RU2361877C2 - Пептиды hsp60 и их apl-производные и фармацевтические композиции - Google Patents
Пептиды hsp60 и их apl-производные и фармацевтические композиции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2361877C2 RU2361877C2 RU2007115411/04A RU2007115411A RU2361877C2 RU 2361877 C2 RU2361877 C2 RU 2361877C2 RU 2007115411/04 A RU2007115411/04 A RU 2007115411/04A RU 2007115411 A RU2007115411 A RU 2007115411A RU 2361877 C2 RU2361877 C2 RU 2361877C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- peptides
- peptide
- cells
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 240
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 132
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 101710154868 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Proteins 0.000 title description 13
- 102100038222 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 title description 13
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 62
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 4
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 101000883686 Homo sapiens 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 6
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 57
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 55
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 55
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 50
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 50
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 42
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 41
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 34
- 208000036762 Acute promyelocytic leukaemia Diseases 0.000 description 32
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 32
- 101800001062 ADAM10-processed FasL form Proteins 0.000 description 31
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 31
- 102400000083 ADAM10-processed FasL form Human genes 0.000 description 30
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 24
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 16
- 238000011161 development Methods 0.000 description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 13
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 12
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 11
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 10
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 8
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 7
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 7
- 241001111421 Pannus Species 0.000 description 7
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 7
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 7
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 7
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 4
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 3
- 206010023203 Joint destruction Diseases 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 3
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 3
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 3
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 229940122450 Altered peptide ligand Drugs 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 101100282617 Bovine herpesvirus 1.1 (strain Cooper) gC gene Proteins 0.000 description 2
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 2
- 102000006303 Chaperonin 60 Human genes 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 241001391926 Neea Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001712 encephalitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 2
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011767 Acute-Phase Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010062271 Acute-Phase Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010071155 Autoimmune arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100021410 Heat shock 70 kDa protein 14 Human genes 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001041756 Homo sapiens Heat shock 70 kDa protein 14 Proteins 0.000 description 1
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- -1 IL -11 Proteins 0.000 description 1
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000049772 Interleukin-16 Human genes 0.000 description 1
- 101800003050 Interleukin-16 Proteins 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 1
- 241000091577 Mexicana Species 0.000 description 1
- 101100341510 Mus musculus Itgal gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N Norphytane Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 1
- 238000010161 Student-Newman-Keuls test Methods 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000599 auto-anti-genic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010228 ex vivo assay Methods 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000006450 immune cell response Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 229940124622 immune-modulator drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000031261 interleukin-10 production Effects 0.000 description 1
- 230000017307 interleukin-4 production Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000004031 partial agonist Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009521 phase II clinical trial Methods 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008409 synovial inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Предложены пептиды белка теплового шока человека 60 кДа, которые представляют собой эпитопы для Т-клеток, а также их пептидные производные, которые модифицированы по участкам контакта с молекулами МНС, способные индуцировать механизмы периферической толерантности, в частности механизмы анергии или механизмы, опосредуемые клонами регуляторных Т-клеток у пациентов с ревматоидным артритом. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим указанные пептиды для лечения ревматоидного артрита. 6 н. и 3 з.п. ф-лы, 14 ил., 3 табл.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к пептидам белка теплового шока человека 60 kDa (сокращенно hHsp60) и полученным из них измененным пептидным лигандам (сокращенно APL). Кроме того, изобретение связано с фармацевтическими композициями для лечения ревматоидного артрита (RA), включающими указанные пептиды.
Уровень техники
RA - аутоиммунная болезнь неизвестной этиологии, которая затрагивает приблизительно 1% мирового населения. Это - синдром, характеризующийся хроническим воспалением суставов, хотя могут также наблюдаться системные явления. Эта болезнь начинается с воспаления синовиальной мембраны и часто вызывает эрозийное разрушение смежного хряща и кости, которое приводит к умеренной нетрудоспособности 80% пациентов и ранней смертности (Moctezuma J.F. (2002) Manifestaciones articulares de la Artritis Reumatide. Revista Mexicana de Reumatologia 17:211-219). RA может проявляться в любом возрасте, без различий расовых или этнических групп, но максимальная частота возникновения указанного заболевания встречается между 25 и 55 годами. Среди людей с RA женщины опережают мужчин в пропорции три к одному (Emery P. (2002). Early referral recommendation for newly diagnosed rheumatoid arthritis: evidence based development of to clinical guide. Ann Rheum Dis. 61:290-297).
Причина RA неизвестна. Это - болезнь, которая включает присутствие генетических, экологических, иммунологических и гормональных факторов. С тенденцией к развитию RA связаны определенные гены, играющие роль в иммунной системе. В то же время, некоторые люди с RA не имеют этих генов, а у других людей, имеющих эти гены, болезнь никогда не развивается. Поэтому предположили, что генетический фон важен, но не является решающим.
В моделях аутоиммунного заболевания микробные антигены со структурой, подобной собственным антигенам, могут вызывать перекрестный ответ на аутоантигены, производя изменение в механизмах толерантности и фиксируя аутоиммунный ответ. В общем смысле, повреждение и местный некроз в ткани, вызванные инфекционным агентом, могут выявить скрытую аутоантигенную детерминанту, которая способна активизировать аутореактивные T-клетки (Albert L.J. (1999) Mechanisms of Disease: Molecular Mimicry and autoimmunity. N Engl J Med 341:2068-2074).
Фаза перехода T-лимфоцита между толерантностью и иммунной/аутоиммунной активностью регулируется на различных уровнях. Двумя важными параметрами в указанном переходе являются состояние созревания антиген-презентирующих клеток (сокращенно APC) и уровни аутоантигенов, которые детектируются иммунной системой (Ohashi, P.S. (2002) Making and breaking tolerance. Current Opinion in Immunology 14:744-759).
Одна из текущих гипотез, которая пытается объяснить развитие аутоиммунных заболеваний, отмечает, что APC в отсутствие сигналов врожденной иммунной системы или сигналов опасности остаются относительно незрелыми и вызывают толерантность аутореактивных T-клеток, когда им презентируются собственные пептиды (Steiman R.M. (2000) The induction of tolerance by dendritic cells that have captured apoptotic cells. J Exp Med. 191:411-416). Индукция периферической толерантности также коррелирует с концентрацией собственного антигена (Kurts, C. (1999) CD8 T cell ignorance or tolerance to islet antigens depends on antigen dose. PNAS 96:12703-12707). Повышение уровня презентирования собственных антигенов из-за повышения уровней их экспрессии позволяет аутореактивным некомпетентным T-клеткам детектировать их. Если уровни собственных антигенов увеличены в отсутствие явлений, которые ускоряют созревание APC, толерантность к этим антигенам сохраняется, в противном случае в присутствии провоспалительных сигналов или других явлений, которые ускоряют созревание APC, толерантность нарушается активацией некомпетентных T-клеток и развиваются аутоиммунные заболевания (Janeway C.A. (2002) Innate immune recognition. Annu Rev Immunol. 20:197-216). Инфекционными агентами, которые были объектом исследования как причина RА, являются среди прочих: вирус Эпштейна-Барра, ретровирус, вирус гепатита C, Mycobacterium tuberculosis (сокращенно Mt), а также Helicobacter pilory.
Патогенез RА характеризуется совместным действием различных типов клеток, которые вызывают прогрессивное разрушение хряща и кости. В нормальных условиях существует баланс между воспалительными цитокинами, такими как: TNFα, IL-1, IL-6, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 и IFNγ, и противовоспалительными, такими как IL-4, IL-11, IL-13 и антагонистами IL-1 или TNFα. В случае RА указанный баланс перемещается, однако, в пользу воспалительных цитокинов (Arend W.P. (2001) Cytokine imbalance in the pathogenesis of rheumatoid arthritis: The role of interleukin-1 receiving antagonist. Semin Arthritis Rheum 30 (2):1-6).
Узнавание экзогенного антигена или аутоантигена вероятно является причиной ряда событий, которые вызывают разрушение суставов у пациентов с RА. Это явление вызывает активацию CD4+ T-лимфоцитов, которая наряду со стимуляцией различных цитокинов ведет к их дифференцировке в Th1-клетки с последующим высвобождением провоспалительных цитокинов (IL-2 и INFy) (Simόn A.J. (2001) Biological therapy in Rheumatoid Arthritis. Magazine of Clinical Investigation 53 (5):452-459). Многие исследователи соглашаются с тем, что хроническое воспаление суставов вызвано указанными активированными T-клетками, которые проникают в синовиальную мембрану. Действие этих цитокинов на макрофаги вызывает выработку большого количества TNFα и IL-1. Они вызывают ряд местных и общих эффектов, таких как регулирование экспрессии молекул адгезии в эндотелиальных клетках (LFA1, ICAM-1), которые привлекают другие клетки к участкам воспаления. Они также стимулируют макрофаги, фибробласты, хондроциты и остеокласты к высвобождению других медиаторов воспаления, таких как IL-15 и IL-8. TNFα и IL-1 стимулируют пролиферацию синовиальной мембраны, что вызывает формирование паннуса, они могут также вызвать дифференцировку B-лимфоцитов в клетки, продуцирующие антитела, которые потенциально участвуют в разрушении сустава. Они также ингибируют выработку противовоспалительных цитокинов (IL-4 и IL-14), вырабатываемых Th2-клетками, и стимулируют гепатоциты к выделению IL-6. IL-6 способствует выработке белков острой фазы, которые участвуют в данном процессе, усиливая иммунный ответ (Forre O. (2000) New possibilities of treatment in AR. Scand J Rheumatol 29 (2):73-84).
Среди аутоантигенов, вовлеченных в патогенез RA, присутствует белок Hsp60, который принадлежит семейству Hsp-белков, которые являются иммуногенными белками с исключительной эволюционной консервативностью. Иммунный ответ против чужеродного Hsp - важный механизм защиты против бактериальных инфекций. Антитела против этих белков могут присутствовать в изобилии и у здоровых людей, и у пациентов с аутоиммунными заболеваниями, и они могут перекрестно реагировать с собственными антигенами (Chen W. (1999) Human 60-kDa Heat-Shock Protein: To Danger Signal to the Innate Immune System. J Immunol. 162:3212-3219).
Hsp65 из Mt гомологичен Hsp60 млекопитающих. Это означает, что Hsp60 может быть признан как аутоантиген у пациента с RA. У пациентов с RA, по сравнению с пациентами с остеоартритом, имеется увеличение пролиферативного ответа B-лимфоцитов в синовиальной жидкости на Hsp65 микобактерий. Интенсивность ответа коррелирует с синовиальным воспалением. Данный ответ не является специфическим для RA по сравнению с другими воспалительными заболеваниями (Life P. (1993) Responses to Gram negative enteric bacterial antigens by synovial T cells from patiens with juvenile chronic arthritis: recognition of heat shock protein hsp60. J Rheumatol. 20:1388-1396).
Концентрация Hsp является возможным сигналом опасности для иммунной системы, который высвобождается из мертвых клеток, и может индуцировать воспалительный ответ и вызвать созревание APC. Hsp-белки являются внутриклеточными белками, которые не только не экспрессируются в клеточной мембране, но и не секретируются, поэтому Hsp являются привлекательными кандидатами на роль молекул, которые представляют собой сигналы опасности (Van den Berg, WB. (1998): Joint inflammation and cartilage destruction may occur uncoupled. Springer Semin lmmunopathol. 20:149-164).
Для лечения некоторых аутоиммунных патологий были предложены несколько препаратов, в которых используется Hsp60 или производные от него пептиды. Например, в патенте EPO262710 предложено использование нескольких пептидов Hsp60 из Mt для лечения и диагностики аутоиммунных заболеваний, особенно артритных состояний. Данное изобретение основано на том факте, что предыдущие инфекции, вызванные несколькими бактериями, могут инициировать развитие аутоиммунных заболеваний у генетически восприимчивых людей, например: пациенты с RA могут показать высокую реактивность к микробным антигенам. Эти же авторы в патенте EPO322990 предлагают использование других пептидов Hsp60 из Mt с той же самой целью, как и в предыдущем патенте. В заявке на патент WО 9610039 предполагается использование пептида Hsp60 из Mt для диагностики и лечения аутоиммунного артрита.
В заявке на патент WО 9711966 авторы предполагают использование пептидов из неконсервативных областей hHsp60, которые не совпадают с Hsp60 бактерий, что может вызвать толерантность T-клеток у пациентов с RA.
В заявке на патент WO 0143691 предлагается использование фармацевтических композиций, специфически составленных из пептидов hHsp60 и их вариантов для профилактики воспалительных заболеваний, таких как RA.
В патенте US 6180103 авторами предполагается использование пептида Hsp60, обозначенного p277, и его аналогов для диагностики и профилактики диабета типа I.
Патент US 5993803 защищает использование Hsp60, пептида p277 и группы пептидов-производных указанного белка для уменьшения тяжести иммунного ответа во время трансплантации органов.
Недавно было установлено, что атеросклероз обнаруживает ряд особенностей, подобных аутоиммунным процессам. В заявке на патент WO 0072023 авторы предлагают способ лечения и диагностики атеросклероза и коронарных заболеваний с использованием препарата, который включает белок Hsp60.
В заявке на патент WO 02057795 защищен новый метод для диагностики и лечения остеопороза с использованием белков семейства Hsp и белков из патогенных микроорганизмов, таких как вирусы и бактерии.
В настоящее время лечения для RA не существует. Современные способы лечения сосредоточены на облегчении боли, уменьшение воспаления, замедление повреждений суставов и на улучшение самочувствия пациентов. Недавно были разработаны иммуномодулирующие лекарственные препараты, которые блокируют цитокины, участвующие в развитии и поддержании воспалительного ответа при RA, с целью остановки или замедления прогрессирования заболевания. Для данного вида терапии существуют два типа лекарственных препаратов: блокирующие действие фактора некроза опухолей (сокращенно TNFα), и те, которые ингибируют действие интерлeйкина 1 (IL-1).
Хотя при терапиях с анти-TNFα и анти-IL-1 результаты являются многобещающими, процент инфекций высок. У многих пациентов, лечившихся этими препаратами, развиваются тяжелые инфекции, которые являются в некоторых случаях фатальными, включая другие аутоиммунные заболевания, неоплазии и т.д. Кроме того, они являются очень дорогими лекарственными средствами (Breshinan B. (1998) Treatment of rheumatoid arthritis with recombinant human antiinterleukin-1 antagonist. Arthritis Reum. 41:2196-2204).
Оральная толерантность была предложена как способ создания периферической толерантности по отношению к определенным антигенам. Она может быть вызвана механизмами активной супрессии, анергии или делеции клона, в зависимости от доз и частоты введения антигена. Указанным способом можно индуцировать регуляторные T-клетки, которые специфическим образом активируются антигеном, но проявляют свое действие независимо (активная супрессия). Поскольку имеет место регулирующее действие, нет необходимости вводить не только потенциально патогенный антиген, но и любой другой, способный вызвать активную супрессию в центре воспаления при ингибировании деятельности патогенных эффекторных клеток. Коллаген типа II (сокращенно CII) является аутоантигеном, который наиболее часто используется в указанном направлении. Результаты исследований, проведенных с пациентами, страдающими RA, с использованием куриного и бычьего CII дали противоречивые результаты (Trentham D.E. (1993) Effects of oral administration of type II collagen in rheumatoid arthritis. Science 261:1727-1730; Sieper J. (1996) Oral type II collagen treatment in early rheumatoid arthritis: to double-blind, placebo-controlled, randomize trial. Arthritis Rheum. 39:41-51).
Патент US 6153200 предполагает использование пептида из Hsp70, белка, принадлежащего семейству Hsp, для индуцирования толерантности оральным путем у пациентов с RA.
Другой вариант, который был предложен для индукции толерантности посредством APL-пептидов, основан на том, что T-клетки активируются, если CD4+ T-лимфоциты, специфичные к определенному антигенному пептиду, узнают антиген, презентированный компетентными APC. Тем не менее, если та же самая T-клетка изначально активирована другой формой антигена, в котором один из участков контакта с TcR слегка изменен, это может привести к неполной активации или даже инактивации T-клеток. Эти антигены называют APL. APL подобны иммуногенным пептидам, которые запускают каскад необходимых событий для полной активации T-клеток, с одной или несколькими заменами в положениях, существенных для контакта с TcR или с MHC.
По существу, среди других воздействий, для усиления ответа T-клеток на специфические антигены могут быть разработаны APL со свойствами, подобными свойствам иммуногенного пептида (агониста). Этот эффект выгоден при патологических состояниях, таких как инфекционные заболевания. Также могут быть разработаны пептиды с антагонистическими свойствами по отношению к иммуногенному пептиду, которые могут быть полезными в контроле над аутоиммунными заболеваниями, так как они могут блокировать ответ T-клеток, действуя в роли антагонистов к TcR (M. De Magistris (1992) Antigen analog-major complex histocompatibility complexes act as antagonist of the T cell receptor. Cell 68:625-634), частичных агонистов или индукторов популяции регуляторных T-клеток, которые опосредуют активную супрессию (Evavold B.D. (1991) Separation of IL-4 production from Th cell proliferation by an altered T cell ligand. Science 252:1308-1310). Возможность экспериментально регулировать характерные свойства пептидных лигандов позволяет изменять природу, направление и силу иммунного клеточного ответа, соответственно.
До настоящего времени на людях были проведены два клинических испытания с использованием пептидов APL-типа для лечения аутоиммунных заболеваний. В обоих испытаниях пептиды происходили из эпитопа в положении 83-93 из основного белка миелина. В одном из этих испытаний участвовало 142 пациента с рассеянным склерозом, но оно было приостановлено, так как у 9% пациентов развилась гиперчувствительность (Ludwig Kapposi (2000) Induction of non-encephalitogenic type 2 T helper-cell autoimmune response in multiple sclerosis after administration of an altered peptide ligand in to placebo controlled, randomized phase II trial. Nature Medicine 10:1176-1182).
Другое испытание включало 25 пациентов и было также прервано, потому что у трех пациентов наблюдалось обострение болезни (Bibiana Bielekova (2000) Encephalitogenic potential of the myelin basic protein peptide (amino acids 83-99) in multiple sclerosis: Results of to phase II clinical trial with an altered peptide ligand. Nature Medicine 6:1167-1175). Главный автор указанной работы анализирует возможные факторы, которые определили эти отрицательные результаты, и отмечает, что изменения, произведенные в сайтах APL, могут образовать новые участки связывания с HLA (как это случилось в случае связывания APL с DRB1*0404, как показано у пациента I), комплекс APL-HLA может также стимулировать T-клетки, не исключенные при отрицательной селекции, и которые могут быть перекрестно активированы нативным аутоантигеном. В данном испытании использовались фармацевтические композиции с высокими концентрациями APL, которые могут стимулировать Т-клетки с высоким сродством к аутоантигену и вызывать гетероклитический Т-клеточный ответ (Bibiana Bielekova and Roland Martin (2001) Antigen-specific immunomodulation via altered peptide tying. J Mol Med. 79:552-556).
Для того чтобы провести эти два клинических испытания, авторы предварительно не анализировали у пациентов Т-клеточный ответ на APL in vitro. Они также не оценивали типы молекул HLA, экспрессируемые у подвергнутых лечению пациентов.
Главная проблема в лечении аутоиммунных заболеваний состоит в разработке терапевтических стратегий, с помощью которых можно специфично устранить патогенные Т-клетки, не затрагивая другие Т-клетки. Таким образом, терапевтический поиск должен дать безопасный, специфичный и эффективный способ выключения развитого аутоиммунного процесса. Настоящее изобретение, в отличие от предыдущего уровня техники, предлагает использование пептидов hHsp60 и их APL-производных, которые специфическим путем индуцируют ингибиторные молекулярные механизмы в процессе RA.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение направлено на решение вышеуказанной задачи по обеспечению пептидами белка теплового шока человека 60 кДа, несущими эпитопы T-клеток, для индукции механизмов толерантности, в частности механизмов индукции анергии или механизмов, опосредованных клонами регуляторных T-клеток у пациентов с RА, и которые представлены следующими последовательностями:
E18-12 MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO:1)
E18-3 SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG (SEQ. ID. NO:2)
F19-6 IIDPTKVVRTALLDAA (SEQ. ID. NO:3)
В заявке на патент WO 9711966 предложено использование пептидов hHsp60 из Mt, основанное на том факте, что они могут индуцировать толерантность у T-клеток и предотвращать RА. Указанные авторы подтверждают определенное улучшение в ходе болезни при введении этих пептидов мышам (артрит был предварительно вызван пристином). В противоположность указанной заявке авторы изобретения продемонстрировали, что пептиды по изобретению индуцируют механизмы активной супрессии, которые вызывают периферическую толерантность очень эффективным способом, подтверждая существенное увеличение IL-10 в двух животных моделях артрита так же, как и в анализах "ex vivo" с использованием мононуклеарных клеток пациентов.
Известно, что основной ответ T-клеток в модели адъювант-индуцированного артрита (AIA) направлен против Hsp60. С помощью указанной модели авторы изобретения установили, что пептиды по изобретению, производные hHsp60, проявляют весьма заметную терапевтическую защиту, вызывая увеличение уровней IL-10 и уменьшение уровней TNFα. Такой же терапевтический эффект, вызванный этими пептидами, авторы также регистрировали на животной модели коллаген-индуцированного артрита (CIA), где основной ответ направлен против коллагена типа II.
Эти факты указывают на то, что терапевтические возможности пептидов по изобретению независимы от индуцирующего агента и могут опосредовать механизмы активной супрессии в участке воспаления, которые могут быть распространены на другие аутоантигены, присутствующие в суставах и которые прогрессивно содействуют иммунопатогенному процессу, имеющему место в процессе RА. Эти результаты подтверждают возможности терапевтического использования наших препаратов для лечения RА.
Согласно настоящему изобретению указанные пептиды в особенности полезны для разработки вариантов пептидных APL-производных E18-12 (SEQ. ID. NO:1) и E18-3 (SEQ. ID. NO:2), модифицированных по сайтам взаимодействия с молекулой MHC человека и APL-производных пептида F19-6 (SEQ. ID. NO:3), модифицированных по сайтам взаимодействия с молекулой MHC крысы. Далее приведены соответствующие аминокислотные последовательности:
где аминокислота в положении 1 замещена на: A,F,I,L,M,V,W, или Y
в положении 2 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, или Y
в положении 3 на: A,K,V,R,T,I,P,L,N,S,G,Y, или M
в положении 4 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, или Y
в положении 5 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, или Y
в положении 6 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W, или Y
в положении 7 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, или Y
где аминокислота в положении 1 замещена на: L,I,V,M,Y,W,F, или A
в положении 2 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, или Y
в положении 3 на: A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W, или Y
в положении 4 на: L,I,V,M,Y,W,F, или A
в положении 5 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, или Y
в положении 6 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, или Y
в положении 7 на: A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W, или Y
в положении 8 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, или Y
где аминокислота в положении 1 замещена на H и аминокислота в положении 2 замещена на E.
В частных случаях выполнения пептидные производные APL-типа имеют аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ. ID. NO:4, SEQ. ID. NO:5, SEQ. ID. NO:6, SEQ. ID. NO:7, SEQ. ID. NO:8, SEQ. ID. NO:9, SEQ. ID. NO:10, SEQ. ID. NO:11, SEQ. ID. NO:12, SEQ. ID. NO:13, SEQ. ID. NO:14, SEQ. ID. NO:15, SEQ. ID. NO:16, SEQ. ID. NO:17, SEQ. ID. NO:18, SEQ. ID.NO:19, SEQ. ID. NO:20 и SEQ. ID. NО:21.
Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены стандартными способами пептидного синтеза. Определенный состав каждого пептида может быть оценен по уровню и качеству иммунного ответа, который указанный пептид вызывает в экспериментах, как это описано в примерах, которые будут представлены далее.
Все последовательности, описанные выше, и последовательности в примерах являются перспективными и могут также использоваться в качестве основы для разработки и синтеза пептидных производных с улучшенными свойствами.
Изобретение также включает фармацевтические композиции, которые включают один или несколько вышеперечисленных пептидов и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.
Введение фармацевтических препаратов пациентам может осуществляться в соответствии с молекулами HLA класса II, которые экспрессируются у каждого конкретного пациента.
Способ введения фармацевтических композиций будет зависеть от профиля цитокинов, который эти препараты индуцируют в тестах "ex vivo". Фармацевтические препараты, включающие APL-пептиды, индуцирующие регуляторный ответ, будут вводиться внутрикожно или подкожно. Фармацевтические препараты, включающие исходные пептиды, вызывающие TH1-ответ, могут быть введены орально.
Дозы пептидов в фармацевтических композициях настоящего изобретения эквивалентны дозам, вызывающим эффективный иммунный ответ в организме-хозяине. Эффективная доза является дозой, которая при введении индуцирует молекулярные механизмы, которые значительно снижают показатели воспалительных симптомов RA и останавливают рост показателей разрушения суставов в процессе заболевания. Количество фармацевтической композиции, вводимой организму-хозяину, может также изменяться в зависимости от нескольких факторов, которые включают: используемые пептиды, ACR-шкалу (Американская Коллегия Ревматологии, сокращенно ACR), HLA типа II, время течения болезни, возраст, пол, общее состояние здоровья, а также уровень иммунного ответа в целом. Настоящее изобретение также относится к способу лечения RА, который включает введение пациенту эффективных доз пептидов или фармацевтических композиций, описанных выше.
Краткое описание чертежей
Результаты частично представлены графически на следующих чертежах:
Фиг.1: Оценка клинических признаков артрита у крыс, обработанных внутрикожно пептидами F19-6 и F19-7 в AIA модели.
Фиг.2: Модуляция уровней TNFα, индуцированных пептидами F19-6 и F19-7 в мононуклеарных клетках крыс в AIA модели на 15 день после индукции болезни.
Фиг.3: Модуляция уровней IL-10, индуцированных пептидами F19-6 и F19-7 в мононуклеарных клетках крыс в AIA модели на 15 день после индукции болезни.
Фиг.4: Оптическая микроскопия среза сустава, принадлежащего больному животному, не получавшему лечения. IS: внутрисуставное пространство, EC: эрозия хряща, P: паннус. Окрашено гематоксилин-эозином.
Фиг.5: Оптическая микроскопия среза сустава, принадлежащего животному, подвергнутому воздействию пептида F19-7, введенного внутрикожно. IS: внутрисуставное пространство. Окрашено гематоксилин-эозином.
Фиг.6: Модуляция уровней TNFα, индуцированных пептидами F19-6 и F19-7 в мононуклеарных клетках крыс в CIA модели на 21 день после индукции болезни.
Фиг.7: Модуляция уровней IL-10, индуцированных пептидами F19-6 и F19-7 в мононуклеарных клетках крыс в СIA модели на 21 день после индукции болезни.
Фиг.8: Модуляция уровней TNFα, пептидами F19-6 и F19-7 в мононуклеарных клетках пациентов с RA.
Фиг.9: Модуляция уровней TNFα, пептидами E18-3 и E18-12 в мононуклеарных клетках пациентов с RA.
Фиг.10: Модуляция уровней IL-10, пептидами E18-3 и E18-12 в мононуклеарных клетках пациентов с RA.
Фиг.11: Модуляция уровней IL-10, индуцированных пептидами E18-3 и E18-12 и их APL-производными в мононуклеарных клетках пациентов с RA.
Фиг.12: Модуляция уровней TNFα, индуцированных пептидами E18-3 и E18-12 и их APL-производными в мононуклеарных клетках пациентов с RA.
Фиг.13: Соотношение уровней IL-10 и TNFα, индуцированных пептидами E18-3 и E18-12 и их APL-производными.
Фиг.14: Оценка клинических признаков артрита у крыс, подвергнутых воздействию пептидов E18-12 и E18-12APL1, введенных внутрикожным путем, в модели AIA.
Подробное описание настоящего изобретения
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Пептиды hHsp60, презентированные человеческим HLA
Были отобраны те пептиды hHsp60, для которых подтверждалось, что они являются эпитопами Т-клеток человека в соответствии с используемыми программами: SYFPEITHI (Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor and Stefan Stevanovic. 1999. Immunogenetics 50:213-219. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs, (access via: http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi /)) and ProPred (Singh H. and Raghava, G.P.S. 2001. ProPred: Prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics, 17(12): 1236-37). Последовательности, соответствующие этим пептидам, показаны в таблице 1.
Таблица 1 | ||
Последовательность пептидов hHsp60, презентированных человеческим HLA | ||
Пептиды | Положение в последовательности | Аминокислотная последовательность |
E18-12 | 55-75 | MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO:1) |
E18-3 | 83-110 | SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG (SEQ. ID. NO:2) |
Пример 2
Пептид hHsp60 для эпитопа крыс Льюиса
Начиная с последовательности hHsp60, отбирают пептид, который связывается с молекулой MHC-II крысы RT1.BI в соответствии с участком последовательности, описанной в базе данных SYFPEITHI (Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic. 1999. Immunogenetics 50:213-219. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs (access via: http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi /)).
Программа, которая анализирует все пептиды из 9 аминокислот, была разработана для поиска тех пептидов, которые отвечают указанному участку. Авторы изобретения также включали варианты, которые в одном из положений не были включены в указанные остатки в качестве якорных или предпочтительных. Последовательность, соответствующая одному из этих пептидов (F19-6), показана в таблице 2.
Таблица 2 | ||
Последовательность пептидов hHsp60, отобранных для крыс | ||
Пептид | Положение в последовательности | Аминокислотная последовательность |
F19-6 | 518-533 | IIDPTKVVRTALLDAA (SEQ. ID. NO:3) |
Пример 3
Конструирование APL с модификациями аминокислот, включенных в связывание с MHC
Начиная с пептидов, отобранных в примерах 1 и 2, изменили положения, включенные в связывание с определенным MHC (положения 1, 3, 4, 6, 8 или 9), с целью увеличить аффинность пептида к молекуле HLA. Эти пептиды были проанализированы на наличие оптимальных остатков в каждом из этих положений, которые могут представлять собой якорные остатки в том случае, если бы пептид был отобран методом, использующим участки связывания (SYFPEITHI), либо остатки, способные увеличить рейтинг пептида как лиганда MHC, если пептид был выбран с использованием другого типа алгоритма (ProPred). В результате этих исследований в пептиде E18-12 были проведены замены в положениях 1-7 каждой из аминокислот, которые перечислены далее:
где аминокислота в положении 1 замещена на: A,F,I,L,M,V,W или Y
в положении 2 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W или Y
в положении 3 на: A,K,V,R,T,I,P,L,N,S,G,Y или M
в положении 4 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W или Y
в положении 5 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V или Y
в положении 6 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W или Y
в положении 7 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V или Y
где аминокислота в положении 1 замещена на: L,I,V,M,Y,W,F или A в положении 2 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W или Y
в положении 3 на: A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W или Y
в положении 4 на: L,I,V,M,Y,W,F или A
в положении 5 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W или Y
в положении 6 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W или Y
в положении 7 на: A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W или Y
в положении 8 на: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W или Y
В пептиде F19-6 по положениям 1 и 2 были осуществлены замены на аминокислоты, перечисленные далее:
где аминокислота в положении 1 замещена на H,
а аминокислота в положении 2 замещена на E.
Пример 4
Индукция артрита адъювантом и коллагеном у крыс Льюиса
В эксперименте использовались инбредные самки крыс Льюиса (RT1.BI MHC), предоставленные Национальным Центром Производства Лабораторных Животных (CENPALAB, Cuba). Крысы с приблизительным весом 101-120 г и 5-8 недель возраста были отобраны случайным образом.
Одним из агентов-индукторов болезни был Mt (H37Ra, Difco, England) в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) (Sigma, USA). Другим агентом-индуктором артрита являлся бычий коллаген типа II в IFA.
В настоящем примере для развития артрита у крыс, вызванного иммунным ответом против двух различных аутоантигенов, использовались два различных индуцирующих агента. Хорошо известно, что в животной модели артрита, в которой в качестве индуктора болезни используется Mt, фундаментальный ответ T-клеток направлен против Hsp60 (Anderton, SM (1995) Activation of T cells recognizing self 60-kD heat shock protein can protect against experimental arthritis. J. Exp. Med. 181: 943-952). В модели, в которой в качестве индуктора используется коллаген, заметный ответ антител, а также клонов T-клеток развивается против указанного антигена (M Griffiths (1988) lmmunogenetics of collagen-induced arthritis in rats. Inten. Rev. Immunology 4:1-15).
Основная цель изобретения получения этих двух животных моделей состояла в том, чтобы оценить пептиды по изобретению на обеих моделях с целью демонстрации того, являлся ли защитный эффект этих пептидов независимым или нет по отношению к аутоантигену, используемому в качестве агента индукции артрита у крыс.
Пример 5
Оценка клинических признаков
Уровень воспаления, связанный с развитием артрита, который показывала каждая крыса, был оценен в соответствии со следующим средним значением, подготовленным для этой цели:
0 единиц: нормальная лапка.
1 единица: Легкая, но характерная краснота лодыжки или очевидная краснота и воспаление, ограниченное отдельным пальцем, независимо от количества затронутых пальцев.
2 единицы: Умеренная краснота и воспаление лодыжки.
3 единицы: Тяжелая краснота и воспаление целой лапки, включая пальцы.
4 единицы: Максимальное воспаление и деформация лапки, вовлекающие большое количество суставов.
Четыре лапки были оценены по отдельности согласно установленной шкале, причем каждая лапка могла получить до 4 пунктов. Таким образом, каждая крыса могла получить максимум 16 пунктов.
Визуальная оценка проводилась после индукции болезни каждые пять дней.
Клиническая оценка признаков артрита демонстрировала, что были существенные статистические различия между животными, соответствующими здоровой контрольной группе (группа IV), где болезнь не была вызвана, и животными, соответствующими больной контрольной группе (группа III), где болезнь была вызвана, но им не вводили пептиды, как это показано на фиг.1.
Пример 6
Синтез пептидов
Пептиды синтезировали в соответствии со стратегией Fmoc/tBu в шприцах. Использовали смолу Fmoc-AM-MBHA (0,54 ммоль/г), и протокол синтеза был продолжен с механическим перемешиванием. После обработки ТФУ, пептид был лиофилизирован и охарактеризован с помощью ВЭЖХ и масс-спектрометрии.
Пример 7
Внутрикожное введение пептидов
Животные были разделены на четыре группы по 12 крыс в каждой. Болезнь была вызвана в трех группах животных (группы I- III), причем двум группам вводили пептиды, а одна группа являлась контролем индукции болезни. Две группы животных, которым вводили пептиды, получили 200 мкг пептида на каждую крысу в 100 мкл PBS, на 12, 17 и 22 дни после индукции болезни при помощи Mt. Животные, разделенные на четыре группы, были подвергнуты терапии следующим образом:
- группа I: животные, подвергнутые обработке пептидом F19-6;
- группа II: животные, подвергнутые обработке пептидом F19-7;
- группа III: животные, не подвергнутые обработке пептидами (контроль индукции болезни);
- группа IV: животные, у которых не была вызвана болезнь и которые не подверглись обработке пептидами (отрицательный контроль).
В дни 15, 21, 28 и 35 после индукции в группе умерщвляли по три животных, извлекали селезенку и отбирали пробы из суставов для гистопатологического анализа.
Как это показано на фиг.1, признаки, связанные с развитием артрита, развивались постепенно. У животных группы III, по сравнению с контрольной группой развития болезни, с 10 дня после индукции артрита стало наблюдаться развитие воспалительного процесса, который начался с легкой красноты нижнего сустава и который продвинулся, распространяясь в остальную часть сустава, пока не стал тяжелым у некоторых крыс. Из указанной фигуры видно, что введение пептида F19-6, соответствующего исходному эпитопу hHsp60, и их варианту APL F19-7, вызвало существенное уменьшение клинических признаков артрита у животных, подвергнутых обработке обоими пептидами. Среди групп, подвергнутых обработке пептидами F19-6 и F19-7, были получены статистически существенные различия, и эта группа была взята в качестве положительного контроля болезни (P<0,05).
Результаты, полученные в данном исследовании, подтверждают, что пептиды F19-6 и F19-7 проявляют защитный эффект у животных, подвергнутых обработке, так как у крыс можно было наблюдать почти полную ремиссию заболевания.
Пример 8
Выделение мРНК
Мононуклеарные клетки, выделенные из селезенки крыс, инкубировали в течение приблизительно 20 часов. Затем отбросили супернатант и в каждую лунку добавили 1 мл реактива: TRI REAGENT TM (SIGMA, USA) и оставили на 5 минут при комнатной температуре. После чего выделение мРНК выполнили по методике, рекомендованной фирмой-производителем.
Пример 9
Обратная транскрипция РНК
Для получения комплементарной ДНК была использована система Gene Amp RNA PCR Kit (Perkin-Elmmer, USA). По методике использовали 1 мг мРНК, соответствующей каждому образцу, после чего опыт провели по методике, рекомендованной фирмой-производителем. Реакция была проведена в амплификаторе (Minicycler, MJ Research, USA) по следующей схеме: первый цикл 1 час при 42°С, затем 5 минут при 95°С и 5 минут при 4°С.
Пример 10
Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была проведена в отношении цитокинов: TNFα и IL-10, а также конститутивного гена, кодирующего фермент GAP-DH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу, сокращенно GAP-DH).
В каждой реакции использовали 10 пмоль каждого из праймеров, 5 мл ДНК матрицы, 0,25 мл термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-Pol) (Perkin-Elmmer, США) в буфере, рекомендованном фирмой-производителем (KCl 50 мМ, Трис-HCl 10 мМ, pH 9,0, Тритон X-100 до 0,1% и 1,5 мМ MgCl2) в конечном объеме 25 мкл.
Реакция для GAP-DH была проведена в амплификаторе (Minicycler, MJ Research, U.S) согласно следующей программе: первый цикл 3 мин при 94°C (температура денатурации), 1 мин при 94°C, 1 мин при 58°C (температура отжига) и 1 мин при 72°C (температура элонгации), далее 35 циклов: 1 мин при 94°C, 1 мин при 58°C и 1 мин при 72°C в каждом цикле. В заключении стадия достройки 3 мин при 72°C.
Для цитокинов была использована предыдущая схема, только с изменением температуры отжига. Для IL-10, 54°C и для TNFα 64°C.
Пример 11
Анализ ПЦР-продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле
Продукт ПЦР был проанализирован с помощью электрофореза в агарозном геле. Изображения электрофореза были зафиксированы и проанализированы с помощью Molecular Program Analyst (BioRad). Результаты были представлены как относительные уровни мРНК для каждого цитокина.
Пример 12
Статистический анализ относительных уровней мРНК для каждого цитокина
Чтобы определить различия между профилем цитокинов (в соответствии с относительными уровнями мРНК для каждого) среди групп обработанных животных, были использованы тесты Крускала-Валлиса и Стьюдента-Ньюмана-Кеулса (Statistical package Sigma Stat v 2 1997, GraphPad Software, Inc).
Статистические исследования показали, что на 15 день после индукции болезни пептиды значительно снижают уровни TNFα по сравнению с контрольной группой заболевания.
Эти результаты показаны на фиг.2, где GI соответствует животным, обработанным пептидом F19-6, GII представляет собой группу крыс, подвергнутых обработке пептидом F19-7, GIII представляет группу не подвергнутых обработке больных животных, и GIV включает здоровых животных. Было четко подтверждено, что терапия пептидами вызвала уменьшение относительных уровней указанного цитокина, в наибольшей мере ответственного за стимуляцию воспалительного процесса у животных. Среди групп, обработанных пептидами, и в группе, используемой в качестве положительного контроля болезни, наблюдались статистически существенные различия в случае цитокина TNFα. Не было зафиксировано существенное различие среди различных групп, обработанных пептидами, и группой, взятой в качестве отрицательного контроля болезни. Этот результат показывает, что введение этих двух пептидов вызвало снижение уровней TNFα фактически до нормальных уровней указанного цитокина, как у здоровых животных.
Для того чтобы определить, могут ли пептиды, используемые в этом исследовании, стимулировать выработку противовоспалительных цитокинов, таких как IL-10, были оценены относительные уровни мРНК, соответствующие указанному цитокину.
IL-10 включен в индукцию периферической толерантности через ответ, опосредованный Т-клетками. IL-10 непосредственно регулирует Т-клетки таким образом, чтобы ингибировать выработку IL-2, IL-5 и TNFα.
На фиг.3 показано количественное измерение уровней экспрессии IL-10 в различных группах терапии на 15 день после индукции болезни. На данной фигуре GI соответствует животным, обработанным пептидом F19-6, GII представляет группу крыс, подвергнутых обработке пептидом F19-7, GIII представляет группу не подвергнутых обработке больных животных, и GIV включает здоровых животных.
Обработка животных этими пептидами вызывает прирост относительных уровней экспрессии IL-10. Авторы изобретения не получали статистически существенных различий между группами, подвергнутыми обработке обоими пептидами, но между этими группами и животными, которые составляют положительный и отрицательный контроли, существуют различия. Начиная с этих результатов, можно сделать такой вывод, что воздействие пептидов вызывает изменение в функциональном фенотипе T-клеток, вовлеченных в патогенез заболевания, при этом увеличиваются уровни выработки противовоспалительных цитокинов, как в случае IL-10, и уменьшаются уровни выработки провоспалительных цитокинов, таких как TNFα.
Пример 13
Гисто-патологический анализ
С целью подтверждения клинических признаков, наблюдаемых у животных данной животной модели, и с целью анализа способности обоих пептидов возвращать к прежнему состоянию или уменьшать деструктивный процесс, вызванный Mt, был выполнен патологический анализ суставов животных каждой группы.
Пласты, соответствующие суставам, были проанализированы группой Патологии CIGB.
Суставы были зафиксированы в нейтральном буфере с 10% формалина и декальцинированы. Ткани были обезвожены в градиенте спирта, абсорбированы в парафине и нарезаны на срезы по 5 мкм. Позже образцы установили на стеклянных пластинках, окрасили смесью гематоксилин-эозин и наблюдали в оптическом микроскопе. Результаты гистологического анализа показаны в таблице 3.
Таблица 3 | ||||||||
Результат гистологического анализа суставов животных из групп I-IV | ||||||||
Группы | № животного | День умерщвления | P | EC | IM | НО | G | PMN |
I (F19-6) | 1 | 15 | X | Х | X | |||
2 | x/- | X | ||||||
3 | ||||||||
I (F19-6) | 1 | 21 | x/- | |||||
2 | x/- | X | ||||||
3 | X | Х | x/- | X | ||||
I (F19-6) | 1 | 28 | X | Х | ||||
2 | X | x/- | X | Х | x/- | X | ||
3 | ||||||||
I (F19-6) | 1 | 35 | X | x/- | X | Х | X | X |
2 | X | X | x/- | |||||
3 | X | X | X | Х | X | X | ||
II (F19-7) | 16 | 15 | ||||||
17 | ||||||||
18 | ||||||||
II (F19-7) | 16 | 21 | X | X | x/- | X | ||
17 | X | X | x/- | X | ||||
18 | X | X | x/- | X | ||||
II (F19-7) | 16 | 28 | X | X | X | X | x/- | X |
17 | X | X | X | X | x/- | X | ||
18 | ||||||||
II (F19-7) | 16 | 35 | ||||||
17 | X | X | X | x/- | X | |||
18 | ||||||||
III | 46 | 15 | X | X | X | X | X | |
47 | X | X | X | |||||
48 | X | X | X | X | X | |||
III | 46 | 21 | X | X | X | X | X | |
47 | X | X | X | X | X | |||
48 | X | X | X | X | X | X | ||
III | 46 | 28 | X | X | X | X | X | X |
47 | X | X | X | X | ||||
48 | X | X | X | X | X | X | ||
III | 46 | 35 | X | X | X | X | X | |
47 | X | X | X | X | ||||
48 | X | X | X | X | X |
В таблице 3 P: представляет собой паннус; EC: эрозия хряща; IM: инвазия костного мозга; HO: гиперплазия остеокластов; G: гранулематозная реакция; PMN: полиморфноядерные.
У животных группы III, включая тех, которых умерщвили на 15 день, было очевидным присутствие паннуса, который вызывает эрозию хряща и инвазию костного мозга. Кроме того, наблюдалась типичная гранулематозная реакция при индукции с Mt и частичная гиперплазия остеокластов, которые представляют собой гигантские клетки, оказывающие большое разрушительное действие на костную ткань. Эти гистологические результаты воспроизводят характерные признаки изменений в суставе, происходящих у пациентов с RA, и демонстрируют, что авторы изобретения разработали животную модель, пригодную для оценки фармакологических кандидатов.
Фиг.4A соответствует суставу животного из группы III. Можно наблюдать присутствие паннуса, который захватывает целое внутрисуставное пространство и распространяется к хрящу, в котором наблюдается эрозия, так же, как и инвазия костного мозга. На фиг.4B показано увеличение области, соответствующей костному мозгу, где отчетливо наблюдается паннус в виде грануляционной ткани, богатой клетками фагоцитов.
При терапии пептидом F19-7, вводимым внутрикожным путем (группа II), умерщвленное на 15 день животное, как показано на фиг.5, не демонстрировало гистологические изменения, а показывало только присутствие полиморфноядерных и избыточной рубцовой ткани; в отличие от остальной части животных группы III, которые были охарактеризованы для того, чтобы продемонстрировать тяжелые гистологические признаки.
Как это показано в таблице 3, группы животных, обработанных пептидами F19-6 и F19-7, фактически не показывали гистологических проявлений в течение первого теста. Более высокая защита от развития артрита наблюдалась у животных, прошедших терапию пептидом F19-7. Половина крыс, включенных в эту группу терапии (6 крыс), не показывала никаких гистологических признаков, в соответствии с группой животных, обработанных F19-6, где только две крысы не проявляли гистопатологическое повреждение. В группах, прошедших терапию пептидами F19-6 и F19-7, не наблюдалось присутствие паннуса на дни 15 и 21 после индукции артрита, что указывает на то, что введение этих пептидов вызвало задержку в появлении показателей клеточных осложнений воспалительной реакции во время развития артрита. Было существенно то, что у животных, получавших пептид F19-7 и которых умерщвили на 35 день после индукции артрита, только одна крыса демонстрировала показатели гистологических проявлений развития заболевания. Эти результаты указывают на то, что терапия этим пептидом вызвала у животных, помимо задержки в клиническом проявлении заболевания, фактически полную ремиссию гисто-патологических признаков артрита, показывая терапевтическое превосходство F19-7 APL по сравнению с пептидом, включающим исходный эпитоп F19-6.
Пример 14
Оценка in vitro образца цитокина, индуцированного пептидами F19-6 и F19-7, с использованием мононуклеарных клеток крыс, в которых артрит был вызван коллагеном типа II
В этом тесте использовались больные крысы, у которых артрит был вызван с использованием бычьего коллагена типа II в IFA. Была извлечена селезенка каждой анализируемой крысы и были выделены мононуклеарные клетки.
Мононуклеарные клетки, выделенные из селезенки, культивировали в 1,5 мл RPMI 1640 в 24-луночных планшетах (Costar, USA). Тест был проведен трижды, и в общей сложности 3x106 клеток на лунку культивировали в течение 24 часов с пептидами F19-6 и F19-7 при концентрации 5 мг/мл, при этом инкубацию вели при 37°C, во влажной атмосфере с 5% CO2. Клетки, культивируемые без пептидов, использовались в качестве отрицательного контроля.
Позже была выделена мРНК, и таким же образом, как описано в предыдущих примерах, были проведены реакции обратной транскрипции нуклеиновой кислоты и ПЦР. Анализы продуктов реакции были выполнены с помощью электрофореза в агарозных гелях, как описано в примере 12. Для определения различий в профиле цитокинов, в соответствии с относительными уровнями мРНК в каждой пробе, использовались статистические тесты, как описано в примере 13.
На фиг.6 показаны уровни TNFα в клетках, культивируемых без пептида, и в клетках, соответствующих 21 дню после индукции заболевания, стимулированных in vitro пептидами F19-6 и F19-7. Буква A обозначает уровни TNFα в клетках, культивируемых без пептида, буква B обозначает уровни указанного цитокина, когда клетки стимулируются пептидом F19-6, и буква C соответствует уровням TNFα при стимуляции клеток пептидом F19-7. На данной фигуре CII обозначает группу животных, в которой артрит был вызван коллагеном типа II, а Контроль представляет собой группу здоровых животных.
На фиг.7 показаны уровни IL-10 клеток, культивируемых без пептида и стимулированных in vitro пептидами F19-6 и F19-7, в соответствии с 21 днем после индукции болезни, буква A обозначает уровни IL-10 в клетках, культивируемых без пептида, буква B обозначает уровни указанного цитокина, когда клетки стимулируются пептидом F19-6, и буква C соответствует уровням IL-10 при стимуляции клеток пептидом F19-7. На данной фигуре CII обозначает группу животных, в которой RA был вызван коллагеном типа II, а контроль представляет собой группу здоровых животных.
Как видно на этих двух фигурах, пептиды F19-6 и F19-7 уменьшают уровни TNFα in vitro, но в случае уровней IL-10, только пептид F19-7 увеличивает их значительно.
Эти результаты указывают на то, что пептид F19-7 способен модулировать профиль цитокинов, аналогичный контрольному фенотипу в животной модели, в которой артрит вызван коллагеном. Таким образом, можно подтвердить, что иммуномодулирующее действие указанного пептида, полученного из hHsp60 in vitro, может быть распространено на животные модели артрита, где агент индукции, участвующий в развитии болезни, не является Mt или родственными аутоантигенами.
Такие результаты предполагают, что пептид F19-7 может вызывать толерантность к структурно родственным антигенам, и способен при этом вызывать in vivo активную суппрессию в участке воспаления.
С этими результатами можно предположить, что пептид F19-7 вызывает защиту против артрита, вызванного Mt или коллагеном типа II у животных, который опосредован регуляторными T-клетками, вырабатывающими IL-10. Этот эффект может распространиться на другие аутоантигены, присутствующие в суставах, и которые вносят существенный вклад в иммунопатогенный процесс, который имеет место в процессе RA.
Пример 15
Измерение уровня цитокина, индуцированного пептидами F19-6 и F19-7 у пациентов с RA
Анализ на измерение цитокинов: TNFα, IFNδ и IL-10 был выполнен с использованием крови пациентов с RA. В данном анализе была оценена потенциальная возможность пептидов hHsp60 увеличивать или уменьшать уровни различных цитокинов, вовлеченных в патогенез болезни.
Кровь каждого пациента, начиная с 10 мл, был разбавлена 1/2 PBS 1X, 5 мл от указанного разбавления были добавлены к 3 мл Ficoll-Paque (Amersham) в центрифужных пробирках по 15 мл, которые центрифугировали в течение 30 мин при 1200 об/мин. Было выделено кольцо, соответствующее мононуклеарным клеткам. Затем клетки были дважды промыты 15 мл PBS 1X и после каждой промывки отцентрифугированы при 900 об/мин. Наконец, осадок клеток был ресуспендирован в RPMI 1640, содержащем 10% бычьей эмбриональной сыворотки с добавлением пенициллина (100 Ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), HEPES 25 мМ/л и L-глутамин 2 мМ (все получено от Gibco BRL). Полученные мононуклеарные клетки были высеяны в количестве 106 клеток на лунку в 24-луночные планшеты (Costar) в объеме 800 мкл. Затем были добавлены пептиды hHsp60 в диапазоне концентрации от 0,5 мкг/мл до 100 мкг/мл, с целью определения оптимальной концентрации каждого пептида, чтобы регулировать уровни цитокинов. Фитогемагглютинин (PHA) 1% использовался в качестве положительного контроля клеточной стимуляции, тогда как только RPMI 1640 использовали как контроль роста базальных клеток.
Клетки культивировали в течение 24 часов, затем из каждой лунки отобрали супернатант, разбавили в 1/2 раз, после чего при помощи специальных наборов (Quantikine®, R&D Системы), согласно рекомендациям производителей была определена концентрация цитокина.
Уровни TNFα, модулированные пептидами F19-6 и F19-7 в мононуклеарных клетках пациентов с РА, представлены на фиг.8. На данной фигуре буква А обозначает культивируемые in vitro без пептидов клетки; тогда как B обозначает клетки, in vitro стимулируемые пептидом F19-6, и C обозначает клетки, in vitro стимулируемые пептидом F19-7. На фигуре, когда существует статистически существенное различие между уровнями цитокинов, секретируемых клетками, которые стимулируются пептидами, и уровнями цитокинов в не стимулируемых клетках, то в столбцах для уровней соответствующего цитокина подписывают другую букву.
У пациентов, обозначенных P19 и P21, по сравнению с не стимулируемыми клетками, как это видно на фиг.8, уровни TNFα значительно снижались пептидами F19-6 и F19-7, хотя у пациента P19 снижение уровня указанного цитокина более существенно с пептидом F19-7.
У пациента, обозначенного P13, уровни TNFα были увеличены пептидом F19-6, однако уровни данного цитокина значительно понижаются, когда мононуклеарные клетки указанного пациента стимулируют пептидом F19-7. Эти результаты доказывают, что хотя пептид F19-7 был разработан, чтобы презентироваться MHC крысы, он может понижать уровни указанного цитокина, который является в значительной степени ответственным за показатели воспалительного процесса при RA, таким образом, указанный пептид является потенциальным терапевтическим кандидатом для лечения данной болезни.
Пример 16
Измерение уровня цитокинов, индуцированных пептидами E18-12 и E18-3, у пациентов с РА
Анализы на измерение цитокинов TNFα, IFNδ и IL-10 были выполнены с использованием крови пациентов с RA. В данном анализе была оценена способность пептидов hHsp60 повышать или снижать уровни различных цитокинов, вовлеченных в патогенез заболевания.
У каждого пациента было отобрано 10 мл крови, которая была разбавлена 1 к 2 в PBS 1X. К 5 мл указанного раствора в 15 мл центрифужных пробирках добавили 3 мл Ficoll-Paque (Amershan) и центрифугировали в течение 30 мин при 1200 об/мин. Было выделено кольцо, соответствующее мононуклеарным клеткам. Затем клетки были дважды промыты 15 мл PBS 1X и после каждой промывки отцентрифугированы при 900 об/мин. Наконец, осадок был ресуспендирован в среде RPMI 1640, содержащей 10% бычьей эмбриональной сыворотки, с добавлением пенициллина (100 Ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), HEPES 25 мМ/л и L-глутамина 2 мМ (все получено от Gibco BRL). Полученные мононуклеарные клетки были высеяны в количестве 106 клеток на лунку в 24-луночных планшетах (Costar) в объеме 800 мкл. Впоследствии были добавлены пептиды hHsp60 в диапазоне концентрации от 0,5 мкг/мл до 100 мкг/мл, с целью определения оптимальной концентрации каждого пептида, чтобы модулировать уровни цитокина. Фитогемагглютинин (PHA) 1% использовался в качестве положительного контроля клеточной стимуляции, тогда как только RPMI 1640 использовали как контроль роста базальных клеток.
Клетки культивировали в течение 24 часов, затем из каждой лунки отобрали супернатант, разбавили в 1/2 раз, после чего при помощи специальных наборов (Quantikine®, R&D Системы), согласно рекомендациям производителей, была определена концентрация цитокина.
Уровни TNFα, модулированные пептидами E18-3 и E18-12 в мононуклеарных клетках пациентов с РА, представлены на фиг.9. У пациентов, представленных как P4, P5 и P16, экспрессируются молекулы DR 0306, у пациентов, обозначенных P7, P8 и P12, экспрессируются молекулы DR 0303, тогда как пациент P9 демонстрирует генотип DR0506, а пациент P10 имеет генотип DR 0204. На данной фигуре буква A обозначает клетки, in vitro культивируемые без пептидов; тогда как B соответствует клеткам, in vitro стимулируемым пептидом E18-3, и C обозначает клетки, in vitro стимулируемые пептидом E18-12.
На фигуре, когда существует статистически существенное различие между уровнями цитокинов, секретируемых клетками, которые стимулируются пептидами, и уровнями цитокинов в нестимулируемых клетках, то в столбцах для уровней соответствующего цитокина подписывают другую букву.
Как это видно на фиг.9, индукция синтеза TNFα в мононуклеарных клетках пациентов, стимулируемых пептидами E18-12 и E18-3, зависит от молекул HLA типа II, которые экспрессируются у данных пациентов. У пациентов P4, P5 и P6, которые демонстрируют генотип DR 0306, наблюдался статистически существенный рост концентрации TNFα, по сравнению с клетками, не стимулируемыми пептидами.
Тот же эффект имеет место у пациента Р9 с генотипом DR0506 и у пациента Р10 DR 0204.
У пациентов Р7, P8 и P12, представляющих генотип DR 0303, не наблюдали никакого различия в уровнях TNFα, когда мононуклеарные клетки стимулируются пептидами по изобретению.
Модуляция уровней IL-10 для пептидов E18-3 и E18-12 представлена на фиг.9, на которой буква A обозначает клетки, культивируемые in vitro без пептидов; тогда как B соответствует клеткам, стимулируемым in vitro пептидом E18-3, и C представляет клетки, стимулируемые in vitro пептидом E18-12.
У пациентов Р9, и P10 в случае IL-10, как показано на фиг.10, наблюдается существенное снижение уровня этого цитокина, но у остальной части пациентов не было существенных изменений.
Из этих наблюдений можно сделать вывод, что пептиды E18-12 и E18-3 индуцируют TH1 фенотип в периферических мононуклеарных клетках.
Терапевтическим вариантом исходных пептидов E18-12 или E18-3 может быть их введение оральным путем, и таким образом они будут индуцировать механизмы толерантности, которые вносят значительный вклад в уменьшение воспаления.
Пример 17
Измерение цитокина, индуцированного пептидными производными APL типа у пациентов с RA
Опираясь на предыдущие результаты, авторы решили модифицировать указанные исходные пептиды, соответствующие эпитопам T-клеток, на участках контакта с молекулой HLA, используя методы биоинформатики, таким образом, чтобы модифицированные пептиды APL типа могли изменить профиль цитокинов к регулирующему фенотипу. Кроме того, модификации, сделанные в каждом из этих пептидов, соответствуют участкам связывания пептида, которые подтверждены для большинства молекул HLA, экспрессируемых у пациентов, и которые теоретически являются благоприятными для взаимодействия с различными молекулами HLA.
Анализ на измерение цитокинов TNFα и IL-10 был выполнен с использованием крови пациентов с RA. В данном анализе была оценена способность пептидов APL типа, производных hHsp60, повышать или снижать уровни различных цитокинов, вовлеченных в патогенез заболевания. Кроме того, в этот анализ в качестве контроля эксперимента были включены исходные пептиды (E18-3, E18-12).
APL пептиды, оцененные в этих тестах были следующим:
MGPKGRTVIILQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO:5)
MGPKGRTVIIMQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO:6)
MGPKGRTVIIAQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO:7)
MGPKGRTVIIEQSLGSPKVTK (SEQ. ID. NO:8)
MGPKGRTVIIEQSMGSPKVTK (SEQ. ID. NO:9)
MGPKGRTVIILQSLGSPKVTK (SEQ. ID. NO:10)
MGPKGRTVIILQSMGSPKVTK (SEQ. ID. NO:11)
MGPKLRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO:12)
MGPKLRTVIILQSMGSPKVTK (SEQ. ID. NO:13)
SIDLKDKLKNIGAKLVQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO:14)
SIDLKDKYKNIGAKLSQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO:15)
SIDLKDKLKNIGAKLSQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 16)
SIDLKDKYKNAGAKLVQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO:17)
SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNTNEEA (SEQ. ID. NO:18)
SIDLKDKYKNIGAKLVQAVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 19)
SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNANEEA (SEQ. ID. NO:20)
SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNANEEA (SEQ. ID. NO:21)
У каждого пациента было отобрано 10 мл крови, которая была разбавлена 1 к 2 в PBS 1X. К 5 мл указанного раствора в 15 мл центрифужных пробирках добавили 3 мл Ficoll-Paque (Amershan) и центрифугировали в течение 30 мин при 1200 об/мин. Было выделено кольцо, соответствующее мононуклеарным клеткам. Затем клетки были дважды промыты 15 мл PBS 1X и после каждой промывки отцентрифугированы при 900 об/мин. Наконец, осадок был ресуспендирован в среде RPMI 1640, содержащей 10% бычьей эмбриональной сыворотки, с добавлением пенициллина (100 Ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), HEPES 25 мМ/л и L-глутамина 2 мМ (все получено от Gibco BRL).
Полученные мононуклеарные клетки культивировали в количестве 106 клеток на лунку в 24-луночных планшетах (Costar) в объеме 800 мкл. Клетки стимулировали пептидами [E18-3, E18-12, E18-3APL1 (SEQ. ID. NO:18), E18-3APL2 (SEQ. ID. NO:21), E18-12APL1 (SEQ. ID. NO:5), E18-12APL3 (SEQ. ID. NO:12)] при концентрации 40 мкг/мл, повторяя эксперимент трижды. RPMI 1640 использовался в качестве контроля роста базальных клеток.
Клетки культивировали в течение 24 часов, затем из каждой лунки отобрали супернатант, разбавили в 1/2 раз, после чего при помощи специальных наборов (Quantikine®, R&D Системы), согласно рекомендациям производителей была определена концентрация цитокина.
На фиг.11 показаны уровни IL-10, индуцированного пептидами (E18-12 и E18-3) и набором APL пептидов: E18-3APL1 (SEQ. ID. NO:18); E18-3APL2 (SEQ. ID. NO:21); E18-12APL1 (SEQ. ID. NO:5); E18-12APL3 (SEQ. ID. NO:12). На этой фигуре буквами обозначены статистически существенные различия (авторы изобретения только сравнивают статистические значения между различными пептидами и контрольными клетками у каждого пациента индивидуально). Кроме того, клетки пациентов Р4 и P6 не стимулировались ни пептидом E18-3APL2, ни пептидом E18-12APL3. Очевидно, что у всех пациентов пептид E18-3APL1 очень значительно повышает уровни IL-10 по сравнению с не стимулируемыми клетками. Увеличение, вызванное этим пептидом у некоторых пациентов, таких как P2 и P4, было приблизительно в 9 раз выше, чем количество, выработанное клетками без стимуляции, а у пациентов P1, P3 и P5 приблизительно в 5 раз выше. Кроме того, из-за существенного увеличения уровней IL-10 у пациентов Р1, P4 и P6 подобные результаты были получены и с E18-12APL1. С другой стороны, ни исходные пептиды, ни пептиды E18-3APL2 и E18-12APL3 не вызвали увеличение уровней IL-10 по сравнению с клетками, которые являлись отрицательным контролем.
На фиг.12 показаны уровни TNFα, индуцированного различными пептидами в той же самой группе пациентов. На этой фигуре буквы показывают статистически существенные различия (авторы только сравнивают статистическое значение между различными пептидами и контрольными клетками у каждого пациента индивидуально). Кроме того, клетки пациентов Р4 и P6 не стимулировались ни пептидом E18-3APL2, ни пептидом E18-12APL3. Так как можно оценить это, все пациенты не отвечают с той же самой интенсивностью на стимуляцию различными пептидами, хотя известно, что ответ был совершенно гомогенным. С другой стороны, пептид E18-12APL1 больше всего увеличил продукцию TNFα, особенно у пациентов Р4 и P5, тогда как пациенты P1, P2 и P3 показали небольшое увеличение относительно отрицательного контроля. Кроме того, пептид E18-3APL1 оказывал на большинство пациентов аналогичное действие. В случае с пептидом E18-3APL1 клетки пациентов Р2, P4 и P5 показали значительное повышение уровней TNFα, хотя и менее выраженное. В этом тесте авторы получили результаты, подобные предыдущим анализам с исходными пептидами. Предыдущие результаты показывают, что ни пептид, ни его APL не вызывают уменьшение TNFα, экспрессируемого в мононуклеарных клетках пациентов.
Указанные результаты могли быть противоречивыми, так как те APL, которые увеличивает продукцию IL-10, способствуют повышению уровней TNFα. На фиг.13 показывается отношение уровней IL-10 и TNFα, индуцированных исходными пептидами и их APL-производными. На этой фигуре буквы указывают статистически существенные различия (авторы только сравнивают статистическое значение между различными пептидами и контрольными клетками у каждого пациента индивидуально).
Кроме того, клетки пациентов Р4 и P6 не стимулировали ни пептидами E18-3APL2, ни пептидами E18-12APL3. Очевидно, что повышение уровней IL-10 по сравнению с уровнями TNFα, было значительно более сильным, потому что клетки, стимулируемые E18-3APL1 показали индекс выше, чем 1 у четырех из шести пациентов, что указывает на то, что уровни IL-10 превысили уровни TNFα. Кроме того, у всех пациентов уровни IL-10 были значительно выше в клетках, стимулируемых пептидом E18-3APL1 по сравнению с клетками, которые являлись отрицательным контролем, обнаруживая при этом статистически значимые различия. В случае с E18-12APL1 различия по сравнению с отрицательным контролем не были настолько заметны. Так что, хотя E18-3APL1 и увеличивает уровни TNFα, чистый преобладающий эффект состоит в увеличении уровней IL-10, что объясняется как поляризация ответа в пользу иммуносуппрессивных цитокинов.
Результаты настоящего исследования являются чрезвычайно перспективными, поскольку данные результаты предполагают, что эти два APL-производных могут быть введены пациентам и могут индуцировать субпопуляцию регуляторных T-клеток, секретирующих IL-10, который вызывает активную суппрессию на общем уровне. Другой частный вывод, который авторы изобретения могут сделать посредством анализа этих результатов, состоит в том, что эти APL фактически демонстрируют гомогенное действие на всех изученных пациентов, независимо от генотипа, который они имеют. Эти результаты чрезвычайно обнадеживающие, поскольку они предполагают, что введение данных APL-производных оказывало бы тот же самый эффект на всех пациентов, несмотря на существующие различия относительно молекул HLA типа II, которые они имеют.
Полученные экспериментальные данные подтверждают, что основное преимущество настоящего изобретения состоит в использовании фармацевтических композиций, включающих иммуномодулирующие пептиды белка стресса человека, Hsp60, которые соответствуют эпитопам T-клеток, или варианты этих пептидов APL-типа, которые могут эффективно использоваться в терапии пациентов с RA, вызывая специфический иммунный ответ, направленный на выключение клонов аутореактивных T-клеток, включенных в иммунопатогенные механизмы этого заболевания. Метод лечения, который предложен авторами в настоящем изобретении, является приемлемым и может быть распространен на большое количество пациентов, а также может использоваться в комбинации с современными методами терапии этого заболевания.
Пример 18
Оценка терапевтического эффекта пептидных производных APL-типа в животной модели, в которой артрит вызван Mt
Животные были разделены на двенадцать групп по восемь крыс в каждой. Болезнь была вызвана в одиннадцати группах животных (группы I-XI), из которых десять групп обработали пептидами, а одну оставили в качестве контроля индукции заболевания. Группы животных, которые обработали пептидами, получили 50 мкг пептида в объеме 100 мкл PBS на крысу, в дни 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 после индукции болезни при помощи Mt. Животные, разделенные на двенадцать групп, обрабатывали следующим способом:
Группа I: получала пептид E18-12 (SEQ. ID. NO:1)
Группа II: получала пептид соответствующий SEQ. ID. NO:5
Группа III: получала пептид, соответствующий SEQ. ID. NO:8
Группа IV: получала пептид, соответствующий SEQ. ID. NO:12
Группа V: получала пептид, соответствующий SEQ. ID. NO:13
Группа VI: получала пептид E18-3 (SEQ. ID. NO:2)
Группа VII: получала пептид, соответствующий SEQ. ID. NO:14
Группа VIII: получала пептид, соответствующий SEQ. ID. NO:15
Группа IX: получала пептид, соответствующий SEQ. ID. NO:16
Группа X: получала пептид, соответствующий SEQ. ID. NO:17
Группа XI: не получала пептид (контроль индукции заболевания)
Группа XII: заболевание не индуцировали и не вводили пептид (отрицательный контроль).
В дни 21 и 35 после индукции несколько животных из каждой группы умерщвили, была извлечена селезенка, и был взят образец суставов для гистопатологического анализа.
В группах животных, прошедших терапию пептидами APL-типа, по сравнению с не обработанной группой животных и с группами, обработанными пептидами E18-12 и E18-3, клиническое улучшение было значительным. Эти результаты, демонстрирующие во всех случаях превосходство пептидных производных APL-типа над исходными пептидами, были подтверждены гистопатологическим анализом и измерением уровня цитокинов.
На фиг.14 показан график развития болезни в четырех группах животных, относящихся к данной животной модели. В этом случае группы представляют собой: группа I (животным вводили E18-12), группа II (животным вводили E18-12APL1 SEQ. ID. NO: 5), группа XI (контроль индукции болезни) и группа XII (здоровые животные). На этом графике различные буквы обозначают существенные различия (р<0,001) (его сравнивают со статистически существенным различием между всеми группами в определенные дни измерений).
На данном графике можно увидеть, что с 12 дня после индукции болезни животные групп I, II и XI начали показывать характерные клинические признаки RA. Многие животные также демонстрировали внесуставные проявления, такие как узелки на ушах, хвосте и на конечностях. Самые серьезные проявления RA наблюдали приблизительно на 20-й день в трех группах больных животных. В случае животных, которым ввели E18-12, на 21-й день не могли выявить существенные различия по сравнению с контрольной группой индукции болезни. Однако примерно на 35-й день после индукции болезни клинические признаки у животных этой группы были значительно более легкими по сравнению с клиническими признаками в группе XI (р<0,001). Эти результаты подтверждают, что защитный эффект пептида E18-12 проявляется, приблизительно, на 35-й день. В этом смысле можно рекомендовать вводить этот пептид в более ранних фазах болезни, чтобы получить лучшие результаты на 21-й день. Однако в случае животных группы II клинические признаки воспаления были очевидно более слабыми по сравнению с группами I и XI (p<0,001), что указывает на то, что этот пептид проявляет мощный защитный эффект у животных, у которых была вызвана болезнь.
Claims (9)
1. Пептиды белка теплового шока человека 60 кДа, представляющие собой эпитопы для Т-клеток, предназначенные для индукции механизмов периферической толерантности, в частности индукторы механизмов анергии, или механизмов, опосредованных клонами регуляторных Т-клеток у пациентов с ревматоидным артритом, характеризующиеся последовательностями:
Е18-12 MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO:1)
E18-3 SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG (SEQ. ID. NO:2)
F19-6 IIDPTKVVRTALLDAA (SEQ. ID. NO:3).
Е18-12 MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO:1)
E18-3 SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG (SEQ. ID. NO:2)
F19-6 IIDPTKVVRTALLDAA (SEQ. ID. NO:3).
2. Пептиды APL-типа, представляющие собой производные пептида Е18-12 (SEQ. ID. NO:1), модифицированные по участкам контакта с молекулами МНС человека, с аминокислотной последовательностью:
где замену аминокислоты выбирают из:
в положении 1 аминокислота замещена на L;
в положении 4 на A, L, M;
в положении 6 на L, M.
где замену аминокислоты выбирают из:
в положении 1 аминокислота замещена на L;
в положении 4 на A, L, M;
в положении 6 на L, M.
3. Пептидные производные APL-типа по п.2, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ. ID. NO:5, SEQ. ID. NO:6, SEQ. ID. NO:7, SEQ. ID. NO:8, SEQ. ID. NO:9, SEQ. ID. NO:10, SEQ. ID. NO:11, SEQ. ID. NO:12 и SEQ. ID. NO:13.
4. Пептиды APL-типа, представляющие собой производные пептида Е18-3 (SEQ. ID. NO:2), модифицированные по участкам контакта с молекулами МНС человека, с аминокислотной последовательностью:
где замену аминокислоты выбирают из:
в положении 1 аминокислота замещена на L,
в положении 2 на A;
в положении 5 на S;
в положении 6 на A, L;
в положении 8 на A.
где замену аминокислоты выбирают из:
в положении 1 аминокислота замещена на L,
в положении 2 на A;
в положении 5 на S;
в положении 6 на A, L;
в положении 8 на A.
5. Пептидные производные APL-типа по п.4, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ. ID. NO:14, SEQ. ID. NO:15, SEQ. ID. NO:16, SEQ. ID. NO:17, SEQ. ID. NO:18, SEQ. ID. NO:19, SEQ. ID. NO:20 и SEQ. ID. NO:21.
6. Пептид, представляющий собой производное APL-типа пептида F19-6 (SEQ. ID. NO:3), модифицированный по участкам контакта с молекулами МНС крысы, с аминокислотной последовательностью:
где аминокислота в положении 1 замещена на H,
в положении 2 замещена на E,
и соответствует пептиду F19-7: (SEQ. ID. NO:4).
где аминокислота в положении 1 замещена на H,
в положении 2 замещена на E,
и соответствует пептиду F19-7: (SEQ. ID. NO:4).
7. Фармацевтическая композиция, обладающая иммуномодулирующей активностью, включающая один или несколько пептидов по пп.1-6 и фармацевтически приемлемый носитель.
8. Фармацевтическая композиция по п.7 для лечения ревматоидного артрита.
9. Способ лечения пациентов, страдающих ревматоидным артритом, включающий введение эффективных доз пептидов по любому из пп.1-6 или фармацевтической композиции по п.7.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CU20040207A CU23504A1 (es) | 2004-09-24 | 2004-09-24 | Péptidos y derivados tipo apl de la hsp60 y composiciones farmacéuticas |
CU2004-0207 | 2004-09-24 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2007115411A RU2007115411A (ru) | 2008-10-27 |
RU2361877C2 true RU2361877C2 (ru) | 2009-07-20 |
Family
ID=40273413
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007115411/04A RU2361877C2 (ru) | 2004-09-24 | 2005-09-22 | Пептиды hsp60 и их apl-производные и фармацевтические композиции |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8383771B2 (ru) |
EP (2) | EP1803732B1 (ru) |
JP (1) | JP4755649B2 (ru) |
KR (2) | KR101035283B1 (ru) |
CN (2) | CN101935345B (ru) |
AR (2) | AR051928A1 (ru) |
AT (1) | ATE546462T1 (ru) |
AU (2) | AU2005287757B2 (ru) |
BR (2) | BR122018077204B8 (ru) |
CA (2) | CA2797769C (ru) |
CU (1) | CU23504A1 (ru) |
DK (2) | DK1803732T3 (ru) |
ES (2) | ES2445707T3 (ru) |
MX (1) | MX2007003624A (ru) |
RU (1) | RU2361877C2 (ru) |
WO (1) | WO2006032216A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200702938B (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2596925C2 (ru) * | 2009-09-06 | 2016-09-10 | Протаб Лтд. | Гуманизированные антитела, специфические для пептида-6, полученного из hsp65, способы их использования |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2423220B1 (en) * | 2007-01-30 | 2015-04-29 | Epivax, Inc. | Regulatory t cell epitopes, compositions and uses thereof |
CU23701A1 (es) * | 2008-12-29 | 2011-09-21 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Método de tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales y diabetes tipo i |
WO2011059758A2 (en) * | 2009-10-28 | 2011-05-19 | Argentis Pharmaceuticals, Llc | Apls for treating arthritis |
CU24508B1 (es) * | 2017-12-29 | 2021-04-07 | Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia Biocubafarma | Composición farmacéutica que comprende péptido tipo apl |
CU20200026A7 (es) * | 2020-04-13 | 2021-11-04 | Ct Ingenieria Genetica Biotecnologia | Péptido para el tratamiento del síndrome de la tormenta de citocinas |
CN111870697B (zh) * | 2020-09-18 | 2022-09-09 | 山东鲁抗医药股份有限公司 | 糖类物质在提高apl型衍生肽稳定性中的应用和冻干组合物 |
KR102333645B1 (ko) | 2021-07-27 | 2021-12-02 | (주)문화전기 | 각도조절이 용이한 엘이디조명시스템 |
CN115671253B (zh) * | 2021-07-30 | 2024-02-27 | 河北菲尼斯生物技术有限公司 | Se-dr亲和肽在制备治疗风湿疾病的药物中的用途 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL8701163A (nl) | 1986-09-09 | 1988-04-05 | Nederlanden Staat | Gebruik van een peptide voor de bereiding van preparaten voor het verlichten, het behandelen en de diagnose van autoimmuunziekten, in het bijzonder arthritische toestanden, verbindingen die met dit peptide verwant zijn, alsmede farmaceutische en diagnostische preparaten en testkits. |
NL8703107A (nl) | 1987-12-22 | 1989-07-17 | Nederlanden Staat | Polypeptiden en derivaten daarvan, alsmede de toepassing daarvan in farmaceutische en diagnostische preparaten. |
US5773570A (en) | 1994-05-20 | 1998-06-30 | The Regents Of The University Of California | Vaccine compositions and methods useful in inducing immune protection against arthritogenic peptides involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis |
GB9419553D0 (en) | 1994-09-27 | 1994-11-16 | Univ Bristol | Polypeptides and their use in the treatment of auto-immune disease |
US6180103B1 (en) | 1994-12-21 | 2001-01-30 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Peptide p277 analogs, and pharmaceutical compositions comprising them for treatment or diagnosis of diabetes |
GB9519737D0 (en) * | 1995-09-27 | 1995-11-29 | Peptide Therapeutics Ltd | Polypeptides and their use in treatment and prophylaxis of auto-immune |
US5993803A (en) | 1996-08-30 | 1999-11-30 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Method of reducing the severity of host vs graft reaction by down-regulating hsp60 autoimmunity |
GB9911772D0 (en) | 1999-05-21 | 1999-07-21 | Semmelweis University Of Medic | Diagnosis and treatment of atherosclerosis |
US20020169302A1 (en) * | 1999-08-23 | 2002-11-14 | Genesis Research And Development Corp. Ltd. | Compositions isolated from bovine mammary gland and methods for their use |
CA2394504A1 (en) * | 1999-12-15 | 2001-06-21 | Peptor Ltd. | Fragments and antagonists of heat shock protein 60 |
JP2005503533A (ja) | 2001-01-19 | 2005-02-03 | ケンブリッジ サイエンティフィック, インコーポレイテッド | 骨粗鬆症の診断方法および処置方法 |
-
2004
- 2004-09-24 CU CU20040207A patent/CU23504A1/es active IP Right Grant
-
2005
- 2005-09-21 AR ARP050103950A patent/AR051928A1/es active IP Right Grant
- 2005-09-22 CA CA2797769A patent/CA2797769C/en active Active
- 2005-09-22 AU AU2005287757A patent/AU2005287757B2/en not_active Ceased
- 2005-09-22 CN CN2010100038161A patent/CN101935345B/zh active Active
- 2005-09-22 KR KR1020107001135A patent/KR101035283B1/ko active IP Right Grant
- 2005-09-22 EP EP05794474A patent/EP1803732B1/en active Active
- 2005-09-22 DK DK05794474.6T patent/DK1803732T3/da active
- 2005-09-22 MX MX2007003624A patent/MX2007003624A/es active IP Right Grant
- 2005-09-22 ES ES10189769.2T patent/ES2445707T3/es active Active
- 2005-09-22 WO PCT/CU2005/000008 patent/WO2006032216A2/es active Application Filing
- 2005-09-22 RU RU2007115411/04A patent/RU2361877C2/ru active
- 2005-09-22 CN CN2005800403891A patent/CN101065398B/zh active Active
- 2005-09-22 DK DK10189769.2T patent/DK2371847T3/da active
- 2005-09-22 BR BR122018077204A patent/BR122018077204B8/pt active IP Right Grant
- 2005-09-22 CA CA2581110A patent/CA2581110C/en active Active
- 2005-09-22 EP EP10189769.2A patent/EP2371847B1/en active Active
- 2005-09-22 ES ES05794474T patent/ES2386498T3/es active Active
- 2005-09-22 AT AT05794474T patent/ATE546462T1/de active
- 2005-09-22 US US11/663,603 patent/US8383771B2/en active Active
- 2005-09-22 JP JP2007532752A patent/JP4755649B2/ja active Active
- 2005-09-22 BR BRPI0515893A patent/BRPI0515893B8/pt active IP Right Grant
- 2005-09-22 KR KR1020077008682A patent/KR101054332B1/ko active IP Right Grant
-
2007
- 2007-04-10 ZA ZA200702938A patent/ZA200702938B/xx unknown
-
2009
- 2009-12-28 AR ARP090105137A patent/AR074924A2/es active IP Right Grant
- 2009-12-30 US US12/649,687 patent/US8324164B2/en active Active
-
2010
- 2010-09-06 AU AU2010219312A patent/AU2010219312B2/en not_active Ceased
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
RAMMENSEE HANS-GEORG; ET AL "SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs", MMUNOGENETICS, 1999, v.50, №3-4, p.213 -219. SINGH H; RAGHAVA G P S "ProPred: prediction of HLA-DR binding sites", BIOINFORMATICS, 2001, v.17, №12, p. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2596925C2 (ru) * | 2009-09-06 | 2016-09-10 | Протаб Лтд. | Гуманизированные антитела, специфические для пептида-6, полученного из hsp65, способы их использования |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2361877C2 (ru) | Пептиды hsp60 и их apl-производные и фармацевтические композиции | |
US8343500B2 (en) | Peptide composition | |
JP2021107443A (ja) | 調節性t細胞エピトープ、組成物およびその使用 | |
US20040091945A1 (en) | Peptides and methods of screening immunogenic peptide vaccines against Alzheimer's Disease | |
CZ122697A3 (en) | Preparations and methods of treating disseminated sclerosis | |
JPH09502346A (ja) | 自己免疫疾患に関連するプロトコールにおけるミエリン希突起神経膠細胞糖蛋白質およびそのペプチド部分の使用 | |
JP2004501061A (ja) | 熱ショックタンパク質60のフラグメントおよびアンタゴニスト | |
EP2026830B1 (fr) | Peptides modulateurs de l'activation des macrophages, utilisables pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde | |
US20060199228A1 (en) | Peptides for treatment of autoimmune diseases | |
JP2006508901A (ja) | T細胞非結合性ペプチド及びその用途 | |
Kela-Madar et al. | Autoimmune spread to myelin is associated with experimental autoimmune encephalomyelitis induced by a neuronal protein, β-Synuclein | |
CN117986351A (zh) | 一种ra自身抗原表位多肽及其制备的抗原特异性t细胞疫苗、制备方法和应用 | |
Miletić et al. | Humoral and cell-mediated immunity to mycobacterial proteins in AO and DA rats |