BR112015015539B1 - Vacinas monovalentes e polivalentes contra leishmania - Google Patents

Abstract

vacinas monovalentes e polivalentes contra leishmania. a presente invenção refere-se a compostos peptídicos, mono ou poliepitópicos de sequências seq id no 1 a 16, assim como os respectivos derivados análogos, muteínas e homólogos, destinados à prevenção e ao tratamento das leishmanioses nos mamíferos e, em particular, no homem, nos canídeos, nos felinos e nos equinos. mais particularmente, a invenção se refere igualmente às vacinas que compreendem esses compostos peptídicos em condições que assegurem uma imunização, levando a uma proteção eficaz do homem ou do animal vacinado contra uma ou várias leishmanias.

Description

[001] A presente invenção refere-se a compostos peptídicos mono- ou multiepitópicos destinados à prevenção e ao tratamento das leishmanioses nos mamíferos e, em particular, no Homem, nos cães, nos felídeos e os equinos. Mais particularmente, a invenção refere-se também às vacinas compreendendo esses compostos peptídicos em condições, assegurando uma imunização, levando a uma proteção eficaz do homem ou do animal vacinado contra uma ou várias leishmanias.

[002] As grandes endemias parasitárias são, de muito longe, as causas as mais importantes de morbidez e de mortalidade não somente para a espécie humana, mas para todas as outras espécies animais tanto domésticas quanto selvagens.

[003] As leishmanioses estão dentre as mais graves infecções parasitárias afetando o Homem no mundo. Trezentos e cinquenta milhões de indivíduos são expostos em oitenta e oito países repartidos em quatro dos cinco continentes e dezesseis milhões dentre eles são portadores do parasita. Elas são responsáveis por um largo espectro de manifestações clínicas (cutânea, muco-cutânea e visceral).

[004] A leishmaniose visceral (LV) é causada pelos parasitas do complexo Leishmania donovani, (Leishmania infantum, Leishmania chagasi, e L. dovani) que são parasitas intracelulares do macrófago. Contrariamente às outras espécies de Leishmania causando as formas cutâneas da doença (L. major, L. brasiliensis,...) as leishmanias do complexo donovani apresentam uma capacidade para se disseminar no conjunto dos órgãos onde se multiplicam. Os pacientes atingidos de LV apresentam então uma tabela clínica associando uma febre moderada, mas persistente, uma hepatosplenomegalia e uma pancitopenia que leva geralmente ao luto, caso nenhum tratamento específico seja iniciado suficientemente de modo rápido.

[005] Mesmo se a LV à L. infantum/chagasi é um problema importante na Europa do Sul com a extensão da pandemia da AIDS e aparecimento de um número crescente de coinfecções Leishmania/HIV, ela está longe de ser controlada e se torna muito preocupante em termos de problema de saúde pública nos países da América do Sul. Em outras partes do mundo, notadamente nas zonas de endemia à L.donovani ,ela atinge aproximadamente um quinto da população no Sudão e na Índia, onde epidemias mortais fizeram centenas de milhares de vítimas nesses últimos decênios. Além disso, a situação se torna crítica na Índia com a emergência de cepas resistentes aos derivados pentavalentes do antimônio (medicamentos de primeira intenção).

[006] A incidência anual das leishmanioses humanas é estimada entre 2 e 2,5 milhões de novos casos, dentre os quais mais de 500 000 foram atingidos de leishmaniose visceral e 1,5 a 2 milhões de leishmanioses cutâneas das quais determinadas são muito desfigurantes e mutilantes como as leishmanioses muco-cutâneas (LMC). Isto tem por consequência uma morbidez global superior a dois milhões de DALYs (para Disability Adjusted Life Years) e a morte de aproximadamente sessenta mil pessoas a cada ano. Essas doenças constituem ainda hoje um verdadeiro problema de saúde pública na América Latina, na Ásia, na África e no sul da Europa. Suas consequências em numerosas regiões do mundo constituem um handicap maior ao desenvolvimento dos países os mais pobres. Além disso, o efeito global das mudanças ambientais (antrópicas e climáticas) leva, seja a um aumento da incidência (doenças "reemergentes" e incontroladas em numerosas regiões do mundo), seja a uma extensão geográfica (doenças "emergentes" notadamente no norte da Europa e na América do Norte) dessas doenças parasitárias. Elas permanecem, todavia, desprezadas pela pesquisa médica, os financiadores, a opinião pública e as instâncias políticas dos países gravemente atingidos.

[007] A leishmaniose visceral atinge também a população canina, que constitui um reservatório de parasitas aprovisionando, de maneira contínua o ciclo de transmissão. Ela é devido a L. infantum / chagasi, espécie responsável por uma zoonose dos cães domésticos e selvagens largamente difundida no mundo. Ela afeta milhões de cães na Europa, Ásia , África do Norte e América do Sul. Os cães sintomáticos, mas também assintomáticos constituem uma fonte de parasitas para a transmissão da LV no Homem.

[008] As medidas de prevenção contra as leishmanioses são numerosas. Durante muito tempo elas foram baseadas na luta contra o inseto vetor e o objetivo principal, visava controlar sua multiplicação pela utilização de inseticidas e evitar o contato entre o vetor (flebotoma) e seus hospedeiros (cão, Homem,...). O controle das leishmanioses, uma vez diagnosticadas, passa também pelos tratamentos quimioterapêuticos. Estes são infelizmente colocados em perigo por um arsenal terapêutico muito limitado, tratamentos longos, tóxicos e onerosos, acompanhando-se de numerosos casos de nova queda e pela emergência dos fenômenos de quimiorresistência. Na ausência de tratamentos eficazes e tornando-se a amplidão do problema, torna-se, portanto, necessário colocar à disposição das populações as mais gravemente atingidas pelos meios de prevenção aplicáveis em grande escala, dos quais o mais adaptado seria a vacinação.

[009] Vários argumentos são à favor da fabricação de uma vacina no Homem. O fato de um indivíduo vivo na zona de endemia poder desenvolver uma forte resistência à leishmaniose cutânea, em sequência à injeção voluntária de uma pequena quantidade de parasitas vivos mostrou muito rapidamente que a vacinação contra essas parasitoses era possível no homem. Embora extremamente eficaz (mais de 80 % de proteção), essa prática , utilizando promastigotos de L. Mayor, ainda denominada "leishmanização", foi durante muito tempo utilizada, notadamente no Oriente Médio. Ela foi na sequência abandonada por razões éticas e securitárias. Com efeito, ela provocava formas graves de leishmaniose em 2 a 3 % dos indivíduos (Ferrua et al., Vaccine 2006). Além disso, foi então bem estabelecido que, em sequência à infecção por leishmanioses, a maioria dos indivíduos imunocompetentes desenvolve infecções subclínicas ou assintomáticas mais do que uma forma severa de leishmaniose (sintomática), e dessa forma, adquire uma imunidade robusta e durável à reinfecção. O mesmo acontece nos indivíduos que controlaram uma leishmaniose cutânea ou após uma leishmaniose visceral curada.

[0010] Apesar disso, no Homem, nenhuma vacina está atualmente disponível contra as leishmanioses. Na realidade, só uma abordagem pragmática utilizando parasitas inteiros mortos foi tornada possível nesse dia. Historicamente, as vacinas de primeira geração, baseadas na utilização de parasitas inteiros atenuados ou mortos (notadamente autoclavados) combinados ou não a adjuvantes, tinham por finalidade de proteger principalmente contra as leishmanioses cutâneas , tentando reproduzir os níveis de proteção obtidos com os parasitas vivos.

[0011] Todavia, os numerosos testes clínicos feitos em milhares de indivíduos na América do Sul mas também no Irã deram resultados mais do que mitigados, até mesmo decepcionantes (Modabber, International Journal of Antimicrobial Agents, 2010; Evans e Kedzierski, Journal of Tropical Medicine, 2012).

[0012] As infecções experimentais no rato, notadamente a cepa murina BALB/ c submetida a muitas espécies de leishmanioses, foram e ainda são muito utilizadas para avaliar a eficácia de uma vacina candidata, notadamente ao encontro de uma leishmaniose visceral. Numerosas vacinas com subunidades constituídas de proteínas nativas purificadas (vacina de primeira geração) ou recombinantes (vacina de segunda geração) foram assim testadas (Goto et al., clinical and Vaccine Immunology, 2011). Determinadas vacinas candidatas conferiram um bom nível de proteção ao encontro de uma infecção experimental no rato. As proteções podiam, atingir até 81 % segundo o antígeno e o adjuvante. Mais recentemente, as vacinas ADN, ditas de terceira geração, mais fáceis de produzir, mais estáveis e mais imunogênicas foram desenvolvidas com as sequências nucleotídicas codificando para as proteínas utilizadas nas vacinas de segunda geração (Gurunathan et al., Nature Med., 1998; Dumonteil et al., Vaccine, 2003; Rafati et al, Vaccine, 2005; Rodriguez-Cortes et al, Vaccine, 2007). Enfim, outras pistas vacinais foram exploradas com sucesso no rato como as vacinas à base de antígenos presentes na saliva do flebotoma (Morris et al, J. Immunol., 2001; Valenzuela et al., J. Exp. Biol., 2004) que permitiram obter uma relativa resistência à infecção experimental à leishmaniose major.

[0013] Atualmente, poucas vacinas candidatas ultrapassaram o estágio experimental (modelos ratos ou hamsters) em razão da dificuldade a desenvolver um modelo animal apropriado reproduzindo as características da doença humana e utilizar testes clínicos nos hospedeiros naturais da infecção que necessitam dos coortes importantes, das infraestruturas pesadas e que podem levar anos antes de dar um resultado definitivo. Além disso, é difícil extrapolar diretamente resultados obtidos no rato com hospedeiros naturais da infecção, tais com o cão ou o Homem. Enfim, as respostas imunitárias protetoras que controlam uma infecção de prova podem não refletir aquelas requeridas para prevenir as leishmanioses em zonas endêmicas.

[0014] Dois candidatos vacinais estão em curso de desenvolvimento clinico: - a Leish 111 f MPL SE du Infections Disease Research Institute (IRDI) em Seattle é uma vacina quimérica denominada LEISH-F1 constituída de 3 proteínas recombinantes em fusão (TSA- LmSTI1-LeIF) formuladas com o lipídeo monofosforilado e o esqualeno em uma emulsão estável (MPL-SE). Todavia, se a proteção contra a leishmaniose cutânea parece em boa via, um estudo feito na Itália em uma estação experimental mostra claramente que Leish-111 f MPL-SE não protege cães expostos a uma infecção natural a L.infantum (Gradoni et al, Veterinary Research, 2005; Gradoni, Veterinary Research, 2006). Em um estudo mais recente realizado no Brasil, essa vacina se revelou eficaz em imunoterapia para os casos leves de LV canina, mas sem efeito em cães gravemente doentes (Trigo et al, Clinical and Vaccine Immunology, 2010); - O HASP + KMP-11 da Universidade de York (Grã Bretanha) sobre o qual os primeiros testes clínicos deveriam acionar no fim de 2012.

[0015] No cão, existe até hoje uma solução eficaz, CaniLeish® que é um produto composto de antígenos de excreção secreção (AES) de promastigotos de L.infantum e comercializado na Europa a partir de 2011. A Leishmaniose canina vê assim suas medidas preventivas profundamente modificadas e completadas.

[0016] A vacinação controla não somente o desenvolvimento da doença, mas diminui tão significativamente a carga parasitária no cão e contribui assim a interrupção do ciclo de transmissão da LV no flebotoma (vetor da doença), no cão e no Homem.

[0017] Todavia, os rendimentos de produção dos AES não são suficientes para permitir uma produção na escala industrial de uma vacina humana. Com efeito, a produção de AES é bastante complexa e induz um produto com preço muito elevado, adaptado a um mercado canino bastante reduzido.

[0018] Assim, uma das dificuldades principais no desenvolvimento de um candidato vacinal reside no fato de o produto final dever ser reprodutível, termoestável e fácil de produzir com baixo preço nas zonas de endemia, com rendimentos de produção, tornando possível sua utilização em grande escala.Com efeito, os resultados de um estudo recente, visando a avaliar a rentabilidade econômica de uma vacina contra a leishmaniose visceral no estado do Bihar (India) comparativamente à quimioterapia, se baseiam muito no prosseguimento do desenvolvimento de uma vacina contra a LV, mesmo se seu custo se mostrasse relativamente elevado (Lee et al, Am. J. Trop. Med. Hyg., 2012).

[0019] Considerando-se o que precede, existe nesse dia uma necessidade urgente de investir em novas pistas, propondo uma alternativa mais eficaz nas vacinas existentes, a fim de permitir a vacinação profilática e/ou terapêutica de pacientes contra as leishmanioses, notadamente os pacientes resistentes às terapias existentes.

[0020] A requerente colocou em evidência novos epitopos que apresentam um elevado poder imunógeno contra as leishmanioses, permitindo o desenvolvimento de vacinas eficazes e financeiramente acessíveis.

[0021] Assim, a solução para o problema apresentado tem por primeiro objeto um epitopo que apresenta uma sequência escolhida dentre: SEQ ID NO: 1: T-P-E-Q-R-T-N-T-L (epitopo HLA-B07); SEQ ID NO: 2: E-L-G-K-K-W-I-G (epitopo HLA-B08); SEQ ID NO: 3: T-L-P-E-M-P-V-G-V (epitopo HLA-A02); SEQ ID NO: 4: P-E-M-P-A-G-V-D-Y (epitopo HLA-A01); SEQ ID NO: 5: A-R-G-R-E-G-Y-F-L (epitopo HLA-B27); SEQ ID NO: 6: A-R-G-A-R-G-R-E-G-Y (epitopo HLA-B44); SEQ ID NO: 7: A-R-G-A-R-G-R-E-G (epitopo HLA—B27); SEQ ID NO: 8: E-G-Y-F-V-T-D-E-K (epitopo HLA-A03); SEQ ID NO: 9: T-N-T-L-A-V-L-Q-A-F-G-R-A-I-P-E-L-G-K-K-W; SEQ ID NO: 10: E-G-Y-F-V-T-D-E-K-T-G-L-V-Y-R-D-G-G-V-A-A-A-S- S-G; SEQ ID no 15: X1-X2-P-E-M-P-X3-G-V-X4-X5 com X1 = T ou nenhum aminoácido X2 = L ou nenhum aminoácido X3 = A ou V X4 =D ou nenhum aminoácido; X5 = Y ou nenhum aminoácido; ou SEQ ID no 16: A-R- X6- X7 - X8- G - R- E- G - X9 - X10 - X11 com X6 = G ou nenhum aminoácido X7 = A ou nenhum aminoácido X8 = R ou nenhum aminoácido X9 = Y ou nenhum aminoácido X10 = F ou nenhum aminoácido X11 = L ou nenhum aminoácido

[0022] A fim de responder à necessidade de uma vacina que assegura uma boa cobertura da população mundial e protegendo contra as principais espécies de leishmaniose, a Requerente considerou a importância de propor uma estratégia vacinal inovadora baseada em fragmentos antigênicos / peptídicos capazes de ativar, de forma durável, a imunidade celular específica dirigida contra esses parasitas. A estratégia vacinal peptídica da Requerente se baseia na identificação e a seleção de peptídeos imunodominantes portados pela sequência de uma proteína de virulência caracterizada como o imunógeno maior dos antígenos excretados-secretados pelas leishmanias, a proteína PSA (para Promastigote Surface Antigen) solúvel (princípio ativo principal da vacina CaniLeish®), comum e muito conservada no meio das espécies de leishmanioses, responsáveis pelas diferentes infecções humanas.

[0023] A vacinação peptídica se fundamenta nas bases moleculares e celulares da identificação do antígeno pelas células T. A colocação da imunidade específica depende para uma larga medida da degradação e da associação dos fragmentos antigênicos, peptídeos, às moléculas do Complexo Maior de Histocompatibilidade (CMH;HLA, do inglês human leukocyte antigen, para o Homem). Essa associação é tornada específica de uma molécula HLA particular por resíduos aminoácidos constituindo os motivos de fixação do peptídeo. Os complexos assim formados são reconhecidos pelos linfócitos T pelo intermediário de um receptor membranário (TcR) e necessita de uma interação específica com determinados aminoácidos do epitopo T. Os epitopos T são ligantes das moléculas HLA com afinidades fortes ou moderadas. Eles são apresentados aos linfócitos T CD8+ (citotóxicos) ou CD4+ (auxiliares) pelas moléculas HLA respectivamente de classe I ou de classe II.

[0024] A formação desses complexos trimoleculares (TcR/HLA/peptídeo) é o pré-requerido à ativação e à expansão das células T específicas e, portanto, à indução de uma resposta imunitária protetora, quando de uma infecção.

[0025] O interesse desses peptídeos é múltiplo: (i) exibem um elevado nível de segurança, dado que impedem qualquer risco de infecção associado com o uso de agentes patogênicos ou agentes infecciosos, (ii) são quimicamente bem definidos e, assim, atendem aos requisitos farmacêuticos (especialmente pureza, reprodutibilidade), (iii) facilitam o controle da resposta imune induzida (detecção de linfócitos T citotóxicos (CTL) dirigidos contra um epitopo T definido), e (iv) a sequência dos mesmos pode ser modificada, de modo a tornar os mesmos mais imunogênicos.

[0026] Esses peptídeos respondem, de forma notável ao conjunto das condições citadas anteriormente: vacina reprodutível, termostável facilitando sua conservação e seu transporte polivalente, fácil de produzir a baixo preço nas zonas de endemia, tornando possível sua utilização em grande escala.

[0027] De acordo com a invenção, entende-se por epitopo, composto peptídico ou peptídeo, qualquer epitopo, composto peptídico ou peptídeo definido por sua sequência, assim como seus derivados análogos, muteínas e homólogos.

[0028] Os epitopos sendo compostos peptídicos que apresentam aproximadamente 8 a 15 aminoácidos, emprega-se, portanto, indiferentemente, o termo "composto peptídico" para designar um epitopo ou um composto peptídico para designar um epitopo ou um composto peptídico.

[0029] De acordo com a invenção, entende-se por "derivado análogo" ou "derivados muteínas" de um composto peptídico, os derivados biologicamente ativos das moléculas de referência que apresentam a atividade desejada, a saber: a capacidade de estimular uma resposta imunitária de mediação celular.

[0030] De forma geral, o termo "derivado análogo" se refere a compostos que têm uma sequência e uma estrutura polipeptídica que apresenta uma ou várias adições, substituições e/ou deleções de aminoácido, em relação aos compostos peptídicos definidos acima, à medida que as modificações não destroem a atividade imunógena.

[0031] Entende-se pelo termo derivado muteína os peptídeos apresentando um ou vários elementos que imitam o peptídeo.

[0032] Processos de preparo de análogos e de muteínas polipeptídicos clássicos são conhecidos do técnico.

[0033] De acordo com a invenção, os análogos particularmente preferidos incluem as substituições conservadoras, isto é, as substituições ou substituição sem consequências sobre a função e a estrutura final da proteína.

[0034] A título de exemplos dessas substituições , podem-se citar as substituições que intervêm: - na família de aminoácidos composta do aspartato e do glutamato; - a família de aminoácidos básicos composta da lisina, da arginina e a histidina; - a família de aminoácidos não polares composta da alanina, da leucina, da isoleucina, da prolina, da fenil alanina, da metionina e do triptofano; e - a família dos aminoácidos não carregados polares, tais como a glicina, a asparagina, a glutamina, a cisteína, a serina, a treonina e a tirosina.

[0035] Por exemplo, considerando-se o fato de, de um ponto de vista estérico e físico-químico, a valina está próxima da alanina; a substituição de uma pela outra não perturba geralmente o funcionamento da proteína.

[0036] O técnico poderá facilmente determinar as regiões dos compostos peptídicos de interesse, podendo tolerar uma mudança por técnicas bem conhecidas.

[0037] Para isto, ele poderá, por exemplo, utilizar matrizes de similaridade, M, que recenseiam o conjunto dos escores M(a,b) obtidos quando se substitui o aminoácido a pelo ácido b em uma sequência de tamanho 20 x 20, para os 20 aminoácidos, com modos de construção diferentes.

[0038] Dentre os mais clássicos, podem-se citar as matrizes de Dayhoff, denominadas PAM para "probability of acceptable mutations", baseadas em distâncias evolutivas entre espécies e as matrizes de Henikoff, denominadas BLOSUM, baseadas no conteúdo em informação das substituições.

[0039] Em cada família, existem várias séries de matrizes, de estringência variável, e, portanto, mais ou menos tolerantes às substituições de aminoácidos.

[0040] Um diagrama de Venn pode também ser utilizado para colocar em evidência as relações existentes entre os 20 aminoácidos de origem natural em função de uma seleção de propriedades físico- químicas, consideradas como importantes na determinação da estrutura das proteínas.

[0041] De acordo com a invenção, entendem-se por "derivado homólogo" compostos peptídicos que apresentam uma certa percentagem de identidade peptídica. O termo "identidade" significa que os aminoácidos de duas sequências peptídicas comparadas correspondem exatamente. A percentagem de identidade se determina por uma comparação direta das sequências entre dois compostos peptídicos, alinhando essas sequências e computando o número exato de descasamento entre as duas sequências alinhadas. Em seguida, divide-se pelo comprimento da sequência a mais curta e multiplica-se o resultado por cem. A percentagem de identidade pode também ser determinada com o auxílio de programas de computadores bem conhecidos do técnico, tais como Dotlet, produzido pela sociedade Dotplot, Clustal X e W, tais como descritos na publicação Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG: The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res 1997, 25 (24): 4876-4882 ou ainda Morgenstern B, tal como descrito na publicação DIALIGN 2: improvement of the segment-tosegment approach to multiple sequence alignment. Bioinformations 1999, 15 (3): 211-218.

[0042] A base BLOCKS (Henikoff et Henikoff, 1991) dá sob a forma de alinhamentos múltiplos sem interseção-deleção (ou blocos) as subsequências de Swissprot que correspondem a regiões conservadas.

[0043] Assim, de acordo com a invenção, duas sequências peptídicas são ditas "sensivelmente homólogas, uma em relação à outra, desde que elas apresentem pelo menos 50 %, de preferência pelo menos 75 %, de preferência ainda pelo menos 85 %, de preferência ainda pelo menos 90 % e mais preferido pelo menos 95 % ou mais de identidade de sequência em um comprimento definido das moléculas peptídicas.

[0044] Além disso, de forma vantajosa, os epitopos ou compostos peptídicos objeto da invenção são ligados a portadores que permitem torna-los mais imunógenos. A título de exemplo não limitativo do portador, podem-se citar as moléculas KLH para Keyhole Limpet Hemocyanin, os lipopeptídeos de tipo palmitoil, ou seus derivados.

[0045] As modificações as mais comuns de proteínas por lipídeos são: a isoprenilação, a N-miristoilação, a palmitoilação (ou (S-acilação) e a glipiação.

[0046] A isoprenilação e a N- miristoilação são modificações cotraducionais ou imediatamente pós- traducionais e o grupamento que é ligado ao resto até a degradação da proteína.

[0047] A palmitoilação é pós-traducional. Essa modificação é reversível e mais rápida que o "turn-over" da degradação das proteínas: ela pode, portanto, ser regulada. A glipiação é co- e pós- traducional.

[0048] Os peptídeos, de acordo com a invenção, são preferencialmente peptídeos palmitoilados, pois esses derivados interagem com os componentes lipídicos da membrana das células alvos, que são, por exemplo, os macrófagos, as células dendríticas ou ainda os neutrófilos, favorecem sua penetração e os veiculam no interior destas para apresenta-los ao sistema imunitário.

[0049] Podem-se também citar os peptídeos glicosilados como, por exemplo, os conjugados manosilados e as construções MAPs, para Multiple Antigenic Peptides.

[0050] Os epitopos objetos da invenção podem, além disso, conter um ou vários grupamentos protetores.

[0051] Com efeito, de modo a melhorar a resistência à degradação, pode ser necessário utilizar uma forma protegida do peptídeo, de acordo com a invenção. A forma de proteção deve evidentemente ser uma forma biologicamente compatível e deve ser compatível com uma utilização no domínio farmacêutico. Numerosas formas de proteção biologicamente compatíveis podem ser consideradas, elas são bem conhecidas do técnico como, por exemplo, a acilação ou a acetilação da extremidade amino-terminal, ou a amidação ou a esterificação da extremidade carbóxi-terminal. Assim, a invenção se refere também a um epitopo, tal como definido anteriormente, caracterizado pelo fato de se apresentar sob a forma protegida ou não. Pode-se utilizar uma proteção baseada em uma substituição sobre a extremidade amino-terminal por um grupamento acetila, um grupamento benzoíla, um grupamento tosila ou um grupamento benzilóxi carbonila. De preferência, utiliza-se uma proteção baseada na amidação da função hidroxila da extremidade carbóxi-terminal por um grupamento NYY com Y representando uma cadeia alquila de C1a C4, ou a esterificação por um grupamento alquila.

[0052] É também possível proteger as duas extremidades do composto peptídico. Os derivados de peptídeos se referem também aos aminoácidos e os peptídeos ligados entre si por uma ligação pseudopeptídica, todos os tipos de ligações capazes de substituir as ligações peptídicas clássicas. No domínio dos aminoácidos, a geometria das moléculas é tal que elas podem teoricamente se apresentar sob a forma de isômeros ópticos diferentes. Existe, com efeito, uma conformação molecular do aminoácido (a), tal que ela desvia à direita o plano de polarização da luz (conformação dextrógira ou D-aa), e uma conformação molecular do aminoácido (aa), tal que ele desvia à esquerda o plano de polarização da luz (conformação levógira ou L-aa). Os aminoácidos naturais são sempre de conformação levógira, em consequência, um peptídeo de origem natural só será constituído de aminoácidos de tipo L-aa. Todavia, a síntese química em laboratório permite preparar aminoácidos tendo as duas conformações possíveis.

[0053] A partir desse material de base, é assim possível incorporar quando da síntese de peptídeo também aminoácidos sob a forma de isômeros ópticos dextrógiros ou levógiros. Assim, os aminoácidos que constituem o peptídeo, de acordo com a invenção, podem estar sob configuração L-, D- ou DL-.

[0054] Os epitopos e compostos peptídicos, segundo a invenção, podem ser obtidos seja por síntese química clássica (em fase sólida ou em fase homogênea líquida), seja por síntese enzimática, a partir de aminoácidos constitutivos ou de seus derivados. Os epitopos e compostos peptídicos, de acordo com a invenção, podem também ser obtidos por fermentação de uma cepa de bactérias modificadas ou não, por engenharia genética, ou ainda por extração de proteínas de origem animal ou vegetal, preferencialmente de origem vegetal, seguida de uma hidrólise controlada que libera fragmentos peptídicos correspondentes totalmente ou parcialmente aos epitopos e compostos peptídicos, de acordo com a invenção.

[0055] Conforme é mostrado nos exemplos 1 a 4, a Requerente pôde colocar em evidência que os diferentes epitopos, de acordo com a invenção, são sequências consensos comuns às principais espécies de leishmanias e apresentam uma elevada e uma média afinidade para o conjunto das moléculas do CMH (Complexo Maior de Histocompatibilidade) dos mamíferos, e mais particularmente para o conjunto das moléculas do HLA (HLA para antígenos dos leucócitos humanos), majoritariamente representadas nas populações humanas as mais gravemente atingidas por essas afecções.

[0056] Com efeito, no contexto de uma estratégia vacinal das populações humanas expostas às infecções leishmanianas e a fim de responder à necessidade de uma vacina, assegurando uma boa cobertura da população mundial e protegendo contra as leishmanioses, é importante utilizar fragmentos antigênicos / peptídicos capazes de ativar, de forma durável, a imunidade celular específica dirigida contra o parasita.

[0057] Para assegurar uma boa abrangência da população mundial e em relação à grande variabilidade do fenótipo HLA (complexo maior de histocompatibilidade humana) entre os indivíduos, os fragmentos antigênicos imunógenos (peptídeos) de comprimento suficiente devem conter uma série de epitopos aptos a serem apresentados por vários tipos de moléculas HLA de classe I e II.

[0058] As moléculas HLA são altamente polimorfos. Com efeito, existem mais de 2500 proteínas HLA de classe I (HLA-I) e mais de 1000 proteínas HLA de classe II (HLA-II). Todavia, determinadas dessas moléculas HLA, próximas em sequência e em conformação espacial, podem apresentar epitopos comuns às células T. O agrupamento de vários milhares de moléculas HLA é atualmente descrito em um pouco mais de duas dezenas de categorias, denominadas "supertipos HLA", apresentando epitopos muito conservados para cada supertipo.

[0059] Ao desenvolvimento de vacinas peptídicas, acrescenta-se a abordagem nultiepitópica ou poliepitópica (peptídeo contendo vários epitopos). Essa abordagem multiepitópica é vantajosa para desenvolver uma vacina destinada ao conjunto da população mundial. Com efeito, para assegurar uma boa abrangência da população mundial e em relação à grande variabilidade do fenótipo HLA entre os indivíduos, os fragmentos antigênicos imunógenos (peptídeos) de comprimento suficiente devem conter uma série de epitopos aptos a serem apresentados por vários supertipos de moléculas HLA-I e II.

[0060] Também, os epitopos objetos da invenção apresentam um elevado poder imunógeno.

[0061] Os epitopos T são sequências antigênicas que reconhecem os linfócitos T. Por exemplo no Homem, os epitopos T são oriundos da degradação dos antígenos pelas células apresentadoras e são apresentados aos linfócitos T CD8+ (citotóxicos) ou CD4+ (auxiliares) pelas moléculas HLA respectivamente de classe I ou de classe II. Os epitopos T são, portanto, necessariamente ligantes das moléculas HLA e fazem efetivamente parte dos peptídeos que se ligam às moléculas HLA com afinidades acentuadas ou moderadas.

[0062] As células que expressam o complexo maior de histocompatibilidade de classe II (CMH2) podem também apresentar antígenos microbianos via CD1 aos linfócitos T gama-delta.

[0063] As capacidades de apresentação dependem de numerosas variáveis. Elas variam de um indivíduo ao outro, em razão do polimorfismo do complexo maior de histocompatibilidade (CMH)

[0064] Assim, a cossanguinidade, diminuindo o número de CMH diferentes expressos por um indivíduo, diminui suas capacidades imunes. Elas diferem também segundo as modalidades de exposição ao antígeno (dose e via de administração), em razão das variações nas capacidades de apresentação de diferentes tipos de células apresentadoras. Por exemplo, as células implicadas na apresentação serão diferentes por via cutânea ou digestiva.

[0065] Enfim, a faixa peptídica produzida por um antígeno dado será diferente, segundo a célula apresentadora (modalidades de clivagem),e segundo a espécie e ao indivíduo (alelo do CMH).

[0066] Os compostos peptídicos, de acordo com a invenção, foram selecionados e concebidos visando a assegurar a abrangência vacinal e terapêutica das populações as mais gravemente atingidas pelas principais espécies patógenas de leishmanias. Eles são destinados a induzir e a caracterizar a prevenção ou o tratamento de afecções nos mamíferos, cuja imunidade protetora depende do estímulo dos linfócitos de tipo Th1 e das células T citotóxicas, característica de um estado de hiperestimulação de tipo retardado.

[0067] Numerosas situações patológicas são associadas a um estado imunitário de tipo Th1 ou Th2.

[0068] Para exemplificar, a exacerbação da via Th2, correspondente a um estado de hiperestimulação imediata, induz determinadas afecções como as dermites atópicas caninas, as alergias e a asma.

[0069] A obtenção de uma cura para essas afecções é feita por imunoestimuladores que permitem a passagem de um estado imunitário de tipo Th2 a um estado de tipo Th1.

[0070] Por outro lado, esse estádio imunitário Th1 está em plena correlação com um estado de resistência aos patógenos intracelulares, tais como Leishmania, Trypanosoma, Candida, Mycobacterium e Listeria.

[0071] Com referência à imunopatologia da asma, a literatura no decorrer do último decênio designou o linfócito T específico do alergeno como chefe de orquestra da reação imunoalérgica (Magnan. A et al. "Cytokines, from atopy to athsma: the Th2 dogma revisited" Cell Mol Biol, 2001, 47, 679-687). Dentre os linfócitos T, a subpopulação Th2 produtora de IL-4 parece no primeiro plano e necessária à indução dessa reação. Desde então é oportuno que estratégias sejam estabelecidas para alvejar especificamente os linfócitos e, em particular, os Th2.

[0072] Esse tipo de estratégia pode ser também seguido para as leishmanioses, polarizando as respostas de mediação celular para um estado imunitário de tipo Th1 e favorecendo as respostas celulares citotóxicas, permitindo se opor e controlar o processo infeccioso.

[0073] Assim como é descrito acima, uma outra dificuldade principal no desenvolvimento de um candidato vacinal reside no fato de ele ter de ser idealmente eficaz contra várias espécies de leishmanias e notadamente contra as formas clínicas as mais severas (visceral e cutânea) e em diferentes hospedeiros naturais da infecção (Homem, cão).

[0074] Assim, a invenção tem por segundo objeto um composto peptídico, compreendendo 1, 2, 3 ou 4 dos epitopos de sequências SEQ ID no 1 a 10, tais como descritos acima, eventualmente separados por um espaçador peptídico, compreendendo 1 a 8 aminoácidos.

[0075] A título de exemplo não limitativo de espaçador peptídico, podem-se citar os motivos T-V, V, Y, L (Lee Y. et al., Biomed Microdevices, 2010, 12: 207-222).

[0076] De preferência, os espaçadores peptídicos utilizados são Y ou T-V, ou seus análogos.

[0077] A título de exemplos não limitativos de compostos peptídicos, compreendendo 2 dos epitopos de sequências SEQ ID no 1 a 10, tais como descritos acima, podem-se citar: SEQ ID NO: 11: T-P-E-Q-R-T-N-T-L-T-V-E-L-G-K-K-W-I-G; ou SEQ ID NO: 12: T-L-P-E-M-P-V-G-V-P-E-M-P-A-G-V-D-Y; SEQ ID NO: 13: A-R-G-R-E-G-Y-F-L-A-R-G-A-R-G-R-E-G- Y-E-G-Y-F-V-T-D-E-K;

[0078] A título de exemplos não limitativos de compostos peptídicos compreendendo 3 dos epitopos de sequência SEQ ID no 1 a 10, tais como descritos acima, podem-se citar:

[0079] A título de exemplos não limitativos de compostos peptídicos compreendendo 4 dos epitopos de sequência SEQ ID no 1 a 10, tais como descritos acima, podem-se citar:

[0080] A invenção será melhor compreendida com a leitura da descrição não limitativa que se segue, redigida em relação aos desenhos anexados, nos quais: - a figura 1 representa a localização dos epitopos HLA-I e HLA-II nas sequências Nter-PSA das principais espécies de leishmanias. - a figura 2 representa a localização dos epitopos HLA-I e HLA-II nas sequências Cter-PSA das principais espécies de leishmanias, em particular no início da sequências Cter-PSA denominada "zona 1". - a figura 3 representa a localização dos epitopos HLA-I e HLA-II nas sequências Cter-PSA das principiais espécies de leishmanias, em particular na segunda parte da sequência Cter-PSA denominada "zona 2".

[0084] Essas figuras 1 a 3 representam mapas de predição in silico das zonas ricas em epitopos com grande e média afinidades para as moléculas HLA classe I e HLA classe II nas sequências amino (Nter) - e carbóxi (Cter) - terminais dos PSA. - a figura 4 representa os compostos peptídicos SEQ ID no 11 a 14, assim como seu recorte em epitopos e a posição de um espaçador entre os epitopos SEQ ID no 1 e SEQ ID no 2 do composto peptídico SEQ ID no 12. - a figura 5 representa o resultado de um algoritmo de predição dos locais de clivagem pelo proteassoma de diferentes compostos peptídicos oriundos da parte amino-terminal de diferentes PSA. - a figura 6 representa o esquema de injeção utilizado no estudo do estado imunitário dos cães antes e depois da vacinação com os compostos, de acordo com a invenção.

[0085] Outros exemplos de compostos peptídicos, de acordo com a invenção, são descritos nos exemplos 3 a 8.

[0086] De preferência, os compostos peptídicos, de acordo com a invenção, são escolhidos dentre: SEQ ID NO: 9: T-N-T-L-A-V-L-Q-A-F-G-R-A-I-P-E-L-G-K-K- W; ou SEQ ID NO: 10: E-G-Y-F-V-T-D-E-K-T-G-L-V-Y-R-D-G-G- V-A-A-A-S-S-G; ou SEQ ID NO: 11: T-P-E-Q-R-T-N-T-L-T-V-E-L-G-K-K-W-I-G; ou SEQ ID NO: 12: T-L-P-E-M-P-V-G-V-P-E-M-P-A-G-V-D-Y; ou SEQ ID NO: 13: A-R-G-R-E-G-Y-F-L-A-R-G-A-R-G-R-E-G- Y-E-G-Y-F-V-T-D-E-K;

[0087] Conforme indicado anteriormente, de acordo com a invenção, os compostos peptídicos SEQ ID no 9 a 13 incluem seus derivados análogos, muteínas e homólogos.

[0088] Dentre os derivados consideráveis dos compostos peptídicos SEQ ID no 9 a 13 acima, escolher-se-ão, de preferência os derivados peptídicos dos compostos acima, comportando pelo menos cinco aminoácidos contíguos.

[0089] Um terceiro objeto da invenção se refere a uma composição como produto farmacêutico, de uso veterinário ou humano, compreendendo pelo menos: - um epitopo de sequência escolhido dentre as sequências SEQ ID no 1 a 10; ou - um composto peptídico compreendendo 1, 2, 3 ou 4 dos epitopos de sequência SEQ ID no 1 a 10, eventualmente separados por um espaçador, tal como definido acima; ou - um composto peptídico de sequência escolhida dentre SEQ ID no 11 a 13.

[0090] A invenção se refere também a essa composição para sua utilização na vacinação profilática e terapêutica dirigida contra uma ou várias das leishmanias, tais como Leishmania donovani, Leishmania infantum, Leishmania chagasi, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leishmania tropica, Leishmania major, Leishmania aethiopica, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) panamensis, Leishmania (Viannia) peruviana.

[0091] Vantajosamente, a composição, de acordo com a invenção, está apta a ser utilizada na vacinação profilática e terapêutica dirigida contra pelo menos 3, de preferência pelo menos 7, de preferência ainda pelo menos 10 e mais preferida contra o conjunto das leishmanias listadas acima.

[0092] De preferência, a composição, de acordo com a invenção, é administrada por via subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, parenteral ou oral.

[0093] Um objeto adicional da invenção se refere a uma composição tal como definida acima a título de medicamento, de vacina, ou de reagente de diagnóstico in vitro e/ou in vivo, para a indução ou o diagnóstico, em um mamífero, da passagem de um estado imunitário de tipo Th2 para um estado imunitário de tipo Th1.

[0094] Um objeto adicional da invenção se refere a uma composição, tal como definida acima, a título de medicamento, de vacina, ou de reagente de diagnóstico in vitro e/ou in vivo, para a indução ou o diagnóstico, em um mamífero, de anticorpos específicos e mais particularmente de isotipos IgG2.

[0095] Um problema adicional que se propõe a resolver a presente invenção é de dispor de uma vacina capaz de conferir uma imunoproteção cruzada face as diferentes espécies de leishmaniose. A importância da comunidade antigênica dividida pelas leishmanias permite considerar o desenvolvimento de uma vacina única polivalente, constituído de imunógenos comuns e altamente conservados. O fato de alvejar como vacina um (uns)o(s) antígeno(s) comum(ns) a todas as espécies de leishmanias deveria sem nenhuma dúvida representar um real vantagem em termos de vacinação cruzada.

[0096] Assim, um quarto objeto da invenção se refere a uma vacina contra as leishmanias, compreendendo pelo menos: - um epitopo de sequência escolhido dentre as sequências SEQ ID no 1 a 10; ou - um composto peptídico compreendendo 1, 2, 3 ou 4 dos epitopos de sequências SEQ ID no 1 a 10, eventualmente separados por um espaçador, tal como definido acima; ou - um composto peptídico de sequências escolhido dentre SEQ ID no 11 a 13.

[0097] Essa vacina é vantajosamente utilizada para uma vacinação profilática e terapêutica dirigida contra uma ou várias das leishmanias escolhidas dentre Leishmania donovani, Leishmania infantum, Leishmania chagasi, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leishmania tropica, Leishmania major, Leishmania aethiopica, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) panamensis, Leishmania (Viannia) peruvian.

[0098] Essa vacina, objeto da invenção, é vantajosamente destinada ao homem, aos cães, aos felídeos e aos equinos. Preferencialmente, a vacina objeto da invenção é destinada ao Homem e aos cães.

[0099] De preferência, a vacina, de acordo com a invenção, compreende pelo menos dois epitopos ou compostos peptídicos dos quais pelo menos um epitopo é escolhido dentre: - um epitopo de sequências escolhido dentre as sequências SEQ ID no 1 a 10; ou - um composto peptídico compreendendo 1, 2, 3, ou 4 dos epitopos de sequências SEQ ID no 1 a 10, eventualmente separados por um espaçador, tal como definido acima; ou - um composto peptídico de sequência escolhida dentre SEQ ID no 11 a 13 .

[00100] De preferência ainda, a vacina, de acordo com a invenção, compreende pelo menos dois epitopos ou compostos peptídicos escolhido dentre: - um epitopo de sequências escolhido dentre as sequências SEQ ID no 1 a 10; ou - um composto peptídico compreendendo 1, 2, 3 ou 4 dos epitopos de sequências SEQ ID no 1 a 10, eventualmente separados por um espaçador, tal como definido acima; ou - um composto peptídico de sequências escolhido dentre SEQ ID no 11 a 13.

[00101] Além disso, um problema adicional que se propõe a resolver a presente invenção é de dispor de uma vacina capaz de assegurar uma abrangência vacinal na escala mundial. Esse candidato vacinal deve, portanto ser reconhecido pelo conjunto das moléculas do Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe I e de classe II majoritariamente representadas nas populações humanas as mais gravemente tocadas por essas afecções.

[00102] Nesse contexto, além dos aspectos securitários, de eficácia e de fabricação industrial próprios ao desenvolvimento de uma vacinação, uma vacina contra as leishmanioses deveria, além disso, satisfazer a um certo número de exigências mais específicas. A elaboração dessa vacina é acompanhada de dificuldades suplementares devido à complexidade do ciclo de vida das leishmanias, na diversidade genética (mais de 20 espécies de leishmanias são responsáveis pelas infecções humanas), nos mecanismos de escapamento extremamente sofisticados que esses patógenos souberam elaborar no decorrer da evolução para se estabelecer em células chaves da imunidade, utilizando nos respectivos proveitos as respostas imunitárias do hospedeiro. A isto se acrescenta a extrema diversidade e pobreza das populações atingidas por essas doenças.

[00103] Uma dificuldade adicional para alcançar o último objetivo da presente invenção não é somente de conduzir um estudo sobre a leishmaniose visceral e obter resultados transponíveis com eficácia e inocuidade no cão e no Homem, mas obter uma vacina única adaptada à prevenção e ao tratamento de todas as espécies de leishmania nos mamíferos e considerando-se a complexidade do polimorfismo HLA do Homem.

[00104] Assim, de acordo com um modo preferido de realização da invenção, a vacina, de acordo com a invenção, compreende vantajosamente, por um lado, pelo menos um composto peptídico escolhido dentre SEQ ID no 9 e 10; e, por outro lado, pelo menos um composto peptídico escolhido dentre as sequências SEQ ID no 11 a 13, essas sequências sendo tais como definidas acima. Naturalmente, conforme indicado anteriormente, segundo a invenção, os compostos peptídicos acima incluem seus derivados análogos, muteínas e homólogos.

[00105] De preferência, dentre os derivados consideráveis, escolher-se-ão preferencialmente os derivados peptídicos dos compostos acima, comportando pelo menos cinco aminoácidos contíguos.

[00106] A abordagem multiepitópica de uma vacina peptídica leva ao desenvolvimento de uma vacina destinada ao conjunto da população mundial. Para assegurar uma boa abrangência da população mundial e em relação à grande variabilidade do fenótipo HLA (complexo maior de histocompatibilidade humana) entre os indivíduos, os fragmentos antigênicos imunógenos (peptídeos) de comprimento suficiente devem, de preferência, conter uma série de epitopos aptos a serem apresentados por vários tipos de moléculas HLA-I e -II.

[00107] A identificação de epitopos, no meio dos antígenos maiores e conservados de leishmania, reconhecido pelas células T abre novas perspectivas em matéria de imunoterapia e de imunoprofilaxia das leishmanioses.

[00108] Assim, a detecção de primeiros peptídeos portados pela parte carbóxi-terminal do antígeno maior PSA permitiu obter nos cães um candidato vacinal peptídico que induz uma resposta de mediação celular, conferindo um bom nível de proteção ao encontro de uma infecção experimental à Leishmania infantum (patente FR2829767), assim como uma resposta anticorpo específico IgG2 importante, permitindo distinguir em zona de endemia um hospedeiro vacinado de um hospedeiro não vacinado, mas infectado (patente FR 2932802).

[00109] Conforme mostrado nos exemplos 3 e 4, a Requerente pôde colocar em evidência que os epitopos ou compostos peptídicos SEQ ID no 1 a 8, SEQ ID no 11 a 13 são compostos peptídicos que apresentam uma afinidade pelas moléculas do complexo Maior de Histocompatibilidade de classe I.

[00110] Da mesma forma, a Requerente colocou em evidência que os epitopos ou compostos peptídicos SEQ ID no 9 e 10 são reconhecidos pelas moléculas do Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe II.

[00111] De forma surpreendente, a Requerente colocou em evidência que o conjunto desses peptídeos é comum a todas as espécies de leishmania.

[00112] De preferência, a vacina, de acordo com a invenção, compreende, portanto, por um lado, pelo menos um ou dois compostos peptídicos escolhidos dentre SEQ ID no 9 e 10; e, por outro lado, pelo menos um, dois ou três compostos peptídicos escolhidos dentre as sequências SEQ ID no 11 a 13, essas sequências sendo tais como definidas acima.

[00113] De preferência ainda, a vacina, de acordo com a invenção compreende, em combinação, os cinco compostos peptídicos multiepitópicos SEQ ID no 9 a 13, essas sequências sendo tais como definidas acima. Naturalmente conforme indicado anteriormente, de acordo com a invenção, os compostos peptídicos acima incluem seus derivados análogos, muteínas e homólogos.

[00114] Esses cinco compostos peptídicos consideram a extrema diversidade das espécies de leishmanias e o nível elevado do polimorfismo HLA.

[00115] Os compostos peptídicos que foram vantajosamente selecionados são destinados a induzir a prevenção ou o tratamento das leishmanioses nos mamíferos, notadamente no Homem, cuja imunidade protetora depende da estimulação dos linfócitos de tipo Th1 (células T auxiliares CD4+) e linfócitos T citotóxicos CD8+. Esse estado imunitário Th1 e citotóxico está em plena correlação com um estado de resistência aos patógenos intracelulares, tais como Leishmania, Trypanosoma, Candida, Mycobacterium e Listeria.

[00116] Para a elaboração específica desses compostos peptídicos, a Requerente teve de, por numerosas experiências, considerar, pesquisar e caracterizar os polimorfismos HLA os mais frequentemente encontrados nas populações humanas expostas às infecções leishmanianas, aos quais são difíceis as respostas de mediação celulares do hospedeiro (HLA-I: resposta citotóxica CD8; HLA-II: respostas auxiliares CD4+).

[00117] O polimorfismo HLA representativo da população humana mundial foi determinado e os supertipos para a concepção de uma vacina leihmaniose foram selecionados.

[00118] O alinhamento das sequências amino- e carbóxi-terminais dos PSA (para Promastigoto Surface Antigen) das principais espécies de leishmanias capazes de infectar, acoplado a métodos de predição in silico baseando-se nas propriedades de ligação de sequências peptídicas face às moléculas HLA, conduziu a: - localizar as regiões as mais conservadas entre os PSA (partes carbóxi- e amino- terminal) das diferentes espécies de leishmanias; - estabelecer os mapas de predição in silico das zonas ricas em epitopos com elevada e média afinidades para as moléculas HLA classe I e HLA classe II sobre as sequências de PSA (partes carbóxi- e amino- terminal); - selecionar sequências peptídicas consensus ricas em epitopos HLA-I e HLA-II e em conceber sequências multiepitópicas HLA classe I consensus e otimizadas, apresentando um bom processo de apresentação dos epitopos e uma conservação dos escores de ligação para construir compostos peptídicos multiepitópicos (de 18 a 28 aminoácidos) com o objetivo de multiplicar as chances de ativação do sistema imunitário.

[00119] Conforme foi demonstrado nos exemplos 1 a 6 abaixo, a combinação específica dos cinco compostos peptídicos SEQ ID no 9 a 13 permite responder com uma grande eficácia aos inconvenientes e insuficiências dos modelos propostos anteriormente. Conforme mostrado nos exemplos 7 e 8 a Requerente avaliou a eficácia dessa vacina peptídica in vivo e em testes clínicos no cão e em testes ex vivo sobre células humanas.

[00120] De forma vantajosa, a vacina objeto da invenção compreende, além disso, um adjuvante permitindo , de preferência, aumentar a resposta imunitária aos compostos peptídicos objeto da invenção. Os adjuvantes são, mais frequentemente, substâncias minerais, oleosas ou derivadas de certos micro-organismos. De preferência, o(s) adjuvante(s) associado(s) aos compostos peptídicos objetos da invenção induzem uma resposta e mediação celular e são escolhidos dentre as classes TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, as saponinas, as emulsões óleo na água ou água no óleo, os polissacarídeos, os lipossomas catiônicos, os virossomas ou os polieletrólitos. Dentre essas diferentes classes, podem-se citar, a título de exemplos não limitativos os compostos Poly I:C, Poly A: U, MPL, RC530, GLA, flagelina, Imiquimod, Resiquimod, CpG, IC41, QS21, esqualano, esqualeno, tocoferol, inulina, DDA e polioxidônio, QA21, a saponina, a quil-A, ou qualquer outro derivado destes conhecidos do técnico, considerados sozinhos ou em mistura.

[00121] De forma preferencial, a relação compostos peptídicos / adjuvante está compreendida entre 3/1 e 3/3.

[00122] De acordo com um modo particular de realização da invenção, a vacina compreende, além disso, um composto peptídico ciclizado por ponte dissulfeto composto de uma sequência de 34 aminoácidos e designado E34P.

[00123] Esse composto peptídico de 34 aminoácidos (E34P) é composto da seguinte sequência SEQ ID no 14: E-D-E-H-K-G-K-Y-C- R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R-G-T-P-T-P-A-P.

[00124] Esse composto peptídico é ciclizado por ponte dissulfeto entre a cisteína em posição 9 (Cys 9) e a cisteína em posição 15 (Cys 15). O composto peptídico E34P é vantajosamente capaz de induzir uma resposta anticorpo importante, permitindo discriminar em zona de endemia um hospedeiro vacinado de um hospedeiro não vacinado, mas infectado. Essa ciclização do composto peptídico é essencial para o aparecimento dos anticorpos específicos IgG2, a ciclização em ponte dissulfeto entre as cisteínas 9 e 15, induzindo uma conformação específica responsável dessa síntese IgG2. Com efeito, a não ciclização do composto peptídico em Cys 9 / Cys 15 induz apenas uma síntese pouco importante em IgG2, às vezes difícil de verificar.

[00125] Naturalmente, conforme indicado anteriormente, de acordo com a invenção, o composto peptídico E34P inclui seus derivados análogos, muteínas e homólogos, tais como definidos acima.

[00126] De forma particularmente vantajosa, a vacina, de acordo com a invenção, compreende os compostos peptídicos objetos da invenção na relação seguinte: SEQ ID NO: 9 / SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 11 / SEQ ID NO: 12 / SEQ ID NO: 13: 20 / 20 / 20 / 15 / 25.

[00127] De forma mais vantajosa ainda, a vacina, de acordo com a invenção, compreende os compostos peptídicos objetos da invenção, assim como o composto peptídico E34P na seguinte relação: SEQ ID NO: 9 / SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 11 / SEQ ID NO: 12 / SEQ ID NO: 13 / SEQ ID NO: 14: 20 / 20 / 20 / 15 / 25 / 10.

[00128] Enfim, um último problema que se propõe a resolver a presente invenção é de dispor de uma vacina que tem a capacidade de induzir respostas imunitárias, permitindo distinguir um hospedeiro vacinado de um hospedeiro infectado. Com efeito, como para numerosas doenças parasitárias, o diagnóstico clínico permanece aleatório, pois os sintomas são pouco específicos, frequentemente ausentes (existem numerosos portadores assintomáticos) que só parecem verdadeiramente quando de uma fase muito avançada da infecção, que se torna então extremamente difícil de tratar. O diagnóstico serológico que consiste em colocar em evidência anticorpos específicos circulantes é feito em rotina (técnica de imunofluorescência indireta). Uma vacina, quando é administrada, gera em geral anticorpos específicos que muito frequentemente podem ser também produzidos, quando de uma infecção. A presença desses anticorpos em um hospedeiro pode então confundir no sentido em que a infecção e a vacinação possuem a mesma assinatura.

[00129] Assim, de acordo com um modo preferido de realização da invenção, a vacina compreende, além disso, pelo menos uma assinatura. A assinatura pode ser qualquer antígeno capaz de gerar anticorpos específicos, quando de uma imunização, mas não produzidos, quando de uma infecção.

[00130] A título de exemplo não limitativo de assinatura utilizável, de acordo com a invenção, pode-se citar o composto peptídico ciclizado por ponte dissulfeto E34P descrito acima. Esse composto peptídico de 34 aminoácidos (E34P) é composto da seguinte sequência SEQ ID no 14: E-D-E-H-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E- P-T-T-T-A-T-P-R-G-T-P-T-P-A-P. Esse composto peptídico é ciclizado por ponte dis-sulfeto entre a cisteína em posição 9 (Cys 9) e a cisteína em posição 15 (Cys 15).

[00131] De acordo com um modo de realização adicional, a invenção se refere também a uma sequência nucleotídica codificando para: - um epitopo de sequências escolhido dentre as sequências SEQ ID no 1 a 10; ou - um composto peptídico compreendendo 1, 2, 3, ou 4 dos epitopos de sequências escolhidos dentre SEQ ID no 1 a 10, eventualmente separados por um espaçador, tal como definido acima; ou - um composto peptídico de sequência escolhido dentre SEQ ID no 11 a 13.

[00132] A invenção se refere também a um vetor de expressão, compreendendo pelo menos uma sequência nucleotídica, tal como definida acima, assim como os meios necessários à sua expressão.

[00133] Enfim, a invenção se refere a um reagente de diagnóstico, compreendendo: - um epitopo de sequências escolhido dentre as sequências SEQ ID no 1 a 10; ou - um composto peptídico compreendendo 1, 2, 3 ou 4 dos epitopos de sequência SEQ ID no 1 a 10, eventualmente separados por um espaçador, tal como definido acima; ou - um composto peptídico de sequência escolhido dentre SEQ ID no 11 a 13.

[00134] A presente invenção vai a seguir ser ilustrada por meio dos seguintes exemplos:

Exemplo 1: análise dos supertipos HLA para uma eficácia na escala mundial.

[00135] A fim de desenvolver epítopos ou compostos peptídicos multiepitópicos, a Requerente pesquisou, recenseou, e caracterizou os supertipos HLA os mais frequentemente encontrados no mundo, notadamente nas populações humanas expostas às infecções leishmanianas. As tabelas 1 e 1bis abaixo representam a frequência média dos supertipos HLA- I e -II nos países os mais referidos pela leishmaniose, na população mundial, assim como os haplotipos associados. Tabela 1: Tabela 1a:

[00136] As percentagens calculadas nas tabelas 1 a 1bis acima são avaliadas a partir de Sette A. and Sidney J. Immunogenetics, 1999.

[00137] A Requerente determinou em seguida as combinações de supertipos HLA de classe I a considerar para a pesquisa e a identificação de compostos peptídicos multiepitópicos T capazes de assegurar a abrangência vacinal das populações as mais gravemente atingidas pelas leishmanioses.

[00138] A tabela 2 abaixo coloca em evidência os supertipos selecionados e mostra que a consideração, em combinação, de vários supertipos HLA, notadamente para HLA-I, permite assegurar uma melhor abrangência vacinal da população mundial. Tabela 2:

[00139] Como para a tabela 1, as percentagens calculadas na tabela 2 acima são avaliadas a partir de Sette A. and Sidney J. Immunogenetics, 1999.

[00140] Conforme é mostrado na tabela 2 acima, os supertipos HLA-I que devem ser reconhecidos pelos compostos peptídicos que entram na composição de uma vacina candidata, de acordo com a invenção, para assegurar uma abrangência vacinal aceitável contra as leishmanioses são, portanto, os supertipos HLA-A02, A03 e HLA-B07. De preferência, para assegurar uma boa abrangência vacinal os supertipos HLA-I que devem ser reconhecidos pelos compostos peptídicos são os supertipos HLA-A01, A02, A03, A24 e HLA-B07 e B44, de preferência ainda os supertipos HLA-A01, A02, A03, A24 e HLA- B07, B27, B44, B58 e B62.

[00141] De forma particularmente vantajosa, os supertipos HLA-I que devem ser reconhecidos pelos compostos peptídicos são os supertipos HLA-A01, A02, A03, A24 e HLA-B07, B08, B27, B44, B58 e B62 listados na tabela 1 acima.

[00142] No que se refere aos supertipos HLA-II, os supertipos selecionados são os supertipos HLA-DR1, DR2, DR3, DR4, DR5, DR7, DRB5 e DPB1.

[00143] Considerando-se o que precede, a Requerente pôde estabelecer que uma vacina compreendendo epitopos ou compostos multiepitópicos reconhecidos pelo conjunto dos supertipos HLA acima asseguraria, portanto, uma abrangência vacinal ótima na escala mundial.

Exemplo 2: identificação das sequências consenso nos diferentes PSA (para Promastigote Surface Antigen).

[00144] A requerente listou, depois estudou as sequências amino- e carbóxi- terminais dos PSA das principais espécies de leishmanias capazes de infectar o Homem, a fim de colocar em evidência zonas muito conservadas, também denominadas zonas "consenso".

[00145] As sequências amino-terminais dos PSA (Nter-PSA) das principais espécies de leishmanias são listadas abaixo. Elas estão representadas sem o peptídeo sinal das vias de excreção-secreção.

[00146] As sequências carbóxi-terminais dos PSA (Cter-PSA) das principais espécies de leishmanias são listadas abaixo. Elas são representadas sem o peptídeo sinal da fixação GPI. O glicosil fosfatidilinositol ou GPI, permite a fixação no nível extracelular de diversas moléculas, em particular proteínas (enzimas) nas membranas celulares. É uma dobradiça que permite à molécula permanecer fixada na membrana e exercer o respectivo papel.

Identificação de sequências consenso amino-terminais dos PSA das diferentes espécies de leishmanias:

[00147] As sequências amino-terminais dos PSA (Nter PSA) foram alinhadas com a finalidade de localizar as regiões as mais conservadas entre os PSA das diferentes espécies de leishmanias.

[00148] A tabela 3 abaixo ilustra o alinhamento das sequências amino-terminais dos diferentes PSA (Nter-PSA). Os aminoácidos representados em branco no fundo negro colocam em evidência as sequências que apresentam o mais de homologia e que são as mais conservadas. Trata-se de sequências consenso.

[00149] Os diferentes símbolos representados sob as sequências colocam em evidência o grau de homologia ou de identidade entre as diferentes sequências alinhadas.

[00150] O símbolo "*" indica que o aminoácido da fileira considerado é o mesmo para cada uma das sequências, fala-se então de identidade. O símbolo ":" indica uma acentuada homologia e o símbolo ". " indica uma ligeira homologia.

[00151] A ausência de símbolo indica a ausência de homologia.

[00152] O "N-" a montante das sequências alinhadas na tabela 3 indica que se trata da extremidade amino-terminal dessas sequências.

[00153] As sequências estudadas provêm de diferentes tipos de leishmanias. As diferentes siglas da tabela 3 abaixo indicam de que tipo leishmania provêm as sequências estudadas: "LMJ" para leishmania major, "LDI" para L. infantum, "LDD" para L.dovani., "LCHA" para L. chagasi, "LAMA" para L. amazonensis, "LBRA" para L. braziliensis e "LTRO" para L. tropica. Tabela 3

[00154] Em sequência ao alinhamento de sequências acima, a Requerente pôde estabelecer as zonas para as quais as sequências apresentam o mais de homologia.

Identificação de sequências consenso carbóxi-terminais dos PSA das diferentes espécies de leishmanias:

[00155] Da mesma forma, as sequências carbóxi-terminais dos PSA (Cter-PSA) foram alinhadas. A tabela 4 abaixo ilustra o alinhamento da parte carbóxi-terminal das sequências dos diferentes PSA.

[00156] Como para a tabela 3, os aminoácidos representados em branco sobre fundo negro colocam em evidência as sequências que apresentam mais de homologia e que são as mais conservadas, ou sequências consenso.

[00157] O "C-" a montante das sequências alinhadas na tabela 4 indica que se trata da extremidade carbóxi-terminal dessas sequências.

[00158] Os diferentes tipos de leishmanias estudados são os mesmos que aqueles estudados na tabela 3. As siglas da tabela 4 permitem identificá-los. Tabela 4

[00159] Em sequência ao alinhamento de sequências acima, a Requerente pôde estabelecer duas zonas principais para as quais as sequências apresentam o mais de homologia.

[00160] Os alinhamentos acima permitiram localizar zonas "consenso", isto é, as zonas as mais conservadas entre os PSA das diferentes espécies de leishmanias.

Exemplo 3: Seleção e otimização de epitopos de acordo com as suas afinidades, com as várias moléculas HLA classe I e HLA classe II.

[00161] Os diferentes derivados dessas sequências "consenso" foram testados, graças a métodos de predição in silico baseando-se nas propriedades de ligação de sequências peptídicas face às moléculas HLA. Mapas de predição in silico das zonas ricas em epitopos com forte e média afinidades para as moléculas HLA classe I e HLA classe II nas sequências dos PSA (partes carbóxi- e aminoterminal) foram realizadas.

[00162] As figuras 1, 2, e 3 ilustram a localização dos epitopos HLA nas sequências de diferentes PSA.

[00163] Esses resultados permitiram a seleção e a otimização de sequências peptídicas conseno ricas em epitopos HLA-I e HLA-II.

[00164] Ao final desses testes, os 10 seguintes epitopos foram retidos: SEQ ID NO: 1: T-P-E-Q-R-T-N-T-L (epitopo HLA-B07); SEQ ID NO: 2: E-L-G-K-K-W-I-G (epitopo HLA-B08); SEQ ID NO: 3: T-L-P-E-M-P-V-G-V (epitopo HLA-A02); SEQ ID NO: 4: P-E-M-P-A-G-V-D-Y (epitopo HLA-A01); SEQ ID NO: 5: A-R-G-R-E-G-Y-F-L (epitopo HLA-B27); SEQ ID NO: 6: A-R-G-A-R-G-R-E-G-Y (epitopo HLA-B44); SEQ ID NO: 7: A-R-G-A-R-G-R-E-G (epitopo HLA—B27); SEQ ID NO: 8: E-G-Y-F-V-T-D-E-K (epitopo HLA-A03); SEQ ID NO: 9: T-N-T-L-A-V-L-Q-A-F-G-R-A-I-P-E-L-G-K-K-W; SEQ ID NO: 10: E-G-Y-F-V-T-D-E-K-T-G-L-V-Y-R-D-G-G-V-A-A-A-S- S-G.

Exemplo 4: construção de compostos peptídicos multiepitópicos a. Compostos peptídicos multiepitopos HLA-I:

[00165] Os epitopos que apresentam a afinidade a mais elevada para as moléculas HLA-I foram ligados em compostos peptídicos multiepitópicos (de 18 a 28 aminoácidos) com o objetivo de multiplicar as chances de ativação do sistema imunitário.

[00166] A afinidade dos seguintes compostos peptídicos SEQ ID no 11 a 13: SEQ ID NO: 11: T-P-E-Q-R-T-N-T-L-T-V-E-L-G-K-K-W-I-G SEQ ID NO: 12: T-L-P-E-M-P-V-G-V-P-E-M-P-A-G-V-D-Y; SEQ ID NO: 13: A-R-G-R-E-G-Y-F-L-A-R-G-A-R-G-R-E-G-Y-E-G-Y-F- V-T-D-E-K; para os supertipos HLA-I A01, A02, A03 (A11), A24, B07, B08, B27, B44 (B18), B58 e B62 foi em seguida determinada pela Requerente. Os resultados são agrupados na tabela 5 abaixo. Tabela 5: composição em aminoácidos e em epitopos dos três compostos peptídicos HLA-I selecionados

[00167] No final desse estudo, os 3 compostos peptídicos multiepitopos HLA-I de sequências SEQ ID no 11 a 13 foram selecionados.

[00168] A figura 4 ilustra a composição em epitopos dos três compostos peptídicos HLA-I selecionados (afinidade com os supertipos HLA-I implicados sobre os 10 mais importantes).

[00169] De forma vantajosa, esses compostos peptídicos serão sintetizados sob sua forma palmitoíla (K).

b. Compostos peptídicos multiepitopos HLA-II:

[00170] Além disso, a Requerente realizou um estudo que tem por finalidade avaliar, para as seguintes sequências consenso: - Nter PSA: T-N-T-L-A-V-L-Q-A-F-G-R-A-I-P-E-L-G-K-K-W (SEQ ID NO: 9); - Cter-PSA-zona 1: P-D-S-W-A-Q-K-A-G-L-V-V-T-I-R-D-E; e Cter-PSA-zona 2: E-G-Y-F-V-T-D-E-K-T-G-L-V-Y-R-D-G-G-V-A-A-A-S- S-G (SEQ ID NO: 10), o número de epitopos tendo uma afinidade alta/moderada com os diferentes tipos HLA-II.

[00171] Os resultados desse estudo são retomados na tabela 6 abaixo.

[00172] Para esse estudo, o servidor NetMHCII 2.2 pode, por exemplo, ser utilizado para predizer a afinidade de diferentes peptídeos com os diferentes tipos HLA. Ele prediz a ligação de peptídeos às moléculas HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, assim como os alelos do CMH classe 2 do rato, utilizando uma rede artificial de neurônios. Os prognósticos podem ser obtidos para 14 alelos HLA-DR abrangendo dos 9 supertipos HLA-DR, os 6 supertipos HLA-DQ, os 6 supertipos HLA-DP, assim como os dois alelos H2 classe 2 do rato.

[00173] Os valores de predições são dados em valores de IC50 em nM e como uma classificação em percentagem em um conjunto de 1 000 000 de peptídeos naturais aleatórios. Os peptídeos de ligações fortes e fracas são indicados nos resultados. Tabela 6:

[00174] Em sequência a esses resultados, os dois compostos peptídicos multiepitopos HLA-II de sequências SEQ ID no 9 e 10 foram selecionados.

[00175] As tabelas 7 e 8 abaixo representam a concentração em peptídeo competidor (nM) (SEQ ID no 9 ou SEQ ID no 10) para a qual 50 % da ligação do peptídeo de referência às moléculas HLA-DRB1 às moléculas HLADRB3, -DRB4, -DRB5 e HLA-DP4, são inibidos (IC50).

[00176] Para cada uma das tabelas 7 e 8, os resultados são oriundos de duas experiências independentes. Tabela 7:

[00177] Os valores indicados correspondem as IC50 obtidas para cada peptídeo estudado.

[00178] Os resultados são reprodutíveis, já que os valores de IC50 obtidos para cada experiência não excedem um fator de três.

[00179] Quanto menor for o valor da IC50, melhor será a afinidade do peptídeo para a molécula HLA estudada. Assim, é importante anotar que os peptídeos de referência não têm todos a mesma capacidade de ligação segundo a molécula HLA considerada. Esses valores correspondem aos valores padrões esperadas.

[00180] Como para os resultados apresentados acima, a tabela 8 ilustra o conjunto dos valores de IC50 obtidos para os dois peptídeos testados e seu peptídeo de referência como controle interno, para a ligação às moléculas HLA-DRB3, -DRB 4, -DRB5 e às moléculas HLA- DP401 e -DP402. Tabela 8:

[00181] A tabela 9 abaixo ilustra a atividade relativa dos dois compostos peptídicos SEQ ID no 9 e 10 para as moléculas HLA-DR, HLA-DRB e HLA-DP4 estudadas. A atividade relativa é calculada a a partir das duas tabelas 7 e 8 acima da seguinte forma: Razão = (média dos valores de IC50 obtidos para o peptídeo testado)/ (média dos valores de IC50 obtidos com o peptídeo de referência). Tabela 9:

[00182] Nessa tabela 9, a atividade relativa é definida pela razão obtida entre a média dos IC50 calculada com o peptídeo competidor e a média dos IC50 calculada com o peptídeo de referência. A atividade relativa permite assim comparar as propriedades de ligação do peptídeo testado àquela do peptídeo de referência que corresponde ao peptídeo que liga de forma a mais eficaz uma molécula HLA determinada. Assim, uma atividade relativa de 2 significa que o peptídeo testado liga 2 vezes menos eficazmente a molécula HLA estudada que o peptídeo de referência. Assim, quanto menor for a razão, melhor será a finidade do peptídeo para a molécula HLA considerada.

[00183] Por conseguinte, segundo a razão obtida, os compostos peptídicos são classificados conforme três categorias: - os compostos peptídicos de alta afinidade, cuja razão não excede 20; - os compostos peptídicos de média afinidade, compreendidos entre 21 e 101; e - os compostos peptídicos não afins com uma razão superior a 102.

[00184] Em vista do conjunto dos resultados obtidos, os dois compostos peptídicos consenso apresentam uma boa afinidade para as moléculas HLA-DR4, -DR11, -DR13 e DR15.

[00185] Mais particularmente, o composto peptídico SEQ ID no 9 se distingue do composto peptídico SEQ ID no 10 por sua afinidade de ligação elevada às moléculas HLA-DR1, -DR7 e DRB5.

[00186] Ao contrário, o composto peptídico SEQ ID no 10 apresenta uma boa afinidade de ligação às moléculas HLA-DR3 e HLADRB3, enquanto que o composto peptídico SEQ ID no 9 não é ativo sobre essas duas moléculas HLA.

[00187] De forma mais geral, esses dois compostos peptídicos são epitopos T potenciais capazes de ativar linfócitos T CD4+, pois se ligam, a eles dois, ao conjunto das moléculas HLADRB1 majoritariamente representadas na população mundial, assim como duas moléculas HLA-DR secundárias em três (HLA-DRB3 e DRB5).

[00188] Os cinco compostos peptídicos retidos foram selecionados para assegurar a abrangência vacinal e terapêutica das populações as mais gravemente atingidas pelas principais espécies de leishmanioses os mais patógenos no homem.

[00189] A terminação N dos compostos peptídicos pode ser modificada por adição de uma marcação ácido graxo a partir de uma proteína N-acilada. A forma a mais comum dessa modificação é a adição de um grupo palmitoíla (K). Isto torna o composto peptídico mais estável e aumenta sua capacidade de ser apresentado às células do sistema imunitário.

Exemplo 5: Predição dos sítios de clivagem para o proteassoma

[00190] A Requerente realizou também um estudo da conservação e da criação de locais de corte pelo proteassoma, permitindo favorecer o processo de apresentação dos epitopos pelas moléculas HLA-I. Esse estudo permitiu conceber sequências multiepitópicas HLA classe I consenso e otimizadas, apresentando um bom processo de apresentação dos epitopos e uma conservação dos escores de ligação dos peptídeos às moléculas HLA.Os epitopos os mais afins para as moléculas HLA-I foram ligados para construir dos peptídeos multiepitópicos, apresentando de 18 a 28 aminoácidos, considerando-se mais particularmente a conservação e/ou a adição de um espaçador, como, por exemplo, o espaçador T-V presente na sequência SEQ ID no 11, locais de clivagem pelo imunoproteassoma das HLA de classe I, favorecendo sua apresentação ao sistema imunitário.

[00191] Os resultados desse estudo estão representados na figura 5.

Exemplo 6: estudo físico-químico dos compostos peptídicos multiepitópicos classe I e classe II oriundos dos PSA de leishmanias e cálculo das concentrações desses compostos.

[00192] Os compostos peptídicos considerados, quando desse estudo são os compostos peptídicos multiepitópicos HLA de classe I SEQ ID no 11 a SEQ ID no 13 e os compostos peptídicos multiepitópicos HLA classe II SEQ ID no 9 e 10.

[00193] O composto peptídico epitopo B "E-34-P" de SEQ ID no 14 é também estudado aqui. Conforme indicado na descrição, trata-se de um composto peptídico de síntese não nativo, composto da seguinte sequência de 34 aminoácidos: E-D-E-H-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R-G-T-P-T- P-A-P.

[00194] Esse composto peptídico é designado pela expressão "E- 34Pc" quando está sob a forma de composto peptídico ciclizado em Cys9-Cys15.

[00195] Ele permite distinguir em zona de endemia um hospedeiro vacinado de um hospedeiro não vacinado, mas infectado. O composto peptídico estudado no presente estudo é o composto peptídico K - (palmitoil)-E-D-E-H-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P- R-G-T-P-T-P-A-P.

[00196] Os compostos peptídicos foram preparados a 1mM em uma solução de 10 % de DMSO/PBS 1X (sem Mg/Ca) com tubos de ensaio contendo 1 mg de cada composto peptídico.

[00197] As tabelas 10, 11, 12 representam os resultados dos estudos físico-químicos dos diferentes compostos peptídicos citados acima. Tabela 10: pesos moleculares e equivalência a 1 mM (milimol/L) dos compostos peptídicos retidos Tabela 1 1: Compostos peptídicos não Palmitoilados Tabela 1 2: Compost tos peptídicos Palmitoi ados (extremidade Pa mitoil

[00198] Esses resultados indicam as propriedades bioquímicas dos peptídeos e permitem preparar soluções mães de peptídeos a 1mM, visando testar, após diluição, sua eficácia no cão e sobre células humanas conforme ilustrado nos exemplos 7 e 8 abaixo.

Exemplo 7: estudo do estado imunitário dos cães antes e após vacinação

[00199] Os compostos peptídicos SEQ ID no 9 a 13 da invenção são misturados ao composto peptídico de síntese não nativo E34Pc, SEQ ID no 14, que permite distinguir em zona de endemia um hospedeiro vacinado de um hospedeiro não vacinado , mas infectado. Esse composto peptídico E34Pc é associado a um adjuvante induzindo, de preferência, uma resposta de mediação celular, tal como, por exemplo do QA21, da saponina, da Quil-A ou qualquer outro derivado destes conhecidos do técnico, tal como QS-21.

[00200] De maneira preferida, as sequências peptídicas são associadas em uma relação SEQ ID NO: 9 / SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 11 / SEQ ID NO: 12 / SEQ ID NO: 13 / SEQ ID NO: 14: 20 / 20 / 20 / 15 / 25 / 10.

[00201] Os compostos peptídicos, de acordo com a invenção, podem ser tornados imunogênicos por ligação a portadores ou qualquer outro derivado (grossa molécula tipo KLH, lipopeptídeos tipo palmitoil ou derivados) e são administrados nos candidatos em presença de um adjuvante e, de preferência ao QA21.

[00202] A fim de conhecer a capacidade do candidato vacinal para induzir uma imunidade protetora, as respostas imunitárias humoral e celular das composições compreendendo: - os cinco compostos peptídicos SEQ ID no 9 a SEQ ID no 13 ou - os seis compostos peptídicos SEQ ID no 9 a SEQ ID no 14, quando o composto peptídico E34Pc está também presente, são avaliados nas composições, nos cães imunizados (vacinados) comparativamente a cães placebos.

[00203] A composição de peptídeos é testada em 38 cães da raça Beagle apresentando uma sorologia leishmaniose negativa, uma parasitologia negativa, uma ausência de resposta celular com leishmania (INF-y e granzyma B) e uma ausência de IgG2 específicos do composto peptídico E34Pc, repartidos em 10 grupos (0 a 9).

[00204] No estabelecimento dos grupos de cães, é notadamente previsto comparar as composições, segundo a invenção, a uma combinação dos três compostos peptídicos descritos nos documentos de patentes FR2829767 e FR2932802. Trata-se dos seguintes três compostos peptídicos: • A16E: A-A-R-C-A-R-L-R-E-G-Y-S-L-T-D-E • A16G: A-A-S-S-T-P-S-P-G-S-G-C-E-V-D-G; e • E34P: E-D-E-H-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T- T-A-T-P—R-G-T-P-T-P-A—P.

[00205] Esses três peptídeos, sob a forma palmitoilada são associados em uma relação 10/25/25 para KE34P / KA17E / KA17G.

[00206] Essa combinação constitui o grupo de referência, que é comparado aos compostos peptídicos de classe I de SEQ ID no 11 a 13, e aos compostos peptídicos de classe II de SEQ ID no 9 a 10.

[00207] A finalidade do presente estudo é também de avaliar um efeito de dose da concentração dos diversos compostos peptídicos da composição vacinal.

[00208] Os 38 cães viveram no Norte da França (Auxerre), zona não endêmica) e foram repatriados no Sudeste da França, 4 semanas antes da vacinação em período de inverno (período que não apresenta vetores flebotomas com leishmania). Dentre os 10 grupos, um grupo prova placebo de 2 cães é previsto, trata-se do grupo 0. Os 9 outros grupos compreendem, cada um, 4 cães que receberam os diversos compostos peptídicos às concentrações indicadas na tabela 13 abaixo. As diferentes misturas peptídicas são formuladas com o adjuvante QA21, do Tween 80 e do TMS e liofilizados.

[00209] O esquema de injeção é ilustrado na figura 6. As doses injetadas são descritas na tabela 13 abaixo. Os valores indicados nessa tabela 13 correspondem às quantidades de peptídeos injetados em μg para 200 μl de composição injetada por via intradérmica. Os grupos identificados por uma estrela na tabela 13 são grupos de 4 cães. Os compostos peptídicos anotados "K" são compostos peptídicos palmitoilados. Por exemplo, o composto peptídico "E34Pc palmitoilados é anotado com "KE34Pc". Tabela 13: grupos de cães estudados

[00210] Um acompanhamento clínico dos 38 cães é efetuado a cada duas semanas.

[00211] As análises são efetuadas antes de qualquer injeção e 7 semanas após a terceira injeção.

[00212] Em um primeiro tempo uma pesquisa é efetuada nos soros dos anticorpos IgG2 específicos do composto peptídico E34Pc. Essas imunoglobulinas de tipo IgG2 de cães específicos do composto peptídico E34Pc são detectadas por métodos ELISA, conforme o método de microtitulação de Kveider et al. (J. Immunol. 1987, 138299), utilizando um conjugado anti-IgG2. Para esse método o composto peptídico é biotinilado antes de revestimento sobre microplacas, conforme o método descrito no pedido de patente FR2932802. Em um segundo tempo, a capacidade das células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) a proliferar após 5 dias de estimulação por diversos antígenos oriundos das vacinas candidatas é avaliada e uma dosagem da citoquina IFNy (resposta Th1) é realizada. Esses dados são obtidos por intermédio de experiências ex vivo nos cães e permitem avaliar a resposta celular.

[00213] A capacidade das células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) a proliferar após 5 dias de estimulação por diversos antígenos oriundos dos candidatos vacinas é avaliada por uma técnica ELISA (método alternativo à radioatividade).

[00214] A dosagem da citoquina IFNy é feita também por um teste ELISA no que flutuou das células estimuladas e permite determinar a capacidade das células a entrar em uma via TH-1 após estimulação.

[00215] A eficácia dos candidatos vacinas é determinada ex vivo por um teste de atividade leishmanicida. Esse teste tem por finalidade avaliar o tipo e o nível de intensidade da resposta imune de mediação celular induzida pela administração de uma vacina no cão, estudando a capacidade dos macrófagos, colocados em contato com linfócitos autólogos, a eliminar os parasitas intracelulares de formas amastigotos.

[00216] Enfim, uma dosagem da serina protease Granzime B é feita no que flutua das células estimuladas a fim de avaliar a resposta citotóxica linfocitária específica e colocar em evidência a produção de Granzime B específico dos linfócitos T citotóxicos. Essa dosagem é realizada pelo estudo do nível de expressão dos transcritos por RT-q-PCR.

[00217] A tabela 14 abaixo dá os resultados desses diversos testes biológicos, e recensa, portanto, o número de cães que dão uma resposta imunitária positiva:

[00218] Conforme é mostrado na tabela 14 acima, a combinação dos compostos peptídicos de classe I e de classe II (grupos 6 a 9) dá melhores resultados em termos de resposta imunitária protetora que os compostos peptídicos de referência (grupo 1) e que os compostos peptídicos de classe I e de classe II considerados separadamente (grupos 2, 3 e grupos 4, 5).

[00219] Dentre os grupos que recebem a composição total dos compostos peptídicos (Classe I, Classe II e E34Pc), os grupos 6 e 7 correspondentes a baixas concentrações em compostos peptídicos dão os melhores resultados. É preciso notadamente anotar os bons resultados do grupo 6 que corresponde à mais baixa concentração em compostos peptídicos da composição seja 60 μg de compostos peptídicos por injeção.

[00220] Foi assim demonstrado que a composição age por estimulação do sistema linfocitário de tipo Th1 com produção de linfócitos T citotóxicos e de IgG2 específicos do composto peptídico E34Pc. O interesse dessas IgG2 não se baseia somente na distinção dos cães vacinados / cães infectados, mas também em sua capacidade de inibir a proliferação das formas amastigotos ou promastigotos de leishmania.

Exemplo 8: eficácia ex vivo dos compostos peptídicos classe I e II de PSA a estimular células humanas e a produzir citoquinas de tipo Th1

[00221] Os pacientes atingidos pela leishmaniose e curados com sucesso pela quimioterapia estão geralmente ao abrigo de novas infecções com leishmania. Essa resistência do hospedeiro à infecção leishmaniana é principalmente mediada por respostas imunes celulares específicas e notadamente uma linfo proliferação dos linfócitos T e a produção das citoquinas Th1 como o interferon- gama(IFN-y) e interleucina (IL)-2 levando à ativação dos macrófagos e acarretando a morte dos parasitas. Embora progressos significativos tivessem sido completados recentemente para compreender os mecanismos da imunidade no Homem, nenhuma vacina está atualmente disponível contra as leishmanioses humanas. Todavia, numerosos esforços foram feitos para identificar antígenos de leishmanias capazes de induzir uma imunidade protetora. Os principais trabalhos relativos à vacinação foram e são ainda realizados no rato. Esses modelos de infecção experimental são muito afastados dos hospedeiros naturais da infecção, isto é, o cão e o homem, hospedeiros que têm um impacto considerável em termos de saúde veterinária e humana. Além disso, esses trabalhos se referiram essencialmente à leishmaniose cutânea a L. major (principal modelo de infecção disponível no rato), para a qual estudos não são diretamente transponíveis à leishmaniose visceral canina ou humana.

[00222] A Requerente desenvolveu, portanto, uma nova abordagem que consiste em avaliar a capacidade dos antígenos de vacinas candidatas a estimular os linfócitos T do sangue periférico de pacientes curados ou de indivíduos expostos assintomáticos e imunes, medindo ex vivo a produção de citoquinas Th1 e/ou Th2. A eficácia desses antígenos a acionar notadamente uma resposta Th1 (liberação de IFN-y pelos linfócitos T estimulados) e a intensidade da resposta provocada serão colocadas em correlação com a proteção ou a cura. Esse teste ex vivo de eficácia de candidatos vacinas sobre células humanas foi utilizado com o PSA recombinante nativa a 10 μM e a vacina candidata peptídica (Pool A = combinação dos cinco compostos peptídicos SEQ ID no 9 a 13) a 2 μM sobre células de indivíduos assintomáticos imunes comparativamente a indivíduos inocentes.

[00223] O estatuto dos indivíduos foi definido por um exame clínico, mas também por métodos imunológicos (proliferação celular contra antígenos solúveis totais de leishmanias, dosagem de IFN-y após estimulação celular, e dosagem dos anticorpos dirigidos contra esses antígenos no plasma) e parasitológicos (pesquisa e quantificação de parasitas no sangue por RT-Q-PCR). Os grupos de indivíduos foram, portanto, definidos conforme a seguir: - indivíduos inocentes: nenhum histórico médico referente a uma leishmaniose, ausência de sinais clínicos, proliferação celular negativa, ausência de produção de IFNy, após estimulação celular, nenhuma evidência da presença de anticorpos dirigidos contra os antígenos totais de leishmanias e PCR negativa; - indivíduos assintomáticos: ausência de sinais clínicos, proliferação celular positiva e/ou produção de IFN-y após estimulação das células pelos antígenos totais de leishmanias, PCR positiva ou negativa.

[00224] Os resultados são apresentados na tabela 15 abaixo: Tabela 15: Taxa de IFN-y secretados pelas células T do sangue periférico isolados de indivíduos assintomáticos (assimpt) e de indivíduos inocentes. TSLA: antígenos totais de leishmania; nsLaPSA: proteína PSA recombinante; Pool A: combinação dos compostos peptídicos de síntese de SEQ ID no 9 a 13.

[00225] Conforme mostram os resultados, só as células de indivíduos assintomáticos, comparativamente àquelas dos indivíduos inocentes, são capazes de induzir uma resposta Th1 (estimulação dos linfócitos T com produção significativa de IFN-y) em presença de PSA recombinante ou do Pool A. Este representa, portanto um excelente candidato para as vacinas profiláticas e terapêuticas contra as leishmanioses humanas.

Claims (6)

1. Vacina profilática e/ou terapêutica contra uma ou várias das leishmanias escolhidas dentre Leishmania donovani, Leishmania infantum, Leishmania chagasi, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leishmania tropica, Leishmania major, Leishmania aethiopica, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) panamensis, Leishmania (Viannia) peruviana, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um composto peptídico escolhido dentre a SEQ ID NO: 9 e 10; e pelo menos um composto peptídico escolhido dentre as sequências SEQ ID NO: 11 a 13.

2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato que compreende pelo menos um ou dois compostos peptídicos escolhidos dentre SEQ ID NO: 9 e 10; e pelo menos um, dois ou três compostos peptídicos escolhidos dentre as sequências SEQ ID NO: 11 a 13.

3. Vacina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende, em combinação, cinco compostos peptídicos multiepitópicos, escolhidos dentre a SEQ ID NO: 9 a 13.

4. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante escolhido dentre as classes TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, as saponinas, as emulsões óleo na água ou água no óleo, os polissacarídeos, os lipossomas catiônicos, os virossomas ou os polieletrólitos.

5. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende ainda o composto peptídico E34P da seguinte SEQ ID NO: 14: E-D-E-H-K-G-Y-C-RL-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P- R- G-T-P-T-P-A-P, ciclizado por ponte de dissulfeto entre a cisteína em posição 9 e a cisteína em posição 15.

6. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antígeno capaz de gerar anticorpos específicos durante a imunização.