PT2288619E - Péptido de síntese não nativo ciclizado e complexo de péptidos compreendendo o referido péptido ciclizado, destinado a induzir e caracterizar a prevenção ou o tratamento de estados em mamíferos - Google Patents

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DESCRIÇÃO "PÉPTIDO DE SÍNTESE NÃO NATIVO CICLIZADO E COMPLEXO DE PÉPTIDOS COMPREENDENDO O REFERIDO PÉPTIDO CICLIZADO, DESTINADO A INDUZIR E CARACTERIZAR A PREVENÇÃO OU O TRATAMENTO DE ESTADOS EM MAMÍFEROS" A presente invenção refere-se a um péptido de síntese não nativo ciclizado por ponte persulfureto e sua mistura com dois outros péptidos de síntese não nativos assim como com um adjuvante, para formar um complexo destinado a induzir e a caracterizar a prevenção ou o tratamento de estados nos mamíferos em que a imunidade protectora depende da estimulação de linfócitos do tipo Thl e, nomeadamente, de um estado de hiperestimulação do tipo retardado.

Este complexo é mais particularmente notável na medida em que permite induzir uma produção importante de anticorpos específicos do isotipo IgG2, permitindo, em caso de estados ligados a um estado de hiperestimulação do tipo retardado, de distinguir um animal ou humano infectado ou doente, de um animal ou humano não infectado ou não doente mas vacinado ou tratado.

Por fim, a presente invenção pode ser utilizada como reagente que induz uma estimulação dos linfócitos do tipo Thl, nomeadamente, para a prevenção ou o tratamento de estados ligados a um estado de hiperestimulação imediata e como reagentes de diagnóstico in vitro permitindo detectar os anticorpos marcadores de vacinação ou de tratamento, ou seja, os 1

IgG2 específicos do péptido ciclizado. Finalmente, a presente invenção refere-se, igualmente, ao papel neutralizante destes IgG2 caracterizados pela inibição da proliferação das formas promastigotas ou amastigotas de Leishmania. Várias situações patológicas são associadas a um estado imunitário do tipo Thl ou Th2.

Por exemplo, a exacerbação da via Th2 correspondente a um estado de hiperestimulação imediata induz certos estados como as dermites atópicas caninas, as alergias e a asma. A obtenção de uma cura para estes estados é efectuada por imunoestimulantes permitindo a passagem de um estado de Tipo Th2 a um estado imunitário do tipo Thl.

Por outro lado, este estado imunitário Thl está em correlação plena com um estado de resistência aos patogénios intracelulares, tais como Leishmania, Trypanosoma, Candida, Mycobacterium e Listeria.

No que se refere à imunopatologia da asma, a literatura ao longo da última década designou o linfócito T específico para o alergénio como o chefe da orguestra da reacção imunoalérgica (Magnan. A et ai. "Cytokines, from atopy to athsma: the Th2 dogma revisited" Cell Mol Biol, 2001, 47, 679-687) . Entre os linfócitos T, a subpopulação Th2 produtora de IL4 aparece em primeiro plano e como necessária à indução desta reacção. É deste modo natural gue as estratégicas sejam estabelecidas para atingir especificamente os linfócitos e, em particular, os Th2. 2

Este tipo de estratégia pode ser igualmente seguida para as leishmanioses.

As leishmanioses constituem um conjunto complexo de infecções parasitárias que irrompem em vastas regiões do globo (são atingidos 88 países, repartidos por 4 de 5 continentes) e que são responsáveis por um largo espectro de manifestações clínicas (cutânea, muco-cutânea e visceral, sendo esta a forma mais grave causando morte na ausência de tratamento). 350 milhões de pessoas estão expostas ao risco de as contrair; cerca de 12 milhões serão portadores do parasita e a incidência anual está estimada entre 2 e 2,5 milhões de novos casos, entre as quais 500000 pessoas com leishmaniose visceral. A leishmaniose visceral (LV) é causada pelos parasitas do complexo Leishmania donovani (L. infantum/chagasi e L. donovani) que, são parasitas intracelulares obrigatórios do macrófago. Contrariamente às outras espécies de Leishmania que causam as formas cutâneas da doença (L. major, L. brasiliensis...), as leishmanias do complexo donovani apresentam uma capacidade de se disseminar no conjunto dos órgãos profundos onde se multiplicam. Os doentes com LV apresentam, deste modo, um quadro clínico que associa uma febre moderada mas persistente, uma hepatoesplenomegalia e uma pancitopenia que conduz, geralmente, à morte se nenhum tratamento específico for iniciado suficientemente breve.

Os canídeos selvagens e os cães são os principais reservatórios de L. chagasi na América Central e do Sul, e de L. infantum na bacia do Mediterrâneo, estendendo-se a certas regiões do Meio Oriente e da Ásia. Nestas regiões fortemente 3 endémicas para a leishmaniose canina, a incidência da doença no homem é muito fraca.

Mesmo se a LV for um problema importante na Europa do Sul, com a extensão da pandemia da SIDA e o aparecimento de um número crescente de co-infecções Leishmania/HIV, ela está longe de estar controlada e torna-se muito preocupante em termos de problema de saúde pública. Em outras partes do mundo, nomeadamente nas zonas endémicas de L. donovani, esta é estimada em cerca de 1/5 da população do Sudão e na índia onde as epidemias mortais fizeram centenas de milhar de vítimas nestas últimas décadas. Além disso, a situação torna-se crítica na índia com a emergência de estirpes resistentes aos antimónios pentavalentes (medicamentos de primeira escolha). 0 controlo das leishmanioses passa, necessariamente, pela quimioterapia. Esta última é infelizmente comprometida por tratamentos longos, tóxicos e dispendiosos que acompanham vários casos de recaída e pela emergência dos fenómenos de quimiorresistência. Parece hoje em dia evidente que o controlo desta endemia parasitária dependerá da descoberta de novos meios de prevenção e de tratamentos abordáveis pelas populações em causa, sendo a vacinação o meio mais adaptado. 0 facto de poder induzir uma imunidade adquirida à re-infecção de um indivíduo que tinha estado voluntariamente infectado com os parasitas vivos mostrou rapidamente que a vacinação contra estas parasitoses seria possível, pelo menos para as formas cutâneas de leishmaniose. Estas práticas, também denominadas leishmanização, há muito tempo utilizadas no Médio-Oriente, no Irão e na Ex URSS, foram, por sua vez, abandonadas devido à sua perigosidade. 4

As vacinas candidatas propostas durante estas últimas décadas, distinguem-se cronologicamente as vacinas de primeira geração que utilizam os promastigotos vivos, mortos ou atenuados que no murganho produziram os resultados mais do que mitigados. Além disso, mais recentemente, o advento das técnicas de biologia molecular permitiu o desenvolvimento de vacinas de subunidades ou constituídas por proteínas recombinantes, como a GP63, a GP46, o Lipofosfoglicano (LPG), ..., principalmente recombinantes de proteínas principais expostas à superfície dos parasitas. Certas destas proteínas recombinantes conferiram um bom nível de protecção contra uma infecção experimental no murganho. Finalmente, existem as vacinas de terceira geração que apelam à genómica funcional e utilizam transgenes como microrganismos transfectados com o gene da GP63 e leishmanias recombinantes com virulência atenuada ou vacinas de ADN.

Em todos estes trabalhos três observações: - a vacinação contra as leishmanioses cutâneas foram o objecto de vários estudos comparativamente às relacionadas com a leishmaniose visceral. Contudo, os modelos de infecção experimental para a leishmaniose visceral são mais difíceis de pôr em prática (nomeadamente por causa da dificuldade de infectar experimentalmente roedores). - os resultados, por vezes extremamente interessantes, foram obtidos no murganho. Mas é difícil e perigoso de transpor directamente os resultados obtidos no murganho em modelos de infecção natural da leishmaniose (cão, homem). Os trabalhos de Dunan et al., realizados em 1989, são um exemplo muito demonstrativo. Estes autores tinham obtido uma muito boa protecção no murganho contra uma infecção de teste com 5 L. infantum utilizando uma fracção antigénica denominada LiF2. Esta mesma fracção, injectada nos cães, não somente não os protege, como, ainda mais grave, aumentam a sua susceptibilidade à infecção - poucos candidatos a vacina passaram o estádio experimental (murganhos, hamsters) por causa da dificuldade de pôr em prática ensaios clínicos longos, dispendiosos e fastidiosos.

Deste modo, quando não se trata de estudos sobre a leishmaniose cutânea, mas sim sobre a leishmaniose visceral, os principais trabalhos relativos à vacinação foram e, são ainda, realizados no murganho. Contudo, estes modelos de infecção experimental são não relevantes porque estão muito distantes dos hospedeiros naturais da infecção, ou seja, o cão e o homem, tendo os hospedeiros um impacto considerável em termos de saúde veterinária e humana. Além disso, como indicado anteriormente, estes trabalhos referem-se apenas a uma leishmaniose cutânea e, nomeadamente, L. major (principal modelo de infecção disponível no murganho) , para a qual os estudos não são transponíveis para a leishmaniose visceral.

Deste modo, a dificuldade em conseguir o objectivo da presente invenção é, por um lado, a condução de um estudo sobre a leishmaniose visceral; e por outro lado, a obtenção de resultados transponíveis com eficácia e inocuidade ao cão e ao homem.

Por ser utilizável num hospedeiro natural, uma vacina contra a leishmaniose deve satisfazer vários critérios gerais: 6 - possuir uma boa inocuidade (ausência de toxicidade local e geral do candidato a vacina, ausência de toxicidade ligada à resposta imunitária induzida). - conferir um excelente nível de protecção num hospedeiro natural da infecção. 0 conjunto dos trabalhos de pesquisa relacionados com a imunologia das leishmanioses estão em acordo ao dizerem que a polarização das respostas imunitárias para de uma via do tipo Thl é responsável pelo estado de protecção. - ter um custo baixo. As leishmanioses são doenças parasitárias ditas «negligenciadas» uma vez que atingem as populações dos países mais pobres. É assim importante proporcionar novos meios de prevenção acessíveis às populações em causa. - apresentar uma boa estabilidade para uma disseminação máxima da vacina nos países pobres onde principalmente, a leishmaniose causa danos - ter uma boa viabilidade industrial. Uma vacina sintética tem todas as vantagens industriais face à produção de uma vacina que necessite da cultura em massa dos parasitas.

Dois outros critérios de eligibilidade mais particulares devem também ser tidos em conta: - a capacidade que possui uma vacina para induzir as respostas imunitárias permitindo distinguir em zona de endemia um hospedeiro vacinado de um hospedeiro infectado. Com efeito, como para várias doenças parasitárias, o diagnóstico clínico é aleatório uma vez que os sintomas são pouco específicos, 7 frequentemente ausentes (existem vários portadores assintomáticos) e não aparecem verdadeiramente até uma fase muito avançada da infecção, que se torna, deste modo, extremamente difícil de tratar. 0 diagnóstico serológico que consiste em colocar em evidência anticorpos específicos

circulantes é praticado em rotina (técnica de imunofluorescência indirecta). Quando uma vacina é administrada, produz, em geral, anticorpos específicos, que muitas vezes podem também ser produtos de uma infecção . A presença destes anticorpos num hospedeiro pode, deste modo, ser confusa, no sentido em que a infecção e a vacinação possuem a mesma assinatura. - a vantagem de conferir uma imunoprotecção cruzada para as diferentes leishmanioses. 0 facto de atingir, como vacina, um ou antigénio(s) comum(s) a todas as espécies de leishmanias, devia, sem dúvida alguma, representar uma real vantagem em termos de vacinação cruzada. A presente invenção responde, notavelmente e vantajosamente, ao conjunto destas condições.

Recentemente, foi proposto um candidato a vacina composto por antigénios de excreção secreção (AES) de promastigotos de L. infantum formulado com o Muramildipéptido (Patente FR 2825633). Um ensaio de vacinação no cão permitiu estabelecer um modelo de estudo imunitário in vivo para Leishmania infantum no cão, hospedeiro reservatório natural da leishmaniose visceral. Este é, de facto, naturalmente receptivo ao ciclo L. infantum/chagasi e representa uma fonte potencial de parasitas transmissíveis ao homem. Os estudos de inocuidade no cão (fase I) mostraram uma muito boa tolerância local e geral do 8 candidato a vacina. Nenhuma toxicidade ligada à resposta imunitária induzida foi revelada durante os diferentes protocolos de inocuidade. A avaliação da sua eficácia mostrou que esta conferia 100% de protecção à infecção de teste (fase II, Lemesre et ai., Vaccine 23, 2005, 2825-2842) e, facto notável, protegia os cães sujeitos à infecção natural de duas temporadas de transmissão na zona de endemia (estudo contendo 414 cães recrutados por 18 clinicas veterinárias) com uma percentagem de eficácia próxima de 90% (fase III, Lemesre et ai., Vaccine 25, 2007, 4223-4234). A vacinação pelas AES controla não somente o desenvolvimento da doença mas também diminui significativamente a carga parasitária no cão e contribua ainda para a interrupção da transmissão das leishmanias. 0 conjunto dos resultados confirma, deste modo, solidamente, o facto de que o candidato a vacina (combinação dos AES de promastigotos de L. infantum com o adjuvante MDP) protege o cão da leishmaniose visceral a L. infantum na medida em que induz de forma durável uma polarização da resposta à mediação celular para um perfil do tipo Thl, conduzindo à produção de IFN-g, capaz de activar o macrófago e induzir a produção do monóxido de azoto (NO) provocando a morte dos amastigotos intracelulares por apoptose (Patentes FR 2825633 e WO 2004011500).

Paralelamente aos ensaios imunoprofiláticos, os ensaios imunoterapêuticos produziram resultados prometedores (patente W02004011500). Os cães vacinados induziram uma resposta especifica e durável para o anticorpo do isotipo IgG2, de titulo fraco e principalmente dirigida contra um imunogénio principal 9 de 54 kDa, comparativamente com o grupo do placebo. 0 imunogénio principal dos AES foi identificado por engenharia genética como pertencendo à família dos «antigénios de superfície de promastigotos» também denominado PSA.

Estes últimos são caracterizados pela presença de um motivo repetido rico em leucina (Repetição Rica em Leucina, LRR) e de uma parte carboxiterminal rica em resíduos serina/treonina.

Conhece-se o documento Lohman/Mc Mahon Pratt (1990) PNAS 87: 8393-8397, que se reporta à clonagem e à sequenciação do gene que codifica a proteína nativa GP46/M2 da forma promastigota de Leishmania amazonensis e reforça a sua implicação na imunização contra as leishmanioses, nomeadamente, de forma cutânea, nos modelos experimentais de murinos.

Este documento observa que a proteína nativa GP46 conserva uma conformação no espaço terciário ou quaternário e é imunoprotectora no murganho num modelo cutâneo de leishmaniose. Esta observação conduz naturalmente o investigador a pensar que esta conformação particular está implicada no carácter imunodominante da proteína. A investigação também foi realizada neste sentido, seguindo o documento oficial: Sjõlander et al., (1998) PH: S0264-410X/98. Este estudo permitiu observar que a proteína GP46, produzida sob a forma recombinante num sistema bacteriano (E. coli) , sistema que não tem em conta as estruturas, já não é protectora e perde a sua eficácia. O que, com toda a lógica, leva a pensar que a conformação no espaço, secundária, terciária ou quaternária da proteína GP46, é importante na eficácia protectora da referida proteína. 10

Ora, ao encontro destas publicações; a requerente do presente pedido continuou os seus trabalhos sobre péptidos de síntese, que pelo seu tamanho e seu método de preparação só podem apresentar vantagens. 0 interesse destes péptidos é, bem evidentemente, múltiplo: evita os problemas ligados ao isolamento de sequências peptidicas, o que reduz o custo e o tempo de pôr em prática esta operação, deste modo, aumentando, a produtividade com um ganho financeiro evidente, permitindo controlar os riscos de infecção. Estes péptidos respondem de forma notável ao conjunto das condições citadas anteriormente: vacina estável a baixo preço e eficácia, adaptada aos países pobres onde, principalmente, a leishmaniose causa danos. Ainda que a PSA (PSA-2) tenha sido inicialmente identificada nas formas promastigotas, diferentes estudos parecem indicar que esta está presente também na forma amastigota. Além disso, foi recentemente demonstrado que esta PSA era mesmo excretada secretada pelos dois principais estádios parasitários e apresentava propriedades imunológicas notáveis no mesmo sentido quando os cães imunizados com os AES de promastigotos de L.infantum eram capazes de induzir uma resposta de anticorpos específicos do isotipo IgG2 especificamente dirigida contra a PSA excretada secretada (patente W02004011200) .

Na Leishmania, nenhum papel biológico funcional lhe foi atribuído enquanto que em outros patogénios, como as bactérias, as proteínas LRR, tais como InlB, Yop e Ssph, são implicadas na virulência e patogenicidade destes organismos (Marino et al., 2000. PNAS. 97(16):8784-8788). 11

Facto notável, nas plantas, estas intervêm na resistência a diferentes patogénios. Muito recentemente, os estudos sobre a implicação da PSA (Antigénio de Superfície de Promastigotos) das leishmanias ao nível da adesão celular (Kedzierski et al., 2004, J Immunol., 172: 4902-6), da resistência dos parasitas à lise pelo complemento (Lincoln et al., Mol Biochem Parasitol. 2004, 137:185-9) e a sua expressão diferencial durante o ciclo de vida das leishmanias (Handman et al., 1995, Inf. Inunun., 63:189-200) tenderam a mostrar que a PSA constitui um componente vital e essencial ao desenvolvimento das leishmanias. A PSA-2 nativa de L. amazonensis confere ao murganho um bom nível de protecção contra uma infecção experimental com L. major induzindo uma imunidade protectora de mediação celular do tipo Thl (Handman et al., 1995. Infect. Immun. 63:4261-4267). Pelo contrário, uma proteína PSA recombinante produzida num sistema de expressão bacteriano não confere esta protecção, deixando sugerir que as modificações pós-tradução da proteína constituem uma etapa indispensável à sua actividade protectora (MacMahon Pratt, 1996).

Mais recentemente, a utilização de um par de péptidos (sob a forma de lipopéptidos) de 16 aminoácidos conferem, cada um, no cão, contra uma infecção de teste, uma imunoprotecção semelhante à desenvolvida aquando da imunização com os AES. Os cães assim vacinados apresentam uma resposta por mediação celular contra a Leishmania infantum (patente FR N° 01/11942).

Pelo contrário, esta vacina peptídica formada por 2 péptidos é incapaz de produzir uma resposta de anticorpos específicos IgG2 importante, permitindo distinguir numa zona de endemia um hospedeiro vacinado de um hospedeiro não vacinado mas 12 infectado. Foram propostas outras soluções para o problema da imunização contra a leishmania nos documentos WO 200605823 e WO 03025012. A presente invenção permite responder vantajosamente a este inconveniente principal, nomeadamente, graças a um péptido de síntese não nativo ciclizado por ponte persulfureto.

Este péptido pode ser utilizado em vacinação isolado ou em associação com outros péptidos.

Contudo, de acordo com um modo preferido de realização da invenção, é utilizado em associação com os dois péptidos de síntese não nativos descritos na patente FR 2839767 e com um adjuvante que induz, de um modo preferido, uma resposta de mediação celular, que se obtém dos resultados óptimos em vacinação. Os resultados dos testes conduzidos em vacinação serão expostos posteriormente.

Esta mistura de três péptidos e de um adjuvante forma um complexo inventivo que permite responder com uma grande eficácia aos inconvenientes e insuficiências dos modelos propostos anteriormente.

Note-se que a forma ciclizada do referido péptido é primordial na eficácia do complexo de acordo com a invenção. Os estudos produzidos pela requerente pode, com efeito, estabelecer que a forma não ciclizada deste péptido não induz senão uma estimulação Thl muito parcial e apresenta uma eficácia globalmente insuficiente, quer o péptido seja utilizado isolado ou em associação com outros péptidos. A requerente conduziu, deste modo, estudos de modo a tentar suplementar esta 13 insuficiência e verificou também que a forma ciclizada, a seguir descrita, do referido péptido adquiria a vantagem requisitada.

De acordo com a invenção, o péptido ciclizado por ponte persulfureto é composto por uma sequência de 34 aminoácidos e designados: E34P.

Este péptido de 34 aminoácidos (E34P) é composto pela sequência seguinte (SEQ ID N°l): E-D-E-H-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R-G-T-

P-T-P-A-P

Este péptido é ciclizado por ponte persulfureto entre a cisteina na posição 9 e a cisteina na posição 15. 0 péptido E34P é, vantajosamente, capaz de induzir uma resposta de anticorpos importante permitindo discriminar numa zona de endemia um hospedeiro vacinado de um hospedeiro não vacinado mas infectado. Esta ciclização do péptido é essencial para o aparecimento de anticorpos específicos IgG2, a ciclização na ponte persulfureto entre as cisteínas 9 e 15, que induz uma conformação específica responsável por esta síntese de IgG2. Com efeito, a não ciclização do péptido em Cys 9/Cys 15 induz apenas uma síntese pouco importante em IgG2, por vezes difícil de detectar.

De acordo com a forma de realização preferida da invenção, o péptido E34P, de acordo com a invenção, é misturado a um segundo e terceiro péptidos de síntese não nativos, cada um composto por uma sequência de 16 aminoácidos respectivamente designados: A16E e A16G, ou de seus derivados, assim como um 14 adjuvante.

Entende-se por «derivados das sequências A16E ou A16G», o conjunto dos análogos estruturais de aminoácidos constituintes das referidas sequências, conhecidas e consideradas como tal pelo especialista da técnica. 0 péptido de 16 aminoácidos A16E é composto pela sequência seguinte (SEQ ID N°2) : A-A-R-C-A-R-C-R-E-G-Y-S-L-T-D-E no qual C pode ser substituído por S e L por I. 0 péptido de 16 aminoácidos A16G é composto da sequência seguinte (SEQ ID N°3): A-A-S-S-T-P-S-P-G-S-G-C-E-V-D-G No qual C pode ser substituído por S e L por I.

Estes dois últimos péptidos são capazes de induzir uma estimulação dos linfócitos T do tipo Thl que asseguram a protecção contra a leishmaniose visceral.

Associado a um adjuvante, que induz, de um modo preferido, uma resposta à mediação celular, um tal tripleto de péptidos apresenta todas as vantagens citadas anteriormente (sem cultura, protecção num hospedeiro natural de uma infecção, marcador de vacinação, imunidade cruzada, abordáveis nas populações em causa...). 0 conjunto de péptidos E34P, A16E, A16G e o adjuvante forma o complexo de péptidos de acordo com a invenção. 15 0 adjuvante associado a estas sequências peptidicas é de um modo preferido, QA21, saponina, quil-A, ou qualquer outro derivado destes conhecido do especialista da técnica, tal como o QS21.

De um modo preferido, as sequências peptidicas E34P, A16E e A16G são associadas numa razão E34P/A16E/A16G: 10/25/25. O complexo peptídico, de acordo com a invenção, induz vantajosamente uma produção importante de anticorpos do isotipo IgG2 específicos para o péptido E34P, o que permite de forma notável distinguir os indivíduos vacinados os indivíduos infectados não vacinados. A presente invenção é por vezes relacionados com a utilização de três sequências peptidicas E34P, A16E e A16G como reagentes, que induzem uma estimulação dos linfócitos T do tipo Thl, nomeadamente, para a prevenção e o tratamento de estados ligados a um estado de hiperestimulação imediata e como reagentes de diagnóstico in vitro permitindo detectar os anticorpos marcadores de vacinação, ou seja, os IgG2 específicos dos fragmentos peptídicos. A presente invenção corresponde a uma vacina sintética de 2 a geração para o cão (a Ia geração de vacina canina corresponde ao desenvolvimento do sistema alternativo de antigénios de excreção secreção AES de promastigotos de Leishmania infantum, citado anteriormente) adaptável a uma fórmula de vacinação humana.

As sequências peptidicas de acordo com a invenção E34P, A16E e A16G podem ser tornadas imunogénicas por ligações aos portadores ou qualquer outro derivado (grandes moléculas tipo KLH, lipopéptidos tipo palmitoílo ou derivados) e são 16 administradas aos candidatos na presença de um adjuvante e, de um modo preferido, o QA21. De um modo preferido, a razão péptidos/adjuvante está compreendida entre 3/1 e 3/3.

No caso de uma infecção por leishmanias, os estudos efectuados no cão permitiram determinar a dose vacinai óptima de 20 pg de QA21 para 60 pg de péptidos injectados. Observa-se, contudo, um inicio de resposta a partir de 55 pg de péptidos injectados. O mecanismo de acção do complexo peptídico obtido de acordo com a invenção é verificado com o auxilio de métodos específicos que demonstram que o complexo peptídico é inovador seja pela imunoestimulação do sistema linfocitário do tipo Thl com produção de IgG2, seja pela imunomodulação de um tipo Th2 para um tipo Thl. Por outro lado, o papel neutralizante dos IgG2 específicos é caracterizado pela inibição da proliferação das formas amastigotos ou promastigotos de Leishmania.

Este estudo do estado imunitário do tipo Thl é efectuado em cães após vacinação e igualmente sobre os cães leishmanianos após tratamento com este complexo peptídico. Método de teste infeccioso: O teste infeccioso consiste na injecção intravenosa de 108 promastigotos em fase metacíclica tratados com complemento de cão saudável e de 5.108 macrófagos peritoneais de cão saudável, infectados in vitro por amastigotos. 17

Os promastigotos e os macrófagos infectados são diluídos num soro fisiológico estéril para um volume final de 1,5 mL. Esta mistura é efectuada mesmo antes da injecção.

Um exame parasitológico é efectuado a partir de uma amostra recolhida directamente no cão.

Um esfregaço a partir da punção de medula óssea é efectuado em lâmina. Este esfregaço, uma vez fixado com metanol, é corado com May Griimwald. Giemsa e observado ao microscópio com imersão (x 1000) .

As colheitas de medula óssea são colocadas em cultura no meio de cultura bifásica NNN (Novy e Mac Neal, 1904, 4. Infec.

Dis., 1: 1-30) em que o RPMI 1640 contendo de 20% do soro de bovino fetal não complementado constitui a fase líquida. As repicagens cegas são realizadas todos os quatro a seis dias. As culturas são regularmente observadas em microscopia fotónica (x 400) durante 20 mn.

As parasitémias são quantificadas como se segue: +/-: formas alongadas-refringentes imóveis +: 1 a 5 formas de promastigotos móveis/campos ++: >5 formas de promastigotos móveis/campos +++: cultura até à confluência 18

Colocação em evidência de uma imunidade com mediaçao celular do tipo Thl.

Esta colocaçao em evidência efectua-se de acordo com duas técnicas: - Titulação da actividade leishmanicida dos monócitos de acordo com o método descrito anteriormente (Patente FR 2825633); - Detecção dos IgG2 de cães, específicos para o péptido ciclizado E34P e da parte carboxiterminal da PSA.

Esta detecção efectua-se pelo método de ELISA de acordo com a técnica de microtitulação de Kweider et al., (J. Immunol, 1987, 138, 299) utilizando um conjugado anti IgG2. Para este método, o péptido é biotinilado antes do revestimento em microplacas. Esta ligação com moléculas grandes do tipo biotina tem, nomeadamente, por efeito, proporcionar o péptido ciclizado E34P mais antigénico. Utilizou-se igualmente como antigénio a proteína recombinante que codifica para a parte carboxiterminal da PSA.

Paralelamente a este estudo do estado Tipo Thl, uma monitorização serológica por imunofluorescência clássica utilizando lâminas revestidas por promastigotos (método de referência serológica para a leishmaniose canina) é efectuada.

A detecção dos anticorpos do isotipo IgG2 específicos para o péptido ciclizado E34P e para a parte carboxiterminal da PSA permite, nomeadamente, seguir a resposta imunitária nos mamíferos vacinados ou tratados e, deste modo, diferenciar os mamíferos infectados ou doentes, os mamíferos não infectados ou 19 não doentes mas vacinados ou tratados, e seguir a eficácia de uma vacinação ou de um tratamento quimioterapêutico e/ou imunoterapêutico. 0 péptido ciclizado E34P ou o complexo de péptidos de síntese de acordo com a invenção pode ser utilizado para o fabrico de um medicamento, de uma vacina ou de um reagente de diagnóstico in vitro e in vivo, para a indução da produção de anticorpos específicos do isotipo IgG2 específico para o péptido ciclizado E34P, permitindo distinguir um mamífero infectado ou doente, de um mamífero não infectado ou não doente mas vacinado ou tratado, e para a indução ou o diagnóstico nos mamíferos de anticorpos específicos e, mais particularmente, do isotipo IgG2, religados com um estado imunitário de tipo Thl. 0 péptido ciclizado E34P ou o complexo de péptidos de síntese de acordo com a invenção pode ser condicionado sob uma forma tal que pode ser administrado por diferentes vias: subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, parentérica e oral.

Pode, igualmente, ser utilizado como produto de diagnóstico in vitro e ser incluído num kit de diagnóstico. Numa tal hipótese, o produto de diagnóstico in vitro é caracterizado por conter o péptido ciclizado E34P ou o complexo de péptidos de acordo com a invenção, para a detecção de uma resposta humoral e particularmente de IgG2, permitindo, nomeadamente, colocar em evidência um estado imunitário do tipo Thl e um estado de hiperestimulação retardado, a monitorização da resposta imunitária nos mamíferos vacinados ou não vacinados mas tratados e a monitorização da eficácia de uma vacinação ou de um tratamento quimioterapêutico e/ou imunoterapêutico. 20 0 carácter inovador do complexo peptídico de acordo com a invenção não reside somente na indução de uma resposta celular do tipo Thl, mas, igualmente, na produção de tais anticorpos do tipo IgG2. Estes IgG2 são detectáveis por diversos métodos in vitro, por exemplo, ELISA, TRANSFERÊNCIA DE MANCHA, TRANSFERÊNCIA DE WESTERN, IMUNOCROMATOGRAFIA, LÁTEX, FLUORÓFOROS e qualquer outro método in vitro fazendo intervir um sistema de conjugado ou outros sistemas de visualização Ag-Ac.

Num kit de diagnóstico, os péptidos E34P, A16E ou A16G podem ser ligados a um suporte sólido e, por exemplo, a membranas de nitrocelulose ou outros polímeros, suportes de látex e diversos materiais de plástico (polímero).

Colocaçao em evidência do papel neutralizante dos IgG2 específicos:

Inibição do crescimento de promastigotos e de amastigotos na presença de IgG2 (patente WO 2004011500) O péptido de síntese não nativo ciclizado E34P induz imunoglobulinas de classe IgG2 capazes de neutralizar a proliferação de amastigotos e promastigotos de Leishmania sp in vitro. RESULTADOS EM IMUNOTERAPIA:

De acordo com os especialistas como PINELLI (PINELLI, E et al., Infect Immun, 1994, 62.229-235) os cães leishmanianos correspondentes à activação do sistema linfocitário do tipo Th2 21 apresentam uma resposta em anticorpos elevada.

Esta produção aumentada em anticorpos corresponde à hiperproteinémia e induz o aparecimento de complexos imunitários resultando numa causa renal (aumento da creatinina e da ureia sanguíneas).

Ensaiou-se, deste modo, a modulação de um estado Thl administrando aos cães perfeitamente leishmanianos por via intradérmica de doses do composto peptídico. A monitorização do estado imunitário assim como a observação clínica são efectuadas antes e depois do tratamento.

Exemplo 1: cao SÉNIOR

Um cão de raça Braque de Weymar com a idade de 6 anos, pertencente a Mr G apresenta várias lesões cutâneas acompanhadas de um estado de fatiga geral e um aspecto magro, tudo evocando uma leishmaniose canina. 0 veterinário, o Dr GH diagnosticou uma leishmaniose. Este diagnóstico é confirmado por uma observação directa ao microscópio de leishmanias a partir de uma camada de pele e uma análise serológica que dá um título em imunofluorescência de leishmaniose positiva de 1/1600. A análise do estado imunitário antes de qualquer injecção permite afirmar que o cão está completamente num estado imunitário do tipo Th2 com um título em anticorpos elevado assim como um teste leishmanicida negativo. Instaurou-se uma imunoterapia que consiste em efectuar por via intradérmica 22 3 injecções de 60 yg de péptidos (25 yg de A16E, 25 yg de A16G, 10 yg de E34P) e 20 yg de QA21, sendo cada injecção espaçada de 3 semanas.

Uma semana após uma terceira injecção, o cão SÉNIOR recuperou o apetite e uma certa vitalidade. O Dr GH começa a observar uma ligeira melhoria cutânea.

Um mês após a última injecção, SÉNIOR recuperou um aspecto clinico normal com, nomeadamente, uma aumento de peso de 1 kg e um desaparecimento de 70% de todas as lesões cutâneas. A análise do estado imunitário permite afirmar uma baixa no titulo em anticorpos anti-leishmania que desce para 1/400 em imunofluorescência. Paralelamente, o efeito leishmanicida é positivado. Além disso, após tratamento, o cão SÉNIOR apresenta IgG2 específicos para o péptido ciclizado E34P e para a parte carboxiterminal da PSA, doseados pelo método ELISA. Estes IgG2 específicos estavam ausentes antes de todo o tratamento.

Uma pesquisa de parasitas por cultura em meio NNN revelou-se negativo. 8 meses após o tratamento o cão SÉNIOR não apresenta nenhuma modificação. As análises biológicas permitem afirmar que o SÉNIOR está sempre no estado imunitário Thl.

Exemplo 2: Cao THEO

Um cão macho de raça Epagneul breton, THEO com 5 anos de idade, pertencente a Mr K, apresenta os sinais clínicos específicos da leishmaniose. De acordo com o Dr DM, a presença de várias escamas brilhantes, depilação peri-ocular direita, lesões ulcerosas ao nível do cotovelo posterior direito e um 23 estado de fatiga pronunciado, com nomeadamente, um parecer de cão idoso. As análises biológicas com, nomeadamente, uma serologia leishmaniose positiva de 1/800 em imunofluorescência confirmam o diagnóstico clinico. É instaurada uma imunoterapia consistindo em efectuar por via intradérmica 3 injecções de 60 pg de composto vacinai peptidico (25 pg de A16E, 25 pg de A16G, 10 pg de E34P) e 20 pg de QA21, sendo cada injecção espaçada de 3 semanas. A análise do estado imunitário antes de qualquer injecção demonstra que o cão THEO desenvolveu um sistema imunitário do tipo Th2 com uma parasitologia fortemente positiva a partir da medula óssea.

Um mês após a última injecção, os sinais clínicos leishmanianos de THEO retrocederam com, nomeadamente, uma cicatrização das lesões ulcerosas, um desaparecimento importante das escamas, assim como uma depilação peri-ocular quase inexistente. A serologia apresenta uma baixa na imunofluorescência a 1/400. Pelo contrário, a análise da resposta celular permite afirmar que THEO apresenta um estado Thl activo com um efeito leishmanicida muito importante.

Paralelamente, a parasitologia foi negativada (cultura da medula óssea no meio NNN).

Ao nível humoral, o cão THEO apresenta IgG2 específicos para o péptido ciclizado E34P e para a parte carboxiterminal da PSA após o tratamento, IgG2 doseados em ELISA. A presente invenção consiste, deste modo, num composto peptidico terapêutico que induz a passagem de um estado imunitário do tipo Th2 com produção importante de anticorpos que exacerba as manifestações clínicas para um estado imunitário do tipo Thl resultando numa cura e acompanhada de IgG2 específicos, nomeadamente, do péptido ciclizado E34P. RESULTADOS EM VACINAÇÃO DO COMPLEXO PEPTÍDICO: 0 complexo de péptidos é testado em 14 cães repartidos em 7 grupos, perfeitamente sãos, que apresentam uma serologia leishmaniose negativa, uma parasitologia negativa, uma ausência de resposta celular à Leishmania e uma ausência de IgG2 específicos para o péptido E34P ciclizado. No estabelecimento dos grupos de cães, está previsto, nomeadamente, comparar o complexo peptídico com o péptido E34P ciclizado do complexo peptídico com o complexo E34 NÃO ciclizado e comparar o péptido E34P ciclizado isolado com o péptido E34P não ciclizado isolado.

Os 14 cães viveram no Norte de França (Auxerre) , zona não endémica, e foram retornados para o Sudeste da França, quatro semanas antes da vacinação em período de inverno (período que não apresenta vectores flebótomos com leishmania). De entre os 7 grupos, 2 grupos de cães receberão o péptido E34P (1 grupo com E34P ciclizado e 1 grupo com E34P NÃO ciclizado) , 3 grupos de cães receberão a mistura peptídica (A16E, A16G e E34P ciclizado) com, nomeadamente, 3 concentrações diferentes do péptido E34P ciclizado. Um outro grupo de cães receberá a mistura peptídica (A16E, A16G e E34P NÃO ciclizado). 25 - grupo testemunha (placebos) Cão N° 1: Testemunha negativa: macho beagle de 3 anos Cão N°8: Testemunha negativa: macho beagle de 3 anos - grupo A: cães vacinados com os 3 péptidos e 1 adjuvante com as concentrações seguintes: A16E: 25 pg A16G: 25 pg E34P ciclizado: 25 pg Adjuvante QA21: 20 pg Cão N° 2: beagle fêmea de 8 anos Cão N° 7: beagle fêmea de 7 anos - grupo B: cães vacinados com os 3 péptidos e 1 adjuvante com as concentrações seguintes: A16E: 25 pg A16G: 25 pg E34P ciclizado: 10 pg adjuvante QA21: 20 pg Cão N° 3: beagle fêmea de 7 anos Cão N° 6: beagle fêmea de 7 anos - grupo C: caes vacinados com os 3 péptidos e 1 adjuvante com as concentrações seguintes: 26 Α16Ε: 25 yg A16G: 25yg E34P ciclizado: yg adjuvante QA21: 20 yg Cão N° 4: beagle fêmea de 9 anos Cão N° 5: beagle fêmea de 9 anos - grupo D: caes vacinados com os 3 péptidos e 1 adjuvante com as concentrações seguintes: A16E: 25yg A16G: 25yg E34P não ciclizado em ponte persulfureto: lOyg Adjuvante QA21: 20 yg Cão N° 9 Cão N°10 - grupo E: caes vacinados com 1 péptido E34P ciclizado e 1 adjuvante com as concentrações seguintes: E34P ciclizado: 10 yg Adjuvante QA21: 20 yg Cão N°11 Cão N°12 27 - grupo F: cães vacinados com 1 péptido E34P NÃO ciclizado e 1 adjuvante com as concentrações seguintes: E34P nao ciclizado: 10 pg Adjuvante QA21: 20 pg Cão N°13 Cão N°14 O esguema de injecçao vacinai é o seguinte (sem. = semana): J0 J30 J60 J100 1a injecção 4 sem. 2a injecção 4 sem. -> 3a injecção 7 sem. teste infeccioso intra-dérmica intra-dérmica intra-dérmica

Uma monitorização clinica dos 14 caes é efectuada de 2 em 2 semanas.

As análises biológicas são efectuadas: — antes de gualguer injecção — 1 mês após a 3a injecção.

As análises biológicas consistem em: — serologia IgG2 específicos para o péptido ciclizado E34P e para a parte carboxiterminal da PSA; — serologia leishmaniose: imunofluorescência guantitativa dos IgG totais (sinal de infecção); 28 - actividade leishmanicida dos monócitos (resposta à mediação celular).

Falta adicionar a estas análises, a pesquisa da Leishmania pela observação directa ao microscópio e cultura em meio NNN a partir de medula óssea após teste infeccioso.

Esta pesquisa de Leishmania efectua-se 4 meses após o teste infeccioso.

Nenhuma manifestação clinica importante apareceu durante todo este estudo.

Antes de qualquer invenção, os 14 cães apresentam seroloqias IgG totais e parasitologias negativas. 0 papel dos IgG2 na viabilidade e o crescimento de promastigotos e de amastigotos de Leishmania é analisada com os imunossoros de cães vacinados com a mistura que contém o péptido E34P ciclizado e os soros de cães placebo. 29

Tabela I

Estado imunitário de cães após a vacinaçao

Legenda: -ELISA IgG2: Exclusão Exclusão 0,110 para a PSA Cter 0,290 para o péptido E34P ciclizado (em Densidade Óptica) \ Parâmetros \ biológicos Cães \ Serologia ELISA IgG2 versus PSA Cter Serologia ELISA IgG2 Versus E34P ciclizado Resposta celular, Actividade leishmanicida dos monócitos IgG totais por IFAT Antes da vacinação 1 mês após a 3a injecção Antes da vacinação 1 mês após a 3a injecção Antes da vacinação 1 mês após a 3a injecção Antes da vacinação 1 mês após a 3a injecção Grupo 1 0,049 0, 088 0, 185 0, 113 <0% 19, 9% - - placebo 8 0,062 0,072 0, 120 0,170 <0% 10% - - Grupo A 2 0,052 0, 062 0, 128 0,350 <10% 71,5% - - 7 0,067 0,350 0, 171 1, 949 <0% 76, 6% - - Grupo B 3 0, 049 0,275 0,220 0, 938 <10% 81,4% - - 6 0, 044 0,595 0, 182 1,125 <0% 91,5% - - Grupo C 4 0, 056 0,069 0,186 0,269 <0% 70,3% - - 5 0, 058 0, 059 0, 118 0,444 <0% 82,2% - - Grupo D 9 0, 040 0,100 0, 110 0,224 <0% 84,5% - - 10 0, 038 0, 150 0, 192 0,287 <0% 90,1% - - Grupo E 11 0, 031 0, 080 0, 162 0,250 <0% 30,5% - - 12 0,058 0, 065 0,175 0,399 <0% 52,7% - - Grupo F 13 0, 041 0,073 0, 182 0, 125 <0% 31% - - 14 0, 045 0, 058 0, 129 0,170 <0% 28, 7% - - - Actividade leishmanicida dos monócitos: expressa em percentagem de inibição do índice parasitário (Patente FR 01/07606): Exclusão = 40% - IgG totais indirecta) IFAT Exclusão > 1/100 (imunofluorescência 30

Caixas sombreadas = resultados positivos Números sublinhados = resultados ligeiramente positivos

De acordo com a Tabela I, o complexo com 3 péptidos com, nomeadamente, 10 pg do péptido ciclizado E34P (grupo B: cães 3 e 6) induz bem uma imunidade celular do tipo Thl com indução de anticorpos do isotipo IgG2 específicos. O péptido ciclizado E34P isolado não induz mais do que uma resposta parcial. 0 péptido E34P NÃO ciclizado é menos eficaz do que ο E34P ciclizado.

Tabela II

Serologia IgG totais e parasitémias efectuadas, 4 meses após o teste infeccioso Cães Serologia IgG Totais (IF quantitativos) Parasitologia (sobre punções da medula) Exame directo Cultura em meio NNN Grupo Placebo 1 1/100 - + + 8 1/100 + + + Grupo A 2 - - - 7 - - - Grupo B 3 - - - 6 - - - Grupo C 4 - - - 5 - - - Grupo D 9 1/100 - + /- 10 - - - Grupo E 11 1/200 - + /- 12 - - - Grupo F 13 1/100 + + 14 1/100 - + /-

Legenda: IF = Imunofluorescência (considerada positiva se o titulo é > 1/100)

Parasitologia = cultura no meio NNN - = ausência +/- = raras formas alongadas refringentes imóveis + = 1 a 5 formas de promastigotos móveis/campo ++ = mais de 5 formas de promastigotos móveis/campo +++ = cultura até confluência 31

De acordo com a tabela II, o complexo dos 3 péptidos com o péptido ciclizado E34P e o adjuvante induz bem um estado imunitário do tipo Thl protector: ausência de parasitas é de IgG totais quatro meses após o teste infeccioso, nomeadamente, para os cães 3 e 6 do grupo B (cães imunizados com 10 pg de E34P, 25 pg de A16E e 25 pG de A16G).

Por outro lado, o péptido isolado E34P ciclizado não é suficiente para induzir uma resposta eficaz, por outro lado, os resultados da tabela II correlacionam-se com os da tabela I no que se refere à diferença dos péptidos E34P e E34P NÃO ciclizado: uma estrutura ciclizada do péptido E34P parece essencial.

Tabela III

Percentagens de inibição do crescimento parasitário para os soros de cães placebo e vacinados (diluição V4) estabelecidas ao 5a dia de cultura

Os resultados obtidos mostram que a resposta IgG2 anti-vacina dos cães vacinados com uma formulação de 3 péptidos com o péptido ciclizado E34P não só acompanha a imunidade protectora mas exerce também uma actividade anti-parasitária. 32 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ORIDAN INC. <120> Péptido de síntese não nativo ciclizado e complexo de péptidos compreendendo o referido péptido ciclizado <130> BI18 12PCT 06 <150> FR 08/03436 <151> 2008-06-19 <16 0> 3 <17 0> Patentln, versão <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Leishmania sp. <40 0> 1

Glu Asp Glu Hi s Lys Gly Lys Tyr Cys Arg Leu Gly Asn Asp Cys Arg 1 5 10 15 Thr Thr Glu Pro Thr Thr Thr Ala Thr pro Arg Gly Thr Pro Thr Pro 20 25 30 Ala Pro <210> 2 <211> 16 <212> <213> PRT Leishmania sp. 33 < 4 Ο Ο > 2

Ala Ala Arg Cys Ala Arg cys Arg Glu Gly Tyr ser Leu Thr Asp Glu 15 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> leishmania sp. <400> 3

Ala Ala Ser ser Thr Pro ser Pro Gly ser Gly cys Glu vai Asp Gly 15 10 15

Lisboa, 19 de Junho de 2012 34

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Péptido de síntese não nativo ciclizado destinado a induzir uma produção importante de anticorpos específicos do isotipo IgG2 permitindo distinguir em casos de estados ligados a um estado de hiperestimulação do tipo retardado, um animal ou humano infectado ou doente, de um animal ou humano não infectado ou não doente mas vacinado ou tratado, caracterizado pela sequência de aminoácidos (E34P) seguinte (SEQ ID N°l): E-D-E-H-K-G-K-Y-C-R-L-G-N-D-C-R-T-T-E-P-T-T-T-A-T-P-R- G-T-P-T-P-A-P sendo a referida sequência ciclizada por ponte persulfureto entre a cisteína na posição 9 e a cisteína na posição 15
2. 2. Complexo de péptidos de síntese não nativos destinado a induzir e a caracterizar a prevenção e/ou o tratamento de estados nos mamíferos em que a imunidade protectora depende da estimulação de linfócitos do tipo Thl e, nomeadamente, de um estado de hiperestimulação do tipo retardado, caracterizado por conter: a sequência ciclizada (E34P) de acordo com a reivindicação 1. - e a sequência (A16E) de 16 aminoácidos seguinte (SEQ ID N° 2) ou derivados (análogos estruturais) desta: A-A-R-C-A-R-C-R-E-G-Y-S-L-T-D-E 1 na qual C pode ser substituído por S e L por I. - e a sequência (A16G) de 16 aminoácidos seguinte (SEQ ID N°3) ou derivados (análogos estruturais) desta: A-A-S-S-T-P-S-P-G-S-G-C-E-V-D-G na qual C pode ser substituído por S e L por I. - e um adjuvante que induz, de um modo preferido, uma resposta à mediação celular.
3. 3. Complexo de péptidos de síntese de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o adjuvante ser QA21, saponina, quil-A, ou qualquer outro derivado deste conhecido do especialista da técnica, tal como o QS21.
4. 4. Complexo de péptidos de síntese de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por as sequências peptídicas E34P, A16E e A16G estarem associadas numa razão E34P/A16E/A16G: 10/25/25.
5. 5. Utilização do péptido E34P de acordo com a reivindicação 1 ou complexo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4 para a preparação de um medicamento, ou de uma vacina, ou de um reagente de diagnóstico in vitro e in vivo, para a indução ou o diagnóstico no mamífero de anticorpos específicos e, mais particularmente, do isotipo IgG2, ligados a um estado imunitário do tipo Thl.
6. 6. Complexo de péptidos de síntese de acordo com qualquer uma 2 das reivindicações 2 a 4, caracterizada por os péptidos E34P, A16E e A16G serem ligados a portadores (grandes moléculas tipo KLH, lipopéptidos tipo palmitoílo ou derivados) para as tornar imunogénicos.
7. 7. Complexo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4 ou 6, condicionada sob uma forma tal que pode ser administrada por diferentes vias: subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, parentérica e oral.
8. 8. Utilização do péptido de sintese não nativo ciclizado E34P destinado a induzir imunoglobulinas de classe IgG2 de acordo com a reivindicação 1 para neutralizar in vitro a proliferação dos amastigotos e promastigotos de Leishmania sp.
9. 9. Produto de diagnóstico in vitro caracterizado por conter o péptido ciclizado E34P de acordo com a reivindicação 1 ou o complexo de péptidos de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4 ou 6, para a detecção de uma resposta humoral e particularmente de IgG2, permitindo nomeadamente colocar em evidência um estado imunitário do tipo Thl e um estado de hiperestimulação retardada, a monitorização da resposta imunitária nos mamíferos vacinados ou não vacinados mas tratados e a monitorização da eficácia de uma vacinação ou de um tratamento quimioterapêutico e/ou imunoterapêutico.
10. 10. Kit de diagnóstico in vitro incluindo o produto de diagnóstico de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por o péptido ciclizado E34P ou o complexo de péptidos estar ligado a um suporte sólido. 3
11. 11. Kit de diagnóstico in vitro de acordo com a reivindicação 10 caracterizada por o péptido ciclizado E34P ou o complexo de péptidos estar ligado a membranas de nitrocelulose ou outros polímeros, suportes de látex e materiais de plástico (polímero). Lisboa, 19 de Junho de 2012 4