TW200800254A

TW200800254A - Vaccines

Info

Publication number: TW200800254A
Application number: TW095123690A
Authority: TW
Inventors: Joseph D Cohen
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2005-06-30
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2008-01-01
Also published as: EP1896060A1; MX2007016240A; NZ564156A; GB0513421D0; US9279006B2; JP2008544969A; US20080317787A1; JP5486802B2; CA2613057A1; KR20130111648A; PE20070203A1; EA200702633A1; NO20076200L; AU2006265329B2; AR055069A1; CA2613057C; AU2006265329A1; ZA200710615B; UA93508C2; KR20080030640A

Description

200800254 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於瘧疾抗原用於免疫以抗癔疾感染及疾病之新用途。本發明尤其係關於子孢子抗原（尤其係環子孢子 (cs)蛋白或其免疫原性片段或衍生物）與適宜佐劑併用，以對預期會前往疫區旅行之未曾感染癔疾的個體免疫而抵抗癔疾感染之用途。【先前技術】瘧疾係世界上主要之健康問題之一。在20世紀，經濟及社會的發展以及抗癔疾運動已使得瘧疾在世界上大部分地區被根除’使得受影響之地球地面區域由5〇%減少至 27%。然而，基於預期的人口增長，預計在2〇1〇年以前半數世界人口（接近35億人）會生活在瘧疾傳播的地區旧叮， 2004)。當前之估計顯示，每年有遠超過1百萬的人死於瘧疾且僅非洲之經濟損失就令人驚愕（Bremen，2004)。此等數字凸顯了全球之癔疾危機及其對國際健康組織造成的挑戰。造成此危機的原因係多樣的，且其範圍從對現有的、可負擔的及過去高度有效的藥物出現普遍之抗藥 f生，到術生系統的破壞與不足及資源缺乏。除非找到方法去控制此疾病，否則全球為改善健康及兒童存活、降低貧困、增加安全及鞏固最脆弱之社會的努力將會失敗。癔疾亦對通常生活在沒有癔疾的地區而前往疫區旅遊或工作者構成危險。該等危險對此種旅行族群更為嚴重，因為其沒有任何因自然暴露而獲得的對瘧疾之背景免疫。到 112640.doc 200800254 · 癌疾疫區的旅行者所引發之另一危險性，係因該疾病之流感樣症狀而使其在早期經常被誤診。當嚴重性增強加而2 疾最終被診斷出時’可能為時已晚。在症狀增強的幾天内，可能因（例如）腦癔疾或有時由器官（例如肝或腎）衰竭而引起死亡。 *該疾病之最嚴重形式之-係由原生動物寄生蟲惡性癌原蟲（P/似所〇心_ 引發，其為大多數癔疾造成之 • 死亡之原因。該疾病之另一形式係由間曰瘧原蟲 (户/卿⑽請w而）引發以在所有癔疾中傳播最廣泛。除了存纟於熱帶及亞熱帶地區夕卜，該寄生蟲在低至Η 攝氏度之溫度時依然可以完成其蚊體週期之能力使其可在溫帶氣候中傳播。然而由於p. Wvfl ^染很少致命，、對控制户.νζνα瘧疾的努力（藉由疫苗之發展）遠不及對控制惡性癌原蟲癌疾之努力。 ▲ 30年前所做的一項觀察使人們充分相信最終會開發出有 • 纟的癔疾疫苗。藉由用活的、輻射減毒之#疾子孢子免疫可使小鼠及人類受到針對癌疾之保護。保護性免疫之產生及維持需要活體内肝内時期之持續，但其機制理論仍未完全弄清楚。已經顯示，抗體、CD8&CD4 τ細胞（H〇ffman， 1996)為重要之效應物免疫介體。癔疾原蟲（P/似㈣山·請π)(例如惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲）之生活週期係複雜的，其完成需要兩個宿主（人及蚊子）。人的感染係因受感染蚊子唾液中之子孢子之注入而引叙。子孢子遷移至肝並在那襄感染肝細胞（肝臟期广在 112640.doc 200800254 那裏其經由紅血球外的細胞内時期分化至裂殖子期，其可感木紅血球(RBC)以開始在無性血液期中循環複製。藉：在RBC中衫裂殖子分化至由蚊子攝取之有性階段配切細胞完成該循環，《中其藉由—系列在中腸之時期生長以產生可遷移至唾液腺之子孢子。已確定瘧疾原蟲（例如惡性瘧原蟲或間日癌原蟲）之子抱子期為瘧疾疫苗之潛在靶點。已知子孢子之主要表面蛋白為壤子孢子蛋白（CS蛋白）。已將多種菌株之此蛋白選殖、表現並測序，例如惡性瘧原蟲NF54菌株，純系扣7 (Caspers，1989)。來自菌株3D7之蛋白之特徵為具有一中央免疫顯性的重複區，該中央免疫顯性的重複區包括一重稷40次之四肽Asn_Ala_Asn_Pr〇，但交替有四肽Αδη_ν‘ Asp-Pro之四個次要重複。在其他菌株中，主要及次要重複之數量以及其相對位置可有所不同。此中央部分之兩側係由被稱為CS蛋白非重複部分之非重複胺基酸序列組成之 N及C末端部分。基於 CS 蛋白之 GlaxoSmithKline Biologicals，RTS，S癌疾疫苗自1987年開始一直在開發中，且其係當前正在研究的最先進的候選癔疾疫苗（Ballou，2004)。此疫苗特異地輕定間日癔原蟲之紅血球前期。在由岡比亞承擔的涉及成人（Doherty，1999)、6至11歲及1至5歲之兒童（Bojang，2005)之連續時期I研究中使用了 RTS，S/AS02A(RTS，S加上含有存於水乳液中之免疫刺激劑及一油之佐劑AS02A)，其證實該疫苗係安全的、具有良 112640.doc 200800254 好的耐受性及免疫原性。隨後選擇一小兒疫苗劑量並在一涉及1至4歲之莫桑比克兒童之時期I研究中對其實施研究，發現其係安全的、具有良好的耐受性及免疫原性 (Macete) ° RTS，S/AS02A疫苗亦在美國及西非地區之臨床試驗中顯示了效能證據。RTS，S/AS02A可引發對惡性癔原蟲環子孢子蛋白及實質T細胞免疫顯著之IgG抗體反應（Lalvani，1999; Sun，2003)。已估計，在美國在未曾感染瘧疾的志願者中進行的抗惡性瘧原蟲實驗攻擊之效能為平均約30至 50%(Stoute，1997; Stoute 1998; Kester，2001) 〇在一小規模試驗中，此等研究之第一項（Stoute，1997)係86%有效，其中7個用RTS，S/AS02A免疫之個體中有6個受到保護。此外，在岡比亞進行的一項半免疫成人之實地研究（其前進行了岡比亞成人中之安全研究（Doherty，1999))顯示經一個15周的傳播季節時段整體效能為34%，在跟蹤研究之最初9周其效能為71%且在之後的效能為0%(Bojang，2001)。此等研究（Stoute，1997; Stoute，1998; Bojang，2001; Kester， 2001)展示抗感染之效能。最近報導了在非洲兒童中用RTS，S/AS02A進行的一項試驗之結果。發現基於CS蛋白之RTS，S疫苗不僅可賦予在天然暴露下抗感染之保護性而且可賦予抗由惡性癔原蟲引起的廣譜臨床疾病之保護性。接受RTS，S疫苗之兒童較對照組中之彼等經歷較少的嚴重負面事件、住院及由癔疾引起之嚴重併發症（包括死亡）(Alonso，2004)。 Π 2640.doc 200800254 此外，RTS，S疫苗預防新感染或臨床發作之效能似乎並不減少或緩慢地減少。在試驗中6個月跟蹤研究結束時，該疫苗依然保持有效，因為在感染流行時有明顯差別。此與先前在未曾感染瘧疾的志願者或在岡比亞成人中進行之。式驗形成對比，該等先前試驗表明rts，s之疫苗效能僅短期存活（Stoute，1998; Bojang，2001)。此外，在一 12個月之

額外跟蹤期後，觀察到該疫苗預防臨床癔疾發作之效能並未顯者減少（Alonso，2005)。雖然上述疫苗調配物可顯示臨床效能，但依然需要另外的改良以增加受保護個體之數目以及保護持久性。新穎佐劑凋配物（例如含有存於含有調配物之脂質體中之QS21及 3D-MPL之調配物，在本文中稱為佐劑B)已在各種臨床前及臨床研究中展示出促進τ細胞免疫反應之較高效能。 /特定而言，不來自瘧疾發病地區但將去瘧疾流行地區旅仃-有限時期者所用之疫苗需要針對感染之更強保護。癌疾之臨床表現僅在有可導致裂殖子形成及其自肝臟期釋放、肝增殖性感染時才發生。隨後此等裂殖子可感染㈣並該:生蟲致病的血液期從而引起有症狀的臨床廬疾。 • *路後,又有增殖性感染（即沒有肝的感染及/或不釋放肝4，子）’則稱此為無增殖免疫。如上文定義在蚊咬後 ::、員者降低增殖性肝感染危險之疫苗對未預存有免疫性之、九者群體而。係非常理想的，因為藉由預防增殖性肝臟二：’該疫苗將預防任何隨後之臨床表現。可將此與指向之兒童或人之，卢結又汗1赉之目的相對比，其中主要目的 112640.doc 200800254 係為降低疾病之嚴重性及/或降低疾病發作之數目，但不必對其進行完全預防。理論上，不可能無限期地維持對疫區的人的無增殖保護，因此其需要藉由暴露於瘧疾感染而增強其自身免疫性。此外，給予生活在疫區之人延長的然而有限時期的無增殖保護係不明智的。【發明内容】吾人於本文中闡述了一在未曾感染癔疾之群體中進行 _ (參見實例）的攻擊臨床試驗，其由RTS，S/AS02A對含有一不同佐劑（佐劑B)(其包含QS21及3D-MPL於一具有含膽固醇脂質體之調配物中）之RTS，S之齊頭式比較組成。其中對 T及B細胞兩者介導的免疫皆進行了研究。該等結果展示在未曾感染癔疾之成人群體中與佐劑B組合之RTS，S抗原在癔疾攻擊後在抗增殖性肝臟感染之保護方面較RTS，S/AS02A之有效性高出大於5〇%。因此，與佐劑B組合之RTS，S抗原在去瘧疾疫區旅行之未曾感染瘧疾的籲個體所舄之無增殖保護方面更有效。由佐劑B賦予之此增加的效能同增加的抗原特異性免疫反應（抗體及CD4_Thl τ 細胞）有關。因此，本1¾明k供一癔原蟲抗原或其一免疫原性片段或衍生物及包含存於一脂質體調配物之一脂質A衍生物及一皂苷在製造用於對則往疫區之旅行者實施免疫以抵抗增殖性瘧疾感染之醫藥中之用途。通常，前往疫區之旅行者從未感染過瘧疾。因此，本發明可應用於未曾感染瘧疾的個體。 112640.doc -10- 200800254 "本發明尤其係關於減少增殖性癔疾感染在前往疫區之旅行者（其可係任何年齡但尤其係成年人）中之發病率。本發明H樣提供_包含原蟲抗原或其一免疫原1·生的片&或街生物及包含存於一脂質體調配物中之一脂質A衍生物及—直接 _ 甚苷之一佐劑並用於對前往疫區之旅行者貝施免疫以抵抗增殖性瘧疾感染之調配物。本毛明之第二態樣提供一種預防前往疫區之旅行者之增籲録癔疾感染之方法，該方法包括投予適宜量之包含一癌原、蟲抗原或其免疫原性片段或衍生物及—包含存於一脂質體調配物中之一脂質A衍生物及一皂苷之佐劑。 ▲在本發明之_實施例中，㈣原蟲抗原係—惡性癌原蟲抗原在本發明之另一實施例中，該癌原蟲抗原係一間日瘧原蟲抗原。適且地，该抗原係一紅血球前期抗原。舉例而言，該抗原可選自任何在該寄生蟲之子孢子或其 • 他紅血球前期（例如肝臟期）表達的抗原。舉例而言，該抗原可選自環子孢子（CS)蛋白、肝臟期抗原_1(LSA_1}(參見例如WO 2004/044167)、肝臟期抗原_3(LSA_3)(闡述於（例如洲專利弟〇 570 489號及歐洲專利第〇 833 917號中）、 Pfs 16 kD(闡述MW0 91/18922及歐洲專利第597 843號中）、輸出抗原-1(Εχρ·1)(闡述於（例如）Meraidi等人2002,

Parasite Immuno^ 24(3)卷：141)、子孢子蘇胺酸天冬醯胺豐富的蛋白質（STARP)、子孢子及肝臟期抗原 (SALSA)、凝血酶敏感素相關無名蛋白質（trapx闡述於 112640.doc 200800254 WO 90/01496、WO 91/11516 及 WO 92/11868)及頂部裂殖子抗原-1(闡述於歐洲專利第〇 372 〇19號）（最近已顯示其除紅血球期外亦出現於肝臟期）。所有此等抗原在皆係該領域中所热知者。該抗原可係完整的蛋白質或其免疫原性片段或此等之一之衍生物。癔疾抗原之免疫原性片段係吾人所熟知者’例如來自AMA_〗之胞外結構域（闡述於（例如）WO 02/077195中）。衍生物包括（例如）與可係癔疾蛋白或非瘧疾蛋白（例如HBsAg)之其他蛋白之融合。本發明之衍生物能夠提高針對天然抗原之免疫反應。該癌原蟲抗原可融合至來自B型肝炎之表面抗原 (HBsAg)。一用於本發明之特殊抗原係源自環子孢子（CS)蛋白且可呈與HBsAg之融合蛋白形式。該抗原可係完整（：8蛋白或其部分，包括CS蛋白之一個或多個片段（(：8蛋白之片段可融合在一起）。基於CS蛋白之抗原可呈包含瘧原蟲以蛋白之實質上完整C末端部分、cs蛋白免疫顯性區之四個或四個以上串聯重複及來自B型肝炎之表面抗原（HBsAg)之一融合蛋白形式。该融合蛋白可包含一含有至少16〇個胺基酸且實質上與CS蛋白之c末端部分同源之序列。特定而言，"實質上完整CS蛋白之C末端部分包括缺乏疏水錨定序列之c末端。而且，對於惡性癔原蟲抗原而言，其包含4個或4個以上 (例如10個或1〇個以上）之Asn-Ala_Asn_p⑺四肽重複基序。該cs蛋白可缺乏自c末端之最後12個胺基酸。 112640.doc -12 - 200800254 用於本發明之融合蛋白可係一包含實質上對應於惡性瘧原蟲3D7純系207至395之胺基酸的惡性瘧原蟲CS蛋白之一部分的蛋白，其源自經由線形連接子順融合至HBsAg之N 末端之菌株NF54(Caspers，1989)。該連接子可包含來自 HBsAg之前S2之一部分。用於本發明之CS結構係如在WO 93/101 52中所述。一個特定結構係稱作RTS之融合蛋白，如WO 93/10152(其中將其表示為RTS*)及WO 98/05355中所闡述，兩專利之全部内容皆以引用的方式併入本文中。用於本發明之一特定融合蛋白係稱作RTS之融合蛋白，其由以下物質組成： • 一由源自釀酒酵母菌（Sacchromyes cerevisiae)TDH3基因序列、由核苷酸1059至1061編碼之甲硫胺酸殘基 (Musti，1983)。 •三個胺基酸Met Ala Pro，其源自藉由用來構建融合基因之選殖程序產生的核苷酸序列（1062至1070)。 • 一具1 89個胺基酸之延長段，其由表示惡性瘧原蟲菌株3D7之環子孢子蛋白（CSP)之胺基酸207至395之核苷酸 1071 至 1637編碼（Caspers，1989)。 • 一由藉由用於構建融合基因之選殖程序產生、由核苷酸1638至1640編碼的胺基酸（Gly)。 •四個胺基酸Pro Val Thr Asn，其由核苷酸1641至1652 編碼並表示B型肝炎病毒（adw血清分型）前S2蛋白質之四個叛基端殘基（Valenzuela，1979) 〇 112640.doc -13- 200800254 •具226個胺基酸之延長段，其由核苷酸1653至2330 編碼並指明B型肝炎病毒（adw血清分型）之S蛋白。該RTS可呈RTS，S混合顆粒形式。該RTS，S顆粒包含兩種多肽挪及8，該兩種顆粒可同時合成並在（例如）純化中自發形成複合顆粒結構（rts，s)。 4 RTS蛋白可在酵母中（例如釀酒酵母菌）中表現。在此伯主中’ RTS可表現為脂蛋白顆粒。該受體酵母菌株可已在其基因組中攜帶有幾個完整的B型肝炎s表現盒複本。因此，所得菌株可合成兩種多肽0及RTS)，其自發地共裝配成混合的（RTS’S)脂蛋白顆粒。此等顆粒可在其表面呈現琺&之CSP序列。在此等混合的顆粒中RTS & s可以一特定比率（例如1:4)存在。另瘧疾抗原或其片段或衍生物在本發明中之用途亦涵盖於本發明中。其他紅血球前期抗原（例如Αμα」、LSA_ 1 LSA_3(舉例而言，闡述於歐洲專利第0 57❶489號及歐洲專利第0 833 917號）)及Pfs μ ]^可與111^，8組合使用。或者RTS，S可與一血液期抗原（例如裂殖子表面蛋白_ UMSP-1)，闡述於（例如）美國專利第4,837,〇16號）、紅血球紇合抗原-175(EBA-175)或MSP-3(闡述於（例如）歐洲專利第〇 666 916號）組合使用。如本文所述任一抗原之免疫原性片段可包含抗原之至少一之抗原決定部位並顯示瘧疾抗原性且當以一適宜結構存在時（例如當融合至其他瘧疾抗原或其他非癔疾抗原、或存在於一載體上時）能夠增強免疫反應，該免疫反應直接 112640.doc -14- 200800254 針對天然抗原。通常該免疫原性片段包含至少μ個或至少 50個或至少1〇〇個取自該瘧疾抗原的連續胺基酸。如本文所述抗原或片段之衍生物同樣包含抗原之至少一個抗原決定部位並顯示瘧疾抗原性且能夠增強免疫反應，該免疫反應直接針對天然抗原。衍生物包括（例如）癔^抗原與其他蛋白（其可係其他癔疾I白或非其他癔疾蛋白且可係（例如）HBsAg)之融合物。根據本發明，該純化的融合蛋白之一水性溶液可直接使用並可與本發明之適宜_結合4者，可在與該佐劑混合前將該蛋白凍乾。該佐劑可係液體並因此用於將該抗原重構成為液體疫苗形式。因此如本文所述，本發明進一步提供癔原蟲抗原或其免疫原性片段或衍生物及一包含存於一脂質體調配物中之一脂質A衍生物及一皂苷之佐劑在製造用於對前往疫區之旅行者實施以抵抗瘧疾感染之套組中之用途，其中該抗原以凍乾的形式提供且該抗原及該佐劑係在投予前進行混合。本發明之疫苗劑量可介於1至100微克RTS，S/劑量之間，例如25至75微克RTS，S，例如50微克RTS，S蛋白之劑量，其可以500微升（最終液體調配物）存在。此係用於成人之適宜劑量。用於兒童之適宜劑量為成人劑量之一半，即25微克 RT S, S ’其可以2 5 0微升（最終液體調配物）存在。對於其他抗原可使用類似劑量。根據本發明’該抗原係與一包含存於一脂質體調配物中之一脂質A衍生物及一皂苷之佐劑結合。 112640.doc -15- 200800254 本發明之適宜佐劑係來自任何來源之解毒脂質A及脂質 A之無毒衍生物，解毒脂質A及脂質A之無毒衍生物係Thl 細胞反應（本文亦稱作Th 1型反應）之較佳刺激物。免疫反應可粗略地分成兩種極端類型··體液免疫反應或細胞介導的免疫反應（慣例上其特徵分別為抗體保護機制及細胞效應子保護機制）。此等反應類型稱作Th 1型反應 (細胞介導的反應）及Th2型免疫反應（體液反應）。極端Thl型免疫反應之特徵係可產生抗原特異性單倍體型限制性細胞毒性T淋巴細胞及自然殺傷細胞反應。在小鼠中Thl型反應之特徵常常係產生IgG2a亞型抗體，而在人類中此#對應於IgG 1型抗體。Th2型免疫反應之特徵係可產生一系列同型免疫球蛋白，包括小鼠中之IgG1。可逐為此兩種類型之免疫反應之發展的背後推動力係細胞因子。尚水平之Th 1型細胞因子往往有利於引發對該抗原之細胞介導的免疫反應，而高水平之Th2型細胞因子往往有利於引發對該抗原之體液免疫反應。

Th 1及"ΓΙι2型免疫反應的區別並非絕對的，且可採取介於該兩個極端之間之連續形式。實際上，一個體可支持一闡述為以Thl或Th2佔優勢之免疫反應。然而，根據由

Mosmann及Coffman在小鼠CD4 +ve T細胞選殖中闡述的内容（Mosmann，1989)考慮細胞因子家族常常很方便。一般上’ Thl型反應與T淋巴細胞之INF-γ細胞因子產生相關。其他常常直接與Thl型免疫反應之引發有關的細胞因子並非由T細胞產生，例如il-12。與此相反，Th2型反應與IL· II2640.doc -16 - 200800254 *、比-5、IL-6、IL-10及腫瘤壞死因子-p(TNF-p)之分泌有關。已知某些疫苗佐劑尤其適於刺激Thl或者Th2型細胞因子反應。傳統上，疫苗接種或感染後免疫反應之Thl:Th2平衡之指標包括直接量測在用抗原再刺激後活體外T淋巴細胞之Thl或Th2細胞因子之產生量，及/或量測（至少在小鼠中）抗原特異性抗體反應之IgGi:igG2a比率。 φ 因此，一 Thl型佐劑係當用抗原體外再刺激時可刺激分離的τ細胞群體產生高水平Th i型細胞因子且引發與J型同型有關的抗原特異性免疫球蛋白反應之佐劑。 WO 94/00153及WO 95/17209中對能夠優先刺激Thl細胞反應之佐劑進行了闞述。很久以前人們就已經瞭解了腸桿菌脂多醣（Lps)係一潛在免疫系統刺激劑，但其毒性作用減少了其於佐劑中的應用。有人已闡述了一藉由自還原末端葡萄糖胺去除核心碳 • 水化合物基團及磷酸鹽而產生的LPS無毒衍生物（單磷醯脂質A(MPL))(Ribi，1986)，且其具有以下結構· 112640.doc 17- 200800254

產生’稱其為3-0-脫酿單構酿脂質A(3D-MPL)。其可夢由教示於英國專利第2122204Β號中之方法來純化及製備，該參考文獻亦揭示二鱗醯脂質Α及其3-0 -脫醯變異體之製備。用於本發明中之一特定形式之3D-MPL係呈具有直徑小於0.2微米之小顆粒大小的乳液形式，且其製造方法揭示於WO 94/21292中。包含單磷醯脂質A及一表面活性劑之水性調配物已闡述於WO98/43 670中。擬用於本發明中之源自細菌脂多糖之佐劑可自細菌源純化及加工，或另一選擇為其可人工合成。舉例而言，純化的單磷醯脂質A由Ribi等人闡述（Ribi，1986)，且源自沙門氏菌屬印.）之3-0_脫醯單磷醯或二磷醯脂質a 闡述於英國專利第2220211號及美國專利第4912094號中。 112640.doc •18- 200800254 其他純化的及合成的脂多糖已有闡述（Hilgers，1986 ; Hilgers，1987 ;歐洲專利第〇 549 074 B1號）。用於本發明之一特定的細菌脂多糖之佐劑係3D-MPL。因此，可用於本發明之LPS衍生物係彼等在結構上與 LPS或MPL或3D-MPL類似之免疫刺激劑。在另一選擇中，該等LPS衍生物可係一醯化單醣，其係上述MPL結構之子部分。皂苷亦係Thl免疫刺激劑。皂苷係熟知之佐劑（Lacaille_ Dubois，1996)。用於本發明之適宜皂苷包括免疫活性皂苷（例如Quil A(源自南美皂皮樹（South American tree Quillaja Saponaria Molina)之樹皮）及其免疫活性部分）已闡述於美國專利第5,057,540號中及，，Saponins aS vaecine adjuvants" (Kensn，1996)及歐洲專利第〇 362 279 B1 號中。溶血性皂苷QS21及QS17(經HPLC純化之Quil A組份）已被闡述為有效的全身佐劑，且其生產方法揭示於美國專利第5,057,540號及歐洲專利第〇 362 279 B1號中。在此等參考文獻中亦闡述了擔當全身疫苗之有效佐劑的 QS7(Quil-A之非溶血組份）之用途。QS21之用途由Kensil等人進一步闡述（Kensil，1991)。QS21與聚山梨醇酯或環糊精之組合亦為人們所瞭解（WO 99/10008)。包含QUUA部份 (例如QS21及QS7)之微粒佐劑系統闡述於w〇 96/3 373 9及 WO 96/11711 中。上述用於本發明之脂多糖及皂苷免疫刺激劑係與一脂質體載體一起調配。舉例而言，該載體可包含如W〇 112640.doc -19- 200800254 96/33739中所述含有膽固醇之脂質體。單磷醯脂質A與皂苷衍生物之組合闡述於WO 94/ 00153 ； WO 95/17210 ； WO 96/33739 ； WO 98/56414 ； WO 99/12565 ; WO 99/11241 中，且QS21 與3D-MPL之組合揭示於 WO 94/00153 中。因此，用於本發明之適宜佐劑系統包括（例如）一單磷醯脂質A(例如3D-MPL)與皂苷衍生物之組合，特定而言如 WO 94/00153中揭示的QS21與3D-MPL之組合。該佐劑系統包括一（例如）存於一組合物中之脂質體載體（例如含有膽固醇之脂質體），其中在如WO 96/33739中揭示的含有膽固醇之脂質體（DQ)中受到抑制。因此，如WO 96/33739中所述，該皂苷（例如QS21)亦可存在於該等脂質體之膜中或與該等脂質體之膜相連。3D-MPL或其他脂質A衍生物之存在方式為：被捕獲於該等脂質體之膜中、或於該等脂質體之外部，或以上兩種方式兼有。一用於本發明之特定佐劑包含兩種存於具有含有膽固醇之脂質體之調配物中之免疫刺激劑QS2 1及3D-MPL，其中3D-MPL係被捕獲於該等脂質體内部而QS21係與該等脂質體相連。在典型疫苗中，存於每一疫苗劑量中之本發明蛋白質之數量應係可引發免疫保護反應而無顯著不良副作用之量。此數量可端視所用之特定免疫原及特定佐劑而定。通常，預期每一劑量會包含1至1000微克蛋白質，例如1至200微克，例如10至100微克。對一具體疫苗而言之最佳量可藉 112640.doc -20- 200800254 由涉及觀察受試者中 p ^ 百甲之抗體滴度及其它反應之標準研究來確定。 :本兔月之適且疫苗接種計劃表係去癔疾疫區旅行前最初私序1在到達該地區前(例如)至少2至4週完成誃程序°此最初程序可涉及1次與3次之間之劑量（例如2次^ 3人Μ里）’以至少7天、或1週與4週之間或（例如）一個月之劑量間間隔投予。最初疫苗接種程序之後，只要存在感毕，風險則應每六個月進行一次重複加強。於是定期加強疫苗接種適於在前往疫區之再次旅行前使用。每一劑量之 Rts，s蛋白之適宜量如上文所述。本發明之疫苗可藉由多種途徑中之任_種投予，例如經口、外敷、經皮下、經黏膜(通常係陰道内）、經靜脈内、經肌内、經鼻内、經舌下、經皮内及經栓劑投予。本發明可進一步用於異源基礎免疫_補強免疫計劃。替代或除RTS，S或其他含有多肽之組合物之重複劑量外，可在一異源"基礎免疫-補強免疫"疫苗接種方案中投予該疫苗之不同形式。該基礎免疫組合物及該補強免疫組合物將具有至少一種共同抗原，但其不必係同樣的抗原形式；其可係相同抗原的不同形式。本發明之基礎免疫-補強免疫可用蛋白質與聚核菩酸、尤其係基於DN A之调配物之組合來實施。此一策略據認為可有效引發廣泛的免疫反應。佐劑化蛋白質疫苗主要引發抗體及τ辅助免疫反應，而作為質粒或活載體之DNA之輸送則誘導強細胞毒性T淋巴細胞（CTL)反應。因此，蛋白質 112640.doc •21 - 200800254 與DNA疫苗接種之組合將產生多種免疫反應。因此本發明進一步提供一癔原蟲抗原或其免疫原性片段或衍生物及一包含存於一脂質體調配物中之一脂質A衍生物及一皂苷之佐劑(如本文所述）連同編碼該瘧原蟲抗原或其一免疫原性片段或衍生物之聚核苷酸在製造用於對前往疫區之旅行者實施免疫以抵抗增殖性癔疾感染之醫藥套組中之用途。本發明亦提供一套組，該套組包括：一以凍乾形式提供的瘧原蟲抗原或其免疫原性片段或衍生物、一含有存於脂質體調配物中之一脂質A衍生物及一皂苷之佐劑、及說明在投予前往疫區之旅行者之前將該抗原、佐劑及視情況另一載體混合之說明書，藉此防止該旅行者受到增殖性瘧疾感染。因此於將RTS，S或其他基於CS蛋白之多肽用作基礎免疫_ 補強免疫計劃之多肽組份處，該多肽組份應編碼cs蛋白或其免疫原性片段或衍生物。該DNA可作為裸露DNA(例如質粒DNA)或以重組活載體之形式遞送。用於本發明之活載體可係具複製缺陷者。可使用之活載體之實例可係痘病毒載體（包括改良的痘病毒載體，例如改良的安卡那（Ankara)病毒（MVA))、阿爾法病毒載體（例如委内瑞拉馬腦炎（Venezuelian Equine ncephalitis)病母载體）或腺病毒載體（例如非人類腺病毒載體（例如黑猩猩腺病毒載體）），或任何其他適宜的活載體。在本發明之基礎免疫-補強免疫疫苗中用作活載體之適 112640.doc -22- 200800254 宜腺病毒係低血清流行性人類腺病毒，例如Ad5‘Ad35，或非人源腺病毒，例如一非人類靈長類動物腺病毒（例如猿腺病毒）。該等載體可係複製缺陷的。通常此等病毒含有E1缺失且能在用E1基因轉化的細胞系中生長。適宜之猿腺病毒係自黑猩猩分離之病毒。具體而言C68(亦稱為卩⑽ 9)(參見美國專利第6〇83 716號）及pan 5、6及7(w〇 03/046124)可用於本發明。此等載體可經操縱以插入本發響明之一異源聚核甞酸，以使本發明之多肽可得到表現。此等重組腺病毒載體之用途、調配及製造詳細闡述於W0 03/046142 中。蛋白質抗原可注射一次或幾次，接著一次或多次投予 DNA，SDNA可首先用於一次或多：欠投予，接著實施一次或多次蛋白質免疫。先投予DNA隨後投予蛋白質可係有益的。因此本發明一基礎免疫-補強免疫之具體實例包括用呈 _ 重組活載體形式（例如上述彼等之任一種）之單劑量聚核苷酸基礎免疫，接著用一次或多次劑量（例如2次或3次劑量）之佐劑化蛋白質（例如帶有本文所述佐劑之RTS，S)實施補強。該聚核甞酸編碼相同蛋白質（例如cs蛋白）或其一免疫原性片段或衍生物。因此本發明進一步提供一種醫藥套組，其包含： a) 一瘧原蟲抗原或其一免疫原性片段或衍生物及一包含存於脂質體調配物中之一脂質A衍生物及一皂苷之佐劑，及 112640.doc -23- 200800254 b)編碼该瘧原蟲抗原或其一免疫原性片段或衍生物之聚核苷酸；其中a)及b)以任-次序依序使用，但特定而言其中b)係用作基礎免疫而a)係用作補強免疫。本發明亦提供該套組之使用及明書’该說明書說明：就a)而t，係在投予前往疫區之旅行者之前將該抗原、佐劑及視情況另一載體混合。該組合物a)可係任一存於如本文所述適宜佐劑中之如本文所述多肽組合物。舉例而言幻可係包含RTS，S&一存於脂質體調配物中之含有QS21& 3D_MPL之佐劑之組合物，且b)可係編碼CS蛋白或其一免疫原性片段或衍生物之如本文所述活載體，例如腺病毒載體（例如一黑猩猩腺病毒載體）。該基礎免疫組合物及該補強免疫組合物兩者皆可以一次以上之劑量遞送。另外，在基礎免疫及補強劑量之後可使用可交替變化之其它劑量以達成例如DNA基礎免疫/蛋白質補強/其它DNA劑量/其它蛋白質劑量。用於本發明之適宜醫藥上可接受之稀釋劑或賦形劑係業内所熱知者且包括（例如）水或緩衝劑。疫苗製備係一般所闡述者（Powell，1995 ; Voller，1978)。舉例而言，至脂質體中之包囊作用由Fullerton闡述於美國專利第4,235,877號中。舉例而言，蛋白質至大分子之結合由Likhite揭示於美國專利第4,372,945號中且由Armor等人揭示於美國專利第 4,474,757號中。本發明之另一癌樣提供一種用於確定在一癔疾抗原組合 112640.doc -24 - 200800254 物尤其係紅血球前期瘧疾抗原組合物投予一個體後該個體是否受到了預防瘧疾之保護的方法，該方法包括量測個體中對该癔疾抗原具特異性之升高的CD4 1細胞水平。本文亦提供一種確定在將一癔疾抗原組合物、尤其係紅血球則期瘧疾抗原組合物投予一個體後該個體是否受到預防癔疾之保遵之方法’該方法包括量測個體中對該癔疾抗原具特異性之升高的抗體濃度。本發明之另一態樣提供一種用於評估一候選疫苗、尤其係一紅血球前期候選疫苗在預防瘧疾中之效能之方法，該方法包括量測個體中針對該候選疫苗之升高的Cd4細胞水平。本文亦提供一種用於評估一候選疫苗、尤其係一紅血球前期候選疫苗在預防瘧疾中之效能的方法，該方法包括 ΐ測個體中針對該候選疫苗升高的特異性抗體濃度。在另一具體實施例中，此疫苗包含一瘧原蟲抗原或其免疫原性片段或衍生物及一包含存於脂質體調配物中之一脂質Α衍生物及一皂苷之佐劑。【實施方式】實例實例1 ··使用RTS，S及佐劑B之疫苗接種及實驗性瘧疾攻擊疫苗 RTS，S : RTS，S係一具有424個胺基酸（a.a·)之51 kDa融合多狀鏈’其由源自癔疾寄生蟲惡性癔原蟲菌株NF54(csp 抗原’胺基酸207至395)之子孢子表面抗原（該以蛋白中心串聯重複及C末端區，共計189個胺基酸）之ι89個胺基酸組 112640.doc -25 - 200800254 成，融合至該B型肝炎病毒S蛋白之胺基末端。S係一對應於B型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)之24 kDa多肽（226個胺基

I 原。該兩種蛋白質在酵母（釀酒酵母菌）中於細胞内生產並自發組裝成混合的聚合顆粒結構，估計每一顆粒結構包含約 100個多肽。 RTS，S之製備闡述於WO 93/10152中。一總劑量的 RTS，S/AS02A (GlaxoSmith Kline Biologicals， Rixensart，比利時）包含50微克凍乾的RTS，S抗原，該抗原再構成於500微升AS02A佐劑一含有免疫刺激劑3D-MPL⑧（GlaxoSmithKline Biologicals、Montana、美國）及 QS21各50微克之水包油乳液中。一總劑量的 RTS，S/佐劑 B(GlaxoSmithKline Biologicals ’ Rixensart，比利時）包含50微克再構成於500微升佐劑B中之凍乾的RTS，S抗原，該佐劑B含有存於帶有含有膽固醇之脂質體之調配物中的免疫刺激劑3Ό-ΜΡΙ^& QS21各50微克。該等脂質體可自存於有機溶劑中之去油酸磷脂醯膽驗 (DOPC)、膽固醇及3D-MPL之混合物製備，其中該混合物係經完全乾燥。隨後加入一水性溶液以懸浮該脂質。將該懸浮液微流體化直至將該脂質體之大小減至可無菌過濾通過一 0.2微米濾器。通常，膽固醇：卵磷脂之比率係1:4(重量/重量），並加入水性溶液以獲得5至50毫克/毫升之最終膽固醇濃度。將QS21加入含有膽固醇之脂質體中。 112640.doc -26- 200800254 方法此臨床試驗已評估了含有用AS〇2A或佐劑b輔助的抗原 RTS，S的癔疾疫苗的安全性、致反應力、免疫原性及初次效能。將招募的103個受試者分成兩組並根據〇、1、2個月之疫苗接種計劃表隨機地接受3次劑量之任一疫苗。由於涉及大量受試者，各組在招募後係依序受到攻擊。對於每一組，要求志願者在第三次劑量後2至4周接受一標準化的初次癔疾攻擊（chulay，1986)。初次攻擊包括使5 個經惡性瘧原蟲子孢子感染的斯蒂芬斯按蚊 Weve似/)叮咬每個攻擊志願者5分鐘之時間段。對於每一組，亦攻擊12個未經疫苗接種的對照志願者。在初次攻擊後約六個月，要求在該初次攻擊中受到保護的志願者接受-重複攻擊。在攻擊之間不投予另外劑量之疫田。對於初次攻擊實施重複攻擊。對於每一組，亦攻擊六個未經疫苗接種的對照志願者。在每一攻擊後，在至少30天之時㈣每天跟蹤受試者以評估其是否已受到瘧疾感染。檢測感染之主要方法係評估吉姆薩（GieSma)染色的外周血液塗片以藉助光學顯微鏡檢 ^測無性期寄生蟲。此表明受試者已經歷了-增殖性感染’寄生蟲已自肝釋放出且發展至紅血球期^因此未達成針對攻擊之無增殖保護。t出現首個錢跡象時，即宣佈受試者對癔疾呈陽性並使其接受一治療劑量之氯查寧。該初次效能^值讀㈣無增殖保護，即該受試者從未顯現出/ 112640.doc -27- 200800254 無性期寄生蟲血症。另外記錄了未受到完全保護之彼等中介於攻擊與寄生蟲血症之出現之間的時間。此外，在疫苗接種前、在Π接種後2週及在III接種後14 至28天（攻擊日：DOC)採集外周血單核細胞（PBMC)樣品。使用PBMC樣品藉由細胞因子流式細胞儀評估CD4及 CD8 T細胞反應。近來之技術容許對一給定抗原具特異之 T細胞進行量化。在細胞表型之習知免疫螢光標記及細胞内細胞因子之產生後藉由流式細胞儀對抗原特異性CD4及 CD8 T細胞進行計數。簡言之，可在活體外重新刺激外周血抗原特異性CD4及CD8 T細胞以在用其對應抗原進行培養時產生IL-2、CD40L、TNF-α或IFN-γ。HBs(B型肝炎表面抗原）及胜肽之CSP庫兩者皆可用作再刺激抗原特異性T 細胞之抗原。結果表示為在CD4或CD8 T細胞亞群中表現 CD40L、IL-2、TNF-α、或IFN-β中之至少兩種不同細胞因子的CD4或CD8 T細胞之頻率。抗體水平係藉由評價抗體（IgG)對惡性癔原蟲CS重複區之反應（此係用重組蛋白R32LR作為捕捉抗原使用標準 ELISA方法測得）而測定。簡言之，將該R32LR蛋白[對應於惡性癔原蟲環子孢子蛋白質（CSP)之重複區（NANP)]塗在一 96孔板上。在該等培養板飽和後，將該血清樣品連續稀釋液直接加入該等培養板中。存於該血清樣品中之R32LR 之抗體會與該預塗覆的R32LR結合。洗滌該等培養板。加入一過氧化物酶標記的羊抗-人IgG(y)抗體，其會與抗CS IgG抗體結合。在另一洗滌步驟後，加入對該過氧化物酶 112640.doc -28- 200800254 具特異性的色原體底物溶液以提供一種檢測與該預塗覆抗原結合的抗CS IgG的方法。過氧化物酶可催化一顯色反應。形成顏色的強度與血清中包含的抗CS IgG抗體的滴度成比例。在每一板上相對於已知血清標準試樣測定抗重複抗體水平，並以微克/毫升表示。結果第1組：佐劑經疫苗接種的志願者之數量經攻擊的志願者之數量(受保護的數量）經重攻擊的志願者之數量(受保護的數量）佐劑B 26 17(10) 5(3) AS02A 25 24 (9) 5(1) 共計： 51 41 10 組2 : 佐劑經疫苗接種的志願者之數量經攻擊的志願者之數量(受保護的數量）經重攻擊的志願者之數量(受保護的數量）佐劑B 無效數字 19(8) 未進行 AS02A 無效數字 20 (5) 未進行共計： 52 39 用於初次攻擊之組合的組1及2 佐劑經疫苗接種及攻擊(初次攻擊)的志願者之數量受保護的志願者之數量受感染的志願者之數量疫苗效能佐劑B 36 18 18 50% AS02A 44 14 30 32% 因此在此試驗中，發現佐劑B對保護未曾感染的個體預防瘧疾感染更有效。與AS02A群組中32%的受攻擊個體相比較，佐劑B群組中有50%的受攻擊個體受到保護。此表示該兩種佐劑之間在保護性上超過50%之改良。 112640.doc -29- 200800254 此外，在第1組中，發現佐劑B較AS02A可顯著更有效地引發CD4 T細胞定向針對存在於RTS，S中之抗原的反應（圖1. p=0.01663)。第1及第2組之合併的資料具較小顯著性（圖2. ρ=0·07) 〇在疫苗接種前，沒有直接針對HBs或CSP之可察覺的 CD4/CD8 T細胞反應。相反，在II期接種後2週及III期接種後2週（DOC :攻擊日），在大多數用兩種調配物接種之個體中檢測到了 HBs及CSP特異性CD4 T細胞。在相同之時間點上，未觀察到任何可檢測到的CD8 T細胞反應。此等觀察證明，用於T細胞免疫-監督之分析係特異的及靈敏的，其係在已接受不同疫苗調配物之群組之間實施正式比較之前提。圖1展示在II期接種後2週以及III期接種後2週（DOC)， RTS，S/佐劑B疫苗接種之第1組之個體與用RTS，S/AS02A疫苗接種之彼等相比具有更高CSP特異性CD4 T細胞頻率。可對在II期接種後2週產生IFN-γ及在IL-2、CD40L、TNF_a 中之另一細胞因子之HBs特異性CD4 T細胞得出類似結論 (未展示資料)。圖2展示與圖1相同之研究，不同之處僅為其整合了來自兩個組之資料。在圖1及2中，結果表示為在106 CD4 T細胞内表現 CD40L、IL-2、TNF-α或IFN-γ中至少兩種不同細胞因子的 CD4 T細胞之頻率。根據抗CSP特異性抗體反應可得出一類似圖。自圖5可 112640.doc -30- 200800254 見在對RTS，S/佐劑B之反應中升高的抗體濃度顯著地大於在對RTS，S/AS02A之反應中升高的濃度（具體而言參見 DOC-III期接種後2週（Ρ=0·00793)，但II期接種後2週之效果係顯著的）。結果表示為幾何平均濃度（GMC)。”Pre"意指在投予任一劑量前之初始時間點。

Ml意指在第一次劑量後2週之時間點。 M2意指在第二次劑量後2週之時間點。 DOC意指”攻擊日"，其係在第三次劑量後之2週。針對癔疾攻擊之保護與一顯著較高CD4 T細胞反應及對 CSP的特異性抗體反應有關。與RTS，S/AS02A相比較RTS，S/佐劑B之增加的免疫原性不一定暗示其會轉化成生物相關的效應。然而，在此試驗中用RTS，S/佐劑B進行疫苗接種的個體與用RTS，S/AS02A 進行疫苗接種之彼等（44個個體中篩選出14個：32%)相比較已顯示出增加的針對瘧疾攻擊之保護水平（36個個體中篩選出18個·· 50%)。因此，發現在CD4 T細胞反應之幅度與預防瘧疾之間可能有聯繫。若上述假設正確，則與用RTS，S/AS02A或甚至RTS，S/佐劑B進行疫苗接種的個體相比較，受保護的個體應具有一更高的CD4 T細胞反應。圖3及4，各自對應第1組及合併組 (混合的兩個佐劑群組），可清晰地證實以上假設並支持 CSP特異性CD4 T細胞在保護中起顯著作用之觀點。相一致地，對在II期接種後2週及III期接種後2週採集的樣品所做的統計分析證明，在受保護的與未受保護的個體之間的 112640.doc •31 · 200800254 頻率差異系統計上顯著的。在圖3及4中，結果表示為在1〇6 CD4 T細胞内表現 CD40L、IL-2、TNF-α或IFN-γ中至少兩種不同細胞因子的 CD4 T細胞之頻率。免疫原性分析亦表明，與CSp特異性 CD4 T細胞相反，HBs特異性CD4 T細胞不與在π期接種後 2週及III期接種後2週時針對癔疾之保護相關（分別為 ρ=0·14及ρ=〇·〇53)。此進一步鞏固以上結果之相關性並有力地表明保護與能夠識別CSP而非HBs胜肽之CO4 Τ細胞之存在特定地相關聯。最後’因為沒有可察覺的CD8 T細胞反應，亦可得出結論：最可能地，由佐劑B或AS02A辅助的RTS，S賦予的癔疾紅血球前期保護不可能係由於疫苗接種後CSP特異性CD8 T細胞之引發而產生。自對抗CSP抗體反應之監測中觀察到一類似圖。圖6展示受保護的及未受保護的個體中之抗體濃度（結果涉及兩個組’其中包括兩個佐劑組）。月…員地彼荨受保護的個體較彼等未受到保護的個體顯示一顯著更高的抗體濃度（P<〇.〇〇〇1)。討論以上結果清晰地證明：CSP特異性CD4 T細胞一方面與抗體反應之間存在關聯且另一方面與針對瘧疾攻擊的保護性狀態存在關聯。CSP特異性CD4 τ細胞或抗體行使抗寄生蟲作用之機制係未知的。然而，分析亦清晰地證實，少數個體具有未叉保護的高CD4 Τ細胞或高抗體反應此意謂 112640.doc -32- 200800254 單有對CSP之強CD4 T細胞反應或高抗體反應不能預知針對癔疾攻擊之保護。人們已開發出不同技術來監測Τ細胞反應，例如淋巴增殖法、細胞因子分泌法、四聚體染色、elips〇t或細胞因子流式細胞儀。最近已選擇後者作為基於以極佳可重複性/ 可重現性數據以及相關標記檢測（CD4、CD8、CD40L、IL_ 2、TNF、IFNg)之先導技術。亦已確定了一特分析方法，其可解決用細胞因子流式細胞儀方法常常遇到的高背景問題。本報告可證明在一人類臨床試驗中用細胞因子流式細胞儀加強監測T細胞反應之可行性。此外，亦可證明有可能確定一不直接與體液免疫相關的保護標記。雖然已證明佐劑B與八802八調配物相比可顯著更有效地誘導CSP特異性CD4 T細胞及抗體，但在CD4 T細胞頻率與抗體濃度方面之差別係相對適度的，因而人們可得出結論一其可能並非生物相關的。在此臨床試驗中獲得的數據容許用癔疾保護數據作為一生物相關標記來正式評估此等差別之生物相關性。分析清晰地表明：佐劑間在T細胞頻率及抗體濃度方面之適中但顯著的差別可轉化成顯著更高程度的瘧疾攻擊保護。【圖式簡單說明】圖1係針對CSP之CD4 T細胞反應（第一組）圖2係針對CSP之CD4 T細胞反應（兩個組）圖3係針對CSP之CD4 T細胞反應（第一組）圖4係針對CSP之CD4 T細胞反應（兩個組） 112640.doc -33- 200800254 圖5係抗CSP抗體反應（兩個組) 圖6係抗CSP抗體反應（兩個組）參考文獻 • Alonso P 等人（2004)vaccke against Plasmodium falciparum infection and disease in young African children: randomised controlled trial. Lancet 10 月；364:1411-1420。

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Claims

200800254 十、申請專利範圍： 1 · 一種瘧原蟲抗原或其免疫原性片段或衍生物及包含存於脂質體調配物中之脂質A衍生物及皂苷之佐劑用於製造使前往疫區之旅行者免疫以抵抗增殖性瘧疾感染之藥物之用途。 2.如請求項1之肖途，其中該瘧原蟲抗原係能夠提升抗癌原蟲之免疫反應之環子孢子（CS)蛋白或其免疫原性片段或衍生物。 3·如請求項2之用途，其中該CS蛋白或片段係融合至來自b 型肝炎之表面抗原（HBsAg)。 4. T請求項3之用途，其中該〇8蛋白或片段係呈包含瘧原 ** CS蛋白之實質上整個c末端部分、匚8蛋白免疫優勢區之4或4個以上串聯重複及B型肝炎之表面抗原（HBsAg)之融合蛋白形式。

如請求項1至4中任一項之用途，其中該融合蛋白包含實質上對應於惡性瘧原蟲NF54菌株3D7純系CS蛋白之2〇7 至395胺基酸的惡性瘧原蟲〇8蛋白序列，其經由線形連接子順融合至HBsAg之N末端。 6 ·如請求項5之用途，其中該融合蛋白係RTS。 7·如請求項6之用途，其中該RTS呈混合的顆粒rts，sb 式。 8.如請求項7之用途，其中RTS，S之量係每劑量25至5〇微克。 9·如請求項！至4中任一項之用途，其中該佐劑包含 112640.doc 200800254 MPL及 QS21。 10·如明求項9之用途，其中該QS21係在含有膽固醇之脂質體中受到抑制。 . 11·如請求項1至4中任-項之用途，其係與編碼該瘧原蟲抗原或其免疫原性片段或衍生物之聚核甞酸併用，其中該抗原/佐劑混合物及該聚核苷酸係以任一次序依序使用。 12·如請求項丨！之用途，其中該聚核甞酸係首先使用。 13. —種用於免疫前前往疫區之旅行者以抵抗增殖性癔疾感木之凋配物，其包含癔原蟲抗原或其免疫原性片段或衍生物及包含存於脂質體調配物中之脂質A衍生物及皂苷之佐劑。 14. 如明求項13之調配物，其中該癔原蟲抗原係能夠提升對瘧原蟲之免疫反應之環子孢子（cs)蛋白或其免疫原性片段或衍生物。 15·如請求項14之調配物，其中該以蛋白或片段係融合至來自B型肝炎之表面抗原（HBsAg)。 16·如請求項15之調配物，其中該以蛋白或片段係呈包含癔原蟲CS蛋白之實質上整個c末端部分、cS蛋白免疫優勢區之4或4個以上串聯重複及b型肝炎之表面抗原（HBsAg) 之融合蛋白形式。 17·如請求項13至16中任一項之調配物，其中該融合蛋白包含實質上對應於惡性瘧原蟲NF54菌株3D7純系CS蛋白之 207至395胺基酸的惡性癔原蟲cs蛋白序列，其經由線形連接子順融合至HBsAg之N末端。 112640.doc 200800254 18·如請求項17之調配物，其中該融合蛋白係RTS。 19·如請求項18之調配物，其中該RTS呈混合的顆粒RTS，S形 20.如請求項19之調配物，其中RTS，S之量係每劑量25至50 微克。 21 ·如請求項13至16項中任一項之調配物，其中該佐劑包含 3D-MPL及 QS21 〇馨 2 2 ·如清求項21之調配物’其中該Q s 21係在含有膽固醇之脂質體中受到抑制。 23·如請求項13至16項中任一項之調配物，其係作為基礎/補強免疫計劃之一部分，其中額外之部分包含編碼該癔原蟲抗原或其免疫原性片段或衍生物之聚核苷酸，其中該抗原/佐劑混合物及該聚核甞酸係以任一次序依序使用。 24·如請求項23之調配物，其中該聚核苷酸係首先使用。 25· -種癔原蟲抗原或其免疫原性片段或衍生物及包含存於脂質體調配物中之脂質A衍生物及4苷之佐劑用於製造使前往疫區之旅行者免疫以抵抗瘧原蟲感染之套組之用途，其中該抗原係呈凍乾形式，且 ^ ^且，亥抗原及該佐劑係在投予之前進行混合。 26.如請求項25之用途，其中嗜痂甩虫 η ③m原蟲抗原係補提升抗癔原蛾之免疫反應的環子孢子（cs 或衍生物。）蛋自或其免疫原性片段 27· —種套組，其包括： •呈凍乾形式的瘧原蟲抗原或其免疫原性片段或衍生 112640.doc 200800254 物， •包含存於脂質體調配物中之脂質A衍生物及皂苷之佐劑，及 •說明在投予前該疫區之旅行者之前，將該抗原、佐劑及視情況含自之另一載劑混合之說明書，藉此以防護該旅行者免於增殖性癔疾感染。 28·如請求項27之套組，其進一步包括編碼該瘧原蟲抗原或其免疫原性片段或衍生物之聚核苷酸；其中該抗原/佐劑混合物及該聚核苷酸係以任一次序依序使用，但特定而言，其中該聚核苷酸係用於基礎免疫，而該抗原/佐劑混合物係用作於補強免疫。 29·如請求項27或28之套組，其中該瘧原蟲抗原係能夠提升抗瘧原蟲之免疫反應的環子孢子（CS)蛋白或其免疫原性片段或衍生物。 3 0 · —種評估候選疫苗（尤其係紅血球前期候選疫苗）預防癔疾之效能的方法，該方法包括量測個體中升高之抗該候選疫苗之CD4細胞量。 3 1 · —種評估候選疫苗（尤其係紅血球前期候選疫苗）預防癔疾之效能的方法，該方法包括量測個體中升高之抗該候選疫苗之特異抗體之濃度。 32.如請求項30或31之方法，其中該疫苗包含瘧原蟲抗原或其免疫原性片段或衍生物及包含存於脂質體調配物中之脂質A衍生物及皂苷之佐劑。 3 3 · —種用於測定個體在施用癔疾抗原組合物（尤其係紅血球 112640.doc 200800254 則期瘧疾抗原組合物）後是否受到γ+ ^ U/L遽疾之防護的方法，該方法包括量測該個體中升高之斟 n之對该癔疾抗原具特異性的CD4 T細胞量。认二種用於測定個體在施用癍疾抗原組合物（尤其係紅血球刖期癔疾抗原組合物）後是否受到抗癌疾之防護的方法，該方法包括量测該個體中升高之斟兮生 η <對邊癔疾抗原具特異性的抗體濃度。

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