ES2875862T3 - Vacunas monovalentes y polivalentes contra la Leishmania - Google Patents
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Abstract
Epítopo que presenta una secuencia seleccionada entre SEQ ID Nº 1 a SEQ ID Nº 10.
Description
DESCRIPCIÓN
Vacunas monovalentes y polivalentes contra la Leishmania
[0001] La presente invención se refiere a compuestos peptídicos mono o multiepitópicos para la prevención y el tratamiento de las leishmaniosis en mamíferos y, en particular, en humanos, cánidos, félidos y équidos. Más particularmente, la invención se refiere también a las vacunas que comprenden dichos compuestos peptídicos en condiciones que garantizan una inmunización que conduce a una protección eficaz del ser humano o del animal vacunado contra una o varias leishmanias.
[0002] Las principales endemias parasitarias son, con diferencia, las causas más importantes de morbilidad y mortalidad no sólo para la especie humana, sino para todas las demás especies animales, tanto domésticas como salvajes.
[0003] Las leishmaniosis son una de las infecciones parasitarias más graves que afectan al ser humano en el mundo. Trescientos cincuenta millones de personas están expuestas en ochenta y ocho países de cuatro de los cinco continentes y dieciséis millones de ellas son portadoras del parásito. Son responsables de un amplio espectro de manifestaciones clínicas (cutáneas, mucocutáneas y viscerales).
[0004] La leishmaniosis visceral (LV) es provocada por los parásitos del complejo Leishmania donovani (L. infantum, L. chagasi y L. donovani) que son parásitos intracelulares del macrófago. A diferencia de las otras especies de Leishmania causantes de las formas cutáneas de la enfermedad (L. major, L. brasiliensis, etc.), las leishmanias del complejo donovani presentan una capacidad de diseminación en todos los órganos profundos donde se multiplican. Los pacientes que padecen LV presentan un cuadro clínico que asocia una fiebre moderada pero persistente, una hepatoesplenomegalia y una pancitopenia que, generalmente, conducen a la muerte si no se inicia un tratamiento específico con la suficiente rapidez.
[0005] Aunque la LV de L. infantum/chagasi es un problema importante en la Europa meridional con la propagación de la pandemia del SIDA y la aparición de un número creciente de coinfecciones de Leishmania/VIH, está lejos de estar controlada y se está convirtiendo en una importante preocupación de salud pública en los países de América del Sur. En otras partes del mundo, especialmente en las zonas con endemia de L. donovani, afecta a aproximadamente una quinta parte de la población en Sudán y en la India, donde las epidemias mortales se han cobrado cientos de miles de vidas en las últimas décadas. Asimismo, la situación se está volviendo crítica en la India con la aparición de cepas resistentes a los derivados pentavalentes del antimonio (medicamentos de primera línea).
[0006] La incidencia anual de las leishmaniosis humanas se estima entre 2 y 2,5 millones de nuevos casos, de los cuales más de 500000 están afectados por la leishmaniosis visceral y de 1,5 a 2 millones por la leishmaniosis cutánea, algunas de las cuales son muy desfigurantes y mutilantes, como las leishmaniosis mucocutáneas (LMC). El resultado es una morbilidad mundial de más de dos millones de AVAD (años de vida ajustados por discapacidad) y la muerte de casi sesenta mil personas cada año. Estas enfermedades siguen siendo un verdadero problema de salud pública en América Latina, Asia, África y el sur de Europa. Sus consecuencias en muchas regiones del mundo las convierten en un gran obstáculo para el desarrollo de los países más pobres. Además, el efecto global de los cambios ambientales (antrópicos y climáticos) conduce bien a un aumento de la incidencia (enfermedades "reemergentes" e incontroladas en muchas regiones del mundo), bien a una extensión geográfica (enfermedades emergentes, sobre todo en el norte de Europa y Norteamérica) de estas enfermedades parasitarias. Sin embargo, siguen siendo ignoradas por la investigación médica, los organismos de financiación, la opinión pública y las autoridades políticas de los países gravemente afectados.
[0007] La leishmaniosis visceral también afecta a la población canina, que constituye un reservorio de parásitos que alimenta continuamente el ciclo de transmisión. Está causada por L. infantum/chagasi, la especie responsable de una zoonosis de los cánidos domésticos y salvajes muy extendida en todo el mundo. Afecta a millones de perros en Europa, Asia, el Norte de África y Sudamérica. Tanto los perros sintomáticos como los asintomáticos son una fuente de parásitos para la transmisión de la LV a los humanos.
[0008] Existen muchas medidas de prevención contra las leishmaniosis. Durante mucho tiempo, se han basado en la lucha contra el insecto vector y el objetivo principal era controlar su multiplicación mediante el uso de insecticidas y evitar el contacto entre el vector (flebótomo) y sus huéspedes (perro, hombre, etc.). El control de las leishmaniosis, una vez diagnosticadas, requiere también tratamientos quimioterapéuticos. Desgraciadamente, estos últimos se ven comprometidos por un arsenal terapéutico muy limitado, tratamientos largos, tóxicos y costosos acompañados de numerosos casos de recaída, y por la aparición de fenómenos de quimiorresistencia. A falta de tratamientos eficaces y teniendo en cuenta el alcance del problema, es necesario proporcionar a las poblaciones más afectadas medios de prevención ampliamente aplicables, de los cuales el más adecuado sería la vacunación.
[0009] Varios argumentos apoyan la viabilidad de una vacuna en humanos. El hecho de que una persona que vive en una zona endémica pueda desarrollar una fuerte resistencia a la leishmaniosis cutánea tras la inyección voluntaria de una pequeña cantidad de parásitos vivos demostró rápidamente que la vacunación contra estas parasitosis era posible en el ser humano. Aunque es extremadamente eficaz (más del 80 % de protección), esta práctica, que utiliza promastigotes de L. major, todavía llamada "leishmanización", se utilizó durante mucho tiempo, especialmente en Oriente Medio. Posteriormente, se abandonó por razones éticas y de seguridad. De hecho, causó formas graves de leishmaniosis en entre un 2 y un 3 % de los sujetos (Ferrua et al, Vaccine 2006). Además, ahora está bien establecido que, tras la infección por leishmanias, la gran mayoría de las personas inmunocompetentes desarrollan infecciones subclínicas o asintomáticas en lugar de una forma grave (sintomática) de leishmaniosis y, por lo tanto, adquieren una inmunidad robusta y duradera a la reinfección. Lo mismo ocurre en personas con leishmaniosis cutánea controlada o tras una leishmaniasis visceral curada.
[0010] A pesar de ello, en los seres humanos, no existe actualmente ninguna vacuna contra las leishmaniosis. De hecho, hasta la fecha sólo ha sido posible un enfoque pragmático utilizando parásitos enteros muertos. Históricamente, las vacunas de primera generación, basadas en el uso de parásitos enteros atenuados o muertos (especialmente esterilizados en autoclave) combinados o no con adyuvantes, estaban destinadas a proteger principalmente contra las leishmaniosis cutáneas, intentando reproducir los niveles de protección obtenidos con los parásitos vivos.
[0011] No obstante, los numerosos ensayos clínicos realizados en miles de personas en Sudamérica, pero también en Irán, han arrojado resultados desiguales, incluso decepcionantes (Modabber, International Journal of Antimicrobial Agents, 2010; Evans y Kedzierski, Journal of Tropical Medicine, 2012).
[0012] Las infecciones experimentales en ratones, específicamente la cepa murina BALB/c susceptible a muchas especies de leishmanias, han sido y siguen siendo ampliamente utilizadas para evaluar la eficacia de una vacuna candidata, especialmente contra una leishmaniosis visceral. Así, se han probado numerosas vacunas de subunidades formadas por proteínas nativas purificadas (vacuna de primera generación) o recombinantes (vacuna de segunda generación) (Goto et al, Clinical and Vaccine Immunology, 2011). Algunas vacunas candidatas proporcionaron un buen nivel de protección contra una infección experimental en ratones. Las protecciones fueron de hasta el 81 % dependiendo del antígeno y del adyuvante. Más recientemente, se han desarrollado las vacunas de ADN, llamadas de tercera generación, más fáciles de producir, más estables y más inmunógenas, con las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas utilizadas en las vacunas de segunda generación (Gurunathan et al, Nature Med., 1998; Dumonteil et al, Vaccine, 2003; Rafati et al, Vaccine, 2005 ; Rodriguez-Cortes et al, Vaccine, 2007). Por último, se han explorado con éxito otros enfoques de vacunas en ratones, como las vacunas basadas en antígenos presentes en la saliva de los flebótomos (Morris et al, J. Immunol., 2001; Valenzuela et al, J. Exp. Biol., 2004), que han permitido obtener una resistencia relativa a la infección experimental con Leishmania major.
[0013] Hasta la fecha, pocos candidatos a vacunas han superado la fase experimental (modelos de ratón o hámster) debido a la dificultad de desarrollar un modelo animal apropiado que imite las características de la enfermedad humana y de realizar ensayos clínicos en huéspedes naturales de la infección, que requieren grandes cohortes, infraestructuras engorrosas y pueden tardar años en dar un resultado definitivo. Además, es difícil extrapolar directamente los resultados obtenidos en ratones a los huéspedes naturales de la infección, como los perros o los humanos. Por último, las respuestas inmunitarias protectoras que controlan una infección de prueba pueden no reflejar las necesarias para prevenir la leishmaniosis en zonas endémicas.
[0014] El documento WO 2009/153458 A2 divulga un péptido sintético no nativo ciclado por puente disulfuro y un complejo de péptidos sintéticos no nativos para inducir y caracterizar la prevención y/o el tratamiento de afecciones en mamíferos cuya inmunidad protectora depende de la estimulación de los linfocitos de tipo Th1.
[0015] Hay dos candidatos a vacunas en desarrollo clínico:
• Leish 111 f MPL SE del Instituto de Investigación de Enfermedades Infecciosas (IRDI, por sus siglas en inglés) de Seattle es una vacuna quimérica denominada LEISH-F1 que consiste en 3 proteínas de fusión recombinantes (TSA-LmSTI1-LeIF) formuladas con lípido monofosforilado y escualeno en una emulsión estable (MPL-SE). Sin embargo, mientras que la protección contra la leishmaniosis cutánea parece estar bien encauzada, un estudio realizado en Italia en una estación experimental muestra claramente que Leish-111 f MPL-SE no protege a los perros expuestos a una infección natural de L. infantum (Gradoni et al, Veterinary Research, 2005; Gradoni, Veterinary Research, 2006). En un estudio más reciente realizado en Brasil, esta vacuna resultó ser eficaz como inmunoterapia para los casos leves de LV canina, pero no tuvo ningún efecto en los perros gravemente enfermos (Trigo et al, Clinical and Vaccine Immunology, 2010).
• HASP KMP-11 de la Universidad de York (Gran Bretaña) sobre el que deberían comenzar los primeros ensayos clínicos a finales de 2012.
[0016] En perros, existe actualmente una solución eficaz, CaniLeish®, que es un producto compuesto por antígenos de excreción-secreción (AES) de promastigotes de L. infantum y comercializado en Europa desde el 2011. Así, las medidas de prevención de la leishmaniosis canina han sido profundamente modificadas y completadas.
[0017] La vacunación no sólo controla el desarrollo de la enfermedad, sino que también reduce significativamente la carga de parásitos en el perro y, por tanto, contribuye a la interrupción del ciclo de transmisión de la LV en el flebótomo (vector de la enfermedad), el perro y el ser humano.
[0018] Sin embargo, los rendimientos de producción de los AES no son suficientes para permitir la producción a escala industrial de una vacuna humana. En efecto, la producción de los AES es bastante compleja y da lugar a un producto con un precio demasiado elevado, adaptado a un mercado canino bastante reducido.
[0019] Así, una de las principales dificultades en el desarrollo de un candidato a vacuna radica en que el producto final debe ser reproducible, termoestable y fácil de producir a bajo coste en zonas endémicas, con rendimientos de producción que hagan posible su uso a gran escala. De hecho, los resultados de un estudio reciente para evaluar la rentabilidad económica de una vacuna contra la leishmaniosis visceral en el estado de Bihar (India) en comparación con la quimioterapia apoyan firmemente el desarrollo de una vacuna contra la LV, aunque su coste sería relativamente alto (Lee et al, Am. J. Trop. Med. Hyg., 2012).
[0020] En vista de lo anterior, es urgente invertir en nuevas vías que ofrezcan una alternativa más eficaz a las vacunas existentes, para permitir la vacunación profiláctica y/o terapéutica de los pacientes contra las leishmanias, incluidos los pacientes resistentes a las terapias existentes.
[0021] El solicitante ha identificado nuevos epítopos con alta inmunogenicidad contra las leishmaniosis, lo que permite el desarrollo de vacunas eficaces y económicamente asequibles.
[0022] Así, la solución al problema planteado tiene como primer objeto un epítopo que presenta una secuencia seleccionada entre:
SEQ ID N°1: T-P-E-Q-R-T-N-T-L (epítopo HLA-B07);
SEQ ID N°2: E-L-G-K-K-W-I-G (epítopo HLA-B08);
SEQ ID N°3: T-L-P-E-M-P-V-G-V (epítopo HLA-A02);
SEQ ID N°4: P-E-M-P-A-G-V-D-Y (epítopo HLA-A01);
SEQ ID N°5: A-R-G-R-E-G-Y-F-L (epítopo HLA-B27);
SEQ ID N°6: A-R-G-A-R-G-R-E-G-Y (epítopo HLA-B44);
SEQ ID N°7: A-R-G-A-R-G-R-E-G (epítopo HLA-B27);
SEQ ID N°8: E-G-Y-F-V-T-D-E-K (epítopo HLA-A03);
SEQ ID N°9 : T-N-T-L-A-V-L-Q-A-F-G-R-A-I-P-E-L-G-K-
K-W ;
SEQ ID N°10 : E-G-Y-F-V-T-D-E-K-T-G-L-V-Y-R-D-G-G-
V-A-A-A-S-S-G;
SEQ ID N °15: X1-X2-P-E-M-P-X3-G-V-X4-X5
con
X 1 = T o ningún aminoácido
X2 = L o ningún aminoácido
X3 = A o V
X4 = D o ningún aminoácido
X5 = Y o ningún aminoácido; o SEQ ID N°16: A-R-X6-X7-X8-G-R-E-G-X9-X10-X11
con
X6 = G o ningún aminoácido
X7 = A o ningún aminoácido
X8 = R o ningún aminoácido
X9 = Y o ningún aminoácido
X i0 = F o ningún aminoácido
X11 = L o ningún aminoácido
[0023] Para responder a la necesidad de una vacuna que garantice una buena cobertura de la población mundial y que proteja contra las principales especies de leishmaniosis, el solicitante consideró la importancia de proponer una estrategia vacunal innovadora basada en fragmentos antigénicos/peptídicos capaces de activar, de forma duradera, una inmunidad celular específica dirigida contra estos parásitos. La estrategia vacunal peptídica del solicitante se basa en la identificación y selección de péptidos inmunodominantes que lleva la secuencia de una proteína de virulencia caracterizada como el principal inmunógeno de los antígenos excretados-secretados por las leishmanias, la proteína soluble PSA (antígeno prostático específico) (principal principio activo de la vacuna CaniLeish®), común y muy conservada dentro de las especies de leishmanias, responsables de las diversas infecciones humanas.
[0024] La vacunación peptídica se basa en las bases moleculares y celulares del reconocimiento del antígeno por las células T. El desarrollo de la inmunidad específica depende en gran medida de la degradación y asociación de fragmentos antigénicos, péptidos, con las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH; HLA, siglas en inglés de antígeno leucocitario humano, para los humanos). Esta asociación se convierte en específica para una molécula HLA en particular por los residuos de aminoácidos que constituyen los motivos de anclaje del péptido. Los complejos formados de esta manera son reconocidos por los linfocitos T por medio de un receptor membranoso (TcR) y necesita una interacción específica con determinados aminoácidos del epítopo T. Los epítopos T son ligandos de las moléculas HLA con afinidades altas o moderadas. Se presentan a los linfocitos T CD8+ (citotóxicos) o CD4+ (auxiliares) mediante moléculas HLA de clase I o de clase II, respectivamente.
[0025] La formación de estos complejos trimoleculares (TcR/HLA/péptido) es el requisito previo para la activación y expansión de las células T específicas y, por tanto, para la inducción de una respuesta inmunitaria protectora durante una infección.
[0026] El interés de estos péptidos es múltiple:
(i) Presentan una gran inocuidad, ya que evitan cualquier riesgo infeccioso relacionado con el uso de agentes patógenos o agentes infecciosos,
(ii) están químicamente bien definidos y, por lo tanto, cumplen con los requisitos farmacéuticos (especialmente la pureza y la reproducibilidad)
(iii) facilitan la monitorización de la respuesta inmunitaria inducida (búsqueda de linfocitos T citotóxicos (CTL) dirigidos contra un epítopo T definido), y
(iv) su secuencia puede ser modificada para hacerlos más inmunógenos.
[0027] Dichos péptidos cumplen notablemente con todas las condiciones mencionadas anteriormente: vacuna reproducible, termoestable, lo que facilita su conservación y transporte, versátil, fácil de producir a bajo coste en zonas endémicas, lo que hace posible su uso a gran escala.
[0028] Según la invención, por epítopo, compuesto peptídico o péptido se entiende cualquier epítopo, compuesto peptídico o péptido definido por su secuencia, así como sus derivados análogos, muteínas y homólogos.
[0029] Dado que los epítopos son compuestos peptídicos que presentan aproximadamente entre 8 y 15 aminoácidos, el término "compuesto peptídico" se utiliza indistintamente para designar un epítopo o un compuesto peptídico.
[0030] Según la invención, se entiende por "derivado análogo" o "derivados de muteínas" de un compuesto peptídico los derivados biológicamente activos de las moléculas de referencia que presentan la actividad deseada, es decir, la capacidad de estimular una respuesta inmunitaria mediada por células.
[0031] En general, el término "derivado análogo" se refiere a compuestos que tienen una secuencia y estructura polipeptídica con una o más adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos, en comparación con los compuestos peptídicos definidos anteriormente, siempre que las modificaciones no destruyan la actividad inmunogénica.
[0032] Se entiende por "derivado de muteína" los péptidos que presentan uno o varios elementos que imitan el péptido.
[0033] Los expertos en la materia conocen procedimientos de preparación de análogos y de muteínas polipeptídicas clásicas.
[0034] Según la invención, los análogos particularmente preferidos incluyen las sustituciones conservadoras, es decir, las sustituciones o los reemplazos sin consecuencias para la función y la estructura final de la proteína.
[0035] A título de ejemplo de dichas sustituciones, se pueden citar las sustituciones que intervienen en:
• la familia de aminoácidos compuesta por aspartato y glutamato;
• la familia de aminoácidos básicos compuesta por lisina, arginina e histidina;
• la familia de aminoácidos no polares compuesta por alanina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano; y
• la familia de los aminoácidos no cargados polares, como la glicina, la asparagina, la glutamina, la cisteína, la serina, la treonina y la tirosina.
[0036] Por ejemplo, dado que, desde el punto de vista estérico y fisicoquímico, la valina está cerca de la alanina, la sustitución de una por otra no suele alterar el funcionamiento de la proteína.
[0037] El experto en la materia podrá determinar fácilmente las regiones de los compuestos peptídicos de interés que pueden tolerar un cambio mediante técnicas bien conocidas.
[0038] Para ello, podrá, por ejemplo, utilizar matrices de similitud, M, que enumeran todas las puntuaciones M(a,b) obtenidas cuando el aminoácido a es sustituido por el ácido b en una secuencia peptídica determinada. Hay varias de estas matrices de tamaño 20 x 20, para los 20 aminoácidos, con diferentes modos de construcción. Entre las más clásicas, están las matrices de Dayhoff, llamadas PAM por "probability of acceptable mutations", basadas en las distancias evolutivas entre especies y las matrices de Henikoff, llamadas BLOSUm , basadas en el contenido de información de las sustituciones.
[0039] En cada familia, existen varias series de matrices, de rigor variable y, por tanto, más o menos tolerantes a las sustituciones de aminoácidos.
También se puede utilizar un diagrama de Venn para resaltar las relaciones entre los 20 aminoácidos de origen natural en función de una selección de propiedades fisicoquímicas consideradas importantes para determinar la estructura de las proteínas.
[0040] De acuerdo con la invención, "derivado homólogo" significa compuestos peptídicos que presentan un cierto porcentaje de identidad peptídica. El término "identidad" significa que los aminoácidos de dos secuencias peptídicas comparadas se corresponden exactamente. El porcentaje de identidad se determina mediante una comparación directa de las secuencias entre dos compuestos peptídicos, alineando dichas secuencias y contando el número exacto de desajustes entre las dos secuencias alineadas. A continuación, se divide por la longitud de la secuencia más corta y se multiplica el resultado por cien. El porcentaje de identidad también puede determinarse utilizando programas informáticos bien conocidos por el experto en la materia, como Dotlet, producido por la empresa Dotplot, Clustal X y W, como se describe en la publicación Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG: The CLUSTAL_X Windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res 1997, 25 (24):4876-4882 o Morgenstern B como se describe en la publicación DIALIGN 2: improvement of the segment-tosegment approach to multiple sequence alignment. Bioinformatics 1999, 15(3):211-218.
La base BLOCKS (Henikoff y Henikoff, 1991) ofrece, en forma de alineamientos múltiples sin inserción-deleción (o bloques), las subsecuencias de Swissprot que corresponden a regiones conservadas.
[0041] Así, según la invención, se dice que dos secuencias peptídicas son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando presentan al menos un 50 %, preferentemente al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 85 %, incluso más preferentemente al menos un 90 % y más preferentemente al menos un 95 % o más de identidad de secuencia sobre una longitud definida de las moléculas peptídicas.
[0042] Además, ventajosamente, los epítopos o compuestos peptídicos objeto de la invención están unidos a portadores que permiten hacerlos más inmunógenos. Como ejemplos no limitativos de portadores, pueden mencionarse las moléculas de KLH, del inglés Keyhole Limpet Hemocyanin, los lipopéptidos del tipo palmitoilo o sus derivados.
[0043] Las modificaciones más comunes de las proteínas por parte de los lípidos son: la isoprenilación, N-miristoilación, la palmitoilación (o S-acilación) y la glipiación.
[0044] La isoprenilación y la N-miristoilación son modificaciones cotraduccionales o inmediatamente postraduccionales y el grupo permanece unido hasta que la proteína se degrada.
[0045] La palmitoilación es postraduccional. Esta modificación es reversible y más rápida que el "recambio" de la degradación de las proteínas: por tanto, puede regularse. La glipiación es co- y postraduccional.
[0046] Los péptidos según la invención son preferentemente péptidos palmitoilados porque estos derivados interactúan con los componentes lipídicos de la membrana de las células diana, que son, por ejemplo, los macrófagos, las células dendríticas o los neutrófilos, promueven su penetración y los llevan al interior de estas para presentarlos al sistema inmunitario.
[0047] También se pueden mencionar los péptidos glicosilados como, por ejemplo, los conjugados mannosilados y los construction MAP, del inglés Múltiple Antigenic Peptides (péptidos antigénicos múltiples).
[0048] Los epítopos objeto de la invención también pueden contener uno o más grupos protectores.
[0049] En efecto, para mejorar la resistencia a la degradación, puede ser necesario utilizar una forma protegida del péptido según la invención. La forma de protección debe ser, obviamente, una forma biológicamente compatible y debe ser compatible con un uso en el campo farmacéutico. Se pueden prever numerosas formas de protección biológicamente compatibles, que son bien conocidas por el experto en la materia, como, por ejemplo, la acilación o acetilación del extremo amino-terminal, o la amidación o esterificación del extremo carboxi-terminal. Así, la invención también se refiere a un epítopo como el definido anteriormente, caracterizado por el hecho de que está en forma protegida o no. Puede utilizarse una protección basada en una sustitución en el extremo amino terminal con un grupo acetilo, un grupo benzoilo, un grupo tosilo o un grupo benciloxicarbonilo. Preferentemente, se utiliza una protección basada en la amidación de la función hidroxilo del extremo carboxi-terminal por un grupo NYY con Y representando una cadena alquílica de C1 a C4, o la esterificación por un grupo alquilo.
[0050] También es posible proteger ambos extremos del compuesto peptídico. Los derivados peptídicos se refieren también a los aminoácidos y a los péptidos unidos entre sí mediante un enlace pseudopeptídico. Por enlace pseudopéptido se entiende todo tipo de enlaces que pueden sustituir a los enlaces peptídicos convencionales. En el campo de los aminoácidos, la geometría de las moléculas es tal que pueden presentarse teóricamente en forma de isómeros ópticos diferentes. En efecto, existe una conformación molecular del aminoácido (aa) tal que desvía hacia la derecha el plano de polarización de la luz (conformación dextrógira o D-aa), y una conformación molecular del aminoácido (aa) tal que desvía hacia la izquierda el plano de polarización de la luz (conformación levógira o L-aa). Los aminoácidos naturales son siempre de conformación levógira, por lo que un péptido de origen natural estará constituido únicamente por aminoácidos de tipo L-aa. No obstante, la síntesis química en laboratorio permite preparar aminoácidos con dos conformaciones posibles.
[0051] A partir de este material básico, es por tanto posible incorporar durante la síntesis de péptido ambos aminoácidos en forma de isómeros ópticos dextrógiros o levógiros. Así, los aminoácidos que constituyen el péptido según la invención pueden estar en configuración L-, D- o DL-.
[0052] Los epítopos y compuestos peptídicos según la invención pueden obtenerse por síntesis química convencional (en fase sólida o en fase líquida homogénea) o por síntesis enzimática, a partir de aminoácidos constituyentes o de sus derivados. Los epítopos y compuestos peptídicos según la invención también pueden obtenerse por fermentación de una cepa de bacterias modificadas o no, por ingeniería genética, o por extracción de proteínas de origen animal o vegetal, preferentemente de origen vegetal, seguida de una hidrólisis controlada que libera fragmentos peptídicos correspondientes total o parcialmente a los epítopos y compuestos peptídicos según la invención.
[0053] Como se muestra en los ejemplos 1 a 4, el solicitante pudo demostrar que los diversos epítopos según la invención son secuencias de consenso comunes a las principales especies de leishmanias y tienen una afinidad alta y media por todas las moléculas de CMH (complejo mayor de histocompatibilidad) de los mamíferos, y más particularmente para todas las moléculas de HLA (antígeno leucocitario humano), que están representadas principalmente en las poblaciones humanas más gravemente afectadas por estas enfermedades.
[0054] En efecto, en el marco de una estrategia de vacunación de las poblaciones humanas expuestas a las infecciones leishmanianas y para responder a la necesidad de una vacuna que garantice una buena cobertura de la población mundial y que proteja contra la leishmaniasis, es importante utilizar fragmentos antigénicos/peptídicos capaces de activar, de manera duradera, una inmunidad celular específica dirigida contra el parásito.
[0055] Para garantizar una buena cobertura de la población mundial y en vista de la gran variabilidad del fenotipo HLA (complejo mayor de histocompatibilidad humano) entre las personas, los fragmentos antigénicos inmunógenos (péptidos) de longitud suficiente deben contener una serie de epítopos capaces de ser presentados por varios tipos de moléculas HLA de clase I y II.
[0056] Las moléculas HLA son muy polimorfas. De hecho, existen más de 2500 proteínas HLA de clase I (HLA-I) y más de 1000 proteínas HLA de clase II (HLA-II). Sin embargo, algunas de estas moléculas HLA, cercanas en secuencia y conformación espacial, pueden presentar epítopos comunes con las células T. La agrupación de varios
miles de moléculas HLA se describe actualmente en algo más de veinte categorías, denominadas "supertipos HLA", con epítopos muy conservados para cada supertipo.
[0057] Al desarrollo de vacunas peptídicas, se le añade el enfoque multiepitópico o poliepitópico (péptido que contiene varios epítopos). Este enfoque multiepitópico es ventajoso para desarrollar una vacuna para toda la población mundial. En efecto, para garantizar una buena cobertura de la población mundial y habida cuenta de la gran variabilidad del fenotipo HLA entre las personas, los fragmentos antigénicos inmunógenos (péptidos) de longitud suficiente deben contener una serie de epítopos capaces de ser presentados por varios supertipos de moléculas HLA-I y -II.
[0058] Además, los epítopos objeto de la invención tienen un alto poder inmunogénico.
[0059] Los epítopos T son secuencias antigénicas que son reconocidas por los linfocitos T. Por ejemplo, en los seres humanos, los epítopos T se derivan de la degradación de los antígenos por parte de las células presentadoras y se presentan a los linfocitos T CD8+ (citotóxicos) o CD4+ (auxiliares) mediante las moléculas HLA de clase I o de clase II, respectivamente. Por lo tanto, los epítopos T son necesariamente ligandos de las moléculas HLA y, de hecho, se encuentran entre los péptidos que se unen a las moléculas HLA con afinidades altas o moderadas.
[0060] Las células que expresan el complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (CMH2) también pueden presentar antígenos microbianos a través de CD1 a los linfocitos T gamma-delta.
[0061] Las capacidades de presentación dependen de muchas variables. Varían de una persona a otra debido al polimorfismo del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH).
[0062] Por lo tanto, la consanguinidad, al disminuir el número de CMH diferentes expresados por una persona, disminuye sus capacidades inmunitarias. También difieren según las modalidades de exposición al antígeno (dosis y vía de administración), debido a las variaciones en las capacidades de presentación de los diferentes tipos de células presentadoras. Por ejemplo, las células implicadas en la presentación serán diferentes por vía cutánea o digestiva.
[0063] Por último, la gama de péptidos producidos por un antígeno determinado será diferente según la célula presentadora (modalidades de escisión), y según la especie y el individuo (alelo del CMH).
[0064] Los compuestos peptídicos según la invención han sido seleccionados y diseñados con el fin de proporcionar una cobertura vacunal y terapéutica a las poblaciones más afectadas por las principales especies patógenas de leishmanias. Están destinados a inducir y caracterizar la prevención o el tratamiento de enfermedades en mamíferos cuya inmunidad protectora depende de la estimulación de los linfocitos de tipo Th1 y de las células T citotóxicas, característica de un estado de hiperestimulación de tipo retardado.
[0065] Muchas situaciones patológicas están asociadas a un estado inmunitario de tipo Th1 o Th2.
[0066] Por ejemplo, la exacerbación de la vía Th2, que corresponde a un estado de hiperestimulación inmediata, induce determinadas afecciones como las dermatitis atópica canina, las alergias y el asma.
[0067] La obtención de una curación para estas afecciones se logra mediante inmunoestimulantes que permiten la transición de un estado inmunitario de tipo Th2 a un estado de tipo Th1.
[0068] Por otro lado, este estado inmunitario Th1 está en plena correlación con un estado de resistencia a patógenos intracelulares como Leishmania, Trypanosoma, Candida, Mycobacterium y Listeria.
[0069] En cuanto a la inmunopatología del asma, la literatura de la última década ha designado al linfocito T específico del alérgeno como conductor de la reacción inmunoalérgica (Magnan. A et al. "Cytokines, from atopy to athsma: the Th2 dogma revisited" Cell Mol Biol, 2001, 47, 679-687). Entre los linfocitos T, la subpoblación Th2 productora de IL-4 parece estar en primera línea y ser necesaria para la inducción de esta reacción. Por lo tanto, es oportuno que se establezcan estrategias dirigidas específicamente a los linfocitos y, en particular, a los Th2.
[0070] Este tipo de estrategia también puede seguirse para la leishmaniosis, polarizando las respuestas mediadas por células hacia un estado inmunitario de tipo Th1 y promoviendo respuestas celulares citotóxicas, que permiten oponerse y controlar el proceso infeccioso.
[0071] Como se ha descrito anteriormente, otra de las principales dificultades en el desarrollo de un candidato a vacuna radica en el hecho de que, idealmente, debe ser eficaz contra varias especies de leishmanias y, en particular, contra las formas clínicas más graves (visceral y cutánea) y en diferentes huéspedes naturales de la infección (humanos, perros).
[0072] Así, el segundo objeto de la invención es un compuesto peptídico que comprende 1,2, 3 o 4 de los epítopos de las secuencias SEQ ID N° 1 a 10 como se ha descrito anteriormente, opcionalmente separados por un espaciador peptídico que comprende de 1 a 8 aminoácidos.
[0073] A modo de ejemplo no limitativo de espaciador peptídico, se pueden citar los motivos T-V, V, Y, L (Lee Y. Et al., Biomed Microdevices, 2010, 12: 207-222 .
[0074] Preferentemente, los espaciadores peptídicos utilizados son Y o T-V, o sus análogos.
[0075] A modo de compuestos peptídicos que comprenden 2 de los epítopos de la secuencia SEQ ID N° 1 a 10, como los que se han descrito anteriormente, se pueden citar los siguientes:
SEQ ID N°11: T-P-E-Q-R-T-N-T-L-T-V-E-L-G-K-K-W-I-G; o
SEQ ID N°12: T-L-P-E-M-P-V-G-V-P-E-M-P-A-G-V-D-Y; o
SEQ ID N°13 : A-R-G-R-E-G-Y-F-L-A-R-G-A-R-G-R-E-G-
Y-E-G-Y-F-V-T-D-E-K ;
[0076] A modo de compuestos peptídicos que comprenden 3 de los epítopos de la secuencia SEQ ID N° 1 a 10, como los que se han descrito anteriormente, se pueden citar los siguientes:
A modo de compuestos peptídicos que comprenden 4 de los epítopos de la secuencia SEQ ID N°1 a 10, como los que se han descrito anteriormente, se pueden citar los siguientes:
La invención se podrá comprender mejor mediante la lectura de la siguiente descripción no limitativa, redactada con arreglo a las figuras adjuntas, en las cuales:
• La figura 1 representa la localización de los epítopos HLA-I y HLA-II en las secuencias Nter-PSA de las principales especies de leishmanias.
• La figura 2 representa la localización de los epítopos HLA-I y HLA-II en las secuencias Cter-PSA de las principales especies de leishmanias, en particular en el inicio de la secuencia Cter-PSA llamada "zona 1".
• La figura 3 representa la localización de los epítopos HLA-I y HLA-II en las secuencias Cter-PSA de las principales especies de leishmanias, en particular en la segunda parte de la secuencia Cter-PSA llamada "zona 2".
Estas figuras 1 a 3 representan mapas de predicción in silico de las zonas ricas en epítopos con afinidades altas y medias para las moléculas HLA de clase I y HLA de clase II en las secuencias amino (Nter) y carboxi (Cter) terminales de los PSA.
• La figura 4 representa los compuestos peptídicos SEQ ID N°11 a 14, así como su división en epítopos y la posición de un espaciador entre los epítopos SEQ ID N°1 y SEQ ID N°2 del compuesto peptídico SEQ ID N°12.
• La figura 5 representa el resultado de un algoritmo para predecir los sitios de escisión por el proteasoma de diferentes compuestos peptídicos procedentes de la parte amino-terminal de diferentes pSa .
• La figura 6 representa el esquema de inyección utilizado en el estudio del estado inmunitario de los perros antes y después de la vacunación con los compuestos según la invención.
[0077] En los ejemplos 3 a 8, se describen otros ejemplos de compuestos peptídicos según la invención.
[0078] Preferentemente, los compuestos peptídicos según la invención se seleccionan entre:
SEQ ID N °9 : T - N - T - L - A - V - L - Q - A - F - G - R - A - I - P - E - L - G - K -
K-W ; o
SEQ ID N ° 10 : E -G -Y - F -V -T - D -E -K -T - G -L - V - Y - R - D -G -G -
V -A -A -A -S -S -G ; o
SEQ ID N°11: T-P-E-Q-R-T-N-T-L-T-V-E-L-G-K-K-W-I-G; o
SEQ ID N°12: T-L-P-E-M-P-V-G-V-P-E-M-P-A-G-V-D-Y; o
SEQ ID N ° 13 : A -R -G -R -E -G -Y -F -L -A -R -G -A -R -G -R -E -G -
Y - E - G - Y - F -V -T - D -E -K ;
[0079] Como se ha indicado anteriormente, según la invención, los compuestos peptídicos SEQ ID N° 9 a 13 incluyen sus derivados análogos, muteínas y homólogos.
[0080] Entre los derivados posibles de los compuestos peptídicos anteriores SEQ ID N° 9 a 13, se seleccionarán preferentemente los derivados peptídicos de los compuestos anteriores que tengan al menos cinco aminoácidos contiguos.
[0081] Un tercer objeto de la invención se refiere a una composición como producto farmacéutico, para uso veterinario o humano que comprende al menos:
• un epítopo de secuencia seleccionado entre las secuencias SEQ ID N° 1 a 10; o
• un compuesto peptídico que comprende 1, 2, 3 o 4 de los epítopos de la secuencia SEQ ID N° 1 a 10, opcionalmente separados por un espaciador como se ha definido anteriormente; o
• un compuesto peptídico de secuencia seleccionada entre SEQ ID N°11 a 13.
[0082] La invención también se refiere a una composición de este tipo para su uso en la vacunación profiláctica y terapéutica dirigida contra una o más de las leishmanias como Leishmania donovani, Leishmania infantum, Leishmania chagasi, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leishmania trópica, Leishmania major, Leishmania aethiopica, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) panamensis, Leishmania (Viannia) peruviana.
[0083] Ventajosamente, la composición según la invención es adecuada para su uso en la vacunación profiláctica y terapéutica dirigida contra al menos 3, preferentemente al menos 7, más preferentemente al menos 10, y más preferentemente contra todas las leishmanias enumeradas anteriormente.
[0084] Preferentemente, la composición según la invención se administra por vía subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, parenteral u oral.
[0085] Un objeto adicional de la invención se refiere a una composición como la definida anteriormente como medicamento, vacuna o reactivo de diagnóstico in vitro y/o in vivo, para la inducción o el diagnóstico, en un mamífero, de la transición de un estado inmunitario de tipo Th2 a un estado inmunitario de tipo Th1.
[0086] Un objeto adicional de la invención se refiere a una composición como la definida anteriormente como medicamento, vacuna o reactivo de diagnóstico in vitro y/o in vivo, para la inducción o el diagnóstico, en un mamífero, de anticuerpos específicos y, más particularmente, de isotipos IgG2.
[0087] Un problema adicional que la presente invención propone resolver es tener una vacuna capaz de conferir inmunoprotección cruzada contra las diferentes especies de leishmaniosis. La gran comunidad antigénica que comparten las leishmanias permite considerar el desarrollo de una única vacuna polivalente, compuesta por inmunógenos comunes y muy conservados. Dirigirse a un/unos antígeno(s) común(es) a todas las especies de leishmanias como vacuna debería, sin duda, representar una ventaja real en términos de vacunación cruzada.
[0088] Así, un cuarto objeto de la invención se refiere a una vacuna contra las leishmanias que comprende al menos:
• Un epítopo de secuencia seleccionado entre las secuencias SEQ ID N° 1 a 10; o
• un compuesto peptídico que comprende 1, 2, 3 o 4 de los epítopos de secuencias SEQ ID N°1 a 10, opcionalmente separados por un espaciador como el que se ha definido anteriormente; o
• un compuesto peptídico de secuencia seleccionada entre SEQ ID N°11 a 13.
[0089] Dicha vacuna se utiliza ventajosamente para una vacunación profiláctica y terapéutica contra una o más de las leishmanias seleccionadas entre Leishmania donovani, Leishmania infantum, Leishmania chagasi, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leishmania Tropica, Leishmania major, Leishmania aethiopica, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) panamensis, Leishmania (Viannia) peruvian.
[0090] Dicha vacuna objeto de la invención está ventajosamente destinada a los seres humanos, cánidos, félidos y équidos. Preferentemente, la vacuna objeto de la invención está destinada a los seres humanos y a los perros.
[0091] Preferentemente, la vacuna según la invención comprende al menos dos epítopos o compuestos peptídicos, de los cuales al menos un epítopo se selecciona entre:
• Un epítopo de secuencia seleccionada entre las secuencias SEQ ID N° 1 a 10; o
• un compuesto peptídico que comprende 1, 2, 3 o 4 de los epítopos de secuencia de la SEQ ID N° 1 a 10, opcionalmente separados por un espaciador como se ha definido anteriormente; o
• un compuesto peptídico de secuencia seleccionada entre SEQ ID N°11 a 13.
[0092] Aún más preferentemente, la vacuna según la invención comprende al menos dos epítopos o compuestos peptídicos seleccionados entre:
• un epítopo de secuencia seleccionada entre las secuencias SEQ ID N° 1 a 10; o
• un compuesto peptídico que comprende 1, 2, 3 o 4 de los epítopos de secuencias SEQ ID N°1 a 10, opcionalmente separados por un espaciador como el que se ha definido anteriormente; o
• un compuesto peptídico de secuencia seleccionada entre los números SEQ ID N°11 a 13.
[0093] Además, un problema adicional que la presente invención se propone resolver es el de disponer de una vacuna capaz de garantizar una cobertura vacunal mundial. Por lo tanto, este candidato a vacuna debe ser reconocido preferentemente por todas las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y clase II que están representadas predominantemente en las poblaciones humanas más afectadas por estas enfermedades.
[0094] En este contexto, además de los aspectos de seguridad, eficacia y viabilidad industrial propios del desarrollo de una vacunación, una vacuna contra las leishmaniosis debe cumplir también con una serie de requisitos más específicos. El desarrollo de una vacuna de este tipo va acompañado de dificultades adicionales debido a la complejidad del ciclo vital de las leishmanias, la diversidad genética (más de 20 especies de leishmanias son responsables de las infecciones humanas) y los mecanismos de escape extremadamente sofisticados que estos patógenos han desarrollado durante la evolución para establecerse en las células inmunitarias clave frustrando y utilizando en su beneficio las respuestas inmunitarias del huésped. A esto se suma la extrema diversidad y pobreza de las poblaciones afectadas por estas enfermedades.
[0095] Una dificultad adicional para lograr el último objetivo de la presente invención es no sólo realizar un estudio sobre la leishmaniosis visceral y obtener resultados que puedan ser transpuestos con eficacia y seguridad a los perros y a los humanos, sino obtener una única vacuna adecuada para la prevención y el tratamiento de todas las especies de Leishmania en mamíferos, y teniendo en cuenta la complejidad del polimorfismo HLA de los humanos.
[0096] Así, según un modo de realización preferido de la invención, la vacuna según la invención comprende ventajosamente, por una parte, al menos un compuesto peptídico elegido entre SEQ ID N° 9 y 10;
y, por otro lado, al menos un compuesto peptídico elegido entre las secuencias SEQ ID N° 11 a 13,
siendo dichas secuencias tal y como se ha definido anteriormente. Por supuesto, como se ha indicado anteriormente, según la invención, los compuestos peptídicos anteriores incluyen sus derivados análogos, muteínas y homólogos.
[0097] Preferentemente, entre los derivados posibles, se seleccionarán, preferentemente, los derivados peptídicos de los compuestos anteriores que constan al menos de cinco aminoácidos contiguos.
[0098] El enfoque multiepitópico de una vacuna peptídica conduce al desarrollo de una vacuna para toda la población mundial. Para garantizar una buena cobertura de la población mundial y en vista de la gran variabilidad del fenotipo HLA (complejo mayor de histocompatibilidad humano) entre las personas, los fragmentos antigénicos inmunógenos (péptidos) de longitud suficiente deben contener, preferentemente, una serie de epítopos capaces de ser presentados por varios tipos de moléculas HLA-I y -II.
[0099] La identificación de epítopos dentro de los antígenos principales y conservados de Leishmania, reconocido por las células T, abren nuevas perspectivas en materia de inmunoterapia e inmunoprofilaxis de la Leishmaniosis.
[0100] Así, la detección de los primeros péptidos transportados por la parte carboxi-terminal del antígeno mayor PSA ha permitido obtener un candidato a vacuna peptídica en perros que induce una respuesta mediada por células que confiere un buen nivel de protección contra una infección experimental con Leishmania infantum (patente FR2829767) así como una respuesta significativa de anticuerpos específicos IgG2 que permite distinguir en una zona endémica un huésped vacunado de un huésped no vacunado pero infectado (patente FR2932802).
[0101] Como se muestra en los ejemplos 3 y 4, el solicitante ha podido demostrar que los epítopos o compuestos peptídicos SEQ ID N° 1 a 8, SEQ ID N° 11 a 13 son compuestos peptídicos que tienen afinidad por las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I.
[0102] Asimismo, el solicitante ha demostrado que los epítopos o compuestos peptídicos SEQ ID N° 9 y 10 son reconocidos por las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II.
[0103] Sorprendentemente, el solicitante ha demostrado que todos estos péptidos son comunes a todas las especies de Leishmania.
[0104] Preferentemente, la vacuna según la invención comprende así, por una parte, al menos uno o dos compuestos peptídicos elegidos entre SEQ ID N° 9 y 10;
y, por otra parte, al menos uno, dos o tres compuestos peptídicos elegidos entre las secuencias SEQ ID N° 11 a 13, siendo dichas secuencias tal y como se ha definido anteriormente.
[0105] Preferentemente aún, la vacuna según la invención comprende, en combinación, los cinco compuestos peptídicos multiepitópicos SEQ ID N° 9 a 13, siendo dichas secuencias tal y como se ha definido anteriormente. Por supuesto, como se ha indicado anteriormente, según la invención, los compuestos peptídicos anteriores incluyen sus derivados análogos, muteínas y homólogos.
[0106] Estos cinco compuestos peptídicos tienen en cuenta la extrema diversidad de las especies de leishmanias y el alto nivel de polimorfismo h La .
[0107] Los compuestos peptídicos que se han seleccionado ventajosamente están destinados a inducir la prevención o el tratamiento de las leishmaniosis en los mamíferos, en particular en los seres humanos, cuya inmunidad protectora depende de la estimulación de los linfocitos de tipo Th1 (células T helper CD4+) y de los linfocitos T citotóxicos c D8+. Este estado inmunitario Th1 y citotóxico está en plena correlación con un estado de resistencia a patógenos intracelulares como Leishmania, Trypanosoma, Candida, Mycobacterium y Listeria.
[0108] Para la elaboración específica de estos compuestos peptídicos, el solicitante tuvo que considerar, investigar y caracterizar, a través de numerosos experimentos, los polimorfismos HLA más frecuentemente encontrados en las poblaciones humanas expuestas a las infecciones leishmanianas, a los que se limitan las respuestas mediadas por las células del huésped (HLA-I: respuesta citotóxica CD8+; HLA-II: respuestas auxiliares CD4+).
[0109] Se determinó el polimorfismo HLA representativo de la población humana mundial y se seleccionaron los supertipos para el diseño de una vacuna contra las leishmaniosis.
[0110] El alineamiento de las secuencias amino y carboxi-terminal de los PSA (de Promastigote Surface Antigen) de las principales especies de leishmanias capaces de infectar, junto con los métodos de predicción in silico basados en las propiedades de unión de las secuencias peptídicas con respecto a las moléculas HLA, llevaron a:
• localizar las regiones más conservadas entre los PSA (partes carboxi y amino-terminal) de las diferentes especies de leishmanias;
• establecer los mapas de predicción in silico de las zonas ricas en epítopos con afinidades altas y medias para las moléculas HLA de clase I y HLA de clase II en las secuencias de PSA (partes carboxi y aminoterminal);
• seleccionar secuencias peptídicas de consenso ricas en epítopos HLA-I y HLA-II y diseñar secuencias multiepitópicas HLA de clase I consenso y optimizadas, presentando un buen proceso de presentación de los epítopos y una conservación de las puntuaciones de unión para construir compuestos peptídicos multiepitópicos (de 18 a 28 aminoácidos) con el objetivo de aumentar las posibilidades de activación del sistema inmunitario.
[0111] Como se demuestra en los ejemplos 1 a 6 siguientes, la combinación específica de los cinco compuestos peptídicos SEQ ID N° 9 a 13 permite responder con una gran eficacia a los inconvenientes y las limitaciones de los modelos presentados anteriormente. Como se muestra en los ejemplos 7 y 8, el solicitante analizó la eficacia de esta vacuna peptídica in vivo y en ensayos clínicos en perros y en pruebas ex vivo en células humanas.
[0112] De manera ventajosa, la vacuna objeto de la invención comprende, además, un adyuvante que permite, preferentemente, aumentar la respuesta inmunitaria a los compuestos peptídicos objeto de la invención. Los adyuvantes son, la mayoría de las veces, sustancias minerales, aceitosas o derivadas de algunos microorganismos. Preferentemente, el o los adyuvantes asociados a los compuestos peptídicos objeto de la invención inducen una respuesta y mediación celular y se seleccionan entre las clases TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, las saponinas, las emulsiones aceite en agua o agua en aceite, los polisacáridos, los liposomas catiónicos, los virosomas o los polielectrolitos. Entre las diferentes clases, se puede citar, a modo de ejemplo no limitativo, los compuestos Poly I:C, Poly A:U, MPL, RC530, GLA, flagelina, Imiquimod, Resiquimod, CpG, IC41, QS21, escualano, escualeno, tocoferol, inulina, DDA y polioxidonio, QA21, saponina, quil-A, o cualquier otro derivado de estos conocidos por el experto en la materia, tomados solos o combinados.
[0113] Preferentemente, la relación compuestos peptídicos/adyuvante se encuentra comprendida entre 3/1 y 3/3.
[0114] Según un modo particular de realización de la invención, la vacuna comprende, además, un compuesto peptídico ciclado por puente disulfuro formado por una secuencia de 34 aminoácidos y representado como E34P.
[0115] Este compuesto peptídico de 34 aminoácidos (E34P) está formado por la secuencia SEQ ID N° 14 siguiente: E-D-EH-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R-G-T-P-T-P-A-P.
[0116] Este compuesto peptídico está ciclado por puente disulfuro entre la cisteína en la posición 9 (Cys 9) y la cisteína en la posición 15 (Cys 15). El compuesto peptídico E34P es ventajosamente capaz de inducir una respuesta de los anticuerpos notable, que permite discriminar en una zona endémica un huésped vacunado de un huésped no vacunado pero infectado. Esta ciclización del compuesto peptídico es esencial para la aparición de los anticuerpos específicos IgG2, la ciclización en puente disulfuro entre las cisteínas 9 y 15 induce una conformación específica responsable de esta síntesis de IgG2. En efecto, la no ciclización del compuesto peptídico en Cys 9/Cys 15 sólo induce una pequeña síntesis en la IgG2, a veces, difícil de detectar.
[0117] Por supuesto, como se ha indicado anteriormente, según la invención, el compuesto peptídico E34P incluye sus derivados análogos, muteínas y homólogos, tal y como se ha definido anteriormente.
[0118] De manera particularmente ventajosa, la vacuna según la invención comprende los compuestos peptídicos objeto de la invención en la siguiente relación:
SEQ ID N°9 / SEQ ID N°10 / SEQ ID N°11 / SEQ ID N°12 / SEQ ID N°13: 20 / 20 / 20 / 15 / 25.
[0119] De manera todavía más ventajosa, la vacuna según la invención comprende los compuestos peptídicos objeto de la invención, así como el compuesto peptídico E34P en la siguiente relación:
SEQ ID N°9 / SEQ ID N°10 / SEQ ID N°11 / SEQ ID N°12 / SEQ ID N°13 / SEQ ID N°14: 20 / 20 / 20 /15 / 25 / 10.
[0120] Finalmente, un último problema que la presente invención propone resolver es el de disponer de una vacuna con capacidad de inducir respuestas inmunitarias que permitan distinguir a un huésped vacunado de un huésped infectado. De hecho, como ocurre con muchas enfermedades parasitarias, el diagnóstico clínico sigue siendo incierto porque los síntomas son poco específicos, a menudo están ausentes (hay muchos portadores asintomáticos) y sólo aparecen realmente en una fase muy avanzada de la infección, que entonces se vuelve extremadamente difícil de tratar. El diagnóstico serológico, que consiste en la detección de anticuerpos circulantes específicos, se realiza de forma rutinaria (técnica de inmunofluorescencia indirecta). Cuando se administra una vacuna, generalmente se generan anticuerpos específicos que a menudo también pueden producirse durante una infección. La presencia de tales anticuerpos en un huésped puede, entonces, llevar a confusión en el sentido de que la infección y la vacunación tienen la misma firma.
[0121] De esta manera, según un modo de realización preferido de la invención, la vacuna comprende además al menos una firma. La firma puede ser cualquier antígeno que pueda generar anticuerpos específicos durante una inmunización, pero no producidos durante una infección.
[0122] A modo de ejemplo no limitativo de firma que puede utilizarse según la invención, se puede citar el compuesto peptídico ciclado por puente disulfuro E34p , descrito anteriormente. Este compuesto peptídico de 34 aminoácidos (E34P) está compuesto por la secuencia SEQ ID N° 14 siguiente: E-D-EH-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R-G-T-P-T-P-A-P. Este compuesto peptídico está ciclado por puente disulfuro entre la cisteína en la posición 9 (Cys 9) y la cisteína en la posición 15 (Cys 15).
[0123] Según un modo de realización adicional, la invención se refiere, asimismo, a una secuencia de nucleótidos que codifica:
• un epítopo de secuencia seleccionado entre las secuencias SEQ ID N° 1 a 10; o
• un compuesto peptídico que comprende 1, 2, 3 o 4 de los epítopos de secuencia de la SEQ ID N° 1 a 10, opcionalmente separados por un espaciador como se ha definido anteriormente; o
• un compuesto peptídico de secuencia seleccionada entre los números SEQ ID N°11 a 13.
[0124] La invención se refiere, asimismo, a un vector de expresión que comprende al menos una secuencia de nucleótidos tal y como se ha definido anteriormente, así como los medios necesarios para su expresión.
[0125] Por último, la invención se refiere a un reactivo de diagnóstico que comprende:
• un epítopo de secuencia seleccionado entre las secuencias SEQ ID N° 1 a 10; o
• un compuesto peptídico que comprende 1, 2, 3 o 4 de los epítopos de la secuencia SEQ ID N° 1 a 10, opcionalmente separados por un espaciador como se ha definido anteriormente; o
• un compuesto peptídico
de secuencia seleccionada entre SEQ ID N° 11 a 13.
[0126] La presente invención se ilustrará a continuación por medio de los ejemplos siguientes:
Ejemplo 1: Análisis de los supertipos HLA para una eficacia mundial
[0127] Para desarrollar epítopos o compuestos peptídicos multiepitópicos, el solicitante ha investigado, identificado y caracterizado los supertipos HLA más frecuentes en todo el mundo, especialmente en las poblaciones humanas expuestas a infecciones leishmanianas. Las tablas 1 y 1 bis siguientes representan la frecuencia media de los supertipos HLA-I y -II en los países más afectados por la leishmaniosis, en la población mundial y los haplotipos asociados.
Tabla 1:
Tabla 1 bis:
[0128] Los porcentajes calculados en las tablas 1 y Ibis anteriores se han estimado a partir de Sette A. y Sidney J. Immunogenetics, 1999.
[0129] A continuación, el solicitante determinó las combinaciones de supertipos HLA de clase I que debían tenerse en cuenta para la búsqueda e identificación de compuestos peptídicos T multiepitópicos capaces de garantizar la cobertura vacunal de las poblaciones más gravemente afectadas por las leishmaniosis.
[0130] La tabla 2 siguiente destaca los supertipos seleccionados y muestra que, si se tienen en cuenta, en combinación, diversos supertipos HLA, especialmente HLA-I, se puede garantizar una mejor cobertura vacunal de la población mundial.
T l 2:
[0131] Como en la tabla 1, los porcentajes calculados en la tabla 2 anterior se han estimado a partir de Sette A. y Sidney J. Immunogenetics, 1999]
[0132] Como se muestra en la tabla 2 anterior, los supertipos HLA-I que deben ser reconocidos por los compuestos peptídicos que entran en la composición de un candidato a vacuna según la invención para garantizar una cobertura vacunal aceptable contra las leishmaniosis son, por lo tanto, los supertipos HLA-A02, A03 y HLA-B07. Preferentemente, para garantizar una buena cobertura vacunal, los supertipos HLA-I que deben ser reconocidos por los compuestos peptídicos son los supertipos HLA-A01, A02, A03, A24 y HLA-B07 y B44, preferentemente los supertipos HLA-A01, A02, A03, A24 y HLA- B07, B27, B44, B58 y B62.
[0133] De manera particularmente ventajosa, los supertipos HLA-I que deben ser reconocidos por los compuestos peptídicos son los supertipos HLA-A01, A02, A03, A24 y HLA-B07, B08, B27, B44, B58 y B62, enumerados en la tabla 1 anterior.
[0134] Con respecto a los supertipos HLA-II, los supertipos seleccionados son los supertipos HLA-DR1, DR2, DR3, DR4, DR5, DR7, DRB5 y DPB1.
[0135] Teniendo en cuenta lo anterior, el solicitante ha podido establecer que una vacuna que comprende epítopos o compuestos multiepitópicos reconocidos por el conjunto de supertipos HLA anteriores garantizaría, por consiguiente, una cobertura vacunal óptima en el mundo.
Ejemplo 2: Identificación de secuencias de consenso en los diferentes PSA (de Promastigote Surface Antigen) [0136] El solicitante ha identificado y estudiado las secuencias amino y carboxi-terminales de los PSA de las principales especies de leishmanias capaces de infectar a los seres humanos, con el fin de destacar las zonas altamente conservadas, también conocidas como zonas de "consenso".
[0137] Las secuencias amino-terminales de los PSA (Nter-PSA) de las principales especies de leishmanias se identifican a continuación. Se representan sin el péptido señal de las vías de excreción-secreción.
Nter Lma A3B [protein=LaPSA-38S;acc=ACY70940]
AGTSDFTEAQQTNTLTVLQAFARAIPALGDTWTGSDFCSWKHIICDSPGVGV
WMGDVDYTGTLPEMPASVDYKDV
Nter Li IJ11 [protein=LiPSA-50S; acc=ACY7Q941]
AVKDDFTAAQRTNTLAVLEAFGRAIPELGKLWKGDDFCFWESVVCDVTEVYL
WEIGATYTGTLPEMPVDVDYTAV
Nter PSAb Ldd [protein=LdPSAb;acc-AAY96325]
AGKDDFTPEQRTNTLAVLQAFGRAIPELGKKWIGNDFCAWEYIKCYSSAVSL
VÍMDSVDYAGTLPEMPAGVDYKHV
Nter PSA2 LmjF12.0980
[protein=PSA2;acc-XP 001681679]
AGTGDFTAAQRTNTLAVLQAFGRAIPKLGEKWAGNDFCSWEAVLCNAPDVYV
SGISPTYAGTLPEMPVNVDYRHV
Nter PSA2 Lm.jFl2.0755
[protein=PSA2;acc=XP 001681698] GTNDFTAAQRTNr2TAVLQAFGRAT?E:,GEKXAGXDFCSviFFTVCXV',rGVNVR GISPTYAGTLPEIPVNVDYRHV
Nter PSA2 LTropica [protein=PSA2;acc= AAF80491]
AGTGDFTDEQRTNTLAVLQAFGSAIPELGEKWTGDDFCSWDHVTCVSLSVFV
RLDVS TYAGTL PEMPVGVDYSHV
Nter GP46 LChagasi 627aa [protein=GP46;acc=AARll511]
AGISDFTSAQQLNTLAVLQAFGRAIPELGKLWTGDDFCSWDFIKCVSSGARV
WLKGATYAGTLPQMPAGVDYKHV
Nter GP46 LChagasi 417aa [protein=GP46;acc=AAB62271]
VKEDNLTETQKSNTLAVLQAFGRAIPEVKKLWKGDDFCSWKYVYCYPSAVGV
LMDSVDYAGSLPEMPAGVDYTNV
Nter SurfaceAntigenProt Lbraz912aa
[protein=surface antigen protein;acc=XP 001563125]
TVTGDFTAEQQSNTLAVLQAFAGAIPELQSTWSGSDFCSWGGVTCAVSSVRV
AGINAMYTGTLPEMPAGVDYANV
Nter lca08protl Lbraz 793aa (field strain) 750B FW
and REV
TVTGDFTAEQQSNTLAVLQAFAGAIPELQSTWSGSDFCSWGGVTCAVSSVRV
AGINAMYAGTLPEMPAGVDYANV
Nter Ldd K59 (Field strain) AP1-P3
AGKDDFTPEQRTNTLKVLQAFGRAIPELGKKWIGNDFCAWEYIKCYSSAVSL
WMDSVDYAGTLPGMPAGVDYKHV
Nter Ldd8 c!2 montp2 IRD [reference strain]P1-P3
AGKDDFTPEQRTNTLKVLQAFGRAIPELGKKWIGNDFCAWEYIKCYSSAVSL
WMDSVDYAGTLPEMPAGVDYKHV
Nter Ldi K263 c12 Montp IRD [reference strain] P1-P3
AVKDDFTAAQRTNTLAVLEAFGRAIPELGKLWKGDDFCFWEPVVCDVTEVYL
WEIGATYTGTLPEMPVDVDYTAV
[0138] Las secuencias carboxi-terminales de los PSA (Cter-PSA) de las principales especies de leishmanias se identifican a continuación. Se representan sin el péptido señal del anclaje GPI. El glicosilfosfatidilinositol o GPI permite el anclaje extracelular de diversas moléculas, en particular las proteínas (enzimas) a las membranas celulares. Una bisagra es la encargada de permitir que la molécula permanezca unida a la membrana y desempeñe su función.
Cter A3B [protein=LaPSA-38S;acc=ACY70940]
KDRLDVTIEEWHMGEDCKLANACRPTAAPGTTTTNPPTTTGTPAASSTPSPG
SGCEVDGCEVCEGDSAARCARCREGYSLTDEKTCLANHDGGVAAAS
Cter IJ11 [protein=LiPSA-50S; acc=ACY70941]
KAGLVVEIEDKHTGNSCIAGADCATTTTTTTEPTSTASPTATPTSAPETECE
VDGCEVCDGDSAARCARCREGYFLTDERTCLVYRDGGWAVSTG
Cter PSAb Ldd [protein=LdPSAb;acc=AAY96325] TQRIAVTIEDEHKGRNCKLENKCRQAAPTTTATPTATPTLAPETECEVDGCE VCEGDSAARCARCGAGYFLTSEKTCRANGDGGRMVSS
Cter PSA2 LmjF12.0980 [protein=PSA2;acc=XP 001681679]
KAGLVVDIEDKHKGSDCLAAKDCTTTTTKPSATTATTPNLTNFPPTPRTTTE PLTTTSTEAPAEPTTTTEAPAEPTTTATPTNTPTPAPETECEVDGCEVCEGD SAARCARCREDYFLTDEKTCLKHND
Cter PSA2 LmjF12.0755
[protein=PSA2;acc= XP 001681698] KAGLVVGIEDKHKGSDCLAAKDCTTTTTKPPTTTTTPTKPPATTTTEAPAEP TTTTEAPAEPTTTTEAPAEPTTTTEAPAEPTTTTEAPAEPTTTATPTNTPTP APETECEVDGCEVCEGDSAARCARCREDYFLTDERTCLVYCD
Ct.er P5A2: i.trópica ,[prptein=PSA2;.a.cc=__AAF804911 KANLVVDIEDEHKGTNCLAGPDCTTTTTTTTTTKPPTTTTTTTKPPTTTTTT TKPPTTTTTTTTKPPTTTTTTTTEPPATTTTTTTKPPTTTTTEAPAEPTTTA TPTN'TPTPAPETECEVDGCEVCEGDSAARCARCGDDYFLTDEKTCLVYCDGG VAAASSGV
Cter GP46 LChaqasi 627aa [protein=GP4 6;acc=AARH511 ] KAGLVVSIEDKHTGNNCIASGECTTTTTTTTTTTKPPTTTTTKPPTTTTTTT KPPTTTTTKPPTTTTTTTKPPTTTTTKPPTTTTTKPPTTTTTTTKPPTTTTT KPPTTTTTKPPTTTTEAPSEPTTTASPTATPTPAPETECEVDGCEVCDGDSA ARCARCREGYFLTDXRTCLVYCD GGWAAT
Modif : TDERTCLVYCDGGVVAAT
Cter GP46 LChaqasi 417aa [protein=GP46;acc=AAB62271] KRKLMVTIEADHEGRNCKLENKCRPAAPTTTTTTTSTTTKRATASTSTTTTT TVPPTLPSTTATPTATPTPAPETECEVDGCEVCEEDSAARCARCREGYFVTS EKTCLMTTDGGLAAALS
Cter SurfaceAntigenProt Lbraz912aa [protein=surface antiqen protein;acc=XP 001563125] KPGLVVSIEDEHMGNDCTTENICPTTTTTTTTTTTSTEPPAVSTTTTTSTEP PAVSTTTTTSTEPPAVSTTTTTSTESPAVSTTTTTSTEPPAVSTTTTTSTEP PAVSTTTTTSTEPPAVSTTTTTTSTEPPAVSTTTTTTSTEPPAVSTTTTTST ESPAVSTTTTTSTEPPAVSTTTTTSTEPPAVSTTTTLSPDTRCEVDGCAKCE
Cter lca08protl Lbraz 793aa (field strain) 75QB FW
and REY
KPGLVVSIEDEHMGNDCTTENICPTTTTTTTTTTTSTEPPAVSTTTTTSTEP
PAVSTTTTTSTESPAVSTTTTTSTESPAVSTTTTTSTEPPAVSTTTMTSTES
PAVSTTTTLSPDTRCEVDGCAKCEDDSSVRCARCHDDYYLMDDKTCLVYCAD
DVAAAPSGVLTAAVVCVVTLFSMGLVMGCRGCPVQTT
Cter Ldd K59- (Field strain) AP1-P3
TQRIAVTIEDEHKGRNCKLENKCRQAAPTTTATPTATPTLAPETECEVDGCE
VCEGDSAARCARCREGYFLTSEKTCRANGDGGVAAVSS
Cter Ldd8 c!2 montp2 IRD [reference strain]P1-P3
TQRIAVTIEDEHKGRNCKLENKCRQAAPTTTATPTATPTLAPETECEVDGCE
VCEGDSAARCARCREGYFLTDEKTCL
Cter Ldi K263 c!2 Montp IRD [reference strain] P1-P3
KAGLAVEIEDKHTGNSCIAGADCATTTTTTTEPTSTASPTATPTSAPETECE
VDGCEVCDGDSAARCARCREGYFLTDEKTCL
Identificación de secuencias de consenso amino-terminales de los PSA de diferentes especies de leishmanias:
[0139] Las secuencias amino-terminales de los PSA (Nter PSA) se alinearon con el objetivo de localizar las regiones más conservadas entre los PSA de las diferentes especies de leishmanias.
[0140] En la tabla 3 siguiente, se ilustra el alineamiento de las secuencias amino-terminales de los diferentes PSA (Nter-PSA). Los aminoácidos representados en blanco sobre fondo negro destacan las secuencias que presentan la mayor homología y más conservadas. Se trata de secuencias de consenso.
[0141] Los diferentes símbolos representados en las secuencias destacan el grado de homología o de identidad entre las diferentes secuencias alineadas.
[0142] El símbolo "*" indica que el aminoácido del rango considerado es el mismo para cada una de las secuencias; se habla, pues, de identidad. El símbolo ": " indica una alta homología y el símbolo ". " indica una baja homología.
[0143] La ausencia de símbolos indica la ausencia de homología. La "N-" delante de las secuencias alineadas en la tabla 3 indica que se trata del extremo amino-terminal de dichas secuencias.
[0144] Las secuencias estudiadas provienen de diferentes tipos de leishmanias. Las diferentes siglas de la tabla 3 siguiente indican de qué tipo de leishmania provienen las secuencias estudiadas: "LMJ" para Leishmania major, "LDI" para L. infantum, "LDD" para L. donovani, "LCHA" para L. chagasi, "LAMA" para L. amazonensis, "LBRA" para L. braziliensis y "LTRO" para L. tropica.
Tabla 3:
[0145] Como resultado del alineamiento de secuencias anteriores, el solicitante ha podido establecer las zonas en las que las secuencias muestran la mayor homología.
Identificación de secuencias de consenso carboxi-terminales de los PSA de las diferentes especies de leishmanias:
[0146] De la misma manera, se alinearon las secuencias carboxi-terminales de los PSA (Cter-PSA). La tabla 4 siguiente ilustra el alineamiento de la parte carboxi-terminal de las secuencias de los diferentes PSA.
[0147] Como en la tabla 3, los aminoácidos representados en blanco sobre fondo negro destacan las secuencias que presentan la mayor homología y más conservadas, o secuencias de consenso.
[0148] La "C" delante de las secuencias alineadas en la tabla 4 indica que se trata del extremo carboxi-terminal de dichas secuencias.
[0149] Los diferentes tipos de leishmanias estudiados son los mismos que los estudiados en la tabla 3. Las siglas de la tabla 4 permiten identificarlos.
Tabla 4:
[0150] Como resultado del alineamiento de secuencias anterior, el solicitante pudo establecer dos zonas principales en las que las secuencias muestran la mayor homología.
[0151] Los alineamientos anteriores permitieron localizar zonas de "consenso", es decir, las zonas más conservadas entre los PSA de las diferentes especies de leishmanias.
Ejemplo 3: Selección y optimización de epítopos en función de su afinidad con las diferentes moléculas HLA de clase I y HLA de clase II
[0152] Los diferentes derivados de estas secuencias de "consenso" fueron sometidos a prueba mediante métodos de predicción in silico basados en las propiedades de unión de secuencias peptídicas con respecto a las moléculas HLA. Se han realizado mapas de predicción in silico de las zonas ricas en epítopos de alta y media afinidad para las moléculas HLA de clase I y HLA de clase II en las secuencias de los PSA (partes carboxi y amino-terminal).
[0153] Las figuras 1,2 y 3 ilustran la localización de los epítopos HLA en las secuencias de diferentes PSA.
[0154] Estos resultados permitieron la selección y optimización de secuencias peptídicas de consenso ricas en epítopos HLA-I y HLA-II.
[0155] Como resultado de estas pruebas, se seleccionaron los siguientes 10 epítopos:
SEQ ID N°1: T-P-E-Q-R-T-N-T-L (epítopo HLA-B07);
SEQ ID N°2: E-L-G-K-K-W-I-G (epítopo HLA-B08);
SEQ ID N°3: T-L-P-E-M-P-V-G-V (epítopo HLA-A02);
SEQ ID N°4: P-E-M-P-A-G-V-D-Y (epítopo HLA-A01);
SEQ ID N°5: A-R-G-R-E-G-Y-F-L (epítopo HLA-B27);
SEQ ID N°6: A-R-G-A-R-G-R-E-G-Y (epítopo HLA-B44);
SEQ ID N°7: A-R-G-A-R-G-R-E-G (epítopo HLA-B27);
SEQ ID N°8: E-G-Y-F-V-T-D-E-K (epítopo HLA-A03);
SEQ ID N°9: T-N-T-L-A-V-L-Q-A-F-G-R-A-l-P-E-L-G-K-K-W; y
SEQ ID N° 10 : E-G-Y-F-V-T-D-E-K-T-G-L-V-Y-R-D-G-G-V-A-A-A-S-S-G .
Ejemplo 4: Construcción de compuestos peptídicos multiepitópicos
a. Compuestos peptídicos multiepitópicos HLA-I:
[0156] Los epítopos que presentan la afinidad más elevada para las moléculas HLA-I se ensamblaron en compuestos peptídicos multiepitópicos (de 18 a 28 aminoácidos) con el objetivo de incrementar las posibilidades de activación del sistema inmunitario.
[0157] El solicitante determinó a continuación la afinidad de los compuestos peptídicos SEQ ID N° 11 a 13 siguientes:
SEQ ID N°11: T-P-E-Q-R-T-N-T-L-T-V-E-L-G-K-K-W-I-G
SEQ ID N°12: T-L-P-E-M-P-V-G-V-P-E-M-P-A-G-V-D-Y;
SEQ ID N°13 : A-R-G-R-E-G-Y-F-L-A-R-G-A-R-G-R-E-G-Y-E-G
Y-F-V-T-D-E-K ;
para los supertipos HLA-I A01, A02, A03 (A11), A24, B07, B08, B27, B44 (B18), B58 y B62. Los resultados se reagrupan en la tabla 5 siguiente.
Tabl ados
[0158] Como resultado de este estudio, se seleccionaron los 3 compuestos peptídicos multiepitópicos HLA-I de secuencia SEQ ID N° 11 a 13.
[0159] La figura 4 ilustra la composición de epítopos de los tres compuestos peptídicos HLA-I seleccionados (afinidad con los supertipos HLA-I implicados en los 10 más importantes).
[0160] De manera ventajosa, estos compuestos peptídicos se sintetizarán en su forma palmitoilo (K).
b. Compuestos peptídicos multiepitópicos HLA-II:
[0161] Asimismo, el solicitante realizó un estudio con el fin de evaluar, en relación con las secuencias de consenso siguientes:
• Nter PSA: T-N-T-L-A-V-L-Q-A-F-G-R-A-I-P-E-L-G-K-K-W (SEQ ID N° 9);
• Cter-PSA-zona 1: P-D-S-W-A-Q-K-A-G-L-V-V-T-I-E-DE; y
• Cter-PSA-zona 2: E-G-Y-F-V-T-D-E-K-T-G-L-V-Y-R-D-G-G-V-A-A-A-S-S-G (SEQ ID N° 10), el número de epítopos que presentan una afinidad alta/moderada con los diferentes tipos de HLA-II.
[0162] Los resultados de este estudio se plasman en la tabla 6 que se presenta a continuación.
[0163] Para este estudio, puede utilizarse, por ejemplo, el servidor NetMHCII 2.2 para predecir la afinidad de diferentes péptidos con los diferentes tipos de HLA. Predice la unión de péptidos a las moléculas HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, así como a los alelos del CMH de clase 2 de ratón mediante la utilización de una red neuronal artificial. Los pronósticos pueden obtenerse para 14 alelos HLA-DR que cubren los 9 supertipos HLA-DR, los 6 supertipos HLA-DQ, los 6 supertipos HLA-DP, así como los dos alelos H2 de clase 2 de ratón.
[0164] Los valores de predicciones se proporcionan en valores de IC50 en nM y como una clasificación en porcentaje en un conjunto de 1000000 de péptidos naturales aleatorios. Los péptidos de uniones fuertes y débiles se indican en los resultados.
[0165] Habida cuenta de estos resultados, se seleccionaron los dos compuestos peptídicos multiepitópicos HLA-II de las secuencias SEQ ID N° 9 y 10.
[0166] Las tablas 7 y 8 siguientes representan la concentración de péptido competidor (nM) (SEQ ID N° 9 o SEQ ID N° 10) para la que el 50 % de la unión del péptido de referencia a las moléculas HLA-DRB1 y a las moléculas HLADRB3, -DRB4, -DRB5 y HLA-DP4 se inhibe (IC50).
[0167] Para cada una de las tablas 7 y 8, los resultados provienen de dos experimentos independientes.
[0168] Los valores indicados corresponden a los IC50 obtenidos para cada péptido estudiado.
[0169] Los resultados son reproducibles porque los valores de IC50 obtenidos para cada experiencia no sobrepasan un factor de tres.
[0170] Cuanto más bajo sea el valor del IC50, mejor será la afinidad del péptido para la molécula HLA estudiada. Por lo tanto, es importante tener en cuenta que los péptidos de referencia no tienen todos la misma capacidad de unión en función de la molécula HLA considerada. Estos valores corresponden a los valores estándar esperados.
[0171] De forma similar a los resultados presentados anteriormente, la tabla 8 ilustra el conjunto de valores de IC50 obtenidos para los dos péptidos sometidos a prueba y su péptido de referencia como control interno, para la unión a las moléculas HLA-DRB3, -DRB4, -DRB5 y a las moléculas HLA-DP401 y -DP402.
=
[0172] La tabla 9 siguiente ilustra la actividad relativa de los dos compuestos peptídicos SEQ ID N° 9 y 10 para las moléculas HLA-DR, HLA-DRB y HLA-DP4 estudiadas. La actividad relativa se calcula a partir de las dos tablas 7 y 8 anteriores de la manera siguiente: Relación = (media de los valores de IC50 obtenidos para el péptido sometido a prueba)/(media de los valores de IC50 obtenidos con el péptido de referencia).
[0173] En esta tabla 9, la actividad relativa se define mediante la relación obtenida entre la media de los IC50 calculado con el péptido competidor y la media de los IC50 calculada con el péptido de referencia. La actividad relativa permite, de esta manera, comparar las propiedades de unión del péptido sometido a prueba con las del péptido de referencia, que corresponde al péptido que une de la manera más eficaz una molécula HLA determinada. De esta manera, una actividad relativa de 2 significa que el péptido sometido a prueba une 2 veces menos eficazmente la molécula HLA estudiada que el péptido de referencia. De esta manera, cuánto más baja sea la relación, mejor será la afinidad del péptido para la molécula HLA considerada.
[0174] Por consiguiente, según la relación obtenida, los compuestos peptídicos se clasifican según tres categorías:
• los compuestos peptídicos de alta afinidad cuya relación no sobrepasa 20;
• los compuestos peptídicos de media afinidad, comprendida entre 21 y 101; y
• los compuestos peptídicos no afines con una relación superior a 102.
[0175] A la vista del conjunto de resultados obtenidos, los dos compuestos peptídicos de consenso tienen una buena afinidad para las moléculas HLA-DR4, -DR11, -DR13 y DR15.
[0176] Más particularmente, el compuesto peptídico SEQ ID N° 9 se distingue del compuesto peptídico SEQ ID N° 10 en su alta afinidad de unión a las moléculas HLA-DR1, -DR7 y DRB5.
[0177] Por el contrario, el compuesto peptídico SEQ ID N° 10 presenta una buena afinidad de unión a las moléculas HLA-DR3 y HLADRB3, mientras que el compuesto peptídico SEQ ID N° 9 no es activo en estas dos moléculas HLA.
[0178] De manera más general, estos dos compuestos peptídicos son epítopos T potenciales capaces de activar linfocitos T CD4+ porque se unen, entre ellos, al conjunto de moléculas HLADRB1 en su mayoría representadas en la población mundial, así como a dos de las tres moléculas HLA-DR secundarias (HLA-DRB3 y - DRB5).
[0179] Los cinco compuestos peptídicos escogidos fueron seleccionados para garantizar la cobertura vacunal y
terapéutica de las poblaciones más afectadas por las principales especies de leishmaniosis más patógenas para el ser humano.
[0180] La terminación N de los compuestos peptídicos puede modificarse mediante la adición de una marca de ácido graso a partir de una proteína N-acilada. La forma más común de esta modificación es la adición de un grupo palmitoilo (K). Esto hace que el compuesto peptídico sea más estable y aumenta su capacidad de ser presentado a las células del sistema inmunitario.
Ejemplo 5: Predicción de los sitios de escisión por el proteasoma
[0181] Asimismo, el solicitante llevó a cabo un estudio de la conservación y de la creación de sitios de corte por parte del proteasoma, lo que permite favorecer el proceso de presentación de los epítopos por parte de las moléculas HLA-I. Este estudio permitió diseñar secuencias multiepitópicas HLA de clase I de consenso y optimizadas, con un buen proceso de presentación de los epítopos y una conservación de las puntuaciones de unión de los péptidos a las moléculas HLA. Los epítopos más afines para las moléculas HLA-I se ensamblaron para construir péptidos multiepitópicos que presentan entre 18 y 28 aminoácidos, considerando más particularmente la conservación y/o la adición de un espaciador como, por ejemplo, el espaciador T-V presente en la secuencia SEQ ID N°11, de los sitios de escisión por parte del inmunoproteasoma de HLA de clase I, favoreciendo su presentación al sistema inmunitario.
[0182] Los resultados de este estudio se representan en la figura 5.
Ejemplo 6: Estudio fisicoquímico de los compuestos peptídicos multiepitópicos de clase I y clase II procedentes de los PSA de leishmanias y cálculo de las concentraciones de estos compuestos
[0183] Los compuestos peptídicos tenidos en cuenta durante este estudio son los compuestos peptídicos multiepitópicos HLA de clase I SEQ ID N°11 a SEQ ID N° 13 y los compuestos peptídicos multiepitópicos HLA de clase II SEQ ID N° 9 y 10.
[0184] El compuesto peptídico epítopo B "E-34-P" de SEQ ID N° 14 también se estudia en el presente documento. Tal y como se indica en la descripción, se trata de un compuesto peptídico de síntesis no nativo, formado por la secuencia de 34 aminoácidos siguiente:
E-D-E-H-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R-G-
T-P-T-P-A-P. '
[0185] Este compuesto peptídico es indicado por la expresión "E34Pc" cuando está en forma de compuesto peptídico ciclado Cys9-Cys15.
[0186] Permite distinguir en una zona endémica un huésped vacunado de un huésped no vacunado pero infectado. El compuesto peptídico estudiado en el presente estudio es el compuesto peptídico K-(palmitoilo)-E-D-E-H-K-G-K-Y-C- R-L-G-N-D-C-R-T-T-E- P-T-T-T-A-T- P-R-G-T-P-T-P-A-P.
[0187] Los compuestos peptídicos fueron preparados con 1 mM en una solución de 10 % DMSO/PBS 1X (sin Mg/Ca) con viales que contienen 1 mg de cada compuesto peptídico. Las tablas 10, 11 y 12 representan los resultados de los estudios físicoquímicos de los diferentes compuestos peptídicos citados anteriormente.
Tabla
T l 11: m í i ^ n lmi il
T l 12: m í i lmi i l P lmi il PM= 4
[0188] Estos resultados indican las propiedades bioquímicas de los péptidos y permiten preparar soluciones madres de péptidos de 1 mM con el fin de probar, tras su dilución, su eficacia en los perros y en las células humanas, como se ilustra en los ejemplos 7 y 8 a continuación.
Ejemplo 7: Estudio del estado inmunitario de los perros antes y después de la vacunación
[0189] Los compuestos peptídicos SEQ ID N°9 a 13 de la invención se mezclan con el compuesto peptídico sintético no nativo E34Pc, SEQ ID N°14, que permite distinguir en una zona endémica un huésped vacunado de un huésped no vacunado pero infectado. Este compuesto peptídico E34Pc se asocia con un adyuvante que induce preferentemente una respuesta mediada por células como, por ejemplo, QA21, saponina, Quil-A o cualquier otro derivado del mismo conocido por el experto en la materia, como Qs -21.
[0190] Preferentemente, las secuencias peptídicas se asocian en una relación SEQ ID N°9 / SEQ ID N°10 / SEQ ID N°11 / SEQ ID N°12 / SEQ ID N°13 / SEQ ID N°14: 20 / 20 / 20 /15 / 25 / 10.
[0191] Los compuestos peptídicos según la invención pueden hacerse inmunogénicos uniéndose a portadores o a cualquier otro derivado (molécula grande tipo KLH, lipopéptidos tipo palmitoilo o derivados) y se administran a los candidatos en presencia de un adyuvante y, preferentemente, en a Q21.
[0192] Para determinar la capacidad del candidato a vacuna de inducir inmunidad protectora, las respuestas inmunitarias humorales y celulares de las composiciones que comprenden
• los cinco compuestos peptídicos SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 13 o
• los seis compuestos peptídicos SEQ ID N°9 a SEQ ID N°14, cuando el compuesto peptídico E34Pc también está presente, se evalúan en las composiciones, en los perros inmunizados (vacunados) en comparación con perros placebo.
[0193] La composición peptídica se prueba en 38 perros de raza "Beagle" con serología negativa para la leishmaniosis, parasitología negativa, ausencia de respuesta celular a la Leishmania (INF-y y granzima B) y ausencia de IgG2 específicas para el compuesto peptídico E34Pc, distribuidos en 10 grupos (0 a 9).
[0194] Al establecer los grupos de perros, se pretende en particular comparar las composiciones según la invención con una combinación de los tres compuestos peptídicos descritos en los documentos de patente FR2829767 y FR2932802. Se trata de los tres compuestos peptídicos siguientes: •
• A16E: A-A-R-C-A-R-L-R-E-G-Y-S-L-T-D-E
• A16G: A-A-S-S-T-P-S-P-G-S-G-C-E-V-D-G; y
• E34P: E-D-E-H-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R-G-T-P-T-P-A-P.
Estos tres péptidos, en forma palmitoilada, se asocian en una relación 10/25/25 para KE34P/KA17E/KA17G.
[0195] Esta combinación constituye el grupo de referencia, que se compara con los compuestos peptídicos de clase I de SEQ ID N° 11 a 13, y los compuestos peptídicos de clase II de SEQ ID N° 9 a 10.
[0196] El propósito del presente estudio es también evaluar un efecto de dosis de la concentración de los diversos compuestos peptídicos de la composición vacunal.
[0197] Los 38 perros vivían en el norte de Francia (Auxerre), una zona no endémica, y fueron repatriados al sureste de Francia, 4 semanas antes de la vacunación en el período de invierno (un período sin vectores flebótomos de Leishmania) Entre los 10 grupos, se prevé un grupo de control con placebo de 2 perros; este es el grupo 0. Los otros 9 grupos constan de 4 perros cada uno que reciben los distintos compuestos peptídicos en las concentraciones indicadas en la tabla 13 a continuación. Las distintas mezclas de péptidos se formulan con el adyuvante QA21, Tween 80 y TMS y se liofilizan.
[0198] El esquema de inyección se ilustra en la figura 6. Por su parte, las dosis inyectadas se describen en la tabla 13 a continuación. Los valores indicados en la tabla 13 corresponden a las cantidades de péptidos inyectados en ^g por 200 ^l de composición inyectada por vía intradérmica. Los grupos identificados por una estrella en la tabla 13 son grupos de 4 perros. Los compuestos peptídicos indicados como "K" son compuestos peptídicos palmitoilados. Por ejemplo, el compuesto peptídico "E34P palmitoilado se indica como "KE34Pc".
Tabla 13: Grupos de perros estudiados
[0199] Cada 2 semanas, se lleva a cabo un seguimiento clínico de los 38 perros.
[0200] Los análisis se llevan a cabo antes de cada inyección y 7 semanas después de la tercera inyección.
[0201] En un primer paso se busca en los sueros de los anticuerpos IgG2 específicos del compuesto peptídico E34Pc. Estas inmunoglobulinas de tipo IgG2 de perros específicas del compuesto peptídico E34P se detectan mediante el método ELISA según el método de microtitulación de Kveider et al. (J. Immunol. 1987, 138-299) utilizando un conjugado anti-IgG2. Para este método, el compuesto peptídico se biotinila antes del recubrimiento en microplacas según el método descrito en la solicitud de patente FR2932802. En un segundo paso, se evalúa la capacidad de proliferación de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) tras 5 días de estimulación
con varios antígenos de las vacunas candidatas y se realiza un análisis cuantitativo de la citoquina IFNy (respuesta Th1). Estos datos se obtienen mediante experimentos ex vivo en los perros y permiten evaluar la respuesta celular.
[0202] La capacidad de proliferación de las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) después de 5 días de estimulación con varios antígenos de las vacunas candidatas se evalúa mediante una técnica ELISA (método alternativo a la radiactividad).
[0203] El análisis cuantitativo de la citoquina IFNy también se realiza mediante un ELISA en los sobrenadantes de las células estimuladas y permite determinar la capacidad de las células de entrar en una vía TH-1 tras la estimulación.
[0204] La eficacia de las vacunas candidatas se determina ex vivo mediante un ensayo de actividad leishmanicida. El propósito de esta prueba es evaluar el tipo y el nivel de intensidad de la respuesta inmune mediada por células inducida por la administración de una vacuna en perros, estudiando la capacidad de los macrófagos, al entrar en contacto con linfocitos autólogos, para eliminar los parásitos intracelulares de formas amastigotes.
[0205] Finalmente, se realiza un análisis cuantitativo de la serina proteasa Granzyme B en los sobrenadantes de las células estimuladas para evaluar la respuesta citotóxica linfocitaria específica y poner de manifiesto la producción de Granzyme B específica de los linfocitos T citotóxicos. Este análisis cuantitativo se realiza estudiando el nivel de expresión de los transcritos mediante RT-q-PCR.
[0206] En la tabla 14 siguiente, se muestran los resultados de estas diversas pruebas biológicas y, por lo tanto, el número de perros que proporcionan una respuesta inmunitaria positiva:
Tabla 14:
[0207] Como se muestra en la tabla 14 anterior, la combinación de compuestos peptídicos de clase I y clase II (grupos 6 a 9) proporciona mejores resultados en términos de respuesta inmunitaria protectora que los compuestos peptídicos de referencia (grupo 1) y los compuestos peptídicos de clase I y clase II tomados por separado (grupos 2, 3 y grupos 4, 5).
[0208] Entre los grupos que reciben la composición total de los compuestos peptídicos (Clase I, Clase II y E34Pc), los grupos 6 y 7 correspondientes a bajas concentraciones de compuestos peptídicos proporcionan los mejores resultados. En particular, cabe destacar los buenos resultados del grupo 6, que corresponde a la concentración más baja de compuestos peptídicos de la composición, es decir, 60 ^g de compuestos peptídicos por inyección.
[0209] De esta manera, se ha demostrado que la composición actúa por estimulación del sistema linfocitario de
tipo Th1 con producción de linfocitos T citotóxicos y de IgG2 específicas del compuesto peptídico E34Pc. El interés de estas IgG2 no se basa sólo en la distinción entre perros vacunados y perros infectados, sino también en la capacidad de inhibir la proliferación de las formas amastigotas o promastigotas de Leishmania.
Ejemplo 8: Eficacia ex vivo de los compuestos peptídicos de clase I y II de PSA en la estimulación de células humanas y la producción de citoquinas de tipo Th1
[0210] Los pacientes con leishmaniosis que se curan con éxito mediante quimioterapia suelen estar libres de nuevas infecciones por Leishmania. Esta resistencia del huésped a la infección leishmanianna está mediada principalmente por respuestas inmunitarias celulares específicas y, especialmente, una linfoproliferación de los linfocitos T y la producción de las citoquinas Th1 como el interferón-gamma (IFN-y) y la interleucina (IL)-2 que conducen a la activación de los macrófagos y provocan la muerte de los parásitos. Aunque recientemente se han realizado importantes avances en la comprensión de los mecanismos de inmunidad en los seres humanos, actualmente no se dispone de ninguna vacuna contra las leishmaniosis humanas. Sin embargo, se han realizado muchos esfuerzos para identificar antígenos de leishmanias capaces de inducir una inmunidad protectora. Los principales trabajos relacionados con la vacunación se han realizado y se siguen realizando en ratones. Estos modelos de infección experimental están muy alejados de los huéspedes naturales de la infección, es decir, los perros y los seres humanos, huéspedes que tienen un impacto considerable en términos de salud veterinaria y humana. Además, este trabajo se ha centrado en la leishmaniasis cutánea por L. major (el principal modelo de infección disponible en ratones), cuyos estudios no son directamente transferibles a la leishmaniosis visceral canina o humana.
[0211] Por lo tanto, el solicitante ha desarrollado un enfoque novedoso, que consiste en evaluar la capacidad de los antígenos de vacunas candidatas para estimular los linfocitos T de la sangre periférica de pacientes curados o de sujetos expuestos asintomáticos e inmunes, midiendo ex vivo la producción de citoquinas Th1 y/o Th2. La eficacia de estos antígenos para desencadenar especialmente una respuesta Th1 (liberación de IFN-y por los linfocitos T estimulados) y la intensidad de la respuesta provocada se correlacionarán con la protección o la curación. Esta prueba ex vivo de la eficacia de los candidatos a vacuna en células humanas se utilizó con el PSA recombinante nativo a 10|jM y el candidato a vacuna peptídica (Pool A = combinación de los cinco compuestos peptídicos SEQ ID N°9 a 13) a 2 j M en células de personas inmunes asintomáticas en comparación con sujetos ingenuos.
[0212] El estado de las personas se definió por medio de un examen clínico, pero también por métodos inmunológicos (proliferación celular contra antígenos solubles totales de leishmanias, ensayo de IFN-y tras la estimulación celular y análisis cuantitativo de los anticuerpos contra estos antígenos en el plasma) y parasitológicos (búsqueda y cuantificación de parásitos en la sangre por RT-Q-PCR). Por lo tanto, los grupos de individuos se definieron de la siguiente manera:
• Personas ingenuas: sin antecedentes médicos de leishmaniosis, ausencia de signos clínicos, proliferación celular negativa, ausencia de producción de IFNy tras la estimulación celular, ausencia de evidencia de la presencia de anticuerpos contra los antígenos totales de leishmanias y PCR negativa;
• Personas asintomáticas: ausencia de signos clínicos, proliferación celular positiva y/o producción de IFN-Y tras la estimulación celular con antígenos totales de leishmanias, PCR positiva o negativa.
[0213] Los resultados se presentan en la tabla 15 a continuación:
Tabla 15: Tasa de IFN- y secretados por las células T de la sangre periférica aisladas de personas asintomáticas in in n .
[0214] Como muestran los resultados, sólo las células de personas asintomáticas, en comparación con las de sujetos ingenuos, son susceptibles de inducir una respuesta Th1 (estimulación de linfocitos T con producción significativa de IFN-y) en presencia de PSA recombinante o Pool A. Por lo tanto, este último es un excelente candidato para las vacunas profilácticas y terapéuticas contra las leishmaniosis humanas.
Claims (16)
1. Epítopo que presenta una secuencia seleccionada entre SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 10.
2. Epítopo según la reivindicación 1, que presenta una secuencia seleccionada entre SEQ ID N°1, 2, 8, 9 o 10.
3. Compuesto peptídico de 18 a 28 aminoácidos que comprende 1, 2, 3 o 4 de los epítopos según una de las reivindicaciones 1 o 2, opcionalmente separados por un espaciador peptídico que comprende de 1 a 8 aminoácidos.
4. Compuesto peptídico según la reivindicación 3 seleccionado entre SEQ ID N°9 a SEQ ID N°13.
5. Composición farmacéutica, para uso veterinario o humano que comprende al menos un epítopo según la reivindicación 1 o 2, o un compuesto peptídico según una de las reivindicaciones 3 o 4.
6. Composición según la reivindicación 5, para su uso en la vacunación profiláctica y terapéutica dirigida contra las leishmanias como Leishmania donovani, Leishmania infantum, Leishmania chagasi, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leishmania trópica, Leishmania major, Leishmania aethiopica, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) panamensis, Leishmania (Viannia) peruviana.
7. Vacuna profiláctica y/o terapéutica dirigida contra una o más de las leishmanias seleccionadas entre Leishmania donovani, Leishmania infantum, Leishmania chagasi, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leishmania tropica, Leishmania major, Leishmania aethiopica, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) panamensis, Leishmania (Viannia) peruviana;
que comprende al menos un epítopo según la reivindicación 1 o 2, o un compuesto peptídico según una de las reivindicaciones 3 o 4.
8. Vacuna según la reivindicación 7, caracterizada por que comprende, por un lado, al menos un compuesto peptídico seleccionado entre SEQ ID N°9 y 10;
y, por otro lado, al menos un compuesto peptídico multiepitópicos seleccionado entre las secuencias SEQ ID N°11 a 13.
9. Vacuna según la reivindicación 8, caracterizada por que comprende, por un lado, al menos uno o dos compuestos peptídicos seleccionados entre SEQ ID N°9 y 10;
y, por otro lado, al menos uno, dos o tres compuestos peptídicos seleccionados entre las secuencias SEQ ID N°11 a 13.
10. Vacuna según la reivindicación 9, caracterizada por que comprende, en combinación, cinco compuestos peptídicos multiepitópicos seleccionados entre SEQ ID N°9 a 13.
11. Vacuna según una de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizada por que comprende, además, un adyuvante seleccionado entre las clases TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, las saponinas, las emulsiones aceite en agua o agua en aceite, los polisacáridos, los liposomas catiónicos, los virosomas o los polielectrolitos.
12. Vacuna según una de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizada por que comprende, además, el compuesto peptídico E34P de SEQ ID N° 14 siguiente:
E-D-E-H-K-G-Y-C-RL-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R-G-T-P-T-P-A-P, ciclado por puente disulfuro entre la cisteína en la posición 9 y la cisteína en la posición 15.
13. Vacuna según una de las reivindicaciones 7 a 12, caracterizada por que comprende, además, un antígeno capaz de generar anticuerpos específicos durante una inmunización.
14. Secuencias de nucleótidos que codifican el epítopo o el compuesto peptídico tal y como se define en una de las reivindicaciones 1 a 4.
15. Vector de expresión que comprende al menos una secuencia de nucleótidos tal y como se define en la reivindicación 14, así como los medios necesarios para su expresión.
16. Reactivo de diagnóstico que comprende un compuesto peptídico según una de las reivindicaciones 1 a 4.
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