MX2012007916A - Metodos y composiciones para proporcionar inmunidad protectora en los adultos mayores. - Google Patents

Abstract

Composiciones que incluyen una proteína de flagelina/antígeno que comprenden al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antígeno, y los métodos para la administración de estas composiciones a humanos de al menos 49 años de edad. Las composiciones estimulan la respuesta inmune al antígeno, en particular, una respuesta inmunoprotectora al antígeno, en el humano, tal como un adulto mayor humano.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA PROPORCIONAR INMUNIDAD PROTECTORA EN LOS ADULTOS MAYORES REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de la fecha de presentación de la Solicitud Provisional Estadounidense No. 61/292,593 presentada el 6 de enero de 2010; cuya divulgación se incorpora en este documento mediante referencia .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Muchos adultos mayores humanos (mayores de 65 años) han sido inmunizados o expuestos a muchas enfermedades, tales como la influenza, y aún muchos requieren inmunización para permanecer saludables. La respuesta inmune a la inmunización activa tiende a reducirse con la edad.

La mejora de la respuesta de las vacunas contra la influenza ha sido una iniciativa principal desde los años 1970 (Mostow, SR. , et al., (1973), Inactive vaccines in Volunteer studies with very high doses of influenza vaccine purified by zonal centrifugation, Postgrad Med., J. 49: 152-158) . Numerosos investigadores han explorado el efecto de las dosis de la hemaglutinina (HA) mayores a la dosis estándar de 15 µ?. El esfuerzo más exhaustivo y bien documentado para proporcionar una vacuna contra la gripe eficaz para los adultos mayores, a involucrado FluZone®. Estos ensayos exitosos (Keitel et al., (2006) Safety of High Doses of Influenza Vaccine and Effect on Antibody Responses in Elderly Persons, Arch. Intern. Med. 166: 1121-1127 (Tabla 1); Couch et al., (2007) Safety and immunogenicity of a High-dose Trivalent Influenza Vaccine among Elderly Subjects Vaccine 25:7656-7663 (Tabla 2) y Falsey et al., (200) Randomized, double-blind controlled phase 3 trial comparing the immunogenicity of high-dose and standard-dose influenza vaccine in adults 65 years and older, J. Infect. Dis. 200: 172-180 (Tabla 3)), han demostrado que el incremento en la dosis de HA de 15 \xq a 60 g, enfocada en el componente de HA; arroja una mejora en las concentraciones de HA1 de alrededor de 1.6 a 1.7 veces .

Tabla 1. Keitel, Arch. Int. Med. 2006 Tabla 2. Adultos Mayores, Couch. Vacuna 2007 Tabla 3. Flasey, Treanor, JID, 2009, Dosis estándar vs . 60 µg en 3876 sujetos Estudios más agresivos con dosis tan altas como 405 g (Keitel, et al. (1994) High doses of purified influenza A virus hemagglutinin significantly augment serum and nasal secretion antibody responses in healty young adults. J. Clin. Microbiol 32: 2468-2473; (Tabla 4) Keitel et al., (1996) Increased doses of purified influenza hemagglutinin and subvirion vaccines enhance antibody responses in the elderly. Clin. Diang. Lab. Immunol. 3:507-210 (Tabla 5) ) resultaron en una mejora de aproximadamente 2.1 veces en concentraciones de HAI.

Tabla 4. Keitel, Couch, J. Clin. Microbiol. 1994, HA pura, olivada con bromelina, vs . VX estándar.

Tabla 5. Adultos Mayores, Keitel, Clin. Diag. Lab. 1996, HA Purificada vs . Sub iriones Normales Otros estudios que demuestran los efectos de la de la influenza en los adultos mayores, se muestran siguientes tablas.

Tabla 6. Dosis incrementada o acelerador en Adultos Mayores, Cools et al., J. Med. Virol . 2009, 15 g , 15+30 g, 30+15 g Tabla 7. 7 AVP-MSD Vaxigrip vs . Fluad en Adultos Mayores , Squarcione, Sgricia, Biasio, Pernetti, Vacuna 2003 Tabla 8. Fluad vs Fluzone, Frey, Poland, Vacuna 2003 Adultos de 18-64 Tabla 9. Adultos Mayores, Treanor, JID 2006 En general, los adultos mayores son una población difícil para la vacunación contra la influenza. Mientras que el incremento en la cantidad de vacuna administrada proporciona algún beneficio, no es un incremento proporcional. Los adyuvantes también pueden ayudar al incremento de la inmunogenicidad, pero también incrementan la posibilidad de reacciones adversas. Por lo tanto, ha habido una mejora limitada en la aceleración de la respuesta inmune en los adultos mayores a la influenza al incrementar la cantidad de HA administrada. Aún existe una necesidad por formulaciones de vacuna mejoradas para los adultos mayores, que proporcionan inmunidad incrementada para los adultos mayores.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención está relacionada de manera general a los métodos de estimulación de respuestas inmunes en los humanos ancianos y adultos mayores. La presente invención incluye composiciones y métodos para la estimulación de una respuesta inmune en un humano, que comprende los pasos de la administración al humano de una composición que comprende al menos una porción de la menos una flagelina, y al menos una porción de al menos un antígeno, en donde la composición es administrada al humano en una dosis suficiente como para provocar una respuesta inmune en donde el humano es un adulto mayor, esto es, un humano que es mayor de 49 años de edad. En ciertas modalidades, las composiciones se administran a los humanos que son mayores a 55 años de edad, o mayores a 60 años de edad, o mayores a 65 años de edad o mayores a 70 años de edad o mayores a 75 años de edad o mayores a 80 años de edad.

Las composiciones de la presente invención comprenden al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antigeno. La flagelina y el antigeno pueden estar asociados de diferentes maneras. Por ejemplo, la flagelina y el antigeno pueden ser parte de una proteina de fusión en la que la porción de flagelina está asociada con el antigeno mediante la elaboración de una secuencia de ADN o ARN que cuando se expresa produce una proteina que contiene porciones tanto de flagelina como de antigeno como parte de una proteina. La porción de flagelina y la porción de antígeno pueden estar asociadas de otras maneras, por ejemplo, cada una de estas porciones puede estar asociada con una partícula o algún tipo de transportador en donde tanto la porción de flagelina como la porción de antígeno pueden estar fijadas al transportador o partícula.

La presente invención también se relaciona con composiciones y métodos para la estimulación de una respuesta inmune en una población humana de adultos mayores, comprendiendo el paso de administración a la población humana de una composición que incluye una proteina de fusión que comprende al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antigeno, en donde la tasa de seroconversión es de al menos 50% o al menos 60% o al menos 70% o al menos 80% o al menos 90% o al menos 95% o al menos 99%.

La presente invención también se relaciona con composiciones y métodos para la estimulación de una respuesta humana en una población humana de adultos mayores, comprendiendo el paso de la administración a la población humana de una composición que incluye una proteina de fusión que comprenda al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antigeno, en donde la tasa de serorespuesta es de al menos un 50% o al menos un 60% o al menos un 70% o al menos un 80% o al menos un 90% o al menos un 95% o al menos un 99%.

La presente invención también se relaciona con composiciones y métodos para la estimulación de una respuesta inmune en una población humana de adultos mayores, comprendiendo el paso de la administración a la población humana de una composición que incluye una proteina de fusión que comprende al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antigeno, en donde la tasa de seroproteccion es de al menos un 50% o al menos un 60% o al menos un 70% o al menos un 80% o al menos un 9'% o al menos un 95% o al menos un 99%.

DIBUJOS Figura 1 - Secuencia de aminoácidos de STF2-HA1 (VAX125) Figuras 2A y 2B - Representación gráfica de la respuesta pico a GM HAI medida 14 días después de la vacunación con VAX125 entre sujetos mayores a 65 años (Figura 2A) . Las concentraciones de GM HAI medidas desde el día 0 al dia 28 después de una sola dosis de VAX125 varían de 0.5 a Q entre sujetos mayores a 65 años (Figura 2B) .

Figura 3 - Mapa de plásmidos para Vax 128A, Vax 128B y Vax 128C.

Figura 4 - Secuencia de nucleótidos para VAX 128A (HL184 STF2.Hal-2 CA7 (CA07 H1N1) ) .

Figura 5 - Secuencia de aminoácidos para VAX 128A (HL184 STF2.Hal-2 CA7 (CA07 H1N1) ) .

Figura 6 - Secuencia de nucleótidos para VAX 128A (HL185 STF2.Hal-2 CA7 (CA07 H1N1)).

Figura 7 - Secuencia de aminoácidos para VAX 128A (HL185 STF2.Hal-2 CA7 (CA07 H1N1) ) .

Figura 8 - Secuencia de nucleótidos para VAX 128A (HL186 STF2.Hal-2 CA7 (CA07 H1N1) ) .

Figura 9 - Secuencia de aminoácidos para VAX 128A (HL186 STF2.Hal-2 CA7 (CA07 H1N1)).

Figura 10 - Comparación de respuesta inmune por dosis entre 112 sujetos de 18-49 años de edad y 100 sujetos mayores a 65 años de edad que recibieron una sola dosis IM de VAX128 (CA07) . Nota: las respuestas a VAX128A-C se han agrupado .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las características y otros detalles de la invención, ya sea como pasos de la invención o como combinaciones de las partes de la invención, serán descritas ahora más particularmente, y señaladas en las reivindicaciones. Se entenderá que las modalidades particulares de la invención se demuestran a manera de ilustración y no como limitaciones a la invención. Las características del principio de esta invención se pueden usar en varias modalidades sin apartarse del alcance de la invención .

En una modalidad, la invención es un método para la estimulación de una respuesta inmune en un humano, comprendiendo el paso de la administración al humano de una composición que comprende al menos una porción de al menos un antígeno y al menos una porción de al menos una flagelina, en donde la composición es administrada a un humano que tiene al menos 49 años de edad. La administración de la composición al humano puede proporcionar inmunidad contra una infección como consecuencia de la exposición del humano a una fuente del antigeno .

Las composiciones de la presente invención comprenden al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antigeno. La flagelina y el antigeno se pueden asociar de diferentes maneras. Por ejemplo, la flagelina y el antigeno pueden ser parte de una proteina de fusión en la que la porción de flagelina está asociada con el antigeno mediante la elaboración de secuencias de ADN o ARN que cuando se expresan producen una proteina que contiene porciones tanto de flagelina como de antigeno como parte de una proteina. La porción de flagelina y la porción del antigeno se pueden asociar de otras maneras, por ejemplo, cada una de estas porciones se puede asociar con una partícula o un transportador en donde tanto la porción de flagelina como la porción del antígeno, incluyendo, pero no limitado a, proteínas, lipoproteínas, carbohidratos, polisacáridos y/o lípidos, se pueden fijar al transportador o partícula. La partícula o el transportador pueden ser cualquier vehículo mediante el cual la porción de flagelina y la porción del antigeno se pueden asociar de forma tal que cuando se introducen a un humano, se genera una respuesta inmune. Las formulaciones de partículas pueden hacerse de una variedad de materiales, incluyendo, pero no limitados a, lípidos, proteínas, ceras o aminoácidos, polisacáridos, sustancias poliacrílicas o ácidos orgánicos. En una modalidad, la porción de flagelina y la porción de antígeno pueden estar asociadas con virosomas como, por ejemplo, los descritos en la Publicación de Patente Estadounidense No. 20100136053, la cual se incorpora en este documento mediante referencia. Otras partículas potenciales a las que el (los) antígeno (s) y flagelina (s) se puede (n) asociar, pueden incluir, pero no están limitadas a, partículas tipo virus, microesferas biodegradables, liposomas, nanopartículas de péptidos, nanopartículas y partículas tipo virus de auto-ensamblado como se describe en WO2010/002818 , incorporada en este documento mediante referencia. En una modalidad, la flagelina y el antígeno se asocian con nanopartículas de péptidos de auto-ensamblado (SPAN por sus siglas en inglés) . Las SPAN se describen en la solicitud de patente PCT WO 2009/109428, incorporada en este documento mediante referencia. Estas nanopartículas están comprendidas de agregados de una cadena peptídica continua que comprende dos dominios de oligomerización conectados por un segmento vinculante en donde uno o ambos dominios de oligomerización incorporan epitopes de células T y/ epitopes de células B dentro de su secuencia de péptidos.

Los antigenos que se pueden usar junto con la flagelina en las composiciones y los métodos de la presente invención son cualquier antigeno que provocará una respuesta inmune en un humano. Los antigenos usados en las composiciones de la presente invención incluyen antigenos virales tales como antigenos virales de influenza (ej . , proteina de hemaglutinina (HA) , proteina de matriz 2 (M2) , neuraminidasa) , virus sincicial (RSV) , antigenos (ej., proteina de fusión, glicoproteina de adhesión) , papilomaviral (ej., virus del papiloma humano (VPH), tal como una proteina E6, proteina E7, proteina Ll y proteina L2 ) , Herpes Simplex, virus de la rabia y antigenos virales de flavivirus (ej., antigenos virales de dengue, antigenos virales del Nilo Occidental) , antigenos virales de hepatitis incluyendo antigenos de HBV y HC. Antigenos usados en las composiciones de la presente invención incluyen antigenos bacterianos incluyendo aquellos de Streptococcus pneumonía, Haemophilus influenza, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile y patógenos entéricos negativos a gram incluyendo Escherichia, Salmonella , Shigella , Yersinia , Klebsiella , Pseudomonas , Enterobacter, Serratia , Proteus . Los antigenos usados en las composiciones de la presente invención, incluyen antigenos fúngicos incluyendo los de Candida spp. , Aspergillus spp., Crytococcus neoformans, Coccidiodes spp., Histoplasma capsulatum, Pneumocystis carinii, Paracoccidiodes brasiliensis , Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale y Plasmodium malariae .

La proporción de la flagelina al antigeno en las composiciones de la presente invención, pueden ser desde alrededor de 100:1 a alrededor de 1:100. En otras modalidades, la proporción de flagelina a antigeno puede ser de alrededor de 1:20 a alrededor de 02:1. En una modalidad preferida de flagelina y antigeno de influenza, la proporción de flagelina a antigeno de influenza es desde alrededor de 1:20 a alrededor de 1:5. En algunas modalidades, especialmente aquellas en donde la flagelina y el antigeno de la influenza son vinculados en una proteina de fusión, la proporción de flagelina a antígeno de influenza puede ser desde 5:1 a 1:5.

Las composiciones de la presente invención pueden incluir uno o más tipos de flagelina asociados con uno o más tipos de antigeno. Con respecto a los transportadores de partículas, diversas flagelinas diferentes pueden estar asociadas con uno o más antígenos que pueden, al mismo tiempo estar en la misma o en diferentes partículas.

En modalidades preferidas, el antígeno contenido dentro de las composiciones de la presente invención, es un antigeno del virus de la influenza. Un antigeno preferido es hemaglutina (HA) . En modalidades preferidas, las secuencias de HA están conjugadas con flagelina o con flagelinas diseñadas según se describe en WO 2009/128950 incorporada en este documento mediante referencia. Las modalidades preferidas de la presente invención que usan HA como un antigeno, son VAX 125, VAX 128A, VAX 128B y VAX 128C. VAX125, también conocido como STF2. JAI (SI ) , es una proteina de fusión recombinante que consiste de flagelina Salmonella typhimurium tipo 2 (STF2), un ligando de TLR5, fusionado en su término C con la cabeza globular (amino ácidos 62-284) del dominio HAl del HA de la influenza A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) y tiene una masa molecular de 77, 539 kDa. Por peso molecular, aproximadamente dos terceras partes de la composición de acuna es flagelina y una tercera es cabeza globular de influenza HA. Por lo tanto, una dosis de 3 ug consiste de 2 ug de flagelina y 1 ug de influenza HA. La secuencia de aminoácidos de VAX 125 (SEQ ID 1) se muestra en la Figura 1. VAX128A, también conocida como HL184 STF2.HA1-2 CA7, es una proteina de fusión recombinante que consiste de flagelina Salmonella typhimurium tipo 2 (STF2), un ligando de TLRS, fusionado en su término C a la cabeza globular del dominio HAl de la HA de Influenza A/California/07/2009 (H1N1), una cadena epidémica de influenza. Las secuencias de nucleótido (SEQ ID 2) y de aminoácidos (SEQ ID 3) de VAX 128A, se muestran en las Figuras 4 y 5, respectivamente. VAX128B, también conocida como HL185 STF2.HA1-2 CA7 , es una fusión de R3 en donde el dominio de D3 de la flagelina se ha removido y reemplazado con la cabeza globular del dominio HAl de la HA de la Influenza A/California/07/2009 (H1N1) . Las secuencias de nucleótidos (SEQ ID ) y de aminoácidos (SEQ ID 5) de VAX 128B, se muestran en las Figuras 6 y 7, respectivamente. VAX128C, también conocido como HLS186 STF.2.HA1-2 CA 7, es una fusión de R32x en donde el dominio de D3 de la flagelina se ha removido y reemplazado con la cabeza globular del dominio HAl de la HA de Influenza A/California/07/2009 (H1N1) y el término C de esta flagelina se fusiona con la cabeza globular del dominio de HAl de la HA de Influenza A/California/07/2009 (H1N1) . Por lo tanto, la proteina de fusión contiene dos copias del antigeno de HA por unidad de flagelina. Las secuencias de nucleótido (SEQ ID 6) y aminoácidos (SEQ ID 7) de VAX 128B, se muestran en las Figuras 8 y 9, respectivamente. En VAX128C hay dos copias de la cabeza globular de HA y la proporción de HA en la composición de la vacuna se incrementa a 54% de 33% en la elaboración de VAX128A.

Las ventajas de los métodos reclamados por el solicitante incluyen la capacidad para generar una respuesta inmune protectora en una población de adultos mayores que usan dosis relativamente bajas de antígenos para ' agentes infecciosos (ej . , influenza). Los adultos mayores típicamente se encuentran en alto riesgo de enfermedades como consecuencia de la exposición a un agente infeccioso, tal como un antígeno de influenza, debido, en parte, a su incapacidad para montar una respuesta inmune adecuada y sostenible a un agente infeccioso. Un enfoque propuesto para incrementar la respuesta de un adulto mayor humano a un antígeno, es la de incrementar la dosis del antígeno y la frecuencia de la dosificación. Sin embargo, dichos protocolos de tratamiento alternativos han resultado en menos de las respuestas inmunes óptimas a los antígenos, y disminuido la capacidad de proporcionar inmunidad protectora contra las enfermedades como consecuencia de la exposición a antígenos en las poblaciones de adultos mayores (ver las tablas aquí provistas en relación con productos y estudios de la técnica previa) . Los métodos aquí empleados mejoran las respuestas inmunes en poblaciones de adultos mayores, por lo que un exceso de un 40% de la población de adultos mayores monta una respuesta inmune adecuada y sostenible a un antígeno administrado en una dosis relativamente baja, lo que también tiene la ventaja de mínimos efectos laterales. Las composiciones de la presente invención son más inmunogénicas y menos reactogénicas que las vacunas de la técnica previa.

En una modalidad, el humano a ser tratado con las composiciones y métodos de la presente invención, tiene entre 49 y 64 años de edad. En otra modalidad, el humano puede ser mayor a 64 años. En ciertas modalidades, las composiciones son administradas a humanos que son mayores a 55 años, o mayores a 60 años o mayores a 65 años o mayores a 70 años o mayores a 75 años o mayores a 80 años de edad. La dosis de las composiciones de la presente invención se puede seleccionar para optimizar los efectos en los adultos mayores, mientras se busca reducir cualquier efecto lateral no deseado. Por ejemplo, en las composiciones de proteina de fusión que comprenden flagelina y HA (como se describe en el caso de VAX125, VAX128A, VAX128B y VAX128C) , las dosis se pueden seleccionar para optimizar la respuesta inmunogénica mientras se trata de mantener baja la reactogenicidad. Al menos una dosis seleccionada del grupo que consiste de una dosis de 0.1 µq, una dosis de 0. 5 µqf una dosis de 1 pg, una dosis de 2 pg, una dosis de 3 pg, una dosis de 4 una dosis de 5 ig, una dosis de 6 pg, una dosis de 7 g, una dosis de 8 pg, una dosis de 9 ?, una dosis de 10 pg una dosis de 15 \iq, una dosis de 20 g, una dosis de 25 pg, y una dosis de 30 pg, pueden ser suficientes para inducir una respuesta humana en adultos mayores. La dosis de la proteina de fusión pueden ser administradas al humano dentro de un rango de dosis incluyendo desde alrededor de 0.1 µ? a alrededor de 500 pg, 1 pg a alrededor de 100 pg, 1 pg a alrededor de 50 µq, desde alrededor de 1 pg a alrededor de 30 pg, desde alrededor de 1 pg a alrededor de 25 pg, desde alrededor de 1 pg a alrededor de 20 pg, desde alrededor de 1 µg a alrededor de 15 pg, desde alrededor de 1 pg a alrededor de 10 pg, desde alrededor de 2 pg a alrededor de 50 pg, desde alrededor de 2 pg a alrededor de 30 pg, desde alrededor de 2 µg a alrededor de 20 µg, desde alrededor de 2 µg a alrededor de 10 µg, desde alrededor de 2 pg a alrededor de 8 µg, desde alrededor de 3 pg a alrededor de 50 µg, desde alrededor de 3 pg a alrededor de 30 pg, desde alrededor de 3 pg a alrededor de 20 pg, desde alrededor de 3 pg a alrededor de 500 pg, desde alrededor de 1 pg a alrededor de 10 pg, desde alrededor de 3 pg a alrededor de 8 pg, desde alrededor de 3 pg a alrededor de 5 pg, desde alrededor de 4 pg a alrededor de 50 pg, desde alrededor de 4 pg a alrededor de 30 pg, desde alrededor de 4 pg a alrededor de 20 pg, desde alrededor de 4 pg a alrededor de 10 pg, desde alrededor de 4 pg a alrededor de 8 pg, desde alrededor de 5 pg a alrededor de 50 pg, desde alrededor de 5 pg a alrededor de 30 pg, desde alrededor de 5 pg a alrededor de 20 pg, desde alrededor 5 1 pg a alrededor de 10 pg, desde alrededor de 5 pg a alrededor de 9 µg, y desde alrededor de 5 µ? a alrededor de 8 pg. Con respecto a las composiciones de proteina de fusión que comprenden flagelina y antigeno de influenza, la dosis se refiere a la cantidad de proteina presente en la vacuna dada al humano. Una parte de la cantidad de proteina se relaciona con el antigeno y una parte de la cantidad de proteina se relaciona con la flagelina. Por ejemplo, en VAX 125 y VAX 128A y VAX 128B, el antigeno de HA1 comprende alrededor de un 33% del peso molecular de la elaboración. En VAX128C, existen dos copias de la cabeza globular de HA y la proporción de HA en la vacuna se incrementa a un 54% de un 33% en la elaboración de VAX128A. En las modalidades que usan antigenos diferentes a HA, puede ser más útil la caracterización de la cantidad de la dosis mediante la cantidad de antigeno, especialmente si el antigeno es de origen no proteinaseo. En cualquier caso, las composiciones de flagelina/antígeno de la presente invención, proporcionan propiedades superiores a las composiciones de la técnica previa en el tratamiento de los adultos mayores.

Con respecto a las composiciones en las que la flagelina y el antígeno son administrados mediante partículas, la dosis dependerá del tipo de partícula usado y la proporción de flagelina a antígeno presente en la composición. Con respecto a las composiciones en las que la flagelina y el antígeno están presentes en proporciones diferentes a 1:1, la dosis dependerá de la proporción de los componentes. Con respecto a antigenos diferentes a los antigenos de la influenza, la dosificación dependerá del antigeno usado y la proporción de flagelina al antigeno. Una persona con conocimientos en la materia puede ser capaz fácilmente de determinar la dosificación óptima de las composiciones de flagelina con base en el transportador, antigeno y proporción de flagelina a antigeno.

El componente del antigeno de las composiciones de proteina de fusión de la presente invención, son preferentemente antigenos de influenza (antigeno de influenza A, influenza B, influenza C) . En modalidades preferidas de las composiciones, al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un antigeno de hemaglutinina de influenza (ej., la proteina de fusión incluye SEQ ID No. 1 (Figura 1)), una matriz 2 (M2, tal como un extodominio de 2, también referido como "M2e") o un antigeno de neuraminidasa de influenza. El antigeno de influenza puede incluir un antigeno de influenza H1N1. En las modalidades preferidas, el antigeno es fusionado con una secuencia de moléculas de flagelina tal como se describe en WO 2009/128950, que se incorpora aquí mediante referencia. Las composiciones de la presente invención pueden comprender una o más proteínas de fusión con una o más secuencias de antígenos incluidas en cada proteína de fusión .

La composición se puede administrar intramuscularmente al humano en una sola dosis o en múltiples dosis. El método puede, además, incluir el paso de la administración de al menos una dosis subsecuente de la composición de flagelina/antigeno al humano.

Las composiciones inmunogénicas para su uso de acuerdo con la presente invención pueden ser administradas como una dosis inyectable estándar de 0.5 mi, y contienen desde alrededor de 0.1 µ? a 50 µg de antigeno. En una modalidad preferida de las composiciones inmunogénicas para su uso de acuerdo con la presente invención, está una dosis inyectable estándar de 0.5 mi y contiene desde alrededor de 3 \iq a 20 yg de antigeno. El volumen de la vacuna puede ser de entre 0.25 y 10 mi, adecuadamente entre 0.5 mi y 1.0 mi, en particular, un estándar de 0.5 mi. Una dosis de vacuna de acuerdo con la presente invención se puede proporcionar en un volumen más pequeño a la dosis convencional. Las dosis de bajo volumen de acuerdo con la presente invención, son adecuadas entre 0.5 mi, típicamente, debajo de 0.3 mi y usualmente no menos de 0.1 mi.

De conformidad, en un aspecto de la invención, se proporciona una composición, su método y uso según se reclama en este documento, en donde la respuesta inmune producida por la administración de la composición en una población humana en donde los humanos tienen entre 49 a 64 años de edad, o en donde los humanos son mayores a 55 años de edad, o mayores a 60 años de edad, o mayores a 65 años de edad, o mayores a 70 años de edad, o mayores a 75 años de edad, o mayores a 80 años de edad y tienen una tasa de seroconversión mayor a 50%, mayor a 60%, mayor a 65%, mayor a 70%, mayor a 75%, mayor a 80%, mayor a 85%, mayor a 90%, mayor a 95% o mayor a 99%.

De conformidad, en un aspecto de la invención, se proporciona una composición, su método y uso según se reclama en este documento, en donde la respuesta inmune producida por la administración de la composición en una población humana en donde los humanos tienen entre 49 a 64 años de edad, o en donde los humanos son mayores a 55 años de edad, o mayores a 60 años de edad, o mayores a 65 años de edad, o mayores a 70 años de edad, o mayores a 75 años de edad, o mayores a 80 años de edad y tienen una tasa de seroproteccion mayor a 50%, mayor a 60%, mayor a 65%, mayor a 70%, mayor a 75%, mayor a 80%, mayor a 85%, mayor a 90%, mayor a 95% o mayor a 99%.

Seroreceptivo significa un incremento en una concentración de anticuerpo de HAI de al menos cuatro veces con una concentración posterior a la vacunación mínima de 40.

Seroproteccion significa el logro de mínima concentración de HAI posterior a la vacunación de 40 entre los sujetos con concentraciones previas a la vacunación de <40.

La tasa de seroconversión para la respuesta de anticuerpo anti HA se define como la proporción de sujetos en cada grupo que tienen concentración post-vacunación protectora de >1:40. La tasa de seroprotección es el porcentaje de sujetos que tienen una concentración de HAI antes de la vacunación de <1:10 y >1:40 después de la vacunación. Sin embargo, si la concentración inicial es de >1:10, entonces debe de haber un incremento de al menos cuatro veces en la cantidad de anticuerpos después de la vacunación .

En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición, su método y uso según se reclama en este documento en donde la respuesta inmune mínima producida por la administración de las composiciones de la presente invención, reduce los anticuerpos (HAI) funcionales en la mayoría de los adultos mayores receptores a modo dependiente de la dosis. En ciertas modalidades, la composición inducirá una respuesta neutralizante de anticuerpos mayor a una concentración de alrededor de 50 después de 7 días o después de 14 días o después de 28 días. En otras modalidades, la composición inducirá una respuesta neutralizante de anticuerpos mayor a una concentración de alrededor de 100 después de 7 días, o después de 14 días, o después de 28 dias. En otras modalidades, la composición inducirá una respuesta neutralizante de anticuerpos de mayor a una concentración de alrededor de 150 después de 7 dias, después de 14 dias o después de 28 dias. En otras modalidades, la composición inducirá una respuesta neutralizante de anticuerpos mayor a una concentración de alrededor de 200 después de 7 dias, después de 14 dias, o después de 28 dias.

De conformidad, en un aspecto de la invención, se proporciona una composición, su método y uso como aqui se reclama, en donde la mínima respuesta inmune producida por la administración de la composición en una población de adultos mayores, cumple con o excede uno de los siguientes criterios : una tasa de seroconversión mayor a 50%, mayor a 60%, mayor a 70%, mayor a 80%, mayor a 90%, mayor a 95% o mayor a 99%. una tasa de seroprotección mayor a 50%, mayor a 60%, mayor a 70%, mayor a 80%, mayor a 90%, mayor a 95% o mayor a 99%. un promedio de un incremento de cuatro veces o más en la concentración neutralizante de anticuerpos posterior a la vacunación.

Una "cantidad efectiva", cuando nos referimos a la cantidad de una composición y una proteina de fusión administrada al humano, se refiere a aquella cantidad o dosis de la composición que, al ser administrada al sujeto, es una cantidad suficiente para eficacia terapéutica (ej . , una cantidad suficiente como para estimular una respuesta inmune en un sujeto, una cantidad suficiente como para proporcionar inmunidad protectora en el sujeto) .

Los métodos de la presente invención pueden lograrse mediante la administración de las composiciones y proteínas de fusión de la invención por medios entérales o parenterales . Específicamente, la vía de administración es mediante inyección intramuscular de la composición y la proteína de fusión. Otras vías de administración también están abarcadas por la presente invención, incluyendo las vías intravenosa, intradérmica, intraarterial , intraperitoneal, intranasal, transdérmica, supositorios o subcutánea .

Las composiciones que incluyen las proteínas de fusión se pueden administrar por sí solas o como mezclas con excipientes convencionales, por ejemplo, sustancias transportadoras farmacéutica o fisiológicamente aceptables, orgánicas o inorgánicas, adecuadas para aplicación enteral o parenteral que no reaccionan nocivamente con la composición. Los transportadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen agua, soluciones salinas (tales como la solución de Ringer) , alcoholes, aceites, gelatinas y carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidón, ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa y polivinilpirolidina . Dichas preparaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes auxiliares tales como lubricantes, conservadores, estabilizantes, agentes humectantes, emulsificantes, sales para la influencia de la presión osmótica, tampones, sustancias colorantes y/o aromáticas y similares, que no reaccionan nocivamente con las composiciones administradas al humano. Los diluyentes preferidos para diluir las vacunas de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, 150mM de NaCl con histidina y trehalosa.

Las composiciones, proteínas de fusión y proteínas de la invención, se pueden administrar a un sujeto en un soporte que presenta las composiciones, proteínas y proteínas de fusión de la invención al sistema inmune del sujeto para generar una respuesta inmune en el sujeto. La presentación de las composiciones, proteínas y proteínas de fusión de la invención, incluirían preferentemente la exposición de porciones antigénicas de la proteína de fusión para generar anticuerpos. El soporte es biocompatible . "Biocompatible", como se usa aquí, quiere decir que el soporte no genera una respuesta inmune en el sujeto (ej., la producción de anticuerpos).

La dosis y frecuencia (dosis únicas o múltiples) administradas a un sujeto, pueden variar dependiendo de una variedad de factores, incluyendo, por ejemplo, la exposición previa a una infección consecuente a la exposición del antigeno: saludo, peso corporal, índice de masa corporal y la dieta del sujeto o los problemas relacionados con la salud. Otros regímenes o agentes se pueden usar junto con los métodos y composiciones, proteínas o polipéptidos de la presente invención.

La composición se puede administrar al humano en una sola dosis o en múltiples dosis, tal como al menos dos dosis. Cuando se administran múltiples dosis al sujeto, una segunda o tercera dosis de puede administrar días (ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7), semanas (ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), meses (ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) o años (ej . , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) después de la dosis inicial. Por ejemplo, una segunda dosis de la composición se puede administrar alrededor de 7 días, alrededor de 14 días o alrededor de 28 días después de la administración de una primera dosis de la composición que incluye la proteína de fusión.

Los rangos se pueden expresar aquí como desde alrededor de un valor en particular, y/o a alrededor de otro valor en particular. Cuando dicho rango es expresado, otro aspecto incluye desde el valor en particular y/o el otro valor en particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente alrededor de, se entenderá que el valor en particular forma otro aspecto. Se entenderá, además, que los puntos finales de los rangos son relevantes tanto en relación con el otro punto final, como independientemente del otro punto final.

La dosis de la proteina de fusión se hace en referencia con las dosis en microgramos. La invención generalmente está dirigida a métodos para el tratamiento de poblaciones de adultos mayores de humanos para estimular las respuestas inmunes a antigenos, en particular, una respuesta inmunoprotectora, empleando dosis relativamente bajas de la composición antigénica que incluye el antigeno. En seguida se muestra una descripción de modalidades ejemplares .

EJEMPLOS Ejexnplo 1 Fase II, Marbete Abierto, Estudio de Escalación de Rango de Dosis STF2. HAl (VAS125) es una proteina de fusión recombinante que consiste de flagelina Salmonella typhimuruim tipo 2 (STF2) , un ligando de TLR5, fusionada en su término C a la cabeza globular (aminoácidos 62-284) del dominio HA1 de la HA de influenza A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) y tiene una masa molecular de 77,539 kDa (SEQ ID 1). La vacuna fue suministrada en ampolletas de vidrio a 20 g/mL ó 2 yg/mL, y diluida en tampón de dilución (150 mM de NaCl con histidina y trehalosa) a la concentración final en el día de su administración. Los materiales de estudio se prepararon con farmacéuticos no cegados y proporcionados a personal clínico. La vacuna se administró en un volumen final de 0.5 mi mediante inyección intramuscular profunda en el músculo deltoide.

Un total de 120 adultos vivos de una comunidad que tenían >65 años de edad (la edad media fue de 72 con un rango de 64-84) se enrolaron en los seis grupos de dosis. Los sujetos estaban saludables según su historia médica, exámenes de proyección física y análisis de proyección de laboratorio. Los sujetos con condiciones médicas activas, pruebas de proyección de laboratorio anormales (CBS y diferencial, y AST y ALT) , alergias conocidas a los componentes de la vacuna, vacunados contra la influenza durante los 6 meses previos, o que hubieran recibido otras vacunas en los 30 días anteriores, fueron excluidos de su participación .

El estudio fue llevado a cabo en un diseño de marbete abierto, de escalación de dosis. Veinte sujetos se enrolaren en cada grupo de dosis en hasta 3 sitios de estudio. Los sujetos recibieron una sola doses a niveles de dosis de 0.5 pg, 10 pg, 2.0 yg, 3.0 pg, 5pg y 8 pg (Tabla 1). Los sujetos fueron evaluados en la clínica después de su vacunación a los 30 minutos, 4 horas, Día 1 y por entrevista telefónica en el Día 3. Los sujetos enrolados en los grupos de 5 y 8 g, permanecieron bajo observación en el sitio del estudio durante cuatro horas después de la vacunación. Los sujetos fueron aún más evaluados durante las visitas a la clínica en los días de estudio 7, 14 y 28 después de la vacunación. También se dio un seguimiento de seguridad mediante contacto- telefónico en los meses 6 y 12 después de la vacunación.

Tabla 1. Características Demográficas y de Referencia Iamunogenicidad La capacidad de anticuerpo generado en respuesta al antigeno de hemaglutinina derivado de E. coli para inhibir la hemaglutinación mediante virus de la influenza cultivado en huevo se muestra en las Tablas 2 y 3. La concentración media geométrica (G T) del anticuerpo HAI en el día 18 después de una sola dosis, incrementó dependiendo de la dosis, con la GMT post-vacunación más alta vista en los sujetos que recibieron 5 \iq (Tabla 2) . Se mostraron respuestas de los anticuerpos de cuatro veces o más en la mayoría de los sujetos que recibieron dosis de 5 u 8 pg. entre los sujetos que recibieron dosis de 5 u 8 pg, un total de 30 (75%) de 40 sujetos, tenía cuatro veces o más respuestas de suero de anticuerpo HAI . En los grupos de dosis de 5 y 8 g, 18 (45%) sujetos tuvieron concentraciones de 1:40 ó más en el principio del estudio antes de la vacunación. Entre los 22 sujetos con anticuerpo HAI de suero de pre-vacunación de 1:40 o menos, 21 (98%) lograron una concentración de al menos 1:40 para el día 28 después de la vacunación (Tabla 3) . La cinética de las concentraciones de anticuerpos por grupo en este estudio se muestra en la Figura 2.

La respuesta anti-flagelina según se evaluó mediante IgG de ELISA se muestra en la Tabla 4. Los niveles de IgG de anti-flagelina eran bajos en estos sujetos antes de la vacunación. El VAX125 indujo incrementos sustanciales en los anticuerpos de anti-flagelina . No hubo relación aparente alguna entre el nivel de anticuerpo de anti-flagelina detectado antes de la vacunación, ni en la frecuencia o severidad de los efectos laterales, o la respuesta de anticuerpo de suero a la hemaglutinina de influenza .

La respuesta inmune generada por VAX125 fue comparada con el componente de HlNl de Fluzone estándar (15 yg) y de dosis alta (60 \ig) según fue reportado por Falsey et al. (Tabla 5) . El incremento de GMT en los sujetos de 65 años y más después de Fluzone estándar, se incrementa en alrededor de 2 veces, y después de la dosis alta, en alrededor de 4 veces. Al contrario, el GMT incrementa en los sujetos de 65 años o más y después de VAX125, la dosis de 5 pg se incrementa en más de 10 veces. Esto se traduce en tasas de seroconversión y tasas de seroprotección más altas en los grupos de VAX125.

Tabla 2. Concentraciones medias geométricas (GMT) de anticuerpo de HAI , respuesta de promedio de veces (MFR) entre 120 sujetos > a 65 años de edad, que recibieron una sola dosis de VAX125.

Dosis 0.5 1 2 3 5 8 Día n=20 95* n=20 95% n=20 95% n=20 95% n=20 95% n=20 95% de de de de de de Cl Cl Cl Cl Cl Cl 0 27 14- 27 15- 25 12- 51 29- 18 10- 30 16- 52 50 51 89 32 58 7 30 16- 39 21- 51 25- 106 50- 61 34- 155 86- 58 70 105 225 107 279 14 43 22- 77 43- 70 34- 160 82- 226 121- 234 127- 83 138 143 311 420 431 28 48 24- 75 44- 70 34- 149 79- 219 115- 211 120- 95 126 143 283 413 370 MFR 14 1.6 1- 2.8 1.6- 2.8 1.6 3.1 2.1- 12.6 6-25 7.7 4-16 2.5 5.1 4.9 4.8 28 1.7 1- 2.7 1.6- 2.8 1.6 2.9 1.9- 11.7 6-25 7 4-14 2.9 4.7 4.9 4.6 Tabla 3. Las tasas de seroconversión (SC) y seroproteccion (SP) entre 120 sujetos >65 años de edad que recibieron una sola dosis de VAX125 Dosis (pg) de VAX125 (STF2.HA1 (SI) ) 0.5 1 2 3 5 8 n=20 n=20 n=20 n=20 n=20 n=20 Seroconversión día 14 (%) 3(15) 8 (40) 8 (40) 8 (40) 16(80) 13(65) dia 28 (%) 3(15) 7 (35) 6(30) 7 (35) 16 (80) 1 (70) Seroproteccion dia 0 (%) 10 (50) 11 (55) 7(35) 15 (75) 7 (35) 11(55) dia 14 (%) 13(65) 17 (85) 14 (70) 19) 95) 19(95) 20 (100) dia 28 (%) 14 (70) 18 (90) 13 (65) 19(95) 19(95) 20 (100) Seroconversión (incremento en concentración de HI de al menos 4 veces con una concentración mínima de 40) Seroprotección (concentración posterior a la vacunación mínima de 1:40) Tabla 4. Concentraciones de IgG de media geométrica (ug/ml) de suero anti-flagelina después de una sola dosis de VAX125 en adultos > a 65 años de edad.

Dosis (pg/ml) 0.5 1 2 3 5 8 Dia posterior n=20 n=20 n=20 n=20 n=20 n=20 a la vacunación 0 5 2 4 2 3 2 7 8 8 39 17 41 34 14 19 26 103 49 173 93 28 16 21 72 35 125 58 Respuesta de promedio de veces dia 14 4 14 24 25 55 49 dia 28 3 11 16 18 39 31 Tabla 5. Serorespuesta comparativa contra antigenos de HlNl en adultos mayores a 65 años para dosis estándar y alta de VAX125 y Fluzone A/H1N1 Islas Salomón para VAX125 y HlNl Nueva Celedonia para Fluzone. Dosis estándar de Fluzone (Sanofi) de 15 ]ig, dosis alta de 60 ug cada antigeno .

De Falsey et al., JID 2009; 200:172-80.

Reactogenlcldad La vacuna fue bien tolerada en todos los grupos de dosis (Tabla 6) . Ningún efecto lateral fue grado severo (3) o de amenaza de vida (4) y no hubo eventos adversos serios. Se observó dolor de brazo moderado en alrededor de un 20% de los sujetos que recibieron una dosis de 2pg o más. Los eventos sistémicos adversos fueron generalmente suaves y no parecen ser dependientes de la dosis.

Los niveles de proteina reactiva al C (CRP) fueron medidos en referencia a y en el día 1 (Tabla 7). El incremento medio de veces en CRP mostró una dependencia a la dosis, con un incremento medio de menos de 5 veces en los sujetos que recibieron las dos dosis más alta. En las dosis de 3ug o más, 57% de 60 sujetos experimentaron un incremento de al menos dos veces en CRP. Sin embargo, la mayoría (o nada) de los incrementos de CRP no estaban asociados con síntomas locales o sistémicos de más de una severidad moderada o para los sujetos en la etapa 1 asociados con incrementos en IL-6, IL-8 ó IL-10 (datos no mostrados) .

Tabla 6. Número de sujetos de más de 65 años con síntomas posteriores a la vacunación con VAX125 Dosis (pg) de VAX125 (STF2.HA1 (SI) ) 0.5 1 2 3 5 8 Síntomas n=20 n=20 n=20 n=20 n=20 n=20 locales Grado 0 1 (70) 9(45) 12 (60) 6(30) 4 (20) 6(30) Grado 1 5 10 (50) 3(15) 10 (50) 12 (60) 10 (50) Grado 2 1 1(5) 5(25) 4 (20) 4 (20) 4 (20) Grado 3 0 0 0 0 0 0 Grado 4 0 0 0 0 0 0 Síntomas sistémicos Grado 0 16 (801 18 (90) 10 (50) 12 (60) 11 (55) 12 (60) Grado 1 4 (20) 0 6(30) 4 (20) 6(30) 7 (35) Grado 2 0 2(10) 4(20) 4 (20) 3(15) 1 (5) Grado 3 0 0 0 0 0 0 Grado 4 0 0 0 0 0 0 Tabla 7. Respuesta de CRP entre adultos > 65 años de edad después de una dosis de VAX125 Dosis (pg) 0.5 1 2 3 5 8 No . de n=20 n=20 n=20 n=20 n=20 n=20 sujetos GM CRP día 1.0 1.3 1.2 1.7 1.6 1.4 nu GM CRP día 1.0 2.0 2.2 3.4 4.7 4.0 1 CRP Máx. 4.9 11.9 13.7 13.5 22.8 33.7 día 1 Inc. de 1.1 1.6 1.9 2.0 2.9 2.8 veces de GM CRP No. (%) > 1 (5) 4(20) 7(35) 10 (50) 13 (65) 11 (55) inc. de 2 veces Tabla 8. Concentraciones geométricas medias de anticuerpos de HAI , tasas de seroprotección y seroconversión para H1N1 de Isla Salomón entre sujetos adultos jóvenes que recibieron una dosis IM de VAX125 La Tabla 9 es una comparación de los valores CRP medios y máximos para sujetos saludables mayores a alrededor de 65 años y sujetos de 18-49 años de edad. La media geométrica no varia hasta que se alcanza el grupo de 3pg en donde la media es casi del doble en los adultos jóvenes. El limite de conflabilidad superior de 95% y el valor máximo son menores en los adultos mayores.

Tabla 9. Comparación de CRP en los adultos mayores y en los adultos jóvenes después de VAX125.

Mientras que estos datos pueden sugerir que la dosis óptima en los adultos mayores es mayor a 3pg, las dosis tan bajas como estas aún producen una respuesta HAI al antigeno H1N1 que es mejor que la TIV estándar de Fluzone y es similar a la respuesta observada con la formulación de dosis alta de Fluzone (Tabla 10) .

Tabla 10. Respuesta inmunologica de VAX125 en comparación con la dosis estándar y la dosis alta de Fluzone en sujetos adultos mayores de 65 años o más .

Tabla 11. Serorespuesta comparativa contra antigenos de H1N1 en adultos mayores a 65 años para VAX125 y dosis estándar y dosis alta de Fluzone * Serorespuesta: incremento en concentración de anticuerpos HAI de al menos cuatro veces con una concentración mínima posterior a la vacunación de 40.

** Seroprotección: logro de concentración de HAI mínima posterior a la vacunación de 40 entre sujetos con concentraciones de prevacunación de <40.

VAX125 induce anticuerpos funcionales (HAI) en la mayoría de los receptores mayores según la dosis. Las dosis de 5.0 y 8.0 µ? suscitaron respuesta en veces alta de los valores de HAI GMT (226 y 234, respectivamente) y de GMT (12.6 y 7.7, respectivamente). La dosis de 5.0 ug fue la más inmunogénica . Las dosis de 5.0 y 8.0 ug suscitaron altas tasas de seroconversión (80% y 65%, respectivamente) y altas tasas de seroprotección (95% y 100%, respectivamente) . Los valores pico de GMT en adultos saludables >65 fueron similares a las observadas con la dosis de 0.5 ug en los adultos jóvenes. Esto sugiere que una formulación de dosis alta se requiere para los adultos mayores. La capacidad de producir una vacuna contra la influenza de alta dosis en E. coli para los adultos mayores, es única para este producto.

Ejemplo 2 Elaboración y Expresión de Vaxl28A, Vaxl28B y Vax 128C Clonaje y Expresión Los clones de E. coli que producen cada uno de los tres candidatos a vacuna, VAX128A, VAX128B y VAX128C, se produjeron de manera similar, pero con diferencias en la preparación de plásmidos específicos para cada elaboración.

Los plásmidos que codifican STF2.HA1 (CÁ07) y STF2R3. HAl (CA07) fueron mutados de plásmidos que codifican STF2.HA1 (CA04) y STF2R3.HA1 (CA04). El plásmido que codifica STF2R3.2xHAl (CA07) se produjo de los plásmidos STF2.HA1 (CA07) y STF2R3.HA1 (CA07) . Los detalles de la elaboración de plásmidos y la selección de clones siguen más adelante. Un mapa de plásmidos para los candidatos a vacunas se muestra en la Figura 3.

Elaboración de Plásmidos para VAX128A (STF2. HAl (CA07) ) Un procedimiento de PCR multi-pasos fue llevado a cabo para producir el plásmido que codifica para STF2.HAq (CA07) . Un plásmido que codifica para STF2.HAl (CA04) fue producido inicialmente , y después mutado para codificar para STF2. HAl (CA07 ) . Para hacer el STF2.HAl (CA04) , el ADN codificador de STF2 fue fusionado con ADN que codifica el dominio de cabeza globular HAl de la proteina (CA04)HA. El ADN que codifica el STF2 fue amplificado del plásmido pET24a-STF2. HAl FL . El ADN que codifica la proteina de la cabeza globular de HA fue sintetizado por un proveedor externo (ADN 2.0, Menlo Park, CA) y amplificado por PCR. Después de la purificación con gel tanto del SFT2 como del ADN HA1(CA07), los fragmentos se fusionaron. El producto final de PCR (ADN que codifica la proteína de fusión STF2.HA1 (CA04) fue digerido con enzimas de restricción Ndel y EcoRI y ligado al plásmido pET24a. Debido a que sólo hay una diferencia de residuo entre la porción HA de STF2. HAl-2 (CAO4 ) y STF2. HAl (CA07 ) , STF2. HAl (CA0 ) se hizo mediante mutagénesis dirigida al sitio de STF2.HAl (CA04) . La secuencia recombinante de ADN fue confirmada por un proveedor externo (Genewiz, Inc.).

Elaboración de Plásmidos para VAX128B (STF2R3. HAl (CA07) ) Como con STF2. HAl (CA0 ) , un plásmido que codifica para STF2R3.HA1 CA4 fue inicialmente producido y después mutado para codificar para STF2R3. HAl (CA07 ) . Para hacer STF2R3.HAl (CA04) , ADN que codifica porciones de las secciones terminales N y C de STF2 se fusionó con ADN que codifica el dominio de cabeza globular de HAl de la proteína CA4 HA. Esto tiene el efecto de reemplazo del dominio D3 de STF2 con HA1-2(CA04) en la proteína de fusión. El ADN que codifica las porciones de las secciones terminales de N y C de STF2 fue PCR amplificado del plásmido pET24a-STF2. HAl (CA04 ) . El ADN que codifica HA1(CA04) fue PCR amplificado del mismo plásmido. Fragmentos de STF2 y HA1(CA04) purificados con gel se fusionaron, y el producto final de PCR fue digerido con enzimas de restricción Ndel y EcoRI y ligado al plásmido pET24a. Debido a que solo existe una diferencia de residuo entre la porción de HA de STF2R3. HAl (CA0 ) y STF2R3. HAl (CA07 ) , STF2R3. HAl (CA0 ) se hizo mediante mutagénesis dirigida a un sitio de STF2R3. HAl (CA0 ) . La secuencia recombinante de ADN fue confirmada por un proveedor externo (Genewiz Inc.).

Elaboración de Plásmidos para VAX128C (STF2R3. 2xHAl (CA07) ) El plásmido que codifica STF2R3.2xHAl (CA07 ) se hizo de una fusión del ADN del plásmido de STF2R3. HAl (CA07 ) y el plásmido de STF2.HAl (CA07) . Ambos plásmidos fueron digeridos separadamente con enzimas de Ndel y Mfel. Fragmentos específicos del STF2R3. HAl (CA07 ) (como inserto) y STF2. HAl (CA01) como vector, fueron purificados con gel y ligados para formar una secuencia completa de ADN codificadora de STF2R3.2xHAl (CA07) . El sitio de restricción común está en la sección de terminal C de STF2. La secuencia recombinante de ADN fue confirmada por un proveedor externo (Genewiz, Inc.).

Clonación El ADN se usó para transformar las células comercialmente disponibles de E.coli BLR(DE3) (Novagen, Cat. No. 69053). Las células de E.coli BLR (DE3) de Novagen son un derivado de recA de una cadena BL21 de E.coli que mejora el rendimiento de monómero de plásmido y puede ayudar a estabilizar los plásmidos incluidos. Las células son Ion y ompT deficientes de proteasa, y son lisogénicas para profagos lambda que contienen una polimerasa de ARN T7 inducible por IPTG. Los clones de BLR (DE3 ) resultantes se usaron para producir un banco celular de investigaciones para candidato a vacuna. Para generar los bancos, un clon seleccionado fue cultivado en medio de LB, complementado con 0.5% de glucosa, y 25ug/ml de kanamicina. Las células fueron congeladas en lml de crioampolletas a -60 a -80 °C después de la adición de glicerol para una concentración final de 7%. En los estudios de expresión proteinica, las proteínas que corresponden a los pesos moleculares esperados de los candidatos a vacuna fueron fácilmente visualizadas mediante teñido de Azul Coomassie y mediante análisis de Western blot usando anticuerpos monoclonales de anti-flagelina .

Producción Proteinica Las elaboraciones descritas más adelante están todas comprendidas de flagelina de Salmonella typhimurium fliB (STF2) y una porción del dominio de cabeza globular del antigeno protector de hemaglutinina de la novedosa HlNl que emergió en el año 2009 (A/California07/2009) .

Fabricación de VAX128A Un plásmido de pET24a que codifica la producción de STF2.HA1-2 CA07, se usa para transformar las células comercialmente disponibles de E.coli BLR(DE3). Estas células se expanden para fabricar bancos de investigación y de células maestras de cGMP. Para producir la proteína objetivo, una ampolleta de células de bancada fue expandida en frascos de agitación usando medio sintético y cultivada a una densidad óptica específica. Una cantidad específica de células fue entonces transferida a un bioreactor que contiene un medio sintético diferente. El bioreactor fue operado por control automático (T=30C, pH=7, DO>=30%) en modo intermitente hasta que se agotó la glucosa. En ese punto, se añade un medio de alimentación sintético al bioreactor a una tasa de flujo específica. Después de tres horas, la producción proteinica objetivo fue iniciada en el cultivo mediante adición de IPTG a una concentración de 2 mM. Las células fueron cosechadas cuatro horas después de la inducción y la pasta celular separada del medio acondicionado mediante centrifugación. Después de congelar y descongelar, las células fueron re-suspendidas en un tampón de tri-acetato y lisadas mediante homogenización de alta presión. El superflotante del lisato fue recolectado después de la centrifugación. Las proteínas fueron precipitadas usando 14% de PEG, y después re-suspendidas en 6M de urea a un pH de 4. Después de ajustar el pH de la solución a 8, el tampón fue intercambiado a un tampón de tri-acetato por TFF. Se añadieron Tritón X-114 y PET y la solución resultante fue separada en fases de detergente y acuosa mediante centrifugación. La fase acuosa fue retenida y filtrada. Las proteínas fueron desnaturalizadas por adición de urea y diluidas a una concentración de 2 gramos por litro de proteína en una solución de urea de 2 molares a un pH de 8. La proteína objetiva fue incrementada de manera intermitente en una dilución de 10 veces en un tampón de duplicado. La purificación inicial de vacuna monomérica activa fue llevada a cabo al enlazar y efluir con cromatografía de intercambio de aniones , con proteína objetivo y elusión de impurezas efectuadas al incrementar la concentración de sal a modo de pasos. Después de la filtración y el ajuste del pH del efluido de AEX a 6.8, se purificó aún más una vacuna activa, monomérica, mediante el uso de medio de cromatografía de hidroxiapatita (CHT) en modo de enlace. La elusión de impurezas y proteína objetivo se llevó a cabo al incrementar la concentración de fosfato por pasos. Después de la filtración, el material fue intercambiado de tampón en un tampón de formulación mediante · TFF y diluido, filtrado, hecho en alícuota y almacenado a -70°C. La sustancia de fármaco en bruto resultante fue diluida a la concentración objetivo del producto de fármaco en el mismo tampón de formulación y almacenada a -70 °C antes de la administración.

Fabricación de VAX128B Un plásmido de pET24a que codifica la producción de STF2R3.HA1-2 (CA07) se usó para transformar las células de E.coli comercialmente disponibles BLR (DE3 ) . Estas células fueron expandidas para fabricar bancos de investigación y de células maestras cGMP . Para producir la proteína objetivo, una ampolleta de células bancadas fue expandida en frascos de agitación usando medio sintético y cultivadas a una densidad óptica específica. Una cantidad específica de células fue después transferida a un bio reactor que contiene un medio sintético diferente. El bioreactor fue operado bajo control automático (T=30C, pH=7, DO>=30%) en modo intermitente hasta que la glucosa se agotó. En ese punto, un medio de alimentación sintético fue añadido al bioreactor a una tasa de flujo específica. Después de tres horas, la producción de proteína objetivo se inició en el cultivo mediante adición de IPTG a una concentración de 2 m . Las células fueron cosechadas cuatro horas después de la inducción y la pasta celular fue separada del medio acondicionado mediante centrifugación. Después de congelar y descongelar, las células fueron resuspendidas en un tampón de triacetato y Usadas por homogenizacion de alta presión. El comprimido de lisato fue recolectado después de centrifugación, resuspendido en un tampón de fosfato, y recolectado nuevamente por subsecuente centrifugación. La resuspensión de comprimido y el proceso de recolección fueron repetidos y el comprimido lavado fue solubilizado en un tampón de urea de 6M a un pH de 8. Después del mezclado, las proteínas solubilizadas fueron recuperadas por centrifugado y diluidas a 2 gramos de proteína por litro de solución. La proteína objetivo fue devuelta a su conformación propia al diluir rápidamente las proteínas desnaturalizadas en un exceso de nueve veces de tampón original bajo flujo. La solución de proteína desnaturalizada y el tampón original fueron mezclados en línea a una proporción de tasa de flujo de 1 a 9, sostenidas durante un promedio de 30 minutos antes de cargarla en una columna de cromatografía de intercambio de aniones. La vacuna activa, monomérica, fue unida al medio de AEX con proteína objetivo y elusión de impurezas efectuada al incrementar la concentración de sal en los pasos. Después de la filtración, la elusión de intercambio de aniones fue diluida en 10% con agua y cargada en una columna de cromatografía de intercambio de aniones diferente, para mayor purificación. La elusión de impurezas y la proteina objetivo se llevó a cabo al incrementar la concentración de triacetato en los pasos. Después de la filtración, el material fue intercambiado de tampón en un tampón de formulación por TFF y dilución, filtrada, hecha alícuota, y almacenada a -70°C. La sustancia de fármaco en bruto resultante fue diluida a la concentración del producto de fármaco objetivo en el mismo tampón de formulación y almacenada a -70°C antes de su administración .

Fabricación de VAX128C Un plásmido de pET24a que codifica la producción de STF2R3.2xHAl-2 (CA07) se usó para transformar las células de E.coli comercialmente disponibles BLR (DE3 ) . Estas células fueron expandidas para fabricar bancos de investigación y de células maestras cGMP. Para producir la proteína objetivo, una ampolleta de células bancadas fue expandida en frascos de agitación usando medio sintético y cultivadas a una densidad óptica específica. Una cantidad específica de células fue después transferida a un bioreactor que contiene un medio sintético. El bioreactor fue operado bajo control automático (T=30C, pH=7, DO>=30%) en modo intermitente hasta que la glucosa se agotó. En ese punto, un medio de alimentación sintético fue añadido al bioreactor a una tasa de flujo específica. Después de tres horas, la producción de proteína objetivo se inició en el cultivo mediante adición de IPTG a una concentración de 2 mM. Las células fueron cosechadas cuatro horas después de la inducción y la pasta celular fue separada del medio acondicionado mediante centrifugación. Después de congelar y descongelar, las células fueron resuspendidas en un tampón de triacetato y lisadas por homogenización de alta presión. El comprimido de lisato fue recolectado después de centrifugación, resuspendido en un tampón de fosfato, y recolectado nuevamente por subsecuente centrifugación. La resuspensión de comprimido y el proceso de recolección fueron repetidos y el comprimido lavado fue solubilizado en un tampón de urea de 6 a un pH de 8. Después del mezclado, las proteínas solubilizadas fueron recuperadas por centrifugado y diluidas a 2 gramos de proteína por litro de solución. La proteína objetivo fue devuelta a su conformación original en modo intermitente por una dilución en un tampón original. La purificación inicial de la vacuna activa, monomérica se llevó a cabo por cromatografía de enlace y elusión de intercambio de aniones, efectuando la elusión de impurezas y proteina objetivo al incrementar la concentración de sal en los pasos. Después de la filtración y el ajuste del pH del eluato de AEX a una vacuna de 6.8, activa, monomérica, se purificó aún más usando medio de cromatografía de hidroxiapatita (CHT) en modo de enlace. La elusión de impurezas y la proteina objetivo se efectuaron al incrementar una concentración de fosfato en pasos. Después de la filtración, el material fue intercambiado de tampón en un tampón de formulación por TFF y dilución, filtrada, hecha alícuota, y almacenada a -70°C. La sustancia de fármaco en bruto resultante fue diluida a la concentración del producto de fármaco objetivo en el mismo tampón de formulación y almacenada a -70°C antes de su administración .

Medio sintético de frasco de agitación Medio sintético de bioreactor Medio sintético de alimentación Solución de Metales de Trazo Solución de tampón (pH7) Ejemplo 3 Fase 1. Estudio de Rango de Escalación de Dosis de VAX128A,B,C Un estudio de rango de escalación de dosis de Fase I para evaluar la seguridad e inmunogenicidad de las elaboraciones de la vacuna contra la influenza H1N1 de VAX128A, B y C en adultos saludables de 18 a 49 años de edad y en adultos >65 años de edad, se llevó a cabo. Estas 3 elaboraciones novedosas de vacuna contra la influenza se comprenden de la cabeza globular del dominio HAl de la A/California/07, H1N1 Novedosa (VAX128) genéticamente fusionada al ligando de TLR5, flagelina y producido en £. Coli . En VAX128A, el HAl fue fusionado con el término C de la flagelina, mientras que en el VAX128B HAl reemplazó el dominio D3 de la flagelina y en VAX128C HAl se reemplazó el dominio D3 y se fusionó con el término C. La vacuna fue suministrada en ampolletas de vidrio a 20 ug/ml ó 2 ug/ml, y diluida en tampón de dilución (150 mM de NaCl con histidina y trehalosa) a la concentración final en el dia de la administración. Los materiales del estudio fueron preparados con farmacéuticos no cegados y proporcionados a personal clínico. La vacuna se administró en un volumen final de 0.5 mi mediante inyección intramuscular profunda en el músculo deltoide. 116 sujetos adultos saludables de 18 a 49 años de edad y 100 adultos saludables >65 años de edad, se enrolaron en un ensayo clínico ciego, controlado con placebo, llevado a cabo en dos centros. Los sujetos recibieron una de las tres elaboraciones de vacuna de VAX128 o placebo, en un estudio de escalación de dosis en una proporción de 3:3:3:1. Las vacunas fueron administradas IM a dosis que varían de 0.5-20 ug. A los sujetos se les dio seguimiento por seguridad y sueros y fueron probados por inhibición de hemaglutinación (HAl) contra virus cultivados en huevo en los días 0, 7, 14 y 28. La proteina de suero reactiva a C (CRP) , los niveles de citoquina, y el anticuerpo de anti-flagelina también se evaluaron.

Tabla 13. Número (%) de sujetos adultos jóvenes con síntomas locales y sistemicos en VAX128-01, n=112 VAX128A VAX128B VAX128C Placebo Rangos de <2.5 2.5 4 8 <16 16 <16 16 20 0 dosis N=6 n=12 n=12 n=6 n=18 n=12 n=18 n=12 N=6 n=10 Temp. 0 0 1 (8) 1 (17) 1 (6) 0 4 (22) 0 2(33) 0 >37.22°C Local Ninguna 0 3(25) 3(25) 0 3(17) 2 (17) 4 (22) 1 (8) 1 (17) 8 (80) Media 3(50) 2(17) 4(33) 3(50) 7(39) 7 (58) 9 3(25) 1(17) 2 (20) Moderada 2(33) 7 (58) 1 (8) 2 (33) 8 (44) 3 (25) 4 (22) 6 (50) 4 (67) 0 Severa 1(17) 0 1 (8) 1 (17) 0 0 1(6) 2(17) 0 0 Sistémica Ninguna 3(50) 9(75) 11 (92) 5(83) 12(67) 9(75) 12(67) 7(58) 5(83) 6(60) Media 3(50) 1 (8) 0 1 (17) 5(28) 1 (8) 3(17) 2(17) 1(17) 3(30) Moderada 0 2(17) 0 0 1(6) 1(8) 3(17) 1 (8) 0 1(10) Severa 0 0 1 (8) 0 0 1 (8) 0 2 (17) 0 0 CRP día 0 0 0 1 (17) 1 (6) 4 (33) 0 0 0 0 1>40 CRP >40 0 0 0 0 3(17) 1 (8) 1 (6) 0 0 0 veces Incremento 0 1 (8) 0 0 0 2(17) 0 2(17) 0 0 de WBC Incremento 0 2 (17) 0 0 1(6) 2(17) 0 0 0 0 de LFT Incremento 0 0 0 0 3(17) 3 (25) 1 (6) 0 0 0 de IL-6 Tabla 14. Número (%) de sujetos >65 con síntomas locales y sistemicos o anormalidades de laboratorio en VAX128-01, n=100 Tabla 15a. Concentraciones GMT de HAI , tasas de seroconversión (SC) y seroprotección (SP) entre 112 sujetos de 18-49 años de edad que recibieron una sola dosis IM de elaboración de VA 128 (CA07) A, B o C (grupos elaborados combinados) Tabla 15b. Concentraciones GMT de HAI , tasas de seroconversión (SC) y seroprotección (SP) entre 100 sujetos > 65 años de edad que recibieron una sola dosis IM de elaboración de VAX128 (CA07) A, B o C (grupos elaborados combinados) Tabla 16. Concentraciones GMT de HAI , tasas de seroconversión (SC) y seroprotección (SP) entre 100 sujetos > 65 años de edad que recibieron una sola dosis IM de elaboración de VA 128 (CA07) A, B o C.

Tabla 17. Respuesta inmune por cohorte de edad Tabla 18. Concentraciones de HAI para adultos mayores de 65 años y más mediante elaboración y dosis de VAX128 Tabla 19. Respuesta del anticuerpo después de una o dos dosis del novedoso H1N1 (CA09) basado en huevos medida con el ensayo de HAI Producto, Vacuna de CSL, Greenberg Vacuna de Novartis, Autor Clark Grupo de Edad 18-49 50-64 18-49 50-64 18-49 18-49 Dosis (ug) 15 15 30 30 7.5 7.5 Adyuvante ninguno ninguno ninguno ninguno MF59 MF59 No. de dosis y 1, Día 0 1, Día 0 1, Día 0 1, Día 0 1, Día 0 2, Dias 0 régimen y 7 No. de sujetos n=58 n=62 n=61 n=58 n=25 n=26 HAI Día 0 21 19 20 13 6 7 HAI Día 21 307 157 514 174 172 282 Respuesta de 14 8 25 13 28 59 promedio de veces Seroconversión 76 66 82 74 76 92 Seroprotección 100 94 98 88 80 96 En los adultos jóvenes, la dosis máxima tolerada ( TD) para VAX128A fue de 8 pg y para VAX128B de 16pg. El VAX128C fue seguro a 20pg, la máxima dosis probada (Tabla 13) . Las respuestas del suero anticuerpo se vieron en el HAI después de dosis tan bajas como 0.5 pg. Las dosis de 1.25 pg a 2.5 pg indujeron un G T de 1:250 con más de un 90% de seroconversión y seroprotección (Tabla 15a y 15b) . En los adultos >65 años, las tres vacunas fueron seguras en las dosis más altas probadas de 8 pg, 12pg y 20 pg para VAX128A, B y C, respectivamente (Tabla 14) . Las dosis de 2.5 a 4 pg estuvieron asociadas con concentraciones de HAI reciprocas de 70-180 y las dosis de 8-16 pg estuvieron asociadas con concentraciones de HAI de 60 a 370 (Tabla 16) . La Tabla 17 muestra la respuesta inmune por cohorte de edad y la Tabla 18 muestra la respuesta para cada individuo probado que tuviera 65 años de edad o más.

La alteración de la configuración de HAl y flagelina se usó para producir vacunas contra la influenza que sean seguras con una gran ventana terapéutica. VAX128C con dos copias de la cabeza globular de HAl tuvo el MTD más alto y fue el más inmunogénico . La cabeza globular de la HA de la influenza expresada en un sistema procariótico, fue capaz de inducir una respuesta funcional de anticuerpos. Las respuestas vigorosas se vieron en dosis relativamente bajas de antigeno de HA indicando que la adición de flagelina proporcionó un efecto adyuvante sustancial.

Dentro de esta divulgación, cualquier indicación de que una característica es opcional, pretende proporcionar soporte adecuado (ej., según 35 USC 112 o Art. 83 y 84 del EPC) para las reivindicaciones que incluyen lenguaje cerrado o exclusivo o negativo con referencia a la característica opcional. El lenguaje exclusivo específicamente excluye la característica recitada en particular de la inclusión de cualquier materia adicional. Por ejemplo, si se indica que A puede ser el fármaco X, dicho lenguaje pretende proporcionar soporte para una reivindicación que explícitamente especifica que A consiste de X únicamente, o que A no incluye ningún otro fármaco además de X. El lenguaje "negativo" excluye explícitamente la característica opcional por sí misma del alcance de las reivindicaciones. Por ejemplo, si se indica que el elemento A puede incluir X, dicho lenguaje pretende proporcionar soporte para una reivindicación que explícitamente especifica que A no incluye X. Los ejemplos no limitativos de términos exclusivos o negativos incluyen "únicamente", "solamente", "que consiste de", "consistiendo de", "que consiste esencialmente de", "sólo", "sin", "en la ausencia de (ej., otros elementos del mismo tipo, estructura y/o función)", "excluyendo", "sin incluir", "no", "no puede", o cualquiera combinación y/o variación de dicho lenguaje.

Similarmente, los referentes tales como "un", "uno", "una", "dicho", "dicha", "el", "la" o "los", pretende soportar las ocurrencias singulares y/o plurales a menos que el contexto indique lo contrario. Por ejemplo, "un perro" pretende incluir el soporte para un perro, no más de un perro, al menos un perro, una pluralidad de perros, etc. Los ejemplos no limitativos de términos calificativos que indican singularidad, incluyen "un solo", "una sola", "uno", "una", "solo", "sólo uno", "no más de uno", etc. Los ejemplos no limitativos de términos calificativos que indican pluralidad (potencial o real) incluyen "al menos uno", "uno o más", "más de uno", "dos o más", "una multiplicidad", "una pluralidad", "cualquier combinación de", "cualquier permuta de", "cualquiera o más de", etc. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes, se usan, o son relevantes de otra manera para un producto o proceso dado, a menos que se indique lo contrario o de otra manera sea evidente en el contexto .

En donde se den rangos, los puntos finales están incluidos. Más aún, debe entenderse que a menos que se indique lo contrario o sea evidente lo contrario del contexto y entendimiento de una persona con capacidades ordinarias en la materia, los valores que se expresan como rangos pueden asumir cualquier valor o subrango especifico dentro de los rangos declarados en diferentes modalidades de la invención, a la décima parte de la unidad del limite inferior del rango, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Todas las publicaciones y patentes citadas en esta descripción se incorporan en este documento mediante referencia como si cada publicación o patente individual estuviera especifica e individualmente indicada como incorporada mediante referencia. La cita de cualquier publicación es para su divulgación previa a la fecha de presentación y no deberá ser considerada como una admisión de que la presente invención no está facultada como precedente a dicha publicación en virtud de la invención previa .

Mientras que esta invención ha sido demostrada particularmente y descrita con referencia a sus modalidades ejemplares, los expertos en la materia entenderán que los varios cambios en forma y detalles se pueden hacer sin apartarse del alcance y espíritu de la invención abarcada por las reivindicaciones anexas.

Claims (44)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la estimulación de una respuesta inmune en un humano, que comprende el paso de la administración a un humano de una composición que incluye una proteina de fusión que comprende al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antigeno, caracterizado porque la proteina de fusión es administrada al humano en una dosis mayor a alrededor de una dosis de 0.5 g y el humano tiene al menos 49 años de edad.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la administración de la composición al humano proporciona inmunoprotección contra una infección consecuente a la exposición del humano a una fuente del antigeno .

3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el humano tiene entre alrededor de 49 años de edad y 64 años de edad.

4. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el humano tiene al menos 65 años de edad.

5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la dosis es al menos una dosis seleccionada del grupo que consiste de una dosis de 0.5 µg, una dosis de 1 pg, una dosis de 2 pg, una dosis de 3 pg, una dosis de 4 pg, una dosis de 5 pg, una dosis de 6 pg, una dosis de 7 pg, una dosis de 8 pg, una dosis de 10 pg, una dosis de 15 pg, una dosis de 20 pg, una dosis de 25 pg, y una dosis de 30 pg.

6. El método de la reivindicación 5, caracterizado porque la dosis es al menos una dosis seleccionada del grupo que consiste de una dosis de 0.5 pg, una dosis de 1 µ , una dosis de 2 pg, una dosis de 3 pg, una dosis de 4 pg, una dosis de 5 pg, una dosis de 6 pg, una dosis de 7 pg, y una dosis de 8 pg .

7. El método de la reivindicación 5, caracterizado porque la dosis es al menos una dosis seleccionada del grupo que consiste de una dosis de 5 pg, una dosis de 6 µq , una dosis de 7 pg, una dosis de 8 pg, una dosis de 10 q l una dosis de 15 q l una dosis de 20 q , una dosis de 25 pg, y una dosis de 30 q .

8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la dosis es al menos una dosis seleccionada del grupo que consiste de una dosis de 8 µq l una dosis de 10 µq , una dosis de 15 µq , una dosis de 20 µq , una dosis de 25 pg, y una dosis de 30 pg.

9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el antigeno es un antigeno de influenza.

10. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque el antigeno de influenza es un antigeno de influenza hemaglutinina .

11. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque el antigeno de influenza es un antigeno de influenza A.

12. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque el antigeno de influenza es un antigeno de influenza B.

13. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque el antigeno de influenza es un antigeno de influenza C.

14. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina de fusión se administra intramuscularmente al humano.

15. El método de la reivindicación 1, incluyendo, además, el paso de la administración de al menos una dosis subsecuente de la proteina de fusión al humano.

16. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque la proteina de fusión incluye la SEQ ID No. 1.

17. Un método para la estimulación de una respuesta humana en una población humana de adultos mayores, comprendiendo el paso de la administración a la población humana de una composición que incluye una proteina de fusión que comprende al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antigeno, caracterizado porque la tasa de serorespuesta es de al menos un 75%.

18. Un método para la estimulación de una respuesta humana en una población humana de adultos mayores, comprendiendo el paso de la administración a la población humana de una composición que incluye una proteina de fusión que comprende al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antigeno, caracterizado porque la tasa de serorespuesta es de al menos un 95%.

19. Un método para la estimulación de una respuesta humana en una población humana de adultos mayores, comprendiendo el paso de la administración a la población humana de una composición que incluye una proteina de fusión que comprende al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antigeno, caracterizado porque la tasa de serorespuesta es de al menos un 50%.

20. Un método para la estimulación de una respuesta humana en una población humana de adultos mayores, comprendiendo el paso de la administración a la población humana de una composición que incluye una proteína de fusión que comprende al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antígeno de influenza.

21. Un método para la estimulación de una respuesta inmune en un humano, comprendiendo el paso de la administración al humano de una composición que incluye la comprensión de al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antígeno asociado con una partícula, caracterizado porque el humano tiene al menos 49 años de edad.

22. El método de la reivindicación 18, caracterizado porque la partícula es un virosoma, liposoma, microesfera biodegradable, nanopartícula de péptido de auto-montaje, partícula tipo virus o sus combinaciones.

23. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la partícula es una nanopartícula de péptido de auto-montaje.

24. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la partícula es un virosoma.

25. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la administración de la composición al humano proporciona inmunoprotección contra una infección consecuente a la exposición del humano a una fuente del antígeno .

26. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque el humano tiene entre 29 años de edad y 64 años de edad.

27. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque el humano tiene al menos 55 años de edad.

28. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la dosis es al menos una dosis seleccionada del grupo que consiste de una dosis de 8µ?, una dosis de lC^g, una dosis de 15pg, una dosis de 20 g, una dosis de 25 g, y una dosis de 30pg.

29. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque el antigeno es un antigeno de influenza .

30. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque el antigeno de influenza es un antigeno de influenza hemaglutinina.

31. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque el antigeno de influenza es un antigeno de influenza A.

32. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque el antigeno de influenza es un antigeno de influenza B.

33. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque el antigeno de influenza es un antigeno de influenza C.

34. Un método para la estimulación de una respuesta inmune en una población humana de adultos mayores, comprendiendo el paso de la administración a la población humana de una composición que comprende al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antigeno, caracterizado porque la tasa de serorespuesta es de al menos 75%.

35. Un método para la estimulación de una respuesta inmune en una población humana de adultos mayores, comprendiendo el paso de la administración a la población humana de una composición que comprende al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antigeno, caracterizado porque la tasa de serorespuesta es de al menos 95%.

36. Un método para la estimulación de una respuesta inmune en una población humana de adultos mayores, comprendiendo el paso de la administración a la población humana de una composición que comprende al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antigeno, caracterizado porque la tasa de serorespuesta es de al menos 50%.

37. Un método para la estimulación de una respuesta inmune en una población humana de adultos mayores, comprendiendo el paso de la administración a la población humana de una composición que comprende al menos una porción de al menos una flagelina y al menos una porción de al menos un antigeno de influenza.

38. La secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ . ID. No. 2.

39. La secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ . ID. No. 4.

40. La secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ . ID. , No. 6.

41. La secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ . ID. . No. 3.

42. La secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ . ID. , No. 5.

43. La secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ . ID. . No. 7.

44. Un método para la estimulación de una respuesta inmune en una población humana de adultos mayores, comprendiendo el paso de la administración a la población humana de una composición que comprende al menos 3 ]xq de la SEQ, ID. No. 1, caracterizado porque la respuesta inmune producida por la administración de la composición en una población de adultos mayores, cumple con o excede uno de los siguientes criterios: una tasa de seroconversión mayor a 50% mayor a 60%, mayor a 70%, mayor a 80%, mayor a 90%, mayor 95% o mayor a 99%. una tasa de seroproteccion mayor a 50%, mayor a 60%, mayor a 70%, mayor a 80%, mayor a 90%, mayor a 95% o mayor a 99%. un promedio de un incremento de cuatro veces o más en la concentración neutralizante de anticuerpos posterior a la vacunación.