JPH08506592A

JPH08506592A - ３−ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ含有のインフルエンザワクチン組成物

Info

Publication number: JPH08506592A
Application number: JP6518456A
Authority: JP
Inventors: ディロン，スーザン; ニシカワ，ヒロトシ; モンテ，ポール・ダル; ジュリック，ロバート・ジェイ; ギャルソン−ジョンソン，ナタリー・マリー−ジョセフ・クロード
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1993-02-19
Filing date: 1994-02-15
Publication date: 1996-07-16
Also published as: CN1124013A

Abstract

(57)【要約】本発明は選択されたインフルエンザ抗原に対する防御応答の強化能を有するワクチン組成物であって、少なくとも抗原および３Ｄ−ＭＰＬを含有するワクチン組成物を、およびこれらの組成物を用いるインフルエンザに対する免疫応答の強化方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】３−ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ含有のインフルエンザワクチン組成物他の出願に対する相互参照本出願は１９９３年２月１９日に出願した係属中の米国特許出願第０２１５３５号の一部継続出願である。発明の分野本発明はヒトにおけるインフルエンザ感染の予防に有用なワクチンに関する。発明の背景インフルエンザウイルス感染症はヒト、ウマおよびニワトリにおいて急性呼吸器疾患を、場合によっては汎発性的割合で起こす。インフルエンザウイルスはＲＮＡウイルスのオルトミクソウイルス科に属し、したがって、２個の外部糖タンパクスパイク、赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）、および５個の内部タンパク質、核タンパク質、マトリックスタンパク質および３個のポリメラーゼを有する直径８０〜１２０ナノメーターの被殻で包まれたビリオンを有する。インフルエンザウイルスＲＮＡはまた感染細胞において産生されるが、感染ビリオン中に結合しない非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードする。３種のインフルエンザウイルス、Ａ型、Ｂ型およびＣ型がヒトに感染する。Ａ型ウイルスは近代におけるヒト流行病の大部分の原因であるが、Ｂ型感染症の散在的発生もある。公知のブタ、ウマおよびニワトリウイルスもほとんどＡ型であるが、Ｃ型ウイルスもブタから単離されている。ウイルスのうち、表面タンパク質ＨＡおよびＮＡにおける遺伝的変化により、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、およびＨ３Ｎ２で表わされる３種の重要な亜型がある。Ａ型において、亜型Ｈ１（「ブタインフルエンザ」）、Ｈ２（「アジアインフルエンザ」）およびＨ３（「ホンコンインフルエンザ」）がヒト感染症において主要なものである。インフルエンザウイルスは連続してその表面糖タンパク質が遺伝的に変化しており、これが抗原性変化に影響をおよぼす。これは、Ａ型ウイルスにおいてもっともよく現れ、この場合、ＨＡまたはＮＡタンパク質におけるおもな遺伝的変化はすでに起こっている（抗原不連続変異）。これらの新しいウイルス亜型の出現により、伝染病が汎発性的に広がり、その結果著しい死亡率または罹患率となる。例えば、１９５７年以前流行していたＨ１Ｎ１ウイルス亜型は、Ｈ２Ｎ２ウイルス亜型に取って代わられ、これは１９６８年まで優勢であったが、こんどはＨ３Ｎ２亜型に取って代わられた。現在、Ｈ３Ｎ２株が流行しているが、１９７７年からはＨ１Ｎ１ウイルスが再出現した。特定の亜型のＨＡも毎年または１年おきに（抗原連続変異）小さな抗原性変化が起こっている（点変異）。これらはＨＡ１におけるシアル酸結合部位の周りに集まる抗原決定基にほとんど限られており、その結果新しいウイルス株が出現する。この抗原連続変異は抗原不連続変異により引き起こされるような程度まで重大な死亡率を引き起こさないが、毎年のインフルエンザ流行の原因である。インフルエンザワクチンは、３つの型、ホールビリオン、スプリットおよびサブユニットに分類される。ホールビリオンワクチンは、完全なウイルス粒子ベースであって、一般により免疫原性であるが、より反応原性である傾向にあり、したがって種々の化学試薬での処理によりウイルスを破壊した後に得られる精製ウイルス成分から調製されたスプリットおよびサブユニットワクチンに置き代えられている。スプリットおよびサブユニットワクチンの違いは、サブユニットワクチンがほとんど排他的にウイルスの表面抗原である赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含有し、一方スプリットワクチンがさらに種々の量のリボ核タンパクおよびマトリックスタンパクなどのウイルスの内部成分を含有することにある。現在入手可能な市販のインフルエンザワクチンはＨＡまたはＮＡに対する抗体が防御を与えるという原則に基づく。これらは、胚を含有する鶏卵で増殖したウイルスを用いた非アジュバント添加、不活化、ホールまたはスプリットウイルス製品からなる。すべてのインフルエンザワクチンは現在Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＢ型ウイルス株からの調製物を含有する。年々の抗原性の違いにより、特定のウイルス株が、流行しているウイルス株の疫学的監視に基づくＷＨＯの推薦にしたがった年々の基準により更新される。「普遍的」インフルエンザウイルスワクチン、即ち非株特異性ワクチンは存在しない。最近、このような、普遍的、あるいは半普遍的ワクチンを、異なる株の交差により調製した再配列ウイルスから調製する試みがなされてきた。近年、このような試みは、主にＨＡタンパクに焦点を合わせた組み換えＤＮＡ技術を用いる。インフルエンザワクチンは、有効性に関する疑い、副作用のおそれ、毎年再接種する必要性、および供給者の関心の欠如を包含する種々の理由のもとに利用されている。現在のワクチンは、ワクチンにおいて用いられるウイルス株に抗原的に非常に関連したインフルエンザウイルスでの感染に関しておよそ６０〜８０％の範囲の有効性が示されている。この防御効率の割合は流行しているＨＡ株のＨＡ抗原が、ワクチン株から「ドリフト」した場合に減少する傾向にあり、亜型における「シフト」が起こった場合には０になる。さらに、防御は療養院の高齢者などのある種の免疫抵抗性減弱群においては減少するようである。このように、現在入手可能なワクチンの主な欠点は、頻繁な抗原連続変異の結果、成分ウイルス株を毎年変える必要があり、個人は再接種を受けなければならないことである。当業界においては、広範囲におよぶ病原体に関して動物において防御応答を誘起できるワクチン処方物および組成物が必要とされている。発明の要約一態様において、本発明は、インフルエンザに対して予防接種した動物において向上した免疫性および防御応答の剌激能を有するワクチン組成物であって、選択されたインフルエンザ抗原または抗原性ポリペプチドおよび有効量の３−ｏ− 脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）からなる組成物を提供する。別の態様において、本発明は、選択されたインフルエンザ抗原または抗原性ポリペプチド、有効量の３Ｄ−ＭＰＬおよびリポソーム調製物からなるワクチン組成物を提供する。リポソーム調製物は本明細書において定義し、さらに担体として作用するほかに、アジュバントとして作用し、重要な製造および処方利点を提供する。さらに別の態様において、本発明は被接種者の選択されたインフルエンザ抗原に対する免疫応答を向上させる方法を提供する。この方法は、哺乳動物、好ましくはヒトに、前記ワクチン組成物を投与することからなる。本発明の他の態様および利点は以下の好ましい具体例の詳細な記載においてさらに記載する。図面の簡単な記載図１は、実施例１８において記載するようにアルミニウム＋３Ｄ−ＭＰＬ中ＦｌｕＤタンパク質（ＳＫ＆Ｆ１０６１６０）で免疫したマウスにおけるＨ１Ｎ１およびＨ２Ｎ２亜型インフルエンザウイルスに関する交差防御を表わす棒グラフである。図２Ａは、ｆｌｕＤ処方物で予防接種したマウスおよび対照における攻撃前の脾臓増殖応答を表わす棒グラフである。実施例２０参照。図２Ｂは、ｆｌｕＤ処方物で予防接種したマウスおよび対照における攻撃後の脾臓増殖応答を表わす棒グラフである。実施例２０参照。図３Ａは、２０μｇアルミニウム中ｆｌｕＤ（白抜き）またはアルミニウムおよび３Ｄ−ＭＰＬ中ｆｌｕＤ（斜線）で予防接種したマウスの４日目に得られるリンパ節増殖応答を表わす棒グラフである。実施例２１参照。図３Ｂは、５μｇアルミニウム中ｆｌｕＤ（白抜き）またはアルミニウムおよび３Ｄ−ＭＰＬ中ｆｌｕＤ（斜線）で予防接種したマウスの４日目に得られるリンパ節増殖応答を表わす棒グラフである。実施例２１参照。図３Ｃは、１μｇアルミニウム中ｆｌｕＤ（白抜き）またはアルミニウムおよび３Ｄ−ＭＰＬ中ｆｌｕＤ（斜線）で予防接種したマウスの４日目に得られるリンパ節増殖応答を表わす棒グラフである。実施例２１参照。図４Ａは、１μｇのＤタンパクワクチン処方物で免疫したマウスにおける免疫リンパ節による第２日目の増殖を表わす棒グラフである。実施例２１参照。図４Ｂは、１μｇのＤタンパクワクチン処方物で免疫したマウスにおける免疫リンパ節による第３日目の増殖を表わす棒グラフである。実施例２１参照。図４Ｃは、１μｇのＤタンパクワクチン処方物で免疫したマウスにおける免疫リンパ節による第４日目の増殖を表わす棒グラフである。実施例２１参照。図４Ｄは、１μｇのＤタンパクワクチン処方物で免疫したマウスにおける免疫リンパ節による第２日目のＩＬ−２産生を表わす棒グラフである。実施例２１参照。図４Ｅは、１μｇのＤタンパクワクチン処方物で免疫したマウスにおける免疫リンパ節による第３日目のＩＬ−２産生を表わす棒グラフである。実施例２１参照。図４Ｆは、１μｇのＤタンパクワクチン処方物で免疫したマウスにおける免疫リンパ節による第４日目のＩＬ−２産生を表わす棒グラフである。実施例２１参照。図５Ａは、以下の実施例２４に記載したように免疫したマウスからの抗原−刺激培養物中のインターフェロンレベルを表わすグラフである。図５Ｂは、以下の実施例２４に記載したように免疫したマウスからの抗原−刺激培養物中のＩＬ−２レベルを表わすグラフである。実施例２１参照。図６Ａは、アラム（alum）および３Ｄ−ＭＰＬを含有する対照（−−□−−）、アジュバントを含まないＡ／ＰＲ／８株を含有するインフルエンザ１価スプリットワクチン（−−▲−−）、および３Ｄ−ＭＰＬをアジュバントとして添加したＡ／ＰＲ／８株（−−●−−）について攻撃後１、３、５、７および９日のＭＤＣＫミクロアッセイ（１群５匹のマウス）による鼻において測定されたウイルス力価を表わすグラフである。実施例２８参照。図６Ｂは、アラムおよび３Ｄ−ＭＰＬを含有する対照（−−□−−）、アジュバントを含まないシンガポール株を含有するインフルエンザ１価スプリットワクチン（−−▲−−）、および３Ｄ−ＭＰＬをアジュバントとして添加したシンガポール株（−−●−−）に関する攻撃後１、３、５、７および９日のＭＤＣＫミクロアッセイ（１群５匹のマウス）による鼻において測定されたウイルス力価を表わすグラフである。実施例２８参照。図６Ｃは、図６Ａと同様の３つのワクチン処方物に関する攻撃後１、３、５、７および９日のＭＤＣＫミクロアッセイ（１群５匹のマウス）による気管において測定されたウイルス力価を表わすグラフである。図６Ｄは、図６Ｂと同様の３つのワクチン処方物に関する攻撃後１、３、５、７および９日のＭＤＣＫミクロアッセイ（１群５匹のマウス）による気管において測定されたウイルス力価を表わすグラフである。図６Ｅは、図６Ａと同様の３つのワクチン処方物に関する攻撃後１、３、５、７および９日のＭＤＣＫミクロアッセイ（１群５匹のマウス）による肺において測定されたウイルス力価を表わすグラフである。図６Ｆは、図６Ｂと同様の３つのワクチン処方物に関する攻撃後１、３、５、７および９日のＭＤＣＫミクロアッセイ（１群５匹のマウス）による肺において測定されたウイルス力価を表わすグラフである。発明の詳細な記載本発明は、ヒトを含む予防接種した宿主において、向上した免疫応答を惹起できるワクチン組成物、ならびにこのようなワクチン組成物の製法および使用法を提供する。本発明のワクチン組成物は、有効量の選択されたインフルエンザ抗原または抗原性ポリペプチドおよび３−ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）を含有することを特徴とする。所望により、リポソーム調製物もまた、本発明のワクチン組成物の一成分とすることができる。本発明者らは、３Ｄ−ＭＰＬおよびある種のインフルエンザ抗原の組合せが、インフルエンザ抗原単独では達成できないインフルエンザに対する防御応答を達成するのに有効であることを見いだした。例えば、以下に記載するＦｌｕＤとして公知の抗原性ポリペプチドに関して、この応答は、精製ＦｌｕＤおよび動物に対して毒性である公知の強力なアジュバントである完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）で達成されるのと同じ結果を得るのにより少量の抗原を必要とするものである。さらに、選択された抗原および３Ｄ−ＭＰＬを本明細書に記載したようにリポソーム中に取り込んだ場合、抗原および他のアジュバントの組合せにより達成されるものを越える防御応答が得られる。本明細書において用いる「向上した免疫応答」なる語により、予防接種した宿主が本発明のワクチン組成物に対して、アジュバントを添加ていない場合、または内部投与に適した他の通常のアジュバントを添加た場合、選択された抗原に対する応答において宿主により産生されるより強力な細胞免疫応答（防御Ｔリンパ球産生）を産生することを意味する。増加した抗体（Ｂ細胞）応答もこの向上した応答により期待できる。本明細書において用いる「免疫学的有効量」または「有効量」なる語は、防御免疫応答を誘起する抗原の量を意味する。本明細書において用いる「選択された抗原」、「抗原性ポリペプチドまたはタンパク質」または「免疫原」なる語は完全または不活化病原体、病原体からの免疫原性タンパク質、ペプチドまたはフラグメントであって、所望により同種または異種起源の他のペプチドまたはタンパク質と融合していてもよいものを意味する。これらの用語は以下に定義するスプリットウイルスも包含する。これらの用語は、病原体からの非タンパク性生物学的物質も包含する。病原体は好ましくはヒトに感染する病気を引き起こす生物であるが、獣医学的目的に望ましい場合には動物の病原体もこれらのワクチンに採用することができる。これらの用語は、全病原体、スプリットウイルス、ペプチドまたは融合タンパクの、予防接種した宿主における防御免疫応答を惹起できる能力を意味する。「１価ワクチン」なる語は、単一の、例えばＡ型、Ｂ型およびＣ型のＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２のインフルエンザウイルスの型または亜型からの抗原を含有するワクチンを意味する。「多価ワクチン」なる語は、１種以上の型または亜型のインフルエンザウイルスからの抗原を含有するワクチンを意味し、即ち、３価ワクチンは、例えばＡ型、Ｂ型およびＣ型のＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２の３つのインフルエンザの型または亜型からの抗原を含有してもよい。「スプリットウイルス」なる語は、部分的に精製および濃縮されたシードロット物質を接種した胚含有鶏卵から得られたインフルエンザウイルス懸濁液を意味する。濃縮されたウイルス懸濁液を界面活性剤、例えばデオキシコール酸ナトリウムで処理して、ウイルス粒子を破壊する。この分離プロセス中にウイルスリン脂質を除去することにより、反応原性ポテンシャルを大きく減少させる不活化インフルエンザ抗原が産生される。スプリットウイルス懸濁液は界面活性剤およびホルムアルデヒドの効果により完全に不活化される。以下の本発明の組成物および方法の開示により、インフルエンザウイルスに対する予防的用途に用いるワクチン組成物を記載する。本発明の好ましい一具体例において、インフルエンザウイルスでの感染に対して向上した免疫防御応答の惹起能を有するワクチン組成物は、少なくとも、３Ｄ −ＭＰＬをアジュバントとして用いた、選択されたインフルエンザ抗原性ポリペプチド、例えばＮＳ１_1-81ＨＡ２_65-222（本明細書において、ＦｌｕＤ、Ｄタンパク質またはＦｌｕＤタンパク質と称する）を含有する。現在、ｆｌｕＤタンパク質は、赤血球凝集素領域のＨＡ２タンパク質の完全カルボキシ末端領域を含有するインフルエンザ融合タンパク質のもっとも容易に精製されたものであるので、本発明のワクチン組成物において用いるのに好ましいインフルエンザ抗原性ポリペプチドの１つである。Ｄタンパク質は切断されたＨＡ２サブユニット（アミノ酸６５〜２２２）のアミノ酸６５と融合したＮＳ１の最初の８１個のアミノ酸を含む。所望により、本明細書において開示する他のＮＳ１−ＨＡ２融合タンパク質の場合、リンカー配列を２個の融合配列間に挿入してもよい。現在好ましい具体例において、ｆｌｕＤタンパク質についてのＤＮＡコーディング配列は、ＥＰ０３６６２３８号に記載されているように、ＨＡ２コーディング配列をＰｖｕＩＩで制限し、ＮＳ１コーディング配列における８１および８２アミノ酸間にＮｃｏＩ部位のＣ末端領域を合成オリゴヌクレオチドリンカーにより結紮することにより調製する。このリンカー配列は、グルタミン−イソロイシン−プロリンをコードする。９０〜９５％の純度が達成されているＤタンパク質に関しては、宿主細胞（E.coli）タンパク質および他の汚染物質を実質的に除去するためには本明細書において記載する製法を適用することが必要である。ｆｌｕＤタンパク質およびその組み換え発現および精製は、係属中の米国特許出願第０７／７５１８９９号およびその対応する欧州特許出願第３６６２３８号（１９９０年５月２日公開）および米国特許出願第０７／３８７５５８号および欧州特許出願第３６６２３９号（１９９０年５月２日公開）に詳細に開示されている。これらの出願を出典明示により本明細書の一部とし、本発明のタンパク質について記載の目的、その発現および精製を達成する。ｆｌｕＤに加えて、欧州特許出願第３６６２３８号およびＥＰ第３６６２３９号（共に１９９０年５月２日公開）および係属中の米国特許出願第０７／７５１８９８号、０７／７５１８９６号および０７／８３７７７３号に記載されているものを含む、他の適当なインフルエンザ抗原性ポリペプチドを、本発明のワクチン組成物に用いてもよい。このようなタンパク質は、△Ｍ、△Ｍ＋、Ａ、Ｃ、Ｃ１３、Ｃ１３ショートおよび△Ｄを包含する。他の適当なものとしてはシス− レスＤ、ＨＡ２６６−２２２およびＮＳ１Ｈ３Ａ２構築物、例えば係属中の米国特許出願第０７／７５１８９８号、０７／７５１８９６号、および０７／８３７７７３号およびＷＯ９３／１５７６３号（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されているものを包含する。特に、前記引例のＨ３ＨＡ２構築物が望ましい。本発明者らの最近の研究はＮＳ１−Ｈ１ＨＡ２およびＮＳ１−Ｈ３ＨＡ２融合タンパクの両方を含有する「カクテル」で免疫したマウスは、Ｈ１およびＨ３−ウイルス亜型の両方での致死攻撃から防御されることが明らかにされた。ＨＡ２、ＮＳ１およびインフルエンザウイルスの他のウイルスタンパク質のコーディング配列は合成的に調製することができるか、または公知の技術によりウイルスＲＮＡ、または前記引例の公開欧州出願に記載されているような入手可能なｃＤＮＡ含有プラスミドから誘導できる。例えば、前記文献のほかに、Ａ／日本／３０５／５７株からのＨＡのＤＮＡコーディング配列は、クローンされ、配列決定され、ゲシング（Gething）ら、ネイチャー（Nature），２８７：３０１ −３０６（１９８０）により報告されている；Ａ／ＮＴ／６０／６８株のＨＡコーディング配列は、スレイ（S1eigh）らおよびボス（Both）ら、共にデベロプメンツ・イン・セル・バイオロジー（Developments in Cell Biology），Elsevier Science Publishing Co.，ｐ６９−７９および８１−８９（１９８０）により報告されている様にクローンされている；Ａ／ＷＳＮ／３３株のＨＡコーディング配列は、デイビス（Davis）ら、ジーン（Gene），１０：２０５−２１８（１９８０）；およびヒチ（Hiti）ら、バイアロジー（Viroloogy），１１１：１１３ −１２４（１９８１）により報告されている様にクローンされている。ニワトリペストウイルスのＨＡコーディング配列は、ポーター（Porter）らおよびエンテージ（Emtage）ら、共にデベロプメンツ・イン・セル・バイオロジー（Developm ents in Cell Biology）、前掲、ｐ３９−４９および１５７−１６８）により報告されている様にクローンされている。例えば、イー・コリ（E.coli）、バシラス（Bacillus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）、哺乳動物および昆虫細胞を包含する種々の微生物および細胞においてワクチンポリペプチドをクローンおよび発現する系は公知であり、私立および公立研究所および受託所ならびに商業的販売者から入手できる。Ｄタンパク質は以下の実施例１３に記載するプロセスにより精製できる。種々の通常の方法を本発明の組成物のタンパク質の精製に関連して採用できるが、このような他の方法は、高度に精製された医薬グレードの製品を得るのにかならずしも必要ではない。このような方法は、前記プロセス中、その前または後に採用できる。このような任意の工程の一つとして、透析濾過があり、これは多くの緩衝液交換を行うのに非常に有効な連続的透析の形態である。透析濾過は好ましくはセルロース膜または限外フィルターを通して行う。適当な膜／フィルターは、約１０００分子量（ＭＷ）カットオフを有するものから、直径２.４μｍまでの孔径を有するものまでである。１０Ｋアミコン二元螺旋系カートリッジシステム（Amicon dual spiral cartridge system）などの透析濾過に適用可能な多くの異なる系が市販されている。本発明のプロセスにおいて、本発明のワクチン組成物に用いられるポリペプチドの精製およびその後の濃縮において２０ｍＭ Tris 緩衝液（約ｐＨ８）を用いた透析濾過が有効に採用できる。別の好ましい具体例において、本発明のワクチン組成物において用いる抗原は、完全不活化病原体、例えば実施例２５において詳細に記載するスプリットウイルスである。１個のスプリットウイルスを含有する１価スプリットインフルエンザワクチンまたは１個以上のスプリットウイルスを含有する多価（例えば３価）スプリットインフルエンザワクチンに３Ｄ−ＭＰＬをアジュバントとして添加してもよい。一処方物において、ワクチンは、近年、通常のインフルエンザワクチンに用いられているシンガポール／６／８６［ドイツ、ドレスデン、Sachsisches Serumwerkl GmbH（ＳＳＷ）および英国、ロンドン、the National Institute fo r Biological Standards and Control（ＮＩＢＳＣ）］のようなＨ１Ｎ１株から調製したスプリットウイルスを含有する。別法として、他のＨ１Ｎ１スプリットウイルスをティー・フランシス、プロシーディングズ・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・エクスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メジシン（T.Francis, Proc.Soc.Exp.Biol.Med.），３２：１１７２（１９３５）に記載され、米国、メリーランド洲、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ American Type Culture Collection）からＡＴＣＣＮｏ.ＶＲ−９５で入手可能なＡ／ＰＲ／８／３４（Ａ／ＰＲ／８とも称する）より調製してもよい。１価ワクチンはインフルエンザ型ウイルスの１株由来の抗原を含有する。また、ワクチンは、１種以上のインフルエンザ型ウイルスに対する反応性を増加させるために多価で、１種以上のインフルエンザ抗原、例えば２または３個のスプリットウイルスを含有してもよい。３価ワクチンの一例は、例えばＨ１Ｎ１シンガポール／６／８６株、Ｈ３Ｎ２株ペキン／３２／９２［ドイツ、ドレスデン、ＳＳＷ］およびＢ型株、パナマ／４５／９０［ドイツ、ドレスデン、ＳＳＷ］を包含する。実施例２５に記載したように公知の手段によりスプリットウイルスとして調製できるインフルエンザウイルスは、あらゆる株、亜型および型、特にＷＨＯにより推薦されるものを包含し、これらの多くは臨床的試料および公立受託所、例えば米国、メリーランド州、ロックビル、パークラウン・ドライブ１２３０１番、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Coll ection）（ＡＴＣＣ）およびＮＩＢＳＣから入手できる。例えば、他の適当なＨ３Ｎ２ウイルス株は、制限されるものではなく、フィアズ（Fiers）ら、セル（Cell），１９：６８３−６９６（１９８０）に記載されているＡ／ビクトリア／Ｈ３／７５；シー・ジェイ・レイ（C.J.Lai）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.），ＵＳＡ，７７：２１０−２１４（１９８０）；パリーズおよびシュルマン（Pale seおよびSchulman）、バイアロジー（Virol.），５７：２２７−２３７（１９７４）に記載されているＡ／ウドーン（Udorn）；ＷＨＯウィークリー・エピド・レコード（ＷＨＯ Weekly Epid.Record）ｖｏｌ.４３：４０１（１９６８）に記載され、ＡＴＣＣからＮｏ.ＶＲ−５４４で入手可能なＡ／ＨＫ／８／６８ならびにペキン／３２／９２を包含する。他の適当なＢ型株は、制限されるものではなく、クリスタル（Krystal）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.），ＵＳＡ，７９：４８０４−４９００（１９８２）に記載されているＢ／リー／４０およびＡＴＣＣからＮo.ＶＲ−２９５として入手可能なＢ／タイワン、パナマ／４５／９０、およびＢ／ヤマガタ（Yamaghta）株を包含する。Ｈ２Ｎ２ウイルスもこれらのワクチンにおいて有用である。他のインフルエンザウイルスまたは不活化ウイルス調製物に加えて、他の病原体由来の他の抗原性物質を、本明細書に記載の技法にしたがって、例示した抗原に加えて用いることが期待できる。本発明のワクチン組成物の他の成分は、アジュバント、３Ｄ−ＭＰＬである。３Ｄ−ＭＰＬは出典明示により本明細書の一部とした米国特許第４,９１２,０９４号に記載されており、モンタナ州、ハミルトンのＲＩＢＩ Immunochem Resea rch Inc.より市販されている。簡単には、３Ｄ−ＭＰＬは内毒素、モノ−ホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）などのグラム陰性菌のヘプトース欠失ＲＥ変異株の誘導体から単離された脂質Ａ類似体である。ＭＰＬはグルコサミンのＣ−１位にリン酸基がない。グルコサミンの３位のアシル鎖を除去するためのＭＰＬ分子の処理により３Ｄ−ＭＰＬが得られる。３Ｄ−ＭＰＬは、他の腸内細菌のリポ多糖と対照的に非毒性であるが、親内毒素の抗原性活性を保持する。この分子はグラム−陰性敗血症および内毒素血症の予防において有用である。３Ｄ−ＭＰＬを水中に溶解して脂質二層膜からなると考えられる小胞凝集物の溶液を得ることができる。このように、３Ｄ−ＭＰＬは免疫系により個々の分子としてみられることはないが、細胞表面および小胞表面を含む膜−膜接触により相互作用するようである。好ましい具体例において、ＭＰＬの粒度は「小さく」、一般に、１２０ｎｍを越えない。一般に１２０ｎｍを越えない小さな粒度の３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａを得るためには、ＧＢ２２２０２１１号に記載された方法を用い（あるいはより大きな粒子の市販のＭＰＬをRibi Immunochem.から購入してもよい）、ついで懸濁液が透明になるまで生成物を超音波処理する。粒子の大きさは、以下に記載するような動的光散乱を用いて評価する。好ましくは、粒子の大きさは６０〜１２０ｎｍの範囲である。もっとも有利には、粒子の大きさは１００ｎｍ未満である。本発明にしたがって、本発明者らは、インフルエンザ抗原性ポリペプチド、例えばｆｌｕＤタンパクが、高度に精製された場合、アジュバントの非存在下で免疫原性でも防御的でもないことを証明した。しかし、本明細書で記載し、以下の実施例１４〜２４に例示するように３Ｄ−ＭＰＬでアジュバント処理した場合、タンパク質はインフルエンザ感染に対して防御を誘起することができる。選択された抗原が１価または３価組成物のスプリットウイルスである場合、本発明の組成物は免疫原性および交差反応性において増加を示す。さらに本発明者らはインフルエンザ抗原性ポリペプチド、例えばｆｌｕＤタンパク質に３Ｄ−ＭＰＬをアジュバントとして添加した場合、アルミニウムアジュバントのみをタンパク質のアジュントとした場合と同程度の免疫応答を得るのに要するｆｌｕＤタンパク質量が少なくてすむことを見いだした。選択された抗原が１価または３価組成物におけるスプリットインフルエンザウイルスである場合、組成物の反応原性は本発明の具体例において用いる抗原が少ないほど減少すると考えられる。また、別のアジュバントを本発明のワクチン組成物中に配合してもよい。一の望ましい別のアジュバントは、アルム、または水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムがある。ｆｌｕＤタンパク質をアルミニウムおよび３Ｄ−ＭＰＬの組合せでアジュバントに付した場合、効力のレベルはＴ細胞応答を支持する伝統的アジュバントであるが、ヒトに内部投与するには適当でない完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）と同程度になると見られる。抗原性ポリペプチド、例えばｆｌｕＤタンパク質および３Ｄ−ＭＰＬを含有する本発明の好ましい組成物を調製するためには、望ましい量のｆｌｕＤタンパク質を以下により詳細に記載するように適当量の３Ｄ−ＭＰＬと混合する。所望により、凍結乾燥脂質Ａを抗原より先に以下に詳細に記載するプレリポソームゲルと混合する。もっとも好ましくは、ホスファチドの脂質Ａに対するモル比は６６：１である。しかし、薬剤の濃度は所望のレベルに対して変化する。ワクチン組成物に添加する他の適当な試薬は、例えば、ＩＬ−２、ＱＳ２１［シー・アール・ケンシル（C.R.Kensil）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（ J.Immunol.），１４６（２）：４３１−４３７（１９９１）］およびムラミルジペプチド（ＭＤＰ）を包含する。加えて、前記の他の水溶性または不溶性化合物または薬剤および／またはアジュバントを本発明のワクチン組成物中に配合できる。例えば、ムラミルジペプチドも前記と同様の比で、または所望により用いることができる。本発明のワクチンを形成する他の薬剤としては、被接種者に投与した場合に１またはそれ以上のその機能が変化するもの、例えば薬局方に記載されているもの、または感染の治療または予防に用いられる物質がある。本発明のワクチン組成物はさらにワクチン業界で周知の適当な担体を含有してもよく、これは容易に選択できる。例示的担体は、滅菌セイライン、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、スクアレンおよび水を包含する。加えて、担体または希釈剤は遅延物質、例えばグリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラート単独またはワックスと組合せて含んでもよい。所望により、適当な化学的安定化剤を用いて医薬調製物の安定性を向上させてもよい。適当な化学的安定化剤は当業界で公知のものであり、例えば、クエン酸および他のｐＨを調節する試薬、キレート化剤または金属イオン封鎖剤、および酸化防止剤を包含する。また、リポソーム送達系がワクチン組成物の一部である場合、担体は必要ではない。本発明の他の好ましいワクチン組成物は、選択された抗原、例えば、前記のｆｌｕＤタンパク質、および３Ｄ−ＭＰＬからなり、該成分はリポソーム調製物中に封入または挿入される。所望により、リポソーム、ｆｌｕＤタンパク質、および３Ｄ−ＭＰＬを含有するワクチン組成物はまた１またはそれ以上の他のインフルエンザ抗原または他の抗原または前記のような所望のアジュバントおよび試薬を含有してもよい。好ましい１処方において、ワクチンは担体リポソーム中の抗原性ポリペプチド゛ＦｌｕＤタンパク質および３Ｄ−ＭＰＬを含有する。別の処方において、ワクチンは同様に担体リポソームで包まれた１価または３価インフルエンザ抗原を含有する。本発明者らは、本明細書に記載したリポソーム調製物が、担体としてだけでなくアジュバントとしても機能し、非常に有利であることを見いだした。これらの調製には有機溶剤または高剪断場が必要でなくなるからで、これはタンパク薬剤にとって大きな利点であり、リポソームの全成分は内部投与に関して安全であると考えられる。調製法の簡便性および汎用性の為に、これらのリポソーム調製物は大規模の製造に適している。本発明者らは、また、３Ｄ−ＭＰＬがインフルエンザ抗原と組合せて本明細書において記載するリポソーム構造物中に容易に配合でき、インフルエンザ抗原を公知の通常のアジュバントと組合せた場合よりも優れた結果を得ることができることも見いだした。特に、３Ｄ−ＭＰＬ中Ｄタンパク質およびリポソーム処方を含有するワクチン組成物はＣＦＡ中Ｄタンパク質よりも優れた効力を有する。例えば、以下の実施例２０および２２参照のこと。本発明のワクチン組成物および方法において有用なリポソーム調製物は、係属中米国特許出願第０７／７１４９８４号（ＵＳ５２３０８９９号）に記載され、これを出典明示により本明細書の一部とする。一般に、「リポソーム」なる語は、合成オリゴラメラ脂質小胞を記述するのに科学文献で用いられる用語として提案され、容認されてきた用語である。このような小胞は通常内部水性相を囲む１またはそれ以上の同心性天然または合成脂質二層を含む。本明細書中に詳細に定義されているように、また引例にしたがうと、本発明のワクチン組成物において有用なリポソーム調製物は、長鎖脂肪族または芳香族を基礎とする酸またはアミンを含むリポソーム形成物質；前記酸またはアミンと反対の電荷の水和剤であって、該酸またはアミンに対して１：２０から１：０.０５のモル比で存在するもの；および固体に対して３００モルまでの量の水を含む組成物をリポソームを調製するのに適当な方法で水性媒体中に分散することにより調製する。本発明において有用なリポソームアジュバント担体の調製は以下のとおりである。リポソーム形成物質の例は、ケン化性おび非ケン化性脂質、例えばアシルグリセロール、ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、糖脂質などを包含する。脂肪酸は、飽和または不飽和アルキル（Ｃ₈〜Ｃ₂₄）カルボン酸、Ｃ₄〜Ｃ₁₀ジカルボン酸のモノアルキル（Ｃ₈〜Ｃ₂₇）エステル（例えば、コレステロールヘミコハク酸およびアミノ酸の脂肪酸誘導体で、Ｎ−アシルカルボン酸も含むもの（例えば、Ｎ−オレイルトレオニン、Ｎ−リノレオイルセリンなど））を包含する。モノ−またはジ−アルキル（Ｃ₈〜Ｃ₂₄）スルホン酸エステルおよびモノ−またはジ−アルキル（Ｃ₈〜Ｃ₂₄）リン酸エステルは脂肪酸と置換できる。さらに、リン酸のモノ−またはジ−アシル（Ｃ₈〜Ｃ₂₄）グリセロール誘導体および硫酸のモノ−またはジ−アシル（Ｃ₈〜Ｃ₂₄）グリセロール誘導体を脂肪酸の代わりに用いることができる。さらに、脂肪酸はまた、アミン（例えば、Ｃ₈〜Ｃ₂₄ＮＨ₂）、アミンのＣ₈〜Ｃ₂₄脂肪酸誘導体（例えば、Ｃ₈〜Ｃ₂₄ＣＯＮＨ〜ＮＨ₂）、アミノ酸のＣ₈〜Ｃ₂ ₄ 脂肪アルコール誘導体（例えば、Ｃ₈〜Ｃ₂₄ＯＯＣ〜ＮＨ₂）、およびアミンのＣ₈〜Ｃ₂₄脂肪酸エステル（例えば、Ｃ₈〜Ｃ₂₄ＣＯＯ〜ＮＨ₂）と置換できる。光重合可能な脂質および／または脂肪酸（またはアミン）（例えば、ジアセチレン脂肪酸）も含まれ、これにより、重合の光開始により交差結合した膜二分子層でシールされたリポソームが得られる。長鎖脂肪族および／または芳香族を基礎とする酸またはアミンは、開鎖構造を有し、パラフィン、オレフィンおよびアセチレン炭化水素およびその誘導体からなる酸またはアミンを包含する。即ち飽和および不飽和炭化水素またはこのような鎖の骨格は芳香族置換基を含有する。このような酸およびアミンは１またはそれ以上のこのような官能基を有する。「長鎖」なる語は酸またはアミンの脂肪鎖の骨格が１０またはそれ以上の炭素原子を有することを意味する。鎖が芳香族基、例えばフェニルを含有する場合、該鎖は該芳香族基と結合した少なくとも５個の炭素骨格を含む。骨格を含む炭素原子鎖は飽和または不飽和脂肪族または芳香族官能基でいろいろに置換されてもよい。「酸」または「アミン」なる語は、慣用的に定義された化学官能基である。例えば、酸基はカルボン酸、またはリンまたはイオウ由来の酸基、例えば燐酸塩、亜燐酸塩、またはピロ燐酸塩または硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、または同様に構築されたリンまたはイオウベースの酸である。アミンはイオン化可能な水素を有するかまたは所望の水和錯体形成能を有するようなイオン化定数を有する第４級塩形成能を有するように十分な塩基性でなければならない。ワクチン組成物中で用いられるように、またリポソーム組成物中で用いられる水の量に対して、「固体」なる語は、封入されるリポソーム形成物質および酸またはアミン成分、水和剤、３Ｄ−ＭＰＬ、アルム、および選択された抗原性物質を意味する。本発明の目的に関して、水和剤は、少なくとも２個のイオン化可能な基（好ましくは反対の電荷を有し、そのうちの一つが容易に解離するイオン塩を形成でき、この塩はリポソーム形成物質中の酸またはアミンのイオン性官能基と錯体を形成する）を有する化合物を意味する。水和剤はそれ自体リポソームを形成しない。このような試薬は、また生理学的に許容できる。即ち、本発明の使用にしたがって投与される宿主に不都合なまたは有害な生理学的影響を与えない。好ましい水和剤は、イオン化可能なオメガ置換基、例えばカルボン酸塩、アミノ、およびグアニジノ基を有するアルファアミノ酸および式：Ｘ−(ＣＨ₂)n−ＹＩ［式中、ＸはＨ₂Ｎ−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ−、Ｈ₂Ｎ−、ＺＯ₃Ｓ−、Ｚ₂Ｏ₃Ｐ−またはＺＯ₂ Ｃ−であり（ここに、ＺはＨまたは無機または有機カチオンである）；Ｙは−ＣＨ(ＮＨ₂)−ＣＯ₂Ｈ、−ＮＨ₂、−ＮＨ−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ₂−ＣＯＯＨ、ＣＨ(ＮＨ₂)ＳＯ₃ＺまたはＺＨ(ＮＨ₂)ＰＯ₃Ｚ₂であり（ここに、Ｚは前記定義のとおりである）；ｎは１〜１０の整数を意味する］で示される化合物またはその医薬上許容される塩である。好ましい化合物に含まれるものとしては、Ｎ，Ｎ’−ジアルキル置換アルギニン化合物およびアルキル鎖の長さが違う同様の化合物がある。より好ましい水和剤は、オメガ置換、アルファアミノ酸、例えばアルギニン、そのＮ−アシル誘導体、ホモアルギニン、ガンマ−アミノ酪酸、アスパラギン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、アスパラギン酸または以下の式で表わされる化合物：Ｈ₂ＮＣ(ＮＨ)−ＮＨ−(ＣＨ₂)n−ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＯＯＨ II Ｈ₂Ｎ−(ＣＨ₂)n-ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＯＯＨ III Ｈ₂Ｎ−(ＣＨ₂)n−ＮＨ₂ IV Ｈ₂ＮＣ(ＮＨ)−ＮＨ−(ＣＨ₂)n−ＮＨ−ＣＨ(ＮＨ)−ＮＨ₂ ＶＨＯＯＣ−(ＣＨ₂)n−ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＯＯＨ VI ＨＯＯＣ−(ＣＨ₂)n−ＣＯＯＨ VII ＨＯ₃Ｓ−(ＣＨ₂)n−ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＯＯＨ VIII Ｈ₂Ｏ₃Ｓ−(ＣＨ₂)n−ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＯＯＨ IX ＨＯ₃Ｓ−(ＣＨ₂)n−ＣＨ(ＮＨ₂)ＳＯ₃ＨＸＨ₂Ｏ₃Ｓ−(ＣＨ₂)n−ＣＨ(ＮＨ₂)ＰＯ₃Ｈ₂ XI （ｎは２〜４）である。最も好ましい化合物は、アルギニン、ホモアルギニン、ガンマ−アミノ酪酸、リジン、オルニチン、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。本発明の水和剤は、単独または混合物として用いることができる。これらの水和物質の混合物の使用においてはなんら制限はない。本発明の水和剤は、多くの化学工程便覧に列挙されており、このような通常の製法で製造できるか、または当業界で公知の手段により製造できる。アルギニン、ホモアルギニン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、および他の天然に存在するアミノ酸は、タンパク質の加水分解および個々のアミノ酸の分離、または細菌源から得られる。式IIの化合物は、アイゼル・ケイ（Eise1e,K.）らの、ジャスタスリービッグス・アン・ケム（Justusliebigs.Ann.Chem.），Ｐ.２０３３（１９７５）により調製できる。これらの化合物の代表的数例に関するさらに詳細な情報は、以下の各ケミカルアブストラクトサービス番号から入手可能である：ノンアルギニン、ＣＡＳ＃１４１９１−９０−３；アルギニン、ＣＡＳ＃７４−７９−３；およびホモアルギニン、ＣＡＳ＃１５１−８６−５。式IIIの化合物の代表例に関しては、２，４−ジアミノブトン酸ＣＡＳ＃３０５−６２−４；リジンに関してはＣＡＳ＃５６−８７−１参照。式IVの代表的化合物の調製法は、ケミカルアブストラクトから以下のように入手可能である：エタンジアミン、ＣＡＳ＃３０５−６２−４；プロパンジアミン−５４６１８−９４−９；１，４−ジアミノブタン、ＣＡＳ＃５２１６５−５７−８。特に、ジョンソン、ティー・ビー（Johnson, T.B.）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J.Am.Che m.Soc.），３８：１８５４（１９１６）参照のこと。式VIの化合物のうち、グルタミン酸は当業界で周知であり、多くの商業的供給源から入手可能である。他の代表的化合物の調製に関する記載は文献にある。例えば、２−アミノヘキサンジオン酸−ＣＡＳ＃６２７８７−４９−９；および２ −アミノヘプタンジオン酸−ＣＡＳ＃３２２２４−５１−０。ｎが２である式VI Iの化合物であるグルタミン酸は当業界で周知であり、マリエルおよびテューレイ（MaryelおよびTuley）、オーガニック・シンセシス（0rg.Syn.），５：６９（１９２５））の方法により調製できる。このグループの他の代表的化合物は以下のＣＡＳ番号で照会できる技術にしたがって調製できる：ヘキサジオン酸、ＣＡＳ＃１２３−０４−９およびヘプタジオン酸、ＣＡＳ＃１１１−１６−０。ホモシステン酸は当業界で公知であり、ＣＡＳ番号５６８９２−０３−６で照会される。化合物３−スルホバリンはＣＡＳ＃２３４０５−３４−２で照会される文献において記載されている。水和剤、リポソーム形成物質および種々の量の水の混合物により、ゲル状塊が形成される。このゲル形態において、水和剤および酸またはアミンは、すべてのリポソーム形成物質とともに、高度に配向した液晶である「水和錯体」に配列する。水和錯体とは、水和剤およびリポソーム形成物質中の酸またははアミン間に形成される錯体を意味する。この意味での錯体形成は、１つの官能基がリポソーム形成物質のイオン性官能基と会合し、他の官能基が得られた錯体に水溶性を付与する親水性を有する解離可能なイオン塩を意味する。水和錯体の液晶構造はｐＨおよび水和剤の量により変わるが、液晶構造は保持される。ＮＭＲ分光分析により、この結晶構造が、互いに交互に積み重なったマルチラメラ脂質二分子層および親水性層であることが確認される。³¹Ｐ−ＮＭＲスペクトルは異方性ピークを示し、これはマルチラメラ二分子層の存在を確認するものである。これらのリポソームの主要成分は脂質、リン脂質、他の脂肪酸であるが、リポソームの透過性を修飾するために種々の他の成分、例えば、非イオン性脂質成分、例えばポリオキシアルコール化合物、ポリグリセラル化合物またはポリオールのエステル、ポリオキシアルコリノール化アルコール；ポリオールのエステルおよび合成リポ脂質、例えばセレブロシドを添加してもよい。他の物質、例えば長鎖アルコールおよびジオール、ステロール、長鎖アミンおよびその４級アンモニウム誘導体；ポリオキシエチレン化脂肪アミン、長鎖アミノアルコールのエステルおよびその塩および４級アンモニウム誘導体；脂肪アルコールのリン酸エステル、ポリペプチドおよびタンパク質を添加してもよい。リポソームの組成物は、種々の脂質、脂肪酸、アルキルアミンなどの１成分以上、および水和剤から調製できる。脂質成分それ自体または抗原性物質および封入されるワクチン組成物に添加される他の物質が前記性質を有する場合、脂質組成物は脂肪酸（またはアミン）または「プレリポソームゲル」またはリポソームを形成するための水和剤を含有する必要がない。例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの混合物は水性グルタミン酸溶液と「プレリポソームゲル」またはリポソームを形成し、ＤＰＰＣおよびオレイン酸の混合物と水性エピネフリン溶液は「プレリポソームゲル」およびリポソームを形成する。ワクチン組成物においてアジュバント物質として用いる場合、リポソーム調製物は好ましくは、リン脂質、オレイン酸（またはホスファチジル−エタノールアミン）およびアルギニンまたはリジン（またはグルタミン酸および／またはアスパラギン酸）を含む。リポソーム形成物質に対して約１：２０モル比の水和剤により、約１：０.０５の上限で本発明の有益な効果が得られる。水和剤の好ましい濃度範囲は、リポソーム形成物質に対する水和剤のモル比が１：２から１：０.５の間である。実際の場合、リポソームを長鎖脂肪族または芳香族ベースの酸を用いて調製する場合、少なくとも１個のイオン化可能な窒素を含む水和剤、例えばアルギニン、ホモアルギニン、リジン、オルニチンなどを用いるのが好ましい。反対に、リポソームを形成するのに用いる両親媒性物質が長鎖脂肪族または芳香族を基礎とするアミンを含有する場合、グルタミン酸、アスパラギン酸などの二酸、アルキル二酸、例えば単純な二酸、例えば吉草酸、カプリル酸、カプロン酸、カプリン酸など；または２個のリン酸塩、または硫酸塩基を有する二酸；または−ＣＯＯＨ／−ＳＯ₃Ｈまたは−ＣＯＯＨ／−ＰＯ₃Ｈ₂官能基の混合物を有する二酸を用いるのが好ましい。ある種の脂肪族および芳香族を基礎とする酸およびアミンが本発明の実施において好ましい。このような化合物は、例えば２またはそれ以上の酸またはアミン基またはその組合せを有する複数の官能基を有することができる。例えば、二酸、ジアミンまたは酸またはアミン官能基を有する化合物を用いることができる。好ましい化合物は１または２個の酸またはアミン官能基を有する化合物である。１０〜２０個の炭素を有する飽和および不飽和脂肪酸がより好ましい。１０〜２０個の炭素原子を有するアルキルおよびアルケニル酸、特にオレイン酸が最も好ましい。リポソーム形成物質、長鎖脂肪族または芳香族を基礎とする酸またはアミン、１またはそれ以上の水和剤および全固体に対して３００モルまでの水、選択された量の抗原性物質を含むまたは含まない混合物は、水溶液の添加で直接リポソームを形成するゲルを生成する。このゲルはその構造特性が基本的にリポソームと同じであり、ゲルが水溶液で希釈した場合にリポソームに変化するのが容易であるので、プレリポソームゲルとする。約３００モル当量過剰の水溶液によりリポソーム形成が始まる。このゲルの構造は光学的に透明な溶液を形成する高度に配向した液晶である。液晶のＸ、Ｙ、およびＺ次元は、一定のｐＨでの水和剤の濃度および溶液のｐＨによって変わる。一定ｐＨでの水和剤濃度を変えるかまたは水和剤のパーセンテージを保持しながらｐＨを変えることにより、得られるリポソーム小胞の脂質二分子層のラメラ構造の大きさおよび数を調節できる。ゲル構造それ自体はゲル構造の安定性を損なうことなく固体１モルにつき約３００モルの水まで含有できる。プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学により決定されるゲルの構造は、マルチラメラ脂質二分子層および親水性層が交互に積み重なったものである。同じゲルの³¹Ｐ−ＮＭＲスペクトルは異方性ピークを示し、これはさらにゲルがマルチラメラ二分子層からなることを確認するものである。このゲルは簡便な滅菌手段であるオートクレーブに付すことができる。さらに、ゲルは変色を示さず、高圧滅菌後、室温で少なくとも１年間透明のままである。所望により可能ならば、ゲルを所望によりさらに適当な滅菌フィルターを通して滅菌してもよい。ゲルを水性溶液中に分散させると、リポソームが効率的に、かつ自発的に産生される。プレリポソームゲルを、封入されるべき３Ｄ−ＭＰＬおよび抗原性物質と共にまたはなしで脱水し（例えば凍結乾燥）、粉末を再水和すると、長期の保存後であっても、自発的にリポソームが形成される。この能力は、長期の使用前貯蔵期間が必要な水過敏性抗原性物質を投与する場合に特に有用であるワクチン組成物を提供する。プレリポソームゲルは以下のようにして調製する。プレリポソームゲルと称する半固体液晶性ゲルを、３つの基本成分：リン脂質、脂肪酸、および水和剤を水中合することにより調製する。所望の脂質組成により、ゲル−液体転移温度（Ｔｍ）の範囲の種々のリン脂質またはその混合物を用いてもよい。脂肪酸は飽和の程度または鎖長に基づいて選択でき、通常リン脂質と混合して濃厚なペーストにする。コレステロールを脂質混合物に添加して、二分子層特性を調節してもよい。（ある場合、コレステロールが膜のＴｍを上昇させ、これにより取り込んだ試薬の透過性に影響する）。水和剤、好ましくはアルファアミノ酸、例えばアルギニンを水中溶液として脂質混合物に、均質なペーストが得られるまでゆっくりした速度で添加する。望ましい処方物の一例は、１：１.２モル比の卵ホスファチジルコリン：オレイン酸を用いる。アルギニンを水中約１：１.２のリン脂質のアルギニンに対するモル比で添加する。Ｌ−アルギニンのゲルの水性相成分中の濃度が最終的に形成される安定なリポソーム粒子の直径を決定する。粒子の大きさは投与経路およびマクロファージ細胞を目標にするのが望ましいかどうかによる。例えば、経口投与に関しては、約１から約５マイクロメーター間の大きさのリポソーム粒子が望ましい。リンパ球を目標にするためには、約２００から５００ｎｍ間の粒度が好ましい。貯留槽効果に関しては、約５から約１０マイクロメーター間のリポソーム粒子の大きさが望ましい。当業者は種々の大きさの粒子を容易に試験でき、選択できる。最終的なプレリポソームゲルは約６５から約７０重量％までの水を含有でき、軟膏の濃度を有し、偏光顕微鏡で観察した場合、典型的な液晶の外観を呈する。プレリポソームゲルは不活性雰囲気下で貯蔵できるかまたは凍結乾燥して長期保存用の乾燥粉末にできる。本発明のワクチン組成物の形成において、リポソーム調製の同様の工程を行い、続いて免疫学的に有効量の選択された抗原、例えば抗原性ポリペプチド、特にｆｌｕＤタンパク質、および３Ｄ−ＭＰＬを添加し、所望により、１またはそれ以上の免疫原性タンパク質、ペプチドまたはリポソーム調製物と混合した選択された病原体からのフラグメントを追加してもよい。このようなワクチン組成物を調製するためには、選択された抗原をリポソーム調製物と混合することによりその中に封入または挿入する。３Ｄ−ＭＰＬおよび選択された抗原をリポソーム中に配合して本発明のワクチン組成物を調製するのに２種類の方法がある。一の方法はプレリポソームゲルの水和によりリポソームと抗原を配合するかまたは水和凍結乾燥粉末を抗原の適当な緩衝液中溶液と混合することからなる。別の方法は、プレリポソームゲルを抗原の凍結乾燥調製物と物理的に混合することからなる。この混合物を続いて水和すると自発的にリポソームが形成される。選択された方法は、最大レベルの抗原−リポソームの会合をもたらし、未会合フラクションとしての抗原の損失が最小の方法であり、脂質の存在下での抗原の物理化学的性質に依存するものである。しかし、一般には、このようなワクチン混合物中の成分の割合は、抗原性タンパク質２０ｍｇ：３Ｄ−ＭＰＬ２ｍｇ：リポソームゲル３００ｍｇである。例えば、抗原がｆｌｕＤである場合、抗原が著しい疎水性を有し、水溶性が低いので、第２法を用い、以下に記載するように、本発明のｆｌｕＤ組成物を形成するためには３００ｍｇのリポソームゲルを２０〜３０ｍｇのｆｌｕ−Ｄタンパク質および０.５〜２ｍｇの３Ｄ−ＭＰＬと混合する。本明細書の教示に従って当業者であれば容易に本発明を実施するにおいて用いる抗原性物質の量を決定できると考えられる。所望により、他の薬剤をリポソーム組成物中の選択された抗原、例えばｆｌｕＤタンパクおよび３Ｄ−ＭＰＬに添加できる。適当な他の抗原は前記のものである。一旦リポソームが３Ｄ−ＭＰＬ、選択された抗原、および任意の他の成分の存在下で形成されると、未会合の抗原を種々の手段により除去することができる。典型的には、リポソームを約１００,０００ｘｇで連続して遠心分離し、上清を捨てる。最終的なリポソームペレットを所望の脂質または抗原濃度での注射用に、許容される液体、例えば５％デキストロース、セイライン、または緩衝溶液で復元する。当業者に公知の他の方法、例えばゲル濾過または透析を、会合していない抗原の除去に用いてもよい。選択された抗原、３Ｄ−ＭＰＬおよびリポソーム処方物の記載は、ＦｌｕＤの代わりまたはこれに加えて本明細書において記載したスプリットウイルスの使用も包含する。本発明はまた、ヒトまたは他の哺乳動物におけるワクチン組成物中の選択された抗原に対する免疫応答、特にＴ細胞応答を向上する方法も提供する。この方法は、ヒトまたは他の哺乳動物に３Ｄ−ＭＰＬおよび選択された抗原を含む本発明のワクチン組成物を投与することからなる。所望により、リポソーム調製物が前記の組成物に含まれてもよい。この方法は、本明細書に例示した特定の抗原に限定されない。好ましい具体例において、該方法はインフルエンザ感染に対して効果的な向上した防御を惹起するのに有用である。このような具体例において、ワクチン組成物は前記のように有効量のｆｌｕＤおよび３Ｄ−ＭＰＬを含む。他の具体例において、ワクチン組成物は前記のように有効量の１またはそれ以上のスプリットインフルエンザウイルスおよび３Ｄ−ＭＰＬからなる。他のワクチンを調製し、有効量を同様に投与してもよい。実施例、特に実施例２５〜３０に示すように、３Ｄ−ＭＰＬでアジュバント処理に付したスプリットウイルスを用いたワクチン組成物は、特に肺において優れたウイルス清掃率を示し、高い中和抗体力価の刺激を示し、中和活性の非存在下で、ヘテロ亜型（Ｈ₁Ｎ₁）交差反応性を起こし、上部から下部気道（気管を経由）の病気の進行を変化させる用量および投与法はこれらのワクチン組成物に関して標準的な接種実施例にしたがって最適化できる。典型的には、ワクチンを筋肉内投与するが、皮下、結腸、経口、肺、皮内、腹腔内、または静脈内経路などの他の投与経路も用いることもできる。経路は所望の免疫応答の型により選択される。例えば、皮下経路により、伝統的な「貯留槽効果」、すなわち他よりも長い刺激が得られる。特定の投与経路により細胞応答よりも強い抗体応答が得られ、またその逆の場合もある。例えば、経口投与経路により、局所免疫に関して有用な向上されたＩｇＡ応答が得られる。他のポリペプチドワクチンに関する公知の事項に基づいて、インフルエンザ抗原性ポリペプチドワクチン、例えば本発明のｆｌｕＤタンパク含有ワクチンの平均的ヒト成人に関する有用な単一投与量は、適当量の３Ｄ−ＭＰＬアジュバントとの混合物中Ｄタンパク質約１〜約１０００マイクログラム、好ましくは、約５０〜約５００マイクログラム、最も好ましくは約１００μｇである。これらの用量のｆｌｕＤタンパクを用いた場合、ワクチン組成物中の３Ｄ−ＭＰＬの量は、約１〜約５００マイクログラム３Ｄ−ＭＰＬ／μｇウイルスタンパク質、より好ましくは約１０〜約５０μｇ３Ｄ−ＭＰＬ／μｇウイルスタンパク質、最も好ましくは約５０μｇ３Ｄ−ＭＰＬである。ｆｌｕＤおよび３Ｄ−ＭＰＬを本明細書において記載したリポソーム担体を介して投与した場合、ワクチン組成物中の好ましいＤタンパク質の量は約５０から約５００μｇであり、３Ｄ−ＭＰＬの量は約１０から約５０ｐｇの間である。このような３Ｄ−ＭＰＬをアジュバントとしたｆｌｕＤワクチン組成物は、約０.２ｍｇの抗原性タンパク質あたり約１〜約１０ｍｇ、好ましくは約３ｍｇのリポソーム物質を含有する。ｆｌｕＤおよび３Ｄ−ＭＰＬワクチン処方が所望によりアルミニウムまたは水酸化アルミニウムなどの別のアジュバントを含有する場合、Ｄタンパク質の好ましい用量は、約１０〜約５００μｇのタンパク質であり、アルミニウムまたは水酸化アルミニウムの好ましい量は約１０〜約５００μｇの間である。同様に、他のスプリットウイルスワクチンに関する公知の事項に基づいて、本明細書において記載したような、インフルエンザの１価または多価スプリットウイルスワクチンの平均的ヒト成人に対する有用な単一投与量は、１株当たり約１５マイクログラムの赤血球凝集素（ＨＡ）で、適当な量の３Ｄ−ＭＰＬアジュバントとの混合物中、全タンパク質は約８０〜３００μｇ／ｍｌである。これらの量のスプリットウイルスを用いた場合、ワクチン組成物中の３Ｄ−ＭＰＬの量は好ましくは用量当たり３Ｄ−ＭＰＬ約５０マイクログラムである。もちろん、当業者はウイルスタンパク質および３Ｄ−ＭＰＬの量を変更してもよい。１またはそれ以上のスプリットウイルスおよび３Ｄ−ＭＰＬを本明細書において記載したようにリポソーム担体により投与した場合、ワクチン組成物中の各スプリットウイルスの好ましい量は約１５μｇＨＡ／株であり、３Ｄ−ＭＰＬの量は約１０〜約５０μｇの間である。このような３Ｄ−ＭＰＬをアジュバントとしたインフルエンザスプリットウイルスワクチン組成物は、約０.２ｍｇのウイルスタンパク質当たり約１〜約１０ｍｇ、好ましくは約３ｍｇのリポソーム物質を含有する。スプリットウイルスおよび３Ｄ−ＭＰＬワクチン処方物がアルミニウムまたは水酸化アルミニウムなどの他のアジュバントを含有する場合、ワクチン組成物中の各スプリットウイルスの好ましい用量は以下のようにして調節する。好ましいアルミニウムまたは水酸化アルミニウムの量は、抗原性ポリペプチドに関してすでに記載したのと同様である。本発明により記載されたワクチンは、晩夏または初秋にまず投与し（好ましくは０.５ｍｌ投与単位）、２〜６週間後に再投与することができる。あるいは、所望により、免疫が弱ると定期的に、例えば２〜５年毎に投与してもよい。以下の実施例は、本発明のワクチン組成物の好ましい調製法を例示するものである。これらの実施例は例示的であって、本発明の範囲をなんら制限するものではない。実施例１−ゲル調製物ジパルミトイルホスファチジルコリン（３.０ｇ）を５０ｍｌのビーカー中に秤取する。オレイン酸（１.２ｇ）を添加し、混合して均質なペーストを形成する。蒸留脱イオン水（３０ｍｌ）中アルギニン（０.７２ｇ）をジパルミトイルホスファチジルコリンオレイン酸ペーストに添加し、４５℃に加熱する。手で混合すると、混合物は透明で安定なゲルになる。ゲルを貯蔵し、ゲルを燐酸緩衝塩溶液で希釈するとリポソームが形成される。実施例２−リポソームの調製ジパルミトイルホスファチジルコリン（１２０ｍｇ）およびオレイン酸（２４ｍｇ）を一緒に添加し、白色の均質なペーストが観察されるまでよく混合する。次に２０ｍｇのアルギニンを６０ｍｌの燐酸緩衝塩溶液（イオン強度＝０.１５、ｐＨ＝７.４）中に溶解する。アルギニン−塩溶液をペーストに添加し、４０℃に半時間、または少し濁った溶液が観察されるまで加熱する。実施例３−大規模なゲルおよびリポソーム調製ｉ）ゲル製造：５０ｇの卵ホスファチド粉末２０型（アサヒケミカルズ（Asahi Chemicals））に２０ｇのオレイン酸Ｎ.Ｆ.を添加する。撹拌すると白色ペーストが得られ、これを４℃に冷却し、粉砕して微粉末にする。この粉末を２０ｇのアルギニンおよび５００ｇの蒸留脱イオン化水を含有する水溶液に添加する。混合物をスパチュラで混合しながら、溶液を約３５℃に加熱してリン脂質の水和を助ける。均質な淡黄色ゲルが形成される。このゲルを高圧滅菌し、４℃で保存するかまたは凍結して後に復元する。 ii）リポソームの製造：前項で調製したゲルを冷貯蔵所から取り出し、室温に戻す。次に２リットルの燐酸緩衝塩溶液（pＨ７.４）と混合する。白色不透明リポソーム溶液が形成される。実施例４−ゲルからのリポソームの形成１.０ｇのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）および４００ｍｇのオレイン酸の均質ペーストを形成する。３００ｍｇのアルギニンを１０ｍＬの燐酸緩衝塩溶液と混合し、４５℃に加熱し、ＤＰＰＣ／オレイン酸ペーストに添加して、リポソームを形成する。実施例５−プレリポソームゲル１ｇのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）および４００ｍｇのオレイン酸と混合して、均質ペーストを形成する。３００ｍｇのアルギニンを２ｍｌの水と４５℃で溶解するまで混合する。アルギニン溶液をＤＰＰＣ／オレイン酸ペーストと約４５℃で混合して、粘稠なゲルを得る。このゲルを燐酸緩衝塩溶液で希釈するとリポソームが形成される。実施例６−種々のリポソーム処方Ａ．コレステロール含有リポソームコレステロール（１５ｍｇ）を１００ｍｇのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）と混合して、均質な粉末を形成する。次に２３ｍｇのオレイン酸を粉末に添加し、よく混合して均質なペーストを形成する。リポソームを得るために、３０ｍｇのアルギニンを１０ｍｌの燐酸緩衝塩溶液に添加し、４０℃に加熱し、ＤＰＰＣ／コレステロール／オレイン酸ペーストに添加する。混合物を４０℃で混合して、リポソームを得る。Ｂ．パルミチン酸含有リポソームジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）（２５０ｍｇ）を２５ｍｇのパルミチン酸と混合して、均質な粉末を形成する。次に８０ｍｇのオレイン酸をこの粉末と混合し、均質なペーストが形成されるまで一定して撹拌しながら４５℃に加熱する。アルギニン（１００ｍｇ）を２５ｍｌの蒸留脱イオン化水中に溶解し、４５℃に加熱する。このアルギニン溶液を４５℃でペーストに添加し、均質なゲルが形成されるまで混合する。ゲルを燐酸緩衝塩溶液で１０倍に希釈してリポソームを形成する。Ｃ．イソステアリン酸含有リポソームジパルミトイルホスファチジルコリン（１００ｍｇ）を５０ｍｇのイソステアリン酸と混合して、均質なペーストを形成する。５０ｍｇのアルギニンの２.０ｍｌ蒸留脱イオン化水中溶液を調製し、イソステアリン酸ペーストに添加し、４５℃に加熱する。この混合物を透明なゲルが形成されるまで混合する。燐酸緩衝塩溶液で希釈するとリポソームが形成される。Ｄ．オレイルトレオニン酸含有リポソームジパルミトイルホスファチジルコリン（１２５ｍｇ）および７５ｍｇのオイルトレオニンを一緒に添加し、４０℃に加熱して、ペーストを形成する。ついで２ｍｌの蒸留脱イオン化水溶液を４０℃で一定して撹拌しながら添加する。透明なゲルが形成され、これをｐＨ５の燐酸緩衝塩溶液で希釈するとリポソームが形成する。Ｅ．ミリスチルアミン含有リポソームジパルミトイルホスファチジルコリン（１９２ｍｇ）を７２ｍｇのミリスチルアミンに添加し、均質なペーストが形成されるまで、一定して混合しながら加熱する。６５ｍｇのグルタミン酸の５ｍｌ蒸留脱イオン化水中溶液をペーストに添加し、ゲルが形成されるまで加熱する。燐酸緩衝塩溶液をゲルに添加するとリポソームが形成する。Ｆ．ＤＬＰＣ含有リポソームジラウリルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）（５０ｍｇ）を２０ｍｇのオレイン酸と混合して、均質なペーストを形成する。２０ｍｇのアルギニンを１０ｍｌの燐酸緩衝塩溶液に添加し、ペーストに添加し、濁ったリポソーム溶液が形成されるまで手で混合する。Ｇ．ホスファチジルエタノールアミン−グルタミン酸リポソームＬ−グルタミン酸（３２ｍｇ）を２.０ｍｌの蒸留脱イオン化水中に溶解し、ｐＨを１.０Ｎ水酸化ナトリウムで５.２に調節する。この溶液を６０℃に加熱し、１００ｍｇのホスファチジルエタノールアミンを添加する。溶液を一定して混合しながら均質粘稠ゲルが観察されるまで６０℃に保つ。ホスファチジルエタノールアミン−グルタミン酸ゲルを燐酸緩衝塩溶液で１／１０に希釈する。小胞様構造が位相差顕微鏡下で観察される。実施例７−アルギニン濃度のリポソームの大きさに対する影響５０２ｍｇのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）に１０マイクロリットルの（２−パルミトイル−１−Ｃ₁₄）（０.１ｍＣｉ／ｍｌ）ジパルミトイルホスファチジルコリンを添加する。クロロホルムを添加し、放射活性を完全に混合し、次に蒸発させる。オレイン酸（ＯＡ）（１９５ｍｇ）を次に脂質中に混合してペーストを形成する。１１９ｍｇのアルギニンを含有する５ｍｌの蒸留水を添加し、４５℃で混合して、透明ゲルを形成する。１ｇのゲルを４個の別個のバイアル中に秤取し、以下の第１表に示すようにアルギニンを添加する。１.５ｇの各溶液を５０ｍｌの燐酸緩衝塩溶液（ｐＨ７.８）中に希釈する。推定平均直径を₁₄Ｃ−同位体標識ＤＰＰＣを用いたセファクリルＳ−１０００カラムクロマトグラフィー分析により得る（即ち、直径を光子相関分光分析（ＰＣＳ）を用いた分散の強度に基づいて測定する）。効果を以下の第２表に示す。実施例８−小胞の大きさに対するｐＨの影響さらに、小胞の大きさは水性緩衝溶液のｐＨの変化により変わる。１００ｍｇのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）に２５マイクロリットルの（２−パルミトイル−１−Ｃ₁₄）（０.１ｍＣｉ／ｍｌ）ジパルミトイルホスファチジルコリンを添加する。クロロホルムを添加し放射活性を完全に混合し、次に蒸発させる。オレイン酸（ＯＡ）（４０.１ｍｇ）を次に脂質中に混合してペーストを形成する。２４ｍｇ／ｍｌの水中アルギニンを含有する１ｍｌの溶液を添加し、脂質混合物を４５℃で混合して、透明ゲルを形成する。このゲルのアリコート（１００ｍｇ×２）を、それぞれｐＨ９.０および７.４の燐酸緩衝液（１０ｍｌ）中に希釈する。再び、推定平均直径を¹⁴Ｃ−同位体標識ジパルミトイルホスファチジルコリンを用いたセファクリルＳ−１０００カラムクロマトグラフィー分析により得る。結果を以下の第３表に示す。このように、アルギニン濃度または水性緩衝溶液のｐＨを変えることにより、望ましい大きさのリポソーム小胞を調製することができる。実施例９−リポソーム安定性滅菌リポソームを熱滅菌プレリポソームゲルから調製する。別法として、リポソームゲルまたはリポソームを適当な滅菌フィルターを通して滅菌濾過する。ｐＨ８.０のＤＰＰＣ：ＯＡ：Ａｒｇ（１：１：２）から調製したリポソームを熱滅菌し、抗菌剤または酸化防止剤を添加せずに室温で約１年間貯蔵する。細菌の増殖、変色および沈殿は観察されない。１年目のリポソームの陰影電子顕微鏡観察により、リポソーム小胞は安定であることがわかる。実施例１０−シュークロース潜伏封入したシュークロースの潜伏をｐＨ７.８の水性燐酸緩衝溶液中ＤＰＰＣ：ＯＡ：Ａｒｇ（１：１：１）リポソーム系で封入したＣ₁₄−シュークロースを用いて測定する。結果を以下の第４表に示す。このように、本発明のリポソーム系は薬剤デリバリーに関して優れた潜伏性を有する。実施例１１−凍結乾燥リポソームオレイン酸（３０.０ｇ）およびコレステロールＵ.Ｓ.Ｐ.（７.５ｇ）を調製する。次に７５.０ｇのホスファチド２０型粉末（アサヒケミカル）をオレイン酸／コレステロール混合物と均質なペーストが形成されるまで混合する。次に、１５.０ｇのアルギニン（遊離塩基）を１８３ｇの蒸留脱イオン水中に溶解する。このアルギニン溶液をゆっくり脂質ペーストと混合して、均質ゲルを形成する。ゲルのｐＨを５.０ＮＨＣｌを用いて７.４に調節する。このプレリポソームゲルの１０.０ｇアリコートを１０ｍｌバイアル中に移し、凍結乾燥する。得られた粉末を５ｍｌの燐酸緩衝塩溶液で希釈するとリポソームが形成される。実施例１２−ＦｌｕＤ発現プラスミドの構築プラスミドｐＡＰＲ７０１はＭ１およびＭ２インフルエンザウイルスタンパク質（Ａ／ＰＲ／８／３４）に関するコーディンク領域を有するｐＢＲ３２２由来のクローニングベクターである。これはヤング（Young）ら、ジ・オリジン・オブ・パンデミック・インフルエンザ・バイラシズ（The Origin of Pandemic Inf luenza Viruses），１９８３，ダブリュ・ジー・ラバー（W.G.Laver）編、エルセバイヤー・サイエンス・パブリッシング・コーポレーション（Elsevier Scien ce Publishing Co.）により記載されている。プラスミドｐＡＰＲ８０１はＮＳ１コーディング領域（Ａ／ＰＲ／８／３４）を有するｐＢＲ３２２由来のクローニングベクターである。これは前記ヤングらにより記載されている。プラスミドｐＡＳ１はＰＬプロモーター、Ｎ利用部位（Ｎ蛋白質の存在下での転写極性を軽減する）およびｃＩＩ翻訳開始コドンとその直後のＢamＨＩ部位を含むｃＩＩリボソーム結合部位を含有するｐＢＲ３２２由来の発現ベクターである。これはローゼンベルグ（Rosenberg）ら、メソッド・エンザイモール（Metho ds Enzymol.），１０１：１２３−１３８（１９８３）により記載されている。プラスミドｐＡＳ１デルタＥＨは、ｐＡＳ１からのｐＢＲ３２起源の非必須Ｅ coＲＩ−ＨindＩＩＩ領域を欠失することにより調製する。ウイルス起源の８６１塩基対中ＮＳ１コーディング領域およびｐＢＲ３２２起源の３７５塩基対を含有する１２３６塩基対のｐＡＰＲ８０１のＢamＨＩフラグメントをｐＡＳ１デルタＥＨのＢamＨＩ部位に挿入する。得られたプラスミドｐＡＳ１デルタＥＨ／８０１は真のＮＳ１（２３０アミノ酸）を発現する。このプラスミドは、アミノ酸８１および８２についてのコドンとＮＳ配列に対するＮruＩ部位３’の間にＮco Ｉ部位を有する。アミノ酸１および２間のＢamＨＩ部位は保持される。プラスミドｐＡＳ１△ＥＨ／８０１をＢglＩＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＤＮＡpolＩ；クレノー（Klenow））で末端を埋める。得られたｐＢＧｌ− をＮcoＩで消化し、ＤＮＡpolＩ（クレノー）で末端を埋め、ＢglＩＩリンカーと結紮する。得られたプラスミドｐＢ４はＮＳ１コーディング領域中にＢglＩＩ部位を含む。プラスミドｐＢ４をＢglＩＩで消化し、合成ＤＮＡリンカーとＥＰ０３６６２３８号の実施例４に記載したようにして結紮する。得られたプラスミドｐＢ４＋により、全３個のリーディングフレーム中の終止コドンの前のＮＳ１の最初の８１個のアミノ酸に関するコーディング領域の後のリンカー中にＤＮＡフラグメントが挿入される。プラスミドｐＢ４＋をＸmaＩで消化し（リンカー中で切断する）、末端を埋め（クレノー）、５２０塩基対のＨＡ２コーディング領域由来の末端を埋めたフラグメントであるＰvuIＩＩ／Ｈind ＩＩＩに結紮する。得られたプラスミドｐＤは、欧州公開特許出願第３６６２３８号の第２図に示すように、ＮＳ１の最初の８１個のアミノ酸を含むタンパク質、合成ＤＮＡリンカー由来の３個のアミノ酸（Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ）、そのあとのＨＡ２のアミノ酸６５〜２２２をコードする。生産発酵におけるプラスミドの選択を促進するために、組み換えｆｌｕＤタンパク質をコードするｐＤ発現プラスミド由来のＢamＨＩフラグメントを、選択するためのＴｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子を含むｐＡＳ１プラスミド誘導体のＢamＨＩ部位中に結紮する［バーグ（Berg）ら、マイクロバイオロジー（Microbiology）、ディー・シュレジンガー（D.Schlessinger）編、ｐｐ.１３ −１５、アメリカン・ソサイエティー・フォー・マイクロバイオロジー（Americ an Society for Microbiology）（ワシントンＤＣ１９７８）；ノムラ（Nomur a）ら、ザ・シングル・ストランデッド・ディーエヌエー・ファージズ（The Sin gle-Stranded DNA Phages）、ディー・デンハート（D.Denhardt）ら編、ｐｐ.４６７−４７２、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（ニューヨーク１９７８）；カステラッチ（Castellazzi ）ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジネティックス（Molecul.Gen.Gene t.）、１１７：２１１−２１８（１９８２）］。この結果、ベターｐＣ₁₃（Ｈ₆₅ _-222 ）Ｋｎが得られる。シャッツマンおよびローゼンベルグ（ShatzmanおよびRosenberg）、メソッド・エンザイモール（Meth.Enzymol.），１５２：６６１−６７３（１９８７）に記載されているように、ｐＯＴＳ２０７はＴｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子を有するｐＡＳ由来のクローニングベクターである［バーグ（Berg）、前掲；ノムラ（Nomura）、前掲；カステラッチ（Castellazzi）、前掲］。これはプラスミドｐＵＣ８［ヤニッシュ−ペロン（Yanisch−Perron）ら、ジーン（Gene），３３：１０３−１１９（１９８５）］をＢamＨＩて消化し、Ｔｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子を含むＢclＩフラグメントと結紮することにより構築する。得られたプラスミドｐＵＣ８−ＫａｎをＥcoＲＩおよびＰstＩで消化し、カナマイシン遺伝子を含有するフラグメントをｐＯＴＳＶのＥcoＲＩおよびＰstＩ部位間に挿入する［シャッツマンおよびローゼンベルグ（ShatzmanおよびRosenb erg）、前掲］。得られたプラスミドはｐＯＴＳ２０７である。ＨＡ２コーディング配列をコードする５２０ｂｐのフラグメントはｐＪＺ１０２から単離され［完全ＨＡタンパク質のコーディング領域（Ａ／ＰＲ／８／３４）を有するｐＢＲ３２２由来クローニングベクター］［ヤング（Young）ら、ジ・オリジン・オブ・パンデミック・インフルエンザ・バイラシズ（The Origin o f Pandemic Influenza Viruses）、ダブリュ・ジー・ラバー（W.G.Laver）編、エルセバイヤー・サイエンス・パブリッシング・コーポレーション（E1sevier S cience Publicshing Co.）（１９８３））により記載］、ＸmaＩで切断し、末端を埋めたｐＢ４＋中に挿入する。得られたプラスミドｐＣ₁₃Ｈ_65-222をＢamＨＩで消化し、このフラグメントから単離されたｆｌｕＤタンパク質をコードするフラグメントをｐＯＴＳ２０７のＢamＨＩ部位中に結紮して、プラスミドｐＣ₁₃ （Ｈ_65-222）Ｋｎ［スミスクライン・ビーチャム（SmithKline Beecham）］を産生する。カナマイシン耐性Ｃ１３（Ｈ６５−２２２）Ｋｎプラスミドの配列を以下ように誘導する：ヌクレオチド位置１−３１、３１３６−３９６４、４０２１−４３４３、４５３３−７１６６はｐＢＲ３２２より誘導［ヤングら、前掲］；ヌクレオチド位置３２−１８７９、４３４４−４５３２はラムダファージより誘導、ヌクレオチド位置１８８０−２１２２、２６８２−３１３５はＮＳ１遺伝子より誘導、ヌクレオチド位置２１２３−２１３２、２６６０−２６８１は合成リンカーより誘導、ヌクレオチド位置２１３３−２６５９はＨＡ２遺伝子より誘導、ヌクレオチド位置３９６５−４０２０はｐＣＶ₁ポリリンカーより誘導、およびヌクレオチド位置７１６７−８６０１はｐＵＣＫａｎ１２（Ｔｎ９０３：Ｋｎ^r）より誘導する。ｆｌｕＤタンパク質誘導体のコーディング領域のＤＮＡ配列を配列決定ＤＮＡのジデオキシ鎖終止法により確認する［ザンガー（Sanger）ら、プロシーディングズ・オブ・ジ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（ Proc.Natl.Acad.Sci）．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７（１９７７）］。このｐＣ₁₃（Ｈ_65-222）Ｋｎプラスミドは、β−ラクタムマーカーを除去し、カナマイシンマーカーと置換しておく以外は、係属中の米国特許出願第０７／３８７２００、その対応する公開ＥＰＡ第３６６２３８号、および係属中米国特許出願第０７／３８７５５８、その対応する公開ＥＰＡ第３６６２３９号に記載されているプラスミドと本質的に同じである。前記出願は、他の適当なベクターの記述のため、出典明示により本明細書の一部とする。ｐＣ₁₃（Ｈ_65-222）Ｋｎプラスミドをイ−・コリ発現株ＡＲ５８［スミスクライン・ビーチャム］中に形質転換し；ｆｌｕＤタンパクの産生をイムノブロット分析により確認し［トービン（Towbin）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）ＵＳＡ，７６：４３５０（１９７９））］、これにより、２７.７ｋＤの推定分子量の主な免疫反応性種が明らかになる。実施例１３−Ｄタンパク質の精製ＮＳ１_1-81−ＨＡ２_65-222またはＤタンパク質（ＭＷ２７.７ｋＤ）を、米国特許出願第０７／３８７５５８号に対応する公開欧州特許出願第３６６２３９号に詳細に記載されているように精製する。実施例１２に記載するｐＣ１３（Ｈ_65-222）Ｋｎ系を用いてイー・コリ宿主株ＡＲ５８［スミスクライン・ビーチャム］によりＤタンパク質の合成を誘導した後、細菌細胞を遠心分離により集め、使用するまで−７０℃で凍結する。このペレットを解凍し、５０ｍＭトリス、２ｍＭＥＤＴＡ、０.１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５％グリセロール（ｐＨ８）中に再懸濁する。得られた懸濁液をリソチーム（最終濃度少なくとも約０.２ｍｇ／ｍｌ）で約１時間、外界条件下で処理する。この懸濁液を次にマントン・ガウリン（Manton Gaulin）ホモジナイザー［エイ・ピー・ブイ・ガウリン・インコーポレイテッド（APV Gau1in,Inc.），マサチューセッツ州、エヴェレット］で２つの経路で８０００ｐｓｉで溶解する。得られた懸濁液をトリトン（Triton）Ｘ−１００（最終濃度１％）およびデオキシコレート（ＤＯＣ；最終濃度０.１％）で処理する。Ｄタンパク質を含有するペレットを２ｍＭＥＤＴＡおよび５％グリセロールを含有するｐＨ１０.５の５０ｍＭＧｌｙ−ＮａＯＨ緩衝液でターラックス（Turrax）ホモジナイザーを用いて処理する。トリトンＸ−１００（最終濃度１％）を添加した後の得られた懸濁液を約１時間４℃の冷所で撹拌し、次に遠心分離する。Ｄタンパク質を含有するペレットを８Ｍ尿素および５０ｍＭトリス（ｐＨ８.０）中に４℃で一夜溶解する。上清はＤタンパク質を含有する。ＤＴＴ（最終濃度５０ｍＭ）を添加した後、この上清を外界条件下で約１時間撹拌し、次に８Ｍ尿素および５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したＤＥＡＥファーストフローセファロース［ファーマシア（Pharmacia）］カラムにかける。Ｄタンパク質を平衡緩衝液中０〜０.３ＭＮａＣｌ勾配（５カラム容積以上）で溶出する。Ｄタンパク質を含有するフラクションをミニセッツ（Minisette）タンジエントフロー装置［ファーマシア］で濃縮し、１０ｍｇＳＤＳ／ｍｇタンパク質、ＤＴＴ［シグマ（Sigma）］（最終濃度５０ｍＭ）で処理し、外界温度で約１.５時間撹拌する。得られた溶液を１％ＳＤＳを含有する２５ｍＭトリス−グリシン緩衝液（ｐＨ８.６）で平衡化したセファロース−１２カラム［ファーマシア］に充填する。Ｄタンパク質を平衡緩衝液のイソクラティックグラジエント中推定モノマー分子量で溶出する。適当な純度のＤタンパク質を含有するフラクションをプールし、濃縮し、１０ｍｇＳＤＳ／ｍｇタンパク質およびＤＴＴ（最終濃度５０ｍＭ）で処理し、直前に記載したのと同じ条件下で次にセファロース−１２カラム上クロマトグラフィーに付す。最高純度のＤタンパク質を含有するフラクションをプールし、濃縮し、８Ｍ尿素を含有する５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.０）で平衡化したＧ２５セファデクスファインカラム［ファーマシア］に付す。Ｄタンパク質を平衡緩衝液でイソクラティック溶出し、ＳＤＳを含まないＤタンパク質を含むフラクションをプールし、濃縮する。この高純度のＤタンパク質のサンプルを次に濃縮し、２０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）に対して透析し、滅菌濾過する。実施例１４−ＦｌｕＤワクチン組成物の評価Ｄタンパク質、およびin vitroＴ細胞分析および防御研究に用いられる方法の詳細な記載はエス・ビー・ディロン（S.B.Dillon）ら、バクシン（Vaccine）、１０：３０９（１９９２）（出典明示により本明細書中の一部とする）に記載されている。ＣＴＬおよび増殖分析をすでに記載されているようにして行う［エス・ビー・ディロン（S.B.Dillon）ら、前掲］。ＣＴＬおよび増殖分析をすでに記載されているようにして行う［エス・ビー・ディロンら、前掲］。ＩＬ−２をＩＬ−２依存性ＣＴＬ直線（ＣＴＬＬ）上で測定し、ＩＦＮガンマを市販のＥＬＩＳＡキットにより測定する。水酸化アルミニウムアジュバント中スーパーローズ精製Ｄタンパク質（実施例１３）を含有し、３Ｄ−ＭＰＬを含むかまたは含まない本発明のワクチン組成物を以下のようにして調製する：３Ｄ−ＭＰＬ（ＲＩＢＩ Immunochemical，モンタナ州、ハミルトン）を注射用滅菌水中復元して１ｍｇ／ｍｌの濃度にする。このストック溶液を３０分間超音波処理し、続いて５％デキストロース中で希釈して、前記［エス・ビー・ディロンら、バクシン，１０（５）：３０９−３１８（１９９２）］したように調製した水酸化アルミニウム中Ｄタンパク質の混合物に添加する前に、さらに１０分間超音波処理する。抗原用量を０.０１、０.１、１.０、１０、２０〜１００μｇ／注射用量から滴定する；３Ｄ−ＭＰＬ用量を０.０２５、０.２５、２.５、２５〜５０μｇ／注射用量から滴定する。３Ｄ−ＭＰＬ：抗原の比率を１００μｇ用量を除いてすべての抗原量に関して２.５：１（ｗ／ｗ）に維持する。水酸化アルミニウムはすべての場合において１００μｇ／用量である。対照ワクチン組成物は、エス・ビー・ディロンら、バクシン，１０（５）：３０９−３１８（１９９２）に記載されているようにＣＦＡと混合した抗原２０μｇを含有する。最終注射容積はマウス１匹当たり０.２ｍｌである。これらの防御研究に関して、マウス（ＣＢ６Ｆ₁；Ｈ−２^dxb）に選択されたワクチン用量を、０および３週に皮下注射し、７週に、２〜５ＬＤ₅₀量のＡ／プエルトリコ／８／２３［Ａ／ＰＲ／８／３４（Ａ型インフルエンザ、Ｈ１Ｎ１）］ウイルスを鼻腔内から投与する（メトファン麻酔下）。防御研究に用いた方法の詳細な記載は、、エス・ビー・ディロンら、バクシン，１０（５）：３０９−３１８（１９９２）（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。攻撃後の生存率（％）をフィッシャーの確率試験により群間で比較する。第５表の結果は、致死攻撃からの重大な防御に必要なｆｌｕＤ抗原の最小量は１０μｇ（アルミニウムのみ）からワクチン組成物中に３Ｄ−ＭＰＬが含まれる場合１μｇまで減少することを示す。また、マウスの攻撃の生存率（％）は２０μｇ（ｐ≦０.０１）、１０μｇ（ｐ≧０.０５；ＮＳ）および１μｇ（ｐ≦０ .０１）の抗原量をワクチン組成物中３Ｄ−ＭＰＬならびにアルミニウムとともに投与した場合、アルミニウムのみの場合よりも増加する。ＣＦＡ対照群中の２０μｇの抗原量での生存率はこの実験においては７３％である。実施例１５−ＦｌｕＤワクチン組成物の評価この実験は、３Ｄ−ＭＰＬの用量を滴定し、単独、最小有効量のｆｌｕＤ抗原（１μｇ）およびアルミニウムアジュバント（１００μｇ）と共に、またはｆｌｕＤ抗原（１０μｇ）およびアルミニウムアジュバント（１００μｇ）と共に投与する以外は、基本的に実施例１４に記載したようにして行う。第６表に示した結果より、２μｇ３Ｄ−ＭＰＬが最小有効量である。実施例１６−ＦｌｕＤワクチン組成物の評価この実験において、２、１０または５０ＬＤ₅₀量のウイルスを投与した後に見られる防御レベルを測定することにより、リポソーム＋３Ｄ−ＭＰＬの効力を３Ｄ−ＭＰＬを含まないリポソーム（Lipo）［Ribi Immunochem］およびＡｌ（ＯＨ）またはＣＦＡと比較する。用いたワクチンは以下の第９表におけるのと同じである。マウスに０および３週に注射し、７週にＡ／ＰＲ／８／３４を投与する。以下の第７表に２１日の生存率を示す。結果から、リポソーム／３Ｄ−ＭＰＬ処方で５０ＬＤ₅₀攻撃に対して著しい防御が見られるが、試験した他のアジュバントでは見られない（第７表）。すべての処方に関して、２ＬＤ₅₀攻撃に対して著しい防御が見られ、アルミニウム以外のすべての処方は１０ＬＤ₅₀攻撃量に対して防御的である。したがって、３Ｄ− ＭＰＬ／リポソーム処方中のＤタンパク質はＴ細胞応答を支持する伝統的なアジュバントであるが、ヒトにおける使用には適していないＣＦＡにおけるＤタンパク質よりも強い効力のワクチンを構成する。実施例１７−ＦｌｕＤワクチン組成物の評価この実験において、ｆｌｕＤタンパク質、３Ｄ−ＭＰＬ、およびリポソームを含有する本発明のワクチン組成物を、ｆｌｕＤ、３Ｄ−ＭＰＬおよびアルミニウムアジュバントを含有するワクチン組成物と比較して評価する。リポソーム中に配合されている実際の３Ｄ−ＭＰＬの量を測定する。全タンパク質濃度２.４９ｍｇ／ＭＬの２５ｍＭトリス／１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）中ｆｌｕＤタンパク質（スーパーローズ精製）を２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８）に対して透析し、凍結乾燥して、２０ｍｇずつの粉末に分ける。卵ホスファチド（アサヒ５型）およびオレイン酸（シグマ（Sigma））を約１：１.２モル比で混合する。Ｌ−アルギニン（遊離塩基）（０.３８Ｍ水中溶液）をホスファチド／脂肪酸混合物に添加し（１：１（モル比）ホスファチド：アルギニン）、混合物を滑らかで均質なゲルが形成されるまで混合する。このゲルはプレリポソームゲルである。凍結乾燥したタンパク質をプレリポソームゲルと合し（０.０６〜０.０８タンパク質／ゲル（ｗ／ｗ）比）、室温で均質なペーストが形成されるまで混合する。モノホスホリル脂質Ａ（リビ・イムノケム（Ribi Immunochem））をホスファチド６６μモルに対して脂質Ａ１μモルの比で添加する。これは凝集した３Ｄ− ＭＰＬモノマーのナノ粒子（直径サブミクロン）構造からなる無色透明な系である。得られたリポソーム懸濁液をさらに２５ｍＭトリス／１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）緩衝液で希釈して、均質化する。リポソーム調製物を次に連続して遠心分離し（３回）、未配合タンパク質および３Ｄ−ＭＰＬを除去する。毎回ペレットをトリス／ＥＤＴＡ緩衝液で再懸濁する。最終リポソーム懸濁液を分析し、使用しない場合、Ｎ₂下、５℃で保存する。リポソームを続いて分析して変更したローリー比色検定により、タンパク質含量を測定し、バーレット検定によりリン脂質濃度を測定し［バートレット・ジー・アール（Bartlett，G.R.）、ジャーナル・オブ・バイオロジー・アンド・ケミストリー（J.Biol.Chem.）２３４：４６６−４６８（１９５９）］、リポソームの大きさを光子相関分光分析［マルバーン（Marvern）４７００型］により測定する。すべての検定を標準的技術により行う。リポソームは、脂質Ａ含量に関しては分析しないが、脂質Ａのすべては、最終リポソームフラクション中に保持されることが多い。以下の第８表において、Ｄタンパク質ＬＡおよび対照ＬＡ−Ｉを、固体脂質Ａを脂質相中に配合することにより調製する。対照ＬＡ−１１は配合する脂質Ａの溶液で水和することにより調製する。マウスを０.２ｍｌの抗原／担体／３Ｄ−ＭＰＬ処方て、０および３週に皮下で免疫化し、７週目に５ＬＤ₅₀のＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスで鼻腔内から攻撃する。「担体」は水酸化アルミニウム（Ａｌ）またはリポソーム（Lipo）のいずれかである。生存率を２１日間モニターする。これらの結果を以下の第９表に示す。特記しない限り、ｐ値は３Ｄ−ＭＰＬ対照に対する測定値である。このデータは担体としてリポソームを用いることにより、３Ｄ−ＭＰＬの必要量（０.００５〜０.０５μｇ）はアルミニウムに関して必要な量（約２μｇ）に対して大幅にに減少させることができることを示す（第６表も参照）。実施例１８−ワクチン組成物の評価ＣＢ６Ｆ₁マウス（１群１２匹）に０および３週にアルミニウム（１００μｇ）＋３Ｄ−ＭＰＬ（１０μｇ）中ｆｌｕＤ１００μｇを含むワクチン組成物を皮下注射する。７週に、マウスに３〜５ＬＤ₅₀量の第１図に示すウイルスで攻撃する。攻撃後２１日間，生存率をモニターする。第１図の結果は、ワクチンの抗原特異性がＡ１⁺³アジュバントに関してすでに示されているものと等価であることを示す［エス・ビー・ディロン（S.B.Dillon ）ら、前掲］（即ち、Ｈ１およびＨ２亜型の両方に関して交差反応性であるが、Ｈ３またはＢ型に対して効力を欠く）。生存率も異種のＨ１Ｎ１ウイルス、Ａ／タイ／８６で攻撃した予防接種群において大きいが、結果は有意ではなかった（ｐ＜０.０９）（第１図参照）。実施例１９−ＦｌｕＤワクチン組成物の評価ＣＢ６Ｆ₁マウスに０および３週にアルミニウム（１００μｇ）中＋３Ｄ−ＭＰＬ（２.５μｇ）Ｄタンパク質１μｇまたはアルミニウムのみを含むワクチン組成物を皮下（ｓｃ）注射する。７週目に、１８匹のマウスを５ＬＤ₅₀量のＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスで攻撃する。５匹のマウスを攻撃の７日後に肺力価測定のために屠殺する。（７日の対照群における死亡率は、Ａｌ／３Ｄ−ＭＰＬに関して６０％、ＣＦＡに関して４０％であった）。脾臓を増殖およびシサイトカイン検定（以下の第１５表）のために、攻撃前、１群当たり２匹のマウスから摘出し、攻撃の６日後、１群当たり３匹のマウスから摘出する。第１０表に５ＬＤ₅₀ 攻撃後の生存率（ｎ＝１０／群）および肺ウイルス清掃率（ｎ＝５／群）を示す。肺ウイルス力価を７日目に記録し、第１０表の第４行目に示す。第１０表の結果は、５ＬＤ₅₀攻撃を受けたマウスにおける肺ウイルス力価の減少は３Ｄ−ＭＰＬ対ＣＦＡよりも大きい（２.４常用対数対０.９常用対数）が、生存率はこれらの群において等しいことを示す。実施例２０−ＦｌｕＤワクチン組成物の評価脾臓Ｔ細胞の増殖を測定するために、λＩＦＮ産生を防御と相関させ、これらの応答をＡｌ対Ａｌ／３Ｄ−ＭＰＬ（２.５ｎｇ３Ｄ−ＭＰＬ）アジュバント（第１０表に示した研究から）中１μｇＤタンパク質で免疫化したマウスの脾臓において攻撃の前後にてモニターする。７週に、ウイルス攻撃後６日に２匹のマウスを屠殺する。脾臓をＤタンパク質と共に培養し、３日に³Ｈ−チミジンでパルス処理に付す。培養上清を８時間後に収穫する。全体として、脾臓増殖応答はＡｌまたはＡｌ／３Ｄ−ＭＰＬ処方中のＤタンパク質のいずれかで予防接種した群（未剌激の培養物中の最大ｃｐｍは２７５０ｃｐｍである）について、攻撃の前ｖｓ.後で似ている（第３図）。増殖応答の大きさも、各アジュバント群について似ており、最大刺激指数は同様に３.０以下である（第２図）。抗原刺激培養上清中の攻撃前のガンマーインターフェロンレベルは少し（およそ２倍）上昇するだけで、２つのアジュバント群は第１１表に示すように等しい。しかし、対照的に、ガンマーインターフェロン産生は、抗原刺激培養物においてＡｌ／３Ｄ−ＭＰＬ群から攻撃後に７倍以上に増加するが、攻撃後のレベルはＡｌ³⁺のみで予防接種した群においては上昇しない（第１１表）。これらの結果は、したがって、インターフェロン−ガンマ産生は攻撃後の減少した肺力価および生存率と相関することがわかり、さらに、Ｔ細胞増殖それ自体は２つのアジュバント群間の違いを反映しないことがわかる。実施例２１−ＦｌｕＤワクチン組成物の評価ＣＤ４⁺細胞の役割をさらに調べるために、抗原−特異性増殖およびサイトカイン産生をｆｌｕＤおよびアルミニウムアジュバント（Ａｌ）を含有するワクチン組成物対ｆｌｕＤおよびＡｌ／３Ｄ−ＭＰＬを含有するワクチン組成物で予防接種したマウスにおいて比較する。７日前に１、５または２０μｇのＡｌ／３Ｄ−ＭＰＬまたはＡｌ⁺アジュバント（１００μｇ）中Ｄタンパク質（３Ｄ−ＭＰＬ：抗原の比率は２.５：１ｗ／ｗ）を１回注射したマウスからのリンパ節を０〜３０μｇ／ｍｌ精製Ｄタンパク質と共に培養する。結果を第３図および第４図に示す。増殖はＡｌ／３Ｄ−ＭＰＬを受けた群において明らかに増加し、最低のin vivo抗原量（１μｇ）で違いが最大である。第３図において、未剌激の培養物における最大ｃｐｍは１３６８ｃｐｍである。第４図において未刺激の培養物における最大ｃｐｍは１６００ｃｐｍであり；未刺激培養物からの上清とともに培養したＣＴＬＬ（ＩＬ−２依存性ＣＴＬ株）細胞の最大ｃｐｍは１９５ｃｐｍである。最大（４８時間）ＩＬ−２活性は、Ａｌ／３Ｄ−ＭＰＬ処方で予防接種した群において大きいが、そのレベルはすべての培養物において一般に低い（第４図）。第１２表は、同じ抗原−刺激培養物からの上清中のインターフェロン−ガンマの分析の結果を示す。アジュバント対照培養物からの上清中のインターフェロンレベルはすべて＜１ｎｇ／ｍｌである。インターフェロン−ガンマをギブコ−ＢＲＬ・エライザ（Gibco-BRL ELISA）キットを用いて測定する。このサイトカインは培養の第４日で最高であり、Ａｌ／３Ｄ−ＭＰＬ群よりも５倍まで大きい。第１１表および第１２表からの結果はあわせて、ＭＰＬアジュバントの作用機序におけるインターフェロンガンマの役割を支持するものである。実施例２２−ＦｌｕＤワクチン組成物の評価前記実施例は、３Ｄ−ＭＰＬがワクチンの効力を向上することを示すので、追加抗原注射が防御にとって必要であるかどうかを決める研究を行う。マウスに５０μｇのＤを１回皮下注射して予防接種し、７週間後に２ＬＤ₅₀Ａ／ＰＲ／８／３４で攻撃する。あるいは、第２群に同じ抗原量を３週に追加抗原注射する。３Ｄ−ＭＰＬ量は１２５μｇである。ｆｌｕＤは水酸化アルミニウム、アルミニウム＋３Ｄ−ＭＰＬまたはＣＦＡをアジュバントとする。各アジュバントについて対照実験を行う。以下の第１３表の結果（実施例２３に示す）は、ワクチン組成物中に、５０μ ｇの抗原と共に３Ｄ−ＭＰＬ（１２５μｇ）を配合すると、同じ量のアルミニウムに吸着させたワクチンタンパク質と比較した場合、１または２回の注射のいずれかを受けたマウスにおける生存率が著しく増加する。また、Ａｌ／ＭＰＬ群における生存率はＣＦＡにおいてみられる生存率に匹敵する。実施例２３−細胞毒性Ｔリンパ球検定 in vitro Ｔ細胞検定に用いる方法の詳細な記載は、エス・ディロンら（前掲）に記載されている。記憶ＣＴＬを検出するための検定を、前記されているようにウイルスでの２回目のin vitro刺激の後で行う［エフ・エニス（F.Ennis）ら、ランセット（Lnacet），ＩＩ：８８７−８９１（１９８１）；ヤマダ（Yamada ）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（J.Exp.Med.）１６２：６６３−６７４（１９８５）；およびケイ・クワノ（K.Kuwano）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（J.Exp.Med.）１６９：１３６１−１３７１（１９８９）参照］。簡単には、免疫または対照マウスからの脾臓またはリンパ節細胞を６：１の比でインフルエンザウイルス感染同系脾臓細胞と共に５日間培養する。培地は１０％ウシ胎児血清［ハイクローン・ラボラトリース（Hy clone Laboratories）、ユタ州、ロガン］、２ｍＭグルタミン、５×１０^-5Ｍ２ −ＭＥ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０である。５０μｇのＤタンパク質の注射を１または２回（０および３週）受けたマウスからの脾臓を７週に摘出し、前記のようにしてin vitroで再刺激する。１溶解単位（ＬＵ₃₅）を３５％溶解に必要なクロム放出検定（回帰分析により決定）におけるエフェクター細胞の数と定義する。第１３表は、水酸化アルミニウムおよび３Ｄ−ＭＰＬ中ＳＫ＆Ｆ１０６１６０（Ｄタンパク質）で免疫化したマウスのこれらの脾臓におけるＨ１Ｎ１−特異性ＣＴＬ活性の結果を示す。この実施例の実験において、３Ｄ−ＭＰＬは第１３表に示すように水酸化アルミニウム（Ａｌ⁺³で示す）で生じる応答に関してクラスＩ制限メモリーＣＤ８＋ＣＴＬを活性化しない。加えて、第１３表の結果は、脾臓ＣＴＬを皮下注射を１回施したマウス対２回施したマウスにおいて比較すると、防御は２回目の注射を受けたマウスにおいて明らかに向上した。このように、ＣＤ８＋ＣＴＬ以外の機序は、抗原性ペプチドおよびアルミニウムアジュバントを含有するワクチン組成物中に３Ｄ−ＭＰＬが配合された場合またはマウスに追加抗原注射を施した場合に見られる向上した免疫性の原因であると考えられる。実施例２４−瀉血研究どのＴ細胞サブセットが３Ｄ−ＭＰＬアジュバントの活性ともっとも相関しているかを調べるために、抗−ＣＤ−４または抗−ＣＤ−８単クローン抗体（Mab ）に関して瀉血試験を行う。最初の研究は以下のようにして、Ｔ細胞サブセット瀉血に関する予防接種後の方法を用いて行う。マウス（１群１５匹）に５０μｇのＡｌ／３Ｄ−ＭＰＬ中ｆｌｕＤ（ＳＫ＆Ｆ１０６１６０）を０および２１日に２回皮下注射して免疫化し、５ＬＤ₅₀量のＡ／ＰＲ／８／３４で４２日に攻撃する。抗体（３００μｇ／マウス）を攻撃前、予防接種後３２、３３、３４、３９、４０および４１日、攻撃後４３、４８および５３日に腹腔内投与する。別の研究において、マウスをMabで処置して、−３、−２、−１日にワクチンの初回注射（予防接種前の方法）の前にＴ細胞サブセットを瀉血する。０日に予防接種後、マウスを７、１４、１８、１９および２０日にMabでさらに処置し、次に２１日にワクチンで追加刺激する。マウスをさらに４２日にウイルス攻撃する前に、２８、３５、３９、４０および４１日にMabで処置する。マウスをさらに攻撃後４３、４９および５４日にMabで処置する。これらのＴ細胞サブセット瀉血実験の結果を以下の第１４表に示す。結果から、予防接種の有効性により、マウスをＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのいずれかの瀉血をした場合に減少し、効果はＭａｂ処置を予防接種前に始めた場合に著しいことがわかる。したがって、これらの結果は、Ａｌ／ＭＰＬ処方中ｆｌｕＤワクチンの作用機序がＴ細胞媒介性であり、両方のＴ細胞サブセットが活性のために必要であることを明確に示すものである。ガンマインターフェロンの産生は防御と相関するので（第１１表）、予防接種したマウスにおけるこのサイトカインの産生に関与するＴ細胞の表現型を調べる研究を行う。マウスを抗−ＣＤ４または抗−ＣＤ８Ｍａｂを毎日３日間腹腔内注射（３００μｇ／注射）することによりＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺Ｔ細胞サブセットを瀉血する。最後のMab注射の４日後に、マウスを２０μｇ水酸化アルミニウム（１００μｇ）および３Ｄ−ＭＰＬ（２０μｇ）中ｆｌｕＤ処方で免疫化し、７日後にリンパ節を摘出する。リンパ節細胞をin vitroで０、１または１０μｇ／ｍｌのＤタンパク質で再剌激し、上清をインターフェロンおよびＩＬ−２検定用に１〜４日に集める。第５図の結果は、ＩＬ−２産生が抗−ＣＤ４処理により完全になくなり、抗−ＣＤ−８−処置マウスにおいては部分的に減少することを示す（第５Ｂ図）。最大ＩＦＮγ産生（４日上清）は抗−ＣＤ４または抗−ＣＤ８処置マウスにおいて約５０％まで減少する（第５Ｃ図）。したがって、ＣＤ４⁺ およびＣＤ８⁺のＴ細胞サブセットは共にＩＬ−２およびＩＦＮγを産生する。前記実施例はアルミニウム＋３Ｄ−ＭＰＬを配合した組み換えインフルエンザＨ１Ｎ１ワクチンはウイルス清掃率および生存率を促進し、致死攻撃に対して著しい防御を得るのに必要な抗原量を減少させ、ＣＦＡに関してみられるのと等しい効力レベルにする。今まで集めたデータはこの組み換えインフルエンザワクチンの活性を向上させるように３Ｄ−ＭＰＬが作用する機序がＣＤ４⁺Ｔ細胞応答の選択的有効化により、ＩＬ−２およびＩＦＮγを産生するＴＨ１型細胞に限定される証拠を示す。実施例２５−スプリットウイルスの調製サクシスケス・セルムベルクル株式会社（Sachsishes Serumwerkl GmbH）（ＳＳＷ）（ドイツ、ドレスデン）により製造されているようなスプリットウイルスを公知の方法、例えば、欧州薬局方ＰＡ／ＰＨ／Exp３（１９９２）；ＤＡＢ１０「ワクチン・インフルエンザ・イーエッスク・ヴィロラム・フラグメンティス・プラエパラタム（Vaccines Influenzae ex virorum fragmentis praeparatum ）」、および世界保健機構のインフルエンザワクチン（不活化）に関する改正要件議案（１９９０）に記載されているような方法により調製する。このようなスプリットウイルスをＷＨＯおよびＥＥＣにより推薦される１またはそれ以上のインフルエンザウイルス株、例えば、Ａ／シンガポール／６／８６、Ａ／ペキン／３２／９２およびＢ／パナマ／４５／９０を用いて調製する。これらの株は、特定の年数に応じて変化する。他により詳細に記載されているように、インフルエンザウイルスはシードロット物質を接種した胚含有鶏卵から得られる。これらのウイルス懸濁液を部分的に精製し、濃縮する。濃縮したウイルス懸濁液を界面活性剤、デスオキシコール酸ナトリウムで処理して、ウイルス粒子を破壊（または「スプリット」）する。ウイルスリン脂質をスプリットプロセス中に除去した後、反応原性は大きく減少する。スプリットウイルス懸濁液を界面活性剤およびホルムアルデヒドの効果により完全に不活化する。より詳細には、本発明のスプリットウイルスの製造法は以下のとおりである。Ａ．１価完全ウイルス接種物の調製胚含有卵の接種の日、インフルエンザワーキングシードロットを０.５ｍｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンを含有するリン酸緩衝液と混合することにより新しい接種物を調製する。ウイルス接種物を２〜８℃に維持する。９〜１１日の胚含有卵をウイルス複製に用いる。製造工場に到着する前に卵を農場で暖め、殻の浄化後、生産室にいれる。卵に０.２ｍｌウイルス接種物を自動卵接種装置により接種する。接種物を±０.０３ＭＰａの圧力で注射する。接種した卵を適当な温度（ウイルス株に依存）で５０〜９６時間郷化させる。郷化期間の終わりに、卵を冷却し、２〜８℃で１２〜６０時間保存することにより胚を殺す。冷却卵からの尿膜腔液を適当な卵収穫機により回収する。通常、卵１個あたり８〜１０ｍｌの粗尿膜腔液が得られる。粗１価ウイルスバルクに０.１００ｍｇ／ｍｌのチオメルサールを添加する。収穫した尿膜腔液を１００〜２００Ｌ／時の容積および１０〜１７０００ｇの遠心力で遠心分離することにより清澄化する。この清澄化前液体はさらに６〜８ μｍ膜フィルター上で清澄化できる。清澄化ウイルスプール中ＣａＨＰＯ₄ゲルを得るために、０.５ＭＮａ₂ＨＰＯ₄ および０.５ＭＣａＣｌ₂溶液を添加して、ＣａＨＰＯ₄の最終濃度をウイルス株に応じて１.５ｇ〜３.５ｇＣａＨＰＯ₄／リットルにする。少なくとも１０時間沈降させた後、上清を除去し、０.２６ＭＥＤＴＡ溶液を添加することによりインフルエンザウイルスを含有する沈殿をを再溶解する。ＥＤＴＡの濃度は元の収穫容積１リットル当たり４.５〜１０ｇの間である。再懸濁沈殿を６〜８μｍフィルター膜上を濾過する。インフルエンザウイルスを直線シュークロース勾配（０〜５５％）、９００００ｇで等密度遠心分離により濃縮する。流量は８〜１２リットル／時である。遠心分離の終わりに、ローターの内容物を４つの異なるフラクションを回収する（シュークロースを屈折計で測定する）： −フラクション１：５５〜５２％シュークロース −フラクション２：５２〜３８％シュークロース −フラクション３：３８〜２０％シュークロース −フラクション４：２０〜０％シュークロースさらにワクチンを調製するために、フラクション２および３のみを用いる。フラクション３を希釈して、スクロース含量を約６％に減少させる。この希釈フラクション中に存在するインフルエンザウイルスを５３,０００ｇでペレット化して、可溶性汚染物質を除去する。ペレットを再懸濁し、よく混合して均質な懸濁液を得る。フラクション２およびフラクション３の再懸濁したペレットをプールし、燐酸緩衝液を添加して、容積を３０リットルにする。この段階で、生成物を「１価完全ウイルス濃縮物」と称する。Ｂ．スプリットウイルス１価バルク選択されたインフルエンザウイルス、好ましくは、前項Ａの１価完全ウイルス濃縮物を７０,０００ｇで１,２〜１,５％のデスオキシコール酸ナトリウムの直線的分布を含むNadoc直線シュークロース勾配により破壊する。ツィーン８０は勾配中０.１％で存在する。ウイルス濃縮物を５リットル／時の速度で供給する。遠心分離の終わりに、ローターの内容物を３つの異なるフラクションにより回収する：フラクション１：５５〜４０％シュークロースフラクション２：４０〜１３％シュークロースフラクション３：１３〜０％シュークロース赤血球凝集素をフラクション２中に濃縮する。チオメルサールを０.０１％、ツィーン８０を０.０１％で含有するリン酸緩衝液を添加して、フラクションを４倍に希釈する（±５リットル）。希釈したフラクション２を最後が０.２μｍ膜の複数のフィルター膜上で濾過する。濾過の最後に、フィルターを０.０１％チオメルサールおよび０.０１％ツィーン８０を含有する燐酸緩衝液で洗浄する。その結果、濾過されたフラクション２の最終容積は、元のフラクション容積の５倍である。ウイルス株に応じて、スプリットウイルス物質の短時間超音波処理を導入して滅菌濾過を促進できる。濾過した１価スプリット物質を２２±２℃で少なくとも８４時間培養して、デスオキシコール酸ナトリウムの効果によりウイルスおよびマイコプラズマの不活化を行う。この培養時間の後、全タンパク質含量を最大２５０μｇ／ｍｌに下げるために０.０１％チオメルサールおよび０.０１％ツィーン８０を含有するリン酸緩衝液を添加する。ホルムアルデヒドを５０μｇ／ｍｌの割合で添加すると、４℃±２℃で少なくとも７２時間不活化が起こる。不活化スプリットウイルス物質を平均孔径が２００００ダルトンの膜上限外濾過する。限外濾過中、ホルムアルデヒド、ＮａＤＯＣおよびサッカロースの含量は大きく減少する。限外濾過（透析濾過）中、０.０１％チオメルサールおよび０.０１％ツィーンを含有するリン酸緩衝液の添加により、容積は一定に保たれる。限外濾過スプリット物質を最後に０.２μｍの膜上濾過に付す。ウイルス株に応じて最終濾過膜は０.８μｍであってもよい。この段階で、生成物を「１価最終バルク」と称する。１価最終バルクを２〜８℃で最大１８箇月間貯蔵する。実施例２６−スプリットウイルスワクチン組成物（ａ）粒径が６０〜１２０ｎｍのＭＰＬの調製注射用水を凍結乾燥した３脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）（リビ・イムノケム（Ribi Immunochem）、モンタナ州より入手）を入れたバイアル中に注射器を用いて注入し、１〜２ｍｇ／ｍｌの濃度にする。撹拌機を用いて混合することにより予備懸濁液を得る。バイアルの内容物を次に２５ｍｌ丸底コレックス（Corex）管（懸濁液１０ｍｌ／管）に移し、懸濁液を水浴音波処理器を用いて超音波処理する。懸濁液が透明になったら、粒子の大きさを動的光散乱を用いて評価する（マルバーン・ゼタサイザー（Malvern Zetasizer）３）。ＭＰＬ粒子の大きさが６０〜１２０ｎｍの範囲、好ましくは１００ｎｍ未満になるまで処理を続ける。懸濁液は、ある場合には、５箇月まで著しく凝集することなく４℃で貯蔵できる。等張ＮａＣｌ（０.１５Ｍ）または等張ＮａＣｌ＋１０ｍＭ燐酸塩により、迅速な凝集が誘起される（大きさ＞３〜５μｍ）。（ｂ）本発明のスプリットウイルスワクチン組成物を以下のように調製する。最終バルク緩衝液を、注射用水に濃縮塩溶液：ＮａＣｌ４ｍｇ；Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ０.５２ｍｇ；ＫＨ₂ＰＯ₄０.１９ｍｇ；ＫＣｌ０.１ｍｇ；ＭｇＣｌ₂０.０５ｍｇおよびチオメルサール５０μｇを添加することにより調製する。得られた溶液を使用する前に１５分間撹拌する。ついで、１価スプリットウイルスバルク（１５μｇＨＡ）を、３Ｄ−ＭＰＬ５０μｇと混合し、得られた混合物を室温（または周囲温度）で約１時間撹拌する。緩衝混合物およびウイルスバルク混合物を次に一緒に混合する。３０分室温で撹拌した後、ｐＨを７.１５±０.１にする。得られた最終ワクチンを＋２〜＋８ ℃で保存する。多価スプリットウイルスワクチン、例えば３価ワクチンを調製するために、前記のようにして調製した選択された株の一価スプリットウイルス貯蔵物を混合して最終多価ワクチンを構築する。得られたプール物質を室温で３０分間撹拌する（ｐＨ７.１５±０.１）。得られた最終ワクチンを約２℃から約８℃の間の温度で保存してもよい。ワクチンは無色半乳白色の精製スプリットインフルエンザウイルスの水性懸濁液である。以下の実施例の試験における比較のために、ワクチン調製物をアジュバントなしで調製する。この対照ワクチンについて、注射用水に濃縮塩溶液：ＮａＣｌ４ｍｇ；Ｎａ₂ＨＰＯ₄０.５２ｍｇ；ＫＨ₂ＰＯ₄０.１９ｍｇ；ＫＣｌ０.１ｍｇ；ＭｇＣｌ₂０.０５ｍｇ；およびチオメルサール５０μｇを添加して最終１価バルク緩衝液を調製する。得られた溶液を使用前に１５分間撹拌する。混合物を室温で１５分間撹拌する。１価バルク（１５μｇＨＡ）を添加し、続いて３０分間室温で撹拌する（ｐＨ７.１５±０.１）。得られた最終ワクチンを室温で＋２℃ 〜＋８℃の間の温度で貯蔵する。本発明の２つの１価ワクチン組成物および１価対照ワクチンを、次の実施例に用いるために、３Ｄ−ＭＰＬ５０μｇ（実施例２６（ａ）から得られる粒径＜１００ｎｍ）と混合したＨ１Ｎ１株、Ａ／ＰＲ／８およびシンガポールを用いて調製する。実施例２７−マウスにおける致死攻撃本発明の１価ワクチン組成物の免疫原性を評価し、１価非アジュバント化処方の免疫原性および抗原なしのアジュバント３Ｄ−ＭＰＬと、マウスにおける致死インフルエンザ攻撃に関して比較する。各ワクチンに関して、ＣＢ６Ｆ₁マウス（１群３０匹）を５μｇの示した株± ５μｇの３Ｄ−ＭＰＬを含有する調製物を３週間間隔で２回皮下注射して免疫化する。初回注射の７週間後、マウスをメトファン麻酔下、５ＬＤ₅₀のＡ／ＰＲ／８で鼻腔内から攻撃する。生存率および病気の臨床的兆候を攻撃後３週間まで１５匹のマウスについてモニターする。肺ウイルス力価を残りの動物（１群５匹）についてＭＤＣＫミクロアッセイにより測定する［エイ・エル・フランク（A.L. Frank）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（J.Clin.Mi crobiol.）１２：４２６−４３２（１９８０）］。結果を以下の第１５表に示す。２株（Ａ／ＰＲ／８およびシンガポール）はある程度のレベルの防御を誘起する。両群に関する生存率は、抗原を含まない対照調製物（Ａｌｕｍ＋３Ｄ−ＭＰＬ）よりも著しく高く、肺ウイルス清掃率も早い。当然ながら、Ａ／ＰＲ／８− 接種群（攻撃に関して相同性）はシンガポール接種群（攻撃に関して異種）よりも優れている。さらに、３Ｄ−ＭＰＬを補足した両株は１００％生存率を誘起し、実際肺ウイルス力価はなく、臨床的症状もない。明らかに、本発明の３Ｄ−ＭＰＬをアジュバントとしたワクチンは下部気道感染およびウイルス性肺炎などの重度の臨床的兆候に対して優れた防御を誘起する。この実験から、３Ｄ−ＭＰＬをアジュバントとして添加することにより、スプリットワクチンのホモ亜型およびヘテロ亜型活性が向上し、したがって抗原性シフトおよびドリフトに対して、非アジュバント化ワクチンよりも広範囲の防御が得られることが予想できる。実施例２８−マウスにおける非致死攻撃マウスを鼻腔内攻撃の前に麻酔しない以外は前記実施例２５と同様の方法である。気道におけるウイルス滴定、ウイルス中和検定および気管の走査電子顕微鏡検査を行う。Ａ／ＰＲ／８ウイルスに対するウイルス中和滴定を攻撃後１、５および９日に行う（第１６表）。両方のＡ／ＰＲ／８群は３Ｄ−ＭＰＬの存在下で力価が常に高い中和抗体を産生する。対照的に、シンガポールでの予防接種は３Ｄ−ＭＰＬを添加しても中和抗体を誘起しない。これは、先にシンガポールおよび３Ｄ−ＭＰＬで観察されたヘテロ亜型活性は抗体によるものでなく、細胞免疫によるものであることを示すものである。気管の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を３および５日に収穫したサンプルに関して行う。組織を気管、特に剥離片中にある重度の繊毛を有する上皮細胞における組織病理学的変化に関して評価する。これらの変化は、進行中のインフルエンザ感染の程度または感染からの回復度を示す（以下の第１７表参照）。ＳＥＭの結果は、Ａ／ＰＲ／８またはシンガポール株単独での予防接種により防御が得られ、両方の場合、正の効果が３Ｄ−ＭＰＬの添加により向上し、それにより、アジュバントを添加したスプリットワクチンはインフルエンザの進行を変えることを示す。ウイルス力価を鼻、気管および肺において攻撃後１、３、５、７および９日にＭＤＣＫミクロアッセイにより測定する（１群５匹）。結果を以下の第６Ａから６Ｆ図に示す。当然ながら、鼻力価は気管または肺力価よりも高い。しかし、すべての試験した治療は鼻または気管力価における明らかな違いを示さない。対照的に、肺力価は区別される：Ａ／ＰＲ／８＋３Ｄ−ＭＰＬおよびシンガポール＋３Ｄ−ＭＰＬ力価は常に抗原単独、または３Ｄ−ＭＰＬ単独の値以下である（第６Ａ図から６Ｆ図）。これは、３Ｄ−ＭＰＬアジュバント化により、マウスにおいて優れた肺防御が得られることを示す。マウス実験の両組（致死および非致死攻撃）は２つのＨ₁Ｎ₁の亜型（シンガポールまたはＡ／ＰＲ／８）およびそれに続くホモタイプ攻撃は本発明のアジュバントとしての本発明の３Ｄ−ＭＰＬの配合により向上することを示す。実施例２９−ワクチンの免疫原性各ワクチンに関して、ＣＢ６Ｆ₁マウス（１群１５匹）を通常の非アジュバント化シンガポール１価スプリットワクチンまたはシンガポール株および３Ｄ−ＭＰＬを含有する本発明のワクチン組成物のヒト用量の１／１０を含む調製物を３週間間隔で２回皮下注射して免疫化する。ヒト用量は、各ウイルス株の１５μｇＨＡを含有する注射０.５ｍｌと定義する。本発明において用いる処方は赤血球凝集素（ＨＡ）の３Ｄ−ＭＰＬに対する比が１.５μｇＨＡ／５μｇ３Ｄ−ＭＰＬないし５μｇＨＡ／５μｇ３Ｄ−ＭＰＬの成分を含む。２回目の注射の３週間後、マウスを採血し、血清抗体をそれぞれ赤血球凝集の阻害により検定する。力価を校正基準に対して計算する。マウスは抗体力価がカットオフ値よりも大きい場合応答動物と考えられる。結果を第１８表に示す。両方の型の処方はすべての動物において抗赤血球凝集抗体を誘起し、血清応答率が最大である。しかし、免疫応答は、シンガポール株のみを含有するワクチンよりも５倍大きい幾何平均価で示されるように、本発明の３Ｄ−ＭＰＬを含有するワクチン処方により著しく向上する。この実験は、マウスにおける抗体応答が、本発明の３Ｄ−ＭＰＬアジュバント化ワクチンの使用により向上することを示す。実施例３０−モルモットにおける過敏性研究３Ｄ−ＭＰＬ（粒度＜１００ｎｍ、実施例２６）の３価スプリットワクチンへの添加が過敏性を修飾するかどうかを調べるために過敏性研究をモルモットにおいて行う。３価インフルスプリットで表わす３価ワクチンを実施例２５に記載したようにして調製し、これはＨ１Ｎ１株シンガポール／６／８６、Ｈ３Ｎ２株ペキン／３５３／８４およびＢ型株、Ｂ／ヤマガタ／１６／８８を含有する。増感薬［尿膜腔液０.５または２.５ｍｇ±３Ｄ−ＭＰＬ５０μｇ；１ヒト用量（インフルエンザウイルスのこれらの株それぞれに関して１５μｇＨＡを含有する０.５ｍｌ注射）３価インフルスプリット±３Ｄ−ＭＰＬ５０μｇ］を０、３、５、７、１０および１２日に６回腹腔内注射により投与する。モルモットを４週間休ませ、次に麻酔下で攻撃剤（尿膜腔液０.４５ｍｇ；１ヒト用量３価インフルスプリット±３Ｄ−ＭＰＬ５０μｇ）で静脈内攻撃する。動物を攻撃後３０分観察し、さらに２または３時間観察する。観察される症状（創傷、呼吸障害、けいれん、死亡）を記録する。１回目の攻撃から症状が起こらない場合、動物を尿膜腔液（１.３ｍｇ）で２４時間後に再攻撃する。この試験の結果を以下の第１９Ａ表および第１９Ｂ表に示す。１〜３群（負の対照）に関して効果がないことは、過敏性は腹腔内感作を必要とすることを示す。５群において過敏性がないことは、インフルスプリットが尿膜腔液を感作できないことを示す。６群からも同様の結論が引き出せる（尿膜腔液およびインフルスプリットを用いた攻撃に対する感作）。実際、５および６群の結果もワクチンが尿膜腔液タンパク質の残渣を含有しないことを示す。増感剤（７および８群）または攻撃剤（９群）のいずれかへの３Ｄ−ＭＰＬの添加は応答を変えない（７対４群、８対５群、９対６群の比較）。この実験は、３Ｄ−ＭＰＬと共にまたは単独で攻撃剤として投与された３価インフルスプリットワクチンは予め尿膜腔液で過感作された動物において過敏性反応を引き起こすことができず、実験条件内で、３Ｄ−ＭＰＬは過感作反応に対して著しい影響を及ぼさない。したがって、本発明のワクチン組成物は哺乳動物への投与に関して安全である。本発明の種々の修正および変更は前記明細書に含まれ、当業者には自明であると考えられる。このような本発明の組成物およびプロセスの修正および変更は特許請求の範囲内に含まれると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＴＪ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ディロン，スーザンアメリカ合衆国ペンシルベニア州19317、チャッズ・フォード、レイベン・ドライブ 17番 (72)発明者ニシカワ，ヒロトシアメリカ合衆国ペンシルベニア州19041、ハバーフォード、カーナボン・レーン31番 (72)発明者モンテ，ポール・ダルアメリカ合衆国ペンシルベニア州19341、イクストン、アバーデア・レーン106番 (72)発明者ジュリック，ロバート・ジェイアメリカ合衆国ニューハンプシャー州 03833、エクセター、アシュブルック・ロード12番 (72)発明者ギャルソン−ジョンソン，ナタリー・マリー−ジョセフ・クロードベルギー国ベー―1330リクセンザルト、リュ・デュ・ランスティテュート89番スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム)

Claims

【特許請求の範囲】１．インフルエンザ抗原に対して向上した免疫応答惹起能を有するワクチン組成物であって、有効量の該インフルエンザ抗原および３Ｄ−ＭＰＬからなるワクチン組成物。２．該インフルエンザ抗原が抗原性ポリペプチドである請求項１記載のワクチン組成物。３．該抗原性ポリペプチドが、Ｄタンパク質のＮＳ１_1-81ＨＡ２_65-222、ＮＳ１_1-81ＨＡ２_1-222、ＨＡ２_66-222、△Ｍ、△Ｍ＋、Ａ、Ｃ、Ｃ１３、Ｃ１３ショートおよび△Ｄ、シス−レスＤ、ＨＡ２_66-222、およびＮＳ１Ｈ３Ａ２構築物からなる群より選択される請求項１記載のワクチン組成物。４．該組成物が少なくとも１個のスプリットインフルエンザウイルスからなる請求項１記載のワクチン組成物。５．該組成物が少なくとも３株のインフルエンザウイルスに対して反応性を有する３種のスプリットウイルスからなる請求項４記載のワクチン組成物。６．該株が、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、およびＢ型インフルエンザ株から選択される請求項４記載のワクチン組成物。７．該スプリットウイルスが、Ａ／ＰＲ／８、Ａ／シンガポール、Ａ／ウドーン（Udorn）、Ａ／ビクトリア、Ａ／テキサス、Ａ／ペキン、Ａ／プエルトリコ、Ｂ／パナマ、Ｂ／ヤマガタ（Yamaghta）、Ｂ／リー／４０およびＢ／タイワンからなるインフルエンザ株の群に由来する請求項６記載のワクチン組成物。８．さらにアルミニウム含有アジュバントからなる請求項１記載のワクチン組成物。９．該アジュバントが水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムである請求項８記載のワクチン組成物。１０．インフルエンザ抗原がＮＳ１_11-81ＨＡ２_65-222、Ｄタンパク質である請求項９記載のワクチン組成物。１１．約１μｇ〜約１０００μｇのＤタンパク質および約１μｇ〜約５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬからなる請求項１０記載のワクチン組成物。１２．Ｄタンパク質の量が約２μｇであり、３Ｄ−ＭＰＬの量が約２０μｇである請求項１１記載のワクチン組成物。１３．該抗原がＤタンパク質であり、該組成物が約５０μｇ〜約５００μｇのＤタンパク質、約１０μｇ〜約５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬおよび約１００μｇ〜約５００μｇのアルミニウムアジュバントからなる請求項３記載のワクチン組成物。１４．さらにリポソーム調製物からなり、該リポソーム調製物が、長鎖脂肪族または芳香族を基礎とする酸またはアミンを含むリポソーム形成物質と、該酸またはアミンの電荷と反対の電荷の水和剤であって、該酸またはアミンに対して１：２０〜１：０．０５のモル比で存在する水和剤と、組成物中に存在する固体に対して３００モルまでの量の水とからなる請求項１〜１３のいずれかに記載のワクチン組成物。１５．約５０μｇ〜約５００μｇのＤタンパク質と、約１０μｇ〜約５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬと、約１ｍｇ〜約１０ｍｇのリポソーム調製物とからなる請求項１４記載のワクチン組成物。１６．該抗原がｆｌｕＤであり、約５０μｇ〜約５００μｇのＤタンパク質、約１０μｇ〜約５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇのリポソーム調製物および約１００μｇ〜約５００μｇのアルミニウムアジュバントからなる請求項１４記載のワクチン組成物。１７．水和剤が、カルボキシレート、アミノまたはグアニド基であるオメガ置換基を有するアルファアミノ酸あるいはその医薬上許容される塩であるか、または式：Ｘ−(ＣＨ₂)n−ＹＩ［式中、ＸはＨ₂Ｎ−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ−、Ｈ₂Ｎ−、ＺＯ₃Ｓ−、Ｚ₂Ｏ₃Ｐ−またはＺＯ₂ Ｃ−であり（ここに、ＺはＨまたは無機または有機カチオンである）；Ｙは−ＣＨ(ＮＨ₂)−ＣＯ₂Ｈ、−ＮＨ₂、−ＮＨ−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ₂−ＣＯＯＨ、ＣＨ(ＮＨ₂)ＳＯ₃ＺまたはＺＨ(ＮＨ₂)ＰＯ₃Ｚ₂であり（ここに、Ｚは前記と同意義である）；ｎは１〜１０の整数を意味する］で示される化合物またはその医薬上許容される塩であり、酸またはアミンが炭素数１０〜２０のアルキルまたはアルケニル酸またはアミンである請求項１４〜１６のいずれかに記載のワクチン組成物。１８．該水和剤が、アルギニン、ホモアルギニン、そのＮ−アシル誘導体、ガンマ−アミノ酪酸、アスパラギン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、または式：Ｈ₂ＮＣ(ＮＨ)−ＮＨ−(ＣＨ₂)n−ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＯＯＨ II Ｈ₂Ｎ−(ＣＨ₂)n−ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＯＯＨ III Ｈ₂Ｎ−(ＣＨ₂)n−ＮＨ₂ IV Ｈ₂ＮＣ(ＮＨ)−ＮＨ−(ＣＨ₂)n−ＮＨ−ＣＨ(ＮＨ)−ＮＨ₂ ＶＨＯＯＣ−(ＣＨ₂)n−ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＯＯＨ VI ＨＯＯＣ−(ＣＨ₂)n−ＣＯＯＨ VII ＨＯ₃Ｓ−(ＣＨ₂)n−ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＯＯＨ VIII Ｈ₂Ｏ₃Ｓ−(ＣＨ₂)n−ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＯＯＨ IX ＨＯ₃Ｓ−(ＣＨ₂)n−ＣＨ(ＮＨ₂)ＳＯ₃ＨＸまたはＨ₂Ｏ₃Ｓ−（ＣＨ₂）n−ＣＨ（ＮＨ₂）ＰＯ₃Ｈ₂ XI （式中、ｎは２〜４は意味する）で示される化合物またはその医薬上許容される塩である請求項１７記載のワクチン組成物。１９．３Ｄ−ＭＰＬの粒径が１２０ｎｍを越えない請求項１〜１８のいずれかに記載のワクチン組成物。２０．該粒径が６０〜１２０ｎｍの範囲にある請求項１９記載のワクチン組成物。２１．該粒径が１００ｎｍ未満である請求項１９または２０記載のワクチン組成物。２２．請求項１のワクチン組成物を哺乳動物に内部投与する工程からなるインフルエンザ抗原に対する免疫応答の強化方法。２３．インフルエンザ抗原に対する免疫応答を向上させる医薬の製造における請求項１に記載のワクチン組成物の使用。２４．該抗原および３Ｄ−ＭＰＬを混合することからなる請求項１に記載のワクチン組成物の製法。