KR100278157B1

KR100278157B1 - 보조약을 함유하는 백신 조성물

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Publication number: KR100278157B1
Application number: KR1019940704740A
Authority: KR
Inventors: 프리엘 장-폴; 마리-조세프 끌로드 가르송-존슨 나탈리; 슬라오위 몽세프; 팔라 피에트로
Original assignee: 장 스테판느; 스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 1992-06-25
Filing date: 1993-06-15
Publication date: 2001-01-15
Also published as: FI946064A; ES2143716T3; CN1122530C; NO945003L; NZ253137A; SG49909A1; EP0761231B1; ATE156710T1; MY109278A; FI109767B; HU9403778D0; CZ282235B6; CZ329694A3; NO945003D0; HU219808B; EP0761231A1; DE69327599D1; AU661404B2; PL170980B1; AP408A

Abstract

본 발명은 3데-0-아실화 모노포스포릴 리피드 A 및 QS21을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 상기 백신 조성물은 CTL 및 γ IFN 반응을 유발시키는 효능이 있다.

Description

보조약을 함유하는 백신 조성물

본 발명은 신규한 백신 화합물, 그들의 생산 방법 및 약품에서 그들의 사용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 퀼라쟈 사포나리아 몰리나 (Quillaja Saponaria Molina)의 수피(樹皮)로부터 유래된 Hplc 정제 비-독성 분획, QS21, 및 3 데-0-아실화 모노포스포릴 리피드 A(3D-MPL)을 함유하는 백신에 관한 것이다.

3 데-0-아실화 모노포스포릴 리피드 A 는 GB2220 211 (Ribi)로부터 공지된다. 화학적으로 그것은 3-데아실화 모노포스포릴 리피드 A 와 4,5 또는 6개의 아실화 사슬들과의 혼합물이고 리비 임뮤노켐 몬타나 (Ribi Immunochem Montana)에 의해 제조된다.

QS21 은 남미 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나의 수피로부터의 사포닌의 Hplc정제 비독성 분획이고 그의 생산 방법은 US 특허 제 5,057,540 호 에 (QA21로서)공개된다.

본 발명은 QS21 과 3D-MPL 의 조합물을 함유하는 배합물이 특정 항원에 대한 면역반응을 상승작용하여 향상시킨다는 놀라운 발견을 기초로 한다.

예를들면 3D-MPL 및 QS21 과 배합되어 말라리아 항원, RTS, S 의 백신 배합물은 비장내 CS 단백질 특이 세포독성 T 임파구 (CTL)반응의 강력한 상승 유발을 결과시킨다.

RTS는 B 형 간염 표면 항원의 preS₂부분의 4개의 아미노산을 통해서 간염 B 형 비루스의 표면 (S)항원에 연결된 피이. 팔시파룸 (P. falciparum)의 설컴스포로조이트 (CS; circumsporozoite) 단백질의 C-말단 부분을 거의 모두 포함하는 혼성 단백질이다. 상기 RTS 의 완전한 구조는 UK 특허 출원 제 9124390.7 호로 부터의 우선권을 주장하는 WO 93/10152 하에 공고된, 동시계류중의 국제 특허 출원 제 PCT/EP92/02591 호에 공개된다. 효모내에서 발현될 때 RTS 는 지방 단백질 입자로서 생산되고, RTS 가 HBV 로부터의 S 항원과 함께 동시-발현될 때 그것은 RTS, S 로서 공지된 혼합 입자를 생산한다.

임의 동물 모델에서 세포용해 T 임파구 반응이 질병에 대한 보호를 유발한다고 나타나났으므로, 강한 세포 용해 T 임파구 반응을 유발하는 것이 가능하다는 관찰은 중요하다.

본 발명자는 두 보조약 QS21 및 3D-MPL 과 재조합 미립자 항원 RTS, S 의 조합물은 비장내 CS 단백질 특이 CTL 의 강력한 유발을 결과시킨다는 것을 제시하였다. 또한 QS21 는 그 자체로 CTL 의 유발을 향상시키나 3D-MPL 은 그렇지 않다. 상기 조합물은 각 보조약의 개별적 효과의 합보다 더욱 큰 효과를 가지기 때문에, 그것이 상승적으로 작용한다고 말할 수 있다. CTL 유발을 위한 상기 두 보조약 간의 상승작용은 CTL 중재 면역성의 유발을 위한 백신으로서 재조합 분자의 사용에 중요한 암시를 갖는 놀라운 관찰이다.

표적 항원의 단백질 분해에 의해 생성된 펩티드가 적절한 진행 경로로 들어가, 세포막 상의 부류 I 분자와 함게 발현되기 때문에, 표적 항원이 세포내에서 합성될 때 (예컨대 비루스, 세포내 박테리아에 의한 감염시, 또는 종양에서) CTL 의 유발이 쉽게 나타난다. 그러나, 일반적으로, 미리-형성된 가용성 항원은 상기 진행 및 발현 경로에 도달하지 않고, 부류 I 제한 CTL 을 유도해내지 않는다. 그러므로 통상의 사멸백신은 항체 및 T 헬퍼 반응을 유도하나, 일반적으로 CTL 중재 면역성은 유발하지 않는다. 두 보조약 QS21 및 3D-MPL 의 조합은 백신 기재 단백질 또는 재조합 단백질의 상기 심각한 제한을 극복할 수 있고, 보다 광범위한 면역 반응을 유발할 수 있다.

CS 단백질에 특이성인 CTL 은 생쥐 모델 계에 있어서 말라리아로부터 보호하기 위해 제시되었다 (로메로 (Romero) 일동. Nature 341:323 (1989)). 지원자들이 피이. 팔시파룸의 조사된 스포로조이트를 사용하여 면역되고, 후속 말라리아 공격으로부터 보호된다는 것을 나타냈던 사람 시험에서, CS 에피토프에 특이성인 CTL 의 유발이 증명되었다 (말릭 (Malik)일동. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3300 (1991)).

조사된 스포로조이트의 사용이 면역 반응의 특성 및 생산의 견지에서 실행불가능하므로, 재조합 분자로서 투여된 항원에 특이성인 CTL 을 유발시키는 능력은 말라리아 백신 개발과 관련있다.

말라리아 백신 외에도, CTL 반응을 유발시키는 능력은 단순 포진 비루스. 사이토메갈로비루스, 사람의 면역결핍 비루스, 및 일반적으로 병원체가 세포내 생활기를 갖는 모든 경우에 대항하는 이로운 백신일 것이다.

마찬가지로, 공지된 종양 항원에 특이성인 CTL 은 재조합 종양 항원 및 두 보조약의 조합에 의해 유발될 수 있었다. 이는 항암 백신을 개발할 수 있게 할 것이다.

어떤 시스템에서, 3D-MPL 및 QS21 의 조합물은 인터페론 γ 생산을 상승적으로 향상시킬 수 있었다. 본 발명자는 gD₂t 로 공지된 단순 포진 항원을 이용하므로써 3D-MPL 및 QS21 의 상승작용 가능성을 증명하였다. gD₂t 는 HSV-2로부터의 가용성의 절단된 당단백질 D 이고 베르만 (Berman) 일동. Science 222 524-527 의 방법에 따라 CHO 세포내에서 생산된다.

IFN-γ 분비는 기생충, 박테리아 및 비루스를 포함하는 세포내 병원체에 대항하는 보호 반응과 관련된다. IFN-γ 에 의한 대식세포의 활성화는 미생물의 세포내 사멸을 증가시키고 Fc 수용체의 발현을 향상시킨다. 또한, 특히 임파성독소(TH1 세포의 다른 생성물)와의 상승 작용으로, 직접적인 세포독성이 발생할 수 있다. IFN-γ 는 또한 보호의 주요한 고유 주효체인 NK 세포의 생성물 및 유도질 둘다이다. IFN-γ 또는 그밖의 메카니즘을 통한 TH1 타입 반응은, IgG2A 임뮤노글로블린 중복기준에 바람직한 도움을 제공한다.

당단백질 D 는 비루스 외막 상에 위치하고 또한 감염세포의 세포질에서 발견된다 (아이젠버그 아아르. 제이. (Eisenberg R.J.)일동 J. of Virol. 1980 35 428-435). 상기 당단백질 D 는 신호 펩티드를 포함하는 393개 아미노산으로 구성되고 대략 60 kD 의 분자량을 가진다. 모든 HSV 외막 당단백질 중에서 상기가 아마도 가장 잘 특징된다 (코헨 (Cohen)일동. J. Virology 60 157-166). 생체내에서 당단백질 D 는 비루스를 세포막에 부착시키는데 있어 중요한 역할을 한다는 것이 공지된다. 더욱이, 당단백질 D 는 생체내에서 중화 항체를 유도할 수 있다고 제시되었다 (에임 (Eing)일동. J. Med Virology 127: 59-65). 그러나, 잠복 HSV2 비루스는 환자 혈청에서 높은 중화 항체 역가의 존재에도 불구하고 여전히 재활성화되어 질병의 재발을 유발할 수 있다. 그러므로 중화항체 만을 유발하는 능력이 질병을 적절히 제어하기에는 불충분하다는 것은 명백하다.

질병의 재발을 막기 위해, 중화항체 뿐만 아니라, T-세포, 특히 세포독성 T-세포를 통해 중재된 세포 면역성을 자극하는 임의의 백신을 필요로 할 것이다.

이러한 경우, gD₂t 는 절단 단백질의 C 말단에 아스파라긴 및 글루타민이 첨가된 1-306개 아미노산의 천연 당단백질로 구성되는 308개 아미노산의 HSV2 당단백질 D 이다. 이러한 형태의 단백질은 분할되어 성숙한 283개 아미노산 단백질을 생성하는 신호 펩티드를 포함한다. 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese Hamster ovary cells)에서 상기 단백질의 생산은 Genentech's European patent EP-B-139417 에 기재되었다.

성숙한 절단 당단백질 D (rgD2t) 또는 포유류 세포로부터 분비된 동등한 단백질이 바람직하게 본 발명의 백신 배합물에 사용된다.

본 발명의 배합물은 기니아 피그 내 생식기 포진 모델에서 보호 면역성을 유발시키는데 매우 표과적이다. 매우 낮은 투여량의 항원 (예컨데 rgD2t 5 ㎍ 만큼 적은)에서도 상기 배합물은 기니아 피그를 일차 감염으로부터 보호하고 또한 특이적 중화 항체 반응을 자극시킨다. 본 발명자는 또한 본 발명의 배합을 이용하여 생쥐내 TH1 타입의 주효체 세포 중재 반응을 증명하였다.

따라서, 본 발명은 3 데아실화 모노포스포릴 리피드 A 및 QS21 과 함께 항원으로 구성되는 제약학적 배합물 또는 백신을 제공한다. 상기 배합물은 광범위한 일가 또는 다가 백신에 적당하다.

바람직하게 백신 배합물은 사람 또는 동물 병원체에 대항하는 면역반응을 유도해낼 수 있는 항원 또는 병원성 조성물을 함유할 것이며, 상기 항원 또는 항원성 조성물은 HIV-1, (예컨대 gp120 또는 gp160), 임의의 고양이 면역결핍 비루스, 사람 또는 동물 포진 비루스, 예컨대 gD 또는 이들의 유도체, 또는 수두 대상포진 비루스 (예컨대 gpI,Ⅱ 또는 Ⅲ), 사이토메갈로비루스 ((특히 사람) (예컨대 gB 또는 이들의 유도체), HSV1 또는 HSV2 로부터의 ICP27 과 같은 즉각 초기 단백질 (Immediate Early protein)로부터, 또는 감염 B 형 비루스 예를들면 간염 B 형 표면 항원 또는 이들의 유도체, 간염 A 형 비루스, 간염 C 형 비루스 및 간염 E 형 비루스와 같은 간염 비루스로부터, 또는 그밖의 비루스성 병원체, 예컨대 호흡 합포체 비루스 (Respiratory Syncytial virus), 사람 유두종 비루스 또는 인플루엔자 비루스로부터 유래되거나, 박테리아 병원체 예컨대 살모넬라, 나이세리아, 보렐리아 (예를들면 OspA 또는 OspB 또는 이들의 유도체), 또는 클라미디아 (Chlamydia), 또는 보르데텔라 (Bordetella) 예를들면, p. 69, PT 및 FHA 로부터 유래되거나, 플라스모듐 또는 톡소플라스마와 같은 기생충으로부터 유래된다.

배합물은 또한 항-종양 항원을 함유할 수 있고 면역 치료학적으로 암을 치료하는데 유용할 수 있다.

배합물은 또한 국제 특허 출원 제 PCT/GB92/00824 호 및, 국제 특허 출원 제 PCT/GB92/00179 호에 기재된 바와 같은 포진성 경 입자와 사용하는데 유용할 수 있다.

간염 B 형 표면 항원의 유도체는 당분야에 잘 알려져 있고, 그중에서도, 유럽 특허 출원 EP-A-414 374; EP-A-0304 578, 및 EP 198-474 에 기재된 PreS₁, PreS₂S 항원을 포함한다.

본 발명의 부가 양상에 있어서 약품에 사용하기 위한 본 원에 기재된 바와 같은 백신이 제공된다.

QS21 : 3D-MPL 의 비는 전형적으로 1:10 - 10:1; 바람직하게 1:5 - 5:1 및 종종 실질적으로 1:1 정도일 것이다. 최적 상승작용을 위한 바람직한 범위는 2.5:1 - 1:1 3D MPL : QS21 이다. 전형적으로 사람 투여의 경우 QS21 및 3D MPL 은 투여량 당 1 ㎍ - 100 ㎍, 바람직하게 10 ㎍ - 50 ㎍ 범위로 백신내에 존재할 것이다. 종종 백신은 임의 특이적 부형제를 요구하지 않을 것이고 수성 또는 그밖의 제약학적으로 허용가능한 완충액내에 배합될 것이다. 몇몇 경우에 있어서 본 발명의 백신은 백반을 더 함유하거나 예를들면, 리포좀, 미소구 또는 캡슐화된 항원 입자와 같은 수중유 유탁액 또는 그밖의 적당한 부형액내에 제조되는 것이 유리할 수 있다.

백신 제조는 1978 년 미합중국 메릴랜드주 발티모어시 유니버어시티 파아크프레스의 볼러 (Voller) 일동에 의해 출판된, 백신의 새로운 경향 및 개발 (New Trends and Developments in Vaccines)에 일반적으로 기재된다. 리포좀내 캡슐화는, 예를들면, 풀레르톤 (Fullerton)에 의한 미합중국 특허 4,235,877 에 기재된다. 거대분자에 대한 단백질의 접합은 예를들면, 릭하이트 (Likhite)에 의한 미합중국 특허 4,372,945 및 알모어 (Armor)일동에 의한 미합중국 특허 4,474,757 에 공개된다.

각 백신 투여량내 단백질의 양은 전형적인 백신내에 상당한 해로운 부작용없이 면역보호 반응을 유발하는 양으로서 선택된다. 그러한 양은 어떠한 특이 임뮤노겐이 이용되고 그 임뮤노겐이 어떻게 제공되는지에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 각 투여량은 단백질 1- 1000 ㎍, 바람직하게 2 - 100 ㎍, 가장 바람직하게 4 - 40 ㎍을 함유할 것으로 예상된다. 특정 백신에 대한 최적량은 피검체내 적절한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신 접종 후, 피검체는 적절한 시간 간격을 두고 1회 또는 수회 중강 면역법을 받을 수 있다.

본 발명의 배합물은 예방 및 치료 목적 둘다를 위해 사용될 수 있다.

따라서 한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 백신 유효량을 환자에게 투여하는 것으로 구성되는 치료 방법을 제공한다.

1.0 인터페론 γ 분비의 유발을 위한 3D MPL 과 QS21 간의 상승작용

주효체 세포 중재 면역 반응을 유발시키는, rgD2t 의 3D MPL 및 QS21 기재 보조약 배합물의 능력을 테스트하기 위해, Balb/c 생쥐의 군을 백신 접종시켰고, 고름을 뺀 임파선 세포를 하기 기재된 바와 같이 IFN-γ 분비에 관해 테스트하였다.

1.1 rgD2t 배합물

본 실험은 3가지 보조약 배합물을 비교하였다 :

ⅰ) 3D-MPL 내 rgD2t

ⅱ) QS21 내 rgD2t

ⅲ) 3D-MPL/QS21 내 rgD2t

상기 배합물들을 하기와 같이 제조하였다. HSV-2gD 의 성숙한 1-283 아미노산에 해당하는 rgD2t 를 CHO 세포내에서 생산하고 베르만 (상기) 및 EP 0139417 의 방법학에 따라 생산하였다.

* rgD2t/3D-MPL

5 ㎍ 의 rgD2t/투여량을 실온에서 교반하에 1시간 항온처리한 다음, 3D-MPL 현탁액 (25 ㎍/투여량)과 함게 혼합한다. 부피를 주사용 물 및 염화나트륨 용액 (5M, pH 6.5 ±0.5)을 사용하여 70 ㎕/투여량으로 조정하여 0.15M 염화나트륨의 최종 농도를 얻는다. pH 를 6.5 ±0.5에 유지시킨다.

* rgD2t/QS21

5 ㎍ 의 rgD2t/투여량을 교반하에 실온에서 1시간 항온 처리한다. 염화나트륨 용액 (5M, pH 6.5 ±0.5) 및 주사용 물을 사용하여 부피를 70 ㎕ 로 조정한다. 그 다음 QS21 (10 ㎍/투여량)을 첨가한다. pH 를 6.5 ±0.5로 염화나트륨 최종 농도를 0.15M 로 유지시킨다.

* rgD2t/3D-MPL/QS21

5 ㎍ 의 rgD2t/투여량을 교반하에 실온에서, 1시간 항온 처리한다. 3D-MPL (25 ㎍/투여량)을 수성현탁액으로서 첨가한다. QS21 (10 ㎍/투여량)의 수용액의 첨가에 의해 70 ㎕ 의 최종 부피를 완성하고 pH 를 6.5 ±0.5로 그리고 염화나트륨 농도를 0.15M 로 유지시킨다.

1.2 면역법

생쥐의 푸우트패드 (footpad) 뒤에 배합물 35 μL/푸우트패드를 주사하였다.그 결과 각 생쥐는 70 ㎕를 받았다. 면역법은 0, 및 14 일에 행하였다. 동물은 21일에 죽였다.

1.3 인터페론 γ 검정

면역 생쥐로 부터 슬와근 임파선을 rgD2t 10, 1, 0.1, 0 ㎍/ml 를 사용하여 시험관내에서 자극시켰다. 삼중 배양물 (200 ㎕ 부피)를 2 ×10⁵감응 세포 및 2 ×10⁵조사 (3000 라드) 상승작용 네이브 비장 세포를 사용하여 둥근 바닥 96-웰 마이크로역가 플레이트에 설치하였다. 배양 배지는 10% 태아 송아지 혈청을 가진 RPMI 1640 이었다. 각 복제물로부터의 배양 배지 100 ㎕ 의 부분 표본을 수확하고 IFN-γ 결정을 위해 모았다. 배양물을 72시에 검정했다. 모든 검정의 경우, ConA (베링거 만하임 (Boehringer Mannheim) 5 ㎍/mL 을 사용하는 대조군을 포함하였다. 이것은 항상 양성이었다.

홀란드 바이오테크놀로지 (Holland Biotechnology)에 의해 제조된 (Gibco 에의해 배급된)시판용 ELISA 검정을 사용하여 IFN-γ 의 분비를 결정하였다. 삼중웰로부터 모은 상청액 100 ㎕ 에 대한 검정을 실행하였다.

50 pg/㎕ 의 검정 배경 이상의 IFN-γ 의 분비를 3 배합물 군모두에서 관찰하였다 (표 참조). 그외에, QS21 및 3D-MPL 간의 상승작용 효과를 관찰하였다. 각 보조약이 자력으로 rgD2t 에 응하여 IFN-γ 를 분비할 수 있는 세포를 유발할 수 있는 반면, 그들의 조합물은 개개의 반응의 합의 2배 이상으로 유발시켰다.

1.4 결과

IFN-γ 분비의 유발을 위한 QS21과 3D-MPL 간의 상승작용 효과

IFN-r 는 pg/mL 로 표현된다.

상기 표는 명백히 결합 백신이 IFN-γ 분비를 상승작용적으로 유발한다는 것을 제시한다.

2.0 CTLs 의 유발을 위한 3D-MPL 과 QS21 간의 상승작용

CTLs 를 유발시키는 3D MPL 및 QS21 기재 보조약 배합물내에서 RTS, S 입자의 능력을 테스트하기 위해, B10. BR 생쥐군을 면역시켰고 그들의 비장 세포를 시험관 내에서 자극시켰으며 CS 단배질을 발휘시키는 L 세포에 대한 세포 독성 검정으로 테스트하였다.

2.1 RTS,S 입자들의 배합

RTS,S 입자를 3가지 다른 조성물에 배합하였다 :

1. QS21 (10 ㎍)및 3D-MPL (25 ㎍)와 RTS,S 입자 (10 ㎍);

2. QS21 (10 ㎍)와 RTS,S 입자 (10 ㎍);

3. 3D MPL (25 ㎍)와 RTS,S 입자 (10 ㎍);

상기 배합물들을 하기와 같이 제조하였다 :

RTS, S/3D MTL

10 ㎍ 의 RTS, S 입자/투여량을 교반하에 실온에서 항온처리한 다음 3D MPL 수성 현탁액 (25 ㎍/투여량)과 함께 혼합하였다. 그다음 부피를 주사용 물 및 염화나트륨 용액 (5N, pH 6.5 ±0.5)을 사용하여 70 ㎕/투여량으로 조정하여 최종 농도가 0.15 M 염화나트륨이 되게 한다 (pH 는 6.5 ±0.5 로 유지된다).

RTS, S/QS21

10㎍의 RTS, S 입자/투여량을 교반하에 실온에서 1시간 항온처리하였다. 주사용 물 및 염화나트륨 용액(5N, pH 6.5±0.5)를 사용하여 부피를 조정하여 QS21(10㎍/투여량)의 수용액을 가진 70㎕/투여량의 최종 부피로 완결하였다. pH를 6.5±0.5로 유지시키고 염화나트륨 최종 농도를 0.15M로 유지하였다.

RTS, S/3D MPL/QS21

10㎍의 RTS, S 입자/투여량을 교반하에 실온에서 1시간 항온처리한 다음 3D MPL 수성 현탁액(25㎍/투여량)과 함게 혼합하였다. 그 다음 부피를 주사용 물 및 염화나트륨 용액(5D pH 6.5±0.5)를 사용하여 조정한다. QS21 (10㎍/투여량)의 수용액의 첨가에 의해 최종 부피를 완성한다. pH를 6.5±0.5로 유지시키고 염화나트륨 최종 농도를 0.15M로 유지시킨다.

2.2 RTS, S 입자를 사용하는 생쥐의 면역

균주 B10.BR (H-2^K)의 4-6주 연령의 암컷 생쥐를 IFFA CREDO (프랑스)로부터 구입하였다. 3마리로된 군을 각 뒷다리내로 항원 배합물 35μL의 내부 푸우트-패드 주사에 의해 면역화하였다. 상기 동물에게 두번째 동일 투여량의 항원을 2주 후에 2차 주사하였다.

2.3 항 CS CTL에 대한 시험관내 자극

2차 주사한지 2주 후, 비장 세포를 수확하고 피이. 팔시파룸 설컴스포로조이트 단백질 유전자(7G8 클로운)로 트랜스펙션된 상승작용 섬유아세포를 시험관 내에서 자극시켰다. 상기 CS-트랜스펙턴트 세포는 쿠마르, 에스.(Kumar, S.) 일동(1988), Nature 334:258-260의 논문에 기재되었다.

당업자에게 잘 알려진 조건에서, 가열 불활성화 태아 송아지 혈청 10% 및 보통의 첨가제가 보충된 RPMI 1640 배지내에서 배양물을 설정하였다.

감응 세포를 ml당 10⁵CS-트랜스펙턴트의 존재하에 10⁶세포/mL의 농도에서 배양시켰다. CS-트랜스펙턴트 세포의 증식을 막기 위해, 2×104 rad의 선량을 사용하여 상기 세포를 조사시켰다. 3일 및 6일에 배양 배지의 1/2을 대체하므로써 배양물을 공급하였고 7일에 세포용해 활성에 관해 테스트하였다.

2.4 항-CS CTL에 대한 세포독성 검정

감응 세포 배양물을 수확하였고, 세척하였으며, V-바닥 96-웰 플레이트 내 부피 200 μL의 배지내에서, 표적 세포 일정한 수 2000에 있어 100:1 - 0.3:1의 변화하는 비율로 혼합시켰다. 표적 세포는⁵¹Cr으로 라벨링되었던 상승작용 섬유아세포였다.

2가지 상이한 타입의 표적 세포를 사용하였다:

1. L 세포

2. CS 트랜스펙트된 L 세포

상기는 쿠마르, 에스. 일동(1988), Nature 334:258 - 260에 기재된다.

검정을 37℃에서 6시간동안 항온처리한 다음, 표적 세포의 용해에 의해 상청액내로 방출된 방사능의 양을 측정했다. 세포용해 활성은 % 특이용해로서 표현된다.

결과:

보조약 QS21 및 3D-MPL을 가진 RTS, S(배합물 #1)을 사용하는 B10.BR 생쥐의 면역은 RTS, S의 설컴스포로조이트 성분에 특이성인 CTL의 높은 수준을 비장내에 유발시켰다. 보조약 QS21을 가진 RTS,S 입자(배합물 #2)를 사용하는 면역도 비장내에 CTL을 유발시켰지만, 배합물 #1에 의해 제공된 수준의 약 1/30에 지나지 않았다. 3D MPL을 가진 RTS,S(배합물 #3)는 CTL을 유발시키지 않았다.

본 검정에 사용된 표적 세포가 MHC 부류 Ⅱ 분자를 발현하지 않으므로, 주효체 세포는 CD8⁺, 부류 Ⅰ제한 CTL 이라고 간주될 수 있다.

3. 그밖의 배합

B형 간염 표면 항원, 알룸 3D-MPL 및 QS21.

간염 B형 표면 항원(HBsAg)의 제조를 잘 증명한다. 예를들면 하아포드(Harford) 일동 Develop. Biol. Standard 54 p125 (1983), 그레그(Gregg) 일동 Biotechnology 5 p479 (1987) EP-A-O 226 846 및 EP-A-299 108 및 그 내에 참조 문헌 참조.

3D-MPL을 Ribi Immunochem으로부터 얻었고, QS21을 Cambridge Biotech로부터 얻었으며, 수산화 알루미늄을 Superfos (Alhydrogel)로부터 얻었다.

다수의 여러가지 배합물을 생쥐의 세포 중재 면역성 연구를 위해 그리고 붉은털 원숭이의 연구를 위해 제조하였다.

3.1 배합물 1을 60㎕ 투여량 당 하기를 포함하는 인산염 완충액(pH 6.8)내에 제조하였다.

20㎍ HBsAg

30㎍ Al(OH)₃

30㎍ 3D-MPL

10㎍ QS21

10mM PO₄ ^3-

0.15M NaCl

배합물을 하기와 같이 제조하였다. 20㎍ HBsAg/투여량을 서서히 교반시키면서 실온에서 1시간동안 Al(OH)3 와 함게 항온처리하였다. 3D-MPL을 수성 현탁액으로서 첨가했고, QS21, 인산염 완층액 및 염화나트륨의 첨가로 배합을 완결하였고 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 최종 배합물은 6.5 -7.0의 pH를 가졌고 생쥐내 푸우트 패드 연구를 위해 사용하였다.

3.2 배합물 2을 투여량 200㎕ 당 하기를 포함하는 인산염 완충액(pH 6.8)내에 제조하였다.

1㎍ HBsAg

100㎍ Al(OH)₃

50㎍ 3D-MPL

20㎍ QS21

10mM PO₄ ^3-

0.15M NaCl

배합물을 하기와 같이 제조하였다. HBsAg 및 Al(OH)₃를 서서히 교반시키면서 실온에서 1시간동안 함께 항온처리하였다. 배합물을 인산염 완충액 및 염화나트륨 용액과 함께, Al(OH)₃, 수성 현탁액으로서 3D-MPL 및 QS21의 첨가에 의해 배합을 완결하였고 30분동안 다시 항온처리하였다. 배합물의 pH를 6.5와 7.0 사이에 유지시켰고 생쥐내 액소성 면역 연구를 위해 사용하였다.

3.3 배합물 3일 1ml 투여량 당 하기를 함유하는 인산염 완충액(pH 6.5 - 7.0)내에, 유사한 방식으로 제조하였다:

10㎍ HBsAg

500㎍ Al(OH)₃

50㎍ 3D-MPL

10㎍ QS21

상기 배합물을 원숭이 연구에 사용하였다.

4. 결론

재조합 미립자 항원 RTS, S와 두 보조약 QS21 및 3D-MPL의 결합물은 비장내에 CS 단백질 특이 CTL의 강력한 유발을 결과시켰다. QS21은 자력으로 CTL의 유발을 향상시키는 반면, 3D-MPL은 그렇지 않다. 상기 결합물은 그것이 각 보조약의 개별적 효과의 합 보다 더욱 큰 효과를 갖기 때문에, 상승적으로 작용한다고 할 수 있다. CTL 유발을 위한 상기 두 보조약 간의 상승작용은 가용성 재조합 단백질 gD2t로 인한 자극에 응하여 IFN-γ를 분비할 수 있는 T 세포의 유발에 대한 QS21과 3D-MPL간의 상승작용의 발명자의 관찰을 지지하는 놀라운 관찰이다. 두 보조약 QS21 및 3D-MPL의 병용이 재조합 단백질을 기재로한 백신의 심각한 한계를 극복하고 종래보다 광범위한 면역반응을 유발할 수 있기 때문에, 상기 발견은 CTL 중재 면역성의 유발을 위한 백신으로서 재조합 분자의 사용에 중요한 의미를 갖는다.

생쥐 세포 중재 면역유전학적 데이타는 rgD2t의 QS21 기재 배합물은 상당한 상승작용의 TH1 타입 T 세포 반응(IFN-r 분비)를 유발시킨다는 것을 보인다.

상기 TH1 타입 T 세포는 생쥐내 지연형 감각 과민성 반응의 유발에 관련된다고 제시되었다. HSV 질병의 예방에서 발명인들 자신의 데이타는 중화 항체 역가 및 항원 특이적 DTH 반응의 수반 유발이 단순포진 질병에 대한 최고의 예방을 할 수 있다는 것을 제시한다.

종합하면, 상기 데이타들은 rgD2t의 QS21 배합물이 HSV 질병에 대항하는 보호 반응을 유발시키는데 효과적일 수 있다는 것을 제안하였다. 제공된 데이타들은 IFN-γ 분비 항원 특이 T 세포를 유발시키는데 있어, 3D 모노포스포릴 리피드 A 및 QS21 간의 예상치 못한 상승 작용 효과를 보인다. 그러한 상승작용은 HSV 질병에 대항하는 보호 반응을 유발하는 향상된 능력으로 해석할 수 있으며, 실제로 상기 배합물은 기니아 피그에 있어 질병의 예방에 효과적이다.

Claims

항원 및/또는 항원성 조성물, QS21 및 3-데-0-아실화 모노포스포릴리피드 A (3D-MPL)를 포함하는 백신 조성물.
제1항에 있어서, QS21:3D-MPL의 비가 1:10 - 10:1인 백신 조성물.
제1항에 있어서, 포유류에 있어 항원 또는 항원성 조성물에 대한 세포 용해 T 세포 반응을 유도해낼 수 있는 백신 조성물.
제1-3항 중 어느 한 항에 있어서, 인터페론 γ 생산을 자극할 수 있는 백신 조성물.
제1-3항 중 어느 한 항에 있어서, QS21:3D-MPL의 비가 1:1 -1:2.5인 백신 조성물.
제1-3항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 사람 면역 결핍 비루스, 고양이 면역결핍 비루스(Feline Immunodeficiency Virus), 단순포진 비루스 타입 1, 단순포진 비루스 타입 2, 사람 사이토메갈로비루스(Humancytomegalovirus), 감염 A, B, C 또는 E형, 호흡 합포체 비루스(Respiratory syncytial virus), 사람 유두종 바루스, 인플루엔자 비루스, 살모넬라, 나이세리아(Neisseria), 보렐리아(Borrelia), 클라미디아(Chlamydia), 보르데텔라(Bordetella), 플라스모듐(Plasmodium) 또는 톡소플라즈마(Toxoplasma)로부터 유래된 항원 또는 항원 조성물을 포함하는 백신 조성물.
제1-3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 종양 항원인 백신 조성물.
QS21 및 3D-MPL를 항원 또는 항원성 조성물과 혼합하는 것으로 이루어지는, 제1-3항 중 어느 한 항에 따른 백신 조성물을 제조하는 방법.
QS21 및 3D-MPL을 포함하여 구성되는, 백신 조성물에 유용한 보조제 조성물.