BR112015015539A2 - Vacinas monovalentes e polivalentes contra leishmania - Google Patents
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Abstract
vacinas monovalentes e polivalentes contra leishmania. a presente invenção refere-se a compostos peptídicos, mono ou poliepitópicos de sequências seq id no 1 a 16, assim como os respectivos derivados análogos, muteínas e homólogos, destinados à prevenção e ao tratamento das leishmanioses nos mamíferos e, em particular, no homem, nos canídeos, nos felinos e nos equinos. mais particularmente, a invenção se refere igualmente às vacinas que compreendem esses compostos peptídicos em condições que assegurem uma imunização, levando a uma proteção eficaz do homem ou do animal vacinado contra uma ou várias leishmanias.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACI- NAS MONOVALENTES E POLIVALENTES CONTRA LEISHMANIA".
[001] A presente invenção refere-se a compostos peptídicos mo- no- ou multiepitópicos destinados à prevenção e ao tratamento das leishmanioses nos mamíferos e, em particular, no Homem, nos cães, nos felídeos e os equinos. Mais particularmente, a invenção refere-se também às vacinas compreendendo esses compostos peptídicos em condições, assegurando uma imunização, levando a uma proteção efi- caz do homem ou do animal vacinado contra uma ou várias leishmani- as.
[002] As grandes endemias parasitárias são, de muito longe, as causas as mais importantes de morbidez e de mortalidade não somen- te para a espécie humana, mas para todas as outras espécies animais tanto domésticas quanto selvagens.
[003] As leishmanioses estão dentre as mais graves infecções parasitárias afetando o Homem no mundo. Trezentos e cinquenta mi- lhões de indivíduos são expostos em oitenta e oito países repartidos em quatro dos cinco continentes e dezesseis milhões dentre eles são portadores do parasita. Elas são responsáveis por um largo espectro de manifestações clínicas (cutânea, muco-cutânea e visceral).
[004] A leishmaniose visceral (LV) é causada pelos parasitas do complexo Leishmania donovani, (Leishmania infantum, Leishmania chagasi, e L. dovani) que são parasitas intracelulares do macrófago. Contrariamente às outras espécies de Leishmania causando as formas cutâneas da doença (L. major, L. brasiliensis,...) as leishmanias do complexo donovani apresentam uma capacidade para se disseminar no conjunto dos órgãos onde se multiplicam. Os pacientes atingidos de LV apresentam então uma tabela clínica associando uma febre moderada, mas persistente, uma hepatosplenomegalia e uma pancito- penia que leva geralmente ao luto, caso nenhum tratamento específi-
co seja iniciado suficientemente de modo rápido.
[005] Mesmo se a LV à L.infantum/chagasi é um problema im- portante na Europa do Sul com a extensão da pandemia da AIDS e aparecimento de um número crescente de coinfecções Leishma- nia/HIV, ela está longe de ser controlada e se torna muito preocupante em termos de problema de saúde pública nos países da América do Sul. Em outras partes do mundo, notadamente nas zonas de endemia à L.donovani ,ela atinge aproximadamente um quinto da população no Sudão e na Índia, onde epidemias mortais fizeram centenas de milha- res de vítimas nesses últimos decênios. Além disso, a situação se tor- na crítica na Índia com a emergência de cepas resistentes aos deriva- dos pentavalentes do antimônio (medicamentos de primeira intenção).
[006] A incidência anual das leishmanioses humanas é estimada entre 2 e 2,5 milhões de novos casos, dentre os quais mais de 500 000 foram atingidos de leishmaniose visceral e 1,5 a 2 milhões de leishmanioses cutâneas das quais determinadas são muito desfiguran- tes e mutilantes como as leishmanioses muco-cutâneas (LMC). Isto tem por consequência uma morbidez global superior a dois milhões de DALYs (para Disability Adjusted Life Years) e a morte de aproxima- damente sessenta mil pessoas a cada ano. Essas doenças constitu- em ainda hoje um verdadeiro problema de saúde pública na América Latina, na Ásia, na África e no sul da Europa. Suas consequências em numerosas regiões do mundo constituem um handicap maior ao de- senvolvimento dos países os mais pobres. Além disso, o efeito global das mudanças ambientais (antrópicas e climáticas) leva, seja a um aumento da incidência (doenças "reemergentes" e incontroladas em numerosas regiões do mundo), seja a uma extensão geográfica (do- enças "emergentes" notadamente no norte da Europa e na América do Norte) dessas doenças parasitárias. Elas permanecem, todavia, des- prezadas pela pesquisa médica, os financiadores, a opinião pública e as instâncias políticas dos países gravemente atingidos.
[007] A leishmaniose visceral atinge também a população canina, que constitui um reservatório de parasitas aprovisionando, de maneira contínua o ciclo de transmissão. Ela é devido a L. infantum / chagasi, espécie responsável por uma zoonose dos cães domésticos e selva- gens largamente difundida no mundo. Ela afeta milhões de cães na Europa, Ásia , África do Norte e América do Sul. Os cães sintomáticos, mas também assintomáticos constituem uma fonte de parasitas para a transmissão da LV no Homem.
[008] As medidas de prevenção contra as leishmanioses são nu- merosas. Durante muito tempo elas foram baseadas na luta contra o inseto vetor e o objetivo principal, visava controlar sua multiplicação pela utilização de inseticidas e evitar o contato entre o vetor (fleboto- ma) e seus hospedeiros (cão, Homem,...). O controle das leishmanio- ses, uma vez diagnosticadas, passa também pelos tratamentos quimi- oterapêuticos. Estes são infelizmente colocados em perigo por um arsenal terapêutico muito limitado, tratamentos longos, tóxicos e one- rosos, acompanhando-se de numerosos casos de nova queda e pela emergência dos fenômenos de quimiorresistência. Na ausência de tra- tamentos eficazes e tornando-se a amplidão do problema, torna-se, portanto, necessário colocar à disposição das populações as mais gravemente atingidas pelos meios de prevenção aplicáveis em grande escala, dos quais o mais adaptado seria a vacinação.
[009] Vários argumentos são à favor da fabricação de uma vacina no Homem. O fato de um indivíduo vivo na zona de endemia poder desenvolver uma forte resistência à leishmaniose cutânea, em se- quência à injeção voluntária de uma pequena quantidade de parasitas vivos mostrou muito rapidamente que a vacinação contra essas para- sitoses era possível no homem. Embora extremamente eficaz (mais de 80 % de proteção), essa prática , utilizando promastigotos de L.
Mayor, ainda denominada "leishmanização", foi durante muito tempo utilizada, notadamente no Oriente Médio. Ela foi na sequência aban- donada por razões éticas e securitárias. Com efeito, ela provocava formas graves de leishmaniose em 2 a 3 % dos indivíduos (Ferrua et al., Vaccine 2006). Além disso, foi então bem estabelecido que, em sequência à infecção por leishmanioses, a maioria dos indivíduos imunocompetentes desenvolve infecções subclínicas ou assintomáti- cas mais do que uma forma severa de leishmaniose (sintomática), e dessa forma, adquire uma imunidade robusta e durável à reinfecção. O mesmo acontece nos indivíduos que controlaram uma leishmani- ose cutânea ou após uma leishmaniose visceral curada.
[0010] Apesar disso, no Homem, nenhuma vacina está atualmente disponível contra as leishmanioses. Na realidade, só uma abordagem pragmática utilizando parasitas inteiros mortos foi tornada possível nesse dia. Historicamente, as vacinas de primeira geração, baseadas na utilização de parasitas inteiros atenuados ou mortos (notadamente autoclavados) combinados ou não a adjuvantes, tinham por finalidade de proteger principalmente contra as leishmanioses cutâneas , tentan- do reproduzir os níveis de proteção obtidos com os parasitas vivos.
[0011] Todavia, os numerosos testes clínicos feitos em milhares de indivíduos na América do Sul mas também no Irã deram resultados mais do que mitigados, até mesmo decepcionantes (Modabber, Inter- national Journal of Antimicrobial Agents, 2010; Evans e Kedzierski, Journal of Tropical Medicine, 2012).
[0012] As infecções experimentais no rato, notadamente a cepa murina BALB/ c submetida a muitas espécies de leishmanioses, foram e ainda são muito utilizadas para avaliar a eficácia de uma vacina can- didata, notadamente ao encontro de uma leishmaniose visceral. Nu- merosas vacinas com subunidades constituídas de proteínas nativas purificadas (vacina de primeira geração) ou recombinantes (vacina de segunda geração) foram assim testadas (Goto et al., clinical and Vac- cine Immunology, 2011). Determinadas vacinas candidatas conferiram um bom nível de proteção ao encontro de uma infecção experimental no rato. As proteções podiam, atingir até 81 % segundo o antígeno e o adjuvante. Mais recentemente, as vacinas ADN, ditas de terceira ge- ração, mais fáceis de produzir, mais estáveis e mais imunogênicas fo- ram desenvolvidas com as sequências nucleotídicas codificando para as proteínas utilizadas nas vacinas de segunda geração (Gurunathan et al., Nature Med., 1998; Dumonteil et al., Vaccine, 2003; Rafati et al, Vaccine, 2005; Rodriguez-Cortes et al, Vaccine, 2007). Enfim, outras pistas vacinais foram exploradas com sucesso no rato como as vaci- nas à base de antígenos presentes na saliva do flebotoma (Morris et al, J. Immunol., 2001; Valenzuela et al., J. Exp. Biol., 2004) que permi- tiram obter uma relativa resistência à infecção experimental à leishma- niose major.
[0013] Atualmente, poucas vacinas candidatas ultrapassaram o estágio experimental (modelos ratos ou hamsters) em razão da dificul- dade a desenvolver um modelo animal apropriado reproduzindo as ca- racterísticas da doença humana e utilizar testes clínicos nos hospe- deiros naturais da infecção que necessitam dos coortes importantes, das infraestruturas pesadas e que podem levar anos antes de dar um resultado definitivo. Além disso, é difícil extrapolar diretamente resulta- dos obtidos no rato com hospedeiros naturais da infecção, tais com o cão ou o Homem. Enfim, as respostas imunitárias protetoras que con- trolam uma infecção de prova podem não refletir aquelas requeridas para prevenir as leishmanioses em zonas endêmicas.
[0014] Dois candidatos vacinais estão em curso de desenvolvi- mento clinico: - a Leish 111 f MPL SE du Infections Disease Research Institute (IRDI) em Seattle é uma vacina quimérica denominada
LEISH-F1 constituída de 3 proteínas recombinantes em fusão (TSA- LmSTI1-LeIF) formuladas com o lipídeo monofosforilado e o esqualeno em uma emulsão estável (MPL-SE). Todavia, se a proteção contra a leishmaniose cutânea parece em boa via, um estudo feito na Itália em uma estação experimental mostra claramente que Leish-111 f MPL- SE não protege cães expostos a uma infecção natural a L.infantum (Gradoni et al, Veterinary Research, 2005; Gradoni, Veterinary Rese- arch, 2006). Em um estudo mais recente realizado no Brasil, essa va- cina se revelou eficaz em imunoterapia para os casos leves de LV ca- nina, mas sem efeito em cães gravemente doentes (Trigo et al, Clinical and Vaccine Immunology, 2010); - O HASP + KMP-11 da Universidade de York (Grã Breta- nha) sobre o qual os primeiros testes clínicos deveriam acionar no fim de 2012.
[0015] No cão, existe até hoje uma solução eficaz, CaniLeish® que é um produto composto de antígenos de excreção secreção (AES) de promastigotos de L.infantum e comercializado na Europa a partir de
2011. A Leishmaniose canina vê assim suas medidas preventivas pro- fundamente modificadas e completadas.
[0016] A vacinação controla não somente o desenvolvimento da doença, mas diminui tão significativamente a carga parasitária no cão e contribui assim a interrupção do ciclo de transmissão da LV no flebo- toma (vetor da doença), no cão e no Homem.
[0017] Todavia, os rendimentos de produção dos AES não são su- ficientes para permitir uma produção na escala industrial de uma vaci- na humana. Com efeito, a produção de AES é bastante complexa e induz um produto com preço muito elevado, adaptado a um mercado canino bastante reduzido.
[0018] Assim, uma das dificuldades principais no desenvolvimento de um candidato vacinal reside no fato de o produto final dever ser reprodutível, termoestável e fácil de produzir com baixo preço nas zo- nas de endemia, com rendimentos de produção, tornando possível sua utilização em grande escala.Com efeito, os resultados de um estudo recente, visando a avaliar a rentabilidade econômica de uma vacina contra a leishmaniose visceral no estado do Bihar (India) comparati- vamente à quimioterapia, se baseiam muito no prosseguimento do de- senvolvimento de uma vacina contra a LV, mesmo se seu custo se mostrasse relativamente elevado (Lee et al, Am. J. Trop. Med. Hyg., 2012).
[0019] Considerando-se o que precede, existe nesse dia uma ne- cessidade urgente de investir em novas pistas, propondo uma alterna- tiva mais eficaz nas vacinas existentes, a fim de permitir a vacinação profilática e/ou terapêutica de pacientes contra as leishmanioses, no- tadamente os pacientes resistentes às terapias existentes.
[0020] A requerente colocou em evidência novos epitopos que apresentam um elevado poder imunógeno contra as leishmanioses, permitindo o desenvolvimento de vacinas eficazes e financeiramente acessíveis.
[0021] Assim, a solução para o problema apresentado tem por primeiro objeto um epitopo que apresenta uma sequência escolhida dentre: SEQ ID No. 1: T-P-E-Q-R-T-N-T-L (epitopo HLA-B07); SEQ ID No. 2: E-L-G-K-K-W-I-G (epitopo HLA-B08); SEQ ID No. 3: T-L-P-E-M-P-V-G-V (epitopo HLA-A02); SEQ ID No. 4: P-E-M-P-A-G-V-D-Y (epitopo HLA-A01); SEQ ID No. 5: A-R-G-R-E-G-Y-F-L (epitopo HLA-B27); SEQ ID No. 6: A-R-G-A-R-G-R-E-G-Y (epitopo HLA-B44); SEQ ID No. 7: A-R-G-A-R-G-R-E-G (epitopo HLA—B27); SEQ ID No. 8: E-G-Y-F-V-T-D-E-K (epitopo HLA-A03); SEQ ID No. 9: T-N-T-L-A-V-L-Q-A-F-G-R-A-I-P-E-L-G-K-K-W;
SEQ ID No. 10: E-G-Y-F-V-T-D-E-K-T-G-L-V-Y-R-D-G-G-V-A-A-A-S-S- G; SEQ ID no 15: X1-X2-P-E-M-P-X3-G-V-X4-X5 com X1 = T ou nenhum aminoácido X2 = L ou nenhum aminoácido X3 = A ou V X4 =D ou nenhum aminoácido; X5 = Y ou nenhum aminoácido; ou SEQ ID no 16: A-R- X6- X7 – X8- G – R- E- G – X9 – X10 – X11 com X6 = G ou nenhum aminoácido X7 = A ou nenhum aminoácido X8 = R ou nenhum aminoácido X9 = Y ou nenhum aminoácido X10 = F ou nenhum aminoácido X11 = L ou nenhum aminoácido
[0022] A fim de responder à necessidade de uma vacina que as- segura uma boa cobertura da população mundial e protegendo con- tra as principais espécies de leishmaniose, a Requerente considerou a importância de propor uma estratégia vacinal inovadora baseada em fragmentos antigênicos / peptídicos capazes de ativar, de forma durá- vel, a imunidade celular específica dirigida contra esses parasitas. A estratégia vacinal peptídica da Requerente se baseia na identificação e a seleção de peptídeos imunodominantes portados pela sequência de uma proteína de virulência caracterizada como o imunógeno maior dos antígenos excretados-secretados pelas leishmanias, a proteína PSA (para Promastigote Surface Antigen) solúvel (princípio ativo prin- cipal da vacina CaniLeish®), comum e muito conservada no meio das espécies de leishmanioses, responsáveis pelas diferentes infecções humanas.
[0023] A vacinação peptídica se fundamenta nas bases molecula-
res e celulares da identificação do antígeno pelas células T. A coloca- ção da imunidade específica depende para uma larga medida da de- gradação e da associação dos fragmentos antigênicos, peptídeos, às moléculas do Complexo Maior de Histocompatibilidade (CMH;HLA, do inglês human leukocyte antigen, para o Homem). Essa associação é tornada específica de uma molécula HLA particular por resíduos ami- noácidos constituindo os motivos de fixação do peptídeo. Os comple- xos assim formados são reconhecidos pelos linfócitos T pelo interme- diário de um receptor membranário (TcR) e necessita de uma intera- ção específica com determinados aminoácidos do epitopo T. Os epito- pos T são ligantes das moléculas HLA com afinidades fortes ou mode- radas. Eles são apresentados aos linfócitos T CD8+ (citotóxicos) ou CD4+ (auxiliares) pelas moléculas HLA respectivamente de classe I ou de classe II.
[0024] A formação desses complexos trimoleculares (TcR/HLA/peptídeo) é o pré-requerido à ativação e à expansão das células T específicas e, portanto, à indução de uma resposta imunitá- ria protetora, quando de uma infecção.
[0025] O interesse desses peptídeos é múltiplo: (i) exibem um elevado nível de segurança, dado que impe- dem qualquer risco de infecção associado com o uso de agentes pato- gênicos ou agentes infecciosos, (ii) são quimicamente bem definidos e, assim, atendem aos requisitos farmacêuticos (especialmente pureza, reprodutibilidade), (iii) facilitam o controle da resposta imune induzida (detec- ção de linfócitos T citotóxicos (CTL) dirigidos contra um epitopo T defi- nido), e (iv) a sequência dos mesmos pode ser modificada, de mo- do a tornar os mesmos mais imunogênicos.
[0026] Esses peptídeos respondem, de forma notável ao conjunto das condições citadas anteriormente: vacina reprodutível, termostável facilitando sua conservação e seu transporte polivalente, fácil de pro- duzir a baixo preço nas zonas de endemia, tornando possível sua utili- zação em grande escala.
[0027] De acordo com a invenção, entende-se por epitopo, com- posto peptídico ou peptídeo, qualquer epitopo, composto peptídico ou peptídeo definido por sua sequência, assim como seus derivados aná- logos, muteínas e homólogos.
[0028] Os epitopos sendo compostos peptídicos que apresentam aproximadamente 8 a 15 aminoácidos, emprega-se, portanto, indife- rentemente, o termo "composto peptídico" para designar um epitopo ou um composto peptídico para designar um epitopo ou um composto peptídico.
[0029] De acordo com a invenção, entende-se por "derivado aná- logo" ou "derivados muteínas" de um composto peptídico, os derivados biologicamente ativos das moléculas de referência que apresentam a atividade desejada, a saber: a capacidade de estimular uma resposta imunitária de mediação celular.
[0030] De forma geral, o termo "derivado análogo" se refere a compostos que têm uma sequência e uma estrutura polipeptídica que apresenta uma ou várias adições, substituições e/ou deleções de ami- noácido, em relação aos compostos peptídicos definidos acima, à me- dida que as modificações não destroem a atividade imunógena.
[0031] Entende-se pelo termo derivado muteína os peptídeos apresentando um ou vários elementos que imitam o peptídeo.
[0032] Processos de preparo de análogos e de muteínas polipep- tídicos clássicos são conhecidos do técnico.
[0033] De acordo com a invenção, os análogos particularmente preferidos incluem as substituições conservadoras, isto é, as substitui- ções ou substituição sem consequências sobre a função e a estrutura final da proteína.
[0034] A título de exemplos dessas substituições , podem-se citar as substituições que intervêm: - na família de aminoácidos composta do aspartato e do glutamato; - a família de aminoácidos básicos composta da lisina, da arginina e a histidina; - a família de aminoácidos não polares composta da alani- na, da leucina, da isoleucina, da prolina, da fenil alanina, da metionina e do triptofano; e - a família dos aminoácidos não carregados polares, tais como a glicina, a asparagina, a glutamina, a cisteína, a serina, a treo- nina e a tirosina.
[0035] Por exemplo, considerando-se o fato de, de um ponto de vista estérico e físico-químico, a valina está próxima da alanina; a substituição de uma pela outra não perturba geralmente o funciona- mento da proteína.
[0036] O técnico poderá facilmente determinar as regiões dos compostos peptídicos de interesse, podendo tolerar uma mudança por técnicas bem conhecidas.
[0037] Para isto, ele poderá, por exemplo, utilizar matrizes de simi- laridade, M, que recenseiam o conjunto dos escores M(a,b) obtidos quando se substitui o aminoácido a pelo ácido b em uma sequência de tamanho 20 x 20, para os 20 aminoácidos, com modos de construção diferentes.
[0038] Dentre os mais clássicos, podem-se citar as matrizes de Dayhoff, denominadas PAM para "probability of acceptable mutations", baseadas em distâncias evolutivas entre espécies e as matrizes de Henikoff, denominadas BLOSUM, baseadas no conteúdo em informa- ção das substituições.
[0039] Em cada família, existem várias séries de matrizes, de es- tringência variável, e, portanto, mais ou menos tolerantes às substitui- ções de aminoácidos.
[0040] Um diagrama de Venn pode também ser utilizado para co- locar em evidência as relações existentes entre os 20 aminoácidos de origem natural em função de uma seleção de propriedades físico- químicas, consideradas como importantes na determinação da estrutu- ra das proteínas.
[0041] De acordo com a invenção, entendem-se por "derivado homólogo" compostos peptídicos que apresentam uma certa percen- tagem de identidade peptídica. O termo "identidade" significa que os aminoácidos de duas sequências peptídicas comparadas correspon- dem exatamente. A percentagem de identidade se determina por uma comparação direta das sequências entre dois compostos peptídicos, alinhando essas sequências e computando o número exato de desca- samento entre as duas sequências alinhadas. Em seguida, divide-se pelo comprimento da sequência a mais curta e multiplica-se o resulta- do por cem. A percentagem de identidade pode também ser determi- nada com o auxílio de programas de computadores bem conhecidos do técnico, tais como Dotlet, produzido pela sociedade Dotplot, Clustal X e W, tais como descritos na publicação Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG: The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res 1997, 25 (24): 4876-4882 ou ainda Morgenstern B, tal como descrito na publicação DIALIGN 2: im- provement of the segment-tosegment approach to multiple sequence alignment. Bioinformations 1999, 15 (3): 211-218.
[0042] A base BLOCKS (Henikoff et Henikoff, 1991) dá sob a for- ma de alinhamentos múltiplos sem interseção-deleção (ou blocos) as subsequências de Swissprot que correspondem a regiões conserva-
das.
[0043] Assim, de acordo com a invenção, duas sequências peptí- dicas são ditas "sensivelmente homólogas, uma em relação à outra, desde que elas apresentem pelo menos 50 %, de preferência pelo menos 75 %, de preferência ainda pelo menos 85 %, de preferência ainda pelo menos 90 % e mais preferido pelo menos 95 % ou mais de identidade de sequência em um comprimento definido das moléculas peptídicas.
[0044] Além disso, de forma vantajosa, os epitopos ou compostos peptídicos objeto da invenção são ligados a portadores que permitem torna-los mais imunógenos. A título de exemplo não limitativo do por- tador, podem-se citar as moléculas KLH para Keyhole Limpet Hemo- cyanin, os lipopeptídeos de tipo palmitoil, ou seus derivados.
[0045] As modificações as mais comuns de proteínas por lipídeos são: a isoprenilação, a N-miristoilação, a palmitoilação (ou (S-acilação) e a glipiação.
[0046] A isoprenilação e a N- miristoilação são modificações cotraducionais ou imediatamente pós- traducionais e o grupamento que é ligado ao resto até a degradação da proteína.
[0047] A palmitoilação é pós-traducional. Essa modificação é re- versível e mais rápida que o "turn-over" da degradação das proteínas: ela pode, portanto, ser regulada. A glipiação é co- e pós-traducional.
[0048] Os peptídeos, de acordo com a invenção, são preferenci- almente peptídeos palmitoilados, pois esses derivados interagem com os componentes lipídicos da membrana das células alvos, que são, por exemplo, os macrófagos, as células dendríticas ou ainda os neu- trófilos, favorecem sua penetração e os veiculam no interior destas pa- ra apresenta-los ao sistema imunitário.
[0049] Podem-se também citar os peptídeos glicosilados como, por exemplo, os conjugados manosilados e as construções MAPs, pa-
ra Multiple Antigenic Peptides.
[0050] Os epitopos objetos da invenção podem, além disso, con- ter um ou vários grupamentos protetores.
[0051] Com efeito, de modo a melhorar a resistência à degrada- ção, pode ser necessário utilizar uma forma protegida do peptídeo, de acordo com a invenção. A forma de proteção deve evidentemente ser uma forma biologicamente compatível e deve ser compatível com uma utilização no domínio farmacêutico. Numerosas formas de proteção biologicamente compatíveis podem ser consideradas, elas são bem conhecidas do técnico como, por exemplo, a acilação ou a acetilação da extremidade amino-terminal, ou a amidação ou a esterificação da extremidade carbóxi-terminal. Assim, a invenção se refere também a um epitopo, tal como definido anteriormente, caracterizado pelo fato de se apresentar sob a forma protegida ou não. Pode-se utilizar uma pro- teção baseada em uma substituição sobre a extremidade amino- terminal por um grupamento acetila, um grupamento benzoíla, um gru- pamento tosila ou um grupamento benzilóxi carbonila. De preferência, utiliza-se uma proteção baseada na amidação da função hidroxila da extremidade carbóxi-terminal por um grupamento NYY com Y repre- sentando uma cadeia alquila de C1a C4, ou a esterificação por um grupamento alquila.
[0052] É também possível proteger as duas extremidades do com- posto peptídico. Os derivados de peptídeos se referem também aos aminoácidos e os peptídeos ligados entre si por uma ligação pseudo- peptídica, todos os tipos de ligações capazes de substituir as ligações peptídicas clássicas. No domínio dos aminoácidos, a geometria das moléculas é tal que elas podem teoricamente se apresentar sob a for- ma de isômeros ópticos diferentes. Existe, com efeito, uma conforma- ção molecular do aminoácido (a), tal que ela desvia à direita o plano de polarização da luz (conformação dextrógira ou D-aa), e uma con-
formação molecular do aminoácido (aa), tal que ele desvia à esquerda o plano de polarização da luz (conformação levógira ou L-aa). Os aminoácidos naturais são sempre de conformação levógira, em con- sequência, um peptídeo de origem natural só será constituído de ami- noácidos de tipo L-aa. Todavia, a síntese química em laboratório per- mite preparar aminoácidos tendo as duas conformações possíveis.
[0053] A partir desse material de base, é assim possível incor- porar quando da síntese de peptídeo também aminoácidos sob a for- ma de isômeros ópticos dextrógiros ou levógiros. Assim, os aminoáci- dos que constituem o peptídeo, de acordo com a invenção, podem es- tar sob configuração L-, D- ou DL-.
[0054] Os epitopos e compostos peptídicos, segundo a invenção, podem ser obtidos seja por síntese química clássica (em fase sólida ou em fase homogênea líquida), seja por síntese enzimática, a partir de aminoácidos constitutivos ou de seus derivados. Os epitopos e compostos peptídicos, de acordo com a invenção, podem também ser obtidos por fermentação de uma cepa de bactérias modificadas ou não, por engenharia genética, ou ainda por extração de proteínas de origem animal ou vegetal, preferencialmente de origem vegetal, segui- da de uma hidrólise controlada que libera fragmentos peptídicos cor- respondentes totalmente ou parcialmente aos epitopos e compostos peptídicos, de acordo com a invenção.
[0055] Conforme é mostrado nos exemplos 1 a 4, a Requerente pôde colocar em evidência que os diferentes epitopos, de acordo com a invenção, são sequências consensos comuns às principais espécies de leishmanias e apresentam uma elevada e uma média afinidade para o conjunto das moléculas do CMH (Complexo Maior de Histo- compatibilidade) dos mamíferos, e mais particularmente para o conjun- to das moléculas do HLA (HLA para antígenos dos leucócitos huma- nos), majoritariamente representadas nas populações humanas as mais gravemente atingidas por essas afecções.
[0056] Com efeito, no contexto de uma estratégia vacinal das po- pulações humanas expostas às infecções leishmanianas e a fim de responder à necessidade de uma vacina, assegurando uma boa co- bertura da população mundial e protegendo contra as leishmanioses, é importante utilizar fragmentos antigênicos / peptídicos capazes de ativar, de forma durável, a imunidade celular específica dirigida contra o parasita.
[0057] Para assegurar uma boa abrangência da população mundi- al e em relação à grande variabilidade do fenótipo HLA (complexo maior de histocompatibilidade humana) entre os indivíduos, os frag- mentos antigênicos imunógenos (peptídeos) de comprimento suficien- te devem conter uma série de epitopos aptos a serem apresentados por vários tipos de moléculas HLA de classe I e II.
[0058] As moléculas HLA são altamente polimorfos. Com efeito, existem mais de 2500 proteínas HLA de classe I (HLA-I) e mais de 1000 proteínas HLA de classe II (HLA-II). Todavia, determinadas des- sas moléculas HLA, próximas em sequência e em conformação espa- cial, podem apresentar epitopos comuns às células T. O agrupamento de vários milhares de moléculas HLA é atualmente descrito em um pouco mais de duas dezenas de categorias, denominadas "supertipos HLA", apresentando epitopos muito conservados para cada supertipo.
[0059] Ao desenvolvimento de vacinas peptídicas, acrescenta-se a abordagem nultiepitópica ou poliepitópica (peptídeo contendo vários epitopos). Essa abordagem multiepitópica é vantajosa para desenvol- ver uma vacina destinada ao conjunto da população mundial. Com efeito, para assegurar uma boa abrangência da população mundial e em relação à grande variabilidade do fenótipo HLA entre os indivíduos, os fragmentos antigênicos imunógenos (peptídeos) de comprimento suficiente devem conter uma série de epitopos aptos a serem apresen-
tados por vários supertipos de moléculas HLA-I e II.
[0060] Também, os epitopos objetos da invenção apresentam um elevado poder imunógeno.
[0061] Os epitopos T são sequências antigênicas que reconhe- cem os linfócitos T. Por exemplo no Homem, os epitopos T são oriun- dos da degradação dos antígenos pelas células apresentadoras e são apresentados aos linfócitos T CD8+ (citotóxicos) ou CD4+ (auxiliares) pelas moléculas HLA respectivamente de classe I ou de classe II. Os epitopos T são, portanto, necessariamente ligantes das moléculas HLA e fazem efetivamente parte dos peptídeos que se ligam às molé- culas HLA com afinidades acentuadas ou moderadas.
[0062] As células que expressam o complexo maior de histocom- patibilidade de classe II (CMH2) podem também apresentar antígenos microbianos via CD1 aos linfócitos T gama-delta.
[0063] As capacidades de apresentação dependem de numerosas variáveis. Elas variam de um indivíduo ao outro, em razão do polimor- fismo do complexo maior de histocompatibilidade (CMH)
[0064] Assim, a cossanguinidade, diminuindo o número de CMH diferentes expressos por um indivíduo, diminui suas capacidades imu- nes. Elas diferem também segundo as modalidades de exposição ao antígeno (dose e via de administração), em razão das variações nas capacidades de apresentação de diferentes tipos de células apresen- tadoras. Por exemplo, as células implicadas na apresentação serão diferentes por via cutânea ou digestiva.
[0065] Enfim, a faixa peptídica produzida por um antígeno dado será diferente, segundo a célula apresentadora (modalidades de cliva- gem),e segundo a espécie e ao indivíduo (alelo do CMH).
[0066] Os compostos peptídicos, de acordo com a invenção, foram selecionados e concebidos visando a assegurar a abrangência vacinal e terapêutica das populações as mais gravemente atingidas pelas principais espécies patógenas de leishmanias. Eles são destinados a induzir e a caracterizar a prevenção ou o tratamento de afecções nos mamíferos, cuja imunidade protetora depende do estímulo dos linfóci- tos de tipo Th1 e das células T citotóxicas, característica de um estado de hiperestimulação de tipo retardado.
[0067] Numerosas situações patológicas são associadas a um es- tado imunitário de tipo Th1 ou Th2.
[0068] Para exemplificar, a exacerbação da via Th2, correspon- dente a um estado de hiperestimulação imediata, induz determinadas afecções como as dermites atópicas caninas, as alergias e a asma.
[0069] A obtenção de uma cura para essas afecções é feita por imunoestimuladores que permitem a passagem de um estado imuni- tário de tipo Th2 a um estado de tipo Th1.
[0070] Por outro lado, esse estádio imunitário Th1 está em plena correlação com um estado de resistência aos patógenos intracelulares, tais como Leishmania, Trypanosoma, Candida, Mycobacterium e Liste- ria.
[0071] Com referência à imunopatologia da asma, a literatura no decorrer do último decênio designou o linfócito T específico do alerge- no como chefe de orquestra da reação imunoalérgica (Magnan. A et al. "Cytokines, from atopy to athsma: the Th2 dogma revisited" Cell Mol Biol, 2001, 47, 679-687). Dentre os linfócitos T, a subpopulação Th2 produtora de IL-4 parece no primeiro plano e necessária à indução dessa reação. Desde então é oportuno que estratégias sejam estabe- lecidas para alvejar especificamente os linfócitos e, em particular, os Th2.
[0072] Esse tipo de estratégia pode ser também seguido para as leishmanioses, polarizando as respostas de mediação celular para um estado imunitário de tipo Th1 e favorecendo as respostas celulares citotóxicas, permitindo se opor e controlar o processo infeccioso.
[0073] Assim como é descrito acima, uma outra dificuldade prin- cipal no desenvolvimento de um candidato vacinal reside no fato de ele ter de ser idealmente eficaz contra várias espécies de leishmanias e notadamente contra as formas clínicas as mais severas (visceral e cutânea) e em diferentes hospedeiros naturais da infecção (Homem, cão).
[0074] Assim, a invenção tem por segundo objeto um composto peptídico, compreendendo 1, 2, 3 ou 4 dos epitopos de sequências SEQ ID no 1 a 10, tais como descritos acima, eventualmente separa- dos por um espaçador peptídico, compreendendo 1 a 8 aminoácidos.
[0075] A título de exemplo não limitativo de espaçador peptídico, podem-se citar os motivos T-V, V, Y, L (Lee Y. et al., Biomed Microde- vices, 2010, 12: 207-222).
[0076] De preferência, os espaçadores peptídicos utilizados são Y ou T-V, ou seus análogos.
[0077] A título de exemplos não limitativos de compostos peptídi- cos, compreendendo 2 dos epitopos de sequências SEQ ID no 1 a 10, tais como descritos acima, podem-se citar: SEQ ID No. 11: T-P-E-Q-R-T-N-T-L-T-V-E-L-G-K-K-W-I-G; ou SEQ ID No. 12: T-L-P-E-M-P-V-G-V-P-E-M-P-A-G-V-D-Y; SEQ ID No. 13: A-R-G-R-E-G-Y-F-L-A-R-G-A-R-G-R-E-G-Y-E-G-Y-F- V-T-D-E-K;
[0078] A título de exemplos não limitativos de compostos peptídi- cos compreendendo 3 dos epitopos de sequência SEQ ID no 1 a 10, tais como descritos acima, podem-se citar:
[0079] A título de exemplos não limitativos de compostos peptídi- cos compreendendo 4 dos epitopos de sequência SEQ ID no 1 a 10, tais como descritos acima, podem-se citar:
[0080] A invenção será melhor compreendida com a leitura da descrição não limitativa que se segue, redigida em relação aos dese-
nhos anexados, nos quais: - a figura 1 representa a localização dos epitopos HLA-I e HLA-II nas sequências Nter-PSA das principais espécies de leishma- nias. - a figura 2 representa a localização dos epitopos HLA-I e HLA-II nas sequências Cter-PSA das principais espécies de leishma- nias, em particular no início da sequências Cter-PSA denominada "zona 1". - a figura 3 representa a localização dos epitopos HLA-I e HLA-II nas sequências Cter-PSA das principiais espécies de leishma- nias, em particular na segunda parte da sequência Cter-PSA denomi- nada "zona 2".
[0084] Essas figuras 1 a 3 representam mapas de predição in sili- co das zonas ricas em epitopos com grande e média afinidades para as moléculas HLA classe I e HLA classe II nas sequências amino (Nter) – e carbóxi (Cter) – terminais dos PSA. - a figura 4 representa os compostos peptídicos SEQ ID no 11 a 14, assim como seu recorte em epitopos e a posição de um es- paçador entre os epitopos SEQ ID no 1 e SEQ ID no 2 do composto peptídico SEQ ID no 12. - a figura 5 representa o resultado de um algoritmo de pre- dição dos locais de clivagem pelo proteassoma de diferentes compos- tos peptídicos oriundos da parte amino-terminal de diferentes PSA. - a figura 6 representa o esquema de injeção utilizado no estudo do estado imunitário dos cães antes e depois da vacinação com os compostos, de acordo com a invenção.
[0085] Outros exemplos de compostos peptídicos, de acordo com a invenção, são descritos nos exemplos 3 a 8.
[0086] De preferência, os compostos peptídicos, de acordo com a invenção, são escolhidos dentre:
SEQ ID No. 9: T-N-T-L-A-V-L-Q-A-F-G-R-A-I-P-E-L-G-K-K-W; ou SEQ ID No. 10: E-G-Y-F-V-T-D-E-K-T-G-L-V-Y-R-D-G-G-V-A-A-A-S-S- G; ou SEQ ID No. 11: T-P-E-Q-R-T-N-T-L-T-V-E-L-G-K-K-W-I-G; ou SEQ ID No. 12: T-L-P-E-M-P-V-G-V-P-E-M-P-A-G-V-D-Y; ou SEQ ID No. 13: A-R-G-R-E-G-Y-F-L-A-R-G-A-R-G-R-E-G-Y-E-G-Y-F- V-T-D-E-K;
[0087] Conforme indicado anteriormente, de acordo com a inven- ção, os compostos peptídicos SEQ ID no 9 a 13 incluem seus deriva- dos análogos, muteínas e homólogos.
[0088] Dentre os derivados consideráveis dos compostos peptídi- cos SEQ ID no 9 a 13 acima, escolher-se-ão, de preferência os deriva- dos peptídicos dos compostos acima, comportando pelo menos cinco aminoácidos contíguos.
[0089] Um terceiro objeto da invenção se refere a uma composi- ção como produto farmacêutico, de uso veterinário ou humano, com- preendendo pelo menos: - um epitopo de sequência escolhido dentre as sequências SEQ ID no 1 a 10; ou - um composto peptídico compreendendo 1, 2, 3 ou 4 dos epitopos de sequência SEQ ID no 1 a 10, eventualmente separados por um espaçador, tal como definido acima; ou - um composto peptídico de sequência escolhida dentre SEQ ID no 11 a 13.
[0090] A invenção se refere também a essa composição para sua utilização na vacinação profilática e terapêutica dirigida contra uma ou várias das leishmanias, tais como Leishmania donovani, Leishmania infantum, Leishmania chagasi, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leishmania tropica, Leish- mania major, Leishmania aethiopica, Leishmania (Viannia) braziliensis,
Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) panamensis, Leishmania (Viannia) peruviana.
[0091] Vantajosamente, a composição, de acordo com a invenção, está apta a ser utilizada na vacinação profilática e terapêutica dirigida contra pelo menos 3, de preferência pelo menos 7, de preferência ain- da pelo menos 10 e mais preferida contra o conjunto das leishmanias listadas acima.
[0092] De preferência, a composição, de acordo com a invenção, é administrada por via subcutânea, intradérmica, intramuscular, intrave- nosa, parenteral ou oral.
[0093] Um objeto adicional da invenção se refere a uma composi- ção tal como definida acima a título de medicamento, de vacina, ou de reagente de diagnóstico in vitro e/ou in vivo, para a indução ou o diag- nóstico, em um mamífero, da passagem de um estado imunitário de tipo Th2 para um estado imunitário de tipo Th1.
[0094] Um objeto adicional da invenção se refere a uma composi- ção, tal como definida acima, a título de medicamento, de vacina, ou de reagente de diagnóstico in vitro e/ou in vivo, para a indução ou o diagnóstico, em um mamífero, de anticorpos específicos e mais parti- cularmente de isotipos IgG2.
[0095] Um problema adicional que se propõe a resolver a presente invenção é de dispor de uma vacina capaz de conferir uma imunopro- teção cruzada face as diferentes espécies de leishmaniose. A impor- tância da comunidade antigênica dividida pelas leishmanias permite considerar o desenvolvimento de uma vacina única polivalente, consti- tuído de imunógenos comuns e altamente conservados. O fato de al- vejar como vacina um (uns)o(s) antígeno(s) comum(ns) a todas as es- pécies de leishmanias deveria sem nenhuma dúvida representar um real vantagem em termos de vacinação cruzada.
[0096] Assim, um quarto objeto da invenção se refere a uma vaci-
na contra as leishmanias, compreendendo pelo menos: - um epitopo de sequência escolhido dentre as sequências SEQ ID no 1 a 10; ou - um composto peptídico compreendendo 1, 2, 3 ou 4 dos epitopos de sequências SEQ ID no 1 a 10, eventualmente separados por um espaçador, tal como definido acima; ou - um composto peptídico de sequências escolhido dentre SEQ ID no 11 a 13.
[0097] Essa vacina é vantajosamente utilizada para uma vacina- ção profilática e terapêutica dirigida contra uma ou várias das leishma- nias escolhidas dentre Leishmania donovani, Leishmania infantum, Leishmania chagasi, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leishmania tropica, Leishmania major, Leishmania aethiopica, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) panamensis, Leishmania (Viannia) peruvian.
[0098] Essa vacina, objeto da invenção, é vantajosamente desti- nada ao homem, aos cães, aos felídeos e aos equinos. Preferencial- mente, a vacina objeto da invenção é destinada ao Homem e aos cães.
[0099] De preferência, a vacina, de acordo com a invenção, com- preende pelo menos dois epitopos ou compostos peptídicos dos quais pelo menos um epitopo é escolhido dentre: - um epitopo de sequências escolhido dentre as sequências SEQ ID no 1 a 10; ou - um composto peptídico compreendendo 1, 2, 3, ou 4 dos epitopos de sequências SEQ ID no 1 a 10, eventualmente separados por um espaçador, tal como definido acima; ou - um composto peptídico de sequência escolhida dentre SEQ ID no 11 a 13 .
[00100] De preferência ainda, a vacina, de acordo com a invenção, compreende pelo menos dois epitopos ou compostos peptídicos esco- lhido dentre: - um epitopo de sequências escolhido dentre as sequências SEQ ID no 1 a 10; ou - um composto peptídico compreendendo 1, 2, 3 ou 4 dos epitopos de sequências SEQ ID no 1 a 10, eventualmente separados por um espaçador, tal como definido acima; ou - um composto peptídico de sequências escolhido dentre SEQ ID no 11 a 13.
[00101] Além disso, um problema adicional que se propõe a resol- ver a presente invenção é de dispor de uma vacina capaz de assegu- rar uma abrangência vacinal na escala mundial. Esse candidato vaci- nal deve, portanto ser reconhecido pelo conjunto das moléculas do Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe I e de classe II ma- joritariamente representadas nas populações humanas as mais gra- vemente tocadas por essas afecções.
[00102] Nesse contexto, além dos aspectos securitários, de eficácia e de fabricação industrial próprios ao desenvolvimento de uma vaci- nação, uma vacina contra as leishmanioses deveria, além disso, sa- tisfazer a um certo número de exigências mais específicas. A elabora- ção dessa vacina é acompanhada de dificuldades suplementares de- vido à complexidade do ciclo de vida das leishmanias, na diversidade genética (mais de 20 espécies de leishmanias são responsáveis pelas infecções humanas), nos mecanismos de escapamento extremamente sofisticados que esses patógenos souberam elaborar no decorrer da evolução para se estabelecer em células chaves da imunidade, utili- zando nos respectivos proveitos as respostas imunitárias do hospedei- ro. A isto se acrescenta a extrema diversidade e pobreza das popula- ções atingidas por essas doenças.
[00103] Uma dificuldade adicional para alcançar o último objetivo da presente invenção não é somente de conduzir um estudo sobre a leishmaniose visceral e obter resultados transponíveis com eficácia e inocuidade no cão e no Homem, mas obter uma vacina única adap- tada à prevenção e ao tratamento de todas as espécies de leishmania nos mamíferos e considerando-se a complexidade do polimorfismo HLA do Homem.
[00104] Assim, de acordo com um modo preferido de realização da invenção, a vacina, de acordo com a invenção, compreende vantajo- samente, por um lado, pelo menos um composto peptídico escolhido dentre SEQ ID no 9 e 10; e, por outro lado, pelo menos um composto peptídico escolhido dentre as sequências SEQ ID no 11 a 13, essas sequências sendo tais como definidas acima. Naturalmente, conforme indicado anteriormente, segundo a invenção, os compostos peptídicos acima incluem seus derivados análogos, muteínas e homólogos.
[00105] De preferência, dentre os derivados consideráveis, esco- lher-se-ão preferencialmente os derivados peptídicos dos compostos acima, comportando pelo menos cinco aminoácidos contíguos.
[00106] A abordagem multiepitópica de uma vacina peptídica leva ao desenvolvimento de uma vacina destinada ao conjunto da popula- ção mundial. Para assegurar uma boa abrangência da população mundial e em relação à grande variabilidade do fenótipo HLA (comple- xo maior de histocompatibilidade humana) entre os indivíduos, os fra- gmentos antigênicos imunógenos (peptídeos) de comprimento sufici- ente devem, de preferência, conter uma série de epitopos aptos a se- rem apresentados por vários tipos de moléculas HLA-I e –II.
[00107] A identificação de epitopos, no meio dos antígenos maiores e conservados de leishmania, reconhecido pelas células T abre novas perspectivas em matéria de imunoterapia e de imunoprofilaxia das leishmanioses.
[00108] Assim, a detecção de primeiros peptídeos portados pela parte carbóxi-terminal do antígeno maior PSA permitiu obter nos cães um candidato vacinal peptídico que induz uma resposta de mediação celular, conferindo um bom nível de proteção ao encontro de uma in- fecção experimental à Leishmania infantum (patente FR2829767), as- sim como uma resposta anticorpo específico IgG2 importante, permi- tindo distinguir em zona de endemia um hospedeiro vacinado de um hospedeiro não vacinado, mas infectado (patente FR 2932802).
[00109] Conforme mostrado nos exemplos 3 e 4, a Requerente pô- de colocar em evidência que os epitopos ou compostos peptídicos SEQ ID no 1 a 8, SEQ ID no 11 a 13 são compostos peptídicos que apresentam uma afinidade pelas moléculas do complexo Maior de His- tocompatibilidade de classe I.
[00110] Da mesma forma, a Requerente colocou em evidência que os epitopos ou compostos peptídicos SEQ ID no 9 e 10 são reconhe- cidos pelas moléculas do Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe II.
[00111] De forma surpreendente, a Requerente colocou em evidên- cia que o conjunto desses peptídeos é comum a todas as espécies de leishmania.
[00112] De preferência, a vacina, de acordo com a invenção, com- preende, portanto, por um lado, pelo menos um ou dois compostos peptídicos escolhidos dentre SEQ ID no 9 e 10; e, por outro lado, pe- lo menos um, dois ou três compostos peptídicos escolhidos dentre as sequências SEQ ID no 11 a 13, essas sequências sendo tais como de- finidas acima.
[00113] De preferência ainda, a vacina, de acordo com a invenção compreende, em combinação, os cinco compostos peptídicos multiepi- tópicos SEQ ID no 9 a 13, essas sequências sendo tais como defi- nidas acima. Naturalmente conforme indicado anteriormente, de acor-
do com a invenção, os compostos peptídicos acima incluem seus de- rivados análogos, muteínas e homólogos.
[00114] Esses cinco compostos peptídicos consideram a extrema diversidade das espécies de leishmanias e o nível elevado do polimor- fismo HLA.
[00115] Os compostos peptídicos que foram vantajosamente sele- cionados são destinados a induzir a prevenção ou o tratamento das leishmanioses nos mamíferos, notadamente no Homem, cuja imuni- dade protetora depende da estimulação dos linfócitos de tipo Th1 (cé- lulas T auxiliares CD4+) e linfócitos T citotóxicos CD8+. Esse estado imunitário Th1 e citotóxico está em plena correlação com um estado de resistência aos patógenos intracelulares, tais como Leishmania, Trypanosoma, Candida, Mycobacterium e Listeria.
[00116] Para a elaboração específica desses compostos peptídicos, a Requerente teve de, por numerosas experiências, considerar, pes- quisar e caracterizar os polimorfismos HLA os mais frequentemente encontrados nas populações humanas expostas às infecções leish- manianas, aos quais são difíceis as respostas de mediação celulares do hospedeiro (HLA-I: resposta citotóxica CD8; HLA-II: respostas auxi- liares CD4+).
[00117] O polimorfismo HLA representativo da população humana mundial foi determinado e os supertipos para a concepção de uma va- cina leihmaniose foram selecionados.
[00118] O alinhamento das sequências amino- e carbóxi-terminais dos PSA (para Promastigoto Surface Antigen) das principais espécies de leishmanias capazes de infectar, acoplado a métodos de predição in silico baseando-se nas propriedades de ligação de sequências pep- tídicas face às moléculas HLA, conduziu a: - localizar as regiões as mais conservadas entre os PSA (partes carbóxi- e amino- terminal) das diferentes espécies de leish-
manias; - estabelecer os mapas de predição in silico das zonas ricas em epitopos com elevada e média afinidades para as moléculas HLA classe I e HLA classe II sobre as sequências de PSA (partes carbóxi- e amino- terminal); - selecionar sequências peptídicas consensus ricas em epi- topos HLA-I e HLA-II e em conceber sequências multiepitópicas HLA classe I consensus e otimizadas, apresentando um bom processo de apresentação dos epitopos e uma conservação dos escores de ligação para construir compostos peptídicos multiepitópicos (de 18 a 28 ami- noácidos) com o objetivo de multiplicar as chances de ativação do sis- tema imunitário.
[00119] Conforme foi demonstrado nos exemplos 1 a 6 abaixo, a combinação específica dos cinco compostos peptídicos SEQ ID no 9 a 13 permite responder com uma grande eficácia aos inconvenientes e insuficiências dos modelos propostos anteriormente. Conforme mostrado nos exemplos 7 e 8 a Requerente avaliou a eficácia dessa vacina peptídica in vivo e em testes clínicos no cão e em testes ex vivo sobre células humanas.
[00120] De forma vantajosa, a vacina objeto da invenção compre- ende, além disso, um adjuvante permitindo , de preferência, aumentar a resposta imunitária aos compostos peptídicos objeto da invenção. Os adjuvantes são, mais frequentemente, substâncias minerais, oleo- sas ou derivadas de certos micro-organismos. De preferência, o(s) ad- juvante(s) associado(s) aos compostos peptídicos objetos da invenção induzem uma resposta e mediação celular e são escolhidos dentre as classes TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, as saponinas, as emulsões óleo na água ou água no óleo, os polissacarídeos, os lipos- somas catiônicos, os virossomas ou os polieletrólitos. Dentre essas diferentes classes, podem-se citar, a título de exemplos não limitativos os compostos Poly I:C, Poly A: U, MPL, RC530, GLA, flagelina, Imi- quimod, Resiquimod, CpG, IC41, QS21, esqualano, esqualeno, toco- ferol, inulina, DDA e polioxidônio, QA21, a saponina, a quil-A, ou qualquer outro derivado destes conhecidos do técnico, considerados sozinhos ou em mistura.
[00121] De forma preferencial, a relação compostos peptídicos / ad- juvante está compreendida entre 3/1 e 3/3.
[00122] De acordo com um modo particular de realização da inven- ção, a vacina compreende, além disso, um composto peptídico cicliza- do por ponte dissulfeto composto de uma sequência de 34 aminoáci- dos e designado E34P.
[00123] Esse composto peptídico de 34 aminoácidos (E34P) é composto da seguinte sequência SEQ ID no 14: E-D-E-H-K-G-K-Y-C- R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R-G-T-P-T-P-A-P.
[00124] Esse composto peptídico é ciclizado por ponte dissulfeto entre a cisteína em posição 9 (Cys 9) e a cisteína em posição 15 (Cys 15). O composto peptídico E34P é vantajosamente capaz de induzir uma resposta anticorpo importante, permitindo discriminar em zona de endemia um hospedeiro vacinado de um hospedeiro não vacinado, mas infectado. Essa ciclização do composto peptídico é essencial pa- ra o aparecimento dos anticorpos específicos IgG2, a ciclização em ponte dissulfeto entre as cisteínas 9 e 15, induzindo uma conformação específica responsável dessa síntese IgG2. Com efeito, a não cicliza- ção do composto peptídico em Cys 9 / Cys 15 induz apenas uma sín- tese pouco importante em IgG2, às vezes difícil de descobrir.
[00125] Naturalmente, conforme indicado anteriormente, de acordo com a invenção, o composto peptídico E34P inclui seus derivados análogos, muteínas e homólogos, tais como definidos acima.
[00126] De forma particularmente vantajosa, a vacina, de acordo com a invenção, compreende os compostos peptídicos objetos da in-
venção na relação seguinte: SEQ ID No. 9 / SEQ ID No. 10 / SEQ ID No. 11 / SEQ ID No. 12 / SEQ ID No. 13: 20 / 20 / 20 / 15 / 25.
[00127] De forma mais vantajosa ainda, a vacina, de acordo com a invenção, compreende os compostos peptídicos objetos da invenção, assim como o composto peptídico E34P na seguinte relação: SEQ ID No. 9 / SEQ ID No. 10 / SEQ ID No. 11 / SEQ ID No. 12 / SEQ ID No. 13 / SEQ ID No. 14: 20 / 20 / 20 / 15 / 25 / 10.
[00128] Enfim, um último problema que se propõe a resolver a pre- sente invenção é de dispor de uma vacina que tem a capacidade de induzir respostas imunitárias, permitindo distinguir um hospedeiro va- cinado de um hospedeiro infectado. Com efeito, como para numero- sas doenças parasitárias, o diagnóstico clínico permanece aleatório, pois os sintomas são pouco específicos, frequentemente ausentes (existem numerosos portadores assintomáticos) que só parecem ver- dadeiramente quando de uma fase muito avançada da infecção, que se torna então extremamente difícil de tratar. O diagnóstico serológico que consiste em colocar em evidência anticorpos específicos circulan- tes é feito em rotina (técnica de imunofluorescência indireta). Uma va- cina, quando é administrada, gera em geral anticorpos específicos que muito frequentemente podem ser também produzidos, quando de uma infecção. A presença desses anticorpos em um hospedeiro pode então confundir no sentido em que a infecção e a vacinação possuem a mesma assinatura.
[00129] Assim, de acordo com um modo preferido de realização da invenção, a vacina compreende, além disso, pelo menos uma assina- tura. A assinatura pode ser qualquer antígeno capaz de gerar anticor- pos específicos, quando de uma imunização, mas não produzidos, quando de uma infecção.
[00130] A título de exemplo não limitativo de assinatura utilizável, de acordo com a invenção, pode-se citar o composto peptídico cicliza-
do por ponte dissulfeto E34P descrito acima. Esse composto peptídico de 34 aminoácidos (E34P) é composto da seguinte sequência SEQ ID no 14: E-D-E-H-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R-G- T-P-T-P-A-P. Esse composto peptídico é ciclizado por ponte dis-sulfeto entre a cisteína em posição 9 (Cys 9) e a cisteína em posição 15 (Cys 15).
[00131] De acordo com um modo de realização adicional, a inven- ção se refere também a uma sequência nucleotídica codificando para: - um epitopo de sequências escolhido dentre as sequências SEQ ID no 1 a 10; ou - um composto peptídico compreendendo 1, 2, 3, ou 4 dos epitopos de sequências escolhidos dentre SEQ ID no 1 a 10, eventu- almente separados por um espaçador, tal como definido acima; ou - um composto peptídico de sequência escolhido dentre SEQ ID no 11 a 13.
[00132] A invenção se refere também a um vetor de expressão, compreendendo pelo menos uma sequência nucleotídica, tal como de- finida acima, assim como os meios necessários à sua expressão.
[00133] Enfim, a invenção se refere a um reagente de diagnóstico, compreendendo: - um epitopo de sequências escolhido dentre as sequências SEQ ID no 1 a 10; ou - um composto peptídico compreendendo 1, 2, 3 ou 4 dos epitopos de sequência SEQ ID no 1 a 10, eventualmente separados por um espaçador, tal como definido acima; ou - um composto peptídico de sequência escolhido dentre SEQ ID no 11 a 13.
[00134] A presente invenção vai a seguir ser ilustrada por meio dos seguintes exemplos: Exemplo 1: análise dos supertipos HLA para uma eficácia na escala mundial.
[00135] A fim de desenvolver epitopos ou compostos peptídicos multiepitópicos, a Requerente pesquisou, recenseou, e caracterizou os supertipos HLA os mais frequentemente encontrados no mundo, notadamente nas populações humanas expostas às infecções leish- manianas. As tabelas 1 e 1bis abaixo representam a frequência média dos supertipos HLA- I e –II nos países os mais referidos pela leishma- niose, na população mundial, assim como os haplotipos associados. Tabela 1:
HLA HLA Peru Índia Tunisia classe I classe I Supertipo % Halotipo % Halotipo % Halotipo B58, B44, HLA-A A01 17,5 ? 32,2 B08, B44 37 B07 B07, B27, A02 79,8 30,9 B07 39 B07, B44 B44 B07, B44, B07, B44, B07, B44, A03 31,1 55,5 53 B27 B27, B62 B27 B07, B62, B07, B44, A24 23 11,1 32 B08, B44 B27 B58 HLA-B B07 80,5 109,8 40 B08 4,7 3,3 9 B27 31,2 15,4 20 B44 31,8 47,3 43 B58 ? 27,5 16 B62 21 18,7 5 HLA classe População HLA classe Espanha França I Mundial
I supertipo % Halotipo % Halotipo Média % B08, B27, B08, B44, HLA-A A01 28 59,2 25,2 B44 B62 B44, B27, B07, B27, A02 47 42,3 42,2 B62, B07 B44, B62 B07, B44, A03 22 58,5 B07, B27 44,2 B27 B27, B07, B07, B44, A24 ? 22,3 40,0 B44 B62 HLA-B B07 55 51,5 49,5
HLA classe População HLA classe Espanha França I Mundial
I supertipo % Halotipo % Halotipo Média % B08 10 16,9 8,8* B27 38 23,7 23,4 B44 51 47,9 37,0 B58 8 11,5 10,5 B62 2 13,1 18,1 Tabela 1a: HLA classe II Peru Índia Tunisia Espanha supertipo DR1 12,32 7,5 17 19,7 DR2 (DR15) ? 22,7 13 29 DR3 (DR17) 10,27 10,3 23 17,1 DR4 32,87 1,8 27 19,7 DR5 (DR11) 9,59 1,8 28 29 DR7 8,9 24,3 36 38,1 DRB5 ? ? ? ? DPB1 ? 76,8 76 ? HLA classe II Frequência fenotípica Alelo o mais represen- França média (%) de Prata na supertipo tativo população mundial DR1 17,7 15,2 DRB1*0101 DR2 (DR15) 15,4 29,7 DRB1*1501 DR3 (DR17) 20,6 18,3 DRB1*0301 DR4 10,9 26,2 DRB1*0401 DR5 (DR11) 17,6 16,9 DRB1*1101 DR7 26,0 17,0 DRB1*0701 DRB5 15,2 ? DRB5*0101 DPB1*0401 & DPB1 76 ? DPB1*0402
[00136] As percentagens calculadas nas tabelas 1 a 1bis acima são avaliadas a partir de Sette A. and Sidney J. Immunogenetics, 1999.
[00137] A Requerente determinou em seguida as combinações de supertipos HLA de classe I a considerar para a pesquisa e a identifica- ção de compostos peptídicos multiepitópicos T capazes de assegurar a abrangência vacinal das populações as mais gravemente atingidas pelas leishmanioses.
[00138] A tabela 2 abaixo coloca em evidência os supertipos seleci- onados e mostra que a consideração, em combinação, de vários su- pertipos HLA, notadamente para HLA-I, permite assegurar uma me- lhor abrangência vacinal da população mundial. Tabela 2: Abrangências da população estimada Combinações de supertipos HLA (Caucasianos + Negros N.A + Japoneses+ Chineses + Hispânicos) HLA-A02, A03 and B7 86,2% HLA-A02, A03, B07, A24, B44 e A01 99,2% HLA-A02, A03, B07, A24, B44, A01, B27, 99,8% B62 e B58
[00139] Como para a tabela 1, as percentagens calculadas na tabe- la 2 acima são avaliadas a partir de Sette A. and Sidney J. Immunoge- netics, 1999.
[00140] Conforme é mostrado na tabela 2 acima, os supertipos HLA-I que devem ser reconhecidos pelos compostos peptídicos que entram na composição de uma vacina candidata, de acordo com a in- venção, para assegurar uma abrangência vacinal aceitável contra as leishmanioses são, portanto, os supertipos HLA-A02, A03 e HLA-B07. De preferência, para assegurar uma boa abrangência vacinal os su- pertipos HLA-I que devem ser reconhecidos pelos compostos peptídi- cos são os supertipos HLA-A01, A02, A03, A24 e HLA-B07 e B44, de preferência ainda os supertipos HLA-A01, A02, A03, A24 e HLA- B07, B27, B44, B58 e B62.
[00141] De forma particularmente vantajosa, os supertipos HLA-I que devem ser reconhecidos pelos compostos peptídicos são os su- pertipos HLA-A01, A02, A03, A24 e HLA-B07, B08, B27, B44, B58 e B62 listados na tabela 1 acima.
[00142] No que se refere aos supertipos HLA-II, os supertipos sele- cionados são os supertipos HLA-DR1, DR2, DR3, DR4, DR5, DR7,
DRB5 e DPB1.
[00143] Considerando-se o que precede, a Requerente pôde esta- belecer que uma vacina compreendendo epitopos ou compostos mul- tiepitópicos reconhecidos pelo conjunto dos supertipos HLA acima as- seguraria, portanto, uma abrangência vacinal ótima na escala mundial. Exemplo 2: identificação das sequências consenso nos diferentes PSA (para Promastigote Surface Antigen).
[00144] A requerente listou, depois estudou as sequências amino- e carbóxi- terminais dos PSA das principais espécies de leishmanias capazes de infectar o Homem, a fim de colocar em evidência zonas muito conservadas, também denominadas zonas "consenso".
[00145] As sequências amino-terminais dos PSA (Nter-PSA) das principais espécies de leishmanias são listadas abaixo. Elas estão re- presentadas sem o peptídeo sinal das vias de excreção-secreção.
[00146] As sequências carbóxi-terminais dos PSA (Cter-PSA) das principais espécies de leishmanias são listadas abaixo.
Elas são re- presentadas sem o peptídeo sinal da fixação GPI.
O glicosil fosfatidili- nositol ou GPI, permite a fixação no nível extracelular de diversas mo- léculas, em particular proteínas (enzimas) nas membranas celulares.
É uma dobradiça que permite à molécula permanecer fixada na mem- brana e exercer o respectivo papel.
Identificação de sequências consenso amino-terminais dos PSA das diferentes espécies de leishmanias:
[00147] As sequências amino-terminais dos PSA (Nter PSA) foram alinhadas com a finalidade de localizar as regiões as mais conserva- das entre os PSA das diferentes espécies de leishmanias.
[00148] A tabela 3 abaixo ilustra o alinhamento das sequências amino-terminais dos diferentes PSA (Nter-PSA). Os aminoácidos re- presentados em branco no fundo negro colocam em evidência as se- quências que apresentam o mais de homologia e que são as mais conservadas. Trata-se de sequências consenso.
[00149] Os diferentes símbolos representados sob as sequências colocam em evidência o grau de homologia ou de identidade entre as diferentes sequências alinhadas.
[00150] O símbolo "*" indica que o aminoácido da fileira considera-
do é o mesmo para cada uma das sequências, fala-se então de identi- dade. O símbolo ":" indica uma acentuada homologia e o símbolo ". " indica uma ligeira homologia.
[00151] A ausência de símbolo indica a ausência de homologia.
[00152] O "N-" a montante das sequências alinhadas na tabela 3 indica que se trata da extremidade amino-terminal dessas sequências.
[00153] As sequências estudadas provêm de diferentes tipos de leishmanias. As diferentes siglas da tabela 3 abaixo indicam de que tipo leishmania provêm as sequências estudadas: "LMJ" para leishma- nia major, "LDI" para L. infantum, "LDD" para L.dovani., "LCHA" para L. chagasi, "LAMA" para L. amazonensis, "LBRA" para L. braziliensis e "LTRO" para L. tropica. Tabela 3
[00154] Em sequência ao alinhamento de sequências acima, a Re- querente pôde estabelecer as zonas para as quais as sequências apresentam o mais de homologia. Identificação de sequências consenso carbóxi-terminais dos PSA das diferentes espécies de leishmanias:
[00155] Da mesma forma, as sequências carbóxi-terminais dos PSA (Cter-PSA) foram alinhadas. A tabela 4 abaixo ilustra o alinha-
mento da parte carbóxi-terminal das sequências dos diferentes PSA.
[00156] Como para a tabela 3, os aminoácidos representados em branco sobre fundo negro colocam em evidência as sequências que apresentam mais de homologia e que são as mais conservadas, ou sequências consenso.
[00157] O "C-" a montante das sequências alinhadas na tabela 4 indica que se trata da extremidade carbóxi-terminal dessas sequên- cias.
[00158] Os diferentes tipos de leishmanias estudados são os mes- mos que aqueles estudados na tabela 3. As siglas da tabela 4 permi- tem identificá-los. Tabela 4
[00159] Em sequência ao alinhamento de sequências acima, a Re- querente pôde estabelecer duas zonas principais para as quais as se- quências apresentam o mais de homologia.
[00160] Os alinhamentos acima permitiram localizar zonas "consen- so", isto é, as zonas as mais conservadas entre os PSA das diferentes espécies de leishmanias.
[00161] Exemplo 3: Seleção e otimização de epitopos de acordo com as suas afinidades, com as várias moléculas HLA classe I e HLA classe II.
[00162] Os diferentes derivados dessas sequências "consenso" fo- ram testados, graças a métodos de predição in silico baseando-se nas propriedades de ligação de sequências peptídicas face às moléculas HLA. Mapas de predição in silico das zonas ricas em epitopos com for- te e média afinidades para as moléculas HLA classe I e HLA classe II nas sequências dos PSA (partes carbóxi- e amino- terminal) foram rea- lizadas.
[00163] As figuras 1, 2, e 3 ilustram a localização dos epitopos HLA nas sequências de diferentes PSA.
[00164] Esses resultados permitiram a seleção e a otimização de sequências peptídicas conseno ricas em epitopos HLA-I e HLA-II.
[00165] Ao final desses testes, os 10 seguintes epitopos foram reti- dos: SEQ ID No. 1: T-P-E-Q-R-T-N-T-L (epitopo HLA-B07); SEQ ID No. 2: E-L-G-K-K-W-I-G (epitopo HLA-B08); SEQ ID No. 3: T-L-P-E-M-P-V-G-V (epitopo HLA-A02); SEQ ID No. 4: P-E-M-P-A-G-V-D-Y (epitopo HLA-A01); SEQ ID No. 5: A-R-G-R-E-G-Y-F-L (epitopo HLA-B27); SEQ ID No. 6: A-R-G-A-R-G-R-E-G-Y (epitopo HLA-B44); SEQ ID No. 7: A-R-G-A-R-G-R-E-G (epitopo HLA—B27); SEQ ID No. 8: E-G-Y-F-V-T-D-E-K (epitopo HLA-A03); SEQ ID No. 9: T-N-T-L-A-V-L-Q-A-F-G-R-A-I-P-E-L-G-K-K-W; SEQ ID No. 10: E-G-Y-F-V-T-D-E-K-T-G-L-V-Y-R-D-G-G-V-A-A-A-S-S- G. Exemplo 4: construção de compostos peptídicos multiepitópicos a. Compostos peptídicos multiepitopos HLA-I:
[00166] Os epitopos que apresentam a afinidade a mais elevada para as moléculas HLA-I foram ligados em compostos peptídicos mul- tiepitópicos (de 18 a 28 aminoácidos) com o objetivo de multiplicar as chances de ativação do sistema imunitário.
[00167] A afinidade dos seguintes compostos peptídicos SEQ ID no 11 a 13: SEQ ID No. 11: T-P-E-Q-R-T-N-T-L-T-V-E-L-G-K-K-W-I-G SEQ ID No. 12: T-L-P-E-M-P-V-G-V-P-E-M-P-A-G-V-D-Y;
SEQ ID No. 13: A-R-G-R-E-G-Y-F-L-A-R-G-A-R-G-R-E-G-Y-E-G-Y-F- V-T-D-E-K; para os supertipos HLA-I A01, A02, A03 (A11), A24, B07, B08, B27, B44 (B18), B58 e B62 foi em seguida determinada pela Requerente. Os resultados são agrupados na tabela 5 abaixo. Tabela 5: composição em aminoácidos e em epitopos dos três com- postos peptídicos HLA-I selecionados Epitopo in- Peptídeo Localização HLA classe I cluído em Sequências Escore de classe I (A, sobre PSA supertipo peptídeos epitopos ligação B, ou C) selecionados Nter-zona 2 12 A01 sim PEMPAGVDY 0,54 Nter-zona 2 12 A02 sim TLPEMPVGV 0,97 Cter-zona 2 13 A03 (a11) sim EGYFVDEK 1,22 A24 Nter-zona 1 11 B07 sim TPEQRTNTL 1,57 Nter-zona 1 11 B08 sim ELGKKWIG 0,95
ARGARGREGY 0,83 e ARGAR- Cter-zona 2 13 B27 sim 0,93 GREG e AR- 0,85
ARGARGREGY e ARGAR- Cter-zona 2 13 B44 (B18) sim GREG (Cliva- 0,72 gem possível após G) B58 B62
[00168] No final desse estudo, os 3 compostos peptídicos mul- tiepitopos HLA-I de sequências SEQ ID no 11 a 13 foram selecionados.
[00169] A figura 4 ilustra a composição em epitopos dos três com- postos peptídicos HLA-I selecionados (afinidade com os supertipos HLA-I implicados sobre os 10 mais importantes).
[00170] De forma vantajosa, esses compostos peptídicos serão sin- tetizados sob sua forma palmitoíla (K).
b. Compostos peptídicos multiepitopos HLA-II:
[00171] Além disso, a Requerente realizou um estudo que tem por finalidade avaliar, para as seguintes sequências consenso: - Nter PSA: T-N-T-L-A-V-L-Q-A-F-G-R-A-I-P-E-L-G-K-K-W (SEQ ID No. 9); - Cter-PSA-zona 1: P-D-S-W-A-Q-K-A-G-L-V-V-T-I-R-D-E; e Cter-PSA-zona 2: E-G-Y-F-V-T-D-E-K-T-G-L-V-Y-R-D-G-G-V-A-A-A-S- S-G (SEQ ID No. 10), o número de epitopos tendo uma afinidade alta/moderada com os di- ferentes tipos HLA-II.
[00172] Os resultados desse estudo são retomados na tabela 6 abaixo.
[00173] Para esse estudo, o servidor NetMHCII 2.2 pode, por exemplo, ser utilizado para predizer a afinidade de diferentes peptí- deos com os diferentes tipos HLA. Ele prediz a ligação de peptídeos às moléculas HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, assim como os alelos do CMH classe 2 do rato, utilizando uma rede artificial de neurônios. Os prognósticos podem ser obtidos para 14 alelos HLA-DR abrangendo dos 9 supertipos HLA-DR, os 6 supertipos HLA-DQ, os 6 supertipos HLA-DP, assim como os dois alelos H2 classe 2 do rato.
[00174] Os valores de predições são dados em valores de IC50 em nM e como uma classificação em percentagem em um conjunto de 1 000 000 de peptídeos naturais aleatórios. Os peptídeos de ligações fortes e fracas são indicados nos resultados. Tabela 6: DR2 DR5 DR6 PSA DR1 DR3 DR4 DR7 DRB5 CPB1 (DR15) (DR11) (DR13) 1 high/1 Nter 0/2 0/0 0/1 0/0 1/0 0/1 1/2 0/1 moderada Cter- 0/1 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 zona 1 Cter- 0/2 0/1 0/2 0/2 0/1 0/0 0/1 0/0 0/0 zona 2
[00175] Em sequência a esses resultados, os dois compostos pep- tídicos multiepitopos HLA-II de sequências SEQ ID no 9 e 10 foram se- lecionados.
[00176] As tabelas 7 e 8 abaixo representam a concentração em peptídeo competidor (nM) (SEQ ID no 9 ou SEQ ID no 10) para a qual 50 % da ligação do peptídeo de referência às moléculas HLA-DRB1 às moléculas HLADRB3, -DRB4, -DRB5 e HLA-DP4, são inibidos (IC50).
[00177] Para cada uma das tabelas 7 e 8, os resultados são oriun- dos de duas experiências independentes. Tabela 7: DR1 DR3 DR4 DR7 DR11 DR13 DR15 Referência 2.1 150 9 5 62 100 65
2.5 190 12 6.5 50 50 75 SEQ ID 1.8 >10,000 25 10 120 5000 450 No. 9
1.7 >10,000 22 30 200 1700 300 SEQ ID 550 35 18 8000 120 1800 180 No. 10 700 35 15 3500 200 900 60
[00178] Os valores indicados correspondem as IC50 obtidas para cada peptídeo estudado.
[00179] Os resultados são reprodutíveis, já que os valores de IC50 obtidos para cada experiência não excedem um fator de três.
[00180] Quanto menor for o valor da IC50, melhor será a afinidade do peptídeo para a molécula HLA estudada. Assim, é importante ano- tar que os peptídeos de referência não têm todos a mesma capacida- de de ligação segundo a molécula HLA considerada. Esses valores correspondem aos valores padrões esperadas.
[00181] Como para os resultados apresentados acima, a tabela 8 ilustra o conjunto dos valores de IC50 obtidos para os dois peptídeos testados e seu peptídeo de referência como controle interno, para a ligação às moléculas HLA-DRB3, -DRB 4, -DRB5 e às moléculas HLA- DP401 e –DP402.
Tabela 8: DRB3 DRB4 DRB5 DP401 DP402 Referência 35 11 9.5 8 4.5 38 10 4 9 18 SEQ ID No. 9 >10,000 13,000 8 >10,000 10,000 >10,000 15,000 2.5 >100,000 >100,000 SEQ ID No. 150 >10,000 10,000 >10,000 9000 180 >10,000 1500 50,000 >100,000
[00182] A tabela 9 abaixo ilustra a atividade relativa dos dois com- postos peptídicos SEQ ID no 9 e 10 para as moléculas HLA-DR, HLA- DRB e HLA-DP4 estudadas. A atividade relativa é calculada a a partir das duas tabelas 7 e 8 acima da seguinte forma: Razão = (média dos valores de IC50 obtidos para o peptídeo testado)/ (média dos valores de IC50 obtidos com o peptídeo de referência). Tabela 9: Peptídeo DR1 DR3 DR4 DR7 DR11 DR13 DR15 DRB3 DRB4 DRB5 DP401 DP402
SEQ ID 1 >187 2 3 3 41 5 >274 1331 0,9 >3727 >2222 No. 9
SEQ ID 271 0.2 2 928 3 18 1 5 >9535 688 5556 2000 No. 10
[00183] Nessa tabela 9, a atividade relativa é definida pela razão obtida entre a média dos IC50 calculada com o peptídeo competidor e a média dos IC50 calculada com o peptídeo de referência. A atividade relativa permite assim comparar as propriedades de ligação do peptí- deo testado àquela do peptídeo de referência que corresponde ao peptídeo que liga de forma a mais eficaz uma molécula HLA determi- nada. Assim, uma atividade relativa de 2 significa que o peptídeo tes- tado liga 2 vezes menos eficazmente a molécula HLA estudada que o peptídeo de referência. Assim, quanto menor for a razão, melhor será a finidade do peptídeo para a molécula HLA considerada.
[00184] Por conseguinte, segundo a razão obtida, os compostos peptídicos são classificados conforme três categorias: - os compostos peptídicos de alta afinidade, cuja razão não excede 20;
- os compostos peptídicos de média afinidade, compreendi- dos entre 21 e 101; e - os compostos peptídicos não afins com uma razão supe- rior a 102.
[00185] Em vista do conjunto dos resultados obtidos, os dois com- postos peptídicos consenso apresentam uma boa afinidade para as moléculas HLA-DR4, -DR11, -DR13 e DR15.
[00186] Mais particularmente, o composto peptídico SEQ ID no 9 se distingue do composto peptídico SEQ ID no 10 por sua afinidade de ligação elevada às moléculas HLA-DR1, -DR7 e DRB5.
[00187] Ao contrário, o composto peptídico SEQ ID no 10 apresenta uma boa afinidade de ligação às moléculas HLA-DR3 e HLADRB3, enquanto que o composto peptídico SEQ ID no 9 não é ativo sobre es- sas duas moléculas HLA.
[00188] De forma mais geral, esses dois compostos peptídicos são epitopos T potenciais capazes de ativar linfócitos T CD4+, pois se li- gam, a eles dois, ao conjunto das moléculas HLADRB1 majoritaria- mente representadas na população mundial, assim como duas molé- culas HLA-DR secundárias em três (HLA-DRB3 e DRB5).
[00189] Os cinco compostos peptídicos retidos foram selecionados para assegurar a abrangência vacinal e terapêutica das populações as mais gravemente atingidas pelas principais espécies de leishmanioses os mais patógenos no homem.
[00190] A terminação N dos compostos peptídicos pode ser modi- ficada por adição de uma marcação ácido graxo a partir de uma prote- ína N-acilada. A forma a mais comum dessa modificação é a adição de um grupo palmitoíla (K). Isto torna o composto peptídico mais estável e aumenta sua capacidade de ser apresentado às células do sistema imunitário. Exemplo 5: Predição dos sítios de clivagem para o proteassoma
[00191] A Requerente realizou também um estudo da conservação e da criação de locais de corte pelo proteassoma, permitindo favorecer o processo de apresentação dos epitopos pelas moléculas HLA-I. Esse estudo permitiu conceber sequências multiepitópicas HLA classe I consenso e otimizadas, apresentando um bom processo de apresen- tação dos epitopos e uma conservação dos escores de ligação dos peptídeos às moléculas HLA.Os epitopos os mais afins para as molé- culas HLA-I foram ligados para construir dos peptídeos multiepitópicos, apresentando de 18 a 28 aminoácidos, considerando-se mais particu- larmente a conservação e/ou a adição de um espaçador, como, por exemplo, o espaçador T-V presente na sequência SEQ ID no 11, locais de clivagem pelo imunoproteassoma das HLA de classe I, favorecendo sua apresentação ao sistema imunitário.
[00192] Os resultados desse estudo estão representados na figura
5. Exemplo 6: estudo físico-químico dos compostos peptídicos multiepi- tópicos classe I e classe II oriundos dos PSA de leishmanias e cálculo das concentrações desses compostos.
[00193] Os compostos peptídicos considerados, quando desse es- tudo são os compostos peptídicos multiepitópicos HLA de classe I SEQ ID no 11 a SEQ ID no 13 e os compostos peptídicos multiepitópi- cos HLA classe II SEQ ID no 9 e 10.
[00194] O composto peptídico epitopo B "E-34-P" de SEQ ID no 14 é também estudado aqui. Conforme indicado na descrição, trata-se de um composto peptídico de síntese não nativo, composto da seguinte sequência de 34 aminoácidos: E-D-E-H-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R-G-T-P-T- P-A-P.
[00195] Esse composto peptídico é designado pela expressão "E- 34Pc" quando está sob a forma de composto peptídico ciclizado em
Cys9-Cys15.
[00196] Ele permite distinguir em zona de endemia um hospedeiro vacinado de um hospedeiro não vacinado, mas infectado. O composto peptídico estudado no presente estudo é o composto peptídico K – (palmitoil)-E-D-E-H-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P- R-G-T-P-T-P-A-P.
[00197] Os compostos peptídicos foram preparados a 1mM em uma solução de 10 % de DMSO/PBS 1X (sem Mg/Ca) com tubos de ensaio contendo 1 mg de cada composto peptídico.
[00198] As tabelas 10, 11, 12 representam os resultados dos estu- dos físico-químicos dos diferentes compostos peptídicos citados aci- ma. Tabela 10: pesos moleculares e equivalência a 1 mM (milimol/L) dos compostos peptídicos retidos Nome de compostos [mg/ml] [mM] Tipo de Sequências de com- No. MW peptídicos ou 1 mM 1mg/ml epitopos postos peptídicos a.a. g/mol HLA ligação equivalente equivalente supertipo SEQ ID No. 11 TPEQRTNTLTVELGK 19 2171,48 2,171 4,61 x10-4
KWIG B07 TPEQRTNTL 1059,14 B08 ELGKKWIG 930,11 SEQ ID No. 12 TLPEMPVGVPEMPAG -4 18 1902,2 1,902 5,26 x10
VDY HLA A02 TLPEMPVGV 942,14 Classe I A01 PEMPAGVDY 978,08 SEQ ID No. 13 ARGREGYFLARGARG -4 28 3211,5 3,212 3,11 x10
REGYEGYFVTDEK B27 ARGREGYFL 1068,20 B44 (B18) & ARGARGREGY 1092,18 B27 A03 (A11) EGYFVTDEK 1087,15 SEQ ID No. 9 TNTLAVLQAFGRAIP -4 21 2313,73 2,314 4,32 x10
HLA ELGKKW Classe II SEQ ID No. 10 EGYFVTDEKTGLVYR 25 2549,73 2,550 3,92 x10-4
Nome de compostos [mg/ml] [mM] Tipo de Sequências de com- No. MW peptídicos ou 1 mM 1mg/ml epitopos postos peptídicos a.a. g/mol HLA ligação equivalente equivalente supertipo
EDEHKGKYCRLGNDC -4 B E-24 RTTEPTTTATPRGTP 34 3702,05 3,702 2,70 x10
TPAP Tabela 11: Compostos peptídicos não Palmitoilados Vol- Nome de DMSO PBS 1X Tipo de Sequências de compostos ume compostos MW g/mol Volume Volume epitopos peptídicos Final peptídicos ml ml (ml) SEQ ID No. 11 TPEQRTNTLTVELGKKWIG 2171,48 0,046 0,415 0,461 HLA SEQ ID No. 12 TLPEMPVGVPEMPAGVDY 1902,2 0,053 0,473 0,526 Classe I SEQ ID No. 13 ARGREGYFLARGARGREGYEGY 3211,5 0,031 0,280 0,311
FVTDEK SEQ ID No. 9 TNTLAVLQAFGRAIPELGKKW 2313,73 0,043 0,389 0,432
HLA SEQ ID No. 10 EGYFVTDEKTGLVYRDGGVAAA Classe II 2549,73 0,039 0,353 0,392
SSG Tabela 12: Compostos peptídicos Palmitoilados (extremidade Palmitoil Nome de DMSO PBS 1X Tipo Sequências de compostos MW Volume final compostos Volume Volume epitopos peptídicos palmitoilados g/mol (ml) peptídicos ml ml K-SEQ ID K-(Pal)- 2538,12 0,039 0,355 0,394 No. 11 TPEQRTNTLTVELGKKWIG K-SEQ ID K-(Pal)- HLA 2268,84 0,044 0,397 0,441 No. 12 TLPEMPVGVPEMPAGVDY Classe I K-SEQ ID K-(Pal)- No. 13 ARGREGYFLARGARGREGYEGY 3578,14 0,027 0,252 0,279
FVTDEK K-SEQ ID K-(Pal)- 2680,37 0,037 0,336 0,373 No. 9 TNTLAVLQAFGRAIPELGKKW
HLA K-SEQ ID K-(Pal)- Classe II No. 10 EGYFVTDEKTGLVYRDGGVAAA 2916,37 0,034 0,309 0,343
SSG K-(Pal)-EDEHKGKYCRLGNDCRT B E-34-PC 4066,69 0,025 0,221 0,246
[00199] Esses resultados indicam as propriedades bioquímicas dos peptídeos e permitem preparar soluções mães de peptídeos a 1mM,
visando testar, após diluição, sua eficácia no cão e sobre células hu- manas conforme ilustrado nos exemplos 7 e 8 abaixo. Exemplo 7: estudo do estado imunitário dos cães antes e após vacina- ção
[00200] Os compostos peptídicos SEQ ID no 9 a 13 da invenção são misturados ao composto peptídico de síntese não nativo E34Pc, SEQ ID no 14, que permite distinguir em zona de endemia um hospe- deiro vacinado de um hospedeiro não vacinado , mas infectado. Esse composto peptídico E34Pc é associado a um adjuvante induzindo, de preferência, uma resposta de mediação celular, tal como, por exemplo do QA21, da saponina, da Quil-A ou qualquer outro derivado destes conhecidos do técnico, tal como QS-21.
[00201] De maneira preferida, as sequências peptídicas são asso- ciadas em uma relação SEQ ID No. 9 / SEQ ID No. 10 / SEQ ID No. 11 / SEQ ID No. 12 / SEQ ID No. 13 / SEQ ID No. 14: 20 / 20 / 20 / 15 / 25 / 10.
[00202] Os compostos peptídicos, de acordo com a invenção, po- dem ser tornados imunogênicos por ligação a portadores ou qualquer outro derivado (grossa molécula tipo KLH, lipopeptídeos tipo palmitoil ou derivados) e são administrados nos candidatos em presença de um adjuvante e, de preferência ao QA21.
[00203] A fim de conhecer a capacidade do candidato vacinal para induzir uma imunidade protetora, as respostas imunitárias humoral e celular das composições compreendendo: - os cinco compostos peptídicos SEQ ID no 9 a SEQ ID no 13 ou - os seis compostos peptídicos SEQ ID no 9 a SEQ ID no 14, quando o composto peptídico E34Pc está também presente, são avaliados nas composições, nos cães imunizados (vacinados) compa- rativamente a cães placebos.
[00204] A composição de peptídeos é testada em 38 cães da raça Beagle apresentando uma sorologia leishmaniose negativa, uma para- sitologia negativa, uma ausência de resposta celular com leishmania (INF-y e granzyma B) e uma ausência de IgG2 específicos do com- posto peptídico E34Pc, repartidos em 10 grupos (0 a 9).
[00205] No estabelecimento dos grupos de cães, é notadamente previsto comparar as composições, segundo a invenção, a uma com- binação dos três compostos peptídicos descritos nos documentos de patentes FR2829767 e FR2932802. Trata-se dos seguintes três com- postos peptídicos: • A16E: A-A-R-C-A-R-L-R-E-G-Y-S-L-T-D-E • A16G: A-A-S-S-T-P-S-P-G-S-G-C-E-V-D-G; e • E34P: E-D-E-H-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P—R- G-T-P-T-P-A—P.
[00206] Esses três peptídeos, sob a forma palmitoilada são associ- ados em uma relação 10/25/25 para KE34P / KA17E / KA17G.
[00207] Essa combinação constitui o grupo de referência, que é comparado aos compostos peptídicos de classe I de SEQ ID no 11 a 13, e aos compostos peptídicos de classe II de SEQ ID no 9 a 10.
[00208] A finalidade do presente estudo é também de avaliar um efeito de dose da concentração dos diversos compostos peptídicos da composição vacinal.
[00209] Os 38 cães viveram no Norte da França (Auxerre), zona não endêmica) e foram repatriados no Sudeste da França, 4 semanas antes da vacinação em período de inverno (período que não apresenta vetores flebotomas com leishmania). Dentre os 10 grupos, um grupo prova placebo de 2 cães é previsto, trata-se do grupo 0. Os 9 outros grupos compreendem, cada um, 4 cães que receberam os diversos compostos peptídicos às concentrações indicadas na tabela 13 abai- xo. As diferentes misturas peptídicas são formuladas com o adjuvante
QA21, do Tween 80 e do TMS e liofilizados.
[00210] O esquema de injeção é ilustrado na figura 6. As doses in- jetadas são descritas na tabela 13 abaixo. Os valores indicados nessa tabela 13 correspondem às quantidades de peptídeos injetados em µg para 200 µl de composição injetada por via intradérmica. Os grupos identificados por uma estrela na tabela 13 são grupos de 4 cães. Os compostos peptídicos anotados "K" são compostos peptídicos palmi- toilados. Por exemplo, o composto peptídico "E34Pc palmitoilados é anotado com "KE34Pc". Tabela 13: grupos de cães estudados Peptídeos Peptídeos Misttura de Peptídeos Classe I e Referência Classe I Classe II Classe II grupos de cães 1* 2* 3* 4* 5* 6* 7* 8* 9* (µg) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM) componentes injetados Peptídeo 25 Patent KA17G FR2829767 Peptídeo 25 KA17E Patent Peptídeo 10 10 10 10 10 10 10 10 10 FR2932802 KE34Pc Peptídeo K-SEQ ID 40 80 10 20 40 80 No. 12 Classe I Peptídeo Innovative K-SEQ ID 30 60 7.5 15 30 60 Peptídeos No. 13 Peptídeo K-SEQ ID 50 100 12.5 25 50 100 No. 14 Peptídeo K-SEQ ID 40 80 10 20 40 80 Classe II No. 9 Innovative Peptídeo Peptídeos K-SEQ ID 40 80 10 20 40 80 No. 10 QA21 (µg) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 Adjuvantes Tween 80 & excipien- 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 (µl) tes TMS (µg) 250 250 250 250 250 250 250 250 250 Peptídeos Totais 60 130 250 90 170 60 110 210 410
[00211] Um acompanhamento clínico dos 38 cães é efetuado a ca-
da duas semanas.
[00212] As análises são efetuadas antes de qualquer injeção e 7 semanas após a terceira injeção.
[00213] Em um primeiro tempo uma pesquisa é efetuada nos soros dos anticorpos IgG2 específicos do composto peptídico E34Pc. Essas imunoglobulinas de tipo IgG2 de cães específicos do composto pep- tídico E34Pc são detectadas por métodos ELISA, conforme o método de microtitulação de Kveider et al. (J. Immunol. 1987, 138-299), utili- zando um conjugado anti-IgG2. Para esse método o composto peptídi- co é biotinilado antes de revestimento sobre microplacas, conforme o método descrito no pedido de patente FR2932802. Em um segundo tempo, a capacidade das células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) a proliferar após 5 dias de estimulação por diversos antígenos oriundos das vacinas candidatas é avaliada e uma dosagem da cito- quina IFNy (resposta Th1) é realizada. Esses dados são obtidos por intermédio de experiências ex vivo nos cães e permitem avaliar a res- posta celular.
[00214] A capacidade das células mononucleadas do sangue peri- férico (PBMC) a proliferar após 5 dias de estimulação por diversos antígenos oriundos dos candidatos vacinas é avaliada por uma técnica ELISA (método alternativo à radioatividade).
[00215] A dosagem da citoquina IFNy é feita também por um teste ELISA no que flutuou das células estimuladas e permite determinar a capacidade das células a entrar em uma via TH-1 após estimulação.
[00216] A eficácia dos candidatos vacinas é determinada ex vivo por um teste de atividade leishmanicida. Esse teste tem por finalidade avaliar o tipo e o nível de intensidade da resposta imune de mediação celular induzida pela administração de uma vacina no cão, estudando a capacidade dos macrófagos, colocados em contato com linfócitos autólogos, a eliminar os parasitas intracelulares de formas amastigo-
tos.
[00217] Enfim, uma dosagem da serina protease Granzime B é fei- ta no que flutua das células estimuladas a fim de avaliar a resposta citotóxica linfocitária específica e colocar em evidência a produção de Granzime B específico dos linfócitos T citotóxicos. Essa dosagem é realizada pelo estudo do nível de expressão dos transcritos por RT-q- PCR.
[00218] A tabela 14 abaixo dá os resultados desses diversos testes biológicos, e recensa, portanto, o número de cães que dão uma res- posta imunitária positiva: Análises IFN-γ Granzime B IgG2 (Th1 Citoquina) (Linfócitos T citotóxicos) (versus E34Pc) Grupos de cães 0 0 0 0 (2 cães) 1 4 1 2 (4 cães) 2 2 0 3 (4 cães) 3 2 2 3 (4 cães) 4 3 1 3 (4 cães) 5 1 1 3 (4 cães) 6 4 3 4 (4 cães) 7 4 2 3 (4 cães) 8 2 2 2 (4 cães) 9 2 4 2 (4 cães)
[00219] Conforme é mostrado na tabela 14 acima, a combinação dos compostos peptídicos de classe I e de classe II (grupos 6 a 9) dá melhores resultados em termos de resposta imunitária protetora que os compostos peptídicos de referência (grupo 1) e que os compostos peptídicos de classe I e de classe II considerados separadamente (grupos 2, 3 e grupos 4, 5).
[00220] Dentre os grupos que recebem a composição total dos compostos peptídicos (Classe I, Classe II e E34Pc), os grupos 6 e 7 correspondentes a baixas concentrações em compostos peptídicos dão os melhores resultados. É preciso notadamente anotar os bons resultados do grupo 6 que corresponde à mais baixa concentração em compostos peptídicos da composição seja 60 µg de compostos peptí- dicos por injeção.
[00221] Foi assim demonstrado que a composição age por estimu- lação do sistema linfocitário de tipo Th1 com produção de linfócitos T citotóxicos e de IgG2 específicos do composto peptídico E34Pc. O in- teresse dessas IgG2 não se baseia somente na distinção dos cães vacinados / cães infectados, mas também em sua capacidade de ini- bir a proliferação das formas amastigotos ou promastigotos de leish- mania. Exemplo 8: eficácia ex vivo dos compostos peptídicos classe I e II de PSA a estimular células humanas e a produzir citoquinas de tipo Th1
[00222] Os pacientes atingidos pela leishmaniose e curados com sucesso pela quimioterapia estão geralmente ao abrigo de novas in- fecções com leishmania. Essa resistência do hospedeiro à infecção leishmaniana é principalmente mediada por respostas imunes celula- res específicas e notadamente uma linfo proliferação dos linfócitos T e a produção das citoquinas Th1 como o interferon-gama(IFN-y) e inter- leucina (IL)-2 levando à ativação dos macrófagos e acarretando a morte dos parasitas. Embora progressos significativos tivessem sido completados recentemente para compreender os mecanismos da imu- nidade no Homem, nenhuma vacina está atualmente disponível contra as leishmanioses humanas. Todavia, numerosos esforços foram feitos para identificar antígenos de leishmanias capazes de induzir uma imu- nidade protetora. Os principais trabalhos relativos à vacinação foram e são ainda realizados no rato. Esses modelos de infecção experimental são muito afastados dos hospedeiros naturais da infecção, isto é, o cão e o homem, hospedeiros que têm um impacto considerável em termos de saúde veterinária e humana. Além disso, esses trabalhos se referiram essencialmente à leishmaniose cutânea a L. major (prin- cipal modelo de infecção disponível no rato), para a qual estudos não são diretamente transponíveis à leishmaniose visceral canina ou hu- mana.
[00223] A Requerente desenvolveu, portanto, uma nova aborda- gem que consiste em avaliar a capacidade dos antígenos de vacinas candidatas a estimular os linfócitos T do sangue periférico de pacien- tes curados ou de indivíduos expostos assintomáticos e imunes, me- dindo ex vivo a produção de citoquinas Th1 e/ou Th2. A eficácia des- ses antígenos a acionar notadamente uma resposta Th1 (liberação de IFN-y pelos linfócitos T estimulados) e a intensidade da resposta pro- vocada serão colocadas em correlação com a proteção ou a cura. Es- se teste ex vivo de eficácia de candidatos vacinas sobre células hu- manas foi utilizado com o PSA recombinante nativa a 10 µM e a vaci- na candidata peptídica (Pool A = combinação dos cinco compostos peptídicos SEQ ID no 9 a 13) a 2 µM sobre células de indivíduos as- sintomáticos imunes comparativamente a indivíduos inocentes.
[00224] O estatuto dos indivíduos foi definido por um exame clíni- co, mas também por métodos imunológicos (proliferação celular contra antígenos solúveis totais de leishmanias, dosagem de IFN-y após es- timulação celular, e dosagem dos anticorpos dirigidos contra esses antígenos no plasma) e parasitológicos (pesquisa e quantificação de parasitas no sangue por RT-Q-PCR). Os grupos de indivíduos foram, portanto, definidos conforme a seguir:
- indivíduos inocentes: nenhum histórico médico referente a uma leishmaniose, ausência de sinais clínicos, proliferação celular negativa, ausência de produção de IFNy, após estimulação celular, nenhuma evidência da presença de anticorpos dirigidos contra os an- tígenos totais de leishmanias e PCR negativa; - indivíduos assintomáticos: ausência de sinais clínicos, proliferação celular positiva e/ou produção de IFN-y após estimulação das células pelos antígenos totais de leishmanias, PCR positiva ou negativa.
[00225] Os resultados são apresentados na tabela 15 abaixo: Tabela 15: Taxa de IFN-y secretados pelas células T do sangue perifé- rico isolados de indivíduos assintomáticos (assimpt) e de indivíduos inocentes. (IFN-γ pg/ml) CBA padrão Meio Antígeno Valor - Meio Valor Top pa- Grupos MFI Mé- drão con- meio TSLA TSLA Pool A de indiví- dio top SD PHA nsLaPSA centrado sozinho Ldd8 Ldi 2 µM duos padrão pg/ml Asympt 1 5000 2712,9 922,39 68,48 ND 96,71 132,08 93,68 61,35 Asympt 2 5000 2712,9 922,39 128,63 ND 292,07 94,5 217,67 331,44 Asympt 3 5000 2712,9 922,39 0 ND 89,85 97,42 113,15 137,75 Asympt 4 5000 1538,93 536,14 135,29 6812,34 29,88 352,35 250,62 175,03 Asympt 2 5000 2712,9 922,39 115,04 ND 247,68 579,17 767,32 261,44 sozinho 1 5000 2712,9 922,39 318,48 ND -111,33 -189,85 -223,07 -200,18 sozinho 2 5000 2146,99 712,46 164,18 2923,49 -157,29 -125,61 -69,33 -89,82 sozinho 3 5000 2146,99 712,46 533,91 3424,42 -432,27 -356,45 -446,28 -416,12 sozinho 4 5000 2146,99 712,46 614,13 3189,57 -129,33 8,96 -105,37 -147,68 Sozinho 5 5000 2146,99 712,46 232,79 3245,22 -128,11 -155,78 -8,84 -137 TSLA: antígenos totais de leishmania; nsLaPSA: proteína PSA recom- binante; Pool A: combinação dos compostos peptídicos de síntese de SEQ ID no 9 a 13.
[00226] Conforme mostram os resultados, só as células de indiví- duos assintomáticos, comparativamente àquelas dos indivíduos ino-
centes, são capazes de induzir uma resposta Th1 (estimulação dos linfócitos T com produção significativa de IFN-y) em presença de PSA recombinante ou do Pool A.
Este representa, portanto um excelente candidato para as vacinas profiláticas e terapêuticas contra as leish- manioses humanas.
Claims (16)
1. Epitopo, caracterizado pelo fato de apresentar uma se- quência escolhida dentre SEQ ID No 1, 2, 8, 9,10, 15, 16, assim como seus derivados análogos, muteínas e homólogos.
2. Epitopo, caracterizado pelo fato de apresentar uma se- quência escolhida dentre SEQ ID No 1 à SEQ ID No 10, assim como seus derivados análogos, muteínas e homólogos.
3. Composto peptídico, caracterizado pelo fato de compre- ender 1, 2, 3, ou 4 dos epitopos, como definidos em uma das reivindi- cações 1 ou 2, eventualmente separados por um espaçador peptídico, compreendendo 1 a 8 aminoácidos.
4. Composto peptídico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de ser escolhido dentre a SEQ ID No 9 à SEQ ID No 13, assim como seus derivados análogos, muteínas e homólo- gos.
5. Composição farmacêutica, de uso veterinário ou huma- no, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um epitopo, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou um composto peptídico, como definido em uma das reivindicações 3 ou 4.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracte- rizada pelo fato de sua utilização ser para a vacinação profilática de terapêutica dirigida contra as leishmanias, tais como Leishmania donovani, Leishmania infantum, Leishmania chagasi, Leishmania me- xicana, Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leish- mania tropica, Leishmania major, Leishmania aethiopica, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) panamensis, Leishmania (Viannia) peruviana.
7. Vacina profilática e/ou terapêutica, caracterizada pelo fa- to de ser aplicada contra uma ou várias das leishmanias escolhidas dentre tais como Leishmania donovani, Leishmania infantum, Leish-
mania chagasi, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leishmania tropica, Leishmania major, Leishmania aethiopica, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) panamensis, Leishmania (Viannia) peruviana, compreendendo pelo menos um epitopo, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou um composto peptídico, como de- finido em uma das reivindicações 3 ou 4.
8. Vacina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de compreender, por um lado, pelo menos um composto peptídico escolhido dentre a SEQ ID No 9 e 10, assim como seus deri- vados análogos, muteínas, e homólogos; e, por outro lado, pelo menos um composto peptídico escolhido dentre as sequências SEQ ID No 11 a 13, assim como seus derivados análogos, muteínas e homólogos.
9. Vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender, por um lado, pelo menos um ou dois com- postos peptídicos escolhidos dentre SEQ ID No 9 e 10, assim como seus derivados análogos, muteínas e homólogos; e, por outro lado, pelo menos um, dois ou três compostos peptídicos escolhidos dentre as sequências SEQ ID No 11 a 13, assim como seus derivados análo- gos, muteínas e homólogos.
10. Vacina, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de compreender, em combinação, cinco compostos peptídi- cos multiepitópicos, escolhidos dentre a SEQ ID No 9 a 13, e/ou seus derivados análogos, muteínas e homólogas.
11. Vacina, de acordo com uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de compreender, além disso, um adjuvante es- colhido dentre as classes TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, as saponinas, as emulsões óleo na água ou água no óleo, os po- lissacarídeos, os lipossomas catiônicos, os virossomas ou os po- lieletrólitos.
12. Vacina, de acordo com uma das reivindicações 7 a 11, caracterizada pelo fato de compreender, além disso, o composto pep- tídico E34P da seguinte SEQ ID No 14: E-D-E-H-K-G-Y-C-RL-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P- R- G-T-P-T-P-A-P, ciclizado por ponte de dis-sulfeto entre a cisteína em posição 9 e a cisteína em posição 15.
13. Vacina, de acordo com uma das reivindicações 7 a 12, caracterizada pelo fato de compreender, além disso, uma assinatura.
14. Sequências nucleotídicas, caracterizadas pelo fato de codificarem para o epitopo ou o composto peptídico, tal como definido em uma das reivindicações 1 a 4.
15. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compre- ender pelo menos uma sequência nucleotídica, tal como definida na reivindicação 14, assim como os meios necessários à respectiva ex- pressão.
16. Reagente de diagnóstico, caracterizado pelo fato de compreender um composto peptídico, como definido em uma das rei- vindicações 1 a 4.
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