcc ccccccc 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 358
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 358
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tngtngtttt gtngttttgt ngtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 359
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 359
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtcaagc ttgagggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 360
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 360
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctgcttcc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 361
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtcgt cgtt 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 362
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtcgt cgtt 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 363
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 363
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtcgt cgtt 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 364
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgttga 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 365
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 365
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 366
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 366
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atagttttcc atttttttac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 367
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 367
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatagtcgcc atcgcgcgac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 368
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 368
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatagtcgcc atcccgggac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 369
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 369
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatagtcgcc atcccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 370
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 370
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctgctttt gtgcttttgt gctt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 371
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 371
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtgctttc tgtgtttttc tgtg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 372
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctaatctttc taattttttt ctaa 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 373
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 373
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgttgg tgtcgttggt gtcgtt 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 374
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 374
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgttgg ttgtcgtttt ggtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 375
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accatggacg agctgtttcc cctc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 376
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 376
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt gcgtgcgttt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 377
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 377
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtaagtga gcttggagag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 378
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaacgctg gaccttcc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 379
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggcgactc agtctatcgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 380
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 380
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttctcagat aaagcggaac cagcaacaga cacagaa 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 381
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 381
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttctgtgtct gttgctggtt ccgctttatc tgagaac 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 382
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 382
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagacacaga agcccgatag acg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 383
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agacagacac gaaacgaccg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 384
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 384
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtctgtccca tgatctcgaa 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 385
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 385
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctggccagc ttacctcccg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggcctcta tacaacctgg g 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtccctg agactgcc 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 388
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\vskip0.400000\baselineskip
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gagaacgctg gaccttccat 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtcgg tcctgatgct 
\hfill
20 
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<211> 20
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcttgcgac ctggaaggta 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 391
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 391
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggtacagcc aggactacga 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 392
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 392
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accatggacg acctgtttcc cctc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 393
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 393
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accatggatt acctttttcc cctt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 394
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 394
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggaaggtc cagcgttctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 395
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 395
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcatcagga ccgacatgga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 396
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 396
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctctccaagc tcacttacag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccctgagac tgccccacct t 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 398
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 398
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccaccaaaa cttgtccatg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 399
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 399
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtccatggcg tgcgggatga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 400
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 400
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctctataca acctgggac 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 401
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggcgactc agtctatcgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 402
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 402
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgctaccgg tagcctgagt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 403
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 403
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgactgccga acaggatatc ggtgatcagc actgg 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 404
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 404
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccagtgctga tcaccgatat cctgttcggc agtcg 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 405
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 405
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaggttgta tagaggc 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 406
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 406
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg tacgccat 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 407
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 407
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg tgcgtttt 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 408
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 408
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccgacg tgcgccat 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 409
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 409
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccgtcg tgcgccat 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 410
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 410
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ataatcgtcg ttcaagcaag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 411
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 411
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgt 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 412
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 412
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 413
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 413
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 414
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a ó c ó g ó t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a ó c ó g ó t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a ó c ó g ó t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a ó c ó g ó t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a ó c ó g ó t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a ó c ó g ó t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 414
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcntcgtntt ntcgtnttnt cgtn 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 415
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 415
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccagcg tcgccat 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 416
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 416
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctcccatcg tcgccat 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 417
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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ataatcgtgc gttcaagaaa g 
\hfill
21 
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<213> Secuencia artificial
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ataatcgacg ttcccccccc 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tctatcgacg ttcaagcaag 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tcctgacggg gagt 
\hfill
14 
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<213> Secuencia artificial
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<211> 19
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tccatgacgt tcctgatcc 
\hfill
19 
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19 
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tcctggcgtg gaagt 
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\hfill
19 
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\hfill
21 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
24 
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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cccccccccc cccccccccc cccc 
\hfill
24 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
32 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt ttgtcgtttt ttgtcgtt 
\hfill
28 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
20 
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<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttttttt tttttttttt tttt 
\hfill
24 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tcgtcgtttt gtcgttttgg gggg 
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24 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgctgt ctccgcttct tcttgcc 
\hfill
27 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tcgtcgctgt ctccg 
\hfill
15 
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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ctgtaagtga gcttggagag 
\hfill
20 
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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gagaacgctg gaccttccat 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 440
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaggttgta tagaggc 
\hfill
17 
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<210> 441
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagacgtt agcgtga 
\hfill
17 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggagctcttc gaacgccata 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 443
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctccatgat ggttttatcg 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaggtggggc agtctcaggg a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 445
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcggaggac tggcgcgccg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 446
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 446
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaggacaag gtctagggtg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 447
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accacaacga gaggaacgca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 448
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcagtgcag gctcaccggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 449
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaccttcca tgctgtt 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagacgtt agcgtga 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 451
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<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcttggaggg cctgtaagtg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 452
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
gtagccttcc ta 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 453
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<211> 14
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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cggtagcctt ccta 
\hfill
14 
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<210> 454
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 454
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\hfill
16 
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agcacggtag ccttccta 
\hfill
18 
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
18 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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gaccttccat 
\hfill
10 
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<212> ADN
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tggaccttcc at 
\hfill
12 
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gctggacctt ccat 
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gagaacgctg gaccttccat gt 
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22 
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\hfill
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<212> ADN
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\hfill
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<212> ADN
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22 
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\hfill
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caatcaatct gaggagaccc 
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tcagctctgg tactttttca 
\hfill
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tggaccttct atgtcggtcc 
\hfill
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
tgtcccatgt ttttagaagc 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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gtggttacgg tcgtgcccat 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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cctccaaatg aaagaccccc 
\hfill
20 
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttgtactctc catgatggtt 
\hfill
20 
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<210> 483
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttccatgctg ttccggctgg 
\hfill
20 
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaccttctat gtcggtcctg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 485
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 485
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaccgctc gaccttcgat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 486
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgccccata ttttagaaac 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 487
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttgaaactga ggtgggac 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 488
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctatcggagg actggcgcgc c 
\hfill
21 
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<210> 489
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
cttggagggc ctcccggcgg 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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gctgaacctt ccatgctgtt 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
tagaaacagc attcttcttt tagggcagca ca 
\hfill
32 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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agatggttct cagataaagc ggaa 
\hfill
24 
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<210> 493
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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ttccgcttta tctgagaacc atct 
\hfill
24 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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gtcccaggtt gtatagaggc tgc 
\hfill
23 
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<212> ADN
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gcgccagtcc tccgatagac 
\hfill
20 
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<212> ADN
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atcggaggac tggcgcgccg 
\hfill
20 
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ggtctgtccc atatttttag 
\hfill
20 
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tttttcaacg ttgagggggg 
\hfill
20 
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tttttcaagc gttgattttt t 
\hfill
21 
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<212> ADN
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ggggtcaacg ttgatttttt 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggttttca acgttttgag ggggg 
\hfill
25 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggttacggtc tgtcccatat 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtcccata tttttagaca 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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accatcctga ggccattcgg 
\hfill
20 
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgtctatcgg gcttctgtgt ctg 
\hfill
23 
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggccatccca cattgaaagt t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaaatatcg gtggtcaagc ac 
\hfill
22 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 508
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgcttgacc accgatattt gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgctgatca ccgatatcct gttcgg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 510
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggccaacttt caatgtggga tggcctc 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttccgccgaa tggcctcagg atggtac 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 512
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 512
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tatagtccct gagactgccc caccttctca acaacc 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 513
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcagcctcta tacaacctgg gacggga 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 514
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctatcggagg actggcgcgc cg 
\hfill
22 
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<210> 515
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 515
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tatcggagga ctggcgcgcc g 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 516
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatcggagga ctggcgcgcc g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 517
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 517
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgaacagga tatcggtgat cagcac 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 518
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttggggtc aacgttgagg gggg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 519
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 519
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtcaacg ttgagggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 520
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 521
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 521
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggcatgac gttcgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 522
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 522
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggcatgac gttcaaaaaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 523
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 523
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggcatgag cttcgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 524
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 524
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggcatgac gttcgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 525
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
aaaacatgac gttcaaaaaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 526
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
aaaacatgac gttcgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 527
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggggcatgac gttcaaaaaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 528
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 528
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accatggacg atctgtttcc cctc 
\hfill
24 
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24 
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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18 
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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18 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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22 
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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gggggttttt tttttggggg 
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tttttggggg gggggttttt 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggggggg ggggggggt 
\hfill
19 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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aaaaaccccc cccccaaaaa 
\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
tttgaattca ggactggtga ggttgag 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 564
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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tttgaatcct cagcggtctc cagtggc 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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aattctctat cggggcttct gtgtctgttg ctggttccgc tttat 
\hfill
45 
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45 
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<212> ADN
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28 
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29 
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20 
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<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 602
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacgtt 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 603
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 603
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacgttga 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 604
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 604
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcacgctaac ctctagc 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 605
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 605
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaacgctg gaccttgcat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 606
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 606
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctggacctt ccat 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 607
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 607
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaacgctg gacctcatcc at 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 608
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 608
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaacgctg gacgctcatc cat 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 609
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 609
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacgttgagg ggcat 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 610
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 610
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgcccctca acgtt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 611
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 611
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgttga 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 612
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 612
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctggacctt ccat 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 613
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 613
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caacgtt 
\hfill
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 614
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 614
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acaacgttga 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 615
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 615
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcacgt 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 616
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 616
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaagctt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 617
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 617
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtca 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 618
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 618
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggatatc 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 619
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 619
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tagacgtc 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 620
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 620
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacgtcat 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 621
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 621
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccatcgat 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 622
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 622
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgatgt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 623
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 623
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgcatgt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 624
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 624
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccatgcat 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 625
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 625
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcgctga 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 626
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 626
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcagcgct 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 627
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 627
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccttcgat 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 628
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 628
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgccggggt ctccgggc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 629
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 629
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctgtggggc ggctcctg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 630
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 630
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 631
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de FITC unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 631
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 632
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de FITC unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 632
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacgttga 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 633
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 633
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgt 
\hfill
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 634
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 634
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacgttg 
\hfill
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 635
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 635
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgacga 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 636
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 636
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 637
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 637
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgga 
\hfill
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 638
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 638
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agaacgtt 
\hfill
8 
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<210> 639
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tcatcgat 
\hfill
8 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 8
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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taaacgtt 
\hfill
8 
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<211> 8
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccaacgtt 
\hfill
8 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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gctcga 
\hfill
6 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
6 
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cgtcgt 
\hfill
6 
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\hskip-.1em\dddseqskip
acgtgt 
\hfill
6 
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cgttcg 
\hfill
6 
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<212> ADN
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\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcgta 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgtacg 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaccggt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caagagatgc taacaatgca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acccatcaat agctctgtgc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccatcgat 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 654
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 654
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgacgtc 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 655
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagcgct 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 656
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taagcgct 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgcgaattc gcg 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggaaggtc cagcgttct 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 659
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 659
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actggacgtt agcgtga 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 660
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 660
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcctggggc tggtctgg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 661
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 661
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgtcggggt ctccgggc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 662
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 662
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgccggggt ctccgggc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 663
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 663
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgccgtcgcg gcggttgg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 664
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 664
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaagttcacg ttgaggggca t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 665
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 665
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atctggtgag ggcaagctat g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 666
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 666
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttgaaaccc gagaacatca t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 667
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 667
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 668
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 668
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 669
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 669
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 670
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 670
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 671
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 671
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 672
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 672
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 673
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 673
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 674
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 674
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 675
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 675
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 676
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 676
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaacgtt 
\hfill
8 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 677
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 677
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaacgtt 
\hfill
8 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 8
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 678
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\vskip0.400000\baselineskip
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ataacgtt 
\hfill
8 
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<210> 679
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<211> 8
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 679
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\hfill
8 
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<213> Secuencia artificial
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tccgatcg 
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8 
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<211> 8
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<212> ADN
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tccgtacg 
\hfill
8 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
17 
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
25 
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaacgcta gaccttctat 
\hfill
20 
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actagacgtt agtgtga 
\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
22 
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
22 
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\vskip0.400000\baselineskip
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cgctggacct tccat 
\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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caccaccttg gtcaatgtca cgt 
\hfill
23 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtgcgattg cagatcg 
\hfill
17 
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<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
24 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttcgtttg tcgttttgtc gtt 
\hfill
23 
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttgtttt gtggttttgt ggtt 
\hfill
24 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accgcatgga ttctaggcca 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
15 
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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aacgctggac cttccat 
\hfill
17 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 698
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
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<222> (5)...(5)
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<223> m5c
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaangtt 
\hfill
8 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 699
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccttcgat 
\hfill
8 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 700
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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actagacgtt agtgtga 
\hfill
17 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 701
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggactctc cagcgttctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 703
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgactctc gagcgttctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 704
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 704
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagacgtt agc 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 705
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagacgt 
\hfill
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 706
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtgcgattc gagatcg 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 707
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
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<222> (5)...(5)
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<223> m5c
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 707
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcagngct 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 708
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 708
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgattgctc tctcgtga 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 709
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
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<222> (2)...(2)
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tnaacgtt 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 710
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> base_modificada
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<222> (6)...(6)
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<223> m5c
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\hskip-.1em\dddseqskip
gagaangctg gaccttccat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 711
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 711
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\hskip-.1em\dddseqskip
gctagacgtt aggctga 
\hfill
17 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 712
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 712
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctacttagc gtga 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 713
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 713
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctaccttag cgtga 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 714
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 714
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgacttcg agcgttctc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 715
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 715
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgcactctg cagcgttctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 716
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 716
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtgactctc cagcgttctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 717
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 717
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccagatgtt agctgga 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 718
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 718
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgactcga gcgttctc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 719
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 719
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgatcgag cgttctc 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 720
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 720
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaacgctc gaccttcgat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 721
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 721
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagacgtt agctgga 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 722
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 722
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgactctc gagcgttctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 723
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 723
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tagacgttag cgtga 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 724
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 724
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgactctcga gcgttctc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 725
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 725
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtcgacc ttggaggggg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 726
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 726
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctaacgtta gcgtga 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 727
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 727
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgtcgtcgt 
\hfill
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 728
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaacgctg gacnttccat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 729
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 729
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgacctac gtgcgttntc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 730
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 730
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atngacctac gtgcgttctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 731
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 731
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagangtt agcgt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 732
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 732
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgactctc gagngttctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 733
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 733
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtaatgc atcagggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 734
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 734
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggctgtattc ctgactgccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 735
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 735
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccatgctaac ctctagc 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 736
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 736
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagatgtt agcgtga 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 737
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 737
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgtaccttac ggtga 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 738
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 738
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgctgg tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 739
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 739
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgactctc tcgagcgttc tc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 740
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 740
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagagctt agcgtga 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 741
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 741
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgactctc gagtgttctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 742
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 742
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacgctcgac cttcgat 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 743
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 743
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcaacgctg gaccttccat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 744
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 744
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgacctac gtgcgttctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 745
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 745
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaatgctg gaccttccat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 746
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 746
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcacgctaac ctctgac 
\hfill
17 
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<210> 747
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<211> 20
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 747
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\vskip0.400000\baselineskip
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gagaacgctc cagcactgat 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 748
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagcaagctg gaccttccat 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 749
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
18 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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atggaaggtc cacgttctc 
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19 
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 755
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
tccatggcgg tcctgatgct 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
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<212> ADN
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\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
20 
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
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<222> (13)...(13)
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<223> m5c
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctaggcgtt agcgt 
\hfill
15 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 762
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtngg tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 763
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 763
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtcgg tnctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 764
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
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<222> (10)...(10)
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<223> m5c
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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atngactctn gagngttctc 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 765
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggaaggtc cagtgttctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 766
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcatgacgtt gagct 
\hfill
15 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 767
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtcaacg ttgagggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 768
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 768
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtcaagt ctgagggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 769
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 769
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 770
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 770
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccccccccc cccccccccc cccccccc 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 771
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 771
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccccccccc cccccccccc cccccccccc ccccc 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 772
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 772
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtcgc tcctgatcct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 773
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 773
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctaaacgtt agcgt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 774
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 774
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtcga tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 775
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 775
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgccgg tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 776
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 776
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaatcaacg ttgaaaaaaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 777
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 777
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccataacgt tcctgatgct 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 778
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 778
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggaggtccc accgagatcg gag 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 779
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 779
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgtcgtcgtc gtcgtcgtcg t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 780
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 780
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgctgctgc tgctgctgct g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 781
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 781
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaacgctc cgaccttcga t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 782
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 782
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagatgtt agcgt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 783
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 783
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcatgacgtt gagct 
\hfill
15 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 784
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
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<222> (8)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de FITC unido al extremo 3' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 784
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaatgctga 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 785
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de FITC unido al extremo 3' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 785
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgttga 
\hfill
10 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 786
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 3' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 786
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgttga 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 787
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 3' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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gcaatattgc 
\hfill
10 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de FITC unido al extremo 3' de la secuencia.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 788
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcaatattgc 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 789
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agttgcaact 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 790
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 790
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcttcgaa 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 791
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 791
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgtc 
\hfill
8 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 792
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccatgtcggt cctgatgct 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 793
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtttttatat aatttggg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 794
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttgtttg tcgttttgtc gtt 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 795
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 795
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgggggggg tt 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 796
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 796
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggttgggg gtt 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 797
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 797
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtggtgtag gttttgg 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 798
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 798
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaangctc gaccttcgat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 799
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 799
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgttaa cgttaacgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 800
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 800
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagcaagntg gaccttccat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 801
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 801
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaangctc cagcactgat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 802
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 3' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 802
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaangttga 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 803
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 3' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 803
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gnaatattgc 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 804
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 804
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctgctttt gtcgttttgt gctt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 805
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 805
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgcgttagc aatttaactg tg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 806
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 806
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 807
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcatgccgt gcatccgtac acagctct 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 808
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 808
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcatgccgt acacagctct 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 12
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcatcagct ct 
\hfill
12 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 810
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 810
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tgcgctct 
\hfill
8 
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<210> 811
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
cccccccccc cccccccccc 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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cccccccccc cc 
\hfill
12 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
cccccccc 
\hfill
8 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tgcatcagct ct 
\hfill
12 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcatgccgt acacagctct 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagcaagctg gaccttccat 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgttaa cgttaacgtt aacgttaacg tt 
\hfill
32 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaacgctc gaccttcgat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 819
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<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 819
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtccccattt cccagaggag gaaat 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 25
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<400> 820
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagcggctg acgtcatcaa gctag 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 821
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 821
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagcttgat gacgtcagcc gctag 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 822
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggctgacgt catcaa 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgacgtg 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 824
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 824
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgacgtcat 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 825
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attcgatcgg ggcggggcga g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 826
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 826
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgccccgc cccgatcgaa t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 827
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gactgacgtc agcgt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 828
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagcggctg acgtcataaa gctagc 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 829
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 829
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagctttat gacgtcagcc gctagc 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 830
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 830
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagcggctg agctcataaa gctagc 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 831
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 831
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagtggctg acgtcatcaa gctag 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 832
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 832
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaccacgt ggtctatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 833
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaatgaaa gattttatta taag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 834
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 834
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctaaaaacc atctattctt aaccct 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 835
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 835
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agctcaacgt catgc 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 836
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 836
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaacggtgg tagcggtatt ggtc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 837
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 837
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaagaccaa taccgctacc accg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 838
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 838
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatctagtga tgagtcagcc ggatc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 839
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 839
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatccggctg actcatcact agatc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 840
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 840
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaagacgt tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 841
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 841
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt ccctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 842
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 842
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaccacgt ggctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 843
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 843
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccacgtggac ctctagc 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 844
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 844
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcagaccacg tggtcgggtg ttcctga 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 845
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 845
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcaggaacac ccgaccacgt ggtctga 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 846
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 846
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catttccacg atttccca 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 847
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 847
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcctctctg caagagact 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 848
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 848
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtatctctc tgaaggact 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 849
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 849
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ataaagcgaa actagcagca gtttc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 850
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 850
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaactgctg ctagtttcgc tttat 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 851
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 851
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcccaaaga ggaaaatttg tttcatacag 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 852
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 852
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtatgaaa caaattttcc tctttgggca 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 853
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 853
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttagggttag ggttagggtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 854
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 854
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgagct tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 855
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 855
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaacatgac gttcaaaaaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 856
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 856
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaacatgac gttcgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 857
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 857
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggcatgag cttcgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 858
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 858
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctaggctgac gtcatcaagc tagt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 859
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 859
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctgacgtca tctgacgttg gctgacgtct 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 860
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 860
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaattagta atagatatag aagtt 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 861
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 861
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttacctttt ataaacataa ctaaaacaaa 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 862
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 862
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgttttttt ttgcg 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 863
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 863
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atatctaatc aaaacattaa caaa 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 864
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 864
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctatcccag gtggttcctg ttag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 865
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 865
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 866
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 5' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 866
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgagct tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 867
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de FITC unido al extremo 3' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tiene esqueleto fosfodiéster.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 867
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttttttt ttt 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 868
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina unido al extremo 3' de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tiene esqueleto quimérico fosfororioato y fosfodiéster con fosfodiéster en el extremo 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 868
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttttttt ttt 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 869
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 869
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagcttgat gagctcagcc gctag 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 870
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 870
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcagttgtc ttgctgctta gctaa 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 871
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 871
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgagct tcctgagtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 872
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 872
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagcggctg acgtcatcaa tctag 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 873
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 873
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctagctgt gcctgtacct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 874
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 874
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgctaaagg acgtcacatt gca 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 875
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 875
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcaatgtga cgtcctttag cat 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 876
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 876
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtaggggact ttccgagctc gagatcctat g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 877
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 877
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cataggatct cgagctcgga aagtccccta c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 878
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 878
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtcaggaa ctgcaggtaa gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 879
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 879
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cataacatag gaatatttac tcctcgc 
\hfill
27 
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 880
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\vskip0.400000\baselineskip
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ctccagctcc aagaaaggac g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 881
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaagtttctg gtaagtcttc g 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctgctttt gtgcttttgt gctt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttt gtggttttgt ggtt 
\hfill
24 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tcgtcgtttg tcgttttgtc gtt 
\hfill
23 
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tcctgacgtt cggcgcgcgc cc 
\hfill
22 
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\vskip0.400000\baselineskip
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tgctgctttt gtgcttttgt gctt 
\hfill
24 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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tccatgagct tcctgagctt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttc gtcgttttga cgtt 
\hfill
24 
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
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tcgtcgtttg cgtgcgtttc gtcgtt 
\hfill
26 
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
27 
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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ttcgtcgttt tgtcgttttg tcgtt 
\hfill
25 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
15 
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 894
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctggcggt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 895
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctggcgtt gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 896
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgacgtg gaagt 
\hfill
15 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
20 
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 898
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgacgggcg gcgcgcgccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 899
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggcgtgcg gcgcgcgccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggcggtcg gcgcgcgccc 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgacggtcg gcgcgcgccc 
\hfill
20 
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggcgttcg gcgcgcgccc 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 903
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgacgtgcg gcgcgcgccc 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgctgt ctccg 
\hfill
15 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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tgtgggggtt ttggttttgg 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
aggggagggg aggggagggg 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg t 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctctctctct ctctctctct ct 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtcgacg tcgagggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 910
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 910
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atatatatat atatatatat at 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 911
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
tttttttttt tttttttttt ttttttt 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tttttttttt tttttttttt t 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 913
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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tttttttttt tttttttt 
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18 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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gctagatgtt agggg 
\hfill
15 
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<210> 916
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<211> 15
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcatgagggg gagct 
\hfill
15 
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<210> 917
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 917
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggaaggtc cagggggctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 918
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 918
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggactctg gagggggctc 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 919
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 919
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\hskip-.1em\dddseqskip
atggaaggtc caaggggctc 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 920
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\hskip-.1em\dddseqskip
gagaaggggg gaccttggat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagaaggggg gaccttccat 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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gagaaggggc cagcactgat 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtggg gcctgatgct 
\hfill
20 
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgaggg gcctgatgct 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tccatgtggg gcctgctgat 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 926
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggactctc cggggttctc 
\hfill
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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atggaaggtc cggggttctc 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggactctg gaggggtctc 
\hfill
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 929
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggaggctc catggggctc 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggactctg gggggttctc 
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 931
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgtggg tggggatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 932
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 932
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgcggg tggggatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 933
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatggggg tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 934
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatggggt ccctgatgct 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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tccatggggt gcctgatgct 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatggggt tcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 937
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 937
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatcgggg gcctgatgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagaggga gtgt 
\hfill
14 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 939
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttttttt tttttttt 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 940
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m es a ó c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m es a ó c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 940
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gmggtcaacg ttgagggmgg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 941
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 941
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggagttcg ttgagggggg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 942
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 942
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtttc cccccccccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 943
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 943
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttggggggtt tttttttttt ttttt 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 944
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 944
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttaaatttt aaaatttaaa ata 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 945
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 945
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttggtttttt tggttttttt ttgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 946
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 946
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttccctttt ccccttttcc cctc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 947
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> s es g ó c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 947
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtcatcg atgagggggg s 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 948
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 948
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgacgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 949
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 949
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgacgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 950
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 950
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgacgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 951
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 951
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgacgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 952
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 952
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<212> ADN
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\hfill
24 
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<212> ADN
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hfill
19 
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<212> ADN
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<212> ADN
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\hfill
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\hfill
22 
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22 
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<212> ADN
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\hfill
10 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 983
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<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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tcaagcttga 
\hfill
10 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
12 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcagcatgct ga 
\hfill
12 
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<210> 986
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gggggggggg gggggggggg 
\hfill
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\hfill
22 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 990
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 990
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggacgag ctcgtcgggg gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 991
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 991
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggacgta cgtcgggggg 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 992
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<211> 8
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 992
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaacgtt 
\hfill
8 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
tccataccgg tcctgatgct 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccataccgg tcctaccggt 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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gggggacgat cgttgggggg 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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ggggaacgat cgtcgggggg 
\hfill
20 
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ggggggacga tcgtcggggg g 
\hfill
21 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
gggggacgat cgtcgggggg g 
\hfill
21 
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<210> 999
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<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 999
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaagacgtta aa 
\hfill
12 
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<210> 1000
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1000
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\vskip0.400000\baselineskip
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aaagagctta aa 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1001
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1001
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
aaagangtta aa 
\hfill
12 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1002
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<211> 12
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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aaattcggaa aa 
\hfill
12 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1003
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<400> 1003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggtcatc gatgaggggg g 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1004
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggtcaac gttgaggggg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1005
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgtagctta ataacaaagc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggatcccttg agttacttct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccattccact tctgattacc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1008
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tatgtattat catgtagata 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1009
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcctacgta ttcaccctcc 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1010
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1010
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcctgcaac tactattgta 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1011
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1011
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atagaaggcc ctacaccagt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1012
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1012
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttacaccggt ctatggaggt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1013
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1013
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctaaccagat caagtctagg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1014
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1014
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctagacttg atctggttag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1015
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1015
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tataagcctc gtccgacatg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1016
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1016
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catgtcggac gaggcttata 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1017
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1017
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggtggtggg gagtaagctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1018
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1018
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagctactcc cccaccacca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1019
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1019
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccttcgatc ttcgttggga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1020
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1020
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggacttctc tttgccgtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1021
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1021
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgctgtagc ccagcgataa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1022
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1022
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accgaatcag cggaaagtga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1023
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1023
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgacgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1024
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1024
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggagaaaccc atgagctcat ctgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1025
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1025
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accacagacc agcaggcaga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1026
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1026
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagcgtgaac tgcgcgaaga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1027
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1027
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcggtaccct tgcagcggtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1028
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1028
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctggagccct agccaaggat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1029
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1029
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgactccat caccagcgat 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1030
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1030
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctgaagtaa gaaccagatg t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1031
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1031
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtgttatc tgacatacac c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1032
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1032
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aattagcctt aggtgattgg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1033
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1033
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acatctggtt cttacttcag g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1034
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1034
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ataagtcata ttttgggaac tac 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1035
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1035
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccaatcacc taaggctaat t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1036
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtcgtcg acgagggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtcgttc gaacgagggg gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1038
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggacgttc gaacgtgggg gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1039
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es 5-metilcitosina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1039
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctggcgng gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1040
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1040
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggaacgac gtcgttgggg gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1041
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1041
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggaacgta cgtcgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1042
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggaacgta cgtacgttgg gggg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1043
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1043
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtcaccg gtgagggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1044
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtcgacg tacgtcgagg gggg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1045
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggaccggt accggtgggg gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1046
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1046
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtcgacgt cgagggggg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1047
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtcgacg tcgagggg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1048
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1048
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggaacgtt aacgttgggg gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1049
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1049
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggacgtcg acgtggggg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1050
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1050
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcactcttcg aagctacagc cggcagcctc tgat 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1051
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1051
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggctcttcc atgaggtctt tgctaatctt gg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1052
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1052
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggctcttcc atgaaagtct ttggacgatg tgagc 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1053
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1053
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgcaggt taagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1054
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1054
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggtcgtt cgttgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1055
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1055
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggatgat tgttgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1056
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1056
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggangat ngttgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1057
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1057
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggagcta gcttgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1058
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1058
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggttcttttg gtccttgtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1059
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1059
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggttcttttg gtcctcgtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1060
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1060
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggttcttttg gtccttatct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1061
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1061
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggttcttggt ttccttgtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1062
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1062
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggtcttttg gtccttgtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1063
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1063
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggttcaaatg gtccttgtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1064
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1064
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtcttttg ggccttgtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1065
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaggactt ctctcaggtt tttt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaaaactt ctctcaaatt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tactactttt atacttttat actt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1068
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1068
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1069
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgttgttgt tgtttgttgt tgttg 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggctccgggg agggaatttt tgtctat 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggacgatcg tcggggggg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtcgtcga cgaggggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1073
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtcgtcgac gaggggggg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<400> 1074
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtcgtcgt cgtggggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1075
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggacgatc gtcggggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1076
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggacgtcg tcgtgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1077
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtcgacg tcgacgtcga ggggggg 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggaaccgc ggttgggggg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1079
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1079
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggacgacg tcgtgggggg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1080
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<400> 1080
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtcgt cgtcgtgggg ggg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1081
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1081
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgccggg gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1082
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1082
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgcaggg gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1083
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1083
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgaaggg gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1084
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1084
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctggcggg caagt 
\hfill
15 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1085
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1085
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctggcggg taagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1086
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1086
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctggcggg aaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1087
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccgggcggg gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1088
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1088
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcggggcggg gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1089
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1089
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcccggcggg gaagt 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1090
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1090
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggacgtt ggggg 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1091
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1091
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtttttt ttttgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1092
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1092
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggcccccc ccccgggggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1093
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1093
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggttgttg ttgttggggg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1094
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1094
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttttttt tttttttttt tttttttttt 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1095
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1095
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1096
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1096
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
cccccccccc cccccccccc cccccccccc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1097
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1097
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\hskip-.1em\dddseqskip
cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg 
\hfill
30 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1098
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<211> 12
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
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<400> 1098
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gattttatcg tc 
\hfill
12 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1099
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<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1099
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgatttttc ga 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<400> 1100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcatttttat ga 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1101
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<211> 12
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1101
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gttttttacg ac 
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12 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1102
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaatttttt ga 
\hfill
12 
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<211> 12
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1103
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgtttttac gt 
\hfill
12 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 12
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1104
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtttttac ga 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
16 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1106
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<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aattttttaa cgtt 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtttttta acga 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgtttttta acgt 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatttttatc gtc 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacgattttt cgtc 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gattttagct cgtc 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatttttacg tc 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1113
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attttatcgt 
\hfill
10 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacgattttt cgtt 
\hfill
14 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcacttttgt ga 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtatttta 
\hfill
10 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1117
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acttttgtac cggt 
\hfill
14 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1118
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgatttttc gacgtcga 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1119
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgatttttc gt 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgatcgtc 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1121
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgatgtcga 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcatgtatga 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1123
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgttacgac 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaatgttga 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1125
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgtgtacgt 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtgtacga 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1127
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1127
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgatgtacg tcga 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatgttaacg tt 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1129
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtgttaac ga 
\hfill
12 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1130
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgtgttaac gt 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1131
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgtatcgt c 
\hfill
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1132
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacgatgtcg tc 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1133
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgagctcg tc 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1134
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\vskip0.400000\baselineskip
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gatgtacgtc 
\hfill
10 
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<210> 1135
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<211> 8
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1135
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atgatcgt 
\hfill
8 
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<210> 1136
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<211> 12
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1136
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aacgatgtcg tt 
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12 
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<210> 1137
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1137
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tcactggtga 
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10 
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<210> 1138
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<211> 8
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1138
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tcgtatga 
\hfill
8 
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<210> 1139
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<211> 12
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1139
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actggtaccg gt 
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12 
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<210> 1140
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1140
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tcgatgtcga cgtcga 
\hfill
16 
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<210> 1141
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1141
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acgatgtcgt 
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10 
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<210> 1142
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1142
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tgcaggaagt ccgggttttc cccaaccccc c 
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31 
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<210> 1143
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<211> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia sintética
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<400> 1143
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gacgtt 
\hfill
6 
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<210> 1144
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<211> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1144
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gtcgtt 
\hfill
6 
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<211> 8
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1145
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtcgtt 
\hfill
8

Claims (83)

1. Un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py, que es un ácido nucleico rico en T, que es mayor que el 60% en T y contiene un dinucleótido CpG, para usar en un método de estimulación de una respuesta inmune que comprende la administración del ácido nucleico inmunoestimulador a un sujeto no roedor en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune en un sujeto no roedor.
2. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico inmunoestimulador rico en T es un ácido nucleico poli T que comprende;
5'TTTT 3'
3. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 2, en el que:
a) el ácido nucleico poli T comprende
5'X_{1}X_{2}TTTTX_{3}X_{4}3'
en la que X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4}, son nucleótidos; y/o
b) el ácido nucleico inmunoestimulador rico en T comprende una pluralidad de motivos de ácidos nucleicos poli T.
4. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 3, en el que X_{1}X_{2} es seleccionado del grupo que consiste de TT, TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA y GC, y es preferiblemente TT, y/o X_{3}X_{4} es seleccionado del grupo que consiste de TT, TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA y GC, y es preferiblemente TT.
5. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico inmunoestimulador rico en T comprende una composición nucleotídica mayor que el 80% en T.
6. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico inmunoestimulador:
a) comprende al menos 20 o al menos 24 nucleótidos;
b) tiene un esqueleto nucleótido que incluye al menos una modificación del esqueleto, opcionalmente una modificación fosforotioato, y/o en la que el esqueleto nucleótido es quimérico y/o completamente modificado
c) está libre de dinucleótidos CpG metilados;
d) está libre de secuencias poli C;
e) incluye como una secuencia poli A;
f) incluye una secuencia poli G;
g) comprende una composición nucleotídica mayor que el 25% de C;
h) comprende una composición nucleotídica mayor que el 25% de A;
i) es administrado oralmente;
j) es administrado localmente;
k) es administrado en un dispositivo de liberación sostenida;
l) es administrado mucosalmente en una superficie mucosa,
m) comprende además un motivo TG;
n) incluye al menos dos secuencias poli C de al menos 3 residuos nucleótidos contiguos; y/o
o) está libre de dos secuencias poli A de al menos 3 residuos nucleótidos A contiguos.
\newpage
7. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 6, que es administrado mucosalmente en una superficie mucosa seleccionada del grupo que consiste de una superficie oral, nasal, rectal, vaginal u ocular.
8. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 6, que es administrado mucosalmente en una superficie mucosa, en la que la respuesta inmune es una respuesta inmune mucosa o respuesta inmune sistémica.
9. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 1, en la que el sujeto está expuesto a un antígeno, y en el que la respuesta inmune es una respuesta inmune específica de antígeno.
10. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 9, en la que dicho antígeno es un antígeno peptídico.
11. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 9, en la que un vector ácido nucleico que codifica el antígeno es administrado al sujeto, y en el que el vector de ácido nucleico es separado del ácido nucleico inmunoestimulador.
12. Un método ex vivo de activación de una célula inmune aislada que comprende el contacto de la célula inmune con una cantidad de un ácido nucleico inmunoestimulador, seleccionado del grupo que consiste de ácidos nucleicos ricos en Py y ácidos nucleicos TG, eficaces para activar la célula inmune.
13. Un método como se reivindica en la reivindicación 12, en el que la célula inmune es un leucocito o una célula dendrítica.
14. Un método como se reivindica en la reivindicación 13, en el que la célula inmune es puesta además en contacto con un antígeno.
15. Un método como se reivindica en la reivindicación 14, en el que el antígeno es seleccionado del grupo que consiste en un antígeno tumoral, un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno parasítico.
16. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar asma, para usar en un método de tratamiento o prevención del asma.
17. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar alergia, para usar en un método de tratamiento o prevención de la alergia.
18. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 1, en la que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer, para usar en un método de tratamiento o prevención del cáncer.
19. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 18, en el que el cáncer es seleccionado del grupo que consiste en cáncer del tracto biliar, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer cervical, coriocarcinoma, cáncer del SNC, cáncer de colon, cáncer de tejido conectivo, cáncer endometrial, cáncer ocular, cáncer gástrico, neoplasma intraepitelial, cáncer de laringe, linfomas, linfoma de Hodgkin, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo cáncer de células pequeñas y células no pequeñas), melanoma, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer de la cavidad oral, cáncer de ovarios, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer rectal, sarcomas, cáncer de tiroides, cáncer renal, cáncer de huesos, cáncer de esófago, cáncer de piel y cáncer testicular, así como otros carcinomas y sarcomas.
20. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 18, en el que es también administrado una terapia anti cáncer.
21. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 20, en el que la terapia anti cáncer es un anticuerpo, un agente quimioterapéutico, un agente inmunoterapéutico o una vacuna cancerígena.
22. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 18, en el que el sujeto es un humano, un perro, un gato o un caballo.
23. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 1, en el que un anticuerpo específico para un antígeno de superficie celular es también administrado y en el que la respuesta inmune tiene como resultado una citotoxicidad celular dependiente de antígeno (ADCC).
24. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad infecciosa, para el uso en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad infecciosa.
25. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 23 ó 24, en el que el sujeto es una persona, un perro, un gato, un caballo, una vaca, un cerdo, una oveja, una cabra, un pollo, un mono o un pez.
26. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 23 ó 24, en el que un antígeno es administrado también al sujeto.
27. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 26, en el que dicho antígeno es seleccionado del grupo que consiste en un antígeno bacteriano, un antígeno viral, un antígeno parasítico, o un antígeno fúngico o dicho antígeno es derivado de un microorganismo seleccionado de un grupo que consiste en herpesviridae, retroviridae, ortomiroviridae, toxoplasma, haemophilus, campilobacter, clostridium, E.coli, y staphylococcus.
28. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 6, en el que el ácido nucleico TG comprende
5'N_{1}X_{1}TGX_{2}N_{2}3'
en el que N_{1} es opcionalmente una secuencia de ácidos nucleicos compuesta de un número de nucleótidos que oscila desde (11-N_{2}) hasta (21-N_{2}), N_{2} es opcionalmente una secuencia de ácidos nucleicos compuesta de un número de nucleótidos que oscilan desde (11-N_{1}) hasta (21-N_{1}) y X_{2} es opcionalmente timidina.
29. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 6, en el que el ácido nucleico TG comprende
5'N_{1}X_{1}X_{2}TGX_{3}X_{4}N_{2}3'
en el que N_{1} es opcionalmente una secuencia de ácidos nucleicos compuesta de un número de nucleótidos que oscila desde (9-N_{2}) hasta (19-N_{2}), N_{2} es opcionalmente una secuencia de ácidos nucleicos compuesta de un número de nucleótidos que oscilan desde (9-N_{1}) hasta (19-N_{1}), X_{3} es opcionalmente timidina, X_{1}X_{2} son opcionalmente nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA y TT y X_{3}X_{4} son opcionalmente nucleótidos seleccionados del grupo que consiste de TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA y CA o del grupo que consiste en TT, TC, TA y TG.
30. Un ácido nucleico inmunoestimulador seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en T que es mayor que el 60% en T y que contiene un dinucleótido CpG, y un ácido nucleico TG que está libre de dinucleótidos CpG, para usar en un método para prevenir enfermedades en un sujeto, que comprende la administración al sujeto del ácido nucleico inmunoestimulador en una base regular para prevenir enfermedades en el sujeto.
31. Un ácido nucleico inmunoestimulador seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en T que es mayor que el 60% de T y que contiene un dinucleótido CpG, y un ácido nucleico TG que está libre de dinucleótidos CpG, para usar en un método para inducir una respuesta inmune innata, que comprende la administración al sujeto del ácido nucleico inmunoestimulador en una cantidad eficaz para activar una respuesta inmune innata.
32. Una composición que comprende un dispositivo de liberación sostenida que incluye un ácido nucleico inmunoestimulador seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en T y un ácido nucleico TG, en el que el ácido nucleico inmunoestimulador está libre de motivos CpG sin metilar y opcionalmente, tiene un esqueleto fosfodiéster.
33. Una composición de un suplemento nutricional que comprende un ácido nucleico inmunoestimulador seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en T y un ácido nucleico TG en un dispositivo de suministro seleccionado del grupo que consiste en una cápsula, una pastilla, y una tableta sublingual, en el que el ácido nucleico inmunoestimulador está libre de motivos CpG sin metilar y opcionalmente, tiene un esqueleto fosforotioato.
34. Una composición que comprende un ácido nucleico inmunoestimulador y un antígeno, en el que el ácido nucleico inmunoestimulador está libre de motivos CpG sin metilar y es seleccionado del grupo que consiste de un ácido nucleico inmunoestimulador que comprende la secuencia
5'N_{1}X_{1}X_{2}TGX_{3}X_{4}N_{2}3'
en la que X_{1}X_{2} es seleccionado del grupo que consiste en GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA y TT y X_{3}X_{4} es seleccionado del grupo que consiste en TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA y CA, y
a) el ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py que comprende la secuencia
5'X_{1}X_{2}TTTTX_{3}X_{4}3'
en la que X_{1}X_{2} es seleccionado del grupo que consiste en TA, TG, TC, AA, AG, AC, CC, CA, GG, GA y GC y X_{3}X_{4} es seleccionado del grupo que consiste en AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA y GC.
35. Una composición que comprende un ácido nucleico inmunoestimulador y un agente antimicrobial en el que el ácido nucleico inmunoestimulador está libre de motivos CpG sin metilar y es seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en T y un ácido nucleico TG.
36. La composición como se reivindica en la reivindicación 35, en la que el agente antimicrobial es seleccionado del grupo que consiste en un agente antiviral, un agente antifúngico, un agente antiparasítico, y un agente antibacteriano.
37. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 3 en el que:
a) el ácido nucleico inmunoestimulador comprende al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 motivos poli T;
b) al menos 2 de la pluralidad de los motivos poli T comprende cada uno al menos tres residuos nucleótidos T contiguos;
c) al menos dos de los motivos poli T comprende cada uno al menos cuatro residuos nucleótidos T contiguos;
d) la pluralidad de los motivos poli T es al menos 3 motivos poli T y en los que al menos 3 motivos poli T comprende cada uno al menos 3 residuos nucleótidos T contiguos;
e) la pluralidad de los motivos poli T es al menos 4 motivos poli T y en los que al menos 4 motivos poli T comprenden cada uno al menos 3 residuos nucleótidos T contiguos; y/o
f) al menos uno de la pluralidad de los motivos de ácidos nucleótidos poli T comprende al menos 5, al menos 6, al menos 7, o al menos 8 residuos nucleotídicos T contiguos; y/o
g) el ácido nucleico comprende además una pluralidad de motivos CpG, en la que la pluralidad es al menos 3 motivos o al menos 4 motivos y en los que al menos 4 motivos comprenden cada uno al menos 3 residuos nucleótidos T contiguos y la pluralidad de los motivos CpG y los motivos poli T están preferiblemente intercalados.
38. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz para la estimulación de una respuesta inmune de un ácido nucleico inmunoestimulador aislado como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 12, 13, 28, 29 y 37 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
39. Una composición de materia que comprende un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 12, 13, 28, 29 y 37 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
40. Una composición que comprende un ácido nucleico inmunoestimulador y un terapia anti cancerígena, formulada en un excipiente farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz para tratar un cáncer o reducir el riesgo de desarrollar un cáncer, en el que el ácido nucleico inmunoestimulador es seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en T que es mayor que el 60% en T y contiene un dinucleótido CpG, y un ácido nucleico que está libre de dinucleótidos CpG.
41. Una composición que comprende un ácido nucleico inmunoestimulador y un medicamento para el asma/alergia, formulado en un excipiente farmacéuticamente aceptable y en una cantidad eficaz para prevenir o tratar una respuesta inmune asociada con la exposición a un mediador del asma o alergia, en el que el ácido nucleico inmunoestimulador es seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en T que es mayor que el 60% en T y contiene un dinucleótido CpG y un ácido nucleico TG que está libre de dinucleótidos CpG.
42. Una composición que comprende un ácido nucleico inmunoestimulador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nº: 95-119, SEQ ID Nº: 121-136, SEQ ID Nº: 138-152, SEQ ID Nº: 154-210, SEQ ID Nº: 212-222, SEQ ID Nº: 224-244, SEQ ID Nº: 247-260, SEQ ID Nº: 263-272, SEQ ID Nº: 274-299, SEQ ID Nº: 301, SEQ ID Nº: 303-409, SEQ ID Nº: 414-420, SEQ ID Nº: 424,SEQ ID Nº: 427-758, SEQ ID Nº: 760-947, SEQ ID Nº: 959-963, SEQ ID Nº: 968-1022 y SEQ ID Nº: 1024-1093, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
43. Una composición que comprende un ácido nucleico inmunoestimulador que consiste esencialmente en:
5'M_{1}TCGTCGTTM_{2}3'
en el que al menos una de las Cs está sin metilar, en el que M_{1} es un ácido nucleico que tiene al menos un nucleótido, en el que M_{2} es un ácido nucleico que tiene entre 0 y 50 nucleótidos, y en el que el ácido nucleico inmunoestimulador tiene menos de 100 nucleótidos.
44. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico inmunoestimulador
5'TCGTCGTT3'
en el que al menos una de las Cs está sin metilar, en el que el ácido nucleico inmunoestimulador tiene menos de 100 nucleótidos y un esqueleto fosfodiéster, opcionalmente comprende además un antígeno, y un dispositivo de liberación sostenida, preferiblemente una micropartícula.
45. Un ácido nucleico inmunoestimulador TG que está libre de dinucleótidos CpG para usar en un método de estimulación de una respuesta inmune, que comprende la administración del ácido nucleico inmunoestimulador TG a un sujeto no roedor en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune en un sujeto.
46. Una composición que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácidos nucleicos de TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT (SEQ ID Nº: 343).
47. Una composición como se reivindica en la reivindicación 46 para el uso en un método de tratamiento o prevención de la alergia o el asma que comprende la administración de la composición a un sujeto no roedor con necesidad del mismo en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la alergia o el asma.
48. Un ácido nucleico inmunoestimulador que comprende la secuencia
5'N_{1}X_{1}X_{2}TGX_{3}X_{4}N_{2}3'
en la que X_{1}X_{2} es seleccionado del grupo que consiste en GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA y TT, X_{3}X_{4} es seleccionado del grupo que consiste en TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA y CA y el ácido nucleico está libre de un dinucleótido CpG, o un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py que comprende la secuencia
5'X_{1}X_{2}TTTTX_{3}X_{4}3'
en la que X_{1}X_{2} es seleccionado del grupo que consiste en TA, TG, TC, AA, AG, AC, CC, CA, GG, GA y GC, X_{3}X_{4} es seleccionado del grupo que consiste en AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA y GC y el ácido nucleico está libre de un dinucleótido CpG, para usar en un método de estimulación de una respuesta inmune que comprende la administración del ácido nucleico inmunoestimulador TG o el ácido nucleico rico en Py a un sujeto no roedor en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune en el sujeto.
49. Un ácido nucleico inmunoestimulador como se reivindica en la reivindicación 45, que es un ácido nucleico rico en T y que comprende preferiblemente una composición nucleótida mayor que el 25% en T, mayor que el 35% en T, mayor que el 40% en T, mayor que el 50% en T o mayor que el 60% en T.
50. Un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py, que es un ácido nucleico rico en T y que está libre de un dinucleótido CpG sin metilar, para el uso en un método de estimulación de una respuesta inmune innata no específica de un antígeno, que comprende la administración del ácido nucleico inmunoestimulador a un sujeto no roedor en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune innata no específica de un antígeno en un sujeto no roedor.
51. Un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py, que es un ácido nucleico rico en T y que está libre de un dinucleótido CpG sin metilar, para el uso en un método de redirección de una respuesta inmune Th2 a una respuesta inmune Th1, que comprende la administración del ácido nucleico inmunoestimulador a un sujeto no roedor en una cantidad eficaz para redirigir una respuesta inmune Th2 a una respuesta inmune Th1.
52. El uso de un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py, que es un ácido nucleico rico en T que es mayor que el 60% en T y contiene un dinucleótido CpG, para la fabricación de un medicamento para la administración a un sujeto no roedor en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune en un sujeto no roedor.
53. Un uso según la reivindicación 52, en el que dicho ácido nucleico inmunoestimulador es como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 2 a la 5 y 37.
54. Un uso según la reivindicación 52, en el que dicho ácido nucleico inmunoestimulador:
a) comprende al menos 20 o al menos 24 nucleótidos;
b) tiene un esqueleto nucleótido que incluye al menos una modificación del esqueleto, opcionalmente una modificación fosforotioato, y/o en la que el esqueleto nucleótido es quimérico y/o completamente modificado
c) está libre de dinucleótidos CpG metilados;
d) está libre de secuencias poli C;
e) incluye una secuencia poli A;
f) incluye una secuencia poli G;
g) comprende una composición nucleótida mayor que el 25% en C;
h) comprende una composición nucleótida mayor que el 25% en A;
i) además comprende un motivo TG;
j) incluye al menos dos secuencias poli C de al menos 3 residuos nucleótidos contiguos; y/o
k) está libre de dos secuencias poli A de al menos 3 residuos nucleótidos A contiguos.
55. Un uso según la reivindicación 52, en el que dicho medicamento es para ser administrado oralmente; localmente; en un dispositivo de liberación sostenida y/o mucosamente en una superficie mucosa.
56. Un uso según la reivindicación 55, en el que dicho medicamento es para ser administrado mucosalmente en una superficie mucosa, y en el que dicha superficie mucosa es seleccionada del grupo que consiste en una superficie oral, nasal, rectal, vaginal u ocular.
57. Un uso como se reivindica en la reivindicación 55, en el que dicho medicamento es para ser administrado mucosalmente en una superficie mucosa, y en la que la respuesta inmune es una respuesta inmune mucosa o una respuesta inmune sistémica.
58. Un uso según la reivindicación 52, en el que dicho medicamento es para la administración con un antígeno, y en la que la respuesta inmune es una respuesta inmune específica de antígeno.
59. Un uso según la reivindicación 58, en el que dicho antígeno es un antígeno peptídico.
60. Un uso según la reivindicación 58, en el que dicho antígeno es proporcionado por un vector de ácidos nucleicos que codifica un antígeno, y en el que el vector de ácidos nucleicos está separado del ácido nucleico inmunoestimulador.
61. Un uso según la reivindicación 52, en el que el medicamento es para el tratamiento o prevención del asma en el sujeto no roedor, y dicho sujeto no roedor tiene o está en riesgo de desarrollar asma.
62. Un uso según la reivindicación 52, en el que el medicamento es para el tratamiento o prevención de la alergia en el sujeto no roedor, y dicho sujeto no roedor tiene o está en riesgo de desarrollar una alergia.
63. Un uso según la reivindicación 52, en el que el medicamento es para el tratamiento o prevención del cáncer en el sujeto no roedor, y dicho sujeto no roedor tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer.
64. El uso según la reivindicación 63 en el que el cáncer es seleccionado del grupo que consiste en cáncer del tracto biliar, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer cervical, coriocarcinoma, cáncer del SNC, cáncer de colon, cáncer del tejido conectivo, cáncer endometrial, cáncer ocular, cáncer gástrico, neoplasmas intraepiteliales, cáncer de laringe, linfomas, linfoma de Hodgkin, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de células pequeñas y de células no pequeñas), melanoma, neuroblastomas, cáncer oral, cáncer de la cavidad oral, cáncer de ovarios, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer rectal, sarcomas, cáncer de tiroides, cáncer renal, cáncer de huesos, cáncer esofágico, cáncer de piel y cáncer testicular así como otros carcinomas y sarcomas.
65. Un uso como se reivindica en la reivindicación 63, en el que dicho medicamento es para administración junto con una terapia anticancerígena.
66. Un uso como se reivindica en la reivindicación 65, en el que dicha terapia anticancerígena es seleccionada del grupo que consiste en: un anticuerpo, un agente quimioterapéutico, un agente inmunoterapéutico o una vacuna cancerígena.
67. Un uso como se reivindica en la reivindicación 63, en el que el sujeto es un humano, un perro, un gato o un caballo.
68. Un uso como se reivindica en la reivindicación 52, en el que dicho medicamento es para ser suministrado junto con un anticuerpo específico para un antígeno de superficie celular y en la que los resultados de la respuesta inmune en un antígeno dependen de la citotoxicidad celular (ADCC).
69. Un uso como se reivindica en la reivindicación 52, en la que el medicamento es para el tratamiento o prevención de una enfermedad infecciosa en el sujeto no roedor, dicho sujeto no roedor tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad infecciosa.
70. Un uso según la reivindicación 68 o reivindicación 69, en el que dicho sujeto es un humano, un perro, un gato, un caballo, una vaca, un cerdo, una oveja, una cabra, un pollo, un mono o un pez.
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71. Un uso según la reivindicación 68 o reivindicación 69, en el que dicho medicamento es para la administración con un antígeno.
72. Un uso según la reivindicación 71, en el que dicho antígeno es seleccionado del grupo que consiste en: un antígeno bacteriano, un antígeno viral, un antígeno parasítico, o un antígeno fúngico o dicho antígeno es derivado de un microorganismo seleccionado del grupo que consiste de herpesviridae, retroviridae, ortomiroviridae, toxoplasma, haemophilus, campilobacter, clostridium, E. coli, y staphylococcus.
73. Un uso según la reivindicación 54, en el que el ácido nucleico TG comprende
5'N_{1}X_{1}TGX_{2}N_{2}3'
en el que N_{1} es opcionalmente una secuencia de ácido nucleico compuesto de un número de nucleótidos que oscila desde (11-N_{2}) hasta (21-N_{2}), N_{2} es opcionalmente una secuencia de ácidos nucleicos compuesta de un número de nucleótidos que oscilan desde (11-N_{1}) hasta (21-N_{1}) y X_{2} es opcionalmente timidina.
74. Un uso según la reivindicación 54, en el que el ácido nucleico TG comprende
5'N_{1}X_{1}X_{2}TGX_{3}X_{4}N_{2}3'
en el que N_{1} es opcionalmente una secuencia de ácido nucleico compuesta de un número de nucleótidos que oscila desde (9-N_{2}) hasta (19-N_{2}), N_{2} es opcionalmente una secuencia de ácidos nucleicos compuesta de un número de nucleótidos que oscilan desde (9-N_{1}) hasta (19-N_{1}), X_{3} es opcionalmente timidina, X_{1}X_{2} son opcionalmente nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA y TT y X_{3}X_{4} son opcionalmente nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA y CA o del grupo que consiste en TT, TC, TA y TG.
75. El uso de un ácido nucleico inmunoestimulador seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en T que es mayor que el 60% en T y que contiene un dinucleótido CpG y un ácido nucleico TG que está libre de dinucleótidos CpG para la fabricación de un medicamento para la administración al sujeto en una base regular para prevenir enfermedades en el sujeto.
76. El uso de un ácido nucleico inmunoestimulador seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico rico en T que es mayor que el 60% en T y que contiene un dinucleótido CpG y un ácido nucleico TG que está libre de dinucleótidos CpG para la fabricación de un medicamento para la administración al sujeto en una cantidad eficaz para activar una respuesta inmune innata.
77. Un uso como se reivindica en la reivindicación 52, en el que dicho medicamento comprende una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 32 a la 36, y de la 38 a la 44.
78. El uso de un ácido nucleico inmunoestimulador TG que está libre de dinucleótidos CpG para la fabricación de un medicamento para la administración a un sujeto no roedor en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune en el sujeto.
79. El uso de una composición como se reivindica en la reivindicación 46, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la alergia o asma, para ser administrado a un sujeto no roedor con la necesidad del mismo en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la alergia o el asma.
80. El uso de un ácido nucleico inmunoestimulador que comprende la secuencia
5'N_{1}X_{1}X_{2}TGX_{3}X_{4}N_{2}3'
en la que X_{1}X_{2} es seleccionado del grupo que consiste en GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA y TT y X_{3}X_{4} es seleccionado del grupo que consiste en TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA y CA y el ácido nucleico está libre de un dinucleótido CpG, o un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py que comprende la secuencia
5'X_{1}X_{2}TTTTX_{3}X_{4}3'
en la que X_{1}X_{2} es seleccionado del grupo que consiste en TA, TG, TC, AA, AG, AC, CC, CA, GG, GA y GC, X_{3}X_{4} es seleccionado del grupo que consiste en AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA y GC y el ácido nucleico está libre de un dinucleótido CpG para la fabricación de un medicamento, para la administración a un sujeto no roedor, en una cantidad eficaz, para inducir una respuesta inmune en el sujeto.
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81. Un uso según la reivindicación 80, en el que dicho ácido nucleico inmunoestimulador TG es un ácido nucleico rico en T y comprende preferiblemente una composición nucleotídica mayor que el 25% en T, mayor que el 35% en T, mayor que el 40% en T, mayor que el 50% en T o mayor que el 60% en T.
82. El uso de un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py, que es un ácido nucleico rico en T y está libre de un dinucleótido CpG sin metilar para la fabricación de un medicamento para la administración a un sujeto no roedor en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune innata no específica de antígeno en el sujeto no roedor.
83. El uso de un ácido nucleico inmunoestimulador rico en Py, que es un ácido nucleico rico en T y está libre de un dinucleótido CpG sin metilar para la fabricación de un medicamento para la administración a un sujeto no roedor en una cantidad eficaz para redirigir una respuesta inmune Th2 a una respuesta inmune Th1.
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