KR20090016704A

KR20090016704A - 보조제-보존 수회-투여 인플루엔자 접종 요법

Info

Publication number: KR20090016704A
Application number: KR1020087030382A
Authority: KR
Inventors: 기우제페 델 기우디스; 리카르도 마네티
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2006-06-15
Filing date: 2007-06-15
Publication date: 2009-02-17
Also published as: US9901630B2; HK1129205A1; US20090220545A1; US8808686B2; EP2032163B1; AU2007258874B2; ES2401484T3; CA2657989A1; PL2032163T3; US20120039934A1; AU2007258874A1; JP5981951B2; BRPI0713150A8; JP2009539965A; ZA200810582B; SI2032163T1; DK2032163T3; PT2032163E; JP2014098038A; WO2007144772A2

Abstract

인플루엔자 백신은 수회-투여 요법에 의하여 투여되며, 여기서 (i) 제1 투여는 보조제와 함께 투여되고, (ii) 이후의 투여는 보조제 없이 투여되거나 또는 다른 보조제와 함께 투여된다. 따라서 본 발명은 주어진 보조제의 공급 필요성을 배가하지 않으면서도 2회-투여 요법의 이점을 제공한다.

인플루엔자, 백신, 보조제.

Description

보조제-보존 수회-투여 인플루엔자 접종 요법{ADJUVANT-SPARING MULTI-DOSE INFLUENZA VACCINATION REGIMEN}

본원의 모든 문헌은 일체성을 지니고 참고자료로서 본원에 포함되어 있다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 보호하기 위한 백신에 관한 것이다.

백신을 최소한 4주 간격으로 2회 접종해야하는 8세 이하의 아동의 첫 번째 투여를 제외하고 인플루엔자 백신을 투여한 환자는 현재 매년 1회 투여하게 된다.

2회-투여 요법은 또한 인간 집단이 신종 인플루엔자 바이러스 균주에 면역학적으로 미경험인 대유행기 상황에서 요구된다고 알려져 있다(예컨대, 참고자료 1 참조).

2회 투여의 필요성은, 항원의 고정된 공급량의 항원으로, 제조될 수 있는 투여분량의 수가 1회-투여 요법으로 생산할 수 있는 수의 절반이라는 것을 의미한다. 따라서, 투여당 적은 양의 항원을 사용하도록 제안되어 왔으며, 이러한 감소를 보충하기 위하여 보조제를 사용하도록 제안되어 왔다.

그러나 보조제형 백신의 1회-투여 요법이 충분한 면역 반응을 유발하지 않는다면, 보조제의 적절한 양의 공급이 문제가 되는 추가적 단점을 지니고 있는 2회- 투여 요법이 요구될 것이다. 수백만의 보조제형 백신 투여가 이루어지는 상황에서, 이러한 문제는 매우 중요하며, 합성 보조제는 특히 중요한 것이 될 것이다.

본 발명의 목적은 이러한 불이익을 감소 또는 회피하는 것이다.

본 발명에 따르면, 인플루엔자 백신은 수회-투여 요법에 의하여 투여되며, 여기서 (i) 제1 투약량은 보조제와 함께 투여되며, (ii) 그 이후의 투약량은 보조제 없이 투여되거나 또는 다른 보조제와 함께 투여된다. 따라서 본 발명은 주어진 보조제의 공급의 필요성을 배가하지 않고도 2회-투여의 이점을 제공한다. 제1 투약량 및 그 이후의 투약량은 동일한 투여 경로(예컨대, 둘 다 근육내 주사)에 의하여 투여되는 것이 바람직하며, 반면에 참고자료 2의 연구는 마우스 내의 비경구 초회 경로(등 vs. 목)가 보조제형 백신의 면역성에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위하여 3회-투여 요법에서 제3 투여로서 비보조제형 점막 부스터를 사용하였다.

따라서 본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염에 대하여 환자를 면역화하는 방법을 제공하며, 여기에는 다음의 단계가 포함된다: (i) 제1 보조제와 조합한 인플루엔자 바이러스 백신의 투약량을 투여하는 단계; 및 (ii) 보조제 없이 인플루엔자 바이러스 백신의 추가의 투약량을 투여하는 단계. 추가의 투약량은 보조제를 포함하지 않거나 또는 제1 보조제와는 다른 제2 보조제를 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 다음을 포함하는 키트를 제공한다: (i) 제1 보조제와 조합된 제1 인플루엔자 바이러스 백신; 및 (ii) 보조제 없는 제2 인플루엔자 바이러스 백신. 또한 본 발명은 수회-투여 인플루엔자 백신의 제조에 (i) 제1 보조제와 조합된 제1 인플루엔자 바이러스 백신; 및 (ii) 보조제 없는 제2 인플루엔자 바이러스 백신의 사용을 제공한다. 제2 백신은 보조제를 포함하지 않거나 또는 제1 보조제와는 다른 제2 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 환자의 면역화를 수행하는 방법을 제공하며, 여기서 환자는 이전에 제1 보조제와 조합된 인플루엔자 바이러스 백신의 투약량을 투여받았으며, 이 방법은 환자에 보조제 없는 인플루엔자 바이러스 백신의 추가 투약량을 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 투약량은 보조제를 포함하지 않거나 또는 제1 보조제와는 다른 제2 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 환자의 면역화를 위한 의약의 제조에 비보조제형 인플루엔자 바이러스 백신의 사용을 제공하며, 여기서 환자는 이전에 보조제형 인플루엔자 바이러스 백신을 투여받았다. 본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 환자의 면역화를 위한 의약의 제조에 제2 보조제형 인플루엔자 바이러스 백신의 사용을 제공하며, 여기서 환자는 제1 보조제형 인플루엔자 바이러스 백신을 이전에 투여받았으며, 제1 및 제2 인플루엔자 바이러스 백신 내의 보조제는 동일하지 않다.

이러한 방법, 키트 및 사용은 두번의 접종시 적혈구응집소 투약량이 투여당 균주당 15㎍의 표준보다 적으며, 본 발명이 항원 및 보조제 모두의 요구를 완화하도록하므로 특히 유리하다.

인플루엔자 바이러스 항원

본 발명의 백신은 인플루엔자 바이러스 항원을 포함한다. 항원은 일반적으로 인플루엔자 비리온으로부터 제조되나, 대안적으로, 항원 예컨대 적혈구응집소 및 뉴라미니다제가 재조합 숙주(예컨대, 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터를 사용한 곤충 세포주) 내에서 발현될 수 있으며, 정제된 형태로 사용된다[3,4,5]. 그러나, 일반적으로 항원은 비리온에서 온 것이다.

항원은 생 바이러스 또는, 더 바람직하게는, 불활성 바이러스의 형태를 취한다. 바이러스의 불활성화를 위한 화학적 수단에는 하나 이상의 다음의 약제의 유효량에 의한 처리를 포함할 수 있다: 세척제, 포름알데히드, 포르말린, β-프로피오락톤, 또는 UV 광. 불활성화를 위한 추가적인 화학적 수단은 메틸렌 블루, 솔라렌, 카복시플러렌(C60) 또는 이들의 모든 조합의 처리를 포함한다. 바이러스 불활성화의 다른 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다, 예컨대 예를 들어 2성분 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민, 또는 감마선 조사이다. INFLEXAL™ 제품은 전 비리온 불활성화 백신이다.

불활성 바이러스가 사용되는 경우, 백신은 전 바이러스, 분할 바이러스, 또는 정제된 표면 항원(적혈구응집소 및, 일반적으로, 뉴라미니다아제를 포함)을 포함할 수 있다.

일반적으로, 수회-투여 요법의 각 백신 투약량은 동일한 형태의 항원을 사용하게 된다. 예컨대 제1 투약량에 분할 비리온을 사용하고, 제2 투약량에는 전 비리온을 사용하지는 않는다는 것이다.

비리온은 다양한 방법을 통하여 바이러스-함유 유체로부터 수확될 수 있다. 예를 들어, 정제 방법은 비리온을 파괴하는 성분을 함유한 선형 슈크로스 성분 용액을 사용하는 구역원심분리가 관계될 수 있다. 그 다음 항원은 선택적인 희석 후에 정용여과에 의하여 정제될 수 있다.

분할 바이러스는 비리온을 세척제(예컨대, 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸 인산, 트리톤 X-100, 트리톤 N101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 테르기톨 NP9, 등)로 처리하여 획득하여 '트윈-에테르' 분할 방법에 포함하는 서브비리온 제조물을 생산할 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 분할 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 참고자료 6-11, 등. 바이러스의 분할은 일반적으로 감염성 또는 비감염성인 전 바이러스의 분할제의 파괴 농도로 파괴 또는 절편화에 의하여 수행된다. 파괴에 의하여 바이러스 단백질의 전체 또는 일부 가용화가 되었으며, 바이러스의 통합성을 변화시켰다. 바람직한 분할제는 비이온성 및 이온성(예컨대, 양이온성) 계면활성제 예컨대, 알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실당, 설포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카마이드, 헤카메그(Hecameg), 알킬페녹시-에톡시에탄올, 4차 암모늄 화합물, 사르코실, CTAB(세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드), 트리-N-부틸 포스페이트, 세타브론, 미리스틸트리메틸암모늄염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예컨대, 트리톤 계면활성제, 예컨대 트리톤 X-100 또는 트리톤 N101), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(트윈 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르, 등이다. 유용한 하나의 분할 방법은 나트륨 데옥시콜레이트 및 포름알데히드의 연속 효과를 사용하며, 분할은 초기 비리온 분리정제시 발생할 수 있다(예컨대, 설탕 밀도 성분 용액 내에서). 따라서 분할 방법은 비리온-함유 물질의 정화(비-비리온 물질을 제거하기 위함), 수확된 비리온의 농도(예컨대, 흡착 방법, 예컨대 CaHPO₄ 흡착을 사용), 비-비리온 물질로부터 전 비리온의 분리, 밀도 성분 원심분리 단계에서 분할제를 사용하는 비리온 분할(분할제 예컨대, 나트륨 데옥시콜레이트를 함유한 설탕 성분을 사용), 및 원치않는 물질을 제거하기 위한 후속적인 여과(예컨대 초여과)가 관여될 수 있다. 분할 비리온은 나트륨 포스페이트-완충 등장성 염화 나트륨 용액에 유용하게 재현탁될 수 있다. BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ 및 FLUSHIELD™ 제품은 분할 백신이다.

정제된 표면 항원 백신은 인플루엔자 표면 항원 적혈구응집소 및, 일반적으로, 뉴라미니다아제를 포함한다. 정제된 형태의 이러한 단백질의 제조 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ 및 INFLUVAC™ 제품은 서브유닛 백신이다.

인플루엔자 항원은 INFLEXAL V™ 및 INVAVAC™에서와 같이 바이로솜[12](핵산 유리 바이러스 유사 리포좀 입자)의 형태로 나타낼 수 있으나, 본 발명과 바이로솜을 함께 사용하는 것을 선호하지 않는다. 따라서, 일 실시 상태에서, 인플루엔자 항원은 바이로솜의 형태가 아니다.

인플루엔자 바이러스는 약독화될 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 온도-민감성이 될 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 저온-적응형일 수 있다. 이러한 3 가지 특성은 항원으로서 생 바이러스를 사용하는 경우 특히 유용하다.

백신에 사용되는 인플루엔자 바이러스 균주는 계절별로 변화될 수 있다. 현재의 대유행기간 사이에서, 백신은 일반적으로 두 인플루엔자 A 균주(H1N1 및 H3N2) 및 하나의 인플루엔자 B 균주를 포함하며, 및 3가 백신이 일반적이다. 본 발명은 유행성 균주(즉, 백신 수용자 및 일반 인간 개체군이 면역학적으로 미경험인 균주)의 HA, 예컨대 H2, H5, H7 또는 H9 서브타입 균주(특히 인플루엔자 A 바이러스의 균주)를 사용할 수도 있으며, 유행성 균주용 인플루엔자 백신은 1가가 되거나 또는 유행성 균주에 의하여 보충된 정상 3가 백신에 기초할 수 있다. 그러나, 계절 및 백신에 포함된 항원의 특성에 따라, 본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16에 대하여 보호될 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 NA 서브타입 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, 또는 N9에 대하여 보호할 수 있다.

조성물 내에 유용하게 포함될 수 있는 항원의 그 밖의 균주는 저항성 유행성 균주를 포함하는 항바이러스 요법에 내성(예컨대 오셀타미비르[13] 및/또는 자나미비르에 내성)인 균주이다[14].

본 발명의 항원보강형 조성물은 유행성 균주에 대한 접종에 특히 유용하다. 유행성 발병을 유발할 수 있는 능력을 부여하는 인플루엔자 균주의 특성은: (a) 이는 현재-순환되는 인간 균주 내의 적혈구응집소에 비하여 신규의 적혈구응집소를 함유하며, 즉, 10년 이상 인간 개체군에게 명백하지 않거나(예컨대 H2), 또는 이전에 인간 개체군에서 발견되지 않은 것(예컨대 H5, H6 또는 H9, 일반적으로 조류 개체군에서만 발견)으로서, 인간 개체군이 균주의 적혈구응집소에 면역학적으로 미경험인 것; (b) 인간 개체군에 수평적으로 감염될 수 있는 것; 및 (c) 인간에 병원성인 것. H5 적혈구응집소 타입을 보유한 바이러스는 유행성 인플루엔자, 예컨대 H5N1 균주에 대한 면역접종에 바람직하다. 그 밖의 가능한 균주는 H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 및 H7N7, 및 기타 발생하는 잠재적인 유행성 균주를 포함한다. H5 서브타입 내에서, 바이러스는 HA 클레이드 1, HA 클레이드 1', HA 클레이드 2 또는 HA 클레이드 3 [15]에 해당될 수 있으며, 클레이드 1 및 3는 특히 관련되어 있다.

일반적으로, 수회-투여 요법 내에서 각 백신 투여는 적어도 하나의 일반적인 적혈구응집소 서브타입을 공유하게 되며, 예컨대 본 발명은 제1 투약량에 1가 H5N1 백신을 사용하나 제2 투약량에 1가 H9N2 백신을 사용하지 않게 될 것이다.

본 발명의 조성물은 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는, 하나 이상의(예컨대 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의) 인플루엔자 바이러스 균주의 항원(들)을 포함할 수 있다. 백신이 하나 이상의 인플루엔자 균주를 포함하는 경우, 다른 균주는 일반적으로 분리하여 성장하며, 바이러스를 수확한 후에 혼합되고, 항원이 제조된다. 따라서 본 발명의 방법은 하나 이상의 인플루엔자 균주의 항원 혼합 단계를 포함할 수 있다. 그러나 유행기에는 1가 백신이 바람직하다.

인플루엔자 바이러스는 재배열 균주일 수 있으며, 역 유전학 기법에 의하여 획득할 수 있다. 역 유전학 기법[예컨대, 16-20]에 의하여 소망하는 게놈 부분을 함유한 인플루엔자 바이러스를 플라스미드를 사용하여 시험관 내에서 제조할 수 있다. 일반적으로, 이는 (a) 예컨대, polI 프로모터로부터 소망하는 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 DNA 분자, 및 (b) 예컨대, polII 프로모터로부터 바이러스 단백질을 암호화하는 DNA 분자의 발현과 관련되어 있어, 세포 내에서 두 유형의 DNA의 발현에 의하여 완전 무손상 감염성 비리온의 조립을 유도한다. DNA는 바이러스 RNA 및 단백질 모두를 제공하는 것이 바람직하나, 또한 헬퍼(helper) 바이러스를 사용하여 일부의 RNA 및 단백질을 제공하는 것도 가능하다. 각 바이러스 RNA를 생산하기 위한 별도의 플라스미드를 사용하는 플라스미드계 방법이 바람직하며[21-23], 이러한 방법은 바이러스 단백질의 전부 또는 일부(예컨대, PB1, PB2, PA 및 NP 단백질)를 발현하기 위하여 일부 방법에서 사용되는 12 플라스미드를 사용하는 것이다.

필요한 플라스미드의 수를 감소시키기 위하여, 최근의 연구[24]는 복수의 RNA 중합효소 I 전사 카세트(바이러스 RNA 합성용)를 동일한 플라스미드(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모든 8 인플루엔자 A vRNA 부분을 암호화하는 서열)상에서 결합하고, RNA 중합효소 II 프로모터를 보유한 복수의 단백질-암호화 영역을 다른 플라스미드(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모든 8 인플루엔자 A mRNA 전사체를 암호화하는 서열)상에서 결합한다. 참고자료 34의 방법의 바람직한 특징은: (a) 단일 플라스미드 상의 PB1, PB2 및 PA mRNA-암호화 영역; 및 (b) 단일 플라스미드 상의 모든 8 vRNA-암호화 부분이다. 일 플라스미드 상의 NA 및 HA 부분 및 다른 플라스미드 상의 6개의 다른 부분을 포함하는 것은 문제를 촉진시킬 수 있다.

바이러스 RNA 부분을 암호화하기 위한 polI 프로모터를 사용의 대안으로서, 박테리오파아지 중합효소 프로모터를 사용할 수 있다 [25]. 예를 들면, SP6, T3 또는 T7 중합효소의 프로모터는 편리하게 사용할 수 있다. polI 프로모터의 종-특이성 때문에, 박테리오파아지 중합효소 프로모터는 외인성 중합효소를 암호화하는 플라스미드로 전달감염되어야 함에도 많은 세포 유형(예컨대, MDCK)에 대하여 더욱 편리할 수 있다.

다른 기법으로서, 2중 polI 및 polII 프로모터를 사용하여 바이러스 RNA 및 단일 주형으로부터 발현가능한 mRNA를 동시에 암호화할 수 있다[26,27].

따라서, 바이러스(특히 인플루엔자 A 바이러스)는 A/PR/8/34 바이러스의 하나 이상의 RNA 부분(일반적으로 백신 균주의 HA 및 N 부분을 보유한 A/PR/8/34의 6 부분, 즉 6:2 재분류)을 포함할 수 있다. 특히, 바이러스가 난자에서 성장하는 경우, 이는 A/WSN/33 바이러스, 또는 백신 제조를 위하여 재분류 바이러스를 생산하기에 유용한 다른 바이러스 균주의 하나 이상의 RNA 부분을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 발명은 인간-대-인간 감염이 가능한 균주에 대하여 보호하며, 따라서 균주의 게놈은 일반적으로 포유류 (예컨대, 인간) 인플루엔자 바이러스에서 유래한 최소한 하나의 RNA 부분을 포함하게 된다. 이는 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래한 NS 부분을 포함할 수도 있다.

항원의 공급원으로 사용된 바이러스는 SPF 난(egg) 또는 세포 배양물 상에서 성장할 수 있다. 현재 인플루엔자 바이러스 성장용 표준 방법은 계란 함유물(요막액)으로부터 정제된 바이러스를 보유한 수정 계란을 사용한다. 보다 근자에는, 그러나, 바이러스는 속도와 환자의 알러지의 이유로 동물 세포 배양물에서 성장되었으며, 이 성장 방법이 바람직하다. 난 기초 바이러스 성장이 사용되는 경우, 하나 이상의 아미노산이 바이러스와 함께 난 요막액으로 도입될 수 있다[11].

세포 기질은 일반적으로 포유류 세포주가 될 수 있다. 적합한 포유류 원 세포에는 햄스터, 가축류, 영장류(인간 및 원숭이 포함) 및 개 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다양한 세포 유형, 예컨대 신장 세포, 섬유모세포, 망막 세포, 폐 세포, 등이 사용될 수 있다. 적합한 햄스터 세포는 BHK21 또는 HKCC로 명명된 세포주이다. 적합한 원숭이 세포는 예컨대 아프리카 그린 원숭이 세포로서, 예컨대 신장 세포는 베로 세포주이다. 적합한 개 세포는 예컨대 신장 세포로서 MDCK 세포주이다. 따라서 적합한 세포주는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; 등. 인플루엔자 바이러스 성장용 바람직한 포유류 세포주는 다음을 포함한다: 메디안 더비 카닌 신장으로부터 유도된 MDCK 세포[28-31]; 아프리칸 그린 원숭이(세르코피테쿠스 아에티오프스(Cercopithecus aethiops)) 신장으로부터 유도된 베로 세포[32-34]; 또는 인간 배아성 망막모세포로부터 유도된 PER.C6 세포[35]. 이러한 세포주는 예컨대 아메리칸 타입 셀 컬쳐(ATCC) 콜렉션[36], 코리엘 셀 레포지토리(Coriell Cell Repositories)[37], 또는 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐(ECACC) 등으로부터 광범위하게 활용가능하다. 예를 들어, ATCC는 다양한 다른 베로 세포를 카탈로그 번호 CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 및 CRL-1587에서 공급하며, 이는 MDCK 세포를 카탈로그 번호 CCL-34에서 공급한다. PER.C6는 ECACC로부터 수탁 번호 96022940로서 활용가능하다. 포유류 세포주의 덜 바람직한 대안으로서, 바이러스는 오리 또는 닭로부터 유도된 세포(예컨대, 오리 망막)를 포함하는 조류 세포주[예컨대, 참고자료 38-40] 상에서 성장할 수 있다. 조류 세포주의 예는 조류 배아 줄기 세포[38, 41] 및 오리 망막 세포[39]를 포함한다. 적합한 조류 배아 줄기 세포는 닭 배아 줄기 세포, EB45, EB14, 및 EB14-074로부터 유도된 EBx 세포주를 포함한다[52]. 닭 배아 섬유모세포(CEF)가 사용될 수 있다.

인플루엔자 바이러스 성장에 가장 바람직한 세포주는 MDCK 세포주이다. 원 MDCK 세포주는 ATCC에서 CCL-34로서 이용가능하나, 이 세포주의 유도체를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 참고자료 28은 현탁액 배양시 성장에 적응된 MDCK 세포주를 개시하였다('MDCK 33016', 수탁 번호 DSM ACC 2219). 이와 유사하게, 참고자료 43은 현탁액의 무형청 배양시 성장하는 MDCK-유도성 세포주를 개시하였다('B-702', 수탁 번호 FERM BP-7449). 참고자료 44는 비-종양유발성 MDCK 세포로서, 'MDCK-S'(ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101'(ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102'(ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103'(PTA-6503)를 포함하는 세포를 개시하였다. 참고자료 45는 'MDCK.5F1' 세포(ATCC CRL-12042)를 포함하는 감염에 대한 고 민감성 MDCK 세포주를 개시하였다. 모든 이러한 MDCK 세포주를 사용할 수 있다.

바이러스가 포유류 세포주에서 성장하는 경우, 키트 내의 항원 성분은 계란 단백질(예컨대, 난알부민 및 난점질) 및 닭 DNA가 부재하여, 알러지항원성을 감소시키는 것이 유리하다.

바이러스가 세포주 및 성장용 배지 상에서 성장하는 경우, 배양 개시시 사용된 바이러스 접종물이 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus), 호흡기세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자 바이러스 3(parainfluenza virus 3), SARS 코로나바이러스(SARS coronavirus), 아데노바이러스(adenovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 레오바이러스(reovirus), 폴리오마바이러스(폴리mavirus), 비르나바이러스(birnavirus), 시르코바이러스(circovirus), 및/또는 파르보바이러스(parvovirus)가 부재(즉, 시험되어, 오염에 음성인)한 것이 바람직하다[46]. 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus)의 부재가 특히 바람직하다.

세포주의 성장에 있어서, 예컨대 MDCK 세포의 경우, 바이러스는 현탁액 [47-49] 또는 유착 배양물의 세포에서 성장할 수 있다. 현탁액 배양을 위한 적합한 MDCK 세포주의 하나는 MDCK 33016(DSM ACC 2219로 기탁)이다. 대안으로서, 마이크로담체 배양물이 사용될 수 있다.

인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 세포주는 무혈청 배양 배지 및/또는 무단백질 배지에서 성장하는 것이 바람직하다. 배지는 본원에서 무혈청 배지라는 의미로 사용되며, 인간 또는 동물 기원의 혈청에 첨가제를 부가하지 않은 것이다. 무단백질은 세포를 조작하여 단백질, 성장 인자, 기타 단백질 첨가제 및 비혈청 단백질의 배제로 발생하며, 선택적으로 단백질 예컨대 바이러스 성장에 필수적인 트립신 또는 기타 단백질분해효소를 포함할 수 있는 배양을 의미한다. 이러한 배양액 내에서의 세포 성장에 의하여 자연적으로 자신들의 단백질을 보유하게 된다.

인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 세포주는 바이러스 복제시 37℃ 이하[50], 예컨대, 30-36℃에서 성장하는 것이 바람직하다.

배양된 세포 내의 바이러스 증식 방법은 일반적으로 배양된 세포를 배양된 균주로 접종하는 단계, 예를 들어 바이러스 티터 또는 항원 발현에 의하여 측정하여 (예컨대 접종 후 24 내지 168 시간) 바이러스 증식을 위한 소망하는 시간 동안 감염된 세포를 수확하는 단계, 및 증식된 바이러스를 수거하는 단계를 포함한다. 배양된 세포는 바이러스(PFU 또는 TCID₅₀로 측정)로, 세포비가 1:500 내지 1:1, 바람직하게는 1:100 내지 1:5, 더 바람직하게는 1:50 내지 1:10이 되도록 접종할 수 있다. 바이러스 세포의 현탁액에 첨가되거나 또는 세포의 단일층에 도포될 수 있으며, 바이러스는 세포에 최소한 60 분간 흡수되나 일반적으로 300 분 이하, 바람직하게는 90 내지 240 분으로, 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 28℃ 내지 37℃이다. 감염된 세포 배양물(예컨대 단일층)은 냉동-해동법 또는 수확된 배양 상청액의 바이러스 함량을 증가시키는 효소 반응 등에 의하여 제거될 수 있다. 수확된 유체를 불활성 또는 냉동 저장한다. 배양된 세포는 감염다중도("m.o.i.")가 약 0.0001 내지 10, 바람직하게는 0.002 내지 5, 더 바람직하게는 0.001 내지 2로 감염될 수 있다. 더욱더 바람직하게는, 세포는 m.o.i가 약 0.01로 감염된다. 감염된 세포는 감염 후 30 내지 60 시간 후 수확된다. 바람직하게는, 세포는 감염 후 34 내지 48 시간 후 수확된다. 더욱더 바람직하게는, 세포는 감염 후 38 내지 40 시간 후 수확된다. 단백질분해효소(일반적으로 트립신)는 일반적으로 세포 배양 중에 첨가되어 바이러스 방출이 되도록 하며, 단백질분해효소는 배양 중 모든 적합한 단계에서 첨가될 수 있다.

적혈구응집소(HA)는 현재의 불활성 인플루엔자 백신 내의 주 면역원이며, 백신 투약량은 일반적으로 단일 투여 면역확산 SRID에 의하여 측정된 HA 수준으로 표준화되었다. 현존하는 백신은 일반적으로 약 15㎍의 HA를 균주당 함유하나, 예컨대 아동용으로, 또는 유행성인 경우, 또는 보조제를 사용하는 경우에는 적은 투약량으로 사용될 수도 있다. 분할 투약량 예컨대 1/2 (즉, 7.5 ㎍ HA/ 균주), 1/4 및 1/8가 고복용량(예컨대 3x 또는 9x 투약량[53,54])으로 사용될 수 있다[51,52]. 따라서 백신은 0.1 내지 150 ㎍의 HA/인플루엔자 균주, 바람직하게는 0.1 내지 50 ㎍, 예컨대 0.1-20 ㎍, 0.1-15 ㎍, 0.1-10 ㎍, 0.1-7.5 ㎍, 0.5-5 ㎍, 등을 포함할 수 있다. 특정 투약량은 예컨대 균주 당 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 1.9, 약 1.5, 등을 포함한다. 본 발명에서 보조제가 백신에 존재하는 경우 이러한 낮은 투약량이 가장 유용하다.

생백신의 경우, 투약량은 HA 함량보다는 정중 조직 배양 감염성 투약량(TCID₅₀)에 의하여 측정되며, TCID₅₀가 균주당 10⁶ 내지 10⁸ (바람직하게는 10^6.5-10^7.5)인 것이 일반적이다.

본 발명에 사용되는 HA는 바이러스에서 발견되는 천연 HA일 수 있으며, 또는 변형될 수 있다. 예를 들면, HA는 결정기(예컨대, HA1 및 HA2의 분할 부위 부근의 과염기성 영역)을 제거하여 바이러스가 조류 종에서 고병원성이 되도록 변형된다고 알려져 있으며, 이는 이러한 결정기가 난(egg) 내에서 성장된 바이러스를 예방할 수 있기 때문이다.

본 발명의 조성물은 특히 분할 또는 표면 항원 백신에 대하여 세척제, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제('트윈'으로 알려짐), 옥트옥시놀(예컨대 옥트옥시놀-9 (트리톤 X-100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드('CTAB'), 또는 나트륨 데옥시콜레이트를 포함할 수 있다. 세척제는 단지 소량으로 존재하게 된다. 따라서, 백신은 1 ㎎/㎖ 이하의 옥트옥시놀-10, α-토코페릴 하이드로겐 석시네이트 및 폴리소르베이트 80를 각각 포함할 수 있다. 소량의 기타 잔여 성분은 항생제(예컨대, 네오마이신, 카나마이신, 폴리마이신 B)일 수 있다.

불활성화되었으나 비-전 세포 백신(예컨대, 분할 바이러스 백신 또는 정제된 표면 항원 백신)은 기질 단백질을 포함할 수 있으며, 이는 이 항원 내에 위치하는 추가적인 T 세포 에피토프로부터 이익을 얻기 때문이다. 따라서 적혈구응집소 및 뉴라미니다아제를 포함하는 비-전 세포 백신(특히 분할 백신)은 추가적으로 M1 및/또는 M2 기질 단백질 또는 이들의 절편(들)을 포함할 수 있다. 기질 단백질이 존재하는 경우, 검출가능한 수준의 M1 기질 단백질이 포함되는 것이 바람직하다. 핵단백질이 포함될 수도 있다.

숙주 세포 DNA

바이러스가 세포주 상에서 성장하는 경우 이는 DNA의 어떠한 발암 활성을 최소화하기 위하여 최종 백신 내의 잔여 세포주 DNA의 양을 최소화하는 표준 방법이다. 따라서, 바이러스가 세포주 상에서 성장한 경우, 조성물은 극소량의 숙주 세포 DNA가 존재하더라도 투여당 10 ng 이하 (바람직하게는 1 ng 이하, 및 더 바람직하게는 100 pg 이하)의 잔여 숙주 세포 DNA를 함유하는 것이 바람직하다. 모든 잔여 숙주 세포 DNA의 평균 길이는 500bp 이하 예컨대, 400bp 이하, 300bp 이하, 200bp 이하, 100bp 이하 등 인 것이 바람직하다. 일반적으로, 본 발명의 조성물로부터 배제되기에 바람직한 숙주 세포 DNA는 100bp 이상의 DNA이다.

잔기 숙주 세포 DNA의 측정은 생물학에 있어서 현재 일상적인 것이며, 당해 기술 분야의 숙련자의 능력의 범위에 있다. DNA 측정에 사용되는 측정법은 일반적으로 허가된 분석법이다[55,56]. 입증된 측정법의 성능 특성은 수학적 및 정량적인 용어로 설명될 수 있으며, 이들의 에러(error)의 가능한 공급원은 이미 알려져 있다. 측정법은 일반적으로 예컨대 정확성, 정밀도, 특이성의 특성에 대하여 시험되었다. 측정이 비교되는 경우(예컨대 숙주 세포 DNA의 알려진 표준량과 비교) 및 시험되는 경우, 그 다음으로 정량적 DNA 측정을 통상적으로 수행할 수 있다. DNA 정량을 위한 3종의 기본 기법이 사용될 수 있다: 혼성화 방법, 예컨대 서던 블롯 또는 슬롯 블롯[57]; 면역분석 방법, 예컨대 Threshold™ 시스템[58]; 및 정량적 PCR[59]. 이러한 방법들은 당해 기술 분야의 숙련자에게 익숙한 것이나, 각 방법의 정확한 특성은 숙주 세포 예컨대 혼성화용 프로브의 선택, 증폭을 위한 프라이머 및/또는 프로브의 선택, 등의 문제에 달려있다. Molecular Devices사의 Threshold™ 시스템은 총 DNA의 피코그램 수준의 정량적 측정법이며, 생약학적 물질 내의 DNA 오염 수준을 모니터링하기 위하여 사용되어 왔다[58]. 일반적인 측정법은 바이오틴화 ssDNA 결합 단백질, 우레아제-접합 항-ssDNA 항체, 및 DNA 간의 복합 반응의 비-서열-특이적 형성에 관련되어 있다. 모든 측정 성분은 제조자로부터 구입가능한 완전한 총 DNA 분석 키트 내에 포함되어 있다. 다양한 상업적 제조사들이 잔기 숙주 세포 DNA를 검출하기 위한 정량적 PCR 측정법을 제공한다. 예컨대 AppTec™ Laboratory Services, BioReliance™, Althea Technologies, 등. 인간 바이러스 백신의 숙주 세포 DNA 오염을 측정하기 위한 화학발광 혼성화 측정법 및 총 DNA Threshold™ 시스템의 비교는 참고자료 60에서 찾을 수 있다.

DNA 오염은 표준 정제 절차 예컨대, 크로마토그래피, 등을 사용하여 백신 제조 중에 제거될 수 있다. 잔여 숙주 세포 DNA의 제거는 뉴클레아제 처리 예컨대, DNase에 의하여 증진될 수 있다. 잔여 숙주 세포 DNA의 제거의 편리한 방법은 참고자료 61 및 62에 개시되어 있으며, 이들은 2 단계 처리에 관한 것으로서, 우선 바이러스 성장시 DNase(예컨대, 벤조나아제)를 사용하고, 그 다음 비리온의 파괴시 양이온 세척제(예컨대 CTAB)를 사용한다. 알킬화제, 예컨대 β-프로피오락톤 처리는 숙주 세포 DNA를 제거하기 위하여 사용될 수 있으며, 비리온을 불활성화하기 위하여 사용하는 것이 유리하다[63].

15㎍의 적혈구응집소당 10 ng 이하(예컨대 이하, 1ng 이하, 100pg 이하)의 숙주 세포 DNA를 함유한 백신이 바람직하며, 2.25 ㎖ 부피당 10ng 이하(예컨대 이하, 1 ng 이하, 100 pg 이하) 숙주 세포 DNA를 함유한 백신이다. 50 ㎍의 적혈구응집소당 10 ng 이하(예컨대 1 ng 이하, 100 pg 이하)의 숙주 세포 DNA를 함유한 백신이 바람직하며, 0.5 ㎖ 부피당 10 ng 이하(예컨대 이하, 1 ng 이하, 100 pg 이하)의 숙주 세포 DNA를 함유한 백신이다.

보조제(들)

본 발명은 보조제형 백신의 초기 투여에 관한 것이다. 추가의 백신은 비보조제형이거나, 또는 초기 투여와는 다른 보조제에 의한 보조제형이 될 수 있다. 보조제(들)은 조성물을 투여받은 환자 내에서 유발된 면역 반응(체액성 및/또는 세포성)을 증진시키는 기능을 할 수 있다.

제1 백신에 사용하거나 선택적으로 추가 백신 투여(들)에 사용되기 적합한 보조제는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다:

● 미네랄-함유 조성물, 칼슘염 및 알루미늄염 (또는 이들의 혼합물)를 포함하한다. 칼슘염은 인산 칼슘(예컨대, 참고자료 64에 설명된 "CAP" 입자)를 포함한다. 알루미늄염은 적절한 모든 형태(예컨대, 겔, 결정, 무정형 등)를 띤 염을 지닌 수산화물, 포스페이트, 황산염 등을 포함한다. 이러한 염에 흡착이 바람직하다. 미네랄 함유 조성물은 금속염의 입자로서 제형화될 수 있다[65]. 알루미늄염 보조제를 아래에서 보다 상세하게 설명한다.

● 수중유 에멀젼, 아래에서 보다 상세하게 설명.

● 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 아래에서 보다 상세하게 설명.

● 3-0-데아실화 모노포스포릴 지질 A ('3dMPL' 또는 'MPL™'), 아래에서 보다 상세하게 설명.

● 이미다조퀴놀린 화합물, 예컨대 이미퀴모드("R-837") [66,67], 레시퀴모드("R-848") [68], 및 이들의 유사체; 및 이들의 염(예컨대, 염화수소염). 면역자극 이미다조퀴놀린의 상세는 참고자료 69 내지 73에서 찾을 수 있다.

● 티오세미카바존 화합물, 예컨대 참고자료 74에 설명되어 있다. 활성 화합물의 제형화, 제조 및 선별 방법도 참고자료 74에 설명되어 있다. 티오세미카바존은 사이토카인, 예컨대 TNF-α의 생산을 위하여 인간 말초 혈액 단핵 세포의 자극에 특히 효과적이다.

● 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대: (a) 이사토라빈(ANA-245; 7-티아-8-옥소구아노신):

및 이들의 전구약물; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) 참고자료 75 내지 77에 설명된 화합물; (f) 다음의 화학식을 가지는 화합물:

여기서:

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, 할로, -NR_aR_b, -OH, C_1-6 알콕시, 치환된 C_1-6 알콕시, 헤테로시클릴, 치환된 헤테로시클릴, C_6-10 아릴, 치환된 C_6-10 아릴, C_1-6 알킬, 또는 치환된 C_1-6 알킬이고;

R₃는 부재이거나, H, C_1-6 알킬, 치환된 C_1-6 알킬, C_6-10 아릴, 치환된 C_6-10 아릴, 헤테로시클릴, 또는 치환된 헤테로시클릴이고;

R₄ 및 R₅는 각각 독립적으로 H, 할로, 헤테로시클릴, 치환된 헤테로시클릴, -C(O)-R_d, C_1-6 알킬, 치환된 C_1-6 알킬, 또는 R4-5 내의 5원 고리를 형성하기 위하여 함께 결합되었고:

(결합은 ~~로 나타낸 부분에서 달성된다.)

X₁ 및 X₂는 각각 독립적으로 N, C, O, 또는 S이고;

R₈은 H, 할로, -OH, C_2-6 알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐, -OH, -NR_aR_b, -(CH₂)_n-O-R_c, -0-(C_1-6 알킬), -S(O)_pR₆, 또는 -C(O)-R_d이며;

R₉는 H, C_1-6 알킬, 치환된 C_1-6 알킬, 헤테로시클릴, 치환된 헤테로시클릴 또는 R_9a, 여기서 R_9a는:

(결합은 ~~로 나타낸 부분에서 달성된다.)

R₁₀ 및 R₁₁는 각각 독립적으로 H, 할로, C_1-6 알콕시, 치환된 C_1-6 알콕시, - NR_aR_b, 또는 -OH이고;

각각 R_a 및 R_b는 독립적으로 H, C_1-6 알킬, 치환된 C_1-6 알킬, -C(O)R_d, C_6-10 아릴이고;

각각 R_c는 독립적으로 H, 포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, C_1-6 알킬, 또는 치환된 C_1-6 알킬이고;

각각 R_d는 독립적으로 H, 할로, C_1-6 알킬, 치환된 C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, 치환된 C1-6 알콕시, -NH₂, -NH(C_1-6 알킬), -NH(치환된 C_1-6 알킬), -N(C_1-6 알킬)₂, -N(치환된 C_1-6 알킬)₂, C_6-10 아릴, 또는 헤테로시클릴이고;

각각 R_e는 독립적으로 H, C_1-6 알킬, 치환된 C_1-6 알킬, C_6-10 아릴, 치환된 C_6-10 아릴, 헤테로시클릴, 또는 치환된 헤테로시클릴이고;

각각 R_f는 독립적으로 H, C_1-6 알킬, 치환된 C_1-6 알킬, -C(O)R_d, 포스페이트, 디포스페이트, 또는 트리포스페이트이고;

각 n은 독립적으로 O, 1, 2, 또는 3이며;

각 p는 독립적으로 O, 1, 또는 2; 또는

또는 (g) (a) 내지 (f) 중의 약학적으로 허용가능한 염, (a) 내지 (f) 중의 토오토머, 또는 토오토머의 약학적으로 허용가능한 염.

● 트립탄트린 화합물, 참고자료 78에 설명되어 있다. 활성 화합물의 제형화, 제조 및 선별 방법도 참고자료 78에 설명되어 있다. 티오세미카바존은 사이토카인, 예컨대 TNF-α의 생산을 위하여 인간 말초 혈액 단핵 세포의 자극에 특히 효과적이다.

● 록소리빈 (7-알릴-8-옥소구아노신) [79].

● 참고자료 80 내에 개시된 화합물: 아실피페라진 화합물, 인돌디온 화합물, 테트라하이드라이소퀴놀린(THIQ) 화합물, 벤조시클로디온 화합물, 아미노아자비닐 화합물, 아미노벤즈이미다졸 퀴놀리논(ABIQ) 화합물[81,82], 하이드라프탈라마이드 화합물, 벤조페논 화합물, 이소옥사졸 화합물, 스테롤 화합물, 퀴나질리온 화합물, 파이롤 화합물[83], 안트라퀴논 화합물, 퀴녹살린 화합물, 트리아진 화합물, 피라잘로피리미딘 화합물, 및 벤즈아졸 화합물[84]을 포함한다.

● 참고자료 85 내에 개시된 화합물, 3,4-디(1H-인돌-3-일)-1H-파이롤-2,5-디온, 스타우로스포린 유사체, 유도된 피리다진, 크로멘-4-온, 인돌리논, 퀴나졸린, 및 뉴클리오사이드 유사체를 포함한다.

● 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트 유도체, 예컨대 RC-529[86,87].

● 포스파젠, 예컨대 참고자료 88 및 89에 설명된 폴리[디(카르복시라토페녹시)포스파젠] ("PCPP").

● 소분자 면역포텐시에이터(SMIPs) 예컨대:

N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2,N2-디메틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-에틸-N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N2-프로필-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

1-(2-메틸프로필)-N2-프로필-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-부틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-부틸-N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N2-펜틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N2-프로프-2-에닐-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

1-(2-메틸프로필)-2-[(페닐메틸)티오]-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민

1-(2-메틸프로필)-2-(프로필티오)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민

2-[[4-아미노-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-일](메틸)아미노]에탄올

2-[[4-아미노-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-일](메틸)아미노]에틸 아세테이트

4-아미노-1-(2-메틸프로필)-1,3-디하이드로-2H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-온

N2-부틸-1-(2-메틸프로필)-N4,N4-비스(페닐메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-부틸-N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N4,N4-비스(페닐메틸)-1H-이미다조[4,5- c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N4,N4-비스(페닐메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2,N2-디메틸-1-(2-메틸프로필)-N4,N4-비스(페닐메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

1-{4-아미노-2-[메틸(프로필)아미노]-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일}-2-메틸프로판-2-올

1-[4-아미노-2-(프로필아미노)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-2-메틸프로판-2-올

N4,N4-디벤질-1-(2-메톡시-2-메틸프로필)-N2-프로필-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민.

● 사포닌(참고자료 131의 22장)은 이종유래 그룹의 스테롤 글리코사이드 및 트리테르페노이드 글리코사이드로서 다양한 식물 종의 껍질, 잎, 줄기, 뿌리, 및 꽃에서 발견된다. 장미과 퀴라야(Quillaia saponaria Molina) 나무 수피의 사포닌은 보조제로서 많이 연구되어왔다. 사포닌은 시밀렉스 오르나타(Smilax ornata, sarsaprilla), 깁소필라 파니큘라타(Gypsophilla paniculata, brides veil), 및 소포나리아 오피시아날리스(Saponaria officianalis, soap root)로부터 구득할 수 있다. 사포닌 보조제 제형은 정제된 제형, 예컨대 QS21, 및 지질 제형, 예컨대 ISCOMs를 포함한다. QS21는 Stimulon™로 구득할 수 있다. 사포닌 조성물은 HPLC 및 RP-HPLC를 사용하여 정제되어 왔으며, 이러한 기법을 사용한 특이적 정제 분획이 확인되어왔고, QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B 및 QH-C를 포함한다. 바람직하게는, 사포닌은 QS21이다. QS21의 생산 방법은 참고자료 90에 설명되어 있다. 사포닌 제형은 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 포함할 수 있다[91]. 사포닌 및 콜레스테롤의 조합은 면역자극 복합체(ISCOMs)라고 하는 독특한 입자를 형성하기 위하여 사용될 수 있다[참고자료 131의 23장]. ISCOMs는 일반적으로 인지질, 예컨대 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린을 포함할 수 있다. 모든 공지의 사포닌이 ISCOMs에 사용될 수 있으며, ISCOM는 하나 이상의 QuilA, QHA & QHC를 포함한다. ISCOMs는 참고자료 91-93에 추가로 설명되어 있다. 선택적으로, ISCOMS는 추가의 세척제를 회피할 수 있다[94]. 사포닌계 보조제의 개발에 관한 연구는 참고자료 95 & 96에서 찾을 수 있다.

● 박테리아 ADP-라이보실화 독소(예컨대, E. 콜리 열불안정 엔테로톡신 "LT", 콜레라 독소 "CT", 또는 백일해 독소 "PT") 및 제독된 이들의 유도체, 예컨대 LT-K63 및 LT-R72로 알려진 돌연변이 독소[97]. 점막 보조제로서 제독된 ADP-라이보실화 독소의 사용은 참고자료 98에, 비경구용 보조제로서의 사용은 참고자료 99에 설명되어 있다.

● 생체접착제 및 점막접착제, 예컨대 에스테르화 히알루론산 미소구체[100] 또는 키토산 및 이의 유도체[101].

● 미소입자(즉, 직경이 ~100nm 내지 ~150㎛인 입자, 더 바람직하게는 직경이 ~200nm 내지 ~30um, 또는 직경이 ~500nm 내지 ~10㎛), 생분해성 및 무독성 물딜로 형성되며 (예컨대, 폴리(α-히드록시산), 폴리히드록시부티르산, 폴리오르소에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리카프로락톤, 등), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)가 바람직하다, 선택적으로 음성 전하 표면을 보유하도록(예컨대, SDS로) 처리하거나 또는 양성 전하를 보유하도록(예컨대, 양이온 세척제, 예컨대 CTAB) 처리된다.

● 리포좀(참고자료 131의 13 & 14장). 보조제에 적합한 리포좀 제형의 예는 참고자료 102-104에 설명되어 있다.

● 폴리옥시에틸렌 에테르 및 폴리옥시에틸렌 에스테르[105]. 이러한 제형은 옥트옥시놀과 조합한 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제[106] 및 최소한 하나의 부가적 비이온성 계면활성제 예컨대 옥트옥시놀과 조합한 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스테르 계면활성제[107]를 추가로 포함한다. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에테르는 다음의 군으로부터 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(laureth 9), 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시데일렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르, 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르.

● 무라밀 펩타이드, 예컨대 N-아세틸무라밀-1-트레오닐-D-이소글루타민("thr-MDP"), N-아세틸-노르무라밀-1-알라닐-D-이소글루타민(노르-MDP), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸무라밀-1-Al-D-이소글루-1-알라-디팔미톡시프로필아미드("DTP-DPP", 또는 "Theramide™), N-아세틸무라밀-1-알라닐-D-이소글루타미닐-1-알라닐-2-(1'-2'디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴록시)-에틸아민("MTP-PE").

● 제2 그람-음성 박테리아로부터 유도된 리포사카라이드(LPS) 제품과 조합하여 제1 그람-음성 박테리아로 제조된 외부막 단백질 프로테오좀 제품, 여기서 외부막 단백질 프로테오좀 및 LPS 제품은 안정적인 비공유 보조제 복합체를 형성한다. 이러한 복합체는 네이세라아 메닝기기티디스(Neisseria meningitidis) 외부막 및 LPS로 구성된 복합체인 "IVX-908"를 포함한다. 이들은 인플루엔자 백신의 보조제로 사용되어 왔다 [108].

● 폴리옥시도늄 고분자[109, 110] 또는 다른 N-산화 폴리에틸렌-피페라진 유도체.

● 메틸 이노신 5'-모노포스페이트("MIMP") [111].

● 폴리히드록실화 피롤리지딘 화합물 [112], 예컨대 다음의 화학식을 보유한다:

여기서 R은 수소, 직쇄 또는 가지형, 미치환된 또는 치환된, 포화된 또는 불포화된 아실, 알킬(예컨대, 시클로알킬), 알케닐, 알키닐 및 아릴기, 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 예는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 카수아린, 카수아린-6-α-D-글루코피라노스, 3-epi-카수아린, 7-epi-카수아린, 3,7-diepi-카수아린, 등.

● CD1d 리간드, 예컨대 α-글리코실세라미드[113-120] (예컨대, α-갈락토실세라미드), 피토스핀고신-함유 α-글리코실세라미드, OCH, KRN7000[(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-2-(N-헥사코사노일아미노)-1,3,4-옥타데카네트리올], CRONY-101, 3"-O-설포-갈락토실세라미드, 등.

● 감마 이눌린[121] 또는 이들의 유도체, 예컨대 알감뮬린.

● 화학식 I, II 또는 III의 화합물, 또는 이들의 염:

참고자료 122에서 정의한 바와 같이, 예컨대 ER 803058', 'ER 803732', ER 804053', ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 804764', ER 803022 또는 ER 804057' 예컨대,:

● 에셔리시아 콜리(Escherichia coli)의 지질 A의 유도체, 예컨대 OM-174 (참고자료 123 & 124).

● 양이온성 지질 및 (일반적으로 중성) 결합-지질의 제형, 예컨대 아미노프로필-디메틸-미리스톨릴옥시-프로판아미늄 브로마이드-디피타노일포스파티딜-에탄올아민("Vaxfectin™") 또는 아미노프로필-디메틸-비스-도데실옥시-프로판아미늄 브로마이드-디올레오일포스파티딜-에탄올아민("GAP-DLRIE: DOPE"). (±)-N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-비스(syn-9-테트라데세닐옥시)-1-프로판아미늄 염을 함유하는 제형이 바람직하다[125].

● 포스페이트-함유 아실 골격에 링크된 지질을 함유하는 화합물, 예컨대 TLR4 길항제 E5564 [126,127]:

이러한 및 다른 보조제-활성 물질은 참고자료 131 & 132에 더욱 상세하게 설명되어 있다.

본 발명에 사용되는 보조제(들)은 톨-유사 수용체(TLR)의 조절제 및/또는 작용제이다. 예를 들어, 이들은 하나 이상의 인간 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, 및/또는 TLR9 단백질의 작용제가 될 수 있다. 바람직한 약제는 TLR7(예컨대, 이미다조퀴놀린) 및/또는 TLR9(예컨대, CpG 올리고뉴클레오타이드)의 작용제이다. 이러한 약제는 선천성 면역 경로의 활성화에 유용하다.

단일 백신은 2 이상의 상기 보조제를 포함할 수 있다.

조성물 내의 항원 및 보조제는 일반적으로 혼합의 형태이다.

알루미늄 염 보조제

수산화 알루미늄 및 인산 알루미늄으로 알려진 보조제가 사용된다. 이러한 명칭은 통상적인 것이나, 편의를 위한 것일 뿐이며, 제공된 실제 화학적 화합물의 정확한 명세가 아니다[예컨대, 참고자료 131의 9장]. 본 발명은 일반적으로 보조제로 사용되는 모든 "수산화물" 또는 "인산염" 보조제를 사용할 수 있다.

"수산화 알루미늄"으로 알려진 보조제는 일반적으로 수산화 알루미늄(수산화 알루미늄) 염이며, 일반적으로 최소한 부분적으로 결정이다. 화학식 AlO(OH)로 나타내는 수산화 알루미늄은 알루미늄 화합물, 예컨대 수산화 알루미늄 Al(OH)₃과 적외선(IR) 스펙트럼조사에 의하여 구별되며, 특히 1070 cm^-1의 흡수 밴드 및 3090-3100 cm^-1에서의 강한 숄더(shoulder)의 존재에 의하여 구별된다[참고자료 131의 9장]. 수산화 알루미늄 보조제의 결정도는 작은 입자 크기에 기인하여 확장된 큰 선을 나타내는 불충분하게-결정화된 입자와 함께, 절반 높이에서의 회절 밴드의 폭(WHH)을 반영한다. 표면 영역은 WHH가 증가함에 따라 증가하며, WHH 값이 큰 보조제는 항원 흡착 능력이 크다는 것을 보여주었다. 섬유 형태학(예컨대, 투과 전자 현미경으로 관찰)은 수산화 알루미늄 보조제에 일반적이다. 수산화 알루미늄 보조제의 pI(파이)는 일반적으로 약 11이며, 즉 보조제 자체가 생리학적 pH에서 양성 표면 전하를 보유하게 된다. 수산화 알루미늄 보조제에 대하여 pH 7.4에서 1.8 내지 2.6 ㎎ 단백질/㎎ Al⁺⁺⁺의 흡착능이 보고되었다.

"인산 알루미늄"으로 알려진 보조제 일반적으로 수산화인산 알루미늄 염이며, 때로는 소량의 황산염(즉 수산화인산 알루미늄 황산염)을 함유한다. 이들은 침전에 의하여 획득할 수 있으며, 침전시의 반응 조건 및 농도는 염 내의 포스페이트과 히드록실기의 치환도에 영향을 미친다. 수산화인산은 일반적으로 PO₄/Al 몰비가 0.3 내지 1.2이다. 수산화인산은 히드록실기의 존재에 의하여 AlPO₄와 구별될 수 있다. 예를 들어, 3164cm^-1에서의 IR 스펙트럼 밴드(예컨대, 200℃로 가열시)는 구조적 히드록실기의 존재를 나타낸다[참고자료 131의 9장].

인산 알루미늄 보조제 PO₄/A1³⁺ 몰비는 일반적으로 0.3 내지 1.2이며, 바람직하게는 0.8 내지 1.2, 더 바람직하게는 0.95±0.1이다. 인산 알루미늄은 일반적으로 무정형이며, 특히 수산화포스페이트에서 그러하다. 일반적인 보조제는 무정형 수산화인산 알루미늄으로서 PO₄/A1 몰비가 0.84 내지 0.92이며, 0.6 ㎎의 Al³⁺/㎖를 포함한다. 인산 알루미늄은 일반적으로 입자화된다(예컨대, 투과 전자 현미경으로 관찰시 판-유사 형태). 일반적인 입자의 직경은 어떠한 항원 흡착 후 0.5 내지 20㎛ (예컨대, 약 5 내지 10㎛)이다. 인산 알루미늄 보조제는 pH 7.4에서 0.7 내지 1.5 ㎎ 단백질/㎎ Al⁺⁺⁺의 흡착능을 나타낸다고 보고되었다.

인산 알루미늄의 0 전하점(PZC)은 포스페이트과 히드록실기의 치환도에 강하게 연관되어 있으며, 이 치환도는 침전에 의한 염 제조시 사용되는 반응물의 반응 조건 및 농도에 의존하여 달라질 수 있다. PZC는 용액 내의 유리 인산 이온의 농도 변화시키거나(인산 증가 = 산성 PZC 증가) 또는 완충제 예컨대 히스티딘 완충제를 첨가(PZC를 더욱 염기성화)함으로서 변화된다. 본 발명에 사용된 인산 알루미늄은 일반적으로 PZC가 4.0 내지 7.0, 더 바람직하게는 5.0 내지 6.5 예컨대, 약 5.7이다.

본 발명 조성물의 제조에 사용된 알루미늄 염의 현탁액은 완충제(예컨대, 인산 또는 히스티딘 또는 트리스 완충제)를 포함하나, 항상 요구되는 것은 아니다. 현탁액은 바람직하게는 무균 및 무발열원이다. 현탁액은 유리 수성 인산 이온을 포함할 수 있으며 예컨대, 1.0 내지 2O mM, 바람직하게는 5 내지 15 mM, 및 더 바람직하게는 약 10 mM로 존재한다. 현탁액은 염화 나트륨을 포함할 수 있다.

본 발명은 보조제 성분은 수산화 알루미늄 및 인산 알루미늄의 혼합물을 포함한다. 이 경우 인산 알루미늄이 수산화기보다 더 함유되며, 예컨대, 중량비로 최소한 2:1 예컨대, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 이상, 등이다.

환자 투여용 조성물 내의 Al⁺⁺⁺의 농도는 바람직하게는 10㎎/㎖ 이하, 예컨대, 5 ㎎/㎖ 이하, 4 ㎎/㎖ 이하, 3 ㎎/㎖ 이하, 2 ㎎/㎖ 이하, 1 ㎎/㎖, 등이다. 바람직한 범위는 0.3 내지 1 ㎎/㎖이다. 최대 0.85㎎/투약량 이하가 바람직하다.

수중유 에멀젼 보조제

수중유 에멀젼은 인플루엔자 바이러스 백신의 보조제로 사용하기에 특히 적합하다고 알려져 있다. 다양한 이러한 에멀젼은 공지되어 있으며, 이들은 일반적으로 최소한 하나의 오일 및 최소한 하나의 계면활성제를 포함하고, 오일(들) 및 계면활성제(들)은 생분해성(대사가능)이며, 생체적합성이다. 에멀젼 내의 오일 액적은 일반적으로 직경이 5㎛ 이하이며, 서브-마이크론의 직경이 될 수도 있고, 이러한 작은 크기는 안정한 에멀젼을 제공하기 위하여 미소액체화기에 의하여 달성된다. 220nm 이하의 액적이 여과 멸균에 가할 수 있기 때문에 바람직하다.

본 발명은 오일 예컨대 동물성(예컨대 어류) 또는 식물성 공급원의 오일을 사용할 수 있다. 식물성 오일의 공급원은 너트, 종자 및 곡물을 포함한다. 땅콩 오일, 대두 오일, 코코넛 오일, 및 올리브 오일, 가장 일반적으로 사용되는 오일은 너트 오일이다. 호호바빈으로부터 얻은 호호바 오일이 사용될 수 있다. 종자 오일은 홍화 오일, 면화씨 오일, 해바라기씨 오일, 참깨씨 오일 등을 포함한다. 곡물군에 있어서, 옥수수 오일을 가장 쉽게 이용할 수 있으나, 다른 시리얼 곡식 예컨대 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프, 라이밀 등의 오일을 사용할 수 있다. 글리세롤 및 1,2-프로판디올의 6-10 탄소 지방산 에스테르는, 종자 오일에서 자연 발생하지는 않지만, 너트 및 종자 오일에서 개시되는 적절한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의하여 제조될 수 있다. 포유류 모유의 지방 및 오일이 대사가능하고 따라서, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 동물성 오일에서 순수 오일을 획득하기 위하여 필요한 분리, 정제, 사포닌화를 위한 절차 및 다른 수단이 공지되어 있다. 대부분의 어류는 쉽게 회수가능한 대사가능한 오일을 함유한다. 예를 들어, 대구 간 오일, 상어 간 오일, 및 고래 오일 예컨대 스퍼마세티는 본원에 사용할 수 있는 다수의 어류 오일이다. 다수의 가지쇄형 오일은 5-탄소 이소프렌 유닛으로 생화학적으로 합성할 수 있으며, 일반적으로 테르페노이드로 언급된다. 상어 간 오일은 스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔으로 알려진 가지형의, 불포화된 테르페노이드를 함유하며, 본원에서 이들이 특히 바람직하다. 스쿠알렌의 포화된 유사체인 스쿠알란이 선호되는 오일이다. 스쿠알렌 및 스쿠알란을 포함하는 어류 오일은 쉽게 구득할 수 있거나 또는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의하여 획득할 수 있다. 다른 바람직한 오일은 토코페롤(하기 참조)이다. 오일의 혼합물도 사용할 수 있다.

계면활성제는 이들의 'HLB'(친수/친지 비율)에 의하여 분류될 수 있다. 본 발명의 바람직한 계면활성제는 최소한 10, 바람직하게는 최소한 15, 및 더 바람직하게는 최소한 16의 HLB를 지닌다. 본 발명은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 계면활성제와 함께 사용될 수 있다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (일반명 Tween), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; 상품명 DOWFAX™로 판매되는 산화 에틸렌(EO), 산화프로필렌(PO), 및/또는 산화 부틸렌(BO)의 공중합체, 예컨대 선형 EO/PO 블럭 공중합체; 옥트옥시놀, 이의 에톡시(옥시-1,2-에탄디일)기 반복 회수는 다양하며, 옥트옥시놀-9(Triton X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)이 특히 대상이다; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올(IGEPAL CA-630/NP-40); 포스포리피드 예컨대 포스파티딜콜린(레시틴); 노닐페놀 에톡실레이트, 예컨대 Tergitol™ NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜(Brij 계면활성제), 예컨대 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르(Brij 30)로부터 유도된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르; 및 소르비탄 에스테르(SPAN), 예컨대 소르비탄 트리올레이트(Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트. 비이온성 계면활성제가 바람직하다. 에멀젼에 포함되는 바람직한 계면활성제는 Tween 80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트), Span 85(소르비탄 트리올레이트), 레시틴 및 Triton X-100이다.

계면활성제의 혼합물을 사용할 수 있으며, 예컨대, Tween 80/Span 85 혼합물이다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Tween 80) 및 옥트옥시놀 예컨대, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(Triton X-100)의 혼합물이 적합하다. 다른 유용한 조합은 laureth 9과 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥트옥시놀의 결합이다.

바람직한 계면활성제의 양(% 중량부)은: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 (예컨대 Tween 80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1 %; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예컨대 Triton X-100, 또는 Triton 시리즈의 다른 세척제) 0.001 내지 0.1 %, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르 예컨대, laureth 9) 0.1 내지 20 %, 바람직하게는 0.1 내지 10 % 및 특히 0.1 내지 1 % 또는 약 0.5% 이다.

본 발명에 유용한 특이적 수중유 에멀젼 항원보강제는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다:

● 스쿠알렌, 트윈 80, 및 스판 85의 서브마이크론 에멀젼. 부피부 에멀젼 조성물은 약 5% 스쿠알렌, 약 0.5% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% 스판 85가 될 수 있다. 중량의 면에서, 이러한 비율은 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% 스판 85이 된다. 이 항원보강제는 'MF59'로 알려져 있으며, 참고자료 131의 10장 및 12장에 보다 상세하게 설명되어 있다. MF59 에멀젼은 시트르산 이온, 예컨대 1OmM 나트륨 시트르산 완충제를 포함하는 것이 유리하다.

● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 트윈 80의 에멀젼. 이 에멀젼은 포스페이트 완충제 식염수를 포함할 수 있다. 또한 이는 스판 85 (예컨대 1%) 및/또는 레시틴을 포함할 수 있다. 이러한 에멀젼은 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% 트윈 80을 포함할 수 있으며, 중량 비율로 스쿠알렌:토코페롤은 더 안정적인 에멀젼을 제공하기 위하여 바람직하게는 1 이하이다. 스쿠알렌 및 트윈 80은 약 5:2의 부피비로 존재할 수 있다. 이러한 하나의 에멀젼은 트윈 80을 PBS에 용해시켜 2% 용액화하고, 그 다음 90 ml의 이 용액을 (5 g의 DL-α-토코페롤 및 5 ml의 스쿠알렌)의 혼합물과 혼합한 뒤, 혼합물을 극소액체화하여 제조할 수 있다. 결과 에멀젼은 예컨대 100 내지 250 nm, 바람직하게는 약 180 nm의 평균 직경의 서브마이크론 오일 액적을 보유하게된다.

● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 트리톤 세척제(예컨대, 트리톤 X-100)의 세척제. 이 에멀젼은 3d-MPL(하기 참조)를 포함할 수 있다. 에멀젼은 포스페이트 완충제를 포함할 수 있다.

● 폴리소르베이트 (예컨대, 폴리소르베이트 80), 트리톤 세척제 (예컨대, 트리톤 X-100) 및 토코페롤 (예컨대, α-토코페롤 숙신산염)을 포함하는 에멀젼. 이 에멀젼은 이러한 세 성분은 약 75:11:10 (예컨대 750 ㎍/㎖ 폴리소르베이트 80, 110 ㎍/㎖ 트리톤 X-100 및 100 ㎍/㎖ α-토코페롤 숙신산염)의 질량비로 포함될 수 있으며, 이러한 농도는 항원의 이러한 성분의 모든 부담분을 포함하여야한다. 에멀젼은 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 에멀젼은 또한 3d-MPL(하기 참조)를 포함할 수 있다. 수성상은 포스페이트 완충제를 포함할 수 있다.

● 스쿠알란, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401의 에멀젼("Pluronic™ L121"). 이 에멀젼은 포스페이트 완충 식염수(pH 7.4)로 제형화될 수 있다. 이 에멀젼은 무라밀 디펩타이드의 유용한 전달 운반체이며, 트레오닐-MDP의 "SAF-I" 보조제 용액으로 사용된다[133] (0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알란, 2.5% 플루로닉 L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 이는 "AF" 보조제로서 Thr-MDP 없이 사용될 수 있다[134] (5% 스쿠알란, 1.25% 플루로닉 L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 미소액체화가 바람직하다.

● 스쿠알렌, 수성 용액, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수 비이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제 (예컨대, 소르비탄 에스테르 또는 만나이드 에스테르, 예컨대 소르비탄 모놀레이트 또는 'Span 80')을 포함하는 에멀젼. 이 에멀젼은 바람직하게는 열가역성이며 및/또는 200 nm 이하의 크기를 지닌 최소한 90%의 오일 액적(부피부)을 보유한다[135]. 이 에멀젼은 하나 이상의: 알디톨; 항냉동제(예컨대, 당, 예컨대 도데실말토사이드 및/또는 슈크로스); 및/또는 알킬폴리글리코사이드를 포함한다. 이러한 에멀젼은 동결건조된다.

● 0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 포스포리피드, 및 0.05-5%의 비이온성 계면활성제를 지닌 에멀젼. 참고자료 136에 설명한 바와 같이, 바람직한 포스포리피드 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파타이드산, 스핑고미엘린 및 카디올리핀이다. 서브마이크론 액적 크기가 바람직하다.

● 대사불능 오일 (예컨대 경량 미네랄 오일) 및 최소한 하나의 계면활성제 (예컨대 레시틴, Tween 80 또는 Span 80)의 서브마이크론 수중유 에멀젼. 첨가제는, 예컨대 QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-리포파일 접합체(예컨대 GPI-0100, 참고자료 137, 글루크론산의 카르복실기를 통하여 데사실사포닌에 지방성 아민을 첨가하여 생산), 디메티이디오옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스(2-히드록시에틸)프로판디아민를 포함할 수 있다.

● 사포닌(예컨대, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤(예컨대, 콜레스테롤)이 나선 마이셀로 결합된 에멀젼[138].

● 미네랄 오일, 비이온성 친지성 에톡시화 지방 알콜, 및 비이온성 친수성 계면활성제(예컨대, 에톡시화 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌- 폴리옥시프로필렌 블럭 공중합체)를 포함하는 에멀젼[139].

● 미네랄 오일, 비이온성 친수성 에톡시화 지방알콜, 및 비이온성 친지성 계면활성제(예컨대, 에톡시화 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌- 폴리옥시프로필렌 블럭 공중합체)를 포함하는 에멀젼[139].

에멀젼은 전달시 즉석에서 항원과 결합될 수 있다. 따라서 보조제 및 항원은 사용시 최종 제형화되기 쉽도록 포장되거나 또는 분배된 백신 내에서 별도로 보관될 수 있다. 항원은 일반적으로 수성형태가 될 수 있으며, 따라서 백신은 두 액체를 혼합함으로써 최종적으로 제조될 수 있다. 혼합되는 두 액체의 부피비는 달라질 수 있으나(예컨대, 5:1 내지 1:5 사이), 일반적으로 약 1:1이다.

항원 및 보조제가 혼합된 후, 혈구응집소 항원은 일반적으로 수성 용액에 존재하나, 오일/물 경계상에 자체적으로 분포될 수 있다. 일반적으로, 혈구응집소는 에멀젼의 오일상에 진입하지 않는다.

조성물이 α, β, γ, δ, ε 또는 ξ 토코페롤 중의 하나가 포함되는 경우, 그러나 α-토코페롤이 바람직하다. 토코페롤은 여러 형태 예컨대, 다른 염 및/또는 이성질체를 취할 수 있다. 염은 유기염, 예컨대 석시네이트, 아세테이트, 니코티네이트, 등을 포함한다. D-α-토코페롤 및 DL-α-토코페롤을 모두 사용할 수 있다. 토코페롤은 고령 환자(예컨대, 60세 이상)용 백신에 포함되는 것이 바람직하며, 이는 비타민 E가 이러한 환자 그룹에 긍정적인 영향을 미치기 때문이다[140]. 이들은 에멀젼을 안정화시킬 수 있는 항산화 특성을 보유할 수 있다[141]. 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이며, 및 이 토코페롤의 바람직한 염은 석시네이트이다. 석시네이트 염은 TNF-유관 리간드와 생체 내에서 결합된다고 알려져 있다. 더욱이, α-토코페롤 석시네이트는 인플루엔자 백신과 호환할 수 있다고 알려져 있으며, 수은성 화합물의 대체물로서 유용한 보존제가 된다[10].

면역자극 올리고뉴클레오타이드

면역자극 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 변환/유사체 예컨대 포스포로티에이트 변환을 포함할 수 있으며, 이중-가닥 또는 (RNA 제외) 단일-가닥이 될 수 있다. 참고자료 142, 143 및 144는 가능한 아날로그 치환 예컨대, 구아노신과 2'-데옥시-7-데아자구아노신의 치환을 개시하였다. CpG 올리고뉴클레오타이드의 보조제 효과는 참고자료 145-150에 설명되어 있다. CpG 서열은 TLR9, 예컨대 모티프 GTCGTT 또는 TTCGTT에 결합한다[151]. CpG 서열은 Th1 면역 반응, 예컨대 CpG-A ODN (올리고데옥시뉴클레오타이드)를 유도하는 것에 특화되어 있거나, 또는 B 세포 반응, 예컨대 CpG-B ODN를 유도하는 것에 특화되어 있다. CpG-A 및 CpG-B ODN는 참고자료 152-154에 설명되어 있다. 바람직하게는, CpG는 CpG-A ODN이다. 바람직하게는, CpG 올리고뉴클레오타이드가 구축되어 5' 말단이 수용체 인식을 위하여 접근가능하게 된다. 선택적으로, 두 CpG 올리고뉴클레오타이드 서열은 3' 말단에 부착되어 "이뮤노머"를 형성하게 된다. 예를 들어, 참고자료 151 & 155-157를 참고한다. 유용한 CpG 보조제는 CpG7909이며, ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.)로 공지되어 있다.

대안으로써, 또는 추가적으로, CpG 서열을 사용하기 위하여, TpG 서열이 사용될 수 있다[158]. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 비메틸화 CpG 모티프가 부재할 수 있다.

면역자극 올리고뉴클레오타이드는 피리미딘-강화가 될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 연속적인 티미딘 뉴클레오타이드(예컨대, TTTT, 참고자료 158)를 포함할 수 있으며, 및/또는 25% 이상의 티미딘 (예컨대, 35% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 80% 이상, 등)을 지닌 뉴클레오타이드 조성물을 보유할 수 있다. 예를 들어, 이는 하나 이상의 연속적인 사이토신 뉴클레오타이드(예컨대, CCCC, 참고자료 158)를 포함할 수 있으며, 및/또는 25% 이상의 사이토신(예컨대, 35% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 80% 이상, 등)을 지닌 뉴클레오타이드 조성물을 보유할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 비메틸화 CpG 모티프가 부재할 수 있다.

면역자극 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 최소한 20 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이들은 100 뉴클레오타이드 이하로 구성되어 있다.

3 데-O-아실화 모노포스포릴 리피드 A

3dMPL( 3 데-O-아실화 모노포스포릴 리피드 A 또는 3-O-데사실-4'-모노포스포릴 리피드 A)는 모노포스포릴 리피드 A 내의 환원 말단 글루코사민의 3 위치가 데-아실화된 보조제이다. 3dMPL는 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota)의 무헵토스(heptoseless) 돌연변이로부터 제조되었으며, 지질 A와 화학적으로 유사하나, 산-불안정성 포스포릴기 및 염기-불안정성 아실기가 결핍되어 있다. 이는 단핵구/대식세포 계통의 세포를 활성화하고, IL-1, IL-12, TNF-α 및 GM-CSF를 포함하는 수종의 사이토카인의 방출을 자극한다(참고자료 159). 3dMPL의 제조는 참고자료 160에 설명되어 있다.

3dMPL는 이들의 아실화(예컨대, 다른 길이가 될 수 있는 3, 4, 5 또는 6 아실 사슬을 보유)에 의하여 달라지는 유관 분자의 혼합의 형태를 취할 수 있다. 두 글루코사민(2-데옥시-2-아미노-글루코스) 모노사카라이드는 이들의 2-위치 탄소(즉, 2 및 2' 위치)에서 N-아실화되었으며, 3' 위치에서 또한 O-아실화되었다. 탄소 2에 부착되는 기는 화학식 -NH-CO-CH₂-CR¹R1^1'이다. 탄소 2'에 부착되는 기는 화학식 -NH-CO-CH₂-CR²R^2'이다. 탄소 3'에 부착되는 기는 화학식 -0-CO-CH₂-CR³R^3'이다. 대표적인 구조는 다음과 같다:

R¹, R² 및 R³ 기는 각각 독립적으로 -(CH₂)_n-CH₃이다. n 값은 바람직하게는 8 내지 16, 더 바람직하게는 9 내지 12, 및 가장 바람직하게는 10이다.

R^1', R^2' 및 R^3' 기는 각각 독립적으로: (a) -H; (b) -OH; 또는 (c) -O-CO-R⁴이며, 여기서 R⁴는 -H 또는 -(CH₂)_m-CH₃이고, 여기서, m 값은 바람직하게는 8 내지 16, 더 바람직하게는 10, 12 또는 14이다. 2 위치에서, m은 바람직하게는 14이다. 2' 위치에서, m은 바람직하게는 10이다. 3' 위치에서, m은 바람직하게는 12이다. R^1', R^2' 및 R^3' 기는 따라서 바람직하게는 도데칸산, 테트라데칸산 또는 헥사데칸산의 -O-아실기이다.

모든 R^1', R^2' 및 R^3' 이 -H인 경우, 3dMPL는 3 아실 사슬 만을 보유한다(각 위치 2, 2' 및 3'의 하나). R^1', R^2' 및 R^3' 중의 두 개만이 -H인 경우, 3dMPL는 4 아실 사슬을 보유할 수 있다. R^1', R^2' 및 R^3' 중의 하나만이 -H인 경우, 3dMPL는 5 아실 사슬을 보유할 수 있다. R^1', R^2' 및 R^3' 중의 어느 하나도 -H가 아닌 경우, 3dMPL는 6 아실 사슬을 보유할 수 있다. 본 발명에 사용되는 3dMPL 보조제는 3 내지 6 아실 사슬의 형태의 혼합물이 될 수 있으나, 헥사아실 사슬이 총 3dMPL의 최소한 10% 중량부, 예컨대, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상 또는 그 이상을 차지하도록 하기 위하여 혼합물 내에 6 아실 사슬의 3dMPL를 포함하는 것이 바람직하다. 6 아실 사슬의 3dMPL는 가장 보조제-활성 형태인 것으로 알려져 있다.

따라서 본 발명의 조성물이 포함되기 위한 3dMPL의 가장 바람직한 형태는 다음과 같다:

3dMPL가 혼합물의 형태로 사용되는 경우, 본 발명의 조성물 내의 3dMPL 양 또는 농도의 기준은 혼합물 내에 조합된 3dMPL 종이다.

수성 상태에서, 3dMPL는 예컨대, 직경이 150nm 이하 또는 500nm 이상의 다른 크기의 마이셀 응집체 또는 입자를 형성할 수 있다. 이들 각각 또는 모두는 본 발명에 사용될 수 있으며, 보다 나은 입자를 통상의 분석법에 의하여 선택할 수 있다. 작은 입자(예컨대, 3dMPL의 투명한 수성 현탁액을 생성할 정도로 작은 입자)가 우월한 활성에 기인하여 본발명에 사용되는 것이 바람직하다[161]. 바람직한 입자는 220nm 이하, 더 바람직하게는 200nm 이하 또는 150nm 이하 또는 120nm 이하의 직경을 보유할 수 있으며, 평균 직경이 100nm 이하가 될 수 있다. 대부분의 경우, 그러나, 평균 직경은 50nm 이하가 되지 않는다. 이러한 입자는 여과 멸균에 적합할 정도로 작다. 입경은 입경을 측정하는 동적 광산란의 통상의 기법에 의하여 사정될 수 잇다. 여기서 입자는 x nm의 직경으로 표시될 수 있으며, 일반적으로 평균적인 입자의 분포가 있으며, 입자 숫자의 최소한 50%(예컨대, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 그 이상)는 x+25%의 범위 내에 존재한다.

3dMPL는 수중유 에멀젼과 조합하여 사용되는 것이 바람직하다. 실질적으로 모든 3dMPL는 에멀젼의 수성상에 위치할 수 있다.

3dMPL는 그 자체로 또는 하나 이상의 추가의 화합물과 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 3dMPL이 QS21 사포닌과 조합하여 사용된다는 것이 알려져 있으며[162](수중유 에멀젼 내에 포함[163]), 면역자극 올리고뉴클레오타이드와 함께, QS21 및 면역자극 올리고뉴클레오타이드 둘 모두와 함께, 알루미늄 포스페이트와 함께[164], 수산화 알루미늄과 함께[165], 또는 인산 알루미늄 및 수산화 알루미늄과 함께 사용되는 것이 알려져 있다.

바람직한 보조제 요법

본 발명의 투여 요법은 보조제형 인플루엔자 백신의 최초 투여에 관련된 것이다. 최초 백신에 사용되기 바람직한 보조제는 수중유 에멀젼이다.

2회-투여 요법의 2회 투여는 바람직하게는 비보조제형이다. 대안으로써, 제1 투약량과는 다른 보조제로 보조제형이 될 수 있다. 제1 투약량이 수중유 에멀젼 보조제형인 경우, 제2 투약량에 바람직한 보조제는 알루미늄염을 포함한다.

약학적 조성물

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능하며, 일반적으로 수성형태이다. 이들은 항원(적용가능한 경우 보조제) 성분을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 최종 혼합물은 일반적으로 하나 이상의 약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함한다. 이러한 성분에 대한 철저한 논의는 참고자료 166에서 찾을 수 있다.

조성물은 하나 이상의 보존제, 예컨대 티오메살 또는 2-페녹시에탄올을 포함할 수 있다. 바람직한 것은, 그러나, 백신에 실질적으로 수은성 물질이 부재(즉 5㎍/㎖ 이하), 예컨대 무-티오메살이어야 한다[10, 167]. 수은을 함유하지 않은 백신이 더 바람직하다. 무-보존제 백신이 특히 바람직하다.

등장성을 조절하기 위하여 생리학적 염을 포함하는 것이 바람직하다, 예컨대 등장성을 조절하기 위한 나트륨염이다. 염화 나트륨(NaCl)이 바람직하며, 1 내지 20 ㎎/㎖ 사이에 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 기타 염은 염화 칼륨, 인산 2수소 칼륨, 디나트륨 인산염 디하이드레이트, 염화 마그네슘, 염화 칼슘, 등을 포함한다.

조성물은 일반적으로 삼투압이 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240-360 mOsm/kg이며, 더 바람직하게는 290-310 mOsm/kg의 범위에 있다. 삼투압은 예방접종에 의하여 야기된 통증에 대한 영향이 이전에 보고된 바 없다[168], 그럼에도 이 범위의 삼투압을 유지하는 것이 바람직하다.

조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 일반적인 완충제는: 인산염 완충제; 트리스 완충제; 붕산염 완충제; 숙신산염 완충제; 히스티딘 완충제; 또는 시트르산 완충제를 포한다. 완충제는 일반적으로 5-2O mM의 범위로 포함된다.

조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 더 일반적으로 6.0 및 8.0 예컨대 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8이다. 본 발명의 방법은 따라서 포장 전에 충전 백신의 pH를 조절하는 단계를 포함한다.

조성물은 바람직하게는 무균이다. 조성물은 바람직하게는 비-발열원성으로서, 예컨대 1 EU(내부독소 유닛, 표준 측정)/복용량 이하, 바람직하게는 0.1 EU/복용량 이하를 함유한다. 조성물은 바람직하게는 무 글루텐이다.

조성물은 단일 예방접종용 물질을 포함할 수도 있으며, 수회 예방접종용 물질을 포함할 수도 있다(즉 '수회복용' 키트). 보존제의 함유는 수회복용 준비에 유용하다. 수회복용 조성물 내의 보존제 함유의 대안(또는 이와 함께)으로서, 조성물은 물질 제거용 무균 어댑터를 보유한 용기에 함유될 수 있다.

인플루엔자 백신은 약 0.5ml의 투약 부피로 투여되는 것이 일반적이며, 아동(36 개월까지)을 위하여반절 투약량(즉, 약 0.25ml)로 투여할 수 있다.

조성물 및 키트는 바람직하게는 2℃ 내지 8℃ 사이에서 보관된다. 이들은 냉동되어서는 아니된다. 이들은 직사광선을 피하는 것이 바람직하다.

본 발명의 키트

본 발명은 제1 및 추가의 인플루엔자 백신의 키트를 포함한다. 하나의 키트 성분은 제1 보조제형 백신이 되며, 및 다른 키트 성분은 추가의 백신이 될 수 있으며, 선택적으로 보조제형이다. 두 성분은 실질적으로 다른 시점에서 환자에 투여될 때까지 별도로 보관될 수 있다.

키트 내의 각각의 백신은 즉시 사용할 수 있거나, 또는 전달시 즉석 제조될 수 있다. 이 즉석 배치는 사용시까지 보조제 및 항원을 별도로 보관하게 되며, 이는 수중유 에멀젼 보조제를 사용하는 경우 특히 유용하다.

백신이 즉석에서 제조되는 경우, 이들의 성분은 키트 내에서 물리적으로 분리될 수 있으며, 이 분리는 다양한 방법에 의하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 두 성분은 두개의 별개 용기, 예컨대 바이알에 넣을 수 있다. 두 바이알의 성분은 예컨대, 하나의 바이알의 성분을 제거하고 이들을 다른 성분을 첨가함으로써, 또는 두 성분 모두의 성분을 별도로 제거하고 제3의 용기에서 이들을 혼합함으로써 혼합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 키트 성분 중의 하나는 주사기 내에, 다른 성분은 용기 예컨대 바이알에 존재할 수 있다. 사전-충전 주사기가 사용되어(예컨대, 바늘 포함) 혼합을 위하여 제2의 용기로 성분을 주입하게 되며, 그 뒤 혼합물은 주사기로 회수될 수도 있다. 주사기의 혼합 성분은 이후 환자에 투여될 수 있으며, 일반적으로 멸균 바늘을 사용한다. 사전-충전 주사기에 일 성분을 포장함으로써 환자 투여용 별도의 주사기가 필요하지 않게 된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시 태양에서, 두 키트 성분은 동일 주사기 내에서 별도로 보유될 수 있다. 예컨대, 이중-격실 주사기이며, 예컨대 이들은 참고자료 169-176 등에 상세하게 설명되어 있다. 주사기를 작동시키는 경우(예컨대, 환자 투여시) 두 격실의 성분이 혼합된다. 이러한 배열은 사용시 별도의 혼합 단계를 회피하게 된다.

백신이 즉석에서 제조되는 경우, 두 격실의 성분은 일반적으로 둘 다 수성 형태이다. 본 발명의 일 실시상태에서, 일 성분(일반적으로 보조제 성분보다는 항원 성분)은 건조 형태(예컨대, 동결건조형)이며, 다른 성분은 수성 형태이다. 두 성분은 건조 성분을 활성화시키기 위하여 혼합될 수 있으며, 환자 투여를 위하여 수성 조성물이 주어질 수 있다. 동결건조 성분은 일반적으로 주사기보다는 바이알 내에 위치된다. 건조 성분은 안정화제 예컨대 락토오스, 슈크로스 또는 만니톨, 및 이들의 혼합물 예컨대, 락토오스/슈크로스 혼합물, 슈크로스/만니톨 혼합물, 등을 포함할 수 있다. 사전-충전 주사기 내의 수성 보조제 성분 및 바이알 내의 동결건조 항원 성분을 사용한다.

조성물 또는 키트 성분의 포장

본 발명의 조성물(또는 키트)을 위한 적합한 용기는 바이알, 주사기(예컨대, 1회용 주사기), 비강 스프레이 등을 포함한다. 이러한 용기는 멸균되어야 한다.

조성물/성분이 바이알 내에 존재하는 경우, 바이알은 유리 또는 플라스틱 물질로 제조되는 것이 바람직하다. 바이알은 조성물이 첨가되기 전에 멸균되는 것이 바람직하다. 라텍스-민감성 환자의 문제를 회피하기 위하여, 바이알은 무-라텍스 마개(stopper)로 밀봉되는 것이 바람직하며, 모든 포장 물질 내에 라텍스가 부재하는 것이 바람직하다. 바이알은 단일 투여용 백신을 포함할 수 있으며, 또는 일 투약량 이상('수회투여' 바이알) 예컨대, 10회 투약량을 포함할 수 있다. 바람직한 바이알은 무색 유리로 제조된다.

바이알은 캡(cap)(예컨대, Luer lock)을 구비하여 사전-충전 주사기가 캡에 삽입되어 주사기의 함유물이 바이알로부터 배제될 수 있으며(예컨대, 내부의 동결건조 물질의 재배치), 바이알의 함유물이 주사기에서 제거될 수 있다. 바이알로부터 주사기 제거 후, 바늘이 부착되고, 조성물이 환자에 투여될 수 있다. 캡은 밀봉부 또는 덮개 내부에 위치하여, 밀봉부 또는 덮개가 캡이 접촉하기 전에 제거되어야 한다. 바이알은 이들의 함유물의 항균 제거를 허용하는 캡, 특히 수회투여 바이알용 캡을 구비할 수 있다.

성분이 주사기 내로 포장되는 경우, 주사기는 이에 부착된 바늘을 구비할 수 있다. 바늘이 부착된 경우, 별도의 바늘이 조립 및 사용을 위하여 주사기와 함께 제공될 수 있다. 이러한 바늘은 내장될 수 있다. 안전 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 일반적이다. 주사기는 기록 유지를 위하여 함유물의 생산 번호 및 사용 기간이 인쇄된, 접착식(peel-off) 라벨이 제공될 수 있다. 주사기의 플런저(plunger)는 호흡중 플런저가 사고로 제거되는 것을 예방하기 위하여 정지기가 구비된 것이 바람직하다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런저를 구비할 수 있다. 1회용 주사기는 단일 투여용 백신을 함유할 수 있다. 주사기는 바늘이 부착 전에 팁을 밀봉하기 위하여 팁 캡(tip cap)을 구비하는 것이 일반적이며, 팁 캡은 부틸 고무로 제조되는 것이 바람직하다. 주사기 및 바늘이 별도로 포장되는 경우, 이 후 바늘을 부틸 고무 차단재로 막는 것이 바람직하다. 바람직한 주사기는 상표 "Tip-Lok"™로 판매되는 것이다.

용기는 절반 투약량을 나타내는 표시를 하여 아동에게 절반 투약량을 전달하는 것을 촉진할 수 있으며, 예컨대, 0.5 ㎖ 복용량을 함유하는 주사기는 0.25 ㎖ 부피를 나타내는 표시를 보유할 수 있다.

유리 용기 (예컨대, 주사기 또는 바이알)가 사용되는 경우, 소다 라임 유리보다는 규산염 유리로 제조된 용기를 사용하는 것이 바람직하다.

키트 또는 조성물은 백신의 상세 예컨대, 투여 설명서, 백신 내의 항원의 상세, 등을 포함하는 인쇄물을 포함(예컨대, 동일 포장 내에)할 수 있다. 설명서에는 경고문 예컨대, 예방접종 후의 과민성 반응의 경우 아드레날린 용액을 사용하라는 등의 경고문을 포함할 수 있다.

백신의 치료 및 투여 방법

본 발명의 조성물은 인간에 투여되기에 적합하다. 본 발명에 의하여 발생된 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호성 항체 반응을 포함한다. 인플루엔자 바이러스 접종 후 항체 반응의 사정, 능력의 중화 및 바이러스 예방접종 후 보호 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 인간 연구는 인간 인플루엔자 바이러스의 적혈구응집소에 대한 항체 티터는 보호와 연관되어 있다는 것을 보여주었다(약 30-40의 혈청 시료 적혈구응집-억제 티터는 동종 바이러스에 의한 감염으로부터 약 50% 보호한다)[177]. 항체 반응은 일반적으로 적혈구응집소화 억제, 마이크로중성화, 단일 반경 면역확산(SRID), 및/또는 단일 반경 용혈(SRH)에 의하여 측정된다. 이러한 측정 기법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 예방접종 경로는 근육내 주입(예컨대 팔 또는 다리)에 의한 것이나, 다른 활용할 수 있는 경로에는 피하조직 주입, 비강내[178-180], 구강[181], 진피내[182,183], 경피성, 경피[184], 등을 포함한다.

본 발명에 따라 제조된 백신은 성인 및 어린이 모두의 치료에 사용될 수 있다. 인플루엔자 백신은 현재 6 개월령 이상의 소아 및 성인에 사용되도록 제안되고 있다. 따라서, 환자는 1 세 이하, 1 내지 5세, 5 내지 15세, 15 내지 55세, 또는 최소한 55 세일 수 있다. 환자는 고령(예컨대 50 세 이상, 60 세 이상, 및 바람직하게는 65 세 이상), 유아(예컨대 5 세 이하), 입원 환자, 요양중인 작업자, 군인 및 군사 요원, 임산부, 만성 환자, 면역결핍 환자, 백신 투여 전 7일 이내에 항바이러스 화합물 (예컨대 인플루엔자용 오셀타미비르 또는 자나미비르 화합물; 하기 참조)을 복용한 환자, 계란 알러지가 있는 사람 및 국외 여행중인 환자일 수 있다. 백신은 이러한 그룹에 단독으로 적합하지는 않다, 그러나, 일반적으로 집단적으로 사용될 수 있다. 유행성 균주에 있어서는, 모든 연령의 집단의 투여에 바람직하다.

본 발명의 바람직한 조성물은 효능에대한 CPMP 기준 1, 2 또는 3을 만족시키며, 성인(18-60세)에서, 이러한 기준은: (1) 70% 이상의 혈청보호; (2) 40% 이상의 혈청전환; 및/또는 (3) 2.5배 이상의 GMT 증가이다. 고령자(60세 이상)의 경우, 이러한 기준은: (1) 60% 이상의 혈청보호; (2) 30% 이상의 혈청전환; 및/또는 (3) 2배 이상의 GMT 증가이다. 이러한 기준은 최소한 50명의 환자를 대상으로한 오픈 라벨 연구를 기초로 한다.

치료는 수회 투여 계획에 의한다. 상기한 바와 같이, 다양한 투여가 일반적으로 동일한 형태 항원을 사용하며, 최소한 하나의 일반적인 적혈구응집소 서브타입을 공유한다. 모두 비경구적으로 또는 모두 점막으로 투여되는 것이 바람직하다. 투여는 일반적으로 동일한 투여 경로 예컨대, 비경구 경로, 예컨대 i.m. 주사에 의한다.

수회 투여는 일반적으로 최소한 1 주 간격(예컨대 최소한 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 6 주, 약 8 주, 약 10 주, 약 12 주, 약 16 주, 등.)으로 투여될 수 있다.

본 발명의 바람직한 투여 요법은 2회-투여 요법이다. 일반적인 통상 1회-투여 포멧에서는 추가 투여는 다음 인플루엔자 시즌에 투여될 수 있나, 본 발명에 따른 단일 시즌(예컨대, 단일 6 개월 또는 12 개월 내) 내의 표준 접종은 2회 투여가 될 것이다. 요법상의 추가의 투여(예컨대, 3회-투여 또는 4회-투여 요법)는 추가의 항원 필요성에 기인하여 선호되지 않는다. 그러나, 요법에 3회 투여가 포함되는 경우, 제3의 투여는 제1 투여의 반복과 이후의 추가 투여가 되거나, 또는 추가 투여의 반복이될 수 있다. 예컨대, '보조제, 보조제, 비보조제형' 요법, 또는 '보조제, 비보조제, 비보조제형' 요법이다.

본 발명에 의하여 생산되는 백신은 다른 백신과 실질적으로 동시(예컨대 동일한 의학적 자문 또는 의료 전문가 또는 예방접종 센터에 방문시에)에 환자에 투여될 수 있으며, 예컨대, 홍역 백신, 볼거리 백신, 풍진 백신, MMR 백신, 수두 백신, MMRV 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, DTP 백신, 접합된 H. 인플루엔자 타입 b 백신, 불활성화 폴리오바이러스 백신, B형 간염 바이러스 백신, 수막구균 접합 백신 (예컨대 4가 A-C-W135-Y 백신), 호흡기세포융합 바이러스 백신, 폐렴구균 접합 백신, 등과 실질적으로 동시에 투여될 수 있다. 폐렴구균 백신 또는 수막구균 백신이 실질적으로 동시에 투여되는 것이 특히 노령의 환자에 유용하다.

이와 유사하게, 본 발명의 백신은 항바이러스 화합물과 실질적으로 동시(예컨대 동일한 의학적 자문 또는 의료 전문가 방문시에)에 투여될 수 있다. 특히, 항바이러스 화합물이 인플루엔자 바이러스(예컨대, 오셀타미비르 및/또는 자나미비르)일 수 있다. 이러한 항바이러스는 뉴라미니다아제 억제제, 예컨대, (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복시산 또는 5-(아세틸아미노)-4-[(아미노이미노에틸)-아미노]-2,6-안하이드로-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토논-2-에논산, 이들의 에스테르(예컨대 에틸 에스테르) 및 이들의 염(예컨대 인산염)을 포함한다. 인플루엔자에 대하여 효과적인 바람직한 항바이러스는 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복시산, 에틸 에스테르, 인산염(1:1)이며, 이는 오셀타미비르 인산염(TAMIFLU™)으로 알려져 있다.

일반

용어 "포함하는(comprising)"은 "포함(including)" 및 "구성(consisting)"을 포괄하며 예컨대 X를 "포함하는" 조성물 배타적으로 X로 구성되거나 또는 추가적인 무엇인가를 포함할 수 있으며, 예컨대 X + Y 이다.

단어 "실질적으로(substantially)"는 "완전히(completely)"를 배제하지 않는다. 예컨대 Y가 "실질적으로 부재하는" 조성물은 Y가 완전히 부재할 수도 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.

용어 "약"은 수치 X에 관하여, 예를 들어, x+10%를 의미한다.

특별한 업급이 없다면, 이 이상의 성분이 혼합되는 단계를 포함하는 과정은 특이적 혼합 순서를 요하는 것이 아니다. 따라서 성분들은 어떠한 순서로 혼합될 수도 있다. 세 성분이 존재하는 경우, 두성분이 서로 결합될 수 있고, 그 후 제3 성분 등과 결합하여 조합될 수 있다.

동물(및 특히 소) 물질이 세포 배양에 사용되는 경우, 감염성 해면상뇌증(TSE), 및 특히 소 해면상뇌증(BSE)이 없는 공급원으로부터 획득하여야 한다. 전반적으로, 동물-유도성 물질이 전부 부재한 배양 세포가 바람직하다.

화합물이 조성물의 일부로서 신체에 투여되는 경우, 이후 화합물이 적합한 전구약물에 의하여 대체될 수 있다.

세포 기질이 재배열 또는 역 유전학 절차에 사용되는 경우, 인간 백신 생산에 승인된 것이 바람직하며, 예컨대 Ph Eur general chapter 5.2.3이다.

도 1은 다양한 인플루엔자 백신을 투여한 마우스 내의 항-HA IgG ELISA 반응을 나타낸다.

적혈구응집소는 조류 인플루엔자의 H5N1 균주로부터 제조되었으며, 0.2㎍/투여(50㎕ 부피/투여)로 근육내 주사를 위하여 제형화되었다. 두 백신이 제조되었다: 제1은 비보조제형이며; 제2는 1:1 부피비로 MF59 에멀젼을 포함하는 보조제형이다. 백신은 8주령 암컷 Balb/c 마우스의 4 그룹에 실험 0일 및 8일에 투여하였다. 마우스를 실험 14 및 42일에 방혈하였고 항-HA 면역 반응을 ELISA에 의하여 평가하였다.

결과는 다음과 같다(도 1 참조):

그룹	A	B	C	D
0 일	무 보조제	MF59	무 보조제	MF59
28 일	무 보조제	무 보조제	MF59	MF59
티터(14일)	13	313	6	271
반응자	3/10	10/10	3/10	10/10
티터(42일)	7125	75922	42219	148831
반응자	10/10	10/10	10/10	10/10

따라서, 보조제는 제1 면역화 후 반응개체의 수를 현저하게 증가시켰다 (A와 B 그룹의 비교). 각각 또는 모두에 보조제를 포함하는 것이 비보조제형 백신의 2회 투여에 의하여 유도되는 것보다 현저하게 높은 항-HA 특이적 항체 반응을 나타낸다(A 그룹과 B, C & D 그룹의 비교). 더욱이, 보조제형 백신으로 초회 투여된 백신은 비보조제형 백신에 의하여 증진될 수 있으며, 비보조제형 백신으로 초회 투여하거나 보조제형 백신으로 증진된 것보다 높은 티터를 달성한다(B & C 그룹의 비교). B 그룹에서의 절대 티터가 그룹 D 보다 낮지만, 반응은 통상적인 것보다 더 컸다. 따라서 2회-투여 요법 내의 제1 투여 만으로도 보조제의 누적이 유지되었다.

본 발명은 실시예에 의하여 설명되었으나, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 변형이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.

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Claims

(i) 제1 보조제와 조합하여 인플루엔자 바이러스 백신의 투약량을 투여하는 단계; 및

(ii) 상기 보조제 없이 인플루엔자 바이러스 백신의 추가적 투약량을 투여하는 단계

를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염에 대하여 환자를 면역화하는 방법.
제1항에 있어서, 추가적 투약량은 제1 투약량과 동일한 경로로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 추가적 투약량은 비보조제형인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 추가적 투약량은 제1 보조제와는 다른 보조제를 갖는 보조제형인 것을 특징으로 하는 방법.
(i) 제1 보조제와 조합한 제1 인플루엔자 바이러스 백신; 및

(ii) 상기 보조제 없는 제2 인플루엔자 바이러스 백신

을 포함하는 키트.
수회-투여 인플루엔자 백신의 제조에 (i) 제1 보조제와 조합한 제1 인플루엔자 바이러스 백신; 및 (ii) 보조제 없는 제2 인플루엔자 바이러스 백신의 사용.
이전에 제1 보조제와 조합한 인플루엔자 바이러스 백신의 투약량을 받은 적이 있는 환자에게 상기 보조제 없는 인플루엔자 바이러스 백신의 추가적 투약량을 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염에 대하여 환자의 면역화를 완결하는 방법.
제7항에 있어서, 추가적 투약량은 이전의 투약량과 동일한 경로에 의하여 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
환자가 보조제형 인플루엔자 바이러스 백신을 이전에 투여받은 적이 있는 환자를 인플루엔자 바이러스 감염에 대하여 면역화하는 의약의 제조에 비보조제형 인플루엔자 바이러스 백신의 사용.
제1 및 제2 인플루엔자 바이러스 백신 내의 보조제는 동일하지 않은, 제1 보조제형 인플루엔자 바이러스 백신을 이전에 투여받은 적이 있는 환자를 인플루엔자 바이러스 감염에 대하여 면역화하는 의약의 제조시 제2 보조제형 인플루엔자 바이러스 백신의 사용.
전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 백신은 백신당 균주당 15㎍ 미만의 적혈구응집소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법, 키트 또는 사용.
전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 백신은 H1, H2, H3, H5, H7 또는 H9 인플루엔자 A 바이러스 서브타입 유래의 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법, 키트 또는 사용.
전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 보조제는 수중유 에멀젼을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법, 키트 또는 사용.