BR112013011584A2

BR112013011584A2 - Composição, polipeptídeo isolado e/ou recombinante, polinucleotídeo isolado e/ou exógeno, vetor, métodos de preparar o polipeptídeo e de selecionar um agonistaou antagonista que modula a atividade do polipeptídeo, anticorpo substancialmente 5 purificado, uso da composição, e, organismo transgênico não humano

Info

Publication number: BR112013011584A2
Application number: BR112013011584-0A
Authority: BR
Inventors: Lin Chen; Alan COWMAN; Tony Triglia
Original assignee: The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research
Priority date: 2010-11-09
Filing date: 2011-11-08
Publication date: 2020-08-11
Also published as: AU2011326338B2; CN103260641A; CN103260641B; KR20130129215A; KR101871530B1; WO2012061882A1; AU2011326338A1; US9109040B2; US20140010816A1; MY162954A

Abstract

COMPOSIÇÃO, POLIPEPTÍDEO ISOLADO E/OU RECOMBINANTE, POLINUCELOTÍDEO ISOLADO E/OU EXÓGENO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS DE PREPARAR O POLIPEPTÍDEO, DE TRATAR OU PREVENIR MALÁRIA, DE AUMENTAR UMA RESPOSTA IMUNE E DE SELECIONAR UM AGONISTA OU ANTAGONISTA QUE MODULA A ATIVIDADE DE POLIPEPTÍDEO, ANTICORPO SUBSTANCIALMENTE PURIFICADO, USO DA COMPOSIÇÃO, E, ORGANISMO TRANSGÊNICO NÃO HUMANO. A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos de Plasmodium e aos polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. A invenção diz respeito adicionalmente às composições que compreendem os polipeptídeos e ao seu uso no tratamento e prevenção de malária.

Description

“COMPOSIÇÃO, POLIPEPTÍDEO ISOLADO E/OU RECOMBINANTE, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO E/OU EXÓGENO, VETOR, MÉTODOS DE PREPARAR O POLIPEPTÍDEO E DE SELECIONAR UM AGONISTA

OU ANTAGONISTA QUE MODULA A ATIVIDADE DO 5 POLIPEPTÍDEO, ANTICORPO SUBSTANCIALMENTE PURIFICADO, USO DA COMPOSIÇÃO, E, ORGANISMO TRANSGÊNICO NÃO HUMANO”

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos de Plasmodium e aos polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. A invenção diz respeito adicionalmente às composições que compreendem os polipeptídeos e ao seu uso no tratamento e prevenção de malária.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A malária em humanos é causada por infecção com parasitas protozoários do gênero Plasmodium. Quatro espécies são conhecidas por causar doença em humanos: Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale e Plasmodium vivax. Entretanto, Plasmodium falciparum é responsável pela maioria das doenças graves e morte. Estimativas recentes do número anual de casos clínicos de malária em todo o mundo variam de 214 a 397 milhões (The world health report 2002: reducing risks, promoting healthy life. Geneva: World Health Organization; Breman et al., 2004), embora uma estimativa maior de 515 milhões (variação de 300 a 660 milhões) de casos clínicos de Plasmodium falciparum em 2002 tenha sido proposta (Snow et al., 2004). Sabe-se que a mortalidade anual (quase todos associados à malária causada por Plasmodium falciparum) é em torno de 1,1 milhões (Breman et al., 2004). A malária também aumenta significativamente o risco de morte na infância a partir de outras causas (Snow et al., 2004). Quase metade da população mundial vive em áreas onde são expostos ao risco de malária (Hay et al., 2004), e os números crescentes de visitantes em áreas endêmicas também representam risco. Apesar dos esforços contínuos para controlar a malária, esta doença permanece como um problema de saúde importante em 5 muitas regiões do mundo, e novos meios de prevenir e/ou tratar a doença são urgentemente necessários. O otimismo inicial com relação às vacinas com base em proteínas associadas à malária (assim denominadas vacinas de subunidade) diminuiu nas duas últimas décadas, uma vez que os problemas causados por polimorfismo alélico e variação antigênica, “pecado original antigênico” e as dificuldades de gerar níveis elevados duradouros da imunidade adquirida, e as falhas notáveis de muitas vacinas de subunidade promissoras (tal como SPf66), levaram a uma necessidade de mudança na abordagem para uma vacina contra a malária. Consequentemente, este crescente sentimento de frustração tem levado à busca de diferentes abordagens que focam em cepas atenuadas do parasita que causa a malária ou esporozoítos de Plasmodium falciparum irradiados (Hoffmann et al., 2002). De maneira similar, tanto o sucesso limitado atingido até o momento com as vacinas à base de proteína, quanto o reconhecimento de que a imunidade mediada por célula pode ser importante para a proteção contra os estágios do parasita hepáticos e talvez no sangue, levaram a uma tentativa de desenvolver vacinas de DNA e de vetores, que geram imunidade celular mediada por célula relativamente forte. Infelizmente, as vacinas de DNA têm demonstrado pouca eficiência em humanos com relação à indução de anticorpo (Wang et al., 2001). Assim, permanece uma necessidade de métodos de tratar e prevenir a malária.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Os presentes inventores identificaram um polipeptídeo inédito de Plasmodium que está envolvido na invasão de células hospedeiras. Os presentes inventores observaram que anticorpos contra este polipeptídeo inibem a ligação de merozoíto e invasão de eritrócitos.

Dessa maneira, em um aspecto, a presente invenção fornece uma composição que compreende um polipeptídeo isolado e/ou recombinante (aqui referido como um polipeptídeo Rip), em que o polipeptídeo compreende 5 ou consiste em: i) uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 2 a 4, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 2 a 4, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90 % idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 2 a 4, ou um fragmento antigênico desta.

Em uma modalidade particularmente preferida, o fragmento antigênico compreende mais preferivelmente ou consiste na sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 3. Em uma outra modalidade preferida, a composição compreende adicionalmente um polipeptídeo Rh ou fragmento antigênico deste.

Exemplos de polipeptídeos Rh incluem, mas não são necessariamente limitados a, Rh1, Rh2a, Rh2b, Rh4 e Rh5. Em uma modalidade particular, o polipeptídeo Rh, ou fragmento antigênico, compreende ou consiste em: i) uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 10 a 28, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 10 a 28, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Em uma modalidade, a composição compreende um polipeptídeo Rh1 ou fragmento antigênico deste, o qual compreende ou consiste em: i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 10, 5 ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 10, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Em uma outra modalidade, a composição compreende um polipeptídeo Rh2, ou fragmento antigênico deste, que compreende ou consiste em: i) uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 11 a 14, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 11 a 14, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Em uma modalidade preferida, o fragmento antigênico Rh2 compreende mais preferivelmente ou consiste em: i) a sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 12, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 12, ou ii) a sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 13, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 13. Ainda mais preferivelmente, o fragmento antigênico Rh2 compreende mais preferivelmente ou consiste em: i) a sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 12, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 12. Em uma modalidade adicional, a composição compreende um polipeptídeo Rh4, ou fragmento antigênico deste, que compreende ou consiste em:

i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 16, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 15 e/ou SEQ ID NO: 16, e/ou 5 iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Em uma modalidade preferida, o fragmento antigênico Rh4 compreende mais preferivelmente ou consiste na sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 16, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 16. Em uma modalidade adicional, a composição compreende um polipeptídeo Rh5, ou fragmento antigênico deste, que compreende ou consiste em: i) uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 17 a 28, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 17 a 28, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Em uma modalidade preferida, o fragmento antigênico Rh5 compreende mais preferivelmente ou consiste na sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 18, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 18. Ainda em uma outra modalidade preferida, a composição compreende adicionalmente um polipeptídeo EBA ou fragmento antigênico deste.

Exemplos de polipeptídeos EBA incluem, mas não são necessariamente limitados a, EBA175, EBA140 e EBA181. Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo EBA é EBA 175. Em uma modalidade, o polipeptídeo EBA ou fragmento antigênico compreende ou consiste em: i) uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 35 a 38, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 35 a 38, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). 5 Em uma modalidade, a composição compreende um polipeptídeo EBA 175, ou fragmento antigênico deste, que compreende ou consiste em: i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 35 e/ou SEQ ID NO: 36, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Em uma modalidade preferida, o fragmento antigênico de EBA 175 compreende mais preferivelmente ou consiste na sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 36, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 36. Em uma outra modalidade preferida, a composição compreende: i) um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 3, ii) um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 12; e iii) um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 36. Em uma outra modalidade, a composição compreende um polipeptídeo EBA 181, ou fragmento antigênico deste, que compreende ou consiste em: i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 37,

ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 37, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Em uma outra modalidade, a composição compreende um 5 polipeptídeo EBA 140, ou fragmento antigênico deste, que compreende ou consiste em: i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 38, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 38, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Em uma modalidade particularmente preferida, a composição compreende: a) um polipeptídeo Rip ou fragmento antigênico deste, ou seja, um polipeptídeo que compreende ou consiste em: i) uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 2 a 4, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 2 a 4, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii) b) um polipeptídeo Rh2 ou fragmento antigênico deste, c) um polipeptídeo Rh4 ou fragmento antigênico deste, d) um polipeptídeo Rh5 ou fragmento antigênico deste, e e) um polipeptídeo EBA175 ou fragmento antigênico deste.

Preferivelmente, a) compreende, mais preferivelmente consiste em, a sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 3. Preferivelmente, b) compreende, mais preferivelmente consiste em,

i) a sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 12, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 12, ou ii) a sequência de aminoácidos da maneira apresentada em 5 SEQ ID NO: 13, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 13. Mais preferivelmente, b) compreende, mais preferivelmente consiste em, a sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 12, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 12. Preferivelmente, c) compreende, mais preferivelmente consiste em, a sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 16, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO:

16. Preferivelmente, d) compreende, mais preferivelmente consiste em, a sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 18, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO:

18. Preferivelmente, e) compreende, mais preferivelmente consiste em, a sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 36, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO:

36. Um polipeptídeo Rip também pode ser referenciado como Ripr. Os presentes inventores também identificaram uma região de 15 kDa das proteínas pfRh2a e pfRh2b de Plasmodium que contêm o domínio de ligação de eritrócito. Os anticorpos para esta região de pfRh2a/2b inibem a ligação de merozoíto e a invasão de eritrócitos. Assim, em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição que compreende um polipeptídeo isolado e/ou recombinante, em que o polipeptídeo compreende ou consiste em: i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em

SEQ ID NO: 12, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 12, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). 5 Em uma modalidade, pelo menos um dos polipeptídeos em uma composição da invenção é uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma outra sequência de polipeptídeos.

O pelo menos um outro polipeptídeo pode ser, por exemplo, um polipeptídeo que melhora a estabilidade de um polipeptídeo da presente invenção, ou um polipeptídeo que auxilia na purificação ou detecção da proteína de fusão, ou um polipeptídeo capaz de elicitar uma resposta imune em um animal, especialmente um humano.

Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo pelo menos 90 % idêntico à MSP-1 (SEQ ID NO: 43), ou um fragmento de pelo menos cerca de 50 aminoácidos deste.

Em uma modalidade preferida, o fragmento MSP-1 é MSP- 1(42) (SEQ ID NO: 44) ou MSP-1(19) (SEQ ID NO: 45). Em uma modalidade particularmente preferida, a composição é uma composição imunogênica.

Em uma modalidade particular, a composição é uma vacina.

Em uma modalidade particular, a composição compreende um adjuvante e/ou carreador farmaceuticamente aceitável.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado e/ou recombinante, em que o polipeptídeo compreende ou consiste em: i) uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 2 a 4, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 2 a 4, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Em uma modalidade, o polipeptídeo do aspecto anterior compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOs: 2 a 4, ou um fragmento antigênico 5 desta.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado e/ou recombinante, em que o polipeptídeo compreende ou consiste em: i) uma sequência de aminoácidos da maneira fornecida em SEQ ID NO: 12, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 12, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Em uma modalidade, o polipeptídeo do aspecto anterior compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 12, ou um fragmento antigênico desta.

Em uma modalidade, um polipeptídeo da invenção, ou um polipeptídeo em uma composição da invenção, pode ser purificado a partir de um Plasmodium, por exemplo, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale curtisi, Plasmodium ovale wallikeri, Plasmodium malariae e/ou Plasmodium knowlesi, ou é um fragmento antigênico do polipeptídeo.

Mais preferivelmente, é Plasmodium falciparum.

Em uma outra modalidade, um polipeptídeo da invenção é uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma outra sequência de polipeptídeos.

Ainda em uma outra modalidade, um polipeptídeo da invenção é imunogênico.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado e/ou exógeno que compreende ou consiste em:

i) uma sequência de nucleotídeos da maneira apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 39 ou 42, ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da invenção, 5 iii) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70 % idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 1 , 39 ou 42, e/ou iv) uma sequência que hibridiza em qualquer um ou mais de i) a iii) em condições pelo menos moderadamente severas.

Em uma modalidade, o polinucleotídeo isolado e/ou exógeno compreende ou consiste em: i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende ou que consiste na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3 e ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende ou que consiste na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 12. Ainda em uma outra modalidade, o polinucleotídeo isolado e/ou exógeno compreende adicionalmente: i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende ou que consiste na sequência de aminoácidos, da maneira apresentada em SEQ ID NO: 36. Em um outro aspecto, é fornecido um vetor que compreende o polinucleotídeo isolado e/ou exógeno da invenção.

Em uma modalidade preferida, o polinucleotídeo é operavelmente ligado a um promotor.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma vacina de DNA que compreende o polinucleotídeo isolado e/ou exógeno da invenção, e/ou o vetor da invenção.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula hospedeira que compreende o polipeptídeo da invenção, o polinucleotídeo da invenção, e/ou o vetor da invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de preparar um polipeptídeo da invenção, o método compreendendo: (a) obter um vetor de expressão que compreende uma 5 sequência de polinucleotídeos da invenção operavelmente ligada a um promotor; e (b) introduzir o dito vetor de expressão em uma célula ou sistema de expressão sem célula, por meio do qual a dita célula ou sistema de expressão sem célula produz o polipeptídeo codificado pela dita sequência de polinucleotídeos.

Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente isolar o dito polipeptídeo.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo substancialmente purificado, que se liga especificamente a um polipeptídeo da invenção.

Em uma modalidade, o anticorpo é marcado de maneira detectável.

Em um outro aspecto, é fornecido um método de tratar ou prevenir malária em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma composição da invenção, um polipeptídeo da invenção, um polinucleotídeo da invenção, um vetor da invenção, uma célula hospedeira da invenção, e/ou um anticorpo da invenção.

Ainda em um outro aspecto, é fornecido um método para aumentar uma resposta imune em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma composição da invenção, um polipeptídeo da invenção, um polinucleotídeo da invenção, um vetor da invenção, e/ou uma célula hospedeira da invenção.

Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de uma composição da invenção, um polipeptídeo da invenção, um polinucleotídeo da invenção, um vetor da invenção, uma célula hospedeira da invenção, e/ou um anticorpo da invenção, na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de malária.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma 5 composição da invenção, um polipeptídeo da invenção, um polinucleotídeo da invenção, um vetor da invenção, uma célula hospedeira da invenção, e/ou um anticorpo da invenção para uso no tratamento ou prevenção de malária.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um organismo transgênico não humano que compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo da invenção.

Em uma modalidade, o organismo transgênico não humano é uma bactéria, por exemplo, E. coli.

Em uma outra modalidade, o organismo transgênico não humano é uma planta.

Preferivelmente, a planta é selecionada de uma fruta, vegetal ou cereal.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de selecionar um agonista ou antagonista que modula a atividade de um polipeptídeo da invenção, o método compreendendo colocar o polipeptídeo em contato com um composto candidato, e determinar se o dito composto se liga o polipeptídeo.

Em uma modalidade, o antagonista previne uma ligação do polipeptídeo Rip a um polipeptídeo Rh5. De maneira evidente, as características e atributos preferidos de um aspecto da invenção são aplicáveis a muitos outros aspectos da invenção.

Em toda esta especificação, será entendido que a palavra “compreendem”, ou variações tal como “compreende” ou “que compreende”, implica na inclusão de um elemento número inteiro ou etapa declarada, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas sem a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos,

números inteiros ou etapas. A invenção é descrita daqui por diante por meio dos seguintes exemplos não limitantes, e com referência às figuras em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS 5 Algumas figuras contêm representações ou entidades coloridas. As versões coloridas das figuras são disponíveis a partir do titular da patente mediante requisição, ou a partir de um escritório de Patentes apropriado. Uma taxa pode ser imposta se for obtido de um escritório de Patentes. A figura 1 mostra a caracterização de domínio C-terminal de pfRhS processado de 45 kDa. (A) Cromatografia de filtração em gel de pfRh5a prutificado. As amostras coletadas (# indica número de fração) foram separadas por SDS-PAGE. (B) Eletroforese em gel Blue native de pfRh5 purificado. A figura 2 mostra (A) Cromatografia de filtração em gel de pfRhS em uma coluna analítica Superdex 200. As amostras coletadas (# indica número de fração) foram separadas por SDS-PAGE. (B) Cromatografia de filtração em gel de pfRh5 incubado com anticorpo de pfRh5 em uma coluna Superdex 200. Amostras coletadas (# indica o número de fração) foram separadas por SDS-PAGE. * indica cadeias peadas e leves de IgG; Seta indica pfRh5. A figura 3 mostra a geração da linhagem de parasita pfRip marcado na terminação C (pfRipHA). (A) Diagrama mostrando que uma marca única de Strep e a marca tripla de hemaglutinina (HA) foram adicionadas à terminação C de pfRip por recombinação cruzada homóloga única em 3'. (B) Imunoblotting de pelota de saponina e proteína marcada com HA, purificada a partir do sobrenadante da cultura da linhagem de pfRipHA com o anticorpo anti-HA. (C) PfRipHA analisado por SDS-PAGE em condições redutoras e não redutoras.

A figura 4 confirma a imunoprecipitação recíproca de pfRh5 e pfRip forma um complexo. (A) Immunoblot de proteína imunoprecipitada dos sobrenadantes da cultura de 3D7 e 3D7-pfRipHA com microesferas de anti- HA-Sepharose, e que foi sondada com anticorpo monoclonal anti-pfRh5. (B) 5 Imunoprecipitação dos sobrenadantes da cultura, tanto das linhagens de parasita wt 3D7 quanto 3D7-pfRipHA, com anticorpo monoclonal anti-pfRh5 acoplado à miniesfera. A figura 5 mostra que tanto pfRh5 quanto pfRip são expressos no ciclo de vida tardio do desenvolvimento de parasita. O immunoblot de pelotas de saponina foi obtido de cultura de parasita pfRipHA triplamente sincronizada, sondada com anticorpo monoclonal anti-HA, e a seguir extraída e sondada com anticorpos para pfRh5 e pfhsp70. A figura 6 mostra a estrutura e expressão do domínio de PfRip em P. falciparum. (A) A estrutura do domínio da proteína PfRip. PfRip tem

1.086 aminoácidos com uma sequência sinal e 10 domínios do tipo EGF. Dois são agrupados na terminação N com ou outros oito agrupados na terminação C. Os domínios do tipo EGF são mostrados como os objetos na forma de elipse. (B) Um alinhamento do dez domínio do tipo EGF que mostram os resíduos de cisteína conservados, que definem estes domínios. Os resíduos de aminoácido em PfRip são mostrados à esquerda. Está também no alinhamento o domínio do fator de crescimento epidermal. (C) Expressão de resíduos de aminoácido 791-900 de PfRip como uma proteína recombinante em E. coli. São mostradas a proteína eluida após cromatografia com quelato de Ni (canaleta 1) e cromatografia de exclusão por tamanho (canaleta 2). (D) Anticorpos elevados para a proteína recombinante PfRip reagem com PfRip em preparações de esquizonte de P. falciparum. São mostrados dois immunoblots sondados com anticorpos elevados em dois coelhos (anti- PfRip/1 e anti-PfRip/2). A figura 7 mostra que PfRip é uma proteína de membrana periférica e carrega seu parceiro de complexo, pfRh5, na superfície dos merozoítas. (A) Immunoblot de frações solúveis e insolúveis das pelotas preparadas por lise hipotônica das células vermelhas do sangue infectadas por parasita PfRipHA no estágio tardio de esquizonte. (B) Immunoblot da pelota 5 de saponina preparado a partir das células vermelhas do sangue infectadas com parasita pfRipHA no estágio tardio de esquizonte.

A figura 8 mostra (A) Pré-incubação de merozoítas purificados com proteína-A purificada de anticorpos policlonais de coelho (R1155 & R1156 em 2mg/mL), elevados contra pfRip recombinante, por 2 minutos a 37 °C inibiu a anexação de merozoítas nas células vermelhas do sangue não infectadas em 40-55 %. (B) O ensaio de inibição do crescimento (GIA) para diferentes cepas de P. falciparum usando anticorpos anti-PfRIP-1 IgG. (C) Tiulação de anticorpos IgG anti-PfRIP-1 com FCR3. (D) Titulação de anticorpos IgG anti-PfRIP- 1 com 3D7. A figura 9 mostra que anticorpos em uma região C-terminal de PfRipr inibem a anexação de merozoítas em eritrócitos e o crescimento do parasita. (A) Os anticorpos anti-PfRipr/1 inibem a invasão de cepas de P. falciparum nos eritrócitos.

São mostrados ensaios de inibição do crescimento das cepas de parasita FCR3, W2mef, T994, CSL2, E8B, MCAMP, 7G8, D10, HB3 e 3D7. O gráfico representa três experimentos independentes realizados em triplicata com cada um normalizado com o controle negativo (Proteína A purificada de IgG de soros de coelho normal). As barras de erro representam erro padrão da média dos três experimentos independentes. (B) O ensaio de GIA usando diferentes combinações de anticorpos na invasão da cepa 3D7. São mostrados os anticorpos IgG: αPfRIP/1 , ctPfRIP/2, αPfRIP/1 + aEBA- 175, αPfRIP/1 + αPfRh4, αPfRIP/1 + αPfRh2a/b e αPfRIP/1 + αPfRh2a/b + <xPfRh4 (mostrado como αPfRIP/1 + αPfRh2a/b/PfRh4). A figura 10 mostra que rRh215 recombinante se liga aos eritrócitos. (A) Diagrama esquemático da proteína PfRh2, que exibe o local das proteínas de fusão rRh215 e 2b1. A rRh215 está localizada no domínio de ligação de 85 kDa de PfRh2. O evento de processamento que leva ao produto de 85 kDa é indicado pela seta.

A proteína de fusão 2b1 é de uma região exclusiva Rh2b na terminação C da proteína.

As regiões da proteína em 5 negrito nas terminações N e C representam a sequência sinal e os domínios transmembrana, respectivamente. (B) rRh215 recombinante foi ligada aos eritrócitos não tratados (Unt), tratados com pouca tripsina (TBaixo; 0,067mg/ml), tripsina elevada (TElevado; 1 mg/mL), neuraminidase (N) ou quimotripsina (C). As proteínas ligadas foram eluídas com NaCl 1,5M, separadas em géis de SDS-PAGE, Western blotted e sondadas com um anticorpo (R1170) na proteína de fusão rRh215. A ligação de rRh215 recombinante aos eritrócitos foi parcialmente sensível à neuraminidase e quimotripsina, mas resistente tanto às concentrações baixas quanto elevadas de tripsina.

As proteínas não ligadas e removidas dos eritrócitos não tratados também são mostradas.

A proteína de fusão 2b1 foi ligada aos eritrócitos não tratados.

As proteínas ligadas foram eluídas com NaCl 1,5M, separadas em géis de SDS-PAGE, Western blotted e sondadas com o anticorpo 4B7, elevado para a proteína de fusão 2b1. A proteína de fusão 2b1 não mostrou nenhuma ligação com os eritrócitos não tratados, mas estava evidentemente presente na fração não ligada.

A figura 11 mostra os que anticorpos em rRh215 bloqueiam a ligação e invasão de PfRh2 natural. (A) Os anticorpos R1170 realizam o bloqueio da ligação de rRh215 de PfRh2 natural nos eritrócitos.

Proteína G- purificada R1070, R1170 ou anticorpos do soro de coelho normal em concentrações finais de 0,1 a 1,0 μg μL foram pré-incubados com o sobrenadante de cultura de 3D7 antes de adicionar os eritrócitos não tratados.

As proteínas ligadas foram eluídas com NaCl 1,5M, separadas em géis de SDS-PAGE, Western blotted e sondadas com um anticorpo (6F12) no domínio de ligação PfRh2 de 85 kDa.

Apenas os anticorpos para a rRh215

(R1170) bloquearam a ligação de PfRh2 natural aos eritrócitos.

Os anticorpos em uma outra região do domínio de ligação de 85 kDa e os anticorpos de soros de coelho normal não bloquearam a ligação.

B) Os anticorpos R1170 bloquearam a ligação de rRh215 nos eritrócitos.

Os anticorpos de proteína G 5 purificada R 1170, em concentrações finais de 0,03 a 0,5 g/μL, foram pré- incubados com 0,5 μg de proteína de fusão rRh215 antes de adicionar os eritrócitos não tratados.

As proteínas ligadas foram eluídas com NaCl 1,5 M, separadas por SDS-PAGE, Western blotted e sondadas com proteína G purificada R1170. (C) Os anticorpos para rRh215 bloqueiam a invasão tanto de eritrócitos não tratados quanto tratados com pouca tripsina.

A IgG de proteína G purificada em concentração final de 2 mg/mL, tanto de R1070 quanto soros de R1170 pré-sangria e sangria pós morte, foi adicionada ao parasita 3D7 no estágio trofozoíta junto com os eritrócitos alvos, que não foram tratados ou foram tratados com pouca tripsina (0,067 mg/mL). Após uma outra invasão na presença de anticorpos, as culturas continuaram no estágio de trofozoíta, quando os números de parasita foram determinados a fim de observar o efeito dos anticorpos na invasão.

A invasão percentual na ausência de anticorpos foi ajustada para 100 % de invasão.

Os experimentos foram realizados pelo menos duas vezes em triplicata.

As barras de erro mostram o erro padrão da média. (D) Os anticorpos para rRh215 bloqueiam a invasão de PfRh2b, mas não de Rh2a em parasitas 3D7. A IgG e proteína G purificada do soro do sangue de R1170, em concentração final de 2 mg/mL, foi adicionada aos parasitas 3D7A2a (expressão apenas de Rh2b), 3D7A2b (expressão apenas de Rh2a) e FCR3 (sem expressão de Rh2a e Rh2b), no estágio de trofozoíta, junto com eritrócitos alvo que não foram tratados ou foram tratados com 0,03 mg/ml de tripsina.

Outros detalhes dos experimentos foram os mesmos de (C) anterior.

A figura 12 mostra que anticorpos contra uma combinação de antígenos inibem a invasão de P. falciparum em células vermelhas do sangue humano in vitro. O percentual de invasão é calculado como 100 x (invasão média (poços em triplicata) de IgG controle/IgG teste).

CHAVE PARA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 - sequência codificante de pfRip 5 SEQ ID NO: 2 - sequência de aminoácidos de pfRip SEQ ID NO: 3 - fragmento antigênico 791-900 de pfRip SEQ ID NO: 4 - fragmento antigênico 238-368 de pfRip SEQ ID NO: 5 - peptídeo 93-100 de pfRip SEQ ID NO: 6 - peptídeo 101-114 de pfRip SEQ ID NO: 7 - peptídeo 699-708 de pfRip SEQ ID NO: 8 - peptídeo 760-769 de pfRip SEQ ID NO: 9 - peptídeo 963-972 de pfRip SEQ ID NO: 10 - sequência de aminoácidos de pfRh1 SEQ ID NO: 11 - sequência de aminoácidos de pfRh2a SEQ ID NO: 12 - fragmento antigênico de 15 kDa de pfRh2a/b SEQ ID NO: 13 - fragmento antigênico 2030-2528 de pfRh2a/b SEQ ID NO: 14 - sequência de aminoácidos de pfRh2b SEQ ID NO: 15 - sequência de aminoácidos de pfRh4 SEQ ID NO: 16 - fragmento antigênico 28-766 de pfRh4 SEQ ID NO: 17 - sequência de aminoácidos de pfRhS SEQ ID NO: 18 - fragmento antigênico de pfRh5 (sequência não principal) SEQ ID NO: 19 - fragmento antigênico de pfRh5 SEQ ID NO: 20 - fragmento antigênico de pfRh5 SEQ ID NO: 21 - fragmento antigênico de pfRhS SEQ ID NO: 22 - fragmento antigênico de pfRh5 SEQ ID NO: 23 - fragmento antigênico de pfRh5 SEQ ID NO: 24 - fragmento antigênico de pfRh5

SEQ ID NO: 25 - fragmento antigênico de pfRh5 SEQ ID NO: 26 - fragmento antigênico de pfRh5 SEQ ID NO: 27 - fragmento antigênico de pfRh5 SEQ ID NO: 28 - fragmento antigênico de pfRh5 5 SEQ ID NO: 29 - peptídeo 187-197 de pfRh5 SEQ ID NO: 30 - peptídeo 212-221 de pfRh5 SEQ ID NO: 31 - peptídeo 237-247 de pfRh5 SEQ ID NO: 32 - peptídeo 303-310 de pfRh5 SEQ ID NO: 33 - peptídeo 358-366 de pfRh5 SEQ ID NO: 34 - peptídeo 437-443 de pfRh5 SEQ ID NO: 35 - sequência de aminoácidos de pfEBA175 SEQ ID NO: 36 - fragmento antigênico 760-1271 de pfEBA175 SEQ ID NO: 37 - sequência de aminoácidos de pfEBA181 SEQ ID NO: 38 - sequência de aminoácidos de pfEBA140 SEQ ID NO: 39 - códon otimizado 238-368 de pfRip SEQ ID NO: 40 - oligonucleotídeo iniciador sentido 791-900 de pfRip SEQ ID NO: 41 - oligonucleotídeo iniciador reverso 791-900 de pfRip SEQ ID NO: 42 - sequência de DNA de 15 kDa de pfRh2a/b SEQ ID NO: 43 - sequência de aminoácidos de MSP-1 SEQ ID NO: 44 - sequência de aminoácidos de MSP-1(42) SEQ ID NO: 45 - sequência de aminoácidos de MSP-1(19) SEQ ID NOs: 46 a 57 - Peptídeo ligadores

DESCRIÇÃO DETALHADA Técnicas gerais e definições selecionadas A menos que de outra forma especificamente definida, todos os termos técnicos e científicos aqui usados podem ser obtidos para apresentar o mesmo significado, da maneira comumente entendida pelos versados na técnica (por exemplo, em imunologia, química proteica, bioquímica, cultura de células, microbiologia e genética molecular). A menos que de outra forma indicada, as técnicas 5 imunológicas, microbiológicas e de genética molecular utilizadas na presente invenção são procedimentos padrões bem conhecidos pelos versados na técnica.

Tais técnicas são descritas e explicadas em toda a literatura em fontes tais como, J.

Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley e Sons (1984), J.

Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001), T.A.

Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), D.M.

Glover e B.D.

Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 e 1996), e F.M.

Ausubel et al., (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.

Associates and Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o momento), Ed Harlow e David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (188), e J.E. coligan et al., (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até o momento). O termo “e/ou”, por exemplo, “X e/ou Y”, pode significar tanto “X e Y” quanto “X ou Y”, e pode ser obtido para fornecer suporte explicito para ambos os significados ou para cada um dos significados.

Da maneira aqui usada, o termo cerca de, a menos que declarado ao contrário, refere-se a +/- 20 %, mais preferivelmente +/- 10 %, do valor determinado.

Da maneira aqui usada, o termo “sujeito” refere-se a um animal, por exemplo, um mamífero.

Em uma modalidade, o sujeito é um humano. “Administrar”, da maneira aqui usada, deve ser interpretado de maneira ampla e inclui administrar uma composição ou polipeptídeo a um sujeito, da maneira aqui descrita, bem como fornecer uma composição ou polipeptídeo a uma célula, da maneira aqui descrita.

Da maneira aqui usada o termos “tratando”, “tratar” ou 5 “tratamento” incluem administrar uma quantidade terapeuticamente eficiente de uma composição, polipeptídeo, polinucleotídeo, vetor, célula e/ou anticorpo da invenção, suficiente para reduzir a gravidade ou eliminar pelo menos um sintoma de malária em um sujeito tal como prostração, debilitação da consciência, desconforto respiratório (respiração acidótica), convulsões múltiplas, colapso circulatório, edema pulmonar (radiológica), sangramento anormal, icterícia e/ou hemoglobinúria.

O termo “prevenir” refere-se a proteger de um sujeito de desenvolver pelo menos um sintoma de malária, ou retardar o início de um sintoma de malária em um sujeito.

Polipeptídeos e fragmento antigênicos Os termos “polipeptídeo” e “proteína”, da maneira aqui usada, são em geral usados indiferentemente e referem-se a uma cadeia de polipeptídeo que pode ou não ser modificada pela adição de grupos não relacionados aos aminoácidos.

Assim, a proteína pode ser glicosilada, não glicosilada, e/ou pode conter outras moléculas fundidas, ligadas, agregadas ou de outra forma associadas à proteína, tais como aminoácidos, lipídeos, carboidratos ou outros polipeptídeos.

Pode ser entendido que tais cadeias de polipeptídeo podem se associar com outros polipeptídeos ou proteínas, ou outras moléculas tais como cofatores.

Os termos “proteínas” e “polipeptídeos”, da maneira aqui usada, também incluem variantes, mutantes, fragmentos biologicamente ativos, modificações, análogos e/ou derivados dos polipeptídeos aqui descritos. “Polipeptídeo isolado” significa um polipeptídeo que foi em geral separado dos lipídeos, ácidos nucleicos, outros peptídeos e outras moléculas contaminantes com as quais é associado em sue estado natural.

Preferivelmente, o polipeptídeo substancialmente purificado é pelo menos 60 % livre, mais preferivelmente pelo menos 75 % livre, e mais preferivelmente pelo menos 90 % livre de outros componentes com os quais é naturalmente 5 associado.

O termo “recombinante”, no contexto de um polipeptídeo, refere-se ao polipeptídeo quando produzido por uma célula, ou em um sistema de expressão livre de célula, em uma quantidade alterada ou em uma taxa alterada, comparado ao seu estado natural.

Em uma modalidade, a célula é uma célula que não produz naturalmente o polipeptídeo.

Entretanto, a célula pode ser uma célula que compreende um gene não endógeno que resulta em uma quantidade alterada, preferivelmente maior, do polipeptídeo a ser produzido.

Um polipeptídeo recombinante da invenção inclui polipeptídeos que não foram separados de outros componentes da célula transgênica (recombinante), ou sistema de expressão livre de célula, em que é produzido, e polipeptídeos produzidos em tais células ou sistemas livres de célula que são subsequentemente purificados a partir de pelo menos alguns outros componentes.

O % de identidade de um polipeptídeo é determinado por análise GAP (Needleman e Wunsch, 1970) (programa GCG) com um penalidade de criação de intervalo= 5, e uma penalidade de extensão de intervalo= 0,3. A sequência de consulta apresenta pelo menos 15 aminoácidos em tamanho, e a análise GAP alinha as duas sequências com uma região de pelo menos 15 aminoácidos.

Mais preferivelmente, a sequência de consulta apresenta pelo menos 50 aminoácidos em tamanho, e a análise GAP alinha as duas sequências com uma região de pelo menos 50 aminoácidos.

Mais preferivelmente, a sequência de consulta apresenta pelo menos 100 aminoácidos em tamanho e a análise GAP alinha as duas sequências com uma região de pelo menos 100 aminoácidos.

Mais preferivelmente, a sequência de consulta apresenta pelo menos 250 aminoácidos em tamanho e a análise GAP alinha as duas sequências com uma região de pelo menos 250 aminoácidos.

Mais preferivelmente, a sequência de consulta apresenta pelo menos 500 aminoácidos em tamanho e a análise GAP alinha as duas sequências com uma 5 região de pelo menos 500 aminoácidos.

Mais preferivelmente, as duas sequências são alinhadas com o seu tamanho total.

Com relação a um polipeptídeo definido, será entendido que as figuras com % de identidade maior que aquelas fornecidas anteriormente incluirão as modalidades preferidas.

Assim, onde aplicável, à luz do % mínimo da identidade das figuras, é preferível que o polipeptídeo compreenda uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 76 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 91 %, mais preferivelmente pelo menos 92 %, mais preferivelmente pelo menos 93 %, mais preferivelmente pelo menos 94 %, mais preferivelmente pelo menos 95 %, mais preferivelmente pelo menos 96 %, mais preferivelmente pelo menos 97 %, mais preferivelmente pelo menos 98 %, mais preferivelmente pelo menos 99 %, mais preferivelmente pelo menos 99,1 %, mais preferivelmente pelo menos 99,2 %, mais preferivelmente pelo menos 99,3 %, mais preferivelmente pelo menos 99,4 %, mais preferivelmente pelo menos 99,5 %, mais preferivelmente pelo menos 99,6 %, mais preferivelmente pelo menos 99,7 %, mais preferivelmente pelo menos 99,8 %, e ainda mais preferivelmente pelo menos 99,9 % idêntica à SEQ ID NO relevante proposta.

Os mutantes da sequência de aminoácidos dos polipeptídeos da presente invenção podem ser preparados introduzindo trocas apropriadas de nucleotídeo em um ácido nucleico da presente invenção, ou por síntese in vitro do polipeptídeo desejado.

Tais mutantes incluem, por exemplo,

eliminações, inserções ou substituições de resíduos na sequência de aminoácidos.

Uma combinação de eliminação, inserção e substituição pode ser realizada para originar o construto final, contanto que o produto do polipeptídeo final possua as características desejadas, por exemplo, 5 imunogenicidade.

Os polipeptídeos mutantes (alterados) podem ser preparados usando qualquer técnica adequada conhecida na técnica.

Por exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode ser submetido à mutagênese in vitro.

Tais técnicas de mutagênese in vitro incluem subclonar o polinucleotídeo em um vetor adequado, transformando o vetor em uma cepa “mutadora”, tal como a E. coli XL- 1 Red (Stratagene), e propagando as bactérias transformadas em um número adequado de gerações.

Em um outro exemplo, os polinucleotídeos da invenção são submetidos às técnicas de embaralhamento de DNA, da maneira amplamente descrita por Harayama (1998). Estas técnicas de embaralhamento de DNA podem incluir genes ortólogos a partir de espécies muito relacionadas.

Os produtos derivados de DNA mutado/alterado podem ser facilmente selecionados usando técnicas aqui descritas para determinar se possuem as características desejadas.

Na determinação dos mutantes da sequência de aminoácidos, o local do sítio de mutação e a natureza da mutação dependerão da(s) característica(s) a ser(m) modificada(s). Os sítios para mutação podem ser modificados individualmente ou em séries, por exemplo, (1) substituindo primeiro com escolhas de aminoácido conservativo e a seguir com seleções mais radicais, dependendo dos resultados atingidos, (2) eliminando o resíduo alvo, ou (3) inserindo outros resíduos adjacentes ao sítio localizado.

As eliminações da sequência de aminoácidos variam em geral de cerca de 1 a 15 resíduos, mais preferivelmente cerca de 1 a 10 resíduos e tipicamente cerca de 1 a 5 resíduos contíguos.

Os mutantes de substituição apresentam pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de polipeptídeo removido, e um resíduo diferente inserido em seu lugar.

Os aminoácidos são substituídos preferivelmente de uma maneira relativamente conservativa.

Tais substituições conservativas são conhecidas na tabela 1, no título 5 “substituições exemplares”. Tabela 1. Substituições exemplares.

Resíduo original Substituição exemplar Ala (A) Val; Leu; Ile; Gly Arg (R) Lys Asn (N) Gln; His Asp (D) Glu Cys (C) Ser Gln (Q) Asn; His Glu (E) Asp Gly (G) Pro, Ala His (H) Asn; Gln Ile (I) Leu; Val; Ala Leu (L) Ile; Val; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Met (M) Leu; Phe Phe (F) Leu; Val; Ala Pro (P) Gly Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Trp; Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe, Ala

Além do mais, se desejado, aminoácidos não naturais ou análogos químicos de aminoácido podem ser introduzidos como uma substituição ou adição nos polipeptídeos da presente invenção.

Tais aminoácidos incluem, mas sem limitação, os D-isômeros dos aminoácidos comuns, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4- aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, ácido 6-amino hexanoico, ácido 2- amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t- butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, cicloexilalanina, β-alanina, flúor- aminoácidos, aminoácidos modelo tais como β-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na-metil aminoácidos, e análogos de aminoácido em geral.

São também incluídos no escopo da invenção os polipeptídeos da presente invenção, que são modificados de maneira diferencial durante ou após a síntese, por exemplo, por biotinilação, benzilação, glicosilação,

acetilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos protetores/de bloqueio conhecidos, clivagem proteolíltica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro elemento de ligação celular, etc.

Estas modificações podem funcionar para aumentar a estabilidade e/ou imunogenicidade do 5 polipeptídeo da invenção.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser produzidos de uma variedade de maneiras, incluindo a produção e recuperação de polipeptídeos naturais, produção e recuperação de polipeptídeos recombinantes, e síntese química dos polipeptídeos.

Em uma modalidade, um polipeptídeo isolado da presente invenção é produzido cultivando uma célula capaz de expressar o polipeptídeo em condições eficientes para produzir o polipeptídeo e recuperar o polipeptídeo.

Uma célula preferida para cultura é uma célula hospedeira da presente invenção.

As condições eficientes de cultura incluem, mas sem limitação, meios eficientes, biorreator, temperatura, pH e condições de oxigênio que permitem a produção do polipeptídeo.

Um meio eficiente refere-se a qualquer meio em que uma célula é cultivada para produzir um polipeptídeo da presente invenção.

Tal meio compreende tipicamente um meio aquoso com fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e fosfato, e sais, minerais, metais e outros nutrientes apropriados, tais como vitaminas.

As células da presente invenção podem ser cultivadas em biorreatores de fermentação convencionais, frascos de agitação, tubos de teste, placas de microtitulação e placas de Petri.

O cultivo pode ser realizado em um teor de temperatura, pH e oxigênio adequado para uma célula recombinante.

Tais condições de cultivo são conhecidas pelos versados na técnica.

Os termos “antígeno”, “antigênico”, “fragmento antigênico” e similares são bem entendidos na técnica e referem-se à porção de uma macromolécula, por exemplo, um polipeptídeo aqui definido, que é reconhecido especificamente por um componente do sistema imune, por exemplo, um anticorpo ou um receptor do antígeno de célula T.

Portanto, o termo “antígeno” refere-se a um peptídeo, um polipeptídeo, ou outra macromolécula na qual uma resposta imune pode ser induzida em um hospedeiro.

Assim, a invenção inclui um fragmento antigênico de um 5 polipeptídeo aqui definido.

Preferivelmente, o fragmento antigênico é capaz de aumentar uma resposta imune contra um patógeno do gênero Plasmodium, por exemplo Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale curtisi, Plasmodium ovale wallikeri, Plasmodium malariae e/ou Plasmodium knowlesi.

Em uma modalidade, o fragmento antigênico apresenta 6 aminoácidos em tamanho, mais preferivelmente 7 aminoácidos em tamanho, mais preferivelmente 8 aminoácidos em tamanho, mais preferivelmente 9 aminoácidos em tamanho, mais preferivelmente pelo menos 10 aminoácidos em tamanho.

Alternativamente o fragmento antigênico apresenta pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais aminoácidos em tamanho.

Em uma modalidade, o fragmento antigênico, quando administrado a um sujeito, é capaz de elicitar uma resposta imune contra pelo menos um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos da maneira fornecida em qualquer uma de SEQ ID NOs: 2 a 4, 10 a 28 ou 35 a 38. Os exemplos adicionais de fragmentos antigênicos usados na invenção são descritos em WO 2010/022452, U.S. 2009/0175895 e U.S. 2009/0202579, alguns dos quais são destacados em detalhes a seguir.

Rip Em uma modalidade particularmente preferida, uma composição da invenção compreende um polipeptídeo Rip, ou fragmento antigênico deste.

Um exemplo de um polipeptídeo Rip de P. falciparum é fornecido como SEQ ID NO: 2. É conhecido pelos versados na técnica que existe um grande número de polimorfismo de nucleotídeo único em Rip, e estes e qualquer de outras mutações são incluídos no escopo da invenção.

Os polimorfismos particulares incluem mudanças nos aminoácidos N144 A K,

V190 a A, H511 a R, L673 a V, A755 a G, Y985 a N, e/ou I1039 a M.

Em uma modalidade particularmente preferida, o fragmento antigênico Rip compreende, mais preferivelmente consiste em, domínios EGF 5 e 6 do grupo de 8 domínios EGF (ver figura 6A), tal como 5 i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 3, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 3, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Os exemplos de outros fragmentos antigênicos RIP incluem aqueles que compreendem ou consistem em, um, preferivelmente dois ou mais, e até todos os 8 (tal como cerca de aminoácido 636 a cerca de aminoácido 979) domínios EGF na extremidade C-terminal de pfRip (ver figura 6A e 6B). Rh1 Em uma modalidade, uma composição da invenção compreende ou consiste em um polipeptídeo Rh1, ou fragmento antigênico deste.

Um exemplo de um polipeptídeo Rh1 de P. falciparum é fornecido como SEQ ID NO: 10. É conhecido pelos versados na técnica que existe um grande número de polimorfismo de nucleotídeo único em Rh1, e estes e qualquer de outras mutações são incluídos no escopo da invenção.

Em uma modalidade, o fragmento antigênico compreende ou consiste na região entre cerca de resíduo de aminoácido 1 ao domínio transmembrana de Rh1. Rh1a Em uma modalidade, uma composição da invenção compreende ou consiste em um polipeptídeo Rh2a, ou fragmento antigênico deste.

Um exemplo de um polipeptídeo Rh2a de P. falciparum é fornecido como SEQ ID NO:11. É conhecido pelos versados na técnica que existe um grande número de polimorfismo de nucleotídeo único em Rh2a, e estes e qualquer de outras mutações são incluídos no escopo da invenção.

Exemplos de tais mutações são então A no aminoácido 2546 que é substituído por D, E no aminoácido 2613 que é substituído por G, R no aminoácido 2723 que é 5 substituído por, ou K no aminoácido 2725 que é substituído por Q.

Em uma modalidade, o fragmento antigênico de Rh2a compreende ou consiste na região entre cerca de 31 aminoácidos N-terminais da região de homologia de Prodom PD006364, a cerca do domínio transmembrana de Rh2a.

O fragmento antigênico também pode compreender ou consistir na região de cerca de resíduo 2133 a cerca de resíduo 3065, a região de cerca de resíduo 2098 a cerca de resíduo 2597, ou a região de cerca de resíduo 2616 a cerca de resíduo 3115 de Rh2a.

Em uma modalidade particularmente preferida, o fragmento antigênico Rh2a compreende, mais preferivelmente consiste em, i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 12, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 12, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Em uma outra modalidade particularmente preferida, o fragmento antigênico Rh2a compreende, mais preferivelmente consiste em, i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 13, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 13, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Rh2b Em uma modalidade, uma composição da invenção compreende ou consiste em um polipeptídeo Rh2b, ou fragmento antigênico deste.

Um exemplo de um polipeptídeo Rh2a de P. falciparum é fornecido como SEQ ID NO: 14. É conhecido pelos versados na técnica que existe um grande número de polimorfismo de nucleotídeo único em Rh2b, e estes e qualquer de outras mutações são incluídos no escopo da invenção.

Exemplos 5 de tais mutações são por meio disso D no aminoácido 2546 que é substituído por A, K no aminoácido 2635 que é substituído por E, K no aminoácido 3165 que é substituído por N, ou N no aminoácido 3191 que é substituído por T ou Y.

Em uma modalidade, o fragmento antigênico de Rh2b compreende ou consiste na região entre cerca de 31 aminoácidos N-terminais da região de homologia de Prodom PD006364, a cerca do domínio transmembrana de Rh2b.

O fragmento antigênico pode compreender ou consistir na região de cerca de resíduo 2027 a cerca de resíduo 3115, mais particularmente de cerca de resíduo 2027 a cerca de resíduo 2533, de Rh2b.

Em outros exemplos, o fragmento antigênico pode compreender ou consistir na região de cerca de resíduo 2098 a cerca de resíduo 2597, ou na região de cerca de 2616 a 3115, de Rh2b.

Em uma modalidade particularmente preferida, o fragmento antigênico Rh2b compreende, mais preferivelmente consiste em, i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 12, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 12, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Em uma outra modalidade particularmente preferida, o fragmento antigênico Rh2b compreende, mais preferivelmente consiste em, i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 13, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 %

idêntica à SEQ ID NO: 13, e ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Rh4 Em uma modalidade, uma composição da invenção 5 compreende ou consiste em um polipeptídeo Rh4, ou fragmento antigênico deste.

Um exemplo de um polipeptídeo Rh4 de P. falciparum é fornecido como SEQ ID NO: 15. É conhecido pelos versados na técnica que existe um grande número de polimorfismo de nucleotídeo único em Rh4, e estes e qualquer de outras mutações são incluídos no escopo da invenção.

Exemplos de tais mutações são por meio disso Y no aminoácido 12 que é substituído por A, L no aminoácido 143 que é substituído por I, N no aminoácido 435 que é substituído por K, Q no aminoácido 438 que é substituído por K, T no aminoácido 506 que é substituído por K, N no aminoácido 771 que é substituído por S, N no aminoácido 844 que é substituído por I, K no aminoácido 1482 que é substituído por R, ou N no aminoácido 1498 que é substituído por I.

Em uma modalidade, o fragmento antigênico de Rh2b compreende ou consiste na região de cerca do domínio da superfamília do tipo MTH1187/YkoFa, cerca do domínio transmembrana de Rh4. O fragmento antigênico pode compreender ou consistir na região de cerca de resíduo 1160 a cerca de resíduo 1370 de Rh4. Em uma outra modalidade particularmente preferida, o fragmento antigênico Rh4 compreende, mais preferivelmente consiste em, i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 16, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 16, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). Rh5

Em uma modalidade, uma composição da invenção compreende ou consiste em um polipeptídeo Rh5, ou fragmento antigênico deste.

Um exemplo de um polipeptídeo Rh5 de P. falciparum é fornecido como SEQ ID NO: 17. É conhecido pelos versados na técnica que existe um 5 grande número de polimorfismo de nucleotídeo único em Rh5, e estes e qualquer de outras mutações são incluídos no escopo da invenção.

Exemplos de tais mutações são por meio disso E no aminoácido 48 que é substituído por K, Y no aminoácido 147 que é substituído por H, H no aminoácido 148 que é substituído por N, S no aminoácido 197 que é substituído por Y, C no aminoácido 203 que é substituído por Y, I no aminoácido 204 que é substituído por ou R, N no aminoácido 347 que é substituído por Y ou D, Y no aminoácido 358 que é substituído por F, E no aminoácido 362 que é substituído por D, V no aminoácido 371 que é substituído por I, I no aminoácido 407 que é substituído por V, I no aminoácido 410 que é substituído por M, ou no aminoácido 429 que é substituído por N.

Em uma modalidade, o fragmento antigênico não apresenta a sequência principal N-terminal de 23 aminoácidos (SEQ ID NO: 18). Em modalidades alternativas, o fragmento antigênico pode compreender ou consistir em uma das sequências de aminoácidos fornecidas como SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 28 ou variantes destas, tal como onde uma ou mais das mutações anteriormente mencionadas de Rh5 são presentes.

Em modalidades adicionais, o fragmento antigênico pode compreender ou consistir em resíduos de cerca de resíduo 203 a cerca de resíduo 224, 317, 329, 345 ou 351; ou resíduos de cerca de resíduo 224 a cerca de 317, 329, 345 ou 351; ou resíduos de cerca de resíduo 329 a cerca de resíduo 345 ou 351, ou resíduos de cerca de resíduo 345 a cerca de resíduo 351. Em uma modalidade, as cisteínas 203 (polimórficas em P. falciparum) e 329 (ausentes em P. reichenowi) pareiam na molécula pela ponte de dissulfeto para formar uma alça.

Dessa maneira, em uma forma da invenção, o fragmento antigênico pode compreender ou consistir em resíduos de aminoácidos de cerca de resíduo 203 a cerca de resíduo 329. Propõe-se adicionalmente que as cisteínas 224 e 317 pareiam tanto com a cisteína 345 quanto com a cisteína 351, de maneira tal que o fragmento antigênico possa compreender ou consistir em resíduos de 5 cerca de resíduo 224 a cerca de 345 ou 351 ; ou de cerca de resíduo 317 a cerca de resíduo 345 ou 351. EBA175 Em uma modalidade adicional, uma composição da invenção compreende ou consiste em EBA175, ou fragmento antigênico deste.

Um exemplo de um polipeptídeo EBA 175 de P. falciparum é fornecido como SEQ ID NO: 35. É conhecido pelos versados na técnica que existe um grande número de polimorfismo de nucleotídeo único em EBA175, e estes e qualquer de outras mutações são incluídos no escopo da invenção.

Exemplos de tais mutações são por meio disso N no aminoácido 157 substituído por S, E no aminoácido 274 substituído por K, no aminoácido 279 substituído por E, K no aminoácido 286 substituído por E, D no aminoácido 336 substituído por Y, no aminoácido 388 substituído por N, P no aminoácido 390 substituído por S, E no aminoácido 403 substituído por K, K no aminoácido 448 substituído por E, K no aminoácido 478 substituído por N K no aminoácido 481 substituído por I, N no aminoácido 577 substituído por K, Q no aminoácido 584 substituído por K, R no aminoácido 664 substituído por S, S no aminoácido 768 substituído por N, E no aminoácido 923 substituído por K, K no aminoácido 932 substituído por E, E no aminoácido 1058 substituído por V, ou G no aminoácido 1 100 substituído por D.

Em uma modalidade, o fragmento antigênico é encontrado na região entre o domínio F2 e o domínio transmembrana da proteína EBA175. Em uma modalidade particularmente preferida, o fragmento antigênico EBA175 compreende, mais preferivelmente consiste em, i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em

SEQ ID NO: 36, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 36, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). 5 EBAI81 Em uma modalidade adicional, uma composição da invenção compreende ou consiste em EBA181, ou fragmento antigênico deste.

Um exemplo de um polipeptídeo EBA181 de P. falciparum é fornecido como SEQ ID NO: 37. É conhecido pelos versados na técnica que existe um grande número de polimorfismo de nucleotídeo único em EBA 181, e estes e qualquer de outras mutações são incluídos no escopo da invenção.

Exemplos de tais mutações são por meio disso V no aminoácido 64 substituído por L, Q no aminoácido 364 substituído por H, V no aminoácido 363 substituído por D, R no aminoácido 358 substituído por K, N no aminoácido 414 substituído por I, no aminoácido 443 substituído por Q, P no aminoácido 878 substituído por Q, E no aminoácido 884 substituído por Q, E no aminoácido 1885 substituído por K, Q no aminoácido 890 substituído por E, P no aminoácido 1197 substituído por L, no aminoácido 1219 substituído por N, D no aminoácido 1433 substituído por Y ou N, ou K no aminoácido 1518 substituído por E.

Em uma modalidade, o fragmento antigênico é encontrado na região entre o domínio F2 e o domínio transmembrana da proteína EBA181. O fragmento antigênico pode compreender ou consistir na região de cerca de resíduo 755 a cerca de resíduo 1339 de EBA181. EBA 140 Em uma modalidade adicional, uma composição da invenção compreende ou consiste em EBA140, ou fragmento antigênico deste.

Um exemplo de um polipeptídeo EBA140 de P. falciparum é fornecido como SEQ ID NO: 38. É conhecido pelos versados na técnica que existe um grande número de polimorfismo de nucleotídeo único em EBA140, e estes e qualquer de outras mutações são incluídos no escopo da invenção.

Exemplos de tais mutações são por meio disso V no aminoácido 19 substituído por I, L no aminoácido 112 substituído por F, I no aminoácido 185 substituído por V, N 5 no aminoácido 239 substituído por S, no aminoácido 261 substituído por T.

Em uma modalidade, o fragmento antigênico é encontrado na região entre o domínio F2 e o domínio transmembrana da proteína EBA10. O fragmento antigênico pode compreender ou consistir do região de cerca de resíduo 746 a cerca de 1045 de EBA 140. Proteínas de fusão Em uma modalidade, uma composição da invenção compreende um polipeptídeo que é uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma outra sequência de polipeptídeos.

O pelo menos um outro polipeptídeo pode ser, por exemplo, um polipeptídeo que melhora a estabilidade de um polipeptídeo da presente invenção, ou um polipeptídeo que auxilia na purificação ou detecção da proteína de fusão, ou preferivelmente um polipeptídeo capaz de elicitar uma resposta imune em um animal, especialmente um humano.

A título de exemplo não limitante, a pelo menos uma outra sequência de polipeptídeos pode compreender um ou mais epítopos de célula T para o recrutamento de células T auxiliares, ou ativação de células T citotóxicas, ou um ou mais antígenos, citocinas e/ou quimiocinas.

Em uma modalidade, o pelo menos um outro polipeptídeo é um polipeptídeo de Plasmodium falciparum.

Preferivelmente, o pelo menos um outro polipeptídeo de Plasmodium falciparum compreende um ou mais epítopos de célula T para o recrutamento de células T auxiliares, e/ou um ou mais motivos MHC de classe I ou MHC de classe II.

Os métodos para a identificação de epítopos de célula T e motivos MHC de classe I e MHC de classe II são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, Rammensee (1995), Ohta et al. (1998), e Singh et al. (2010).

Em uma modalidade particular, o pelo menos um outro polipeptídeo é a proteína-1 superficial de merozoíto (MSP-1), ou um fragmento de pelo menos 50 aminoácidos desta.

Um exemplo de MSP-1 é fornecido como SEQ ID NO: 43 (número de acesso ao Banco de Genes 5 BAF62268.1 e moléculas relacionadas). Exemplos de fragmentos de MSP-1 incluem MSP-1(42) fornecido como SEQ ID NO: 44 e MSP-1(19) fornecido como SEQ ID NO: 45. Além disso, a proteína de fusão pode compreender um ou mais ligadores ou espaçadores.

Um “ligador” ou “espaçador”, da maneira aqui usada, refere-se a um peptídeo, polipeptídeo ou outra molécula, por exemplo, um ligador de carbono de cadeia reta ou ramificada ou ligador de carbono heterocíclico, que pode ser incluído entre dois polipeptídeos em uma proteína de fusão para melhorar a expressão da proteína em uma célula de bactéria ou células de eucarioto, ou para diminuir impedimento estérico de maneira tal que um ou mais dos polipeptídeos na proteína de fusão possa assumir sua estrutura terciária desejada, e/ou interagir de maneira adequada com sua molécula alvo, por exemplo, tal como um receptor de célula B ou receptor de célula T.

Assim, a proteína de fusão pode compreender um ou mais espaçadores antes, após, ou entre um ou mais domínios de polipeptídeo no polipeptídeo de fusão.

Os ligadores adequados são bem conhecidos pelos versados na técnica e incluem, mas sem limitação, ligadores de carbono de cadeia reta ou ramificados, ligadores de carbono heterocíclicos ou peptídeos ligadores.

Para os espaçadores e os métodos de identificar os espaçadores desejados, ver, por exemplo, George, et al. (2003). Em uma modalidade, o espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos que apresentam entre 1-50 resíduos de aminoácidos em tamanho, ou cerca de 1-25 resíduos, ou cerca de 5-15 resíduos em tamanho.

Os exemplos não limitantes de peptídeo ligadores incluem

AAA, GGG, SGG, GGSGGS (SEQ ID NO: 46), SAT, PYP, PSPSP (SEQ ID NO: 47), ASA, ASASA (SEQ ID NO: 48), PSPSP (SEQ ID NO: 49), KKK (SEQ ID NO: 50), RRRR (SEQ ID NO: 51), GGGG (SEQ ID NO: 52), GGGGS (SEQ ID NO: 53), GGGGS GGGGS (SEQ ID NO: 54), GGGGS 5 GGGGS GGGGS GGGGS (SEQ ID NO: 55), GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS (SEQ ID NO: 56), e GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS (SEQ ID NO: 57). Da maneira conhecida na técnica, vários grupos químicos podem ser incorporados no segmento espaçador em vez de aminoácidos.

Os exemplos são descritos em U.S. 5.910.300. Em uma modalidade, o espaçador é compreendido de uma cadeia alifática interrompida de maneira ideal por heteroátomos, por exemplo, um alquileno C2-C6, ou =N-(CH2)2-6-N=. Alternativamente, um espaçador pode ser composto de unidades alternadas, por exemplo, de sequências hidrofóbicas, lipofílicas, alifáticas e aril-alifáticas, opcionalmente interrompidas por heteroátomos tais como O, N ou S.

Tais componentes de um espaçador são preferivelmente escolhidos das seguintes classes de compostos: esteróis, alcoóis de alquila, poliglicerídeos com funções variadas de alquila, alquil-fenóis, alquil-aminas, amidas, polioxialquilenos hidroxifóbicos e similares.

Outros exemplos são polianidretros hidrofóbicos, poliortoésteres, polifosfazenos, ácidos poli-hidróxi, policaprolactonas, ácidos poliláticos, poliglicólicos, poli-hidroxibutíricos.

Um espaçador também pode conter cadeias alifáticas curtas de repetição, tais como polipropileno, isopropileno, butileno, isobutileno, pentametileno e similares, separadas por átomos de oxigênio.

Anticorpos O termo “anticorpo” da maneira usada nesta invenção inclui anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos e humanizados, e inclui moléculas intactas, bem como moléculas que compreendem ou consistem em fragmentos destas, tais como Fab, F(ab')2 e Fv, que são capazes de se ligar a um determinante de epítopo.

Assim, os anticorpos podem existir como imunoglobulinas intactas, ou como modificações em uma variedade de formas incluindo, por exemplo, mas sem limitação, domínios de anticorpos incluindo tanto o domínio VH quanto VL, um dímero da região variável de cadeia 5 pesada (VHH, da maneira descrita para um camelídeo), um dímero da região variável de cadeia leve (VLL), fragmentos Fv contendo apenas as regiões variáveis de cadeia leve e pesada, ou os fragmentos Fd contendo a região variável de cadeia pesada e o domínio CHI.

Uma Fvsc, que consiste em regiões variáveis das cadeias pesadas e leves ligadas juntas para formar um anticorpo de cadeia simples, e oligômeros de Fvscs, tais como diacorpos e triacorpos, são também incluídos pelo termo “anticorpo”. Da maneira destacada anteriormente, são também incluídos os fragmentos de anticorpos tais como Fab, (Fab')2 e FabFc2, que contêm as regiões variáveis e partes das regiões constantes.

Os fragmentos de anticorpo enxertados em CDR e oligômeros de fragmentos de anticorpo também são incluídos.

Os componentes de cadeia pesada e leve de um Fv podem ser derivados do mesmo anticorpo ou de anticorpos diferentes, produzindo por meio disso uma região Fv quimérica.

O anticorpo pode ser de animal (por exemplo camundongo, coelho, galinha ou rato) ou de origem humana, ou pode ser quimérico ou humanizado.

Os anticorpos podem ser regiões Fv que compreendem uma cadeia variável leve (VL) e uma variável pesada (VH). As cadeias leves e pesadas podem ser unidas diretamente ou por meio de um ligador.

Da maneira aqui usada, um ligador refere-se a uma molécula que é covalentemente ligada à cadeia leve e pesada, e fornece espaçamento e flexibilidade suficientes entre as duas cadeias, de maneira tal que sejam capazes de atingir uma conformação na qual são capazes de se ligar especificamente ao epítopo para o qual são direcionados.

As proteína ligadoras são particularmente preferidas, uma vez que podem ser expressas como um componente intrínseco da poção

Ig do polipeptídeo de fusão.

Da maneira aqui usada, o termo “se liga especificamente” pode ser obtido para significar uma proteína da invenção que reage ou se associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com 5 maior afinidade com um antígeno particular, ou antígenos ou célula que expressa os mesmos, do que com antígenos ou células alternativas.

Por exemplo, uma proteína que se liga especificamente a um antígeno se liga a este antígeno com maior afinidade, avidez, mais facilmente, e/ou com maior duração do que se liga a outros antígenos.

É também entendido pela leitura desta definição que, por exemplo, uma proteína que se liga especificamente a um primeiro antígeno pode ou não se ligar especificamente a um segundo antígeno.

Como tal, “ligação específica” não exige necessariamente a ligação exclusiva ou ligação não detectável de um outro antígeno, isto é incluído pelo termo “ligação seletiva”. Em geral, mas não necessariamente, a referência aos meios de ligação significa ligação específica, e cada termo pode ser entendido para fornecer suporte explícito para o outro termo.

O anticorpo pode ser marcado de maneira detectável, por exemplo, tal como marcado com uma marca fluorescente (por exemplo, FITC ou Texas Red), radiomarcado, ou um por enzima (por exemplo peroxidase de rábano silvestre (HRP)), fosfatase alcalina (AP) ou β-galactosidase.

Uma variedade de formatos de imunoensaios pode ser usada para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com os polipeptídeos da invenção.

Por exemplo, a marcação superficial e a análise de citometria de fluxo ou imunoensaios de ELISA de fase sólida são usados rotineiramente para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína ou carboidrato.

Ver, Harlow & Lane (supra) para uma descrição de formatos de imunoensaio e condições que podem ser usadas para determinar imunorreatividade específica.

Polinucleotídeos

“Polinucleotídeo isolado” significa um polinucleotídeo que foi em geral separado das sequências de polinucleotídeos com as quais é associado ou ligado em seu estado natural.

Preferivelmente, o polinucleotídeo isolado é pelo menos 60 % livre, mais preferivelmente pelo menos 75 % livre, 5 e mais preferivelmente pelo menos 90 % livre de outros componentes com os quais é naturalmente associado.

Além do mais, o termo “polinucleotídeo” é aqui usado indiferentemente com os termos “molécula de ácido nucleico “, “gene” e “RNAm”. O termo “exógeno” no contexto de um polinucleotídeo refere- se ao polinucleotídeo quando presente em uma célula, ou em um sistema de expressão livre de célula, em uma quantidade alterada, comparado ao seu estado natural.

Em uma modalidade, a célula é uma célula que não compreende naturalmente o polinucleotídeo.

Entretanto, a célula pode ser uma célula que compreende um polinucleotídeo não endógeno resultante em uma quantidade alterada, preferivelmente maior, de produção do polipeptídeo codificado.

Um polinucleotídeo exógeno da invenção inclui polinucleotídeos que não foram separados de outros componentes da célula transgênica (recombinante), ou sistema de expressão livre de célula, no qual está presente, e polinucleotídeos produzidos em tais células ou sistemas livres de célula que são subsequentemente purificados a partir de pelo menos alguns outros componentes. “Polinucleotídeo”, da maneira aqui usada, refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou qualquer fragmento deste.

Pode ser de origem genômica de DNA ou RNA, ou de origem sintética, fita dupla ou fita simples, e combinado com carboidrato, lipídeos, proteína, ou outros materiais para realizar uma atividade particular aqui definida.

O % de identidade de um polinucleotídeo é determinado pela análise GAP (Needleman e Wunsch, 1970) (programa GCG) com uma penalidade de criação de intervalo= 5, e uma penalidade de extensão de intervalo= 0,3. A sequência de consulta apresenta pelo menos 45 nucleotídeos em tamanho, e a análise GAP alinha as duas sequências com uma região de pelo menos 45 nucleotídeos.

Preferivelmente, a sequência de consulta apresenta pelo menos 150 nucleotídeos em tamanho, e a análise GAP alinha 5 as duas sequências com uma região de pelo menos 150 nucleotídeos.

Ainda mais preferivelmente, a sequência de consulta apresenta pelo menos 300 nucleotídeos em tamanho e a análise GAP alinha as duas sequências com uma região de pelo menos 300 nucleotídeos.

Mais preferivelmente, as duas sequências são alinhadas com seu tamanho total.

Com relação aos polinucleotídeos definidos, será entendido que as figuras com % de identidade maior que aquele fornecido anteriormente incluirão as modalidades preferidas.

Assim, onde aplicável, à luz do % mínimo da identidade das figuras, é preferível que o polinucleotídeo compreenda uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 40 %, mais preferivelmente pelo menos 45 %, mais preferivelmente pelo menos 50 %, mais preferivelmente pelo menos 55 %, mais preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 76 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 91 %, mais preferivelmente pelo menos 92 %, mais preferivelmente pelo menos 93 %, mais preferivelmente pelo menos 94 %, mais preferivelmente pelo menos 95 %, mais preferivelmente pelo menos 96 %, mais preferivelmente pelo menos 97 %, mais preferivelmente pelo menos 98 %, mais preferivelmente pelo menos 99 %, mais preferivelmente pelo menos 99,1 %, mais preferivelmente pelo menos 99,2 %, mais preferivelmente pelo menos 99,3 %, mais preferivelmente pelo menos 99,4 %, mais preferivelmente pelo menos 99,5 %, mais preferivelmente pelo menos 99,6 %, mais preferivelmente pelo menos 99,7 %, mais preferivelmente pelo menos 99,8 %, e ainda mais preferivelmente pelo menos 99,9 % idêntica à SEQ ID NO relevante determinada.

Os polinucleotídeos da presente invenção podem possuir, quando comparados às moléculas de ocorrência natural, uma ou mais 5 mutações que são eliminações, inserções, ou substituições de resíduos de nucleotídeo.

Os mutantes podem ser tanto de ocorrência natural (isto é, isolados de uma fonte natural) quanto sintéticos (por exemplo, realizando mutagênese sítio-direcionada ou embaralhamento de DNA no ácido nucleico, da maneira descrita anteriormente). Assim, é evidente que os polinucleotídeos da invenção podem ser tanto de ocorrência natural quanto recombinantes.

Os polinucleotídeos da invenção incluem aqueles que hibridizam em condições severas em um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 50 % idêntica, preferivelmente pelo menos 70 % idêntica, mais preferivelmente pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: l , SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 42. O termo “condições de hibridização severas” e similares, da maneira aqui usada, refere-se aos parâmetros com os quais a técnica é familiar, incluindo a variação da temperatura de hibridização com o tamanho de um oligonucleotídeo.

Os parâmetros da hibridização de ácido nucleico podem ser encontrados em referências que agrupam tais métodos, Sambrook, et al. (supra), e Ausubel, et al. (supra). Por exemplo, condições de hibridização “moderadamente severas”, da maneira aqui usada, podem se referir à hibridização a 20 °C a 64 °C, em SSC 3,5X, 0,1 % p/v de SDS, e as condições de “alta severidade” podem se referir à hibridização a 65 °C em SSC 0,2 X, 0,02 % de Ficoll, 0,02 % de polivinil pirrolidona, 0,02 % de albumina sérica bovina, NaH2PO4 2,5 mM (pH7), 0,5 % de SDS, EDTA 2 mM.

Vetores e células hospedeiras Uma modalidade da presente invenção inclui um vetor recombinante, que compreende pelo menos uma molécula de polinucleotídeo isolado da presente invenção, inserido em qualquer vetor capaz de distribuir o polinucleotídeo molécula em uma célula hospedeira.

Um vetor como este contém sequências heterólogas de polinucleotídeos, isto é, sequências de polinucleotídeos que não são encontradas naturalmente adjacentes às 5 moléculas de polinucleotídeo da presente invenção, e que são preferivelmente derivadas de uma espécie sem ser a espécie a partir da qual a(s) molécula(s) de polinucleotídeo é(são) derivada(s). O vetor pode ser tanto RNA quanto DNA, tanto procariótico quanto eucariótico, e pode ser um transposon, um vírus ou um plasmídeo. “Operavelmente ligado”, da maneira aqui usada, refere-se a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de ácido nucleico (por exemplo, DNA). Tipicamente, refere-se à relação funcional de um elemento regulatório transcricional em uma sequência transcrita.

Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado a uma sequência codificante, tal como um polinucleotídeo aqui definido, se estimular ou modular a transcrição da sequência codificante em uma célula apropriada.

Em geral, os elementos regulatórios transcricionais promotores, que são operavelmente ligados a uma sequência transcrita, são fisicamente contíguos à sequência transcrita, isto é, apresentam ação cis.

Entretanto, alguns elementos regulatórios transcricionais, tais como melhoradores, não precisam ser contíguos ou localizados em muita proximidade com as sequências codificantes, cuja transcrição eles melhoraram.

Da maneira aqui usada, um vetor de expressão é um vetor de DNA ou RNA que é capaz de transformar uma célula hospedeira e de realizar a expressão de uma molécula especificada de polinucleotídeo.

Preferivelmente, o vetor de expressão é também capaz de replicar na célula hospedeira.

Os vetores de expressão podem ser tanto procarióticos quanto eucarióticos, e são tipicamente vírus ou plasmídeos.

Os vetores de expressão da presente invenção incluem qualquer dos vetores que funcionam (isto é,

direcionam a expressão do gene) em células recombinantes da presente invenção, incluindo em células bacterianas, fúngicas, de endoparasita, artrópode, animal e de planta.

Em particular, os vetores de expressão da presente invenção 5 contêm sequências regulatórias, tais como sequências de controle de transcrição, sequências de controle de tradução, origens de replicação, e outras sequências regulatórias que são compatíveis com a célula recombinante e que controlam a expressão de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção.

Em particular, os vetores de expressão da presente invenção incluem sequências de controle de transcrição.

As sequências de controle de transcrição são sequências que controlam o início, alongamento e finalização da transcrição.

As sequências de controle de transcrição particularmente importantes são aquelas que controlam o início da transcrição, tais como sequências promotoras, melhoradoras, funcionais e repressoras.

As sequências de controle de transcrição adequadas incluem qualquer sequência de controle de transcrição que pode funcionar em pelo menos uma das células recombinantes da presente invenção.

Uma variedade de tais sequências controle de transcrição é conhecida pelos versados na técnica.

As moléculas recombinantes da presente invenção também podem (a) conter sinais secretórios (isto é, sequências de ácido nucleico de segmento sinal) para possibilitar que um polipeptídeo expresso da presente invenção seja secretado da célula que produz o polipeptídeo, e/ou (b) conter sequências de fusão que levam à expressão de moléculas de ácido nucleico da presente invenção como proteínas de fusão.

Exemplos de segmentos sinais adequados incluem qualquer segmento sinal capaz de direcionar a secreção de um polipeptídeo da presente invenção.

As moléculas recombinantes também podem incluir sequências de intervenção e/ou não traduzidas que circundam, e/ou estão na nas sequências de ácido nucleico das moléculas de ácido nucleico da presente invenção.

Uma outra modalidade da presente invenção inclui uma célula hospedeira que compreende uma ou mais moléculas recombinantes da presente invenção.

A transformação de uma molécula de polinucleotídeo em uma célula pode ser realizada por qualquer método, por meio do qual uma 5 molécula de polinucleotídeo pode ser inserida na célula.

As técnicas de transformação incluem, mas sem limitação, transfecção, eletroporação, microinjeção, lipofecção, adsorção e fusão de protoplasto.

Uma célula recombinante pode permanecer unicelular ou pode crescer em um tecido, órgão ou um organismo multicelular.

As moléculas transformadas de polinucleotídeo da presente invenção podem permanecer extracromossomicamente, ou podem se integrar em um ou mais sítios em um cromossomo da célula transformada (isto é, recombinante), de uma maneira tal que sua capacidade de ser expressa seja mantida.

As células hospedeiras adequadas para transformação incluem qualquer célula que pode ser transformada com um polinucleotídeo da presente invenção.

As células hospedeiras da presente invenção podem tanto ser capazes de produzir endogenamente (isto é, naturalmente) os polipeptídeos da presente invenção, quanto podem ser capazes de produzir tais polipeptídeos após serem transformadas com pelo menos uma molécula de polinucleotídeo da presente invenção.

As células hospedeiras da presente invenção podem ser qualquer célula capaz de produzir pelo menos uma proteína da presente invenção, e incluem células animais, vegetais, bacterianas, fúngicas (incluindo leveduras), de parasita e artrópode.

Preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, por exemplo, E. coli.

As tecnologias do DNA recombinante podem ser usadas para melhorar a expressão de uma molécula transformada de polinucleotídeo manipulando, por exemplo, o número de cópias da molécula de polinucleotídeo em uma célula hospedeira, a eficiência com que estas moléculas de polinucleotídeo são transcritas, a eficiência com a qual os transcritos resultantes são traduzidos, e a eficiência de modificações pós- translacionais.

As técnicas recombinantes usadas para aumentar a expressão de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção incluem, mas sem 5 limitação, moléculas de polinucleotídeo operavelmente ligadas aos plasmídeos com número de cópia elevado, integração da molécula de polinucleotídeo em um ou mais cromossomos da célula hospedeira, adição de sequências de estabilidade de vetor ao plasmídeos, substituições ou modificações de sinais de controle de transcrição (por exemplo, promotores, operadores, melhoradores), substituições ou modificações de sinais de controle de tradução (por exemplo, sítios de ligação de ribossomo, sequências de Shine-Dalgarno), modificação de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção para corresponder ao uso do códon da célula hospedeira, e a eliminação de sequências que desestabilizam os transcritos.

Composições e administração A presente invenção fornece composições que compreendem o polipeptídeo, incluindo fragmentos antigênicos, aqui definidos.

Em uma modalidade, a composição é uma composição imunogênica.

Uma “composição imunogênica” refere-se a uma composição que compreende materiais que elicitam uma resposta imune desejada e inclui uma “vacina”. O termo “vacina” inclui qualquer composição que induz uma respostas imune pelo menos parcialmente protetora contra um patógeno alvejado ou que protege eficientemente contra o patógeno; por exemplo, após administração ou injeção no sujeito (por exemplo, um mamífero tal como um humano), elicita uma resposta imune pelo menos parcialmente protetora contra o patógeno alvejado ou fornece proteção eficiente contra o patógeno (por exemplo, Plasmodium falciparum). Induzir uma reposta imune “pelo menos parcialmente protetora” significa que uma vacina reduz a infecção e/ou reduz pelo menos um sintoma causado pela infecção com um patógeno que expressa pelo menos um polipeptídeo da maneira aqui definida.

Uma composição imunogênica pode selecionar, ativar ou expandir células do sistema imune, incluindo células de memória B e T, por exemplo, para possibilitar a eliminação de agentes infecciosos, tais como 5 patógenos que expressam pelo menos um polipeptídeo da maneira aqui definida.

Em algumas modalidades, uma composição imunogênica inclui um carreador adequado, tal como um adjuvante, que é um agente que age de uma maneira não específica para aumentar a resposta imune a um antígeno específico, ou a um grupo de antígenos, possibilitando a redução da quantidade de antígeno em qualquer dose desejada, ou a redução da frequência de dosagem exigida para gerar a resposta imune desejada.

Uma resposta imune desejada pode incluir, por exemplo, a proteção total ou parcial contra infecção por uma espécie de Plasmodium, ou a proteção total ou parcial para desenvolver um ou mais sintomas de malária.

Por exemplo, uma resposta imune desejada pode incluir qualquer valor entre 10 % a 100 %, por exemplo, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de proteção contra infecção por Plasmodium em um sujeito vacinado, quando comparada a um sujeito não vacinado.

Os adjuvantes são usados para melhorar a resposta imune e/ou aumentar a estabilidade de preparações de vacina.

Os adjuvantes são descritos tipicamente como estimuladores não específicos do sistema imune, mas também podem ser usados para alvejar braços específicos do sistema imune.

Um ou mais compostos que apresentam esta atividade podem ser adicionados à vacina.

Portanto, vacinas particulares da presente invenção compreendem adicionalmente um adjuvante.

Exemplos de compostos químicos que podem ser usados como adjuvantes incluem, mas sem limitação, compostos de alumínio (por exemplo, alúmen, hidróxido de alumínio), óleos metabolizáveis e não metabolizáveis, óleos minerais, incluindo derivados de oleato de manida em solução de óleo mineral (por exemplo, MONTANIDE ISA 70 da Seppic SA, França), e óleos minerais leves tais como DRAKEOL 6VR, polímeros bloco, ISCOM's (complexos de estimulação do sistema imune), vitaminas e minerais (incluindo, mas sem limitação: vitamina E, vitamina A, selênio e 5 vitamina B12), adjuvantes à base de saponina (por exemplo, da maneira descrita em Sun et al. (2009)) e CARBOPOL®. Outros adjuvantes adequados, que algumas vezes foram referenciados como estimulantes imunes incluem, mas sem limitação: citocinas, fatores de crescimento, quimiocinas, sobrenadantes das culturas de célula de linfócitos, monócitos, células de órgãos linfoides, preparações e/ou extratos celulares de plantas, bactérias ou parasitas (preparações de Staphylococcus aureus ou lipopolissacarídeos) ou mitógenos.

Os adjuvantes específicos incluem MPL, adjuvantes dos sistemas de adjuvantes GS, tal como a faixa AS, por exemplo, AS01, AS02, AS03, AS04, AS15, frações de Quillaja saponaria tais como a fração QH-B, frações QS-7, QS-17, QS-18 e QS-21 (Antigenics, Nova Iorque, N.Y.). Detalhes adicionais com relação aos adjuvantes adequados são fornecidos nas passagens a seguir.

As composições contendo mineral adequadas para uso como adjuvantes na invenção incluem sais minerais, tais como sais de alumínio e sais de cálcio.

A invenção inclui sais minerais tais como hidróxidos (por exemplo oxihidróxidos), fosfatos (por exemplo hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. (por exemplo, ver capítulos 8 & 9 de Powell & Newman (eds.) Vaccine Design (1995) Plena), ou misturas de diferentes compostos minerais, com os compostos obtendo qualquer forma adequada (por exemplo, gel, forma cristalina, amorfa, etc.), e com adsorção sendo preferida.

As composições contendo mineral também podem ser formuladas como uma partícula de sal metálico (WO 00/23105). Um adjuvante de fosfato de alumínio típico é hidroxifosfato de alumínio amorfo, com razão molar de PO4/Al entre 0,84 e 0,92, incluída em

0,6 mg de Al3+/mL.

A adsorção com uma dose baixa de fosfato de alumínio pode ser usada, por exemplo, entre 50 e 100 μg de Al3+ por conjugado por dose.

Onde um fosfato de alumínio é usado e deseja-se não adsorver um antígeno com o adjuvante, isto é favorecido incluindo íons de fosfato livre em 5 solução (por exemplo, pelo uso de um tampão fosfato). As composições de emulsão oleosa adequadas para uso como adjuvantes na invenção incluem emulsões óleo em água e emulsões água em óleo.

Uma emulsão óleo em água submícron pode incluir esqualeno, Tween 80 e Span 85, por exemplo, com uma composição em volume de cerca de 5 % de esqualeno, cerca de 0,5 % de polissorbato 80 e cerca de 0,5 % de Span 85 (em termos de peso, 4,3 % de esqualeno, 0,5 % de polissorbato 80 e 0,48 % de Span 85), conhecida como 'MF595' (57-59, capítulo 10 de Powell & Newman (eds.) Vaccine Design (1995) Plenum; capítulo 12 de O'Hagen (ed.) Vaccina Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 de Methods in Molecular Medicine series)). A emulsão MF59 inclui vantajosamente íons citrato, por exemplo, tampão citrato de sódio 10 mM.

Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e Tween 80 pode ser usada.

A emulsão pode incluir salina tamponada com fosfato.

Também pode incluir Span 85 (por exemplo, em 1 %) e/ou lecitina.

Estas emulsões podem apresentar de 2 a 10 % de esqualeno, de 2 a 10 % de tocoferol e de 0,3 a 3 % de Tween 80, e a razão de peso de esqualeno tocoferol é preferivelmente <1, uma vez que fornece uma emulsão mais estável.

Uma emulsão como esta pode ser preparada dissolvendo Tween 80 em PBS para fornecer uma solução a 2 %, a seguir misturando 90 mL desta solução com uma mistura de (5 g de DL-α-tocoferol e 5 mL de esqualeno), e a seguir microfluidizando a mistura.

A emulsão resultante pode apresentar gotas de óleo submícron, por exemplo, com um diâmetro médio entre 100 e 250 nm, preferivelmente cerca de

180 nm.

Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100) podem ser usados.

Uma emulsão de esqualeno, polissorbato 80 e poloxâmero 401 (“Pluronic™ L 121”) pode ser 5 usada.

A emulsão pode ser formulada em salina tamponada com fosfato, pH 7,4. Esta emulsão é um veículo de distribuição usado para dipeptídeos de muramila, e foi usada com treonil-MDP no adjuvante “SAF-I”, (0,05-1 % de Thr-MDP, 5 % de esqualeno, 2,5 % de Pluronic L 121 e 0,2 % de polissorbato 80). Também pode ser usada sem o Thr-MDP, assim como no adjuvante “AF” (Hariharan et al. (1995) Cancer Res 55:3486-9) (5 % de esqualeno, 1,25 % de Pluronic L121 e 0,2 % de polissorbato 80). A microfluidização é preferida.

O adjuvante completo de Freund (CFA) e o adjuvante incompleto de Freund (IFA) também pode ser usado.

As formulações de saponina também podem ser usadas como adjuvantes na invenção (ver, por exemplo, capítulo 22 de Powell & Newman (eds.) Vaccine Design (1995) Plena). As saponinas são um grupo heterólogo de esteróis glicosídeos e glicosídeos triterpenoides que são encontradas na casca, formas, troncos, raízes e ainda nas flores de uma ampla faixa de espécies de planta.

A saponina da casca da árvore de Quillaia saponaria Molina foi amplamente estudada como adjuvante.

A saponina também pode ser obtida comercialmente da Smilax ornata (salsaparrilha), Gypsophilla paniculata (véu de noiva) e Saponaria officianalis (erva saboeira). As formulações do adjuvante saponina incluem formulações purificadas, tal como QS21, bem como formulações de lipídeo, tais como ISCOMs.

QS21 é comercializado como Stimulon™. As composições de saponina foram purificadas usando HPLC e RP-HPLC.

As frações purificadas específicas usando estas técnicas foram identificadas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C.

Preferivelmente, a saponina é QS21. As formulações de saponina também podem compreender um esterol, tal como colesterol (WO 96/33739). Da maneira discutida supra, as combinações de saponinas e colesteróis podem ser usadas para formar partículas exclusivas denominadas complexos de imunoestimulação (ISCOMs) (ver, por exemplo, capítulo 23 de 5 Powell & Newman (eds.) Vaccine Design (1995) Plena). ISCOMs também incluem tipicamente um fosfolipídeo tal como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina.

Qualquer saponina conhecida pode ser usada em ISCOMs.

Preferivelmente, o ISCOM inclui um ou mais de QuilA, QHA e QHC.

Os ISCOMs são descritos adicionalmente em WO 96/33739, EP-A-0109942, WO 96/1171 1). Opcionalmente, os ISCOMS podem ser desprovidos de detergente adicional WO 00/07621. Os virossomas e partículas semelhantes a vírus (VLPs) também podem ser usados como adjuvantes na invenção.

Estas estruturas contêm em geral uma ou mais proteínas de um vírus opcionalmente combinado ou formulado com um fosfolipídeo.

São em geral não patogênicos, não replicantes e geralmente não contêm nenhum genoma viral natural.

As proteínas virais podem ser produzidas recombinantemente ou isoladas dos vírus na íntegra.

Estas proteínas virais, adequadas para uso em virossomas ou VLPs, incluem proteínas derivadas de influenza vírus (tal como HA ou NA), vírus da hepatite B (tal como parte principal ou proteínas do capsídeo), vírus da hepatite E, vírus do sarampo, vírus Sindbis, rotavírus, vírus da doença da febre aftosa, retrovírus, Norwalk vírus, papiloma vírus humano, HIV, fagos de RNA, fago Qβ (tais como proteínas revestidas), fago GA, fago fr, fago AP205, e Ty (tal como proteína pi de retrotransposon Ty). As VLPs são discutidas adicionalmente em WO03/024480 e WO03/024481. Os adjuvantes adequados para uso na invenção incluem derivados bacterianos ou microbianos, tais como derivados não tóxicos de lipopolissacarídeos enterobacterianos (LPS), derivados de lipídeo A, oligonucleotídeos imunoestimulatórios e toxinas de ADP-ribosilação e derivados desintoxicados destas. Os derivados não tóxicos de LPS incluem monofosforil lipídeo A (MPL) e MPL 3-0-desacilado (3dMPL). 3dMPL é uma mistura de monofosforil lipídeo A 3 de-O-acilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Uma 5 forma de “particular pequena” preferida de 3 monofosforil lipídeo A de-O- acilado é revelada em ref. 77. Tais “partículas pequenas” de 3dMPL são pequenas o suficiente para passarem por filtros com uma membrana de 0,22 μm (EP-A-0689454). Outros derivados não tóxicos de LPS incluem miméticos de monofosforil lipídeo A, tais como derivados de aminoalquil glucosamina de fosfato, por exemplo, RC-529. Os derivados de lipídeo A incluem derivados de lipídeo A de E. coli, tal como OM-174. OM- 174. Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem sequências de nucleotídeos contendo um motivo CpG (uma sequência de dinucleotídeo contendo uma citosina não metilada ligada por uma ligação fosfato a uma guanosina). Também observou-se que os RNAs de fita dupla e os oligonucleotídeos contendo sequências palindrômicas ou poli(dG) são imunoestimulatórios. Os CpG podem incluir modificações de nucleotídeo/análogos, tais como fosforotioato, e podem ser de fita dupla ou fita simples. WO02/26757 e W099/62923 revelaram possíveis substituições de análogo, por exemplo, substituição de guanosina com 2'-desóxi-7-deazaguanosina. O efeito do adjuvante de oligonucleotídeos de CpG é discutido adicionalmente em WO 98/40100, U.S.

6.207.646, U.S. 6.239.116 e U.S. 6.429.199. A sequência de CpG pode ser direcionada a TLR9, tal como o motivo GTCGTT ou TTCGTT. A sequência de CpG pode ser específica para induzir uma resposta imune TH1, tal como uma CpG-A ODN, ou pode ser mais específica para induzir uma resposta de célula B, tal como CpG-B ODN. CpG-A e CpG-B ODNs. Preferivelmente, o oligonucleotídeo de CpG é construído de maneira que a extremidade 5' seja acessível para reconhecimento do receptor. Opcionalmente, as duas sequências de oligonucleotídeo de CpG podem ser anexadas em suas extremidades 3' para formar “imunômeros” (ver, por exemplo, WO03/035836). Outros oligonucleotídeos imunoestimulatórios incluem um 5 RNA de dupla fita ou um oligonucleotídeo contendo uma sequência palindrômica, ou um oligonucleotídeo contendo uma sequência poli(dG). As toxinas de ADP-ribosilação bacterianas e os derivados desintoxacados destas podem ser usados como adjuvantes na invenção.

Preferivelmente, a proteína é derivada de E. coli (enterotoxina termolábil “LT” de E. coli), cólera (“CT”) ou pertussis (“PT”). O uso de toxinas de ADP-ribosilação desintoxicadas como adjuvantes de mucosa é descrito em WO 95/17211 e como adjuvantes parenterais em WO 98/42375. A toxina ou toxoide está preferivelmente na forma de uma holotoxina, que compreende tanto as subunidades A quanto B.

Preferivelmente, a subunidade A contém uma mutação de desintoxicação; preferivelmente a subunidade B não é mutada.

Preferivelmente, o adjuvante é um mutante desintoxicado de LT, tais como LT-K63, LT-R72 e LT-G192. Os imunomoduladores humanos adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-I5 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23, IL- 27), interferons (por exemplo, interferon-γ), fator estimulador de colônia de macrófago, fator de necrose tumoral e proteína inflamatória de macrófago-1 alfa (MIP-1 alfa) e MIP-1 beta.

Os bioadesivos e mucoadesivos também podem ser usados como adjuvantes na invenção.

Os bioadesivos adequados incluem microesferas de ácido hialurônico esterificadas ou mucoadesivas, tais como derivados reticulados de ácido poli(acrílico), álcool polivinílico, polivinil pirolidona, polissacarídeos e carboximetilcelulose.

A quitosana e os derivados desta também podem ser usados como adjuvantes na invenção (WO

99/27960). As micropartículas também podem ser usadas como adjuvantes na invenção. As micropartículas (isto é, uma partícula de ~100 nm a ~150 μm em diâmetro, mais preferivelmente ~200 nm a ~30μm em 5 diâmetro, e mais preferivelmente ~500 nm a ~10μm em diâmetro) formadas a partir de materiais que são biodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um ácido poli(α-hidróxi), um ácido poli-hidroxibutírico, um poliortoéster, um polianidreto, uma policaprolactona, etc.), com poli(lactídeo-co-glicolídeo) são preferidas, opcionalmente tratadas para apresentar uma superfície carregada negativamente (por exemplo, com SDS) ou uma superfície carregada positivamente (por exemplo, com um detergente catiônico, tal como CTAB). Os exemplos de formulações adequadas de lipossomo para uso como adjuvantes são descritos na patente U.S. 6.090.406, patente U.S.

5.916.588, EP-A-0626169. Os adjuvantes adequados para uso na invenção incluem éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno (WO 99/52549). Tais formulações adicionais incluem agentes tensoativos de ésteres de polioxietileno sorbitano em combinação com um octoxinol (WO 01/21207), bem como éteres de alquil polioxietileno ou agentes tensoativos de éster em combinação com pelo menos um agente tensoativos adicional não iônico, tal como um octoxinol (WO 01/21152). Os éteres de polioxietileno preferidos são selecionados do grupo a seguir: polioxietileno-9-lauril éter (Laureth 9), polioxietileno-9-esteoril éter, polioxitileno-8-esteoril éter, polioxietileno-4- lauril éter, polioxietileno-35-lauril éter, e polioxietileno-23-lauril éter. Os adjuvantes de fosfazeno incluem poli(di(carboxilatofenóxi) fosfazeno) (“PCPP”). Os exemplos de peptídeos de muramila adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem N-acetil-muramil-L-treonil-D- isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-

MDP), e N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'- dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE). Os adjuvantes de imidazoquinolina incluem Imiquimod (“R- 837”) (U.S. 4.680.338 e U.S. 4.988.815), Resiquimod (“R-848”) 5 (WO92/15582) e seus análogos, e sais destes (por exemplo, os sais cloridrato). Os detalhes adicionais sobre as imidazoquinolinas imunoestimulatórias podem ser observados nas patentes U.S. 4689338, 4929624, 5238944, 5266575, 5268376, 5346905, 5352784, 5389640, 5395937, 5482936, 5494916, 5525612, 6083505, 6440992, 6627640, 6656938, 6660735, 6660747, 6664260, 6664264, 6664265, 6667312, 6670372, 6677347, 6677348, 6677349, 6683088, 6703402, 6743920, 6800624, 6809203, 6888000 e 6924293. Os adjuvantes de tiosemicarbazona incluem aqueles revelados em WO 2004/060308. Os métodos de formular, produzir e selecionar os compostos ativos também são descritos em WO 2004/060308. As tiosemicarbazonas são particularmente eficientes na estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano para a produção de citocinas, tal como TNF-α. Os adjuvantes de triptantrina incluem aqueles revelados em WO 2004/064759. Os métodos de formular, produzir e selecionar compostos ativos também são revelados em WO 2004/064759. As tiosemicarbazonas são particularmente eficientes na estimulação de células mononucleares de sangue periférico humano para a produção de citocinas, tal como TNF-α. Os vários análogos de nucleosídeo podem ser usados como adjuvantes, tais como (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia- 8-oxoguanosina) e pró-medicamentos desta; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) os compostos revelados em U.S. 6.924.271, U.S. 2005/0070556 e U.S.

5.658.731 , ou (f) um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer de (a) a (g), um tautômero de qualquer de (a) a (g), ou um sal farmaceuticamente aceitável do tautômero.

Os imunopotencializadores de molécula pequena usados como adjuvantes incluem N2-metil-l-(2-metilpropil)-1H-imidazo(4,5-c)quinolina- 2,4-diamina; N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo(4,5-c)quinolina- 5 2,4-diamina; N2-etil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo(4,5-c)quinolina- 2,4-diamina; N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo(4,5- c)quinolina-2,4-diamina; l-(2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo(4,5- c)quinolina-2,4-diamina; N2-butil-1-(2-metilpropil)- 1H-imidazo(4,5- c)quinolina-2,4-diamina; N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H- imidazo(4,5-c)quinolina-2,4-diamina; N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-pentil- 1H-imidazo(4,5-c)quinolina-2,4-diamina; N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2- prop-2-enil-1H-imidazo(4,5-c)quinolina-2,4-diamina; 1-(2-metilpropil)-2- ((fenilmetil)tio)-lH-imidazo (4,5-c)quinolin-4-amina; 1-(2-metilpropil)-2- (propiltio)-1H-imidazo(4,5-c)quinolin-4-amina; 2-((4-amino-1-(2- metilpropil)-1H-imidazo(4,5-c)quinolin-2-il)(metil)amino)etanol; acetato de 2-((4-amino-l -(2-metilpropil)-1H-imidazo(455-c)quinolin-2- il)(metil)amino)etila; 4-amino-l-(2-metilpropil)-1,3-diidro-2H-imidazo(4,5- c)quinolin-2-ona; N2-butil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1 H- imidazo(4,5-c)quinolina-2,4-diamina; N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)- N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo(4,5-c)quinolina-2,4-diamina; N2-metil-1- (2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo(4,5-c)quinolina-2,4- diamina; N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H- imidazo(4,5-c)quinolina-2,4-diamina; 1-(4-amino-2-(metil(propil)amino)-1H- imidazo(4,5-c)quinolin-1-il)-2-metilpropan-2-ol; 1-(4-amino-2-(propilamino)- 1H-imidazo(4,5-c)quinolin-1-il)-2-metilpropan-2-ol; N43N4-dibenzil-1-(2- metóxi-2-metilpropil)-N2propil-1H-imidazo(4,5-c)quinolina-2,4-diamina.

Um adjuvante potencialmente usado é uma preparação de proteossoma da proteína da membrana externa, sintetizada a partir de uma primeira bactéria Gram-negativa em combinação com uma preparação de lipopolissacarídeo derivada de uma segunda bactéria Gram-negativa, em que o proteossoma da proteína da membrana externa e preparações de lipopolissacarídeos formam um complexo adjuvante não covalente estável.

Tais complexos incluem “IVX-908”, um complexo compreendido de 5 membrana externa e lipopolissacarídeos de Neisseria meningitidis.

Foram usados como adjuvantes para vacinas contra influenza (WO 02/072012). Outras substâncias que agem como agentes imunoestimulantes são revelados em Vaccine Design ((1995) eds.

Powell & Newman.

ISBN: 030644867X.

Plena) e Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 de Methods in Molecular Medicine series) (ISBN: 1- 59259-083-7. Ed.

O'Hagan). As substâncias adjuvantes adicionais usadas incluem: Metil inosina 5'-monofosfato (“MIMP”); um composto de pirrolizidina poli-hidroxilada (WO 2004/064715), os exemplos incluem, mas sem limitação: casuarina, casuarina-6-α-D-glicopiranose, 3-epz-casuarina, 7- epz-casuarina, 3,7-diepz-casuarina, etc; uma gama inulina ou derivado desta tal como algamulina; compostos revelados em PCT US2005/022769; compostos revelados em WO 2004/87153 incluindo: compostos de acilpiperazina, compostos de indolediona, compostos de tetraidraisoquinolina (THIQ), compostos de benzociclodiona, compostos de aminoazavinil, compostos de aminobenzimidazol quinolinona (ABIQ) (U.S. 6.606.617, WO 02/018383), compostos de hidraftalamida, compostos de benzofenona, compostos de isoxazol, compostos de esterol, compostos de quinazilinona, compostos de pirrol (WO 04/018455), compostos de antraquinona, compostos de quinoxalina, compostos de triazina, compostos de pirazalopirimidina e compostos de benzazol (WO 03/082272); loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) (U.S. 5.011.828); uma formulação de um lipídeo catiônico e um colipídeo (em geral neutro), tal como aminopropil-dimetil-miristoleiloxi-brometo de propanamínio-difitanoilfosfatidil-etanolamina (“Vaxfectin™”) ou aminopropil-dimetil-bis-dodeciloxi-brometo de propanamínio-

dioleoilfosfatidil-etanolamina (“GAP-DLRIE:DOPE”). Formulações contendo sais de (±)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9- tetradecenoiloxi)-l-propanamínio são preferidas (U.S. 6.586.409). A invenção também pode compreender combinações de 5 aspectos de um ou mais dos adjuvantes identificados anteriormente.

Por exemplo, as composições a seguir de adjuvante podem ser usadas na invenção: (I) uma saponina e uma emulsão óleo em água (WO 99/11241); (2) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado não tóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL) (WO 94/00153); (3) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado não tóxico de LPS (por exemplo 3dMPL) + um colesterol; (4) uma saponina (por exemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + um esterol) (WO 98/57659); (5) combinações de 3dMPL com, por exemplo, QS21 e ou emulsões óleo em água (EP 0835318, EP 0735898, EP 0761231); (6) sistema adjuvante de RibiTM (RAS), (Ribi Immunochem) contendo 2 % de esqualeno, 0,2 % de Tween 80 e uma ou mais componentes da parede celular bacteriana do grupo que consiste em monofosforil lipídeo A (MPL), dimicolato de trealose (TDM) e o esqueleto da parece celular (CWS), preferivelmente MPL + CWS (Detox™); e (7) um ou mais sais minerais (tal como um sal de alumínio) + um derivado não tóxico de LPS (tal como 3dMPL). Em geral, um adjuvante é administrado ao mesmo tempo que o antígeno.

Entretanto, os adjuvantes também podem ser alternativamente administrados um período de duas semanas antes da vacinação, e/ou por um período de tempo após a vacinação, isto é, enquanto o antígeno persistir nos tecidos.

A vacina pode ser administrada de várias maneiras conhecidas pelos versados na técnica, por exemplo, na forma de particulado, tal como em um microcarreador ou um nanocarreador (Paolicelli et al., 2010). Um sistema particular usa a tecnologia PRINT® para diminuir o antígeno da vacina em uma partícula dissolvível (Liquidia Technologies, NC, USA). As composições e vacinas imunogênicas, de acordo com a invenção, podem ser suplementadas adicionalmente pela adição de outros antígenos recombinantes ou purificados, que podem resultar na produção de 5 anticorpos de uma variedade de especificidades, quando administradas a um sujeito.

Nem todos estes anticorpos precisam ser protetores contra uma doença.

Em uma modalidade particular deste tipo, tais antígenos são também de Plasmodium, por exemplo, de Plasmodium falciparum.

Assim, uma vacina da presente invenção pode conter vários outros fatores patogênicos ativos ou inativados, junto com pelo menos um polipeptídeo aqui definido.

Portanto, de acordo com a presente invenção, pelo menos um polipeptídeo aqui definido pode ser combinado com outros antígenos de Plasmodium e não associados à Plasmodium.

Em uma modalidade, a composição da invenção compreende um polipeptídeo Rh ou fragmento antigênico deste.

Como é conhecido pelos versados na técnica, os polipeptídeos Rh pertencem à família de proteínas do tipo de ligação de reticulócito em Plasmodium spp., que são importantes para a invasão de eritrócitos por merozoítas.

Em Plasmodium falciparum, a família de peptídeo Rh inclui pfRh1 (por exemplo, acesso ao PlasmoDB PFD0110w (www.plasmodb.org); acesso ao Banco de Genes AF533700; AF411933; AF411930), pfRh2a (por exemplo, acesso ao PlasmoDB PF13_0198; acesso ao Banco de Genes AY138497; AY138498; AY138499), pfRh2b (por exemplo, acesso ao PlasmoDB MAL13P 1,176; acesso ao Banco de Genes AY138500; AY138501; AY138502; AY138503), pfRh4 (por exemplo, PlasmoDB PFD1 150c; acesso ao Banco de Genes AF432854; AF420309), e pfRh5 (por exemplo, PlasmoDB PFD1 145c; acesso ao Banco de Genes XP 001351544). Os detalhes adicionais de polipeptídeos Rh e fragmentos antigênicos destes são fornecidos anteriormente.

Em uma outra modalidade, a composição da invenção compreende um polipeptídeo EBA ou fragmento antigênico deste.

Da maneira entendida na técnica, os polipeptídeos EBA pertencem à família de proteína do tipo de ligação de eritrócito de Plasmodium (ebl), que também é observada como importante na invasão de merozoíto em eritrócitos.

Em Plasmodium 5 falciparum, a família do polipeptídeo EBA inclui EBA-175 (por exemplo, acesso PlasmoDB MAL7P1.176; acesso ao Banco de Genes XP 001349207), EBA-181 (por exemplo, acesso ao PlasmoDB PFA0125c; acesso ao Banco de Genes ACN62280), EBA-165 (por exemplo, acesso ao PlasmoDB PFD1 155w; acesso ao Banco de Genes XP_001351546), e EBA-140 (por exemplo, acesso ao PlasmoDB MAL13P1.60; acesso ao Banco de Genes XP 001349859). Os detalhes adicionais de polipeptídeos EBA e fragmentos antigênicos destes são fornecidos anteriormente.

Uma composição da invenção compreende tipicamente um carreador farmaceuticamente aceitável.

Tais carreadores incluem qualquer excipiente que não induz ele mesmo a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que está recebendo a composição.

Os carreadores adequados são tipicamente moléculas grandes e metabolizadas lentamente, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, sacarose, trealose, lactose e agregados de lipídeo (tais como gotas de óleo ou lipossomos). Tais carreadores são bem conhecidos pelos versados na técnica.

As vacinas também podem conter diluentes, tais como água, salina, glicerol, etc.

Adicionalmente, as substâncias auxiliares, tais como agentes de umectação ou emulsificantes, substâncias de tamponamento de pH e similares, podem estar presentes.

A salina fisiológica tamponada com fosfato, estéril e sem pirogênio é um carreador típico.

O pH da composição é preferivelmente entre 6 e 8, preferivelmente cerca de 7. O pH pode ser mantido pelo uso de um tampão.

Um tampão fosfato é típico.

A composição pode ser estéril e/ou sem pirogênio.

A composição pode ser isotônica com relação aos humanos.

As composições podem incluir sais de sódio (por exemplo, cloreto de sódio) para fornecer tonicidade.

Uma concentração de 10+/-2 mg/mL de NaCl é típica.

As composições também podem compreender um detergente, por exemplo, um 5 Tween (polissorbato), tal como Tween 80. Os detergentes estão presentes em geral em níveis baixos, por exemplo, <0,01 %. As composições podem compreender um álcool de açúcar (por exemplo, manitol) ou um dissacarídeo (por exemplo, sacarose ou trealose), por exemplo, em torno de 15-30 mg/mL (por exemplo, 25 mg/mL), particularmente se elas devem ser liofilizadas, ou se incluem material que foi reconstituído a partir do material liofilizado.

O pH de uma composição para liofilização pode ser ajustado em torno de 6,1 antes da liofilização.

A composição pode compreender adicionalmente uma substância antimalária, que é usada para o tratamento de infecção plasmodial.

As substâncias antimalária para uso nas composições incluem o fosfato de cloroquina, proguanil, primaquina, doxiciclina, mefloquina, clindamicina, halofantrina, sulfato de quinina, dicloridrato de quinina, gluconato, fosfato de primaquina e sulfadoxina.

As composições da invenção também podem compreender um ou mais agentes imunorregulatórios.

Preferivelmente, um ou mais do(s) agente(s) imunorregulatório(s) inclue(m) um adjuvante.

O adjuvante pode ser selecionado de um ou mais do grupo que consiste em um adjuvante de TH1 e adjuvante de TH2, discutido com mais detalhes a seguir.

As composições e vacinas imunogênicas da presente invenção podem ser administradas em qualquer forma adequada, tal como um líquido, emulsão, pó seco e/ou em uma bruma, por meio de qualquer das vias parenteral, intravenosamente, intraperitonealmente, intradermicamente, por escarificação, subcutaneamente, intramuscularmente, ou inoculada por uma via de mucosa, por exemplo, oralmente.

As composições e vacinas imunogênicas da presente invenção podem ser administradas usando uma variedade de regimes de vacinação, familiares aos versados na técnica.

Em uma forma da invenção, a composição da vacina pode ser administrada após o tratamento da antimalária.

Por 5 exemplo, a parasitemia no estágio sanguíneo pode ser eliminada com Fansidar (25 mg de sulfadoxina/0,75 mg de pirimetamina por kg de peso corporal) antes de cada vacinação.

Em uma outra forma da invenção, o tratamento antimalária (por exemplo, Fansidar) é fornecido 1 a 2 semanas antes das doses (por exemplo, primeira e terceira doses). Em uma outra forma da invenção , o tratamento antimalária (por exemplo, Fansidar) é fornecido antes da primeira dose.

Em uma outra forma da invenção, 3 doses da composição da vacina (por exemplo, 0,5 mg adsorvido em 0,312 g de alúmen em 0,125 mL) são administradas em 3 doses, 2 mg por dose para > 5 anos, 1 mg para menores de 5 anos, nas semanas 0, 4, e 25. Em uma outra forma da invenção, 3 doses de composição da vacina (por exemplo, 1 mg por dose) são fornecidas subcutaneamente nas semanas 0, 4 e 26. Em uma outra forma da invenção, 3 doses de composição da vacina são administradas nos dias 0, 30, e 180 em diferentes doses (por exemplo, 1 mg; 0,5 mg). Em uma outra forma da invenção, 3 doses de composição da vacina são administradas em intervalos de 3 a 4 meses, tanto intramuscularmente quanto subcutaneamente.

Em uma outra forma da invenção, 3 doses de composição da vacina são administradas subcutaneamente nos dias 0, 30 e cerca do dia 180. Em uma outra forma da invenção, a composição da vacina é administrada em 2 doses em intervalos de 4 semanas (por exemplo, 0,55 mL por dose contendo 4 μg, ou 15 μg, ou 13,3 μg de cada antígeno). Em uma outra forma da invenção, 3 doses da composição da vacina são administradas (por exemplo 25 μg em 250 uL de adjuvante AS02A) intramuscularmente no deltoide (em braços alternados), em 0, 1 e 2 meses.

Em uma outra forma da invenção, 4 doses da composição da vacina são fornecidas (por exemplo, 50 μg por 0,5 mL de dose) nos dias 0, 28 e 150; e a dose 4 é fornecida no ano seguinte.

Em uma outra forma da invenção, onde a vacina é uma vacina de DNA, a composição da vacina é administrada em duas doses (por exemplo, 2 mg nos dias 0 e 21 (2 injeções 5 intramusculares de cada vez, 1 em cada músculo deltoide). Em uma outra forma da invenção, onde a composição da vacina compreende uma molécula imunogênica covalentemente ligada a uma outra molécula (por exemplo, toxina A de Pseudomonas aeruginosa), a composição é administrada em 3 doses (por exemplo, em 1, 8 e 24 semanas). Ensaios de seleção Os polipeptídeos da invenção podem ser empregados em um processo de seleção para os compostos que ativam (agonistas) ou inibem (antagonistas) a capacidade do polipeptídeo de se ligar a um receptor de eritrócito (ligação ao receptor). Os exemplos de antagonistas potenciais incluem anticorpos, oligossacarídeos e derivados destes.

Um antagonista potencial inclui uma molécula pequena que se liga ao polipeptídeo da invenção, tornando-o inacessível a um parceiro de ligação do polipeptídeo.

Exemplos de moléculas pequenas incluem, mas sem limitação, compostos orgânicos pequenos, moléculas pequenas de peptídeos ou do tipo peptídeo.

As moléculas pequenas podem imitar a estrutura de um parceiro de ligação do polipeptídeo de acordo com a invenção.

A invenção também compreende ensaios de seleção de alto rendimento (HTS) para identificar compostos que interagem ou inibem a atividade biológica (isto é, afetam a atividade de ligação do receptor) de um polipeptídeo da invenção.

Os ensaios de HTS permitem a seleção de muitos compostos de uma maneira eficiente.

Os ensaios de HTS são determinados para identificar “acertos” ou “compostos líderes” com a propriedade desejada, a partir dos quais as modificações podem ser determinadas para melhorar a propriedade desejada. A modificação química do “acerto” ou “composto líder” baseia-se frequentemente em uma relação identificável de estrutura/atividade entre o “acerto” e o polipeptídeo.

EXEMPLOS 5 Exemplo 1. Identificação de pfRip como o parceiro do complexo Rh5 O pfRh5 de 45 kDa, processado a partir do sobrenadante da cultura do parasita, foi purificado por cromatografia de troca iônica. A análise de pfRH5 por cromatografia de exclusão por tamanho, em uma coluna analítica Superdex 200, demonstrou que pfRh5 foi eluído como uma espécie de ~150-200 kDa (Figura 1A). A eletroforese em gel Blue Native confirmou que pfRh5 migra em um gel como uma espécie de ~150-200 kDa (Figura 1B). Para determinar se pfRh5 é em complexo com outras moléculas, ou se ele forma um homo-oligômero, a proteína foi incubada com o anticorpo pfRh5 e analisada por cromatografia de exclusão por tamanho. Uma fração contendo 300 μL de pfRh5, isolada do sobrenadante da cultura, foi colocado em uma coluna analítica Superdex 200 e eluído com PBS (Figura 2A). Uma amostra idêntica de 300 μL foi pré-incubada com 25 μg de anticorpo monoclonal pfRh5 em temperatura ambiente por 15 minutos, e a seguir no gelo por 2 horas antes de ser colocada em uma coluna analítica Superdex 200 e eluida com PBS. O pfRh5 eluiu como uma espécie de ~300 kDa (Figura 2B), indicando uma molécula de anticorpo molécula ligada às espécies contendo pfRh5 de 150-200 kDa. Isto sugeriu que o fragmento de pfRh5 de 45 kDa está em complexo com outras moléculas, sem ser aquelas que formam um homo-oligômero. O complexo de PfRh5, purificado a partir do sobrenadante da cultura da linhagem do parasita Rh5HA por resina de afinidade anti-HA, foi submetido à digestão com tripsina em solução e os peptídeos resultantes foram analisados por espectrometria de massa (LC-MS/ S) e identificados por bases de dados de pesquisa (Tabela 2). Os resultados mostram que PfRh5 se liga a pfRip (SEQ ID NO: 2). Tabela 2. Espectrometria de massa identificou PfRip como parceiro do complexo pfRh5. Nome da proteína Posição do peptídeo Sequência do peptídeo pfRh5 187 - 197 (K)HLSYNSIYHK(S) (SEQ ID NO:29) 212 - 221 (K)KINETYDKVK(S) (SEQ ID NO:30) 237 - 247 (K)KLEHPYDINNK(N) (SEQ ID NO:31) 303 – 310 (K)MMDEYNTK(K) (SEQ ID NO:32) 358 – 366 (R)YHYDEYIHK(L) (SEQ ID NO:33) 437 - 443 (K)IIQDKIK(L) (SEQ ID NO:34) PfRip 93 – 100 (K)ScDYFISK(E) (SEQ ID NO:5) 101 – 114 (K)EYNSSDKTNQIcYK(K) (SEQ ID NO:6) 699 – 708 (K)LIcQcEEGYK(N) (SEQ ID NO:7) 760 – 769 (K)MEDGINcIAK(N) (SEQ ID NO:8) 963 - 972 (K)INcTcKENYK(N) (SEQ ID NO:9)

5 Exemplo 2. Transferência de pfRip para o sobrenadante da cultura Uma marca simples de Strep e marca de hemaglutinina tripla (HA) foram adicionadas na terminação C de pfRip por recombinação reticulada homóloga simples 3' (Figura 3A). O Imunoblotting da pelota de saponina e proteína marcada com HA, purificada a partir do sobrenadante da cultura da linhagem de pfRipHA com anticorpo anti-HA, demonstrou que PfRip foi processado e transferido para o sobrenadante da cultura (Figura 3B). PfRipHA também foi analisado por SDS-PAGE em condições redutoras e não redutoras e transferido para membrana de nitrocelulose.

O imunobloting com anticorpo anti-HA mostrou que o fragmento C-terminal processado migra de maneira similar tanto em condições redutoras quanto não redutoras, sugerindo que N-terminal e C-terminal de pfRip não estão ligados a nenhuma ligação de dissulfeto após o processamento (Figura 3C). Exemplo 3. Imunoprecipitação de pfRip Os sobrenadantes da cultura tanto das linhagens de parasita wt 3D7 quanto 3D7-pfRipHA foram imunoprecipitados com microesferas anti- HA-Sepharose.

Os materiais ligados foram separados por SDS-PAGE, transferidos para membrana de nitrocelulose para sondar pfRh5, usando o anticorpo monoclonal anti-pfRh5 (clone 2F1). A detecção de pfRh5 no material ligado apenas da linhagem 3D7-pfRipHA indicou que pfRh5 foi especificamente coimunoprecipitado com pfRipHA (Figura 4A). Os sobrenadantes da cultura tanto das linhagens de parasita wt 3D7 quanto 3D7-pfRipHA foram imunoprecipitados com o anticorpo 5 monoclonal anti-pfRh5 acoplado às miniesferas, e o sobrenadante da cultura dos parasitas 3D7-pfRipHA foi incubado apenas com miniesferas como controle adicional.

Os materiais ligados foram separados por SDS-PAGE, transferidos para membrana de nitrocelulose para sondar pfRipHA, usando anti-HA anticorpo (Figura 4B). A detecção de pfRipHA no material ligado apenas na linhagem de parasita 3D7-pfRipHA, imunoprecipitada com miniesfera anti-pfRh5, indicou que pfRip foi especificamente coimunoprecipitado com pfRh5. Exemplo 4. Expressão de pfRh5 e pfRip no ciclo de vida de P. falciparum Uma placa de 30 mL de cultura de parasite pfRipHA sincronizada triplamente (a terceira sincronização foi realizada quando os parasitas estavam no estágio de anel de 8-12 horas) foi distribuída em seis placas de 5 mL.

Uma placa de cultura foi coletada para preparar a pelota de saponina imediatamente após a terceira sincronização.

A segunda placa foi coletada 16 horas depois, a terceira placa após mais 8 horas, e as placas subsequentes a cada mais 6 horas até o final da esquizogonia.

As pelotas de saponina, preparadas a partir dos parasitas coletados, foram separadas por SDS-PAGE e transferidas para membrana de nitrocelulose.

A membrana foi primeiramente sondada com anticorpo monoclonal anti-HA para pfRipHA, e a seguir foi extraída para sondar pfRh5 e pfhsp70. Tanto pfRh5 quanto pfRip mostraram ser expressos em estágio tardio do ciclo de vida do desenvolvimento do parasita (Figura 5). Exemplo 5. Geração de pfRip-791-900 e pfRip-238-368 recombinantes

Para gerar o fragmento recombinante de pfRip-791-900 (aminoácidos 791 a 900), os oligonucleotídeos 5' CGCTAGCCATATGAATGAAGAAACAGATATTGTAAAATG 3' (SEQ ID NO.40) e 5' CGAGGATCCCTAATCTTCTAAAACACATTTTCC 3' 5 (SEQ ID NO: 41) foram usados para amplificar por PCR o fragmento, a partir do DNA genômico preparado do parasita 3D7. O fragmento de PCR resultante foi então clonado no vetor pET14b com os sítios Ndel e BamHI, transformado na cepa de E. coli BL21 RIL para expressar pfRip-791-900 recombinante como uma proteína marcada com hexa-His.

A proteína marcada com His foi purificada a partir do lisado solúvel das células bacterianas por purificação com afinidade de resina de Ni, seguido por cromatografia por filtração em gel, em coluna Superdex 75. O construto para produzir o fragmento recombinante de pfRip- 238-368 (aminoácidos 238 a 368) foi preparado sintetizando a sequência de DNA com códon otimizado, que codifica a sequência de aminoácidos de pfRip 238 a 368, e clonado no vetor pET28a com os sítios Nhel e BamHl.

O construto foi então transformado na cepa de E. coli BL21 RIL, e produziu a proteína marcada com hexa-His como corpo de inclusão.

A proteína solubilizada a partir do corpo de inclusão foi redobrada, purificada por coluna de afinidade com resina de Ni.

Exemplo 6. Produção de anticorpos e análise western blot O diagrama na figura 6A mostra a região de pfRip que foi produzida como proteína recombinante.

A coloração com azul de Coomassie da proteína recombinante purificada em coluna de filtração em gel e resina de Ni é mostrada na figura 6B.

A análise imunoblot de pfRip natural sondado com anticorpos elevados contra a proteína recombinante é mostrada na figura 6C.

As células vermelhas do sangue infectadas com o parasita PfRipHA (estágio esquizonte tardio) foram lisadas hipotonicamente com água, centrifugadas e a fração de pelotas foi lavada com PBS duas vezes.

A fração de pelotas foi então dividida em quatro microtubos e incubada no gelo por 2 horas com Tris 10 mM /pH 8,0; carbonato de sódio 100 mM /pH 11,5; 2 % de Triton X100 e 2 % de CHAPS em Tris 50 mM /pH8,0, EDTA 1 mM e 5 cloreto de sódio 100 mM, respectivamente.

As amostras foram centrifugadas em frações separadas solúveis e insolúveis.

A fração insolúvel foi lavada duas vezes com PBS e analisada por western blot junto com a fração solúvel (Figura 7 A). A pelota de saponina, preparada a partir das células vermelhas do sangue infectadas com o parasita pfRipHA (estágio esquizonte tardio), foi submetida às mesmas análises descritas anteriormente (Figura 7B). Os resultados demonstram que PfRip é uma proteína da membrana periférica e carrega seu parceiro de complexo, pfRh5, na superfície dos merozoítas.

Exemplo 7. Inibição da anexação e crescimento do parasita A pré-incubação dos merozoítas purificados com proteína-A, purificada de anticorpos policlonais de coelho [R1155 (αPfRIP/1) e R1156 (αPfRIP/2) em 2mg/mL] elevados contra pfRip recombinante, por 2 minutos a 37 °C inibiu a anexação de merozoítas em células vermelhas do sangue não infectadas em 40-55 % (Figura 8A). A proteína-A purificada a partir dos anticorpos do soro normal foram usadas como controle (NRS). O ensaio de inibição do crescimento (GIA) para cepas de P. falciparum 3D7, D10, FCR3 e W2mef é mostrado na figura 8B.

Na figura 8C é mostrada a titulação de anticorpos IgG anti-PfRIP-1 com FCR3. A titulação de anticorpos IgG anti- PfRIP-1 com 3D7 é mostrada na figura 8D.

Os presentes inventores testaram os anticorpos anti-PfRIP/1 e anti-PfRIP/2 (anticorpos αPfRIP/1 e 2) com relação à sua capacidade de bloquear o crescimento do parasita (ensaios de inibição do crescimento, GIA), usando as cepas de P. falciparum FCR3, W2mef, T994, CSL2, E8B, MCAMP, 7G8, D10, HB3, e 3D7 (Figura 9A). Significativamente, a cepa FCR3 foi inibida em 80 %, enquanto em comparação, 3D7 foi inibida em 35

% com αPfRIP/1 em 2 mg/mL (Figura 9A). A inibição observada para 3D7 foi comparável com aquela observada para outros anticorpos elevados nas regiões das famílias de proteína PfRh ou EBL.

Resultados similares foram observados para 3D7 usando o αPfRIP/2 (dados não mostrados). O nível da 5 atividade de inibição do crescimento observado com os anticorpos αPfRJP/1 e αPfRIP/2 para os parasitas 3D7 foi similar àquele observado nos ensaios de anexação, demonstrando que o efeito inibitório ocorreu na invasão do merozoíto, sem ser durante o crescimento do parasita (Figura 8A). Entre as outras cepas de P. falciparum testadas, o anticorpo αPfRIP/1 exibiu atividade inibitória significativamente maior com aquelas que invadem preferivelmente o eritrócito, usando receptores dependentes de ácido siálico (isto é, glicoforinas), que incluem FCR3, W2mef, T994, CSL2 e E8B.

O anticorpo αPfRIP/1 foi titulado em GIAs em comparação com IgG a partir do soro normal, tanto para a cepa de parasita FCR3 quanto 3D7. O crescimento de FCR3, um parasita que invade preferivelmente por vias dependentes do ácido siálico, foi completamente eliminado em 3 mg/mL e a inibição significativa ainda permaneceu mesmo em 1 mg/mL (40 %). Em comparação, a cepa de parasita 3D7, que pode usar eficientemente as vias de invasão independentes do ácido siálico, usando principalmente o ligante PfRh4 e o receptor I do complemento, foi inibida e níveis significativamente menores, com 40 % em 3 mg/mL, e diminuiu para 25 % em 1 mg/mL de anticorpo.

Isto sugere que o complexo PfRIP/PfRh5 pode ser mais funcionalmente importante em cepas de P. falciparum que usam eficientemente as vias de invasão dependentes de ácido siálico.

A região de PfRIP, na qual os anticorpos anti-PfRIP foram elevados, foi da cepa 3D7 de P. falciparum; entretanto, este domínio não exibe nenhum polimorfismo em outras cepas que foram sequenciadas (http://plasmodb.org/). Igualmente, os presentes inventores não observaram nenhuma reatividade cruzada dos anticorpos com outras proteínas que contêm os domínios do tipo EGF, tal como MSP1. Isto não foi surpreendente, uma vez que os aminoácidos conservados foram apenas os seis resíduos de cisteína que definem cada domínio do tipo EGF (Figura 6). Portanto, as diferenças na inibição observada em GIA com as várias cepas foram improváveis, em 5 virtude da reatividade cruzada com outras proteínas contendo domínios do tipo EGF ou polimorfismos nesta região de PfRIP.

É mais provável de refletir a dependência destes no complexo PfRh5/PfRIP para mediar uma via de invasão específica, em comparação com a função de outras membranas das famílias das proteínas PfRh e EBA.

Para testar, usou-se uma combinação de anticorpos IgG elevados contra PfRIP, EBA- 175, PfRh4, PfRh2a e PfRh2b, para determinar se estes aumentavam o nível de inibição em GIAs com relação ao parasita 3D7 (Figura 9B). Tanto os anticorpos αPfRIP/1 quanto αPfRIP/2 inibiram os parasitas 3D7 em 25 e 20 %, respectivamente (Figura 9B), similar estes experimentos prévios (Figura 8B). A combinação de αPfRIP/1 com os anticorpos αEBA-175 mostrou uma inibição aditiva de 45 % (Figura 9B). Este foi um resultado similar àquele observado para a combinação de anticorpos αPfRIP/1 com αPfRh4 ou αPfRh2a.

Significativamente, uma combinação de αPfRIP/1, αPfRh2a/b e αPfRh4 mostrou um nível de exibição muito maior (74 %). Este efeito aditivo foi consistente com parasitas que usam múltiplas vias de invasão para entrar no eritrócito.

Exemplo 8. Identificação do sítio de ligação de eritrócito pfRh2a/b Para confirmar que a proteína PfRh2a e b de 85 kDa era diretamente responsável pela ligação nos eritrócitos humanos, as proteínas recombinantes foram preparadas de diferentes porções que incluíam esta.

Uma proteína de 15 kDa, que corresponde aos aminoácidos 446 a 557 da terminação N de PfRh2a/b (rRh2is), expressa como uma proteína marcada com hexa-His de E. coli se ligou aos eritrócitos, ao passo que a proteína 2b1 da região C-terminal de PfRh2b não mostrou nenhuma ligação detectável (Figura 10). A ligação de rRh215 ao eritrócito foi resistente ao tratamento com tripsina, mas parcialmente sensível ao tratamento com quimotripsina e neuraminidase, um padrão de ligação observado para a proteína de 85 kDa de 5 P. falciparum, expressa a partir dos sobrenadantes da cultura.

Para mostrar que a ligação de rRh215 aos eritrócitos foi específica, foi determinado se os anticorpos IgG elevados neste domínio bloqueiam a ligação tanto a partir do fragmento de 85 kDa dos sobrenadantes do parasita quanto do fragmento de rRh215. Os anticorpos R1170 mostraram uma inibição dose-dependente da ligação do fragmento de 85 kDa, ao contrário dos anticorpos que aumentaram em uma segunda proteína recombinante de PfRH2a, preparada a partir da terminação N e IgG do soro normal de coelho (Figura 11A). Os mesmos anticorpos R1170 também bloquearam a ligação da proteína recombinante rRh215 de uma maneira dose- dependente (Figura 1 IB). Portanto, o domínio de ligação ao eritrócito de PfRh2a e b está localizado na região definida pela proteína recombinante rRh215 de 15 kDa.

Exemplo 9. Anticorpos no sítio de ligação PfRh2a/b inibem a invasão do merozoíto Para determinar se os anticorpos para rRh215 (R1170) inibem a invasão, eles foram testados em ensaios de inibição de crescimento com eritrócitos normais e tratados com tripsina.

Os anticorpos anti-rRh215 mostraram aproximadamente 18 % de inibição em eritrócitos normais, comparado à inibição de anticorpos em uma segunda proteína de fusão próxima ao sítio de ligação do receptor, e isto aumentou para as células tratadas com tripsina em 38 % (Figura 11C). A melhoria da inibição ocorreu como um resultado da remoção de receptores sensíveis à tripsina, a partir de eritrócitos, limitando assim aqueles disponíveis.

O receptor de eritrócito PfRh2a/b é resistente à tripsina, e a remoção de outros receptores por este tratamento aumenta a eficácia destes anticorpos inibitórios (Duraisingh et al., 2003). Para mostrar que o efeito inibitório foi específico, e também para determinar estava agindo tanto na função de PfRh2a quanto de PfRh2b, 5 foram usadas as linhagens de P. falciparum, em que cada gene foi especificamente interrompido (Duraisingh et al., 2003). Com relação aos eritrócitos normais, os anticorpos anti-rRh215 inibiram o crescimento aproximadamente no mesmo nível para 3D7A2a, que não apresenta a expressão de PfRh2a, e a 3D7 parental, e isto melhorou com relação aos eritrócitos tratados com tripsina.

Ao contrário, as linhagens de P. falciparum 3D7A2b (que não apresenta a expressão de PfRh2b) e FCR3 (que não apresenta expressão de PfRh2a e PfRh2b) não foram inibidas (Figura 11D). Portanto, os anticorpos anti-rRh215 no sítio de ligação do receptor inibem diretamente a função de PfRh2b, mas não de PfRh2a, uma vez que não foi funcional em 3D7. Exemplo 10. Inibição da invasão de P. falciparum nas células vermelhas do sangue humano Os anticorpos contra uma combinação de antígenos foram testados com relação à sua capacidade de inibir a invasão de P. falciparum em células vermelhas do sangue humano in vitro.

Os coelhos foram imunizados com um total de 225 μg de proteína, a qual compreende 75 μg de cada um dos antígenos a seguir: EBA175 R3-5 (aminoácidos 760-1271 ; SEQ ID NO: 36), PfRh2a/b (15 kDa fragmento; SEQ ID NO: 12) e PfRIPr (791-900; SEQ ID NO: 3). O sangue foi retirado e a fração IgG foi purificada 34 dias após uma única imunização com os três antígenos.

Várias diluições foram realizadas da IgG com a concentração inicial de 2 mg/mL.

Os anticorpos foram incubados junto com os parasitas P. falciparum 3D7. Ab controle foi IgG de coelho não imune.

A invasão percentual é calculada como 100 x

(invasão média (poços em triplicata) de IgG controle/IgG teste). A figura 12 mostra a titulação da resposta inibitória do crescimento contra os parasitas 3D7 tipo selvagem, com uma redução de invasão de 62 % em 2 mg/mL, comparado ao soro não imune. 5 Será entendido pelos versados na técnica que muitas variações e/ou modificações podem ser realizadas na invenção, da maneira observada nas modalidades específicas, sem fugir do escopo da invenção amplamente descrito. As presentes modalidades, portanto, devem ser consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e não restritivas. Todas as publicações aqui discutidas e/ou referenciadas são aqui incorporadas na sua íntegra. O presente pedido reivindica a prioridade de U.S. 61/411598 e U.S. 61/435602, cujos conteúdos são aqui incorporados pela referência. Qualquer discussão de documentos, números, materiais, dispositivos, artigos ou similares que foram incluídos na presente especificação é apenas com o propósito de fornecer um contexto para a presente invenção. Não deve ser tomado como uma admissão de que qualquer ou todos estes assuntos fazem parte da base da técnica anterior, ou são de conhecimento geral comum no campo relevante para a presente invenção, como se existisse antes da data de prioridade de cada reivindicação deste pedido.

REFERÊNCIAS Breman et al. (2004) Am J Trop Med Hyg, 71 Suppl 2: 1-15. Duraisingh et al. (2003) EMBO J, 22: 1047-1057. George, et al. (2003) Protein Engineering, 15:871-879. Harayama (1998) Trends Biotech, 16;76-82. Hay et al. (2004) Lancet Infect Dis, 4:327-336. Hoffmann et al. (2002) J Infect Dis, 185: 1 155-1 164. Needleman and Wunsch (1970) J Mol Biol, 48:443-453.

Ohta et al. (1998) Tokai J Exp Clin Med, 23:85. Paolicelli et al. (2010) Nanomedicine, 5:843-853. Rammensee (1995) Curr Opin Immunol, 7:85-96. Singh et al. (2010) PLos One, 5:e9435. Snow et al. (2004) Am J Trop Med Hyg, 71 Suppl 2: 16-24. Sun et al. (2009) Vaccine 27: 1787- 1796. Wang et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA, 98: 10817-10822.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo isolado e/ou recombinante, em que o polipeptídeo compreende: i) uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma 5 de SEQ ID NOs: 2 a 4, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 2 a 4, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii).

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 2 a 4 ou um fragmento antigênico deste.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a composição compreende adicionalmente um polipeptídeo Rh ou fragmento antigênico deste, o polipeptídeo Rh ou fragmento antigênico compreendendo: i) uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 10 a 28, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 10 a 28, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii).

4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo Rh1 ou fragmento antigênico deste, e que compreende: i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 10, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 10, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii).

5. Composição de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo Rh2 ou fragmento antigênico deste, e que compreende: i) uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma 5 de SEQ ID NOs: 11 a 14, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 11 a 14, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii).

6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo Rh4 ou fragmento antigênico deste, e que compreende: i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 16, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 15 e/ou SEQ ID NO: 16, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii).

7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo Rh5 ou fragmento antigênico deste, e que compreende: i) uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 17 a 28, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 17 a 28, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii).

8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a composição compreende adicionalmente um polipeptídeo EBA ou fragmento antigênico deste, o polipeptídeo EBA ou fragmento antigênico compreendendo: i) uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 35 a 38, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 35 a 38, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). 5

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo EBA175 ou fragmento antigênico deste, e que compreende: i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 35 e/ou SEQ ID NO: 36, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii).

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende: i) um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 3, ii) um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 12; e iii) um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 36.

11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo EBA181 ou fragmento antigênico deste, e que compreende: i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 37, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 37, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii).

12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo EBA140 ou fragmento antigênico deste, e que compreende: i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 38, 5 ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 38, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii).

13. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizada pelo fato de que a composição compreende: i) um polipeptídeo ou fragmento antigênico como definido na reivindicação 1, ii) um polipeptídeo Rh2 ou fragmento antigênico como definido na reivindicação 5, iii) um polipeptídeo Rh4 ou fragmento antigênico como definido na reivindicação 6, iv) um polipeptídeo Rh5 ou fragmento antigênico como definido na reivindicação 7, e v) um EBA175 polipeptídeo ou fragmento antigênico como definido na reivindicação 9.

14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o fragmento antigênico como definido na reivindicação 1 consiste na sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 3.

15. Composição de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que o fragmento antigênico como definido na reivindicação 5 consiste em: i) a sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ

ID NO: 12, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 12, ou ii) a sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 13, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica 5 à SEQ ID NO: 13.

16. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o fragmento antigênico como definido na reivindicação 5 consiste na sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 12, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 12.

17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que o fragmento antigênico como definido na reivindicação 6 consiste na sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 16, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 16.

18. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizada pelo fato de que o fragmento antigênico como definido na reivindicação 7 consiste na sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 18, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 18.

19. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizada pelo fato de que o fragmento antigênico como definido na reivindicação 9 consiste na sequência de aminoácidos da maneira apresentada em SEQ ID NO: 36, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 36.

20. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo isolado e/ou recombinante, em que o polipeptídeo compreende: i) uma sequência de aminoácidos da maneira apresentada em

SEQ ID NO: 12, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 12, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii). 5 21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos polipeptídeos na composição é uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma outra sequência de polipeptídeos.

22. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que é uma composição imunogênica, preferivelmente compreendendo um adjuvante e/ou carreador farmaceuticamente aceitável.

23. Polipeptídeo isolado e/ou recombinante, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende: i) uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 2 a 4, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 2 a 4, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii).

24. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOs: 2 a 4 ou um fragmento antigênico deste.

25. Polipeptídeo isolado e/ou recombinante, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende: i) uma sequência de aminoácidos da maneira fornecida em SEQ ID NO: 12, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 12, e/ou iii) um fragmento antigênico de i) ou ii), o polipeptídeo preferivelmente compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 12 ou um fragmento antigênico deste. 5

26. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma outra sequência de polipeptídeos.

27. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é imunogênico.

28. Polinucleotídeo isolado e/ou exógeno, caracterizado pelo fato de que compreende: i) uma sequência de nucleotídeos da maneira apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 39 ou 42, ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 26 a 31, iii) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70% idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 1, 39 ou 42, e/ou iv) uma sequência que hibridiza em qualquer um ou mais de i) a iii) em condições pelo menos moderadamente severas.

29. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo isolado e/ou exógeno como definido na reivindicação 28, preferivelmente em que o polinucleotídeo é operavelmente ligado a um promotor.

30. Método de preparar o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 23 a 26, caracterizado pelo fato de que método compreende: (a) obter um vetor de expressão que compreende a sequência de polinucleotídeos como definido na reivindicação 27 operavelmente ligado a um promotor; e (b) introduzir o dito vetor de expressão em uma célula ou sistema de expressão sem célula por meio do qual a dita célula ou sistema de expressão sem célula produz o polipeptídeo codificado pela dita sequência de 5 polinucleotídeos.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente isolar o dito polipeptídeo.

32. Anticorpo substancialmente purificado, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 23 a 27, dito anticorpo preferivelmente sendo marcado de maneira detectável.

33. Uso da composição como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, do polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 23 a 27, do polinucleotídeo como definido na reivindicação 28, do vetor como definido na reivindicação 29, e/ou do anticorpo como definido na reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de malária.

34. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27, o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 28, o vetor de acordo com a reivindicação29, e/ou o anticorpo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de malária.

35. Organismo transgênico não humano, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 23 a 27.

36. Método de selecionar um agonista ou antagonista que modula a atividade do polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 23 a 27, caracterizado pelo fato de que método compreende colocar o polipeptídeo em contato com um composto candidato, e determinar se o dito composto se liga a o polipeptídeo.