EA011393B1 - Применение вируса гриппа и адъюванта на основе эмульсии "масло в воде" для индуцирования cd4 т-клеточного ответа и/или улучшенного ответа, основанного на в-клетках памяти - Google Patents

Применение вируса гриппа и адъюванта на основе эмульсии "масло в воде" для индуцирования cd4 т-клеточного ответа и/или улучшенного ответа, основанного на в-клетках памяти Download PDF

Info

Publication number
EA011393B1
EA011393B1 EA200701785A EA200701785A EA011393B1 EA 011393 B1 EA011393 B1 EA 011393B1 EA 200701785 A EA200701785 A EA 200701785A EA 200701785 A EA200701785 A EA 200701785A EA 011393 B1 EA011393 B1 EA 011393B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
influenza virus
oil
adjuvant
use according
virus
Prior art date
Application number
EA200701785A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200701785A1 (ru
Inventor
Эмманнуэль Жюль Ханон
Жанк Стефенн
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36441219&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA011393(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB0506000A external-priority patent/GB0506000D0/en
Priority claimed from GB0505989A external-priority patent/GB0505989D0/en
Priority claimed from GB0505998A external-priority patent/GB0505998D0/en
Priority claimed from GB0506004A external-priority patent/GB0506004D0/en
Priority claimed from GB0506001A external-priority patent/GB0506001D0/en
Priority claimed from GB0510591A external-priority patent/GB0510591D0/en
Priority claimed from GB0510589A external-priority patent/GB0510589D0/en
Priority claimed from GB0510598A external-priority patent/GB0510598D0/en
Priority claimed from GB0510593A external-priority patent/GB0510593D0/en
Priority claimed from GB0510596A external-priority patent/GB0510596D0/en
Priority claimed from GB0603789A external-priority patent/GB0603789D0/en
Priority claimed from GB0603788A external-priority patent/GB0603788D0/en
Priority claimed from GB0603790A external-priority patent/GB0603790D0/en
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA200701785A1 publication Critical patent/EA200701785A1/ru
Publication of EA011393B1 publication Critical patent/EA011393B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к противогриппозным вакцинным композициям и схемам вакцинации для иммунизации против гриппа. В частности, изобретение относится к вакцинным композициям, содержащим адъювант на основе эмульсии «масло в воде» и, возможно, 3-деацилированный монофосфориллипид A (3D-МФЛ), их применению в медицине, в частности их применению в усилении иммунных ответов на антигены вируса гриппа, и к способам приготовления, где эмульсия «масло в воде» содержит стерин, метаболизируемое масло и эмульгатор.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к противогриппозным вакцинным композициям и схемам вакцинации для иммунизации против гриппа. В частности, изобретение относится к вакцинным композициям, содержащим адъювант на основе эмульсии «масло в воде» и, возможно, 3-деацилированный монофосфориллипид А (3Б-МФЛ), их применению в медицине, в частности их применению в усилении иммунных ответов на антигены вируса гриппа, и к способам приготовления, где эмульсия «масло в воде» содержит стерин, метаболизируемое масло и эмульгатор.
Предшествующий уровень техники
Вирусы гриппа являются одними из наиболее повсеместно распространенных вирусов, представленных в мире, поражающих людей и домашний скот. Грипп приводит в результате к экономическому бремени, заболеваемости и даже смертности, которые являются важными.
Вирус гриппа представляет собой РНК-содержащий оболочечный вирус, имеющий размер частиц приблизительно 125 нм в диаметре. Он состоит в основном из внутреннего нуклеокапсида или коры рибонуклеиновой кислоты (РНК), ассоциированного с нуклеопротеином, окруженного вирусной оболочкой, имеющей структуру липидного бислоя и внешних гликопротеинов. Внутренний слой вирусной оболочки состоит преимущественно из белков матрикса, а внешний слой - в основном из липидного материала организма хозяина. Вирус гриппа содержит два поверхностных антигена: гликопротеины нейраминидазу (ΝΑ) и гемагглютинин (НА), которые выглядят в виде зубцов длиной 10-12 нм на поверхности частиц. Именно эти поверхностные белки, в особенности гемагглютинин, определяют антигенную специфичность подтипов вируса гриппа.
Эти поверхностные антигены постепенно, иногда быстро претерпевают некоторые изменения, приводящие к антигенным вариациям вируса гриппа. Эти антигенные изменения, названные «дрейфы» и «смещения» являются непредсказуемыми и могут оказывать значительное воздействие с иммунологической точки зрения, поскольку они в конечном счете ведут к возникновению новых штаммов вируса гриппа и к тому, что обеспечивают вирусу возможность избегать воздействия иммунной системы, вызывая хорошо известные, почти ежегодные эпидемии.
Штаммы вируса гриппа, подлежащие включению в противогриппозную вакцину, каждый сезон определяет Всемирная организация здравоохранения в сотрудничестве с руководящими органами национального здравоохранения и производителями вакцин.
НА представляет собой наиболее важный антиген при определении серологической специфичности различных штаммов вируса гриппа. Этот белок массой 75-80 кДа содержит множество антигенных детерминант, некоторые из которых находятся в областях, которые претерпевают изменения последовательности в различных штаммах (штамм-специфические детерминанты), а другие находятся в областях, которые обычны для множества молекул НА (общие для детерминант).
Вирусы гриппа вызывают эпидемии почти каждую зиму, причем уровни инфекции для вируса типа А или В составляют 40% в течение шестинедельного периода. Инфекция вирусом гриппа приводит в результате к различным болезненным состояниям из субклинической инфекции от слабой инфекции верхних дыхательных путей до тяжелой вирусной пневмонии. Типичные эпидемии, вызванные вирусом гриппа, вызывают увеличение частоты пневмонии и респираторного заболевания нижних дыхательных путей, о чем свидетельствуют увеличенные уровни госпитализации или смертности. Тяжесть заболевания прежде всего определяется возрастом хозяина, его иммунным статусом и сайтом инфекции.
Пожилые люди в возрасте 65 лет и старше особенно восприимчивы, составляя 80-90% всех смертей, связанных с вирусом гриппа в развитых странах. Индивиды, страдающие от скрытых хронических заболеваний, также наиболее вероятно подвержены таким осложнениям. Маленькие дети также могут страдать от тяжелого заболевания. Таким образом, эти группы в особенности должны быть защищены. Помимо этих групп «в состоянии риска» руководствам системы здравоохранения также рекомендуется вакцинировать здоровых взрослых людей, находящихся в контакте с пожилыми людьми.
Вакцинация играет критическую роль при контроле ежегодных эпидемий вируса гриппа. Имеющиеся в настоящее время противогриппозные вакцины представляют собой или инактивированную, или живую ослабленную противогриппозную вакцину. Инактивированные противогриппозные вакцины состоят из трех возможных форм антигенного препарата: инактивированный целый вирус, субвирионы, в которых очищенные вирусные частицы разрушены детергентами или другими реагентами для растворения липидной оболочки (так называемая убиквиторная вакцина), или очищенные НА и ΝΑ (субъединичная вакцина). Эти инактивированные вакцины вводят внутримышечно (в.м.) или интраназально (и.н.).
Противогриппозные вакцины всех типов обычно представляют собой тривалентные вакцины. Они, как правило, содержат антигены, полученные из двух штаммов вируса гриппа А и одного штамма вируса гриппа В. Стандартная инъецируемая доза 0,5 мл в большинстве случаев содержит 15 мкг антигенного компонента гемагглютинина из каждого штамма, измеренная путем одномерной радиальной иммунодиффузии (8ΒΌ) (1.М. \Уооб е! а1.: Ап ипргоуеб кшд1е габ1а1 1ттииоб1ГГикюи 1сс11пк|ис Гог 1Пс аккау οί ίηПиепха йаетадд1ийши аШщеп: абар!а1юи Гог ро!еису бе1егтта1юп оГ тас11уа1еб \\1ю1е уиик аиб кнЬщпй уасстек. 1. Вю1. 81аиб. 5, (1977), 237-247; 1.М. \Уооб е! а1., 1и1егиа1юиа1 сойаЬогабуе к!ибу оГ кшд1е габ1а1
- 1 011393 άίΓΓηδίοη апй 1ттшюе1ес1гор1югек1к 1ес1шк|иек Γογ (Не аккау οί НаетадДиОшп апйдеп οί шПиеп/а νίπικ. 1. Βίο1. 81апй. 9, (1981), 317-330).
Имеющиеся в настоящее время противогриппозные вакцины рассматривают как безопасные для всех возрастных групп (Эе ΡοικιΙο е1 а1., 1999, Уассше, 17, 3094-3101). Тем не менее, имеется небольшое свидетельство того, что имеющиеся в настоящее время противогриппозные вакцины действуют у маленьких детей в возрасте до двух лет. Кроме того, уровни эффективности вакцин, о которых сообщают, для предотвращения типичной подтвержденной заболеваемости вирусом гриппа составляют 23-72% для пожилых людей, что значительно ниже чем уровни эффективности 60-90%, о которых сообщалось для более молодых взрослых людей (6ο·νκΓΐ 1994, 1. Ат. Мей. Ак^с, 21, 166-1665; Сгокк, 1995, Апп 1п1егп. Мей. 123, 523-527). Показано, что эффективность противогриппозной вакцины коррелирует с сывороточными титрами антител, ингибирующими гемагглютинацию (ΗΙ), к вирусному штамму и в нескольких исследованиях обнаружили, что более пожилые взрослые люди демонстрируют меньшие титры ΗΙ после иммунизации вирусом гриппа по сравнению с более молодыми взрослыми людьми (Μιιπικίο. 2002, Ехрег1теп1а1 ^τοώοίο^, 37, 427-439).
Таким образом, сохраняется необходимость в новых вакцинах, обладающих улучшенной иммуногенностью. Приготовление вакцинного антигена с сильными адъювантами представляет собой возможный подход для усиления иммунных ответов на антигены субвириона.
Субъединичная противогриппозная вакцина с адъювантом МЕ59 в виде эмульсии «масло в воде» имеется в продаже, и продемонстрирована ее способность индуцировать более высокий титр антител по сравнению с полученными при использовании субъединичной вакцины без адъюванта (Ре Ροϊ'ΐηΙο е! а1., 1999, Уассше, 17, 3094-3101). Тем не менее, в более поздней публикации та же самая вакцина не продемонстрировала свой улучшенный профиль по сравнению с субъединичной вакциной без адъюванта (Ршд-ВагЬега е! а1., 2004, Уассше 23, 283-289).
Все еще сохраняется необходимость в улучшенных противогриппозных вакцинах, в особенности в популяции пожилых людей.
Изложение сущности изобретения
В первом аспекте настоящего изобретение предложено применение:
(а) вируса гриппа или его антигенного препарата и (б) адъюванта на основе эмульсии «масло в воде» в приготовлении иммуногенной композиции для индуцирования по меньшей мере 1) улучшенного СР4 Т-клеточного иммунного ответа, 2) улучшенного ответа на основе В-клеток памяти против указанного вируса или антигенной композиции у человека, где указанная эмульсия «масло в воде» содержит метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор.
Подходяще, указанный стерин представляет собой альфа-токоферол. В конкретном воплощении указанный адъювант на основе эмульсии «масло в воде» содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет капли масла, из которых по меньшей мере 70% по интенсивности имеет диаметр меньше 1 мкм.
В конкретном воплощении иммуногенная композиция способна индуцировать как улучшенный СР4 Т-клеточный иммунный ответ, так и улучшенный ответ на основе В-клеток памяти по сравнению с полученным с антигеном без адъюванта или антигенной композицией без адъюванта.
Во втором аспекте настоящего изобретения предложено применение:
(а) вируса гриппа или его антигенного препарата и (б) адъюванта на основе эмульсии «масло в воде» в приготовлении иммуногенной композиции для вакцинации человеческого индивида с ослабленным иммунитетом или популяции с ослабленным иммунитетом, такой как взрослый с высоким риском или пожилой человек, против вируса гриппа, где указанная эмульсия «масло в воде» содержит метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор.
В предпочтительном воплощении указанный адъювант на основе эмульсии «масло в воде» содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, из которых по меньшей мере 70% по интенсивности имеют диаметры меньше 1 мкм.
В третьем аспекте настоящего изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата в приготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных вирусом гриппа или его антигенным препаратом, приготовленным с адъювантом на основе эмульсии «масло в воде», содержащей метаболизируемое масло, стерин, подходящим образом альфатокоферол и эмульгатор. Предпочтительно ревакцинацию осуществляют у субъектов, которые были вакцинированы в предшествующий сезон против вируса гриппа. Типично ревакцинацию осуществляют по меньшей мере через 6 месяцев после первой вакцинации, предпочтительно через 8-14 месяцев, более предпочтительно приблизительно через 10-12 месяцев.
Предпочтительно, предложено применение:
(а) вируса гриппа или его антигенного препарата и (б) адъюванта на основе эмульсии «масло в воде», содержащего метаболизируемое масло, стерин (такой как альфа-токоферол) и эмульгатор в приготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных вирусом гриппа или его антигенным препаратом и адъювантом на основе эмульсии «масло в воде», где указанный адъювант на основе эмульсии «масло в воде» содержит
- 2 011393 по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, из которых по меньшей мере 70% по интенсивности имеют диаметры меньше 1 мкм.
В еще одном предпочтительном воплощении иммуногенная композиция для ревакцинации содержит убиквиторный вирус гриппа или его убиквиторный вирусный антигенный препарат, несущий общие 0Ό4 Т-клеточные эпитопы или общие В-клеточные эпитопы, или оба с вирусом гриппа или его антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации.
В четвертом аспекте настоящего изобретения предложено применение:
(а) вируса гриппа или его антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа и (б) адъюванта на основе эмульсии «масло в воде», содержащей метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор в приготовлении иммуногенной композиции для защиты против инфекций гриппа, вызванных штаммом вируса гриппа, представляющим собой вариант указанного первого штамма вируса гриппа. В предпочтительном воплощении указанный адъювант на основе эмульсии «масло в воде» содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, из которых по меньше мере 70% по интенсивности имеют диаметры меньше 1 мкм.
В еще одном аспекте предложен способ вакцинации человеческого индивида с ослабленным иммунитетом или популяции с ослабленным иммунитетом, такого как взрослые люди с высоким риском или пожилые люди, иммуногенной композицией, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант на основе эмульсии «масло в воде», как определено выше.
В еще одном воплощении изобретения предложен способ ревакцинации людей, ранее вакцинированных вирусом гриппа или его вирусным антигенным препаратом и адъювантом на основе эмульсии «масло в воде», содержащим метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор, где указанный способ включает введение указанному человеку иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа с адъювантом или без адъюванта. Подходящим образом указанный стерин представляет собой альфа-токоферол.
В еще одном воплощении предложен способ вакцинации человеческой популяции или индивида против одного штамма вируса гриппа с последующей ревакцинацией указанного человека или популяции против варианта штамма вируса гриппа, включающий введение указанному человеку:
(1) первой композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат из первого штамма вируса гриппа и адъюванта на основе эмульсии «масло в воде», содержащей метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор, и (2) второй иммуногенной композиции, содержащей вариант штамма вируса гриппа указанного первого штамма вируса гриппа.
Подходящим образом указанный стерин представляет собой альфа-токоферол.
В еще одном воплощении в изобретении предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата и адъюванта на основе эмульсии «масло в воде», содержащей метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор. Подходящим образом, указанный стерин представляет собой альфа-токоферол.
В еще одном аспекте изобретения предложен способ разработки противогриппозной вакцины, включающий:
1) выбор антигена вируса гриппа, содержащего 0Ό4+ эпитопы, и
2) объединение указанного антигена вируса гриппа с эмульсией «масло в воде», как определено выше, где указанная вакцина после введения млекопитающему способна индуцировать усиленный 0Ό4 ответ у указанного млекопитающего.
Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения дополнительно описаны в следующем подробном описании его предпочтительных воплощений.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Распределение размера масляных капель в 8В62 эмульсии «масло в воде», измеренное путем фотон-корреляционной спектроскопии (ФКС).
Фиг. 1А демонстрирует измерения размера 8В62 партия 1023 с использованием Ма1уетп ΖοΙαδίζοΓ 3000Н8: А = разведение 1/10000 (регистрация 22-24) (анализ в Сопйп и адаптированной оптической модели 1,5/0,01); Б = разведение 1/20000 (регистрация 28-30) (анализ в Сопйп и адаптированной оптической модели 1,5/0,01).
Фиг. 1Б демонстрирует схематическую иллюстрацию регистрации 22 (верхняя часть) и регистрации 23 (нижняя часть) по интенсивности.
Фиг. 2. Схематическая иллюстрация препарата партии МФЛ.
Фиг. 3. Схематическая иллюстрация препарата адъюванта А803+МФЛ.
Фиг. 4. Клиническое испытание Ехр1о Н1и-001. 0Ό4 Т-клеточный ответ на убиквиторный антиген вируса гриппа (01 = первая квартиль, 03 = третья квартиль).
Фиг. 5. Клиническое испытание Ехр1о Ни-001. СО 8Т-клеточный ответ на убиквиторный антиген вируса гриппа (01 = первая квартиль, 03 = третья квартиль).
Фиг. 6. Клиническое испытание Ехр1о Ни-001. Перекрестно-реактивный 0Ό4 Т-клеточный ответ на убиквиторный антиген вируса гриппа после вакцинации Ниапх + А803.
Фиг. 7. Клиническое испытание Ехр1о Н1и-001. Ответ на основе В-клеточной памяти после вакцинации.
- 3 011393
Фиг. 8. Клиническое испытание Εχρίο Ии-002. СЭ4 Т-клеточный ответ против убиквиторного антигена вируса гриппа после ревакцинации.
Фиг. 9. Клиническое испытание Εχρίο Ии-002. Титры антител против ΗΙ после ревакцинации.
Фиг. 10. Исследование на хорьках I. Контроль температуры (примирование и контрольное заражение).
Фиг. 10А представляет собой примирование.
Фиг. 10Б представляет собой контрольное заражение.
Фиг. 11. Исследование на хорьках I. Выделение вируса.
Фиг. 12. Исследование на хорьках II. Контроль температуры (примирование и контрольное заражение).
Фиг. 12А представляет собой примирование.
Фиг. 12Б представляет собой контрольное заражение.
Фиг. 13. Исследование на хорьках II. Выделение вируса.
Фиг. 14. Исследование на хорьках II.
Фиг. 14А Титры Ш к Η3Ν2 А/Рапата (вакцинный штамм).
Фиг. 14 Б Титры Ш к Η3Ν2 А/Ауотшд (штамм для контрольного заражения).
Фиг. 15. Исследование на мышах. Частоты СИ4 Т-клеток в С57ВЕ6 примированных мышах с использованием полного инактивированного вируса в качестве рестимулирующего антигена (7 день после иммунизации).
Фиг. 16. Исследование на мышах. Частоты СИ8 Т-клеток в С57ВЕ6 примированных мышах с использованием полного инактивированного вируса в качестве рестимулирующего антигена (7 день после иммунизации).
Фиг. 17. Исследование на мышах. Частоты СИ4 (верхняя часть) и СИ8 (нижняя часть) Т-клеток у мышей С57ВЕ6, примированных гетерологическими штаммами с использованием полного инактивированного вируса в качестве рестимулирующего антигена (7 день после иммунизации).
Фиг. 18. Клиническое испытание на людях. Ответ на основе В-клеточной памяти после вакцинации пожилых людей с использованием Ииапх, Ииапх+А803, Ииапх+А803+МФЛ (различие между до и после).
Фиг. 19. Исследование на хорьках III. Контроль температуры до и после контрольного заражения.
Фиг. 20. Исследование на хорьках III. Выделение вируса до и после контрольного заражения.
Фиг. 21. Исследование на хорьках III. Титры Ш на Η3Ν2 А/Аоттд (вакцинный штамм).
Фиг. 22. Исследование на хорьках III. Титры Ш на Η3Ν2 А/Рапата (штамм для контрольного заражения).
Фиг. 23. Клиническое испытание на людях. Титры Ш (геометрические средние титры (ГСТ)) на 21, 90 и 180 день после вакцинации (персистенция).
Фиг. 24. Клиническое испытание на людях. СИ4 ответ - все тесты в двух параллелях. Совокупные антигены на 21, 90 и 180 день после вакцинации (персистенция).
Фиг. 25. Клиническое испытание на людях. Титры Ш в клиническом испытании с ревакцинацией А803+МФЛ по сравнению с Ииапх.
Фиг. 26. Клиническое испытание на людях. КОИ для СИ4 ответа - все тесты в двух параллелях Совокупные антигены на 0 и 21 день.
Фиг. 27. Клиническое испытание на людях с использованием А803+МФЛ в двух концентрациях. Титры Ш на 0 и 21 день.
Фиг. 28. Клиническое испытание на людях с использованием А803+МФЛ в двух концентрациях. Реактогенность.
Подробное описание изобретения
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что противогрипозная композиция, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат вместе с адъювантом на основе эмульсии «масло в воде», содержащей метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол, и эмульгатор, способна улучшать СИ4 Т-клеточный иммунный ответ и/или ответ на основе В-клеточной памяти против указанного антигена или антигенной композиции у человека по сравнению с полученным при применении вируса или его антигенного препарата без адъюванта. Заявленные композиции благоприятно используют для индукции СИ4 Т-клеточного ответа против вируса гриппа, который способен обнаруживать эпитопы вируса гриппа, представленные молекулами главного комплекса гистосовместимости (МИС) II класса. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что эффективно нацеливать клеточно-опосредованную иммунную систему для усиления ответа против гомологичных и дрейфующих штаммов вируса гриппа (после вакцинации и инфицирования).
Адъювантные противогриппозные композиции по изобретению обладают несколькими преимуществами:
1) улучшенная иммуногенность: дает возможность для восстановления слабого иммунного ответа у пожилых людей (в возрасте более 50 лет, типично в возрасте старше 65 лет) до уровней, которые обнаружены у молодых людей (ответы в виде антител и/или Т-клеточные ответы);
- 4 011393
2) улучшенный профиль перекрестной защиты: улучшенная перекрестная защита против вариантов (дрейфующих) штаммов вируса гриппа;
3) возможность для использования уменьшенной дозы антигена для достижения похожего ответа, таким образом обеспечивая улучшенную способность в случае чрезвычайных ситуаций (например, пандемии).
В частности, композиции по настоящему изобретению способны обеспечивать более хорошую сывороточную защиту против вируса гриппа после ревакцинации, оцениваемую тем, что количество людей, столкнувшихся с вирусом гриппа, коррелирует с защитой. Кроме того, композиция для применения в настоящем изобретении также способна вызвать тенденцию более сильного ответа на основе В-клеточной памяти после первой вакцинации человека и более сильного гуморального ответа после ревакцинации по сравнению с неадъювантной композицией.
Авторы настоящего изобретения также способны продемонстрировать, что заявленная адъювантная композиция способна не только вызвать, но также поддерживать защитные уровни антител против всех трех штаммов, представленных в вакцине, у большей части индивидов по сравнению с полученными при использовании неадъювантной композиции (например, см. табл. 43).
Таким образом, в еще одном воплощении заявленная композиция способна обеспечивать персистентный иммунный ответ против заболевания, связанного с вирусом гриппа. В частности, под персистентностью понимают иммунный ответ в виде антител ΗΙ, который способен удовлетворять критериям по меньшей мере после 3 месяцев, предпочтительно по меньшей мере после 6 месяцев после вакцинации. В частности, заявленная композиция способна вызвать защитные уровни антител у более чем 70% индивидов, подходящим образом более чем у 80% индивидов или подходящим образом более чем у 90% индивидов, по меньшей мере, в отношении одного штамма вируса гриппа, предпочтительно для всех штаммов, представленных в вакцине, по меньшей мере после 3 месяцев. В специфическом аспекте защитные уровни антител больше 90% получают по меньшей мере через 6 месяцев после вакцинации против по меньшей мере одного, подходящим образом двух или всех штаммов, представленных в вакцинной композиции.
Штаммы и антигены вируса гриппа.
Вирус гриппа или его антигенный препарат для применения по настоящему изобретению может представлять собой убиквиторный вирус гриппа или его убиквиторный вирусный антигенный препарат. В альтернативном воплощении препарат вируса гриппа может содержать другой тип инактивированного антигена вируса гриппа, такой как инактивированный полный вирус, или очищенная НА и ΝΑ (субъединичная вакцина), или виросома вируса гриппа. В еще одном воплощении вирус гриппа может представлять собой живой ослабленный препарат вируса гриппа.
Убиквиторный вирус гриппа или его убиквиторный вирусный антигенный препарат для применения по настоящему изобретению подходящим образом представляет собой инактивированный вирусный препарат, где вирусные частицы разрушены детергентами или другими реагентами для растворения липидной оболочки. Убиквиторный вирус или его убиквиторный антигенный вирусный препарат подходящим образом готовят путем фрагментации полного вируса гриппа, инфекционного или инактивированного, растворяющими концентрациями органических растворителей или детергентов и последующего удаления всех или большей части растворяющего агента и некоторой части или большей части вирусного липидного материала. Под убиквиторным вирусным антигенным препаратом понимают убиквиторный вирусный препарат, который мог претерпеть некоторую степень очистки по сравнению с убиквиторным вирусом, в то же время сохраняя большую часть антигенных свойств убиквиторных вирусных компонентов. Например, когда вирус получают в яйцах, убиквиторный вирус может быть отделен от белков-примесей из яйца, или когда получают в клеточной культуре, убиквиторный вирус может быть отделен от примесей клеток хозяев. Убиквиторный вирусный антигенный препарат может содержать убиквиторные вирусные антигенные компоненты более чем одного вирусного штамма. Вакцины, содержащие убиквиторный вирус (названные «убиквиторная противогриппозная вакцина») или убиквиторные вирусные антигенные препараты, как правило, содержат остаточный белок матрикса и нуклеопротеин и иногда липид, а также мембранные оболочечные белки. Такие убиквиторные вирусные вакцины обычно содержат большую часть или все вирусные структурные белки, хотя не обязательно в тех же самых пропорциях, как в полном вирусе.
Альтернативно, вирус гриппа может находиться в форме вакцины на основе полного вируса. Это может свидетельствовать о преимуществе по сравнению с убиквиторной вирусной вакциной в случае пандемии, поскольку позволяет избежать неопределенности в том, может ли убиквиторная вирусная вакцина успешно получена для нового штамма вируса гриппа. Для некоторых штаммов обычные детергенты, использованные для продукции убиквиторного вируса, могут разрушать вирус и делать его неприменимым. Хотя всегда имеется возможность применения различных детергентов и/или разработки различного способа продукции убиквиторной вакцины, это может занять время, которое может отсутствовать в ситуации пандемии. Дополнительно к большей степени определенности при использовании подхода полного вируса также имеется большая степень продукции вакцины по сравнению с убиквиторным вирусом, поскольку значительные количества антигена теряются во время дополнительных стадий очистки,
- 5 011393 необходимых для приготовления подходящей убиквиторной вакцины.
В еще одном воплощении получают вирус гриппа в форме очищенной субъединичной противогриппозной вакцины. Субъединичные противогриппозные вакцины, как правило, содержат два основных оболочечных белка НА и ΝΑ и могут обладать дополнительным преимуществом по сравнению с вакцинами на основе полного вириона, так как они, как правило, менее реактогенны, в частности, у молодых вакцинированных пациентов. Субъединичные вакцины могут быть получены рекомбинантно или очищены из разрушенных вирусных частиц.
В еще одном воплощении препарат вируса гриппа находится в форме виросомы. Виросомы представляют собой сферические одноламеллярные везикулы, которые сохраняют функциональные вирусные оболочечные гликопротеины НА и ΝΑ в оригинальной конформации, встроенной в фосфолипидную бислойную мембрану виросом.
Указанный вирус гриппа или его антигенный препарат может быть получен из яиц или из тканевой культуры.
Например, антиген вируса гриппа или его антигенные препараты по изобретению могут быть получены в результате применения обычного способа с развивающимся эмбрионом путем выращивания вируса гриппа в яйцах и очистки собранной аллантоисной жидкости. Яйца могут быть собраны в большом количестве в сокращенный срок. Альтернативно, они могут быть получены из любых новых способов генерации с использованием тканевой культуры для выращивания вируса или экспрессии рекомбинантных поверхностных антигенов вируса гриппа. Подходящие клеточные субстраты для роста вируса включают, например, клетки почки собаки, такие как клетки почки Мадина Дарби (МОСК) или клетки клона МОСК, МОСК-подобных клеток, клетки почки обезьяны, такие как клетки АСМК, включающие клетки Уего, подходящие линии свиных клеток, или любой клеточный тип другого млекопитающего, подходящего для продукции вируса гриппа для задач вакцин. Подходящие клеточные субстраты также включают человеческие клетки, например клетки МКС-5. Подходящие клеточные субстраты не ограничиваются клеточными линиями; например, также включены первичные клетки, такие как фибробласты эмбриона цыпленка и клеточные линии птиц.
Антиген вируса гриппа или его антигенный препарат может быть получен при помощи любого из множества коммерчески применимых способов, например способа δρίίΐ Ди, описанного в патенте № ОО 300833 и ϋϋ 211444, включенном здесь путем ссылки. Традиционно, зр1й Ди получали с использованием обработки сольвентом/детергентом, таким как три-н-бутилфосфат или диэтиловый эфир в комбинации с Тетееп™ (известной как расщепление Тетееп-простой эфир), и этот способ до настоящего времени используют в некоторых средствах производства. Другие используемые в настоящее время расщепляющие агенты включают детергенты или протеолитические ферменты либо соли желчных кислот, например дезоксихолат натрия, как описано в патенте № ОО 155875, включенном здесь путем ссылки. Детергенты, которые могут быть использованы в качестве расщепляющих агентов, включают катионные детергенты, например цетилтриметиламмония бромид (СТАВ), другие ионные детергенты, например лаурилсульфат, тауродезоксихолат, или неионные детергенты, такие как описанные выше, включающие Тгйоп Х-100 (например, в способе, описанном в Ипа е! а1., 2000, Вю1одюа15 28, 95-103) и Тгйоп Ν-101 или комбинации любых двух или более чем двух детергентов.
Способ приготовления убиквитоной вакцины может включать множество различных стадий фильтрации и/или других стадий разделения, таких как стадии ультрацентрифугирования, ультрафильтрации, зонального центрифугирования и хроматографии (например, ионообменной) в различных комбинациях, и, возможно, стадию инактивации, например теплом, формальдегидом или парапропиолактоном или ультрафиолетовым излучением (УФ), которая может быть осуществлена перед или после расщепления. Способ расщепления может быть осуществлен в виде партии, непрерывного или полунепрерывного способа. Предпочтительный способ расщепления и очистки убиквиторной иммуногенной композиции описан в АО 02/097072.
Предпочтительные антигенные препараты вакцины зр1й Ди по изобретению содержат остаточное количество Тетееп 80 и/или Тгйоп Х-100, оставшееся после способа получения, хотя они могут быть добавлены или их концентрации скорректированы после приготовления убиквиторного антигена. Предпочтительно представлены Тетееп 80 и Тгйоп Х-100. Предпочтительные диапазоны конечных концентраций этих неионных поверхностно-активных веществ в дозе вакцины составляют:
Т\гееп 80: от 0,01 до 1%, предпочтительнее приблизительно 0,1% (об./об.);
Тгйоп Х-100: от 0,001 до 0,1% (мас./об.), предпочтительнее от 0,005 до 0,02% (мас./об.).
В специфическом воплощении конечная концентрация Тетееп 80 составляет от 0,045-0,09% (мас./об.). В еще одном специфическом воплощении антиген предложен в 2-кратной концентрированной смеси, которая имеет концентрацию Тетееп 80 в диапазоне 0,045-0,2% (мас./об.) и должна быть разведена в два раза после конечного приготовления адъювантом (или буфером в контрольном препарате).
В еще одном специфическом воплощении конечная концентрация Тгйоп Х-100 составляет 0,0050,017% (мас./об.). В еще одном специфическом воплощении антиген предложен в виде 2-кратной концентрированной смеси, которая имеет концентрацию Тгйоп Х-100 в диапазоне 0,005-0,034% (мас./об.) и должна быть разведена вдвое до конечной концентрации адъювантом (или буфером в контрольном пре
- 6 011393 парате).
Предпочтительно противогриппозный препарат готовят в присутствии низкого уровня тиомерсала или предпочтительно в отсутствии тиомерсала. Предпочтительно получающийся в результате противогриппозный препарат стабилен в отсутствии ртутьорганических консервантов, в частности препарат не содержит остаточного тиомерсала. В частности, противогриппозный препарат содержит гемагглютининовый антиген, стабилизированный в отсутствие тиомерсала или при низких уровнях тиомерсала (как правило, 5 мкг/мл или меньше). Специфически стабилизацию В штамма вируса гриппа осуществляют при помощи производного альфа-токоферола, такого как альфа-токоферола сукцинат (также известный как витамина Е сукцинат т.е. УЕ8). Такие препараты и способы их приготовления раскрыты в №0 02/097072.
Предпочтительная композиция содержит три инактивированных антигена расщепленного вириона, полученные из штаммов, рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения, подходящего сезонного вируса гриппа.
Предпочтительно вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант на основе эмульсии «масло в воде» содержатся в одном и том же контейнере. Это называют «однофлаконным подходом». Предпочтительно флакон представляет собой предварительно заполненный шприц. В альтернативном воплощении вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант на основе эмульсии «масло в воде» содержатся в отдельных контейнерах или флаконах и смешиваются непосредственно перед или после введения субъекту. Он назван как «двухфлаконный подход». В качестве примера, когда вакцина представляет собой двухкомпонентные вакцины для общего объема дозы 0,7 мл, концентрированные антигены (например, концентрированные тривалентные инактивированные антигены расщепленного вириона) представлены в одном флаконе (335 мкл) (контейнер с антигеном), и предварительно заполненный шприц содержит адъювант (360 мкл) (контейнер с адъювантом). В момент инъекции содержимое флакона, содержащего концентрированные антигены инактивированного расщепленного вириона, удаляют из флакона путем использования шприца, содержащего адъювант, с последующим мягким перемешиванием содержимого шприца. Перед инъекцией использованную иглу заменяют внутримышечной иглой и объем корректируют до 530 мкл. Одна из доз разведенной адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 530 мкл.
Адъювант на основе эмульсии «масло в воде».
Адъювантная композиция по изобретению содержит адъювант на основе эмульсии «масло в воде», предпочтительно указанная эмульсия содержит метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, по меньшей мере 70% которых по интенсивности имеют диаметр меньше чем 1 мкм.
Для того чтобы любая композиция «масло в воде» подходила для введения людям, масляная фаза системы эмульсии должна содержать метаболизируемое масло. Значение термина метаболизируемое масло хорошо известно в области техники. Метаболизируемое может быть определено как «способное к превращению путем метаболизма» (Эог1апб'5 Ши81га1еб Меб1са1 Э|с1юпагу. №.В. Бапбегк Сотрапу, 25‘ь ебйюп, (1974)). Масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животное масло или синтетическое масло, которое является нетоксичным для реципиента и способно к превращению путем метаболизма. Орехи, семена и зерна представляют собой обычные источники растительных масел. Синтетические масла также являются частью этого изобретению и могут включать имеющиеся в природе масла, такие как ΝΕΟΒΕΕ® и др. Особенно подходящее метаболизируемое масло представляет собой сквален.
Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен) представляет собой ненасыщенное масло, которое обнаружено в больших количествах в масле печени акулы и в меньших количествах - в оливковом масле, масле проростков пшеницы, рисовом масле и дрожжах, и представляет собой особенно предпочтительное масло для применения в этом изобретении. Сквален представляет собой метаболизируемое масло за счет того, что он представляет собой промежуточное соединение в биосинтезе холестерина (Мегск шбех, 104Ь Ебйюп, еп1гу по. 8619).
Эмульсии масло в воде сами по себе хорошо известны в области техники и были предложены в качестве полезных как адъювантные композиции (ЕР 399843; №0 95/17210).
Подходящим образом метаболизируемое масло представлено в количестве от 0,5 до 20% (конечная концентрация) от общего объема иммуногенной композиции, предпочтительно в количестве от 1,0 до 10% от общего объема, предпочтительно в количестве от 2,0 до 6,0% от общего объема.
В специфическом воплощении метаболизируемое масло представлено в конечном количестве приблизительно 0,5, 1,0, 3,5% или 5,0% от общего объема иммуногенной композиции. В еще одном специфическом воплощении метаболизируемое масло представлено в конечном количестве 0,5, 1,0, 3,57 или 5,0% от общего объема иммуногенной композиции.
Предпочтительно системы на основе эмульсии «масло в воде» по настоящему изобретению имеют небольшой размер капель масла в субмикронном диапазоне. Подходящим образом размеры капель находятся в диапазоне от 120 до 750 нм, предпочтительнее размеры в диаметре составляют от 120 до 600 нм. Наиболее предпочтительно эмульсия «масло в воде» содержит капли масла, по меньшей мере 70% из
- 7 011393 которых по интенсивности меньше чем 500 нм в диаметре, предпочтительнее по меньшей мере 80% по интенсивности меньше чем 300 нм в диаметре, предпочтительнее по меньшей мере 90% по интенсивности находятся в диапазоне от 120 до 200 нм в диаметре.
Размер капель масла, т.е. диаметр, по настоящему изобретению приведен по интенсивности. Имеется несколько путей определения диаметра капли масла по интенсивности. Интенсивность измеряют путем применения аппарата для измерения размера, подходящим образом путем динамического светорассеяния, такого как Макет ΖοΙαδίζοΓ 4000 Н8 или предпочтительно Макет ΖοΙαδίζοΓ 3000Н8. Подробная процедура приведена в примере ΙΙ.2. Первая возможность заключается в определении среднего диаметра ζ (СД/) путем динамического светорассеяния (ФКС-фотонно-корреляционная спектроскопия); этот способ дополнительно позволяет получить индекс полидисперсности (ИПД) и как СДζ, так и ИАД рассчитывают с использованием кумулятивного алгоритма. Эти значения не требуют знания показателя преломления частицы. Второй способ заключается в расчете диаметра капли масла путем определения распределения полного размера частиц при помощи другого алгоритма ί'οηΐίπ. или ΝΝΤ8, или автоматического Макет (используемый по умолчанию алгоритм, предложенный для аппарата для определения размера). Обычно, поскольку показатель преломления частицы в сложной композиции неизвестен, в рассмотрение принимают только распределение интенсивности, и если необходимо, среднее значение интенсивности выводят из этого распределения.
Эмульсия «масло в воде» содержит стерин. Стерины хорошо известны в области техники. Например, холестерин хорошо известен и, например, раскрыт в Мегск 1пбех, 114Ь Εάη., р. 341 в виде встречающегося в природе стерина, обнаруженного в животном жире. Другие подходящие стерины включают бета-ситостерин, стигмастерин, эргостерин, альфа-токоферол и эргокальциферол.
Указанный стерин подходящим образом представлен в количестве от 0,01 до 20% (мас./об.) от общего объема иммуногенной композиции, предпочтительно в количестве от 0,1 до 5% (мас./об.). Предпочтительно, когда стерин представляет собой холестерин, он представлен в количестве от 0,02 до 0,2% (мас./об.) от общего объема иммуногенной композиции, предпочтительнее в количестве 0,02% (мас./об.) в объеме дозы вакцины 0,5 мл или 0,07% (мас./об.) в объеме дозы вакцины 0,5 мл или 0,1% (мас./об.) в объеме дозы вакцины 0,7 мл.
Подходящим образом стерин представляет собой альфа-токоферол или его производное, такое как альфа-токоферола сукцинат. Предпочтительно альфа-токоферол представлен в количестве от 0,2 до 5,0% (об./об.) от общего объема иммуногенной композиции, предпочтительнее в количестве 2,5% (об./об.) или 0,5% (об./об.) в объеме дозы вакцины 0,5 мл либо 1,7-1,9% (об./об.), предпочтительно 1,8% в объеме дозы вакцины 0,7 мл. Для ясности концентрации, приведенные в об./об., могут быть преобразованы в концентрацию, выраженную в мас./об., путем применения следующего коэффициента пересчета: концентрация альфа-токоферола 5% (об./об.) эквивалентна концентрации альфа-токоферола 4,8% (мас./об.).
Эмульсия «масло в воде» может дополнительно содержать эмульгатор. Эмульгатор может быть представлен в количестве от 0,01 до 5,0 мас.% от массы иммуногенной композиции (мас./мас.), предпочтительно представлен в количестве от 0,1 до 2,0 мас.% (мас./мас.). Предпочтительные концентрации составляют от 0,5 до 1,5 мас.% (мас./мас.) от общей массы композиции.
Эмульгатор подходящим образом может представлять собой полиоксиэтилена сорбитанмоноолеат (Тетееп 80). В специфическом воплощении объем дозы вакцины 0,5 мл содержит 1% (мас./мас.) Т\гееп 80, и объем дозы вакцины 0,7 мл содержит 0,7% (мас./мас.) Тетееп 80. В еще одном специфическом воплощении концентрация Тетееп 80 составляет 0,2% (мас./мас.).
Адъювант на основе эмульсии «масло в воде» может быть использован с другими адъювантами или иммуностимуляторами и таким образом важное воплощение по изобретению представляет собой препарат масло в воде, содержащий сквален или другое метаболизируемое масло, альфа-токоферол и Тетееп 80. Эмульсия «масло в воде» также может содержать 8рап 85 и/или лецитин. Типично масло в воде содержит от 2 до 10% сквалена от общего объема иммуногенной композиции, от 2 до 10% альфатокоферола и от 0,3 до 3% Тетееп 80 и может быть получено в соответствии со способом, описанным в \УО 95/17210. Предпочтительно отношение сквален:альфа-токоферол составляет 1 или меньше, поскольку это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. Также может быть представлен 8рап 85 (полиоксиэтилена сорбитантриолеат), например, на уровне 1%.
Иммуногенные свойства иммуногенной композиции, используемой для первой вакцинации по настоящему изобретению.
В настоящем изобретении противогриппозная композиция способна вызывать улучшенный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ против по меньшей мере одного из компонента антигена(ов) или антигенной композиции по сравнению с СЭ4 Т-клеточным иммунным ответом, получаемым с использованием соответствующей композиции, которая является неадъювантной, т.е. не содержит какой-либо экзогенный адъювант (здесь также названная «простой композицией»).
Под «улучшенным СЭ4 Т-клеточным иммунным ответом» понимают, что более высокий СЭ4 ответ получают у человека после введения адъювантной иммуногенной композиции по сравнению с получаемым после введения той же самой композиции без адъюванта. Например, более высокий
- 8 011393
СЭ4 Т-клеточный ответ получают у человека после введения иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат вместе с адъювантом на основе эмульсии «масло в воде», содержащей метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол и эмульгатор, по сравнению с ответом, вызываемым после введения иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат, который является неадъювантным. Такой препарат благоприятно используют для индукции противогриппозного СЭ4 Т-клеточного ответа, способного обнаруживать эпитопы вируса гриппа, представленные молекулами класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС).
Предпочтительно указанный иммунологический ответ, вызываемый адъювантной убиквиторной противогриппозной композицией для применения в настоящем изобретении, более высокий по сравнению с иммунологическим ответом, вызываемым какой-либо другой простой неадъювантной противогриппозной вакциной, такой как субъединичная противогриппозная вакцина или вакцина на основе полного вируса гриппа.
В частности, но не исключительно, указанный «улучшенный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ» получают у иммунологически непримированного пациента, т. е. пациента, который является серонегативным в отношении указанного вируса гриппа или антигена. Эта серонегативность может быть результатом того, что указанный пациент никогда не сталкивался с таким вирусом или антигеном (так называемый «интактный» пациент) или альтернативно не удалось сформировать ответ на указанный антиген после встречи с ним. Предпочтительно указанный улучшенный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ получают у субъекта с ослабленным иммунитетом, такого как пожилой человек, типично в возрасте 65 лет или более, или взрослого человека в возрасте меньше 65 лет, имеющего высокий риск медицинского показания (взрослый с «высоким риском»), или ребенка в возрасте до двух лет.
Улучшенный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ может быть оценен путем измерения количества клеток, продуцирующих какой-либо из следующих цитокинов:
клетки, продуцирующие по меньшей мере два различных цитокина (СО40Ь, 1Ь-2, интерферон гамма ΙΡΝ-γ, фактор некроза опухоли альфа Т№-а);
клетки, продуцирующие по меньшей мере СО40Ь и другой цитокин (1Ь-2, ΊΝΤ-α, ΙΡΝ-γ); клетки, продуцирующие по меньшей мере 1Ь-2 и другой цитокин (СО40Ь, ΕΝΡ-α, ΙΡΝ-γ); клетки, продуцирующие по меньшей мере ΙΡΝ-γ и другой цитокин (1Ь-2, Т№-а, СО40Ь); клетки, продуцирующие по меньшей мере Т№-а и другой цитокин (1Ь-2, СЭ40Ь, ΙΡΝ-γ).
Имеется улучшенный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ, когда клетки, продуцирующие какойлибо из вышеприведенных цитокинов, находятся в более высоком количестве после введения адъювантной композиции по сравнению с введением неадъювантной композиции. Типично, удовлетворяется по меньшей мере одно, предпочтительно два из пяти упомянутых выше условий. В конкретном воплощении клетки, продуцирующие все четыре цитокина, представлены в более высоком количестве в адъювантной группе по сравнению с неадъювантной группой.
Улучшенный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ, придаваемый адъювантной противогриппозной композицией по настоящему изобретению, может быть идеально получен после разового введения. Подход с использованием разовой дозы является весьма подходящим, например, в ситуации быстро развивающейся эпидемии. В некоторых случаях, особенно для пожилых людей, или в случае детей младшего возраста (в возрасте меньше 9 лет), впервые вакцинированных против вируса гриппа, может быть благоприятно вводить две дозы той же самой композиции в течение одного сезона. Вторая доза указанной той же самой композиции (все еще рассматриваемой как «композиция для первой вакцинации») может быть введена в течение развития первичного иммунного ответа и они могут быть подходящим образом разнесены по времени. Типично, вторую дозу композиции вводят через несколько недель или приблизительно один месяц, например через 2, 3, 4, 5 или 6 недель после первой дозы для того, чтобы помочь иммунной системе у индивидов, у которых не формируется иммунный ответ или плохо формируется иммунный ответ.
В специфическом воплощении введение указанной иммуногенной композиции альтернативно или дополнительно вызывает улучшенный ответ на основе В-клеток памяти у пациентов, которым вводили адъювантную иммуногенную композицию, по сравнению с ответом на основе В-клеток памяти, вызванным у индивидов, иммунизированных неадъювантной композицией. Предполагают, что улучшенный ответ на основе В-клеток памяти подразумевает увеличенную частоту В лимфоцитов в периферической крови, способных к дифференцировке в антителосекретирующие клетки плазмы крови после встречи с антигеном, что измеряют путем стимуляции дифференцировки ίη-νίίτο (см. раздел «Примеров», например способы В-клеточной памяти Εΐίκροΐ).
В еще одном специфическом воплощении вакцинация с использованием адъювантной композиции для первой вакцинации не оказывает измеряемого воздействия на СЭ8 ответ.
Заявители неожиданно обнаружили, что композиция, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат, приготовленный с адъювантом на основе эмульсии «масло в воде», содержащей метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол и эмульгатор, эффективно способствует Т-клеточным ответам в популяции людей с нарушением иммунной системы. Как продемонстрировали заявители, вве
- 9 011393 дение разовой дозы иммуногенной композиции при первой вакцинации, как описано в изобретении, способно обеспечить более хорошую сывороточную защиту, что оценивают по корреляции защиты для противогриппозных вакцин после ревакцинации против вируса гриппа в популяции пожилых людей, по сравнению с вакцинацией неадъювантной противогриппозной вакциной. Заявленный адъювантный препарат также способен индуцировать улучшенный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ против вируса гриппа по сравнению с получаемым при использовании неадъювантного препарата. Это открытие может ассоциироваться с увеличенной способностью к ответу после вакцинации или инфекции по сравнению с антигенным воздействием вируса гриппа. Кроме того, это также может ассоциироваться со способностью к перекрестному ответу, т. е. более высокой способностью к ответу против штаммов варианта вируса гриппа. Этот улучшенный ответ может быть особенно благоприятен в популяции людей с нарушением иммунной системы, такой как популяция пожилых людей (в возрасте 65 лет и выше), в частности популяции пожилых людей с высоким риском. Это может приводить в результате к уменьшению общего уровня заболеваемости и смертности и предотвращению срочной госпитализации в больницу при пневмонии и других заболеваниях, подобных вирусу гриппа. Это также может быть преимуществом для популяции детей (в возрасте меньше 5 лет, предпочтительно меньше 2 лет). Кроме того, это дает возможность для того, чтобы вызвать СЭ4 Т-клеточный ответ, который более устойчив по времени, например все еще представлен через один год после первой вакцинации, по сравнению с ответом, вызываемым неадъювантным препаратом.
Предпочтительно СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ, такой как улучшенный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ, получаемый у непримированного субъекта, охватывает индукцию перекрестнореактивного СЭ4 Т-хелперного ответа. В частности, увеличивается количество перекрестно-реактивных СЭ4 Т-клеток. Под «перекрестно-реактивным» СЭ4 ответом понимают СЭ4 Т-клеточные нацеливающие перекрестно-реагирующие эпитопы между штаммами вируса гриппа.
Обычно доступные противогриппозные вакцины эффективны только против инфицирующих штаммов вируса гриппа, имеющих гемагглютинины, обладающие похожими антигенными характеристиками. Когда инфицирующий (циркулирующий) вирус гриппа претерпевает незначительные изменения (такие как точечная мутация или аккумуляция точечных мутаций, приводя в результате, например, к аминокислотным заменам) поверхностных гликопротеинов, в частности гемагглютинина (антигенный вариант штамма вируса в результате дрейфа), вакцина может все еще обеспечивать некоторую защиту, хотя они могут обеспечивать лишь ограниченную защиту, тогда как вновь созданные варианты могут избежать иммуногенности, вызванной предшествующим инфицированием вирусом гриппа или вакцинацией. Антигенный дрейф ответственен за ежегодные эпидемии, возникающие во время межпандемических периодов (^11еу&8кейе1, 1987, Апп. Неу. Вюейет. 56, 365-394). Индукция перекрестно-реактивных СЭ4 Т-клеток придает дополнительное преимущество композиции по изобретению, заключающееся в том, что она может обеспечивать также перекрестную защиту, другими словами, защиту против гетерологических инфекций, т. е. инфекций, вызванных циркулирующим штаммом вируса гриппа, который представляет собой вариант (например, дрейф) штамма вируса гриппа, содержащийся в иммуногенной композиции. Это может быть благоприятно в том случае, когда циркулирующий штамм сложно репродуцировать в яйцах или продуцировать в тканевой культуре, что делает применение дрейфующего штамма рабочей альтернативой. Это также может быть благоприятно, когда субъект получает первую и вторую вакцинацию с разницей в несколько месяцев или год, и штамм вируса гриппа в иммуногенной композиции, используемой для второй иммунизации, представляет собой дрейфующий вариант штамма, используемого в композиции, применяемой для первой вакцинации.
Обнаружение перекрестно-реактивных СЭ4 Т-клеток после вакцинации противогриппозной вакциной.
После введения классической тривалентной противогриппозной вакцины (3 недель) существует значительное увеличение частоты СЭ4 Т-клеток периферической крови, отвечающих на препарат антигенного штамма (полный вирус или убиквиторный антиген), гомологичного представленному в вакцине (Η3Ν2: А/Рапата/2007/99, Η1Ν1: А/Ыете Са1ебоша/20/99, В: В/8йапдбопд/7/97) (см. пример III). Сравнимое увеличение частоты может наблюдаться в том случае, если СЭ4 Т-клетки периферической крови рестимулированы штаммами вируса гриппа, классифицированными как дрейфующие штаммы (Η3Ν2: А/8убпеу/5/97. Η1Ν1: А/Вегрпд/262/95, В: В/Уатапа5Ы/166/98).
Наоборот, если СЭ4 Т-клетки периферической крови рестимулированы штаммами вируса гриппа, классифицированными экспертом в области техники как дрейфующие штаммы (Η2Ν2: А/8шдароге/1/57, Η9Ν2: А/Ηоηдкоηд/1073/99), отсутствует заметное увеличение после вакцинации.
СЭ4 Т-клетки, которые способны распознавать гомологичные и дрейфующие штаммы вируса гриппа, названы в представленном документе как перекрестно-реактивные. Адъювантные противогриппозные композиции, заявленные для применения в настоящем изобретении, способны демонстрировать гетеросубтипичную перекрестную реактивность, поскольку существует видимая кроссреактивность против дрейфующих штаммов вируса гриппа.
В соответствии с вышеприведенными наблюдениями СЭ4 Т-клеточные эпитопы, содержащиеся в различных штаммах вируса гриппа, были идентифицированы у человека (ОеИег С. е! а1., 1998, 1п1. 1ттипо1., 10(2):211-22; ОеШег С.М. е! а1., 1996, I. Уйо1., 70(7):4787-90; ОеШег С.М. е! а1., 1995, I. Уйо1., 1995,
- 10 011393
69(12):7497-506).
В специфическом воплощении адъювантная композиция может обеспечить дополнительное преимущество, заключающееся в том, что она обеспечивает более хорошую защиту против циркулирующих штаммов, которые претерпели основное изменение (такое как генная рекомбинация, например между двумя различными видами) гемагглютинина (антигенный сдвиг), против которого существующие в настоящее время вакцины не обладают эффективностью.
Другие адъюванты.
Композиция может содержать дополнительный адъювант, в частности адъювант на основе лиганда То11-подобного рецептора 4 (ТЬК.-4), подходящим образом нетоксичное производное липида А. Подходящий ТКЕ-4 лиганд представляет собой 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (3Э-МФЛ). Другие подходящие ТЬК.-4 лиганды представляют собой липополисахарид (ЛПС) и производные, МДП (мурамилдипептид) и Р белок респираторно-синцитиального вируса (К.8У).
В одном из воплощений композиция дополнительно может включать лиганд То11-подобного рецептора 4 (ТЬК.), такой как нетоксичное производное липида А, особенно монофосфориллипид А или конкретней 3-деацилированный монофосфориллипид А (3Э-МФЛ).
3Э-МФЛ продается под товарным знаком МРЬ® от Сопха сотротайои (здесь МФЛ) и в основном способствует СЭ4+ Т-клеточным ответам с фенотипом ΙΡΝ-γ (ТЫ). Он может быть получен в соответствии со способами, раскрытыми в СВ 2220211 А. Химически он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями.
Предпочтительно в композициях по настоящему изобретению используют 3Э-МФЛ с небольшими частицами. 3Э-МФЛ имеет такой размер частиц, что он может быть стерильно фильтрован через фильтр 0,22 мкм. Такие препараты описаны в ХО94/21292 и в примере II.
3Э-МФЛ могут быть использованы, например, в количестве от 1 до 100 мкг (мас./об.) на дозу композиции, предпочтительно в количестве от 10 до 50 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Подходящее количество 3Э-МФЛ. например, составляет от 1 до 50 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Предпочтительнее количество 3Э-МФЛ составляет от 25 до 75 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Обычно доза композиции находится в диапазоне приблизительно от 0,5 приблизительно до 1 мл. Типичные дозы вакцины составляют 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мл. В предпочтительном воплощении конечная концентрация 50 мкг 3Э-МФЛ содержится в 1 мл композиции вакцины или 25 мкг в 0,5 мл дозы вакцины. В других предпочтительных воплощениях конечная концентрация 35,7 или 71,4 мкг 3Э-МФЛ содержится в 1 мл композиции вакцины. Конкретно, 0,5 мл объем дозы вакцины содержит 25 или 50 мкг 3Э-МФЛ на дозу.
Доза МФЛ подходящим образом способна усиливать иммунный ответ на антиген у человека. В частности, подходящее количество МФЛ представляет собой такое количество, которое улучшает иммунологический потенциал композиции по сравнению с неадъювантной композицией или по сравнению с композицией, в которой содержится другое количество МФЛ в качестве адъюванта, в то же время оставаясь приемлемой исходя из профиля реактогенности.
Синтетические производные липида А известны, некоторые описаны как агонисты ТЕК.-4 и включают:
ОМ174 (2-дезокси-6-орто[2-дезокси-2-[(К.)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-ортофосфоно(3-О-глюкопиранозил)]-2-[(К.)-3-гидрокситетрадеканоиламино]-а-П-глюкопиранозилдигидрофосфат) (№О 95/14026);
ОМ294 ΌΡ (38,9В)-3-[(В)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(К.)-[(В)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол,1,10-бис-(дигидрофосфат) (\УО99 /64301 и \УО 00/0462);
ОМ197 МР-Ас ΌΡ (38-,9К.)-3-[(К.)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К.)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол,1-дигидрофосфат 10-(6-аминогексаноат) (\УО 01/46127), но не ограничиваются ими
Другие подходящие ТЬВ-4 лиганды представляют собой, например, липополисахарид и его производные мурамилдипептид (МДП) или Р белок респираторно-синцитиального вируса.
Другой подходящий иммуностимулятор для применения в настоящем изобретении представляет собой Οιιί1 А и его производные. 0ιιί1 А представляет собой сапониновый препарат, выделенный из южно-американского дерева 0ш1а)а 8аропапа Мо1ша и впервые описанный Оакдаатб с1 а1. в 1974 (8ароши афиуаий, АтсЫу. Гит Ше дсхашЮ УииИогасйиид, уо1. 44, 8ргтдег Ует1ад, Ветйи, р. 243-254), обладающий адъювантной активностью. Очищенные фрагменты Οιιί1 А, выделенные при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сохраняют адъювантную активность без токсичности, ассоциирующейся с 0ιιί1 А (ЕР 0362278), например 087 и 0821 (также известные как ОА7 и ОА21). 08-21 представляет собой природный сапонин, полученный из коры Ош11а)а кароиапа Мойиа, который индуцирует ответ в виде СЭ8+ цитотоксичных Т-клеток (СТЬ), ТЫ клеток и преимущественно в виде 1дС2а антител, и представляет собой предпочтительный сапонин в контексте настоящего изобретения.
Описаны конкретные препараты 0821, которые являются особенно предпочтительными, эти препараты дополнительно содержат стерин (ХО96/33739). Сапонины, образующие часть настоящего изобретения, могут находиться в форме эмульсии «масло в воде» (\УО 95/17210).
- 11 011393
Ревакцинация и композиция, используемая для ревакцинации (композиция для повторной иммунизации).
В одном из аспектов настоящего изобретения предложено применение антигена вируса гриппа при приготовлении противогриппозной иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных вирусом гриппа, или его антигенным препаратом, или его вариантом, приготовленным с адъювантом на основе эмульсии «масло в воде», содержащей метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол, и эмульгатор.
Типично ревакцинацию осуществляют по меньшей мере через 6 месяцев после первичной вакцинацией), предпочтительно через 8-14 месяцев, предпочтительнее приблизительно через 10-12 месяцев после первичной вакцинации(й).
Иммуногенная композиция для ревакцинации (композиция для повторной иммунизации) может содержать какой-либо тип антигенного препарата, инактивированного или живого ослабленного. Она может содержать тот же самый тип антигенного препарата, т. е. убиквиторный вирус гриппа или его убиквторный вирусный антигенный препарат, полный вирион, очищенную НА и ΝΑ (субъединичную) вакцину или виросому, в качестве иммуногенной композиции, используемой для первой вакцинации. Альтернативно, композиция для повторной иммунизации может содержать тип антигена вируса гриппа, т. е. убиквиторный вирус гриппа или его убиквторный вирусный антигенный препарат, полный вирион, очищенную НА и ΝΑ (субъединичную) вакцину или виросому, отличающийся от используемого для первой вакцинации. Композиция для повторной иммунизации может быть адъювантной или неадъювантной. Неадъювантная композиция для повторной иммунизации может представлять собой Р1иапх™/а-К1х®/1и£1и8р1й®, вводимый внутримышечно. Препарат содержит три инактивированных убиквиторных вирионовых антигена, полученных из штаммов, рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения для соответствующего сезона вируса гриппа.
Соответственно, в предпочтительном воплощении изобретения предложено применение:
(а) вируса гриппа или его антигенного препарата и (б) адъюванта на основе эмульсии «масло в воде» в приготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных вирусом гриппа или его антигенным препаратом и адъювантом на основе эмульсии «масло в воде», содержащей метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор.
Указанный адъювант на основе эмульсии «масло в воде» предпочтительно содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, по меньшей мере 70% которых по интенсивности имеют диаметры меньше чем 1 мкм. Подходящим образом указанный стерин представляет собой альфа-токоферол.
В специфическом воплощении иммуногенная композиция для ревакцинации (также названная здесь ниже «композиция для повторной иммунизации») содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который несет общие ΟΌ4 Т-клеточные эпитопы с вирусом гриппа или его антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации. Предполагают, что общий ΟΌ4 Т-клеточный эпитоп обозначает пептиды/последовательности/эпитопы из различных антигенов, которые могут распознаваться той же самой ΟΌ4 клеткой (см. примеры описанных эпитопов в: ОеИег С. с1 а1., 1998, 1ηΐ. 1ттипо1., 10(2):211-22; ОеИег С.М. с1 а1,. 1996, 1. Уйо1., 70(7):4787-90; ОеШег С.М. с1 а1., 1995, 1. У1го1., 1995, 69(12):7497-506).
В предпочтительном воплощении штамм вируса гриппа может ассоциироваться с пандемической вспышкой или обладает потенциалом ассоциироваться с пандемической вспышкой. В частности, когда вакцина представляет собой мультивалентную вакцину, такую как бивалентная или тривалентная вакцина, по меньшей мере один штамм ассоциируется с пандемической вспышкой или обладает потенциалом ассоциироваться с пандемической вспышкой. Подходящие штаммы представляют собой Η5Ν1, Η9Ν2, Η7Ν7, Η2Ν2 и Η1Ν1, но не ограничиваются ими.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение:
(в) вируса гриппа или его антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа и (г) адъюванта на основе эмульсии «масло в воде», содержащей метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор в приготовлении иммуногенной композиции для защиты против инфекций вирусом гриппа, вызванных штаммом вируса гриппа, который представляет собой вариант указанного первого штамма вируса гриппа.
Предпочтительно указанный адъювант на основе эмульсии «масло в воде» содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, по меньшей мере 70% которых по интенсивности имеют диаметры меньше чем 1 мкм. Подходящим образом указанный стерин представляет собой альфа-токоферол.
Типично композицию для повторной иммунизации, когда ее применяют, вводят в следующий сезон вируса гриппа, например приблизительно через год после первой иммуногенной композиции. Композиция для повторной иммунизации (далее сенсибилизирующая композиция) также может быть введена каждый последующий год (третья, четвертая, пятая вакцинация и т.д.). Сенсибилизирующая композиция может представлять собой ту же композицию, что и композиция, используемая для первой вакцинации.
- 12 011393
Подходящим образом сенсибилизирующая композиция содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который представляет собой вариант штамма вируса гриппа, используемого для первой вакцинации. В частности, штаммы вируса гриппа или его антигенного препарата выбраны в соответствии со ссылками, распространяемыми Всемирной организацией здравоохранения, таким образом, что они адаптированы к штамму вируса гриппа, который циркулирует в год ревакцинации.
Антиген вируса гриппа или антигенная композиция, используемая при ревакцинации, предпочтительно содержит адъювант или эмульсию «масло в воде», подходящим образом, как описано выше. Адъювант может представлять собой адъювант на основе эмульсии «масло в воде», как описано выше, которая предпочтительно возможно содержит дополнительными адъювант, такой как ТШ-4 лиганд, такой как 3Э-МФЛ или сапонин, или может представлять собой другой подходящий адъювант, такой как квасцы или альтернативы квасцов, такие как, например полифосфазен.
Предпочтительно ревакцинация вызывает любой из ответов, предпочтительно два или все из следующих:
(1) улучшенный СЭ4 ответ против вируса гриппа или его антигенного препарата, или (2) улучшенный ответ на основе В-клеточной памяти, или (3) улучшенный гуморальный ответ по сравнению с эквивалентным ответом, вызываемым после первой вакцинации неадъювантным вирусом гриппа или его антигенным препаратом.
Предпочтительно иммунологические ответы, вызываемые после ревакцинации адъювантным вирусом гриппа или его определенным здесь антигенным препаратом, более высокие по сравнению с соответствующим ответом, вызываемым после ревакцинации неадъювантной композицией. Предпочтительно иммунологические ответы, вызываемые ревакцинацией неадъювантным, предпочтительно убиквиторным вирусом гриппа, являются более высокими в популяции, сначала вакцинированной адъювантной, предпочтительно убиквиторной противогриппозной композицией по сравнению с соответствующим ответом в популяции, сначала вакцинированной неадъювантной, предпочтительно субъединичной противогриппозной композицией.
Как показали заявители, ревакцинация субъектов сенсибилизирующей композицией, содержащей вирус гриппа и адъювант на основе эмульсии «масло в воде», содержащей метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол, и определенный выше эмульгатор, демонстрирует более высокий титр антитела по сравнению с соответствующими значениями для группы людей, сначала вакцинированной неадъювантной композицией и сенсибилизированной неадъювантной композицией. Эффект адъюванта при усилении ответа в виде антител на ревакцинацию особенно важен в популяции пожилых людей, которая, как известно, имеет низкий ответ на вакцинацию или инфекцию вирусом гриппа. Преимущество, ассоциирующееся с адъювантной композицией, также очевидно с точки зрения улучшения СЭ4 Т-клеточного ответа после ревакцинации.
Адъювантная композиция по изобретению способна вызывать более хорошую перекрестную ответную реакцию против дрейфующего штамма (штамма вируса гриппа в следующий сезон вируса гриппа) по сравнению с защитой, обеспечиваемой контрольной вакциной. Указанная перекрестная ответная реакция демонстрирует более высокую персистенцию по сравнению с обеспечиваемой неадъювантным препаратом.
Преклинические данные, приведенью в примере 3, например, демонстрируют способность композиции по изобретению защищать против гетеротипичной инфекции вирусом гриппа и заболеваний, что оценивают в соответствии с измерениями температуры организма. То же самое заключение справедливо для данных клинических испытаний, полученных в исследованиях ревакцинации.
Штаммы вируса гриппа и его антигены.
Указанный вирус гриппа или его антигенный препарат подходящим образом является моновалентным или мультивалентным, таким как бивалентный, или тривалентный, или квадривалентный. Предпочтительно вирус гриппа или его антигенный препарат является тривалентным или квадривалентным, имеющим антиген из трех различных штаммов вируса гриппа.
Возможно, по меньшей мере один из штаммов ассоциируется с пандемической вспышкой или обладает потенциалом ассоциироваться с пандемической вспышкой.
В соответствии с предшествующим уровнем техники во время межпандемических периодов вирусы гриппа циркулируют, что связано с вирусами из предшествующих эпидемий. Вирусы распространяются среди людей с различными уровнями иммуннитета от инфекций, ранее проявляющимися в течение жизни. Такое распространение в течение периода обычно 2-3 лет способствует отбору новых штаммов, которые достаточно изменены для того, чтобы вновь вызвать эпидемию в общей популяции; этот процесс назван «антигенный дрейф». «Дрейфующие варианты» могут обладать различными воздействиями в различных сообществах, областях, странах или континентах в какой-либо год, хотя в течение нескольких лет их общее воздействие часто схоже. Другими словами, пандемии вируса гриппа возникают, когда появляется новый вирус гриппа, против которого популяция людей не обладает иммунитетом. Типичные эпидемии гриппа вызывают увеличение частоты явлений и уменьшение частоты респираторных заболеваний, о чем свидетельствует увеличение уровней госпитализации или смертности. Пожилые люди или люди, имеющие фон хронических заболеваний, наиболее вероятно сталкиваются с такими осложнения
- 13 011393 ми, однако дети также могут страдать от тяжелого заболевания.
С непредсказуемыми интервалами возникают новые вирусы гриппа с ключевым поверхностным антигеном, гемагглютинином, имеющим подтип, в общем отличающимся от подтипов, циркулирующих в предшествующий сезон. В этом случае получающиеся в результате антигены могут изменяться на 2050% относительно соответствующего белка штаммов, которые ранее циркулировали среди людей. Это может привести в результате к вирусу, который может избежать «групповой иммунитет» и вызвать пандемии. Это явление названо «антигенным сдвигом». Полагают, что, по меньшей мере, в последнее время пандемии возникают, когда вирус гриппа из различных видов, таких как обезьяний вирус гриппа или вирус гриппа свиньи, пересекает видовой барьер. Если такие вирусы обладают потенциалом передаваться от индивида к индивиду, они могут распространяться в мире в течение от месяцев до года, приводя в результате к пандемии. Например, в 1957 году (пандемия Лааи Е1и) вирусы подтипа Η2Ν2 заместили вирусы Η1Μ, которые циркулировали в человеческой популяции по меньшей мере с 1918 года, когда вирус впервые был выделен. Н2НА и Ν2ΝΑ претерпели антигенный дрейф между 1957 и 1968 гг. до того, как НА был замещен в 1968 году (пандемия Ноид-Коид Е1и) появлением подтипа Η3Ν2 вируса гриппа, после чего Ν2ΝΑ продолжал дрейфовать вместе с Н3НА Щакарша с1 а1., 1991, Ер1бешю1. 1пГсс1. 106, 383-395).
Особенности штамма вируса гриппа, которые обеспечивают ему потенциал вызывать пандемический исход, представляют собой следующее:
он содержит новый гемагглютинин по сравнению с гемагглютинином циркулирующих в настоящее время штаммов, что может сопровождаться или не сопровождаться изменением нейраминидазного подтипа;
он способен горизонтально переноситься в человеческой популяции и он патогенен для людей.
Новый гемагглютинин может представлять собой гемагглютинин, который не был обнаружен в человеческой популяции в течение длительного периода времени, возможно множества десятилетий, такой как Н2. Или он может представлять собой гемагглютинин, который не циркулировал в человеческой популяции ранее, например Н5, Н9, Н7 или Н6, которые найдены у птиц. В любом случае большинство, или по меньшей мере значительная доля, или даже вся популяция ранее не сталкивались с антигеном и иммунологически не подвергнуты его воздействию.
Некоторые группы, как правило, имеют увеличенный риск инфицирования вирусом гриппа в случае пандемии. Особенно восприимчивы пожилые люди, хронически больные и дети младшего возраста, но риск имеют также многие молодые и явно здоровые люди. Для вируса гриппа Н2 часть популяции, рожденной после 1968 года, имеет увеличенный риск. Важно, чтобы эти группы были эффективно защищены по возможности быстро и простым путем.
Другую группу людей, которая имеет увеличенный риск, представляют собой путешественники. В настоящее время люди путешествуют больше, чем ранее, и области, где возникают самые новые вирусы, а именно Китай и юго-восточная Азия, в течение последних лет превратились в популярные места для путешествий. Это изменение картины путешествий дает новым вирусам возможность распространиться по всему миру в течение недель, нежели чем месяцев или лет.
Таким образом, для этих групп людей существует конкретная потребность в вакцинации для защиты от вируса гриппа в случае пандемии или потенциальной ситуации пандемии. Подходящие штаммы представляют собой: Η5Ν1, Η9Ν2, Η7Ν7, Η2Ν2 и Η1Ν1, но не ограничиваются ими.
Возможно, композиция может содержать более чем три валентности, например два непандемических штамма плюс пандемический штамм. Альтернативно композиция может содержать три пандемических штамма.
В еще одном воплощении изобретение относится к схеме вакцинации, в которой первую вакцинацию осуществляют убиквиторной противогриппозной композицией, содержащей по меньшей мере один штамм вируса гриппа, который потенциально может вызывать пандемический исход, а ревакцинацию осуществляют циркулирующим штаммом, пандемическим штаммом или классическим штаммом.
СЭ4 эпитоп в ΗΑ.
Антигенный дрейф в основном происходит в областях эпитопов поверхностных вирусных белков гемагглютинина (ΗΑ) и нейраминидазы (ΝΑ). Известно, что какое-либо различие в СЭ4 и В-клеточных эпитопах между различными штаммами вируса гриппа, используемыми вирусом для ухода от адаптивного ответа иммунной системы хозяина, играет основную роль в противогриппозной вакцинации.
СЭ4 Т-клеточные эпитопы, принадлежащие различным штаммам вируса гриппа, идентифицированы у человека (см., например: Се1бег С. е! а1., 1998, Ιη!/ 1ттипо1., 10(2):211-22; Се1бег С.М. е! а1., 1996, 1. Упо1., 70(7):4787-90 и ОеМет С.М. е! а1., 1995, 1. Упоъ, 69(12):7497-506).
В специфическом воплощении ревакцинацию осуществляют с использованием сенсибилизирующей композиции, которая содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который несет общие СЭ4 Т-клеточные эпитопы с антигеном вируса гриппа или его антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации. Таким образом, изобретение относится к применению иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант на основе эмульсии «масло в
- 14 011393 воде», содержащей метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол, и эмульгатор, при приготовлении первого компонента вакцинации мультидозовой вакцины, где мультидозовая вакцина дополнительно содержит в качестве сенсибилизирующей дозы вирус гриппа или его антигенный препарат, который несет общие 0Ό4 Т-клеточные эпитопы с антигеном вируса гриппа или его антигенным вирусным препаратом дозы, вводимой при первой вакцинации.
Способы вакцинации.
Композиция по изобретению может быть введена при помощи какого-либо подходящего пути доставки, такого как внутрикожный, внутрислизистый, например интраназальный, пероральный, внутримышечный или подкожный.
Другие пути доставки хорошо известны в области техники.
Внутримышечный путь доставки предпочтителен для адъювантной противогриппозной композиции.
Внутрикожная доставка представляет собой другой подходящий путь. Для внутрикожной доставки может быть использовано какое-либо подходящее устройство, например устройства с короткой иглой, такие как устройства, описанные в И8 4886499, И8 5190521, И8 5328483, И8 5527288, И8 4270537, И8 5015235, И8 5141496, И8 5417662. Вакцины для внутрикожного введения также могут быть введены при помощи устройств, которые ограничивают глубину эффективного проникновения иглы в кожу, таких как устройства, описанные в ДО 99/34850 и ЕР 1092444, включенных здесь путем ссылки, и их функциональных эквивалентах. Также подходящими являются устройства для струйной инъекции, которые доставляют жидкие вакцины в дерму при помощи жидкостного струйного инъектора или через иглу, которая прокалывает роговой слой и продуцирует поток, достигающий дерму. Устройства для струйной инъекции описаны, например, в И8 5480381, И8 5599302, И8 5334144, И8 5993412, И8 5649912, И8 5569189, И8 5704911, И8 5383851, И8 5893397, И8 5466220, И8 5339163, И8 5312335, И8 5503627, И8 5064413, И8 5520639, И8 4596556 И8 4790824, И8 4941880, И8 4940460, ДО 97/37705 и ДО 97/13537. Также подходящими являются устройства для баллистической доставки порошка/частиц, в которых используется газ под давлением для ускорения вакцины в порошкообразной форме через внешние слои кожи в дерму. Дополнительно, обычные шприцы могут быть использованы в классическом способе Манту внутрикожного введения.
Другой подходящий путь введения представляет собой подкожный путь. Какое-либо подходящее устройство может быть использовано для подкожной доставки, например классическая игла. Предпочтительно используют безыгольный струйный инъектор, такой как опубликованный в ДО 01/05453, ДО 01/05452, ДО 01/05451, ДО 01/32243, ДО 01/41840, ДО 01/41839, ДО 01/47585, ДО 01/56637, ДО 01/58512, ДО 01/64269, ДО 01/78810, ДО 01/91835, ДО 01/97884, ДО 02/09796, ДО 02/34317. Предпочтительнее указанное устройство предварительно заполняют жидким вакцинным препаратом.
Альтернативно, вакцину вводят интраназально. Типично, вакцину вводят местно в носоглотку, предпочтительно без ингаляции в легкие. Желательно использовать устройство для интраназальной доставки, которое доставляет вакцинный препарат в носоглотку без, или по существу без, его проникновения в легкие.
Предпочтительные устройства для интраназального введения вакцины по изобретению представляют собой распыляющие устройства. Подходящие и имеющиеся в продаже устройства для назального распыления включают Ассикртау™ (Вес1ои Оюкиъоп). Небулайзеры продуцируют очень тонкодисперсный спрей, который можно легче ингалировать в легкие и таким образом эффективно не достигает слизистой оболочки носа. Таким образом, небулайзеры не являются предпочтительными.
Предпочтительные распыляющие устройства для интраназального применения представляют собой устройства, в которых производительность не зависит от давления, прикладываемого пользователем. Эти устройства известны как устройства с порогом давления. Жидкость высвобождается из форсунки только тогда, когда применяют пороговое давление. Эти устройства позволяют легче достичь распыления капель постоянного размера. Устройства с пороговым давлением, подходящие для применения в настоящем изобретении, известны в области техники и описаны, например в ДО 91/13281 и ЕР 311863 В и ЕР 516636, включенных здесь путем ссылки. Такие устройства имеются в продаже от РТетйег СтЬН и также описаны в Воттег, В. Рйагтасеийса1 Тесйпо1о§у Еигоре, 8ер1. 1999.
Предпочтительные устройства для интраназального введения продуцируют капли (измеренные с использованием воды в качестве жидкости) в диапазоне от 1 до 200 мкм, предпочтительно от 10 до 120 мкм. Меньше 10 мкм существует риск ингаляции, таким образом, желательно иметь не более чем приблизительно 5% капель с размером меньше 10 мкм. Капли с размером больше 120 мкм не распределяются столь же хорошо, как меньшие капли, таким образом, желательно иметь не более чем приблизительно 5% капель, имеющих размер больше 120 мкм.
Доставка двойной дозы представляет собой дополнительную предпочтительную особенность системы для интраназального введения при применении вакцины по изобретению. Устройства с двойной дозой содержат две субдозы единичной дозы вакцины, одна субдоза предназначена для введения в каждую из ноздрей. Как правило, две субдозы находятся в одной камере, и конструкция устройства дает возможность для эффективной доставки одной субдозы единовременно. Альтернативно, для введения вак
- 15 011393 цины по изобретению может быть использовано однодозовое устройство.
Альтернативно, также в настоящем изобретении рассмотрен путь эпидермальной или трансдермальной вакцинации.
В специфическом аспекте настоящего изобретения адъювантная иммуногенная композиция для первичного введения может быть введена внутримышечно, а сенсибилизирующая композиция, являющаяся адъювантной или неадъювантной, может быть введена различными путями, например внутрикожно, подкожно или интраназально. В еще одном специфическом воплощении композиция для первичного введения может содержать стандартное количество НА 15 мкг на штамм вируса гриппа, а сенсибилизирующая композиция может содержать низкую дозу НА, т.е. меньшей 15 мкг, и в зависимости от пути введения может быть введена в меньшем объеме.
Популяции для вакцинации.
Целевая популяция для вакцинации может представлять собой людей с ослабленным иммунитетом. Люди с ослабленным иммунитетом, как правило, обладают меньшей способностью отвечать на антиген, в частности на антиген вируса гриппа, по сравнению со взрослыми людьми.
Предпочтительно целевая популяция представляет собой популяцию, которая непримирована против вируса гриппа, являясь наивной (такой как партнер-пандемический штамм), или которой ранее не удалось сформировать ответ на инфекцию вирусом гриппа или противогриппозную вакцинацию. Предпочтительно целевую популяцию составляют пожилые люди, подходящим образом в возрасте 65 лет и старше, взрослые с высоким риском (т.е. в возрасте от 18 до 64 лет), такие как люди, работающие в системе здравоохранения, или молодые взрослые, имеющие фактор риска, такой как сердечно-сосудистое и легочное заболевание, или сахарный диабет. Другая целевая популяция представляет собой всех детей в возрасте от 6 месяцев и выше, особенно детей в возрасте 6-23 месяцев, которые сталкиваются с относительно высоким связанным с вирусом гриппа уровнем госпитализации. Предпочтительно целевую популяцию составляют пожилые люди в возрасте выше 65 лет.
Схемы вакцинации, дозировка и дополнительные критерии эффективности.
Подходящим образом иммуногенные композиции по настоящему изобретению в большинстве случаев представляют собой стандартные инъецируемые дозы по 0,5 мл и содержат 15 мкг гемагглютининового антигенного компонента из каждого штамма вируса гриппа, измеренные при помощи простой радиальной иммунодиффузии (8ΚΌ) (ЕМ. \Уооб е! а1., 1. Вю1. 81аиб., 5 (1977), 237-247; ЕМ. \Уооб е! а1., 1. Вю1. 81апб.. 9 (1981), 317-330). Подходящим образом объем дозы вакцины составляет от 0,5 до 1,0 мл, в частности стандартно объем дозы вакцины составляет 0,5 или 0,7 мл. Легкая адаптация объема может быть осуществлена стандартно в зависимости от концентрации НА в образце исходной партии.
Подходящим образом указанная иммуногенная композиция содержит низкую дозу НА антигена, например любую из 1-14 мкг НА на штамм вируса гриппа. Подходящая низкая доза 25 НА составляет от 1 до 7,5 мкг НА на штамм вируса гриппа, подходящим образом от 3,5 до 5 мкг, такую как 3,75 мкг НА на штамм вируса гриппа, типично приблизительно 5 мкг НА на штамм вируса гриппа.
Благоприятно, доза вакцины по изобретению, в частности низкая доза вакцина, может быть предложена в меньшем объеме, чем для обычных инъецируемых кр111 Пи вакцин, для которых объем, как правило, составляет приблизительно 0,5, 0,7 или 1 мл на дозу. Низкий объем дозы по изобретению предпочтительно меньше 500 мкл, предпочтительнее меньше 300 мкл и наиболее предпочтительно не больше чем приблизительно 200 мкл или меньше на дозу.
Таким образом, предпочтительный низкий объем дозы вакцины в соответствии с одним из аспектов изобретения представляет собой дозу с низкой дозой антигена в малом объеме, например приблизительно 15 мкг, или приблизительно 7,5 мкг, или приблизительно 3,0 мкг НА (на штамм) в объеме приблизительно 200 мкл.
Противогриппозное лекарственное средство по изобретению предпочтительно удовлетворяет определенным международным критериям, предъявляемым к вакцинам.
Стандарты применяют во всем мире для измерения эффективности противогриппозных вакцин. Официальные критерии Евросоюза в отношении эффективной вакцины против вируса гриппа представлены в табл. 1. Теоретически, для того чтобы удовлетворять требованиям Евросоюза, противогриппозные вакцины должны удовлетворять только одному из критериев, указанных в таблице, для всех штаммов вируса гриппа, включенных в вакцину. Композиции по настоящему изобретению подходящим образом удовлетворяют по меньшей мере одному из таких критериев.
Тем не менее, на практике необходимо, чтобы были удовлетворены по меньшей мере два или все три критерия для всех штаммов, особенно для новой вакцины, такой как новая вакцина для введения различными путями. В некоторых случаях могут быть достаточны два критерия. Например, может быть приемлемо, чтобы два из трех критериев удовлетворялись всеми штаммами, хотя третий критерий удовлетворялся некоторыми, а не всеми штаммами (например, двумя из трех штаммов). Требования различны для взрослой популяции (18-60 лет) и популяции пожилых людей (старше 60 лет).
- 16 011393
Таблица 1
18-60 лет больше 60 лет
Уровень сероконверсии* больше 40% больше 30%
Переводной коэффициент** больше 2,5 больше 2,0
Уровень защиты*** больше 70% больше 60%
*Уровень сероконверсии определяют как процент вакцинированных пациентов, которые имеют по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров гемагглютининового ингибирования (Ш) после вакцинации для каждого вакцинного штамма.
**Переводной коэффициент определяют как кратное увеличение сывороточных среднегеометрических титров (СГ) Ш после вакцинации для каждого вакцинного штамма.
***Уровень защиты определяют как процент вакцинированных пациентов с сывороточным титром Ш, равным или больше чем 1:40 после вакцинации (для каждого вакцинного штамма), и обычно его принимают как показатель защиты.
В еще одном аспекте в изобретении предложен способ разработки вакцины для заболеваний, которые, как известно, излечивают или лечат путем СО4- Т-клеточной активации, включающий:
1) выбор антигена, содержащего СО4- эпитопы, и
2) объединение указанного антигена с адъювантом на основе эмульсии «масло в воде», как определено выше, где указанная вакцина после введения указанному млекопитающему способна вызывать усиленный СО4 Т-клеточный ответ у указанного млекопитающего.
Содержание всех ссылок в заявке на изобретение, включающих заявки на патенты и выданные патенты, полностью включено сюда путем ссылки.
Для того чтобы избежать неопределенности, авторы настоящего изобретения предполагают, что использованные здесь термины «содержащий», «содержат» и «содержит» в каждом случае возможно заменяемы терминами соответственно «состоящий из», «состоят из» и «состоит из».
Альтернативные воплощения.
В альтернативном воплощении может быть использован любой адъювант на основе эмульсии «масло в воде», в частности, но не единственно, когда используют с убиквиторным антигеном вируса гриппа или его антигенным препаратом. Соответственно, следующие специфические воплощения также рассмотрены в контексте настоящего изобретения.
1. Применение:
(а) убиквиторного вируса гриппа или его убиквиторного вирусного антигенного препарата и (б) адъюванта на основе эмульсии «масло в воде» в приготовлении иммуногенной композиции, вызывающей по меньшей мере один из ответов:
1) улучшенный СО4 Т-клеточный ответ,
2) улучшенный ответ на основе В-клеточной памяти против указанного антигена или его убиквиторного вирусного антигенного препарата у человека.
2. Применение.
(в) убиквиторного вируса гриппа или его убиквиторного вирусного антигенного препарата и (г) адъюванта на основе эмульсии «масло в воде» в приготовлении иммуногенной композиции для вакцинации человека с ослабленным иммунитетом или популяция, такой как взрослые с высоким риском или пожилые люди, против вируса гриппа.
3. Применение вируса гриппа или его антигенного препарата, адъювантного или неадъювантного, в приготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных убиквиторным вирусом гриппа или его убиквиторным вирусным антигенным препаратом и адъювантом на основе эмульсии «масло в воде». Предпочтительно ревакцинацию осуществляют субъектам, которые вакцинированы в предшествующий сезон против вируса гриппа. Типично ревакцинацию осуществляют по меньшей мере через 6 месяцев после первичной вакцинации, предпочтительно через 8-14 месяцев, предпочтительнее приблизительно через 10-12 месяцев.
4. Предпочтительно, предложено применение:
(а) убиквиторного вируса гриппа или его убиквиторного вирусного антигенного препарата, и (б) адъюванта на основе эмульсии «масло в воде» в приготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных убиквиторным вирусом гриппа или его убиквиторным вирусным антигенным препаратом и адъювантом на основе эмульсии «масло в воде».
5. Применение:
(д) убиквиторного вируса гриппа или его убиквиторного вирусного антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа и (е) адъюванта на основе эмульсии «масло в воде»
- 17 011393 в приготовлении иммуногенной композиции для защиты против инфекций вирусом гриппа, вызванных штаммом вируса гриппа, который представляет собой вариант указанного первого штамма вируса гриппа.
6. В еще одном специфическом воплощении иммуногенная композиция для ревакцинации содержит убиквиторный вирус гриппа или его убиквиторный вирусный антигенный препарат, который несет общие ί.Ό4 Т-клеточные эпитопы с убиквиторным вирусом гриппа или его убиквиторным вирусным антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации.
7. Способ вакцинации человека с нарушением иммунной системы или популяции, такой как взрослые с высоким риском или пожилые люди, иммуногенной композицией, содержащей убиквиторный вирус гриппа или его убиквиторный вирусный антигенный препарат и адъювант на основе эмульсии «масло в воде», как определено выше.
8. Способ ревакцинации людей, ранее вакцинированных убиквиторным вирусом гриппа или его убиквиторным вирусным антигенным препаратом и адъювантом на основе эмульсии «масло в воде», включающий введение указанному человеку иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа с адъювантом или без адъюванта.
9. Способ вакцинации человеческой популяции или индивида против одного штамма вируса гриппа с последующей ревакцинацией указанного человека или популяции против варианта штамма вируса гриппа, включающий введение указанному человеку:
(1) первой композиции, содержащей убиквиторный вирус гриппа или его убиквиторный вирусный антигенный препарат на основе первого штамма вируса гриппа и адъювант на основе эмульсии «масло в воде», и (2) второй иммуногенной композиции, содержащей вариант штамма вируса гриппа указанного первого штамма вируса гриппа.
10. Способ разработки противогриппозной вакцины, включающий:
1) выбор антигена вируса гриппа, содержащего ί.Ό4+ эпитопы, и
2) объединение указанного антигена вируса гриппа с эмульсией «масло в воде», как определено выше, где указанная вакцина после введения млекопитающему способна вызывать усиленный ί.Ό4 ответ у указанного млекопитающего.
В специфическом воплощении иммуногенная композиция дополнительно способна вызывать улучшенный ί.Ό4 Т-клеточный ответ и улучшенный ответ на основе В-клеток памяти по сравнению с получаемым при использовании антигена или антигенной композиции без адъюванта.
Во всех этих воплощениях указанный адъювант на основе эмульсии «масло в воде» подходящим образом содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, по меньшей мере 70% по интенсивности из которых имеют диаметры меньше 1 мкм.
Изобретение далее описано со ссылкой на следующие не ограничивающие его объем примеры.
Пример I описывает иммунологические способы считывания, используемые в исследованиях на мышах, хорьках и людях.
Пример II описывает приготовление и характеристику эмульсии «масло в воде» и адъювантных препаратов, используемых в примерах исследований.
Пример III описывает клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный вирусный антигенный препарат и адъювант Л803.
Пример IV описывает второе клиническое испытание - исследование ревакцинации - в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа и адъювант Л803.
Пример V демонстрирует преклиническую оценку адъювантной и неадъювантной противогриппозных вакцин у хорьков (исследование I и исследование II). Измеряли температуру, выделение вируса и СИ4 Т-клеточный ответ.
Пример VI демонстрирует преклиническую оценку адъювантной и неадъювантной противогриппозных вакцины у наивных и примированных мышей С57ВЕ6.
Пример VII демонстрирует преклиническую оценку адъювантной и неадъювантной убиквиторной и субъединичной противогриппозной вакцин у мышей С57ВЕ6, примированных гетерологическими штаммами.
Пример VIII описывает клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа, содержащий адъювант Л803, адъювант Л803+МФЛ, или отсутствие экзогенного адъюванта.
Пример IX демонстрирует преклиническую оценку адъювантной и неадъювантной противогриппозной вакцин у хорьков (исследование III). Измеряли температуру, выделение вируса и титры НГ
Пример X демонстрирует клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа, содержащий Л803 с адъювантом МФЛ или без него: данные по персистентности иммуногенности на 90- и 180 день.
- 18 011393
Пример ΧΙ демонстрирует клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа, содержащий А803 с адъювантом МФЛ.
Пример ΧΙΙ демонстрирует клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный вируса гриппа, содержащий А803 с адъювантом МФЛ в двух концентрациях.
Пример Ι. Способы иммунологического считывания.
Ι.Ι. Способы на мышах.
Ι.1.1. Тест ингибирования гемагглютинации.
Процедура теста.
Титры антител против гемагглютинина для трех штаммов вируса гриппа определяли с использованием теста ингибирования гемагглютинации (ΗΙ). Принцип ΗΙ теста основан на способности специфических антител к вирусу гриппа ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (КВС) цыплят гемагглютинином вируса гриппа (НА). Инактивированные теплом сыворотки крови предварительно обрабатывали каолином и КВС цыплят для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сывороток крови инкубировали с 4 единицами гемагглютинации для каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыплят и оценивали ингибирование агглютинации. Титры выражали как обратную величину наибольшего разведения сыворотки крови, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Поскольку первое разведение сыворотки крови составляло 1:20, необнаруживаемый уровень оценивали как титр, равный 10.
Статистический анализ/
Статистический анализ осуществляли на титрах ΗΙ после вакцинации с использованием ИМБТАТ. Протокол, применяемый для дисперсионного анализа, кратко может быть описан в соответствии со следующим:
логарифмическое преобразование данных;
тест Шапиро-Вилка для каждой популяции (группы) для подтверждения нормальности распределения групп;
тест Кокрана для подтверждения гомогенности дисперсии между различными популяциями (группами);
двусторонний дисперсионный анализ проводили в группах;
тест Тикеу Η8Ό для множественных сравнений.
Ι.1.2. Внутриклеточное окрашивание цитокинов.
Этот способ дает возможность для количественной оценки антигенспецифических Т-лимфоцитов на основе продукции цитокинов: эффекторные Т-клетки и/или эффекторные/памяти Т-клетки продуцируют ΙΡΝ-γ и/или центральные Т-клетки памяти продуцируют Ш-2. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) собирают на 7 день после иммунизации.
Лимфоидные клетки рестимулируют ίη-νίΐτο в присутствии ингибитора секреции (ВтеГе1бте).
Эти клетки затем обрабатывали при помощи обычного способа иммунофлуоресценции с использованием флуоресцирующих антител (СЭ4, СЭ8, ΙΡΝ-γ и Ш-2). Результаты выражены в виде частоты цитокинположительных клеток среди СО4/СО8 Т-клеток. Внутриклеточное окрашивание цитокинов в Т-клетах осуществляли на МКПК через 7 дней после второй иммунизации. Кровь собирали у мышей и объединяли в гепаринизированной среде ΚΡΜΙ+Абб. Для крови ΚΡΜΙ+Абб-разбавленные суспензии лимфоцитов периферической крови (ЛПК) наносили на градиент Ьутрйо1у1е-Матта1 в соответствии с рекомендуемым протоколом (центрифугирование в течение 20 мин при 2500 об./мин и комнатной температуре (к.т.)). Мононуклеарные клетки с границы раздела удаляли, дважды промывали ΚΡΜΙ+Абб и суспензии МКПК доводили до 2х 106 клеток/мл в ΚΡΜΙ 5% фетальной телячьей сыворотке.
Антигенную стимуляцию МКПК ίη-νίΐτο осуществляли с конечной концентрацией 1х107 клеток/мл (пробирка ΡАС8) с \У1ю1е ΡΙ (1 мкг НА/штамм) и затем инкубировали в течение 2 ч при 37°С с добавлением антител против СО28 и антител против СО496 (1 мкг/мл для обоих).
После стадии антигенной рестимуляции МКПК инкубируют в течение ночи при 37°С в присутствии ВгеГе1бш (1 мкг/мл) при 37°С для ингибирования цитокиновой секреции. Окрашивание ΙΡΝ-γ/ΙΓ-2/ί.Ό4/ί.Ό8 осуществляли в соответствии со следующим: клеточные суспензии промывали, ресуспендировали в 50 мкг ФБР 1% фетальной телячьей сыворотки (ΡΟ8), содержащей 2% Бе блокирующий реагент (1/50; 2.402). После инкубации в течение 10 мин при 4°С 50 мкл смеси антител против СЭ4 ΡΕ (2/50) и антител против ΟΌ8 добавляли регСр (3/50) и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. После промывки в ФБР 1% у ΡΟ8 клеток нарушали проницаемость мембраны путем ресуспендирования в 200 мкл СуфДх-СуФрегт (набор ВО) и инкубировали в течение 20 мин при 4°С. Клетки затем промывали Бегт \Уа511 (набор ВО) и ресуспендировали с 50 мкл смеси антител против ΙΡΝ-γ антигенпрезентирующих клеток (АБС) (1/50) + антител против Ш-2 флуоресцеин-изотиоцианат (ИТС) (1/50), разведенных в Гегт \Уа511. После инкубации, минимум в течение 2 ч, максимум в течение ночи при 4°С, клетки промывали Гегт \Уаз11 и ресуспендировали в ФБР 1% ΡΟ8 + 1% параформальдегид. Анализ образцов
- 19 011393 осуществляли при помощи флуоресцентного метода разделения клеток лимфоцитов (ЕАС8). Живые клетки собирали (Б8С/88С) и осуществляли считывание приблизительно на 20000 событиях (лимфоцитах) или 35000 событиях на СР4+Т-клетках. Процент ΙΡΝ-γ+ или 1Ь2+ рассчитывали в популяциях СР4+ и СР8+.
Ι.2. Способы на хорьках.
1.2.1. Тест ингибирования гемагглютинации (ΗΙ).
Процедура теста.
Титры антител против гемагглютинина для трех штаммов вируса гриппа определяли с использованием теста ингибирования гемагглютинации (ΗΙ). Принцип теста ΗΙ основан на способности специфических антител к вирусу гриппа ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (КВС) цыпленка гемагглютинином вируса гриппа (ΗΑ). Сыворотки крови сначала обрабатывали 25% раствором нейраминидазы (КРЕ) и инактивировали теплом для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратное разведение сыворотки крови инкубировали с 4 единицами гемагглютинации для каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыпленка и оценивали ингибирование агглютинации. Титры выражали как обратную величину наибольшего разведения сыворотки крови, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Поскольку первое разведение сыворотки крови составляло 1:20, не обнаруживаемый уровень оценивали как титр, равный 5.
Статистический анализ.
Статистический анализ осуществляли на титрах ΗΙ (день 41, перед контрольным заражением) с использованием υΝΙδΤΑΤ. Протокол, применяемый для анализа дисперсии, кратко может быть описан в соответствии со следующим:
логарифмическое преобразование данных;
тест Шапиро-Вилка для каждой популяции (группы) для подтверждения нормальности распределения групп;
тест Кокрана для подтверждения гомогенности дисперсии между различными популяциями (группами);
тест взаимодействия односторонний ΑΝΟνΑ;
тест Тикеу Η8Ρ для множественных сравнений.
Ι.2.2. Контроль температуры организма.
Индивидуальные температуры контролировали в течение периода контрольного заражения при помощи датчиков и при помощи телеметрической регистрации. Все имплантаты проверяли и обновляли и новую калибровку осуществляли путем Ρ8Ι (Ра!а 8с1епсек Iηίе^ηаί^οηа1, Сеп1аигик\\'ед 123, 5015 ТС ТИЬигд, Т1е №!Ъег1апйк) перед помещением во внутрибрюшинную полость. Во время этих измерений всех животных индивидуально содержали в отдельных клетках.
Температуры регистрировали каждые 15 мин в течение от 4 дней перед контрольным заражением до 7 дня после контрольного заражения.
Ι.2.3. Назальные смывы.
Назальные смывы осуществляли путем введения 5 мл ФБР в обе ноздри пришедших в сознание животных. Инокулят собирали в чашку Петри и помещали в контейнер для образца на сухом льду.
Титрование вируса в назальных смывах.
Все назальные образцы сначала подвергали стерильной фильтрации через фильтры 8рт X (С.ок1аг) для удаления каких-либо бактериальных примесей. 50 мкл серийных десятикратных разведений назальных промывок переносили в микротитрационные планшеты, содержащие 50 мкл среды (10 лунок/разведение). Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл клеток МРСК (2,4х105 клеток/мл) и инкубировали при 35°С в течение 5-7 дней.
После 5-7 дней инкубации культуральную среду осторожно удаляли и добавляли 100 мкл 1/20 ^8Т-1, содержащей среду, и инкубировали в течение еще 18 ч.
Интенсивность желтого формазанового окрашивания, продуцируемого после восстановления ^8Т-1 живыми клетками, пропорциональна количеству живых клеток, находящихся в лунке к концу анализа вирусного титрования, и количественно оценивали путем измерения абсорбции в каждой лунке при подходящей длине волны (450 нм). Отсечение определяют как среднюю оптическую плотность (ΟΡ) для неинфицированных контрольных клеток - 0,3 ΟΡ (0,3 ΟΡ соответствует +/- 3 Ст.Откл. ΟΡ для неинфицированных контрольных клеток). Положительную оценку определяют, когда ΟΡ меньше отсечения, и наоборот отрицательную оценку определяют, когда ΟΡ больше отсечения. Титр высвобожденных вирусов определяли путем Кеей апй МиепсЬ и выражали как Εο§ ТСГО50/мл.
Ι.3. Анализы для оценки иммунного ответа у людей.
Ι.3.1. Анализ ингибирования гемагглютинации.
Иммунный ответ определяли путем измерения ΗΙ антител с использованием способа, описанного \νΗΟ Сο11аЬο^аί^ηд Сеп!ге для вируса гриппа, Сеп!гек Γογ Р1кеаке СогИтоЕ 25 Αί^ΐΗ, υδΑ (1991).
Измерения титра антител осуществляли на замороженных образцах сыворотки крови, подвергнутых размораживанию, со стандартизированным и полностью признанным микрометодом с использованием
- 20 011393 единиц ингибирования гемагглютинации (4 НШ) соответствующих антигенов и 0,5% суспензией эритроцитов кур. Неспецифические ингибиторы сыворотки крови удаляли путем тепловой обработки и при помощи фермента, разрушающего рецептор.
Полученные сыворотки крови оценивали в отношении уровней ΗΙ антител. Начиная с исходного разведения 1:10, готовили серии разведений (с фактором 2) до конечного разведения 1:20480. Конечную точку титрования взяли в качестве наивысшей стадии разведения, что демонстрирует полное ингибирование (100%) гемагглютинации. Все анализы осуществляли в двух параллелях.
Ι.3.2. Анализ ингибирования нейраминидазы.
Анализ осуществляли в микротитрационных планшетах, покрытых фетуином. Готовили 2-кратные серии разведений антисывороток и смешивали со стандартизированным количеством вируса гриппа А Η3Ν2, Η1Ν1 или вирусом гриппа В. Тест основан на биологической активности нейраминидазы, которая ферментативно высвобождает нейраминовую кислоту из фетуина. После отщепления концевой нейраминовой кислоты в-О-галактоза-№ацетилгалактозамин демаскировали. В лунки добавляли меченный пероксидазой хрена (НКР) агглютинин арахиса из АгасЫк йуродаеа, который специфически связывается с галактозными структурами. Количество связавшегося агглютинина может быть обнаружено и количественно оценено в реакции субстрата с тетраметилбензидином (ТМВ). Наивысшее разведение антитела, которое все еще ингибирует активность вирусной нейраминидазы по меньшей мере на 50%, указано как титр ΝΙ.
Ι.3.3. Анализ нейтрализующего антитела.
Измерения нейтрализующего антитела осуществляли на замороженных образцах сыворотки крови, подвергнутых размораживанию. Нейтрализацию вируса антителами, содержащимися в сыворотке крови, определяли в анализе микронейтрализации. Сыворотки крови использовали без дополнительной обработки в анализе.
Каждый образец сыворотки крови тестировали в трех параллелях. Стандартизированное количество вируса смешивали с сериями разведений сыворотки крови и инкубировали для того, чтобы дать возможность для связывания антител с вирусом. Клеточную суспензию, содержащую определенное количество клеток МОСК, затем добавляли к смеси вируса и антител и инкубировали при 33°С. После периода инкубации репликацию вируса визуализировали путем гемагглютинации эритроцитов цыплят. 50% нейтрализующий титр сыворотки крови рассчитывали с использованием способа Кеей апй Миепсй.
Ι.3.4. Опосредованный клетками иммунитет оценивали путем цитокиновой проточной цитометрии (ЦПЦ).
Антигенспецифические СЭ4 и СЭ8 Т-клетки периферической крови могут быть рестимулированы ίη-νίΐΓο для продукции 1Ь-2, СП40Ь, ΓΝΡ-α и ΙΡΝ при инкубации с соответствующим антигеном. Затем антигенспецифические ί.Ό4 и СЭ8 Т-клетки могут быть подсчитаны путем проточной цитометрии после обычного иммунофлуоресцентного мечения клеточного фенотипа, а также внутриклеточной продукции цитокинов. В настоящем исследовании антиген противогриппозной вакцины, а также пептиды, полученные из специфического белка вируса гриппа, использовали как антиген для рестимуляции специфических в отношении вируса гриппа Т-клеток. Результаты выражены в виде частоты цитокин(ы)положительных ί.Ό4 или СЭ8 Т-клеток в СЭ4 или СЭ8 Т-клеточной субпопуляции.
Ι.3.5. Статистические способы.
Ι.3.5.1. Первичные конечные результаты.
Процент, интенсивность и взаимосвязь с вакцинацией вызванных локальных и общих сигналов и симптомов в течение 7-дневного последующего периода (т.е. день вакцинации и 6 последующих дней) после вакцинация.
Процент, интенсивность и взаимосвязь с вакцинацией вызванных локальных и общих сигналов и симптомов в течение 21 дневного последующего периода (т.е. день вакцинации и 20 последующих дней) после вакцинация.
Проявление серьезных отрицательных явлений в течение всего исследования.
Ι.3.5.2. Вторичные конечные результаты.
Для гуморального иммунного ответа.
Обнаруженные переменные:
на 0 и 21 день: сывороточные титры, ингибирующие гемагглютинацию (ΉΙ), и титры ΝΙ антител тестировали отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине (антитела против НШ1, антитела против Κ3Ν2 и антитела против В);
на 0 и 21 день: титры нейтрализующих антител тестировали отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине.
Переменные-производные (с 95% доверительными интервалами): среднегеометрические титры (ГСТ) сывороточных Ш антител с 95% доверительными интервалами (95% ДИ) до и после вакцинации;
уровни сероконверсии* с 95% ДИ на 21 день;
факторы превращения** с 95% ДИ на 21 день;
- 21 011393 серопротективные уровни*** с 95% ДИ на 21 день;
ГСТ сывороточного N1 антитела (с 95% доверительными интервалами) во все моменты времени;
*Уровень сероконверсии, определенный в виде процента вакцин, которые вызывали меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров Н1 на 21 день по сравнению с 0 днем для каждого вакцинного штамма.
**Фактор превращения, определенный как кратное увеличение ГСТ сывороточных Н1 на 21 день по сравнению с 0 днем для каждого вакцинного штамма.
***Уровень защиты, определенный в виде процента вакцин с сывороточным титром Н1 40 после вакцинации (для каждого вакцинного штамма), обычно принимаемым как показатель защиты.
Для опосредованного клетками иммунного (КОИ) ответа.
Обнаруженная переменная.
На 0 и 21 день: частота цитокин-положительных СБ4/СБ8 клеток на 106 клеток в различных тестах.
Каждый тест количественно оценивает ответ СБ4/СБ8 Т-клеток на пептидный антиген (рГ) вируса гриппа (точная природа и происхождение этих антигенов должны быть указаны/объяснены);
убиквиторный антиген (кГ) вируса гриппа;
полный антиген (\\Г) вируса гриппа.
Переменные-производные:
клетки, продуцирующие по меньшей мере два различных цитокина (СБ40Б, ГБ-2, ΙΡΝ-γ, ΤΝΡ-α);
клетки, продуцирующие по меньшей мере СБ40Б и другой цитокин (ГБ-2, ΤΝΕ-α, ΙΡΝ-γ); клетки, продуцирующие по меньшей мере 1Ь-2 и другой цитокин (СБ40Б, ΤΝΡ-α, ΙΡΝ-γ); клетки, продуцирующие по меньшей мере ΙΡΝ-γ и другой цитокин (1Ь-2, ΤΝΡ-α, СБ40Б); клетки, продуцирующие по меньшей мере ΤΝΡ-α и другой цитокин (1Ь-2, СБ40Б, ΙΡΝ-γ). Ι.3.5.3. Анализ иммуногенности.
Анализ иммуногенности основан на общей вакцинированной группе. Для каждой обрабатываемой группы рассчитывали следующие параметры (с 95% доверительными интервалами):
среднегеометрические титры (ГСТ) Ш и титры ΝΙ антител на 0 и 21 день;
среднегеометрические титры (ГСТ) нейтрализующих антител на 0 и 21 день;
фактор превращения на 21 день;
уровни сероконверсии (СК) на 21 день, определенные в виде процента вакцин, которые вызывают по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров Ш на 21 день по сравнению с 0 днем;
уровни защиты на 21 день, определенные в виде процента вакцин с сывороточным титром Ш 1:40;
частота СБ4/СБ8 Т-лимфоцитов, секретируемых в ответ, суммировали (описательная статистика) для каждой вакцинируемой группы в каждый момент времени (день 0, день 21) и для каждого антигена (пептид вируса гриппа (рГ), убиквиторный вирус гриппа (кГ) и полный вирус гриппа (\уГ));
описательная статистика индивидуальных различий между ответами в момент времени (после-до) для каждой вакцинируемой группы и каждый антиген (рГ, кГ, и \уГ) для каждого из 5 различных тестов;
непараметрический тест (тест Крушкалла-Валлиса) использовали для сравнения различий по расположению между 3 группами, и статистическое р-значение рассчитывали для каждого антигена в каждом из 5 различных тестов. Все тесты значимости были двусторонними. Р-значения меньше или равные 0,05 рассматривали как статистически значимые.
Пример ΙΙ. Приготовление и характеристика эмульсии «масло в воде» и адъювантных препаратов.
Если не указано иначе, эмульсия «масло в воде», используемая в последующих примерах, состоит из органической фазы, приготовленной из 2 масел (альфа-токоферол и сквален), и водной фазы ФБР, содержащего Иуееп 80 в качестве эмульгатора. Если не указано иначе, готовили препараты с эмульсией «масло в воде» в качестве адъюванта, используемые в последующих примерах, содержащие следующий компонент эмульсии масло в воде (приведены конечные концентрации): 2,5% сквален (об./об.), 2,5% альфа-токоферол (об./об.), 0,9% полиоксиэтиленсорбитана моноолеат (об./об.) (Ъуееп 80), см. XVО 95/17210. Эту эмульсию, обозначенную А803 в последующих примерах, готовили в соответствии со следующим в виде двукратного концентрата.
ΙΙ.1. Приготовление эмульсии 8В62.
ΙΙ.1.1. Приготовление в лабораторном масштабе.
Ъуееп 80 растворяют в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (ФБР), с получением 2% раствора в ФБР. Для получения 100 мл эмульсии с двукратной конентрацией 5 г ББ альфатокоферола и 5 мл сквалена смешивают на вортексе для тщательного перемешивания. Добавляют 90 мл раствора ФБР/Иуееп и тщательно смешивают. Получающуюся в результате эмульсию затем пропускают через шприц и в заключение микроожижают с использованием аппарата для микроожижения М1108. Получающиеся в результате капли масла имеют размер приблизительно 120-180 нм (выраженный как средняя Ζ величина, измеренная при помощи ФКС). В эмульсию при простом смешивании добавляют другие адъюванты/антигенные компоненты.
- 22 011393
ΙΙ.1.2. Масштабируемое приготовление.
Приготовление эмульсии 8В62 осуществляют путем смешивания при сильном встряхивании масляной фазы, состоящей из гидрофобных компонентов (α-токоферол и сквален), и одной фазы, содержащей водорастворимые компоненты (Тетееп 80 и ФБР-модиф. (модифицированный), рН 6,8). При перемешивании масляную фазу (1/10 общего объема) переводят в водную фазу (9/10 общего объема) и смесь перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Получающуюся в результате смесь затем подергают воздействию усилий сдвига, ударных и кавитации в камере для взаимодействия микроожижителя (103,421х106 Па (15000 фунт/кв.дюйм) - 8 циклов) с получением субмикронных капель (распределение от 100 до 200 нм). Получающийся в результате рН составляет 6,8 ±0,1. Эмульсию 8В62 затем стерилизуют путем фильтрации через мембрану 0,22 мкм и стерильную партию эмульсии хранят охлажденной в контейнерах Сирас при 2-8°С. Стерильный инертный газ (азот или аргон) продувают в мертвый объем контейнера с окончательной партией эмульсии 8В62 в течение по меньшей мере 15 с. Конечная композиция эмульсии 8В62 является следующей:
Т\уееп 80: 1,8% (об./об.) 19,4 мг/мл;
Сквален: 5% (об./об.) 42,8 мг/мл;
α-токоферол: 5% (об./об.) 47,5 мг/мл;
ФБР-модиф.: №1С1 121 мМ, КС1 2,38 мМ, №2НРО4 7,14 мМ, КН2РО4 1,3 мМ;
рН 6,8±0,1.
ΙΙ.2. Измерение размера капель масла путем динамического светорассеяния.
ΙΙ.2.1. Введение.
Размер диаметра капель масла определяют в соответствии со следующем способом и в следующих экспериментальных условиях. Измерение размера капель приведено как измерение интенсивности и выражено в виде средней ζ величины, измеренной путем ФКС.
ΙΙ.2.2. Приготовление образца.
Измерения размера осуществляют в адъюванте на основе эмульсии «масло в воде»: 8В62, приготовленной в соответствии с масштабируемым способом, А803 и А803+МФЛ (50 мкг/мл), последние два готовят непосредственно перед применением. Композиция образцов приведена ниже (см. раздел ΙΙ.2.4). Образцы разбавляли 4000х-8000х в ФБР 7,4. В качестве контроля стандарты размера частиц РБ-№поса1 100 нм (кат. № 6011-1015) разбавляли в 10 мМ №С1.
ΙΙ.2.3. Измерения размера с использованием Ма1уегп Ζеίа5^ζе^ 3000Н8
Все измерения размера осуществляли с использованием Макет Ζеΐа5^ζе^ 3000Н8. Образцы измеряли в пластиковой кювете для анализа Макет при подходящем разбавлении (обычно при разбавлении 4000Х-20000Х в зависимости от концентрации образца) и с двумя оптическими моделями:
реальный показатель преломления частиц 0 и мнимый показатель преломления частиц 0 или реальный показатель преломления частиц 1,5 и мнимый показатель преломления частиц 0,01 (адаптированная оптическая модель для эмульсии в соответствии со значениями, обнаруженными в литературе).
Технические условия:
длина волны лазерного излучения: 532 нм Ще1а3000Н8);
мощность лазера: 50 мВт Ще1а3000Н8);
детекция рассеянного света при 90° Ще1а3000Н8);
температура: 25°С;
длительность: автоматическое определение при помощи программного обеспечения; количество: 3 последовательных измерения;
средний ζ-диаметр: путем кумулятивного анализа;
распределение частиц: при помощи способа СопЦп или автоматического способа.
В автоматическом алгоритме Макет используют комбинацию кумулятивных значений, алгоритмы СопЦп и алгоритмы неотрицательных наименьших квадратов (НОНК).
Распределение интенсивности может быть преобразовано в объемное распределение благодаря теории М1е.
- 23 011393
ΙΙ.2.4. Результаты (см. табл. 2).
Кумулятивный анализ (средний /-диаметр(СУ.Д)).
Таблица 2
Образец Разбавл ение Регистрация Интенсивность имульсов сгд Полидисперсность
5В62 5000 1 7987 153 0,06
2 7520 153 0,06
3 6586 152 0,07
среднее 7364 153 0,06
8В62 (Пример IV) 8000 1 8640 151 0,03
2 8656 151 0,00
3 8634 150 0,00
среднее 8643 151 0,01
8В62+МФЛ 25 мкг 8000 1 8720 154 0,03
О 2 8659 151 0,03
3 8710 152 0,02
среднее 8697 152 0,02
(*)Готовили в соответствии со следующим: Вода для инъекций, ФБР 10х концентрированный, 250 мкл эмульсии 8В62 и 25 мкг МФЛ вместе смешивают с достижением конечного объема 280 мкл.
Средний ζ-диаметр (С/Д) оценивают по количеству света, рассеянного частицами каждого из размеров в образце. Это значение связано с мономодальным анализом образца и в основном используется для задач воспроизводимости.
Интенсивность импульсов (ИИ) представляет собой меру рассеянного света: он соответствует тысячам фотонов в секунду.
Индекс полидисперсности (Ро1у) представляет собой ширину распределения. Он представляет собой безразмерную величину ширины распределения.
Анализ Сопйи и автоматический анализ.
Готовили два других препарата 8В62 (Ά803 с двукратной концентрацией) и оценивали в соответствии со способом, разъясненным выше со следующими минорными модификациями.
Образцы измеряли в пластиковой кювете для анализа Ма1уеги с двумя разведениями, определенными для получения оптимальных значений интенсивности импульсов: 10000х и 20000х для /еЧа^ег 3000И8, те же самые оптические модели, что и использованные в вышеприведенном примере.
Результаты представлены в табл. 3.
Таблица 3
8В62 Разведе ние Показатель преломления(ПП) Анализ Οοηίΐπ (среднее в нм) Автоматический анализ (среднее в нм)
Реальный Мнимый Интенсивность Объем Интенсивность Объем
1022 1/10000 0 0 149 167 150 -
1,5 0,01 158 139 155 143
1/20000 0 0 159 200 155 196
1,5 0,01 161 141 147 -
1023 1/10000 0 0 158 198 155 -
1,5 0,01 161 140 150 144
1/20000 0 0 154 185 151 182
1,5 0,01 160 133 154 -
- полученные значения не были связанными.
Схематическое представление этих результатов представлено на фиг. 1 для препарата 1023. Как можно видеть, подавляющее большинство частиц (например, по меньшей мере 80%) имеют диаметр меньше чем 300 нм по интенсивности.
ΙΙ.2.5. Общее заключение.
Препарат 8В62 измеряли с различными разведениями с использованием аппарата Ма1уеги /еЧа^ег 3000И8 и двух оптических моделей. Размер частиц С/Д (т.е. среднее значение интенсивности в соответ
- 24 011393 ствии с кумулятивным анализом) в препаратах, оцененных выше, составлял приблизительно 150-155 нм.
Когда использовали кумулятивный алгоритм, авторы изобретения обнаружили отсутствие влияния разбавления на С2Д и полидисперсность.
ΙΙ.3. Приготовление А803, содержащей МФЛ.
ΙΙ.3.1. Приготовление жидкой суспензии МФЛ.
Жидкую партию МФЛ (МФЛ, используемый в данном изобретении, представляет собой сокращение 3Э-МФЛ. т.е. 3-О-деацилированный монофосфориллипид А) готовили из лиофилизированного порошка МРЬ®. Жидкая партия МФЛ представляет собой стабильную концентрированную (приблизительно 1 мг/мл) водную дисперсию неочищенного материала, который готов для приготовления препарата вакцины или адъюванта. Схематическое представление способа приготовления представлено на фиг. 2.
Для максимального размера партии 12 г приготовление жидкой партии МФЛ осуществляют в стерильных стеклянных контейнерах. Дисперсия МФЛ состоит из следующих стадий:
суспендируют порошок МФЛ в воде для инъекции разрушают какие-либо крупные агрегаты путем нагревания (термическая обработка);
уменьшают размер частиц до 100-200 нм путем микроожижения;
предварительно фильтруют препарат на префильтре 8айос1еап, 0,8/0,65 мкм;
подвергают препарат стерильной фильтрации при комнатной температуре (8аг1оЬгап Р, 0,22 мкм).
Порошок МФЛ лиофилизируют путем микроожижения, что приводит в результате к стабильной коллоидной водной дисперсии (размер частиц МФЛ меньше чем 200 нм). Лиофилизированный порошок МФЛ диспергируют в воде для инъекции с получением грубой суспензии 10 мг/мл. Суспензия затем претерпевает температурную обработку при перемешивании. После охлаждения до комнатной температуры способ микроожижения начинают для уменьшения размера частиц.
Микроожижение осуществляют с использованием аппрата МюгоПшбюк М110ЕН путем непрерывной циркуляции дисперсии через камеру взаимодействия микроожижителя при определенном давлении при минимальном количестве пропусканий (количество циклов: пмин). Длительность микроожижения, представляющая количество циклов, рассчитывают на основе измеренной скорости потока и объема дисперсии. На заданном оборудовании при заданном давлении получающаяся в результате скорость потока может варьировать от одной камеры взаимодействия к другой и в течение жизненного цикла конкретной камеры взаимодействия. В настоящем примере используемая камера взаимодействия имеет тип Ε20Υ М1сгоЛи1Шск. Поскольку эффективность микроожижения связана с парой давление, скорость потока, время обработки может варьировать от одной партии к другой. Время, требующееся для 1 цикла, рассчитывают на основе скорости потока. Под скоростью потока рассматривают скорость потока, измеренную с водой для инъекции непосредственно перед введением МФЛ в аппарат. Один цикл определяют как время (в минутах), необходимое для однократного пропускания общего объема МФЛ через аппарат. Время, необходимое для получения п циклов рассчитывают в соответствии со следующим:
η х количество МФЛ для обработки (мл)/скорость потока (мл/мин)/
Таким образом, соответственно адаптируют количество циклов. Минимальное количество циклов для проведения (пмин) описано для предпочтительного оборудования и используемых камер взаимодействия. Общее количество циклов для проведения определяют по результату измерения размера частиц, проведенному после п,^ циклов. Предел размера частиц (блим) определяют на основе исторических данных. Измерение осуществляют при помощи способа фотонно-корреляционной спектроскопии (ФКС) и блим выражают как одномодальный результат (2среднее). При таком ограничении микроожижение может быть остановлено после пмин циклов. Выше этого предела микроожижение продолжают до получения удовлетворительного уменьшения размера частиц, максимально еще для 50 циклов.
Если фильтрация не осуществляется непосредственно сразу после микроожижения, диспергированный МФЛ хранят при 2-8°С, ожидая переноса в область фильтрации.
После микроожижения дисперсию разбавляют водой для инъекции и подвергают стерильной фильтрации через фильтр 0,22 мкм при плоском потоке. Конечная концентрация МФЛ составляет 1 мг/мл (0,80-1,20 мг/мл).
ΙΙ.3.2. Приготовление вакцины с А803+МФЛ в качестве адъюванта: подход с 1 виалой.
К препарату адъюванта А803 добавляют МФЛ в конечной концентрации от 10 до 50 мкг на дозу вакцины.
10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 при однократной концентрации), а также смесь 8В62, содержащую Тетееп, Тгйоп Х-100 и УЕ8 (сукцинат витамина Е), добавляют к воде для инъекции. Количества принимают во внимание детергент, представленный в штаммах вируса гриппа для того, чтобы достичь целевую конечную концентрацию 750 мкг/мл Тетееп 80, 110 мкг/мл Тгйоп Х-100 и 100 мкг/мл УЕ8. После перемешивания в течение 5 мин добавляют по 15 мкг каждого интересующего штамма вируса гриппа (например, штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и В в классической тривалентной вакцине). После перемешивания в течение 15 мин добавляют 250 мкл эмульсии 8В62 и затем 25 или 50 мкг МФЛ.
- 25 011393
Схематическое представление способа приготовления приведено на фиг. 3. Конечная композиция А803, содержащая МФЛ, на дозу для человека приведена в табл. 4.
Таблица 4
Ингредиенты Концентрация На дозу для человека
Название Компонент Количество Другие
8В62 Сквален (раствор 43 мг/мл) Токоферол (раствор 48 мг/мл) Ъл/ееп 80 (раствор 20 мг/мл) 781 мкл/мл 250 мкл 10,68 мг 11,86 мг 4,85 мг
МФЛ** (раствор 1 мг/мл) 78 мкг /мл или 156 мкг/мл 25 мкг или 50 мкг
ФБР-модиф.* №С1 КС1 №2НРО4 КН2РО4 137 мМ 2,7 мМ 8,1 мМ 1,47 мМ 2.56 мг 0.064 мг 0.368 мг 0.064 мг
Вода для инъекций До 320 мкл
РН 6,8+/-0,1
*ФБР-модиф. в 10х концентрации рН 6,8 = ΚΗ2ΡΟ4, №2ΗΡΟ4, №С1, КС1-11С1. **МФЛ составляет 25 или 50 мкг на дозу.
ΙΙ.3.3. Приготовление вакцины с А803+МФЛ в качестве адъюванта: подход с 2 виалами.
Тот же самый препарат может быть приготовлен в подходе с 2 виалами путем смешивания антигена или антигенного препарата в 2х концентрации с адъювантом А803 (8В62 250 мкл) или А803+МФЛ (8В62 250 мкл+25 мкг или 50 мкг МФЛ). В этом случае это осуществляют в соответствии со следующим. Приготовление А825-адъювантной противогриппозной вакцины состоит из трех основных стадий.
1) Приготовление тривалентной конечной партии (2х концентрация) без адъюванта и заполнение в антигенный контейнер.
2) Приготовление адъюванта А803+МФЛ.
3) Растворение А803+МФЛ убиквиторной адъювантной вирусной вакцины непосредственно перед применением.
1) Приготовление тривалентной конечной партии без адъюванта и заполнение в антигенный контейнер.
Объемы трех одновалентных партий основаны на содержании ΗА, измеренном для каждой моновалентной партии перед приготовлением, и с целевым объемом 1100 мл. Концентрированный физиологический раствор, забуференный фосфатом, и предварительную смесь Тмееп 80, ТгЬоп Х-100 и α-токоферилгидросукцината разбавляют в воде для инъекции. Три концентрированные монопартии (Λ'№\ν Са1ебоша, АХл Уогк, В/Папдзи) затем последовательно разбавляют в получающемся в результате физиологическом растворе, забуференном фосфатом.Тмееп 80-Тп1оп Χ-100-αтокоферилгидросукцинатный раствор (рН 7,4,137 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 8,1 мМ №211ΡΟ.|, 1,47 мМ ΚΗ2ΡΟ4, 990 мкг/мл Тмееп 80, 150 мкг/мл Тп1оп Х-100 и 130 мкг/мл α-токоферилгидросукцинат) для получения конечной концентрации 39,47 мкг ΗΆ А штаммов (Η1Ν1, Η3Ν2) на 1 мл тривалентной конечной партии (15 мкг ΗА/А штамм/380 мкл тривалентной конечной партии) и 46 мкг ΗА В штамма (17,5 мкг ΗА/В штамм/380 мкл тривалентной конечной партии). Между добавлениями каждой одновалентной партии смесь перемешивают в течение 10-30 мин при комнатной температуре. После добавления последней моновалентной партии и перемешивания в течение 15-30 мин рН контролируют и доводят до 7,2±0,2 с ΗΟ1 или ΝηΟΗ.
Тривалентную конечную партию антигенов асептически заполняют в 3-мл стерильные стеклянные виалы I типа (РЬ. Еиг.). Каждая виала содержит объем 470 мкл (380 мкл+90 мкл переполнение).
2) Приготовление партии адъюванта А803/МФЛ и заполнение в адъювантный контейнер.
Адъювант А803/МФЛ получают путем смешивания двух компонентов: эмульсия 8В62 (способ в разделе П.1.2) и МФЛ (способ в разделе П.3.1). ФБР-модиф. в однократной концентрации (приготовленный путем разведения 10х концентрированного ФБР-модиф. в воде для инъекции) с партией 8В62 и жидкой партией МФЛ в концентрации 1 мг/мл. Концентрацию МФЛ определяют таким образом, чтобы достичь конечного содержания от 10 до 50 мкг, подходящим образом приблизительно 25 мкг на конечную
- 26 011393 дозу вакцины для человека. Смесь перемешивают в течение 5-30 мин при комнатной температуре и рН доводят до 6,8±0,1 с использованием ΝΑ0Η (0,05 или 0,5 М)/НС1 (0,03 или 0,3 М). После другого перемешивания в течение 5-30 мин при комнатной температуре смесь стерилизуют путем фильтрации через мембрану 0,22 мкм. Продувание стерильным инертным газом (азотом) осуществляют с получением инертного головного пространства в заполненных контейнерах в течение минимум 1 мин. Стерильный адъювант А803+МФЛ хранят при 2-8°С до асептического заполнения в 1,25-мл стерильные стеклянные шприцы I типа (Р11. Еиг.). Каждый шприц содержит средний объем 80 мкл (320 мкл+80 мкл переполнение).
В момент инъекции содержимое предварительно заполненного шприца, содержащего адъювант, инъецируют в виалу, содержащую концентрированные тривалентные инактивированные убиквиторные антигены вириона. После смешивания содержимое отбирают в шприц и иглу заменяют на иглу для внутримышечного введения. Одна доза разведенной противогриппозной вакцины-кандидата с адъювантом А825 соответствует 0,7 мл.
П.4. Приготовление иммуногенных композиций, содержащих антиген вируса гриппа и возможно МФЛ в препарате эмульсии «масло в воде».
К эмульсии БВ62 по П.1 добавляли равный объем дважды концентрированного убиквиторного антигена вируса гриппа (Е1иапх™) (15 мкг НА на штамм) и перемешивали. Его комбинировали, когда подходит, с 50 мкг/мл МФЛ с получением конечного препарата.
Пример III. Клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа и адъювант А803 (Ехр1о-Е1и-001).
Открытое рандомизированное исследование I фазы проводили в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет в 2003 году для оценки реактогенности и иммуногенности противогриппозных вакцин-кандидатов С1ахо8тИйК1те Вю1одюак, содержащих адъювант А803. Гуморальный иммунный ответ (т.е. антитела против гемагглютинина, титры нейтрализующих антител и антител против нейраминидазы) и опосредованный клетками иммунный ответ (ί.Ό4 и/или СЭ8 Т-клеточные ответы) измеряли через 21 день после внутримышечного введения одной дозы А803 адъювантной вакцины или №V вакцины. Е1иаг1х™ использовали в качестве эталона.
Ш.1. План исследования.
Три группы субъектов в параллели внутримышечно получали следующую вакцину:
одна группа из 50 субъектов получала одну дозу восстановленной и адъювантной противогриппозной вакцины (Е1иА803);
одна группа из 50 субъектов получала одну дозу противогриппозной вакцины на основе полного вируса (Е1и№УУ);
одна группа из 50 субъектов получала одну дозу Ииапх™ (Е1иапх) = контрольная схема вакцинации: одна инъекция противогриппозной вакцины на 0 день, отбор образца крови, анализ считывания на 21 день (определение ΗΣ антитела, определение ΝΊ антитела, определение нейтрализующих антител и КОИ анализ) и завершение исследования.
Стандартная тривалентная убиквиторная противогриппозная вакцина Ииапх™, используемая в этом исследовании, представляет собой имеющуюся в продаже вакцину, с 2003 года разработанную и производимую С1ахо8тЦ111<1те Вю1ощсаЕ.
Ш.2. Вакцинная композиция и введение (табл. 5).
Ш.2.1. Вакцинный препарат.
Противогриппозная вакцина с адъювантом А803.
Кандидат противогриппозной вакцины с адъювантом А803 представляет собой 2-компонентную вакцину, состоящую из концентрированных тривалентных инактивированных убиквиторных антигенов вириона, представленных в стеклянной виале I типа (335 мкл) (антигенный контейнер), и из предварительно заполненного стеклянного шприца I типа, содержащего эмульсию 8В62 (335 мкл) (адъювантный контейнер). В момент инъекции содержимое антигенного контейнера удаляют при помощи шприца, предварительно заполненного эмульсией 8В62. с последующим осторожным смешиванием содержимого шприца. Смешивание эмульсии 8В62 с вакцинными антигенами разбавляет адъювант А803. Перед инъекцией используемую иглу заменяют на внутримышечную иглу и объем корректируют до 500 мкл.
Одна доза восстановленной противогриппозной вакцины с адъювантом.
А803 соответствует 0,5 мл, содержит 15 мкг НА каждого штамма вируса гриппа как в зарегистрированной вакцине Е1иапх™/а-К1х® и содержит 10,68 мг сквалена, 11,86 мг ΌΕ-α-токоферола и 4,85 мг полисорбата 80 (Т\гееп 80).
Приготовление.
Приготовление противогриппозной вакцины с адъювантом А803 состоит из трех основных стадий.
1) Приготовление тривалентной конечной партии без адъюванта и заполнение антигенного контейнера.
Объемы трех одновалентных партий основаны на содержании НА, измеренном в каждой одновалентной партии перед приготовлением и при целевом объеме 800 мл.
- 27 011393
Концентрированный физиологический раствор, забуференный фосфатом, и предварительно приготовленную смесь Т\гееп 80, Тгйоп Х-100 и α-токоферилгидросукцината разбавляют в воде для инъекции. Три концентрированных моноштамма (штамм Λ/№\ν Са1ебоша-, штамм А/Рапата- и штамм В/8йап§боп§-) затем последовательно разбавляют в получающемся в результате физиологическом растворе, забуференном фосфатом/Т\гееп 80-ТгИоп Х-100-раствор α-токоферилгидросукцината (рН 7,4, 137 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 8,1 мМ ^БРОд, 1,47 мМ ΚΗ2ΡΟ4, 1500 мкг/мл Т^ееп 80, 220 мкг/мл Тгйоп Х-100 и 200 мкг/мл α-токоферилгидросукцината) для получения конечной концентрации 60 мкг ΗА А штаммов на 1 мл тривалентной конечной партии (15 мкг ΗА/А штамм/250 мкл тривалентной конечной партии) и 70 мкг ΗА В штамма (17,5 мкг ΗА/В штамма/250 мкг тривалентной конечной партии). Между добавлениями каждой одновалентной партии смесь перемешивают в течение 10 мин при комнатной температуре. После добавления последней одновалентной партии и перемешивания в течение 15 мин рН контролируют и доводят до 7,2±0,1 с использованием ΗΟ1 или №011.
Тривалентную конечную партию антигенов асептически заполняют в 3-мл стерильные стеклянные виалы I типа. Каждая виала содержит 34% объемный избыток (общий объем 335 мкл).
2) Приготовление стерильной партии эмульсии 8В62 и заполнение в адъювантный контейнер.
Водная фаза: при перемешивании 902 мл Т\гееп 80 смешивают с 44105 мл ФБР-модиф. буфера (рН 6,8 после доведения с использованием ΗΟ1).
Масляная фаза: при перемешивании 2550 мл сквалена добавляют к 2550 мл α-токоферола.
Смешивание водной и масляной фаз: при перемешивании 5000 мл масляной фазы (1/10 общего объема) переносят в 45007 мл водной фазы (9/10 общего объема). Смесь перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре.
Эмульгация: получающуюся в результате смесь подергают воздействию усилий сдвига, ударных и кавитации в камере для взаимодействия микроожижителя (103,421 х 106 Па (15000 фунт/кв.дюйм) - 8 циклов) с получением субмикронных капель (распределение от 100 до 200 нм). Получающийся в результате рН составляет 6,8±0,1.
Стерильная фильтрация: эмульсию 8В62 стерилизуют путем фильтрации через мембрану 0,22 мкм и стерильную партию эмульсии хранят охлажденной в контейнерах Сирас при 2-8°С. Стерильный инертный газ (азот или аргон) продувают в мертвый объем контейнера с окончательной партией эмульсии 8В62 в течение по меньшей мере 15 с.
Все указанные количества ингредиентов приведены для препарата 50 л эмульсии и указаны в объемах. На практике количества взвешены, принимая во внимание плотности ингредиентов. Плотность ФБР рассматривают равной 1. Конечная композиция эмульсии 8В62 является следующей.
Таблица 5
Т\л/ееп 80: 1,8% 19,4 мг/мл
Сквален: 5% (об./об.) 42,8 мг/мл
альфа-токоферол: 5% (об./об.) 47,5 мг/мл
ФБР-модиф.:
№С1 121 мМ
КС1 2,38 мМ
Ν32ΗΡΟ4 7,14 мМ
КН2РО4 1,3 мМ
рН 6,8 ±0,1
Стерильную партию эмульсии 8В62 затем асептически заполняют в 1,25-мл стерильные стеклянные шприцы I типа. Каждый шприц содержит 34% излишек объема (общий объем 335 мкл).
3) Восстановление убиквиторной вирусной вакцины с адъювантом А803 непосредственно перед применением.
В момент инъекции содержимое виалы, содержащей концентрированные тривалентные инактивированные убиквиторные антигены вириона, удаляют из виалы при помощи шприца, содержащего эмульсию 8В 62, с последующим осторожным смешиванием содержимого шприца. Смешивание эмульсии 8В62 с вакцинными антигенами разбавляет адъювант А803.
- 28 011393
ΙΙΙ.2.2. Вакцинная композиция (табл. 6) и введение
Таблица 6
Вакцина Состав Группа
Ниапх™ НА из 3 штаммов вируса гриппа (общее НА = 45 мкг) • Α/Νβνν Са1ес1огна/20/99 (ΐνΚ-116):15 мкг • А/Рапата/2007/99 (ΚΕδνΐΚ-17): 15 мкг • В/8папдс1опд/7/97:15 мкг Содержание тиомерсала: 5 мкг В предварительно заполненных шприцах по 0,5 мл Пиапх
νννν НА из 3 штаммов вируса гриппа (общее НА = 45 мкг) • Α/Νβνν Са1ес!оп1а/20/99 (ММ 16): 15 мкг • А/Рапата/2007/99 (ΚΕ8νΐΚ-17): 15 мкг • В/8Ьапдс1опд/7/97:15 мкг Содержание тиомерсала: 5 мкг В виалах по 0,5 мл ΕΙιΜΛ/ν
Пиапх + А803 НА из 3 штаммов вируса гриппа (общее НА = 45 мкг) • Α/Νβνν Са1ес!оп1а/20/99 (ММ 16): 15 мкг • А/Рапата/2007/99 (КЕ8У1ГМ7): 15 мкг • В/8Ьапдбопд/7/97:15 мкг Содержание тиомерсала: 5 мкг В виалах по 0,335 мл (с 2 кратной концентрацией) + шприц (0,335 мл), содержащий эмульсию «масло в воде» 8В62 (масштабируемый препарат) Пи-А803
Вакцины вводили внутримышечно в дельтовидную область недоминантной руки. За вакцинами наблюдали сразу в течение по меньшей мере 30 мин, с подходящей медицинской обработкой, легкодоступной в случае редкой анафилактической реакции после введения вакцины.
ΙΙΙ.3. Результаты исследования на популяции.
В общей сложности 148 субъектов были вовлечены в это исследование: 49 субъектов в группе Р1иА803, 49 субъектов в группе Р1иаг1х и 50 субъектов в группе Р1иАУУ. Средний возраст общей вакцинированной группы в момент вакцинации составлял 71,8 лет со стандартным отклонением 6,0 лет. Распределение среднего возраста и пола для субъектов в трех группах вакцин было похожим.
ΙΙΙ.4. Заключения по безопасности.
Введение противогриппозной вакцины с адъювантом А803 является безопасным и клинически хорошо переносится в исследуемой популяции, т.е. пожилых людей в возрасте больше 65 лет.
ΙΙ1.5. Результаты иммуногенности.
Анализ иммуногенности осуществляли в общей вакцинированной группе.
ΙΙΙ.5.1. Гуморальный иммунный ответ.
Для оценки гуморального иммунного ответа, вызванного вакциной с адъювантом А803, следующие параметры (с 95% доверительными интервалами) рассчитывали для каждой обрабатываемой группы: среднегеометрические титры (ГСТ) ΗΙ и титры ΝΙ антитела на 0 и 21 день;
среднегеометрические титры (ГСТ) нейтрализующих антител на 0 и 21 день;
уровни сероконверсии (СК) на 21 день, определенные в виде процента вакцин, которые вызывают по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров ΗΙ на 21 день по сравнению с 0 днем;
факторы превращения на 21 день, определенные в виде кратного увеличения сывороточных ГСТ ΗΙ на 21 день по сравнению с 0 днем для каждого вакцинного штамма;
уровни защиты на 21 день, определенные в виде процента вакцин с сывороточным титром ΗΙ 1:40.
ΙΙΙ.5.1.1 Ответ в виде антител против гемагглютинина.
а) Среднегеометрические титры (ГСТ) ΗΙ.
ГСТ для ΗΙ антител с 95% ДИ представлены в табл. 7 (ГСТ для антитела против ΗΙ). ГСТ антител в момент перед вакцинацией для всех вакцинных штаммов находился в том же самом диапазоне для трех групп. После вакцинации уровни антител против гемагглютинина значительно увеличивались. После вакцинации существовала тенденция более высоких ГСТ ΗΙ антитела для всех трех вакцинных штаммов в группах Р1иА803 и Р1иаг1х, хотя имелось некоторое перекрывание 95% ДИ между группой Р1иаг1х и группой Ι'ΊιιΑνν.
- 29 011393
Таблица 7
Антитело Группа Время N ГСТ
значение 95% ДИ
НП ВП
Α/Νβνν Са1ес1огпа ПиАбОЗ Пре 49 25,6 17,3 37,9
Еиапх ПВ (21 день) 49 317,7 219,1 460,7
Πυνννν Пре 49 26,3 18,1 38,4
ПВ (21 день) 49 358,5 244,2 526,4
Пре 50 19,7 13,6 28,6
ПВ (21 день) 50 138,2 90,3 211,7
А/Рапата ПиАЗОЗ Пре 49 52,3 35,4 77,4
Еиапх ПВ (21 день) 49 366,1 264,5 506,6
Πυνννν Пре 49 40,9 28,1 59,5
ПВ (21 день) 49 296,0 205,4 426,6
Пре 50 25,8 18,0 37,1
ПВ (21 день) 50 165,6 116,0 236,5
В/ ЗНапдбопд ПиАЗОЗ Пре 49 27,5 19,0 39,8
Еиапх ПВ (21 день) 49 317,7 226,9 444,9
Πυνννν Пре 49 26,0 17,2 39,2
ПВ (21 день) 49 270,0 187,0 389,7
Пре 50 32,0 20,8 49,3
ПВ (21 день) 50 195,6 135,2 282,9
N = количество субъектов, для которых имеются результаты; 95% ДИ = 95% доверительный интервал;
НП = нижний предел;
ВП = верхний предел;
МИН/МАКС = минимальный/максимальный;
Пре = перед вакцинацией на 0 день;
ПВ (21 день) = после вакцинации на 21 день.
б) Факторы превращения титров антител против Н1, серопротективные уровни и уровни сероконверсии (коррелируют с защитой у человека).
Результаты представлены в табл. 8.
Факторы превращения представляют кратное увеличение сывороточных ГСТ Н1 для каждого вакцинного штамма на 21 день по сравнению с 0 днем. Фактор превращения варьирует от 6,1 до 13,6 в соответствии с штаммом вируса и вакциной. Этот фактор превращения значительно превышает 2-кратное увеличение ГСТ, которое требуется европейскими регулирующими органами. Серопротективные уровни представляют долю субъектов, имеющих сывороточный титр Н1 540 на 21 день. В начале исследования половина субъектов (диапазон 34,0-69,4%) во всех группах имела защитные уровни антител для всех штаммов на 21 день, серопротективные уровни в трех группах находились в диапазоне от 88,0 до 100% для различных штаммов вируса. В терминах защиты это означает, что более чем 88% субъектов имеет сывороточный титр Н1 не менее 40 после вакцинации и полагают, что они защищены против трех штаммов. Этот уровень значительно превосходит серопротективный уровень 60%, требующийся для популяции в возрасте не менее 60 лет европейскими регулирующими органами.
Уровни сероконверсии представляют долю субъектов, имеющих по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров Н1 на 21 день по сравнению с 0 днем. Общие уровни ответа для трех штаммов были, по существу, эквивалентами для трех групп. Для того чтобы рассматриваться как эффективная и в соответствии с Евросоюзом, вакцина должна индуцировать уровень сероконверсии больше 30% в популяции людей в возрасте 60 лет. В этом исследовании уровень сероконверсии был больше чем 50% для трех групп.
- 30 011393
Таблица 8
Серопротективный уровень Уровень сероконверсии Фактор конверсии
ЕС стандарт (больше 60 лет) больше 60% больше 30% больше 2,0
Штаммы Группа N % [95%ДИ] % [95%ДИ] ΘΜΚ [95%ДИ]
А/ Νθνν Са1ес1оп1а Пи А803 49 98,0 [89,1-99,9] 69,4 [54,6-81,7] 12,4 [7,3-21,0]
Ниапх 49 98,0 [89,1-99,9] 69,4(54,6-81,7] 13,6 [8,0-23,2]
Ни \ЛЛЛ/ 50 88,0 [75,7-95,5] 52,0 [37,4-66,3] 7,0 [4,0-12,2]
А/ Рапата Ни А803 49 100,0 [92,7-100,0] 55,1 [40,2-69,3] 7,0 [4,2-11,6]
Ниапх 49 91,8 [80,4-97,7] 65,3 [50,4-78,3] 7,2 [4,7-11,3]
Ни УЛЛ/ 50 90,0 [78,2-96,7] 56,0 [41,3-70,0] 6,4 [3,9-10,4]
В/ зЬапдс1опд Ни А803 49 100,0 [92,7-100,0] 73,5(58,9-85,1] 11,6 [7,2-18,6]
Ниапх 49 95,9 [86,0-99,5] 69,4 [54,6-81,7] 10,4 [6,5-16,5]
Ни νννν 50 90,0 [78,2-96,7] 50,0 [35,5-64,5] 6,1 [3,6-10,3]
Ν = общее количество субъектов.
Заключение.
После вакцинации существовала тенденция в более высоких ГСТ антитела ΗΙ для всех трех вакцинных штаммов в группах Ρ14Α803 и Р1иапх, хотя существовало некоторое перекрывание 95% ДИ между группой Е1иаг1х и группой Ии^УУ.
Фактор превращения варьирует от 6,1 до 13,6 в соответствии с штаммом вируса и вакциной. Этот фактор превращения значительно превосходит 2-кратное увеличение ГСТ, требующееся европейскими регулирующими органами.
На 21 день серопротективные уровни в трех группах находятся в диапазоне от 88,0 до 100% для различных штаммов вируса. Этот уровень значительно превышает серопротективный уровень 60%, требующийся для популяции людей в возрасте больше 60 лет европейскими регулирующими органами.
В этом исследовании уровень сероконверсии превышал 50% для трех групп.
Общие уровни ответа для трех штаммов были, по существу, равны в трех группах.
III. 5.1.2 Титры нейтрализующих антител.
Для того чтобы более хорошо характеризовать иммунный ответ на вакцинацию противогриппозной вакциной у пожилых людей, оценивали ответы в виде сывороточных антител на нейтрализующие антигены. Результаты представлены в табл. 9 (серопротективные уровни и среднегеометрические титры (ГСТ) для антител против нейтрализующих антигенов) и табл. 10 (уровни сероконверсии для антител против нейтрализующих антигенов на 21 день после вакцинации (кратное увеличение = 4)).
Титры нейтрализующих антител против трех штаммов вируса гриппа измеряли в образцах сыворотки крови до и после иммунизации. Определяли следующие параметры:
среднегеометрические титры (ГСТ) сывороточных нейтрализующих антител с 95% доверительными интервалами (95% ДИ) до и после вакцинации;
уровни сероконверсии с 95% ДИ на 21 день, определенные в виде процента вакцин, вызывающих по меньшей мере 4-кратное увеличение титров ΗΙ на 21 день по сравнению 0 днем для каждого вакцинного штамма.
- 31 011393
Таблица 9
Антитело Группа Время N Не меньше 181/011. гст
η % 95% ди Велич ина 95% ДИ
НП ВП НП ВП
Α/ΝΕνν_ΟΑΙ_ΕΟΟΝίΑ 1 Пре 49 46 93,9 83,1 98,7 106,6 77,6 146,6
П В(21 день) 49 49 100,0 92,7 100,0 870,2 608,5 1244,3
2 Пре 49 48 98,0 89,1 99,9 115,6 89,4 149,5
ПВ(21 день) 49 49 100,0 92,7 100,0 955,8 649,5 1406,5
3 Пре 50 46 92,0 80,8 97,8 87,7 63,6 120,8
ПВ(21 день) 50 50 100,0 92,9 100,0 375,4 271,2 519,6
Α/ΡΑΝΑΜΑ 1 Пре 49 49 100,0 92,7 100,0 724,7 558,0 941,1
ПВ(21 день) 49 49 100,0 92,7 100,0 2012,8 1438,4 2816,5
2 Пре 49 49 100,0 92,7 100,0 727,8 556,1 952,6
ПВ(21 день) 49 49 100,0 92,7 100,0 1597,7 1128,8 2261,5
3 Пре 50 50 100,0 92,9 100,0 512,0 409,3 640,6
ПВ(21 день) 50 50 100,0 92,9 100,0 977,8 738,2 1295,0
Β/3ΗΑΝ0ϋ0Ν3 1 Пре 49 29 59,2 44,2 73,0 25,6 18,8 35,0
ПВ(21 день) 49 48 98,0 89,1 99,9 222,5 148,1 334,2
2 Пре 49 27 55,1 40,2 69,3 29,3 20,1 42,7
Β/3ΗΑΝΟϋΟΝΟ ПВ(21 день) 49 49 100,0 92,7 100,0 190,4 127,6 284,3
3 Пре 50 31 62,0 47,2 75,3 33,4 23,1 48,4
ПВ(21 день) 50 46 92,0 80,8 97,8 117,8 82,6 168,0
Группа 1: Г1и вакцина смесь Адъювант 2х конц. Г1и уас.
Группа 2: Г1и вакцина Г1и вакцина.
Группа 3: Г1и вакцина НиАУУ вакцина.
N = количество субъектов, для которых имеются результаты.
п/% = количество/процент субъектов, имеющих титр в указанном диапазоне. 95% ДИ = 95% доверительный интервал.
НП = нижний предел; ВП = верхний предел.
Пре = перед вакцинацией на 0 день.
ПВ (21 день) = после вакцинации на 21 день.
Таблица 10
Антитело Группа N Респонд енты
η % 95% ДИ
НП ВП
Α/Νβνν Са1ес1оп1а 1 49 29 59,2 44,2 73,0
2 49 30 61,2 46,2 74,8
3 50 21 42,0 28,2 56,8
А/Рапата 1 49 12 24,5 13,3 38,9
2 49 9 18,4 8,8 32,0
3 50 9 18,0 8,6 31,4
В/ЗЬапддопд 1 49 29 59,2 44,2 73,0
2 49 26 53,1 38,3 67,5
3 50 19 38,0 24,7 52,8
Группа 1: Г1и вакцина (ОГГи58А16) смесь адъювант (Э621024А8) 2х конц. Г1и уас.
Группа 2: Г1и вакцина (18854В9) Г1и вакцина.
Группа 3: Г1и вакцина (ОГГи59А2) НиАУУ вакцина.
N = количество субъектов, для которых имеются результаты до и после вакцинации. п = количество респондентов.
% = доля респондентов (п\х 100).
95% ДИ = точно 95% доверительный интервал.
НП = нижний предел; ВП = верхний предел.
- 32 011393
Основные результаты.
Для трех вакцин на 21 день серопротективный уровень 100% получен для обоих А штаммов. Для В штамма серопротективные уровни в трех группах находились в диапазоне от 92 до 100%.
После вакцинации существует значительное увеличение ГСТ для всех штаммов в трех группах. Тем не менее, существует тенденция более высоких ГСТ нейтрализующего антитела для всех трех вакцинных штаммов в группах Р1иА803 и Р1иапх по сравнению с Р1иДУУ, хотя существует некоторое перекрывание 95% ДИ между группой Р1иапх и группой Р1иДУУ.
Для уровней сероконверсии общие уровни ответа для трех штаммов были, по существу, эквивалентны для трех групп.
Во всех группах результаты согласовывались с результатами, полученными в анализе, проведенном для антител против гемагглютинина.
ΙΙΙ.5.1.3 Титры антител против нейраминидазы (ΝΑ).
Для более хорошей характеристики иммунного ответа на вакцинацию противогриппозной вакциной в популяции пожилых людей оценивали ответ в виде сывороточных антител на нейраминидазные антигены. Аналогично титру антитела ΗΙ определяли следующие окончательные результаты:
ГСТ (принимая во внимание антилогарифм среднего значения логарифмических преобразований титра);
уровень сероконверсии определяли как процент вакцин, вызывающих по меньшей мере 4-кратное увеличение титров ΗΙ на 21 день по сравнению с 0 днем для каждого вакцинного штамма.
ГСТ и уровни сероконверсии для антител ΝΙ с 95% ДИ представлены в табл. 11 (ГСТ антитела против ΝΑ) и табл. 12 (уровни сероконверсии ΝΑ после вакцинации (21 день) (4-кратное увеличение)).
Таблица 11
Антитело Группа Время N ГСТ 95%ДИ
НП ВП
Α/Νβνν Са1ес1оп1а Е|иА803 Пре 49 77,8 61,8 97,9
ПВ(21 день) 48 270,0 212,9 342,3
Яиапх Пре 49 77,8 64,6 93,6
ПВ(21 день) 49 249,1 190,0 326,5
Εΐω/ννν Пре 50 66,8 53,8 83,0
ПВ(21 день) 50 159,2 122,8 206,4
А/Рапата ЯиАЗОЗ Пре 49 33,3 28,5 48,7
ПВ(21 день) 48 156,8 124,8 196,9
Яиапх Пре 49 34,2 25,6 45,8
ПВ(21 день) 49 133,7 100,9 177,3
Яи\ЛЛЛ/ Пре 50 24,6 18,7 32,4
ПВ(21 день) 49 78,9 59,4 104,7
В/8папдс1опд ЯиАЗОЗ Пре 49 46,7 36,5 59,9
ПВ(21 день) 49 204,2 156,4 266,7
Яиапх Пре 49 46,1 35,3 60,1
ПВ(21 день) 49 133,7 100,9 177,3
Яи\ЛЛЛ/ Пре 50 48,6 36,4 64,7
ПВ(21 день) 49 128,2 101,7 161,6
Р1иА803: Р1и вакцина (ΌΡΕϋ58Α16) смесь с адъювантом А803 (Ό621024Α8).
Р1иапх: Р1и вакцина (18854В9).
Р1иДУУ: Р1иДУУ вакцина (ПРЬи59А2).
Пре = перед вакцинацией.
ПВ (21 день)= 21 день после вакцинации.
95% ДИ, НП и ВП = 95% доверительный интервал, нижний и верхний предел.
- 33 011393
Таблица 12
Антитело Группа N Респонденты
η % 95% ДИ
НП ВП
Α/Νβνν Са1ес1оп1а ЯиАЗОЗ 48 25 52.1 37.2 66.7
Пиапх 49 24 49.0 34.4 63.7
Γΐιινννν 49 18 36.7 23.4 51.7
А/Рапата ЯиАбОЗ 48 27 56.3 41.2 70.5
Пиапх 49 23 46.9 32.5 61.7
ΡΙυνννν 49 21 42.9 28.8 57.8
В/8Ьапдс1опд ЯиАЗОЗ 48 26 54.2 39.2 68.6
Пиапх 49 23 46.9 32.5 61.7
ЯиУУХЛ/ 49 16 32.7 19.9 47.5
Г1иА803: Г1и вакцина (рГЬи58А16) смесь с адъювантом А803 (Ό621024Α8).
Г1иапх: Г1и вакцина (18854В9).
Г1и№УУ: Г1и№УУ вакцина (ПГЬи59А2).
Ν = количество субъектов, для которых имеются результаты до и после вакцинации.
η = количество респондентов.
% = доля респондентов (η/Νχ100).
95% ДИ = точно 95% доверительный интервал. НП = нижний предел; ВП = верхний предел.
Основные результаты.
Более высокое значение ГСТ и уровни сероконверсии обнаружены для гемагглютинина по сравнению с нейраминидазой.
ГСТ антител до вакцинации для всех вакцинных штаммов находились в том же самом диапазоне в трех группах. После вакцинации значительно увеличивались уровни антитела против нейраминидазы. Как для титров антитела Ю, после вакцинации существовала тенденция более высоких ГСТ антитела НТ для всех трех вакцинных штаммов в группах Р1иА803 и Р1иапх, хотя существовало некоторое перекрывание 95% ДИ между группой Р1иапх и группой НРЛУУУ.
В отношении уровней сероконверсии общие уровни ответов для трех штаммов были, по существу, эквивалентными для трех групп и для трех штаммов.
Полученные авторами изобретения результаты демонстрируют, что у здоровых пожилых людей, вакцинированных в этом исследовании против вируса гриппа, развивался хороший ответ в виде антител на нейраминидазные антигены независимо от противогриппозной вакцины. Тем не менее, ответ на нейраминидазный антиген был меньше по сравнению с ответом на гемагглютининовый антиген.
ΙΙΙ.5.2. Клеточный иммунный ответ.
Антигенспецифические С1)4 и С1)8 Т-клетки периферической крови могут быть рестимулированы ΐπ-νΐΤτο для продукции ΙΡ-2, СП40Р, ΊΝΓ-α и ΙΡΝ-γ, если их инкубировать с соответствующим антигеном.
Следовательно, антигенспецифические С1)4 и С1)8 Т-клетки могут быть посчитаны путем проточной цитометрии после обычного иммунофлуоресцентного мечения клеточного фенотипа, а также продукции внутриклеточных цитокинов. В настоящем исследовании антиген противогриппозной вакцины, а также пептиды, являющиеся производными специфического белка вируса гриппа, использовали в качестве антигена для рестимуляции специфических в отношении вируса гриппа Т-клеток. Результаты представлены для С1)4 и С1)8 Т-клеточного ответа в табл. 13-18.
- 34 011393
Таблица 13
Антигенспецифические С1)4 Т-клеточные ответы, выраженные в клетках, продуцирующих по меньшей мере два различных цитокина:
Описательная статистика для Пре и После для С^40^/I^2/ΊNГ-α/IГN-γ (общая вакцинированная , группа)
Секреция Антиген гр Время N Среднее СО Мин
Пептид вируса 1 0 День 44 33,50 139,026 1,00
гриппа 1 21 День 45 58,40 132,664 1,00
2 0 День 42 92,10 368,790 1,00
2 21 День 44 88,36 272,528 1,00
3 0 День 45 80,13 284,316 1,00
3 21 День 47 91,40 382,967 1,00
Убиквиторный 1 0 День 47 1901,66 1596,203 102,00
ΟΟ40Ι-/ΙΙ-2/ΙΕΝ вирус гриппа 1 21 День 48 6163,75 4265,900 773,00
γ/ΤΝΕα в С04 2 0 День 45 2151,04 2622,594 265,00
2 21 День 49 4150,73 3712,469 328,00
3 0 День 48 1678,44 916,329 142,00
3 21 День 50 3374,60 1920,194 449,00
Полный вирус 1 0 День 48 3134,33 2568,369 507,00
гриппа 1 21 День 47 9332,04 6875,403 1482,00
2 0 День 47 -3050,85 2654,936 486,00
2 21 День 49 6760,31 6788,258 1852,00
3 0 День 48 2955,33 2019,233 473,00
3 21 День 50 5681,40 4530,321 635,00
Секреция Антиген Сг Время 01 Медиана ОЗ Макс. Тест Кру шкала -Валлиса (Рзначение)
Пептид вируса 1 0 День 1,00 1,00 4,00 915,00 0,7631
гриппа 1 21 День 1,00 1,00 56,00 733,00
2 0 День 1,00 1,00 54,00 2393,00
2 21 День 1,00 1,00 69,50 1740,00
3 ОДень 1,00 1,00 65,00 1908,00
3 21 День 1,00 1,00 63,00 2615,00
Убиквиторный 1 ОДень 957,00 1560,00 2408,00 9514,00 0,0002
СС)40и ΙΙ_2/ вирус гриппа 1 21 День 3468,00 4908,00 7624,00 21324,00
ΙΡΝγ/ΤΝΕα в 2 0 День 930,00 1381,00 2274,00 16289,00
004 2 21 День 2247,00 3036,00 4744,00 21924,00
3 ОДень 1086,00 1502,00 2189,00 3899,00
3 21 День 2312,00 3040,00 4437,00 10431,00
Полный вирус 1 0 День 1730,00 2298,50 3876,00 15066,00 0,0040
гриппа 1 21 День 4091,00 6523,00 14045,00 29251,00
2 0 День 1190,00 2031,00 4161,00 11994,00
2 21 День 3573,00 4621,00 7234,00 40173,00
3 0 День 1421,50 2668,50 3411,50 10578,00
3 21 День 2459,00 4315,00 7303,00 22053,00
Группа 1: Г1иА803: Г1и вакцина Г1иапх™ смешанная с адъювантом А803.
Группа 2: Г1иапх: Г1и вакцина Г1иапх™.
Группа 3: Ии^УУ: Ии^УУ вакцина.
СО = стандартное отклонение.
Мин, Макс = минимальный, максимальный.
С)1 = первая квартиль; 03 = третья квартиль.
Ν= количество субъектов, для которых имеются результаты.
Р-значение: Тест Крушкалла-Валлиса (непараметрический способ) для тестирования различия (ранговый суммарный тест Вилкоксона) для 3 групп на 21 день.
- 35 011393
Таблица 14
Антигенспецифические СО4 Т-клеточные ответы, выраженные в клетках, продуцирующих по меньшей мере два различных цитокина:
Описательная статистика по различию между Пре и После (общая вакцинированная группа)
Секреция Антиген Группа 01 Медиана 03 Макс. Р-значение
Пептид вируса 1 0,00 0,00 37,50 430,00 0,0765
гриппа 2 -15,00 0,00 26,00 514,00
3 -37,00 0,00 0,00 212,00
0040ί/ΙΕΝ-
γ/ΤΝΕ-α в Убиквиторный 1 1888,00 3396,00 6634,00 19555,00 <0,0001
С 04 вирус гриппа 2 699,00 1490,00 2573,00 15169,00
3 466,00 1183,50 2186,50 7851,00
Полный вирус 1 2170,00 4009,00 11681,00 25570,00 0,0003
гриппа 2 1246,00 2382,00 3992,00 33801,00
3 503,00 1382,50 3300,50 19337,00
Пептид вируса 1 -106,00 0,00 81,00 655,00 0,0932
гриппа 2 -58,00 13,00 202,00 703,00
3 -160,50 0,00 53,00 567,00
Οϋ40υΐΡΝ- Убиквиторный 1 -122,00 35,50 221,00 1387,00 0,2121
γ/ΤΝΕ-α в вирус гриппа 2 -64,50 0,00 160,50 1252,00
СЦ8 3 -99,00 0,00 76,00 1060,00
Полный вирус 1 -420,00 49,00 591,00 5045,00 0,0851
гриппа 2 -1016,00 -263,50 180,00 3743,00
3 -651,00 -86,50 180,00 1011,00
Таблица 15 Антигенспецифические С1)4 Т-клеточные ответы, выраженные в клетках, продуцирующих по меньшей мере СП40Г и другой цитокин: Описательная статистика по различию между Пре и После (общая вакцинированная группа)
Секреция Антиген Группа N Среднее СО Мин
СО401. в СЦ4 Пептид вируса 1 44 10,09 153,007 -815,00
гриппа 2 42 -29,40 316,983 -1921,00
3 45 -43,73 251,146 -1629,00
Убиквиторный 1 46 4266,20 4470,807 -8093,00
вирус гриппа 2 45 2026,42 3511,508 -11482,0
3 47 1512,34 1576,133 -494,00
Полный вирус 1 47 6071,96 7118,132 -11691,0
гриппа 2 47 3764,64 5740,762 -2114,00
3 48 2544,27 3959,879 -4390,00
СО40Ь в СЦ8 Пептид вируса 1 44 -19,41 81,675 -370,00
гриппа 2 41 -3,98 100,998 -399,00
3 45 -5,56 64,666 -181,00
Убиквиторный 1 43 39,53 190,122 -438,00
вирус гриппа 2 44 27,61 91,173 -155,00
3 45 30,18 191,326 -291,00
Полный вирус 1 41 -91,24 617,077 -1779,00
гриппа 2 44 -115,91 588,424 -2583,00
3 45 -150,89 367,300 -1239,00
- 36 011393
Секреция Антиген Г руппа 01 Медиана ОЗ Макс. Р-значение
СБ40Ь в СБ4 Пептид вируса 1 0,00 0,00 36,50 428,00 0,1233
гриппа 2 -8,00 0,00 27,00 494,00
3 -35,00 0,00 3,00 230,00
Убиквиторный 1 1799,00 3156,50 6647,00 19480,00 <0,0001
вирус гриппа 2 783,00 1485,00 2546,00 15021,00
3 469,00 1107,00 2035,00 7687,00
Полный вирус 1 2109,00 4048,00 11472,00 25448,00 0,0004
гриппа 2 1212,00 2509,00 3957,00 33428,00
3 523,00 1392,00 3261,50 19478,00
СЭ40Б в СБ8 Пептид вируса 1 -2,00 0,00 0,50 100,00 0,9721
гриппа 2 -28,00 0,00 24,00 231,00
3 -13,00 0,00 3,00 176,00
Убиквиторный 1 -35,00 0,00 140,00 608,00 0,6175
вирус гриппа 2 -18,50 0,00 77,50 326,00
3 -9,00 0,00 28,00 1188,00
Полный вирус 1 -142,00 -8,00 175,00 2087,00 0,3178
гриппа 2 -195,50 -34,50 150,00 1258,00
3 -270,00 -103,00 88,00 588,00
Таблица 16
Антигенспецифические С1)4 Τ-клеточные ответы, выраженные в клетках, продуцирующих по меньшей мере ΙΡΝ-γ и другой цитокин: Описательная статистика по различию между Пре и После (общая вакцинированная группа)
Секреция Антиген Группа N N пропусков Среднее СО Мин.
ΙΕΝγ в СБ4 Пептид вируса 1 44 5 7,50 64,539 -171,00
гриппа 2 42 7 -30,67 277,984 -1766,00
3 45 5 -27,91 103,403 -639,00
Убиквиторный 1 46 3 2712,87 2905,629 -4394,00
вирус гриппа 2 45 4 1148,56 2526,536 -10586,0
3 47 3 871,00 1016,251 -764,00
Полный вирус 1 47 2 4240,09 4811,891 -8272,00
гриппа 2 47 2 2445,38 4030,694 -3018,00
3 48 2 1535,48 2456,915 -3670,00
ΙΕΝγ в СБ8 Пептид вируса 1 44 5 7,75 146,412 -226,00
гриппа 2 41 8 10,68 176,026 -420,00
3 44 6 -49,80 217,214 -699,00
Убиквиторный 1 43 6 138,58 365,565 -470,00
вирус гриппа 2 44 5 -112,82 793,746 -4919,00
3 44 6 29,91 238,157 -708,00
Полный вирус 1 41 8 6,66 1642,577 -5610,00
гриппа 2 44 5 -471,55 1792,348 -9586,00
3 44 6 -189,05 685,291 -1879,00
Секреция Антиген Группа 01 Медиана аз Макс. Р-значение
ΙΕΝγ в СБ4 Пептид -9,50 0,00 7,50 265,00 0,1541
вируса гриппа 2 -5,00 0,00 24,00 222,00
3 -20,00 0,00 0,00 51,00
Убиквиторны 1 1273,00 1644,00 4057,00 13296,00 <0,0001
й вирус 2 405,00 931,00 1757,00 9426,00
гриппа 3 283,00 ι 624,00 1114,00 5031,00
Полный вирус 1 1610,00 : 2693,00 7437,00 17489,00 <0,0001
гриппа 2 723,00 1487,00 2983,00 21594,00
3 232,50 : 810,00 2218,50 11319,00
ΙΕΝγ в СБ8 Пептид 1 -52,50 ι 0,00 40,00 615,00 0,3322
вируса гриппа 2 -1,00 ι 0,00 72,00 610,00
3 -172,00 ι 0,00 90,50 424,00
Убиквиторны 1 -46,00 ‘ 42,00 294,00 1549,00 0,1257
й вирус 2 -62,00 ( 3,00 74,00 1028,00
гриппа 3 -59,50 : 26,50 123,00 643,00
Полный вирус 1 -385,00 131,00 450,00 5068,00 0,1179
гриппа 2 -955,50 -221,00 177,00 3492,00
3 -476,50 -36,50 198,00 1299,00
- 37 011393
Таблица 17
Антигенспецифические С1)4 Т-клеточные ответы, выраженные в клетках, продуцирующих по меньшей мере ΙΕ2 и другой цитокин:
Описательная статистика по различию между Пре и После (общая вакцинированная группа)
Секреция Антиген Г руппа N Среднее СО Мин
Пептид вируса 1 44 2,82 118,164 -595,00
гриппа 2 42 0,90 84,255 -167,00
3 45 -28,62 191,709 -1222,00
Убиквиторный 1 46 3456,15 3853,960 -7009,00
11_2 в СР4 вирус гриппа 2 45 1738,29 2406,045 -451,00
3 47 1210,02 1361,705 -634,00
Полный вирус 1 47 4839,02 5978,277 -9178,00
гриппа 2 47 2891,00 4493,387 -1370,00
3 48 2042,50 3123,912 -3179,00
Пептид вируса 1 42 -30,60 219,777 -630,00
гриппа 2 41 38,85 210,715 -674,00
3 45 -44,80 197,026 -526,00
Убиквиторный 1 41 54,85 250,817 -336,00
11_2 в СР8 вирус гриппа 2 44 -2,36 423,957 -2272,00
3 45 -26,07 244,870 -1004,00
Полный вирус 1 39 56,21 406,262 -704,00
гриппа 2 44 -151,02 822,384 -4304,00
3 45 -63,56 359,699 -1036,00
Секреция Антиген Г руппа 01 Медиана ОЗ Макс Р-значение
Пептид вируса 1 -1,50 0,00 31,50 324,00 0,0806
гриппа 2 -34,00 0,00 2,00 362,00
3 -19,00 0,00 0,00 253,00
Убиквиторный 1 1309,00 2598,50 5926,00 16988,00 <0,0001
!Ь2 в С04 вирус гриппа 2 453,00 1113,00 2049,00 12273,00
3 331,00 806,00 1596,00 6474,00
Полный гриппа вирус 1 2 3 1516,00 995,00 371,50 3341,00 1942,00 1083,50 8955,00 3007,00 2624,50 21032,00 26358,00 14057,00 0,0006
Пептид вируса 1 -111,00 0,00 103,00 412,00 0,1684
гриппа 2 -41,00 0,00 138,00 542,00
3 -150,00 -34,00 71,00 447,00
Убиквиторный 1 -76,00 26,00 133,00 803,00 0,2311
Н_2 в СО8 вирус гриппа 2 -78,50 0,00 121,50 1064,00
3 -93,00 -1,00 30,00 705,00
Полный вирус 1 -167,00 63,00 261,00 1302,00 0,4586
гриппа 2 -444,50 -4,00 199,00 1398,00
3 -198,00 9,00 131,00 838,00
- 38 011393
Таблица 18
Антигенспецифические С1)4 Т-клеточные ответы, выраженные в клетках, продуцирующих по меньшей мере ΊΝΡ-α и другой цитокин:
Описательная статистика по различию между Пре и После (общая вакцинированная группа)
Среднее
Секреция
Антиген
Г руппа
Пептид гриппа
Убиквиторныи вирус гриппа
Полный гриппа
Пептид гриппа
Убиквиторныи вирус гриппа
Полный
-4450,00
-14260,0 гриппа
Секреция Антиген Группа 01 Медиана ОЗ Мах Р-значение
Пептид вируса 1 -1,50 0,00 39,00 239,00 0,1836
гриппа 2 -4,00 0,00 12,00 277,00
3 -26,00 0,00 5,00 53,00
Убиквиторныи 1 862,00 1466,50 3931,00 9267,00 <0,0001
ΤΝΕ-α в вирус гриппа 2 251,00 698,00 1229,00 12275,00
СО4 3 191,00 540,00 1010,00 3288,00
Полный вирус 1 868,00 1607,00 5266,00 17199,00 0,0008
гриппа 2 367,00 871,00 1584,00 23540,00
3 175,00 592,00 1385,50 8760,00
Пептид вируса 1 -80,00 0,50 70,00 772,00 0,2759
гриппа 2 -81,00 0,00 155,00 791,00
3 -179,00 0,00 39,50 566,00
Убиквиторныи 1 -23,00 60,00 178,00 1468,00 0,0790
ΤΝΡ-α в вирус гриппа 2 -107,00 0,00 158,00 1286,00
С08 3 -185,00 0,00 78,50 1021,00
Полный вирус 1 -250,00 108,00 399,00 4601,00 0,1482
гриппа 2 -392,00 -56,50 205,00 3258,00
3 -233,50 -54,00 160,00 1543,00
Результаты также выражены в виде частоты цитокинположительных С1)4 или С1)8 Т-клеток в субпопуляции С1)4 или СБ8 Т-клеток и представлены на фиг. 4 и 5.
В похожем анализе перекрестно-реактивный С1)4 Т-клеточный ответ оценивали с использованием антигена вируса гриппа из дрейфующих штаммов (А/НШ1/Веут§/262/95 (Η1Ν1ά), А/Ι Ι3Ν2/8νώκ'\75/97 (Η3Ν2ά), В/¥ашапа§Ш/166/98 (Вф) или дрейфующих штаммов (А/8т§ароге/1/57 (Η2Ν2),
А/Нопдкопд/1073/99 (Η9Ν2)). Результаты, выраженные в виде частоты цитокинположительных СΌ4 Т-клеток, представлены на фиг. 6.
Основные сведения.
Вакцинация Р1иапх или полным вирусом слегка усиливает С 1)4 Т-клеточный ответ. Вакцинация Р1иА803 вызывает сильный С1)4 Т-клеточный ответ (фиг. 4), что является статистически значимым. То же самое заключение получено после стимуляция т-уИго убиквиторным антигеном или полным вирусом и это получено со всеми исследованными цитокинами (1Б-2, ΙΡΝ-γ, Т№-а и СБ40Ь).
Большая часть индивидов имела СБ8 Т-клеточный ответ против полного Г1и, тем не менее, вакцинация не оказывала измеряемого воздействия на СБ8 Т-клеточный ответ (т.е. Перед = После) независимо от исследуемой группы (фиг. 5).
Вакцинация только Р1иапх вызывает низкие уровни перекрестно-реактивного С 1)4 Т-клеточного ответа (фиг. 6). Вакцинация Р1иА803 вызывает сильный С1)4 Т-клеточный ответ против дрейфующих штаммов вируса гриппа и это является статистически значимым (фиг. 6). Небольшой ответ обаружен
- 39 011393 против дрейфующих штаммов.
Ш.5.3. В-клетки памяти в анализе ЕШ8Р0Т.
Ш.5.3.1. Задача.
Для более хорошей характеристики КОИ ответа, вызванного А803-адъювантной противогриппозной вакциной, ответ в виде В-клеток в анализе Е11§ро1, вызванный для дифференцировки на клетки плазмы крови ΐη-νΐΐΐΌ с использованием штаммов противогриппозной вакцины или антител против человеческого иммуноглобулина, оценивали для регистрации плазмы крови, секретирующей антитела против вируса гриппа или секретирующей ^О. Результаты описаны в табл. 19 и 20 и на фиг. 7.
Подмножество из 22 первых субъектов, получающих одну дозу вакцины НиА803 и из 21 первого субъекта, получающего одну дозу вакцины Ииапх, отбирали для оценки влияния вакцинации на специфические в отношении вируса гриппа В-клетки памяти с использованием способа Е11§ро1 для В-клеток памяти. Определяли следующие конечные результаты:
на 0 и 21 день: Специфические в отношении вируса гриппа В-клетки памяти измеряли при помощи Е11§ро1 для всех субъектов. Результаты выражены в виде частоты клеток, образующих антитела, специфических в отношении вируса гриппа, на миллион (106) клеток, образующих антитела;
различие между вакцинацией после (21 день) и до (0 день) также выражено в виде частоты клеток, образующих антитела, специфические в отношении вируса гриппа, на миллион (106) клеток, образующих антитела.
Ш.5.3.2. Статистические способы.
Описательная статистика для каждой вакцинированной группы на 0 день и 21 день, выраженная в виде частоты клеток, образующих антитела, специфические в отношении вируса гриппа, на миллион (106) клеток, образующих антитела. Описательная статистика по индивидуальному различию на 21 день и 0 день (После-Перед) в виде частоты клеток, образующих антитела, специфические в отношении вируса гриппа, на миллион (106) клеток, образующих антитела.
Тест Вилкоксона использовали для сравнения различий между двумя группами и статистическое р-значение рассчитывали для каждого из 3 штаммов (АЛе\у Са1еТоша, А/Рапата и В/8йапдТопд).
Ш.5.3.3. Результаты.
Существует тенденция в пользу противогриппозной вакцины с адъювантом А803 по сравнению с группой Ииапх. Для штамма А/\е\х Са1еТоша существует статистически значимое различие (р-значение =0,021) в пользу НиА803 по сравнению с Ииапх. Для двух групп для штаммов А/Рапата и В/8йапдТопд не обнаружено статистически значимое различие.
Таблица 19
В-клетки памяти: описательная статистика для Пре (0 день) и После (21 день) и логически выведенная статистика для После (21 день) частоты антиген-плазмы крови в 106 ^О-продуцирующих клетках плазмы крови (подгруппа субъектов)
ШТАММ
Α/ΝΕνν
ΟΑΙ_ΕΟΟΝΙΑ
Α/ΡΑΝΑΜΑ
Β/δΗΑΝϋΟΝΟ
Г руппа
Ϊ
Время 0 День 21 День 0 День 21 День 0 День 21 День 0 День 21 День 0 День 21 День 0 День 21 День
Среднее
9751,58
22001,65
9193,61
12263,08
18066,69
4860,41
13872,95
3722,80
15949,60
3030,39
9714,03
СО
Мин
0,00
3981,90
4339,421
7285,698
2923,497
14604,842
3392,373
12052,163
1300,81
789,47
0,00
0,00
0,00
- 40 011393
ШТАММ Гр Время 01 Медиана ОЗ Макс Рзначени е (Тест Вилкокс она)
Α/ΝΕνν ΟΑίΕϋΟΝΙΑ 1 0 День 4117,65 9606,46 13430,66 25570,78 0,0056
1 21 День 11052,63 20450,55 30234,74 40526,32
2 0 День 6363,64 9686,41 11698,11 19164,84
2 21 День 7741,05 9545,45 17069,60 32000,00
Α/ΡΑΝΑΜΑ 1 0 День 2275,45 4003,02 5764,55 10842,49 0,1814
1 21 День 9347,37 13176,41 21471,39 54789,92
СМ 0 День 2222,22 4545,45 7495,74 11698,11
2 21 День 6231,88 10147,06 20540,54 52188,84
Β/8ΗΑΝΟΟΝΟ 1 0 День 2058,82 2956,78 5972,22 7832,17 0,1483
1 21 День 6860,47 12796,90 22947,37 48947,37
2 0 День 1290,32 2113,82 4770,02 7783,25
2 21 День 6590,91 9009,01 12774,87 21201,72
Группа 1: Ни вакцина Г1иапх™+адъювант А803 на основе эмульсии «масло в воде».
Группа 2: Ни вакцина Ииапх™.
СО = стандартное отклонение.
Мин = минимальный; Макс = максимальный.
С)1 = первая квартиль; 03 = третья квартиль.
N = количество субъектов, для которых имеются результаты
Р-значение: Тест Вилкоксона (непараметрический способ) для тестирования различия (ранговый суммарный тест Вилкоксона) для 2 групп на 21 день.
Таблица 20
В клетки памяти: Описательная и логически выведенная статистика для различия между После (21 день) и Перед (0 день) частоты антигенспецифической плазмы крови в 106 ^О-продуцирующих клеток плазмы крови (подгруппа субъектов)
ШТАММ Группа Ν Среднее СО Мин
Α/ΝΕνν САЬЕООМА 1 22 12250,07 12875,755 -4365,08
2 21 3069,46 7309,731 -10043,4
Α/ΡΑΝΑΜΑ 1 22 13737,52 13677,942 -188,29
2 21 9012,54 11489,012 -1551,05
Β/8ΗΑΝϋΟΝΟ 1 22 12226,81 12243,895 -2222,22
2 21 6683,64 6240,312 -2113,82
Группа 1: Р1и вакцина Ниапх™+адъювант А803 на основе эмульсии «масло в
ШТАММ гр 01 Медиана ОЗ Макс Р-значение (Тест Вилкоксона)
Α/ΝΕνν ΟΑΙ_ΕϋΟΝΙΑ 1 2418,07 6776,65 26036,01 35059,98 0,0210
2 -1762,54 1694,51 6850,19 18579,97
Α/ΡΑΝΑΜΑ 1 4551,30 11039,04 16614,85 49881,94 0,1449
2 1522,85 6480,96 9214,67 47812,47
Β/δΗΑΝϋΟΝ 1 1788,75 9322,70 18907,05 42134,18 0,1895
<3 I 2 2117,44 5384,41 9897,27 19801,28
воде».
Группа 2: Р1и вакцина Ииапх™.
СО = стандартное отклонение.
Мин = минимальный; Макс = максимальный.
С)1 = первая квартиль; 03 = третья квартиль.
N = количество субъектов, для которых имеются результаты.
Р-значение: Тест Вилкоксона (непараметрический способ) для тестирования различия (ранговый суммарный тест Вилкоксона) для 2 групп на 21 день.
- 41 011393
ΙΙΙ.6. Общие заключения.
ΙΙΙ.6.1. Результаты реактогенности и безопасности.
Хотя иммунизация вирусом гриппа значительно уменьшает риск пневмонии и ассоциирующейся с ней смерти, вакцинация только пожилых людей обеспечивает 23-72% защиту против гриппа. Приготовление вакцинного антигена с сильными адъювантами представляет собой привлекательный подход для усиления иммунных ответов на убиквиторные антигены. Это исследование определено для оценки (1) безопасности и реактогенности у здоровых пожилых людей противогриппозной вакцины с эмульсией «масло в воде» в качестве адъюванта, т.е. А803; (2) иммунных ответов в виде антител и опосредованных клетками иммунных ответов. Данные по реактогенности демонстрируют, что противогриппозная вакцина с адъювантом А803 вызывает более локальные и общие симптомы по сравнению с двумя другими вакцинами. Тем не менее, в отношении данных побочных эффектов не обнаружено различие между тремя вакцинами. Из этих результатов можно сделать вывод, что реактогенность и профиль безопасности для вакцины-кандидата являются удовлетворительными и клинически приемлемыми.
Ш.6.2. Результаты иммуногенности.
В отношении иммунного ответа три вакцины превосходили требования европейских руководящих органов для ежегодной регистрации противогриппозных вакцин на основе убиквиторного вириона ('Хо1е £ог Ошбапсе оп Нагшошзайоп о£ КецшгешеЩз £ог шйие^а Уасстез £ог 1Ье 1ттипо1од1са1 аззеззтеп! о£ 1Не аппиа1 з1гат сйапдез - СРМР/В^Р/214/96). Три противогриппозные вакцины, протестированные в этом исследовании, были иммуногенны для здоровых пожилых людей, у которых развивался хороший ответ в виде антител на гемагглютинин вируса гриппа и нейтрализующие антигены (табл. 21).
Таблица 21
Переменная ЕС стандарт для ответа в виде антител Результаты
Фактор превращения >2,0 >6,1
Уровень сероконверсии >30% > 50%
Уровень защиты >60% > 88%
В отношении опосредованного клетками иммунного ответа (КОИ) противогриппозная вакцина с адъювантом А803 вызывала значительно более сильный С1)4 ответ (включены дрейфующие штаммы) по сравнению с двумя другими вакцинами (Н1иапх и вакцина на основе полного вируса гриппа). Тем не менее, вакцинация не оказывала измеряемого воздействия на С1)8 ответ.
В отношении ответа на основе В-клеточной памяти существует тенденция в пользу противогриппозной адъювантной вакцины по сравнению с неадъювантной вакциной.
Пример ГУ. Клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа и адъювант А803 - Ехр1о-Н1и-002.
Открытое контролируемое исследование Ι/ΙΙ фазы проводили в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет и ранее вакцинированных в 2003 году вакциной-кандидатом в клиническом испытании Ехр1о-Н1и-001 для оценки реактогенности и иммуногенности противогриппозных вакцин-кандидатов О1ахо8шЦЙК1те Вю1ощса1з, содержащих адъювант А803. Для оценок иммуногенности и безопасности вакцину Н1иапх™ (известную как α-пх™ в Бельгии) использовали в качестве эталона.
Ιν.1. Задача.
Гуморальный иммунный ответ (т.е. титры антител против гемагглютинина) и опосредованный клетками иммунный ответ (С1)4 и/или С1)8 Т-клеточные ответы) и ответ на основе В-клеток памяти измеряли на 21 день после внутримышечного введения одной дозы вакцины с адъювантом А803. Н1иапх™ использовали в качестве эталона. Задача заключалась в следующем:
1) определить, подтверждает ли Н1и с адъювантом А803 (40 субъектов) по сравнению с Н1иапх (18 субъектов) свою наиболее сильную иммуностимулирующую активность в отношении С1)4 и/или С1Э8опосредованного иммунитета у индивидов, вакцинированных антигенами вируса гриппа;
2) исследовать с использованием продольного анализа влияние адъюванта А803 на иммунный ответ в момент перед вакцинацией в 2004 году (таким образом, ответ через один год после первой вакцинации в 2003 году).
ΙΥ.2. План исследования, состав вакцины и конечные результаты.
субъектов в возрасте больше 65 лет, которые ранее получали одну дозу противогриппозной вакцины с адъювантом А803 в течение клинического испытания Ехр1о-Н1и-001 в 2003 году (Н1иА803).
Одна контрольная группа приблизительно из 20 субъектов в возрасте больше 65 лет, которые ранее получили одну дозу Н1иапх™ в течение клинического испытания Ехр1о-Н1и-001 в 2003 году (Н1иапх).
Ιν.2.1. Состав вакцины.
Состав вакцины похож на используемый для исследования Ехр1о-Н1и-001, за исключением штаммов вируса гриппа, включенных в вакцину (вакцина 2004 года). Штаммы были следующими:
А\'е\с Са1ебоша/20/99 (ΙΥΚ-116) (НШ1) = А\'е\с СаЫоша^НШ^-подобный штамм
АЖуошт§/3/2003(Х-147)(Н3№) = А/Ницап(Н3№)-подобный штамм;
- 42 011393
В/Лапд8и/10/2003 = В/8Еапдйа1-подобный штамм.
[У.2.2. Результаты иммуногенности (Ш).
ГСТ (принимая во внимание антилогарифм среднего значения логарифмических преобразований титра).
Факторы превращения (кратное увеличение сывороточных ГСТ Ш на 21 день по сравнению с 0 днем).
Уровень сероконверсии (процент вакцинированных пациентов по меньшей мере с четырехкратными увеличениями титров Ш на 21 день по сравнению с 0 днем для каждого вакцинного штамма).
Уровень защиты (процент вакцинированных пациентов с сывороточным Ш>1:40 на 21 день).
^.2.3. Результаты КОИ.
Обнаруженная переменная.
На 0 и 21 день: частота цитокинположительных СЭ4/СЭ8 клеток на 106 с 4 различными цитокинами. В каждом тесте количественно оценивается ί.Ό4/ί.Ό8 Т-клеточный ответ на совокупность 3 следующих антигенов:
антиген №\ν Са1еЛоша;
антиген ХУуопипд;
антиген Лапдки.
Переменные-производные.
Антигенспецифический СЭ4 и СЭ8-Т-клеточный ответ, выраженный в 5 различных тестах (цитокины):
1) клетки, продуцирующие по меньшей мере два различных цитокина (СО40Ь, ГЕ-2, ΊΕΝ-γ, ΨΝΕ-α);
2) клетки, продуцирующие по меньшей мере СО40Б и другой цитокин (ΊΕ-2, ΨΝΕ-α. ΊΕΝ-γ);
3) клетки продуцирующие по меньшей мере ^-2 и другой цитокин (СО40Ь, ΕΝΕ-ο, ΊΕΝ-γ);
4) клетки, продуцирующие по меньшей мере ΊΕΝ-γ и другой цитокин (ΊΕ-2, ΊΝΕ-ο., СО40Б);
5) клетки, продуцирующие по меньшей мере ΊΝΕ-ο. и другой цитокин (ΊΕ-2, СО40Ь, ΊΕΝ-γ).
Ίν.2.4. КОИ анализ.
Первичный КОИ анализ основан на общей вакцинированной группе (Ν=40 субъектов для группы Ε1иА§03 и Ν=18 субъектов для группы Ε1ι.ι;·ιπχ).
Продольный анализ основан на кинетических исследованиях группы Εxр1о-Ε1и-001 (убиквиторный белок) и Εxр1о-Ε1и-002 (совокупный антиген Ли):
Перед: Ν=36 субъектов для группы Ε1иА§03 и Ν=15 для группы Ε1ι.ι;·ιπχ.
После-Перед: Ν=34 субъекта для группы Ε1иА§03 и Ν=15 для группы Ε1ι.ι;·ιπχ.
(а) Частоту ί.Ό4/ί.Ό8 Т-лимфоцитов, секретируемых в ответ, суммировали путем описательной статистики для каждого антигена, для каждого цитокина, для каждой вакцинной группы и в каждый момент времени (перед и после вакцинации).
(б) Описательную статистику ответов у индивидов в различные моменты времени (После-Перед) табулировали для каждого антигена, для каждого цитокина и для каждой вакцинной группы.
(в) Для моментов времени после и (После-Перед) вакцинации непараметрический тест Вилкоксона использовали для сравнения различий между двумя вакцинными группами и для расчета статистического р-значения в отношении 4 различных цитокинов на:
СЭ4 Т-клеточный ответ на штаммы №\ν Са1еЛоша, ^уотшд, Лапдки и совокупности 3 штаммов;
ί.Ό8 Т-клеточный ответ на штаммы №\ν Са1еЛоша, ХУуотйщ;
Лапдки и совокупности 3 штаммов.
(г) Непараметрический тест (тест Вилкоксона) также использовали для исследования кинетики иммунного ответа в момент Перед (0 день) с точки зрения частоты специфических СЭ4 между Εχρ^-Ε1π-001 и Εχρ^-Ε1π-002 в каждой вакцинной группе;
Для исследования кинетики иммунного ответа в момент Перед (0 день) с точки зрения частоты специфических СЭ4 между 2 вакцинными группами в каждом из исследований Εxρ1о-Ε1и-001 и Εχρ1α-Ε1υ002;
для исследования кинетики иммунного ответа с точки зрения различий (После-Перед) частоты специфических СЭ4 между Εχρ^-Ε1π-001 и Εχρ^-Ε1π-002 в каждой вакцинной группе;
для исследования кинетики иммунного ответа с точки зрения различий (После-Перед) частоты специфических СЭ4 между 2 вакцинными группами в каждом из исследований Εxρ1о-Ε1и-001 и Εχρ1α-Ε1υ002.
Все тесты значимости были двусторонними. Р-значения меньше чем или равные 0,05 рассматривали как статистически значимые.
Ίν.3. Результаты.
Результаты выражали в виде частоты цитокинположительных СЭ4 или СЭ8 Т-клеток в СЭ4 или СЭ8 Т-клеточной субпопуляции.
- 43 011393 ΐν.3.1. Антигенспецифические С1)4 Т- лимфоциты.
Частоту антигенспецифических С1)4 Т-лимфоцитов, секретирующихся в ответ, суммировали при помощи описательной статистики для каждого антигена, для каждого цитокина, для каждой вакцинной группы и в каждый момент времени (перед и после вакцинации).
Описательная статистика индивидуальных различий между моментами времени (После-Перед) С1)4 Т-лимфоцитарных ответов для каждого антигена, для каждого из 5 различных цитокинов и для каждой вакцинной группы представлены в табл. 22.
Таблица 22
Описательная статистика для различия между после вакцинации (на 21 день) и перед вакцинацией (на 0 день) для антигенспецифических С1)4 Т-чимфоцигарных ответов (общая вакцинированная группа)
Антиген Цитокин Вакцина Группа N Среднее СО Мин 01 Медиана 03 Макс.
ΡοοΙ Пи Все пары Ниапх 18 1268,67 1051,744 197,00 724,00 863,00 1561,00 4676,00
Пи А503 36 1781,31 1484,860 -2379,00 929,50 1664,50 2821,00 4669,00
СО40Б Ниапх 18 1260,11 1054,487 243,00 721,00 849,00 1602,00 4743,00
Пи А803 36 1711,56 1433,113 -2359,00 838,00 1576,00 2759,50 4575,00
ΙΡΝγ Ниапх 18 762,94 813,884 -12,00 294,00 496,00 1061,00 3564,00
Ни А503 36 1179,92 881,255 -817,00 692,50 1180,50 1865,50 2831,00
11.2 Ниапх 18 1019,06 917,905 -258,00 544,00 702,00 1174,00 3850,00
Ни А803 36 1423,33 1359,471 -2702,00 651,00 1260,00 2200,50 4342,00
ΤΝΕα Ниапх 18 803,39 915,838 32,00 231,00 533,00 936,00 3892,00
Ни А803 36 1078,28 1029,122 -1816,00 446,00 983,00 1836,00 3310,00
Α/Νβνν Все пары Ниапх 18 481,44 381,534 -241,00 282,00 448,50 598,00 1412,00
Са1ес1оп1а Ни А803 36 812,78 749,192 -828,00 215,50 911,50 1274,50 3206,00
СО40Б Ниапх 18 450,78 360,378 -239,00 291,00 447,00 580,00 1248,00
Ни А803 36 783,75 711,608 -760,00 242,00 808,00 1161,00 3050,00
ΙΕΝγ Ниапх 18 316,28 279,662 -165,00 175,00 259,00 387,00 1111,00
Ни А803 36 438,22 420,770 -685,00 125,00 393,00 733,50 1557,00
11_2 Ниапх 18 326,06 290,792 -294,00 193,00 330,00 488,00 834,00
Ни А803 36 634,72 616,478 -557,00 179,50 678,50 952,00 2602,00
ΤΝΡα Ниапх 18 316,44 372,492 -140,00 50,00 278,00 542,00 1449,00
Ни А803 36 449,17 591,796 -916,00 100,50 343,50 848,00 2452,00
ΑΛΛ/γοητίη Все пары Ниапх 18 609,56 559,396 -176,00 257,00 510,50 957,00 1998,00
д Ни А803 36 766,61 579,191 -568,00 316,00 864,50 1221,00 1662,00
СО40Б Ниапх 18 616,33 550,853 -176,00 274,00 488,00 939,00 2017,00
Ни А803 36 728,61 570,316 -670,00 260,00 789,50 1216,00 1675,00
ΙΡΝγ Ниапх 18 407,06 424,758 -311,00 129,00 370,50 723,00 1372,00
Ни А803 36 526,72 443,938 -770,00 219,00 556,50 776,00 1342,00
11.2 Ниапх 18 495,83 503,805 -187,00 88,00 540,50 801,00 1841,00
Ни А803 36 572,89 533,728 -789,00 220,00 602,00 882,50 1512,00
ΤΝΡα Ниапх 18 424,56 485,591 -260,00 110,00 359,50 461,00 1718,00
Ни А803 36 550,58 538,461 -765,00 269,50 543,50 905,50 1678,00
ВАЛапдзи Все пары Ниапх 18 698,44 793,119 -306,00 233,00 433,00 961,00 2822,00
Ни АЗОЗ 36 861,42 688,852 -223,00 339,00 745,00 1325,50 2284,00
СО40Б Ниапх 18 678,39 777,259 -206,00 227,00 401,50 962,00 2878,00
Ни А803 36 825,89 674,879 -223,00 305,00 722,00 1282,00 2337,00
ΙΕΝγ Ниапх 18 431,72 489,912 -95,00 191,00 272,50 382,00 1712,00
Ни А803 36 615,94 473,543 -286,00 288,50 501,50 897,50 1740,00
11.2 Ниапх 18 552,50 666,853 -234,00 155,00 278,50 833,00 2386,00
Ни А803 36 696,19 622,931 -359,00 207,50 540,50 1146,50 2182,00
ΤΝΕα Ниапх 18 441,39 695,792 -338,00 97,00 269,50 564,00 2440,00
Ни А803 36 500,03 448,636 -166,00 107,50 436,00 745,00 1626,00
СО = стандартное отклонение.
Мин, Макс = минимальный, максимальный.
- 44 011393
Р'1 = первая квартиль.
Р3 = третья квартиль.
Ν = количество протестированных субъектов, для которых имеются результаты.
Показано, что вызванные введением вакцины С1)4 Т-клетки способны существовать по меньшей мере в течение одного года, поскольку имеется обнаруживаемое различие между уровнями С1)4 Т-клеточных ответов перед вакцинацией у индивидов, вакцинированных Е1иапх, по сравнению с индивидами, вакцинированными Ρ1π3πχ/Α803 за год до этого. Результаты также представлены на фиг. 8, демонстрируя С1)4 Т-клеточный ответ на убиквиторный Е1и антиген перед и после ревакцинации. Ό0 соответствует 12 месяцам после первого года вакцинации и таким образом свидетельствует о персистенции. При сравнении различия в частоте антигенспецифических С1)4 Т-лимфоцитов между 2 группами при помощи теста Вилкоксона в момент после вакцинации почти все р-значения были меньше чем 0,05 и рассматривались как статистически значимые (см. табл. 23) в пользу группы Ε1πΑ803.
Таблица 23
Логически выведенная статистика: Р-значения, рассчитанные при помощи рангового суммарного теста Вилкоксона между двумя вакцинными группами на 21 день для антигенспецифических СТ)4 ответов (общая вакцинированная
Тгруппа)
Цитокин Р-значение
Совокупная Νβνν Са1е6ота УУуоттд Халдеи
Все пары 0,0014 0,0023 0,0286 0,0133
СО401- 0,0016 0,0014 0,0427 0,0155
ΙΝΕγ 0,0006 0,0366 0,0400 0,0041
11_2 0,0037 0,0024 0,0584 0,0162
ΤΝΕα 0,0031 0,0103 0,0918 0,0114
Р-значение: Тест Вилкоксона (непараметрический способ) для тестирования различия (ранговый суммарный тест Вилкоксона) для 2 групп на 21 день.
При сравнении индивидуальных различий (После-Перед) в частоте антигенспецифических С1)4 Тлимфоцитарных ответов между 2 группами при помощи теста Вилкоксона р-значения меньше чем 0,05 и рассматриваемые как статистически значимые возникали для следующих комбинаций антиген-цитокин: совокупный Г1и-все пары, совокупный йи-ΙΡΝ-γ и Лапдзи-ΙΕΝ-γ в пользу группы Ρ14Α803 (табл. 24).
Таблица 24
Логически выведенная статистика: Р-значения, рассчитанные при помощи рангового суммарного теста Вилкоксона между различными группами по различию между после вакцинации (на 21 день) и перед вакцинацией (на 0 день) для антигенспецифических С1)4 Т-лимфоцитарных ответов (общая вакцинированная группа)
Цитокин Р-значение
Совокупная Νβνν Са1ес1ота УУуоттд Лапдви
Все пары 0,0435 0,1124 0,2189 0,3085
С040Ь 0,0638 0,0781 0,2831 0,2872
ΙΝΕγ 0,0290 0,3589 0,2553 0,0435
И_2 0,1024 0,0563 0,3986 0,0435
ΤΝΕα 0,0693 0,4090 0,1232 0,3129
Р-значение: Тест Вилкоксона (непараметрический способ) для тестирования различия (ранговый суммарный тест Вилкоксона) для 2 групп на 21 день.
Ιν.3.2. Антигенспецифические СТ)8 Т-лимфоциты.
Частоту антигенспецифических С1)8 Т-лимфоцитов, секретирующихся в ответ, суммировали путем описательной статистики для каждого антигена для каждого цитокина для каждой вакцинной группы и в каждый момент времени (перед и после вакцинации), аналогично способу, которому следовали в отношении СТ)4 Т-клеточного ответа.
При сравнении различий в частоте антигенспецифических С1)8 Т-лимфоцитарных ответов между 2 группами при помощи теста Вилкоксона после вакцинации все Р-значения были больше чем 0,05 и их не
- 45 011393 рассматривали как статистически значимые. При сравнении индивидуальных различий (После-Перед) в частоте антигенспецифических СП8-Т-лимфоцитарных ответов между 2 группами при помощи теста Вилкоксона все Р-значения были выше 0,05 и не рассматривались как статистически значимые.
Ιν.3.3. Кинетический анализ: иммунный ответ в момент времени перед вакцинацией (через один год после первой вакцинации в 2003 году).
Частоту антигенспецифических СО4 Т-лимфоцитов, секретирующихся в ответ, в момент перед вакцинацией суммировали путем описательной статистики для каждого цитокина и для каждой вакцинной группы и для каждого из двух исследований в табл. 25, для каждого из двух исследований и для каждой вакцинной группы в табл. 27. Логически выведенная статистика приведена в табл. 26 и 28.
Таблица 25
Описательная статистика в момент перед вакцинацией (0 день) для специфического СО4 Тлимфоцитарного ответа . на вакцинацию (кинетика)
Цитокин Группа Исследова ние N Среднее СО Мин 01 Медиана (23 Макс.
Все пары Пи А803 ЕХРЮ 001 36 2000,86 1783,474 102,00 911,50 1461,50 2791,00 9514,00
ЕХРЮ 002 36 2028,28 1427,000 55,00 1190,50 1647,50 2575,00 7214,00
Пиапх ЕХРЮ 001 15 2152,87 2162,463 747,00 930,00 1354,00 2101,00 7868,00
ЕХРЮ 002 15 1587,07 2123,841 192,00 468,00 735,00 1578,00 8536,00
СО40(_ Пи А503 ЕХРЮ 001 35 1946,66 1771,102 120,00 837,00 1340,00 2819,00 9462,00
ЕХРЮ 002 35 1992,20 1440,721 77,00 1125,00 1590,00 2587,00 7286,00
Пиапх ЕХРЮ 001 15 2094,93 2076,632 745,00 902,00 1340,00 2077,00 7385,00
ρνρΐ_0 002 15 1561 73 2097 201 34 00 475 00 Й7О лл ν / 4 Д7О ЛЛ 1 ялпо лл υτί.υ,υυ
ΙΝΕγ Пи А503 ЕХРЮ 001 35 1068,63 1030,745 91,00 448,00 790,00 1503,00 5425,00
ЕХРЮ 002 35 1259,23 890,590 312,00 725,00 984,00 1354,00 4146,00
Пиапх ЕХРЮ 001 15 1248,07 1452,459 320,00 388,00 778,00 1227,00 5431,00
ЕХРЮ 002 15 974,80 1394,044 52,00 252,00 337,00 1057,00 5576,00
И2 Пи А803 ЕХРЮ 001 ЕХРЮ 002 35 35 1690,20 1883,60 1524,689 1361,337 37,00 14,00 688,00 1068,00 1211,00 1413,00 2416,00 2370,00 8235,00 6891,00
Пиапх ЕХРЮ 001 15 1888,40 2085,857 568,00 715,00 1136,00 1770,00 7403,00
ЕХРЮ 002 15 1493,93 2037,139 58,00 444,00 755,00 1485,00 8193,00
ΤΝΕα Пи А203 ЕХРЮ 001 35 1174,74 1119,633 55,00 466,00 795,00 1720,00 5415,00
ЕХРЮ 002 35 1545,40 1159,490 135,00 831,00 1203,00 1857,00 5354,00
Пиапх ЕХРЮ 001 15 1444,20 1946,211 201,00 520,00 688,00 1254,00 7213,00
ЕХРЮ 002 15 1304,73 1759,716 144,00 316,00 824,00 1171,00 7056,00
СО = стандартное отклонение.
Мин, Макс = минимальный, максимальный.
Р'1 = первая квартиль.
= третья квартиль.
Ν = количество протестированных субъектов, для которых имеются результаты.
При сравнении различий в частоте антигенспецифических СО4 Т-лимфоцитов между 2 исследованиями при помощи теста Вилкоксона для каждой вакцинной группы р-значения, которые были меньше 0,05 и рассматривались как статистически значимые (в пользу Ехр1о-Р1и-002) возникали только для группы Р1иА803 и с цитокином ТNР-α (см. табл. 26).
- 46 011393
Таблица 26
Логически выведенная статистика: р-значения, рассчитанные при помощи рангового суммарного теста Вилкоксона между различными исследованиями на 0 день для антигенспецифических С1)4 Т-лимфоцитарных ответов (кинетика)
р-значение: Тест Вилкоксона (непараметрический способ) для тестирования различия (ранговый суммарный тест Вилкоксона) для 2 групп на 21 день.
Таблица 27
Описательная статистика в момент перед вакцинацией (0 день) для специфического СГ)4 Т-лимфоцитарного ответа на вакцинацию (кинетика)
Цитокин Исследование Группа N Среднее СО Мин. 01 Медиана ОЗ Макс.
Все пары ЕХРЮ 001 Пи АЗОЗ 36 2000,86 1783,474 102,00 911,50 1461,50 2791,00 9514,00
Пиапх 15 2152,87 2162,463 747,00 930,00 1354,00 2101,00 7868,00
ЕХРЮ 002 Пи АЗОЗ 36 2028,28 1427,000 55,00 1190,50 1647,50 2575,00 7214,00
Пиапх 15 1587,07 2123,841 192,00 468,00 735,00 1578,00 8536,00
СО401. ЕХРЮ 001 Ни АЗОЗ 35 1946,66 1771,102 120,00 837,00 1340,00 2819,00 9462,00
Пиапх 15 2094,93 2076,632 745,00 902,00 1340,00 2077,00 7385,00
ЕХРЮ 002 Пи АЗОЗ 35 1992,20 1440,721 77,00 1125,00 1590,00 2587,00 7286,00
Пиапх 15 1561,73 2097,201 34,00 475,00 672,00 1579,00 8428,00
ΙΝΕγ ЕХРЮ 001 Пи АЗОЗ 35 1068,63 1030,745 91,00 448,00 790,00 1503,00 5425,00
Пиапх 15 1248,07 1452,459 320,00 388,00 778,00 1227,00 5431,00
ЕХРЮ 002 Пи АЗОЗ 35 1259,23 890,590 312,00 725,00 984,00 1354,00 4146,00
Пиапх 15 974,80 1394,044 52,00 252,00 337,00 1057,00 5576,00
11_2 ЕХРЮ 001 Пи АЗОЗ 35 1690,20 1524,689 37,00 688,00 1211,00 2416,00 8235,00
Пиапх 15 1888,40 2085,857 568,00 715,00 1136,00 1770,00 7403,00
ЕХРЮ 002 Пи АЗОЗ 35 1883,60 1361,337 14,00 1068,00 1413,00 2370,00 6891,00
Пиапх 15 1493,93 2037,139 58,00 444,00 755,00 1485,00 8193,00
ΤΝΕα ЕХРЮ 001 Пи АЗОЗ 35 1174,74 1119,633 55,00 466,00 795,00 1720,00 5415,00
Пиапх 15 1444,20 1946,211 201,00 520,00 688,00 1254,00 7213,00
ЕХРЮ 002 Пи АЗОЗ 35 1545,40 1159,490 135,00 831,00 1203,00 1857,00 5354,00
Пиапх 15 1304,73 1759,716 144,00 316,00 824,00 1171,00 7056,00
СО = стандартное отклонение.
Мин, Макс = минимальный, максимальный.
С)1 = первая квартиль.
С)3 = третья квартиль.
N = количество протестированных субъектов, для которых имеются результаты.
При сравнении различий в частоте антигенспецифических СГ)4 Т-лимфоцитов между 2 вакцинными группами при помощи теста Вилкоксона для каждого исследования все р-значения для Ехр1о-Р1и-002 были меньше чем 0,05 и их рассматривали как статистически значимые (в пользу Р1иА803) (см. табл. 28).
- 47 011393
Таблица 28 Логически выведенная статистика: р-значения, рассчитанные при помощи рангового суммарного теста Вилкоксона между различными группами на 21 день антигенспецифических СР4 Т-лимфоцитарных ответов (кинетика)
Цитокин Исследование р-значение
Все пары ΕχρΙο Яи 001 0,9423
ΕχρΙο Е1и 002 0,0300
Οϋ40Ι_ ΕχρΙο Яи 001 0,8989
ΕχρΙο Яи 002 0,0361
ΙΝΕγ ΕχρΙο Яи 001 0,8738
ΕχρΙο Яи 002 0,0121
Ιί.2 ΕχρΙο Яи 001 0,9747
ΕχρΙο Яи 002 0,0216
ΤΝΕα ΕχρΙο Яи 001 0,9916
ΕχρΙο Яи 002 0,0514
р-значение: Тест Вилкоксона (непараметрический способ) для тестирования различия (ранговый суммарный тест Вилкоксона) для 2 групп на 21 день.
1У.3.4. Кинетический анализ: иммунный ответ в момент после минус в момент перед вакцинацией.
Частоту антигенспецифических СО4 Т-лимфоцитов, секретирующихся в ответ в момент времени (после-перед) суммировали путем описательной статистики для каждого цитокина и для каждой вакцинной группы и для каждого исследования в табл. 29, для каждого исследования и для каждой вакцинной группы в табл. 31. Логически выведенная статистика приведена в табл. 30 и 32.
Таблица 29 Описательная статистика по различию между после вакцинации (21 день) и перед вакцинацией (0 день) для специфических СО4 Т-лимфоцитарных ответов на вакцинацию (кинетика)
Цитокин Группа Исследован ие N Среднее СО Мин. (21 Медиана аз Макс.
Все пары Ни АЗОЗ ЕХРЮ 001 34 4837,56 4476,129 -609,00 1888,00 5483,50 8148,00 19555,00
ЕХРЮ 002 34 1737,79 1450,177 -2379,00 936,00 1664,50 2743,00 4669,00
Е1иапх ЕХРЮ 001 15 3103,53 3726,645 436,00 800,00 2283,00 3226,00 15169,00
ЕХРЮ 002 15 1369,00 1127,784 197,00 725,00 869,00 1808,00 4676,00
С040Ь Ни АЗОЗ ЕХРЮ 001 33 4819,06 4489,788 -718,00 1799,00 3479,00 8288,00 19480,00
ЕХРЮ 002 33 1694,73 1431,082 -2359,00 921,00 1659,00 2662,00 4575,00
Ниапх ЕХРЮ 001 15 3090,00 3684,759 477,00 822,00 2189,00 3208,00 15021,00
ЕХРЮ 002 15 1360,93 1131,051 243,00 725,00 860,00 1687,00 4743,00
ΙΡΝγ Ни АЗОЗ ЕХРЮ 001 33 3127,09 2974,067 -453,00 1325,00 1721,00 5162,00 13296,00
ЕХРЮ 002 33 1167,85 893,363 -817,00 633,00 1207,00 1803,00 2831,00
Ниапх ЕХРЮ 001 15 1660,13 1834,023 -84,00 480,00 1386,00 2284,00 7120,00
ЕХРЮ 002 15 851,87 859,585 148,00 294,00 501,00 1222,00 3564,00
11_2 Ни АЗОЗ ЕХРЮ 001 33 3950,18 3878,538 -358,00 1309,00 2780,00 6635,00 16988,00
ЕХРЮ 002 33 1404,67 1355,665 -2702,00 719,00 1341,00 2109,00 4342,00
Ниапх ЕХРЮ 001 15 2413,87 3027,392 263,00 674,00 1672,00 2425,00 12273,00
ЕХРЮ 002 15 1117,80 975,934 -258,00 575,00 714,00 1618,00 3850,00
ΤΝΕα Ни АЗОЗ ЕХРЮ 001 33 2627,36 2574,458 -825,00 862,00 1475,00 4764,00 9267,00
ЕХРЮ 002 33 1072,36 1044,140 -1816,00 447,00 1000,00 1752,00 3310,00
Ниапх ЕХРЮ 001 15 1460,53 3115,174 -1586,00 251,00 813,00 1314,00 12275,00
ЕХРЮ 002 15 904,67 974,958 32,00 338,00 752,00 965,00 3892,00
СО = стандартное отклонение.
Мин, Макс = минимальный, максимальный.
= первая квартиль.
= третья квартиль.
Ν = количество протестированных субъектов, для которых имеются результаты.
При сравнении различий в частоте антигенспецифических СО4 Т-лимфоцитов между 2 исследованиями при помощи теста Вилкоксона для каждой вакцинной группы все р-значения для группы Р1иА803
- 48 011393 были меньше чем 0,05 и рассматривались как статистически значимые (в пользу Ехр1о-Р1и-001) (см. табл. 30).
Таблица 30 Логически выведенная статистика по различию между после вакцинации (21 день) и перед вакцинацией (0 день): р-значения, рассчитанные при помощи рангового суммарного теста Вилкоксона между различными исследованиями на 21 день для антигенспецифических СО4 Т-лимфоцитарных ответов (кинетика)
р-значение: Тест Вилкоксона (непараметрический способ) для тестирования различия (ранговый суммарный тест Вилкоксона) для 2 групп на 21 день.
Таблица 31
Описательная статистика по различию между после вакцинации (21 день) и перед вакцинацией (0 день) для специфических СР4 Т-лимфоцитарных ответов (кинетика)
Цитокин Исследова ние Группа N Среднее СО Мин. 01 Медиана ОЗ Макс.
Все пары ЕХРЮ 001 Яи А803 34 4837,56 4476,129 -609,00 1888,00 3483,50 8148,00 19555,00
Е1иапх 15 3103,53 3726,645 436,00 800,00 2283,00 3226,00 15169,00
ЕХРЮ 002 ΕΙυ АЗОЗ 34 1737,79 1450,177 -2379,00 936,00 1664,50 2743,00 4669,00
Яиапх 15 1369,00 1127,784 197,00 725,00 869,00 1808,00 4676,00
С0401. ЕХРЮ 001 Яи А503 33 4819,06 4489,788 -718,00 1799,00 3479,00 8288,00 19480,00
Яиапх 15 3090,00 3684,759 477,00 822,00 2189,00 3208,00 15021,00
ЕХРЮ 002 Яи АЗОЗ 33 1694,73 1431,082 -2359,00 921,00 1659,00 2662,00 4575,00
Яиапх 15 1360,93 1131,051 243,00 725,00 860,00 1687,00 4743,00
ΙΕΝγ ЕХРЮ 001 ΕΙυ АЗОЗ 33 3127,09 2974,067 -453,00 1325,00 1721,00 5162,00 13296,00
Яиапх 15 1660,13 1834,023 -84,00 480,00 1386,00 2284,00 7120,00
ЕХРЮ 002 Яи АЗОЗ 33 1167,85 893,363 -817,00 633,00 1207,00 1803,00 2831,00
Яиапх 15 851,87 859,585 148,00 294,00 501,00 1222,00 3564,00
11_2 ЕХРЮ 001 Яи АЗОЗ 33 3950,18 3878,538 -358,00 1309,00 2780,00 6635,00 16988,00
Яиапх 15 2413,87 3027,392 263,00 674,00 1672,00 2425,00 12273,00
ЕХРЮ 002 Яи АЗОЗ 33 1404,67 1355,665 -2702,00 719,00 1341,00 2109,00 4342,00
Яиапх 15 1117,80 975,934 -258,00 575,00 714,00 1618,00 3850,00
ΤΕΝα ЕХРЮ 001 Ни АЗОЗ 33 2627,36 2574,458 -825,00 862,00 1475,00 4764,00 9267,00
Яиапх 15 1460,53 3115,174 -1586,00 251,00 813,00 1314,00 12275,00
ЕХРЮ 002 Ни АЗОЗ 33 1072,36 1044,140 -1816,00 447,00 1000,00 1752,00 3310,00
Яиапх 15 904,67 974,958 32,00 338,00 752,00 965,00 3892,00
СО = стандартное отклонение.
Мин, Макс = минимальный, максимальный.
Р'1 = первая квартиль.
ф3 = третья квартиль.
Ν = количество протестированных субъектов, для которых имеются результаты.
- 49 011393
При сравнении различия в частоте антигенспецифических СТ)4 Т-лимфоцитов между 2 вакцинными группами при помощи теста Вилкоксона для каждого исследования р-значение было меньше чем 0,05 только для Ехр1о-Г1и-001 и рассматривалось как статистически значимое (в пользу Г1иА803) (см. табл. 32).
Таблица 32
Логически выведенная статистика: р-значения, рассчитанные при помощи рангового суммарного теста Вилкоксона между различными группами на 21 день для антигенспецифических СТ)4 Т-лимфоцитарных ответов (кинетика)
Цитокин Исследование р-значение
Все пары Εχρίο Пи 001 0,0827
Εχρίο Ни 002 0,0992
СО4СИ. Εχρίο Ни 001 0,0931
Εχρίο Е1и 002 0,1391
ΙΝΕγ Εχρίο Ни 001 0,0543
Εχρίο Ни 002 0,1068
И2 Εχρίο Ни 001 0,0847
Εχρίο Е1и 002 0,2254
ΤΝΕα Εχρίο Ни 001 0,0375
Εχρίο Ни 002 0,2009
р-значение: Тест Вилкоксона (непараметрический способ) для тестирования различия (ранговый суммарный тест Вилкоксона) для 2 групп на 21 день.
ГУ.4. Титры ΗΓ
Результаты представлены на фиг. 9 и в табл. 33-36.
Таблица 33
Пиапх
ПиАЗОЗ
Пиапх
Среднегеометрические титры (ГСТ) и уровни серопозитивности титров антител против И (ГСТ, рассчитанные для вакцинированных субъектов)
Са1еаота
А/РиДап
В/8папдпа1
ПиАЗОЗ
Пре = перед вакцинацией.
ПВ (21 день) = 21 день после вакцинации.
95% ДИ, НП и ВП = 95% доверительный интервал, нижний и верхний пример. 8+ = количество серопозитивных субъектов.
ПиАЗОЗ
- 50 011393
Таблица 34
Фактор превращения титров . антител против ΗΙ (все вакцинированные . субъекты)
Группа А/Ы-Са1ес1ота А/Еирап В/8папдНа|
N ОГС [95% ДИ] N ОГС [95% ДИ] N ОГС [95% ДИ]
Пиапх 18 2,1 [1,4:3,2] 18 5,2 [3,0:9,3] 18 6,0 [3,5;10,2]
ПиАЗОЗ 40 3,1 [2,4;4,0] 40 7,8 [5,6;10,9] 40 6,2 [4,7;8,2]
Ν = общее количество субъектов.
ОГС = отношение геометрических средних (отношения антилогарифм среднего логарифма титров на день 21/день 0).
95% ДИ = 95% доверительный интервал.
Таблица 35
Серопротективные уровни титров антител против ΗΙ (все вакцинированные субъекты)
Антитело Группа Время N >=40
η % 95% ДИ
Α/Νβνν Пиапх Пре 18 14 77,8 52,4 93,6
Са1ес1оп1а ПВ(21 18 16 88,9 65,3 98,6
День)
ПиАЗОЗ Пре 40 32 80 64,4 90,9
А/РиЦап ПВ(21 40 39 97,5 86,8 99,9
день)
Пиапх Пре 18 14 77,8 52,4 93,6
ПВ(21 18 18 100 81,5 100
В/ЗЬапдпа! день)
ПиАЗОЗ Пре 40 36 90 76,3 97,2
ПВ(21 40 40 100 91,2 100
день)
Пиапх Пре 18 6 33,3 13,3 59,0
ПВ(21 18 14 77,8 52,4 93,6
день)
ПиАЗОЗ Пре 40 34 85 70,2 94,3
ПВ(21 40 40 100 91,2 100
день)
Пре = перед вакцинацией.
ПВ (21 день) = 21 день после вакцинации.
Ν= количество субъектов, для которых имеются результаты.
η = количество субъектов с титрами в пределах указанного диапазона. % = процент субъектов с титрами в пределах указанного диапазона.
Таблица 36
Уровни сероконверсии ПВ на 21 день (кратное увеличение = 4) (все вакцинированные субъекты)
Антитело Группа вакцины N Респонденты
η % 95% ДИ
НП ВП
Α/Νενν Пиапх 18 3 16,7 3,6 41,5
Са!ес1оп1а ПиАЗОЗ 40 19 47,5 31,5 63,9
А/Еирап Пиапх 18 13 72,2 46,5 90,3
ПиАЗОЗ 40 34 85,0 70,2 94,3
В/8Ьапдпа! Пиапх 18 12 66,7 41,0 86,7
ПиАЗОЗ 40 31 77,5 61,5 89,2
Ν = количество субъектов, для которых имеются результаты перед и после вакцинации.
η = количество респондентов.
% = доля респондентов (η/Νχ100).
95% ДИ = точный 95% доверительный интервал. НП = нижний предел; ВП = верхний предел.
- 51 011393
ГУ.5. Общие заключения.
В этом клиническом исследовании подтверждено, что адъювантная вакцина Е1и-А803 превосходит эквивалентную недаъювантную вакцину Е1иапх с точки зрения частоты СТ)4 Т-клеток, специфических в отношении вируса гриппа, и также с точки зрения персистенции иммунного ответа, вызываемого первой Е1и-А803 вакцинацией (первичная вакцинация в Ехр1о Е1и 001) до Ό0 исследования ревакцинации (Ехр1о Е1и 002, т.е. +/-1 год позже). Кроме того, этот ответ способен распознавать дрейфующие штаммы вируса гриппа, представленные в новой вакцине, и распознать штаммы противогриппозной вакцины 2004 года.
В противоположность первому году вакцинации после ревакцинации индивиды, ранее вакцинированные адъювантной Е1иапх™, демонстрировали увеличенную ответную реакцию в виде титров Ш по сравнению с индивидами, вакцинированными неадъювантной Е1иапх™. Существует обнаруживаемая тенденция для 1,5-2-кратного увеличения титра Ш, направленных против штаммов НШ1 и №N2, и продемонстрировано статистическое увеличение титра Ш, направленных против штамма В.
Пример У. Преклиническая оценка адъювантной и неадъювантной противогриппозной вакцин у хорьков.
Первое исследование. Эффективность новых препаратов А803 и А803+МФЛ.
У.1. Обоснование и задачи.
Инфекция вирусом гриппа в модели хорьков хорошо имитирует вирус гриппа у людей в отношении чувствительности к инфекции и клинического ответа.
Хорьки чрезвычайно чувствительны к инфекции вирусами гриппа А и В без предшествующей адаптации вирусных штаммов. Таким образом, они представляют собой превосходную модельную систему для исследований защиты, обеспечиваемой путем введения противогриппозных вакцин.
В этом исследовании изучали эффективность различных тривалентных убиквиторных вакцин с адъювантами или без адъювантов для уменьшения симптомов заболевания (температуры тела) и выделения вируса в назальные секреты хорьков, иммунизированных гомологичными штаммами.
Задача этого эксперимента заключалась в том, чтобы продемонстрировать эффективность адъювантной противогриппозной вакцины по сравнению с простой (неадъювантной) вакциной.
Конечные результаты:
1) первичный результат: уменьшение выделения вируса в назальных смывах после гомологичного контрольного заражения;
2) вторичные результаты: анализ гуморального ответа ША и контроль температуры в период около примирования и контрольного заражения.
У.2. Схема эксперимента.
У.2.1. Обработка/группа (табл. 37).
Самки хорьков (МизДе1а риДопиз Диго) (6 хорьков/группу) в возрасте 14-20 недель были получены в М^АУ Сопзи1Дапсу (НашрзЫге, иК). Хорьков примировали на 0 день гетеросубтипическим штаммом НШ1 А/8ДоскЕо1т/24/90 (4 Еод средней цитопатогенной дозы (ТСГО50)/мл). На 21 день хорькам внутримышечно инъецировали полную человеческую дозу (дозу вакцины 500 мкг, 15 мкг НА/штамм) комбинации НШ1 АЧеет Са1еТоша/20/99, №N2 А/Рапата/2007/99 и В/8ЕапдТопд/7/97. Хорьков затем сенсибилизировали на 41 день интраназальным путем гомотипическим штаммом №N2 А/Рапата/2007/99 (4,51 Еод ТСГО50/мл).
Таблица 37
Группа Антиген(ы) + доза Препарат + доза Комментарии (схема/путь /сенсибилизац ия) Другая обработка
1 Тривалентная простая Полная Ηϋ:15 мкг НА/штамм ВМ; 21 день Примирование Η1Ν1 (А/81оско1т/24/90) 0 день
2 Тривалентная А803 Полная Ηϋ: 15 мкг НА/штамм ВМ; 21 день Примирование Η1Ν1 (А/81оско1т/24/90) 0 день
3 Тривалентная А503+МФЛ Полная Ηϋ: 15 мкг НА/штамм ВМ; 21 день Примирование Η1Ν1 (А/8Доско1т/24/90) 0 день
4 ФБР I ВМ; 21 день Примирование Η1Ν1 (А/81оско1т/24/90) 0 день
- 52 011393
ν.2.2. Приготовление препаратов вакцин.
Препарат 1. Тривалентный простой (неадъювантный) препарат (500 мкл).
10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 для однократной концентрации), а также смесь, содержащую Т\\е'еч1 80, ТпЮп Х-100 и νΕ8 (количества с учетом детергентов, представленных в штаммах), добавляют в воду для инъекции. Достигнутые количества детергентов были следующими: 750 мкг Т\\е'еч1 80, 110 мкг ТпЮп Х-100 и 100 мкг νΕ8 на 1 мл. После перемешивания в течение 5 мин последовательно добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и 17,5 мкг штамма В с 10-минутным перемешиванием после каждого добавления. Препарат перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Препарат 2. Тривалентная убиквиторная противогриппозная вакцина с адъювантом А803 (500 мкл).
10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 для однократной концентрации), а также смесь, содержащую Т\\е'еч1 80, ТпЮп Х-100 и νΕ8 (количества с учетом детергентов, представленных в штаммах), добавляют в воду для инъекции. Достигнутые количества детергентов были следующими: 750 мкг Т\\е'еч1 80, 110 мкг ТпЮп Х-100 и 100 мкг νΕ8 на 1 мл. После перемешивания в течение 5 мин последовательно добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и 17,5 мкг штамма В с 10 мин перемешиванием после каждого добавления. После перемешивания в течение 15 мин добавляют 250 мкл эмульсии 8В62 (приготовленной как изложено в примере ΙΙ.1). Препарат перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Препарат 3. Тривалентная убиквиторная противогриппозная вакцина с адъювантом А803+МФЛ.
10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 для однократной концентрации), а также смесь, содержащую Т\\е'еч1 80, ТпЮп Х-100 и νΕ8 (количества с учетом детергентов, представленных в штаммах), добавляют в воду для инъекции. Достигнутые количества детергентов были следующими: 750 мкг Т\\е'е'п 80, 110 мкг ТпЮп Х-100 и 100 мкг νΕ8 на 1 мл. После перемешивания в течение 5 мин последовательно добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и 17,5 мкг штамма В с 10-минутным перемешиванием после каждого добавления. После перемешивания в течение 15 мин добавляют 250 мкл эмульсии 8В62 (приготовленной как изложено в примере ΙΙ.1). Смесь вновь перемешивают в течение 15 мин до добавления 25 мкг МФЛ из суспензии, приготовленной, как подробно описано в примере ΙΙ.3.1. Препарат перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Замечание. В каждом из препаратов 10-кратную концентрацию ФБР добавляют для достижения изотоничности и 1-кратной концентрации в конечном объеме. Объем I ГО рассчитывают для достижения целевого объема.
ν.2.3. Считывания (табл. 38).
Таблица 38
Считывание Момент времени Тип образца И/С Способ анализа
Выделение вируса От Д-1 до Д+7 после примирования и от Д-1 до Д+5 после контрольного заражения Назальные промывки В Титрование
Контроль Т° От Д-1 до Д+3 после примирования и от Д-2 до Д+3 после контрольного заражения Имплантат в брюшинную полость В Телеметрия
ИГ Перед, после примирования, после иммунизации, после контрольного заражения Сыворотка крови В ИГ
И = индивидуальный/С = совокупный.
ν.3. Результаты.
Схематическое представление результатов приведено на фиг. 10 и 11.
ν.3.1. Контроль температуры.
Индивидуальную температуру контролировали с использованием датчиков и путем телеметрической регистрации (в соответствии со способом, подробно изложенным в 1.2.2). Все имплантаты проверяли и обновляли и осуществляли новую калибровку путем Ό8Ι перед помещением в брюшинную полость. Всех животных индивидуально содержали в клетках в течение этих измерений.
Температуру контролировали с 3 дней перед контрольным заражением до 5 дней после контрольно
- 53 011393 го заражения каждые 15 мин и среднее значение рассчитывали в середине дня. Результаты от базовой температуры до базовой температуры организма представлены на фиг. 10Α (представлены результаты от -1 до +3 дня) и фиг. 10Б (представлены результаты от -2 до +3 дня).
После контрольного заражения пик температуры организма был обнаружен только после иммунизации тривалентной убиквиторной простой вакциной или ФБР. Никакие пики не обнаружены после иммунизация тривалентной убиквиторной адъювантной вакциной с Αδ03 или Αδ03+МФЛ.
У.3.2. Выделение вируса (фиг. 11).
Титрование вируса в назальных смывах осуществляли на 6 животных на группу.
Назальные смывы осуществляли путем введения 5 мл ФБР в обе ноздри бодрствующих животных. Инокулум собирали в чашку Петри и помещали в контейнер для образца при -80°С (сухой лед). Все назальные образцы сначала подвергали стерильной фильтрации через фильтры 8рт X (Οο^Η) для удаления каких-либо бактериальных примесей. 50 мкл серийных десятикратных разведений назальных промывок переносили в микротитрационные планшеты, содержащие 50 мкл среды (10 лунок/разведение). Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл леток МОСК (2,4х105 клеток/мл) и инкубировали при 35°С до достижения клеточной конфлюэнтности для контрольных клеток, например, в течение 5-7 дней. После 6-7 дней инкубации культуральную среду осторожно удаляли и добавляли 100 мкл 1/20 νδ^Γ содержащей среду, и инкубировали в течение еще 18 ч.
Интенсивность желтого формазанового окрашивания, продуцируемого после восстановления VδΤ-1 живыми клетками, пропорциональна количеству живых клеток, находящихся в лунке к концу анализа вирусного титрования, и количественно оценивали путем измерения абсорбции в каждой лунке при подходящей длине волны (450 нм). Отсечение определяют как среднюю оптическую плотность (ΟΌ) для неинфицированных контрольных клеток - 0,3ΟΌ (0,3ΟΌ соответствует +/-3 Ст.Откл. ΟΌ для неинфицированных контрольных клеток). Положительную оценку определяют, когда ΟΌ меньше отсечения, и, наоборот, отрицательную оценку определяют, когда ΟΌ больше отсечения. Титр выделенных вирусов определяли путем Кеей апй МиепсЬ и выражали как ί-οβ ТСГОяАмл.
Меньшее выделение вируса обнаружено после контрольного заражения тривалентной убиквиторной вакциной с адъювантом с Αδ03 или Αδ03+МФЛ по сравнению с тривалентной убиквиторной простой вакциной или ФБР. Защитный эффект был слегка лучше с Αδ03 по сравнению с Αδ03+МФЛ (см. день 2 после контрольного заражения). Статистическая значимость не может быть определена ввиду низкого количества животных на группу.
У.3.3. Заключение по эксперименту.
Более высокие гуморальные ответы (титры ΗΙ) были обнаружены с тривалентной убиквиторной вакциной с адъювантом Αδ03 или Αδ03+МФЛ по сравнению с тривалентной убиквиторной простой вакциной для всех 3 штаммов (по меньшей мере 2-кратные для 2 из 3 штаммов, т.е. штаммов Η3Ν2 и В).
Препараты Αδ03 и Αδ03+МФЛ демонстрировали дополнительное преимущество с точки зрения защитной эффективности у хорьков (меньшее выделение вируса и температура) (фиг. 10 и 11). После контрольного заражения не обнаружено усиление гуморального ответа после иммунизации тривалентной убиквиторной адъювантной вакциной с Αδ03 или Αδ03+МФЛ.
Второе исследование. Исследование гетеротипического контрольного заражения у хорьков: демонстрация эффективности нового протестированного препарата.
У.4. Обоснование и задачи.
В этом исследовании изучали эффективность различных тривалентных убиквиторных вакцин с адъювантами или без них по их способности уменьшать симптомы заболевания (температура организма) и их воздействиям выделение вируса в назальных секретах иммунизированных хорьков после гетерологического контрольного заражения.
У.5. План эксперимента.
Самки хорьков (Мик!е1а рнЮгшк Гига) (6 хорьков/группу) в возрасте 14-20 недель были получены из МIδΑΥ Сοηκи1ίаηсу (Штрюте, иК). Тестировали четыре группы:
Ииапх;
тривалентная убиквиторная Αδ03;
тривалентная убиквиторная Αδ03+МФЛ;
ФБР.
Хорьков примировали на 0 день гетеросубтипическим штаммом Η1Ν1 Α/δ^1<1ιο1ιη/24/90 (4Εο§ ТСГО50/мл). На 21 день хорькам внутримышечно инъецировали полную человеческую дозу (500 мкг доза вакцины, 15 мкг ΗΑ/штамм) комбинации Η1Ν1 Α/№\ν Сак^ша^^, Η3Ν2 Α/Раηата/2007/99 и В^^апд^^^^ (17,5 мкг ΗΑ). Хорьков затем сенсибилизировали на 43 день интраназальным путем гетеросубтипическим штаммом Η3Ν2 Α/\ν\Όΐηίπ8/3/2003 (4,51Εο§ ТСГО50/мл).
У.6. Результаты.
Схематическое представление результатов приведено на фиг. 12 и 13.
У.6.1. Контроль температуры.
Индивидуальную температуру контролировали с использованием датчиков и путем телеметрической регистрации. Все имплантаты проверяли и обновляли и осуществляли новую калибровку путем ΌδΙ
- 54 011393 перед помещением в брюшинную полость. Всех животных индивидуально содержали в клетках в течение этих измерений.
Результаты (фиг. 12) демонстрируют следующее.
При примировании обнаружена высокая вариабельность одной группы относительно другой. По-видимому, базовый уровень был выше перед примированием, чем после него.
Несмотря на высокую вариабельность температуры организма, пиковое значение было обнаружено только после контрольного заражения хорьков, иммунизированных ФБР (6/6 хорьков), тривалентной убиквиторной простой вакциной (5/6 хорьков) и тривалентной убиквиторной вакциной с адъювантом А803 (2/6 хорьков). Никакое пиковое значение не обнаружено после иммунизации тривалентной убиквиторной вакциной с адъювантом А803+МФЛ (0/6 хорьков).
А803. по-видимому, менее эффективна по сравнению с А803+МФЛ против гетерологических штаммов с точки зрения предотвращения жара. Авторы изобретения не могут сделать заключение относительно возможности того, что различие между адъювантами является следствием различных уровней антител перед контрольным заражением.
V.6.2. Выделение вируса (фиг. 13).
Назальные смывы осуществляли путем введения 5 мл ФБР в обе ноздри бодрствующих животных. Инокулум собирали в чашку Петри и помещали в контейнер для образца при -80°С (сухой лед). Все назальные образцы сначала подвергали стерильной фильтрации через фильтры 8рт X (Со81аг) для удаления каких-либо бактериальных примесей. 50 мкл серийных десятикратных разведений назальных промывок переносили в микротитрационные планшеты, содержащие 50 мкл среды (10 лунок/разведение). Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл леток МОСК (2,4х105 клеток/мл) и инкубировали при 35°С до достижения клеточной конфлюэнтности для контрольных клеток, например, в течение 5-7 дней. После 6-7 дней инкубации культуральную среду осторожно удаляли и добавляли 100 мкл 1/20 №8Т-1, содержащей среду, и инкубировали в течение еще 18 ч.
Интенсивность желтого формазанового окрашивания, продуцируемого после восстановления №8Т-1 живыми клетками, пропорциональна количеству живых клеток, находящихся в лунке к концу анализа вирусного титрования, и количественно оценивали путем измерения абсорбции в каждой лунке при подходящей длине волны (450 нм). Отсечение определяют как среднюю оптическую плотность (0Ό) для неинфицированных контрольных клеток - 0,30Ό (0,30Ό соответствует +/-3 Ст.Откл. 0Ό для неинфицированных контрольных клеток). Положительную оценку определяют, когда 0Ό меньше отсечения, и, наоборот, отрицательную оценку определяют, когда 0Ό больше отсечения. Титр выделенных вирусов определяли путем Кееб апб МнепсН и выражали как Ьод ТСЮ^/мл.
Выделение вируса после примирования.
Выделение вируса измеряли для 12 хорьков с 1 дня перед примированием до 7 дня после примирования. Результаты выражены в совокупности. Клиренс вируса был обнаружен на 7 день после примирования у всех хорьков.
Выделение вируса после контрольного заражения.
Выделение вируса измеряли для 6 хорьков/группу с 1 дня перед контрольным заражением до 7 дня после контрольного заражения.
Через 2 дня после контрольного заражения были обнаружены статистически значимо меньшие титры вирусов у хорьков, иммунизированных тривалентной убиквиторной вакциной с адъювантом А803 и А803+МФЛ по сравнению с хорьками, иммунизированными тривалентной убиквиторной простой вакциной и ФБР (различие 1,25/1,221од и 1,67/1,641од с адъювантной группой А803/А803+МФЛ соответственно по сравнению с простой вакциной). На 50 день в назальных промывках не был обнаружен вирус.
V.6.3. Тест ингибирования гемагглютинации (титры Ш) (фиг. 14А и Б).
Образцы сыворотки крови собирали за 1 день перед примированием, 21 день после примирования, 22 дня после иммунизации и 14 дней после контрольного заражения.
Титры антител против гемагглютинина в отношении вируса гриппа №N2 (вакцина и штамм для экспериментальных заражений) определяли с использованием теста ингибирования гемагглютинации (НЕ). Принцип Ш теста основан на способности специфических антител к вирусу гриппа ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (КВС) цыплят гемагглютинином вируса гриппа (НА). Сыворотки крови сначала обрабатывали 25% раствором нейраминидазы (КОЕ) и инактивировали теплом для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сывороток крови инкубировали с 4 единицами гемагглютинации для каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыплят и оценивали ингибирование агглютинации. Титры выражали как обратную величину наибольшего разведения сыворотки крови, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Поскольку первое разведение сыворотки крови составляло 1:10, необнаруживаемый уровень оценивали как титр, равный 5.
Результаты.
Результаты представлены на фиг. 14А и 14Б. После иммунизаций №N2 А/Рапата обнаружены более высокие гуморальные ответы (титры Ш) у хорьков, иммунизированных тривалентной убиквиторной вакциной с адъювантом А803 или А803+МФЛ, по сравнению с гуморальным ответом, обнаруженным
- 55 011393 после иммунизаций хорьков неадъювантной (простой) тривалентной убиквиторной вакциной (Р1иапх™).
Похожие титры ΗΙ титры были обнаружены у хорьков, иммунизированных Η3Ν2 Α/Рапата с адъювантом Α803 или Α§03+МФЛ.
Перекрестно-реактивные титры ΗΙ в отношении гетерологического штамма Α/^уоттд Η3Ν2 были обнаружены только после иммунизации штаммом Α/Рапата Η3Ν2, содержащим вакцину с адъювантом Α803 или ΑБ03+МФЛ (не обнаруженная после иммунизация тривалентной субъединичной простой вакциной).
Увеличение ΑΛVуот^ηд-специ(|)ических титров ΗΙ было обнаружено у хорьков, иммунизированных гетерологическим штаммом Α/Рапата Η3Ν2 и сенсибилизированных Α/^уоттд Η3Ν2. Как ожидали и в противоположность гомологичному контрольному заражению, гетерологическое контрольное заражение привело в результате к увеличению Α/Рапата-специфических титров ΗΙ у хорьков, иммунизированных Α/Рапата Η3Ν2 с адъювантом Α803 и ΑБ03+МФЛ.
У.6.4. Заключение по эксперименту.
Как ожидали, усиление титров ΗΙ антител против Η3Ν2 было обнаружено после гетерологического контрольного заражения по сравнению с ситуацией после гомологичного контрольного заражения (отсутствие усиления).
Тем не менее, похожая защита (выделение вируса) была обнаружена после гетерологического и гомологичного контрольного заражения.
Пример νΙ. Преклиническая оценка адъювантной и неадъювантной противогриппозной вакцин у С57ВЕ6 примированных мышей.
νΙ.1. План и задача эксперимента.
Значительно более высокие СО4 Т-клеточные ответы были обнаружены в клиническом исследовании Ехр1о-Р1и-001 (см. пример ΙΙΙ) для тривалентной Р1и Бр1й Α803 по сравнению с Р1иапх простой (неадъювантной) вакциной. Никакие различия не были обнаружены для СО8 Т-клеточных ответов и гуморальных ответов между этими двумя группами.
Задача заключалась в отборе считываний для индукции у мышей КОИ ответов, похожих на ответы, обнаруженные у людей. В частности, задача заключалась в том, чтобы продемонстрировать более высокие КОИ ответы у мышей путем использования убиквиторной Α803 или убиквиторной ΑБ03+МФЛ по сравнению с убиквиторной простой вакциной.
νΙ.1.1. Обработка/группа.
Самки мышей С57ВЕ6 (15 мышей/группа) в возрасте 6-8 недель были получены из Иаг1ап Иог51, №111ег1апб.
Протестированные группы:
тривалентная убиквиторная простая вакцина;
тривалентная убиквиторная Α803;
тривалентная убиквиторная ΑБ03+МФЛ;
ФБР.
Мышей примировали на 0 день гетеросубтипическими штаммами (5 мкг ΗΑ полных инактивированных Η1N1Α/^оЬηаηηе8Ьшд/82/96, Η3Ν2 Αν'ώκν/5/97, В/ИагЬ|п/7/94). Ш 28 день мышам внутримышечно инъецировали 1,5 мкг ΗΑ тривалентной убиквиторной (Α/Μνν Са1ебоша/20/99, Α/Раηата/2007/99, В/БЕапдбопд/7/97) простой или адъювантной (см. группы ниже) вакцины.
νΙ.1.2. Приготовление препаратов вакцин.
В каждый препарат добавляли 10-кратную концентрацию ФБР для достижения изотоничности и однократной концентрации конечного объема. Объем Н2О рассчитывают для достижения целевого объема.
Убиквиторная тривалентная простая вакцина (неадъювантная).
Препарат 1 (для 500 мкл).
10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 для однократной концентрации), а также смесь, содержащую Т\гееп 80, Тгкоп Х-100 и УЕБ (количества с учетом детергентов, представленных в штаммах), добавляют в воду для инъекции. Достигнутые количества детергентов были следующими: 750 мкг Т\гееп 80, 110 мкг Тп!оп Х-100 и 100 мкг УЕБ на 1 мл. После перемешивания в течение 5 мин последовательно добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и В с 10-минутным перемешиванием после каждого добавления. Препарат перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Убиквиторная тривалентная адъювантная вакцина с адъювантом на основе эмульсии «масло в воде» ΑБ03.
10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 для однократной концентрации), а также смесь, содержащую Т\гееп 80, Тгкоп Х-100 и УЕБ (количества с учетом детергентов, представленных в штаммах), добавляют в воду для инъекции. Достигнутые количества детергентов были следующими: 750 мкг Т\гееп 80, 110 мкг Тп!оп Х-100 и 100 мкг УЕБ на 1 мл. После перемешивания в течение 5 мин последовательно добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и 17,5 мкг штамма В с 10-минутным перемешиванием после каждого добавления. После перемешивания в течение 15 мин добавляют 250 мкл эмульсии БВ62 (приготовленной как изложено в примере ΙΙ.1). Препарат перемешивают в течение 15 мин при
- 56 011393 комнатной температуре и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Тривалентная убиквиторная адъювантная вакцина с А803+МФЛ.
10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 для однократной концентрации), а также смесь, содержащую Тетееп 80, Тгйоп Х-100 и УБ8 (количества с учетом детергентов, представленных в штаммах), добавляют в воду для инъекции. Достигнутые количества детергентов были следующими: 750 мкг Тетееп 80, 110 мкг Тгйоп Х-100 и 100 мкг УБ8 на 1 мл. После перемешивания в течение 5 мин последовательно добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и 17,5 мкг штамма В с 10-минутным перемешиванием после каждого добавления. После перемешивания в течение 15 мин добавляют 250 мкл эмульсии 8В62 (приготовленной как изложено в примере П.1). Смесь вновь перемешивают в течение 15 мин до добавления 25 мкг МФЛ. Препарат перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
У1.1.3. Считывания.
КОИ анализ (Κ'.’8: окрашивание СЭ4/СЭ8, I^-2/IΕN-γ).
РВМС из примированных мышей собрали через 7 дней после иммунизации. Их тестировали в совокупности/группу.
У1.2. Результаты.
Условия, которые демонстрировали более высокие частоты ί.Ό4 и СЭ8+ Т-клеток, а также меньшие отрицательные действия, определяли путем использования С57ВП6 примированных мышей и 1 мкг/мл полного инактивированного вируса в качестве рестимулирующего антигена. Результаты представлены на фиг. 15 (СЭ4 Т-клеточные ответы) и на фиг. 16 (СЭ8 Т-клеточный ответ). В этих условиях можно вызвать следующее.
Более высокие СЭ4 Т-клеточные ответы для убиквиторной А803 по сравнению с убиквиторной простой вакциной, что обнаружено у людей.
Более высокие СЭ4 Т-клеточные ответы для убиквиторной А803+МФЛ по сравнению с убиквиторной простой вакциной.
Похожие СЭ8 Т-клеточые ответы между убиквиторной простой и убиквиторной А803 вакциной, что обнаружено у людей.
Тенденция более высоких СЭ8 Т-клеточных ответов для А803+МФЛ по сравнению с убиквиторной А803 или убиквиторной простой вакциной.
Пример УЛ. Преклиническая оценка адъювантной и неадъювантной убиквиторной и субъединичной противогриппозных вакцин у мышей С57ВI/6, примированных гетерологическими штаммами.
УП.1. План и задача эксперимента.
Значительно более высокие СЭ4 Т-клеточные ответы были обнаружены в клиническом исследовании Εxρ1о-Ε1и-001 (см. пример III) для тривалентной Ε1υ 8ρ1ί! А803 по сравнению с Ε1ι.ι;·ιπχ Р1аш (неадъювантной). Никакого различия не обнаружили для СЧ8-Т-клеточного и гуморального ответов в этих двух группах.
Животная модель, воспроизводящая иммунные профили, похожие на обнаруженные для людей, разработана с использованием мышей С57ВI/6, примированных гетерологическими штаммами. Для ВОЦ (внутриклеточного окрашивания цитокинов) рестимуляцию осуществляют инактивированным полным вирусом. Задача заключалась в сравнении КОИ ответа, вызванного имеющейся в продаже убиквиторной вакциной С1аxо8т^!йΚ1^ηе (Ε^^ίχ™), по сравнению с субъединичной вакциной (вакцина Хирона Ε^ά™), а также КОИ ответа, полученного для этих вакцин с адъювантом А803 или А803+МФЛ или другим адъювантом на основе эмульсии «масло в воде» (МВ).
УП.1.1. Обработка/группа.
самок мышей С57ВУ6 (24 мыши/группу) в возрасте 6-8 недель были получены из Иаг1ап Иогек №!йег1аиЛ. Мышей примировали интраназально в 0 день гетеросубтипическими штаммами (5 мкг ΗА полноразмерными инактивированными формальдегидом Η1Ν1 А/^ойиаηие8Ьи^д/82/96, Η3Ν2 А/8уйпеу/5/97, В/ВагЬт/ТЛМ). Ча 29 день мышам внутримышечно инъецировали 1,5 мкг ΗА тривалентной убиквиторной (А/Хе^ Са1ейоша/20/99, А/^уотшд/3/2003, В/Лапдки/10/2003) простой или адъювантной (см. группы в табл. 39) вакцины.
- 57 011393
Таблица 39
Антиген / Препарат Другая обработка
1 Тривалентная убиквиторная* / Простая (неадъювантная) = Пиапх™ Гетерологическое примирование ϋθ
2 Тривалентная убиквиторная* / МВ Гетерологическое примирование ϋθ
3 Тривалентная убиквиторная* / А803 Гетерологическое примирование ϋθ
4 Тривалентная убиквиторная */А803+МФЛ (2,5 нг на дозу) Гетерологическое примирование ϋΟ
5 Спрдиагб (= Пиас!|М) = субъединичная в эмульсии «масло в воде» Гетерологическое примирование ϋθ
6 Аддпра1|М (субъединичная) / А803 Гетерологическое примирование ϋΟ
7 Аддпра11М (субъединичная) /А803+МФЛ (2,5 мкг на дозу) Гетерологическое примирование ϋθ
8 Аддпра!|М (субъединичная) / МВ** Гетерологическое примирование ϋθ
9 Аддпра1|М (субъединичная) Гетерологическое примирование ϋθ
10 ФБР Гетерологическое примирование ϋθ
*Н1иапх™.
**МВ готовили, как описано в нижеизложенном разделе.
νΙ.1.1.2. Приготовление препаратов вакцин.
Приготовление МВ.
Эмульсию «масло в воде», названную МВ, готовят в соответствии с рецептом, опубликованном в инструкции, содержащейся в вакцине СЫгоп Вейппд Н1иАб.
Воду для инъекции, 36,67 мг лимонной кислоты и 627,4 мг цитрата Νη·2112О смешивают вместе и объем доводят до 200 мл. 470 мг Т\уееп 80 смешивают с 94,47 мл этого буфера и эту смесь называют раствор А. Масляную смесь готовят путем смешивания 3,9 г сквалена и 470 мг 8рап 85 при перемешивании на магнитной мешалке. Затем к масляной смеси добавляют раствор А и конечный получаемый объем составляет 100 мл. Смесь затем сначала пропускают через иглу 18Ох 1 1/2 и затем помещают в микроожижитель М1108 (из М1сго£1и1б1с§) с двумя образцами для уменьшения размера капель масла. Когда для каждого образца получают размер частиц приблизительно 150 нм, 2 образца объединяют и фильтруют через фильтр 0,2 мкм. Для объединенного образца получают среднее значение ζ 143 нм с полидисперсностью 0,10 на момент ТО и 145 нм с полидисперсностью 0,06 после хранения в течение 4 месяцев при 4°С. Этот размер получают с использованием Ζеΐа8^ζе^ 3000Н8 (из Ма1уегп) в следующих технических условиях:
длина волны лазерного излучения: 532 нм ^е!а3000Н8);
мощность лазера: 50 мВт ^е!а3000Н8);
детекция рассеянного света при 90° ^е!а3000Н8);
температура: 25°С;
длительность: автоматическое определение при помощи программного обеспечения; количество: 3 последовательных измерения;
ζ-средний диаметр: путем кумулятивного анализа.
Препарат для группы 1 (на 1 мл).
10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 для однократной концентрации), а также смесь, содержащую Т\\ееп 80, Тгйоп Х-100 и УЕ8 (количества с учетом детергентов, представленных в штаммах), для достижения конечной концентрации 375 мкг/мл Т\уееп 80, 55 нг/мл Тп1оп Х-100 и 50 мкг/мл УЕ8 добавляют в воду для инъекции. После перемешивания в течение 5 мин последовательно добавляют по 15 мкг каждого штамма НШ1, IΙ3Ν2 и В с 10-минутным перемешиванием после каждого добавления. Препарат перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Препарат для группы 2 (на 1 мл).
10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 для однократной концентрации), а также смесь, содержащую Т\\ееп 80, Тгйоп Х-100 и УЕ8 (количества с учетом детергентов, представленных в штаммах), для достижения конечной концентрации 375 мкг/мл Т\уееп 80, 55 нг/мл Тп1оп Х-100 и 50 мкг/мл УЕ8 добавляют в воду для инъекции. После перемешивания в течение 5 мин последовательно добавляют по 15 мкг каждого штамма НШ1, ΙΙ3Ν2 и В с 10-минутным перемешиванием после каждого добавления. После перемешивания в течение 15 мин добавляют 250 мкл эмульсии МВ. Препарат перемешивают в течение
- 58 011393 мин при комнатной температуре и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Препарат для группы 3 (на 1 мл).
10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 для однократной концентрации), а также смесь, содержащую Τχνυυιι 80, Х-100 и УЕ8 (количества с учетом детергентов, представленных в штаммах), для достижения конечной концентрации 375 мкг/мл Τνυυιι 80, 55 нг/мл 'Гп1оп Х-100 и 50 мкг/мл УЕ8 добавляют в воду для инъекции. После перемешивания в течение 5 мин последовательно добавляют по 15 мкг каждого штамма НШ1, IΙ3Ν2 и В с 10-минутным перемешиванием после каждого добавления. После перемешивания в течение 15 мин добавляют 250 мкл эмульсии 8В62. Препарат перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Препарат для группы 4 (на 1 мл).
10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 для однократной концентрации), а также смесь, содержащую Τνυυιι 80, 'Гп1оп Х-100 и УЕ8 (количества с учетом детергентов, представленных в штаммах), для достижения конечной концентрации 375 мкг/мл Ф^ееи 80, 55 нг/мл 'Гп1оп Х-100 и 50 мкг/мл УЕ8 добавляют в воду для инъекции. После перемешивания в течение 5 мин последовательно добавляют по 15 мкг каждого штамма НШ1, IΙ3Ν2 и В с 10-минутным перемешиванием после каждого добавления. После перемешивания в течение 15 мин добавляют 250 мкл эмульсии 8В62. Смесь вновь перемешивают в течение 15 мин непосредственно перед добавлением 25 мкг МФЛ. Препарат перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Препарат для группы 5 (на 1 мл).
Смешивают равные объемы ФБР и вакцины Е1иАб ™/Опр§иагб™ (имеющаяся в продаже). Препарат перемешивают в течение 15 мин и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Препарат для группы 6 (на 1 мл).
250 мкл ФБР-модиф. рН 7,4 добавляют к 500 мкл дозы А§§пра1™ (имеющаяся в продаже вакцина). После перемешивания в течение 15 мин добавляют 250 мкл 8В62 (готовили в соответствии с методологией, подробно изложенной для масштабируемого получения). Препарат перемешивают в течение 15 мин и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Препарат для группы 7 (на 1 мл).
ФБР-модиф. рН 7,4 (для достижения конечного объема 1 мл) добавляют к дозе 500 мкл А§§пра1™ (имеющаяся в продаже вакцина). После перемешивания в течение 15 мин добавляют 250 мкл 8В62 (приготовленной в соответствии с методологией, подробно изложенной для масштабируемого получения). Затем добавляли 25 мкг МФЛ. Препарат перемешивают в течение 15 мин и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Препарат для группы 8 (на 1 мл).
250 мкл ФБР-модиф. рН 7,4 добавляют к дозе 500 мкг Аддпра1. После перемешивания в течение 15 мин добавляют 250 мкл МВ, приготовленной для группы 2, и препарат перемешивают в течение 15 мин и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Препарат для группы 9 (на 1 мл).
Смешивают равные объемы ФБР-модиф. рН 7,4 и Аддпра1. Препарат перемешивают в течение 15 мин и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
УИ.1.3. Считывания (табл. 40).
КОИ ЦС8): 7 дней после иммунизации.
ША/анализ нейтрализации: 21 день после иммунизации.
Таблица 40
Считывание Момент времени Тип образца И/С Способ анализа
1С8 (СО4.СО8, 11.- 2, ΙΡΝ-γ) 35 день ЛПК С Анализ ЕАС8
Гуморальный ответ 14 день, 44 день Сыворотки крови И ΙΗΑ, пеи!га
И = индивидуальный/С = совокупный.
КОИ анализ (ОСЗ: окрашивание СО4/СО8; ΙΕ-2/ΙΕΝ-γ).
РВМС у 24 мышей/группу собирали на 7 день после иммунизации и тестировали в совокупностях/группу.
УП.2. Результаты.
УИ.2.1. Гуморальный иммунитет.
Активность, ингибирующую гемагглютинацию, против 3 вакцинных штаммов обнаруживали в сыворотке крови 24 животных на группу на 14 день после интраназально гетерологического примирования
- 59 011393 и на 16 день после иммунизации.
Для 3 штаммов и для всех групп после иммунизации обнаружено увеличение титров ΗΙ.
Для одного и того же адъюванта и для 3 штаммов похожие титры ΗΙ были вызваны субъединичной вакциной и убиквитарной вакциной.
Похожие титры ΗΙ были обнаружены для Е1иаб по сравнению с Аддпра1 МВ для 3 штаммов.
Никакого различия не было обнаружено между Е1иапх и Аддпра1 для штаммов Η1Ν1 и В.
Для 3 штаммов были обнаружены статистически значимо более высокие титры ΗΙ, когда вакцина Е1и (убиквиторная или субъединичная) приготовлена с адъювантом А803 с МФЛ или без МФЛ по сравнению с простой вакциной Е1и.
Титры ΗΙ были статистически значимо более высокими для вакцины Е1и (убиквиторной или субъединичной) с адъювантом МВ по сравнению с простой вакциной Е1и только для штамма ААУуоттд.
νΙΙ.2.2. Опосредованный клетками иммунный ответ (Ιί,'δ на 7 день после иммунизации).
ί.Ό4 Т-клеточные ответы - фиг. 17, верхняя часть.
РВМС из 24 мышей на группу отбирали на 7 день после иммунизации и тестировали в одной совокупности/группу. Инактивированные тривалентные полные вирусы (1 мкг/мл) использовали в качестве рестимулирующего антигена. Результаты представлены на фиг. 17, верхняя часть.
С точки зрения ί.Ό4+ Т-клеток, специфических в отношении Е1и полного вируса, экспрессирующих ΙΕ-2, ΙΕΝ-γ или обоих цитокинов (фиг. 17, верхняя часть):
1. Адъюванты С8К демонстрировали ту же самую тенденцию, как обнаружено ранее (пример VI): А803+МФЛ превосходила А803, которая, в свою очередь, превосходила результат, полученный с простой вакциной. Эта тенденция была обнаружена для убиквиторной или субъединичной вакцины.
2. Независимо от препарата (простой, А803 или А803+МФЛ) убиквиторная вакцина вызывала более высокие ί.Ό4+ Т-клеточные ответы по сравнению с субъединичной вакциной.
3. Е1иаб (субъединица+эмульсия «масло в воде» МВ - см. раздел приготовления), по-видимому, вызывает частоту, похожую на частоту для простой вакцины Е1иаг1х.
4. Препараты тривалентной убиквиторной/А803 или тривалентной убиквиторной/А803+МФЛ вызывали более высокие СО4+Т-клеточные ответы по сравнению с препаратом субъединичная вакцина/эмульсия «масло в воде» МВ.
СО8-Т-клеточные ответы - фиг. 17, нижняя часть.
МКПК из 24 мышей на группу отбирали на 7 день после иммунизации и тестировали в одной совокупности/группу. Инактивированные тривалентные полные вирусы (1 мкг/мл) использовали в качестве рестимулирующего антигена.
С точки зрения ί.Ό8+ Т-клеток, специфических в отношении Е1и полного вируса, экспрессирующих ΙΕ-2, ΙΕΝ-γ или обоих цитокинов (фиг. 17, нижняя часть):
1. Отсечение для этого эксперимента было относительно высоким ввиду высоких отрицательных эффектов, обнаруженных для отрицательной контрольной группы с ФБР.
2. Тем не менее, более высокие специфические ί.Ό8 Т-клеточные ответы были обнаружены для мышей, иммунизированных тривалентной убиквиторной/А803+МФЛ по сравнению с другими препаратами вакцин.
νΙΙ.3. Совокупность результатов и заключений.
Получены следующие результаты:
1) Е1и-специфические СЭ4+ Т-клетки, получаемые путем Ιί.'8 на 7 день после иммунизации, продемонстрировали:
1. Похожие ответы получены для Е1иаб по сравнению с Е1иапх.
2. Адъювантный препарат вызывал более высокий иммунный ответ по сравнению с неадъювантной вакциной для убиквиторной противогриппозной вакцины (как обнаружено у людей) и для субъединичной (Аддпра1) вакцины (не оцененной у людей). Адъювант на основе эмульсии «масло в воде» А803, дополненной МФЛ (группы 4 и 9), обеспечивал более высокие ответы по сравнению с адъювантом на основе эмульсии «масло в воде» А803 (группы 3 и 8).
3. Существует тенденция более высоких ί.Ό4 ответов с убиквиторной/А803+МФЛ по сравнению с убиквиторной/А803 (фиг. 17).
4. Ответы, вызываемые убиквиторной вакциной, превосходили ответы, получаемые с субъединичной вакциной (сравнение групп 1-4 и групп 5-9).
5. Убиквиторная вакцина, независимо от того, является ли она адъювантной с А803 с МФЛ или без МФЛ (группы 3 и 4), демонстрировала более высокие ответы ί.Ό4+ Т-клеточные ответы по сравнению с субъединичной вакциной, независимо от того, является ли она Е1иаб (группа 5) или Аддпра1 + МВ (группа 7).
2) Е1и-специфические СЭ8+ Т-клетки, полученные путем Ιί.'8 на 7 день после иммунизация, не продемонстрировали различий между убиквиторной/А83 и убиквиторной простой вакциной (как обнаружено у людей). Существовала тенденция более высоких ί.Ό8+ Т-клеточных ответов при использовании убиквиторной/А803+МФЛ по сравнению с убиквиторной/А803 или убиквиторной простой вакциной.
- 60 011393
3) Для того же самого адъюванта и для 3 штаммов похожие титры Ш были вызваны субъединичной вакциной и убиквиторной вакциной. Для 3 штаммов были обнаружены статистически значимо более высокие титры, когда Ии вакцина (субъединичная или убиквиторная) приготовлена с адъювантом А803 или А803+МФЛ по сравнению с простой вакциной Ии (Ии вакцина МВ>Ии вакцина простая только для штамма АЖуотшд).
Пример VII. Клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа и А803 с адъювантом МФЛ или без него.
νΐΠ.1. План исследования.
Открытое рандомизированное контролируемое исследование I фазы проводили в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет для оценки реактогенности и иммуногенности противогриппозных вакцин-кандидатов 61ахо8тйБК1те Вю1ощса15. содержащих адъювант А803 или А803+МФЛ, вводимых внутримышечно по сравнению с вакциной Ииапх™ (известной как а-К1х™ в Бельгии).
Оценивали три параллельные группы:
1) группа из 50 субъектов, получающих одну дозу восстановленной и А803 адъювантной противогриппозной вакцины 8ν (ИиА803);
2) группа из 50 субъектов, получающих одну дозу восстановленной и Ии А803+МФЛ адъювантной противогриппозной вакцины 8ν (Ии А803+МФЛ);
3) контрольная группа из 50 субъектов, получающих одну дозу Ииапх™ (Ииапх).
νΐΠ.2. Состав вакцины и введение.
Штаммы, используемые в трех вакцинах, были теми же самыми, как рекомендованные ВОЗ для 2004-2005 сезона №г111егп Ηет^5ρΗе^е. т.е. Λ/№\ν Са1ебоша/20/99 (Η1Ν1), Λ/№\ν СаНГогша/3/2003 (Η3Ν2) и В/Лапдки/10/2003. Подобно Ииапх™/а-К1х™ имеющаяся в продаже вакцина, используемая для сравнения, адъювантная вакцина (А803 или А803+МФЛ) содержит 15 мкг гемагглютинина (ΗА) каждого штамма вируса гриппа на дозу.
Адъювантные противогриппозные вакцины-кандидаты представляют собой 2-компонентные вакцины, состоящие из концентрированных тривалентных инактивированных убиквиторных антигенов вириона, представленных в стеклянной виале I типа, и предварительно заполненного стеклянного шприца I типа, содержащего адъювант (А803 или А803+МФЛ). Они были приготовлены, как подробно изложено в примере II. Три инактивированных убиквиторных антигена вириона (одновалентные партии), используемые в препарате адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата, являются теми же самыми, что и активные ингредиенты, используемые в препарате имеющейся в продаже Ииапх™/а-К1х.
А803 адъювантная вакцина.
А803-адъювантная противогриппозная вакцина-кандидат представляет собой 2-компонентную вакцину, состоящую из концентрированных тривалентных инактивированных убиквиторных антигенов вириона, представленных в стеклянной виале I типа (335 мкл) (антигенный контейнер), и предварительно заполненного стеклянного шприца I типа, содержащего эмульсию 8В62 (335 мкл) (адъювантный контейнер). Описание и композиция вакцины-кандидата А803 представлены в примере III.
А803+МФЛ адъювантная вакцина.
Кратко, А803+МФЛ-адъювантная противогриппозная вакцина-кандидат представляет собой 2-компонентую вакцину, состоящую из концентрированных тривалентных инактивированных убиквиторных антигенов вириона, представленных в стеклянной виале I типа (335 мкл) (антигенный контейнер), и предварительно заполненного стеклянного шприца I типа, содержащего адъювант А803+МФЛ (360 мкл) (адъювантный контейнер). В момент инъекции содержимое антигенного контейнера удаляют из виалы путем использования шприца, содержащего адъювант А803+МФЛ, с последующим мягким перемешиванием содержимого шприца. Перед инъекцией использованную иглу заменяют внутримышечной иглой и объем корректируют до 530 мкл. Одна из доз разведенной А803+МФЛ-адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 530 мкл. Для получения 15 мкг ΗА для каждого штамма вируса гриппа при разведении А803+МФЛ адъювантной вакцины инактивированный убиквиторный антиген вириона вдвое более концентрирован в антигенном контейнере (т.е. 60 мкг ΗΛ/мл) по сравнению с Ииапх™ (т.е. 30 мкг ΗΛ/мл).
Состав одной дозы восстановленной адъювантной противогриппозной вакцины идентичен представленному в табл. 45 (см. пример XI), за исключением штаммов вируса гриппа. Обе вакцины вводили внутримышечно.
νΐΠ.3. Задача и конечные результаты КОИ.
Задачи КОИ заключались в том, чтобы определить, какая иммуногенная композиция между препаратом с адъювантом А803 или А803+МФЛ по сравнению с композицией без какого-либо адъюванта обладает самой сильной иммуностимулирующей активностью в отношении СЭ4 и СЭ8-опосредованного иммунитета у индивидов, вакцинированных антигенами вируса гриппа.
- 61 011393 νΙΙΙ.3.1. Конечные результаты КОИ.
Обнаруженная переменная.
На 0 и 21 день: частота цитокинположительных СЭ4/СЭ8 клеток на 106 клеток в 5 различных цитокинах. Каждый тест количественно определяет ответ СЭ4/СЭ8 Т-клеток на совокупность 3 следущих антигенов:
антиген №\ν Са1ейоша;
антиген ХАуоштд;
антиген Лапдки.
Переменные-производные.
Антигенспецифический СЭ4 и СЭ8-Т-клеточный ответ, выраженный в 5 различных тестах:
(а) клетки, продуцирующие по меньшей мере два различных цитокина (СО40Ь, ΙΕ-2, ΙΕΝ-γ, ТИР-α);
(б) клетки, продуцирующие по меньшей мере СО40Ь и другой цитокин (ΙΕ-2, ТИР-а, ΙΕΝ-γ);
(в) клетки продуцирующие по меньшей мере ΙΕ-2 и другой цитокин (СО40Ь, ТИР-а, ΙΓΝ-γ);
(г) клетки, продуцирующие по меньшей мере ΙΒΝ-γ и другой цитокин (ΙΕ-2, 'ТЫР-а, СО40Ь);
(д) клетки, продуцирующие по меньшей мере ТИР-а и другой цитокин (ΙΕ-2, СО40Ь, ΙΡΝ-γ). Анализ КОИ ответа.
КОИ анализ основан на общей вакцинированной группе:
(а) для каждой обрабатываемой группы частоту СЭ4/СЭ8 Т-лимфоцитов, секретирующихся в ответ, определяли для каждой вакцинируемой группы в каждый момент времени (0 день, 21 день) и для каждого антигена: №\ν Са1ейоша, ХАуоштд и Лапдки и совокупность 3 различных штаммов;
(б) описательная статистика индивидуальных различий между ответами в моменты времени (ПослеПре) для каждой вакцинируемой группы и каждого антигена в каждом из 5 различных цитокинов;
(в) сравнение 3 групп в отношении 5 различных цитокинов по
СЭ4 Т-клеточному ответу на №\ν Са1ейоша, ХАуоттд, Лапдки и совокупность 3 штаммов,
СЭ8 Т-клеточному ответу на №\ν Са1ейоша, ХАуоттд, Лапдки и совокупность 3 штаммов;
(г) непараметрический тест (тест Крушкалла-Валлиса) использовали для сравнения различий между 3 группами и статистическое р-значение рассчитывали для каждого антигена для каждого из 5 различных цитокинов;
(д) тест Вилкоксона использовали для тестирования парного сравнения 2 групп соответственно между Р1и А803+МФЛ с Р1иапх, Р1и А803+МФЛ с Р1и А803 и Р1и А803 с Р1иапх;
(е) все тесты значимости были двусторонними. р-значения меньше чем или равные 0,05 рассматривали как статистически значимые.
νΠΙ.3.2. КОИ результаты.
Результаты выражали в виде частоты цитокинположительных СЭ4 или СЭ8 Т-клеток в СЭ4 или СЭ8 Т-клеточной субпопуляции.
Частота антигенспецифических СЭ4 Т-лимфоцитов:
(а) частоту антигенспецифических СЭ4 Т-лимфоцитов, секретирующихся в ответ, определяли для каждой вакцинируемой группы в каждый момент времени (0 день, 21 день) и для каждого антигена (совокупного, №\ν Са1ейоша, ХАуоттд и Лапдки) по аналогии с примером ΙΙΙ;
(б) сравнение различия частоты антигенспецифических СЭ4 Т-лимфоцитов между 3 группами при помощи теста Крушкалла-Валлиса, все р-значения были меньше чем 0,05 и рассматривались как статистически значимые;
(в) сравнение различия частоты антигенспецифических СЭ4 Т-лимфоцитов между группами Р1и А803+МФЛ и Р1иапх при помощи теста Вилкоксона, все р-значения были меньше чем 0,05 и рассматривались как статистически значимые;
(г) сравнение различия частоты антигенспецифических СЭ4 Т-лимфоцитов между группами Р1и А803 и Р1иапх при помощи теста Вилкокосона, все р-значения были меньше чем 0,05 и рассматривались как статистически значимые;
(д) сравнение различия частоты антигенспецифических СЭ4 Т-лимфоцитов между группами Р1и А803 и Р1и А803+МФЛ при помощи теста Вилкоксона, все р-значения были больше чем 0,05 и рассматривались как статистически незначимые.
Индивидуальное различие между моментами времени (После-Перед) для СЭ4 Т-лимфоцитов:
(а) описательную статистику индивидуальных различий между моментами времени (после-перед) для СЭ4 Т-лимфоцитарных ответов рассчитывали для каждой вакцинируемой группы и для каждого антигена для каждого из 5 различных цитокинов по аналогии с примером ΙΙΙ;
(б) сравнение индивидуальных различий между После-Перед для антигенспецифических СЭ4 Тлимфоцитарных ответов между 3 группами при помощи теста Крушкалла-Валлиса, все р-значения были меньше чем 0,001 и рассматривались как статистически высокозначимые;
(в) сравнение индивидуальных различий между После-Перед для антигенспецифических СЭ4 Тлимфоцитарных ответов между Р1и А803+МФЛ и Р1иапх с использованием теста Вилкоксона, все рзначения были меньше чем 0,05 и рассматривались как статистически значимые;
- 62 011393 (г) сравнение индивидуальных различий между После-Перед для антигенспецифических СЭ4 Тлимфоцитарных ответов между Р1и А803 и Р1иапх с использованием теста Вилкоксона, все р-значения были меньше чем 0,001 и рассматривались как статистически высокозначимые;
(д) сравнение индивидуальных различий между После-Перед для антигенспецифических СЭ4 Тлимфоцитарных ответов между Р1и А803+МФЛ и Р1и А803 с использованием теста Вилкоксона, все рзначения были больше чем 0,05 и рассматривались статистически незначимые.
νΙΙΙ.4. Ответ на основе В-клеточной памяти. Задача и конечные результаты.
Задача исследования заключалась в исследовании того, вызывается ли значительно частота В-клеток памяти, специфических в отношении Р1и антигена, после единичной внутримышечной вакцинации Р1и вакциной-кандидатом, содержащей адъювант А803+МФЛ или А803, по сравнению с Р1иапх в популяции пожилых людей. Частоту В-клеток памяти оценивали путем В-клеточного анализа Ε1^8роΐ.
νΙΙΙ.4.1. Конечные результаты ответа на основе В-клеточной памяти.
Конечные результаты представляют собой:
(а) на 0, 21 день: клетки, образующиеся ш-уйго, культивируемые В-клетки памяти, измеренные путем В-клеточного Ε^I8ΡО8Т у всех субъектов с точки зрения частоты антител в плазме крови, специфических в отношении антигена на миллион (106) клеток плазмы крови, продуцирующих ШС;
(б) различие между вакцинациями перед (21 день) и после (0 день) также выражено в виде частоты клеток, продуцирующих антитела, специфические в отношении вируса гриппа, на миллион (106) клеток, продуцирующих антитела.
νΙΙΙ.4.2. Результаты ответа на основе В-клеточной памяти.
Определяли частоту клеток, продуцирующих антитела, специфические в отношении вируса гриппа, на миллион (106) клеток, продуцирующих антитела. Результаты продемонстрировали, что частота В-клеток памяти, специфических в отношении Р1и антигена между группами Р1и А803+МФЛ и Р1иапх при помощи теста Вилкоксона, была значимо (р<0,05) более высокой для штамма В/Лапдки, а не для двух других штаммов (А штаммы №\ν Са1ебоша и ХУуоштд).
Также определяли индивидуальное различие между моментами времени (После-Перед) для В-клеток памяти, специфических в отношении Р1и антигена. Результаты продемонстрировали, что индивидуальное различие между моментами времени (После-Перед) по частоте В-клеток памяти, специфических в отношении Р1и антигена между группами Р1и А803+МФЛ и Р1иапх при помощи теста КрушкаллаВаллиса, было значимо (р<0,05) более высоким для штамма В/Лапдки, а не для двух других штаммов (штаммы А №\ν Са1ебоша и ХУуоштд).
Результаты представлены на фиг. 18.
Пример ЙХ. Преклиническая оценка адъювантной и неадъювантной противогриппозных вакцин у хорьков (исследование ΙΙΙ)
ЙХ.1. Обоснование и задачи.
В этом исследовании сравнивали имеющуюся в продаже тривалентную противогриппозную убиквиторную вакцину С8К, без адъюванта (Р1иапх™) или с адъювантом А803+МФЛ, с двумя другими имеющимися в продаже субъединичными вакцинами:
Р1иаб™, адъювантная субъединичная вакцина Сй1гоп (адъювант представляет собой адъювант МР59 Сй1гоп);
Адпрра1™, неадъювантная имеющаяся в продаже субъединичная вакцина Сй1гоп, которая в настоящем исследовании приготовлена с адъювантом А803.
Задача данного исследования заключалась в оценке способности этих вакцин уменьшать симптомы заболевания (температуру организма и выделение вируса) в назальных секретах хорьков, иммунизированных гетерологическими штаммами.
Конечные результаты:
1) Первичный конечный результат: уменьшение выделения вируса в назальных смывах после гетерологического контрольного заражения.
2) Вторичные конечные результаты: анализ гуморального ответа путем ША и контроль температуры при примировании и гетерологическом контрольном заражении.
ЙХ.2. План эксперимента.
ЙХ.2.1. Обработка/группа.
Самки хорьков (Ми81е1а рШогшк (иго) в возрасте 14-20 недель были получены в МШАУ Сопкийапсу (Ηатр8Й^^е, ПК). Хорьков интраназально примировали на 0 день гетеросубтипическим штаммом Η1Ν1 А/81оскйо1ш/24/90 (4Ьод ТСГО50/мл). На 21 день хорькам внутримышечно инъецировали полную человеческую дозу (дозу вакцины 1 мл, 15 мкг ΗА/штамм) комбинации Η1Ν1 А/№\\' Са1ебоша/20/99, Η3Ν2 АЛУуо1птд/3/2003 и В/Лапд8и/10/2003. Хорьков затем интраназальным путем сенсибилизировали на 41 день гомотипическим штаммом Η3Ν2 А/Рапата/2007/99 (4,51Ьод ТСЮ^/мл).
Группы (6 хорьков/группу) проиллюстрированы в табл. 41. Считывания, которые осуществляли, подробно изложены в табл. 42.
- 63 011393
Таблица 41
Группа Антиген(ы) + доза Препарат + доза Комментарии (например:схема /путь/контрольное заражение) Другие обработки
1 Тривалентная простая (Пиапх™) Полная НО: 15 мкг НА/штамм ВМ; 21 день Примирование Η1Ν1 (А/81оско1т/24 /90) 0 день
2 Тривалентная А503+МФЛ Полная Ηϋ: 15 мкг НА/штамм ВМ; 21 день Примирование Η1Ν1 (А/81оско1т/24 /90) 0 день
3 Пиаб™ Полная НО: 15 мкг НА/штамм ВМ; 21 день Примирование Η1Ν1 (А/81оско1т/24 /90) 0 день
4 Адпрра!1МА803 Полная Ηϋ: 15 мкг НА/штамм ВМ; 21 день Примирование Η1Ν1 (А/81оско1т/24 /90) 0 день
К.2.2. Приготовление препаратов вакцин.
Убиквиторная тривалентная простая (неадъювантная): препарат на 1 мл.
10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 для однократной концентрации), а также смесь, содержащую Тхееп 80, Тгйоп Х-100 и VΕ8 (количества с учетом детергентов, представленных в штаммах), добавляют в воду для инъекции. Достигаемые количества детергентов являются следующими: 375 мкг/мл Тхееп 80, 55 нг/мл Тгйоп Х-100 и 50 мкг/мл VΕ8 на 1 мл. После перемешивания в течение 5 мин последовательно добавляют по 15 мкг каждого штамма НШ1, №N2 и 17,5 мкг штамма В с 10-минутным перемешиванием после каждого добавления. Препарат перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
Убиквиторная тривалентная вакцина с адъювантом А803+МФЛ: препарат на 1 мл.
10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 для однократной концентрации), а также смесь, содержащую Тхееп 80, Тгйоп Х-100 и VΕ8 (количества с учетом детергентов, представленных в штаммах), добавляют в воду для инъекции. Достигаемые количества детергентов являются следующими: 375 мкг/мл Тхееп 80, 55 нг/мл Тгйоп Х-100 и 50 мкг/мл VΕ8 на 1 мл. После перемешивания в течение 5 мин последовательно добавляют по 15 мкг каждого штамма НШ1, №N2 и В с 10-минутным перемешиванием после каждого добавления. После перемешивания в течение 15 мин добавляют 250 мкл эмульсии 8В62 (приготовленной, как подробно изложено в примере 11.1) Смесь вновь перемешивают в течение 15 мин непосредственно перед добавлением 25 мкг МФЛ. Препарат перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и хранят при 4°С в том случае, если не вводят сразу же.
НиАб™ препарат: препарат на 1 мл.
2-кратное разведение вакцины НиАб™ осуществляют в буфере ФБР при рН 7,4.
Препарат Адпрра1™ А803: препарат на 1 мл.
250 мкл буфера ФБР рН 7,4 добавляют к одной дозе Аддпра1™. После смешивания добавляют 2 50 мкл эмульсии 8В62 (приготовленной, как подробно изложено в примере 11.1). Смесь перемешивают при комнатной температуре.
- 64 011393
ΙΧ.2.2. Считывания.
Таблица 42
Считывание Момент времени Тип образца И/С Способ анализа
Выделение вируса С Д-З по Д+7 после примирования С Д+1 по Д+5 после контрольного заражения Назальные смывы В Титрование
Контроль Т° С Д-З по Д+4 после примирования с 0-2 по 0+4 после контрольного заражения Имплантат в брюшинную полость В Телеметрия
ΙΗΑ перед, после примирования, после имм., после контрольного заражения Сыворотка крови В ΙΗΑ
И = индивидуальный/С = совокупный.
ΙΧ.3. Результаты (фиг. 19-22).
ΙΧ.3.1. Контроль температуры.
Индивидуальную температуру контролировали с использованием датчиков и путем телеметрической регистрации. Все имплантаты проверяли и обновляли и осуществляли новую калибровку путем Ό8Ι перед помещением в брюшинную полость. Всех животных индивидуально содержали в клетках в течение этих измерений.
Температуру контролировали с 2 дней перед контрольным заражением до 4 дней после контрольного заражения каждые 15 мин и среднее значение рассчитывали в середине дня. Результаты представлены на фиг. 19.
Результаты.
После контрольного заражения максимальное значение температуры организма было обнаружено после иммунизации хорьков неадъювантной (простой) тривалентной убиквиторной (Ниапх™) или субъединичной вакцины Ниад™ (которая содержит эмульсию МТ59 «масло в воде»). Никакие пики не обнаружили после иммунизации хорьков тривалентной субъединичной вакциной с адъювантном А803+МФЛ, но не с субъединичной Адпрра1™ адъювантной с А803. В заключение, дополнительная ценность А803содержащей вакцины при предотвращении увеличения температуры организма после контрольного заражения продемонстрирована для убиквиторной и субъединичной протестированных вакцин, в противоположность неспособности МТ59 - содержащих вакцин предотвращать это увеличение температуры у хорьков после контрольного заражения.
ΙΧ.3.2. Выделение вируса.
Титрование вируса в назальных смывах осуществляли на 6 животных на группу. Назальные смывы осуществляли путем введения 5 мл ФБР в обе ноздри бодрствующих животных. Инокулум собирали в чашку Петри и помещали в контейнер для образца при -80°С (сухой лед).
Все назальные образцы сначала подвергали стерильной фильтрации через фильтры 8рт X (СозДаг) для удаления каких-либо бактериальных примесей. 50 мкл серийных десятикратных разведений назальных промывок переносили в микротитрационные планшеты, содержащие 50 мкл среды (10 лунок/разведение). Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл клеток МОСК (2,4х105 клеток/мл) и инкубировали при 35°С в течение 5-7 дней. После 5-7 дней инкубации культуральную среду осторожно удаляли и добавляли 100 мкл 1/20 А8Т-1, содержащей среду, и инкубировали в течение еще 18 ч.
Интенсивность желтого формазанового окрашивания, продуцируемого после восстановления А8Т-1 живыми клетками, пропорциональна количеству живых клеток, находящихся в лунке к концу анализа вирусного титрования, и количественно оценивали путем измерения абсорбции в каждой лунке при подходящей длине волны (450 нм). Отсечение определяют как среднюю оптическую плотность (ΟΌ) для неинфицированных контрольных клеток - 0,3ΟΌ (0,3ΟΌ соответствует +/-3 Ст.Откл. ΟΌ для неинфицированных контрольных клеток). Положительную оценку определяют, когда ΟΌ меньше отсечения, и, наоборот, отрицательную оценку определяют, когда ΟΌ больше отсечения. Титр высвобожденных вирусов определяли путем Кеед апд МиепсЕ и выражали как Ьод ТСДП50/мл.
- 65 011393
Результаты.
Результаты представлены на фиг. 20. Меньшее выделение вируса обнаружено после контрольного заражения тривалентной убиквиторной вакциной с адъювантом А803+МФЛ, или субъединичной вакциной Адпрра1™ с адъювантом А803, по сравнению с очень низким выделением вируса, обнаруженным после иммунизации хорьков неадъювантной (простой) тривалентной убиквиторной вакциной (Ниапх™) или субъединичной вакциной Ниаб™.
По аналогии с обсуждавшимся в отношении увеличения температуры организма дополнительная ценность А803-содержащих вакцин обнаружена по сравнению с МР59-содержащими вакцинами.
ΙΧ.3.3. Титры ΗΙ.
Титры антител против гемагглютинина в отношении штамма вируса гриппа Η3Ν2 определяли с использованием теста ингибирования гемагглютинации (ΗΙ). Принцип ΗΙ теста основан на способности специфических антител к вирусу гриппа ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (КВС) цыплят гемагглютинином вируса гриппа (ΗΛ). Сыворотки крови сначала обрабатывали 25% раствором нейраминидазы (КОЕ) и инактивировали теплом для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сывороток крови инкубировали с 4 единицами гемагглютинации для каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыплят и оценивали ингибирование агглютинации. Титры выражали как обратную величину наибольшего разведения сыворотки крови, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Поскольку первое разведение сыворотки крови составляло 1:10, не обнаруживаемый уровень оценивали как титр, равный 5.
Результаты.
После иммунизации Η3Ν2 Λ/^уοт^ηд более высокие гуморальные ответы (титры ΗΙ) были обнаружены у хорьков, иммунизированных тривалентной убиквиторной вакциной с адъювантом А803+МФЛ или субъединичной вакциной Адпрра1™ с адъювантом А803, по сравнению с гуморальным ответом, обнаруженным после иммунизации хорьков неадъювантной (простой) тривалентной убиквиторной вакциной (Пиапх™) или субъединичной вакциной Ниаб™ (фиг. 21).
После иммунизация Η3Ν2 Λ/\Vуοт^ηд более высокие гуморальные ответы (титры ΗΙ) также были обнаружены против дрейфующего штамма Η3Ν2 Λ/Ρаηата, используемого в качестве штамма для экспериментального заражения хорьков, иммунизированных тривалентной убиквиторной вакциной с адъювантом А803+МФЛ или Адпрра1™ с адъювантом А803 по сравнению с хорьками, иммунизированными тривалентной убиквиторной простой вакциной или Ниаб (фиг. 22).
Перекрестную реакцию обнаруживали с адъювантом по изобретению (А803 или А803+МФЛ) против гетерологического штамма, коррелирующего с защитой, обнаруженной у хорьков, иммунизированных тривалентной убиквиторной вакциной с адъювантом А803+МФЛ или субъединичной вакциной Адпрра1™ с адъювантом А803, и затем сенсибилизировали этим гетерологическим штаммом. Эта перекрестная реактивность в отношении гетерологического штамма, вызываемая А803-содержащими вакцинами, не вызывалась вакцинами с адъювантом ΜΡ59 (НцАб™).
Пример Χ. Клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа и адъювант А803 с МФЛ или без МФЛ.
Данные о персистентности иммуногенности на 90 и 180 день.
Х.1. План исследования.
Открытое рандомизированное контролируемое исследование Ι фазы проводили в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет (>65 лет) для оценки реактогенности и иммуногенности противогриппозных вакцин-кандидатов С1аxο8т^ΐЬΚ1^ηе ВюЦдюак, содержащих адъювант А803 или А803+МФЛ, вводимых внутримышечно по сравнению с вакциной Ниапх™ (известной как а-К1х™ в Бельгии). Это исследование продолжает изложенное в примере УШ.
Оценивали три параллельные группы:
1) группа из 50 субъектов, получающих одну дозу восстановленной и А803 адъювантной противогриппозной вакцины 8У (НцА803);
2) группа из 50 субъектов, получающих одну дозу восстановленной и Иц А803+МФЛ адъювантной противогриппозной вакцины 8У (Пи А803+МФЛ);
3) контрольная группа из 50 субъектов, получающих одну дозу Ниапх™ (Ниапх).
Х.2. Результаты по иммуногенности.
Х.2.1. Конечные результаты гуморального иммунного ответа.
Для оценки гуморального иммунного ответа, вызываемого вакциной с адъювантом А803 и А803+МФЛ и его персистенции для каждой обрабатываемой группы, рассчитывали следующие параметры.
На 0, 21, 90 и 180 день: сывороточные титры антител, ингибирующих гемагглютинацию (ΗΙ), тестировали отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа соответственно, представленных в вакцине (антитела против Η1Ν1, антитела против Η3Ν2 и анти-В-антитела):
сывороточные ГСТ антител ΗΙ с 95% ДИ на 0, 21, 90 и 180 день;
- 66 011393 уровни сероконверсии с 95% ДИ на 21, 90 и 180 день;
факторы превращения с 95% ДИ на 21 день; серопротективные уровни с 95% ДИ на 0, 21, 90 и 180 день. Результаты.
ГСТ для антител ΗΙ с 95% ДИ представлены на фиг. 23. ГСТ антител перед вакцинацией для всех 3 штаммов вакцины находились в том же самом диапазоне для 3 групп. После вакцинаций уровни антител против гемагглютинина значительно увеличивались. После вакцинации ГСТ антител для 3 вакцинных штаммов оставался, тем не менее, в тех же самых диапазонах для всех вакцин. На 21 день слабая тенденция в пользу 2 адъювантных вакцин по сравнению с Р1иапх отмечена для штаммов ΑΝΑ\ν Са1ебоша и В/Лапдзи и среди двух адъювантных вакцин более высокие ГСТ обнаружены в отношении РЬи А803 для штаммов А/Дуоттд и В/Лапдзи.
Та же самая тенденция обнаружена на 90 день. На 180 день ГСТ антител для 3 вакцинных штаммов находились в том же самом диапазоне для 3 вакцин.
Все противогриппозные вакцины удовлетворяли требованиям европейских руководящих органов по ежегодной регистрации инактивированных противогриппозных вакцин |\о1е' £ог Ошбапсе оп НагтошзаЦоп о£ Вецшгетеп^ £ог Iп Пиепха Уасстез £ог Ше 1ттипо1од1са1 аззеззтеп! о£ Ше аппиа1 Чгат сйапдез (СРМР/ВДР/214/96)] у субъектов в возрасте больше 60 лет. Через 3 месяца (90 дней) и 6 месяцев (180 дней) после вакцинации серопротективные уровни оставались более высокими по сравнению с минимальным уровнем 60%, требующимся европейскими руководящими органами независимо от рассматриваемой исследуемой группы. На 90 день все еще достигался минимальный уровень сероконверсии 30%, требующийся европейскими руководящими органами, для всех штаммов вакцин в 3 вакцинных группах, за исключением Р1иапх для штамма ΑΝΑ\ν Са1ебоша. На 180 день это все еще достигалось для штаммов А/Дуоттд и В/Лапдзи с 3 вакцинами, но не для штамма Α ΝΑ\ν Са1ебоша (табл. 43 и 44).
Таблица 43
Серопротективные уровни в виде процента вакцинированных пациентов с сывороточным титром ингибирования гемагглютинации, превышающим или равным 1:40 (группа АТР в отношении иммуногенности)
>1:40 95% ДИ
Антитело Группа Момент времени N η % НП ВП
Α/Νενν Са1ес1оп1а Яи А803+ МФЛ Пре 50 28 56,0 41,3 70,0
ПВ (21 День) 50 46 92,0 80,8 97,8
ПВ (90 день) 50 43 86,0 73,3 94,2
- 67 011393
ПВ (180 день) 50 39 78,0 64,0 88,5
Пиапх Пре 50 26 52,0 37,4 66,3
ПВ (21 день) 50 46 92,0 80,8 97,8
ПВ (90 день) 50 38 76,0 61,8 86,9
ПВ (180 день) 50 34 68,0 53,3 80,5
НиАЗОЗ Пре 49 28 57,1 42,2 71,2
ПВ (21 день) 49 48 98,0 89,1 99,9
ПВ (90 день) 49 45 91,8 80,4 97,7
ПВ (180 день) 49 38 77,6 63,4 88,2
Α/ν\/νοηηίηπ Пи А803+ МФЛ Пре 50 33 66,0 51,2 78,8
ПВ (21 день) 50 47 94,0 83,5 98,7
ПВ (90 день) 50 46 92,0 80,8 97,8
ПВ (180 день) 50 45 90,0 78,2 96,7
Пиапх Пре 50 32 64,0 49,2 77,1
ПВ (21 день) 50 50 100 92,9 100,0
ПВ (90 День) 50 49 98,0 89,4 99,9
ПВ (180 день) 50 50 100 92,9 100,0
ПиАЗОЗ Пре 49 34 69,4 54,6 81,7
ПВ (21 день) 49 48 98,0 89,1 99,9
- 68 011393
В/Лапдзи
ПВ (90 день) 49 46 93,9 83,1 98,7
ПВ (180 День) 49 47 95,9 86,0 99,5
Пи А803+МФЛ Пре 50 19 38,0 24,7 52,8
ПВ (21 день) 50 50 100 92,9 100,0
ПВ (90 день) 50 47 94,0 83,5 98,7
ПВ (180 день) 50 46 92,0 80,8 97,8
Пиапх Перед 50 17 34,0 21,2 48,8
ПВ (21 день) 50 48 96,0 86,3 99,5
ПВ (90 День) 50 47 94,0 83,5 98,7
ПВ (180 День) 50 47 94,0 83,5 98,7
ПиАЗОЗ Пре 49 25 51,0 36,3 65,6
ПВ (21 день) 49 49 100 92,7 100,0
ПВ (90 день) 49 47 95,9 86,0 99,5
ПВ (180 день) 49 46 93,9 83,1 98,7
Ν = количество субъектов, для которых имеются результаты.
п/% = количество/процент субъектов с титром в пределах заданного диапзона. Пре = титр перед вакцинацией.
ПВ (21 день) = забор крови после вакцинации на 21 день.
ПВ (90 день) = забор крови после вакцинации на 90 день.
ПВ (180 день) = забор крови после вакцинации на 180 день.
- 69 011393
Таблица 44 Уровень сероконверсии для титров антител, ингибирующих гемагглютинацию (ΗΙ), определенных в виде процента вакцинированных пациентов, которые имеют по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточного титра ΗΙ в каждый момент времени после вакцинации по сравнению с 0 днем (группа АТР в отношении иммуногенности)
Вакцинный штамм Момент времени Группа N 4-кратное
η % 95%ДИ
НП ВП
Α/ΝΕ\Λ/ ΟΑίΕϋΟΝΙΑ 21 День Пи А803+ МФЛ 50 30 60,0 45,2 73,6
Ниапх 50 25 50,0 35,5 64,5
нидвоз 49 31 63,3 48,3 76,6
90 День Ни А803+ МФЛ 50 19 38,0 24,7 52,8
Ниапх 50 14 28,0 16,2 42,5
Ни А803 49 17 34,7 21,7 49,6
180 День НиАЗОЗ+МФЛ 50 12 24,0 13,1 38,2
Ниапх 50 11 22,0 11,5 36,0
Ни А803 49 10 20,4 10,2 34,3
ΑΛΛ/ΥΟΜΙΝΟ 21 День Ни А803+ МФЛ 50 46 92,0 80,8 97,8
Ниапх 50 38 76,0 61,8 86,9
Ни А803 49 40 81,6 68,0 91,2
90 День НиАЗОЗ+МФЛ 50 33 66,0 51,2 78,8
Ниапх 50 33 66,0 51,2 78,8
Ни АЗОЗ 49 31 63,3 48,3 76,6
180 День Ни А303+ МФЛ 50 27 54,0 39,3 68,2
Ниапх 50 23 46,0 31,8 60,7
Ни А603 49 26 53,1 38,3 67,5
Β/ΛΑΝΘδΙΙ 21 День Ни А803+ МФЛ 50 44 88,0 75,7 95,5
Ниапх 50 38 76,0 61,8 86,9
90 День Ни А803 НиАЗОЗ+МФЛ Ниапх Ни А803 49 50 50 49 43 37 36 37 87,8 74,0 72,0 75,5 75,2 59,7 57,5 61,1 95.4 85.4 83,8 86,7
180 День Ни А803+ МФЛ 50 32 64,0 49,2 77,1
Ниапх 50 29 58,0 43,2 71,8
Ни АЗОЗ 49 31 63,3 48,3 76,6
N = количество субъектов, для которых имеются результаты перед и после вакцинации. п/% = количество/процент субъектов по меньшей мере с 4-кратным увеличением. 95% ДИ = точный 95% доверительный интервал. НП = нижний предел; ВП = верхний предел.
Х.2.2. Конечные результаты для ответа КОИ.
Для оценки клеточного иммунного ответа, вызываемого адъювантными вакцинами, и его персистенции параметры после вакцинации рассчитывали для каждой обрабатываемой группы в каждый момент времени (0, 21, 90 и 180 день) с частотой цитокинположительных СБ4/СП8 клеток на 106 в различных тестах (антигены Νι'\ν Са1ебоша, Ауопнпц и Лапдзи рассматривались отдельно, а также совокупно на 0 и 21 день; антигены Са1ебоша, Ауопнпц, Лапдзи и Νν Уогк рассматривались отдельно, а также объединялись на 90 и 180 день):
все пары: клетки, продуцирующие по меньшей мере два различных цитокина (СВ40Ь, ΙΡΝ-γ, 1Б-2, ΤΝΡ-α);
- 70 011393
СО40Б: клетки, продуцирующие по меньшей мере СО40Ь и другой цитокин (ΖΕΝ-γ, ^-2, ЮТ-а); ΖΕΝ-γ: клетки, продуцирующие по меньшей мере ΖΕN-γ и другой цитокин (СО40Ь, ^-2, ΙΝΕ-ο); ^-2: клетки, продуцирующие по меньшей мере ^-2 и другой цитокин (СО40Ь, ΣΕΝ-γ, ЮТ-а); ЮТ-а: клетки, продуцирующие по меньшей мере ЮТ-а и другой цитокин (СО40Ь, IΕN-γ, ^-2). Результаты.
Основные обнаружения (фиг. 24):
(а) через 21 день после вакцинации частота цитокинположительных СЭ4 Т-клеток (^-2, СО40Ь, ЮТ-а и ΣΕN-γ) была значительно выше в двухадъювантной вакцинной группе по сравнению с группой Ε1ι.ι;·ιπχ. Тем не менее, между двумя адъювантами не обнаружено статистически значимое различие;
(б) все статистические различия между адъювантными вакцинами и Ε1ι.ι;·ιπχ поддерживались до 90 дня и 180 дня, за исключением следующих на 180 день:
не было обнаружено статистически значимых различий между Ε1иА803/МФЛ и Ε1ι.ι;·ιπχ для всех пар, СО40Ь, ΣΕN-γ и ^2 (только штамм ХУуотпщ) и для пары СО40Б и ЮТ-а (только штамм №\ν Уогк);
не обнаружено никаких статистически значимых различий между Ε1иА803 и Ε1ι.ι;·ιπχ в отношении ^2 (только штамм Лапдки);
(в) отсутствие статистически значимых различий между двумя адъювантными вакцинами подтверждалось до 90 дня и 180 дня;
(г) различие между перед и после вакцинации (21 день) в ответах виде СЭ4 Т-лимфоцитов для всех исследованных цитокинов (^-2, СО40Ь, Т№-а и ΣΕN-γ) было значительно более высоким с двухадъювантными вакцинами по сравнению с Ε1ι.ι;·ιπχ™. Тем не менее, значительное различие между обоими адъювантами не было обнаружено;
(д) вакцинация не оказывала измеряемого воздействия на СЭ8 ответ независимо от обрабатываемой группы.
Пример XI. Клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа и адъювант А803 с МФЛ.
Х11. План и задачи исследования
Для оценки реактогенности и иммуногенности противогриппозных вакцин-кандидатов С1аxо8т^ιΗΚ1^пе ВЫощсаК содержащих адъювант А803 или А803+МФЛ, проводили открытое рандомизированное контролируемое исследование ЦП фазы в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет (>65 лет), ранее вакцинированных в 2004 году той же самой вакциной-кандидатом. Для оценки иммуногенности и безопасности в качестве эталона использовали вакцину Ε1ι.ι;·ιπχ™ (известную как а-Κίχ™ в Бельгии).
Оценивали две параллельные группы:
1) группа приблизительно из 50 субъектов, ранее получавших одну дозу восстановленной адъювантной противогриппозной вакцины в течение предшествующего клинического испытания;
2) контрольная группа (Пиану) приблизительно из 50 субъектов, ранее получавших одну дозу Ε1ι.ι;·ιπχ™ в течение предшествующего клинического испытания.
Одна из задач этого исследования заключалась в оценке гуморального иммунного ответа (титры антител против гемагглютинина и против МФЛ) при ревакцинации адъювантной противогриппозной вакциной Ε1υ А803+МФЛ, вводимой приблизительно через год после введения первой дозы. Для задач сравнения субъекты, которые уже получили Ε1ι.ι;·ιπχ™ в предшествующем испытании, получали дозу имеющейся в продаже вакцины и образовывали контрольную группу в этом испытании.
Х12. Состав вакцины и введение.
Штаммы, используемые в трех вакцинах, были теми же самыми, как рекомендованные ВОЗ для 2004-2005 сезона №г111егп ^ιηιφΙκίΌ, т.е. А/Не^ Са1ейоша/20/99 (Η1Ν1), А/Не^ Са1гГогша/3/2003 (Η3Ν2) и В/Лап^и/10/2003. Подобно Ε1иаπx™/α-ΚΣx™ имеющаяся в продаже вакцина, используемая для сравнения, адъювантная вакцина (А803+МФЛ, далее коротко адъювантная вакцина) содержит 15 мкг гемагглютинина (ЯА) каждого штамма вируса гриппа на дозу.
Адъювантные противогриппозные вакцины-кандидаты представляют собой 2-компонентные вакцины, состоящие из концентрированных тривалентных инактивированных убиквиторных антигенов вириона, представленных в стеклянной виале I типа, и предварительно заполненного стеклянного шприца I типа, содержащего адъювант А803+МФЛ. Они были приготовлены, как подробно изложено в примере II.
В момент инъекции содержимое предварительно заполненного шприца, содержащего адъювант, инъецируют в виалу, содержащую концентрированные тривалентные инактивированные убиквиторные антигены вириона. После смешивания содержимое забирают обратно в шприц и иглу меняют на внутримышечную. Одна доза восстановленной противогриппозной вакцины-кандидата с адъювантом соответствует 0,7 мл. Адъювантная противогриппозная вакцина-кандидат представляет собой вакцину без консервантов.
Состав одной дозы восстановленной адъювантной противогриппозной вакцины приведен в табл. 45. Обе вакцины вводили внутримышечно.
- 71 011393
Таблица 45
Состав восстановленной противогриппозной адъювантной (АБ03+МФЛ) вакцины-кандидата
Компонент Количество на дозу
Инактивированные убиквиторные
вирионы
-Α/Νθνν Са1ес1оп1а/20/99 (Η1Ν1) 15 мкг НА
- Α/Νθνν Са1Иогп1а/7/2004 (Η3Ν2) 15 мкг НА
- ВАЛапдзи/10/2003 15 мкг НА
Адъювант
8В62 эмульсия
- (сквален) 10,68 мг
- (ϋί-альфа-токоферол) 11,86 мг
- (полисорбат 80 - Τννβθη 80) 4,85 мг
МФЛ 25 мкг
ΧΙ.3. Результаты по иммуногенности.
ΧΙ.3.1. Конечные результаты по гуморальному иммунному ответу против ΗΑ.
Обнаруженные переменные.
На 0 и 21 день: сывороточные титры антитела, ингибирующего гемагглютинацию (ΗΙ), тестированного отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине (антитела против Η1Ν1, антитела против Η3Ν2 и анти-В-антитела).
Переменные-производные (с 95% доверительными интервалами):
(е) среднегеометрические титры (ГСТ) сывороточных ΗΙ антител с 95% доверительными интервалами (95% ДИ) перед и после вакцинации;
(ж) уровни сероконверсии* с 95% ДИ на 21 день;
(з) факторы сероконверсии** с 95% ДИ на 21 день;
(и) серопротективные уровни*** с 95% ДИ на 21 день.
* Уровень сероконверсии определяли в виде процента вакцинированных пациентов с титром ΗΙ перед вакцинацией <1:10 и титром после вакцинации >1:40 или титром перед вакцинацией >1:10 и минимально 4-кратным увеличением титра после вакцинации для каждого вакцинного штамма.
** Фактор сероконверсии определяли как кратное увеличение ГСТ сывороточных ΗΙ на 21 день по сравнению с 0 днем для каждого вакцинного штамма.
***Уровень защиты определяли в виде процента вакцин с сывороточным титром ΗΙ>40 после вакцинации (для каждого вакцинного штамма), что обычно принимают как показатель защиты.
Результаты.
Как ожидалось, подавляющее большинство субъектов уже были серопозитивными в отношении трех штаммов в обеих группах перед вакцинацией. ГСТ перед вакцинацией для всех 3 вакцинных штаммов находились в том же самом диапазоне в 2 группах. Существовала тенденция более высоких ГСТ после вакцинации для всех 3 вакцинных штаммов в группе Р1и ΑБ03+МФЛ по сравнению с группой Р1иапх, хотя 95% ДИ перекрывались (фиг. 25).
Две противогриппозные вакцины удовлетворяли требованиям европейских руководящих органов по ежегодной регистрации инактивированных вакцин вируса гриппа [Ыо1е Гог Ошйапсе оп I клтотзаПоп оГ Кесцпгешетз Гог Ыйие^а Уасстез Гог Фе 1ттипо1о§1са1 аззеззтеп! оГ 111е аппиа1 зйат сйапдез (СРМР/В^Р/214/96)] у субъектов в возрасте больше 60 лет (табл. 46).
- 72 011393
Таблица 46
Серопротективные уровни, уровни сероконверсии и факторы конверсии на 21 день (группа АТР в отношении иммуногенности)
Штаммы Группа N Серопротективный уровень (титр ΗΙ > 40) % Уровень сероконверсии (> 4-кратное увеличение) [95% ДИ] % Фактор сероконверсии [95°/ ДИ] %
ЕС стандарт (>60 >60% >30% >2,0
Α/Νθνν Са1ес1оп1а Е1и+МФЛ- А803 38 89,5 [75,20-97,06] 31,6 [17,5-48,7] 3,1 [2,2-4,4]
Ниапх 45 82,2 [67,95-92,00] 31,1 [18,2-46,6] 2,5 [1,8-3,5]
Α/Νβνν Уогк (Η3Ν2) Е1и+МФЛ- А803 38 92,1 [78,62-98,34] 78,9 [62,7-90,4] 8,8 [6,1-12,5]
Ниапх 45 95,6 [84,85-99,46] 68.9 [53,4-818] 6,0 [4,4-8,3]
ВАЛапдзи(В) Адг+МФЛ- А803 38 100 [90,75-100] 57,9 [40,8-73,7] 5,1 [3,7-7,0]
Ниапх 45 100 [92,13-100] 37,8 [23,8-53,5] 3,1 [2,4-4,0]
Ν = общее количество субъектов.
% = процент субъектов, имеющих титр на 21 день в пределах определенного диапазона. ДИ = доверительный интервал.
Пример XII. Клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа с адъювантом А803 и МФЛ в двух различных концентрациях.
ХП.1. План и задачи исследования.
Открытое рандомизированное исследование фазы для того, чтобы продемонстрировать не худшие качества с точки зрения опосредованного клетками иммунного ответа на противогриппозную вакцину-кандидата О1ахо8тИЛК1ше Вю1о§1са18, содержащую различные адъюванты, вводимую популяции пожилых людей (в возрасте 65 лет и старше), по сравнению с Т1иапх™ (известной как а-К1х™ в Бельгии), вводимой взрослым (18-40 лет). Назначали четыре параллельные группы:
a) 75 взрослых (в возрасте 18-40 лет) в одной контрольной группе получали одну дозу Т1иапх™ (группа Т1иаг1х);
b) 200 пожилых субъектов (в возрасте 65 лет и старше), случайным образом распределенных 3:3:2 на три группы:
1) группа с 75 субъектами, получающими противогриппозную вакцину с адъювантом А803+МФЛ (концентрация 1-25 мкг),
2) группа с 75 субъектами, получающими противогриппозную вакцину с адъювантом А803+МФЛ (концентрация 2-50 мкг),
3) эталонная группа Т1и с 50 субъектами, получающими одну дозу Т1иапх™.
Первичная задача.
Первичная задача заключалась в том, чтобы продемонстрировать не худшие качества через 21 день после вакцинации противогриппозными адъювантными вакцинами, вводимыми пожилым субъектам (в возрасте 65 лет и старше) по сравнению с Т1иапх™, вводимой взрослым (в возрасте 18-40 лет), с точки зрения частоты специфических для вируса гриппа СБ4 Т-лимфоцитов, продуцирующих по меньшей мере два различных цитокина (СБ40Ь, П.-2, ΊΝΡ-α, ШЛ-у).
Вторичные задачи.
Вторичные задачи заключались в следующем:
(а) оценка безопасности и реактогенности вакцинации противогриппозными адъювантными вакцинами-кандидатами в течение 21 дня после внутримышечного введения вакцины пожилым субъектам (в возрасте 65 лет и старше). Т1иапх™ использовали в качестве эталона.
(б) оценка гуморального иммунного ответа (титр антител против гемагглютинина) через 21, 90 и 180 дней после вакцинации противогриппозными адъювантными вакцинами-кандидатами. Т1иапх™ использовали в качестве эталона.
- 73 011393
Третичная задача.
Третичная задача заключалась в оценке опосредованного клетками иммунного ответа (продукция ΙΡΝ-γ, ГБ-2, СБ40Б и ΤΝΡ-α и ответа в виде В-клеток памяти) через 21, 90 и 180 дней после вакцинации адъювантными противогриппозными вакцинами. Ρ1ι.ι;·ιπχ'ΙΛ1 использовали в качестве эталона.
ΧΙΙ.2. Состав вакцины и введение.
Систему противогриппозной вакцины с адъювантом А803+МФЛ (25 мкг на дозу) также использовали в исследовании, проиллюстрированном в примере ΧΙ. Система противогриппозной вакцины с адъювантом А803+МФЛ (50 мкг на дозу) имеет идентичный состав, за исключением того, что концентрация МФЛ удвоена. Способ тот же самый, как описанный в примере УШ для противогриппозной вакцины с адъювантом А803+МФЛ, единственное различие заключается в том, что концентрация МФЛ удвоена.
Контроль: полная доза Б1иапх™ путем внутримышечного (в.м.) введения. На субъекта по 4 запланированных визита: на 0, 21, 90 и 180 день с забором образца крови при каждом визите для оценки иммуногенности.
Схема вакцинации: одна инъекция противогриппозной вакцины на 0 день.
ΧΙΙ.3. Результаты по иммуногенности.
ΧΙΙ.3.1. Конечные результаты КОИ.
Оценка первичных конечных результатов.
На 21 день: КОИ ответ у всех субъектов с точки зрения частоты в тестах специфических для вируса гриппах СБ4 Т-лимфоцитов на 106, продуцирующих по меньшей мере два различных цитокина (ЙБ-2, ΙΡΝ-γ, ΤΝΡ-α и СБ40Б).
Для оценки КОИ ответа частоту специфических для вируса гриппа СБ4 анализировали следующим образом:
Отношение геометрических средних (ГС) с точки зрения специфической для вируса гриппа частоты СБ4 между группами, вакцинированными адъювантной вакциной и Ρ1υ ΥΝΟ. получали с использованием модели ΑNСОУΑ на логарифмически преобразованных титрах. Модель ΑNСОУΑ включает вакцинированную группу в качестве фиксированного действия и логарифмически-преобразованный титр регрессора перед вакцинацией. Отношение ГС и его 98,75% ДИ получены в виде экспоненциального преобразования различий для соответствующей группы в модели. 98,75% ДИ для приведеных ГС получают путем экспоненциального преобразования 98,75% ДИ для группового полученного методом наименьших квадратов среднего в вышеприведенной модели ΑNСОУΑ.
Результаты.
Интерференционный анализ (табл. 47).
Приведенные ГС и отношения ГС (с их 98,75% ДИ) специфических для вируса гриппа СБ4 Т-лимфоцитов, продуцирующих по меньшей мере два цитокина (ΙΡ-2, ΙΡΝ-γ, ΤΝΡ-α и СБ40Б), на 21 день после рестимуляции ш-уйто совокупными антигенами ΙΙ представлены в табл. 47. Для каждой адъювантной противогриппозной вакцины верхний предел двустороннего 98,75% ДИ для отношения ГС был гораздо ниже клинического предела 2,0. Это демонстрирует не худшие качества адъювантных противогриппозных вакцин, вводимых пожилым субъектам, по сравнению с вакциной Ρ^ύχ™, вводимой взрослым людям в возрасте от 18 до 40 лет, с точки зрения частоты специфических для вируса гриппа СБ4 после вакцинации.
- 74 011393
Таблица 47 Приведенное отношение ГС для специфических в отношении вируса гриппа СЭ4, продуцирующих по меньшей мере два цитокина на 21 день (группа АТР в отношении иммуногенности)
Пи ΥΝΟ А803+МФЛ (конц. 1) Приведенное отношение ГС (Ни ΥΝΟ /А803+МФЛ (конц. 1)
Значение 98,8% ДИ
N Приведенное ГС N Приведенное ГС НП ВП
70 1995,3 72 2430,0 0,82 0,65 1,04 Приведенное отношение ГС (Ни ΥΝΘ /А803+МФЛ (конц. 2)
Ни ΥΝΟ А803+МФЛ (конц. 2) 98,8% ДИ
N Приведенное ГС N Приведенное ГС Значение НП ВП
70 1979,4 72 2603,8 0,76 0,59 0,98
ГС = геометрически среднее антитело, приведенное к базовому титру.
N = количество субъектов, для которых имеются результаты перед и после вакцинации.
98,8% ДИ = 98,8% доверительный интервал для приведенного отношения ГС (модель Апсоуа: приведенная к базовому значению).
НП = нижний предел; ВП = верхний предел.
Результаты.
Описательный анализ (фиг. 26).
Основные результаты.
Перед вакцинацией КОИ ответ более высокий у молодых взрослых людей, чем у пожилых.
После вакцинации существовал бустер-эффект противогриппозной вакцины на КОИ ответ у молодых взрослых людей (18-40 лет);
КОИ ответ у пожилых людей, получающих адъювантную противогриппозную вакцину сравним с КОИ ответом у молодых взрослых людей.
Различие между перед и после вакцинации в СЭ4 Т-лимфоцитарных ответах для всех исследованных цитокинов (ΙΉ-2, СП40Ь, ΈΝΗ-α и ΙΗΝ-γ) было значительно более высоким с адъювантной вакциной по сравнению с Н1иапх™ (18-40 лет) для всех тестов, за исключением ΙΗΝ-γ, когда авторы изобретения сравнивали Н1иапх (18-40 лет) и Н1ц/А803+МФЛ (конц. 1).
Следует отметить, что стимуляцию т-уйго осуществляли штаммами Н1и (1) В/Лапдзи, (2) А/Н3№/№^ Уогк и (3) А/Н3ЮЖуотт§ вместо А/НШ1 \е\х Са1ейоша, включенного в вакцину. Тем не менее, предварительные данные, включающие вакцинный штамм ΛΊΙ1Ν1'Ν2\ν Са1ейоша из подгруппы субъектов, указывают на то, что результаты похожи.
Результаты.
Оценка третичных конечных результатов (табл. 48).
Для оценки третичных конечных результатов частоту специфических для вируса гриппа СП4/СЭ8 Т-лимфоцитов и В-клеток памяти измеряли на 0, 21, 90, и 180 день.
Частоту специфических для вируса гриппа цитокинположительных СП4/СЭ8 Т-лимфоцитов суммировали (описательная статистика) для каждой вакцинируемой группы на 0 и 21 день для каждого антигена.
Непараметрический тест (тест Вилкоксона) использовали для сравнения различий между двумя группами (противогриппозная адъювантная вакцина по сравнению с Н1иапх™) и статистическое р-значение рассчитывали для каждого антигена в каждом из тестов. Описательную статистику для индивидуальных различий ответов на 21день/0 день (после/перед вакцинацией) рассчитывали для каждой вакцинируемой группы и каждого антигена в каждом из тестов.
Непараметрический тест (тест Вилкоксона) использовали для сравнения индивидуальных различий (после/перед вакцинацией) и статистическое р-значение рассчитывали для каждого антигена в различных тестах.
р-значения из теста Вилкоксона, использованные для сравнения различий частоты специфических для вируса гриппа С1)4 Т-лимфоцитов, представлены в табл. 48.
- 75 011393
Таблица 48
Логически выведенная статистика: р-значения из тестов Крушкалла-Валлиса для СГ)4 Т-клеток в каждый момент времени (группа АТР в отношении иммуногенности)
р-значение
Группа 1 и Пи ЕЮ Группа 2 и Пи ЕЮ Группа 1 и Пи ΥΝΟ Группа 2 и Пи ΥΝΟ
0 день 21 день 0 день 21 день 0 день 21 день 0 день 21 день
Все пары 0,4380 0,0003 0,4380 0,0003 0,0000 0,9014 0,0005 0,4889
СО4О1_ 0,3194 0,0002 0,3194 0,0002 0,0000 0,9841 0,0003 0,5412
ΙΡΝγ 0,5450 0,0004 0,5450 0,0004 0,0000 0,5397 0,0001 0,7895
11_2 0,3701 0,0008 0,3701 0,0008 0,0003 0,8557 0,0022 0,4766
ΤΕΝα 0,3716 0,0004 0,3716 0,0004 0,0000 0,8730 0,0013 0,2114
Группа 1: Противогриппозная вакцина с адъювантом А803+МФЛ (конц. 1).
Группа 2: Противогриппозная вакцина с адъювантом А803+МФЛ (конц. 2).
Основные заключения:
(а) перед вакцинацией частоты ГС специфических для вируса гриппа С 1)4 были схожи во всех группах пожилых субъектов, но превосходили частоты для взрослых субъектов в возрасте от 18 до 40 лет;
(б) после вакцинации (21 день) частота специфических для вируса гриппа С1)4 Т-лимфоцитов были схожи у пожилых субъектов, вакцинированных адъювантными вакцинами, и взрослых субъектов в возрасте от 18 до 40 лет, вакцинированных Т1иапх™;
(в) у пожилых субъектов после вакцинации (21 день) частота специфических для вируса гриппа С1)4 Т-лимфоцитов была значительно более высокой после вакцинации адъювантными вакцинами по сравнению с Т1иапх™;
(г) частота ГС специфических для вируса гриппа СЭ8 Т-клеток перед и после вакцинации была, по существу, схожа во всех группах.
Результаты.
Оценка конечных результатов гуморального иммунного ответа.
Обнаруженные переменные.
На 0, 21, 90 и 180 день: сывороточные титры антитела, ингибирующего гемагглютинацию (Ш), протестированные отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине (антитела против НШ1, антитела против Н3№ и анти-В-антитела).
Отсекающее значение для Н антитела против всех вакцинных антигенов определяли в лаборатории перед анализом (и оно составляло 1:10). Серонегативный субъект представлял собой субъект, у которого титр антител был ниже отсекающего значения. Серопозитивный субъект представляет собой субъект, у которого титр антитела был выше или равен отсекающему значению. Титр антитела ниже отсекающего значения в анализе приведен как случайное значение вполовину от отсекающего значения.
Основываясь на титрах антител Ш, рассчитывали следующие параметры:
(к) среднегеометрические титры (ГСТ) антитела Н на 0 и 21 день, рассчитанные, принимая во внимание антилогарифм среднего значения логарифмических преобразований титра;
(л) факторы сероконверсии (8Т) на 21 день, определенные в виде кратного увеличения сывороточных ГСТ Н на 21 день по сравнению с 0 днем;
(м) уровни сероконверсии (8С) на 21 день, определенные в виде процента вакцин титром Н перед вакцинацией <1:10 и титром после вакцинации >1:40 или титром перед вакцинацией >1:10 и минимально 4-кратном увеличением титра после вакцинации;
(н) серопротективные уровни (8РК) на 21 день, определенные в виде процента вакцин с сывороточным титром Ы>1:40.
95% ДИ для ГС отдельно получен в каждой группе. Сначала был получен 95% ДИ для среднего значения логарифмически преобразованного титра, предполагая, что логарифмически трансформированные титры нормально распределены с неизвестным вариантом. 95% ДИ для ГС затем получали путем экспоненциальных преобразований 95% ДИ для среднего значения логарифмически преобразованного титра.
Утраченный серологический результат для измерения конкретного антитела не заменяли.
Таким образом, субъект без серологического результата в заданный момент времени не участвовал в анализе при заданном моменте времени.
Результаты гуморального иммунного ответа (фиг. 27 и табл. 49).
ГСТ антител Н перед вакцинацией для всех 3 вакцинных штаммов находились в том же самом
- 76 011393 диапазоне в 4 обрабатываемых группах. После вакцинации существовало явное воздействие 2 адъювантов, которые увеличивали гуморальный ответ у пожилых людей по сравнению со стандартной Р1иапх в той же самой популяции.
ГСТ значительно более высокие для 111X1 для А803+МФЛ (конц. 2), значительно более высокие для Н3№ и для В для обоих адъювантов.
Через 21 день после вакцинации субъекты Р1иапх (18-40 лет) имели более высокий Ш ответ в отношении штаммов Са1едоша и ВЛапдзи.
Как показано в табл. 49, адъювантные противогриппозные вакцины превосходили требования европейских руководящих органов для ежегодной регистрации противогриппозных вакцин на основе убиквиторного вириона [ΝοΙό £ог Ошдапсе оп НагтошзаЛоп о£ КецшгешеЩз £ог шПиечш! Уасстез £ог 1Ре 1ттипо1од1са1 аззеззтеп! о£ (Не аппиа1 81гат сНапдез - СРМР,В\\'Р/214/96] для субъектов в возрасте больше 60 лет.
После вакцинации существовало статистически значимое различие с точки зрения серопротективных уровней антител Н между группой Р1иапх (>65 лет) и Р1и А803+МФЛ (конц. 2) в отношении штамма АЖе’^ Са1едоша.
Для каждого вакцинного штамма серопротективные уровни для 2 групп с противогриппозной адъювантной вакциной находились в том же самом диапазоне, что и группа Р1иапх (18-40 лет).
Существовало статистически значимое различие с точки зрения уровней сероконверсии антител Н между группой Р1иапх (>65 лет) и Р1и А803+МФЛ (конц. 2) в отношении штамма А ΝΑ\ν Са1едоша, Р1и А803+МФЛ (конц. 1) в отношении штамма В/Лапдзи.
Для каждого вакцинного штамма уровни сероконверсии для 2 групп с противогриппозной адъювантной вакциной находились в том же самом диапазоне, что и группа Р1иапх (18-40 лет), за исключением штамма Νον Са1едоша.
Таблица 49
Серопротективные уровни, уровни сероконверсии и факторы превращения на 21 день (группа АТР в отношении иммуногенности)
Штаммы Группа N Серопротективн ый уровень (титр ΗΙΞ* 40) % Уровень сероконверсии (> 4-кратное увеличение) [95% ДИ] Фактор превращения [95% ДИ] %
Стандарт ЕС (>60 лет) >60% >30% >2,0
Стандарт ЕС (< 60 лет) >70% >40% >2,5
Α/Νενν Са1едоп1а (Η1Ν1) Яи Упд 75 100 [95,20-100] 77,3 [66,2-86,2] 35,1 Л21,9-56,4]
Яи Пожилые люди 49 71,4 [56,74-83,42] 30,6 [18,3-45,4] 3,7 [2,4-5,7]
ЯиА803+МФЛ (конц. 1) 75 90,5 [81,48-96,11] 55,4 [43,4-67,0] 6,4 [4,5-9,0]
ЯиА803+МФЛ (конц. 2) 75 98,7 [92,79-99,97] 74,7 [63,3-84,0] 9,2 [6,4-13,3]
Α/Νθνν Уогк (Η3Ν.2) Ни Упд 75 93,3 [85,12-97,80] 76,0 [64,7-85,1] 9,2 [7,1-11,8]
Ни Пожилые люди 49 81,6(67,98-91,24] 69,4 [54,6-81,7] 8,2 [5,7-11,8]
ЯиА503+МФЛ (конц. 1) 75 94,6 [86,73-98,51] 90,5 [81,5-96,1] 19,2 [14,6-25,3]
ЯиА803+МФЛ (конц. 2) 75 93,3(85,12-97,80] 82,7 [72,2-90,4] 15,0(11,2-20,2]
ВАЛапдзи (В) Яи Упд 75 100(95,20-100] 80,0 [69,2-88,4] 13,9[10,1-19,1]
г !и Пожилые люди 49 93,9(83,13-98,721 81,3 [70,7-89,4] 4,3(3,0-6,1]
ЯиАЗОЗ+МФЛ (конц. 1) 75 95,9(88,61-99,16] 73,0(61,4-82,6] 8,5(6,5-11,2]
ЯиА803+МФЛ (конц. 2) 75 98,7 (92,79-99,97] 66,7(54,8-77,1] 7,6(5,6-10,2]
Ν = общее количество субъектов.
% = процент субъектов, имеющих титр на 21 день в пределах определенного диапазона.
- 77 011393
ΧΙΙ.3.2. Заключения по иммуногенности.
(а) Частота специфических в отношении вируса гриппа С1)4 перед вакцинацией была значительно выше у пожилых взрослых людей по сравнению с взрослыми людьми в возрасте от 18 до 40 лет. Частота после вакцинации Е1иалх™ (21 день) оставалась выше у пожилых взрослых людей по сравнению с более молодыми. Наоборот, не худшие качества с точки зрения частоты специфических для вируса гриппа С1)4 после вакцинации адъювантной вакцины у пожилых субъектов были продемонстрированы по сравнению с вакцинацией Е1иалх™ взрослым в возрасте от 18 до 40 лет.
(б) В отношении гуморального иммунного ответа с точки зрения ответа в виде антител ΗΙ все противогриппозные вакцины удовлетворяли требованиям европейских руководящих органов для ежегодной регистрации противогриппозных вакцин на основе убиквиторного вириона |Хо1е £ог Сшбапсе оп Иагшотзайоп о£ КедшгешеШз £ог тПиеп/а Уасстез £ог 1Ье 1шшипо1од1са1 аззеззшеп! о£ 1Ье аппиа1 §1гат сЬапдез - СРМР/В^Р/214/96]. У пожилых взрослых людей адъювантные вакцины опосредовали, по меньшей мере, тенденцию более высокого гуморального иммунного ответа на гемагглютинин вируса гриппа по сравнению с Е1иалх™. Значительное различие между гуморальным иммунным ответом против каждого вакцинного штамма, опосредованного у пожилых субъектов адъювантной вакциной, по сравнению с Е1иапх™ собраны в табл. 50. По сравнению со взрослыми людьми в возрасте от 18 до 40 лет, вакцинированных Е1иапх™, пожилые субъекты, вакцинированные адъювантной вакциной, демонстрировали тенденцию более высоких ГСТ после вакцинации и фактора сероконверсии на 21 день против штамма Л;\е\у Υо^к.
Таблица 50 Значимое различие в гуморальном иммунном ответе между адъювантной вакциной и Е1иапх у пожилых субъектов
ГСТ после вакцинации Фактор сероконверсии Серопротективный уровень Уровень сероконверсии
Пи А803+МФЛ (конц. 1) Α/Νθνν Уогк ВАЛапдзи Α/Νθνν Уогк В/Лапдзи
Пи А803+МФЛ (конц. 2) Α/Νθνν Уогк ВЛЛапдзи Α/Νθνν Са1е0огна Α/Νθνν Са!ес!оп1а Α/Νθνν Са!ес!оп1а Α/Νθνν Са!ес!ота
ΧΙΙ.4. Результаты по реактогенности.
ΧΙΙ.4.1. Регистрация неблагоприятных эффектов (НЭ).
Регистрировали предусмотренные симптомы (табл. 51), возникающие в течение 7-дневного последующего периода (день вакцинации и 6 последующих дней). Также регистрировали непредусмотренные симптомы, возникающие в течение 21-дневного последующего периода (день вакцинации и 20+3 последующих дня). Интенсивность следующих НЭ оценивали, как описано в табл. 52.
Таблица 51
Предусмотренные локальные/генерализованные неблагоприятные эффекты
Предусмотренные локальные НЭ П ре ду с мотре н н ые генерализованные НЭ
Боль в месте инъекции Покраснение в месте инъекции Опухание места инъекции Гематома Усталость Жар Головная боль Мышечная боль Дрожь Боль в суставах в руке, в которую сделана инъекция Боль в суставах в других местах
Примечание. Температуру регистрировали вечером. Если дополнительные измерения температуры проводили в другое время в течение суток, регистрировали наивысшую температуру.
- 78 011393
Таблица 52
Интенсивность по шкале предусмот эенных симптомов у взрослых
Неблагоприятный эффект Уровень интенивности Параметр
Боль в месте инъекции 0 Отсутствует
1 При прикосновении
2 При движении конечности
3 Препятствует нормальной активности
Покраснение места инъекции Регистрируют наибольший поверхностный диаметр в мм
Опухоль места инъекци Регистрируют наибольший поверхностный диаметр в мм
Гематома в месте инъекции Регистрируют наибольший поверхностный диаметр в мм
Жар* Регистрируют температуру в °С/°Б
Головная боль 0 Отсутствует
1 легко переносится
2 влияет на нормальную активность
3 препятствует нормальной активности
Усталость 0 Отсутствует
1 легко переносится
2 влияет на нормальную активность
3 препятствует нормальной активности
Боль в суставах в месте инъекции и других местах 0 Отсутствует
1 легко переносится
2 влияет на нормальную активность
3 препятствует нормальной активности
Мышечная боль 0 Отсутствует
1 легко переносится
2 влияет на нормальную активность
3 препятствует нормальной активности
Дрожь
0 Отсутствует
1 легко переносится
2 влияет на нормальную активность
3 препятствует нормальной активности
*Жар определяют как температуру в подмышечной области >37,5°С (99,5°Р).
Максимальную интенсивность покраснения области локальной инъекции/опухание оценивали в соответствии со следующим:
соответствует 0 мм;
соответствует >0-<20 мм;
соответствует >20-<50 мм;
соответствует >50 мм.
Максимальную интенсивность жара оценивают в соответствии со следующим:
соответствует >37,5-<38,0°С;
соответствует >38,0-<39,0°С;
соответствует >39,0.
- 79 011393
Исследователь оценивает интенсивность всех других НЭ, т. е. непредусмотренных симптомов, включающих ПНЭ, о которых сообщалось во время исследования. Оценка основана на клинических суждениях исследователя. Интенсивность каждого регистрируемого НЭ приписывают одой из следующих категорий:
(слабая) = НЭ, который легко переносится субъектом, вызывая минимальный дискомфорт и не влияя на ежедневную активность;
(умеренная) = НЭ, который достаточно дискомфортен, оказывая влияние на ежедевную активность;
(тяжелая) = НЭ, который препятствует нормальной ежедневной активности (у взрослых/подростков, такой НЭ может, например, препятствовать присутствию на работе/в школе и может потребовать введение коррекционного лечения).
ХП.4.2. Регистрация неблагоприятных эффектов (НЭ).
Обнаружено, что реактогенность, наблюдаемая у пожилых субъектов при применении адъювантных вакцин с точки зрения локальных и генерализованных симптомов, является более высокой по сравнению с Ииапх™ в той же самой популяции. Тем не менее, показано, она схожа с уровнем, обнаруженным для взрослой популяции. Частота и интенсивность симптомов увеличивались после вакцинации адъювантными вакцинами по сравнению с реактогенностью, обнаруженной у пожилых субъектов при использоании Ииапх™ (фиг. 28). Во всех случаях симптомы быстро проходили. Симптомы 3 степени демонстрировали тенденцию быть более высокими в группе, которая получала вакцину с адъювантом с самой высокой концентрацией МФЛ, по сравнению с группой, которая получала адъювантную вакцину, в которой МФЛ присутствовал в меньшей концентрации. Тем не менее, во всех случаях симптомы быстро проходили.

Claims (47)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1) выбор антигена вируса гриппа, содержащего 0Ό4+ эпитопы, и
1) улучшенный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ;
1. Применение (а) вируса гриппа или его антигенного препарата и (б) адъюванта на основе эмульсии «масло в воде» в приготовлении иммуногенной композиции для индуцирования по меньшей мере одного из следующих:
2) объединение указанного антигена с адъювантом на основе эмульсии «масло в воде», как определено в любом из пп.1, 2, 4-20, где указанная вакцина после введения указанному млекопитающему способна индуцировать усиленный 0Ό4 ответ против вируса гриппа или его антигенного препарата у указанного млекопитающего.
2. Применение вируса гриппа или его антигенного препарата и адъюванта на основе эмульсии «масло в воде» в приготовлении иммуногенной композиции для вакцинации пожилых людей против гриппа, где указанная эмульсия «масло в воде» содержит метаболизируемое масло, стерин и/или альфатокоферол и эмульгатор.
2) улучшенный ответ на основе В-клеток памяти против указанного вируса или антигенной композиции у человека, где указанная эмульсия «масло в воде» содержит метаболизируемое масло, стерин и/или альфа-токоферол и эмульгатор.
3. Применение по п.2, где композиция индуцирует улучшенный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ против указанного вируса или антигенной композиции у указанного пожилого субъекта.
4. Применение по любому из пп.1-3, где указанная эмульсия «масло в воде» содержит капли масла, из которых по меньшей мере 70% по интенсивности меньше чем 1 мкм в диаметре.
5. Применение по любому из пп.1-4, где указанная эмульсия «масло в воде» содержит капли масла, из которых по меньшей мере 70% по интенсивности меньше чем 500 нм в диаметре.
6. Применение по любому из пп.1-5, где указанная эмульсия «масло в воде» содержит капли масла, из которых по меньшей мере 80% по интенсивности меньше чем 300 нм в диаметре.
7. Применение по любому из пп.1-6, где указанная эмульсия «масло в воде» содержит капли масла, из которых по меньшей мере 90% по интенсивности находятся в диапазоне диаметров от 120 до 200 нм.
8. Применение по любому из пп.1-7, где указанный альфа-токоферол присутствует в количестве от 1,0 до 20% от общего объема указанной иммуногенной композиции.
9. Применение по п.8, где указанный альфа-токоферол присутствует в количестве от 1,0 до 5,0% от общего объема указанной иммуногенной композиции.
10. Применение по любому из пп.1-9, где указанное метаболизируемое масло представляет собой сквален.
11. Применение по любому из пп.1-10, где указанное метаболизируемое масло присутствует в количестве от 0,5 до 20% от общего объема указанной иммуногенной композиции.
12. Применение по п.11, где метаболизируемое масло присутствует в количестве от 1,0 до 10% от общего объема указанной иммуногенной композиции.
13. Применение по п.12, где указанное метаболизируемое масло присутствует в количестве от 2,0 до 6,0% от общего объема указанной иммуногенной композиции.
14. Применение по любому из пп.1-13, где эмульсия «масло в воде» дополнительно содержит стерин.
15. Применение по п.14, где указанный дополнительный стерин представляет собой холестерин.
16. Применение по любому из пп.10-15, где отношение сквален:альфа-токоферол равно или меньше
- 80 011393 чем 1.
17. Применение по любому из пп.1-16, где указанный эмульгатор представляет собой Тетееп 80.
18. Применение по п.17, где указанный эмульгатор присутствует в количестве от 0,01 до 5,0% (мас./мас.) от указанной иммуногенной композиции.
19. Применение по п.18, где указанный эмульгатор присутствует в количестве от 0,1 до 2,0% (мас./мас.) от указанной иммуногенной композиции.
20. Применение по любому из пп.1-19, где указанный адъювант на основе эмульсии «масло в воде» имеет следующий состав: 2-10% сквалена, 2-10% альфа-токоферола и 0,3-3% Т\гееп 80.
21. Применение по любому из пп.1-20, где иммуногенная композиция дополнительно содержит лиганд То11-подобного рецептора 4 (ТЬК-4).
22. Применение по п.21, где указанный лиганд ТЬК-4 выбран из перечня, состоящего из нетоксичного производного липида А, такого как 3-деацилированный-монофосфориллипид А (3П-МФЛ), синтетическое производное липида А, мурамилдипептид (МДП) и Р белок респираторно-синцитиального вируса (Κ8ν).
23. Применение по п.22, где указанное производное липида А представляет собой 3Э-МФЛ.
24. Применение по п.23, где 3Э-МФЛ присутствует в количестве от 10 до 50 мкг (мас./об.) на дозу композиции.
25. Применение по п.24, где 3Э-МФЛ присутствует в количестве приблизительно 25 мкг (мас./об.) на дозу композиции.
26. Применение по любому из пп.1-25, где введение указанной иммуногенной композиции дополнительно индуцирует как улучшенный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ, так и улучшенный ответ на основе В-клеток памяти.
27. Применение по любому из пп.1 и 3-26, где указанный СЬ4 Т-клеточный иммунный ответ включает индукцию перекрестно-реактивного СЬ4 Т-хелперного ответа.
28. Применение по любому из пп.1-27, где вакцинируемое население имеет возраст старше 50 лет.
29. Применение по любому из пп.1-28, где вакцинируемое население представляет собой пожилых людей в возрасте старше 65 лет.
30. Применение вируса гриппа или его антигенного препарата в приготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных вирусом гриппа или его антигенным препаратом и адъювантом на основе эмульсии «масло в воде», содержащей метаболизируемое масло, стерин и/или альфа-токоферол и эмульгатор.
31. Применение по п.30, где композиция, используемая для ревакцинации, содержит адъювант.
32. Применение по п.31, где указанный адъювант выбран из перечня, состоящего из адъюванта на основе эмульсии «масло в воде», алюминиевого адъюванта, лиганда ТЬК-4, сапонина.
33. Применение по любому из пп.30-32, где указанный адъювант на основе эмульсии «масло в воде» является таким, как определено в любом из пп.1, 2 и 4-20, и лиганд ТЬК-4 является таким, как определено в любом из пп.22-25.
34. Применение по любому из пп.30-33, где указанная иммуногенная композиция для ревакцинации содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет по меньшей мере одно из: 1) общие СЬ4 Т-клеточные эпитопы, 2) общие В-клеточные эпитопы с убиквиторным вирусом гриппа (кр111 1пйиепха У1Ш8) или его убиквиторным вирусным антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации.
35. Применение по любому из пп.30-34, где иммунологический ответ после ревакцинации представляет собой любой, или два, или все из следующих: улучшенный СЬ4 ответ против вируса гриппа или его антигенного препарата, или улучшенный гуморальный ответ, или улучшенный ответ на основе Вклеточной памяти.
36. Применение (а) вируса гриппа или его антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа и (б) адъюванта на основе эмульсии «масло в воде» в приготовлении иммуногенной композиции для защиты против инфекций вирусом гриппа, вызванных вариантом штамма вируса гриппа, где указанная эмульсия «масло в воде» содержит метаболизируемое масло, стерин и/или альфа-токоферол и эмульгатор.
37. Применение по п.36, где указанный адъювант на основе эмульсии «масло в воде» является таким, как определено в любом из пп.1, 2 и 4-20, и лиганд ТЬК-4 является таким, как определено в любом из пп.21-25.
38. Применение по любому из пп.1-37, где вирус гриппа или его антигенный препарат является моновалентным, бивалентным или тривалентным.
39. Применение по любому из пп.1-38, где вирус гриппа или его антигенный препарат получен из трех различных штаммов вируса гриппа.
40. Применение по п.39, где по меньшей мере один штамм ассоциирован с пандемической вспышкой или обладает потенциалом быть ассоциированным с пандемической вспышкой.
41. Применение по п.40, где указанный пандемический штамм выбран из перечня, состоящего из Η5Ν1, Η9Ν2, Η7Ν7, Η2Ν2 и Η1Ν1.
- 81 011393
42. Применение по любому из пп. 30-41, где первую вакцинацию осуществляют с использованием композиции на основе убиквиторного вируса гриппа, содержащей штамм вируса гриппа, который потенциально может вызывать пандемическую вспышку, и ревакцинацию осуществляют циркулирующим пандемическим штаммом.
43. Применение по любому из пп.1-42, где указанная иммуногенная композиция содержит низкую дозу антигена ΗА.
44. Применение по любому из пп.1-43, где указанный антиген вируса гриппа или его антигенный препарат получен из яйца или тканевой культуры.
45. Способ разработки вакцины от гриппозных заболеваний, которые, как известно, вылечивают или лечат путем активации 0Ό4+ Т-клеток, включающий:
46. Применение по любому из пп.1-45, где указанный вирус гриппа выбран из перечня, состоящего из убиквиторного вируса гриппа, полного вируса гриппа, субъединичного вируса гриппа, гриппозной виросомы и их антигенного препарата.
47. Применение по п.46, где указанный вирус гриппа представляет собой убиквиторный антиген вируса гриппа или его антигенный препарат.
EA200701785A 2005-03-23 2006-03-21 Применение вируса гриппа и адъюванта на основе эмульсии "масло в воде" для индуцирования cd4 т-клеточного ответа и/или улучшенного ответа, основанного на в-клетках памяти EA011393B1 (ru)

Applications Claiming Priority (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0505998A GB0505998D0 (en) 2005-03-23 2005-03-23 Novel compositions
GB0506004A GB0506004D0 (en) 2005-03-23 2005-03-23 Compositions
GB0506001A GB0506001D0 (en) 2005-03-23 2005-03-23 Novel use
GB0506000A GB0506000D0 (en) 2005-03-23 2005-03-23 Novel use
GB0505989A GB0505989D0 (en) 2005-03-23 2005-03-23 Compositions
GB0510591A GB0510591D0 (en) 2005-05-24 2005-05-24 Novel use
GB0510589A GB0510589D0 (en) 2005-05-24 2005-05-24 Novel use
GB0510598A GB0510598D0 (en) 2005-05-24 2005-05-24 Composition
GB0510593A GB0510593D0 (en) 2005-05-24 2005-05-24 Novel compositions
GB0510596A GB0510596D0 (en) 2005-05-24 2005-05-24 Composition
GB0603789A GB0603789D0 (en) 2006-02-24 2006-02-24 Novel use
GB0603788A GB0603788D0 (en) 2006-02-24 2006-02-24 Novel composition
GB0603790A GB0603790D0 (en) 2006-02-24 2006-02-24 Composition
PCT/EP2006/002836 WO2006100109A1 (en) 2005-03-23 2006-03-21 Use of an influenza virus an oil-in-water emulsion adjuvant to induce cd4 t-cell and/or improved b-memory cell response

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200701785A1 EA200701785A1 (ru) 2008-04-28
EA011393B1 true EA011393B1 (ru) 2009-02-27

Family

ID=36441219

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200701785A EA011393B1 (ru) 2005-03-23 2006-03-21 Применение вируса гриппа и адъюванта на основе эмульсии "масло в воде" для индуцирования cd4 т-клеточного ответа и/или улучшенного ответа, основанного на в-клетках памяти
EA200701786A EA011419B1 (ru) 2005-03-23 2006-03-21 Поливалентная противогриппозная иммуногенная композиция
EA200701787A EA200701787A1 (ru) 2005-03-23 2006-03-21 Иммунная композиция, способ ее изготовления, ее применение и способ вакцинации

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200701786A EA011419B1 (ru) 2005-03-23 2006-03-21 Поливалентная противогриппозная иммуногенная композиция
EA200701787A EA200701787A1 (ru) 2005-03-23 2006-03-21 Иммунная композиция, способ ее изготовления, ее применение и способ вакцинации

Country Status (24)

Country Link
US (5) US20090081253A1 (ru)
EP (4) EP2397153A1 (ru)
JP (4) JP2008534467A (ru)
KR (5) KR101916787B1 (ru)
AR (3) AR054020A1 (ru)
AU (3) AU2006226459A1 (ru)
CA (3) CA2601022C (ru)
CY (1) CY1117874T1 (ru)
DK (1) DK1861120T3 (ru)
EA (3) EA011393B1 (ru)
ES (1) ES2585810T3 (ru)
HR (1) HRP20160816T1 (ru)
HU (1) HUE027837T2 (ru)
IL (3) IL185897A (ru)
MA (3) MA29715B1 (ru)
MX (3) MX2007011756A (ru)
NO (3) NO20074635L (ru)
NZ (2) NZ561822A (ru)
PE (3) PE20061300A1 (ru)
PL (1) PL1861120T3 (ru)
PT (1) PT1861120T (ru)
SI (1) SI1861120T1 (ru)
TW (3) TW200700079A (ru)
WO (3) WO2006100109A1 (ru)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2371994C (en) * 1999-02-26 2010-09-28 Guido Grandi Enhancement of bactericidal activity of neisseria antigens with oligonucleotides containing cg motifs
GB9923176D0 (en) * 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US20100221284A1 (en) * 2001-05-30 2010-09-02 Saech-Sisches Serumwerk Dresden Novel vaccine composition
DE10144906B4 (de) 2001-09-12 2013-11-28 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen
CA2601022C (en) 2005-03-23 2023-03-07 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Use of an influenza virus an oil-in-water emulsion adjuvant to induce cd4 t-cell and/or improved b-memory cell response
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
WO2007052059A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Changing th1/th2 balance in split influenza vaccines with adjuvants
KR20080069232A (ko) * 2005-11-04 2008-07-25 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 에스.알.엘. 스플리트 인플루엔자 백신에 대한 보조제로서 유리 수성상계면활성제를 갖는 에멀젼
EP2368572B1 (en) * 2005-11-04 2020-03-04 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
NZ592713A (en) * 2005-11-04 2012-12-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Adjuvanted influenza vaccines including a cytokine-inducing agents other than an agonist of Toll-Like Receptor 9
FR2896162B1 (fr) * 2006-01-13 2008-02-15 Sanofi Pasteur Sa Emulsion huile dans eau thermoreversible
EP1991264B1 (en) 2006-03-07 2015-01-07 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin, methods of making and methods of use thereof
US20100068223A1 (en) * 2006-03-24 2010-03-18 Hanno Scheffczik Storage of Influenza Vaccines Without Refrigeration
KR20090016704A (ko) 2006-06-15 2009-02-17 노파르티스 아게 보조제-보존 수회-투여 인플루엔자 접종 요법
ES2469568T3 (es) * 2006-07-17 2014-06-18 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacuna contra la gripe
CA2583555C (en) * 2006-07-17 2020-01-07 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Influenza vaccine
JP5639760B2 (ja) * 2006-07-17 2014-12-10 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム インフルエンザワクチン
EP2433648A3 (en) * 2006-10-12 2012-04-04 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine comprising an oil in water emulsion adjuvant
CA2664619C (en) * 2006-10-12 2012-12-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic compositions comprising an oil-in-water emulsion adjuvant containing a reduced amount of squalene, tocol and an emulsifying agent
GB0622282D0 (en) * 2006-11-08 2006-12-20 Novartis Ag Quality control methods
EP1923070A1 (en) * 2006-11-15 2008-05-21 Intervet International BV Vaccine for vaccinating feline against influenza virus
PL2121011T3 (pl) * 2006-12-06 2014-10-31 Novartis Ag Szczepionki zawierające antygeny czterech szczepów wirusa grypy
EP1938835A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-02 Pevion Biotech AG Non-specific immunostimulating agents
WO2008118587A2 (en) * 2007-02-23 2008-10-02 Baylor Research Institute Therapeutic applications of activation of human antigen-presenting cells through dectin-1
TW200908994A (en) * 2007-04-20 2009-03-01 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US8999353B2 (en) 2007-10-12 2015-04-07 Csl Limited Method of eliciting an immune response against pandemic influenza virus
PL2200642T3 (pl) 2007-10-19 2012-09-28 Novartis Ag Preparaty szczepionek meningokokowych
GB0810305D0 (en) 2008-06-05 2008-07-09 Novartis Ag Influenza vaccination
EP2227251A1 (en) * 2007-12-06 2010-09-15 GlaxoSmithKline Biologicals SA Influenza composition
US8466259B2 (en) * 2007-12-07 2013-06-18 National Health Research Institutes Adjuvants
TWI376385B (en) * 2007-12-07 2012-11-11 Nat Health Research Institutes Production of lipidated proteins in e. coli
EP2268309B1 (en) * 2008-03-18 2015-01-21 Novartis AG Improvements in preparation of influenza virus vaccine antigens
EP3115060A1 (en) 2008-04-18 2017-01-11 VaxInnate Corporation Deletion mutants of flagellin and methods of use
GB0905570D0 (en) * 2009-03-31 2009-05-13 Novartis Ag Combined vaccines
WO2009156852A1 (en) 2008-06-25 2009-12-30 Novartis Ag Rapid responses to delayed booster immunisations
CA2752039A1 (en) 2009-02-10 2010-08-19 Novartis Ag Influenza vaccine regimens for pandemic-associated strains
AU2015203072B2 (en) * 2009-02-10 2017-05-25 Seqirus UK Limited Influenza vaccine regimens for pandemic-associated strains
EA201500910A1 (ru) 2009-02-10 2016-04-29 Новартис Аг Вакцины против гриппа со сниженным количеством сквалена
US8287880B2 (en) * 2009-06-02 2012-10-16 National Health Research Institutes Lipidated vaccine against dengue virus infection
EP2445927B1 (en) * 2009-06-22 2014-04-23 National Health Research Institutes Lipidated tumor- associated antigens and immunotherapeutic compositions
EP2289575B1 (de) * 2009-08-06 2017-07-05 Biotronik VI Patent AG Medizinisches Implantat enthaltend eine antioxidative Substanz
CN107582526A (zh) * 2009-08-12 2018-01-16 希格默伊德药业有限公司 包含聚合物基质和油相的免疫调节组合物
EP2308506A1 (en) * 2009-10-02 2011-04-13 Mucosis B.V. Adjuvanted intranasal vaccine formulations
GB0918830D0 (en) 2009-10-27 2009-12-09 Glaxosmithkline Biolog Niederl Process
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
DE102009056884B4 (de) 2009-12-03 2021-03-18 Novartis Ag Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben
JP5820390B2 (ja) 2009-12-03 2015-11-24 ノバルティス アーゲー エマルジョンの微小流動化中および／または均質化中における成分の循環
AU2013202690B2 (en) * 2009-12-03 2016-02-11 Novartis Ag Hydrophilic filtration during manufacture of vaccine adjuvants
MX2012005598A (es) * 2009-12-03 2012-05-29 Novartis Ag Filtracion hidrofilica durante la fabricacion de adyuvantes de vacuna.
DE102009056871A1 (de) 2009-12-03 2011-06-22 Novartis AG, 4056 Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben
PL2380558T5 (pl) * 2009-12-03 2020-10-05 Novartis Ag Wytwarzanie emulsji w układzie komory oddziaływań i komory przeciwciśnieniowej do mikrofluidyzacji
CL2012001399A1 (es) 2009-12-03 2013-03-08 Novartis Ag Metodo para fabricar adyuvante para vacuna (emulsion aceite/agua con escualeno, polisorbato 80 y trioleato de sorbitan), que comprende (i) formar primera emulsion en homogenizador desde un contendor a otro para formar segunda emulsion, (ii) y microfluidizar primera emulsion para formar segunda emulsion.
DE102009056883B4 (de) 2009-12-03 2012-08-16 Novartis Ag Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben
EP2515938A4 (en) * 2009-12-22 2013-08-28 Sanofi Pasteur Ltd IMMUNOGENIC COMPOSITIONS
MX2012007916A (es) * 2010-01-06 2012-11-06 Vaxinnate Corp Metodos y composiciones para proporcionar inmunidad protectora en los adultos mayores.
WO2011088451A1 (en) * 2010-01-15 2011-07-21 Novavax, Inc. Uses of influenza virus-like particles (vlps) for characterization of neuraminidase and hemagglutinin activity
RU2527688C2 (ru) * 2010-02-27 2014-09-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственная Фирма "Материа Медика Холдинг" Способ лечения инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностого антигена н1n1 и лекарственное средство для лечения инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена н1n1
GB201009673D0 (en) 2010-06-10 2010-07-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
GB201009671D0 (en) 2010-06-10 2010-07-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
GB201009676D0 (en) * 2010-06-10 2010-07-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
US9821051B1 (en) 2010-10-28 2017-11-21 Seqirus UK Limited Reducing hospitalization in elderly influenza vaccine recipients
TW201221642A (en) 2010-11-15 2012-06-01 Nat Health Research Institutes Method of producing lipidated polypeptides
TWI507413B (zh) 2010-11-15 2015-11-11 Nat Health Research Institutes 脂質化多抗原表位疫苗
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
BR112015015523B1 (pt) * 2012-12-28 2023-02-23 Japan As Represented By Director-General Of National Institute Of Infectious Diseases Composição de vacina nasal para influenza
US20140335116A1 (en) * 2013-05-10 2014-11-13 Novartis Ag Avoiding narcolepsy risk in influenza vaccines
CN104436157A (zh) * 2013-09-23 2015-03-25 恩金生物有限公司 流感疫苗和治疗
US10080792B2 (en) * 2013-09-23 2018-09-25 Engen Bio, Inc. Influenza vaccine and therapy
EP3197487B1 (en) * 2014-09-26 2022-08-03 Seqirus UK Limited Vaccination of immunocompromised subjects
WO2019108928A1 (en) * 2017-11-30 2019-06-06 Ohio State Innovation Foundation Mucoadhesive nanoparticle entrapped influenza virus vaccine delivery system
WO2020160080A1 (en) 2019-01-30 2020-08-06 Glaxosmithkline Llc Oil/surfactant mixtures for self-emulsification
CA3155749A1 (en) * 2019-12-20 2021-06-24 Fresenius Kabi Austria Gmbh Method for producing oil-in-water emulsions
RU2741003C1 (ru) * 2020-03-27 2021-01-22 Евгений Дмитриевич Некрасов Способ производства четырехвалентной субъединичной вакцины против гриппа без адъювантов
EP4171629A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Adjuvants
MX2023002356A (es) 2020-08-24 2023-03-22 Sanofi Pasteur Inc Vacunas contra la covid-19 con coadyuvantes en emulsion de escualeno que contiene tocoferol.
IL300632A (en) 2020-08-24 2023-04-01 Sanofi Pasteur Inc Vaccines against SARS-COV-2 infections
KR102270165B1 (ko) 2020-10-22 2021-06-28 한국화학연구원 세정제 조성물
WO2022200582A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions
EP4362974A1 (en) 2021-06-28 2024-05-08 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Novel influenza antigens
RU2766292C1 (ru) * 2021-08-05 2022-03-14 Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) Состав вакцины против covid-19
WO2023020992A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023020994A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023020993A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023061993A1 (en) 2021-10-13 2023-04-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Polypeptides
GB202219228D0 (en) 2022-12-20 2023-02-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel influenza antigens

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995017210A1 (en) * 1993-12-23 1995-06-29 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccines
WO1999011241A1 (en) * 1997-09-05 1999-03-11 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
WO2002097072A2 (en) * 2001-05-30 2002-12-05 Saechsisches Serumwerk Dresden Branch Of Smithkline Beecham Pharma Gmbh & Co. Kg Influenza vaccine composition

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3095974A (en) * 1961-10-27 1963-07-02 Anthony R Perini Collapsible book rack
US4047869A (en) * 1973-02-23 1977-09-13 Mulvany Jr R F Apparatus for forming plastic articles
FR2333610A1 (fr) * 1975-12-03 1977-07-01 Zhdanovsky Z Tyazhelogo Mash Bande-electrode a ame en poudre pour rechargement a l'aide d'un alliage resistant a l'usure
US4270537A (en) 1979-11-19 1981-06-02 Romaine Richard A Automatic hypodermic syringe
DD155875A1 (de) 1980-12-31 1982-07-14 Willy Nordheim Verfahren zur herstellung eines ballaststoffarmen inaktivierten influenzaimpfstoffes
US4436727A (en) * 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) * 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
DD211444A3 (de) 1982-08-19 1984-07-11 Saechsisches Serumwerk Verfahren zur herstellung von influenza-impfstoffen
GB8300467D0 (en) 1983-01-08 1983-02-09 Wellcome Found Equine influenza
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
DD300833A7 (de) 1985-10-28 1992-08-13 Saechsische Landesgewerbefoerd Verfahren zur herstellung von inaktivierten influenza-vollvirusimpfstoffen
CA1283827C (en) 1986-12-18 1991-05-07 Giorgio Cirelli Appliance for injection of liquid formulations
GB8704027D0 (en) 1987-02-20 1987-03-25 Owen Mumford Ltd Syringe needle combination
EP0362278A4 (en) 1987-06-05 1990-05-14 Us Health FACTORS OF AUTOCRINE MOTILITY IN THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER.
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
DE3734306A1 (de) 1987-10-10 1989-04-27 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung fuer fliessfaehige medien
US5376369A (en) * 1987-11-03 1994-12-27 Syntex (U.S.A.) Inc. Vaccine adjuvant
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8821049D0 (en) 1988-09-08 1988-10-05 Health Lab Service Board Method & composition for treatment & prevention of viral infections
FR2638359A1 (fr) 1988-11-03 1990-05-04 Tino Dalto Guide de seringue avec reglage de la profondeur de penetration de l'aiguille dans la peau
DK0382271T3 (da) * 1989-02-04 1995-05-01 Akzo Nobel Nv Tocoler som adjuvanser i vacciner
US5092235A (en) 1989-05-24 1992-03-03 Tektronix, Inc. Pressure fixing and developing apparatus
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE4005528C2 (de) 1990-02-22 1998-01-15 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung für Medien
US5969109A (en) * 1990-02-28 1999-10-19 Bona; Constantin Chimeric antibodies comprising antigen binding sites and B and T cell epitopes
WO1991013261A1 (en) 1990-03-02 1991-09-05 Experimentalny Nauchno-Issledovatelsky Institut Metallorezhuschikh Stankov Digital servo drive
US5149531A (en) * 1990-06-27 1992-09-22 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Method of using cold-adapted live influenza virus vaccine as an antiviral agent against influenza
US5190521A (en) 1990-08-22 1993-03-02 Tecnol Medical Products, Inc. Apparatus and method for raising a skin wheal and anesthetizing skin
US5527288A (en) 1990-12-13 1996-06-18 Elan Medical Technologies Limited Intradermal drug delivery device and method for intradermal delivery of drugs
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
SE9102652D0 (sv) 1991-09-13 1991-09-13 Kabi Pharmacia Ab Injection needle arrangement
US5328483A (en) 1992-02-27 1994-07-12 Jacoby Richard M Intradermal injection device with medication and needle guard
MA22842A1 (fr) 1992-03-27 1993-10-01 Smithkline Beecham Biolog Procede de preparation de compositions de vaccin.
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
JPH08506592A (ja) * 1993-02-19 1996-07-16 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション ３−ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ含有のインフルエンザワクチン組成物
CA2156525A1 (en) 1993-02-19 1994-09-01 Susan Dillon Influenza vaccine compositions containing 3-o-deacylated monophosphoryl lipid a
PL178578B1 (pl) 1993-03-23 2000-05-31 Smithkline Beecham Biolog Zawiesina cząstek 3-0-deacylowanego monofosforylolipidu A i sposób jej wytwarzania oraz kompozycja szczepionki zawierającej antygen w połączeniu z 3-0-deacylowanym monofosforylolipidem A i sposób jej wytwarzania
US5762939A (en) * 1993-09-13 1998-06-09 Mg-Pmc, Llc Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
WO1995011700A1 (en) 1993-10-29 1995-05-04 Pharmos Corp. Submicron emulsions as vaccine adjuvants
BR9408071A (pt) 1993-11-17 1996-12-24 Om Lab Sa Di-sacarideos de glucosamina processo para sua preparação e composição farmacêutica que compreende os mesmos e seu uso
DE69533693T2 (de) 1994-02-24 2005-12-22 Novavax Inc.(n.d.Ges.d.Staates Delaware) Impfstoffe, die paucilamelläre Lipidvesikel als Adjuvans enthalten
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
US5916879A (en) 1996-11-12 1999-06-29 St. Jude Children's Research Hospital DNA transcription unit vaccines that protect against avian influenza viruses and methods of use thereof
TW570803B (en) 1997-04-09 2004-01-11 Duphar Int Res Influenza vaccine
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9718901D0 (en) * 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
KR20010041629A (ko) * 1998-03-09 2001-05-25 장 스테판느 혼합 백신 조성물
US6838269B1 (en) * 1998-04-15 2005-01-04 Genencor International, Inc. Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
ES2296390T3 (es) 1998-05-07 2008-04-16 Corixa Corporation Composicion coadyuvante y procedimiento para su uso.
HUP0102332A3 (en) 1998-06-08 2002-11-28 Sca Emballage France Fast flattening packaging
AU761396B2 (en) 1998-06-30 2003-06-05 Om Pharma Novel acyl pseudodipeptides, preparation method and pharmaceutical compositions containing same
AT408615B (de) 1998-09-15 2002-01-25 Immuno Ag Neue influenzavirus-impfstoffzusammensetzung
US6551600B2 (en) 1999-02-01 2003-04-22 Eisai Co., Ltd. Immunological adjuvant compounds compositions and methods of use thereof
US20040006242A1 (en) 1999-02-01 2004-01-08 Hawkins Lynn D. Immunomodulatory compounds and method of use thereof
AT407958B (de) 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
JP2002537102A (ja) 1999-02-26 2002-11-05 カイロン コーポレイション 吸着された高分子および微粒子を有するミクロエマルジョン
FR2796290B1 (fr) 1999-07-16 2001-09-14 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille fonctionnant avec un generateur d'onde de choc a travers une paroi
FR2796289B1 (fr) 1999-07-16 2001-08-10 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille avec injecteur a elements superposes
FR2796291B1 (fr) 1999-07-16 2001-09-21 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille munie d'un systeme de declenchement piezo-electrique
GB9921146D0 (en) * 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
GB9921147D0 (en) * 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
GB9923176D0 (en) * 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
FR2800619B1 (fr) 1999-11-05 2002-02-08 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille avec un moyen de poussee temporairement retenu
FR2802102B1 (fr) 1999-12-08 2002-07-12 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille munie d'un tube d'ejection a section constante
FR2802103B1 (fr) 1999-12-08 2003-10-03 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant avec entrainement du principe actif par effet tube a choc
WO2001046127A1 (fr) 1999-12-22 2001-06-28 Om Pharma Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
FR2802820B1 (fr) 1999-12-27 2002-10-18 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant par effet tube a choc, avec maintien prealable du principe actif sur le cote
KR20070073987A (ko) 2000-01-31 2007-07-10 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. Ｈｉｖ에 대한 예방 또는 치료용 면역화를 위한 백신
FR2804329B1 (fr) 2000-02-02 2002-12-13 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille munie d'un opercule contenant le principe actif
FR2804869B1 (fr) 2000-02-11 2002-05-17 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille pour l'injection d'un liquide contenu dans une ampoule pre-remplie
FR2805749B1 (fr) 2000-03-01 2002-05-17 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille a deux niveaux de vitesse d'injection
FR2807946B1 (fr) 2000-04-19 2002-06-07 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant avec un chargement pyrotechnique bicomposition
FR2809626B1 (fr) 2000-05-30 2003-03-07 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille avec membrane d'isolation d'un ejecteur multiconduit
FR2810554B1 (fr) 2000-06-22 2003-05-16 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille munie d'un reservoir modulable
FR2812202B1 (fr) 2000-07-28 2002-09-13 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant par mise en compression du reservoir contenant le principe actif liquide
GB0025577D0 (en) 2000-10-18 2000-12-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
FR2815544B1 (fr) 2000-10-23 2003-02-14 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille securisee a architecture compacte
EP1201250A1 (en) 2000-10-25 2002-05-02 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Immunogenic compositions comprising liver stage malarial antigens
US20040071734A1 (en) * 2001-02-23 2004-04-15 Nathalie Garcon Novel vaccine
US7361352B2 (en) * 2001-08-15 2008-04-22 Acambis, Inc. Influenza immunogen and vaccine
US6861410B1 (en) 2002-03-21 2005-03-01 Chiron Corporation Immunological adjuvant compositions
WO2003084467A2 (en) * 2002-04-01 2003-10-16 Euro-Celtique S.A. Epitope constructs comprising antigen presenting cell targeting mechanisms
WO2004075829A2 (en) 2003-01-30 2004-09-10 Chiron Corporation Adjuvanted influenza vaccine
CA2559371C (en) * 2004-03-09 2014-07-08 Chiron Corporation Influenza virus vaccines
CA2601022C (en) * 2005-03-23 2023-03-07 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Use of an influenza virus an oil-in-water emulsion adjuvant to induce cd4 t-cell and/or improved b-memory cell response
US20090028903A1 (en) * 2005-03-23 2009-01-29 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Novel use
AR054822A1 (es) 2005-07-07 2007-07-18 Sanofi Pasteur Emulsion inmuno adyuvante
JP2009514850A (ja) 2005-11-04 2009-04-09 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル アジュバントとして減少した量の水中油型エマルションを有するインフルエンザワクチン
FR2896162B1 (fr) 2006-01-13 2008-02-15 Sanofi Pasteur Sa Emulsion huile dans eau thermoreversible
US9101578B2 (en) 2006-05-01 2015-08-11 Technovax, Inc. Polyvalent influenza virus-like particle (VLP) compositions
ES2469568T3 (es) * 2006-07-17 2014-06-18 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacuna contra la gripe
JP5639760B2 (ja) * 2006-07-17 2014-12-10 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム インフルエンザワクチン
CA2664619C (en) * 2006-10-12 2012-12-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic compositions comprising an oil-in-water emulsion adjuvant containing a reduced amount of squalene, tocol and an emulsifying agent
TW200908994A (en) * 2007-04-20 2009-03-01 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP2227251A1 (en) * 2007-12-06 2010-09-15 GlaxoSmithKline Biologicals SA Influenza composition

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995017210A1 (en) * 1993-12-23 1995-06-29 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccines
WO1999011241A1 (en) * 1997-09-05 1999-03-11 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
WO2002097072A2 (en) * 2001-05-30 2002-12-05 Saechsisches Serumwerk Dresden Branch Of Smithkline Beecham Pharma Gmbh & Co. Kg Influenza vaccine composition

Also Published As

Publication number Publication date
JP2008534466A (ja) 2008-08-28
NO20074638L (no) 2007-12-19
ES2585810T3 (es) 2016-10-10
SI1861120T1 (sl) 2016-09-30
TW200722101A (en) 2007-06-16
PT1861120T (pt) 2016-08-18
AU2006226543B2 (en) 2011-10-06
JP5770414B2 (ja) 2015-08-26
US20110287054A1 (en) 2011-11-24
IL185897A (en) 2015-11-30
CA2601022A1 (en) 2006-09-28
KR20140004815A (ko) 2014-01-13
AU2006226458B2 (en) 2012-08-30
WO2006100110A1 (en) 2006-09-28
EP1861122A1 (en) 2007-12-05
KR20160064249A (ko) 2016-06-07
DK1861120T3 (en) 2016-07-25
PE20061428A1 (es) 2007-01-16
JP2008534465A (ja) 2008-08-28
JP2008534467A (ja) 2008-08-28
EP1861120A1 (en) 2007-12-05
KR20070116652A (ko) 2007-12-10
JP5869744B2 (ja) 2016-02-24
AR053833A1 (es) 2007-05-23
US9730999B2 (en) 2017-08-15
WO2006100111A1 (en) 2006-09-28
NZ561823A (en) 2010-04-30
HUE027837T2 (en) 2016-11-28
PE20061387A1 (es) 2007-01-19
TW200700078A (en) 2007-01-01
CA2603180C (en) 2015-10-13
CA2601022C (en) 2023-03-07
US20080171063A1 (en) 2008-07-17
NO20074930L (no) 2007-12-07
JP2014129359A (ja) 2014-07-10
IL185901A0 (en) 2008-01-06
NZ561822A (en) 2010-04-30
IL185897A0 (en) 2008-01-06
EA200701786A1 (ru) 2008-04-28
EP1863529A1 (en) 2007-12-12
AR052625A1 (es) 2007-03-21
EA200701787A1 (ru) 2008-08-29
TW200700079A (en) 2007-01-01
AU2006226459A1 (en) 2006-09-28
KR20070116650A (ko) 2007-12-10
AU2006226543A1 (en) 2006-09-28
MA29715B1 (fr) 2008-09-01
EP1861120B1 (en) 2016-05-25
PE20061300A1 (es) 2006-12-23
EP2397153A1 (en) 2011-12-21
EA200701785A1 (ru) 2008-04-28
PL1861120T3 (pl) 2016-11-30
US20090081253A1 (en) 2009-03-26
AR054020A1 (es) 2007-05-30
MX2007011756A (es) 2008-03-11
HRP20160816T1 (hr) 2016-08-12
CA2603180A1 (en) 2006-09-28
WO2006100109A1 (en) 2006-09-28
IL185906A0 (en) 2008-01-06
KR20070116651A (ko) 2007-12-10
CY1117874T1 (el) 2017-05-17
US20140363474A1 (en) 2014-12-11
MA30298B1 (fr) 2009-04-01
US20080181911A1 (en) 2008-07-31
NO20074635L (no) 2007-12-19
MX2007011748A (es) 2008-03-11
MX2007011775A (es) 2008-03-11
MA29342B1 (fr) 2008-03-03
KR101916787B1 (ko) 2019-01-24
AU2006226458A1 (en) 2006-09-28
CA2602456A1 (en) 2006-09-28
EA011419B1 (ru) 2009-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA011393B1 (ru) Применение вируса гриппа и адъюванта на основе эмульсии &#34;масло в воде&#34; для индуцирования cd4 т-клеточного ответа и/или улучшенного ответа, основанного на в-клетках памяти
KR101696727B1 (ko) 인플루엔자 백신
EA024250B1 (ru) Дозированная форма иммуногенного препарата против гриппа для применения у человека и содержащая её вакцина, способы их приготовления и их применение для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых вирусом гриппа у людей
EP2422810B1 (en) Influenza vaccine
US20070141078A1 (en) Influenza vaccine
US20110123568A1 (en) Novel use
BRPI0609516A2 (pt) uso de um vìrus de influenza ou preparação antigênica do mesmo e um adjuvante de emulsão de óleo-em-água, e, método para projetar uma vacina para doenças conhecidas por serem curadas ou tratadas por meio de uma ativação de células tcd4+
AU2007202129A1 (en) Influenza vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM