BRPI0613087A2 - uso de um antìgeno de plasmódium ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo e um adjuvante, formulação, kit, e, métodos para avaliar a eficácia de uma vacina candidata na prevenção de malária e para determinar se um indivìduo é protegido contra malária - Google Patents
uso de um antìgeno de plasmódium ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo e um adjuvante, formulação, kit, e, métodos para avaliar a eficácia de uma vacina candidata na prevenção de malária e para determinar se um indivìduo é protegido contra malária Download PDFInfo
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USO DE UM ANTìGENO DE PLASMODIUM OU UM FRAGMENTO IMUNOGêNICO OU DERIVADO DO MESMO E UM ADJUVANTE, FORMULAçãO, KIT, E, MéTODOS PARA AVALIAR A EFICáCIA DE UMA VACINA CANDIDATA NA PREVENçãO DE MALáRIA E PARA DETERMINAR SE UM INDIVìDUO é PROTEGIDO CONTRA MALáRIA. é fornecido, inter alia, um método para a profilaxia de infecção por malária produtiva em viajantes para regiões endêmicas compreendendo a administração de quantidades adequadas de uma formulação compreendendo um antígeno de plasmodium ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo e um adjuvante, compreendendo um derivado de lipideo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma.
Description
"USO DE UM ANTÍGENO DE PLASMODIUM OU UM FRAGMENTO IMUNOGÊNICO OU DERIVADO DO MESMO E UM ADJUVANTE, FORMULAÇÃO, KIT, E, MÉTODOS PARA AVALIAR A EFICÁCIA DE UMA VACINA CANDIDATA NA PREVENÇÃO DE MALÁRIA E PARA DETERMINAR SE UM INDIVÍDUO É PROTEGIDO CONTRA MALÁRIA"
A presente invenção diz respeito a um novo uso de um antígeno de malária para imunizar contra a infecção por malária e doença. A invenção em particular diz respeito ao uso de antígenos de esporozoíta, em particular proteína circunsporozoíta (CS) ou fragmentos imunogênicos ou derivados destes, combinados com adjuvantes adequados, para imunizar indivíduos ingênuos de malária que esperam viajar para regiões endêmicas contra a infecção por malária.
A malária é um dos problemas de saúde principais do mundo. Durante o século 20, o desenvolvimento econômico e social, juntamente com campanhas anti-maláricas, resultou na erradicação da malária de grandes áreas do mundo, reduzindo a área afetada da superfície terrestre de 50% a 27%. Entretanto, dado o crescimento populacional esperado é projetado que em 2010 metade da população mundial, aproximadamente 3,5 bilhões de pessoas, estarão vivendo em áreas onde a malária é transmitida (Hay, 2004). Estimativas correntes sugerem que existem profundamente em excesso de 1 milhão de mortes devido à malária todos os anos, e os custos econômicos para África apenas são surpreendentes (Bremen, 2004).
Estas figuras realçam a crise de malária global e os desafios que ela possui para a comunidade de saúde internacional. As razões para esta crise são múltiplas e variam da emergência de resistência muito difundida a medicamentos disponíveis, de preço acessível e altamente eficazes previamente, para a falha e insuficiência de sistemas de saúde e a carência de recursos. A menos que caminhos sejam descobertos para controlar esta doença, esforços globais para melhorar a saúde e sobrevivência infantil, reduzir a pobreza, aumentar a segurança e fortalecer as sociedades mais vulneráveis falharão.
A malária também apresenta riscos àqueles que viajam para ou trabalham em regiões endêmicas que normalmente vivem em países livres de malária. Os riscos podem ser maiores para esta população de viajante porque eles não têm nenhuma imunidade de fundo à malária a partir da exposição natural. Um outro aspecto do risco incorrido por um viajante a uma região endêmica de malária é que a doença é freqüentemente mal diagnosticada em seus estágios iniciais devido aos sintomas semelhantes à gripe. Quando a severidade aumenta e a malária é finalmente diagnosticada, pode ser muito tarde. Dentro de alguns dias dos sintomas aumentados, a morte pode resultar, por exemplo, de malária cerebral, ou algumas vezes insuficiência orgânica (por exemplo, hepática ou renal).
Uma das formas mais agudas da doença é causada pelo protozoário parasita Plasmodium falciparum que é responsável pela maioria da mortalidade atribuível à malária. Uma outra forma da doença é causada pelo Plasmodium vivax. P. vivax é a mais difundida de todas as malárias. Além de estar presente em regiões tropicais e sub-tropicais, a capacidade do parasita para completar seu ciclo de mosquito em temperaturas tão baixas quanto 15 graus Celsius, tem deixado-o difundir em climas temperados. Entretanto devido ao fato de que a infecção por P. vivax é raramente fatal, os esforços para controlar a malária P. vivax (através do desenvolvimento da vacina) estão ficando para trás daqueles para P. falciparum.
Uma observação feita 30 anos atrás fornece suporte forte para o ponto de vista de que uma vacina contra malária eficaz eventualmente será desenvolvida. Camundongos e seres humanos podem ser protegidos contra malária por imunização com esporozoítas da malária vivos, atenuados por radiação. A persistência de estágio intra-hepático in vivo é necessária para produzir e manter imunidade protetora, mas os mecanismos subjacentes não foram ainda completamente definidos. Anticorpos, células T CD8 e CD4 (Hoffman, 1996) foram implicados como mediadores imunes efetores críticos.
O ciclo de vida de Plasmodium sp (por exemplo, P. falciparum ou P. vivax) é complexo, requerendo dois hospedeiros, homem e mosquito para a conclusão. A infecção do homem é iniciada pela inoculação de esporozoítas na saliva de um mosquito infectado. Os esporozoítas migram ao fígado e lá infectam hepatócitos (estágio hepático) onde eles diferenciam, por intermédio do estágio intracelular exoeritrocítico, no estagio de merozoíta que infecta hemácias (RBC) para iniciar a replicação cíclica no estágio sangüíneo assexual. O ciclo é completado pela diferenciação de vários merozoítas nas RBC no gametócitos do estágio sexual que são ingeridos pelo mosquito, onde eles desenvolvem-se através de uma série de estágios no intestino intermediário para produzir esporozoítas que migram para a glândula salivar.
O estágio de esporozoíta de Plasmodium sp (por exemplo, P. falciparum ou P. vivax) foi identificado como um alvo potencial de uma vacina contra malária. A proteína de superfície principal do esporozoíta é conhecida como a proteína circunsporozoíta (proteína CS). Esta proteína foi clonada, expressada e seqüenciada para uma variedade de cepas, por exemplo para P. falciparum a cepa NF54, clone 3D7 (Caspers, 1989). A proteína da cepa 3D7 é caracterizada por ter uma região de repetição imunodominante central compreendendo um tetrapeptídeo Asn-Ala-Asn-Pro repetido 40 vezes mas intercalado com quatro repetições menores do tetrapeptídeo Asn-Val- Asp-Pro. Em outras cepas o número de repetições maiores e menores varia assim como sua posição relativa. Esta porção central é flanqueada por uma porção de terminal NeC composta de seqüências de aminoácido não repetitivas designadas como a porção sem repetição da proteína CS.
A vacina contra malária RTS,S da GlaxoSmithKline Biologicals com base na proteína CS estava em desenvolvimento desde 1987 e é correntemente o candidato de vacina contra malária mais avançado que é estudado (Bailou, 2004). Esta vacina especificamente alveja o estágio pré eritrocítico do P. falciparum.
RTS,S/AS02A (RTS,S mais o adjuvante AS02A que contém os imunoestimulantes QS21, 3D-MPL e uma emulsão óleo em água) foi usado em estudos de Fase I consecutivos experimentados na Gâmbia envolvendo adultos (Doherty, 1999), crianças da idade de 6 a 11 e 1 a 5 anos (Bojang, 2005), que confirmaram que a vacina foi segura, bem tolerada e imunogênica. Subseqüentemente uma dose de vacina pediátrica foi selecionada e estudada em um estudo de Fase I envolvendo crianças Moçambicanas da idade de 1 a 4 anos onde ela foi descoberta ser segura, bem tolerada e imunogênica (Macete).
A vacina RTS,S/AS02A também mostrou evidência da eficácia em experiências clínicas nos USA e no campo no Oeste da África. RTS,S/AS02A induz respostas de anticorpo IgG significantes à proteína circunsporozoíta de P. falciparum e imunidade de célula T substancial (Lalvani, 1999; Sun, 2003). A eficácia contra a inoculação experimental de P. falciparum em voluntários ingênuos de malária nos USA foi estimada ser cerca de 30 a 50% em média (Stoute, 1997; Stoute 1998; Kester, 2001). O primeiro destes estudos (Stoute, 1997) foi 86% eficaz em uma experiência em escala pequena em que 6 de 7 indivíduos imunizados com RTS,S/AS02A foram protegidos. Além disso, um estudo de campo de adultos semi-imunes na Gâmbia (precedidos por um estudo seguro em adultos Gambianos (Doherty, 1999)) mostrou uma eficácia global de 34% durante um período de uma período de transmissão de 15 semanas, com 71% de eficácia nas primeiras nove semanas de acompanhamento e 0% de eficácia depois (Bojang, 2001). Estes estudos (Stoute, 1997; Stoute, 1998; Bojang, 2001; Kester, 2001) mostram eficácia contra a infecção. Resultados foram recentemente relatados de uma experiência usando RTS,S/AS02A em crianças Africanas. Foi descoberto que a vacina RTS,S com base em proteína CS pode conferir não apenas proteção contra a infecção sob exposição natural mas também proteção contra um espectro amplo de doença clínica causada por P. falciparum. Crianças que receberam a vacina RTS5S experienciaram menos eventos adversos sérios, hospitalizações, e complicações severas da malária, incluindo morte, do que aqueles no grupo de controle (Alonso, 2004).
Além disso, a eficácia da vacina RTS,S tanto contra novas infecções quanto episódios clínicos parece não diminuir ou agir tão lentamente. No final dos 6 meses de acompanhamento na experiência, a vacina permaneceu eficaz visto que houve uma diferença significante na prevalência da infecção. Isto é em comparação com experiências prévias em voluntários ingênuos de malária ou adultos Gambianos que sugeriram que a eficácia da vacina com RTS,S foi curta (Stoute, 1998; Bojang, 2001). Além disso, depois de um período de acompanhamento adicional de 12 meses, foi observado que a eficácia da vacina contra um episódio de malária clínica não diminuiu significantemente (Alonso, 2005).
Embora a formulação de vacina descrita acima mostre eficácia clínica, melhoras adicionais ainda são necessárias de modo a aumentar tanto o número de indivíduos protegidos assim como a persistência da proteção. Novas formulações de adjuvante tais como uma formulação que contém QS21 e 3D-MPL em uma formulação contendo lipossoma (referido aqui como o adjuvante B) demonstrou uma potência mais alta para impulsionar a resposta imune de célula T em várias investigações pré clínicas e clínicas.
Em particular, o que é necessário para uma vacina para pessoas que não vêm de uma região endêmica de malária mas estão viajando por um período limitado de tempo para regiões onde a malária é endêmica, é a melhor proteção contra a infecção. A manifestação clínica da malária pode ocorrer apenas se existe uma infecção produtiva do fígado levando à formação de merozoítas e sua liberação do estágio hepático. Estes merozoítas depois podem infectar RBC e iniciam o estágio sangüíneo patogênico do parasita resultando em malária clínica sintomática. Se não existe nenhuma infecção produtiva a seguir da exposição (isto é, nenhuma infecção do fígado e/ou nenhuma liberação de merozoítas hepáticos), então isto é conhecido como imunidade estéril. Uma vacina que reduziria significantemente o risco de uma infecção hepática produtiva, como definido acima, a seguir de picadas de mosquito seria altamente desejável para uma população de viajante que não têm imunidade pré existente, porque prevenindo-se a infecção hepática produtiva a vacina preveniria qualquer manifestação clínica subseqüente. Isto pode ser contrastado com o objetivo do desenvolvimento da vacina alvejando crianças ou pessoas em regiões endêmicas, onde o objetivo principal seria diminuir a severidade da doença e/ou diminuir o número de episódios da doença, mas não necessariamente preveni-los completamente. Na teoria, não seria possível manter indefinidamente a proteção estéril em pessoas em regiões endêmicas, e portanto eles precisam construir sua própria imunidade pela exposição à infecção por malária. Além disso, pode não ser oportuno conferir proteção estéril em pessoas que moram em regiões endêmicas durante um período prolongado ainda limitado de tempo.
Descreveu-se aqui uma experiência clínica de inoculação que consiste de uma comparação de igual para igual de RTS,S/AS02A versus RTS,S com um adjuvante diferente (adjuvante B) que contém QS21 e 3 D- MPL em uma formulação com lipossomas contendo colesterol, em uma população ingênua de malária (ver os Exemplos). A imunidade mediada tanto por célula T quanto B foi investigada.
Os resultados mostram que em uma população adulta ingênua de malária o antígeno RTS,S em combinação com o adjuvante B é mais do que 50% mais eficaz na proteção contra infecção hepática produtiva a seguir da inoculação de malária do que RTS,S/AS02A. Assim, o antígeno RTS,S em combinação com o adjuvante B é mais eficaz em termos da proteção estéril que é necessária para indivíduos ingênuos de malária que viajam para regiões onde a malária é endêmica. Esta eficácia aumentada conferida pelo adjuvante B é associada com uma resposta imune específica de antígeno aumentada (anticorpos e células T CD4-Thl).
Portanto a presente invenção fornece o uso de um antígeno de Plasmódio ou um fragmento imunogênico ou derivado deste e um adjuvante compreendendo um derivado de lipídeo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma, na fabricação de um medicamento para imunizar viajantes para regiões endêmicas contra a infecção por malária produtiva.
Geralmente, viajantes para regiões endêmicas serão ingênuos de malária. Assim, a invenção aplica-se a indivíduos ingênuos de malária.
A invenção está particularmente preocupada com a redução da incidência de infecções por malária produtiva em viajantes para regiões endêmicas, que podem ser de qualquer idade mas em particular adultos.
Um segundo aspecto da invenção fornece uma formulação compreendendo um antígeno de Plasmódio ou um fragmento imunogênico ou derivado deste e um adjuvante, compreendendo um derivado de lipídeo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma, para o uso na imunização de viajantes para regiões endêmicas contra a infecção por malária produtiva.
Um terceiro aspecto da invenção fornece um método de profilaxia da infecção por malária produtiva em viajantes para regiões endêmicas compreendendo a administração de quantidades adequadas de uma formulação compreendendo um antígeno de Plasmódio ou um fragmento imunogênico ou derivado deste e um adjuvante, compreendendo um derivado de lipídeo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma.
Em uma forma de realização da invenção o antígeno de Plasmódio é um antígeno de P. falciparum. Em uma outra forma de realização da invenção o antígeno de Plasmódio é um antígeno de P. vivax.
Adequadamente o antígeno é um antígeno pré eritrocítico.
O antígeno por exemplo pode ser selecionado de qualquer antígeno que é expressado no esporozoíta ou outro estágio pré eritrocítico do parasita tal como o estágio hepático. Por exemplo o antígeno pode ser selecionado da proteína circunsporozoíta (CS), antígeno-1 do estágio hepático (LSA-I) (ver por exemplo, a W02004/044167), antígeno-3 do estágio hepático (LSA-3) (descrito por exemplo, na EP 0 570 489 e EP 0 833 917), Pfs 16kD (descrito na WO 91/18922 e EP 597 843), antígeno-1 exportado (Exp-I) (descrito por exemplo em Meraldi et aí 2002, Parasite Immunol vol 24(3): 141), proteína rica em esporozoíta-treonina-asparagina (STARP), antígeno de esporozoíta e estágio hepático (SALSA), proteína anônima relacionada à trombospondina (TRAP) (descrita na WO 90/01496, WO 91/11516 e WO 92/11868) e antígeno-1 de merozoíta apical (AMA-I) (descrito na EP 0 372 019) que recentemente foi mostrado estar presente no estágio hepático (além do estágio eritrocítico). Todos estes antígenos são bem conhecidos no campo. O antígeno pode ser a proteína inteira ou um fragmento imunogênico desta ou um derivado de qualquer um destes. Fragmentos imunogênicos de antígenos de malária são bem conhecidos, por exemplo o ectodomínio de AMA-I (descrito por exemplo, na WO 02/077195). Os derivados incluem por exemplo fusões com outras proteínas que podem ser proteínas da malária ou proteínas que não da malária tais como HBsAg. Os derivados de acordo com a invenção são capazes de promover uma resposta imune contra o antígeno nativo.
O antígeno de Plasmódio pode ser fundido ao antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg).
Um antígeno particular para o uso na invenção é derivado da proteína circunsporozoíta (CS) e pode estar na forma de uma proteína híbrida com HBsAg. O antígeno pode ser a proteína inteira CS ou parte desta, incluindo um fragmento ou fragmentos da proteína CS fragmentos estes que podem ser fundidos entre si. O antígeno com base em proteína CS pode estar na forma de uma proteína híbrida compreendendo substancialmente toda a porção terminal C da proteína CS de Plasmódio, quatro ou mais repetições em tandem da região imunodominante de proteína CS, e o antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg). A proteína híbrida pode compreender uma seqüência que contém pelo menos 160 aminoácidos e que é substancialmente homóloga à porção terminal C da proteína CS. Em particular "substancialmente toda" a porção de terminal C da proteína CS inclui o término C destituído da seqüência âncora hidrofóbica. Além disso, no caso do antígeno do Plasmodium falciparum, ele contém 4 ou mais por exemplo 10 ou mais motivos de repetição de tetrapeptídeo Asn-Ala-Asn-Pro. A proteína CS pode ser destituída dos últimos 12 aminoácidos do terminal C.
A proteína híbrida para o uso na invenção pode ser uma proteína que compreende uma porção da proteína CS de P. falciparum substancialmente como correspondendo aos aminoácidos 207 a 395 do clone 3D7 de P. falciparum, derivado da cepa NF54 (Caspers, 1989) fundido em estrutura por intermédio de um ligador linear ao terminal N de HBsAg. O ligador pode compreender uma porção de preS2 de HBsAg.
Construções CS para o uso na presente invenção são como esboçadas na WO 93/10152. Uma construção particular é a proteína híbrida conhecida como RTS como descrito na WO 93/10152 (em que ela é denotada RTS*) e WO 98/05355, os conteúdos inteiros de ambas as quais são incorporadas aqui por referência.
Uma proteína híbrida particular para o uso na invenção é a proteína híbrida conhecida como RTS que consiste de:
• Um resíduo de metionina, codificado por nucleotídeos 1059 a 1061, derivado da seqüência genética TDH3 de Sacchromyes cerevisiae. (Musti, 1983).
• Três aminoácidos, Met Ala Pro, derivados de uma seqüência de nucleotídeo (1062 a 1070) criados pelo procedimento de clonagem usado para construir o gene híbrido.
• Um trecho de 189 aminoácidos, codificado por nucleotídeos 1071 a 1637 representando os aminoácidos 207 a 395 da proteína circunsporozoíta (CSP) de cepa 3D7de Plasmodium falciparum (Caspers, 1989).
• Um aminoácido (Gly) codificado por nucleotídeos 1638 a 1640, criado pelo procedimento de clonagem usado para construir o gene híbrido.
• Quatro aminoácidos, Pro Val Thr Asn, codificados por nucleotídeos 1641 a 1652, e representando os quatro resíduos de terminal carbóxi da proteína preS2 do vírus da hepatite B (sorotipo adw) (Valenzuela, 1979).
• Um trecho de 226 aminoácidos, codificado por nucleotídeos 1653 a 2330, e especificando a proteína S do vírus da hepatite B (sorotipo adw).
A RTS pode estar na forma de partículas mistas RTS,S.
As partículas RTS,S compreendem dois polipeptídeos RTS e S que podem ser sintetizados simultânea e espontaneamente de estruturas particuladas compósitas (RTS5S) por exemplo, durante a purificação.
A proteína RTS pode ser expressada em levedura, por exemplo S. cerevisiae. Em um tal hospedeiro, RTS será expressada como partículas de lipoproteína. A cepa de levedura receptora já pode carregar em seu genoma várias cópias integradas de um cassete de expressão S da hepatite Β. A cepa resultante sintetiza portanto dois polipeptídeos, S e RTS, que espontaneamente encontram-se em conjunto em partículas de lipoproteína (RTSiS) mistas. Estas partículas podem apresentar as seqüências de CSP do híbrido em sua superfície. A RTS e S nestas partículas mistas podem estar presentes em uma razão particular, por exemplo 1:4.
O uso de um outro antígeno de malária ou fragmento ou derivado deste na invenção também é abrangido dentro da invenção. Outros antígenos pré eritrocíticos tais como AMA-I9 LSA-1, LSA-3 (descritos por exemplo, na EP 0 570 489 e EP 0 833 917) e Pfs 16kD, podem ser usados em combinação com RTS,S. Alternativamente RTS,S pode ser usada em combinação com um antígeno de estágio sangüíneo tal como proteína-1 de superfície de merozoíta (MSP-I) (descrita por exemplo, na US 4.837.016), antígeno-175 de ligação de eritrócito (EBA-175) ou MSP-3 (descrito por exemplo, na EP 0 666 916).
Fragmentos imunogênicos de qualquer um dos antígenos como descrito aqui conterão pelo menos um epítopo do antígeno e exibem antigenicidade para malária e são capazes de promover uma resposta imune quando apresentados em uma construção adequada, tal como por exemplo quando fundidos a outros antígenos de malária ou outros antígenos que não de malária, ou apresentados em um carregador, a resposta imune sendo dirigida contra o antígeno nativo. Tipicamente os fragmentos imunogênicos contêm pelo menos 20, ou pelo menos 50, ou pelo menos 100 aminoácidos contíguos do antígeno de malária.
Derivados dos antígenos ou fragmentos como descrito aqui similarmente conterão pelo menos um epítopo do antígeno e exibem antigenicidade para malária e são capazes de promover uma resposta imune, a resposta imune sendo dirigida contra o antígeno nativo. Os derivados incluem por exemplo fusões do antígeno de malária a uma outra proteína que pode ser ou não uma outra proteína da malária e pode ser, por exemplo, HBsAg.
De acordo com a invenção, uma solução aquosa da proteína híbrida purificada pode ser usada diretamente e combinada com o adjuvante adequado de acordo com a invenção. Alternativamente, a proteína pode ser liofilizada antes da mistura com o adjuvante. O adjuvante pode ser um líquido e é assim usado para reconstituir o antígeno em uma forma de vacina líquida.
Assim a invenção fornece ainda o uso de um antígeno de Plasmódio ou um fragmento imunogênico ou derivado deste e um adjuvante compreendendo um derivado de lipídeo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma, como descrito aqui, na fabricação de um kit para imunizar viajantes para regiões endêmicas contra a infecção por malária, em que o antígeno é fornecido na forma liofilizada e o antígeno e o adjuvante são misturados antes da administração.
A dose da vacina de acordo com a invenção pode estar entre 1 a 100 μg de RTS5S por dose, por exemplo 25 a 75 μg de RTS,S, por exemplo uma dose de 50 μg de proteína RTS,S, que pode estar presente em 500 μΐ (formulação líquida final). Esta é uma dose adequada para o uso em adultos. Uma dose adequada para o uso em crianças é metade da dose para adulto, que é 25 μg de RTS,S, que pode estar presente em 250 μΐ (formulação líquida final). Doses similares podem ser usadas para outros antígenos.
De acordo com a invenção o antígeno é combinado com um adjuvante que compreende um derivado de lipídeo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma.
Adjuvantes adequados de acordo com a invenção são lipídeo A desintoxicado de qualquer fonte e derivados não tóxicos de lipídeo A, que são estimuladores preferenciais de uma resposta de célula Thl (também aqui chamada uma resposta do tipo Thl).
Uma resposta imune pode ser amplamente dividida em duas categorias extremas, sendo uma resposta imune humoral ou mediada por célula (tradicionalmente caracterizada por mecanismos efetores de anticorpo e celulares de proteção respectivamente). Estas categorias de resposta foram denominadas respostas do tipo Thl (resposta mediada por célula), e respostas imunes do tipo Th2 (resposta humoral). Respostas imunes do tipo Thl extremas podem ser caracterizadas pela geração de antígeno específico, linfócitos T citotóxicos restritos de haplótipo, e respostas de célula exterminadora natural. Em camundongos respostas do tipo Thl são freqüentemente caracterizadas pela geração de anticorpos do subtipo IgG2a, embora no ser humano estas correspondem a anticorpos do tipo IgGl. Respostas imunes do tipo Th2 são caracterizadas pela geração de uma faixa de isótipos de imunoglobulina incluindo em camundongos IgGl.
Pode ser considerado que a força impulsora por detrás do desenvolvimento destes dois tipos de respostas imunes são citocinas. Níveis altos de citocinas do tipo Thl tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por célula ao antígeno dado, embora níveis altos de citocinas do tipo Th2 tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais ao antígeno.
A distinção de respostas imunes do tipo Thl e Th2 não é absoluta, e pode tomar a forma de uma seqüência contínua entre estes dois extremos. Na realidade um indivíduo suportará uma resposta imune que é descrita como sendo predominantemente Thl ou predominantemente Th2. Entretanto, é freqüentemente conveniente considerar as famílias de citocinas em termos daquilo descrito em clones de célula T CD4 +ve de murino por Mosmann e Coffman (Mosmann, 1989). Tradicionalmente, respostas do tipo Thl são associadas com a produção das citocinas de INF-gama por linfócitos T. Outras citocinas freqüentemente associadas diretamente com a indução de respostas imunes do tipo Thl não são produzidas por células T, tais como IL- .12. Ao contrário, respostas do tipo Th2 são associadas com a secreção de IL- .4, IL-5, IL-6, IL-IO e fator-beta de necrose tumoral (TNF-beta).
É conhecido que certos adjuvantes de vacina são particularmente apropriados ao estímulo de respostas de citocina do tipo Thl ou Th2. Tradicionalmente, indicadores do equilíbrio Thl:Th2 da resposta imune depois de uma vacinação ou infecçao incluem medição direta da produção de citocinas Thl ou Th2 por linfócitos T in vitro depois do restímulo com antígeno, e/ou a medição (pelo menos em camundongos) da razão de IgGl :IgG2a de respostas de anticorpo específicas de antígeno.
Assim, um adjuvante do tipo Thl é um que estimula populações de célula T isoladas para produzir níveis altos de citocinas do tipo Thl quando restimuladas com o antígeno in vitro, e induz respostas de imunoglobulina específicas de antígeno associadas com o isótipo do tipo Thl.
Adjuvantes que são capazes de estímulo preferencial da resposta de célula Thl são descritos na WO 94/00153 e WO 95/17209.
Foi muito tempo conhecido que o lipopolissacarídeo enterobacteriano (LPS) é um estimulador potente do sistema imune, embora seu uso em adjuvantes fosse encurtado por seus efeitos tóxicos. Um derivado não tóxico de LPS, monofosforil lipídeo A (MPL)j produzido pela remoção do grupo carboidrato do núcleo e do fosfato da glicosamina de extremidade reduzida, foi descrito (Ribi, 1986) e tem a estrutura seguinte:
<formula>formula see original document page 15</formula>
Uma outra versão desintoxicada de MPL resulta da remoção da cadeia de acila da posição 3 da cadeia principal de dissacarídeo, e é chamada monofosforil lipídeo A 3-O-Deacilado (3D-MPL). Ela pode ser purificada e preparada pelos métodos mostrados em GB 2122204B, referência esta que também divulga a preparação de difosforil lipídeo A, e variantes 3- O-deaciladas deste.
Uma forma particular de 3D-MPL para o uso na presente invenção está na forma de uma emulsão tendo um tamanho de partícula pequeno menor do que 0,2 μηι em diâmetro, e seu método de fabricação é divulgado na WO 94/21292. Formulações aquosas compreendendo monofosforil lipídeo A e um tensoativo foram descritas na WO 98/43670.
Os adjuvantes derivados de lipopolissacarídeo bacteriano a serem usados na presente invenção podem ser purificados e processados de fontes bacterianas, ou alternativamente eles podem ser sintéticos. Por exemplo, monofosforil lipídeo A purificado é descrito em Ribi et aí (Ribi, .1986), e monofosforil ou difosforil lipídeo A 3-O-Deacilado derivado de Salmonella sp. é descrito em GB 2220211 e US 4912094. Outros lipopolissacarídeos purificados e sintéticos foram descritos (Hilgers, 1986; Hilgers, 1987; EP 0 549 074 BI). Um adjuvante de lipopolissacarídeo bacteriano particular para o uso na invenção é 3DMPL.
Conseqüentemente, os derivados de LPS que podem ser usados na presente invenção são aqueles imunoestimulantes que são similares em estrutura àquele de LPS ou MPL ou 3D-MPL. Em uma outra alternativa os derivados de LPS podem ser um monossacarídeo acilado, que é uma sub- porção para a estrutura acima de MPL.
Saponinas também são imunoestimulantes de Th 1. As saponinas são adjuvantes bem conhecidos (Laçaille-Dubois, 1996). Saponinas adequadas para o uso na invenção incluem saponinas imunologicamente ativas por exemplo, Quil A (derivada da casca da árvore Sul Americana Quillaja Saponaria Molina), e frações imunologicamente ativas destas, são descritas na US 5.057.540 e aSaponins as vaccine adjuvants" (Kensil, 1996) e EP 0 362 279 BI. As saponinas hemolíticas QS21 e QS17 (frações 16
purificadas de HPLC de Quil A) foram descritas como adjuvantes sistêmicos potentes, e o método de sua produção é divulgado na Patente US Nfi 5.057.540 e EP 0 362 279 BI. Também descrito nestas referências é o uso de QS7 (uma fração não hemolítica de Quil-A) que age como um adjuvante potente para vacinas sistêmicas. O uso de QS21 é descrito ainda em Kensil et ai. (Kensil, 1991). Combinações de QS21 e polissorbato ou ciclodextrina também são conhecidas (WO 99/10008). Sistemas de adjuvante particulado compreendendo frações de QuilA, tais como QS21 e QS7 são descritos na WO 96/33739 e WO 96/11711. Os imunoestimulantes de lipopolissacarídeo e saponina descritos acima para o uso na invenção são formulados juntamente com um carregador de lipossoma. Por exemplo, o carregador pode compreender lipossomas contendo colesterol como descrito na WO 96/33739.
Combinações de um monofosforil lipídeo A e um derivado de saponina são descritas na WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241, e a combinação de QS21 e 3D-MPL é divulgada na WO 94/00153.
Assim, sistemas de adjuvante adequados para o uso na invenção incluem, por exemplo, uma combinação de um monofosforil lipídeo A, tal como 3D-MPL, juntamente com um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como divulgado na WO 94/00153. O sistema de adjuvante inclui um carregador de lipossoma, por exemplo lipossomas contendo colesterol, por exemplo em uma composição onde o QS21 é extinto em lipossomas contendo colesterol (DQ) como divulgado na WO 96/33739.
Assim a saponina tal como QS21 também pode estar presente em ou associada com as membranas dos lipossomas, como descrito na WO 96/33739. O 3D-MPL ou outro derivado de lipídeo A pode estar presente capturado na membrana dos lipossomas, ou fora dos lipossomas, ou ambos. Um adjuvante particular para o uso na invenção compreende os dois imunoestimulantes QS21 e 3 D-MPL, em uma formulação com lipossomas contendo colesterol, em que o 3D-MPL é capturado dentro dos lipossomas e o QS21 é associado com os lipossomas.
A quantidade da proteína da presente invenção presente em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos colaterais adversos, significantes em vacinas típicas. Tal quantidade variará dependendo de qual imunógeno específico é utilizado e qual adjuvante específico. Geralmente, é esperado que cada dose compreenda 1 a 1000 μg de proteína, por exemplo 1 a 200 μg, por exemplo IOa 100 μg. Uma quantidade ideal para uma vacina particular pode ser verificada por estudos padrão envolvendo a observação de títulos de anticorpo e outras respostas em pacientes.
Um programa de vacinação adequado para o uso com a invenção é um curso primário antes da viagem para uma região endêmica de malária que pode ser concluído por exemplo pelo menos 2 a 4 semanas antes da chegada na região. Este curso primário pode envolver entre 1 e 3 doses, por exemplo 2 ou 3 doses, administradas com um intervalo de pelo menos 7 dias, ou entre 1 e 4 semanas ou por exemplo um mês entre as doses. Um curso de vacinação primário pode ser seguido por reforços repetidos a cada seis meses durante todo o tempo que um risco de infecção existe. Vacinações de reforço periódicas depois podem ser apropriadas antes da repetir a viagem para regiões endêmicas. Quantidades adequadas de proteína RTS,S por dose são como fornecidas aqui acima.
As vacinas da invenção podem ser administradas por qualquer uma de uma variedade de vias tais como oral, tópica, subcutânea, mucosa (tipicamente intravaginal), intravenosa, intramuscular, intranasal, sublingual, intradérmica e por intermédio de supositório.
A invenção pode ser usada ainda em um regime principal- auxiliar heterólogo.
Ao invés de ou além de repetir as doses da RTS5S ou outra composição contendo polipeptídeo, uma forma diferente da vacina pode ser administrada em um regime de vacinação "principal-auxiliar" heterólogo. A composição principal e a composição auxiliar terão pelo menos um antígeno em comum, embora ela não seja necessariamente uma forma idêntica do antígeno; ela pode ser uma forma diferente do mesmo antígeno.
Imunizações principais-auxiliares de acordo com a invenção podem ser realizadas com uma combinação de proteína e polinucleotídeo, particularmente formulações com base em DNA. Uma tal estratégia é considerada ser eficaz em induzir respostas imunes amplas. Vacinas auxiliadas de proteína induzem principalmente anticorpos e respostas imunes de célula auxiliar T, enquanto a liberação de DNA como um plasmídeo ou um vetor vivo induz respostas de linfócito T citotóxico (CTL) fortes. Assim, a combinação de proteína e vacinação de DNA levará em consideração uma variedade ampla de respostas imunes.
Assim a invenção fornece ainda o uso de um antígeno de Plasmódio ou um fragmento imunogênico ou derivado deste e um adjuvante compreendendo um derivado de lipídeo A e uma saponina em uma formulação de Iipossoma5 como descrito aqui, juntamente com um polinucleotídeo que codifica o antígeno de Plasmódio ou um fragmento imunogênico ou derivado deste, na fabricação de um kit farmacêutico para imunizar viajantes para regiões endêmicas contra a infecção por malária produtiva.
A invenção também leva em consideração um kit compreendendo um antígeno de Plasmódio ou um fragmento imunogênico ou derivado deste fornecido na forma liofilizada, um adjuvante compreendendo um derivado de lipídeo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma, e instruções especificando qual o antígeno, adjuvante, e opcionalmente um 19
outro carregador, devem ser misturados antes da administração a um viajante para uma região endêmica, protegendo deste modo o dito viajante contra a infecção por malária produtiva.
Assim onde RTS,S ou uma outra proteína CS com base em polipeptídeo é usada como o componente de polipeptídeo de um regime principal-auxiliar, o componente de polinucleotídeo codificará a proteína CS ou um fragmento imunogênico ou derivado desta.
O DNA pode ser liberado como DNA desnudo tal como DNA de plasmídeo, ou na forma de um vetor vivo recombinante. Os vetores vivos para o uso na invenção podem ser defectivo de replicação. Exemplos de vetores vivos que podem ser usados são vetores de poxvírus incluindo vetores de poxvírus modificados, por exemplo Vírus Ankara Modificado (MVA), vetores de alfavírus por exemplo vetores do vírus da Encefalite Eqüina Venezuelana, ou vetores de adenovírus por exemplo um vetor de adenovírus não humano tal como um vetor de adenovírus de chimpanzé, ou qualquer outro vetor vivo adequado.
Um adenovírus adequado para o uso como um vetor vivo em uma vacina principal-auxiliar de acordo com a invenção é um adenovírus humano soro-prevalente inferior tal como Ad5 ou Ad35 ou um adenovírus de origem não humana tal como um adenovírus de primata não humano tal como um adenovírus símio. Os vetores podem ser defectivos de replicação. Tipicamente estes vírus contêm uma supressão El e podem ser desenvolvidos em linhagens celulares que são transformadas com um gene El. Adenovírus símios adequados são vírus isolados de chimpanzé. Em particular C68 (também conhecido como Pan 9) (Ver a Patente US N- 6083 716) e Pan 5, 6 e Pan 7 (WO 03/046124) podem ser usados na presente invenção. Estes vetores podem ser manipulados para inserir um polinucleotídeo heterólogo de acordo com a invenção tal que os polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser expressados. O uso, formulação e fabricação de tais vetores adenovirais recombinantes são descritos em detalhe na WO 03/046142.
Antígenos de proteína podem ser injetados uma vez ou várias vezes seguido por uma ou mais administrações de DNA, ou o DNA pode ser usado primeiro para uma ou mais administrações seguido por uma ou mais imunizações de proteína. Pode ser benéfico administrar o DNA primeiro, seguido pela proteína.
Assim um exemplo particular de imunização principal-auxiliar de acordo com a invenção envolve a preparação com uma única dose de um polinucleotídeo na forma de um vetor vivo recombinante tal como qualquer um daqueles descritos acima, seguido pelo reforço com uma ou mais doses, por exemplo 2 ou 3 doses, da proteína auxiliada tal como RTS,S com um adjuvante descrito aqui. O polinucleotídeo codifica a mesma proteína (por exemplo, proteína CS) ou um fragmento imunogênico ou derivado desta.
Assim a invenção fornece ainda um kit farmacêutico compreendendo
a) um antígeno de Plasmódio ou um fragmento imunogênico ou derivado deste e um adjuvante compreendendo um derivado de lipídeo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma, e
b) um polinucleotídeo que codifica o antígeno de Plasmódio ou um fragmento imunogênico ou derivado deste;
em que a) e b) são para o uso seqüencialmente em qualquer ordem, mas particularmente em que b) é usado como o principal e a) é usado como o auxiliar. A invenção também leva em consideração instruções com o dito kit, especificando que, em relação a a), o antígeno, adjuvante, e opcionalmente um outro carregador, devem ser misturados antes da administração a um viajante para uma região endêmica.
A composição a) pode ser qualquer composição de polipeptídeo como descrito aqui, em um adjuvante adequado como descrito aqui. Por exemplo a) pode ser uma composição compreendendo RTS,S e um adjuvante compreendendo QS21 e 3D-MPL em uma formulação de lipossoma, e b) pode ser um vetor vivo como descrito aqui tal como um vetor de adenovírus por exemplo, um vetor de adenovírus de chimpanzé, que codifica a proteína CS ou um fragmento imunogênico ou derivado desta.
Tanto a composição principal quanto a composição auxiliar podem ser liberadas em mais do que uma dose. Além disso as doses principais e auxiliares iniciais podem ser acompanhadas com outras doses que podem ser alternadas para resultar em por exemplo, um DNA principal/proteína auxiliar/outra dose de DNA/outra dose de proteína.
Diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis apropriados para o uso na invenção são bem conhecidos na técnica e incluem por exemplo água ou tampões. A preparação da vacina é geralmente descrita (Powell, 1995; Voller, 1978). A encapsulação dentro de lipossomas é descrita, por exemplo, por Fullerton, Patente U.S. 4.235.877. A conjugação das proteínas às macromoléculas é divulgada, por exemplo, por Likhite, Patente U.S. 4.372.945 e por Armor et ai, Patente U.S. 4.474.757.
Em um outro aspecto a invenção fornece um método para determinar se um indivíduo é protegido contra malária a seguir da administração de uma composição de antígeno de malária, em particular uma composição de antígeno de malária pré eritrocítica, ao indivíduo, método este que compreende medir o nível de células T CD4 elevado no indivíduo específico para o antígeno de malária. Também é fornecido um método para determinar se um indivíduo é protegido contra malária a seguir da administração de uma composição de antígeno de malária, em particular uma composição de antígeno de malária pré eritrocítica, ao indivíduo, método este que compreende medir a concentração de anticorpos elevada no indivíduo específico para o antígeno de malária.
Em um outro aspecto a invenção fornece um método para avaliar a eficácia de uma vacina candidata, particularmente uma vacina candidata pré eritrocítica, na prevenção de malária, método este que compreende medir o nível de células CD4 elevado em um indivíduo contra a vacina candidata. Também é fornecido um método para avaliar a eficácia de uma vacina candidata, particularmente uma vacina candidata pré eritrocítica, na prevenção de malária, método este que compreende medir a concentração de anticorpos específicos elevada em um indivíduo contra a vacina candidata. Em uma forma de realização mais específica esta vacina compreende um antígeno de Plasmódio ou um fragmento imunogênico ou derivado deste e um adjuvante compreendendo um derivado de lipídeo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma. Exemplos
Exemplo 1: Vacinação usando RTS5S e Adjuvante B e inoculação de malária experimental. As Vacinas
RTS,S: RTS é uma cadeia de polipeptídeo híbrido de 51 kDa de 424 aminoácidos (a.a.), que consiste de 189 aminoácidos derivados de um antígeno de superfície esporozoíta (as regiões de repetição em tandem central de proteína CS e de terminal carboxila, 189 aminoácidos em total) do parasita da malária P. falciparum cepa NF54 (o antígeno CSP, a.a. 207 a 395), fundido à extremidade de terminal amino da proteína S do vírus da hepatite B. S é um polipeptídeo de 24 kDa (226 aminoácidos de comprimento) correspondendo ao antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg), e é o antígeno usado na vacina Engerix-B® da GSK Biologicals.
As duas proteínas são produzidas intracelularmente em levedura (S. cerevisiae) e espontaneamente encontram-se em estruturas particuladas poliméricas mistas que são todas estimadas a conter aproximadamente 100 polipeptídeos.
A preparação de RTS,S é descrita na WO 93/10152.
Uma dose completa de RTS,S/AS02A (GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart, Belgium) contém 50 μg de antígeno RTS,S liofilizado reconstituído em 500 μΐ, de adjuvante AS02A-emulsão óleo em água contendo os imunoestimulantes 3D-MPL® (GlaxoSmithKline Biologicals, Montana, USA) e QS21, 50 μg de cada.
Uma dose completa de RTS,S/Adjuvante B (GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart, Belgium) contém 50 μg de antígeno RTS,S liofilizado reconstituído em 500 μΐ, de adjuvante B contendo os imunoestimulantes 3D- MPL® e QS21 (50 μg de cada) em uma formulação com lipossomas contendo colesterol. Os lipossomas podem ser preparados de uma mistura de fosfatidilcolina desoléica (DOPC), colesterol e 3D-MPL em solvente orgânico, em que a mistura é seca. Uma solução aquosa depois é adicionada para colocar em suspensão o lipídeo. A suspensão é microfluidizada até que o tamanho do lipossoma seja reduzido para ser filtrável estéril através de um filtro de 0,2 μιη. Tipicamente a razão de colesterol:fosfatidilcolina é de 1:4 (p/p), e a solução aquosa é adicionada para fornecer uma concentração de colesterol final de 5 a 50 mg/ml. QS21 é adicionado aos lipossomas contendo colesterol. Metodologia
Esta experiência clínica tem avaliado a segurança, reatogenicidade, imunogenicidade e eficácia preliminar de uma vacina contra malária contendo o antígeno RTS,S auxiliada com AS02A ou adjuvante B.
.103 pacientes foram recrutados em dois grupos e foram randomizados para receber 3 doses de cada vacina de acordo com um programa de vacinação de 0, 1,2 meses. Por causa dos grandes números de pacientes envolvidos, os grupos foram recrutados e inoculados seqüencialmente.
Para cada grupo, voluntários foram solicitados a passar por uma inoculação de malária primária padronizada (Chulay, 1986) duas a quatro semanas a seguir da terceira dose. A inoculação primária envolveu permitindo que cinco mosquitos Anophelese stevensi infectados com esporozoíta P. falciparum alimentassem em cada voluntário inoculado durante um período de cinco minutos. Para cada grupo, doze voluntários de controle não vacinados também foram inoculados.
Aproximadamente seis meses depois da inoculação primária,
voluntários que foram protegidos na inoculação primária foram convidados a passar por uma inoculação de repetição. Nenhuma dose adicional da vacina foi administrada entre as inoculaçÕes. A inoculação de repetição foi realizada como para a inoculação primária. Para cada grupo, seis voluntários de controle não vacinados também foram inoculados.
Depois de cada inoculação os pacientes foram acompanhados diariamente durante um período de pelo menos 30 dias para avaliar se eles foram infectados com malária. O método de princípio de detectar a infecção foi uma avaliação de um esfregaço de sangue periférico manchado com Giesma para detectar parasitas de estágio assexual por microscopia óptica. Isto indica que um paciente sofreu uma infecção produtiva, com parasitas tendo sido liberados do fígado e progredidos ao estágio eritrocítico. Assim a proteção estéril contra a inoculação não foi obtida. No primeiro sinal de infecção os pacientes foram declarados serem positivos para malária e receberam uma dose curativa de cloroquina. A leitura de eficácia primária foi proteção estéril, que é o paciente que nunca desenvolveu parasitemia de estágio assexual. Além disso o tempo entre a inoculação e o aparecimento da parasitemia naqueles que não foram completamente protegidos foi registrado.
Além disso, amostras de célula mononuclear do sangue periférico (PBMC) foram coletadas na pré vacinação, em 2 semanas pós vacinação II e em 14 a 28 dias pós III (Dia da inoculação: DOC).
Amostras de PBMCs foram usadas para avaliar respostas de célula T CD4 e CD8 por citometria de fluxo de citocina. Esta tecnologia permite a quantificação de células T específicas a uma antígeno dado. Células T CD4 e CD8 específicas de antígeno foram enumeradas por citometria de fluxo seguindo rotulagem por imunofluorescência convencional de fenótipo celular assim como produção intracelular de citocinas. Brevemente, células T CD4 e CD8 específicas de antígeno do sangue periférico podem ser restimuladas in vitro para produzir IL-2, CD40L, TNF-alfa ou IFN-gama quando incubadas com seu antígeno correspondente. Tanto HBs (antígeno de superfície da hepatite B) quanto misturas de CSP de peptídeo foram usados como antígenos para restimular células T específicas de antígeno. Os resultados foram expressados como uma freqüência de células T CD4 ou CD8 que expressam pelo menos duas citocinas diferentes entre CD40L, IL-2, TNF- alfa, ou IFN-gama dentro da sub-população de célula T CD4 ou CD8.
Níveis de anticorpo são determinados avaliando-se respostas de anticorpo (IgG) para a região de repetição de CS de P. falciparum como medido usando metodologias de ELISA padrão com a proteína recombinante R32LR como o antígeno de captura. Brevemente, a proteína R32LR [correspondendo à região de repetição (NANP) da proteína circunsporozoíta de Plasmodium falciparum (CSP)] é revestida em uma placa de 96 reservatórios. Depois da saturação das placas, as diluições seriais de amostras de soro são adicionadas diretamente às placas. Os anticorpos para R32LR presentes na amostra de soro ligar-se-ão à R32LR pré revestida. As placas são lavadas. Um anticorpo IgG(y) anti-humano de cabra rotulado com peroxidase é adicionado, e ele ligar-se-á aos anticorpos IgG anti-CS. Depois de uma outra etapa de lavagem, a adição de uma solução de substrato cromogênio específica para a peroxidase fornece um meio de detectar IgG anti-CS ligado ao antígeno pré revestido. A peroxidase catalisa uma reação com cor. A intensidade da cor formada é proporcional ao título dos anticorpos IgG anti- CS contidos no soro. Níveis de anticorpo anti-repetição são determinados em relação a uma rodada padrão de soro conhecida em cada placa, e são expressados em μg/ml. Resultados
Grupo 1:
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Grupo 2:
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Grupos 1 & 2 combinados para a inoculação primária:
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Assim nesta experiência, o adjuvante B foi descoberto ser mais
eficaz na proteção de indivíduos ingênuos contra a infecção por malária. 50% dos indivíduos inoculados a partir do grupo de adjuvante B foram protegidos comparados a 32% de indivíduos inoculados a partir do grupo AS02A. Isto representa uma melhora na proteção entre os dois adjuvantes de mais do que 50%.
Além disso, no grupo 1, o adjuvante B foi descoberto ser significantemente mais potente do que AS02A para induzir respostas de célula T CD4 dirigidas contra antígenos presentes em RTS,S (Figura l.p = 0,01663). Os dados combinados para os grupos 1 e 2 foram menos significantes (Figura 2. ρ = 0,07).
Antes da vacinação, não houve nenhuma resposta de célula T CD4/CD8 detectável dirigida contra HBs ou CSP. Ao contrário, na 2~ semana pós vacinação II assim como 2~ semana pós vacinação III (DOC: dia da inoculação), células T CD4 específicas de HBs e CSP foram detectadas na maioria dos indivíduos vacinados com ambas as formulações. Nos mesmos pontos no tempo, nenhuma resposta de célula T CD8 detectável foi observada. Estas observações demonstram que o ensaio usado para imunomonitoramento de célula T é específico e sensível, o que é um pré- requisito para realizar a comparação formal entre grupos que receberam formulações de vacina diferentes.
A Figura 1 mostra que indivíduos do grupo 1 vacinados com RTS,S/adjuvante B têm uma freqüência mais alta de células T CD4 específicas de CSP comparados àqueles vacinados com RTS,S/AS02A na 2~ semana pós vacinação II e pós III (DOC). Uma conclusão similar pode ser tirada para células T CD4 específicas de HBs que produzem IFN-gama e uma outra citocina entre IL-2, CD40L, TNF-alfa na 2~ semana pós vacinação II (dados não mostrados).
A Figura 2 mostra o mesmo estudo como a Figura 1, exceto que ela incorpora os dados de ambos os grupos.
Nas Figuras 1 & 2, os resultados são expressados como uma freqüência de células T CD4 que expressam pelo menos duas citocinas diferentes entre CD40L, IL-2, TNF-alfa, ou IFN-gama dentro de IO6 células T CD4.
Um quadro similar pode ser observado em termos de respostas de anticorpo específico anti-CSP. A partir da Figura 5 pode ser observado que a concentração de anticorpos elevada em resposta a RTS,S/Adjuvante B foi significantemente maior do que a concentração elevada em resposta a RTS,S/AS02A (ver particularmente DOC - 2 semanas pós vacinação III (P = 0,00793), mas um efeito é notável 2 semanas pós vacinação II). Os resultados são expressados como concentração média geométrica (GMC). Pré refere-se ao ponto no tempo inicial, antes que quaisquer doses sejam administradas.
Ml refere-se ao ponto no tempo 2 semanas depois da primeira
dose. Μ2 refere-se ao ponto no tempo 2 semanas depois da segunda
dose.
DOC refere-se à 'Data da Inoculação', que é 2 semanas depois da terceira dose.
A proteção contra inoculação de malária é associada com uma resposta de célula T CD4 mais alta significante e resposta do anticorpo específico a CSP.
A imunogenicidade aumentada de RTS,S/adjuvante B comparada a RTS,S/AS02A não necessariamente implica que ela traduzirá em um efeito biologicamente relevante. Entretanto, indivíduos vacinados com RTS,S/adjuvante B nesta experiência mostraram nível de proteção aumentado (18 de 36 indivíduos: 50%) contra inoculação de malária comparados àqueles vacinados com RTS,S/AS02A (14 de 44 indivíduos: 32%). Uma ligação possível entre amplitude da resposta de célula T CD4 e proteção à malária portanto foi descoberta.
Se a hipótese acima for verdadeira, indivíduos protegidos devem ter uma resposta de célula T CD4 mais alta do que indivíduos vacinados com RTS,S/AS02A ou então RTS,S/adjuvante B. Figuras 3 e 4, para o 1~ grupo e os grupos combinados respectivamente (com ambos os grupos de adjuvante misturados), confirmam claramente a hipótese acima e sustentam a idéia de que células T CD4 específicas de CSP desempenham um papel significante na proteção. Consistentemente, a análise estatística feita em amostras coletadas na 2~ semana pós vacinação II assim como 2~ semana pós vacinação III demonstram que a diferença na freqüência entre indivíduos protegidos e não protegidos é estatisticamente significante.
Nas Figuras 3 e 4 os resultados são expressados como uma freqüência de células T CD4 que expressam pelo menos duas citocinas diferentes entre CD40L, IL-2, TNF-alfa, ou IFN-gama dentro de IO6 células T CD4. A análise de imunogenicidade também indica que, ao contrário de células T CD4 específica de CSP, células T CD4 específicas de HBs não são associadas com a proteção contra malária na 2~ semana pós vacinação II assim como 2- semana pós vacinação III (p = 0,14 e ρ = 0,053, respectivamente). Isto consolida ainda a relevância dos resultados acima e fortemente sugere que a proteção é especificamente ligada com a presença de células T CD4 capazes de reconhecer CSP mas não peptídeos HBs.
Finalmente, visto que não existe nenhuma resposta de célula T CD8 detectável, também pode ser concluído que, o mais provavelmente, a proteção do estágio pré eritrocítico da malária conferida por RTS5S auxiliada com o adjuvante B ou AS02A não é provável devido à indução de células T CD8 específicas de CSP a seguir da vacinação.
Um quadro similar é observado a partir do monitoramento de respostas de anticorpo anti-CSP. A Figura 6 mostra concentrações de anticorpo em indivíduos protegidos e não protegidos (resultados referem-se a ambos os grupos com ambos os grupos de adjuvante misturados).
Está claro que aqueles indivíduos que são protegidos mostram uma concentração de anticorpo significantemente mais alta do que aqueles que não são protegidos (P < 0,0001). Discussão
Os resultados acima demonstram claramente que uma associação entre célula T CD4 específica de CSP e respostas de anticorpo por um lado e o estado protetor por outro lado contra a inoculação de malária existe. O mecanismo pelo qual as células T CD4 específicas de CSP ou anticorpos exerceriam um efeito anti-parasítico não é conhecido. Entretanto, a análise também identificou claramente uma minoria de indivíduos tendo uma resposta de célula T CD4 alta ou de anticorpo alta que não são protegidos. Isto significa que a resposta de célula T CD4 forte ou a resposta de anticorpo alta para CSP não prognosticam sozinhos a proteção contra inoculação de malária. Tecnologias diferentes foram desenvolvidas para monitorar as respostas de célula T tais como linfoproliferação, secreção de citocina, manchamento de tetrâmero, elipsot ou citometria de fluxo de citocina. O último foi recentemente selecionado como a tecnologia mais importante na base de dados de repetibilidade/reproducibilidade excelentes assim como detecção de marcador relevante (CD4, CD8, CD40L, IL-2, TNF, IFNg). Uma metodologia analítica específica também foi identificada, que resolve o problema secundário elevado freqüentemente observado com métodos de citometria de fluxo de citocina. O presente relatório demonstra a possibilidade de usar a citometria de fluxo de citocina para o monitoramento robusto de respostas de célula T em uma experiência clínica em ser humano. Além disso, ele também demonstra que é possível identificar um marcador de proteção que não é diretamente ligado à imunidade humoral.
Embora o adjuvante B fosse demonstrado ser significantemente mais potente do que a formulação de AS02A para induzir células T CD4 específicas de CSP e anticorpos, a diferença em termos de freqüência de células T CD4 e concentrações de anticorpo é relativamente modesta e uma pessoa pode ter concluído que ela pode não ser relevante biologicamente. Os dados obtidos nesta experiência clínica permitem a avaliação formal da relevância biológica de tais diferenças usando dados de proteção contra malária como um marcador biologicamente relevante. A análise indica claramente que diferenças modestas mas significantes entre adjuvante em termos de freqüências de célula T e concentrações de anticorpo traduzem em grau significantemente mais alto de proteção contra inoculação de malária. Referências
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<212> PRT
<213> Plasmodium faleiparum
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Asn Ala Asn Pro 1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> Plasmodi um falci parum
<400> 2
Asn Val Asp Pro 1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 3
Pro Val Thr asη 1
Claims (34)
1. Uso de um antígeno de Plasmodium ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo e um adjuvante compreendendo um derivado de Iipideo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para imunizar viajantes para regiões endêmicas contra a infecção por malária produtiva.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o antígeno de Plasmodium é a proteína circunsporozoíta (CS) ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo capaz de promover uma resposta imune contra Plasmodium.
3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína ou fragmento CS é fundido ao antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg).
4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a proteína ou fragmento CS está na forma de uma proteína híbrida compreendendo substancialmente toda a porção terminal C da proteína CS de Plasmodium, quatro ou mais repetições em tandem da região imunodominante de proteína CS, e o antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg).
5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a .4, caracterizado pelo fato de que a proteína híbrida compreende uma seqüência da proteína CS de P. falciparum substancialmente como correspondendo aos aminoácidos 207 a 395 de proteína CS clone 3D7 cepa NF54 de P. falciparum fundida em estrutura por intermédio de um ligador linear ao terminal N de HBsAg.
6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proteína híbrida é RTS.
7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a RTS está na forma de partículas mistas RTS,S.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a quantidade de RTS,S é de 25 ou 50 ug por dose.
9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o adjuvante compreende 3D-MPL e QS21.
10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o QS21 é resfriado bruscamente em lipossomas contendo colesterol.
11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser em combinação com um polinucleotídeo que codifica o antígeno de Plasmodium ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo, em que a mistura de antígeno/adjuvante e o polinucleotídeo são para o uso seqüencialmente em qualquer ordem.
12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é usado primeiro.
13. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreende um antígeno de Plasmodium ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo e um adjuvante, compreendendo um derivado de lipídeo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma, para o uso na imunização de viajantes para regiões endêmicas contra a infecção por malária produtiva.
14. Formulação de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o antígeno de Plasmodium é a proteína circunsporozoíta (CS) ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo capaz de promover uma resposta imune contra Plasmodium.
15. Formulação de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a proteína ou fragmento CS é fundida ao antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg).
16. Formulação de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a proteína ou fragmento CS está na forma de uma proteína híbrida compreendendo substancialmente toda a porção terminal C da proteína CS de Plasmodium^ quatro ou mais repetições em tandem da 13 região imunodominante de proteína CS, e o antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg).
17.Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 16, caracterizada pelo fato de que a proteína híbrida compreende uma seqüência da proteína CS de P, falciparum substancialmente como correspondendo aos aminoácidos 207 a 395 da proteína CS clone 3D7 cepa NF54 de P. falciparum fundida em estrutura por intermédio de um ligador linear ao terminal N de HBsAg.
18.Formulação de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a proteína híbrida é RTS.
19.Formulação de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a RTS está na forma de partículas mistas RTS,S.
20.Formulação de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a quantidade de RTS5S é 25 ou 50 ug por dose.
21.Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 20, caracterizada pelo fato de que o adjuvante compreende 3D-MPL e QS21.
22.Formulação de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o QS21 é resfriado bruscamente em lipossomas contendo colesterol.
23.Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 22, caracterizada pelo fato de que é para o uso como parte de um regime principal/auxiliar, em que uma parte adicional compreende um polinucleotídeo que codifica o antígeno de Plasmodium ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo, em que a mistura de antígeno/adjuvante e o polinucleotídeo são para o uso seqüencialmente em qualquer ordem.
24.Formulação de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é usado primeiro.
25. Uso de um antígeno de Plasmodlum ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo e um adjuvante compreendendo um derivado de lipídeo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um kit para imunizar viajantes para regiões endêmicas contra a infecção por malária, em que o antígeno é fornecido na forma liofilizada e o antígeno e o adjuvante são misturados antes da administração.
26. Uso de acordo com a reivindicação 25 caracterizado pelo fato de que o antígeno de Plasmodlum é a proteína circunsporozoíta (CS) ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo capaz de promover uma resposta imune contra Plasmodlum.
27. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: • um antígeno de Plasmodlum ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo fornecido na forma liofilizada, • um adjuvante compreendendo um derivado de lipídeo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma, e • instruções especificando que o antígeno, adjuvante, e opcionalmente um outro carreador, devem ser misturados antes da administração a um viajante para uma região endêmica, protegendo deste modo o dito viajante contra a infecção por malária produtiva.
28. Kit de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um polinucleotídeo que codifica o antígeno de Plasmodlum ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo; em que a mistura de antígeno/adjuvante e o polinucleotídeo são para o uso seqüencialmente em qualquer ordem, mas particularmente em que o polinucleotídeo é usado como o principal e a mistura de antígeno/adjuvante é usada como o auxiliar.
29. Kit de acordo com as reivindicações 27 ou 28 caracterizado pelo fato de que o antígeno de Plasmodium é a proteína circunsporozoíta (CS) ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo capaz de promover uma resposta imune contra Plasmodium.
30. Método para avaliar a eficácia de uma vacina candidata na prevenção de malária, em particular uma vacina candidata pré-eritrocítica, caracterizado pelo fato de que compreende medir o nível de células CD4 elevadas em um indivíduo contra a vacina candidata.
31. Método para avaliar a eficácia de uma vacina candidata na prevenção de malária, em particular uma vacina candidata pré-eritrocítica, caracterizado pelo fato de que compreende medir a concentração de anticorpos específicos elevados em um indivíduo contra a vacina candidata.
32. Método de acordo com a reivindicação 30 ou reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a vacina compreende um antígeno de Plasmodium ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo e um adjuvante compreendendo um derivado de lipídeo A e uma saponina em uma formulação de lipossoma.
33. Método para determinar se um indivíduo é protegido contra malária a seguir da administração de uma composição de antígeno de malária, em particular uma composição de antígeno de malária pré- eritrocítica, ao indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende medir o nível de células T CD4 elevadas no indivíduo específico para o antígeno de malária.
34. Método para determinar se um indivíduo é protegido contra malária a seguir da administração de uma composição de antígeno de malária, em particular uma composição de antígeno de malária pré- eritrocítica, ao indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende medir a concentração de anticorpos elevados no indivíduo específica para o antígeno de malária.
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Free format text: SOLICITA-SE A REGULARIZACAO DA PROCURACAO, UMA VEZ QUE BASEADO NO ARTIGO 216 1O DA LPI, O DOCUMENTO DE PROCURACAO DEVE SER APRESENTADO NO ORIGINAL, TRASLADO OU FOTOCOPIA AUTENTICADA. |
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