CN1575184A - 治疗免疫复合物相关疾病的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗免疫复合物相关疾病(ICAD)的方法和组合物，用于患有ICAD的受试者或者ICAD高危受试者，所述ICAD的实例包括SLE、类风湿性关节炎、丙型肝炎相关的免疫复合物疾病(例如冷球蛋白血症)。本发明基于如下令人意外的发现，即含有染色质的免疫复合物通过双受体结合过程而活化自身反应性B细胞和树突状细胞，并且在这两种细胞中均涉及Toll样受体(TLR)。治疗ICAD的方法包括：给予需要治疗的个体一种具有如下属性的化合物：或者1)抑制免疫复合物的形成，其或者通过阻止其形成，和/或通过与TLR相结合而实现上述功能；或者2)干扰含有自身抗原的免疫复合物(或其抗原成分)与TLR相结合；或者3)抑制由BCR和TLR(在B细胞中)或FcR和TLR(在树突状细胞中)双结合(通过免疫复合或未复合的自身抗原)所启动的信号通路。

Description

治疗免疫复合物相关疾病的方法和组合物
本发明是在政府支持下进行的，由国立卫生研究院给予资助，合同号为R01 AR-35230和K08 DK-02597。政府在该发明中享有一定权利。
技术领域
本发明涉及治疗免疫复合物相关疾病的方法和组合物，特别适用于系统性红斑狼疮(SLE)以及与患有Toll样受体(TLR)/Bcell受体(BCR)双结合(在B cells中)或者TLR/Fc gamma受体双结合(在树突状细胞和/或巨噬细胞)异常的患者相关的其他系统性自身免疫疾病。
背景技术
自身免疫疾病是一系列很常见的疾病，但目前对其知之甚少；在患有自身免疫疾病的个体中，其免疫系统或者1)开始将自身抗原作为外源抗原加以识别，并且开始破坏表达此类抗原的组织从而引发疾病；或者2)与这些抗原形成免疫复合物，这些免疫复合物随后沉积在组织中并引发炎症反应。此类自身免疫疾病包括：例如，糖尿病，其中免疫系统发生转变，破坏产生胰岛素的胰岛细胞；多发性硬化症，其中目标抗原是髓鞘保护的神经元，导致运动神经元功能的破坏；牛皮癣，其中免疫系统的目标是皮肤；类风湿性关节炎，其中目标器官是软骨；以及系统性红斑狼疮(SLE)，其特征是没有明显特异性或选择性地将多种组织作为靶标，但是目标抗原本身却非常一致并且很独特。由于人们对导致自身免疫疾病发展的机制总的来说还几乎一无所知，因此对它们的治疗通常是一般性地抑制免疫系统。此类一般性免疫抑制疗法往往会产生很多不良的副作用，包括癌症，不育症，对病毒、真菌、酵母和细菌的易感性增加等。因此，人们很希望能理解引起免疫系统发生转变从而识别自身抗原的机制，从而使人们可以发展出特异性更强的治疗自身免疫疾病的方法。
人们知之甚少的自身免疫疾病的一个实例是系统性红斑狼疮(SLE)，通常称为狼疮。SLE的特征是免疫系统调节失常，从而导致了抗核抗体的产生，循环系统中免疫复合物的产生以及补体系统的活化。免疫复合物在组织和关节中积累从而引发炎症以及关节和组织的降解。虽然术语“系统性”恰当地暗示了该疾病影响整个机体和大多数器官系统，但最为常见的是，该疾病涉及炎症反应以及相应的对关节、皮肤、肾、大脑、体腔膜、肺、心脏和胃肠道的损害。患有SLE的个体通常会经历预想不到的急性期或“暴发”以及同样令人意外的恢复。该疾病的病理特征是反覆、分布广以及类似皮疹的多种脉管损伤或皮肤表面的变化。
在美国，SLE的流行是一个有争议的话题。预计流行范围在250,000到2,000,000人之间。虽然在年龄很大的老人以及年龄非常小的孩子中也有报道，但该疾病主要的感染对象是育龄妇女。在孩子之中，女孩子患有SLE的比例比男孩子患SLE的比例高三倍。60％的SLE患者的发病时间在青春期和四十岁之间，在该人群中，女性与男性的比例为9∶1。此后，女性的患病比例仍然占优势，这与在青春期前的孩子们身上所观察到的相同(也就是3∶1)。此外，非洲和亚洲后裔患有该疾病的比例似乎比白种人后裔高三倍。
SLE的病因仍然不为人知。已经有人提出，遗传易感性、性激素的系统性增加以及各种环境诱因例如病毒感染在诱发该疾病的典型特征即免疫反应异常方面具有一定作用。在SLE患者之中，两种组织相容性抗原HLA-DR2和HLA-DR3的百分比提高，这暗示了遗传的作用。此外，在被感染的个体中，扩展单体型HLA-A1、B8和DR3的频率提高。在同卵双胞胎中，该疾病的一致性(concordance)进一步支持了遗传的作用。但是，该一致性比例也暗示了这种遗传易感性的多基因属性以及环境因素的作用，据报道，该一致性比例在25％到60％之间，仅仅是中等水平。
SLE精确的发病原因仍然不为人知。但是一般认为，该疾病的大部分临床表现是直接或间接地由自身抗体的产生和后续的致病免疫复合物的形成而导致的。这些由调节失常的B淋巴细胞所产生的自身抗体具有不同的特异性，识别不同的核自身抗原，包括DNA、核小体、亚核小体(subnucleosome)等。某些RNA/蛋白质复合物，包括Sm抗原以及核内小核糖核蛋白(snRNP)，是另外的特征性自身抗原种类(specificities)。致病免疫复合物通过自身抗体与其相应的核自身抗原相结合而形成。
SLE患者的自身抗体通常与其相应的自身抗原相结合并以免疫复合物(IC)的形式参加循环。在小鼠和人中，染色质或染色质片段例如DNA、核小体或亚核小体微粒是特别常见的自身抗原种类(Tan，E.Adv.Immunol.44，93-151(1989)；Monestier andNovick，Mol.Immunol.33：89-99，1996)。
因此在SLE的治疗中，最核心的目的或者是努力抑制功能失常的B淋巴细胞从而减少自身抗体的生产，或者是在免疫复合物一旦形成后，努力减少其致病性。目前，这些目的只能通过利用广谱系统性免疫抑制药物进行治疗而实现，但通常不能完全实现这些目的，其中所采用的药物例如可的松、硝基咪唑硫嘌呤、羟化氯喹以及环磷酰胺。这些疗法往往会有多种严重的不良副作用，包括感染、不育、视网膜病以及癌症。因此，人们很希望获得治疗SLE以及其他自身免疫疾病的新方法。
发明概述
因此，本发明的目的是提供用于治疗免疫复合物相关疾病(ICAD)的方法和组合物，用于患有ICAD的受试者或者ICAD高危受试者，ICAD的实例包括系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、丙型肝炎相关的免疫复合物疾病(例如冷球蛋白血症)。
我们已经发现，含有染色质的免疫复合物通过一个双受体结合过程而活化B细胞和树突状细胞。在这两种细胞中均涉及Toll样受体(Toll-like receptor，以下简称为TLR)。TLR9位于胞浆的囊泡内，是细胞活化所必需的第二个受体。对于B细胞而言，B细胞抗原受体位于细胞表面，是细胞活化所必需的第一个受体。对于树突状细胞而言，刺激性Fc gamma受体位于细胞表面，是细胞活化所必需的第一个受体。我们已经发现了一种治疗ICAD的方法，给予需要治疗的个体一种具有如下属性的化合物：或者1)抑制免疫复合物(也就是自身抗体和核自身抗原)的形成，其或者通过阻止其形成，和/或通过与Toll样受体(TLR)相结合而实现上述功能；或者2)干扰含有自身抗原的免疫复合物(或其抗原成分)与TLR相结合；或者3)抑制由BCR和TLR(在B细胞中)或FcR和TLR(在树突状细胞中)双结合(通过免疫复合(complexed)或未复合的自身抗原)所启动的信号通路。在给药时，将该化合物置于药学上可以接受的载体中。
ICAD优选为SLE、类风湿性关节炎或丙型肝炎相关的免疫复合物疾病(例如冷球蛋白血症)。在另一个实施例中，所述ICAD与器官移植后宿主的免疫反应有关。
虽然并不想受理论上的限制，但是我们相信含有自身抗原(例如染色质)的免疫复合物(immune complexes，以下简称为IC)，而不是含有外源抗原的IC，能够活化自身反应性B细胞，并且这种活化完全依赖于含有自身抗原的IC与B细胞的B细胞受体或树突状细胞的FcγR以及第二种受体(一种Toll样受体)顺序结合的能力。这一发现在先天性免疫系统和获得性免疫系统之间建立了一种新的联系，并进而建立了一种一般性机制，对蛋白质/核酸自身抗原具有特异性的自身反应性B细胞通过该机制而被活化。
本发明的一个方面提供了一种治疗患有ICAD的受试者或者ICAD高危受试者的方法，包括鉴定出一位患有ICAD的个体，并给予有效量的化合物，所述化合物能够抑制自身抗原或自身抗原/免疫复合物的形成和/或抑制自身抗原或自身抗原/免疫复合物激活B细胞或树突状细胞。
ICAD或系统性自身免疫疾病的高危人包括：至少有一位父母、祖父母或兄妹患有ICAD或系统性自身免疫疾病的个体。
所述化合物选自一个组，所述的组由与免疫复合物的组成成分相结合的化合物所构成，这些化合物或者阻止所述免疫复合物的形成，或者阻止自身抗原活化Toll样受体(TLR)。此类化合物包括：Toll样受体诱饵(decoys)，抑制MyD88活性的化合物，抑制免疫复合物成分的生产的化合物(例如反意核苷酸)，负显性(dominant-negative)TLR，Toll样受体拮抗剂，以及抑制信号通路的化合物，其中所述信号通路由免疫复合物或自身抗原片段与TLR的结合或相互作用而活化。较为理想的是，所述化合物与Toll样受体TLR2、TLR3、TLR9或其功能性结构域结合和/或抑制其功能。更为理想的是，所述TLR是TLR3、TLR9或其功能性片段。
与免疫复合物的组成成分相结合并阻止其形成或者阻止复合物与Toll样受体相结合的化合物以及抑制MyD88信号传导的化合物包括：多克隆或单克隆抗体，能够阻断野生型TLR的活性或阻断TLR介导的信号级联成分的负显性蛋白质，抑制性寡聚脱氧核苷酸(ODN)例如S-ODN 2088(Lenart，et al.，AntisenseNucleic Acid Drug Dev.4，247-256(2001))，翻译核苷酸(包括RNA和经修饰的核苷酸)，或其他的通路特异性激酶抑制剂。所述化合物中不包括氯奎。
在一个实施方案中，本发明提供了筛选能抑制复合物形成或与Toll样受体结合和/或抑制B细胞/树突状细胞活化的化合物或试剂的方法。所述方法包括将免疫复合物成分与待测试剂相接触，并检测B细胞或树突状细胞的活化和/或增殖和/或复合物与Toll样受体的结合。
在另一个实施方案中，本发明还提供了诊断ICAD的方法。该方法包括：从被怀疑患有ICAD的个体身上提取生物样品，其中含有IgG；将所述生物样品与RF+B细胞或树突状细胞一起进行培养；测定RF+B细胞或树突状细胞活化，其中，与暴露于来自对照个体的含有IgG的生物样品的RF+B细胞或树突状细胞相比，暴露于从被怀疑患有ICAD的个体身上提取的生物样品的RF+B细胞或树突状细胞活性的变化表明患有ICAD。较为理想的是，该变化是活性的增加。可以测定B细胞的活化，例如通过测定B细胞的增殖或者各种共刺激分子(例如CD80或CD86)的表达或MHC II类分子的上调节。树突状细胞的活化可以通过多种方式加以评估，例如通过测定共刺激分子的表达，细胞因子例如TNF-α的生产，或者树突状细胞表现型的变化。
在有一个实施方案中，本发明提供了一种体内模型系统，用于评价化合物或者试剂在治疗ICAD方面的功效。该模型系统包括给ICAD模型动物(包括小鼠和大鼠模型)服用一种待测试剂，并测定在此类动物中B细胞或树突状细胞的活化和/或增殖和/或复合物与Toll样受体的结合，其中，如果活化减少则表明该试剂能够治疗ICAD。可选地，人们可以使用表达Toll样受体的细胞系，并筛选调节(最好是抑制或阻断)此类受体的化合物。
本发明的其他方面将在下面进行描述。
附图说明
附图被插入到本申请的说明书中，并构成了本申请说明书的一部分；附图与说明书一起解释了本发明的实施方式，用于解释和说明本发明的目的、优点以及原理。在附图中，
图1表明AM14 RF+B细胞的抗核小体抗体(PL2-3)刺激对Dnase敏感。IgG2a抗核小体抗体与从培养物的B细胞中释放出来的染色质相结合，以形成免疫复合物，所述免疫复合物可由B细胞通过其IgG2a特异性抗原受体所识别。在加入山羊抗小鼠IgM F(ab′)2，PL2-3(IgG2aj抗核小体mAb)或LPS之前，将AM14RF+脾细胞与不同浓度的DNase I(0，5，15或50μg/ml)预培养15分钟。结果表示为在Dnase不存在的情况下对每种配体最大反应的百分比。
图2A-2B表明抗TNP/TNP-BSA IC不能有效地刺激AM14RF+B细胞的增殖。将抗TNP mAbs Hy1.2(IgG2aa)和C4010(IgG2ab)与不同浓度的TNP-BSA[50μg/ml(圆圈)，12.5μg/ml(正方形)，3.1μg/ml(上三角形)]相混合，以便形成抗体/蛋白质比例分别为1∶1、4∶1和16∶1的IC。在图2A中，通过Clq结合活性相对于未复合抗体(下三角形)的偏移而确认IC的形成。在图2B中，将上述抗TNP/TNP-BSA IC刺激RF+B细胞增殖的能力与抗核小体mAb PR1-3、未复合的Hy1.2、C4010或50μg/mlTNP-BSA所诱导的刺激相比较。
图3表明，RF+B细胞的自身抗体/自身抗原IC刺激不依赖于补体受体。利用山羊抗小鼠IgM F(ab′)2、CpG S-ODN 1826、抗核小体mAbs PR1-3(IgG2aj)、PL2-3(IgG2aj)、PL2-8(IgG2b)或来自代表性自身免疫小鼠(lpr/gld和gld)的3％血清来刺激来自两种WT对照小鼠(灰色)、RF+CR+/+小鼠(白色)以及RF+CR-/-小鼠(阴影线)的脾细胞。
图4A-4C表明，RF+B细胞的autoAb/autoAg-IC刺激依赖于MyD88。在图4A中，利用B220和个体基因型特异性抗体4G7对来自野生型(WT)和RF+MyD88-/-小鼠的被去除T的脾细胞进行染色。在图4B中，通过PCR对MyD88 WT或敲除小鼠进行鉴定。在图4C中，利用抗IgM F(ab′)2、CpG S-ODN 1826、抗核小体mAbs PR1-3、PL2-3、PL2-8或3％lpr/gld血清来刺激来自两种WT(灰色)、RF+MyD88+/+(白色)以及RF+MyD88-/-小鼠(阴影线)的脾细胞。抗IgM刺激的培养物的总cpm为83,414/39,049(WT)；93,126/61,315(RF+MyD88+/+)以及39,826/57,484(RF+MyD88-/-)。结果被表示为抗IgM反应的百分比，并代表了四个分开进行的实验。
图5A-5C表明，RF+B细胞的autoAb/autoAg-IC刺激可以被TLR9信号通路的抑制剂所阻断。在图5A中，在加入刺激性配体抗IgM F(ab′)2、5-50μg/ml PL2-3、0.3-2.0μlg/ml CpG S-ODN1826、LPS脂肽或孔蛋白B之前，将RF+B细胞与1或2μg/ml的氯奎(a)预培养15分钟，与concanamycin B(b)预培养2小时，或与抑制性CpG S-ODN 2088(c)预培养30分钟。在图5B中，在加入刺激性配体之前，将RF+B细胞与12μg/ml的CpG S-ODN 2088预培养30分钟。结果被表示为在抑制剂不存在的情况下抗IgM反应的百分比。图5A和图5C中的数据代表了2-4个试验，而图5B是两个试验的平均值。
图6A-B示出了试验结果，在所述试验中，MyD88-缺陷型(MyD88-/-)Fas-充足小鼠与MyD88-充足(MyD88+/+)Fas-缺陷型(lprlpr)自身免疫小鼠杂交，以产生MyD88-/-lpr/lpr小鼠以及合适的对照组。按照前述方法(Rifkin et al.，Journal of Immunology.161：5164-5170，1998)以HEp-2细胞为底物，通过间接免疫荧光法检测年龄匹配的MyD88+/+lprlpr(图6A)和MyD88-/-lpr/lpr(图6B)同窝小鼠(12-13周龄)血清中的抗核抗体(ANA)。来自患病的自身免疫MRL-lpr/lpr小鼠的血清作为阳性对照，来自非自身免疫BALB/c小鼠的血清作为阴性对照。该体内试验证明，在广泛使用的标准狼疮小鼠模型株系中，自身抗体的产生需要通过MyD88的信号传导。这强烈暗示，在该模型中TLR的活化对狼疮的发展是必需的。
在图7A-7B表明，B细胞可通过TLR9而被活化，并且这种活化可以被ODN 2088导致的TLR9抑制所阻断。B细胞从MRL+/+小鼠的脾脏中纯化得到，并与不同剂量的ODN 2088(一种特异性地阻断通过TLR9的信号传导的抑制性寡聚脱氧核苷酸)预培养30分钟，也可以不进行上述的预培养操作。然后向培养物中加入通过B细胞受体发挥活化作用的抗IgM F(ab′)2(抗IgM)(7A)，或者通过TLR9发挥特异性活化作用的(7B)刺激性ODN 1826。在20-24小时之后，向培养物中加入3[H]胸腺嘧啶核苷，在另外的14-18小时之后，通过检测胸腺嘧啶核苷的掺入而确定增殖，其中使用了LKB Wallac 1212 Rackbeta counter。只有通过TLR9的刺激被ODN 2088阻断，这表明了抑制效果的特异性：由B细胞受体交联所诱导的刺激没有被抑制。
图8A-8C表明，树突状细胞可以通过TLR9被特异性地活化，并且这种活化可以被ODN 2088导致的TLR9抑制所阻断。
图9表明，ODN 2088对含有染色质的免疫复合物所介导的B细胞增殖的抑制性效果是长期的。B细胞从MRL+/+小鼠的脾脏中纯化得到，并与12μg/ml的ODN 2088(一种特异性地阻断通过TLR9的信号传导的抑制性寡聚脱氧核苷酸)预培养16-20小时，也可以不进行上述的预培养操作。在预培养之后冲洗细胞以便将ODN 2088从培养物中除去，然后培养B细胞，或者单独用培养基培养，或者与新鲜的浓度为12μg/ml的ODN 2088一起培养。三十分钟之后，向培养物中加入抗染色质单克隆抗体PL2-3(50μg/ml)或LPS(10μg/ml)。在20-24小时之后，向培养物中加入3[H]胸腺嘧啶核苷，在另外的14-18小时之后，通过检测胸腺嘧啶核苷的掺入而确定增殖，其中使用了LKB Wallac 1212Rackbeta counter。
具体实施方式
本发明提供了用于治疗和/或预防免疫复合物相关疾病(ICAD)的方法和组合物，用于患有ICAD的受试者或者ICAD高危受试者。
出于本发明的目的，术语“免疫复合物相关疾病”(immunecomplex associated diseases)或“ICAD”的含义包括但不限于：系统性红斑狼疮(SLE)以及相关的结缔组织疾病、风湿性关节炎、丙型肝炎(Hepatitis-C)及乙型肝炎(Hepatitis-B)相关的免疫复合物疾病(例如冷球蛋白血症)、贝切特氏病(Behcetsdisease)、自身免疫肾小球性肾炎(autoimmuneglomerulonephritides)以及与LDL/抗LDL免疫复合物的存在有关的血管病变等疾病。
我们发现，含有自身抗原(例如染色质)的免疫复合物(immune complexes，以下简称为IC)，而不是含有外源抗原的IC，能够活化自身反应性B细胞，并且这种活化依赖于含有自身抗原的IC与B细胞受体和第二种受体(一种Toll样受体)顺序结合的能力。这一发现在先天性免疫系统和获得性免疫系统之间建立了一种新的联系，并进而建立了一种一般性机制，对蛋白质/核酸自身抗原具有特异性的自身反应性B细胞通过该机制而被活化。
Toll样受体(TLRs)是一个膜结合受体蛋白质家族，它们在先天性免疫反应中具有重要作用，识别与病原体有关的、看来是微生物所特有的分子模式(molecular patterns)或决定簇(determinants)，并且参与活化免疫细胞以对抗这些微生物微粒的来源。
Toll样受体家族在其胞外结构域上具有富含亮氨酸的重复序列，在其胞内结构域上具有Toll/IL-1受体同源结构域。Toll家族在进化上是高度保守的。第一个被发现的成员是toll基因的产物，它是与果蝇Drosophila melanogaster早期发育阶段背腹极性形成有关的信号通路的一部分。
目前已经鉴定出了十种哺乳动物同源体，称为TLR1到TLR10。IL-1受体和TLRs具有相似的下游效应，例如免疫反应基因的活化；所有这些受体都通过信号级联(包括适配蛋白MyD88)(Mussio et al.，Science 278：1612；Wesche et al.，Immunity7：837)发挥作用，此前MyD88被描述为髓样分化蛋白(Lord etal.，Oncogene 5：1095)。一般认为，不同的TLRs通过不同类型的微生物微粒活化(Hemmi et al.，Nature 408：740-745(2000)；Underhill et al.，Nature 402：39-43(1999)；Aliprantis et al.，EMBOJ.，19：3325-3336(2000))。但是有越来越多的证据表明，除了微生物微粒以外，哺乳动物的TLRs也可以识别某些自身(哺乳动物)抗原，更具体地说，是细胞死亡所产生的、从细胞中释放出来的胞浆成分(Akira et al.，Nat.Immunol.，2：675-680(2000))。
此处，术语“Toll样受体”的含义包括完整的Toll样受体，例如在Online Mendelian Inheritance in Man中所描述的登记号如下的Toll样受体：*601194 TOLL样受体1，TLR1；*603028 TOLL样受体2，TLR2；*603029 TOLL样受体3，TLR3；*603030 TOLL样受体4，TLR4；*603031 TOLL-LIKE RECEPTOR 5，TLR5；*605403 TOLL样受体6，TLR6；*300365 TOLL样受体7，TLR7；*300366 TOLL样受体8，TLR8；*605474 TOLL样受体9；TLR9；and*606270 TOLL样受体10；TLR10或其功能性片段，例如Toll样受体的可溶形式，也就是膜结合结构域已经被去掉或已改变，在某些实施例中，胞内结构域也不存在，或者Toll样受体的MyD88结合或相互作用片段，或者能够与MyD88结合或发生相互作用的Toll样受体类似物。更为优选的TLR是TLR9。
通过在这方面所进行的实验，我们已经确证了TLR9和含有染色质的免疫复合物中的染色质成分之间的相互作用很重要。但是，在SLE以及相关疾病中，免疫复合物通常由自身抗体和不同的RNA/蛋白质抗原复合物所形成，所述RNA/蛋白质抗原复合物包括Sm抗原以及核内小核糖核蛋白(snRNP)(Tan，E.Adv.ImmunoL 44，93-151(1989))。此外，在免疫复合物相关疾病例如丙型肝炎中，致病的免疫复合物在抗体和含有RNA的病毒之间形成。已经证实TLR3是双链RNA的一种特异性受体(Alexopoulou，Nature.413，732-738(2001)。因此，可以合理地预测TLR3的结合在由这些含有RNA的免疫复合物所引发的活化过程中有重要作用。
优选的TLR是TLR3或者TLR9，或者其功能性片段，或者与TLR3或TLR9同源并且能够与MyD88结合或发生相互作用的片段。
根据本发明的较为有用的Toll样受体也可以是融合受体，其中，Toll样受体与另一种蛋白质例如Myc-tag相融合。优选的Toll样受体包括：Toll样受体2或Toll/白细胞介素1样受体4(Toll/Interleukin-1 receptor-like 4)(Chaudhary，et al.，Blood 91：4020-4027，1998)，Toll样受体3(Rock，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.95：588-593，1998)，Toll样受体9(Chuang and Ulevitch，Europ.Cytokine Netw.11：372-378，2000；Du，et al.，Europ.Cytokine Netw.11：362-371，2000)，或者其功能性片段，或者具有类似功能(例如与MyD88相结合)的同源物。
此处所使用的术语“治疗”包括：(1)阻止受试者感染此类疾病，其中，所述的受试者对于此类疾病易感，但尚未被诊断为患有所述疾病；(2)抑制此类疾病，也就是阻止其发展；或者(3)改善或者缓解此类疾病的症状，也就是引发患病状态的消退。
这些化合物优先抑制B细胞(BC)或树突状细胞(DC)的活化，在下面所讨论的体外或体内试验中，其抑制作用至少为约50％。这些化合物更为优先地抑制B细胞或树突状细胞通过Toll样受体的自身抗原活化，其抑制作用为75％，最为的是95％。在筛选试验中，还鉴定并测试了其他一些化合物，下面将对其进行更为详细的讨论。
根据本发明的较为有用的化合物选自一个组，所述的组由与免疫复合物或Toll样受体的组成成分相结合的化合物所构成。这些化合物或者阻止所述免疫复合物的形成；阻止自身抗原或者所述免疫复合物的自身抗原片段，使其不能活化Toll样受体(TLR)，或者阻止源自Toll样受体的下游分子信号传导，例如通过MyD88介导的信号传导。此类化合物包括：Toll样受体诱饵(decoys)，抑制MyD88活性的化合物，抑制免疫复合物成分的生产的化合物(例如反意核苷酸)，负显性TLR，Toll样受体拮抗剂或阻断剂(例如ODN 2088或抗TLR的抗体)，以及抑制信号通路的化合物，其中所述信号通路由免疫复合物的自身抗原片段与TLR的结合或相互作用而活化。较为理想的是，所述化合物与Toll样受体TLR2、TLR3、TLR9或其功能性结构域结合和/或抑制其功能。更为理想的是，所述TLR是TLR3、TLR9或其功能性片段。
本发明还提供了有效的筛选方法，以鉴定药理学试剂(pharmacological agents)或者抑制免疫复合物(或其自身抗原成分)与TLR结合的试剂的先导化合物(lead compound)，优选为TLR2、TLR3、TLR9或其任意组合，最为优选的是TLR3或TLR9。所述方法适用于自动化的较为经济的高通量药物筛选，并且在很多药物发展项目中有直接的应用。
一般来讲，这些筛选方法涉及对化合物的试验，其中所述化合物调节与TLR的自身抗原相互作用，优选为TLR2、TLR3、TLR9或其任意组合，最为优选的是TLR3或TLR9。同样，更为理想的是，所述化合物调节与TLR9的自身抗原相互作用。还提供了多种用于结合试剂(binding agents)的试验，包括标记式体外蛋白-蛋白结合试验，免疫试验，基于细胞的试验等。
体外结合试验中使用一种由多种成分构成的混合物，包括TLR多肽，优选为TLR2、TLR3、TLR9或其任意组合，最为优选的是TLR3或TLR9，更进一步优选的是TLR9，它可以是与另一种肽或多肽所形成的融合产物的一部分，例如用于检测或锚定的标签。试验中所采用的上述混合物中也可以包含天然的细胞内TLR结合靶标，例如MyD88。虽然可以使用天然的全长结合靶标，但通常较为优选的是使用其某些部分(例如肽)，只要所述的部分提供了与受试者MyD88多肽的结合亲和力(affinity andavidity)并且所述亲和力在试验中可以很方便的测量即可。试验中所采用的混合物中也可以包含候选的药理学试剂。候选试剂覆盖多种化学类别，虽然它们通常是有机化合物；较为优选的是小分子有机化合物，可由多种来源获得，包括合成化合物库或天然化合物库。所述混合物中也可以包含很多其他试剂。这些试剂包括盐、缓冲剂、中性蛋白(例如清蛋白)、去污剂、蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗菌剂等。
所获得的混合物在一定条件下(在候选药理学试剂的存在下)进行温育，使得TLR多肽与细胞的结合靶标、部分或类似物以参考值的结合亲和力发生特异性的结合。所述混合物的成分可以以任何适当的顺序加入，但要能提供必需的结合；温育可以在任何有利于使结合效果最佳的温度下进行。同样可以对温育时间进行选择，以便使结合效果最佳，但也应使之尽量的短，以便有利于使筛选过程更快、产率更高。
在温育之后，通过任何方便的手段将TLR多肽与一种或多种结合靶标的结合检测出来，其中所述结合是对试剂有选择性的(agent-biased)。在不存在所述试剂的情况下所述TLR多肽对靶标的结合亲和力与存在所述试剂情况下的结合亲和力之间的差别说明，所述试剂调节TLR多肽与所述TLR结合靶标之间的结合。类似地，在下面所描述的基于细胞的试验中，在试剂存在和不存在的情况下TLR依赖型转录活化之间的差别说明所述试剂调节TLR的功能，例如与MyD88的结合。此处所使用的术语“差别”是指在统计学上具有显著性，并且优选为代表至少50％，更优选为至少75％，再进一步优选为至少90％的差别。
在检验药理学试剂阻断B细胞或树突状细胞活化的能力的优选试验中，包括RF+B细胞或树突状细胞，将其与待测试剂和TLR刺激剂例如PR1-3、PL2-3或CpG S-ODN 1826(参见Leadbetter et al.，Nature，416：603-607，2002)在适当的细胞培养基中进行温育。可以在加入刺激剂之前或者在加入刺激剂的同时，进行与待测试剂的温育。
可以通过本领域技术人员公知的多种技术观察到B细胞的活化。例如，可以通过3[H]胸腺嘧啶核苷掺入试验检测B细胞的增殖。或者也可以通过荧光激活细胞分类术(FACS)分析B细胞的活化，以检测某些物质在细胞表面的表达，例如CD80、CD86或MHC II类分子。树突状细胞的活化可以通过检测细胞因子，例如TNF-α、干扰素α、IL-12以及BAFF，或者共刺激分子，例如CD80、CD86或MHC II类分子，的生产而观察到(Banchereau，et al.，Annu.Rev.Immunol.18：767-811，2000；Mackay andBrowning，Nat.Rev.Immunol.2：465-475)。
树突状细胞的活化也可以通过检测DC的形态变化而观察到(Banchereau，et al.，Annu.Rev.Immunol.18：767-811，2000)。
如果对表达(例如共刺激分子)的刺激由于加入了待测试剂而减小，那么就可以认为该待测试剂是一种可能用于治疗ICAD的试剂。与未加入待测试剂的细胞样品相比，如果表达量减少了至少约50％，更优选为至少约60-75％，最优选为至少约90％，那么可以认为表达量减少了。更具体的细节将在本部分末尾的实施例部分中给出。
在实施例中描述了本发明优选的试验混合物。本发明的试验混合物中也包含候选的药理学试剂。一般来讲，多种试验混合物与不同浓度的候选试剂平行地进行试验，以便获得对各种浓度的不同反应。典型地，以这些试验混合物中的一种作为对照，也就是浓度为零或者在试验所能检测的限度以下。候选试剂覆盖多种化学类别，虽然它们通常是有机化合物，较为优选的是小分子有机化合物。例如，较为合适的小分子有机化合物的分子量可以大于约50但小于约2,500。候选试剂可以包含与蛋白质和/或DNA相互作用的化学官能团。
候选试剂由多种来源获得，包括合成化合物库或天然化合物库。例如，现有多种手段用于随机地或定向地合成很多有机化合物和生物分子，包括随机化寡核苷酸和肽的表达。作为另一种选择，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库也可以得到，或者可以很容易地生产出来。库可以由较小的多肽(参见例如Lam et al.，Nature，354：82，1991以及WO92/00091；Geysenet al.，J Immunol Meth，102：259，1987；Houghten et al.，Nature，354：84，1991以及WO92/09300以及Lebl et al.，Int J Pept Prot Res，41，201，1993)。作为另一种选择，非肽小分子库可以基于共同的模板或核心结构(例如，苯并二氮模板参考Ellman and Bunin，JAmer Chem Soc，114：10997，1992；唑酮和aminidine模板参考WO95/32184；苯并二氢吡喃(dihydrobenzopyran)模板参考WO95/30642，四氢吡咯模板参考WO95/35278)。
此外，可以通过常规的化学、物理以及生物化学手段很容易地对天然的以及合成的库和化合物进行修饰。而且，可以对已知的药理学试剂进行定向的或随机的化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化、amidification等。
抗体，以及能够与免疫复合物成分相结合并阻止形成或TLR结合的所述抗体的结合片段或适体(aptamers)(例如可从SomaLogic Inc.，Boulder，CO获得)也是有用的。根据本发明的有用的抗体实例包括抗TLRs的单克隆抗体，例如抗TLR3的单克隆抗体(Matsumoto et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，293：1364-1369，2002)，抗TLR-9(Toll样受体9，Imgenex，圣地亚哥，加利福尼亚州)或其人化版本(humanized versions)。
此处所使用的术语“负显性Toll样受体”是指被工程化从而具有某种缺陷，例如下游信号传导所需的结构域缺失，但能结合免疫复合物的抗原部分的Toll样受体。
抗体及其结合片段可以是多克隆的或单克隆的，但优选为单克隆的。如果是多克隆的，那么抗体的形式可以是抗血清或者单一特异性的抗体，例如用经纯化的蛋白质免疫动物而制得的纯化的抗血清。但是优选为单克隆抗体，以便使给予个体的外源蛋白质最少。可以根据公知的试验方法制备单克隆抗体。参见例如Skare et al.，J Biol.Chem.268：16302-16308(1993)；以及美国专利4,918,163和5,057,598，此处以引用的方式将其包括在本文中。抗体可以是完整抗体、Fab′s、单链、单结构域重链等。单链抗体是优选的。在美国专利4,946,778中详细地描述了单链结合多肽的制备方法，此处以引用的方式将其包括在本文中。
当使用抗体或其他蛋白质或肽时，肽最好与载体相偶联，所述载体的实例包括生物素或聚碱性氧化物(例如聚乙二醇)。可以使用多种聚合物，例如葡聚糖、聚乙烯基砒络烷酮、多糖、淀粉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或其他类似的聚合物。聚碱性氧化物(poly(alkylene oxide))可以包括单甲氧基聚乙二醇、聚乙二醇、聚乙二醇嵌段共聚物等。作为聚碱性氧化物的聚乙二醇是优选的。聚合物的末端也可以由C1-4的烷基而不是单甲氧基进行加帽(capped)。
对于人类的给药而言，例如作为体内治疗组合物的一种成分，单克隆抗体最好基本是人源的或者是人化的以便使免疫原性最小，并且最好基本是纯净的。“基本是人源的”是指所述组合物的免疫球蛋白部分通常含有至少约70％人类抗体序列，优选为至少约80％人类抗体序列，最优选为至少约90-95％或更大比例的人类抗体序列。
在治疗实践中，所述化合物可以被适当地给予受试者例如哺乳动物，特别是人，可以单独给予或者作为药物组合物的一部分给予，所述药物组合物中包含所述化合物以及一种或多种可接受的载体以及可以选择加入的其他治疗成分。所述载体在与制剂的其他成分相容方面必须是“可以接受的”，并且对其接受者无害。
本发明的药物组合物包括那些适用于口腔、直肠、鼻腔、局部(包括口腔和舍下)、阴道、非肠道(包括皮下、肌肉、静脉内以及皮下)、眼部(使用滴眼液)、经肺给药(使用气雾剂化或雾状药物)的组合物。制剂可以以单位剂量的形式方便地给予，例如药片和缓释胶囊以及位于脂质体中，可以通过制药领域公知的任何方法制备这些制剂(参见例如Remington：The Science andPractice of Pharmacy by Alfonso R.Gennaro(Ed.)20th edition，December 15，2000，Lippincott，Williams & Wilkins；ISBN：0683306472.)。
此类制备方法包括一个步骤，在该步骤中，使待给予的分子与诸如载体之类的成分相互联系，其中所述成分构成了一种或多种添加剂。一般来讲，通过使活性成分与液态载体、脂质体或粉碎得很细的固态载体或两者均一而密切地相互联系，从而制备所述组合物；然后，必要时可以对产品进行成形。
本发明适用于口腔给药的组合物可以以不连续单位(discreteunits)的形式给予，例如胶囊、扁胶剂(cachets)或药片，其中的每一个含有预定量的活性成分；可以作为粉末或颗粒；可以作为水性液体或非水性液体的溶液或悬浊液；或者作为水中油液体乳浊液或油中水液体乳浊液，或者包装在脂质体中，以及作为大药丸等。
药片可以通过挤压或成型(molding)而进行制备，可以选择性地加入一种或多种辅助成分。挤压的药品可以通过在合适的机器中挤压自由流动形式(例如粉末或颗粒)的活性成分而获得，可以选择性地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂进行混合。成型的药品可以通过在合适的机器中对已用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物进行成型而获得。可以选择性地对药品进行包被或划线；可以对其进行配制，以便使其较慢地或持续地释放其中所含有的活性成分。
适用于局部给药的组合物包括：锭剂(lozenges)，其中包含带有味道的成分，通常是蔗糖、阿拉伯树胶或黄蓍胶；以及软锭剂(pastilles)，其中包含惰性成分，例如明胶和甘油，或者蔗糖以及阿拉伯树胶。
适用于非肠道给药的组合物包括：水性和非水性的无菌注射溶液，其中可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使得该制剂与预期服药者的血液等渗的溶质；水性和非水性的无菌悬浊液，其中可以包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以以单位剂量或多剂量容器的形式给予，例如密封的安瓿和管形瓶；可以储存在冰冻干燥(冻干)条件下，仅需要在马上就要使用之前加入无菌的液态载体例如水以便用于注射。现成可用的(Extemporaneous)注射溶液和悬浊液可以由无菌粉末、颗粒和药片制得。
应当理解，在给定的治疗中所使用的给定化合物的实际优选量将会根据多种因素而有所变化，例如所使用的具体化合物，所配制的具体组合物，应用方式，给药的具体位置，患者的体重、一般健康状况、性别等，有待治疗的具体指征(indication)等，以及可以被本领域普通技术人员所认知的其他此类因素，包括巡诊医师或兽医。对于给定的给药方案而言，本领域普通技术人员可以通过常规的剂量确定试验而容易地确定最佳的给药量。
本发明还提供了诊断个体是否患有ICAD的方法。该方法包括测定由Toll样受体所介导的、由生物样品所诱导的B细胞或树突状细胞活化，其中，所述生物样品中含有免疫复合物，所述免疫复合物由自身抗原和自身抗体所构成。B细胞Toll样受体的活化可以直接测定，例如通过测定B细胞的增殖、各种共刺激分子例如CD80或CD86的表达或MHC II类分子的上调节。树突状细胞Toll样受体的活化可以通过多种方式测定，例如通过观察经/不经特异性染色后树突状细胞的形态变化，或者通过测定共刺激分子例如CD80或CD86的表达，或者通过测定活化标志物例如CD69的上调节，或者通过测定趋化因子例如CCR7的上调节，或者通过测定细胞因子例如TNF-α的生产，可以使用多种不同的技术，包括检测mRNA或蛋白质的水平。
例如，TNF-α表达的变化可以利用从树突状细胞中所分离到的RNA来加以测定。RNA定量方法包括基于聚合酶链式反应(PCR)的方法，例如TaqMan system(Applied Biosystems)，BrilliantQuantitative PCR(Stratagene)，Platinum quantitative PCR(Resgen，Inc.)。RNA是从生物样品例如血液样品中分离出来的，所述生物样品来自被怀疑患有ICAD的个体。Toll样受体mRNA的量利用诸如前面所列出的方法进行测定，并与来自对照个体的样品进行比较。
较为理想的是，利用诸如FACS分析等试验来测定共刺激分子蛋白质的表达。如果这些共刺激分子的表达量增加，那么就表明该个体已经感染了ICAD。如果试验表明，与对照样品相比，共刺激分子的量增加至少约5％，那么就认为活性增加了。
或者，将来自被怀疑患有ICAD的待测个体的血清注射到细胞培养物中，所述细胞培养物表达功能性Toll样受体通路。然后平行地测定经对照血清和待测受试者的血清处理过的细胞培养物中Toll样受体的活性。与经对照血清处理的细胞相比，如果经待测个体的血清处理过的细胞中的Toll样受体活性增加，那么这说明该个体已经感染ICAD。如果与对照样品相比表达量增加了至少约5％，那么就认为表达量增加了。
应当理解，尽管本发明是参照其特定的优选实施例来描述的，但是前面的描述以及后面要描述的实施例都是出于解释和说明的目的，而不是对本发明范围的限制。对于本领域的技术人员而言，在本发明的范围内，其他的方面、优点和修改将是清楚明了的。
                     实施例1
自身反应性B细胞存在于健康个体的淋巴组织中，但通常处于静止状态(quiescent)。当这种动态平衡被打破时，自身反应性抗体的形成可能会产生严重的病理效应。表达对自身IgG具有特异性的抗原-受体的B细胞制造一类被称为类风湿因子(rheumatoid factor，以下简称为RF)的自身抗体。此处我们证明RF+B细胞的有效活化是通过IgG2a/染色质免疫复合物介导的，并且需要所述抗原-受体和MyD88依赖型Toll样受体家族成员的顺序结合。这些数据在系统性自身免疫疾病的发展上，在先天性免疫系统和获得性免疫系统之间建立了一种新的联系，并解释了对核酸/蛋白质微粒具有反应性的自身抗体为何占优势。这种双结合通路(dual-engagement pathway)独有的特性应该有助于特异性地将自身反应性B细胞作为靶标的疗法的发展。
目前我们已经发展出了一种体外系统模型，用于分析在自身免疫疾病中自身反应性B细胞和树突状细胞的活化所涉及的因子。在红斑狼疮易感性lpr小鼠中，一种常见的特异性自身抗体是类风湿因子(RF)。RFs是能够与自身IgG进行反应的抗体。在自身免疫的小鼠品系中，RF B细胞被活化，数量增多，并分化为可分泌抗体的细胞，但是在没有自身免疫背景的小鼠中则没有上述现象。为了研究该病理活化过程所涉及的机理，我们研究了从小鼠脾脏中获得的原代RF+B细胞，此处所使用的小鼠已经被基因工程化以表达一对转基因，所述的转基因可以使其具有对大部分B细胞有特异性的某种RF。这些B细胞是SLE患者体内所发现的自身反应性B细胞的原型。
最初的时候，我们证明了这些RF+B细胞被来自自身免疫小鼠的血清样品所活化，但来自非自身免疫小鼠的血清不能使其活化(Rifkin et al，2000)。我们又进一步证明了血清中的刺激因子实际上是IgG2a。但是，从非自身免疫的血清中所分离出来的数量相当的IgG2a却没有刺激作用，这表明并不是所有的IgG2a都足以刺激RF+B细胞。因此，我们认为自身免疫的血清中的IgG2a具有独特的性质。为了进一步鉴定出有关的IgG2a成分，我们使用了IgG2a的单克隆抗体(mAbs)，并证明了对自身抗原，例如DNA-组蛋白复合物，有特异性的mAbs具有刺激作用，而对外源抗原或非自身抗原有特异性的抗体不具有刺激作用。
接下来我们考虑了自身抗体/自身抗原免疫复合物是相关成分的可能性。当使用血清和mAbs的实验在DNAse的存在下进行时，RF+B细胞的刺激被显著减弱(图1)。这些数据暗示，DNA骨架的断裂导致了自身抗体/自身抗原(DNA)免疫复合物的解离。这清楚地表明自身抗原/自身抗体免疫复合物具有独特的性质，优先活化自身反应性B细胞。含有非自身抗原的免疫复合物不能活化自身反应性B细胞，如图2所示。
我们研究了自身抗体/自身抗原免疫复合物能够与第二个受体相结合的可能性，而这种结合有助于RF B细胞的活化。最近的研究表明，被称为Toll样受体(TLR)的蛋白质家族可以与细菌DNA相结合，并导致巨噬细胞、树突状细胞和B细胞的活化，因此，我们考虑了TLR在这些自身反应性RF B细胞的活化中发挥作用的可能性。目前，TLR是一个很热门的研究领域，已经证明TLR与很多病原体相关分子模式(PAMPS)的结合和识别有关，因此，与先天性免疫反应的这种关联将是自身免疫的一种很独特的联系。所有已知的哺乳动物TLR都通过适配器蛋白MyD88进行信号传导。通过基因工程将小鼠的MyD88敲除，在这种小鼠中，TLR介导的活化被严重破坏，并且通过TLR9介导的信号被完全破坏。我们将RF+转基因小鼠与MyD88-/-背景进行杂交。所得到的小鼠对RF转基因而言是阳性的(图4A)，但缺乏MyD88信号分子(图4B)。
我们发现，RF MyD88-/-小鼠不能对任何一种能刺激RFMyD88+/+B细胞增殖的自身抗体做出反应(参见图4C)。我们测试了多种形式的自身抗体：血清、抗核小体抗体和抗Sm抗体。这与如下假设是一致的，即：自身抗体/自身抗原免疫复合物中含有重复模式成分(repeating pattern components)，例如DNA或RNA，其能与Toll受体在B细胞内部(DNA/TLR9)或B细胞表面(RNA/TLR3)相结合。对于自身反应性RF+B细胞而言，自身抗体/自身抗原免疫复合物可能与BCR和TLR顺序结合，导致增强的活化和增殖。这是BCR和TLR的共结合(co-engagement)能够导致自身反应性B细胞活化的第一个证据。这种联系在自身免疫和人体的先天性免疫反应之间提供了一种很独特的联系，可以为自身免疫疾病，例如SLE和类风湿性关节炎，中的很多病原反应提供一种初始机制。
后续研究表明，已知的通过刺激性CpG ODN通过TLR9阻断B细胞活化的药物，例如氯奎及concanamycin A，能够完全阻断含有染色质的IC刺激RF+B细胞的能力。这种反应也可以被抑制性CpG ODN阻断，而抑制性CpG ODN通过TLR9特异地抑制活化。这些数据表明，TLR9在自身反应性B细胞的活化中是一个重要的受体。这些数据表明，免疫复合物中的IgG成分与BCR相结合，导致免疫复合物的内化(internalization)以及向内部囊泡的运送。接下来，TLR9在该内部囊泡中被IC的染色质成分所结合，从而导致B细胞的活化。对生物利用度(availability)的增强以及由此而来的对染色质本身的摄取(SLE的易感性因子)有贡献的因子，也能通过类似的机制导致B细胞的活化。值得注意的是，抗染色质的抗体是在SLE患者以及自发性SLE动物模型的血清中可被最先检测到的自身抗体。
                     实施例2
受SLE和其他系统性自身免疫疾病困扰的患者会产生多种特异性自身抗体。这些自身抗体非常频繁地结合到染色质或其他亚细胞核酸/蛋白质微粒上(Tan，E.Adv.Immunol.44，93-151(1989))。MRL/lpr小鼠是一种研究得较为透彻的用于系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎的鼠类模型，它也产生非常高滴度的IgG抗IgG类风湿因子(RF)(Theofilopoulos，et al.，J.Exp.Med.162，1-18(1985)；Wolfowicz，et al.，Clin.Immunol.Immunopath.46，382-395(1988))。这种RF反应为研究自身抗体的调控提供了高度相关的转基因模型。AM14转基因小鼠种系的B细胞表达对IgG2aa/j具有特异性的抗原受体，其最初是从患病的MRL/lpr小鼠的脾脏中作为杂交瘤产品而获得的(Shlomchik，et al.，Int.Immunol.5，1329-1341(1993))。AM14对于单体IgG2a的同种异型特异性和相对较低的亲和力，对于与RF库(repertoire)有关的疾病来说是很典型的(Jacobson，et al.，J.Immunol.152，4489-99(1994))。在野生型小鼠中，AM14 RF+B细胞发育正常，并且保持功能上的幼稚状态(naive)(Hannum，et al.，J.Exp.Med.184，1269-1278(1996))。但是，在同种异型的易发自身免疫lpr的背景下，它们被活化，发生增殖并且分泌自身抗体(Wang，andShlomchik，J Exp.Med.190，639-649(1999))。某些因子可能对于lpr小鼠的AM14 B细胞的活化具有一定作用，其中，自身抗原IgG2a的状态起到了较为重要的作用。
RF+B细胞被自身抗体/自身抗原免疫复合物所活化
前面我们已经表明，AM14 RF+B细胞可以在体外被IgG2aa/j所活化，其中的IgG2aa/j是从自身免疫小鼠的血清中分离得到的；但是，水平相当的、存在于野生型小鼠血清中的IgG2a却不能将其活化(Rifkin，et al.，J.Immunol.165，1626-1633(2000))。我们也发现，RF+B细胞可以在对亲和纯化的对核小体(一种自身抗原)具有特异性的IgG2aj mAbs做出反应时迅速增殖，但是，对于半抗原或其他外源抗原具有特异性的IgG2aa/j mAbs却只能做出很弱的反应(如果有的话)(Rifkin，et al.，J.Immunol.165，1626-1633(2000))。这些研究表明，由IgG2a核小体特异性mAbs和从共培养细胞中释放出来的染色质片段所形成的免疫复合物(IC)(Emlen，et al.，J.Immunol.148，3042-3048(1992))能够有效地活化RF+B细胞，而单体状态的抗半抗原IgG2a抗体却不能。为了进一步测试这一假设，向实验用培养基中加入DNase以破坏假定的IC。纯化的抗核小体mAb PL2-3(Monestier and Novick.Mol.Immunol.33，89-99(1996))或自身免疫血清通常所能引发的强烈的增殖反应被显著减弱(图1)。DNase非特异性的毒性并不是其中的一个因素，因为对F(ab′)2抗-IgM和LPS的反应并未受到影响(图1)。这些数据证实了RF+B细胞对含有DNA的IgG2aIC做出反应，而对单体状态的IgG2a抗体不能单独做出反应。
如果IgG2a IC对RF+B细胞的活化仅仅是因为抗原抗体交联的效果比单体状态的IgG2a可能的效果更好的话，那么常规的抗-半抗原/半抗原-蛋白质复合物也应该强烈地刺激RF+B细胞。为了解决这一问题，将IgG2a抗TNP的单克隆抗体与不同浓度的TNP-BSA进行预培养，从而制备ICs；通过Clq结合活性的增加而证实复合物的形成(图2a)。正如原来所期望的那样，C4010(一种IgG2ab抗TNP mAb)的IC，在各种抗TNP/TNP-BSA比例下均不能刺激RF+B细胞。令人意外的是，与含有抗核小体mAb的IC所引发的增殖反应相比，Hy1.2(一种IgG2aa抗TNP mAb)的IC仅仅引发了很温和的增殖反应。这一差异表明，由IC所引发的RF+B细胞增殖的程度取决于抗体和(自身)抗原的性质。
由IC所引发的活化不依赖于补体受体的共结合
对于抗核小体IC和抗NTP IC在刺激能力上的这一巨大差异，一种可能的解释是，只有前者能够协同地与B细胞受体(BCR)和位于B细胞表面的第二个受体相结合。一种潜在的候选受体是补体受体CD21，因为已经表明，补体成分可以与自身抗原IC相结合，并且理论上能够与CD19/CD21和BCR有效地共结合(Carter et al.，J Immunol.141，457-463(1988))。但是，当AM14重链和轻链转基因物(transgenics)被杂交(breed)到缺乏CR1/2Cr2的小鼠(Aheam，et al.Immunity 4，251-262(1996))中时，来自CR1/2-缺乏和CR1/2-充足的同窝小鼠的RF+B细胞对IgG2a抗核小体mAbs和自身免疫血清的反应大致相当(图3)。来自作为对照的RF-同窝小鼠的B细胞不能对任何形式的IgG2a做出反应，证实了在本研究中所采用的配体的特异性。包括致有丝分裂的甲基化不足的CpG寡聚脱氧核苷酸，它在此处用作对照刺激。这些数据表明，对于RF+B细胞对自身抗体/自身抗原IC做出反应来说，补体受体并不是必需的。
MyD88依赖性受体的作用
潜在的候选受体包括Toll样受体(TLR)家族的成员。这些模式识别受体(pattesrn recognition receptor)最早是在果蝇Drosophila中被描述的，已经证明它们能在果蝇中引发抗真菌肽的释放(Lemaitre et al.，Cell 86，973-983(1996))。人们发现，后来被确认的哺乳动物同源物能够识别一系列保守的微生物产物(也就是LPS、微生物脂蛋白以及甲基化不足的CpG DNA)，后者被称为病原体相关的分子模式(pathogen associatedmolecular pattern，简称为PAMPS)(Medzhitov，et al.，Nature 388，323-324(1997)；Akira，et al.，Nat.Immunol.2，675-680(2001))。最初的研究重点是微生物产物对先天性免疫系统的细胞的效果，此前人们发现，这些微生物产物能够刺激很多炎症调节因子(inflammatory mediators)的释放(Akira，et al.，Nat.Immunol.2，675-680(2001))。但是，后来证明除了外源性微生物配体之外，TLRs也能够识别从损伤的哺乳动物细胞或胁迫状态下的哺乳动物细胞中释放出来的内源性配体(Li，et al.，J Immunol.166，7128-7135(2001))。所有已知的哺乳动物TLRs信号通路都使用适配器蛋白MyD88(Akira，et al.，Nat.Immunol.2，675-680(2001))，但是对于TLR4而言，已经描述了另外一种不依赖于MyD88的通路(Horng，et al.，Nat.Immunol.2，835-841(2001))。
为了研究TLRs在介导RF+B细胞对自身抗体/自身抗原IC所做出的反应中的潜在作用，我们将AM14转基因交叉到MyD88-/-背景上(Adachi，et al.，Immunity 9，143-150(1998))。对来自RF-MyD88+/+(野生型)，RF+MyD88+/+以及RF+MyD88-/-子代的B细胞(通过将PCR和FACS分析结合在一起进行鉴定(图4A-4B))进行检测，分析它们对抗IgM，CpG ODN，LPS，以及一组(panel)抗核小体mAbs和自身免疫血清的反应能力。来自MyD88缺乏型小鼠的B细胞能够对抗IgM做出正常的反应，但不能对刺激性CpG DNA做出反应[Hacker，et al.，J.Exp.Med.192，595-600(2000)]。它们对LPS的反应要比野生型小鼠低的多，但仍然是可以检测到的，这与通过MyD88的部分活化是一致的；它们只对LPS做出较弱的反应，已经公知，LPS是部分地通过不依赖MyD88的机制产生刺激(Horng，et al.，Nat.Immunol.2，835-841(2001))(图4C)。最值得注意的是，来自RF+MyD88缺乏型小鼠的B细胞完全不能对抗核小体mAbs PR1-3或PL2-3或任何一种能有效刺激RF+MyD88+/+B细胞的自身免疫血清做出反应(图4C)。这些结果清楚地表明自身抗体/自身抗原IC对于RF+B细胞而言刺激特别强，因为它们能够协同地与BCR和MyD88依赖性受体相结合。
甲基化不足的CpG模体(motifs)是细菌DNA的共同特征，但它们也存在于哺乳动物DNA的启动子元件中(Singal andGinder.Blood 93，4059-4070(1999))。由于B细胞对CpG寡聚脱氧核糖核苷酸(ODN)的反应是通过TLR9来介导的(Hemmi，et al.，Nature 408，740-745(2000))，因此我们假定含有染色质的IC能够通过与TLR9的共结合而刺激RF B细胞。TLR9介导的对CpG S-ODN的反应与其他已知的TLR信号通路是不同的，其区别特征在于其对内涵体酸化和/或成熟的假定的要求，这一点可以通过对氯奎和氯化铵的敏感性而确定(Yi，et al.，J.Immunol.160，4755-4761(1998)；Hacker，et al.，EMBO J.17，6230-6240(1998))。Concanamycin B and bafilomycin A是负责内涵体酸化的V型ATPase的特异性抑制剂(Benaroch，et al.，EMBO J.14，37-49(1995))。为了研究TLR9在RF+B细胞活化中的作用，对氯奎、concanamycin B、bafilomycin A和氯化铵对mAb PL2-3以及已知的TLR2(脂蛋白，孔蛋白B)(Massari，et al.，R Immunol.168：1533-1537，2002)、TLR4(LPS)以及TLR9(CpG S-ODN 1826)配体的刺激能力的作用进行了测定。正如原来所期望的，氯奎抑制了CpG S-ODN反应，而且这些抑制剂对TLR2和TLR4配体的反应作用很小。值得注意的是，所有四种能够阻断氯奎的试剂也抑制RF+B细胞对mAb PL2-3的反应(图5A、图5B)。与氯奎的这种联系是很有意思的，因为氯奎是治疗包括类风湿性关节炎和SLE在内的自身免疫疾病的有效手段(CanadianHydroxychloroquine Study Group，N.Engl.J Med.324，150-154(1991)；Furst，et al.，Arth.Rheu.42，357-365(1999))。因此，我们的数据表明，氯奎的治疗效果至少部分地来源于其干扰TLR介导的信号的能力，而所述信号对于自身抗体的产生或者前炎症调节因子(proinflammatory mediators)的产生是有作用的。
B细胞对刺激性CpG S-ODN 1826的反应也可以被一组紧密相关的抑制性CpG S-ODN所阻断，例如S-ODN 2088(Lenart，etal.，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.4，247-256(2001))。我们发现，S-ODN 2088严重抑制了对S-ODN 1826的增殖反应，但对于抗IgM或我们的TLR2和TLR4配体的反应则没有效果(图5C、图5B)。最为重要的是，S-ODN 2088也显著地阻断了RF+B细胞对mAb PL2-3的反应。总的来说，这些数据强烈地暗示了在RF+B细胞的活化中，内涵体处理和/或内涵体相关TLR(最有可能的是TLR9)的结合。
已经清楚地表明，自身反应性B细胞克隆可以经历类别转换(isotype switching)和体细胞突变(somatic mutation)，这与B细胞对外源抗原的常规反应所具有的T依赖性的特征很相似(Shlomchik，et al.，Nature 328，805-811(1987))。但是，最近的研究报告暗示，自身反应性B细胞可以在外周淋巴组织中与常规B细胞分隔开；自身反应性B细胞往往定位于脾脏白髓26的边缘区域(Zeng，et al.，J.Immunol.164，5000-5004(2000))，而常规B细胞则通过归巢作用迁移至滤泡区域。此外，在某些情况下，自身反应性B细胞的扩张和体细胞突变也可以发生在生发中心(germinal center)的外面。这些离散的定位模式可以反应出刺激性自身抗体/自身抗原IC在这些位点的优先积累。或者，这种相对独特的归巢模式(homing pattern)可能是由于不同的趋化因子受体谱图(profiles)所致，后者是在对BCR/TLR结合的共同效应进行反应时所产生的。需要进行进一步的研究，以便比较单独通过BCR交联而活化的B细胞和通过BCR/TLR双结合而活化的B细胞的功能特性。
识别DNA/核小体的自身抗体是SLE患者和SLE的鼠类模型中定义的和最常见的特异性种类(specificity)，而RFs在一部分SLE患者、自身免疫易感性lpr小鼠和RA患者中是一个典型特征。值得注意的是，这些同样的自身抗原是一些新型的鼠类自身免疫模型的靶标，而所述的鼠类自身免疫模型是通过突变而破坏淋巴细胞的动态平衡或自身抗原代谢而得到的(Botto，et al.，Nature Genetics 19，56-59(1998)；Bickerstaff，et al.，NatureMedicine 5，694-697(1999)；Napirei，et al.，Nat.Gen.25，177-180(2000)；Scott，et al.，Nature 411，207-211(2001))。在过去的很长时间之中，人们一直在寻找这些具体的特异性种类之所以占优势的原因。我们的数据提供了一种解释，也就是对由含有染色质的免疫复合物介导的BCR/TLR信号传导的有效的协同作用。在我们的实验系统中，依赖于内涵体/溶酶体定位的TLR9(Hacker，et al.，EMBO J：17，6230-6240(1998))，可以合理地推断自身抗体/自身抗原IC与BCR的结合触发了IC相关抗原的胞饮作用，并导致染色质片段被高效地运送至内涵体相关的TLR9。与公开的研究结果(Bell，et al.，J.Clin.Invest.85，1487-1496(1990)；Bell，et al.，Clin.ImmunoL Immunopath.60，1326(1991))相反，我们不能单独通过培养物上清液或染色质片段而活化B细胞。其他的小鼠品系是否会对我们的片段反应更为敏感仍有待证实。
除了目前的实验模型外，一般来讲，BCR/TLR双结合的原理对于自身免疫而言具有广泛的意义。诸如半抗原化的LPS和半抗原化的LPSLPS偶联的SRBC的模型配体也可以共同对BCRs和TLRs进行信号传递，而且对于具有相关受体的B细胞而言相当有效并且具有较高的特异性(Pike，Methods Enzymol.1987；150：265-75，1987)。因此，在很多不同的环境中，这种模式的活化很可能是外周B细胞耐受丢失中的主要事件；其他的自身抗原可以通过TLR9之外的其他TLRs进行信号传导。总的来讲，这些数据证实了内源性TLR配体在自身免疫的获得性免疫系统异常活化中的重要作用，并解释了自身抗体库为何经常性地不正常地识别亚细胞核酸/蛋白质微粒(Tan，E. Adv.Immunol.44，93-151(1989))的原因。
方法
小鼠.将前面所描述的MRL+/+AM14 BCR Tg小鼠(Hannum，et al.，J.Exp.Med.184，1269-1278(1996)；Riflcin，etal.，J.Immunol.165，1626-1633(2000))与Cr2缺陷型小鼠杂交，后者由Michael Carroll博士提供(哈佛大学医学院，波士顿)，F1子代进行互交(intercross)以产生AM14 Cr2缺陷型以及Cr2充足型(sufficient)对照小鼠。最初由Shizuo Akira博士(大阪大学，大阪，日本)制备的MyD88-/-小鼠(Adachi，et al.，Immunity 9，143-150(1998))由Douglas Golenbock博士(麻萨诸塞大学医学院，伍斯特，麻萨诸塞州)提供，将这种小鼠与AM14 MRL+/+小鼠进行杂交，以产生AM14 MyD88-/-小鼠以及作为对照的子代同窝小鼠。首先通过PCR鉴定RF+子代，然后通过流式细胞术分析外周血淋巴细胞或脾脏细胞而证实对它们的鉴定，使用所述的4-G7单克隆抗个体基因型(4-G7monoclonal anti-idiotype)(Shlomchik，et al.，Int.Immunol.5，1329-1341(1993))。采用FITC-偶联的7G6抗体(Pharmingen，圣地亚哥，加利福尼亚州)通过流式细胞术确定补体受体的基因型。MyD88的基因型通过PCR技术利用下列引物进行确定：MyD88F(5′-TGG CAT GCC TCC ATC ATA GTT AAC C-3′)[SEQID NO：1]，MyD88R(5′-GTC AGA AAC AAC CAC CAC CATGC-3′)[SEQ ID NO：2]，以及neoR(5′-ATC GCC TTC TAT CGCCTT CTT GAC G-3′)[SEQ ID NO：3](MWG Biotech，海波因特，北卡罗来那州)，以获得长度分别为约550bp和750bp的野生型和敲除产物。
细胞培养物和试剂.脾细胞制备物中的T被去除，并与适当的配体共同培养40-48小时。在某些实验中，按照文献中描述的方法将B细胞与CD40L一起进行预培养(Rifkin，et al.，J.Immunol.165，1626-1633(2000))。在培养的最后16小时内加入3[H]-胸腺嘧啶核苷以评估增殖状况。数据是以三组培养物抗IgM反应的平均百分比表示的。按照下述公式计算抗IgM反应的百分比：[(cpm实验条件-cpm CD40L单独)/(cpm抗IgM-cpm CD40L单独)×100]。
配体包括：山羊抗小鼠IgM F(ab′)2(15μg/ml，JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，宾夕法尼亚州)；核小体特异性mAbs PR1-3(IgG2a′)，PL2-3(IgG2a′)以及PL2-8(IgG2b)(浓度均为50μg/ml)，由Marc Monestier博士提供(坦普尔大学医学院，费城，宾夕法尼亚州)(Monestier and Novick Mol.Immunol.33，89-99(1996))；10μg/ml LPS(Sigma，圣路易斯，密苏里州)；0.3-2g/ml的刺激性CpG S-ODN 1826(Yi，et al.，J.Immunol.160，4755-4761(1998))(Oligo′s Etc，Wilsonville，俄亥俄州)，10μg/ml脑膜炎双球菌(Neisseria Meningitidis)孔蛋白B(由Lee Wetzler博士提供，波士顿大学医学院，波士顿，麻萨诸塞州)；10μg/ml合成的脂肽Pam3Cys-Sk4(G.Jung博士，Univ.ofTuebingen，德国，由Doug Golenbock博士提供)；以及抗TNPmAbs Hy1.2(IgG2aa)和C1040(IgG2ab)(Hannum，et al.，J Exp.Med.184，1269-1278(1996))(浓度均为50μg/ml)，与不同浓度的TNP-BSA相络合(complexed)。在某些实验中，在加入配体之前的15-30分钟-2小时，将DNase I(IV类)(Sigma，圣路易斯，密苏里州)，氯奎(Sigma)，concanamycin B，bafilomycin A(Sigma)或12pg/ml的抑制性CpG S-ODN 2008(Lenart，et al.，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.4，247-256(2001))(Oligo′sEtc.)加入到培养物中。通过鲎鱼阿米巴状细胞溶解物ELISA(Limulus Amebocyte Lysate ELISA)(Bio-Whittaker，Walkersville，马里兰州)证明所有的mAb和ODN制备物均不含内毒素。
                   实施例3
我们进一步证明树突状细胞可以被含有染色质的免疫复合物活化，其通过与Fc受体和TLR9的顺序结合而发挥作用。这与前面所描述的B细胞活化的机理很相似，其区别在于：对于B细胞而言，相关的细胞表面受体是B细胞抗原受体；而对于树突状细胞而言，相关的细胞表面受体是Fc gamma受体(FcyR)。这两种细胞表面受体的作用都是将染色质运送到位于内涵体/溶酶体囊泡中的TLR9。
在图8A-图8C中，我们表明树突状细胞可以通过TLR9而被特异性地活化，这种活化可以被ODN 2088所形成的TLR9抑制而阻断。这些实验证明，我们在后续实验中所使用的树突状细胞(示于下面的表1和表2中)表达功能性的TLR9，因为特异性活化TLR9的配体ODN 1826诱导树突状细胞产生TNF-a和IL-12(图8A，图8B)，而且还进一步诱导共刺激分子的上调节(图8C)。ODN 2088是TLR9介导的活化的特异性抑制剂，因为ODN 2088阻断了ODN 1826介导的活化，但是对于LPS介导的活化却没有作用(如图8A、8B、8C所示)。
树突状细胞来源于C57BL/6小鼠的骨髓中，通过在体外利用GM-CSF和IL-4培养6天而获得。在第六天时将CD11c阳性的树突状细胞分离出来，分离过程中采用磁性珠子(magnetic beads，Miltenyi Biotec)，并与ODN 2088(一种特异性地阻断通过TLR9的信号传导的抑制性寡聚脱氧核苷酸)预培养30分钟；也可以不进行上述的预培养操作。然后向培养物中加入通过TLR9发挥特异性活化作用的刺激性ODN 1826(CpG，3μg/ml)或者通过TLR4发挥活化作用的脂多糖(LPS，10μg/ml)，或者仅加入培养基。在48小时之后，通过ELISA(结果以测得的405nm处的吸收的OD值表示)测定培养物上清液中TNF-α(图8A)和IL-12(图8B)的水平。在除去上清液之后，将细胞收集起来，并用流式细胞术分析共刺激分子CD86的表达(图8c)。“未刺激”是指在只有培养基的情况下CD86的表达水平，“刺激”是指在存在刺激物(ODN 1826或LPS)的情况下CD86的表达水平。
下面的表1表明，含有染色质的免疫复合物(复合物中含有自身抗体和染色质自身抗原)活化了树突状细胞，使其生产TNF-α；而含有外源抗原(TNP-BSA)的免疫复合物则不能诱导树突状细胞的这种活化。此外，含有染色质的免疫复合物所诱导的活化可以被TLR9的特异性抑制剂ODN 2088所完全阻断，这表明TLR9的结合(可能是通过位于含有染色质的免疫复合物内的染色质)在上述活化过程中是一个很重要的因素。
                          表1
刺激     无     2088
培养基(无刺激)     ＜50     ＜50
ODN 1826     2347     ＜50
LPS     2514     2393
PL2-3     1653     ＜50
TNP/αTNP-BSA IC 1∶1     ＜50     ＜50
TNP/αTNP-BSA IC 4∶1     ＜50     ＜50
TNP/αTNP-BSA IC 16∶1     ＜50     ＜50
表1说明，含有染色质的免疫复合物所诱导的树突状细胞对TNF-α的生产被TLR9的特异性抑制剂ODN 2088所阻断。树突状细胞来源于C57BL/6小鼠的骨髓中，通过在体外利用GM-CSF和IL-4培养6天而获得。在第六天时利用磁性珠子(MiltenyiBiotec)将CD11c阳性的树突状细胞分离出来。然后将树突状细胞与浓度为12μg/ml的ODN 2088预培养30分钟，也可以不进行上述的预培养操作。然后向培养物中加入通过TLR9发挥特异性活化作用的刺激性ODN 1826(3μg/ml)，通过TLR4发挥活化作用的脂多糖(LPS，10μg/ml)，抗染色质抗体PL2-3(50μg/ml)，抗体/蛋白质比例不同的三种αTNP/TNP-BSA免疫复合物(50μg/ml)，或者仅加入培养基。在48小时之后，通过ELISA测定培养物上清液中TNF-α的水平(结果以pg/ml表示；检测灵敏度的下限水平(lower level)是50pg/ml)。此处示出了三个类似实验中的一个有代表性的实验。
表2说明，含有染色质的免疫复合物能够诱导来自野生型小鼠的树突状细胞生产TNF-α(这一点在表1中所示的ODN 2088不存在时的研究结果中也能看到)，但是完全不能诱导来自Fc受体γ链缺陷型小鼠的树突状细胞生产TNF-α。这说明在含有染色质的免疫复合物活化树突状细胞的过程中，参与活化作用的Fc受体是绝对必要的。
                              表2
刺激     野生型 Fc受体γ链缺陷型
培养基(无刺激)     ＜50 ＜50
ODN 1826     7899 2373
LPS     7056 3411
PL2-3     4554 ＜50
PL2-8     3964 ＜50
TNP/αTNP-BSA IC 1∶1     ＜50 ＜50
TNP/αTNP-BSA IC 4∶1     ＜50 ＜50
表2证明，含有染色质的免疫复合物能够诱导来自野生型小鼠的树突状细胞生产TNF-α，但是不能诱导来自Fc受体γ链缺陷型小鼠的树突状细胞生产TNF-α。树突状细胞来源于C57BL/6小鼠以及缺乏Fc受体γ链的C57BL/6小鼠的骨髓，通过在体外将所述骨髓细胞与GM-CSF和IL-4培养6天而获得。在第六天时利用磁性珠子将CD11c阳性的树突状细胞分离出来。然后向树突状细胞培养物中加入通过TLR9发挥特异性活化作用的刺激性ODN 1826(3μg/ml)，脂多糖(LPS，10μg/ml)，抗染色质抗体PL2-3(50μg/ml；IgG2a)和PL2-8(50μg/ml；IgG2b)，抗体/蛋白质比例不同的二种α-TNP/TNP-BSA免疫复合物(50μg/ml)，或者仅加入培养基。在48小时之后，通过ELISA测定培养物上清液中TNF-α的水平(结果以pg/ml表示；检测灵敏度的下限水平是50pg/ml)。此处示出了二个类似实验中的一个有代表性的实验。
将上述的表1和表2合在一起考虑，其中的数据证明：含有染色质的免疫复合物所诱导的树突状细胞的活化，需要一个通过参与活化的Fcγ受体的信号以及由TLR9介导的一个信号。
下面将简要介绍一下用于评价该FcγR/TLR双结合通路的机理和结果的其他实验。
生产TNF-α的树突状细胞亚群(subset)的描述
小鼠株系.已经描述了自身免疫狼疮样(Lupus-Like)小鼠株系和非自身免疫小鼠株系之间在树突状细胞和巨噬细胞功能上的差异。这些差异包括在免疫复合物的处理(Jones et al.，Clin.Immunol.Immunopathol.36：30-39，1985；Magilavy et al.，J.Immunol.131：2784-2788，1983)、吞噬作用(Russell，andSteinberg Clin.Immunol.Immunopathol.27：387-402，1983)、Fc受体的表达和功能(Pritchard et al.，Current Biology.10：227-230，2000；Jiang et al.，Immunogenetics.51：429-435，2000)以及细胞因子生产(Alleva et al.，J.Immunol.159：5610-5619.，1997；Kohet al.，J.Immunol.165：4190-4201，2000)等方面的差异。因此，直接比较来自身免疫和非自身免疫小鼠株系的树突状细胞是很重要的。MRL+/+和(NZBxNZW)F1是我们所使用的两个自身免疫狼疮样株系，C57BL/6和BALB/c是我们所使用的两个非自身免疫小鼠株系。
树突状细胞亚群的纯化.有两个对于SLE的发病机制特别重要的树突状细胞亚群：CD11c+CD8α+以及CD11c+B220+Gr-1+。这些细胞或者是从脾脏直接获得(Hochrein et al.，J.Immunol.166：5448-5455，2000；Nakano et al.，J.Exp.Med.194：1171-1178，2001)，或者是在Flt3配体的存在下通过体外培养骨髓细胞而获得(Brasel et al.，Blood.96：3029-3039，2000；Gilliet etal.，J.Exp.Med.195：953-958，2002)。按照文献中所述的方法分离脾树突状细胞(Vremec et al.，J.Immunol.164：2978-2986，2000)；在经过适当的荧光抗体染色之后，特定的树突状细胞亚群被分开，并采用MoFlo细胞分类器(Cytomation，柯林斯堡，科罗拉多州)进行收集。在脾脏中也能发现的CD11c+CD8α-树突状细胞亚群与作为目标的CD11c+CD8α+树突状细胞亚群被同时分离出来，并且在实验中被用作对照。
为了获得来源于骨髓的树突状细胞，将骨髓细胞收集起来并在重组鼠Flt3配体的存在下体外培养6-10天，采用的是已知的实验方案(Gilliet et al.，J.Exp.Med.195：953-958，2002；Labeuret al.，J.Immunol.162：168-175，1999)。在Flt3配体存在下生长的骨髓细胞被富集于目标种群，也就是CD11c+CD8+以及CD11c+B220+Gr-1+树突状细胞。通过上面描述的细胞分类法将来源于脾的树突状细胞分开。
确定TLR9在特定的树突状细胞亚群中的表达.通过定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定TLR9 mRNA。此外，通过测定共刺激分子的表达和细胞因子的生产而比较树突状细胞亚群对TLR9特异的刺激性配体S-ODN 1826的反应(Ballas et al.，J.Immunol.167：4878-4886，2001)。可以通过本领域普通技术人员公知的技术生产鼠TLR9的特异抗体。
IC的制备以及树突状细胞对IC的结合和吸收
免疫复合物的制备。将抗核小体单克隆抗体PL2-3(IgG2a)、PL2-8(IgG2b)以及PL9-7(IgG3)与脾细胞24小时体外培养物的上清液进行培养，以制备抗核小体/染色质的IC。染色质从培养物中的脾细胞内自发地释放出来(Bell et al.，J.Clin.Invest.85：1487-1496，1990)；抗核小体的抗体与上述染色质的结合导致了IC的形成，这可以通过Clq免疫试验进行测定(Riflin et al.，Journal of Immunology.165：1626-1633，2000)。我们已经进一步证明，与培养液预培养过的生物素化的PL2-3与类风湿因子B细胞特异性结合，这可以通过流式细胞术检测出来；而单体状态的生物素化的PL2-3则不结合。使用抗TNP单克隆抗体Hy1.2(IgG2a)或C4010(IgG2b)并将其与TNP-BSA进行培养，从而制备非自身抗原对照IC；IC形成的确认也是通过Clq结合进行的(Leadbetter et al.，Nature.416：603-607，2002)。另外的非自身抗原对照IC是利用本实验室制备的抗卵清蛋白单克隆抗体Ov1(IgG2a)和Ov2(IgG2b)，并将其与卵清蛋白进行培养而制备的。除了用Clq结合试验证明IC的形成以外，还使用了FPLC作为证实IC形成的另一种实验手段。
树突状细胞对免疫复合物的结合和吸收.在建立含有IC和树突状细胞的实际实验培养物之前，有必要确定来自不同株系的纯化的树突状细胞亚群所能结合和吸收IC的程度。考虑到所报道的自身免疫和非自身免疫小鼠株系之间在IC处理(Jones et al.，Clin.Immunol.Immunopathol.36：30-39，1985；Magilavy et al.，J.Immunol.131：2784-2788，1983)和Fc受体表达(Pritchard etal.，Current Biology.10：227-230，2000；Jiang et al.，Immunogenetics.51：429-435.，2000)等方面的差别，这一点是特别重要的。该实验方法是通过组合利用流式细胞术和共聚焦显微镜术而追踪免疫复合物中的抗体成分。抗核小体抗体PL2-3(IgG2a)、PL2-8(IgG2b)以及PL9-7(IgG3)已经通过标准步骤与生物素进行了偶联；通过上述方法制备生物素-抗核小体/染色质IC。为了证实生物素-抗核小体/染色质IC保留了其功能，对生物素-PL2-3/染色质IC能否在诱导类风湿因子B细胞的增殖上达到非生物素-PL2-3/染色质IC所能达到的程度进行了评估(Rifkinet al.，Journal of Immunology.165：1626-1633，2000)。生物素-PL2-8/染色质IC和生物素-PL9-7/染色质IC不能通过这种方式进行测定，因为IgG2b和IgG3不能被类风湿因子B细胞受体所识别，但是人们认为在不考虑同种异型时，生物素偶联在功能上的影响是相似的。同种异型匹配的生物素-抗TNP/TNP-BSA IC以及生物素-抗卵清蛋白/卵清蛋白IC以类似方法制备。没有进入复合物的单独的生物素偶联抗体被用作对照。生物素偶联IC和生物素偶联抗体被单独加到不同的树突状细胞亚群中，利用流式细胞术检测细胞表面的结合。通过与特异的荧光染料相偶联的抗生物素单克隆抗体，可以看到生物素标记的化合物(分子探针：抗生物素小鼠单克隆2F5 Alexa Fluor 488偶联物)。接下来，使用共聚焦显微镜术评估在培养1-12小时并用3％多聚甲醛固定之后，树突状细胞对抗核小体抗体(生物素-抗核小体/染色质IC)、抗TNP抗体(生物素-抗TNP/TNP-BSA IC)或抗卵清蛋白抗体(生物素-抗卵清蛋白/卵清蛋白IC)的内化作用。
此外，还进行了共定位研究，其中采用了与对内涵体/溶酶体囊泡具有特异性的荧光标记单克隆抗体进行的共染色，或者能分配到酸性细胞器中的荧光pH指示剂(分子探针)。
含有染色质的IC所导致的树突状细胞活化的测定以及Toll样受 体和Fc gamma受体作用的确定
IC所导致的树突状细胞活化的测定.将前述的抗核小体/染色质IC、抗TNP/TNP-BSA IC以及抗卵清蛋白/卵清蛋白IC与树突状细胞亚群进行培养，树突状细胞的活化通过测定共刺激分子的上调节和细胞因子的产生而确定。对照包括单独的处于单体状态未形成符合物的抗体，单独的抗原，作为TLR9信号传导阳性对照的刺激性CpG S-ODN 1826，作为TLR4信号传导阳性对照的LPS以及作为TLR2信号传导阳性对照的孔蛋白B。通过ELISA测定细胞因子，所述细胞因子包括IL-12，TNF-α，IL-10以及IFN-α。IL-12和TNF-α是用作树突状细胞活化标记的最常用的两种细胞因子(Banchereau et al.，Annu.Rev.Immunol.18：767-811，2000)，IFN-α是与CD11c+CD8α+以及CD11c+B220+Gr-1+树突状细胞亚群的活化关系最为密切的细胞因子。有必要测定IL-10，因为已经表明，巨噬细胞Fc受体的结合可能导致由后续刺激所诱导的IL-10的生产；而所述刺激在Fc受体未结合的情况下，会导致IL-12而不是IL-10的生产(Gerber and Mosser J.Immunol.166：6861-6868，2001)。MHC II类分子以及共刺激分子CD80、CD86和CD40表达的增加通过流式细胞术进行测定。
Toll样受体和Fc gamma受体在IC介导的树突状细胞活化中的作用.S-ODN 2088是一种抑制性CpG S-ODN，它特异性地阻断通过TLR9的信号传导(Lenert et al.，Antisense and NucleicAcid Drug Development.11：247-256，2001)。我们已经证明，S-ODN 2088强烈抑制含有染色质的IC所诱导的B细胞增殖，其中所述B细胞来自类风湿因子B细胞受体转基因小鼠(Leadbetteret al.，Nature.416：603-607，2002(Leadbetter et al.，Nature.416：603-607，2002)。我们也已经证明，S-ODN 2088通过对TLR9的作用而完全阻止了刺激性CpG S-ODN(例如S-ODN 1826)对树突状细胞的活化。上面所介绍的这些实验是在S-ODN 2088存在/不存在的情况下进行的，以便评价TLR9在IC介导的树突状细胞活化中的作用。这些实验也是在内涵体酸化抑制剂存在/不存在的情况下进行的，所述抑制剂包括氯奎、concanamycin B和bafilomycin A，其能够阻止通过TLR9的信号传导。此外，还将来自C57BL/6 MyD88+/+小鼠的树突状细胞和来自C57BL/6MyD88-/-小鼠的树突状细胞进行了比较，以便确定对TLR信号传导的需要。
为了评估对Fc gamma受体(FcγR)信号传导的需要，我们还在2.4.G2(一种单克隆抗体，能够特异性地阻断鼠FcγR II和FcγR III)(Araujo-Jorge et al.，Infect Immun.61：4925-4928，1993)存在/不存在的情况下进行进行了实验。但是，第三种类型的鼠Fc gamma受体，FcγR I，不能被2.4G2所阻断，并且可以介导IC诱导的炎症反应(Ioan-Facsinay et al.，Immunity.16：391-402，2002；Barnes et al.，Immunity.16：379-389，2002)。树突状细胞表达所有这三种FcγR(FcγR I、FcγR II和FcγR III)(Ravetch andBolland，Ann.Rev.Immunol.19：275-290，2001)。因此，可以利用FcγR敲除的小鼠进行另外的研究。这种小鼠可以从Jackson实验室获得，包括：i)FcγR I和FcγR III基因缺陷型小鼠，这种小鼠是通过将上述两种受体所共有的刺激性信号传导gamma链敲除而获得的(Takai et al.，Cell.76：519-529，1994)；ii)FcγR II敲除小鼠(Takai et al.，Nature.379：346-349，1996)；以及iii)FcγR III敲除小鼠(Hazenbos et al.，Immunity.5：181-188，1996)。
IC和TLR9在树突状细胞的抗原处理和呈递中的作用.  在人类以及SLE的鼠类模型中，CD4+自身反应性T细胞在SLE的发病过程中有很重要的作用(Craft et al.，Immunol.Res.19：1999；Hoffman，Front.Biosci.6：D1369-78，2001；Shlomchik et al.，Nature Rev.Immunol.1：147-153，2001)。在T细胞应答的启动中，树突状细胞是关键的抗原呈递细胞(Banchereau et al.，Annu.Rev.Immunol.18：767-811，2000)；已经证明，TLR9的结合强烈地促进了Th1型免疫反应的发展(Jakob et al.，J.Immunol.161：3042-3049，1998；Lipford et al.，J.Immunol.165：1228-1235，2000)。为了证明TLR9的结合是否改变了T细胞对包含在免疫复合物中的抗原的反应，我们按照文献中所述的方法将卵清蛋白与刺激性CpG S-ODN 1826偶联在一起(Shirota et al.，J.Immunol.164：5575-5582，2000)。因此，IC是通过将未偶联的卵清蛋白或卵清蛋白-CpG偶联物与抗卵清蛋白单克隆抗体Ov1(IgG2a)或Ov2(IgG2b)进行培养而制得。来自BALB/c小鼠(H-2d)的树突状细胞亚群与这些IC进行脉冲式接触。CD4+T细胞在H-2Ad的环境中识别卵清蛋白；将CD4+T细胞从卵清蛋白特异性T细胞受体转基因小鼠(DO11.10小鼠)的淋巴结中纯化出来(Murphy etal.，Science.250：1720-1723，1990)。将这些CD4+T细胞与经过IC脉冲式接触的树突状细胞一起培养；在初次T细胞应答以及再次T细胞应答中，检测T细胞的增殖和细胞因子的生产(IFN-gamma，IL-4以及IL-2)。使用S-ODN 2088和内涵体酸化抑制剂来评价TLR9的作用。
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此处以及本说明书中所引用的参考文献以引用的方式将其全部内容包括在本文中。

Claims (16)

1.一种方法，用于治疗患有免疫复合物相关疾病(ICAD)或系统性自身免疫疾病的患者或者ICAD或系统性自身免疫疾病的高危患者，包括：给予所述患者有效量的化合物，其中所述化合物抑制所述免疫复合物或自身抗原使其不能与Toll样受体相结合或使Toll样受体活化，其中所述免疫复合物包含自身抗体以及与细胞受体相结合的自身抗原。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的ICAD是系统性红斑狼疮。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的ICAD是类风湿性关节炎。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的ICAD是丙型肝炎相关的免疫复合物疾病。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述的Toll样受体是Toll样受体9。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述的Toll样受体是Toll样受体3。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述的化合物选自由以下成员构成的组：
(a)与免疫复合物的组成成分相结合并阻止其形成或其与Toll样受体相结合的化合物；
(b)Toll样受体诱饵；
(c)抑制MyD88活性或TLR起始的信号级联的其他成分活性的化合物；
(d)抑制免疫复合物成分的生产的化合物；以及
(e)Toll样受体拮抗剂。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述的化合物是与Toll样受体相结合的抗体。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述的抗体是单链抗体。
10.如权利要求7所述的方法，其中使用了一种化合物溶液(cocktail)，所述化合物抑制与受体组合的结合，其中所述受体组合由Toll样受体2、Toll样受体3、Toll样受体9中的至少两种所构成。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述的Toll样受体拮抗剂是抑制性寡核苷酸。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述的Toll样受体拮抗剂是负显性Toll样受体。
13.一种用于筛选能抑制免疫复合物形成或与Toll样受体结合的化合物的方法，所述方法包括将免疫复合物成分与待筛选的化合物相接触，并检测B细胞的活化和/或增殖和/或免疫复合物的抗原片段与Toll样受体的结合，其中所述的免疫复合物包括自身抗体和自身抗原。
14.一种用于筛选能抑制免疫复合物的形成或与Toll样受体结合的化合物的方法，所述方法包括将免疫复合物成分与待筛选的化合物相接触，并检测树突状细胞的活化和/或免疫复合物的抗原片段与Toll样受体的结合和/或细胞形态，其中所述的免疫复合物包括自身抗体和自身抗原。
15.抑制免疫复合物或自身抗原使其不能与Toll样受体相结合或使Toll样受体活化的化合物在治疗患有免疫复合物相关疾病(ICAD)或系统性自身免疫疾病的患者或者ICAD或系统性自身免疫疾病的高危患者中的应用，其中所述的免疫复合物包含自身抗体以及与细胞受体相结合的自身抗原。
16.如权利要求15所述的化合物，其中所述的化合物选自由以下成员构成的组：
(a)与免疫复合物的组成成分相结合并阻止其形成或其与Toll样受体相结合的化合物；
(b)Toll样受体诱饵；
(c)抑制MyD88活性或TLR起始的信号级联的其他成分活性的化合物；
(d)抑制免疫复合物成分的生产的化合物；以及
(e)Toll样受体拮抗剂。
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