BRPI0618254A2 - emulsões com agente tensoativo de fase aquosa livre para fornecer adjuvante às vacinas contra influenza dividido - Google Patents

Abstract

EMULSOES COM AGENTE TENSOATIVO DE FASE AQUOSA LIVRE PARA FORNECER ADJUVANTE áS VACINAS CONTRA INFLUENZA DIVIDIDO Uma vacina do vírus Influenza dividido possuiadjuvante com uma emulsão de óleo e água que contém agente tensoativo livre em sua fase aquosa. O agente tensoativo livre continua a exercer um "efeito de divisão" no antigeno, pelo que, interrompendo quaisquer vírions e/ou agregados de vírus não divididos que possam estar presentes.

Description

EMULSÕES COM AGENTE TENSOATIVO DE FASE AQUOSA LIVRE PARAFORNECER ADJUVANTE ÀS VACINAS CONTRA INFL UENZA DIVIDIDO

Todos os documentos e informações on-line citadasaqui são incorporadas como referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

As vacinas contra Influenza são descritas noscapítulos 17 e 18 da referência 1. Elas se baseiam no vírusvivo ou no vírus inativado e as vacinas inativadas podem sebasear no vírus integral, vírus "dividido" ou nos antígenosde superfície purificados (incluindo hemaglutinina eneuraminidase). A hemaglutinina (HA) é o principalimunógeno nas vacinas contra Influenza inativado e asdoses de vacina são padronizadas com referência aos níveisde HA, as vacinas contendo, tipicamente, cerca de 15 μg deHA por cepa.

As vacinas "divididas" são obtidas por tratamentodos vírions com detergentes para produzir preparações desubvírions, empregando métodos, tais como, processos dedivisão de "Tween-éter". As vacinas divididas geralmenteincluem múltiplos antígenos do vírion do Influenza. Osprodutos BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ e FLUSHIELD™ sãovacinas divididas.

Durante a estação de 2000-2001 no Canadá, umasíndrome oculorespiratória (ORS) identificada recentementefoi observada em pacientes que receberam vacinas divididas.A ORS foi associada à divisão incompleta . dos vírionsdurante a fabricação, fornecendo composições com uma altaproporção de microagregados de vírions não divididos (2) .

Não existe explicação de causa da ligação entre asvacinas divididas e a ORS, porém aspectos clínico eepidemiológicos da ORS são sugestivos de hipersensibilidadee, assim, foi proposto que a vacina possa perturbar oequilíbrio natural de Th1/Th2, com os vírions não divididosespecíficos causando uma inclinação na direção do fenótipoTh2. Na referência 3, por exemplo, a presença de agregadosnas vacinas de Influenza divididas foi encontrada,desviando a resposta imune para um padrão de citocina Th2maior. Na referência 4, contudo, nenhuma ligação seriaconfirmada entre ORS e o equilíbrio de Th1/Th2.

Em uma situação onde as vacinas contra Influenzadevem ser produzidas com pressa (por exemplo, em um surtopandêmico), entre a pressão sobre os fabricantes poderesultar inadvertidamente na liberação de vacinas quesofrem de alguns problemas como as bateladas Canadensesagregadas parcialmente não divididas de 2000-2001. Narealidade, a referência 2 afirma que "pode não ser possíveleliminar os vírions não divididos e agregados em conjunto"e que "algum risco de nível baixo para desencadear sintomasoculares e respiratórios pode ser inevitável".

É um objetivo da invenção minimizar o risco de umavacina contra Influenza dividida sofrer dos mesmosproblemas conforme visto no Canadá na estação de 2000-2001.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO

A invenção satisfaz esse objetivo por acrescentarum adjuvante a uma vacina contra vírus Influenza com umaemulsão de óleo e água que contém agente tensoativo livreem sua fase aquosa. O agente tensoativo livre podecontinuar a exercer um "efeito de divisão" no antígeno,pelo que, interrompendo qualquer vírion não dividido e/ouagregados de vírion que possam de outra forma estarpresentes. Além disso, embora possa ser esperado que oagente tensoativo livre tenha um efeito desnaturante nasglicoproteínas da membrana, tal como o antigeno HAimportante, a vida útil curta em prateleira requerida parauma vacina contra o vírus Influenza significa que essaquestão não causa dificuldades na prática.

Assim, a invenção provê uma composição imunogênicacompreendendo um antigeno do vírus Influenza e uma emulsãode óleo e água, onde a emulsão inclui agente tensoativolivre em sua fase aquosa.

A invenção também provê um método para preparar umacomposição imunogênica compreendendo as etapas de: (i) umantigeno do vírus Influenza divivido; e (ii) uma emulsãode óleo e água que inclui agente tensoativo livre em suafase aquosa.

A invenção também provê um kit compreendendo: (1)um primeiro componente de kit compreendendo um antigeno dovírus Influenza dividido; e (ii) um segundo componente dekit compreendendo uma emulsão de óleo e água que incluiagente tensoativo livre em sua fase aquosa.

Embora não existam atualmente vacinas contra

Influenza divivido contendo adjuvante no mercado, existemvárias propostas para introdução dos adjuvantes nas vacinascontra Influenza, de modo a permitir que mais doses sejamproduzidas de uma quantidade fixa de antigeno. Por exemplo,as referências 5 a 8 revelam o uso de sais de alumínio paraacrescentar adjuvante às vacinas de contra Influenza devírion integral. A invenção evita o uso de sais de alumíniocomo o único adjuvante para as vacinas divididas, uma vezque eles promovem a resposta imune do tipo Th2 quando usadopropriamente, fato que esteve implicado no surto de ORSCanadense (vide acima).

Antígeno do vírus Influenza dividido

As composições da invenção incluem um antígenoobtido por divisão dos vírus Influenza.. 0 vírions divididotipicamente incluirá antígenos múltiplos do vírionsInfluenza, incluindo hemaglutinina, neuraminidase, matrize nucleoproteína. A invenção não engloba vacinas de vírusvivo (tais como, o produto FLUMIST™, vacinas inativadas devírion integral (tais como, produto INFLEXAL™, vacinas deantígeno de superfície purificado (que se baseiam nahemaglutinina purificada e glicoproteínas de superfície deneuraminidase, tais como, os produtos FLUVIRIN™, AGRIPAL™ eINFLUVAC™) ou vacinas virossômicas (que tomam a forma departículas lipossômicas semelhantes ao vírus isentas deácido nucléico (9) , como nos produtos INFLEXAL™ eINAVAVAC™) .

Os vírions podem ser colhidos dos fluidos contendovírus por vários métodos. Por exemplo, um processo depurificação pode envolver centrifugação por zona usando umasolução gradiente de sacarose linear que contém detergentepara fragmentar os vírions.

Os vírus divididos são obtidos por tratamento dosvírions com detergentes, (por exemplo, éter etílico,polissorbato 80, desoxicolato, fosfato de tri-N-butila,Triton X-100, Triton NlOl, brometo de cetiltrimetilamônio,Tergitol NP9, etc.) para produzir preparações de subvírionincluindo os processos de divisão de "Tween-éter". Osmétodos de divisão dos vírus Influenza são bem conhecidosna técnica, vide por exemplo, referências 10-15, etc. Adivisão dos vírus é realizada tipicamente por interrupçãoou fragmentação do vírus integral, quer infecciosos ou nãoinfecciosos com uma concentração de interrupção de umagente de divisão. A interrupção resulta em umasolubilização plena ou parcial das proteínas virais,alterando a integridade do vírus. Agentes de divisãopreferidos são agentes tensoativos não iônicos e iônicos(por exemplo catiônicos), por exemplo, alquilglicosídeos,alquiltioglicosídeos, açúcares acila, sulfobetaínas,betaínas, éteres polioxietilenoalquílicos, N,N-dialquil-glucamidas, Hecameg, alquilfenóxi-polietoxietanóis,compostos de amônio quaternário, sarcosila, CTABs (brometosde cetil trimetil amônio) , fosfato de tri-iV-butila,Cetavlon, sais de miristiltrimetilamônio, lipofectina,liofectamina e DOT-MA, os polioxietanóis octil ounonilfenóxi (por exemplo, os agentes tensoativos Triton,tais como, Triton X-100 ou Triton ΝΙΟΙ), ésterespolioxietileno sorbitano (os agentes tensoativos Tween) ,éteres de polioxietileno, ésteres de polioxietileno, etc.

Um procedimento de divisão útil emprega os efeitosconsecutivos do desoxicolato de sódio e aldeído fórmico e adivisão pode acontecer durante a purificação inicial dovírion (por exemplo, em uma solução gradiente de densidadede sacarose). Os vírions divididos podem geralmente serressuspensos na solução de cloreto de sódio isotônicatamponada com fosfato de sódio.

O vírus Influenza pode ser atenuado. O vírusInfluenza pode ser sensível à temperatura. O vírusInfluenza pode ser adaptado ao frio.

As cepas do vírus Influenza para uso nas vacinasmudam de estação a estação. No período interpandêmicocorrente, as vacinas trivalentes são típicas, incluindoduas cepas de Influenza A (H1N1 e H3N2) e uma cepa deInfluenza Β. A invenção também pode ser usada com cepas inter-pandêmicas desse tipo, porém podem ser usadas comvírus das cepas pandêmicas (isto é, cepas para as quais oreceptor da vacina e a população humana em geral sãoimunológica e não previamente desafiados), tais como, cepasH2, H5, H7 ou H9 (especificamente do vírus Influenza A) e vacinas Influenza para cepas pandêmicas podem sermonovalentes ou podem se basear em uma vacina trivalentenormal suplementada por uma cepa pandêmica. Dependendo daestação e da natureza do antígeno incluído na vacina,contudo, a invenção pode proteger contra um ou mais dentre os subtipos de HA do vírus Influenza A: Hl, H2, H3, H4,H5, H6, H7, H8, H9, HlO, Hll, H12, H13, H14, H15 ou H16. Ainvenção pode proteger contra um ou mais dentre os subtiposde Na do vírus de Influenza A: NI, N2, N3, N4, N5, N6, N7,N8 ou N9.

As composições da invenção, além de seremapropriadas para imunização contra cepas inter-pandêmicas,podem ser especificamente úteis para imunização contracepas pandêmicas. As características de uma cepa Influenzaque fornecem à mesma o potencial para causar um surto pandêmico são: (a) que ela contenha uma nova HA emcomparação às HAs nas cepas humanas circulandocorrentemente, isto é, uma que não seja evidente napopulação humana por mais de uma década (por exemplo, H2)ou que não tenha sido anteriormente encontrada na populaçãode seres humanos (por exemplo, H5, H6 ou H9) , que foramencontradas de modo geral apenas em populações aviárias) ,tal que a população humana será imunológica e nãopreviamente desafiada com relação à HA da cepa; b) que sejacapaz de ser transmitida horizontalmente na populaçãohumana; e c) que seja patogênica aos seres humanos. Umvírus com hemaglutinina do tipo H5 é preferido paraimunização contra Influenza pandêmica, tal como uma cepaH5N1. Outras cepas possíveis incluem H5N3, H9N2, H2N2, H7N1e H7N7, e quaisquer outras cepas pandêmicas potencialmenteemergentes. Dentro do subtipo H5, um vírus pode seencontrar na classificação 1 de HA, classificação 1' de HA,classificação 2 de HA ou classificação 3 de HA (16) , com asclassificações 1 e 3 sendo especificamente relevantes.

As cepas do vírus Influenza empregadas com ainvenção podem ser resistentes à terapia antiviral (porexemplo, resistentes ao oseltamivir (17) e/ou zanamivir)incluindo cepas pandêmicas resistentes (18) .

As composições da invenção podem incluirantígeno(s) de uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) cepas do vírus Influenza, incluindo vírus Influenza Ae/ou vírus Influenza B. Quando a vacina inclui mais de umacepa de Influenza, as diferentes cepas são tipicamentedesenvolvidas separadamente e são misturadas após os vírusterem sido colhidos e os antígenos terem sido divididos.

Assim o processo da invenção pode incluir a etapa demistura dos antígenos de mais de uma cepa de Influenza. Umavacina trivalente é preferida incluindo duas cepas do vírusInfluenza A e uma cepa do vírus Influenza B.

Em algumas concretizações da invenção, ascomposições podem incluir antígeno de uma cepa deInfluenza A simples. Em algumas concretizações, ascomposições podem incluir antigeno de duas cepas deInfluenza A, contanto que essas duas cepas não sejam H1N1e H3N2. Em algumas concretizações, as composições podemincluir antigeno de mais de duas cepas de Influenza A.

O vírus Influenza pode ser uma cepa de reabsorção epode ter sido obtida por técnicas genéticas reversas. Astécnicas genéticas reversas (por exemplo, 19-23) permitemque o virus Influenza com segmentos de genoma desejadosseja preparado in Vitro usando plasmídeos. Tipicamente,isso envolve a expressão de (a) moléculas de DNA quecodificam moléculas de RNA virais desejadas, por exemplo,de promotores de poli e (b) moléculas de DNA que codificamproteínas virais, por exemplo, promotores de polll, tal quea expressão de ambos os tipos de DNA em uma célula conduzaao agrupamento de um vírion infeccioso intacto e completo.O DNA preferivelmente provê todos RNA virais e proteínas,porém também é possível usar um vírus auxiliar para proveralgum RNA e proteínas. Os métodos à base de plasmídeousando plasmídeos separados para produção de cada RNA viralsão preferidos (24-26) e esses métodos também envolverão oemprego de plasmídeos para expressar todas ou algumas (porexemplo, apenas as proteínas PBl, PB2, PA e NP) dasproteínas virais, com 12 plasmídeos sendo usados em algunsmétodos.

De modo a reduzir o número de plasmídeosnecessários, uma abordagem recente (27) combina várioscassetes de transcrição de RNA polimerase I (para síntesede RNA viral) no mesmo plasmídeo (por exemplo, seqüênciascodificando 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os segmentos deRNAv do Influenza A) e várias regiões de codificação deproteína com promotores de RNA polimerase II em outroplasmídeo (por exemplo, seqüências codificando 1, 2, 3, 4,5, 6, 7 ou todas 8 transcrições de RNAm do Influenza A). Osaspectos preferidos do método de referência 27 envolvem:(a) regiões de PBl, PB2 e PA codificando RNAm em umplasmídeo simples; e (b) todos 8 segmentos codificando RNAvem um plasmídeo simples. A inclusão dos segmentos de NA eHA em um plasmídeo e os seis outros segmentos no outroplasmídeo podem também facilitar a questão.

Como uma alternativa ao uso dos promotores polipara codificar os segmentos de RNA virais, é possível usarpromotores de bacteriofago polimerase (28) . Por exemplo, ospromotores para as polimerases SP6, T3 ou T7 podem serconvenientemente empregados. Em razão da especificidade deespécie dos promotores poli, os promotores de bacteriofagopolimerase podem ser mais convenientes para muitos tipos decélula (por exemplo, MDCK), embora uma célula deva tambémser transfectada com um plasmídeo codificando a enzima depolimerase exógena.

Em outras técnicas é possível usar promotoresduplos poli e polll para codificar simultaneamente os RNAsvirais e para RNAms expressáveis a partir de um gabaritosimples (29,30).

Assim um vírus Influenza A pode incluir um ou maissegmentos de RNA de um vírus A/PR/8/34 (tipicamente 6segmentos de A/PR/8/34 com segmentos HA e N sendo de umacepa de vacina, isto é, um reabsorvente 6:2),especificamente quando os vírus crescem em ovos. Isso podetambém incluir um ou mais segmentos de RNA de um vírusA/WSN/33 ou de qualquer outra cepa de vírus útil parageração de vírus reabsorventes para preparação de vacina.Tipicamente, a invenção protege contra uma cepa que é capazde transmissão humano-a-humano e assim o genoma da cepageralmente incluirá pelo menos um segmento de RNA que seoriginou em um vírus Influenza de mamífero (por exemplo, emum ser humano) . Isso pode incluir um segmento NS que seoriginou em um vírus Influenza aviário.

Os vírus empregados como a fonte dos antígenospodem se desenvolver tanto em ovos quanto em culturas decélulas. 0 método padrão corrente para crescimento do vírusInfluenza utiliza ovos de galinha embrionários isentos deagente patogênico (SPF), com o vírus sendo purificado apartir do conteúdo do ovo (fluido alantóico). Maisrecentemente, contudo, os vírus vêm crescendo em cultura decélula animal e, por razões de velocidade e alergias depacientes, esse método de crescimento é preferido. Se ocrescimento viral à base de ovos for empregado, então um oumais aminoácidos podem ser introduzidos no fluido alantóicodo ovo em conjunto com o vírus (15).

Quando uma cultura de célula é empregada, osubstrato de crescimento viral tipicamente será umalinhagem de célula com origem em mamífero. As célulasoriginárias de mamíferos incluem, porém não estão limitadasas células de hamster, gado, primata (incluindo sereshumanos e macacos) e de cães. Vários tipos de células podemser usados, tais como, células de rins, fibroblastos,células retinais, células de pulmão, etc. Exemplos decélulas de hamster apropriadas são as linhagens de célulapossuindo as denominações BHK21 ou HKCC. Células de macacosapropriadas são, por exemplo, células de macacos africanos,tais como, células de rins como na linhagem de célula Vero.Células de cães apropriadas são, por exemplo, células derins, como na linhagem de célula de MDCK. Assim, aslinhagens de célula apropriadas incluem, porém não estãolimitadas a: MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; etc. Linhagens de células de mamíferos preferidas quedesenvolvem vírus Influenza incluem: células MDCK (31-34)derivadas dos rins de cães Madin Darby; células Vero (33-37), derivadas dos rins de macaco verde africano(Cercopithecus aethiops); ou células PER-C6 (38) derivadasde retinoblastos embriônicos humanos. Essas linhagens decélulas se encontram amplamente disponíveis, por exemplo,na American Type Cell Culture (ATCC) Collection (39), naCoriell Cell Repositories (40) ou na European Collection ofCell Cultures (ECACC). Por exemplo, a ATCC fornece váriascélulas Vero diferentes sob os números de catálogo CCl-81,CCl-81.2, CRl-1586 e CR1-1587, e fornece células MDCK sobnúmero de catálogo CC1-34. PER.C6 está disponível na ECACCsob número de depósito 96022940. Como uma alternativa menospreferida às linhagens de células de mamíferos, o víruspode crescer em linhagens de células aviárias (por exemplo,referências 41-43), incluindo linhagens de célulasderivadas de patos (por exemplo, retina de pato) ougalinhas, por exemplo, fibroblastos de embriões de galinha(CEF), etc. Exemplos incluem células tronco embrionáriasaviárias (41,44), incluindo a linhagem de célula EBxderivada das células tronco embrionárias de galinha, EB45,EB14 e EB14-074 (45).

As linhagens de células mais preferidas para ocrescimento dos vírus Influenza são as linhagens de célulaMDCK. A linhagem de célula MDCK original está disponível naATCC como CC1-34, porém também podem ser empregados osderivados dessa linhagem de células. Por exemplo, areferência 31 revela uma linhagem de célula MDCK que foiadaptada para crescimento na cultura de suspensão ('MDCK33016depositada como DSM ACC 2219). De modo semelhante,a referência 46 revela uma linhagem de célula derivada deMDCK que cresce em suspensão na cultura isenta de soro ('Β-702', depositada como FERM BP-7449). A referência 47 revelacélulas de MDCK não tumorigênicas incluindo 1MDCK-S' (ATCCPTA-6500), 'MDCK-SFlOl' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF1021 (ATCCPTA-6502) e 'MDCK-SF103' (PTA-6503). A referência 48 revelaas linhagens de célula MDCK com alta suscetibilidade àinfecção, incluindo células 'MDCK.5Fl' (ATCC CR1-12042).Qualquer uma dessas linhagens de célula MDCK pode serusada.

Para o crescimento em uma linhagem de célula, talcomo células MDCK, o vírus pode ser desenvolvido nascélulas em suspensão (31,49,50) ou em cultura aderente. Umalinhagem de célula MDCK apropriada para a cultura emsuspensão é MDCK 33 016 (depositada como DSM ACC 2219). Comouma alternativa, a cultura de microveículo pode serempregada.

Linhagens de célula sustentando a replicação dovírus Influenza são preferivelmente desenvolvidas em meiosde cultura isentos de soro e/ou meios isentos de proteína.Um meio é referido como um meio isento de soro no contextoda presente invenção, onde não existem aditivos de soro deorigem humana ou animal. Isentas de proteína significaculturas onde a multiplicação das células ocorre comexclusão das proteínas, fatores de crescimento, outrosaditivos de proteína e proteínas diferentes de soro, porémpodem incluir opcionalmente proteínas, tais como, tripsinaou outras proteases que podem ser necessárias aocrescimento do vírus. As células que crescem em taisculturas naturalmente contêm proteínas propriamente.

As linhagens de célula sustentando a replicação dovírus Influenza são preferivelmente desenvolvidas abaixode 37°C (51) (por exemplo, 30-36°C, ou cerca de 30°C, 31°C,32 °C, 33 °C, 34 °C, 35°C, 36°C) por exemplo, durante areplicação viral.

Quando o vírus cresce em uma linhagem de célula,então a cultura para o crescimento e também o inócuo viralusado para iniciar a cultura, preferivelmente serão isentos(isto é, terão sido testados e fornecem um resultadonegativo para contaminação) do vírus da herpes simples,vírus sincicial respiratório, vírus paralnfluenza. 3,coronavírus SARS1 adenovírus, rinovírus, reovírus,poliomavírus, birnavírus, circovírus e/ou parvovírus (52).A ausência dos vírus da herpes simples é especificamentepreferida.

Quando o vírus se desenvolve em uma linhagem decélula de mamífero então a composição será vantajosamenteisenta das proteínas do ovo (por exemplo, albumina eovomucóide) e do DNA da galinha, pelo que, reduzindo aalergenicidade. O não emprego de alergenos é um modoadicional de minimizar a respostas de Th2.

Quando o vírus se desenvolve em uma linhagem decélula, então a composição preferivelmente contém menos de10 ng (preferivelmente menos de 1 ng, e maispreferivelmente menos de 100 pg) de DNA residual de célulahospedeira por dose, embora quantidades de traço do DNA dacélula hospedeira estejam presentes. Em geral, o DNA dacélula hospedeira que se deseja excluir das composições dainvenção é o DNA que possui mais de 100 pares de base.

A medição do DNA residual da célula hospedeira éagora um requisito regulador da rotina biológica e seencontra dentro das capacidades normais de um versado natécnica. O ensaio usado para medir o DNA tipicamente seráum ensaio validado (53,54). As características dedesempenho do ensaio validado podem ser descritas emtermos matemáticos e quantificáveis e suas fontespossíveis de erro serão identificadas. O ensaiogeralmente será testado quanto as características taiscomo, exatidão, precisão, especificidade. Uma vez que oensaio tenha sido calibrado (por exemplo, contraquantidades padrão conhecidas de DNA de célula dehospedeiro) e testado, então medições de DNAquantitativas podem ser realizadas rotineiramente. Trêstécnicas principais para quantificação de DNA podem serusadas: métodos de hibridização, tais como, Southernblots ou slot blots (55) ; métodos de imunoensaio, taiscomo o ThresholdTM System 95 6) ; e PCR quantitativa (57) .Esses métodos são todos familiares a um versado natécnica, embora as características precisas de cadamétodo possam depender da célula de hospedeiro emquestão, por exemplo, a escolha das sondas parahibridização, a escolha dos iniciadores e/ou sondas paraampliação, etc. 0 sistema ThresholdTM da MolecularDevices é um ensaio quantitativo para níveis depicograma do DNA total e foi usado para monitorar osníveis de contaminação do DNA nos biofarmacêuticos (56).Um ensaio típico envolve formação não específica deseqüência de um complexo de reação entre uma proteína deligação de DNAss biotinilada, um anticorpo anti-DNAssconjugado com urease e DNA. Todos os componentes doensaio estão incluídos no Kit de Ensaio de DNA Totalcompleto disponível no fabricante. Vários fabricantescomerciais oferecem ensaios de PCR quantitativos, paradetecção do DNA residual da célula hospedeira, porexemplo, AppTecTM Laboratory Services, BioRelianceTM,Althea Technologies, etc. Uma comparação de um ensaio dehibridização quimioluminescente e do sistema ThresholdTM deDNA total para medição da contaminação do DNA da célulahospedeira de uma vacina viral humana pode ser encontradana referência 58.

0 DNA de contaminação pode ser removido durante apreparação da vacina usando procedimentos de purificaçãopadrão, por exemplo, cromatografia, etc. A remoção do DNAresidual da célula hospedeira pode ser melhorada portratamento com nuclease por exemplo, por uso de um DNAse.Um método conveniente para redução da contaminação do DNAda célula hospedeira é revelado nas referências 59 e 60,envolvendo um tratamento de duas etapas, primeiro usando umDNAse (por exemplo, Benzonase) que pode ser usado durante ocrescimento viral e então um detergente catiônico (porexemplo, CTAB), que pode ser usado durante o rompimento dovírion. 0 tratamento com um agente alquilante, tal como, β-propiolactona, pode também ser usado para remover o DNA dacélula hospedeira e vantajosamente pode também ser usadopara inativar vlrions (61).

As vacinas contendo <10 ng (por exemplo <1 ng, <100pg) de DNA da célula hospedeira por 15 pg de hemaglutininasão preferidas, como as vacinas contendo <10 ng (porexemplo, <1 ng, <100 pg) de DNA da célula hospedeira por0,25 mL de volume. As vacinas contendo <10 ng (por exemplo<1 ng, <100 pg) DNA de célula hospedeira por 50 pg dehemaglutinina são mais preferidas, como são as vacinascontendo <10 ng de DNA de célula hospedeira (por exemplo,<1 ng, <100 pg de DNA de célula hospedeira) por 0,5 mL devolume.

O método para propagação do vírus nas célulascultivadas geralmente inclui etapas de inoculação dascélulas cultivadas com a cepa a ser cultivada, cultivo dascélulas infectadas por um período de tempo desejado parapropagação do vírus, tal como, por exemplo, conformedeterminado por titulação viral ou expressão de antígeno(por exemplo, entre 24 e 168 horas após inoculação) ecoleta do vírus propagado. As células cultivadas sãoinoculadas com uma razão de vírus (medido por PFU ouTCID50) para razão de célula de 1:500 para 1:1,preferivelmente 1:100 a 1:5, mais preferivelmente de 1:50 a1:10. O vírus é adicionado a uma suspensão das células ou éaplicado a uma monocamada das células, e o vírus éabsorvido nas células por pelo menos 60 minutos, porémgeralmente menos de 3 00 minutos, preferivelmente entre 90 e24 0 minutos a 25°C a 40°C, pref erivelmente 28°C a 37°C. Acultura de célula infectada (por exemplo, monocamadas) podeser removida tanto por congelamento-descongelamento quantopor ação enzimática para aumentar o teor viral dossobrenadantes da cultura colhida. Os fluidos colhidos sãotanto inativados ou armazenados congelados. As célulascultivadas podem ser infectadas em uma variedade deinfecções ("m.o.i") de cerca de 0,0001 a 10,preferivelmente de 0, 002 a 5, mais preferivelmente de 0,001a 2. Ainda mais preferivelmente, as células são infectadasem uma m.o.i de cerca de 0,01. As células infectadas podemser colhidas 3 0 a 60 horas após a infecção.Preferivelmente, as células são colhidas 34 a 48 horas apósa infecção. Ainda mais preferivelmente, as células sãocolhidas 3 8 a 4 0 horas após infecção. As proteases(tipicamente tripsina) são geralmente adicionadas durante acultura da célula, de modo a permitir liberação viral e asproteases podem se adicionadas em qualquer estágioapropriado durante a cultura.

Hematoglutinina (HA) é o imunógeno principal nasvacinas de Influenza inativadas e doses de vacina sãopadronizadas com referência aos níveis de HA, tipicamenteconforme medido por ensaio de imunodifusão radial simples(SRID). As vacinas divididas existente contêm, tipicamente,cerca de 15 pg de HA por cepa, embora doses mais baixassejam também usadas, por exemplo, para crianças ou emsituações pandêmicas. As doses fracionais tais como, M(isto é, 7,5 pg HA por cepa), 1/4 e 1/8 vêm sendo usadas(7,8) como possuem doses maiores (por exemplo, 3x ou 9xdoses (62,63)). Assim, as vacinas podem incluir entre 0,1 e150 pg de HA por cepa de Influenza, pref erivelmente entre0,1 e 50 μg, por exemplo, 0,1-20 μg, 0,1-15 μg, 0,1-10 μg,0,1-7,5 μg, 0,5-5 μg etc. Doses específicas incluem, porexemplo, cerca de 45, cerca de 30, cerca de 15, cerca de10, cerca de 7,5, cerca de 5, cerca de 3,8, cerca de 1,9,cerca de 1,5, etc. por cepa. A inclusão de um adjuvante navacina pode compensar a imunogenicidade inerentemente baixadessas doses mais baixas.

A HA empregada com a invenção pode ser um HAnatural, conforme encontrada em um vírus ou pode ter sidomodificada. Por exemplo, é conhecida a modificação de HApara remover determinantes (por exemplo, regiõeshiperbásicas ao redor do sítio de clivagem entre HAl e HA2)que fazem com que o vírus seja altamente patogênico nasespécies aviárias, como esses determinantes podem de outraforma impedir que o vírus se desenvolva em ovos.

As composições da invenção podem incluirdetergente, por exemplo, um agente tensoativo do éster depolioxietileno sorbitano (conhecido como "Tweens"), umoctoxinol (tal como, octoxinol-9 (Triton X-100) ou t-octilfenoxipolietoxietanol), um brometo de cetil trimetilamônio ("CTAB") ou desoxicolato de sódio, especificamentepara uma vacina de antígeno de superfície ou dividida. 0detergente pode estar presente apenas em quantidades detraço. Assim, a vacina pode incluir menos de 1 mg/mL decada um de octoxinol-10, α-tocoferil hidrogênio succinato epolissorbato 80. Outros componentes residuais emquantidades de traço seriam antibióticos (por exemplo,neomicina, canamicina, polimixina B).

A emulsão de óleo e água

Foi verificado que as emulsões de óleo e água sãoespecificamente apropriadas para uso nas vacinas viraiscontra Influenza com adjuvante. Várias de tais emulsõessão conhecidas e elas incluem tipicamente pelo menos umóleo e pelo menos um agente tensoativo, com o(s) óleo(s) eagente(s) tensoativos sendo biodegradáveis (metabolizáveis)e biocompatíveis. As gotículas de óleo na emulsão sãogeralmente inferiores a 5 μπι de diâmetro e podem mesmo terum diâmetro de submícron, com esses tamanhos pequenos sendoencontrados com um microfluidificador para prover emulsõesestáveis. As gotículas com tamanho inferior a 220 nm sãopreferidas uma vez que são submetidas à esterilização emfiltro.

A invenção pode ser empregada com óleos, taiscomo, de uma fonte animal (tal como peixe) ou fontevegetal. Outras fontes de óleos vegetais incluem nozes,sementes e grãos. O óleo de amendoim, óleo de soja, óleo decoco e óleo de oliva, o mais disponível atualmente,exemplificam os óleos de nozes. O óleo de jojoba podetambém ser usado, por exemplo, obtido da jojoba. Os óleosde sementes incluem óleo de açafrão, óleo de semente dealgodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente degergelim e semelhantes. No grupo dos grãos, o óleo de milhoé o mais prontamente disponível, porém os óleos de outrosgrãos cereais, tais como, trigo, aveia, centeio, arroz,cereal africano, triticale e semelhantes também podem serusados. Os ésteres de ácido graxo de 6-10 carbonos deglicerol e 1,2-propanodil, embora não ocorrendonaturalmente nos óleos de semente, podem ser preparados porhidrólise, separação e esterificação dos materiaisapropriados começando dos óleos de semente e de nozes. Asgorduras e óleos do leite de mamíferos são metabolizáveis epodem, portanto, ser usadas na prática dessa invenção. Osprocedimentos para separação, purificação, saponificação eoutros meios necessários para obtenção dos óleos puros dasfontes animais são bem conhecidos na técnica. A maior partedos peixes contém óleos metabolizáveis que podem serprontamente recuperados. Por exemplo, óleo de fígado debacalhau, óleos de fígado de tubarão e óleo de baleia, talcomo, espermacetes, exemplificam vários dos óleos de peixeque podem ser usados aqui. Vários óleos de cadeiaramificada são sintetizados bioquimicamente em unidades deisopreno de 5 carbonos e são referidos, de modo geral comoterpenóides. O óleo de fígado de tubarão contém terpenóidesinsaturados, ramificados, conhecidos como esqualeno,2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno,que é especificamente preferido aqui. O esqualano, oanálogo saturado do esqualeno, é também um óleo preferido.Óleos de peixe incluindo esqualeno e esqualano sãoprontamente disponíveis nas fontes comerciais ou podem serobtidos por métodos conhecidos na arte. Outros óleospreferidos são os tocoferóis (vide abaixo). As misturas deóleos podem ser usadas.

Os agentes tensoativos podem ser classificadosquanto ao seu "HLB" (equilíbrio hidrófilo/lipófilo). Osagentes tensoativos preferidos da invenção possuem um HLBde pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 e, maispreferivelmente pelo menos 16. A invenção pode ser usadacom-agentes tensoativos incluindo, porém não limitados aos:agentes tensoativos de ésteres polioxietileno sorbitano(geralmente referidos como Tweens) , especialmentepolissorbato 20 e polissorbato 80; copolímeros de óxido deetileno (EO), óxido de propileno (PO) e/ou óxido debutileno (BO), vendidos sob a marca registrada DOWFAX™,tais como, copolímeros de bloco linear EO/PO; octoxinóis,que podem variar no número dos grupos de repetição etóxi(óxi-1,2-etanodiil), com octoxinol-9 (Triton X-100, ou t- octilfenoxipolietoxietanol) sendo de interesse específico;(octilfenóxi)polietóxietanol (IGEPAL CA-630/np-40);

fosfolipídeos, tais como, fosfatidilcolina (Iecitina);etoxilatos de nonilfenol, tais como, Tergitol™ série NP;éteres graxos de polioxietileno derivados de lauril, cetil, estearil e álcoois oleila (conhecidos como agentestensoativos Brij), tais como, éter monolauriltrietilenoglicol (Brj 30) e ésteres sorbitano (geralmenteconhecido como SPANs), tais como, trioleato de sorbitano(Span 85) e monolaurato de sorbitano. Agentes tensoativos não iônicos são preferidos. Os agentes tensoativospreferidos para inclusão na emulsão são Tween 80(monooleato de polioxietileno sorbitano) , Span 85(trioleato de sorbitano), lecitina e Triton X-100.

Misturas de agentes tensoativos podem ser usadas, por exemplo, misturas de Tween 80/Span 85. Uma combinaçãode um éster polioxietileno sorbitano, tal como, monooleatode polióxietileno (Tween 80) e um octoxinol, tal como, t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) é tambémapropriado. Outra combinação útil compreende laureth 9 mais um éster polioxietileno sorbitano e/ou um octoxinol.

Quantidades preferidas de agentes tensoativos (% empeso) são: ésteres de polioxietileno sorbitano (tais como,Tween 80) 0,001 a 1% em peso, especificamente 0,1% em peso;polioxietanóis octil ou nonilfenóxi (tais como, Triton X- 100, ou outros detergentes na série Triton) 0,001 a 0,1% empeso, especificamente 0,005 a 0,02%; éteres polioxietileno(tais como, laureth 9) 0,1 a 20%, preferivelmente 0,1 a 10%e especificamente 0,1 a 1% ou cerca de 0,5%.

Qualquer que seja a escolha do(s) óleo(s) e agentetensoativo(s), o(s) agente(s) tensoativo(s) é/são incluídosem excesso à quantidade necessária para emulsificação, talque, o agente tensoativo livre permanece na fase aquosa. 0agente tensoativo livre na emulsão final pode ser detectadopor vários ensaios. Por exemplo, um método de centrifugaçãogradiente de sacarose pode ser usado para separar asgotículas de emulsão da fase aquosa e a fase aquosa podeentão ser analisada. A centrifugação pode ser usada paraseparar as duas fases, com as gotículas de óleo coalescendoe se elevando para a superfície, após o que o agentetensoativo da fase aquosa pode ser determinado, porexemplo, usando HPLC ou qualquer outra técnica analíticaapropriada.

Adjuvantes de emulsão de óleo e água específicosúteis com a invenção incluem, porém não estão limitadosa:

- uma emulsão de submícron de esqualeno, Tween 8 0e Span 85. A composição da emulsão em volume pode ser decerca de 5% de esqualeno, 0,5% de polissorbato 80 ecerca de 0,5% de Span 85. Em termos de peso, essasrazões se tornam 4,3% de esqualeno, 0,5% de polissorbato80 e 0,48% de Span 85. Esse adjuvante é conhecido como"MF59", conforme descrito em maiores detalhes noCapítulo 10 do Powell & Newman e capítulo 12 de O1Hagan. Aemulsão MF59 inclui, vantajosamente, íons citrato, porexemplo, 10 mM de tampão de citrato de sódio.- uma emulsão de esqualeno, tocoferol e Tween 80. Aemulsão pode incluir salmoura tamponada com fosfato. Elatambém pode incluir Span 85 (por exemplo a 1%) e/oulecitina. Essas emulsões podem ter de 2 a 10% de esqualeno,de 2 a 10% de tocoferol e de 0,3 a 3% de Tween 80 e a razãoem peso de esqualeno: tocoferol é preferivelmente sal comoisso provê uma emulsão mais estável. O esqualeno e o Tween80 podem estar presentes em razão de volume de cerca de5:2. Uma tal emulsão pode ser fabricada por dissolução doTween 80 em PBS para fornecer uma solução a 2%, então amistura de 90 mL dessa solução com uma mistura de (5 g deD1-α-tocoferol e 5 mL de esqualeno) , entãomicrofluidificação da mistura. A emulsão resultante podepossuir goticulas de óleo de submícron, por exemplo, com umdiâmetro médio entre 100 e 250 nm, preferivelmente cerca de180 nm.

uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e umdetergente Triton (por exemplo, Triton X-100). A emulsãopode também incluir 3d-MPL. A emulsão pode conter um tampãode fosfato.

- uma emulsão compreendendo um polissorbato (porexemplo, polissorbato 80), um detergente Triton (porexemplo, Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo, umsuccinato de a-tocoferol). A emulsão pode incluir essestrês componentes em uma razão de massa de cerca de 75:11:10(por exemplo, 750 μg/mL de polissorbato 80, 110 μg/mL deTriton X-100 e 100 μg/mL de succinato de α-tocoferol) eessas concentrações incluiriam qualquer contribuição dessescomponentes dos antígenos. A emulsão também pode incluiresqualeno. A emulsão também pode incluir 3d-MPL (videabaixo). A fase aquosa pode conter um tampão fosfato.

Uma emulsão de esqualano, polissorbato 80 epoloxâmero 401 ("Pluronic™ L121"). A emulsão pode serformulada em salmoura tamponada com fosfato, pH 7.4. Essaemulsão é um veículo de distribuição útil para dipeptídeosde muramila e vem sendo usada com treonil-MDP no adjuvante11SAF-I" (69) (0,05-1% de Thr-MDP, 5% de esqualano, 2,5% dePluronic L121 e 0,2% de polissorbato 80). Ela também podeser usada sem o Thr-MDP, como no adjuvante "AF" (70) (5% deesqualano, 1,25% de Pluronic L121 e 0,2% de polissorbato80). A microfluidificação é preferida.

- Uma emulsão possuindo 0,5-50% de um óleo, 0,1-10%de um fosfolipídeo e 0,05-5% de um agente tensoativo nãoiônico. Conforme descrito na referência 71, componentes defosfolipídeo preferidos são fosfatidilcolina,fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina,fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico,esfinogomielina e cardiolipina. Tamanhos de gotículas desubmícron são vantajosos.

- Uma emulsão de óleo e água em submícron de umóleo não metabolizável (tal como, óleo mineral leve) e pelomenos um agente tensoativo (tal como, lecitina, Tween 80 ouSpan 80). Podem ser incluídos aditivos, tais como, saponinaQuilA, colesterol, um conjugado de saponina-lipófilo (talcomo, GPI-0100, descrito na referência 72, produzido poradição de amina alifática à desacilsaponina, através dogrupo carboxila do ácido glicurônico), brometo dedimetilidioctadecilamônio e/ou N, N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina.

- Uma emulsão na qual a saponina (por exemplo,QuilA ou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol)são associados como micelas helicoidais (73).

As emulsões e o antígeno dividido podem sermisturados durante a fabricação, antes do empacotamento oueles podem ser misturados extemporaneamente, na hora dadistribuição. Assim, o adjuvante e o antígeno podem sermantidos separadamente em uma vacina embalada oudistribuída, pronta para formulação final na hora do uso. 0antígeno geralmente estará na forma aquosa, tal que avacina é finalmente preparada por mistura de dois líquidos.A razão em volume dos dois líquidos para mistura podevariar (por exemplo, entre 5:1 e 1:5) porém geralmente é decerca de 1:1. Kits apropriados são descritos em maioresdetalhes a seguir.

Após o antígeno e o adjuvante serem misturados, oantígeno da hemaglutinina geralmente permanecerá na soluçãoaquosa, porém pode se distribuir ao redor da interface deóleo/água. Em geral, pouca hemaglutinina se alguma entraráa fase oleosa da emulsão.

Quando uma composição inclui um tocoferol, qualquerum dentre os α, β, γ, δ, ε ou ξ tocoferóis pode ser usado,porém os a-tocoferóis são os preferidos. 0 tocoferol podetomar várias formas, por exemplo, de diferentes sais e/ouisômeros. Os sais incluem sais orgânicos, tais como,succinato, acetato, nicotinato, etc. D-α-tocoferol e Dl-a-tocoferol podem ambos ser usados. Os tocoferóis sãovantajosamente incluídos nas vacinas para uso nos pacientesmais velhos (por exemplo, com 60 anos de idade ou maisvelhos) uma vez que foi reportado que a vitamina E tem umefeito positivo na resposta imune nesse grupo de pacientes(74). Eles também possuem propriedades antioxidantes quepodem ajudar a estabilizar as emulsões (75). Um a-tocoferolpreferido é D1-a-tocoferol e o sal preferido dessetocoferol é o succinato. Foi verificado que o sal desuccinato coopera com os ligantes relacionados ao TNF invivo. Além disso, o succinato de α-tocoferol é conhecidopor ser compatível com as vacinas contra Influenza e comosendo um preservante útil como uma alternativa aoscompostos de mercúrio (14). Além disso, a estimulação davitamina E das células imunes pode conduzir diretamente àprodução acrescida de 11-2 (isto é, uma resposta do tipoThl) (76) , que pode ajudar a evitar um fenótipo Th2premeditado.

Adjuvantes Adicionais

As composições da invenção que incluem uma emulsãode óleo e água, podem também incluir um ou mais adjuvantesadicionais. Tais adjuvantes incluem, porém não estãolimitados a:

- Uma composição contendo mineral, incluindo saisde cálcio e sais de alumínio (ou misturas dos mesmos). Ossais de cálcio incluem fosfato de cálcio (por exemplo, aspartículas "CAP" reveladas na referência 77). Os sais dealumínio incluem hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc. comos sais tomando qualquer forma apropriada (por exemplo,gel, cristalina, amorfa, etc.). A adsorção para esses saisé preferida. As composições contendo mineral podem tambémser formuladas como uma partícula de sal de metal (78).Adjuvantes de sal de alumínio são descritos em maioresdetalhes a seguir.

- Agentes induzindo citocina (vide em maioresdetalhes a seguir).

- As saponinas (capítulo 22 da referência 67) sãoum grupo heterólogo de glicosídeos de esterol e glicosídeosde triterpenóide que são encontrados nas cascas, folhas,caules, raízes e mesmo flores de uma ampla faixa deespécies de plantas. As saponinas da casca da árvore MolinaQuillaia saponaria foram amplamente estudadas comoadjuvantes. A saponina também pode ser obtidacomercialmente de Smilax ornata (salsaparila) , Gypsophilapaiculata (véu de noiva) e Saponaria officinalis (raiz dequilaia). As formulações de adjuvante da saponina incluemformulações purificadas, tais como, QS21, bem comoformulações de lipídeo, tais como ISCOMs. QS21 écomercializada como Stimulon™. As composições de saponinaforam purificadas usando HPLC e RP-HPLC e fraçõespurificadas específicas usando essas técnicas foramidentificadas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-Be QH-C. Preferivelmente, a saponina é QS21. Um método paraprodução de QS21 é revelado na referência 79. Asformulações de saponina podem também compreender umesterol, tal como, colesterol (80) . As combinações dassaponinas e colesteróis podem ser usadas para formarpartículas únicas denominadas complexos imunoestimulantes(ISCOMs) (capítulo 23 da referência 67). ISCOMs tipicamentetambém incluem um fosfolipídeo, tal como,

fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquersaponina conhecida pode ser usada nos ISCOMs.Preferivelmente, o ISOM inclui um ou mais de QuiIA, QHA eQHC. Os ISCOMs são adicionalmente descritos nas referências80-82. Opcionalmente, os ISCOMs podem ser isentos dedetergente adicional (83) . Uma revisão do desenvolvimentodos adjuvantes com base na saponina pode ser encontrada nasreferências 84 e 85.

- Adjuvantes graxos (vide mais detalhes a seguir).

- Toxinas bacterianas de ribosilação de ADP (porexemplo, a enterotoxina "LT" instável ao calor do E.coli,toxina do cólera "CT" ou toxina da coqueluche "PT") ederivados desintoxicados dos mesmos, tais como, toxinasmutantes, como LT-K63 e LT-R72 (86) . 0 uso de toxinas deribosilação de ADP desintoxicadas como adjuvantes mucosaisé descrito na referência 87 e como adjuvantes parenteraisna referência 88.

Bioadesivos e mucoadesivos, tais como,microesferas de ácido hialurônico esterifiçado (89) ouquitosana e seus derivados (90).

- Micropartículas (isto é, uma partícula com ~100nm a ~150 μm de diâmetro, mais preferivelmente de ~200 nm a~30 μm de diâmetro e, mais pref erivelmente de ~500 nm a ~10μm de diâmetro) formadas de materiais que sãobiodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um poli(a-hidróxi ácido), um ácido poliidroxibutírico, umpoliortoéster, um polianidrido, uma policaprolactona,etc.), com o poli(lactídeo-co-glicolídeo)sendo o preferido,opcionalmente tratadas para ter uma superfície carregadanegativamente (por exemplo, com SDS) ou uma superfíciecarregada positivamente (por exemplo, com um detergentecatiônico, tal como, CTAB).

- Lipossomas (capítulos 13 e 14 da referência 67).Exemplos de formulações de lipossomas apropriadas para usocomo adjuvantes são descritos nas referências 91-93). Oslipossomas podem promover respostas fortes de Thl,especificamente lipossomas catiônicos contendo lipídeosmicobacterianos (94).

Éteres de polioxietileno e ésteres depolioxietileno (95). Tais formulações podem incluir agentestensoativos de éster polioxietieno sorbitano em combinaçãocom um octoxinol (96), bem como éteres de polioxietilenoalquila ou agentes tensoativos de éster em combinação compelo menos um agente tensoativo não iônico adicional, talcomo, octoxinol (97). Éteres de polioxietileno preferidossão selecionados do grupo que se segue: éterpolioxietileno-9-laurilo (laureth 9), éter polioxietileno-9 esteorila, éter polioxietileno-8 esteorila, éterpolietileno-4-laurilo, éter polioxietileno-35-laurilo eéter polioixietileno-23-laurilo.

Os peptídeos de muramila, tais como, N-acetilmuramil-1-treonil-D-isoglutamina ("thr-MDP"), N-acetil-normuramil-l-alanil-D_isoglutamina (nor-MDP), N-acetilglicosaminil-N-acetilmuramil-I-Al-D-isoglu-1-Ala-dipalmitóxi propilamida ("DTP-DPP", ou "Theramide™), N-acetilmuramil-l-alanil-D-isoglutaminil-l-alanina-2-(11 -2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforilóxi)-etilamina("MTP-PE").

Metil inosina 5'-monofosfato (MIMP") (98).

- Os compostos contendo lipídeos ligados a umaestrutura acrílica contendo fosfato, tais como o agonistaTLR4 E5564 (99,100):<formula>formula see original document page 31</formula>

- Derivados do lipídeo A de Escherichia coli, taiscomo, OM-174 (descrito nas referências 101 e 102) .

- Um composto da fórmula I, II ou III ou um sal do

mesmo:

<formula>formula see original document page 31</formula>

conforme definido na referência 103, tal como, 1ER803058', 'ER 803732', 'ER 804053', ER 804058', 'ER 804059','ER 804442', 'ER 804680', "ER 804764', ER 803022 ou 'ER804057', por exemplo:

<formula>formula see original document page 31</formula>ER-803022:

- Um composto pirrolizidina poliidroxilada (104),tal como um possuindo a fórmula:

<formula>formula see original document page 32</formula>

onde R é selecionado do grupo compreendendohidrogênio, acila linear ou ramificada, substituída ou nãosubstituída, saturada ou insaturada, grupos alquila (porexemplo, cicloalquila), alquenila, alquinila e arila ou umsal farmaceuticamente aceitável ou derivado da mesma.

Exemplos incluem, porém não estão limitados a: casuarina,casuarina-6-a-D-glicopiranose, 3-epi-casuarina, 7-epi-casduarina, 3,7-diepi-casuarina, etc.

- Uma outra preparação de proteossoma de proteínade membrana obtida de uma primeira bactéria gram-positivaem combinação com uma preparação de lipossacarídeo derivadade uma segunda bactéria gram-negativa, onde o proteossomada proteína de membrana e as preparações de lipossacarídeoformam um complexo adjuvante não covalente estável. Taiscomplexos incluem 11IVX-908", um complexo compreendido damembrana externa de Neisseria meningitides elipopolissacarídeos. Eles foram usados como adjuvantes paravacinas contra Influenza (105).- Uma gama inulina (106) ou derivado da mesma, talcomo, algamulina.

Essas e outras substâncias ativas adjuvantes sãodiscutidas em maiores detalhes nas referências 67 e 68.

As composições podem incluir dois ou mais dos ditosadjuvantes. Por exemplo, elas podem incluir,vantajosamente, ambos emulsão de óleo e água e um agenteinduzindo a citocina, como essa combinação melhora asrespostas da citocina promovidas pelas vacinas contraInfluenza, tais como, resposta interf eron-γ, com omelhoramento sendo maior que o visto tanto quando a emulsãoou o agente são usados propriamente.

Os antígenos e adjuvantes em uma composiçãotipicamente estarão em mistura.

Adjuvantes adicionais preferidos são aqueles quefavorecem a resposta imune do tipo Thl. Tais adjuvantesincluem, porém não estão limitados a: oligonucleotídeosimúnoestimuladores (107); 3dMPL (108); ISCOMs; QS21;micropartículas de PLG; fosfato de cálcio (109) ;pirrolidizinas poliidroxiladas; gama inulinas (110);imidazoquinolinas (123) ; Ioxoribina e derivados de fosfatoaminoalquila glicosaminida (111).

Agentes de indução de citocina

Os agentes de indução de citocina para inclusão nascomposições da invenção são capazes, quando administrados aum paciente, de promover o sistema imune para liberarcitocinas, incluindo interferons e interleucinas. Asrespostas da citocina são conhecidas como estandoenvolvidas nos estágios anteriores e decisivos da defesa dohospedeiro contra infecção por Influenza (112). Os agentespreferidos podem promover a liberação de um ou mais dentre:interferon-y; interleucina-1; interleucina-2; interleucina-12; TNF-α; TNF-β; e GM-CSF. Os agentes preferidos promovema liberação de citocinas associadas com uma resposta imunedo tipo Thl, por exemplo, interferon-γ, TNF-α,interleucina-2. A estimulação de ambos interferon-γ einterleucina-2 é preferida.

Como um resultado da recepção de uma composição dainvenção, portanto, um paciente terá células T que, quandoestimuladas com um antígeno de Influenza, liberará a(s)citocina(s) desejada(s) em uma maneira especifica deantígeno. Por exemplo, as células T purificadas do sangueliberarão γ-interferon quando expostas in vitro parahemaglutinina do vírus Influenza. Os métodos para mediçãode tais respostas nas células mononucleares do sangueperiférico (PBMC) são conhecidos na técnica e incluemELISA, ELISPOT, citometria de fluxo e PCR em tempo real.Por exemplo, a referência 113 reporta um estudo no qual asrespostas imunes mediadas por célula T específicas deantígeno contra toxóide tetânico, especialmente respostasde γ-interferon, foram monitoradas e foi verificado queELISPOT era o método mais sensível para discriminarrespostas induzidas por TT específicas para antígeno, apartir de respostas espontâneas, porém que a detecção decitocina intracitoplásmica por citometria de fluxo foi ométodo mais eficiente para detectar efeitos dereestimulação.

Agentes de indução de citocina apropriados incluem,porém não estão limitados a:

- Um oligonucleotídeo imunoestimulador, tal como umcontendo um motivo de CpG (uma seqüência de dinucleotídeocontendo uma citosina não metilada ligada por uma ligaçãode fosfato a uma guanosina) , ou um RNA de filamento duplo,ou um oligonucleotídeo contendo uma seqüência palindrômica,ou um oligonucleotídeo contendo uma seqüência poli(dG).

Líquido A de 3-0-monofosforila desacetilada('3dMPL' também conhecido como 1MPL™1) (114-117).

- Um composto imidazoquinolina, tal como, Imiquimod("R-83 7") (118,119), Resiquimod ("R-848") (120) e seusanálogos e sais dos mesmos (por exemplo, os saiscloridrato). Detalhes adicionais com relação àsimidazoquinolinas imunoestimuladoras podem ser encontradosnas referências 121 a 125.

- Um composto de tiosemicarbazona, tal como aquelesrevelados na referência 126. Os métodos para formulação,

fabricação e peneiramento para compostos aditivos sãotambém descritos na referência 126. As tiosemicarbazonassão especificamente eficazes na estimulação das célulasmononucleares de sangue periférico humano para a produçãodas citocinas, tais como, NTF-a.

Um composto triptantrina, tal como aquelesdescritos na referência 127. Os métodos para formulação,fabricação e peneiramento para compostos aditivos sãotambém descritos na referência 127. As tiosemicarbazonassão especificamente eficazes na estimulação das célulasmononucleares de sangue periférico humano para a produçãodas citocinas, tais como, NTF-a.

Um análogo de nucleotídeo, tal como: (a)Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):<formula>formula see original document page 36</formula>

e promedicamentos do mesmo; (b)ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) os compostos revelados nas referências128 a 13 0; (f) um composto possuindo a fórmula:

<formula>formula see original document page 36</formula>

onde:

Rl e R2 são cada um independentemente H, halo,NRaRb, -0H, alcóxi C1-6, alcóxi C1-6 substituído,heterociclila, heterociclila substituída, arila C6-10,arila C6-10 substituída, alquila C1-6, ou alguila C1-6substituída;

R3 está ausente, H, alquila C1-6, alquila C1-6substituída, arila C6-10, arila C6-10 substituída,heterociclila ou heterociclila substituída;

R4 e R5 são cada um, independentemente, H, halo,heterociclila, heterociclila substituída, -C(O)-Rd, alquilaC1-6, alquila C1-6 substituída, ou ligados em conjunto paraformar um anel de 5 elementos como em R4-5;

<formula>formula see original document page 36</formula>

a ligação sendo obtida como nas ligações indicadaspor um vvvv

Xl e X2 são cada um, independentemente, N, C, O ouS ;

R8 é Η, halo, -OH, alquila Cl-6, alquenila C2-6,alquinila C2-6, -OH, -NRaRb, -(CH2)n-O-Rc, -O-(alquila Cl-6), -S(O)pRe ou -C(O)-Rd; R9 é H, alquila Cl-6, alquila Cl-6 substituída,heterociclila, heterociclila substituída ou R9a, onde R9a

<formula>formula see original document page 37</formula>

e:

a ligação sendo obtida como nas ligações indicadaspor um vvvv

RlO e Rll são cada um, independentemente, H, halo,alcóxi Cl-6, alcóxi Cl-C6 substituído, -NRaRb, ou -OH;cada Ra e Rb é independentemente H, alquila Cl-6alquila Cl-6 substituída, -C(O)Rd, arila C6-10;cada Rc é independentemente H, fosfato, difosfato, trifosfato, alquila Cl-6 ou alquila Cl-6 substituída;

cada Rd é independentemente H, halo, alquila Cl-6,alquila Cl-6 substituída, alcóxi Cl-6, alcóxi Cl-6substituído, -NH2, -NH(alquila Cl-6), -NH(alquila Cl-6substituída), -N(alquila Cl-6)2, -N(alquila Cl-6 substituída)2, arila C6-10 ou heterociclila;

cada Re é independentemente H, alquila Cl-6,alquila Cl-6 substituída, arila C6-10, arila C6-10substituída ou heterociclila substituída;

cada Rf é independentemente H, alquila Cl-6, alquila Cl-6 substituída, -C(O)Rd, fosfato, difosfato outrifosfato;

cada n é independentemente 0, 1, 2 ou 3;cada ρ é independentemente 0, 1 ou 2; ou(g) um sal farmaceuticamente aceitável de qualquerum de (a) a (f) , um tautômero de qualquer um de (a) a (f)ou um sal farmaceuticamente aceitável do tautômero.

- Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) (131).

- Os compostos revelados na referência 132,incluindo: compostos Acilpiperazina, compostos Indolediona,compostos Tetraidroisoquinolina (THIQ), compostosBenzociclodiona, compostos Aminoazavinila, compostosAminobenzimidazol quinolina (ABIQ) (133,134), compostosHidraftalamida, compostos Benzofenona, compostos Isoxazol,compostos Esterol, compostos Quinazilinona, compostosPirrol (135), compostos Antraquinona, compostosQuinoxalina, compostos Triazina, compostosPirazolpirimidina e compostos Benzazol (136).

- Um polímero polioxidômio (13 7, 138) ou outroderivado de N oxidado de polietileno-piperazina.

- Os compostos revelados na referência 139.

-Um derivado de fosfato de aminoalquilglicosamidina, tal como, RC-529 (140, 141).

-Um fosfazeno, tal como,poli[di(carboxilatofenóxi)fosfazeno] ("PCPP") conformerevelado, por exemplo, nas referências 142 e 143.

Imunopotencializadores de molécula pequena(SMIPs), tais como:

N2-metil-l-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina;

N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina;N2-etil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina;

N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina;

1-(2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina;

N2-butil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina;

N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina;

N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-pentil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina;

N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-prop-2-enil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina;

1-(2-metilpropil)-2-[(fenilmetil)tio]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina;

1-(2-metilpropil)-2-(propiltio)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina;

2-[[4-amino-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2- il](metil)amino]etanol;

Acetato de 2-[[4-amino-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-il](metil)amino];

4-amino-1-(2-metilpropil)-1,3-diidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-one;

N2-butil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina;

N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo [4,5-c]quinolina-2,4-diamina;

N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5- c] quinolina-2,4-diamina;

N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis (fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina;

1-{4-amino-2-[metil(propil)amino]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il}-2-metilpropan-2-ol;

1-[4-amino-2-(propilamino)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il}-2-metilpropan-2-ol;

N4,N4-dibenzil-1-(2-metóxi-2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina.

Os agentes de indução de citocina para uso napresente invenção podem ser moduladores e/ou agonistas dosReceptores Semelhantes a Toll (TLR) . Por exemplo, elespodem ser agonistas para um ou mais dentre as proteínashumanas TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR 8 e/ou TLR9. Osagentes preferidos são os agonistas de TLR7 (por exemplo,imidazoquinolinas) e/ou TLR9 (por exemplo,oligonucleotídeos de CpG) . Esses agentes são úteis paraativar as vias de imunidade inata.

O agente de indução de citocina pode ser adicionadoa ma composição em vários estágios durante suas produção.Por exemplo, ele pode estar dentro de uma composiçãoantigênica e essa mistura pode então ser adicionada a umaemulsão de óleo e água. Como uma alternativa, ele podeestar dentro de uma emulsão de óleo e água quando o agentepode ser tanto adicionado aos componentes da emulsão antesda emulsificação, quanto ele pode ser adicionado à emulsãoapós a emulsif icação. De modo semelhante, ao gente pode serconservado dentro das gotículas da emulsão. A localização edistribuição do agente de indução da citocina dentro dacomposição final dependerá de suas propriedadeshidrófilas/lipófilas, por exemplo, ao gente pode estarlocalizado na fase aquosa, na fase oleosa e/ou na interfacede óleo e água.

O agente de indução da citocina pode ser conjugadoem um agente separado, tal como, um antígeno (por exemplo,CRM197) . Uma revisão geral das técnicas de conjugação para moléculas pequenas é provida na referência 144. Como umaalternativa, os adjuvantes podem ser não covalentementeassociados aos agentes adicionais, tal como por meio deinterações hidrófobas ou iônicas.

Dois agentes de indução da citocina preferidos são (a) oligonucleotídeos estimuladores e (b) 3dMPL.Oligonucleotideos estimuladores

Os oligonucleotídeos estimuladores podem incluirmodificações de nucleotideo/análogos, tais como,modificações de fosforotioato e podem ser de filamento duplo ou filamento simples (exceto para RNA) . Asreferências 145, 146 e 147 revelam possíveis substituiçõesanálogas, por exemplo, substituição de guanosina com 2'-desõxi-7-deazaguanosina. O efeito adjuvante dosoligonucleotídeos de CpG é adicionalmente discutido nas referências 148-153. Uma seqüência CpG pode ser dirigidapara TLR9, tal como o motivo GTCGTT ou TTCGTT (154) . Aseqüência de CpG pode ser específica para induzir umaresposta imune de . Thl, tal como um CpG-A ODN(oligodesoxinucleotídeo) ou pode ser mais específica para induzir uma resposta de célula B, tal como, CpG-B ODN. CpG-A e CpG-B ODNs são discutidas nas referências 155-157.Preferivelmente, a CpG é uma CpG-A ODN. Preferivelmente, ooligonucleotídeo de CpG é construído de modo que aextremidade 5' é acessível ao reconhecimento do receptor.Opcionalmente, duas sseqüências de oligonucleotídeo de CpGpodem ser anexadas às suas extremidades 3' para formarem"imunômeros". Vide, por exemplo, as referências 154 e 158-160. Um adjuvante de CpG útil é o CpG7909, também conhecidocomo ProMune™ (Coley PharTnaceutical Group, Inc.).

Como uma alternativa ou adição ao uso dasseqüências de CpG, podem ser empregadas as seqüências deTpG (161). Esses oligonucleotídeos podem ser isentos dosmotivos de CpG não metilados.

O oligonucleotídeo imunoestimulador pode ser ricoem pirimidina. Por exemplo, ele pode compreender mais de umnucleotídeo de timidina consecutivo (por exemplo, TTTT,conforme revelado na referência 161) e/ou pode ter umacomposição de nucleotídeo com a ≥25% de timidina (porexemplo, ≥35%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥80%, etc.). Por exemplo,ele pode compreender mais de um nucleotídeo de citocinaconsecutivo (por exemplo, CCCC, conforme revelado nareferência 161), e/ou ele pode ter uma composição denucleotídeo com ≥25% de citocina (por exemplo ≥35%, ≥40%,≥50%, ≥60%, ≥80%, etc.). Esses oligonucleotídeos podem serisentos de motivos CpG não metilados.

Os oligonucletídeos imunoestimuladores tipicamentecompreenderão pelo menos 20% de nucleotídeos. Eles podemcompreender um pouco mais de 100 nucleotídeos.

Uma combinação de lipossomas e oligonucleotídeosimunoestimuladores pode ser empregada, especificamente,quando os oligonucleotídeos são encapsulados dentro doslipossomas. Essa combinação pode incluir respostas imunesde Th1 fortes (162).

3dMPL

3dMPL (também conhecido como lipídeo A de 3-0-monofosforila desacetilada ou lipídeo A de 3-0-desacil-4'-monofosforila) é um adjuvante no qual a posição 3 daglicosamina de extremidade de redução no lipídeo A demonofosforila foi desacilada. 3dMPL foi preparado de ummutante sem heptose de Salmonella minnesota, e équimicamente semelhante ao lipídeo A, porém não possui umgrupo fosforila instável em ácido e um grupo acila instávelem base. Ele ativa as células da linhagem demonócito/macrófago e estimula a liberação de váriascitocinas, incluindo IL-1, IL-12, TNF-a e GM-CSF (videtambém referência 163) . A preparação de 3dMPL foioriginalmente descrita na referência 164.

3dMPL pode tomar a forma de uma mistura demoléculas correlatas, variando em sua acilação (porexemplo, possuindo 3, 4, 5 ou 6 cadeias de acila, que podemser de comprimentos diferentes). Os dois monossacarídeos deglicosamina (também conhecidos como 2-desóxi-2-amino-glicose) são N-acilados em seus carbonos na posição 32(isto é, nas posições 2 e 2') e existe também a acilação deO na posição 3' . O grupo anexado ao carbono 2 possui afórmula -NH-CO-CH2-CRlRl'. O grupo anexado ao carbono 2'possui a fórmula -NH-CO-CH2-CR2R2' . O grupo anexado aocarbono 3' possui a fórmula -0-C0-CH2-CR3R3. A estruturarepresentativa ê:<formula>formula see original document page 44</formula>

Os grupos R1, R2 e R3 são cada um,independentemente, -(CH2)n-CH3. O valor de n estápreferivelmente entre 8 e 16, mais preferivelmente entre 9e 12 e mais preferivelmente 10.

Os grupos R1', R2' e R3' podem serindependentemente: (a) -H; (b) -OH; ou (c) -O-CO-R4, ondeR4 é tanto -H quanto -(CH2)m-CH3, onde o valor de m estápref erivelmente entre 8 e 16, e mais pref erivelmente 10, 12ou 14. Na posição 2, m é pref erivelmente 14. Na posição 2'm é preferivelmente 10. Na posição 3', m é preferivelmente12. Os grupos Rl' , R21 e R31 são assim pref erivelmentegrupos -O-acila do ácido dodecanóico, ácido tetradecanóicoou ácido hexadecanóico.

Quando todos dentre Rl1, R21 e R3' forem -H, entãoo 3dMPL possuirá apenas 3 cadeias acila (uma em cada umadas posições 2, 2' e 3') . Quando apenas dois dentre Rl1,R2' e R3' forem -H então o 3dMPL pode ter 4 cadeias acila.Quando apenas um dentre Rl' , R21 e R31 for -H então o 3dMPLpoderá ter 5 cadeias acila. Quando nenhum de Rl1 , R2' e R31for -H então o 3dMPL poderá ter 6 cadeias acila. 0adjuvante 3dMPL empregado de acordo com a invenção pode seruma mistura dessas formas, com cerca de 3 a 6 cadeiasacila, porém é preferido que inclua 3dMPL com 6 cadeiasacila na mistura e especificamente para garantir que acadeia hexacila constitua até pelo 10% em peso do 3dMPLtotal, por exemplo ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50% ou mais, sendoverificado que 3dMPL com 6 cadeias acila é a forma maisativa do adjuvante.

Assim, a forma mais preferida de 3dMPL parainclusão nas composições da invenção é:

<formula>formula see original document page 45</formula>

Quando 3dMPL for usado na forma de uma mistura,então referências às quantidades ou concentrações de 3dMPLnas composições da invenção serão às espécies de 2dMPLcombinadas na mistura.

Nas condições aquosas, 3dMPL pode formar agregadosde micelas ou partículas com tamanhos diferentes, porexemplo, com diâmetro < 150 nm ou > 500 nm. Cada um ouambos podem ser empregados na invenção e as partículasmelhores podem ser selecionadas por ensaio de rotinaartículas menores (por exemplo, menores o suficiente parafornecer uma suspensão aquosa límpida de 3dMPL) sãopreferidas para uso de acordo com a invenção, em razão desua atividade superior (165). As partículas preferidaspossuem um diâmetro médio inferior a 220 nm, maispreferivelmente inferior a 200 nm ou menos de 150 nm oumenos de 120 nm e cada um pode mesmo ser inferior a 50 nm.Essas partículas são pequenas o suficiente para seremapropriadas à esterilização do filtro. O diâmetro departícula pode ser avaliado por técnica de rotina dedifusão de luz dinâmica, que revela um diâmetro departícula médio. Quando for dito que a partícula tem umdiâmetro de x nm, haverá de modo geral uma distribuição departículas ao redor dessa média, porém pelo menos 50% emnúmero (por exemplo, s60%, a70%, a80%, >90% ou mais) daspartículas terá um diâmetro dentro da faixa de x í 25%.

3dMPL pode ser usado vantajosamente em combinaçãocom uma emulsão de óleo e água. Substancialmente todo o3dMPL pode estar localizado na fase aquosa da emulsão.

Uma quantidade típica de 3dMPL em uma vacina é de10-100 μg/dose, por exemplo, cerca de 25 μg ou cerca de 50μg·

O 3dMPL pode ser usado propriamente, ou emcombinação com um ou mais compostos adicionais. Porexemplo, é conhecido o emprego de 3dMPL em combinação com asaponina QS21 (166) (incluindo em uma emulsão de óleo eágua (167)), com um oligonucleotídeo imunoestimuador, comambos QS21 e oligonucleotídeo imunoestimulador, com fosfatode alumínio (168), com hidróxido de alumínio (169) ou comambos fosfato de alumínio e hidróxido de alumínio.Composições farmacêuticas

As composições da invenção são farmaceuticamenteaceitáveis. Elas geralmente incluem componentes diferentesdo antigeno dividido e emulsão, por exemplo, por exemplo,elas incluem tipicamente um ou mais veículo(s)farmacêutico(s) e/ou excipiente(s). Uma discussão completade tais componentes está disponível na referência 170.

As composições de modo geral estarão na formaaquosa. 0 antigeno dividido e emulsão tipicamente serãoapresentados em mistura.

A composição final pode incluir preservantes, taiscomo, tiomersal ou 2-fenoxietanol. É preferido, contudo,que a vacina seja substancialmente isenta (isto é, menos de5 μg/mL) de material de mercúrio, por exemplo, isenta detiomersal (14,171). As vacinas não contendo mercúrio sãomais preferidas e isso pode ser convenientemente obtidoquando se emprega um adjuvante contendo tocoferol de acordocom a referência 14. As vacinas isentas de preservante sãoespecificamente preferidas.

Para controlar a tonicidade, é preferido incluir umsal fisiológico, tal como, um sal de sódio. 0 cloreto desódio (NaCl) é preferido, podendo estar presente entre 1 e20 mg/mL. Outros sais que podem estar presentes incluemcloreto de potássio, fosfato de diidrogênio potássio,desidrato de fosfato dissódio, cloreto de magnésio, cloretode cálcio, etc.

As composições para administração geralmente terãouma osmolalidade entre 200 mOsm/kg e 4 00 mOsm/kg,preferivelmente entre 240-360 mOsm/kg e maispreferivelmente estarão dentro da faixa de 290-310 mOsm/kg.A osmolalidade foi reportada anteriormente como nãopossuindo um impacto na dor causada pela vacinação (172),porém não obstante sendo preferida a manutenção daosmolalidade nessa faixa.

As composições podem incluir um ou mais tampões. Ostampões típicos incluem: um tampão fosfato; um tampão Tris;um tampão borato; um tampão succinato; um tampão histidinaou um tampão citrato. Os tampões tipicamente serãoincluídos na faixa de 5-20 mM. Uma emulsão formada na salmoura tamponada com fosfato pode ser convenientementeempregada.

O pH de uma composição geralmente estará entre 5,0e 8,1 e mais tipicamente entre 6,0 e 8,0, por exemplo,entre 6,5 e 7,5 ou entre 7,0 e 7,8. 0 processo da invenção portanto pode incluir uma etapa de ajuste do pH da vacinaem volume antes do embalamento.

A composição é preferivelmente estéril. Acomposição é preferivelmente não pirogênica, por exemplo,contendo < 1 EU (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose e, preferivelmente, < 0,1 EU por dose. Acomposição é preferivelmente isenta de glúten.

A composição pode incluir material para umaimunização simples ou pode incluir material paraimunizações múltiplas (isto é, um kit de "múltiplas doses") . A inclusão de um preservante é útil nasdisposições de múltiplas doses. Como uma alternativa (ouadição) para inclusão de um preservante em composições demúltiplas doses, as composições podem estar contidas em umrecipiente possuindo um adaptador asséptico para remoção do material.As vacinas contra Influenza são tipicamenteadministradas em um volume de dosagem de cerca de 0,5 mL,embora uma meia dose (por exemplo, cerca de 0,25 mL) possaser administrada às crianças.

As composições e kits são preferivelmentearmazenados entre 20C e 8°C. Elas não seriam congeladas.Elas deveriam ser mantidas, de modo ideal, fora da luzdireta.

Kits da Invenção

As composições da invenção podem ser preparadasextemporaneamente, na hora da distribuição. Assim, ainvenção provê kits incluindo os vários componentes prontospara mistura. O kit permite que o adjuvante e o antigenosejam mantidos separadamente até a hora do uso, o que podeser útil quando se emprega um adjuvante de emulsão de óleoe água.

Os dois componentes são fisicamente separados um dooutro dentro do kit, e essa separação pode ser obtida devários modos. Por exemplo, os dois componentes podem estarem dois recipientes separados, tais como frascos. 0conteúdo dos dois frascos pode então ser misturado, porexemplo, por remoção do conteúdo de um frasco e adição domesmo ao outro frasco ou por remoção separada do conteúdode ambos frascos e mistura dos mesmos em um terceirorecipiente.

Em uma disposição preferida, um dos componentes dokit está em uma seringa e o outro está em um recipiente,tal como um frasco. A seringa pode ser usada (por exemplo,com uma agulha) para inserir seu conteúdo no segundorecipiente para mistura e a mistura pode então ser inseridana seringa. O conteúdo misturado da seringa pode então seradministrado a um paciente, tipicamente através de uma novaagulha estéril. 0 embalamento de um componente em umaseringa pré-enchida elimina assim a necessidade de empregode uma seringa separada para administração ao paciente.

Em outra disposição preferida, os dois componentesdo kit são mantidos juntos, porém separadamente, na mesmaseringa, por exemplo, uma seringa de câmara dupla, taiscomo aqueles revelados nas referências 173-18 0 etc. Quandoa seringa é acionada (por exemplo, durante administração aopaciente) então o conteúdo das duas câmaras é misturado.Essa disposição evita a necessidade de uma etapa de misturaseparada na hora do uso.

Os componentes do kit geralmente estarão na formaaguosa. Em algumas disposições, um componente (tipicamenteo componente antigênico ao invés do componente adjuvante)está na forma seca (por exemplo, em uma forma liofilizada),com o outro componente estando na forma aquosa. Os doiscomponentes podem ser misturados a fim de reativar ocomponente seco e fornecer uma composição aquosa paraadministração a um paciente. 0 componente liofilizaçãotipicamente estará localizado dentro de um frasco ao invésde dentro da seringa. Os componentes secos podem incluirestabilizadores, tais como, lactose, sacarose ou manitol,bem como misturas dos mesmos, por exemplo, misturas delactose/sacarose, misturas de sacarose/manitol, etc. Umadisposição possível usa um componente adjuvante aquoso emuma seringa pré-enchida e um componente antigênicoliofilizado em um frasco.

Embalamento das composições ou componentes do kitRecipientes apropriados para composições dainvenção (ou componentes do kit) incluem frascos, seringas(por exemplo, seringas descartáveis), aspersões nasais,etc. Esses recipientes seriam estéreis.

Quando uma composição/componente estiver localizadoem um frasco, o frasco será fabricado de vidro ou ummaterial plástico. O frasco pode ser esterilizado antes dacomposição/componente ser adicionado ao mesmo. De modo aevitar problemas com pacientes sensíveis ao látex, osfrascos podem ser vedados com uma trava isenta de látex, aausência do látex em todo material de embalagem sendopreferida. O frasco pode incluir uma dose simples da vacinaou pode incluir mais de uma dose (um frasco de "múltiplasdoses"), por exemplo, 10 doses. Os frascos preferidos sãofabricados de vidro incolor.

Um frasco pode ter uma tampa (por exemplo, umatrava Luer) adaptada de modo que uma seringa pré-enchidapossa ser inserida dentro da tampa, o conteúdo da seringapodendo ser expelido para dentro do frasco (por exemplo,para reconstituir ali o material liofilizado) e o conteúdodo frasco pode ser removido de volta para a seringa. Apósremoção da seringa do frasco, uma agulha pode então seranexada e a composição pode ser administrada ao paciente. Atampa está localizada preferivelmente dentro de uma vedaçãoou capa, tal que a vedação ou capa precisa ser removidaantes da tampa ser acessada. 0 frasco pode ter uma tampaque permita a remoção asséptica de seu conteúdo,especificamente para frascos com múltiplas doses.

Quando uma composição/componente for embalado emuma seringa, a seringa normalmente não terá uma agulhaanexada à mesma, embora uma agulha separada possa serfornecida com a seringa para ser montada e utilizada.Agulhas seguras são preferidas de calibre 23, de 2,54 cm,calibre 25 de 2,54 cm e calibre 25 de 1,58 cm são típicas.

As seringas podem ser providas com rótulos descartáveis nosquais o número do lote, estação do Influenza e a data devencimento do conteúdo podem ser impressos, de modo afacilitar a manutenção do registro. O êmbolo na seringapossui preferivelmente uma trava para impedir que o êmboloseja acidentalmente removido durante aspiração. As seringastambém possuem uma tampa de borracha de látex e/ou êmbolo.As seringas descartáveis contêm uma dose simples de vacina.A seringa geralmente terá uma tampa de ponta para vedar aponta antes da anexação de uma agulha, a tampa de ponta sendo preferivelmente fabricada de uma borracha de butila.Se a seringa e a agulha forem embaladas separadamente,então a agulha será ajustada preferivelmente com umrevestimento de borracha de butila. As seringas preferidassão aquelas comercializadas sob a marca registrada "Tip- Lok™".

Os recipientes podem ser marcados para mostrarem umvolume de meia-dose, por exemplo, para facilitar adistribuição para as crianças. Por exemplo, uma seringacontendo uma dose de 0,5 mL terá uma marca mostrando um volume de 0,25 mL.

Quando for utilizado um recipiente de vidro (porexemplo, uma seringa ou um frasco), então é preferidoutilizar um recipiente fabricado de vidro de borossilicatoao invés de vidro com cal de soda.O kit ou composição pode ser embalado (por exemplo,na mesma caixa) uma bula incluindo detalhes da vacina, porexemplo, instruções para administração, detalhes dosantígenos dentro da vacina, etc. As instruções podem contertambém avisos, por exemplo, para manter a solução deadrenalina prontamente disponível no caso de reaçãoanafilática seguindo-se a vacinação, etc.Concretização Preferida da Invenção

Uma composição preferida compreende (i) uma emulsãode óleo e água incluindo esqualeno e polissorbato 80, e(ii) um antígeno do vírus Influenza dividido.

Um kit preferido compreende (i) um primeirocomponente de kit compreendendo um antígeno do vírusInfluenza dividido e (ii) um segundo componente de kitcompreendendo uma emulsão de óleo e água que incluiesqualeno e polissorbato 80.

Antes do processo ser realizado, as concentraçõesde antígeno e emulsão são maiores que o desejado para oproduto final, em razão da combinação dos componentesseparados causar diluição. Se volumes substancialmenteiguais dos dois componentes forem misturados, por exemplo,então as concentrações de pré-mistura serão dobradas paraas concentrações finais desejadas.

O antígeno do vírus Influenza dividido e a emulsãoassim serão preparados separadamente e então combinados.Embora a preparação dos dois componentes possa serrealizada em tempos diferentes por pessoas diferentes e emlocais diferentes, a invenção provê um processocompreendendo as etapas de:

(i) preparação de um antígeno do vírus Influenzadividido; (ii) preparação de uma emulsão de óleo e água,onde a emulsão inclui esqualeno e polissorbato 80; e (iii)combinação do antigeno do vírus Influenza dividido e aemulsão de óleo e água. A emulsão pode ser preparada porcombinação do(s) óleo(s) e agente(s) tensoativo(s) em ummeio aquoso e então microfluidificação da combinação paraformar a emulsão, por exemplo, para fornecer gotícuias desubmícron.

Quando o antigeno e a emulsão forem combinados emuma escala industrial, então o processo poderá incluir umaetapa adicional de extração de uma dose unitária damistura.

O antigeno do vírus Influenza dividido pode sermonovalente ou multivamente (tal como um trivalente, porexemplo, de dois vírus Influenza A e um vírus InfluenzaB).

Além do esqualeno e do polissorbato 80, a emulsãopode incluir um ou mais dentre: (a) Span 85; (b) umtocoferol; (c) um polioxietanol, tal como, Triton X-100(octilfenoxipolietoxietanol); (d) um tampão citrato; e/ou

(e) um tampão fosfato.

Métodos de tratamento e administração de vacinas

As composições da invenção são apropriadas paraadministração aos pacientes humanos e a invenção provê ummétodo para acionar a resposta imune em um paciente,compreendendo a etapa de administração de uma composição dainvenção ao paciente.

A invenção também provê um kit ou composição dainvenção para uso como um medicamento.

A invenção também provê o emprego de (i) umantigeno do vírus Influenza dividido, e (ii) uma emulsãode óleo e água que inclui agente tensoativo livre em suafase aquosa, na fabricação de um medicamento para acionar aresposta imune em um paciente.

A resposta imune acionada por esses métodos e usosincluirá, de modo geral, uma resposta de anticorpo,preferivelmente uma resposta do anticorpo de proteção. Osmétodos para avaliar as respostas do anticorpo, capacidadede neutralização e proteção após vacinação contra o vírusInfluenza são bem conhecidos na arte. Estudos em humanosmostraram que as titulações do anticorpo contrahemaglutinina do vírus Influenza humano estãocorrelacionadas à proteção (uma titulação de inibição dehemaglutinação da amostra de soro de cerca de 30-40 fornececerca de 50% de proteção contra infecção por um vírushomólogo) (181). As respostas do anticorpo são medidastipicamente por inibição da hemaglutinação, pormicroneutralização, por imunodifusão radial simples (SRID)e/ou por hemólise radial simples (SRH). Essas técnicas deensaio são bem conhecidas na arte.

As composições da invenção podem ser administradasde vários modos. A via de imunização mais preferida é porinjeção intramuscular (por exemplo, no braço ou perna),porém outras vias disponíveis incluem injeção subcutânea,intranasal (182-184), oral (185), intradérmica (186, 187),transcutânea, transdérmica (188) etc.

As vacinas preparadas de acordo com a invençãopodem ser usadas para tratar crianças e adultos. As vacinascontra Influenza são correntemente recomendadas para usona imunização pediátrica e de adultos, a partir da idade deseis meses. Assim, o paciente pode ter menos de 1 ano deidade, 1-5 anos de idade, 5-15 anos de idade, 15-55 anos deidade, ou pelo menos 55 anos de idade. Os pacientespreferidos para receberem as vacinas são os mais velhos(por exemplo, > 50 anos de idade, a 60 anos de idade epreferivelmente > 65 de idade) , e jovens (por exemplo, < 5anos de idade), pacientes hospitalizados, trabalhadores dasaúde, pessoal das força armadas, mulheres grávidas e ospacientes cronicamente doentes, imunodeficientes, quetomaram um composto antiviral (por exemplo, um compostooseltamivir ou zanamivir para Influenza; vide a seguir) nos7 dias antes de receber a vacina, pessoas com alergias aovos e pessoas que viajam ao exterior. As vacinas não sãounicamente apropriadas a esses grupos, contudo e podem serusadas de modo geral na população. Para cepas pandêmicas,será preferida a administração a todos os grupos de idade.

As composições preferidas da invenção satisfazem 1,2 ou 3 dos critérios CPMP para eficácia. Em adultos (18-60anos), esses critérios são: (1) a 70% de soroproteção; (2)> 4 0% de soroconversão; e/ou (3) um aumento de GMT > a 2,5vezes. Nas pessoas mais velhas (> 6Oanos), esses critériossão: (1) a 60% de soroproteção; (2) > 3 0% de soroconversão;e/ou (3) um aumento de GMT a a 2 vezes. Esses critérios têmcomo base um estudo de rótulo aberto com pelo menos 5 0pacientes.

O tratamento pode ser feito por uma programação dedose simples ou uma programação de múltiplas doses. Asdoses múltiplas podem ser usadas em uma programação deimunização primária e/ou em uma programação de imunizaçãode reforço. Em uma programação de doses múltiplas, asvárias doses podem ser fornecidas pelas mesmas ou por viasdiferentes, por exemplo, por um iniciador parenteral ereforço mucosal, um iniciador mucosal e reforço parenteral,etc.. A administração de mais de uma dose (tipicamenteduas doses) é especificamente útil nos pacientes nãodesafiados imunologicamente, por exemplo, para pessoasque nunca receberam uma vacina contra Influenzaanteriormente ou para vacinação contra o novo subtipo HA(como em um surto pandêmico). Doses múltiplastipicamente serão administradas pelo menos 1 semanaseparada (por exemplo, cerca de duas semanas, cerca de 3semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cercade 8 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 12 semanas,cerca de 16 semanas, etc.).

As vacinas produzidas pela invenção podem seradministradas aos pacientes substancialmente ao mesmotempo (por exemplo, durante a mesma consulta médica ouvisita a um profissional de saúde ou centro devacinação) que outras vacinas, por exemplo,substancialmente ao mesmo tempo de uma vacina contrasarampo, uma vacina contra caxumba, uma vacina contrarubéola, uma vacina contra MMR, uma vacina contravaricela, uma vacina contra MMRV, uma vacina contradifteria, uma vacina contra tétano, uma vacina paracoqueluche, uma vacina contra DTP, uma vacina conjugadacontra H.Influenzae do tipo b, uma vacina contrapoliovirus inativada, uma vacina contra Hepatite do tipoB, uma vacina de conjugado meningocõcico (tal como umavacina tetravalente A-C-W135-Y) , uma vacina contra vírussincicial respiratório, uma vacina de conjugadopneumocócico, etc. A administração substancialmente aomesmo tempo como uma vacina pneumocócica ou uma vacinameningocócica é especificamente útil em pacientes maisvelhos.

De modo semelhante, as vacinas da invenção podemser administradas aos pacientes substancialmente aomesmo tempo (por exemplo, durante a mesma consulta ouvisita a um profissional de saúde) como um compostoantiviral e especificamente um composto antiviral ativocontra o vírus Influenza. (por exemplo, oseltamivir e/ouzenamivir). Esses antivirais incluem inibidores deneuraminidase, tais como, um ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropóxi)-1-ciclohexeno-1-carboxílico ou um ácido 5-(acetilamino)-4-[(aminoiminometil)-amino]-2,6-anidro-3,4,5-trideóxi-D-glicero-D-galactonon-2-enônico, incluindo ésteres dosmesmos (por exemplo, os ésteres etílicos) e sais dosmesmos (por exemplo, os sais de fosfato). Um antiviralpreferido é o ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropóxi)-1-ciclohexeno-l-carboxílico, ésteretílico, fosfato (1:1), também conhecido como fosfatooseltamivir (TAMIFLUTM).

General

O termo "compreendendo" engloba "incluindo" bemcomo "consistindo", por exemplo, uma composição"compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X oupode incluir alguma coisa adicional, por exemplo X + Y.

A palavra "substancialmente" não exclui"completamente", por exemplo, uma composição que é"substancialmente isenta" de Y pode ser completamenteisenta de Y. Quando necessário, a palavra"substancialmente" pode ser omitida da definição dainvenção.

O termo "cerca de" em relação a um valor numérico xrepresenta, por exemplo x ± 10%.

A menos que especificamente declarado, um processocompreendendo uma etapa de mistura de dois ou maiscomponentes não requer qualquer ordem especifica demistura. Assim, os componentes podem ser misturados emqualquer ordem. Quando existem três componentes, então doiscomponentes podem ser combinados entre si, e então acombinação pode ser conjugada a um terceiro componente,etc.

Quando materiais de animais (e especificamentebovinos) forem usados na cultura das células, eles deverãoser obtidos de fontes que sejam isentas de encefalopatiasespongiformes transmissíveis (TSEs) e especificamenteisentas de encefalopatia espongiforme bovina (BSE). Emgeral, é preferido cultivar as células na ausência total demateriais derivados de animais.

Quando um composto for administrado a um corpo comoparte de uma composição, então aquele composto poderá seralternativamente substituído por um promedicamentoapropriado.

Quando um substrato de célula for usado paraprocedimentos de ressorção ou genética reversa, serápreferível um que tenha sido aprovado para uso em produçãode vacina humana, por exemplo, como no Ph Eur Generalcapítulo 5.2.3.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO

Análise do agente tensoativo livre em uma emulsão deesqualeno e água

Um adjuvante de emulsão de esqualeno-águamicrofluidicada compreendendo um agente tensoativo Tween 80foi preparado conforme revelado no capítulo 10 dareferência 67. A emulsão foi analisada para determinar onível de Tween 80 na fase aquosa. A fase oleosa doadjuvante foi removida e os ésteres na fase aquosa foramsaponifiçados e derivados fluorescentemente. Após separaçãocromatográfica, a detecção da fluorescência foi empregadapara quantificar a quantidade total de Tween 8 0 na faseaquosa.

Um método RP-HPLC foi também usado para quantificarTween 80 na fase aquosa separada.

Ambos os métodos fornecem resultados semelhantes,com 12 ± 1% do Tween 8 0 total na emulsão sendo formados nafase aquosa.

Emprego de adjuvante nas vacinas divididas com MF59

Duas vacinas contra Influenza trivalentes devírion dividido sem emprego de adjuvante disponíveiscomercialmente ("DIVISÃO (A)") e "DIVISÃO (B)") foramobtidas e usadas para imunizar camundongos. As vacinasforam diluídas para fornecer uma dose de 0,2 μg em cada HA.A diluição usou cada tampão sozinho, ou o tampão e aemulsão de esqualeno e água. Os grupos de 8 camundongosfêmeas Balb/C, com oito semanas de idade, foram imunizadosintramuscularmente com as vacinas com adjuvante e semadjuvante, com doses de 50 μL nos dias 0 e 28. Os sorosforam obtidos nos dias 14 e 42, e foram analisados quanto atitulação anti-HA (IgG), titulação HI e células T.

As titulações de anticorpo IgG de soro (ELISA)foram como se segue, determinando cada vírus separadamente:

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As titulações de anticorpo de soro HI no dia 42 foram como se segue:

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Assim, as emulsões de óleo e água podem melhorar asrespostas imunes obtidas por vacinas contra Influenzadividido. Incluindo-se o agente tensoativo livre na faseaquosa, a emulsão pode também continuar a exercer um"efeito de divisão" no vírus, pelo que, interrompendoqualquer vírions não divididos e/ou agregados de vírion quepodem de outra forma estar presentes.

Será entendido que a invenção foi descrita apenascomo exemplo e modificações podem ser feitas, contanto quepermaneçam dentro do escopo e espírito da invenção.

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Claims (34)

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fatode que compreende um antigeno de vírus Influenza divididoe uma emulsão de óleo e água, onde a emulsão inclui agentetensoativo livre em sua fase aquosa.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o antigeno do vírusInfluenza é um subtipo de vírus Influenza A H1, H2, H3,H5, H7 ou H9.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou areivindicação 2, caracterizada pelo fato de que acomposição cresceu na cultura celular e está livre deovalbumina, ovomucóide e DNA de galinha.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que o vírus cresceu em umacultura celular de uma linhagem de célula selecionada dogrupo consistindo em: MDCK; Vero; e PER.C6.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 3 oureivindicação 4, caracterizada pelo fato de que acomposição contém menos de 10 ng de DNA celular de umhospedeiro da cultura celular.

6. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 3, 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que acomposição contêm menos de 10 ng de DNA que possui 100nucleotídeos ou mais de comprimento.

7. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizada pelo fatode que a composição contém entre 0,1 e 20 μg dehemaglutinina por cepa viral.

8. Composição, de acordo com qualquer umas dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizada pelofato de que a emulsão inclui um esqualeno.

9. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizada pelofato de que a emulsão inclui um tocoferol.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que o tocoferol é Dl-a-tocopferol.

11. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10,caracterizada pelo fato de que a emulsão possui gotículascom um diâmetro de submícron.

12. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12,caracterizada pelo fato de que o antígeno do vírusInfluenza é preparado de um vírus Influenza possuindo umou mais segmentos de RNA de um vírus Influenza A/PR/8/34.

13. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12,caracterizada pelo fato de que o antígeno do vírusInfluenza é preparado de um vírus Influenza obtido portécnicas de reversão genética.

14. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13,caracterizada pelo fato de que a cultura celular é umacultura - de microveículo, uma cultura aderente ou umacultura de suspensão.

15. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14,caracterizada pelo fato de que a cultura celular é isentade soro.

16. Composição, de acordo com qualquer um dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13,-14 ou 15, caracterizada pelo fato de que a emulsãocompreende um lipideo A de 3-0-monofosforila desacetilada(3dMPL).

17. Composição, de acordo com a reivindicação 16,caracterizada pelo fato de que pelo menos 10% em peso de3dMPL é a forma de cadeia de hexaacila.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 16 oureivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o 3dMPLestá na forma de partículas com um diâmetro < 15Onm.

19. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que ésubstancialmente isenta de material de mercúrio.

20. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizada pelo fato de queinclui entre 1 e 20 mg/mL de cloreto de sódio.

21. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, caracterizada pelo fato deque possui uma osmolalidade entre 200 e 4 00 mOsm/kg.

22. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, caracterizada pelo fatode que inclui um ou mais tampões.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de que o tampão inclui: um tampãofosfato; um tampão Tris; um tampão borato; um tampãosuccinato; um tampão histidina; ou um tampão citrato.

24. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizadapelo fato de que possui um pH entre 5,0 e 8,1.

25. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, caracterizada pelo fato de que contém < 1 unidade de endotoxina por dose.

26. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25,caracterizada pelo fato de que é isenta de glúten.

27. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26,caracterizada pelo fato de que a composição inclui duascepas de Influenza A e uma cepa de Influenza B.

28. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 OU 26,caracterizada pelo fato de que a composição é uma vacinamonovalente contra a cepa do vírus Influenza pandêmica.

29. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende:(i) um primeiro componente de kit compreendendo um antígenode vírus Influenza dividido; e (ii) um segundo componentede kit compreendendo um adjuvante de emulsão de óleo e águaque inclui agente tensoativo livre em sua fase aquosa.

30. Kit, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que o primeiro componente e osegundo componente estão em recipientes separados.

31. Kit, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que o primeiro e segundocomponente estão em frascos.

32. Kit, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que um dos primeiro e segundocomponentes estão em uma seringa e onde o outro componenteestá em um frasco.

33. Kit, de acordo com a reivindicação 31 oureivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o frasco éfabricado de um material de vidro ou plástico.

34. Kit, de acordo com as reivindicações 31, 32 ou-33, caracterizado pelo fato de que o frasco é vedado comuma trava de látex.