JP5566687B2 - アジュバントを使用しない複数回投与ワクチン接種レジメン - Google Patents

Description

本明細書において言及するすべての書類は、その内容全体が参考として援用される。

本発明は、インフルエンザウイルス感染を防御するためのワクチンの分野に含まれる。

インフルエンザワクチンを投与される患者は、８歳以下の小児にワクチンが初めて投与される時に少なくとも４週間あけて２回の用量が投与される場合を除いて、現在は１年に１回の用量が投与される。

新たなインフルエンザウイルス株に対してヒトの集団が免疫学的にナイーブなパンデミックの状態においても、２回投与レジメンが必要になるであろうと考えられる（例えば、参考文献１（非特許文献１）参照）。

抗原の供給量が固定されている状況で２回投与が必要になるということは、作製可能な用量数が、１回投与レジメン用に作製可能な用量数の半分になるということを意味する。そのため、１用量当たり少ない量の抗原を使用し、この減少分を補うためのアジュバントを使用するよう提唱されている。

しかし、もしもアジュバント添加ワクチンによる１回投与レジメンによって十分な免疫反応が誘発されなければ、いずれにせよ２回投与レジメンが必要となり、今度は、十分な量のアジュバントの供給の問題というさらなるデメリットが持ち上がる。何億用量分というアジュバント添加ワクチンが用意されているような状況では、この問題は非常に重要となり、特に、合成アジュバントにとって重要となるであろう。

Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（2005）309：989

本発明の目的は、このデメリットを抑える、または回避することである。

発明の要旨
本発明によれば、（ｉ）初回用量はアジュバントとともに投与され、（ｉｉ）その後の用量はアジュバントなしか、または異なるアジュバントとともに投与される、複数回投与レジメンによってインフルエンザワクチンが投与される。そのため、本発明は、ある任意のアジュバントの必要供給量を２倍に増やすことなしに、２回投与レジメンの利点を提供する。初回用量とその後の用量は、好ましくは同じ投与経路（例えば、両方とも筋肉内注射で）によって与えられる必要があるが、参考文献２で行われた研究では、マウスの準備免疫に非経口経路（背中対頸部）を使用するとアジュバント添加ワクチンの免疫原性に影響を与えるかどうかを判定するために、３回投与レジメンにおいて、アジュバント未添加の粘膜ブースターが３回目の用量として使用された。

そのため、本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルスワクチンの用量を、第１のアジュバントとともに投与する工程と（ｉｉ）インフルエンザウイルスワクチンのさらなる用量をそのアジュバントなしで投与する工程を含む、インフルエンザウイルス感染に対して患者を免疫化するための方法を提供する。さらなる用量は、アジュバントを含まなくてもよく、または第１のアジュバントとは異なる第２のアジュバントを含んでもよい。

本発明は、（ｉ）第１のアジュバントと組み合わせた第１のインフルエンザウイルスワクチンと（ｉｉ）そのアジュバントを含まない第２のインフルエンザウイルスワクチンを含むキットも提供する。本発明は、（ｉ）第１のアジュバントと組み合わせた第１のインフルエンザウイルスワクチンと（ｉｉ）そのアジュバントを含まない第２のインフルエンザウイルスの、複数回投与用インフルエンザワクチンの製造における使用も提供する。第２のワクチンは、アジュバントを含まなくてもよく、または第１のアジュバントとは異なる第２のアジュバントを含んでもよい。

本発明は、インフルエンザウイルス感染に対する患者の免疫化を達成する方法も提供し、患者は以前に、第１のアジュバントと組み合わせた一定用量のインフルエンザウイルスワクチンを受けており、本方法は、そのアジュバントなしでインフルエンザウイルスワクチンのさらなる用量をその患者に投与する工程を含む。さらなる用量は、アジュバントを含まなくてもよく、または第１のアジュバントとは異なる第２のアジュバントを含んでもよい。

本発明は、インフルエンザウイルス感染に対して患者を免疫化するための薬剤の製造における、アジュバント未添加インフルエンザウイルスワクチンの使用も提供し、その患者は以前にアジュバント添加インフルエンザウイルスワクチンを投与されている。本発明は、インフルエンザウイルス感染に対して患者を免疫化するための薬剤の製造における、第２のアジュバント添加インフルエンザウイルスワクチンの使用も提供し、その患者は以前に第１のアジュバント添加インフルエンザウイルスワクチンを投与されており、第１および第２のインフルエンザウイルス中のアジュバントは同一ではない。

２回のワクチン接種における赤血球凝集素の用量が、１用量、１株当たりの標準的な１５μｇよりも少ない場合には、本発明によって抗原およびアジュバント両方の要件を緩和できるため、これらの方法、キット、および使用が特に有用である。

インフルエンザウイルス抗原
本発明とともに使用されるワクチンは、インフルエンザウイルス抗原を含む。この抗原は一般にインフルエンザウイルス粒子から作成されるが、他の方法として、赤血球凝集素やノイラミニダーゼのような抗原を組み換え宿主内で発現させ（例えば、バキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞株内で）、精製体として使用することができる［３、４、５］。しかし通常は、抗原はウイルス粒子由来である。

抗原は、生きたウイルス、あるいは、より好ましくは不活化ウイルスの形態をとってよい。ウイルスの不活化に使用される化学的手段には、界面活性剤、ホルムアルデヒド、ホルマリン、β‐プロピオラクトン、またはＵＶ光のうちの、効果的な量の１つ以上の物質での処理が含まれる。不活化に使用されるさらなる化学的手段には、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、またはこれらの任意の物質の組み合わせを使用した処理が含まれる。その他のウイルス不活化方法は当該技術分野で既知であり、例えば、２成分エチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはガンマ線照射などがある。ＩＮＦＬＥＸＡＬ（登録商標）という製品は不活化全粒子ワクチンである。

不活化ウイルスが使用される場合、ワクチンは完全ウイルス粒子、分解ウイルス粒子、または精製された表面抗原（赤血球凝集素を含み、通常ノイラミニダーゼも含む）を有していてよい。

一般的には、複数化投与レジメンにおけるワクチンの各用量は同じ形態の抗原を使用し、例えば、初回用量にスプリットワクチンを使用しながらも２回目の用量に全粒子ワクチンを使用するということはない。

各種の方法を使用して、ウイルスを含有する液体からウイルス粒子を回収することができる。例えば、精製プロセスは、ウイルス粒子を崩壊させるための界面活性剤を含む、ショ糖直線勾配溶液を使用したゾーン遠心分離法を含んでよい。任意で希釈した後、ダイアフィルトレーションによって抗原を精製してもよい。

サブビリオン製剤を作製するために、ウイルス粒子を界面活性剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ‐Ｎ‐ブチルホスファート、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、ＴｒｉｔｏｎＮ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、タージトールＮＰ９等）での処理により分解ウイルス粒子が得られ、これには「Ｔｗｅｅｎエーテル」分解プロセスが含まれる。インフルエンザウイルスを分解する方法は当該技術分野で周知であり、例えば参考文献６〜１１、他を参照されたい。ウイルスの分解は一般に、感染性、非感染性にかかわらず、崩壊用濃度の分解用物質でウイルス全体を崩壊または断片化することによって行われる。崩壊させることにより、ウイルスタンパク質の完全な、または部分的な可溶化がもたらされ、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分解用物質は、非イオン性およびイオン性（例、カチオン性）の界面活性剤であり、例えばアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ‐ジアルキル‐グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ‐ポリエトキシエタノール、４級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トリ‐Ｎ‐ブチルホスファート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ‐ＭＡ、オクチル‐またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例、Ｔｒｉｔｏｎ系の界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎＸ‐１００またはＴｒｉｔｏｎＮ１０１）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル等である。有用な分解手順の１つでは、デオキシコール酸ナトリウムとホルムアルデヒドを連続して作用させ、最初のウイルス粒子精製の際に分解が起こり得る（例、ショ糖密度勾配溶液中において）。そのため、分解プロセスは、ウイルス粒子含有物質の清澄化（非ウイルス粒子物質を除去するため）、回収したウイルス粒子の濃縮（例、ＣａＨＰＯ_４吸着のような吸着法を使用して）、非ウイルス粒子物質からの完全ウイルス粒子の分離、密度勾配遠心分離手順（例、デオキシコール酸ナトリウムのような分解用物質を含有するショ糖勾配液を使用して）における、分解用物質を使用したウイルス粒子の分解、不要な物質を除去するための濾過（例、超濾過）を含み得る。有用には、分解ウイルス粒子はリン酸ナトリウムで緩衝化した生理食塩液に再懸濁され得る。ＢＥＧＲＩＶＡＣ（登録商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（登録商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標）、およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（登録商標）などの製品は、スプリットワクチンである。

精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザの表面抗原である赤血球凝集素と、一般にはノイラミニダーゼを有する。これらのタンパク質の精製体を作製するためのプロセスは当該技術分野で周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（登録商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（登録商標）、およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（登録商標）などの製品は、サブユニットワクチンである。

インフルエンザ抗原は、ＩＮＦＬＥＸＡＬ Ｖ（登録商標）およびＩＮＶＡＶＡＣ（登録商標）などの製品のように、ビロゾーム［１２］（核酸をもたないウイルス様のリポソーム粒子）の形でも存在し得るが、本発明とともにビロゾームを使用しないことが好ましい。そのため、いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗原はビロゾームの形態ではない。

インフルエンザウイルスは弱毒化されてもよい。インフルエンザウイルスは温度感受性であってよい。インフルエンザウイルスは低温適合性であってよい。これらの３つの特徴は、生ウイルスを抗原として使用する場合に特に有用である。

ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス株はシーズン毎に変わる。現在のパンデミック間期において、ワクチンは一般に２種類のインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１種類のインフルエンザＢ株を含み、三価のワクチンが一般的である。本発明はこれらのワクチンとともに使用可能であるが、パンデミック株（すなわち、ワクチン接種者とヒトの一般集団が免疫学的にナイーブである株）、例えばＨ２、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９サブタイプ株（特に、インフルエンザＡウイルスの）由来のウイルスにとって特に有用であり、パンデミック株に対するインフルエンザワクチンは一価であってもよく、またはパンデミック株が追加された通常の三価ワクチンをベースとしていてもよい。しかし、シーズンや、ワクチンに加えられる抗原の性質に応じて、本発明は、インフルエンザＡウイルスの赤血球凝集素のサブタイプ、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６の１つ以上を防御してもよい。本発明は、インフルエンザＡウイルスのＮＡサブタイプ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、またはＮ９の１つ以上を防御してもよい。

有用には、組成物に加えることができるその他の株は、抗ウイルス療法に抵抗性を示す株（例えば、オセルタミビル［１３］および／またはザナミビルに抵抗性を示すもの）であり、耐性パンデミック株［１４］を含む。

本発明は、パンデミック株に対する免疫化に特に有用である。パンデミックの発生を引き起こす可能性をインフルエンザ株に与える特性とは、（ａ）それが、現在出回っているヒトの株に存在する赤血球凝集素と比べて新たな赤血球凝集素、すなわち、１０年以上ヒトの集団での存在が明らかでないもの（例えば、Ｈ２）、またはヒトの集団においてこれまでに全く認められていないもの（例えば、通常は鳥の集団にのみ認められているＨ５、Ｈ６、またはＨ９）を含むために、ヒトの集団がその株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブであること、（ｂ）それが、ヒトの集団において水平伝播する能力を持つこと、ならびに（ｃ）それが、ヒトに対して病原性を持つことである。パンデミックインフルエンザに対する免疫化には、Ｈ５型の赤血球凝集素を持つウイルス、例えばＨ５Ｎ１株が好ましい。その他の利用可能な株には、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、およびＨ７Ｎ７、ならびにパンデミックを引き起こす可能性があるその他任意の新興株が含まれる。Ｈ５サブタイプの中では、ウイルスはＨＡクレード１、ＨＡクレード１」、ＨＡクレード２、またはＨＡクレード３［１５］に分類されてもよく、クレード１および３は特に関連がある。

一般に、複数回投与レジメンにおけるワクチンの各用量は、少なくとも１つの共通の赤血球凝集素サブタイプを共有することになり、例えば、本発明が、初回用量に一価のＨ５Ｎ１ワクチンを使用し２回目の用量に一価のＨ９Ｎ２ワクチンを使用するということはない。

本発明の組成物は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを含む、１つ以上（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上）のインフルエンザウイルス株由来の抗原（１つ以上）を含んでよい。ワクチンが２つ以上のインフルエンザ株を含む場合、異なる株は一般に個別に培養され、ウイルスが回収されて、抗原が作製された後に混合される。そのため、本発明のプロセスは、２つ以上のインフルエンザ株由来の抗原を混合する手順を含んでよい。しかし、パンデミック状態においては一価のワクチンが好ましい場合がある。

インフルエンザウイルスは再集合株であってよく、逆遺伝子技術によって得られたものでもよい。逆遺伝子技術［例えば、１６〜２０］によって、所望のゲノム分節を有するインフルエンザウイルスを、プラスミドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで作成することができる。一般に、この技術は、（ａ）所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子、例えばｐｏｌＩプロモーター由来の分子、および（ｂ）ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子、例えばｐｏｌＩＩプロモーター由来の分子を発現させることによって、細胞内で両タイプのＤＮＡを発現させて、完全に無傷な感染性ウイルス粒子を構築する手順を伴う。好ましくは、ＤＮＡはすべてのウイルスＲＮＡおよびタンパク質を提供するが、一部のＲＮＡやタンパク質を提供するためにヘルパーウイルスを使用することも可能である。各ウイルスＲＮＡの作成に個別のプラスミドを使用する、プラスミドの使用に基づいた方法が好ましく［２１〜２３］、こうした方法は、ウイルスタンパク質のすべて、または一部（例えば、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＰタンパク質のみ）を発現させるためのプラスミドの使用を伴い、いくつかの方法では最大１２のプラスミドが使用される。

必要なプラスミドの数を減らすため、最近の手法［２４］では、同一のプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡ合成用）（例えば、１、２、３、４、５、６、７つ、または８つすべてのインフルエンザＡのｖＲＮＡ分節をコードする配列）と、別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１、２、３、４、５、６、７つ、または８つすべてのインフルエンザＡのｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を組み合わせている。参考文献２４の方法の好ましい態様には、（ａ）単一のプラスミド上のＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡのｍＲＮＡコード領域、ならびに（ｂ）単一のプラスミド上の、８つすべてのｖＲＮＡコード分節が含まれる。ＮＡおよびＨＡ分節を１つのプラスミド上に、他の６つの分節を別のプラスミド上に含めることでも、この問題が容易になる。

ウイルスＲＮＡ分節をコードするためのｐｏｌＩプロモーターの使用に代わるものとして、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターの使用が可能である［２５］。例えば、好都合には、ＳＰ６、Ｔ３、またはＴ７ポリメラーゼに対するプロモーターを使用できる。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性のため、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞種（例えば、ＭＤＣＫ）にとってより好都合であり得るが、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドを細胞にトランスフェクションしなくてはならない。

他の技術においては、単一のテンプレートから、ウイルスＲＮＡと、発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために、ｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩのデュアルプロモーターの使用が可能である［２６、２７］。

そのため、殊にウイルスを鶏卵内で増殖させる場合、ウイルス、特にインフルエンザＡウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１つ以上のＲＮＡ分節を含んでよい（一般にはＡ／ＰＲ／８／３４由来の６つの分節で、ＨＡおよびＮ分節はワクチン株由来であり、すなわち６：２の再集合体である）。また、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス、またはワクチン製剤用の再集合ウイルスの作成に有用なその他任意のウイルス株由来の１つ以上のＲＮＡ分節を含んでもよい。一般に、本発明は、ヒトからヒトへの伝播能を持つ株を防御するため、その株のゲノムは、哺乳動物（例えば、ヒト）におけるインフルエンザウイルスを起源とする少なくとも１つのＲＮＡ分節含む場合が多い。鳥インフルエンザウイルスを起源とするＮＳ分節を含んでもよい。

抗原のソースとして使用されるウイルスを、鶏卵または培養細胞のいずれかで増殖させることが可能である。現在、インフルエンザウイルスの増殖に使用される標準的な方法では、特定病原体未感染（ＳＰＦ）孵化鶏卵を使用し、ウイルスは鶏卵内容物（尿膜腔液）から精製される。しかし最近では、動物の培養細胞内でのウイルス増殖が行われており、スピードや患者のアレルギーなどの理由からこの増殖方法が好ましい。鶏卵の使用に基づくウイルス増殖が使用される場合、ウイルスとともに１つ以上のアミノ酸を鶏卵の尿膜腔液に導入してよい［１１］。

培養細胞が使用される場合のウイルス増殖基質は一般に、哺乳動物が起源の細胞株である。適当な哺乳動物起源の細胞には、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）、およびイヌの細胞が含まれるがこれらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞等の様々な細胞種が使用されてよい。適当なハムスターの細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣと呼ばれる細胞株である。適当なサルの細胞は、例えばアフリカミドリザルの細胞、例えばＶｅｒｏ細胞株のような腎細胞である。適当なイヌの細胞は、例えばＭＤＣＫ細胞株のような腎細胞である。そのため、適当な細胞株には、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、２９３Ｔ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＭＲＣ‐５、ＰＥＲ．Ｃ６、ＷＩ‐３８等が含まれるがこれらに限定されない。インフルエンザウイルスの増殖に使用される好ましい哺乳動物の細胞株には、Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞［２８〜３１］、アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓由来のＶｅｒｏ細胞［３２〜３４］、またはヒト胎児網膜芽細胞由来のＰＥＲ．Ｃ６細胞［３５］が含まれる。これらの細胞株は広く入手可能であり、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［３６］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［３７］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から入手できる。例えば、ＡＴＣＣはＣＣＬ‐８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６、およびＣＲＬ‐１５８７のカタログ番号で各種のＶｅｒｏ細胞を提供しており、ＣＣＬ‐３４のカタログ番号でＭＤＣＫ細胞を提供している。ＰＥＲ．Ｃ６細胞は、９６０２２９４０のデポジット番号でＥＣＡＣＣから入手可能である。あまり好ましくはないものの、哺乳動物の細胞株に代わるものとして、カモ由来（例えば、カモの網膜）またはニワトリ由来の細胞株を含む、トリの細胞株［例えば、参考文献３８〜４０］上でウイルスを増殖させることも可能である。トリの細胞株の例には、トリ胚幹細胞［３８、４１］およびカモ網膜細胞［３９］が含まれる。適当なトリ胚幹細胞には、ニワトリ胚幹細胞由来のＥＢｘ細胞株、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４‐０７４が含まれる［４２］。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）も使用されてよい。

インフルエンザウイルスの増殖に最も好ましい細胞株は、ＭＤＣＫ細胞株である。オリジナルのＭＤＣＫ細胞株は、ＣＣＬ‐３４としてＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞株の誘導体も使用されてよい。例えば、参考文献２８は、浮遊培養での増殖用に改良されたＭＤＣＫ細胞株（「ＭＤＣＫ３３０１６」、ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９としてデポジットされている）を開示している。同様に、参考文献４３は、無血清培養において浮遊状態で増殖するＭＤＣＫ誘導細胞株（「Ｂ‐７０２」、ＦＥＲＭ ＢＰ‐７４４９としてデポジットされている）を開示している。参考文献４４は、「ＭＤＣＫ‐Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ‐６５００）、「ＭＤＣＫ‐ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ‐６５０１）、「ＭＤＣＫ‐ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ‐６５０２）、および「ＭＤＣＫ‐ＳＦ１０３」（ＰＴＡ‐６５０３）、を含む、非腫瘍原性ＭＤＣＫ細胞を開示している。参考文献４５は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ‐１２０４２）を含む、感染症に対して高い感受性を持つＭＤＣＫ細胞株を開示している。これらのＭＤＣＫ細胞株のうち任意のものが使用可能である。

哺乳動物の細胞株でウイルスが増殖された場合、好都合なことに、組成物は卵タンパク質（例えば、卵白アルブミンおよびオボムコイド）や、ニワトリＤＮＡを含まなくなるため、アレルゲン性が低下する。

ウイルスが細胞株で増殖された場合、増殖用培養液、さらに培養を開始するのに使用されるウイルス接種材料は、ヘルペス単純ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを好ましくは含まない（すなわち、これらのウイルス汚染について検査され、陰性の結果が得られる）であろう［４６］。ヘルペス単純ウイルスが存在しないことが特に好ましい。

ＭＤＣＫ細胞のような細胞株での増殖については、浮遊状態［４７‐４９］、または接着培養液でウイルスの増殖が行われてよい。浮遊培養に適したＭＤＣＫ細胞株の１つは、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９としてデポジットされている）である。あるいは、マイクロキャリア培養を使用することも可能である。

インフルエンザウイルスの複製を支える細胞株は、好ましくは無血清培養用培地および／または無タンパク質培地で増殖が行われる。本発明の文脈における培地とは、ヒトまたは動物起源の血清由来の添加物を含まない無血清培地を意味する。無タンパク質とは、タンパク質、増殖因子、その他のタンパク質添加物および非血清タンパク質が存在しない状態で細胞の増殖が起こるが、トリプシンまたはウイルスの増殖に必要な場合があるその他のプロテアーゼのようなタンパク質を場合により含むことができる培養液を意味すると理解される。このような培養液中で増殖する細胞は、必然的にそれら自身がタンパク質を含む。

インフルエンザウイルスの複製を支える細胞株は、好ましくは、ウイルス複製の間、３７℃未満［５０］、例えば３０〜３６℃で増殖が行われる。

培養細胞中でウイルスを増殖させる方法には、通常、培養する株を培養細胞に接種する手順と、ウイルス増殖のために感染細胞を所望の時間、例えばウイルス力価または抗原の発現によって判定されるような時間（例えば、接種後２４〜１６８時間）培養する手順と、増殖したウイルスを回収する手順とが含まれる。培養細胞に、１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５、より好ましくは１：５０〜１：１０の細胞比でウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ_５０で測定されたもの）が接種される。ウイルスは細胞の浮遊液に添加される、または細胞の単層に加えられ、２５℃〜４０℃で、好ましくは２８℃〜３７℃で少なくとも６０分間、通常は３００分未満、好ましくは９０〜２４０分間、細胞上でウイルスを吸着させる。回収される培養液上清のウイルス含有量を増やすため、凍結融解または酵素作用のいずれかで感染細胞培養（例えば、単層）が除去されてもよい。次に、回収された液体は不活化されるか、または凍結保存される。約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ」）で培養細胞を感染させてもよい。さらにより好ましくは、約０．０１のｍ．ｏ．ｉで細胞の感染が行われる。感染細胞は感染の３０〜６０時間後に回収されてよい。好ましくは、感染の３４〜４８時間後に細胞が回収される。さらにより好ましくは、感染の３８〜４０時間後に細胞が回収される。プロテアーゼ（一般にトリプシン）は、ウイルス放出が起こるように通常細胞培養の間に添加され、培養中の任意適切な段階においてプロテアーゼが添加される。

赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチン中の主要な免疫原であり、一般的に一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）解析によって測定されるＨＡレベルを基準としてワクチンの用量が標準化される。現行のワクチンは一般的に１株当たり約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば小児への投与や、またはパンデミック状態においてはこれより少ない用量も使用される。高用量（例えば、３×または９×用量［５３、５４］）が使用されるのと同様に、１／２（すなわち１株当たり７．５μｇのＨＡ）、１／４、および１／８のような分割用量が使用されている［５１、５２］。そのため、ワクチンはインフルエンザ１株に当たり０．１〜１５０μｇのＨＡ、好ましくは０．１〜５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等を含んでよい。特定の用量は１株当たり、例えば約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５μｇ等を含む。これらの低用量用量は、本発明のように、ワクチン中にアジュバントが存在する場合に最も有用である。

生ワクチンについては、ＨＡ含有量よりも５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０）で投薬量が測定され、１株当たり１０^６〜１０^８（好ましくは１０^６．５〜１０^７．５）のＴＣＩＤ_５０が一般的である。

本発明とともに使用されるＨＡは、ウイルスに認められるような天然ＨＡであってよく、または改変されていてもよい。例えば、鳥類においてウイルスが高い病原性を持つ原因となる決定因子（例えば、ＨＡ１およびＨＡ２の間の開裂部位付近の塩基性アミノ酸連続領域（ｈｙｐｅｒ−ｂａｓｉｃ ｒｅｇｉｏｎ））を除去するようにＨＡを改変することが知られているが、これは、さもなければこれらの決定因子が鶏卵中でのウイルスの増殖を妨げ得るためである。

本発明の組成物は、界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として知られる）、オクトキシノール（例えばオクトキシノール‐９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）またはｔ‐オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウムを、特にスプリットワクチンまたは表面抗原ワクチン用に含んでよい。界面活性剤は、ごく微量で存在してもよい。そのため、ワクチンは、オクトキシノール‐１０、α‐トコフェリル琥珀酸水素塩、およびポリソルベート８０を各１ｍｇ／ｍＬ未満含んでよい。微量のその他の残りの成分は、抗生物質の場合もある（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）。

不活化されているが、全粒子ではないワクチン（例えば、スプリットウイルスワクチンまたは精製表面抗原ワクチン）はマトリックスタンパク質を含んでよいが、これはこの抗原の内部に存在するさらなるＴ細胞エピトープの利点を利用するためである。そのため、赤血球凝集素とノイラミニダーゼを含む非全粒子ワクチン（特にスプリットワクチン）は、Ｍ１および／またはＭ２マトリックスタンパク質、またはそれらの断片（１つ以上）をさらに含んでよい。マトリックスタンパク質が存在する場合、検出可能なレベルのＭ１マトリックスタンパク質を含んでいるのが好ましい。核タンパク質も存在していてよい。

宿主細胞のＤＮＡ
細胞株でウイルスの増殖が行われた場合は、ＤＮＡのあらゆる発癌活性を最小限に抑えるために、最終的なワクチンに存在する細胞株のＤＮＡの残存量を最小限にするのが標準的な手順である。そのため、細胞株でウイルスの増殖が行われた場合は、１用量当たり、組成物は好ましくは１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残存宿主細胞ＤＮＡを含有するが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在してもよい。残存宿主細胞ＤＮＡの平均長が、５００ｂｐ未満、例えば４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、等であるのが好ましい。通常は、本発明の組成物から排除するのが望ましい宿主細胞ＤＮＡは、１００ｂｐより長いＤＮＡである。

現在では、残存宿主細胞ＤＮＡの測定は、生物学的製剤におけるルーチンの規制上の要件であり、当業者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡの測定に使用されるアッセイは、一般には有効性が確認されたアッセイである［５５、５６］。有効なアッセイの性能特性は数学および定量化の用語によって表すことができ、その誤差の原因となり得るものが特定されることになる。アッセイは通常、正確度、精度、特異性のような特性について検査されることになる。アッセイのキャリブレーション（例えば、既知の標準量の宿主細胞ＤＮＡに対して）とテストが済むと、定量的ＤＮＡ測定のルーチンでの実施が可能になる。ＤＮＡ定量化に使用される３つの基本的な技術が使用できる：サザンブロットまたはスロットブロットのようなハイブリダイゼーション法［５７］、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（登録商標）システムのような免疫測定法［５８］、そして定量ＰＣＲ［５９］である。当業者はこれらのすべての方法に精通しているが、問題としている宿主細胞によって、それぞれの方法の正確な特性は変化する、例えばハイブリダイゼーション用のプローブの選択、増幅用のプライマーおよび／またはプローブの選択等である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（登録商標）システムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡの定量的アッセイであり、生物医薬品中のＤＮＡの汚染レベルのモニタリングに使用されている［５８］。一般的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質、ウレアーゼ結合抗ｓｓＤＮＡ抗体、およびＤＮＡの間の、非配列特異的な反応複合体の形成を伴う。アッセイのすべての構成要素はこの製造業者から入手可能なＴｏｔａｌ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ一式に含まれる。様々な民間製造業者、例えばＡｐｐＴｅｃ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（登録商標）、Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ等が、残存宿主細胞ＤＮＡの検出のための定量的ＰＣＲアッセイを提供している。ヒト用ウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡの汚染を測定するための化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと全ＤＮＡ用Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（登録商標）システムの比較は、参考文献６０に認められる。

ＤＮＡ汚染は、標準的な精製手順、例えばクロマトグラフィー等を使用してワクチン作製時に除去可能である。ヌクレアーゼ処理、例えばＤＮａｓｅを使用することで、残存宿主細胞ＤＮＡの除去の向上が可能である。宿主細胞ＤＮＡの汚染を減らすのに便利な方法が参考文献６１および６２に開示されており、方法には、ウイルス増殖中に使用されてもよいＤＮａｓｅ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を最初に使用し、次いでウイルス粒子の崩壊中に使用されてもよいカチオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）を使用する、２手順の処理が含まれる。β‐プロピオラクトンのようなアルキル化剤での処理も、宿主細胞ＤＮＡの除去に使用可能であり、有利には、ウイルス粒子の不活化にも使用されてよい［６３］。

０．２５ｍＬ量当たり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンが好ましいのと同様に、１５μｇの赤血球凝集素当たり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンが好ましい。０．５ｍＬ量に当たり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンが好ましいのと同様に、５０μｇの赤血球凝集素当たり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンがより好ましい。

アジュバント
本発明は、アジュバント添加ワクチンの最初の投与を含む。追加のワクチンはアジュバント未添加でよく、またはアジュバントが添加されているが、最初の投与とは異なるアジュバントであってよい。アジュバント（１つ以上）は、組成物を与えられる患者において発現する免疫反応（体液性および／または細胞性）を高めるように働く。

第１のワクチンとの使用に、ならびに、追加のワクチン用量（１つ以上）との任意での使用に適するアジュバントには以下が含まれるが、これらに限定されない：
・ カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはこれらの混合物）を含む、ミネラル含有組成物。カルシウム塩は、リン酸カルシウム（例えば、参考文献６４で開示される「ＣＡＰ」粒子）を含む。アルミニウム塩は、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩等を含み、塩は任意適切な形態をとる（例えば、ゲル、結晶、非結晶等）。これらの塩への吸着が好ましい。ミネラル含有組成物は、金属塩の粒子として製剤化されてもよい［６５］。アルミニウム塩アジュバントの詳細は下記で述べる。
・ 下記で詳細を述べるような、水中油型乳剤。
・ 下記で詳細を述べるような、免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
・ 下記で詳細を述べるような、３‐Ｏ‐脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「３ｄＭＲＬ」、「ＭＲＬ（登録商標）」としても知られる）。
・ イミダゾキノリン化合物、例えばＩｍｉｑｕｉｍｏｄ（「Ｒ‐８３７」）［６６、６７］、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（「Ｒ‐８４８」）［６８］、およびこれらのアナログ、ならびにこれらの塩（例えば、塩酸塩）。免疫刺激性イミダゾキノリンに関しては、参考文献６９〜７３でさらに詳述されている。
・ 参考文献７４で開示されるもののような、チオセミカルバゾン化合物。参考文献７４では、活性化合物の処方、製造、およびスクリーニングの方法も説明されている。チオセミカルバゾンは、ヒト末梢血の単核球を刺激して、サイトカイン、例えばＴＮＦ‐αを産生させるのに特に効果的である。
・ ヌクレオシドの類似体、例えば、（ａ）Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ（ＡＮＡ‐２４５、７‐チア‐８‐オキソグアノシン）

およびそのプロドラッグ、（ｂ）ＡＮＡ９７５、（ｃ）ＡＮＡ‐０２５‐１、（ｄ）ＡＮＡ３８０、（ｅ）参考文献７５〜７７に開示される化合物、（ｆ）式

を有する化合物であって、
Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ独立してＨ、ハロゲン、‐ＮＲ_ａＲ_ｂ、‐ＯＨ、Ｃ_１〜６アルコキシ、置換Ｃ_１〜６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換へテロシクリル、Ｃ_６〜１０アリール、置換Ｃ_６〜１０アリール、Ｃ_１〜６アルキル、または置換Ｃ_１〜６アルキルであり、
Ｒ_３は非存在、Ｈ、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_６〜１０アリール、置換Ｃ_６〜１０アリール、ヘテロシクリル、または置換へテロシクリルであり、
Ｒ_４およびＲ_５はそれぞれ独立してＨ、ハロゲン、ヘテロシクリル、置換へテロシクリル、‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒ_ｄ、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキルであるか、または一緒に結合してＲ_４‐５のような５員環を作り、

で示される結合部位で結合が達成され、
Ｘ_１およびＸ_２はそれぞれ独立してＮ、Ｃ、Ｏ、またはＳであり、
Ｒ_８はＨ、ハロゲン、‐ＯＨ、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニル、‐ＯＨ、‐ＮＲ_ａＲ_ｂ、‐（ＣＨ_２）_ｎ‐Ｏ‐Ｒ_ｃ、‐Ｏ‐（Ｃ_１〜６アルキル）、‐Ｓ（Ｏ）_ｐＲ_ｅ、または‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒ_ｄであり、
Ｒ_９はＨ、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキル、ヘテロシクリル、置換へテロシクリル、またはＲ_９ａであり、Ｒ_９ａは

であり、

で示される結合部位で結合が達成され、
Ｒ_１０およびＲ_１１はそれぞれ独立してＨ、ハロゲン、Ｃ_１〜６アルコキシ、置換Ｃ_１〜６アルコキシ、‐ＮＲ_ａＲ_ｂ、または‐ＯＨであり、
各Ｒ_ａおよびＲ_ｂは独立してＨ、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキル、‐Ｃ（Ｏ）Ｒ_ｄ、Ｃ_６〜１０アリールであり、
各Ｒ_ｃは独立してＨ、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、Ｃ_１〜６アルキル、または置換Ｃ_１〜６アルキルであり、
各Ｒ_ｄは独立してＨ、ハロゲン、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、置換Ｃ_１〜６アルコキシ、‐ＮＨ_２、‐ＮＨ（Ｃ_１〜６アルキル）、‐ＮＨ（置換Ｃ_１〜６アルキル）、‐Ｎ（Ｃ_１〜６アルキル）_２、‐Ｎ（置換Ｃ_１〜６アルキル）_２、Ｃ_６〜１０アリール、またはヘテロシクリルであり、
各Ｒ_ｅは独立してＨ、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_６〜１０アリール、置換Ｃ_６〜１０アリール、ヘテロシクリル、または置換へテロシクリルであり、
各Ｒ_ｆは独立してＨ、Ｃ_１〜６アルキル、置換Ｃ_１〜６アルキル、‐Ｃ（Ｏ）Ｒ_ｄ、リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩であり、
各ｎは独立して０、１、２、または３であり、
各ｐは独立して０、１、または２である、化合物、
または（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、（ａ）〜（ｆ）のうちのいずれかの互変異性体、またはその互変異性体の薬学的に許容される塩。
・ 例えば参考文献７８で開示されるもののような、トリプタントリン化合物。参考文献７８では、活性化合物の処方、製造、およびスクリーニングの方法が説明されている。チオセミカルバゾンは、ヒト末梢血の単核球を刺激して、サイトカイン、例えばＴＮＦ‐αを産生させるのに特に効果的である。
・ ロキソリビン（７‐アリル‐８‐オキソグアノシン）［７９］。
・ アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドロイソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［８１、８２］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナゾリノン化合物、ピロール化合物［８３］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン化合物、およびベンザゾール化合物［８４］を含む、参考文献８０に開示される化合物。
・ ３，４‐ジ（１Ｈ‐インドール‐３‐イル）‐１Ｈ‐ピロール‐２，５‐ジオン、スタウロスポリン類似体、誘導体化ピリダジン、クロメン‐４‐オン、インドリノン、キナゾリン、およびヌクレオシド類似体を含む、参考文献８５に開示される化合物。
・ アミノアルキルグルコサミニドホスファート誘導体、例えばＲＣ‐５２９［８６、８７］。
・ 例えば、参考文献８８および８９で説明されるような、ホスファゼン、例えばポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）。
・ 小分子免疫増強物質（ＳＭＩＰ）、例えば、
Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
Ｎ２，Ｎ２‐ジメチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
Ｎ２‐エチル‐Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐プロピル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐プロピル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
Ｎ２‐ブチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
Ｎ２‐ブチル‐Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐ペンチル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐プロプ‐２‐エニル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
１‐（２‐メチルプロピル）‐２［（フェニルメチル）チオ］‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐４‐アミン
１‐（２‐メチルプロピル）‐２（プロピルチオ）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐４‐アミン
２‐［［４‐アミノ‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２‐イル］（メチル）アミノ］エタノール
２‐［［４‐アミノ‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２‐イル］（メチル）アミノ］エチルアセテート
４‐アミノ‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１，３‐ジヒドロ‐２Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２‐オン
Ｎ２‐ブチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ４，Ｎ４‐ビス（フェニルメチル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
Ｎ２‐ブチル‐Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ４，Ｎ４‐ビス（フェニルメチル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ４，Ｎ４‐ビス（フェニルメチル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
Ｎ２，Ｎ２‐ジメチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ４，Ｎ４‐ビス（フェニルメチル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
１‐｛４‐アミノ‐２‐［メチル（プロピル）アミノ］‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐１‐イル｝‐２‐メチルプロパン‐２‐オール
１‐［４‐アミノ‐２‐（プロピルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐１‐イル］‐２‐メチルプロパン‐２‐オール
Ｎ４，Ｎ４‐ジベンジル‐１‐（２‐メトキシ‐２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐プロピル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン
・ 幅広い植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花に認められる、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドからなる異種のグループである、サポニン［参考文献１３１、２２章］。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ ｔｒｅｅの樹皮からとれるサポニンはアジュバントとして広く研究されている。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（花嫁のベール）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（シャボンソウ）などから商業化可能な程得られる。サポニンアジュバント製剤には、ＱＳ２１のような精製製剤だけでなく、ＩＳＣＯＭのような脂質製剤も含まれる。ＱＳ２１はＳｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）として販売されている。サポニン組成物はＨＰＬＣおよびＲＰ‐ＨＰＬＣを使用して精製されている。こうした技術を使用して特定の精製画分が同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ‐Ａ、ＱＨ‐Ｂ、およびＱＨ‐Ｃが含まれる。好ましくは、サポニンはＱ２１である。ＱＳ２１の作製方法は参考文献９０に開示されている。サポニン製剤は、コレステロールのようなステロールも有してよい［９１］。サポニンとコレステロールの組み合わせを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれるユニークな粒子の作成が可能である［参考文献１３１、２３章］。ＩＳＣＯＭは一般に、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質も含む。あらゆる既知のサポニンをＩＳＣＯＭに利用できる。好ましくは、ＩＳＣＯＭはＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１つ以上を含む。参考文献９１〜９３にＩＳＣＯＭがさらに詳しく記載されている。場合により、ＩＳＣＯＭは追加の界面活性剤を含まなくてもよい［９４］。サポニンベースのアジュバントの開発に関するレビューは参考文献９５および９６に記載されている。
・ 細菌性ＡＤＰリボシル化毒素（例えば、大腸菌の熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）およびそれらの無毒化誘導体、例えばＬＴ‐Ｋ６３およびＬＴ‐Ｒ７２として知られる変異毒素［９７］。無毒化ＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は参考文献９８に、非経口アジュバントとしての使用は参考文献９９に記載されている。
・ エステル化ヒアルロン酸ミクロスフィア［１００］またはキトサンおよびその誘導体［１０１］のような生体接着物質および粘膜接着物質。
・ 生体分解性かつ非毒性の材料（例えば、ポリ（α‐ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトン等）から形成されるミクロ粒子（すなわち、直径が〜１００ｎｍから〜１５０μｍの粒子、より好ましくは直径が〜２００ｎｍから〜３０μｍ、または直径が〜５００ｎｍから〜１０μｍ）であり、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）が好ましく、場合により、負に荷電する表面（例えば、ＳＤＳを使用して）または正に荷電する表面（例えば、ＣＴＡＢのようなカチオン性界面活性剤を使用して）を持つように処理される。
・ リポソーム（参考文献１３１、１３・１４章）。アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は参考文献１０２〜１０４に記載されている。
・ ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［１０５］。このような製剤は、オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１０６］だけでなく、オクトキシノールのような少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［１０７］をさらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン‐９‐ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン‐８‐ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン‐４‐ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン‐３５‐ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン‐２３‐ラウリルエーテル。
・ ムラミルペプチド、例えばＮ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐スレオニル‐Ｄ‐イソグルタミン（「ｔｈｒ‐ＭＤＰ」）、Ｎ‐アセチル‐ノルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミン（ｎｏｒ‐ＭＤＰ）、Ｎ‐アセチルグルコサミニル‐Ｎ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐Ａｌ‐Ｄ‐イソグル‐Ｌ‐Ａｌａ‐ジパルミトキシプロピルアミド（「ＤＴＰ‐ＤＰＰ」、または「Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（登録商標）」）、Ｎ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミニル‐Ｌ‐アラニン‐２‐（１’‐２’ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ヒドロキシホスホリルオキシ）‐エチルアミン（「ＭＴＰ‐ＰＥ」）。
・ 第２のグラム陰性細菌から得られるリポ多糖（ＬＰＳ）製剤と組み合わされた、第１のグラム陰性細菌から調製される外膜タンパク質プロテオソーム製剤であり、外膜タンパク質プロテオソームおよびＬＰＳ製剤は、安定した非共有結合性のアジュバント複合体を作る。このような複合体には、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜とＬＰＳからなる複合体「ＩＶＸ‐９０８」が含まれる。これらは、インフルエンザワクチン用のアジュバントとして使用されている［１０８］。
・ ポリオキシドニウム（ｐｏｌｙｏｘｉｄｏｎｉｕｍ）ポリマー［１０９、１１０］またはその他のＮ‐酸化ポリエチレン‐ピペラジン誘導体。
・ メチルイノシン５’‐一リン酸塩（「ＭＩＭＰ」）［１１１］。
・ ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１１２］、例えば式

を有する化合物であって、Ｒは、水素、直鎖または分枝、置換型または非置換型、飽和または不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニル、およびアリール基、またはそれらの薬学的に許容できる塩または誘導体からなる群から選択される。例には、カスアリン、カスアリン‐６‐α‐Ｄ‐グルコピラノース、３‐ｅｐｉ‐カスアリン、７‐ｅｐｉ‐カスアリン、３，７‐ｄｉｅｐｉ‐カスアリン等が含まれるがこれらに限定されない。
・ ＣＤ１ｄリガンド、例えばα‐グリコシルセラミド［１１３〜１２０］（例えば、α‐ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α‐グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ、３Ｓ、４Ｒ）‐１‐Ｏ‐（α‐Ｄ‐ガラクトピラノシル）‐２‐（Ｎ‐ヘキサコサノイルアミノ）‐１，３，４‐オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３”‐Ｏ‐スルホ‐ガラクトシルセラミド等。
・ ガンマイヌリン［１２１］またはその誘導体、例えばアルガムリン。
・ 参考文献１２２で定義されるような、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物、またはそれらの塩、

例えば「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、「ＥＲ８０４０５８」、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、「ＥＲ８０３０２２」または「ＥＲ８０４０５７」、例えば

・ 大腸菌由来のリピドＡの誘導体、例えばＯＭ‐１７４（参考文献１２３・１２４に記載）。
・ カチオン性脂質と（多くの場合天然の）コリピッド（ｃｏ‐ｌｉｐｉｄ）の製剤、例えばアミノプロピル‐ジメチル‐ミリストレイルオキシ‐プロパンアミニウムブロミド‐ジフィタノイルホスファチジル‐エタノールアミン（「Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標）」）またはアミノプロピル‐ジメチル‐ビス‐ドデシルオキシ‐プロパンアミニウムブロミド‐ジオレオイルホスファチジル‐エタノールアミン（「ＧＡＰ‐ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）。（±）‐Ｎ‐（３‐アミノプロピル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ビス（ｓｙｎ‐９‐テトラデセネイルオキシ）‐１‐プロパンアミニウム塩を含有する製剤が好ましい［１２５］。
・ リン酸含有非環状骨格と結合した脂質を含有する化合物、例えばＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１２６、１２７］：

これらの、ならびに他のアジュバント活性物質は、参考文献１３１および１３２においてさらに詳細に解説されている。

本発明で使用するためのアジュバント（１つ以上）は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のモジュレータおよび／またはアゴニストであってよい。例えばそれらは、ヒトＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９タンパク質のうちの１つ以上のアゴニストであってよい。好ましい物質は、ＴＬＲ７のアゴニスト（例えば、イミダゾキノリン）および／またはＴＬＲ９のアゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）である。これらの物質は、先天性免疫経路の活性化に有用である。

単一のワクチンは、該アジュバントの２つ以上を含んでよい。

組成物中の抗原とアジュバントは、一般的には混合された状態である。

アルミニウム塩アジュバント
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして知られるアジュバントが使用されてよい。これらの名称は従来使用されているが、どちらも実際に存在する化合物を正確に表していないため、便宜上のものにすぎない（例えば、参考文献１３１、９章参照）。本発明は、アジュバントとして通常使用される、あらゆる「水酸化物」または「リン酸化物」アジュバントを使用できる。

「水酸化アルミニウム」として知られるアジュバントは、一般的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、通常少なくとも部分的に結晶である。オキシ水酸化アルミニウムは化学式ＡｌＯ（ＯＨ）で表され、赤外（ＩＲ）分光法を使用して、特に１０７０ｃｍ^−１の吸収帯と３０９０〜３１００ｃｍ^−１に強いショルダーが存在することによって、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）_３のようなその他のアルミニウム化合物と区別できる［参考文献１３１、９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半分高さにおける回折バンドの幅（ＷＨＨ）によって反映され、結晶度の低い粒子は結晶子のサイズが小さくなるため、ラインの広がりが大きくなる。ＷＨＨが大きくなると表面積も増加し、ＷＨＨ値が大きいアジュバントほど高い抗原吸着能を持つことが確認されている。繊維状の形態（例、透過型電子顕微鏡像に見られるようなもの）が水酸化アルミニウムアジュバントでは一般的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは一般に約１１であり、すなわち生理学的ｐＨの条件下では、このアジュバント自身の表面が正に荷電している。水酸化アルミニウムアジュバントでは、ｐＨ７．４において、Ａｌ^＋＋＋１ｍｇにつき１．８〜２．６ｍｇのタンパク質の吸着能を有することが報告されている。

「リン酸アルミニウム」として知られるアジュバントは、一般的には水酸化リン酸アルミニウムであり、少量の硫酸塩も含有することが多い（すなわち水酸化リン酸アルミニウム硫酸塩）。これらは沈殿によって得られてもよく、沈殿の際の反応条件と濃度が塩における水酸基のリン酸による置換度に影響を与える。水酸化リン酸塩のＰＯ_４／Ａｌのモル比は、通常０．３〜１．２である。水酸基の存在によって、厳密なＡｌＰＯ_４から水酸化リン酸塩を区別できる。例えば、３１６４ｃｍ^−１のＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃に加熱されたとき）は、構造的水酸基の存在を示す［参考文献１３１、９章］。

リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ_４／Ａｌ^３＋のモル比は通常、０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、より好ましくは０．９５±０．１である。リン酸アルミニウム、特に水酸化リン酸塩は通常は非結晶質である。一般的なアジュバントは、ＰＯ_４／Ａｌのモル比が０．８４〜０．９２の非結晶水酸化リン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇＡｌ^３＋／ｍＬで加えられる。リン酸アルミニウムは一般的に粒子状物質である（例えば、透過電子顕微鏡像で見られるような板状の形態をとる）。任意の抗原を吸着した後の粒子の一般的な直径は、０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）である。リン酸アルミニウムに関しては、ｐＨ７．４においてＡｌ^＋＋＋１ｍｇにつき０．７〜１．５ｍｇのタンパク質吸着能を有することが報告されている。

リン酸アルミニウムの零電荷点（ＰＺＣ）は、リン酸基のヒドロキシル基への置換度と反比例し、この置換度は、沈殿による塩の調製に使用される反応条件や反応物の濃度に応じて変化し得る。ＰＺＣは、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させることでも変化し（リン酸が多い＝ＰＺＣの酸性度が高い）、またはヒスチジンバッファーのようなバッファーの添加によっても変化する（ＰＺＣの塩基性が高まる）。本発明にしたがって使用されるリン酸アルミニウムのＰＺＣは、一般的に４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば５．７である。

本発明の組成物の調製に使用されるアルミニウム塩の懸濁液は、バッファー（例、リン酸またはヒスチジンまたはトリスバッファー）を含んでよいが、これが必ずしも必要なわけではない。懸濁液は、好ましくは滅菌済みで、ピロゲンフリーである。懸濁液は、例えば１．０〜２０ｍＭの濃度、好ましくは５〜１５ｍＭの濃度、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する水溶性遊離リン酸イオンを含んでよい。懸濁液は塩化ナトリウムも有していてよい。

本発明は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用できる。この例では、水酸化アルミニウムよりもリン酸アルミニウムが多く存在してもよく、例えば少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１等の重量比であってよい。

患者への投与に使用される組成物中のＡｌ^＋＋＋濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍＬ、≦４ｍｇ／ｍＬ、≦３ｍｇ／ｍＬ、≦２ｍｇ／ｍＬ、≦１ｍｇ／ｍＬ等である。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍＬである。最大で０．８５ｍｇ／用量が好ましい。

水中油型乳剤アジュバント
水中油型乳剤は、インフルエンザウイルスワクチンへのアジュバントの添加への使用に特に適していることが認められている。このような乳剤が各種知られており、それらは一般的に少なくとも１つの油と少なくとも１つの界面活性剤を含み、油（１つ以上）および界面活性剤（１つ以上）は生体分解性（代謝性）かつ生体適合性である。乳剤中の油の直径は、通常５μｍ未満であり、さらには直径がサブミクロンであってもよく、このような小さいサイズはマイクロフルイダイザーを使用して得られ、安定した乳剤をもたらす。２２０ｎｍ未満の大きさの滴は、濾過滅菌が実施可能であるため好ましい。

本発明は、動物（例えば魚）または植物性由来の油などの油とともに使用可能である。植物油の供給源には、実、種、および穀物が含まれる。堅果油の例としてはラッカセイ油、大豆油、ココナッツ油、およびオリーブ油が最も広く使用される。例えばホホバの実から得られるホホバ油も利用できる。種油には、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが含まれる。穀物の群ではトウモロコシ油が最も容易に入手できるが、その他の穀物、例えばコムギ、カラスムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギなどの油も利用してよい。堅果油および種油を出発原料として適切な材料を加水分解、分離、エステル化することによって、天然では種油中に含まれないものの、グリセロールおよび１，２‐プロパンジオールの６〜１０個の炭素数の脂肪酸エステルを調製してよい。哺乳動物の乳汁由来の脂肪と油は代謝性であり、故に本発明を実施する際に使用されてもよい。分離、精製、けん化、ならびに動物性ソースから精製油を得るのに必要なその他の手段の手順は当該技術分野で周知である。大部分の魚は、容易に回復する代謝性の油を含有する。例えば、タラの肝油、サメの肝油、および鯨ろうのような鯨油が、本明細書で使用されてもよい魚油のいくつかの例である。多数の分枝鎖油が炭素数５のイソプレンユニットに生化学的に合成され、通常テルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３‐ヘキサメチル‐２，６，１０，１４，１８，２２‐テトラコサヘキサンとして知られる分枝、不飽和テルペノイドを含有し、これは本明細書において特に好ましい。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は民間業者から容易に入手でき、または当該技術分野で既知の方法を使用して得てもよい。その他の好ましい油はトコフェロール（下記参照）である。油の混合物を使用できる。

界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類可能である。本発明の好ましい界面活性剤のＨＬＢは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６である。本発明は、限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０、ＤＯＷＦＡＸ（登録商標）の登録商標名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）の共重合体、例えば直鎖状ＥＯ／ＰＯブロック共重合体、オクトキシノール‐９（ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、またはｔ‐オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に関心が持たれている、エトキシ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）基のリピート数が変化し得るオクトキシノール、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ‐６３０／ＮＰ‐４０）、ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質、タージトール（登録商標）ＮＰシリーズのようなノニルフェノールエトキシラート、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（ブリッジ３０）のような、ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコールから得られるポリオキシエチレン脂肪酸エーテル（ブリッジ界面活性剤として知られる）、ソルビタントリオレエート（ＳＰＡＮ８５）およびソルビタンモノラウレートのようなソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして知られる）を含む界面活性剤とともに使用可能である。非イオン性界面活性剤が好ましい。乳剤に添加するのに好ましい界面活性剤はＴｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎＸ‐１００である。

例えばＴｗｅｅｎ８０／ＳＰＡＮ８５の混合液のような、界面活性剤の混合液を使用できる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ‐オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００）のようなオクトキシノールの組み合わせも適している。別の有用な組み合わせは、ラウレス９にポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノール加えたものを有する。

界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えばＴｗｅｅｎ８０）０．０１〜１％、特に約０．１％、オクチル‐またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤）０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％、ポリオキシエチレンエーテル（例えばラウレス９）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％である。

本発明に有用な特定の水中油型乳剤アジュバントには以下が含まれるが、これらに限定されない：
・ スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳＰＡＮ８５からなるサブミクロン乳剤。体積によるこの乳剤の組成は、約５％がスクアレン、約０．５％がポリソルベート８０、および約０．５％がＳＰＡＮ８５であってもよい。重量でいうと、これらの比は、４．３％がスクアレン、０．５％がポリソルベート８０、および０．４８％がＳＰＡＮ８５となる。このアジュバントは「ＭＦ５９」［１２８〜１３０］として知られており、参考文献１３１の１０章および参考文献１３２の１２章でさらに詳しく説明されている。有利には、ＭＦ５９乳剤は、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファーを含む。
・ スクアレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ８０からなる乳剤。この乳剤は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでよい。この乳剤は、ＳＰＡＮ８５（例えば１％で）および／またはレシチンも含んでよい。これらの乳剤は、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロール、および０．３〜３％Ｔｗｅｅｎ８０を含んでよく、スクアレン：トコフェロールの重量比は好ましくは≦１であるが、これはこの比がより安定な乳剤をもたらすためである。スクアレンとＴｗｅｅｎ８０は、約５：２の体積比で存在してもよい。このような乳剤の１つは、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳに溶解して２％溶液を作り、次いでこの溶液の９０ｍＬを、５ｇの（ＤＬ‐α‐トコフェロールと５ｍＬのスクアレンの）混合液と混合し、この混合液をマイクロフルイダイズすることで作製可能である。こうして得られる乳剤は、例えば平均径が１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍのサブミクロンの油滴を有していてよい。
・ スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００）からなる乳剤。この乳剤は、３ｄ‐ＭＰＬ（下記参照）も含んでよい。この乳剤はリン酸バッファーを含んでよい。
・ ポリソルベート（例、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００）、およびトコフェロール（例、α‐コハク酸トコフェロール）を有する乳剤。この乳剤は、これらの３つの成分を約７５：１１：１０の質量比（例、７５０μｇ／ｍＬのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍＬのＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、および１００μｇ／ｍＬのαコハク酸トコフェロール）を含んでよく、これらの濃度は、抗原に由来するこれらの成分の寄与分を含む必要がある。この乳剤はスクアレンも含んでよい。この乳剤は、３ｄ‐ＭＰＬ（下記参照）も含んでよい。水相はリン酸バッファーを含んでよい。
・ スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「プルロニック（登録商標）Ｌ１２１」）からなる乳剤。この乳剤はｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水で調製されてよい。この乳剤は、ムラミルジペプチドの有用な送達媒体であり、「ＳＡＦ‐１」アジュバント［１３３］においてスレオニル‐ＭＤＰとともに使用されている（０．０５〜１％Ｔｈｒ‐ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％プルロニックＬ１２１、および０．２％ポリソルベート８０）。これは、「ＡＦ」アジュバント［１３４］にみられるように、Ｔｈｒ‐ＭＤＰなしでも使用可能である（５％スクアラン、１．２５％プルロニックＬ１２１、および０．２％ポリソルベート８０）。ミクロ流動化が好ましい。
・ スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（例、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル、例えばソルビタンモノオレートまたは「ＳＰＡＮ８０」）を有する乳剤。この乳剤は、好ましくは熱可逆性であり、および／または大きさが２００ｎｍ未満の油滴を少なくとも９０％（体積で）有する［１３５］。この乳剤は、アルジトール、凍結保護物質（例、糖、例えばドデシルマルトシドおよび／またはスクロース）、および／またはアルキルポリグリコシドのうち１つ以上を含んでよい。このような乳剤は凍結乾燥してもよい。
・ ０．５〜５０％の油、０．１％〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有する乳剤。参考文献１３６に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。サブミクロンの滴の大きさが有利である。
・ 非代謝性油（例えばライトミネラルオイル）および少なくとも１つの界面活性剤（例えばレシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳＰＡＮ８０）からなる、サブミクロンの水中油型乳剤。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン‐親油性物質複合体（例えば参考文献１３７に記載されているような、脂肪族アミンをグルクロン酸のカルボキシル基を介してデスアシルサポニンに添加することによって作製されるＧＰＩ‐０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ，Ｎ‐ジオクタデシル‐Ｎ，Ｎ‐ビス（２‐ヒドロキシエチル）プロパンジアミンのような添加剤が加えられてよい。
・ サポニン（例、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例、コレステロール）がらせん状ミセルとして結合している乳剤［１３８］。
・ ミネラルオイル、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤を含む乳剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン‐ポリオキシプロピレンブロック共重合体）［１３９］。
・ ミネラルオイル、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤を含む乳剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン‐ポリオキシプロピレンブロック共重合体）［１３９］。

乳剤は、送達の際にその場で抗原と混合されてよい。そのため、アジュバントと抗原は包装された、または流通しているワクチンにおいて別々の状態であり、使用時に最終的に製剤化できるような状態になっていてよい。抗原は通常水溶性形態であり、ワクチンは２つの液体を混合することで最終的に調製される。混合される２つの液体の体積比は様々であるが（例えば、５：１〜１：５）、通常は約１：１である。

抗原とアジュバントが混合された後は、赤血球凝集素抗原は通常水溶液中にとどまるが、油／水の界面に自身を分散させる場合もある。通常、乳剤の油相に入る赤血球凝集素はほとんどない。

組成物がトコフェロールを含む場合は、α、β、γ、δ、ε、またはξトコフェロールのいずれかが使用可能であるが、α‐トコフェロールが好ましい。トコフェロールは複数の形態、例えば様々な塩および／または異性体をとることができる。塩には、有機塩、例えばコハク酸エステル、酢酸塩、ニコチン酸塩等が含まれる。Ｄ‐α‐トコフェロールとＤＬ‐α‐トコフェロールの両方を使用できる。ビタミンＥが高齢の患者（例、６０歳以上）の免疫反応にプラスの効果を与えることが報告されているため、有利には、この年齢群に使用するためのワクチンにトコフェロールが加えられる［１４０］。トコフェロールは、乳剤の安定化に役立つ可能性がある抗酸化作用も有している［１４１］。好ましいα‐トコフェロールはＤＬ‐α‐トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩はコハク酸エステルである。コハク酸塩は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＴＮＦ関連リガンドと協同することが認められている。さらに、α‐コハク酸トコフェロールはインフルエンザワクチンに適合すること、また水銀化合物の代わりとして有用な保存料であることが知られている［１０］。

免疫刺激性オリゴヌクレオチド
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾のようなヌクレオチド修飾体／類似体を含むことができ、二本鎖または（ＲＮＡは例外だが）一本鎖であり得る。参考文献１４２、１４３、および１４４は、可能な類似体置換、例えば２’‐デオキシ‐７‐デアザグアノシンでのグアノシンの置換を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は参考文献１４５〜１５０でさらに解説されている。ＣｐＧ配列はＴＬＲ９を標的としてもよく、例えばモチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなどがある［１５１］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ‐Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）のようにＴｈ１の免疫反応の誘発に特異的であってよく、またはＣｐＧ‐Ｂ ＯＤＮのようにＢ細胞の反応の誘発により特異的であってもよい。ＣｐＧ‐ＡおよびＣｐＧ‐Ｂ ＯＤＮは参考文献１５２〜１５４で取り上げられている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ‐Ａ ＯＤＮである。好ましくは、受容体認識用に５’末端が利用可能となるようにＣｐＧオリゴヌクレオチドが構築される。場合により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、それらの３’末端で結合して「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成してよい。例えば、参考文献１５１および１５５〜１５７を参照されたい。有用なＣｐＧアジュバントは、ＰｒｏＭｕｎｅ（登録商標）（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても知られるＣｐＧ７９０９である。

ＣｐＧ配列の使用に代わるものとして、またはこれに加えて、ＴｐＧ配列も利用できる［１５８］。これらのオリゴヌクレオチドは非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくてよい。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドはピリミジンリッチであってよい。例えばこれは、２つ以上の連続するチミジンヌクレオチド（例えば、参考文献１５８に開示されるようなＴＴＴＴ）を有してよく、および／または＞２５％チミジン（例、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％等）を持つヌクレオチド組成を有してもよい。例えばこれは、２つ以上の連続するシトシンヌクレオチド（例、参考文献１５８に開示されるようなＣＣＣＣ）を有してよく、および／または＞２５％シトシン（例、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％等）を持つヌクレオチド組成を有してもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくてよい。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドは一般に、少なくとも２０のヌクレオチドを有する。それらは１００未満のヌクレオチドを有してよい。

３脱‐Ｏ‐アシル化モノホスホリルリピドＡ
３ｄＭＰＬ（３脱‐Ｏ‐アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３‐Ｏ‐デスアシル‐４’‐モノホスホリルリピドＡとしても知られる）は、モノホスホリルリピドＡ内の３位の還元端のグルコサミンが脱アシル化されたアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトースを含まない変異体から調製されており、リピドＡと化学的に類似しているが、酸に不安定なホスホリル基と塩基に不安定なアシル基を欠く。この物質は、単球／マクロファージ系の細胞を活性化し、ＩＬ‐１、ＩＬ‐１２、ＴＮＦ‐α、およびＧＭ‐ＣＳＦを含む複数のサイトカインの放出を刺激する（参考文献１５９も参照）。３ｄＭＰＬの調製は、もとは参考文献１６０で説明された。

３ｄＭＰＬは、関連する分子の混合物の形態をとり得るが、それらのアシル化（例、異なる長さであってよい、３、４、５、または６つのアシル鎖を持つ）によって変化する。２つのグルコサミン（２‐デオキシ‐２‐アミノ‐グルコースとしても知られる）単糖は、それらの２位の炭素の位置でＮがアシル化されたものであり（すなわち、２位および２’位において）、３’位の位置でのＯのアシル化も存在する。２位の炭素に結合する基は、式‐ＮＨ‐ＣＯ‐ＣＨ_２‐ＣＲ^１Ｒ^１’を有する。２’位の炭素に結合する基は、式‐ＮＨ‐ＣＯ‐ＣＨ_２‐ＣＲ^２Ｒ^２’を有する。３’位の炭素に結合する基は、式‐Ｏ‐ＣＯ‐ＣＨ_２‐ＣＲ^３Ｒ^３’を有する。代表的な構造は、

である。

基Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３はそれぞれ独立して‐（ＣＨ_２）_ｎ‐ＣＨ_３である。ｎの値は、好ましくは８〜１６、より好ましくは９〜１２、最も好ましくは１０である。

基Ｒ^１’、Ｒ^２’、およびＲ^３’はそれぞれ独立して、（ａ）‐Ｈ、（ｂ）‐ＯＨ、または（ｃ）‐Ｏ‐ＣＯ‐Ｒ^４であってよく、Ｒ^４は‐Ｈまたは‐（ＣＨ_２）_ｍ‐ＣＨ_３のいずれかであり、ｍの値は好ましくは８〜１６、より好ましくは１０、１２、または１４である。２位の位置では、ｍは好ましくは１４である。２’位の位置では、ｍは好ましくは１０である。３’位の位置では、ｍは好ましくは１２である。そのため、基Ｒ^１’、Ｒ^２’、およびＲ^３’は好ましくは、ドデカン酸、テトラデカン酸、またはヘキサデカン酸からの‐Ｏ‐アシル基である。

Ｒ^１’、Ｒ^２’、およびＲ^３’のすべてが‐Ｈの場合、３ｄＭＰＬは３つのアシル鎖のみを有する（２、２’、３’位のそれぞれに１つずつ）。Ｒ^１’、Ｒ^２’、およびＲ^３’のうち２つだけが‐Ｈの場合、３ｄＭＰＬは４つのアシル鎖を有し得る。Ｒ^１’、Ｒ^２’、およびＲ^３’のうち１つだけが‐Ｈの場合、３ｄＭＰＬは５つのアシル鎖を有し得る。Ｒ^１’、Ｒ^２’、およびＲ^３’が‐Ｈではない場合、３ｄＭＰＬは６つのアシル鎖を有し得る。本発明にしたがって使用される３ｄＭＰＬアジュバントはこれらの形態の混合物であり、３つ〜６つのアシル鎖を有し得るが、６つのアシル鎖を持つ３ｄＭＰＬを混合物中に加えること、また特に、ヘキサアシル鎖形態の重量が、全３ｄＭＰＬの少なくとも１０％、例えば≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％またはそれ以上を占めるようにするのが好ましい。６つのアシル鎖を持つ３ｄＭＰＬはアジュバントとして最も活性が高い形態であることが認められている。

そのため、本発明の組成物に加える３ｄＭＰＬの形態として最も好ましいのは、

である。

３ｄＭＰＬが混合物の形態で使用される場合、本発明の組成物中における３ｄＭＰＬの量または濃度に関する記載は、混合物中で混合された３ｄＭＰＬの種類を意味する。

水性条件において３ｄＭＰＬは、様々な大きさ、例えば直径が＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍのミセル集合体または粒子を形成し得る。これらのいずれか、または両方を本発明とともに使用でき、ルーチンのアッセイを使用してより優れた粒子を選択できる。より小さい粒子（例、十分に小さく、透明な３ｄＭＰＬ水性懸濁液をもたらす）はより優れた活性を有するため、本発明に従った使用に好ましい［１６１］。好ましい粒子の平均径は２２０ｎｍ未満であり、より好ましくは２００ｎｍ未満、または１５０ｎｍ未満、または１２０ｎｍ未満であり、さらには平均径が１００ｎｍ未満のこともある。しかし、ほとんどの場合、平均径は５０ｎｍを下回ることはない。これらの粒子は十分に小さいため、濾過滅菌に適している。粒子径は、粒子の平均径を示す、動的光散乱を使用するルーチン技術によって測定可能である。粒子の径がｘｎｍであるとされる場合、通常はおおよそこの中間値の粒子が分布するが、個数で少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、またはそれ以上）の粒子が、ｘ±２５％の範囲内の直径を有することになる。

有利には、３ｄＭＰＬは水中油型乳剤と組み合わせて使用することができる。実質的にすべての３ｄＭＰＬが、乳剤の水相に位置してもよい。

３ｄＭＰＬは単独で、または１つ以上のさらなる化合物と組み合わせて使用することができる。例えば３ｄＭＰＬを、ＱＳ２１サポニンと［１６２］（水中油型乳剤中での使用を含む［１６３］）、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと、ＱＳ２１と免疫刺激性オリゴヌクレオチドの両方と、リン酸アルミニウムと［１６４］、水酸化アルミニウムと［１６５］、またはリン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムの両方との組み合わせでの使用が知られている。

好ましいアジュバント添加レジメン
本発明の投薬レジメンは、アジュバント添加インフルエンザワクチンを最初に投与する工程を伴う。この最初のワクチンに使用するのに好ましいアジュバントは水中油型乳剤である。

２回投与レジメンの２回目の用量は好ましくはアジュバント未添加である。あるいは、これはアジュバント添加であってもよいが、初回用量のアジュバントとは異なるものを添加する。初回用量に水中油型乳剤がアジュバントとして添加されている場合、アジュバント添加された２回目の用量に使用するのに好ましいアジュバントはアルミニウム塩を有する。

医薬組成物
本発明の組成物は薬学的に許容でき、一般的には水性形態である。組成物は、抗原に加えて成分（および、適用がある場合、アジュバント）を含んでよく、例えば組成物は一般に１つ以上の医薬用担体（１つ以上）および／または賦形剤（１つ以上）を含む。参考文献１６６において、このような成分がより詳しく取り上げられている。

組成物は、チオマーサルまたは２‐フェノキシエタノールのような保存剤を含んでよい。しかし、ワクチンが水銀性物質を実質的に含まない（すなわち、５μｇ／ｍＬ未満）、例えばチオマーサルフリーであることが好ましい［１０、１６７］。水銀を含まないワクチンがより好ましい。保存剤を含まないワクチンが特に好ましい。

浸透圧を調整するために、生理的塩、例えばナトリウム塩を加えるのが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍＬで存在していてよい。存在していてもよいその他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム脱水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等が含まれる。

組成物の重量オスモル濃度は通常、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇとなり、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に含まれる。ワクチン接種に起因する痛みに重量オスモル濃度が影響を与えないことが報告されているが［１６８］、それでもやはり重量オスモル濃度をこの範囲にとどめるのが好ましい。

組成物は、１つ以上のバッファーを含んでよい。一般的なバッファーには、リン酸バッファー、トリスバッファー、ホウ酸塩バッファー、コハク酸塩バッファー、ヒスチジンバッファー（特に水酸化アルミニウムアジュバントと使用する）、またはクエン酸バッファーが含まれる。バッファーは一般に５〜２０ｍＭの範囲で加えられる。

組成物のｐＨは通常５．０〜８．１となり、より一般的には６．０〜８．０、例えば６．５〜７．５、７．０〜７．８である。したがって、本発明のプロセスは包装前にバルクワクチンのｐＨを調整する手順を含んでよい。

組成物は好ましくは滅菌済みである。組成物は好ましくは非発熱性であり、例えば１用量当たり＜１ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準的な測定基準）、好ましくは１用量当たり＜０．１ＥＵを含有する。組成物は好ましくはグルテンを含まない。

組成物は単回の免疫化用の材料を含んでよく、または複数回の免疫化用の材料を含んでもよい（すなわち、「複数回用量」キット）。複数回用量方式では保存剤の添加が好ましい。複数回用量用組成物に保存剤を加える代わりに（またはこれに加えて）、材料の取り出し用の無菌アダプターを備える容器に組成物が入れられてもよい。

インフルエンザワクチンは、一般に約０．５ｍＬの投薬量で投与されるが、半分の用量（すなわち約０．２５ｍＬ）が小児（例、３６ヶ月まで）に投与されてよい。

組成物およびキットは、好ましくは２℃〜８℃で保存される。これらを凍結させてはいけない。直射日光避けて保存するのが理想的である。

本発明のキット
本発明は、第１のおよび追加のインフルエンザワクチンからなるキットを含む。キットの１つの成分は第１のアジュバント添加ワクチンであり、キットのもう１つの成分は、アジュバントが任意で添加される追加のワクチンである。この２つの成分は、実質的に異なる時期に患者に投与されるため、別々の状態である。

キットに含まれる個別のワクチンはそれぞれ使用準備完了状態であってもよいし、または送達時に用時調製してもよい。この用時調製方式によって、アジュバントと抗原とを使用時まで個別に保存でき、これは水中油型乳剤アジュバントを使用する場合、特に有用である。

ワクチンが用時調製される場合、その成分はキット内において互いに物理的に分離されており、この分離は各種の方法で行うことができる。例えば、２つの成分は２つの別々の容器、例えばバイアルに入れられてもよい。その後、例えば１つのバイアルの内容物を取り出し、それをもう１つのバイアルに加えることによって、または両方のバイアルの内容物を別々に取り出して３つ目の容器中でそれらを混合することによって、この２つのバイアルの内容物が混合されてよい。好ましいアレンジでは、キットの成分の１つはシリンジに入っており、もう１つはバイアルのような容器に入っている。シリンジを、その内容物を２番目の容器に注入（例、針を使用して）して混合するのに使用し、次いで混合物をそのシリンジで吸い取ることができる。一般には新たな滅菌済みの注射針を使用して、シリンジ内の混合された内容物を患者に投与できる。１つの成分をシリンジに詰めておくことで、患者に投与する際に別のシリンジを使用する必要がなくなる。

別の好ましいアレンジでは、ワクチンの２つの成分は、同一のシリンジ、例えば参考文献１６９〜１７６等で開示されているもののようなニ腔シリンジ内に一緒ではあるが別々に充填されている。シリンジを作動させると（例えば、患者への投与時）、２つのチャンバーの内容物が混合される。このアレンジによって、使用時の別の混合手順の必要がなくなる。

ワクチンが用時調製される場合、その成分は通常水性形態である。いくつかのアレンジでは、成分（通常は、アジュバント成分ではなく抗原成分）は乾燥形態（例えば、凍結乾燥状態）であり、もう１つの成分は水性形態である。乾燥成分を再活性化し、患者への投与に使用する水性組成物を得るために２つの成分を混合できる。凍結乾燥成分は、一般的にシリンジではなくバイアル内に入れられる。乾燥成分は、ラクトース、スクロース、またはマンニトール、さらにはそれらの混合物、例えばラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物等のような安定剤を含んでよい。１つの可能なアレンジは、プレフィルドシリンジに入った水性アジュバント成分とバイアルに入った凍結乾燥抗原成分を使用する。

組成物またはキット成分の包装
本発明の組成物（またはキット成分）に適した容器には、バイアル、シリンジ（例えば、使い捨てシリンジ）、鼻腔用スプレー等が含まれる。これらの容器は滅菌済みでなくてはいけない。

組成物／成分がバイアルに入っている場合、バイアルは好ましくはガラスまたはプラスチック製である。バイアルは、好ましくは組成物がその中に充填される前に滅菌される。ラテックスアレルギー患者の問題を避けるため、好ましくはラテックスを含まないストッパーでバイアルが密封され、すべての包装材料がラテックスを含まないことが好ましい。バイアルはワクチンの単回用量分を含んでよく、または２用量以上、例えば１０用量を含んでよい（「複数回用量」バイアル）。好ましいバイアルは無色のガラス製である。

プレフィルドシリンジをキャップに挿入し、シリンジの内容物をバイアルに注入し（例えば、その中に入っている凍結乾燥材料を再構成するため）、バイアルの内容物を吸い取ってシリンジ内に戻せるようにキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）が、バイアルに付いていてよい。バイアルからシリンジを抜いた後、注射針を取り付けて組成物を患者に投与できる。キャップは好ましくはシールまたはカバーの内側に位置し、シールまたはカバーを取り外さなければキャップに触ることができないようになっている。バイアル、特に複数回用量バイアルでは、その内容物を無菌で取り出せるようなキャップがつけられていてよい。

組成物／成分がシリンジに充填されている場合、シリンジには注射針が取り付けられていてもよい。もし注射針が取り付けられていない場合、取り付けて使用できるように注射針が個別にシリンジとともに供給されてよい。このような針は外装で覆われてよい。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージ、および５／８インチ２５ゲージの針が一般的である。シリンジは、記録管理が容易になるように、内容物のロット番号、インフルエンザシーズン、および使用期限が印字されていてもよい剥離可能なラベルとともに提供されてよい。吸引の際に偶発的にプランジャーが外れるのを防ぐため、シリンジ内のプランジャーには好ましくはストッパーが付いている。シリンジはラテックスゴムのキャップおよび／またはプランジャーを備えていてよい。使い捨てシリンジは単回用量のワクチンを含有する。針を取り付ける前のシリンジには、通常先端を密封するための先端キャップが付いており、先端キャップは好ましくはブチルゴム製である。シリンジと針が個別に包装される場合は、好ましくは針にブチルゴムの保護材が取り付けられる。好ましいシリンジは、登録商標名「Ｔｉｐ‐Ｌｏｋ」（登録商標）として販売されているものである。

小児への送達を容易にするため、半分の用量を示すマークが容器に表示されてよい。例えば、０．５ｍＬの用量を含有するシリンジには、０．２５ｍＬの量を示す表示があってよい。

ガラス製容器（例えば、シリンジまたはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラスではなくホウケイ酸ガラス製の容器を使用するのが好ましい。

キットまたは組成物は、ワクチンの詳細、例えば投与方法、ワクチンに含まれる抗原の詳細等を記載したリーフレットとともに包装されてよい（例えば、同じ箱に）。使用説明書は、例えばワクチン接種後にアナフィラキシー反応が発生した場合に備えて、アドレナリン溶液をすぐに使用できる環境を整える、等の警告事項も含んでよい。

治療方法およびワクチンの投与
本発明の組成物はヒト患者への投与に適している。本発明にしたがって誘発される免疫反応は、通常は抗体反応、好ましくは防御性抗体反応を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体反応、中和能および防御を評価する方法は当該技術分野で周知である。ヒトを対象とした研究では、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体力価は、防御と相関することが示されている（約３０〜４０の血球凝集阻害力価を持つ血清サンプルは、同種のウイルスによる感染をおよそ５０％防御する）［１７７］。抗体反応は一般に、血球凝集反応の阻害、ミクロ中和反応、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、および／または一元放射溶血試験（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は当該技術分野で周知である。

本発明の組成物は、様々な方法で投与できる。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚）によるものであるが、その他の利用可能な経路には、皮下注射、鼻腔内［１７８〜１８０］、経口［１８１］、皮内［１８２、１８３］、経皮［１８４］等が含まれる。

本発明のワクチンは、小児および成人の両方の治療に使用されてよい。インフルエンザワクチンは現在、生後６ヶ月から、小児および成人への免疫化への使用が推奨されている。そのため、患者は１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であってよい。ワクチン接種が好ましい患者は、高齢者（例、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳）、若年者（例、≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍兵士、妊婦、慢性疾患患者、免疫不全患者、ワクチン接種の７日前に抗ウイルス化合物（例、オセルタミビルまたはザナミビル化合物、下記参照）を摂取した患者、鶏卵アレルギーのある者、および海外旅行者である。しかし、ワクチンはこれらのグループにのみ適しているわけではなく、集団内でより広く使用されてよい。パンデミック株は、全年齢群への投与が好ましい。

本発明の好ましい組成物は、有効性に関するＣＰＭＰ基準の１、２、または３つを満たす。成人（１８〜６０歳）におけるこれらの基準は、（１）≧７０％の血清抗体保有、（２）≧４０％の血清抗体陽転、および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増加である。高齢者（＞６０歳）では、これらの基準は（１）≧６０％の血清抗体保有、（２）≧３０％の血清抗体陽転、および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増加である。これらの基準は少なくとも５０名の患者を対象とした非盲検試験に基づくものである。

治療は複数回投与スケジュールによって行われる。上述のように、各種用量は一般に同一形態の抗原を使用し、少なくとも１つの共通の赤血球凝集素サブタイプを共有する。用量は、すべて非経口で、またはすべて経粘膜で与えられることが好ましい。用量は、一般に同一の投与経路、例えば同一の非経口経路、例えば筋肉内注射によって与えられる。

複数回投与は、一般的に少なくとも１週間あけて（例えば、少なくとも約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間の間隔、約１２週間、約１６週間の間隔、等）与えられる。

本発明の好ましい投薬レジメンは、２回投与レジメンである。通常の１回投与方式では、さらなる用量は一般に次のインフルエンザシーズンに投与されてよいが、本発明に従う１シーズン（例、単一の６ヶ月の期間または１２ヶ月の期間内）における標準的な免疫化は２回投与を必要とする。抗原が余分に必要になるので、このレジメンにおいて余分の用量（例、３回または４回投与レジメン）は好ましくない。しかし、もし３つ目の用量がレジメンに加えられる場合、３つ目の用量は初回用量の繰り返し、次いでさらなる用量を投与するか、あるいはさらなる用量の繰り返しであってもよく、例えば、「アジュバント添加、アジュバント添加、アジュバント未添加」レジメン、または「アジュバント添加、アジュバント未添加、アジュバント未添加」レジメンであってよい。

本発明によって作製されるワクチンは、その他のワクチンと実質的に同じ時期（例えば、同一の診療時、または医療専門家またはワクチン接種機関への訪問時）に、例えば麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、インフルエンザ菌ｂ型結合ワクチン、ポリオウイルス不活化ワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合ワクチン（例えば四価のＡ‐Ｃ‐Ｗ１３５‐Ｙワクチン）、呼吸器合胞体ウイルスワクチン、肺炎球菌結合ワクチン等と実質的に同じ時期に患者に投与されてよい。肺炎球菌ワクチンまたは髄膜炎菌ワクチンとの実質的な同時投与は、高齢患者において特に有用である。

同様に、本発明のワクチンは抗ウイルス化合物、特にインフルエンザウイルスに対して活性を持つ抗ウイルス化合物（例、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同じ時期に（例、同一の診察時または医療専門家訪問時に）患者に投与されてよい。これらの抗ウイルス薬には、ノイラミニダーゼ阻害薬、例えば（３Ｒ、４Ｒ、５Ｓ）‐４‐アセチルアミノ‐５‐アミノ‐３（１‐エチルプロポキシ）‐１‐シクロヘキサン‐１‐カルボン酸または５‐（アセチルアミノ）‐４‐［（アミノイミノメチル）‐アミノ］‐２，６‐アンヒドロ‐３，４，５‐トリデオキシ‐Ｄ‐グリセロ‐Ｄ‐ガラクトノン‐２‐エノン酸、ならびにこれらのエステル（例、エチルエステル）およびこれらの塩（例、リン酸塩）を含む。好ましい抗ウイルス薬は、リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））としても知られる、（３Ｒ、４Ｒ、５Ｓ）‐４‐アセチルアミノ‐５‐アミノ‐３（１‐エチルプロポキシ）‐１‐シクロヘキサン‐１‐カルボン酸、エチルエステル、リン酸塩（１：１）である。

一般的事項
語句「有する」は、「含む」だけでなく「からなる」も包含し、例えばＸを「有する」組成物はＸのみで構成されていてもよいし、または追加の物質、例えばＸ＋Ｙを含んでよい。

語句「実質的に」は「完全に」を排除するものではなく、例えばＹを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合は、語句「実質的に」は本発明の定義から削除されてよい。

数値ｘに関する語句「約」は、例えばｘ±１０％を意味する。

特別な記載がない限り、２つ以上の成分を混合する手順を有するプロセスは、特定の混合順を必要としない。そのため、成分は任意の順番で混合され得る。３つの成分が存在する場合、２つの成分を互いに混合し、次いでその混合物を３つ目の成分と混合してもよい、等。

動物（特にウシ）性物質が細胞培養に使用される場合、それらは感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）に罹患していない、特に牛海綿状脳症（ＢＳＥ）に罹患していない動物源から入手しなくてはならない。全体として、動物由来の物質が完全に存在しない状態で細胞を培養するのが好ましい。

組成物の一部として化合物が身体に投与される場合、その化合物は適切なプロドラッグで代用されてもよい。

再集合または逆遺伝子の手順に細胞基質が使用される場合、Ｐｈ Ｅｕｒ ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈａｐｔｅｒ ５．２．３に見られるように、ヒトのワクチン製造における使用が承認されているものが好ましい。

各種のインフルエンザワクチンを投与されたマウスにおける、抗ＨＡ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ反応を示す。

赤血球凝集素は鳥インフルエンザのＨ５Ｎ１株から調製され、１用量当たり０．２μｇ（１用量当たり５０μｌ量）で筋肉内注射用に処方された。２つのワクチンが調製され、１つ目はアジュバント未添加のもの、２つ目は１：１の体積比でＭＦ５９乳剤がアジュバントとして添加されたものであった。ワクチンは、８週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス４グループに、０日目と２８日目に投与された。１４日目および４２日目にマウスの血液を採取し、抗ＨＡ免疫反応をＥＬＩＳＡで評価した。

結果は以下の通りであった（図１も参照）：

このように、アジュバントは、初回の免疫化後に反応を示すマウスの数を有意に増加させる（グループＡとＢを比較）。用量のいずれか、または両方にアジュバントを加えると、アジュバント未添加ワクチンの２回投与によって誘発される反応より有意に高い抗ＨＡ特異的抗体反応が誘発された（グループＢ、Ｃ、およびＤをグループＡと比較）。さらに、アジュバント添加ワクチンで準備免疫された動物は、アジュバント未添加ワクチンも打たれ、アジュバント未添加ワクチンで準備免疫し、アジュバント添加ワクチンを打たれるよりも高い力価が得られた（グループＢとＣを比較）。グループＤと比べてグループＢの絶対力価は低かったが、反応は十分過ぎるほどであった。そのため、２回投与レジメンの初回用量にのみアジュバントを使用することで、アジュバントのストックを保つことができる。

本発明は一例として説明されたものに過ぎず、本発明の範囲と精神から逸脱しない範囲で改変が行われてもよいことが理解されるであろう。
本発明の好ましい実施形態によれば、例えば以下の方法などが提供される：
（項目１）
インフルエンザウイルス感染に対して患者を免疫化するための方法であって、該方法は、
（ｉ）インフルエンザウイルスワクチンの用量を、第１のアジュバントとともに投与する工程と、
（ｉｉ）インフルエンザウイルスワクチンのさらなる用量を該アジュバントなしで投与する工程と、
を含む、方法。
（項目２）
前記さらなる用量は初回用量と同じ経路で投与される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記さらなる用量はアジュバント未添加である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記さらなる用量は、前記第１のアジュバントとは異なるアジュバントでアジュバント添加されている、項目１または項目２に記載の方法。
（項目５）
（ｉ）第１のアジュバントと組み合わせた第１のインフルエンザウイルスワクチンと（ｉｉ）そのアジュバントを含まない第２のインフルエンザウイルスワクチンとを含む、キット。
（項目６）
（ｉ）第１のアジュバントと組み合わせた第１のインフルエンザウイルスワクチンと、（ｉｉ）該アジュバントを含まない第２のインフルエンザウイルスの、複数回投与用インフルエンザワクチンの製造における、使用。
（項目７）
インフルエンザウイルス感染に対する患者の免疫化を達成するための方法であって、
該患者は以前に、第１のアジュバントと組み合わせた一定用量のインフルエンザウイルスワクチンを受けており、
該方法は、該アジュバントなしでインフルエンザウイルスワクチンのさらなる用量を該患者に投与する工程を含む、方法。
（項目８）
前記さらなる用量は、以前の用量と同じ経路で投与される、項目７に記載の方法。
（項目９）
インフルエンザウイルス感染に対して患者を免疫化するための薬剤の製造におけるアジュバント未添加インフルエンザウイルスワクチンの使用であって、該患者は以前にアジュバント添加インフルエンザウイルスワクチンを受容している、使用。
（項目１０）
インフルエンザウイルス感染に対して患者を免疫化するための薬剤の製造における、第２のアジュバント添加インフルエンザウイルスワクチンの使用であって、該患者は以前に第１のアジュバント添加インフルエンザウイルスワクチンを受容しており、該第１および第２のインフルエンザウイルス中のアジュバントは同一ではないことを特徴とする、使用。
（項目１１）
前記ワクチンは、１ワクチン当たり、１株当たり１５μｇ未満の赤血球凝集素を含む、項目１〜１０のいずれかに記載の方法、キット、または使用。
（項目１２）
前記インフルエンザウイルスワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９インフルエンザＡウイルスサブタイプ由来のインフルエンザウイルス抗原を含む、項目１〜１１のいずれかに記載の方法、キット、または使用。
（項目１３）
前記第１のアジュバントは、水中油型乳剤を含む、項目１〜１２のいずれかに記載の方法、キット、または使用。

参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）

Claims (10)

1. インフルエンザウイルス感染に対して患者を免疫化するための組み合わせ物であって、該組み合わせ物は、
   スクアレンを含むサブミクロンの水中油型乳剤を含むアジュバントと組み合わせた、不活化インフルエンザウイルスワクチンの第１の用量と、
   アジュバントを含まない不活化インフルエンザウイルスワクチンの第２の用量と、
   を含み、該第１の用量および該第２の用量が、筋肉内注射により投与されることを特徴とし、
   ここで、該不活化インフルエンザウイルスワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９インフルエンザＡウイルスサブタイプ由来の赤血球凝集素を含み、ここで、該不活化インフルエンザウイルスワクチンは、少なくとも１つの共通の赤血球凝集素サブタイプを共有する、組み合わせ物。
2. （ｉ）スクアレンを含むサブミクロンの水中油型乳剤を含むアジュバントと組み合わせた第１の不活化インフルエンザウイルスワクチンと（ｉｉ）アジュバントを含まない第２の不活化インフルエンザウイルスワクチンとを含む、筋肉内注射のためのキットであって、
   ここで、該不活化インフルエンザウイルスワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９インフルエンザＡウイルスサブタイプ由来の赤血球凝集素を含み、ここで、該不活化インフルエンザウイルスワクチンは、少なくとも１つの共通の赤血球凝集素サブタイプを共有する、キット。
3. （ｉ）スクアレンを含むサブミクロンの水中油型乳剤を含むアジュバントと組み合わせた第１の不活化インフルエンザウイルスワクチンと、（ｉｉ）アジュバントを含まない第２の不活化インフルエンザウイルスワクチンの、筋肉内注射のための複数回投与用インフルエンザワクチンの製造における、使用であって、
   ここで、該不活化インフルエンザウイルスワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９インフルエンザＡウイルスサブタイプ由来の赤血球凝集素を含み、ここで、該不活化インフルエンザウイルスワクチンは、少なくとも１つの共通の赤血球凝集素サブタイプを共有する、使用。
4. インフルエンザウイルス感染に対する患者の免疫化を達成するための組成物であって、
   該患者は以前に、スクアレンを含むサブミクロンの水中油型乳剤を含むアジュバントと組み合わせた第１の用量の不活化インフルエンザウイルスワクチンを受けており、
   該組成物は、アジュバントを含まない不活化インフルエンザウイルスワクチンの第２の用量を含み、該第１の用量および該第２の用量が、筋肉内注射により投与されることを特徴とし、
   ここで、該不活化インフルエンザウイルスワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９インフルエンザＡウイルスサブタイプ由来の赤血球凝集素を含み、ここで、該不活化インフルエンザウイルスワクチンは、少なくとも１つの共通の赤血球凝集素サブタイプを共有する、組成物。
5. インフルエンザウイルス感染に対して患者を免疫化するための組成物であって、該組成物は、スクアレンを含むサブミクロンの水中油型乳剤を含むアジュバントと組み合わせた、不活化インフルエンザウイルスワクチンの用量を含み、該患者は、インフルエンザウイルス感染に対する該免疫化を達成するために、アジュバントを含まない不活化インフルエンザウイルスワクチンの第２の用量がさらに投与され、該第１の用量および該第２の用量が、筋肉内注射により投与されることを特徴とし、
   ここで、該不活化インフルエンザウイルスワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９インフルエンザＡウイルスサブタイプ由来の赤血球凝集素を含み、ここで、該不活化インフルエンザウイルスワクチンは、少なくとも１つの共通の赤血球凝集素サブタイプを共有する、組成物。
6. インフルエンザウイルス感染に対して患者を筋肉内注射により免疫化するための薬剤の製造におけるアジュバント未添加の不活化インフルエンザウイルスワクチンの使用であって、該患者は以前に、スクアレンを含むサブミクロンの水中油型乳剤を含むアジュバント添加した不活化インフルエンザウイルスワクチンを受容している、使用であって、
   ここで、該不活化インフルエンザウイルスワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９インフルエンザＡウイルスサブタイプ由来の赤血球凝集素を含み、ここで、該不活化インフルエンザウイルスワクチンは、少なくとも１つの共通の赤血球凝集素サブタイプを共有する、使用。
7. 前記不活化ワクチンは、１ワクチン当たり、１株当たり１５μｇ未満の赤血球凝集素を含む、請求項１に記載の組み合わせ物。
8. 前記不活化ワクチンは、１ワクチン当たり、１株当たり１５μｇ未満の赤血球凝集素を含む、請求項２に記載のキット。
9. 前記不活化ワクチンは、１ワクチン当たり、１株当たり１５μｇ未満の赤血球凝集素を含む、請求項３および６のいずれかに記載の使用。
10. 前記不活化ワクチンは、１ワクチン当たり、１株当たり１５μｇ未満の赤血球凝集素を含む、請求項４〜５のいずれかに記載の組成物。

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