BR102013011330B1 - Utilizaqao de epitopos como alvos vacinais contra a esquistossomose - Google Patents

Abstract

UTILIZAÇÃO DE EPÍTOPOS COMO ALVOS VACINAIS CONTRA A ESQUISTOSSOMOSE A presente invenção diz respeito a dois epítopos, que são peptídeos sintéticos ou epítopos imunodominantes, capazes de induzir resposta imune contra a esquistossomose. Através de técnicas como a vacinologia reversa e bioinformática, o desenvolvimento de vacinas a partir da predição de antígenos In silico é uma possibilidade. Com o uso de tais recursos, os epítopos em questão foram preditos e, posteriormente, testados in vivo e in vitro quanto a sua capacidade de gerar resposta imune, obtendo resultados satisfatórios, podendo ser usados como alvos vacinais contra a esquistossomose.

Description

A presente invenção refere-se à utilização de epítopos presentes na membrana do Schistosoma mansoni como alvos vacinais contra a esquistossomose. Os epítopos, selecionados através de análises de bioinformática e sintetizados, podem ser aplicados de forma eficaz tanto no diagnóstico, quanto na imunização, através de composições vacinais, contra esta parasitose.

Atualmente, a quimioterapia é a principal forma adotada para controle da esquistossomose.Existem dois fármacos frequentemente usados, oxaminiquina e praziquantel, sendo que o praziquantel tem sido mais adotado, devido ao seu menor custo (DOENHOFF e MATTOCCIA, 2006). No entanto, o uso desses quimioterápicos por vários anos não impediu que a doença continuasse em expansão pelo mundo, principalmente porque o tratamento não impede as constantes reinfecções dos indivíduos que vivem nas áreas endêmicas. O praziquantel não atua sobre vermes imaturos, o que impede o tratamento de indivíduos recém-infectados e, além disso, embora ainda não tenham sido detectadas formas resistentes, tem-se observado diminuição da sensibilidade do parasito aos fármacos (GRYSEELS et al., 2006; LOUKAS e MACMANUS, 2008).

Essa carência do estado da técnica justifica os esforços dos pesquisadores para o desenvolvimento de uma vacina anti-ecquistossomótica. Adicionalmente, existe ainda o fato de que indivíduos de áreas endêmicas tornaram-se naturalmente resistentes ou adquiriram resistência a reinfecções após anos de exposição ao Schistosoma mansoni (CALDAS et al., 2000) e o entendimento dos mecanismos dessas respostas em conjunto com experimentos em modelos animais vêm aumentando o otimismo no desenvolvimento dessa vacina.

Diferentemente de outras vacinas, como de vírus e bactérias, que ativam mecanismos imunológicos de eliminação e de memória, uma vacina contra o Schistosoma, ainda que não seja totalmente esterilizante, mas que consiga reduzir significativamente a carga parasitária, também representa umaestratégia interessante, uma vez que esta poderia ser usada em conjunto com a quimioterapia (BERGQUIST et al., 2005) Como o parasito não se multiplica dentro do hospedeiro humano, a redução do número de vermes reduziria também a postura de ovos e a intensidade da infecção, já que estes são os principais responsáveis pela patologia da doença, além disso, a diminuição da ovoposição também diminuiria a transmissão do parasito (BERGQUIST, 1998; CAPRON et al., 2002).

A vacinologia reversa, uma das técnicas adotadas nesta invenção, tem como objetivo determinar a capacidade teórica de moléculas em induzir resposta imune, abrindo possibilidades ao desenvolvimento de vacinas a partir da predição de antigenos in silico. Peso molecular, ponto isoelétrico, localização celular, domínios conservados, glicosilação, hélices transmembrana e presença de peptídeos imunodominantes são algumas das informações que podem ser preditas por esses programas e que são extremamente úteis para o isolamento e caracterização dessas sequências, que posteriormente podem ser sintetizadas e testadas quanto à sua imunogenicidade através de ensaios in vivo (PINHEIRO et al.,2011).

Atualmente a abordagem da vacinologia reversa, que prediz os epítopos imunodominantes através de análises de bioinformática, pode ainda ser combinada a outros sistemas de modelagem e afinidade, também preditos através de análise in silico (RAPPUOLI et al., 2001; RINAUDO et al., 2009). Neste contexto, metodologias têm sido utilizadas para a predição de ligação de peptídeos a moléculas de MHC, predição de ligação baseada na sequência primária de peptídeos e predição de ligação baseada na estrutura tridimensional (3D), a qual permite uma melhor compreensão das interações intermoleculares que governam o reconhecimento do peptídeo pela molécula MHC (ZHAO et al., 2007). O docking molecular tem sido usado como ferramenta para tentar predizer a conformação e a afinidade de ligação entre uma pequena molécula (ligante) e uma biomacromolécula (receptor), partindo de suas estruturas não ligadas (TROTT et al., 2010).

Muitos antigenos estão sendo estudados como potenciais alvos vacinais contra a esquistossomose. Em 1995, a OMS realizou testes para avaliardiversos antígenos como candidatos vacinais, entretanto nenhum antígeno atingiu o objetivo, que era induzir uma redução da carga parasitária igual ou superior a 40% (Wilson e Coulson, 2006). Dentre os seis antígenos testados, o único candidato que está em fase final de aumento de produção é o Sm14 (patente WO2012034197, 2012 e patente PI1100551-3, 2007), que apresentou maior sucesso na imunização contra o parasito, devido principalmente a uma reatividade cruzada com Fasciola hepatica. Mesmo assim, muitos autores defendem a continuidade das pesquisas para seleção de novos antígenos vacinais, principalmente por causa da não identificação dessas moléculas como secretadas ou expostas na superfície do parasita (com exceção da Sm23), e, por conseguinte, acessíveis aos mecanismos efetores da resposta imune (Rofatto et al., 2011).

Recentemente, bancos de dados genômicos e proteômicos gerados com o advento da biologia molecular aliados a programas de predição e modelagem molecular disponibilizados na rede, vêm fornecendo informações importantes para o isolamento e caracterização de novos antígenos vacinais para o desenvolvimento de uma vacina contra a esquistossomose. Através dessas ferramentas, Sérgio Costa Oliveira e colaboradores identificaram e caracterizaram a proteína Sm29 (patente número PI0604176-0) que em ensaios de imunização de camundongos reduziu em 51% a carga parasitária de vermes adultos (CARDOSO et al., 2000).

A partir desses recursos, a presente invenção trata-se da predição de dois epítopos com potencialidade de serem usados como alvos vacinais para a imunização contra a esquistossomose, pois apresentam significativa indução de proliferação de linfócitos T CD4 e/ou foram reconhecidos com grande afinidade pelo MHCII, conforme análises in silico. Os dois epítopos sintetizados são provenientes de proteínas presentes na membrana do Schistosoma mansoni e foram selecionados através de análises de bioinformática. Esses peptídeos foram testados in vivo como um coquetel de imunógenos em ensaios vacinais utilizando camundongos fêmeas de C57-Black para a verificação da proliferação de linfócitos TCD4 e utilizados para avaliar a sua interação commoléculas de MHC de classe II humanas e de camundongos, através de análises in silica.

Vacinas compostas de peptídeos sintéticos (epítopos) apresentam tecnologia de produção barata e segura, nenhum risco de mutação, pouco risco de contaminação por patógenos ou substâncias tóxicas, maior estabilidade do peptideo e menores efeitos colaterais na administração, além de serem capazes de induzir resposta imune contra porções do antígeno que permanecem ocultas durante a infecção natural. Os epítopos aqui selecionados podem ainda ser usados em conjunto com adjuvantes que potencializam a resposta imunológica, como sais de alumínio e Freund, ou ser conjugados a moléculas carreadoras, como açúcares modificados, e nanotubos, ou ainda ser encapsulados por moléculas lipídicas. Essas estruturas atuam como veículos de entrega e oferecem proteção contra a rápida degradação dos antígenos ligados, tornando a apresentação e a estimulação do sistema imune mais eficiente.

Sendo assim, a produção de vacinas utilizando epítopos, que são apenas um fragmento de antígeno, torna-se mais vantajosa do que a produção de vacinas convencionais, podendo resultar numa maneira econômica de produção. Estando a esquistossomose mais comumente associada às regiões mais pobres, uma vacina com baixo custo de produção é bastante relevante no controle da doença.

Para a obtenção de tais epítopos, foram obtidas as sequências proteicas no banco de dados do GeneDB (http://www.genedb.org), onde foram selecionadas apenas proteínas hipotéticas presentes na membrana do S. mansoni, cujo potencial imunogênico ainda não havia sido avaliado. As sequências obtidas foram comparadas ao banco de dados do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) através da ferramenta de alinhamento BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) para confirmação das sequências. As sequências expostas das proteínas selecionadas foram analisadas por meio de três programas de predição de epítopos: Rankpep (http://imed. med.ucm.es/Tools/rankpep.html), SYFPEITHI (http://www.syfpeithi. de/Scripts/ MHCServer.dll / EpitopePrediction.htm), e NetMHCII 3,2 (http.V/www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCll/). As afinidades de todas as sequências foram avaliadas para os seis tipos de HLAs humano: HLA-DRB1 0101, HLA-DRB1 0301, HLA- DRB1 0401, HLA-DRB1 0701, HLA-DRB1 1101 e HLA-DRB1 1501 [16, 17],

Como resultados, foram obtidas no banco de dados GeneDB duzentas e noventa e cinco sequências de proteínas de membrana plasmãtica hipotéticas (PTHs), cujo potencial imunogênico é desconhecido.Das duzentas e noventa e cinco proteínas analisadas pelo programa Psort II, sessenta foram preditas pelo programa com a maior probabilidade de serem proteínas de membrana plasmática, sendo assim, as outras foram descartadas.As sequências das sessenta proteínas foram depositadas em um banco de dados para a realização das próximas análises e aquelas cujas localizações eram diferentes da desejada, foram descartadas. A figura 1 apresenta, como exemplo da análise, a predição da localização celular de uma cestas proteínas selecionadas, a Sm149930 (GeneBank CCD79088.1), feita pelo programa Psort II. Na figura, X representa o tamanho da sequência de amínoácidos analisada e Y indica a probabilidade desta ser uma proteína de membrana plasmática (69.6%).

O peptídeo sinal é uma sequência que possui entre quinze e sessenta amínoácidos e geralmente está localizado na região N-terminal de proteínas. Muitas das proteínas sintetizadas nos compartimentos celulares não desempenham seus papéis biológicos necessariamente nos locais onde são geradas, necessitando serem exportadas para as regiões onde exercerão suas funções. As sessenta proteínas selecionadas anteriormente foram analisadas pelo programa SignalP Server 3.0 para predição de peptídeo sinal.Destas, apenas vinte e cinco proteínas apresentaram peptídeo sinal e tiveram esse fragmento retirado para as análises seguintes. A figura 2A apresenta a predição de uma proteína que possui o peptídeo sinal na região N-terminal, bem como o sítio de clivagem da mesma, que fica por volta do aminoácido vinte e cinco (Sm145420- GeneBank: CCD79353.1), onde X corresponde aos amínoácidos com maior probabilidade de comporem o peptídeo sinal e Y corresponde ao sitio de clivagem. A figura 2B apresenta uma proteína que não possui o peptídeo sinal (Sm145460- GeneBank: XP_002575652.1). Ter ou nãoo peptídeo sinal não foi motivo para exclusão de nenhuma das sequências isoladas.

Em seguida, as proteínas foram modeladas na membrana plasmática e apenas aquelas cuja topologia foi semelhante nos três programas de predição usados, foram selecionadas. Foram obtidas ao todo dezessete proteínas e apenas as porções expostas na membrana do parasito foram obtidas, as demais regiões (intracelulares e intermembrânicas) foram descartadas, com exceção de uma região interna, da proteína Sm149930 que foi selecionada como controle para verificação e comparação da sua imunogenicidade em relação às demais regiões expostas selecionadas. A figura 3 ilustra a predição das hélices transmembrânicas da proteína Sm149930 nos três programas analisados. Afigura 3-A mostra o programa SOSUI, onde M indica uma região exposta de 150 aminoácidos (Met a Ser) e N indica uma região interna de 377 aminoácidos (Ser a Cis), a figura 3-B mostra o programa TMHMM, onde R indica uma região exposta de 147 aminoácidos e S a região interna de 381 aminoácidos e a figura 3-C mostra o programa Tmpred, onde X indica uma região exposta de 150 aminoácidos e Y indica a região interna de 287 aminoácidos. A maior região exposta, que fica aproximadamente entre os aminoácidos 1 e 150, foi selecionada para a próxima análise. Além disso, a região interna dessa proteína localizada aproximadamente entre os aminoácidos 300 e 680 também foi selecionada.

As sequências proteicas das dezessete proteínas, selecionadas anteriormente, foram usadas para a predição de epítopos. Nas análises realizadas pelos três programas de predição de epítopos, Rankpep, SYFPEITHI e NetMHCII 2.2, foram preditos cerca de 3500 epítopos diferentes, constituídos por quinze aminoácidos, que apresentaram significativa probabilidade de se ligarem aos diferentes tipos de HI_As analisados. A Figura 4 apresenta os resultados obtidos na análise da proteína Sm050890 (Genbank: XP_002576389.1), onde foram selecionados os epítopos com maior pontuação de afinidade pelos HLAs: DRB1 0101, DRB1 0301, DRB1 0401, DRB1 0701, DRB1 1101 e DRB1 1501. As áreas destacadas apresentam os epítopos selecionados, de acordo com a pontuação de afinidade de ligação ao HLA-DRB0101 pelos programas Rankpep (Figura 4A), SYFPEITHI (Figura 4B) e NetMHCII 2.2 (Figura 4C).

As sequências dos epítopos preditos nos programas anteriores foram alinhados juntamente com a sequência proteica total usando o programa MultiAlin 5.4.1 e foram selecionadas dez sequências de quinze aminoácidos que corresponderam aos epítopos mais fortemente reconhecidos pelos MHCII, preditos pelos três programas. É mostrado na figura 5, e a área destacada mostra o alinhamento de uma sequência comum aos três programas de predição de epítopos para todos os HLAs analisados. Entre as proteínas analisadas, aquelas que apresentaram os epítopos mais promíscuos foram: Sm141290 (XP002582151.1), Sm141730 (XP_002574997.1), Sm141880 (XP_002575023.1), Sm050890 (XP_002576389.1), Sm135880 (CCD82381.1), Sm144970 (XP_002575547.1), Sm145420 (CCD79353.1), Sm145460 (XP_002575652.1), Sm149930 (CCD79088.1), esta última com dois epítopos selecionados (1- região interna, 2- região externa) conforme apresentado na tabela 1. Tabela 1: Epítopos selecionados das proteínas de membranas

Além disso, foí verificado também, usando o programa SYFPEITHI, o número de HLAs que se ligam aos epítopos selecionados das proteínas alvo. Cada coluna representa o percentual de ligação, de pelo menos parte, doepítopo selecionado aos vários HLAs Dos dez epítopos selecionados, sete apresentaram percentual de ligação superior a 80%, como mostrado na figura 6. Na figura, cada coluna representa o percentual de ligação de pelo menos parte do epítopo selecionado aos vários HLAs (DRB1 0101, DRB1 0301, DRB1 0401, DRB1 0701, DRB1 1101 e DRB1 1501) pelo programa SYFPEITHI.

Após a seleção, os dez epitopos foram sintetizados através do método de fase sólida e purificados por cromatografia liquida de alta definição. No método de síntese de peptídeos, os compostos de sequência de amínoácidos QDIFALIPAAEIRAL (1) e GFGLTVANHIRAGRD (2) são preparados através de metodologia de síntese de peptídeos em fase sólida. A síntese é realizada utilizando resina RINK AMIDE MBHA 0,1 mmol em sintetizador automático Protein Technologies modelo PS3. Sequências de acoplamento são realizadas com reação do aminoácido com grupo protetor Fmoc na sequência inversa [LARIEAAPILAFDIQ para (1) e DRGARIHNAVTLGFG para (2)] com base N- metilmorpholina (NMP) em solvente N.N-dimetilformamida (DMF) e agente de acoplamento HCTU [(2-(6-Chloro-1 H-benzotriazole-1 -yl)-1,1,3,3-tetramethyla- minium hexafluorophosphate)]. Para cada sequência de acoplamento é necessária uma sequência de desproteção que é realizada com 4- metilpiperidina. Para a clivagem da resina é utilizado um coquetel contendo: ácido trifluor acético (TFA) 92,5%, etanoditiol (EDT) 2,5%, triisopropilsilano (TIS) 2,5% e água deionizada 2,5%. Após clivagem da resina, o resíduo contendo é evaporado em evaporador rotativo seguido de precipitação em éter etílico. O precipitado é filtrado e purificado utilizando extração em fase sólida com sílica gel C18 e liofilizado no final do processo. Os peptídeos são analisados através de espectrometria de massas.

Após essa fase, os epítopos foram testados in vivo como um coquetel de imunógenos em ensaios vacinais utilizando camundongos C57Black para a verificação da proliferação de linfócitos TCD4 e utilizados para avaliar a sua interação com moléculas de MHC de classe II humanas e de camundongos, através de analises in silico.

Um grupo de dez animais foi imunizado com três doses subcutâneas em intervalos de 15 dias com um coquetel contendo os epítopos selecionados. Osanimais foram imunizados com um coquetel contendo 10pg de cada epítopo diluídos em 100 pl de PBS, sendo que na primeira imunização receberam 100 pl de adjuvante de Freund completo (Sigma) e nas imunizações subsequentes receberam 100 pl de adjuvante de Freund incompleto (Sigma). O mesmo procedimento foi realizado com um segundo grupo de animais, que recebeu apenas PBS, sem adição dos epítopos.

Uma semana após a última imunização os animais foram sacrificados para avaliação da proliferação de linfócitos TCD4 provenientes do baço, em resposta a reestimulação in vitro com cada epítopo isoladamente. Para isso, estes órgãos foram retirados dos camundongos imunizados, macerados e as hemácias lisadas com tampão de lise (0,15M NH4CI, 1M KHCO3, 0,1M Na2EDTA). Após várias lavagens com solução salina estéril e centrifugações, as hemácias lisadas foram separadas dos esplenócitos, que foram ressuspendidos em meio RPMI (Gibco) completo contendo 10% de soro fetal bovino (Gibco) e 1% penicilina/streptomicina (Gibco). As células foram ajustadas para uma concentração de 107 células/ml e a esse volume foi adicionado fluorocromo 7,5 pM CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) (Sigma). Em seguida os tubos foram centrifugados e as células ressuspendidas em meio RPMI completo ficando aproximadamente cerca de 5x105 das células marcadas por poço. O experimento foi realizado em duplicata.

Os epítopos na concentração de 10 pg/ml foram adicionados isoladamente aos poços de cultura para estimularem a proliferação celular. Como controle do experimento, os esplenócitos marcados foram estimulados com meio RPMI completo ou com ConA (Concanavalina A) na concentração final de 5 pg/ml. As placas foram então incubadas em estufa contendo 5% de CO2 a 37° C por um período de 72 horas ou 120 horas.

Após o período de incubação, linfócitos TCD4 com CF3E da cultura de esplenócitos foram marcados para análise da proliferação específica dessas células. As culturas de esplenócitos foram centrifugadas e o sobrenadante descartado, as células foram então incubadas com anticorpos 0,2 mg/mL anti- CD16/CD32 (BD-bioscience). Em seguida, as células foram incubadas com 0,2 mg/mL de anticorpos anti-CD4 biotinilados (BD-bioscience) e posteriormenteligados a estreptavidina conjugada ao fluorocromo aloficocianina (APC) na proporção de 1:200. Todos os anticorpos e a estreptavidina conjugada foram diluídos em PBS, 0,5% soro albumina bovina (BSA) e 2 mM azida sódica antes de serem adicionados aos poços. As células foram então fixadas com formaldeído 2% diluído em PBS e em seguida armazenadas a 4o C.

Após a marcação, a proliferação dos linfócitos TCD4 foi realizada no citômetro de fluxo FACScalibur.Os dados gerados pela citometria foram analisados pelo programa FlowJo 7.6.5 (Tree Star, Inc., Oregon, USA).

As análises estatísticas foram realizadas através do programa Graphpad Prism 5.0 (San Diego, Ca, USA), através de análise de variância (ANOVA), seguida dos testes de comparações múltiplas de Dunnet.

Os leucócitos foram separados em áreas de acordo com suas características físicas, tamanho (FSC) versus granularidade (SSC), para a seleção das populações linfocitárias de interesse.Em seguida, os linfócitos TCD4 foram selecionados nessas áreas, através da intensidade da fluorescência emitida pela estreptavidina conjugada ao fluorocromo APC, utilizando-se gráficos de distribuição da fluorescência pelo tamanho das células (FSC). Finalmente os níveis de proliferação foram registrados através da diminuição da fluorescência do CFSE contido nos linfócitos TCD4, após cada ciclo de divisão celular. Para cada uma das análises o programa forneceu as frequências em porcentagem das células de interesse contidas nas áreas selecionadas (Figura 7). A figura 7-A mostra a população de linfócitos separados de acordo com o tamanho (FSC) versus granularidade (SSC), a figura 7-B, os linfócitos CD4 separados de acordo com o tamanho (FCS) versus marcação positiva com fluorocromo APC e a figura 7-C mostra o nível de proliferação dos linfócitos TCD4 detectado pela diminuição da fluorescência do CFSE, área destacada em vermelho mostra a percentual de proliferação.

Os níveis de proliferação dos linfócitos TCD4 marcados e estimulados com os dez epítopos isoladamente foram expressos pelo programa FlowJo 7.6.5 em porcentagem de proliferação celular e comparados simultaneamente com o controle negativo.Os resultados revelaram que apesar de ocorrer maior proliferação de linfócitos nas culturas de 120 horas em relação às culturas de72 horas quando comparados com o controle negativo, alguns epítopos estimularam elevada proliferação em ambas as culturas. As análises estatísticas (ANOVA/Dunnett) revelaram proliferações significativas estimuladas pelo epítopo 10 proveniente da proteína Sm141290 na cultura de 72 horas e pelo epítopo 7 proveniente da proteína Sm050890 na cultura de 120 horas (Figura 8). A figura 8-A mostra a cultura celular de 72 horas, e a figura 8- B, a cultura celular de 120 horas. Proliferações estatisticamente significantes (P <0.05) entre os grupos E e o controle negativo (meio) são indicadas pelos asteriscos,

O próximo passo foi a obtenção das estruturas tridimensionais otimizadas das moléculas de MHCII e dos peptideos selecionados.

Dentre as moléculas de MHC II selecionadas, foram encontradas no PDB cinco estruturas disponíveis (código PDB: 1MUJ, 1DLH, 1A6A, 2SEB e 1BX2), cada uma complexada com seu respectivo ligante. As moléculas de HLA-DRB1 0701 e HLA-DRB1 1101 foram construídas por modelagem comparativa usando como moldes as estruturas crista log ráficas sobre o código PDB 3PDO e 1YMM, as quais possuem 90% e 92% de similaridade sequencial entre suas cadeias beta, respectivamente. Este percentual de similaridade é considerado muito adequado para a construção da estrutura 3D de proteínas, conferindo acurácia aos modelos construídos.Considerando que os peptideos interagem com as moléculas de HLA em sua conformação estendida, suas estruturas 3D foram construídas e otimizadas nesta conformação. Este procedimento de minimização de energia das estruturas garante que qualquer contato entre os átomos, distância de ligação, ângulos de ligação ou diedros que levem a uma estrutura energeticamente instável sejam eliminados.

Simulação do docking molecular dos peptideos com as moléculas de MHCII; A partir das estruturas 3D otimizadas das moléculas de MHCII e dos dez peptideos selecionados por bioinformática, foram realizados o re-docking do peptídeo para validar a simulação do docking molecular. Os valores de RMSD das estruturas dos peptideos complexados com as moléculas de MHCII determinados antes e após o redocking foram baixos, como podem ser exemplificados usando o peptídeo da molécula de HLA-DRB1 1501 e damolécula de H-2 l-Ab em que os valores de RMSD referentes aos átomos pesados foram de 1.07 A e 1,58 A, respectivamente O limite de RMSD de 2 A é frequentemente utilizado como indicativo de uma adequada predição da conformação de ligação. Como pode ser observado na Figura 9 (9-A mostra a molécula de HLA DRB1 1501, e 9-B, a molécula H-2 l-Ab), ocorreu boa sobreposição da conformação do ligante que foi submetido ao redocking molecular quando comparado com a estrutura cristalográfica otimizada, demonstrando que esta metodologia está adequada para determinar a interação dos peptídeos com as moléculas de MHCII.

Após a realização do redocking, prosseguiu-se com o docking molecular de cada um dos dez peptídeos com todas as moléculas de MHC II acima mencionadas. Foram avaliados os valores de energia de ligação dos peptídeos contra moléculas de MHCII humanas e murino para cada um dos peptídeos a todos os HLAs. Verificou-se que o peptídeo 10 obteve grande destaque por possuir média da energia de ligação aos HLAs de -8,1 Kcal/mol e energia de ligação de -8,9 Kcal/mol à molécula de l-Ab, indicando maior afinidade deste epítopo pelas moléculas de MHC de classe II, tanto humana quanto de camundongos.

Na figura 10 estão apresentados os valores da média da energia de ligação dos peptídeos com as moléculas de HLA e os valores da energia de ligação dos peptídeos com a proteína de l-Ab foram correlacionados com a capacidade de cada peptídeo estimular a proliferação de linfócitos in vitro. A figura 10-A mostra a média da energia de ligação (kcal/mol) dos peptídeos às moléculas de HLAs vs. estimulação de linfócitos, e a figura 10-B, a energia de ligação (kcal/mol) dos peptídeos à molécula de H-2 l-Ab vs. estimulação de linfócitos. Os coeficientes de correlação foram de 0,83 e 0,71, respectivamente, como mostra a figura 10A e 10B, após a eliminação dos valores dos epítopos da proteína Sm141730 na figura 10A e da proteína Sm149930.2 na figura 10B por serem considerados como outliers. Além disso, como também pode ser observado, há a formação de dois grupos de peptídeos de valores próximos. Um desses grupos esta relacionado a peptídeos que tiveram alta capacidade de estimulação de linfócitos e valores de energia de ligação mais negativos (epítopo 10 proveniente da proteína Sm141290 e 2 proveniente da proteína Sm149930) e o outro a peptídeos de baixa capacidade de estimulação e valores menos negativos de energia de ligação.

Após o procedimento de docking molecular, o potencial eletrostático foi calculado para a molécula de MHC classe II l-Ab e para todos os peptídeos usando o programa Autodock Vina. Uma superfície de potencial eletrostático foi gerada para verificar se a região de ligação na molécula de MHC II apresenta uma complementaridade eletrostática entre a superfície de potencial do ligante e a do receptor. Estes dados foram correlacionados com a energia de ligação obtida após o docking e com os resultados experimentais.

A região de ligação na molécula de MHC apresenta uma complementaridade eletrostática entre a superfície de potencial do ligante e a do receptor, como observado no mapa de potencial eletrostático da molécula de MHC II l-Ab e do ligante CLIP (Class Il-associated invariant chain peptide) obtidos do PDB (código PDB 1MUJ) (Figura 11). O receptor mostra duas regiões com polaridades contrárias. A Figura 11-B apresenta a vista inferior do ligante, ou seja, a região que entra em contato com as regiões de ligação da molécula de MHC (Figura 11-A). A região em azul apresenta potencial positivo, interagindo fortemente com a parte vermelha do receptor, cuja cavidade apresenta potencial negativo intenso. Entretanto, a outra extremidade do epítopo apresenta polaridade negativa, dessa forma interagindo com o potencial positivo do receptor.

O mapa de potencial eletrostático do epítopo 10, proveniente da proteína Sm141290 e que obteve melhores resultados experimentais e teóricos, está representado na Figura 12-A, onde se verifica uma distribuição semelhante àquela encontrada no ligante CLIP, obtido do PDB, apresentando complementaridade eletrostática com a região de interação da molécula de MHC II l-Ab. Um mapa de potencial eletrostático semelhante a este foi encontrado no peptídeo 2, proveniente da proteína Sm149930.1 (Figura 12-C). Entretanto, observando o mapa de potencial eletrostático dos demais epítopos percebe-se uma distribuição diferente daquela do ligante obtido do PDB, como pode ser exemplificado observando o epítopo 9, proveniente da Sm 145460, nafigura 12-B, que apresentou afinidade reduzida pelo MHC II e também apresenta uma região volumosa que impede uma ancoragem adequada nesta molécula de MHC.

Os resultados até aqui obtidos mostram que dois epítopos se 5 destacaram nos ensaios in vitro (epítopo 7 e 10) e dois se destacaram nas analises in silico de docking molecular (epítopos 2 e 10). Por se tratar de um controle o epítopo 2 foi descartado e apenas os epítopos 7 e 10 foram testados quanto à proteção induzida.Ensaios preliminares indicaram que os dois epítopos em conjunto foram capazes de induzir 44% de proteção em 10 camundongos infectados com cercarias.

Os presentes epítopos aqui selecionados e testados podem ser utilizados como alvos vacinais, individualmente ou em conjunto, na forma de um coquetel. Uma vacina contra a esquistossomose tem sido alvo de estudos há muito tempo, e os epítopos em questão são de grande relevância para que 15 esta vacina seja uma realidade.

Claims (6)

1.Utilização de epítopos como alvos vacinais contra a esquistossomose, caracterizado pela sequência como definida na SEQ ID NO: 1, ocupando a posição 44 ao 58 da proteína Sm050890, localizada na membrana de Shistosoma mansoni.

2.Utilização de epítopos como alvos vacinais contra a esquistossomose, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por sua capacidade de induzir resposta imune contra a esquistossomose.

3.Utilização de epítopos como alvos vacinais contra a esquistossomose, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pela sua utilização como alvo vacinai.

4.Utilização de epítopos como alvos vacinais contra a esquistossomose, caracterizado pela sequência como definida na SEQ ID NO: 2, ocupando a posição 225 ao 239 da proteína Sm141290, localizada na membrana de Shistosoma mansoni.

5.Utilização de epítopos como alvos vacinais contra a esquistossomose, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por sua capacidade de induzir resposta imune contra a esquistossomose.

6.Utilização de epítopos como alvos vacinais contra a esquistossomose, de acordo com as reivindicações 4 e 5, caracterizado pela sua utilização como alvo vacinai.

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