BRPI0515893B1 - Peptídeos da proteína humana de estresse térmico, composição farmacêutica, e, uso do peptídeo e da composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

peptídeos da proteína humana de estresse térmico, composição farmacêutica e método de tratamento da artrite reumatóide. peptídeos da proteína humana de estresse térmico de 60 kda que constituem epítopos para células t, assim como peptídeos derivados deles, os quais estão modificados nos sítios de contato com a molécula mhc, úteis para induzir mecanismos de tolerância periférica, em particular mecanismos indutores de anergia ou mediados por clones de células t regulatórias em pacientes com artrite reumatóide. a invenção também se refere a composições farmacêuticas que compreendem tais peptídeos para tratamento da artrite reumatóide.

Description

Campo da técnica

[001] A presente invenção se relaciona com peptídeos da proteína de estresse térmico humana de 60 kDa (em inglês 60 kDa heat shock protein, abreviado HspóOh) e derivados destes do tipo de peptídeo ligando alterado (em inglês Altered Peptide Ligands, abreviado APL). Ademais, a invenção se relaciona com as composições farmacêuticas que compreendem tais peptídeos para o tratamento da artrite reumatóide (AR). Estado da técnica Anterior

[002] A AR é uma doença autoimune de etiologia desconhecida que afeta aproximadamente 1% da população mundial. Ela é uma síndrome caracterizada por uma inflamação crônica das articulações, ainda que se possam observar manifestações sistêmicas. Esta doença começa com a inflamação da membrana sinovial e com frequência leva à destruição erosiva da cartilagem adjacente e o osso, resultando na incapacidade física moderada do 80% dos pacientes e uma mortalidade prematura (Moctezuma, J. F. (2002) Manifestaciones articulares de la artritis reumatóide. Revista Mexicana de Reumatologia17:211- 219). Ela pode se apresentar em a qualquer idade, sem distinções de raças ou grupos étnicos, porém a incidência máxima de seu inicio ocorre entre os 25 e 55 anos de idade. Entre as pessoas com AR, as mulheres superam os homens em uma proporção de três a um (Emery, P. (2002) Early referral recommendation for newly diagnosed rheumatoid arthritis: evidence based development of a clinical guide. Ann Rheum Dis. 61:290-297).

[003] A causa da AR é desconhecida. Sabe-se que é uma doença de etiologia multifatorial, que envolve a presença de fatores genéticos, ambientais, imunológicos e hormonais. Existem certos genes, que têm um papel no sistema imune, associados com uma tendência a desenvolver a AR. Ao mesmo tempo, algumas pessoas com AR não têm estes genes e outras pessoas os têm e nunca desenvolvem a doença. Isto sugeriu que o fundo genético de cada pessoa é importante porém não é determinante. Nos modelos de patogênese de doenças autoimunes, os antígenos microbianos com estrutura similar a antígenos próprios podem desencadear uma resposta cruzada com os antígenos tissulares próprios produzindo uma alteração nos mecanismos de tolerância e perpetuando uma resposta autoimune. Em sentido general, o dano e a necrose local em um tecido produzida por um agente infeccioso poderiam descobrir os epítopos críticos de autoantígenos, podendo ativar células T auto-reativas (Albert, LJ. (1999) Mechanisms of Disease: Molecular Mimicry and autoimmunity. N Engl J Med 341:2068-2074)

[004] O estado de transição dos linfócitos entre tolerância e imunidade/autoimunidade é regulado a diferentes níveis. Dois parâmetros importantes nesta transição são o estado de maturação das células apresentadoras de antígenos (em inglês Antigen Presenting Cells, abreviado APC) e os níveis de antígenos próprios que são detectados pelo sistema imune (Ohashi, P. S. (2002) Making e breaking tolerance. Current Opinion in Immunology 14:744-759).

[005] Uma das hipóteses atuais que tratam de explicar o desenvolvimento das doenças autoimunes, estabelece que as APC em ausência de sinais do sistema imune inato ou de sinais de perigo, permanecem relativamente imaturas e induzem tolerância nas células T auto-reativas ao apresentar-lhe peptídeos próprios (Steiman, R.M. (2000) The induction of tolerance by dendritic cells that have captured apoptotic cells. J Exp Med. 191:411-416). A indução de tolerância periférica é também dependente da concentração de antígeno próprio (Kurts, C. (1999) CD8 T cell ignorance or tolerance to islet antigens depends on antigen dose. PNAS 96:12703-12707). Um incremento na apresentação de antígenos próprios devido a aumentos em seus níveis de expressão, permite que as células T auto-reativas ignorantes o detectem. Se se incrementam os níveis de antígenos próprios em ausência de eventos que promovam a maturação de APC, a tolerância a estes antígenos é mantida, se pelo contrário ocorre em presença de sinais proinflamatórios ou outros eventos que promovam a maturação das APC, rompe-se a tolerância por ativação das células T ignorantes e se desenvolvem doenças autoimunes (Janeway, CA. (2002) Innate immune recognition. Annu Rev Immunol. 20:197-216).

[006] Entre os agentes infecciosos que foram objeto de maior estudo como causa de AR tem-se o vírus de Epstein Bar, os retrovirus, o vírus causador da hepatite C, o Mycobacterium tuberculosis (abreviado Mt) e o Helicobacter pylori, entre outros. A patogênese da AR se caracteriza pela ação concertada de diferentes tipos de células que desencadeiam a destruição progressiva da cartilagem e do osso. Em situações normais existe um equilíbrio entre as citocinas inflamatórias como: o TNFa, IL-1 , IL-6, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 e o IFNy, e as antiinflamatórias como IL-4, IL-11, IL-13 e antagonistas de IL-1 ou TNFa. Em a AR sem embargo este equilíbrio se move a favor das citocinas inflamatórias (Arend, WP. (2001) Cytokine imbalance in the pathogenesis of rheumatoid arthritis: The role of interleukin- 1 receptor antagonist. Semin Arthritis Rheum 30(2): 1 -6)

[007] Provavelmente o reconhecimento de um antígeno exógeno ou autoantígeno seja o detonador de uma série de eventos que culminam com a destruição articular em pacientes com AR. Este fenômeno desencadeia a ativação dos linfócitos T CDU o que conjuntamente com a estimulação de diferentes citocinas, induz a sua diferenciação a células Thl com a consequente liberação de citocinas proinflamatórias (IL-2 e INFy) (Simón, AJ. (2001) Terapia biológica en artritis reumatóide. Revista de Investigation Clinica 53(5):452-459). Muitos investigadores coincidem que a inflamação crônica das articulações é induzida por estas células T ativadas que infiltram a membrana sinovial. A ação destas citocinas sobre os macrófagos provoca a produção de quantidades elevadas de TNFa e de IE-1. Estes por sua vez exercem uma série de ações no âmbito local e sistêmico tais como regular a expressão das moléculas de adesão nas células endoteliais (LFA1 , ICAM-1), as quais favorecem o recrutamento de outras células ao sítio da inflamação. Ademais, eles estimulam os macrófagos, fibroblastos, condrócitos e osteoclastos à liberação de outros mediadores da inflamação, como a IL-15 e a IL-8. O TNFα e a IE-1 estimulam a proliferação da membrana sinovial que leva à formação do pano e podem induzir a diferenciação de linfócitos B a células produtoras de anticorpos, que potencialmente também participam na destruição articular. Ademais, eles inibem a produção de citocinas antiinflamatórias (IE-4 e IE-14) produzidas pelas células Th2 e estimulam aos hepatócitos para liberar IE-6. A IE-6 a sua vez favorece a produção das proteínas da fase aguda, as quais participam potenciando a resposta imune (Forre, O. (2000) New posibilities of treatment in AR. Scand J Rheumatol 29(2)73-84).

[008] Dentro dos autoantígenos envolvidos na patogênese da AR se encontra a Hsp60,proteína que pertence à família das Hsp, as quais são proteínas altamente imunogênicas com um excepcional grau de conservação evolutiva. A resposta imune contra as Hsp estranhas é um mecanismo de defesa importante contra as infecções bacterianas. Os anticorpos contra estas proteínas podem ser abundantes em indivíduos normais e em pacientes com doenças autoimunes e podem reagir em forma cruzada com os antígenos próprios (Chen, W. (1999) Human 60-kDa Heat-Shock Protein: A Danger Signal to the Innate Immune System. J Immunol. 162:3212-3219).

[009] A Hsp65 de Mt é homologa à HspóO dos mamíferos. Sugere-se que a HspóO possa ser reconhecida como autoantígeno em pacientes com AR. Comparando pacientes com osteoartrite e pacientes com AR, estes últimos têm um aumento da resposta proliferativa de linfócitos B no líquido sinovial à Hsp65 micobacteriana. A intensidade da resposta se correlaciona com a inflamação sinovial. Esta resposta no é específica para AR comparada com outras doenças inflamatórias (Life, P. (1993) Responses to Gram negative enteric bacterial antigens by synovial T cells from patients with juvenile chronic arthritis: recognition of heat shock protein hspóO. J Rheumatol. 20: 1388-1396).

[0010] Um sinal possível de perigo para o sistema imune é constituído pelas Hsp, que são liberadas das células que morrem, e que podem induzir uma resposta inflamatória e iniciar a maturação das APC. Ao ser proteínas intracelulares, não são altamente expressadas na membrana celular, nem são secretadas, pelo que são candidatos atrativos para moléculas que constituem sinais de perigo (Van den Berg, WB. (1998): Joint inflammation and cartilage destruction may occur uncoupled. Springer Semin Immunopathol. 20:149- 164).

[0011] Várias preparações foram propostas utilizando a HspóO ou peptídeos derivados delas para o tratamento de algumas patologias autoimunes. Por exemplo na patente EPO262710 propõe-se o uso de vários peptídeos da HspóO de Mf para o tratamento e diagnóstico de doenças autoimunes, especialmente de condições artríticas. Esta invenção está baseada no fato de que infecções prévias com varias bactérias podem iniciar o desenvolvimento de doenças autoimunes, em pessoas geneticamente suscetíveis, por exemplo: pacientes com AR podem mostrar uma alta reatividade com antígenos microbianos.

[0012] Estes mesmos inventores na patente EPO322990 propõem o uso de outros peptídeos também da Hsp60 de Mt com o mesmo propósito da patente anterior.

[0013] No pedido de patente W09610039 propõe-se o uso de um peptídeo da Hsp60 de Mt para o diagnóstico e tratamento da artrite autoimune.

[0014] No pedido de patente WO9711966, propõe-se o uso de peptídeos de regiões não conservadas da Hsp60 humana, que não coincidam com as Hsp60 de bactérias, que puderam induzir tolerância nas células T de pacientes com AR.

[0015] O pedido de patente WO0143691 propõe o uso de preparações farmacêuticas compostas por peptídeos da HspóOh e variantes destes na prevenção de doenças inflamatórias especificamente para diversas doenças autoimunes entre elas a AR.

[0016] Na patente US6180103 propõe-se o uso de um peptídeo da Hsp60 numerado p277 e análogos deste para o diagnóstico e prevenção da diabetes tipo I.

[0017] A patente US5993803 protege o uso da proteína Hsp60, o peptídeo p277 e um grupo de peptídeos derivados de dita proteína para reduzir a severidade da resposta imune durante o transplante de órgãos. Recentemente foi considerado que a aterosclerose apresenta uma série de características similares aos processos autoimunes.

[0018] No pedido de patente W00072023 requer-se um método para o tratamento e diagnóstico da aterosclerose e doenças coronarianas empregando uma preparação que contém a proteína Hsp60.

[0019] No pedido de patente WO02057795 protege-se um novo método para o diagnóstico e tratamento da osteoporose usando proteínas da família de Hsp e proteínas de patógenos como: vírus e bactérias.

[0020] Na atualidade não existe cura para a AR. Os métodos atuais de tratamento são centrados em aliviar a dor, reduzir a inflamação, atrasar os danos nas articulações e melhorar as funções e o bem estar dos pacientes.

[0021] Recentemente foram elaborados medicamentos imunomoduladores que bloqueiam citocinas que participam no inicio e na manutenção da resposta inflamatória em AR, com o propósito de que sua utilização detenha ou retarde a progressão da doença. Para este tipo de terapia dispõe-se de 2 tipos de medicamentos: os que inibem ou bloqueiam a ação do Fator de Necrose Tumoral-a (em inglês Tumor Necrosis Factor, abreviado TNFα) e os que inibem ou bloqueiam a ação da interleucina 1 (IL-1).

[0022] Se bem que os resultados sejam promissores com a terapia anti-TNFa e anti-IL-1, a porcentagem de infecções é alta. Muitos dos pacientes tratados com estes fármacos desenvolvem ao menos um quadro infeccioso grave, que em alguns casos é fatal e que pode incluir outras doenças autoimunes, neoplasias, etc. Além disso, eles são medicamentos muito caros (Breshinan, B. (1998) Treatment of rheumatoid artritis with recombinant human anti-interleukin-1 antagonist. Arthritis Reum. 41:2196- 2204).

[0023] A tolerização oral foi proposta como método de criar tolerância periférica frente a certos antígenos. Esta pode ser induzida por mecanismos de supressão ativa ou por anergia ou deleção clonal, dependendo das doses e a frequência da administração do antígeno. O método pode induzir células T reguladoras que são ativadas de forma específica com o antígeno, mas que exercem sua ação independentemente (supressão ativa). Para que se produza a ação reguladora, não é necessário administrar o antígeno supostamente patogênico, mas sim outro qualquer capaz de induzir a supressão ativa no foco inflamatório, inibindo a atividade das células efetoras patogênicas. O colágeno tipo II (abreviado CII) é o autoantígeno que mais foi empregado neste sentido. Os resultados dos estudos realizados em pacientes com AR, utilizando CII de frango e colágeno de tipo bovino deram resultados contraditórios (Trentham, D.E. (1993) Effects of oral administration of type 11 collagen in rheumatoid arthritis. Science 261:1727-1730; Sieper, J. (1996) Oral type II collagen treatment ;n early rheumatoid arthritis: a double-blind, placebo-controlled, randomize trial. Arthritis Rheum. 39:41-51).

[0024] Na patente US6153200 propõe-se o uso de um peptídeo da Hsp70, proteína pertencente à família de Hsp, para induzir tolerância por via oral em pacientes com AR.

[0025] Outra variante que foi sugerida para induzir tolerância é através dos peptídeos APL, baseado no fato de que as células T são ativadas se os linfócitos T CD4+ específicos de um determinado antígeno peptídico reconhecem o antígeno apresentado por APC competentes. No obstante, se as mesmas células T se encontram primeiro com uma forma diferente do antígeno em que os resíduos que contatam com o receptor de células T (em inglês T cell receptor, abreviado TcR) estão ligeiramente alterados, pode resultar em uma ativação parcial ou inclusive inativação das células T. Estes antígenos são os denominados APLs. Os APLs são análogos de peptídeos imunogênicos com uma ou varias substituições nas posições essenciais de contato com o TcR ou com o complexo maior de incompatibilidade (em inglês Major Histocompatibility Complex, abreviado MHC), que interferem com ou modificam a cascata de eventos necessários para a completa ativação das células T.

[0026] Conceitualmente pode-se projetar -se APLs com propriedades similares ao peptídeo imunogênico (agonistas) entre cujos efeitos se encontra incrementar a resposta de células T para antígenos específicos. Este efeito é vantajoso em condições patológicas como doenças neoplásicas e infecciosas. Também pode-se projetar peptídeos com propriedades antagônicas ao peptídeo imunogênico que poderiam resultar benéficos no controle de doenças autoimunes já que podem bloquear a resposta de células T atuando como antagonistas do TcR (M De Magistris (1992) Antigen analog-major complex histocompatibility complexes act as antagonist of the T cell receptor. Cell 68:625- 634), agonistas parciais ou induzindo uma população de células T reguladoras que mediam a supressão ativa (Evavold, B. D. (1991) Separation of IL-4 production from Th cell proliferation by an altered T cell ligand. Science 252:1308-1310).

[0027] A capacidade de manipular experimentalmente as propriedades intrínsecas de ligandos peptídicos conhecidos permite alterar apropriadamente a natureza, o curso e a potência da resposta celular imune.

[0028] Até o momento foram desenvolvidos para o tratamento de doenças autoimunes dois ensaios clínicos em humanos empregando peptídeos do tipo APL. Em ambos ensaios empregaram-se peptídeos APL derivados do epítopo que abarca os aminoácidos do 83 ao 93 da MBP (do inglês myelin basic protein, abreviado MPB). Um destes ensaios incluía 142 pacientes com esclerose múltipla, e foi suspenso porque 9% dos pacientes desenvolveram hipersensibilidade (Ludwig Kapposi (2000) Induction of a non- encephalitogenic type 2 T helper-cell autoimmune response in multiple sclerosis after administration of an altered peptide ligand in a placebocontrolled, randomized phase II trial. Nature Medicine 10:1176-1182).

[0029] O outro ensaio incluía 25 pacientes e foi detido antes do tempo, porque em três pacientes observou-se uma exacerbação da doença (Bibiana Bielekova (2000) Encephalitogenic potential of the myelin basic protein peptide (amino acids 83-99) in multiple sclerosis: Results of a phase II clinical trial with an altered peptide ligand. Nature Medicine 6:1167-1175). A autora principal deste trabalho faz uma análise dos possíveis fatores que determinaram estes resultados negativos, e requer que as trocas realizadas nos sítios APL podem originar novos motivos de união ao HLA (como ocorreu no caso do APL unido ao alelo DRB 1*0404 presente no paciente I), além disso o complexo APL-HLA pode estimular células T não deletadas na seleção negativa que podem ser cross-ativadas pelo autoantígeno nativo. Neste ensaio usou-se concentrações altas do APL nas preparações farmacêuticas, as quais podem estimular células T com alta afinidade pelo autoautoantígeno e induzir uma resposta de células T heteroclítica. (Bibiana Bielekova e Roland Martin (2001) Antigen-specific immunomodulation via altered peptide ligand. J Mol Med. 79:552-556).

[0030] Para a realização destes dois ensaios clínicos, os autores não analisaram previamente a resposta in vitro da células T dos pacientes frente aos APL, tampouco tiveram em conta os tipos de moléculas HLA que expressam os pacientes tratados.

[0031] O desafio principal no tratamento das doenças autoimunes é o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que possam deletar células T patogênicas com especificidade, sem afetar a outras células T não relacionadas. Portanto, a busca terapêutica deve encontrar o modo seguro, específico e eficaz de apagar um processo autoimune avançado.

[0032] A presente invenção, em contraste com o estado da técnica anterior, propõe o uso de peptídeos da HspóOh e derivados destes do tipo APL, os quais induzem de forma específica mecanismos moleculares inibitórios do curso da AR. Explicação da invenção

[0033] A presente invenção resolve o problema acima mencionado, proporcionando peptídeos da proteína humana de estresse térmico de 60 kDa que constituem epítopos para células T, para induzir mecanismos de tolerância periférica, em particular mecanismos indutores de anergia ou mediados por clones de células T regulatórias em pacientes com AR e que apresentam as sequências: E18-12 MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 1) El8-3 SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG (SEQ. ID. NO: 2) F19-6 IIDPTKWRTALLDAA (SEQ. ID. NO: 3)

[0034] No pedido de patente WO9711966, propõe-se o uso de peptídeos da HspóO humana e de Mt baseado no fato de que eles podiam induzir tolerância nas células T e prevenir a AR. Estes autores ao administrar estes peptídeos em ratos, onde a artrite se induziu com pristina, obtêm uma certa melhora da doença.

[0035] Diferentemente deste pedido, a requerente demonstrou que seus peptídeos desencadeiam mecanismos de supressão ativa, indutores de tolerância periférica de forma muito eficiente, ao comprovar-se um aumento significativo de IL-10 em dois modelos animais de artrite, assim como nos ensaios "ex vivo" empregando células mononucleares de pacientes.

[0036] E conhecido que a resposta fundamental de células T no modelo de artrite induzida por adjuvante (abreviado AIA), está dirigida contra a HspóO. Comprovou-se neste modelo que os presentes peptídeos derivados da HspóOh exerciam uma proteção terapêutica muito marcada, produzindo um aumento da IL-10 e uma diminuição do TNFa. Este mesmo efeito terapêutico exercido por estes peptídeos, também foi comprovado no modelo animal de artrite induzida por colágeno (abreviado AIC), onde a reposta majoritária é contra o colágeno tipo II.

[0037] Estes fatos indicam que as capacidades terapêuticas dos presentes peptídeos são independentes do agente indutor e podem mediar mecanismos de supressão ativa no sítio da inflamação, que pode se estender a outros autoantígenos presentes na articulação e que progressivamente contribuem para o processo imunopatogênico que tem lugar no curso da AR. Estes resultados reforçam as possibilidades terapêuticas do uso das presentes preparações para o tratamento da AR em pacientes.

[0038] Estes peptídeos são em particular úteis de acordo com a presente invenção, para o desenho de variantes derivadas tipo APL dos peptídeos E18-12 (SEQ. ID. NO: 1) e E18-3 (SEQ. ID. NO: 2), modificados nos sítios de contato com a molécula MHC humana e o derivado tipo APL do peptídeo F19-6 (SEQ. ID. NO: 3), modificado nos sítios de contato com a molécula MHC de rata. As sequências de aminoácidos respectivas são: MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 1) 1 2 34 56 7 Substitui-se posição 1 por: A,F,I,L,M,V,W, ou Y posição 2 por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, ou Y posição 3 por: A,K,V,R,T,I,P,L,N,S,G,Y, ou M posição 4 por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, ou Y posição 5 por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, ou Y posição 6 por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W, ou Y posição 7 por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, ou Y SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA (SEQ.ID. NO: 2) 1 2 3 45 6 7 8 substitui-se na posição 1 por: L,1,V,M,Y,W,F, ou A posição 2 por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, ou Y posição 3 por: A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W, ou Y posição 4 por: L,I,V,M,Y,W,F, ou A posição 5 por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, ou Y posição 6 por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, ou Y posição 7 por: A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W, ou Y posição 8 por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, ou Y IIDPTKVVRTALLDAA (F19-6) (SEQ.ID. NO: 3) 1 2 posição 1 substitui-se por H. posição 2 substitui-se por E.

[0039] Em uma realização particular, os peptídeos derivados tipo APL têm uma sequência aminoácida selecionada do grupo que consiste de SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, SEQ. ID. NO: 8, SEQ. ID. NO: 9, SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 11 , SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 19, SEQ. ID. NO: 20 e SEQ.ID. NO: 21.

[0040] Os peptídeos da presente invenção podem ser produzidos pelos métodos rotineiros de síntese de peptídeos. Cada composição que possua um peptídeo específico pode ser testado pelo nível e a qualidade da resposta imune que induz em experimentos como os que se descrevem nos exemplos que se apresentaram posteriormente.

[0041] Todas as sequências descritas acima e nos exemplos são úteis em si e também podem ser usadas como uma base para o desenho e a síntese de derivados com propriedades melhoradas.

[0042] A invenção também inclui composições farmacêuticas que compreendem um ou mais dos peptídeos anteriormente enumerados e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente. A administração das preparações farmacêuticas aos pacientes, deverá estar em correspondência com as moléculas HLA classe II expressadas pelo paciente em questão.

[0043] A via de administração das composições farmacêuticas, dependerá do padrão de citocinas que induzem ditas preparações nos ensaios "ex vivo". As preparações farmacêuticas contendo peptídeos APL indutores de uma resposta reguladora serão administradas por via intradérmica ou subcutânea. As preparações farmacêuticas contendo os peptídeos originais indutores de uma resposta TH1 poderão ser administrados por via oral.

[0044] As quantidades presentes nas composições farmacêuticas da presente invenção são as que produzem a resposta imune efetiva no hospedeiro. A quantidade efetiva é a quantidade que ao ser administrada resulta na indução de mecanismos moleculares que diminuem significativamente os sinais inflamatórios característicos da AR e detêm os danos articulares histopatológicos característicos do curso desta doença. Ademais a quantidade da composição farmacêutica administrada ao hospedeiro pode variar em dependência de vários fatores que incluem: os peptídeos empregados, contagem ACR (em inglês, American College of Rheumatology, abreviado ACR), HLA tipo II, tempo de diagnosticada a doença, idade, sexo, saúde geral, assim como o nível de resposta imunológica em geral.

[0045] A presente invenção ademais relaciona a um método de tratamento da AR, o qual compreende a administração a um paciente de quantidades efetivas dos peptídeos ou as composições farmacêuticas referidas anteriormente. Breve descrição dos desenhos

[0046] Em parte, os resultados são mostrados graficamente nas seguintes figuras:

[0047] Figura 1: Avaliação dos sinais clínicos da artrite em ratas tratadas com os peptídeos F19-6 e F19-7 por via intradérmica, no modelo de AIA.

[0048] Figura 2: Modulação dos níveis de TNFa induzido pelos peptídeos F19-6 e F19- 5 7 em células mononucleares de ratas do modelo AIA no dia 15 depois de induzida a doença.

[0049] Figura 3: Modulação dos níveis de IL-10 induzido pelos peptídeos F19-6 e F19- 7 em células mononucleares de ratas do modelo AIA no dia 15 depois de 10 induzida a doença.

[0050] Figura 4: Microscopia óptica de uma seção da articulação pertencente a um animal enfermo no tratado. EI: espaço intrarticular, EC: erosão do cartilagem, P: pano. Mancado com: hematoxilina-eosina. 15.

[0051] Figura 5: Microscopia óptica de uma seção da articulação pertencente a um animal tratado com o peptídeo F19-7 por via intradérmica. EI: espaço intrarticular. Manchado com: hematoxilina-eosina.

[0052] Figura 6: Modulação dos níveis de TNFa induzido pelos peptídeos F19-6 e F19- 7 em células mononucleares de ratas do modelo animal de AIC, no dia 21 depois de induzida a doença.

[0053] Figura 7: Modulação dos níveis de IL-10 pelos peptídeos F19- 6 e F19-7 em 5 células mononucleares de ratas do modelo animal de artrite induzida com colágeno, no dia 21 depois de induzida a doença.

[0054] Figura 8: Modulação dos níveis de TNFa pelos peptídeos F19- 6 e F19-7 em células mononucleares de pacientes com AR.

[0055] Figura 9: Modulação dos níveis de TNFa pelos peptídeos El 8- 3 e El 8-12 em células mononucleares de pacientes com AR.

[0056] Figura 10: Modulação dos níveis de IL-10 pelos peptídeos El 8-3 e El 8-12 em células mononucleares de pacientes com AR.

[0057] Figura 11: Modulação dos níveis de IL-10 induzido pelos peptídeos El8-3 e El8-12 e seus APL em células mononucleares de pacientes com AR.

[0058] Figura 12: Modulação dos níveis de TNFa induzido pelos peptídeos El8-3 e El8-12 e seus APL em células mononucleares de pacientes com AR.

[0059] Figura 13: Relação dos níveis de IL-10 e TNFa, induzido pelos peptídeos E18-3 e E18-12 e seus APLs.

[0060] Figura 14: Avaliação dos sinais clínicos da artrite nas ratas tratadas com os peptídeos E18-12 e E18-12APL1 por via intradérmica, no modelo de AIA. Exposição detalhada de modos de realização/Exemplos Exemplo 1: Peptídeos da HspóOh apresentados por HLA humano.

[0061] Selecionou-se aqueles peptídeos da HspóOh, reportados como epítopos de células T humanas pelos dois programas empregados: SYFPO THI (Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic. 1999. Immunogenetics 50:213- 219. SYFPO THI: database for MHC ligands and peptide motifs, (access via: http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)) e ProPred (Singh,H. and Raghava.G.P.S. 2001. ProPred: Prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics, 17(12): 1236-37). A sequência correspondente a estes peptídeos é mostrada na Tabela 1. Tabela1.SequênciadospeptídeosdaHspóOhapresentadosporHLAhumano

Exemplo 2: Peptídeo da HspóOh para epítopo de ratas Lewis.

[0062] A partir da sequência de HspóOh selecionou-se um peptídeo que se une à molécula de MHC-I1 de rata RT1 .BI de acordo com o motivo de sequência descrito na base de dados SYFPE1THI (Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic. 1999. Immunogenetics 50:213-219. SYFPO THI: database for MHC ligands and peptide motifs, (access via: http://www.uni- tuebingen.de/uni/kxi/)).

[0063] Executou-se um programa que analisa todos os peptídeos de 9 aminoácidos para buscar aqueles que cumprem com o motivo. Foram incluídas também as variantes nas quais em uma das posições não está incluído nenhum dos resíduos descritos como de ancoragem ou preferenciais.

[0064] A sequência correspondente a um destes peptídeos (F19-6) é mostra na Tabela 2. Tabela 2. Sequência do peptídeo da HspóOh selecionado para ratas

Exemplo 3: Desenho dos APL com modificações nos aminoácidos envolvidos na união ao MHC.

[0065] Partindo dos peptídeos selecionados nos exemplos 1 e 2, modificou-se as posições envolvidas na união ao MHC específico (posições 1, 3, 4, 6, 8 ou 9) tratando de aumentar a afinidade do mesmo pela molécula de HLA. Buscou-se que em cada uma destas posições estivessem os resíduos ótimos como sejam resíduos de ancoragem se o peptídeo selecionado o foi por métodos que usam motivos de união (SYFPOTHI) ou resíduos capazes de aumentar a pontuação do peptídeo como ligando do MHC se a seleção do peptídeo se fez usando outro tipo de algoritmo (ProPred).

[0066] Como resultado destas análises o peptídeo El 8-12, foi substituído nas posições do 1 ao 7 assinaladas a seguir por cada um dos aminoácidos que se especificam MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 1) 1 2 34 5 6 7 posição 1 se substitui por: A,F,I,L,M,V,W, ou Y posição 2 se substitui por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, ou Y posição 3 se substitui por: A,K,V,R,T,I,P,L,N,S,G,Y, ou M posição 4 se substitui por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, ou Y posição 5 se substitui por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, ou Y posição 6 se substitui por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W, ou Y posição 7 se substitui por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, ou Y

[0067] O peptídeo El 8-3, foi substituído nas posições de 1 a 8 assinaladas a seguir por cada um dos aminoácidos que se especifica: SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA (El 8-3) 1 2 3 45 6 7 8 posição 1 se substitui por: L,I,V,M,Y,W,F, ou A posição 2 se substitui por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, ou Y posição 3 se substitui por: A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W, ou Y posição 4 se substitui por: L,I,V,M,Y,W,F, ou A posição 5 se substitui por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, ou Y posição 6 se substitui por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, ou Y posição 7 se substitui por: A,F,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W, ou Y posição 8 se substitui por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, ou Y

[0068] O peptídeo F19-6, foi substituído nas posições 1 e 2 assinaladas a seguir pelos aminoácidos que se especificam: IIDPTKWRTALLDAA (F19-6) 1 2 posição 1 se substitui por H. posição 2 se substitui por E. Estas duas substituições deram origem ao peptídeo F19-7: IIDPTHWRTELLDAA (Fl9-7) (SEQ. ID. NO: 4) Exemplo 4: Indução da artrite por adjuvante e colágeno em ratas Lewis.

[0069] No experimento foram empregadas ratas Lewis fêmeas isogênicas (haplotipo RT1 .BI MHC) fornecidas pelo Centro Nacional para a Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, Cuba). As ratas foram selecionadas aleatoriamente, com um peso aproximado de 101-120 g e de 5-8 semanas de idade.

[0070] Um dos agentes indutores da doença empregado era o Mt (H37Ra, Difco, Inglaterra) em adjuvante incompleto de Freund (AIF) (Sigma, EEUU). O outro agente indutor da artrite era o colágeno tipo II bovino em AIF.

[0071] Neste exemplo foram empregados dois agentes indutores diferentes para desenvolver nas ratas a artrite, mediada esta por uma resposta imune contra dois autoantígenos diferentes.E bem conhecido que no modelo de artrite onde se emprega como indutor o Mt, a resposta fundamental de células T é contra a HspóO(Anderton, SM (1995) Activation of T cells recognizing self 60-kD heat shock protein can protect against experimental artritis. J. Exp. Med. 181: 943-952). No modelo onde se emprega o colágeno como indutor se desenvolve uma marcada resposta de anticorpos e clones de células T contra este autoantígeno (M Griffiths (1988) Immunogenetics of collagen-induced artritis in rats. Inten. Rev. Immunology 4: 1-15).

[0072] O objetivo fundamental da requerente ao desenvolver estes dois modelos, era avaliar em ambos os presentes candidatos peptídicos, com o propósito de demonstrar se o efeito protetor dos peptídeos era independente ou não do autoantígeno empregado como agente indutor da artrite nas ratas. Exemplo 5: Avaliação dos sinais clínicos.

[0073] O grau de inflamação associado com o desenvolvimento da artrite que apresentava cada rata, foi avaliado com o seguinte escore confeccionado para este fim:

[0074] 0 ponto: pata normal.

[0075] 1 ponto: Ligeiro, porém definitivo enrijecimento do tornozelo ou munheca, ou aparentemente enrijecimento e inflamação limitados a um dedo individual, independentemente do número de dedos afetados.

[0076] 2 pontos: Moderado enrijecimento e inflamação do tornozelo e a munheca.

[0077] 3 pontos: Severo enrijecimento e inflamação de toda a pata incluindo os dedos.

[0078] 4 pontos: Inflamação máxima e deformidade da pata envolvendo múltiplas articulações.

[0079] Foram avaliadas as quatro patas por separado e segundo a pontuação elaborada, cada pata podia receber até 4 pontos. Portanto cada rata podia receber um máximo de 16 pontos.

[0080] A avaliação visual foi realizada depois da indução da doença cada cinco dias.

[0081] A avaliação clínica dos sinais da artrite demonstrou que havia diferenças estatísticas significativas entre os animais correspondentes ao grupo de controle sadio (grupo IV), onde não se induziu a doença, e os animais correspondentes ao de grupo controle doente (grupo III), onde se induziu a doença porém não foram tratados com os peptídeos, como se mostra na Figura 1. Exemplo 6: Síntese de peptídeos.

[0082] Os peptídeos foram sintetizados pela estratégia Fmoc/tBu em seringas. Utilizou-se a resina Fmoc-AM-MBHA (0,54 mmol/g) e seguiu-se o protocolo de síntese com agitação mecânica. Depois do tratamento com TFA, o peptídeo foi liofilizado e caracterizado por HPLC e espectrometria de massa. Exemplo 7: Administração intradérmica dos peptídeos.

[0083] Os animais foram separados em quatro grupos de 12 ratas cada um. A doença foi induzida em três grupos de animais (Grupo I- Grupo III), dos quais dois foram tratados com os peptídeos e um ficou como controle da indução da doença. Aos dois grupos de animais que foram tratados com os peptídeos, foram administrados 200 pg de peptídeo por rata em um volume de 100 pL de PBS, nos dias 12, 17 e 22 depois de induzida a doença com Mt.Os animais separados em quatro grupos foram tratados da seguinte forma: > grupo I: administrou-se o peptídeo F19-6 > grupo II: administrou-se o peptídeo F 19-7 > grupo III: não se administrou peptídeo (controle da indução da doença) > grupo IV: não se induziu a doença nem se administrou peptídeo (controle negativo)

[0084] Nos dias 15, 21, 28 e 35 depois da indução sacrificou-se três animais por grupo, extraiu-se seu o baço e tomou-se neste amostra das articulações para a análise histopatológica.

[0085] Como se mostra na Figura 1 os sinais associados com o desenvolvimento da artrite começaram a se manifestar paulatinamente. Nos animais do grupo III, correspondente ao grupo de controle do desenvolvimento da doença, a partir do dia 10, depois de induzida a mesma, tornou-se evidente o desenvolvimento de um processo inflamatório que se iniciou com um enrijecimento ligeiro das articulações traseiras e que foi se estendendo para o resto das articulações chegando a tornar-se severo em algumas das ratas.

[0086] Nesta mesma figura evidencia-se que a administração do peptídeo F19-6 correspondente ao epítopo original da HspóOh e de sua variante APL F19-7, induziram uma redução significativa dos sinais clínicos da artrite nos animais tratados com ambos peptídeos. Obteve-se diferenças estatisticamente significativas entre os grupos tratados com os peptídeos F19- 6 e F19-7 e o grupo tomado como controle positivo da doença (P< 0.05).

[0087] Os resultados obtidos a partir deste ensaio permitem corroborar que os peptídeos F19-6 e F19-7 exercem um efeito protetor nos animais tratados, já que era possível observar uma remissão quase completa da doença nos mesmos. Exemplo 8: Isolamento de ácido ribonucleico mensageiro (RNAm).

[0088] As células mononucleares isoladas do baço das ratas, foram incubadas aproximadamente durante 20 horas. Passado este tempo, dessecou- se o sobrenadante de cultivo e adicionou-se 1 ml do reativo: TRI REAGENT™ (SIGMA, EEUU) por poço e deixou-se durante 5 minutos a temperatura ambiente.

[0089] Posteriormente procedeu-se ao isolamento do RNAm seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Exemplo 9: Transcrição reversa de ácido ribonucléico.

[0090] Para obter o DNA complementar utilizou-se o sistema Gene Amp RNA PCR Kit (Perkin- Elmmer, EEUU). Tomou-se 1 pg de RNAm correspondente a cada uma das amostras e seguiu-se o protocolo que recomenda o fabricante.

[0091] A reação foi incubada em um termociclador (Minicycler, MJ Research, EEUU), segundo o seguinte esquema: um primeiro ciclo de 1 hora a 420C, e em seguida 5 minutos a 950C e 5 minutos a 40C. Exemplo 10: Reação em cadeia da polimerase.

[0092] A reação em cadeia da polimerase (abreviada RCP) foi realizada para as citocinas: TNFa e IL-10 e o gene constitutivo que codifica para a enzima GAP-DH (em inglês glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, abreviado GAP-DH).

[0093] Para cada reação utilizou-se 10 pmol de cada iniciador, 5 pl do DNA molde, 0,25 pl de DNA Polimerase Termoestável (Taq-Pol) (Perkin- Elmmer, EEUU) no tampão recomendado pelos fabricantes (KC1 50 m, Tris- HCI 10 mM, pH 9,0, Triton X-100 a 0,% e MgChl,5 mM) em um volume final de 25 pl. A reação para o GAP-DH foi incubada em um termociclador (Minicycler, MJ Research, EE.UU) segundo o seguinte programa: um primeiro ciclo de 3 minutos a 94°C (temperatura de desnaturalização), 1 minuto a 94°C, 1 minuto 58°C (temperatura de hibridização) e 1 minuto a 72°C (temperatura de alongamento), em seguida 35 ciclos de: 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 58°C e 1 minuto a 72°C cada um. Por último uma passagem de extensão de 3 minutos a 72°C.

[0094] Para as citocinas seguiu-se o esquema anterior variando somente a temperatura de hibridização. Para a IL-10, 54°C e para o TNFa 64°C. Exemplo 11: Análise dos produtos da RCP por eletroforese em géis de agarose.

[0095] O resultado dos produtos de RCP foi comprovado mediante uma eletroforese em gel de agarose. As imagens das corridas eletroforéticas foram captadas e analisadas com o programa Molecular Analyst (BioRad). Os resultados foram expressos como níveis relativos de RNAm para cada citocina. Exemplo 12: Análise estatística dos níveis relativos de RNAm para cada citocina.

[0096] Para determinar as diferenças no padrão de citocinas (segundo os níveis relativos de RNAm para cada uma delas) entre os grupos de animais tratados, empregou-se as provas de Kruskal-Wallis e de Student-Newman- Keuls. (Pacote estatístico Sigma Stat v 2 1997, GraphPad Software, Inc).

[0097] As análises estatísticas demonstraram que no dia 15 depois de induzida a doença, os peptídeos diminuem significativamente os níveis de TNFa em comparação com o grupo controle da doença.

[0098] Estes resultados são mostrados na Figura 2, onde G1 corresponde aos animais tratados com o peptídeo F19-6, GII representa o grupo de ratas tratadas com o peptídeo F19-7, GIII representa o grupo enfermo não tratado e GIV inclui os animais sãos. Comprovou-se claramente que o tratamento com os peptídeos 00008 provocou uma diminuição nos níveis relativos desta citocina responsável em grande medida por induzir o processo inflamatório nos animais. Encontrou-se diferença estatisticamente significativa para o caso da citocina TNFa entre os grupos tratados com os peptídeos e no grupo empregado como controle positivo da doença. Não se evidenciou diferença significativa entre os diferentes grupos tratados com os peptídeos nem entre estes e o grupo tomado como controle negativo da doença. Este resultado indica que a administração das duas variantes peptídicas causou uma diminuição nos níveis do TNFa, praticamente até os níveis em que se encontra esta citocina nos animais sãos.

[0099] Com o propósito de determinar se os peptídeos empregados neste ensaio, podiam estimular a produção de citocinas antiinflamatórias como a IE-10, foram avaliados os níveis relativos de RNAm correspondentes a esta citocina.

[00100] A IE-10 se encontra envolvida na indução de tolerância periférica através de uma resposta mediada por células T. Sabe-se que ela regula diretamente as células T inibindo a produção de IL-2, IL-5 e TNFa.

[00101] A Figura 3 mostra a medição semi-quantitativa dos níveis de expressão da IE-10 nos diferentes grupos de tratamento, no dia 15 posterior à indução da doença. Nesta figura G1 corresponde aos animais tratados com o peptídeo F19-6, GII representa o grupo de ratas tratadas com o peptídeo F19- 7, GUI representa o grupo de animais enfermos não tratados e GIV inclui os animais sãos.

[00102] Como se pode observar, o tratamento dos animais com os peptídeos induz um incremento nos níveis de expressão relativos da IL-10. Não se obteve diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos de animais tratados com os peptídeos, existindo diferenças significativas entre estes dois grupos e os animais que constituem os controles positivo e negativo do ensaio. A partir destes resultados podemos inferir que os peptídeos atuam induzindo uma troca no fenótipo funcional das células T envolvidas na patogênese da doença, incrementando os níveis de produção de citocinas antiinflamatórias como é o caso da IL-10 e diminuindo os níveis de produção das citocinas proinflamatórias como o TNFa. Exemplo 13: Análise Histopatológica.

[00103] Com o objetivo de corroborar os sinais clínicos observados nos animais deste biomodelo e analisar a capacidade de ambos peptídeos de reverter ou diminuir o processo destrutivo gerado pelo Mt,realizou-se a análise histopatológica das articulações dos animais de cada grupo.

[00104] As lâminas correspondentes às articulações foram analisadas pelo grupo de Patologia do Bioterio do CIGB.

[00105] As articulações foram fixadas em buffer neutro de formalina ao 10% e descalcificadas. Os tecidos foram desidratados em um gradiente de álcool, embebidos em parafina e cortados em seções de 5 pm. Posteriormente as amostras foram montadas em cursores de vidro e manchados com uma mescla de hematoxilina-eosina e observadas em um microscópio óptico.

[00106] Os resultados das análises histopatológicas são mostrados na tabela 3. Tabela 3. Resumo da análise histopatológica das articulações dos animais dos grupos I-grupo IV.

[00107] Na Tabela 3 a P: representa o pano; EC: erosão da cartilagem articular; IM: invasão da medula óssea; HO: hiperplasia dos osteoclastos; G: reação granulomatosa; PMN: polimorfonucleares.

[00108] Nos animais do grupo III incluindo os sacrificados no dia 15, evidenciou-se a presença do pano que levou à erosão da cartilagem e a invasão da medula óssea. Ademais, observa-se a reação granulomatosa típica da indução com Mt e com frequência a hiperplasia dos osteoclastos, que são células gigantes que têm um grande poder destrutivo da substância óssea. Estes resultados histopatológicos reproduzem os sinais característicos das modificações articulares que ocorrem nos pacientes com AR, o que demonstra que foi desenvolvido um modelo animal adequado para avaliar os candidatos farmacológicos de que se dispõe.

[00109] A Figura 4A corresponde à articulação de um animal do grupo III não tratado. Nela, pode observar-se a presença do pano que invade todo o espaço intrarticular, estendendo-se até a cartilagem onde se evidencia a erosão deste, assim como a invasão até a medula óssea. Na Figura 4B mostra-se uma ampliação da região que corresponde à medula óssea onde se observa com maior nitidez o pano que é um tecido de granulação rico em células fagocíticas.

[00110] No tratamento com o peptídeo F19-7 por via intradérmica (grupo II) como mostrado na Figura 5, o animal sacrificado no dia 15 não apresenta alterações histológicas, só a presença de polimorfonucleares e abundante tecido de cicatrização. Em contraste com o resto dos animais do grupo III, que se caracterizaram por apresentar sinais histopatológicos severos.

[00111] Como se mostra na Tabela 3, os grupos de animais tratados com os peptídeos F19-6 e F19-7, praticamente não mostraram afetações histológicas durante o curso do primeiro ensaio. Evidenciou-se uma maior proteção ao desenvolvimento da artrite nos animais tratados com o peptídeo F19-7. A metade das ratas envolvidas neste grupo de tratamento (6 ratas) não apresentaram nenhuma manifestação histopatológica, em correspondência com o grupo de animais tratados com o F19-6, onde somente duas ratas não apresentaram dano histopatológico. Nos grupos tratados com os peptídeos F19-6 e F19-7 não se observou a presença de pano nos dias 15 e 21 depois de induzida a artrite, isto indica que a administração destas variantes peptídicas induziu um retardo no aparecimento dos eventos celulares próprios da reação inflamatória implicada no desenvolvimento da artrite. Resultou significativo que dos animais tratados com a variante peptídica F19-7 sacrificados no dia 35 depois de induzida a artrite, somente uma rata evidenciou as afetações histológicas características do desenvolvimento da doença. Estes resultados indicam que o tratamento dos animais com este peptídeo induziu neles, além de um retardo na manifestação clínica da doença, uma remissão praticamente total dos sinais histopatológicos da artrite, pondo de manifesto uma superioridade terapêutica do APL F19-7 com respeito ao peptídeo que contém o epítopo original F19-6. Exemplo 14. Avaliação in vitro do padrão de citocinas frente aos peptídeos F19-6 e F19-7, empregando células mononucleares de ratas onde a artrite foi induzida com colágeno tipo II.

[00112] Neste ensaio empregou-se ratas doentes onde a artrite foi induzida usando colágeno tipo II de origem bovina em AIF. Extraiu-se o baço de cada rata analisada e isolou-se as células mononucleares.

[00113] As células mononucleares isoladas do baço foram cultivadas em 1,5 ml de RPMI 1640 em placas de 24 poços (Costar, EEUU). O ensaio foi realizado em triplicata, e um total de 3x106 células/poço foram cultivadas durante 24 horas com os peptídeos F19-6 e F19-7 a uma concentração de 5 pg/ml e incubadas a 370C, em atmosfera úmida de CCF a 5%. As células cultivadas sem os peptídeos foram utilizadas como controle negativo do ensaio.

[00114] Posteriormente isolou-se o RNAm, realizou-se a reação de transcrição reversa do ácido nucleico e a RCP da mesma maneira como se descreve nos exemplos anteriores. As análises dos produtos de RCP foram efetuadas por eletroforese em géis de agarose como se descreve no exemplo 12. Para determinar as diferenças no padrão de citocinas segundo os níveis relativos de RNAm para cada uma das amostras, empregou-se as provas estatísticas que se descrevem no exemplol3.

[00115] Na Figura 6 mostra-se os níveis de TNFa das células cultivadas sem peptídeo e estimuladas com os peptídeos F19-6 e F19-7 in vitro correspondentes ao dia 21 posterior à indução da doença, a letra A representa os níveis de TNFa nas células cultivadas sem peptídeo, a letra B representa os valores desta citocina quando as células são estimuladas com o peptídeos F19-6 e a letra C corresponde aos níveis de TNFa quando as células são estimuladas com o peptídeos F19-7. Nesta figura CII representa o grupo de animais, onde a artrite foi induzida com colágeno tipo II e Controle representa o grupo de animais sãos.

[00116] Na Figura 7 mostra-se os níveis de IL-10 das células cultivadas sem peptídeo e estimuladas com os peptídeos F19-6 e F19-7 in vitro correspondentes ao dia 21 posterior à indução da doença, a letra A representa os níveis de IL-10 nas células cultivadas sem peptídeo, a letra B representa os valores desta citocina quando as células são estimuladas com o peptídeos F19-6 e a letra C corresponde aos níveis de IL-10 quando as células são estimuladas com o peptídeos F19-7. Nesta figura CII representa o grupo de animais, onde a AR foi induzida com colágeno tipo II e Controle representa o grupo de animais sãos.

[00117] Como se observa nestas duas figuras os peptídeos F19-6 e F19-7 in vitrodiminuem os níveis de TNFa, no caso dos níveis de IL-10 somente o peptídeo F19-7 o incrementa significativamente.

[00118] Estes resultados indicam que o peptídeo F19-7 é capaz de modular o padrão de citocinas até um fenótipo regulador no modelo animal onde a artrite é induzida com colágeno. Portanto pode-se afirmar que a ação imunomoduladora deste peptídeo derivado da HspóOh in vitropode ser estendida a modelos animais de artrite, onde o agente indutor que participa no desenvolvimento da doença no é Mt ou autoantígenos relacionados.

[00119] Ditos resultados sugerem que o peptídeo F19-7 pode induzir tolerância para antígenos não relacionados estruturalmente pelo que pode-se mediar in vivo uma supressão ativa no sítio da inflamação.

[00120] Com estes resultados pode-se sugerir que o peptídeo F19-7 induz nos animais uma proteção frente à artrite induzida por Mt ou colágeno tipo II, a qual está mediada por células T reguladoras que produzem IL-10. Este efeito pode ser estendido a outros autoantígenos presentes na articulação e que progressivamente contribuem para o processo imunopatogênico que tem lugar em curso da AR. Exemplo 15: Medição de citocinas em pacientes com AR frente aos peptídeos F19-6eF19-7.

[00121] Utilizando sangue de pacientes com AR realizou-se ensaios de medição das citocinas: TNFa, IFNy e IL-10. Nestes ensaios avaliou-se a potencialidade dos peptídeos da HspóOh para aumentar ou diminuir as diferentes citocinas envolvidas na patogênese da doença.

[00122] Partiu de 10 ml de sangue de cada paciente, que se diluiu Vi em PBS IX. Adicionou-se 5 ml desta diluição a 3 ml de Ficoll-Paque (Amershan) em tubos de centrifugação de 15 ml, os quais foram centrifugados durante 30 min. a 1200 rpm. Extraiu-se o anel correspondente às células mononucleares. Posteriormente as células foram lavadas duas vezes com 15 ml de PBS IX e depois de cada lavagem foram centrifugadas a 900 rpm. Finalmente o precipitado foi ressuspenso em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino e suplementado com penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml), HEPES 25 mM/1 e L-glutamina 2mM (todos adquiridos de Gibco BRL).

[00123] As células mononucleares obtidas foram semeadas em número de 106 células /poço em placas de 24 poços (Costar) em um volume de 800 jil. Posteriormente adicionou-se os peptídeos da HspóOh em uma faixa de concentração desde 0,5 pg/ml até 100 pg/ml, precisando-se para cada peptídeo a concentração ótima para modular os níveis de citocinas. A Fito- hemaglutinina (PHA) a 1 % foi usada como controle positivo de estimulação celular, enquanto que o RPMI 1640 somente foi empregado como controle do crescimento celular basal.

[00124] As células foram cultivadas durante 24 horas e posteriormente tomou-se o sobrenadante de cada poço, diluído Yz, e determinou-se a concentração das citocinas através dos kits específicos para cada uma delas Quantikine® (R&D Systems) segundo as recomendações dos fabricantes.

[00125] Na Figura 8, representa-se os níveis de TNFa modulados pelos peptídeos F19- 6 e F19-7 em células mononucleares de pacientes com AR. Nesta figura, a letra C" representa as células cultivadas in vitro sem peptídeos; enquanto que F19-6 corresponde às células estimuladas in vitro com o peptídeo F19-6 e F19-7 representa as células estimuladas in vitro com o peptídeo F19-7.

[00126] Na figura quando existe diferença estatística significativa entre os níveis das citocinas produzidas pelas células estimuladas com o peptídeo com respeito às células não estimuladas, atribui-se uma letra diferente nas barras correspondendo aos níveis da citocina em questão.

[00127] Como se observa na Figura 8, nos pacientes representados como P19 e P21, os níveis de TNFa diminuem significativamente frente aos peptídeos F19-6 e F19-7 em comparação com as células que não foram confrontadas com os peptídeos, ainda que no paciente PI 9 a diminuição nos níveis desta citocina é mais significativa com o peptídeo F19-7.

[00128] No paciente representado como P13, os níveis de TNFa aumentam frente ao peptídeo F19-6, contudo os níveis desta citocina diminuem significativamente, quando as células mononucleares deste paciente são confrontadas com o peptídeo F19-7. Estes resultados evidenciam que o peptídeo F19-7, ainda que desenhado para ser apresentado pela molécula MHC de rata, pode diminuir os níveis desta citocina, responsável em grande medida pelo processo inflamatório característico da AR, pelo que este peptídeo representa um candidato terapêutico potencial para o tratamento desta doença. Exemplo 16: Medição de citocinas em pacientes com AR frente aos peptídeos E18-12eE18-3

[00129] Utilizando sangue de pacientes com AR realizou-se ensaios de medição das citocinas: TNFa, IFNy e IL-10. Nestes ensaios avaliou-se a potencialidade dos peptídeos da HspóOh para aumentar ou diminuir as diferentes citocinas envolvidas na patogênese da doença.

[00130] Partiu-se de 10 ml de sangue de cada paciente, que se diluiu Vi em PBS IX. Adicionou-se 5 ml desta diluição a 3 ml de Ficoll-Paque (Amershan) em tubos de centrifugação de 15 ml, os quais foram centrifugados durante 30 min a 1200 rpm. Extraiu-se o anel correspondente às células mononucleares. Posteriormente as células foram lavadas duas vezes com 15 ml de PBS IX e depois de cada lavagem foram centrifugadas a 900 rpm. Finalmente o precipitado foi ressuspenso em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino e suplementado com penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml), HEPES 25 mM/L e L-glutamina 2mM (todos adquiridos de Gibco BRL).

[00131] As células mononucleates obtidas foram semeadas em número de 106células /poço em placas de 24 poços (Costar) em um volume de 800 pL. Posteriormente adicionou-se os peptídeos da HspóOhem uma faixa de concentração desde 0,5 pg/ml até 100 pg/ml, precisando-se para cada peptídeo a concentração ótima para modular os níveis de citocinas. A Fito- hemaglutinina (PHA) a 1 % foi usada como controle positivo de estimulação celular, enquanto que o RPMI 1640 somente foi empregado como controle do crescimento celular basal.

[00132] As células foram cultivadas durante 24 horas e posteriormente tomou-se o sobrenadante de cada poço, diluído ¥i, e determinou-se a concentração das citocinas através dos kits específicos para cada uma delas Quantikine® (R&D Systems) segundo as recomendações dos fabricantes.

[00133] Na Figura 9, representa-se os níveis de TNFa modulados pelos peptídeos El8- 3 e El 8-12 em células mononucleares de pacientes com AR. Os pacientes representados por P4, P5 e PI 6 expressam a molécula DR 0306, os pacientes identificados como P7, P8 e PI2 expressam a molécula DR 0303, enquanto que o paciente P9 apresenta um genótipo DR 0506 e o paciente P10 tem um genótipo DR 0204. Nesta figura, a letra C" representa as células cultivadas in vitro sem peptídeos; enquanto que El8-3 corresponde às células estimuladas in vitro com o peptídeo El8-3 e El8-12 representa as células estimuladas in vitro com o peptídeo El 8-12.

[00134] Na figura quando existe diferença estatística significativa entre os níveis das citocinas produzidas pelas células estimuladas com o peptídeo com respeito às células não estimuladas, atribui-se lhe uma letra diferente nas barras que corresponde aos níveis da citocina em questão.

[00135] Como se observa na Figura 9, a indução da síntese de TNFa nas células mononucleares dos pacientes, estimuladas com os peptídeos El 8- 12 e El 8-3 depende das moléculas HLA tipo II que expressem estes pacientes. Nos pacientes P4, P5 e P6 que apresentam um genótipo DR 0306, observou-se um aumento estatisticamente significativo na concentração de TNFa em comparação com as células não estimuladas com peptídeos.

[00136] Este mesmo efeito é produzido nos pacientes P9 de genótipo DR 0506 e o paciente P10 DR 0204.

[00137] Nos pacientes P7, P8 e P12 os quais apresentam um genótipo DR 0303, não se observou nenhuma diferença nos níveis de TNFa, quando as células mononucleares destes são estimuladas com os peptídeos da invenção.

[00138] A modulação dos níveis de IL-10 pelos peptídeos El8-3 e El 8-12 é representada na Figura 9, onde a letra C representa as células cultivadas in vitro sem peptídeos; enquanto que El8-3 corresponde às células estimuladas in vitro com o peptídeo El8-3 e El8-12 representa as células estimuladas in vitro com o peptídeo El8-12.

[00139] No caso da IL-10, como se observa na Figura 10, há uma diminuição significativa desta citocina nos pacientes P9 e P10, no resto dos pacientes não houve alterações significativas.

[00140] Destas observações pode-se inferir que os peptídeos El 8-12 e El 8-3 induzem um fenótipo TH 1 em células mononucleares periféricas.

[00141] Uma variante terapêutica dos peptídeos originais: El 8-12 ou El8-3 poderia ser a administração destes por via oral, de forma tal que induzissem mecanismos de tolerização antigênica, que contribuem significativamente para a diminuição da inflamação. Exemplo 17: Medição de citocinas em pacientes com AR frente aos peptídeos derivados tipo APL.

[00142] A partir dos resultados anteriores propôs-se modificar estes peptídeos correspondentes a epítopos originais de célula T, através de ferramentas de Bioinformática, nos sítios de contato com a molécula HLA, de forma tal que estes peptídeos modificados de tipo APL eram capazes de alterar o padrão de citocinas a fenótipo regulador. Utilizando sangue de pacientes com AR realizou-se ensaios de medição das citocinas: TNFa e IL- 10. Nestes ensaios avaliou-se a potencialidade dos peptídeos derivados tipo APL da HspóOh, de aumentar ou diminuir as diferentes citocinas envolvidas na patogênese da doença. Os peptídeos APL avaliados nestes ensaios eram os seguintes: MGPKGRTVIILQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 5) MGPKGRTVIIMQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 6) MGPKGRTVIIAQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 7) MGPKGRTVIIEQSLGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 8) MGPKGRTVIIEQSMGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 9) MGPKGRTVIIEQSLGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 10) MGPKGRTVIIEQSMGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 11) MGPKLRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 12) MGPKLRTVIILQSMGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 13) SIDLKDKLKNIGAKLVQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 14) SIDLKDKYKNIGAKLSQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 15) SIDLKDKLKNIGAKLSQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 16) SIDLKDKYKNAGAKLVQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 17) SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 18) SIDLKDKYKNIGAKLVQAVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 19) SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNANEEA (SEQ. ID. NO: 20) SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNANEEA (SEQ. ID. NO: 21)

[00143] Partiu-se de 10 ml de sangue de cada paciente, que se diluiu Yz em PBS IX. Adicionou-se 5 ml desta diluição a 3 ml de Ficoll-Paque (Amershan) em tubos de centrifugação de 15 ml, os quais foram centrifugados durante 30 min a 1200 rpm. Extrai-se o anel correspondente às células mononucleares. Posteriormente as células foram lavadas duas vezes com 15 ml de PBS IX e depois de cada lavagem foram centrifugadas a 900 rpm. Finalmente o precipitado foi ressuspenso em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino e suplementado com penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml), HEPES 25 mM/1 e L-glutamina 2 mM (todos adquiridos de Gibco BRL).

[00144] As células mononucleares obtidas foram semeadas em número de 106 células/poço em placas de 24 poços (Costar) em um volume de 800 pl. As células foram estimuladas com os peptídeos [E18-3, E18-12, E18-3APL1 (SEQ. ID. NO: 18), E18-3APL2 (SEQ. ID. NO: 21), E18-12APL1 (SEQ. ID. NO: 5), E18-12APL3 (SEQ. ID. NO: 12)], a uma concentração de 40 pg/ml e em triplicata. O RPMI 1640 somente foi empregado como controle do crescimento celular basal.

[00145] As células foram cultivadas durante 24 horas e posteriormente tomou-se o sobrenadante de cada poço, diluído Yi e determinou-se a concentração das citocinas através dos kits específicos para cada uma delas Quantikine® (R&D Systems) segundo as recomendações dos fabricantes.

[00146] Na figura 11 mostra-se os níveis de IL-10 induzido pelos peptídeos originais (E18-12 e E18-3) e o painel de peptídeos tipo APLs: E18- 3APL1 (SEQ. ID. NO: 18); E18-3APL2 (SEQ. ID. NO: 21); E18-12APL1 (SEQ. ID. NO: 5); E18-12APL3 (SEQ. ID. NO: 12). Nesta figura, as letras indicam diferenças estatisticamente significativas (somente se faz referência à significação estatística entre os diferentes peptídeos e as células de controle de cada paciente individualmente). Ademais, as células dos pacientes P4 e P6 não foram estimuladas com os peptídeos E18-3APL2 e E18-12APL3. Resulta evidente que, em todos os pacientes, o peptídeo E18-3APL1 incrementa muito significativamente os níveis de IL-10 com respeito às células não estimuladas. O incremento induzido por este peptídeo em alguns dos pacientes, como P2 e P4, foi de até 9 vezes a quantidade produzida pelas células sem estimular e em pacientes como Pl, P3 e P5 de até 5 vezes superior. Também com o El 8- 12APL1 obteve-se de forma geral resultados similares, evidenciando-se um incremento significativo nos níveis de IL-10 nos pacientes Pl , P4 e P6. Por outro lado nem os peptídeos originais nem os peptídeos E18-3APL2 e El 8- 12APL3 induziram um incremento nos níveis de IL-10 em comparação com as células que representam o controle negativo.

[00147] Na figura 12, representa-se os níveis de TNFa induzido pelos diferentes peptídeos no mesmo grupo de pacientes. Nesta figura, as letras indicam diferenças estatisticamente significativas (somente se faz referência à significação estatística entre os diferentes peptídeos e as células de controle de cada paciente individualmente). Ademais, as células dos pacientes P4 e P6 não foram estimuladas com os peptídeos E18-3APL2 e E18-12APL3. Como se pode apreciar, todos os pacientes não respondem com a mesma intensidade ao estímulo com os diferentes peptídeos, ainda que se deva destacar que a resposta foi bastante homogênea. Por outra parte o peptídeo que mais incrementou a produção de TNFa foi o E18-12APL1, sobretudo nos pacientes P4 e P5, enquanto que nos pacientes Pl, P2 e P3 mostrou-se um ligeiro aumento com respeito ao controle negativo. Também o peptídeo E18-3APL1 teve um comportamento similar na maioria dos pacientes. No caso do peptídeo E18-3APL1 as células dos pacientes P2, P4 e P5, foram as em que mais se evidenciou o aumento dos níveis de TNFa, ainda que seu incremento tenha sido menos marcado. Neste ensaio com os peptídeos originais obteve-se resultados similares aos de avaliações anteriores. Os resultados anteriores indicam que nenhum peptídeo nem seus APL induzem uma diminuição na expressão do TNFa nas células mononucleares dos pacientes.

[00148] Estes resultados poderiam resultar contraditórios, posto que os mesmos APLs que aumentam a produção de IL-10 promovem um incremento nos níveis de TNFa.

[00149] Na figura 13 mostra-se a relação dos níveis de IL-10 e TNFa induzidos pelos peptídeos e seus APLs. Nesta figura, as letras indicam diferenças estatisticamente significativas (somente se faz referência à significação estatística entre os diferentes peptídeos e as células de controle de cada paciente individualmente). Ademais, as células dos pacientes P4 e P6 no se estimularam com os peptídeos E18-3APL2 e E18-12APL3. Resulta evidente o fato de que foi consideravelmente superior o incremento da IL-10 com respeito ao do TNFa, pois em quatro dos seis pacientes, as células estimuladas com o E18-3APL1 mostraram um índice maior que 1, o que indica que os níveis de IL-10 sobrepujaram os de TNFa. Ademais, em todos os pacientes os níveis de IL-10 eram consideravelmente superiores nas células estimuladas com o peptídeo E18-3APL 1 com respeito às células que constituíam o controle negativo, mostrando diferenças estatisticamente significativas. No caso do E18-12APL1 as diferenças em comparação ao controle negativo não resultaram tão notáveis. Desta maneira pode-se assegurar que ainda que o E18-3APL1 incremente os níveis de TNFa, o efeito líquido predominante é o incremento nos níveis de IL-10, o que se traduz em uma polarização da resposta a favor das citocinas imunossupresoras.

[00150] Os resultados do estudo são extremamente promissores, pois apontam para o fato de que estes dois APL ao serem administrados aos pacientes poderiam induzir uma subpopulação de células T reguladoras secretoras de IL-10, que mediem uma supressão ativa a nível sistêmico. Outra conclusão parcial a que se pode chegar mediante a análise destes resultados, é que estes APL apresentam um comportamento praticamente homogêneo em todos os pacientes estudados, independentemente do genótipo que possuam.

[00151] O exposto anteriormente é sumamente alentador, pois permitiria que a administração destes APL tivesse o mesmo efeito em todos os pacientes, apesar das diferenças existentes com respeito ao tipo de moléculas HLA-II que possuam.

[00152] A partir dosa resultados experimentais da requerente, a presente invenção tem como vantagem fundamental o uso de preparações farmacêuticas contendo peptídeos imunomoduladores da proteína de estresse HspóO humana, correspondentes a epítopos de células T ou variantes tipo APL destes peptídeos, que podem ser utilizados eficazmente no tratamento de pacientes com AR, induzindo uma resposta imune especifica dirigida a silenciar os clones de células T auto-reativas envolvidas nos mecanismos imunopatogênicos desta doença.

[00153] O tratamento que se propõe nesta invenção é exequível e pode ser estendido a um grande número de pacientes e ademais pode ser empregado em combinação com as terapias atuais para esta doença. Exemplo 18: Avaliação do efeito terapêutico dos peptídeos derivados tipo APL, em um modelo animal onde a artrite é induzida com Mt.

[00154] Os animais foram separados em doze grupos de oito ratas cada um. A doença foi induzida em onze grupos de animais (Grupo I- Grupo XI), dos quais dez foram tratados com os peptídeos e um ficou como controle da indução da doença. Aos grupos de animais que foram tratados com os peptídeos, administrou-se 50 pg de peptídeo por rata em um volume de 100 pL de PBS, nos dias 12, 14, 16,18, 20, 22, 24 e 26 depois de induzida a doença com Mt

[00155] Os animais separados em doze grupos foram tratados da seguinte forma: r grupo I: administrou-se o peptídeo El 8-12 (SEQ. ID. NO: 1) > grupo II: administrou-se o peptídeo correspondente a: SEQ. ID. NO: 5 > grupo III: administrou-se o peptídeo correspondente a: SEQ. ID. NO: 8 > grupo IV: administrou-se o peptídeo correspondente a: SEQ. ID. NO: 12 > grupo V: administrou-se o peptídeo correspondente a: SEQ. ID. NO: 13 > grupo VI: administrou-se o peptídeo El 8-3 (SEQ. ID. NO: 2) > grupo VII: administrou-se o peptídeo correspondente a: SEQ. ID. NO: 14 > grupo VIH: administrou-se o peptídeo correspondente a: SEQ. ID. NO: 15 > grupo IX: administrou-se o peptídeo correspondente a: SEQ. ID. NO: 16 r grupo X: administrou-se o peptídeo correspondente a: SEQ. ID. NO: 17 'r grupo XI: não se administrou peptídeo (controle da indução da doença) > grupo XII: não se induziu a doença nem se administrou peptídeo (controle negativo).

[00156] Nos dias 21 e 35 depois da indução sacrificou-se vários animais por grupo, extraiu-se o seu baço e tomou-se amostras das articulações para a análise histopatológica.

[00157] Nos grupos de animais tratados com os peptídeos derivados tipo APL, foi significativa uma melhora clínica em comparação com o grupo de animais não tratados e com os grupos tratados com os peptídeos El 8-12 e El8-3. Estes resultados foram corroborados pelas análises histopatológicas e medição de citocinas, evidenciando-se em todos os casos uma superioridade dos peptídeos derivados tipo APL sobre os peptídeos originais.

[00158] Na figura 14 mostra-se o gráfico de evolução da doença em quatro grupo de animais pertencentes a este biomodelo. Neste caso os grupos que se mostra são: grupo I (animais tratados com o El8-12), grupo II (animais tratados com o E18-12APL1, SEQ. ID. NO: 5), grupo XI (controle da indução da doença) e grupo XII (animais sãos). Neste gráfico, letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,001) (faz-se referência à significação estatística entre todos os grupos nos dias específicos de medição).

[00159] Como se pode apreciar neste gráfico, a partir do dia 12 depois de induzida a doença os animais dos grupos I, Il e XI começaram a se manifestar os sinais clínicos próprios da AR. Muitos animais apresentaram também manifestações extra-articulares como nódulos nas orelhas, na cauda e nas extremidades. As manifestações mais severas da AR foram apreciadas em torno do dia 20 para os três grupos de animais doentes. No caso dos animais tratados com o El8-12, no dia 21 não se pode apreciar diferenças significativas com respeito ao grupo de controle da indução da doença. Contudo, em torno do dia 35 depois de haver induzido a doença os sinais clínicos nos animais deste grupo foram significativamente inferiores aos do grupo XI (p<0,001). Estes resultados indicam que o efeito protetor do peptídeo El8-12 se manifesta em torno do dia 35. Neste sentido, seria recomendável administrar o peptídeo em estados mais prematuros da doença para melhorar os resultados no dia 21. Todavia, no caso dos animais do grupo II os sinais clínicos de inflamação foram evidentemente menores em comparação com os dos grupos I e XI (p<0,001), o que indica que este peptídeo exerce um potente efeito protetor nos animais onde se induziu a doença. 1/1

Claims (4)

1. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que é um peptídeo do tipo Peptídeo Ligando Alterado (APL) derivado do peptídeo E18-3APL1 (SEQ ID NO: 18) e E18-3APL2 (SEQ ID NO: 21).

2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais dos peptídeos selecionados a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 21 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que é empregada para o tratamento da Artrite Reumatóide.

4. Uso do peptídeo como definido na reivindicação 1 ou da composição farmacêutica como definida na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser para produção de um medicamento para o tratamento da Artrite Reumatóide.

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