CN103154242B - 诺如病毒衍生的免疫原性组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含第一诺如病毒株VP1的S结构域和包含至少一部分第二诺如病毒株VP1P结构域的P结构域的嵌合诺如病毒VP1蛋白。本发明也涉及编码嵌合VP1蛋白、包含嵌合诺如病毒VP1蛋白的病毒样颗粒的核酸，以及免疫原性组合物。

Description

诺如病毒衍生的免疫原性组合物和方法
本申请要求2010年7月6日提交的美国临时申请61/361,581的优先权，其全部内容通过引用纳入本文以用于所有目的。
诺如病毒（Norovirus）(先前称为诺沃克类病毒、NVL或诺沃克病毒)是成人和儿童中急性病毒性胃肠炎的主要病因。诺如病毒有高度传染性（infectious），并且通过摄入污染食物例如牡蛎和水扩散。诺如病毒也在半封闭社区（如医院、学校、疗养院和大型游轮）中通过粪口途径（fecal-oral route）人际传播而快速蔓延。这些特性使诺如病毒成为主要的公众健康问题。例如，仅在美国，诺如病毒造成大于95%病毒性胃肠炎的爆发，和估计的每年2千3百万例胃肠炎(Fankhauser等(2002)J.Infect.Dis.186:1-7;MMWR Morb.Mortal Weekly Rep.(2000)49:207-211)。
诺如病毒传染（infectious）的症状包含腹泻和呕吐以及伤寒、头疼、寒颤和胃疼。这种症状的原因可以与诺如病毒和小肠表皮细胞糖受体结合有关，所述结合造成了离子转移中的不平衡(Marionneau等(2002)Gastroenterology122:1967-1977;Hutson等(2003)J.Virol.77:405-415)。极易传染的诺如病毒能用少至10个病毒颗粒传染引起疾病。尽管其他方面健康，传染诺如病毒的人可以在2-4天内恢复，但其在症状开始后仍传播病毒多至2周。约30-40%传染的人可以保持无症状，但是通过向更容易传染的其他人传播病毒来扩散传染(Hutson等(2004)Trends Microbiol.12(6):279-287)。
诺如病毒是杯状病毒（Caliciviridae）家族成员，所述杯状病毒是小的、无包膜、二十四面体病毒，直径27-40nm，包含单链正义RNA。系统发生研究显示了诺如病毒属由至少40种不同的毒株组成，根据序列相似性分成5个基因群（genogroup），GI-GV。这5个基因群中，GI和GII是对人类传染最重要的基因群。每个基因群进一步分成基因型。当前GI包含8种不同的基因型，和GII有至少17种不同的基因型。在基因组水平，基因群中的毒株有51-56%核苷酸序列相同性，和基因型中的毒株有69-70%核苷酸序列相似性(Donaldson等，Nat.Rev.Microbiol.2010年2月2日[在线提前发表])。
诺如病毒RNA包含了编码所述病毒结构和非结构蛋白的三个开放阅读框(ORF)。诺如病毒的主要结构蛋白是病毒蛋白1(VP1)。其完全由诺如病毒RNA的ORF2编码，并且形成诺如病毒衣壳结构。所述诺如病毒衣壳由180个拷贝的VP1单体组成。当重组表达VP1时，其能自体组装成缺乏病毒基因组的二十四面体衣壳结构，并称为病毒样颗粒(VLP)。
X射线晶体学研究揭示了各衣壳蛋白VP1由2个不同的结构域组成：壳(S)结构域和突出（protruding）(P)结构域。这两个结构域通过短的柔性接头或铰链拴在一起。VP1单体的S结构域共同形成诺如病毒VLP的核心，并且P结构域在VLP表面辐射状延伸，并且包含大量已知诺如病毒抗原表位部分。所述P结构域(aa226-530,诺沃克株编号)分成两个亚结构域Pl和P2。所述P2结构域呈辐射状位于病毒颗粒(或VLP)的最外表面，并且认为序列上高度可变。(参见例如Chen等，(2004)J.Virol.78:6469-6479)。所述P2结构域是诺如病毒株中VPl最不保守的区域，并且认为在受体结合和免疫反应中起重要作用。(Kitamoto等(2002)J.Clin.Microbiol.40:2459-2465;Prasad等(1999)Science286:287-290;Tan等(2003)J.Virol.77:12562-12571;White等(1996)J.Virol.70:6589-6597;Vance等(2005)J.General Virol.86:2799-2806)。结构研究显示了不同诺如病毒P2亚结构域形状和大小的多样性，这与观察到的P2亚结构域序列可变性一致。Chen等(2004)J.Virology78(12):6469-6479。
使用杆状病毒传染的昆虫细胞表达系统(Jiang等(1992)J.Virol.66:6527-6532)且随后使用委内瑞拉马脑炎病毒载体传染的哺乳动物细胞表达系统(Baric等(2002)J.Virol.76:3025-3030)第一次显示了诺沃克病毒VLP的表达和自体组装。当在真核表达系统中高水平表达时，诺沃克病毒中VP1单体和某些其他诺如病毒自体组装成结构上模仿天然诺如病毒颗粒的VLP。VLP保持了病毒蛋白衣壳的可靠构型，但是缺乏诺如病毒遗传材料。当注射到动物中时，诺如病毒VLP能引起合适的宿主免疫反应。
尽管已经知道了关于诺如病毒的抗原属性，开发针对诺如病毒的有效疫苗缓慢并且有挑战性。有数个原因造成开发有效针对广泛诺如病毒株（包含从不同基因群和基因型中地域分离（field isolate））的诺如病毒疫苗是一个挑战。一个原因是在不同的诺如病毒株中存在的复杂抗原多样性。基因型变异能产生新的配体结合特性和抗原属性(Donaldson等,Nat.Rev.Microbiol.2010年2月2日[在线提前发表])。第二个原因是优势(dominant)循环诺如病毒株的顺序取代(Siebenga等(2007)J.Virol81:9932-9941)。第三个原因是缺乏人诺如病毒的细胞培养模型，阻止了中和试验的发展。第四个原因是缺乏人诺如病毒的动物模型，限制了疫苗功效的临床前测试并且妨碍了解诺如病毒病因和免疫的研究(Donaldson等(2010)Nature Rev.Microbiol.8:231-241)。
为了呈现优势免疫诺如病毒表位作为疫苗，先前制备了包含来自仅一种诺如病毒株的一种类型VP1蛋白的VLP(也称为单价VLP)或来自两种或更多种诺如病毒株的非嵌合VP1蛋白的混合物(也称为多价VLP)。见例如WO2009039229。单价VLP可能针对广泛诺如病毒株的有效性小于多价VLP。当前多价VLP可限制在来自不同株的VP1范围中，所述不同株能由于株之间VP1-VP1相互作用表面的差异而共组装。由于这些问题，上述疫苗系统都不适合针对由于病毒进化而出现的新型诺如病毒的快速定制。
诺如病毒经历了抗原类型的累进变化，用新的抗原变体代替更旧的抗原变体。因此，可能需要周期性改变诺如病毒疫苗的毒株组成，如现在对季节性流感疫苗所完成的。在不同的效率水平发生来自不同诺如病毒株VP1的VLP组装，并且所得VLP有不同水平的产率和稳定性。株之间的这种变化会妨碍诺如病毒疫苗组合物中所需株改变的速度、可靠性和便利性。
因此，仍需要改善诺如病毒疫苗的开发方法，所述方法使具有来自任意所需诺如病毒株（包含新的地域（field）和/或临床分离）的有效制备、稳定和合适呈现的诺如病毒免疫原性材料的毒株组成快速改变。
发明内容
本发明部分提供了包含诺如病毒抗原和材料的免疫原性组合物，以及能用于快速开发这种组合物的方法。本发明的诺如病毒抗原包含嵌合诺如病毒VP1蛋白，其中全部或部分P结构域用来自不同诺如病毒株的全部或部分P结构域取代。
一方面，本发明涉及嵌合诺如病毒的病毒蛋白1(VP1)，所述病毒蛋白包含来自第一诺如病毒株VP1的S结构域和至少一部分来自第二诺如病毒株VP1的P结构域，和可选操作性连接所述S结构域和P结构域的接头肽。当存在时，所述接头肽能是任意合适的接头，例如来自第一诺如病毒株、来自第二诺如病毒株或来自第三诺如病毒株的VP1的接头肽。所述嵌合VP1能有如式(I)所述的结构:A—S—L—P—B(I)。
在式(I)中，A和B各自缺失，或是任意所需的氨基酸序列;S是来自第一诺如病毒株VP1的S结构域;L不存在或是接头肽;并且P是诺如病毒VP1的P结构域;其中至少一部分P结构域来自第二诺如病毒株。
在一些实施方式中，P是来自第二诺如病毒株的P结构域。在其他实施方式中，P包含来自第一诺如病毒株的P1亚结构域或其部分，和来自第二诺如病毒株的P2亚结构域。
所述嵌合VP1蛋白能包含数个部分，如来自任意所需诺如病毒株如表1所列举的诺如病毒株的S结构域、P结构域。在一些实施方式中，所述S结构域来自雪山（SnowMountain）株。在这些实施方式中，所述P结构域或其部分(如P2亚结构域)能来自任意其他诺如病毒株，如表1所列举的那些。在特定实施方式中，所述S结构域来自雪山株，和所述P结构域或其部分(如P2亚结构域)来自基因群GII的不同诺如病毒株、基因群GI的诺如病毒株或基因群GIV的诺如病毒株。在更特定的实施方式中，所述S结构域来自雪山株，和所述P结构域或其部分(如P2亚结构域)来自诺沃克病毒、GII.4.2006a或新奥尔良(New Orleans)病毒。
在另一方面，本发明涉及包含本文所述嵌合VP1蛋白的诺如病毒病毒样颗粒(VLP)。所述VLP能是单价或多价。所述多价VLP能包含如本文所述的两种或更多种嵌合VP1蛋白。所述多价VLP能包含本文所述嵌合VP1蛋白和天然产生的诺如病毒VP1蛋白。
本发明也涉及编码本文所述嵌合诺如病毒VP1蛋白的重组核酸。所述重组核酸能是例如RNA或DNA，并且若需要能包含载体。在一些实施方式中，所述重组核酸是自体复制的，例如自体复制RNA。
另一方面，本发明涉及包含本文所述嵌合诺如病毒VP1蛋白、本文所述VLP或其组合的免疫原性组合物。本发明也涉及包含编码本文所述嵌合诺如病毒VP1蛋白的重组核酸的免疫原性组合物。
另一方面，本发明涉及包含编码本文所述嵌合诺如病毒VP1蛋白的重组核酸的重组宿主细胞。例如所述宿主细胞能是昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、细菌、酵母细胞、四膜虫细胞和其组合。
本发明也涉及生成嵌合诺如病毒VP1蛋白和/或VLP的方法，所述方法包含在表达所述重组核酸和生成嵌合VP1蛋白的条件下培养本文所述重组宿主细胞。在一些实施方式中，在适于形成VLP的条件下维持所述重组宿主细胞。在一些实施方式中，所述方法还包含从培养基和/或所述重组宿主细胞中分离所述嵌合诺如病毒VP1蛋白和/或VLP。
附图简要说明
图1描述适合亚克隆和扩增本发明所述嵌合VP1寡核苷酸的载体pMADC5的图。
图2描述适合在酿酒酵母（S.cerevisiae）中表达嵌合VP1蛋白和VLP的载体pBS24.1的图。
图3是来自三个不同诺如病毒株（诺沃克(norw)基因型G1.1(SEQ ID NO:11)、雪山(雪（snow）)基因型GII.2(SEQ ID NO:12)和2006a(g2.4)GII.4(SEQ ID NO:13)）的VP1蛋白的氨基酸比对。如所示，所述壳结构域(S结构域)是残基1-221，所述接头肽是残基222-230，和所述突出结构域(P结构域)是残基231-530。
图4A描述诺如病毒株雪山中ORF2的核苷酸序列(SEQ ID NO:14)，所述核苷酸序列在所述株中编码VP1蛋白。图4B显示了由雪山ORF2编码的VP1蛋白的经翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)。
图5描述编码嵌合VP1蛋白的核酸(SEQ ID NO:15)，所述蛋白的S结构域衍生自雪山株，和P结构域衍生自诺沃克株。
图6描述编码嵌合VP1蛋白的核酸(SEQ ID NO:16)，所述蛋白的S结构域衍生自雪山株，和P结构域衍生自GII.42006a株。
图7显示了24种本发明示例性嵌合VP1蛋白的初级结构的示意图。所述变体A、S、L、P1-1、P2、P1-2和B如本文所述。
图8A-8E显示了数个诺如病毒株的VP1序列的多个氨基酸比对。见Hansman等(2006)J.General Virology87:909-919。这些图中指示了下列区域:N末端区(线);S结构域(填充框),P1-1亚结构域(空心框);P2亚结构域(XXX);P1-2亚结构域(空心框)和C末端区(线)。星号表示保守氨基酸。所示序列来自下列诺如病毒株:#8(SEQ ID NO:17)(AB058547，GI/11株);SeV(SEQ ID NO:18)(AB031013,GI/1株);258(SEQ ID NO:19)(AB078335,GI/2株);645(SEQ ID NO:20)(BD011871,GI/3株);CV(SEQ ID NO:21)(AB042808,GI/4株);WUG1(SEQ ID NO:22)(AB081723,GI/8株);HV(SEQ ID NO:23)(U07611,GII/1株);485(SEQ ID NO:24)(DQ093065,GII/1株);Ina(SEQ ID NO:25)(AB195225,GII/2株);809(SEQ ID NO:26)(BD011876,GII/3株);Sh5(SEQ ID NO:27)(AB195226,GII/3株);18-3(SEQ ID NO:28)(DQ093062,GII/3株);336(SEQ ID NO:29)(DQ093063,GII/3株);1152(SEQ ID NO:30)(DQ0930);104(SEQ ID NO:31)(AB078336,GII/4株);754(SEQ ID NO:32)(BD011877,GII/5株);7k(SEQ ID NO:33)(AB078337,GII/6株);445(SEQ ID NO:34)(DQ093064,GII/6株);10-25(SEQ ID NO:35)(9BD011881,GII/7株);U25(SEQ ID NO:36)(AB039780,GII/8株);026(SEQ ID NO:37)(AF504671,GII/10株);CHV(SEQ ID NO:38)(AB032758,GII/12株);47(SEQ IDNO:39)(AB078334,GII/14株);Hiro(SEQ ID NO:40)(AB044366,GII/12株);Alph23(SEQ ID NO:41)(DQ093067,GII/17株)。
图9是显示由Chakavarty等(2005)J.Virology,79(1):554-568鉴定的氨基酸残基，所述氨基酸残基来自区分不同的已知和提示抗原性诺如病毒株和种类的S和P结构域。
图10A是有深灰色S结构域(内部)和浅灰色P结构域(外部)的诺沃克病毒样颗粒的X射线结构。图10B是图10A中彩色的单个单体的视图。
图11A是描述雪山VLP的纯化蛋白的图像。图11B是雪山VLP的电子显微照片。
图12A是描述雪山/诺沃克VLP嵌合体的纯化蛋白的图像。图12B是雪山/诺沃克嵌合VLP的电子显微照片。
发明详述
本发明提供了生产和使用嵌合诺如病毒VP1蛋白的组合物和方法。本发明还提供了包含含有所述VP1蛋白的诺如病毒VLP的免疫原性组合物，其中所述S结构域获自第一诺如病毒株和全部或部分所述P结构域获自第二诺如病毒株。
本发明的其他方面包含核酸和多肽，以及制备和纯化这种核酸和多肽的方法。下面更详细描述了本发明的这些方面与本发明的VLP和其在免疫原性组合物中的应用以及这种组合物在治疗或预防诺如病毒中的使用方法。
I．定义
除非另外说明，本申请中使用的所有科学和技术术语的含义具有本领域通用的含义。本申请使用的下列单词或短语有特定含义。
如本文所用，“一个”、“一种”和“该”包括单数和复数指代形式，除非文中另有明确说明。因此，例如提及“一种多核苷酸”包括两种或更多种多核苷酸的混合物等。
与数值x相关的术语“约”表示，例如x+10%。
本文使用的术语"诺如病毒"和"诺沃克样病毒"指正义单链RNA包膜病毒的杯状病毒家族的诺如病毒属成员(Green等，Human Caliciviruses(人杯状病毒)，FieldsVirology（《费氏病毒学》），卷1，第841-874页(Knipe和Howley,主编，第4版，利平科特威廉斯.威尔金斯出版公司（Lippincott Williams&Wilkins）2001))。术语诺如病毒包含所有病毒基因群中的毒株。当前，诺如病毒株分成5个基因群(GI-GV)，再分成至少20个基因簇或基因型。特别地，术语诺如病毒包括但不限于：物种诺沃克病毒(NV)、Lordsdale病毒(LV)、墨西哥病毒(MV)、夏威夷病毒(HV)、雪山病毒(SMV)、沙漠风暴病毒(DSV)和南安普顿病毒(SV)。大量诺如病毒分离物被部分或完全测序。见例如GenBank数据库(ncbi.nlm.nih.gov)、国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）的分类学数据库（TaxonomyDatabase）(ncbi.nlm.nih.gov)或杯状病毒的pathosystems资源整合中心数据库（PathoSystems Resource Integration Center Database）(patric.vbi.vt.edu)。术语诺如病毒也包含在提交时间没有定性的分离物。
术语"多肽"和"蛋白"指氨基酸残基的聚合物，且不限于产物的最小长度。因此，该定义中包含肽、寡肽、二聚体、多聚体等。该定义包含全长蛋白和其片段。所述术语也包含多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外，出于本发明的目的，"多肽"指包含对天然序列修饰例如缺失、加入和取代(通常性质上保守)的蛋白，只要所述蛋白维持了所需活性。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，或者可以是意外的，例如通过产生蛋白质的宿主突变或PCR扩增所致的误差。
"基本纯化"通常指物质(化合物、多核苷酸、蛋白、多肽、多肽组合物)的分离，从而所述物质包含大部分其驻留的样品。通常样品中，基本纯化成分包含样品的50%，优选80%-85%，更优选90-95%。纯化感兴趣的多核苷酸和多肽的技术为本领域熟知，并且包含例如离子交换层析、亲和层析和密度沉降。
当涉及多肽时，"分离的"指所示分子是从全生物体中分离和分开（discrete），所述全生物体中天然发现所述分子或者所述分子在基本没有相同类型的其他生物大分子情况下存在。对多核苷酸而言，术语"分离的"是全部或部分没有其天然相关（associate）序列的核酸分子;或者如其天然存在的一种序列，但是有与之关联的异源序列;或者从染色体解离的分子。
本文用于描述核酸分子的“重组”指基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作，所述多核苷酸与其天然相关（associate）的全部或部分多核苷酸不关联。对蛋白或多肽而言，使用术语“重组”指由重组多核苷酸表达生成的多肽。通常，克隆感兴趣基因并且然后在如下面进一步所述的转化生物体中表达。所述宿主生物体表达外源基因以生成表达条件下的蛋白。
术语“转化”指将外源多核苷酸插入到宿主细胞，而不考虑使用插入的方法。例如，包含直接摄取、转染、转导或f匹配。所述外源多核苷酸可维持为非整合载体例如质粒，或者可以整合到宿主基因组中。
“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和其他这种术语表示培养的微生物或高等真核细胞系，因为单细胞实体指能用作或者已经用作重组载体或其他转移DNA的受体，并且包含已转染原始细胞的初始后代。
“编码序列”或“编码”选定多肽的序列是置于合适调节序列(或“控制元件”)控制下时体内转录(DNA情况中)和翻译(mRNA情况中)成多肽的核酸分子。编码序列的边界能由5’(氨基)末端起始密码子和3’(羧基)末端翻译终止密码子确定。编码序列能包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA或RNA的基因组DNA序列，和甚至合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3’端。
通常“控制元件”包括但不限于转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、聚腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子的3′)、翻译起始优化序列(位于编码序列的5′)和翻译终止序列。
术语“核酸”包括DNA和RNA，以及其类似物，如含有修饰主链的类似物(如硫代磷酸酯等)，及肽核酸（PNA）等。本发明包含与上述那些互补的序列的核酸(例如出于反义或探针目的)。
术语“自体复制”指编码聚合酶、包含能使聚合酶复制所述核酸分子的核苷酸序列元件、并且优选也编码所需多肽如嵌合诺如病毒VP1的核酸分子。所述自体复制核酸优选是自体复制RNA分子。例如自体复制RNA分子能基于α病毒基因组，并且编码能指导所述RNA分子复制的非结构蛋白，包含足以使RNA分子复制的复制识别序列，还编码所需靶标多肽例如嵌合诺如病毒VP1。可选地，从自体复制RNA分子中删除或省略一种或多种结构病毒基因(如衣壳和/或包膜糖蛋白)。能用于生成自体复制RNA分子的合适α病毒包含辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等。(关于自体复制RNA分子，参见例如EP1751289B1;Ying等(1999)Nat.Med.5(7):823-827;Racanelli等(2004)Immunity,20(1):47-58)。
"操作性连接"指配置所述组件以便行使其常见功能的元件排列。因此，当存在合适的酶时，操作性连接到编码序列的给定启动子能影响编码序列的表达。启动子可不必与编码序列毗连，只要其发挥指导编码序列表达的功能。因此，例如，间插非翻译和尚未转录序列可启动子序列和编码序列之间出现，仍可认为该启动子序列“操作性连接”该编码序列。
“由…编码”指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分包含至少3个氨基酸的氨基酸序列。
“表达盒”或“表达构建物”指能指导感兴趣序列或基因表达的组件。表达盒一般包括上述控制元件，例如操作性连接到感兴趣序列或基因的启动子(以指导其转录)，并且通常还包括聚腺苷酸化序列。在本发明的某些实施方式中，本文所述的表达盒可以包含在质粒构建物中。除了表达盒的成分，所述质粒构建物可以包含一种或多种选择标记、使质粒构建物作为单链DNA存在的信号(如复制的M13起点)、至少一个多克隆位点和复制的“哺乳动物”起点(如复制的SV40或腺病毒起点)。
“纯化的多核苷酸”指感兴趣多核苷酸或其片段，其基本没有所述多核苷酸天然结合（associate）的蛋白，例如包含少于约50%、优选少于约70%、和更优选少于约至少90%的所述蛋白。纯化感兴趣多核苷酸的技术为本领域熟知，并且包含例如用离液剂破坏包含多核苷酸的细胞，和通过离子交换层析、亲和层析和密度沉降分离多核苷酸和蛋白。
“载体”能转移核酸序列到靶细胞(如病毒载体、非病毒载体、特定运载体和脂质体)。"载体构建物"、"表达载体"和"基因转移载体"通常指能指导感兴趣核酸表达并能将核酸序列转移至靶细胞的核酸构建物。因此，该术语包括克隆和表达运载体以及病毒载体。
本文使用的术语“表位”通常指由T细胞受体和/或抗体识别的抗原上位点。其可以是衍生自蛋白抗原或是作为蛋白抗原一部分的短肽。所述表位的三维结构对其功能可以重要或不重要。然而所述术语也意在包含有糖肽和糖表位的肽。单个抗原分子可以载有数个不同的表位。术语“表位”也包含刺激识别全生物体反应的氨基酸或糖的修饰序列。如果选定表位是造成传染性（infectious）疾病的传染剂的表位，那么这是有利的。
对于各种诺如病毒衣壳表位的描述，参见例如Hardy等,美国专利申请公开号2005/0152911;通过引用全文纳入本文。特别地，Hardy等鉴定了诺沃克病毒衣壳蛋白的残基133-137和雪山病毒衣壳蛋白的残基319-327的表位，所述表位包含下列序列:WTRGSHNL(SEQ ID NO:1)、WTRGGHGL(SEQ ID NO:2)、WTRGQHQL(SEQ IDNO:3)或WLPAPIDKL(SEQ ID NO:4)。包含这种衣壳表位的免疫原性多肽和其编码核酸可以用于实施本发明。
本文使用的术语“T细胞表位”通常指能诱导T细胞反应的那些肽结构特性，以及“B细胞表位”通常指能诱导B细胞反应的那些肽结构特性。
对抗原或组合物的“免疫反应”是在对象中发展感兴趣组合物内所存在抗原的体液和/或细胞免疫反应。出于本发明的目的，“体液免疫反应”指由抗体分子介导的免疫反应，而“细胞免疫反应”是T-淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫反应。细胞免疫的一个重要方面涉及细胞溶解T细胞(“CTL”)的抗原特异性反应。CTL有针对肽抗原的特异性，所述肽抗原与主要组织相容性复合体(MHC)编码并在细胞表面表达的蛋白关联呈递。CTL帮助诱导并促进胞内微生物的破坏，或传染有这类微生物的细胞裂解。细胞免疫的另一方面涉及辅助T细胞的抗原特异性反应。辅助T细胞作用于帮助刺激非特异性效应细胞的功能并集中其活性，所述细胞针对在其表面展示MHC分子相关肽抗原的细胞。"细胞免疫反应"也指由活化的T-细胞和/或包括CD4+和CD8+T细胞衍生细胞在内的其他白细胞产生的细胞因子、趋化因子和其他这类分子生成。
引起细胞免疫反应的免疫原性组合物或疫苗可通过在细胞表面呈递MHC分子相关抗原而使脊椎动物对象致敏。细胞介导的免疫反应针对在其表面呈递抗原的细胞或其附近。此外，可产生抗原特异性T淋巴细胞用于今后保护免疫宿主。
特定抗原刺激细胞介导免疫反应的能力可以由很多试验测定，例如淋巴增殖(淋巴细胞活化)试验、CTL细胞毒性细胞试验，或通过测试敏化对象中的抗原特异性T淋巴细胞。这些试验为本领域熟知。参见例如Erickson等，(1993)J.Immunol.151:4189-4199；Doe等，(1994)Eur.J.Immunol.24:2369-2376。近期测量细胞介导免疫反应的方法包含测量胞内细胞因子或T细胞群的细胞因子分泌，或者通过测量表位特异性T细胞(如通过四聚体技术)(由McMichael,A.J.和O'Callaghan,C.A.(1998)J.Exp.Med.187(9)1367-1371;Mcheyzer-Williams,M.G.等(1996),Immunol.Rev.150:5-21;Lalvani,A.等(1997)J.Exp.Med.186:859-865综述)。
因此，本文使用的免疫反应可以是刺激抗体生成的那种(如中和阻断细菌毒素和病原体如病毒进入细胞的抗体，和通过结合毒素和病原体而复制，通常保护细胞免于传染和破坏)。感兴趣抗原也可以引起CTL的生成。因此，免疫反应可包含下面一种或多种效果：B细胞生成抗体;和/或抑制T细胞的活化，和/或特异针对感兴趣组合物或疫苗中所存在一种或多种抗原的记忆/效应T细胞的活化。这些反应可用于中和传染性和/或介导抗体-补体或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)来为经免疫宿主提供保护。这种反应能使用标准免疫试验测定。通过活化免疫细胞上的Toll样受体和相似受体分子，哺乳动物的先天免疫系统还识别和响应病原生物体的分子特性。先天免疫系统活化后，各种非获得性免疫反应细胞被活化以例如生成各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子。由先天免疫反应活化的细胞包含单核细胞和浆细胞谱系(MDC、PDC)的未成熟和成熟树突细胞，以及γ、Δ、α和βT细胞和B细胞等。因此，本发明也考虑了免疫反应，其中所述免疫反应涉及先天和获得性反应。
“免疫原性复合物”是包含抗原分子的组合物，其中给予对象组合物引起对象中发展出对感兴趣抗原分子的体液和/或细胞免疫反应。
术语“免疫原性”蛋白或多肽指引起上述免疫反应的氨基酸序列。本文使用的“免疫原性”蛋白或多肽包含测试蛋白的全长天然或重组序列，包含前体或成熟形式，其类似物或其免疫原性片段。
上面定义的诺如病毒多核苷酸、寡核苷酸、核酸、蛋白、多肽或肽是分别衍生自诺如病毒的分子，包括但不限于任意多种诺如病毒分离物。所述分子不需要从特定的测试分离物中物理衍生，但是可以是合成或重组生成的。
特别地，诺如病毒株基因组包含三个开放阅读框:转录成多蛋白的ORF1;转录成主要衣壳蛋白VP1的ORF2;和转录成次要结构蛋白VP2的ORF3。在诺如病毒株诺沃克中，VP1蛋白内的多肽结构域边界如下:氨基酸残基1-221形成的壳(S)结构域、氨基酸残基222-230的可变铰链区和氨基酸231-530形成的突出(P)结构域。所述P结构域再分成两个亚结构域：P1和高度可变P2，其从衣壳延伸最远并且包含推定的受体结合位点(Choi等(2008)Proc.Natl.Aacd.Sci.USA105:9175-9180,Prasad等(1999)Science286:287-290)。尽管上述编号是相对于诺沃克株的多蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:11)，应理解获自其他基因型和诺如病毒分离物的序列的对应氨基酸位点也意在包含在本发明中。例如参见图3。任一编码全长VP1或VP2，以及其变体，其免疫原性片段的多肽，和编码这种多肽、变体或免疫原性片段的核酸能用于实施本发明。
已知很多诺如病毒分离物的核酸和蛋白序列。代表性诺如病毒VP1和VP2序列示于图4A-4B和5A-5B。其他代表性序列包含序列ORF1、ORF2、ORF3，和其来自诺如病毒分离物的编码多肽列举于国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中。见例如GenBank编号:诺如病毒基因群1株Hu/NoV/西切斯特/2001/USA,GenBank登录号AY502016;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/Braddock Heights/1999/USA,GenBank登录号AY502015;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/拉法叶（Fayette）/1999/USA,GenBank登录号AY502014;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/费尔菲尔德/1999/USA,GenBank登录号AY502013;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/桑达斯基/1999/USA,GenBank登录号AY502012;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/坎顿（Canton）/1999/USA,GenBank登录号AY502011;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/蒂芬（Tiffin）/1999/USA,GenBank登录号AY502010;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/CS-E1/2002/USA,GenBank登录号AY50200;诺如病毒基因群1株Hu/NoV/威斯康辛/2001/USA,GenBank登录号AY502008;诺如病毒基因群1株Hu/NoV/CS-841/2001/USA,GenBank登录号AY502007;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/希拉姆/2000/USA,GenBank登录号AY502006;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/Tontogany/1999/USA,GenBank登录号AY502005;诺沃克病毒，全基因组,GenBank登录号NC—001959;诺如病毒Hu/GI/音更镇/1979/JP基因组RNA,全基因组,GenBank登录号AB187514;诺如病毒Hu/北海道/133/2003/JP,GenBank登录号AB212306;诺如病毒悉尼2212,GenBank登录号AY588132;诺沃克病毒株SN2000JA,GenBank登录号AB190457;Lordsdale病毒全基因组,GenBank登录号X86557;诺沃克样病毒基因组RNA,Gifu'96,GenBank登录号AB045603;诺沃克病毒株越南026,全基因组,GenBank登录号AF504671;诺如病毒Hu/GII.4/2004/N/L,GenBank登录号AY883096;诺如病毒Hu/GII/北辰/03/JP,GenBank登录号AB195227;诺如病毒Hu/GII/加茂（Kamo）/03/JP,GenBank登录号AB195228;诺如病毒Hu/GII/Sinsiro/97/JP,GenBank登录号AB195226;诺如病毒Hu/GII/Ina/02/JP,GenBank登录号AB195225;诺如病毒Hu/NLV/GII/新施特雷利茨260/2000/DE,GenBank登录号AY772730;诺如病毒Hu/NLV/德雷斯顿174/pUS-NorII/1997/GE,GenBank登录号AY741811;诺如病毒Hu/NLV/牛津/B2S16/2002/UK,GenBank登录号AY587989;诺如病毒Hu/NLV/牛津/B4S7/2002/UK,GenBank登录号AY587987;诺如病毒Hu/NLV/惠特尼/B7S2/2003/UK,GenBank登录号AY588030;诺如病毒Hu/NLV/班柏立/B9S23/2003/UK,GenBank登录号AY588029;诺如病毒Hu/NLV/奇平诺顿/2003/UK,GenBank登录号AY588028;诺如病毒Hu/NLV/迪德科特/B9S2/2003/UK,GenBank登录号AY588027;诺如病毒Hu/NLV/牛津/B8S5/2002/UK,GenBank登录号AY588026;诺如病毒Hu/NLV/牛津/B6S4/2003/UK,GenBank登录号AY588025;诺如病毒Hu/NLV/牛津/B6S5/2003/UK,GenBank登录号AY588024;诺如病毒Hu/NLV/牛津/B5S23/2003/UK,GenBank登录号AY588023;诺如病毒Hu/NLV/牛津/B6S2/2003/UK,GenBank登录号AY588022;诺如病毒Hu/NLV/牛津/B6S6/2003/UK,GenBank登录号AY588021;诺沃克病毒分离物Bo/瑟斯克10/00/UK,GenBank登录号AY126468;诺沃克样病毒分离物Bo/彭里斯55/00/UK,GenBank登录号AY126476;诺沃克病毒分离物Bo/阿伯里斯特威斯24/00/UK,GenBank登录号AY126475;诺沃克样病毒分离物Bo/邓弗里斯/94/UK,GenBank登录号AY126474;诺如病毒NLV/IF2036/2003/伊拉克,GenBank登录号AY675555;诺如病毒NLV/IF1998/2003/伊拉克,GenBank登录号AY675554;诺如病毒NLV/BUDS/2002/USA,GenBank登录号AY660568;诺如病毒NLV/巴黎岛/2003/USA,GenBank登录号AY652979;雪山病毒,全基因组,GenBank登录号AY134748;诺沃克样病毒NLV/Fort Lauderdale/560/1998/US,GenBank登录号AF414426;Hu/诺如病毒/广岛/1999/JP(9912-02F),GenBank登录号AB044366;诺沃克样病毒株11MSU-MW,GenBank登录号AY274820;诺沃克样病毒株B-1SVD,GenBank登录号AY274819;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/法明顿希尔斯/2002/USA,GenBank登录号AY502023;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/CS-G4/2002/USA,GenBank登录号AY502022;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/CS-G2/2002/USA,GenBank登录号AY502021;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/CS-G12002/USA,GenBank登录号AY502020;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/安克雷奇/2002/USA,GenBank登录号AY502019;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/CS-D1/2002/CAN,GenBank登录号AY502018;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/Germanton/2002/USA,GenBank登录号AY502017;人杯状病毒NLV/GII/兰根(Langen)1061/2002/DE,全基因组,GenBank登录号AY485642;鼠诺如病毒1多蛋白,GenBank登录号AY228235;诺沃克病毒,GenBank登录号AB067536;人杯状病毒NLV/Mex7076/1999,GenBank登录号AF542090;人杯状病毒NLV/奥伯豪森455/01/DE,GenBank登录号AF539440;人杯状病毒NLV/赫茨伯格385/01/DE,GenBank登录号AF539439;人杯状病毒NLV/博克瑟（Boxer）/2001/US,GenBank登录号AF538679;诺沃克样病毒基因组RNA,全基因组,GenBank登录号AB081723;诺沃克样病毒基因组RNA,全基因组,分离物:崎玉（Saitama）U201,GenBank登录号AB039782;诺沃克样病毒基因组RNA,全基因组,分离物:崎玉（Saitama）U18,GenBank登录号AB039781;诺沃克样病毒基因组RNA,全基因组,分离物:崎玉（Saitama）U25,GenBank登录号AB039780;诺沃克病毒株:U25GII,GenBank登录号AB067543;诺沃克病毒株:U201GII,GenBank登录号AB067542;诺沃克样病毒株416/97003156/1996/LA,GenBank登录号AF080559;诺沃克样病毒株408/97003012/1996/FL,GenBank登录号AF080558;诺沃克样病毒NLV/波沃什兰丁/331/1995/US,GenBank登录号AF414425;诺沃克样病毒NLV/迈阿密滩(Miami Beach)/326/1995/US,GenBank登录号AF414424;诺沃克样病毒NLV/白河(White River)/290/1994/US,GenBank登录号AF414423;诺沃克样病毒NLV/新奥尔良/306/1994/US,GenBank登录号AF414422;诺沃克样病毒NLV/卡纳维拉尔港/301/1994/US,GenBank登录号AF414421;诺沃克样病毒NLV/火奴鲁鲁/314/1994/US,GenBank登录号AF414420;诺沃克样病毒NLV/里士满/283/1994/US,GenBank登录号AF414419;诺沃克样病毒NLV/威斯多佛（Westover）/302/1994/US,GenBank登录号AF414418;诺沃克样病毒NLV/UK3-17/12700/1992/GB,GenBank登录号AF414417;诺沃克样病毒NLV/迈阿密/81/1986/US,GenBank登录号AF414416;雪山株,GenBank登录号U70059;沙漠风暴病毒DSV395,GenBank登录号U04469;诺沃克病毒，全基因组，GenBank登录号AF093797;夏威夷杯状病毒,GenBank登录号U07611;南安普顿病毒,GenBank登录号L07418;诺沃克病毒(SRSV-KY-89/89/J),GenBank登录号L23828;诺沃克病毒(SRSV-SMA/76/US),GenBank登录号L23831;坎伯威尔病毒,GenBank登录号U46500;人杯状病毒株梅尔克舍姆（Melksham）,GenBank登录号X81879;人杯状病毒株MX,GenBank登录号U22498;微小呼肠病毒（Minireovirus）TV24,GenBank登录号U02030;和诺沃克样病毒NLV/Gwynedd/273/1994/US,GenBank登录号AF414409;所有这些序列(如此申请提交日输入)通过引用纳入本文。其他诺如病毒序列公开于下列专利公开:WO05/030806、WO00/79280、JP2002020399、US2003129588、美国专利号6,572,862、WO94/05700和WO05/032457，所有这些通过引用纳入本文。也参见Green等(2000)J.Infect.Dis.181(增刊2):S322-S330;Wang等(1994)J.Virol.68:5982-5990;Chen等(2004)J.Virol.78:6469-6479;Chakravarty等(2005)J.Virol.79:554-568;和Fankhauser等(1998)J.Infect.Dis.178:1571-1578;用于诺如病毒的序列比较和基因多样性的讨论和系统发生分析。
本文使用关于诺如病毒的术语“主要衣壳蛋白”或“主要衣壳多肽”或“VP1”指包含与诺如病毒ORF2编码多肽序列同源或相同的多肽，并且包含显示与其至少约70-100%或约80-100%氨基酸序列相同性的序列，包含这个范围内的任意百分比相同性，如71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%氨基酸序列相同性。
本文使用关于诺如病毒的术语“次要结构蛋白”或“次要结构多肽”或“VP2”或“小碱性蛋白”指包含与诺如病毒ORF3编码多肽序列同源或相同的多肽，并且包含显示与其至少约70-100%或约80-100%氨基酸序列相同性的序列，包含这个范围内的任意百分比相同性，如71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%氨基酸序列相同性。
本文使用的术语“病毒样颗粒”或“VLP”指非复制、非传染性（noninfectious）病毒壳，包含病毒衣壳但是缺少全部或部分病毒基因组，特别是病毒基因组的复制和传染组分。VLP通常由一种或多种病毒蛋白组成，例如但不限于称为衣壳、包被（coat）、壳、表面、结构蛋白(如VP1、VP2)的蛋白。诺如病毒VLP能在合适病毒系统中重组表达VP1后自发形成。生成特定VLP的方法为本领域已知，并且在下面更详细讨论。重组表达病毒蛋白后，VLP的存在能使用本领域已知的传统技术检测，例如电子显微镜、生物物理定性等。例如，VLP能通过密度梯度离心分离和/或通过定性密度特征鉴定。或者，能在测试VLP制品的玻璃化水性样品上进行冷冻电子显微检测，并且在合适的暴露条件下记录图像。在用电子致密的阴性造影剂（例如乙酸铀酰、甲酸双氧铀（uranuyl formate）或磷钨酸）包被后，能在诺如病毒或诺如病毒VLP样品上进行负染电子显微镜检查。
本文使用的“生物样品”指从对象中分离的组织或液体样品，包括但不限于例如，血液、血浆、血清、粪便物质、尿、骨髓、胆汁、脑脊液、淋巴液、皮肤样品、皮肤外部分泌、呼吸、肠、和泌尿生殖道、眼泪、唾液、乳液、血细胞、器官、生物活检，以及体外细胞培养组分的样品，包括但不限于培养基中细胞和组织生长所得的条件培养基，如重组细胞，和细胞组分。特别地，诺如病毒可获自生物样品，例如来自传染病毒个体的呕吐或腹泻。
“对象”指脊索动物亚门的任意成员，包括但不限于人和其他灵长类动物，包括非人灵长类动物如黑猩猩和其他猿和猴物种；家畜如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠；包括家养、野生和狩猎鸟类在内的禽类如鸡、火鸡和其他鹑鸡类禽、鸭、鹅等。该术语不表示特定年龄。因此，旨在涵盖成年和新生个体。
“同源性”指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的相同性百分比。当所述序列显示定义分子长度上至少约50%序列相同性，优选至少约75%序列相同性，更优选至少约80%-85%序列相同性，更优选至少约90%序列相同性，和最优选至少约95%-98%序列相同性时，两个核酸或两个多肽序列彼此“基本同源”。如本文所用，基本同源也指显示与特定序列完全相同性的序列。
“相同性”通常分别指两条多核苷酸或多肽序列的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的确切对应性。相同性百分比可通过以下步骤直接比较两个分子之间的序列信息来确定：比对序列，计数两条比对序列之间的确切匹配数目，除以更短序列的长度并将结果乘以100。可使用方便可用的计算机程序来帮助分析，例如Dayhoff，M.O.的Atlas of Protein Sequence and Structure(《蛋白质序列和结构图集》)，(M.O.Dayhoff编.，5增刊3:353-358，National biomedical Research Foundation，华盛顿哥伦比亚特区)中的ALIGN，该程序采用了Smith和Waterman（1981）Advances in Appl.Math.2:482-489的局部同源性算法进行肽分析。确定核苷酸序列相同性的程序可获自Wisconsin Sequence Analysis Package(威斯康星序列分析包)，第八版(得自威斯康星州麦迪逊的基因计算机组（Genetics Computer Group）)，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖Smith和Waterman算法。这些程序可用生产商推荐的和以上威斯康星序列分析包所述默认参数方便地使用。例如，具体核苷酸序列与参比序列的相同性百分比可使用Smith和Waterman同源性算法确定，该算法采用默认评分表和6个核苷酸位置的空位罚分。
本发明内容中建立相同性百分比的另一个方法是使用John F.Collins和Shane S.Sturrok开发，爱丁堡大学版权所有，并由IG公司（IntelliGenetics,Inc.）（加利福尼亚州芒廷维尤）分销的MPSRCH程序包。这套程序包可使用Smith-Waterman算法，其中评分表使用默认参数(例如，空位开放罚12分、空位延伸罚1分、一个空位罚6分)。产生“匹配”值的数据反映了“序列相同性”。计算序列之间相同性或相似性百分比的其它合适程序一般为本领域已知，例如另一比对程序是BLAST，使用默认参数。例如，BLASTN和BLASTP能使用下面默认参数应用:遗传密码=标准;过滤=无;链=二者都（both）;截止=60;预计=10;矩阵=BLOSUM62;说明=50序列;由…分选=高评分（HIGH SCORE）;数据库=非冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的细节不难获得。
或者，测定同源性可以通过多核苷酸在允许同源区域间形成稳定双链体的条件下杂交，然后用单链特异性核酸酶消化并确定已消化片段的大小。基本同源的DNA序列可在Southern杂交实验中鉴定，例如在对特定系统限定的严谨条件下。本领域技术人员能确定适当的杂交条件。
氨基酸取代存在于嵌合VP1蛋白中时优选性质上保守，即取代中第一氨基酸由根据其侧链有相似属性的第二氨基酸代替。特别地，氨基酸通常分成4个家族，认为家族的取代是保守取代。这4个家族是：(1)酸性氨基酸-天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电极性氨基酸-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、色氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸分类为芳族氨基酸。
本文中免疫原性组合物的“治疗有效量”指一定量的免疫原(如嵌合VP1蛋白、VLP或编码抗原的核酸)，其会诱导免疫反应以生成抗体或者治疗或预防诺如病毒传染或疾病。这种反应通常引起对象中发展出对组合物的抗体介导和/或分泌或细胞免疫反应。通常，这种反应包括但不限于一种或多种下列效果;来自任意免疫家族的抗体生成，例如免疫球蛋白A、D、E、G或M;B和T淋巴细胞的增殖;提供免疫细胞的活化、生长和分化信号;辅助T细胞、抑制T细胞、和/或细胞毒性T细胞和/或γδT细胞群的扩增。
出于本发明目的，“有效量”佐剂是增强对共给予抗原或编码抗原的核酸的免疫反应量。
本文使用的“治疗”指以下任一：(i)传染或再传染或疾病的预防,(ii)症状的减少或消除,和(iii)测试病原体的基本或完全消除。可预防（传染前）和治疗（传染后）性影响治疗。
II.具体实施方式
本文所述发明不限于特定示例性分子或可以改变的工艺参数。本文所用的术语仅仅用来描述本发明的具体的方面、特性和实施方式，而不是用于限制。另外，本发明的实践会使用病毒学、微生物学、分子生物学、重组DNA技术和免疫学的传统方法，所有这些都在本领域普通技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（《分子克隆：实验室手册》）(第3版，2000);DNA Cloning:A Practical Approach（《DNA克隆：实践方法》）,第I和II卷(D.Glover编);Oligonucleotide Synthesis（《寡核苷酸合成》）(N.Gait编，1984);A Practical Guide to Molecular Cloning（《分子克隆实践指南》）(1984);和Fundamental Virology（《基础病毒学》）,第4版,2001(B.N.Fields和D.M.Knipe编);Handbook of Experimental Immunology（《实验免疫学手册》）,第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编,布莱克威尔科学出版公司（Blackwell ScientificPublications）);A.L.Lehninger,Biochemistry（《生物化学》）(沃斯出版公司（WorthPublishers,Inc.）,最新版本（current addition）);Methods In Enzymology(《酶学方法》)(S.Colowick和N.Kaplan编，学术出版社公司（Academic Press,Inc.）)。虽然也可采用与本文所述相似或等同的很多方法和材料实施本发明，但本文描述了优选的材料和方法。另外，本文之前和之后引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文。
本发明部分基于以下发现：全部或部分的第一诺如病毒株VP1蛋白P结构域能用全部或相应部分的第二诺如病毒株P结构域取代，并且当表达时，这种嵌合VP1蛋白能自体组装成VLP。也发现了包含任意所需VP1P结构域的VLP，甚至来自重组宿主细胞中没有良好表达的诺如病毒株VP1蛋白的P结构域，并且因此不易于形成VLP。这通过制备包含表达良好诺如病毒株VP1的S结构域的嵌合VP1蛋白来完成，因此能易于形成VLP，和全部或部分的任意其他所需诺如病毒株的VP1蛋白P结构域。因此，本发明提供了嵌合诺如病毒VP1蛋白和诺如病毒VLP，其包含全部或部分的任意所需P结构域。现在，能相对容易和快速地生成嵌合诺如病毒VP1蛋白和诺如病毒VLP，其包含全部或部分的任意P结构域，包含来自新兴诺如病毒株的P结构域。
因此，本发明提供了组合物和方法以快速产生能用于诱导对象中免疫反应的免疫原性组合物，优选能保护对象免受诺如病毒传染和/或诺如病毒疾病。本发明提供了包含嵌合诺如病毒VP1蛋白单体形式或VLP形式的免疫原性组合物。所述嵌合诺如病毒VP1蛋白包含来自第一诺如病毒株的VP1S结构域和来自全部或部分的第二诺如病毒株VP1P结构域。
本发明的诺如病毒VLP能是单价，和能由单一类型的嵌合VP1蛋白构成。这种单价VLP包含来自单个诺如病毒株的多拷贝单一VP1P结构域。如果需要，本发明的诺如病毒VLP能是多价，且能由两种或多种不同的嵌合VP1蛋白构成。优选，所述两种或多种不同的嵌合VP1蛋白包含来自相同诺如病毒株的VP1S结构域，但是来自不同诺如病毒株的VP1P结构域。
另外，本发明的免疫原性组合物还能包含一种或多种佐剂或编码佐剂的核酸，其中免疫原性多肽和/或VLP与佐剂混合或共表达。免疫原性组合物也可以包含诺如病毒抗原以外的其他抗原，例如能用于免疫针对造成腹泻疾病的病原体。
也提供了包含编码嵌合诺如病毒VP1的核酸分子的免疫原性组合物，例如RNA分子或自体复制RNA分子。这种组合物能给予对象，并且所述编码嵌合诺如病毒VP1能在对象中优选以VLP形式生成。
为了进一步理解本发明的其他方面，包含核酸、多肽和/或VLP，和其制备、纯化的方法以及在治疗或预防诺如病毒传染中应用，下面提供更详细的讨论。
A.多肽和VLP
嵌合诺如病毒VP1蛋白包含第一诺如病毒株VP1的S结构域，和包含至少一部分第二诺如病毒株VP1P结构域的P结构域。嵌合诺如病毒VP1蛋白的S结构域和P结构域一般通过接头肽连接，因为其在天然产生的VP1蛋白中。所述接头肽能使嵌合VP1蛋白适当折叠，从而其自体组装以形成VLP。所述接头肽能是任意合适的氨基酸序列，例如来自第一诺如病毒株、第二诺如病毒株或第三诺如病毒株的VP1蛋白的接头肽。所述第一、第二和第三诺如病毒株能是任意所需的诺如病毒株，例如表1所列毒株中的任意一种。例如所述第一诺如病毒株能是雪山株，和所述第二诺如病毒株能是任意其他株，例如所述诺沃克株或所述2006a株。
如果需要，嵌合VP1的S结构域、接头和/或P结构域的氨基酸序列可以与相应的天然产生氨基酸序列差异一个或多个氨基酸替代、增加或删除(例如突变、取代、插入、缺失、截断等)上不同。这种序列改变应该不会防止嵌合VP1蛋白适当折叠和自体结合成VLP。通常，可以接受氨基酸序列在非高度保守的区域上不同于天然产生序列（包含增加或删除一个或多个氨基酸）。例如图8A-8B所示，数个诺如病毒VP1蛋白的氨基酸序列比对揭示了S结构域高度保守，而P结构域且特别是P2亚结构域更可变。因此，如果需要，氨基酸序列的变化能引入氨基末端区域，羧基末端区域和P结构域。一些氨基酸序列变化也能引入S结构域和/或P1亚结构域，优选图8A中未用星号标记的非保守位置。
一些诺如病毒株的VP1蛋白难于通过在宿主细胞如酵母中的重组表达高产率生成。然而，当嵌合诺如病毒VP1蛋白包含在所需宿主细胞如酵母细胞中高表达(例如表达能是>40mg/升酵母细胞的雪山株)株的S结构域时，即使所述P结构域来自表达不好的毒株，所述嵌合蛋白能在所述宿主细胞中高产率生成。例如诺沃克P结构域的分泌可溶表达能通过生成所述有雪山S结构域的嵌合构建物而增加5倍以上。因此，本发明的嵌合VP1蛋白能用于生成包含来自宿主细胞中表达不好的毒株的VP1P结构域的VLP，并且因此不易于形成VLP。因此，通常优选S结构域来自所需宿主细胞如酵母细胞中表达良好的毒株的VP1蛋白。优选所述高表达子诺如病毒株是在宿主细胞优选酵母中重组生成VP1蛋白的毒株，数量为至少约5mg/升细胞、至少约10mg/升细胞、至少约15mg/升细胞、至少约20mg/升细胞、至少约25mg/升细胞、至少约30mg/升细胞、至少约35mg/升细胞、至少约40mg/升细胞。
所述嵌合诺如病毒VP1蛋白能有以下式I所述的结构：
A—S—L—P—B  (I)
其中：
A和B各自缺失，或是任意所需氨基酸序列；
S是第一诺如病毒株VP1的S结构域；
L是接头肽或不存在；和
P是诺如病毒VP1P结构域，其中至少一部分P来自第二诺如病毒株的P结构域。
所述接头肽(L)能是使嵌合VP1蛋白适当折叠和自体组装形成VLP的任意氨基酸序列。合适的接头肽包含来自第一诺如病毒株、第二诺如病毒株或第三诺如病毒株VP1蛋白的接头肽。或者，所述接头肽(L)能是使所述嵌合蛋白适当折叠和自体组装成VLP的短氨基酸序列，如20个或更少氨基酸(如20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1氨基酸)，优选约9个氨基酸。合适的接头肽(L)示例包含多聚甘氨酸接头(Glyn，其中n=2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大(SEQ ID NO:5))，和(GGGS)n其中n=1、2、3或4(SEQ ID NO:6)，和高度带电接头，如(SRSK)n其中n=1、2、3或4(SEQ ID NO:7)。优选，L是来自第一诺如病毒株、第二诺如病毒株或第三诺如病毒株VP1蛋白的接头肽。
A和B存在时独立地是任意所需氨基酸序列，例如具有约1-500氨基酸、约1-250氨基酸、约1-100氨基酸、约1-50氨基酸、约1-40氨基酸、约1-30氨基酸、约1-20氨基酸、约1-10氨基酸或约1-5氨基酸的序列。例如A和B能是加入嵌合蛋白的一个或多个氨基酸，用于促进克隆或是作为克隆的结果，或促进蛋白纯化例如表位标签或组氨酸标签(Hisn，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10(SEQ ID NO:8))。表位标签可以由设计成提高蛋白免疫原性的强T细胞表位或经修饰表位组成。作为免疫调节剂策略的一部分，这些其他残基会包含经修饰TLR激动剂。如果需要，A和/或B能包含免疫原性片段，包含例如热激蛋白或片段如公开于美国公开号20060264609中的那些，或病毒和细菌抗原如公开于美国专利号7,527,801中的那些。或者，A和/或B能包含全长蛋白，例如在诺如病毒VP1融合蛋白上展示（display）的重组蛋白，或用于展示（display）诺如病毒VP1或其部分的重组蛋白。在一些实施方式中，A和B都不存在。
如本文所述，VP1的P结构域包含P1亚结构域和P2亚结构域。因此，在本文公开的式中，P能描述成P1—P2，其中P1是P1亚结构域和P2是P2亚结构域。
在P结构域的一级结构中，所述P2亚结构域氨基酸插入到P1亚结构域氨基酸的序列中，并且所述一级结构有式P1-1—P2—P1-2，其中P1-1是P1亚结构域序列的氨基末端部分，P1-2是P1亚结构域序列的剩余部分，并且P2是P2亚结构域序列。
在一些示例性实施方式中，所述嵌合诺如病毒VP1蛋白能具有式I，其中S来自第一诺如病毒株，和P来自第二诺如病毒株。在这种实施方式中，L能是任意合适的接头，例如来自第一诺如病毒株或第二诺如病毒株的天然接头，或不存在。
如本文所述，所述嵌合诺如病毒VP1蛋白能包含P结构域，其中一部分P结构域来自与S结构域相同的毒株，和一部分P结构域来自不同毒株。来自不同毒株的部分能是P1结构域或其部分，P2结构域或其部分，和P1结构域和P2结构域部分的任意组合。优选来自不同毒株的部分是P2结构域或其部分。例如，在一些实施方式中，嵌合诺如病毒VP1蛋白能有以下式II或式III所述的结构。
A—S—L—P1—P2—B  (II)
A—S—P1—P2—B     (III)
在式II和III中，变量A、S、L和B描述于式I，P1是VP1的P1结构域和P2是VP1的P2结构域，并且P1和P2中至少一个来自与提供S的毒株不同的诺如病毒株。在一些实施方式中，S和P1来自第一诺如病毒株，和P2来自第二诺如病毒株。在另一些实施方式中，S和P2来自第一诺如病毒株，和P1来自第二诺如病毒株。在这种实施方式中，接头L若存在能是任意合适的接头，例如来自第一诺如病毒株或第二诺如病毒株的接头。在一些实施方式中，嵌合诺如病毒VP1蛋白具有式II，其中S、L和P1来自第一诺如病毒株和P2来自第二诺如病毒株。式II和III所涵盖示例性实施方式的描述解释包含P结构域的嵌合诺如病毒VP1蛋白，其中部分P结构域来自与S结构域相同的毒株，和部分P结构域来自不同毒株。
在一些实施方式中，所述嵌合诺如病毒VP1蛋白有式IV和XVII中任意一个所述的结构:SNV—L—PSMV(IV),SSMV—L—PNV(V),SNV—L—PDSV(VI),SSMV—L—PDSV(VII),SNV—L—PGI(VIII),SNV—L—PGII(IX),SNV—L—PGIII(X),SNV—L—PGIV(XI),SNV—L—PGV(XII),SSMV—L—PGI(XIII),SNV—L—PGII(XIV),SSMV—L—PGIII(XV),SSMV—L—PGIV(XVI),SSMV—L—PGV(XVII),其中P表示P结构域，包含P1和P2亚结构域，其中下标指示S结构域或P结构域来自下列毒株:NV，诺沃克株;SMV,雪山株;DSV,沙漠风暴株;以及GI、GII、GIII、GIV和GV是分别来自基因群GI、GII、GIII、GIV和GV的任意诺如病毒。
在特定实施方式中，所述嵌合诺如病毒VP1蛋白包含来自雪山株VP1的S结构域，来自雪山株VP1的接头肽，和包含另一个诺如病毒株VP1的P结构域至少一部分的P结构域。在更特定的实施方式中，所述P结构域或其部分来自诺沃克株、2006a株或新奥尔良株的VP1。
在一些实施方式中，所述嵌合诺如病毒VP1蛋白有以下式XVIII所述的一级结构：
A—S第一—L—P1-1(第一)—P2(第二)—P1-2(第一)—B  (XVIII),
在式XVIII中，下标第一和第二分别指示所述结构域来自第一毒株或第二毒株。在某些实施方式中，所述嵌合诺如病毒VP1蛋白有以下式XIX–XLVI中任意一个所述的一级结构：A—SNV—L—P1-1(NV)—P2 (SMV)—P1-2(NV)—B(XIX),A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(NV)—P1-2(SMV)—B  (XX),A—SNV—L—P1-1(NV)—P2(DSV)—P1-2(NV)—B  (XXI),A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(DSV)—P1-2(SMV)—B                               (XXII),A—SNV—L—P1-1(NV)—P2(GI)—P1-2(NV)—B                                  (XXIII),A—SNV—L—P1-1(NV)—P2(GII)—P1-2(NV)—B                                  (XXIV),A—SNV—L—P1-1(NV)—P2(GIII)—P1-2(NV)—B                                  (XXV),A—SNV—L—P1-1(NV)—P2(GIV)—P1-2(NV)—B                                  (XXVI),A—SNV—L—P1-1(NV)—P2(GV)—P1-2(NV)—B                                  (XXVII),A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(GI)—P1-2(SMV)—B                              (XXVIII),A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(GII)—P1-2(SMV)—B                               (XXIX),A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(GIII)—P1-2(SMV)—B                               (XXX),A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(GIV)—P1-2(SMV)—B                               (XXXI),A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(GV)—P1-2(SMV)—B                               (XXXII),A—SNV—L—P1-1(NV)—P2(SMV)—B  (XXXIII),A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(NV)—B(XXXIV),               A—SNV—L—P1-1(NV)—P2(DSV)—B                    (XXXV),A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(DSV)—B  (XXXVI),A—SNV—L—P1-1(NV)—P2(GI)—B(XXXVII),              A—SNV—L—P1-1(NV)—P2(GII)—B                 (XXXVIII),A—SNV—L—P1-1(NV)—P2(GIII)—B  (XXXIX),A—SNV—L—P1-1(NV)—P2(GIV)—B  (XL),A—SNV—L—P1-1(NV)—P2(GV)—B  (XLI),A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(GI)—B  (XLII),A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(GII)—B  (XLIII),A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(GIII)—B(XLIV),              A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(GIV)—B                 (XLV),A—SSMV—L—P1-1(SMV)—P2(GV)—B(XLVI)，其中下标指示S结构域或P亚结构域来自下列毒株:NV,诺沃克株;SMV,雪山株;DSV,沙漠风暴株;以及GI、GII、GIII、GIV和GV是分别来自基因群GI、GII、GIII、GIV和GV的任意诺如病毒。
根据本发明描述，很多不同的嵌合VP1蛋白能使用标准过程通过重组方法生成。来自不同诺如病毒株的VP1蛋白的氨基酸序列和其编码多核苷酸序列能获自GenBank数据库(ncbi.nlm.nih.gov)、国家生物技术信息中心（National Center forBiotechnology Information）的分类学数据库（Taxonomy Database）(ncbi.nlm.nih.gov)或杯状病毒的pathosystems资源整合中心数据库（PathoSystems Resource IntegrationCenter Database）(patric.vbi.vt.edu)。
当本发明的嵌合VP1蛋白通过在宿主细胞例如酵母细胞中表达生成时，其能自体组装成VLP。这对于包含宿主细胞中良好表达诺如病毒株VP1的S结构域（如雪山株的S结构域）的嵌合VP1蛋白尤其如此。因此，本发明还提供包含嵌合VP1的VLP。所述VLP能是单价或二价或多价。单价VLP包含嵌合VP1蛋白和仅一个P结构域。在一些实施方式中，单价VLP能包含嵌合VP1和天然产生的VP1，各包含相同的P结构域。优选的单价VLP由多拷贝(如180个拷贝)的单个嵌合VP1蛋白构成。因此，在某些实施方式中，例如，本发明的单价VLP包含180拷贝的式I–XLVI中任意一个的单个嵌合VP1。
二价和多价VLP包含嵌合VP1蛋白和至少2种不同的P结构域。例如，在一些实施方式中，二价VLP能包含含有第一P结构域的嵌合VP1，和包含第二P结构域的天然产生VP1。在这种实施方式中，优选嵌合VP1和天然产生VP1中的S结构域相同。在其他实施方式中，所述二价或多价VLP包含两种或更多种含有来自不同毒株P结构域的不同嵌合VP1蛋白。优选所述两种或更多种嵌合VP1蛋白包含相同S结构域。
例如，在某些其他实施方式中，本发明的二价或多价VLP包含两种或更多种选自例如式I–XLVI所述嵌合VP1蛋白的嵌合VP1蛋白。
若需要，嵌合VP1 S和P结构域(包含P亚结构域)中一个或两个的氨基酸序列能改变(通过插入、删除、突变、取代)以包含使结构域或亚结构域的氨基酸序列不同于相应天然产生氨基酸序列的一个或多个氨基酸插入、删除、突变、取代，例如在结构域或亚结构域的氨基酸序列长度上多至约20%、多至约1%、多至约2%、多至约3%、多至约4%、多至约5%、多至约10%、多至约15%或多至约20%。
如图8A-8E所示，比对天然产生的VP1氨基酸序列显示N末端区(aa1-49),S结构域(aa50-225)和P1-1亚结构域(aa226-278)氨基酸序列比P2亚结构域(aa279-405)、P1-2结构域(aa406-520)和C末端区氨基酸序列更加保守（星号指示保守的氨基酸）(Hansman等(2006)J.General Virology87:909-919)。因为保守氨基酸残基通常对适当折叠或功能重要，优选存在的任意氨基酸序列改变没有引入保守位置。例如，S结构域中的保守氨基酸可以对VLP的适当折叠和形成重要。因此，在本发明的嵌合VP1蛋白中，优选没有删除或取代保守的氨基酸残基。
因此，在一些实施方式中，本发明嵌合VP1蛋白的S结构域能与天然发生的S结构域有至少约70-100%或约80-100%氨基酸序列相同性，包含这个范围内的任意百分比相同性，例如至少约70、至少约71、至少约72、至少约73、至少约74、至少约75、至少约76、至少约77、至少约78、至少约79、至少约80、至少约81、至少约82、至少约83、至少约84、至少约85、至少约86、至少约87、至少约88、至少约89、至少约90、至少约91、至少约92、至少约93、至少约94、至少约95、至少约96、至少约97、至少约98、至少约99或100%氨基酸序列相同性。或者或另外，本发明嵌合VP1蛋白的P1-1亚结构域能相对于天然产生的P1-1亚结构域有至少约70-100%或约80-100%氨基酸序列相同性，包含这个范围内的任意百分比相同性，例如至少约70、至少约71、至少约72、至少约73、至少约74、至少约75、至少约76、至少约77、至少约78、至少约79、至少约80、至少约81、至少约82、至少约83、至少约84、至少约85、至少约86、至少约87、至少约88、至少约89、至少约90、至少约91、至少约92、至少约93、至少约94、至少约95、至少约96、至少约97、至少约98、至少约99或100%氨基酸序列相同性。或者或另外，本发明嵌合VP1蛋白的P2亚结构域能与天然产生的P2亚结构域有至少约70-100%或约80-100%氨基酸序列相同性，包含这个范围内的任意百分比相同性，例如至少约70、至少约71、至少约72、至少约73、至少约74、至少约75、至少约76、至少约77、至少约78、至少约79、至少约80、至少约81、至少约82、至少约83、至少约84、至少约85、至少约86、至少约87、至少约88、至少约89、至少约90、至少约91、至少约92、至少约93、至少约94、至少约95、至少约96、至少约97、至少约98、至少约99或100%氨基酸序列相同性。或者或另外，本发明嵌合VP1蛋白的P1-2亚结构域能与天然产生的P1-2亚结构域有至少约70-100%或约80-100%氨基酸序列相同性，包含这个范围内的任意百分比相同性，例如至少约70、至少约71、至少约72、至少约73、至少约74、至少约75、至少约76、至少约77、至少约78、至少约79、至少约80、至少约81、至少约82、至少约83、至少约84、至少约85、至少约86、至少约87、至少约88、至少约89、至少约90、至少约91、至少约92、至少约93、至少约94、至少约95、至少约96、至少约97、至少约98、至少约99或100%氨基酸序列相同性。
本发明VP1蛋白的S结构域相对于天然产生的S结构域为全长或接近全长。由于在保持有利VLP形成的条件下能形成VLP，可以接受N或C末端或两者的截短和内部截短。因此，所述S结构域可以包含参照或天然S结构域的全长序列、片段、截短的和部分序列，以及类似物和前体形式。在一些实施方式中，本发明VP1蛋白的S结构域在其N末端截断5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。或者或另外，本发明VP1蛋白的S结构域在其C末端截断5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。或者或另外，本发明VP1蛋白的S结构域能包含长度为5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基的内部删除。
本发明VP1蛋白的P1-1亚结构域相对于天然产生的P1-1亚结构域为全长或接近全长，有N或C末端或两者的序列截断和/或内部删除。因此，所述P1-1亚结构域可以包含天然产生P1-1结构域的全长序列、片段、截短的和部分序列，以及类似物和前体形式。在一些实施方式中，本发明VP1蛋白的P1-1亚结构域在其N末端截断1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。或者或另外，本发明VP1蛋白的P1-1亚结构域在其C末端截断1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。或者或另外，本发明VP1蛋白的P1-1亚结构域能包含长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的内部删除。
本发明VP1蛋白的P2亚结构域相对于天然产生的P2亚结构域为全长或接近全长，有N或C末端或两者的序列截断和/或内部删除。因此，所述P2亚结构域可以包含天然产生P2结构域的全长序列、片段、截短的和部分序列，以及类似物和前体形式。在一些实施方式中，本发明VP1蛋白的P2亚结构域在其N末端截断1-约26个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、16、20、24或26个氨基酸残基。或者或另外，本发明VP1蛋白的P2亚结构域在其C末端截断1-约26个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、16、20、24或26个氨基酸残基。或者或另外，本发明VP1蛋白的P2亚结构域包含1-约26个氨基酸的内部删除，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、16、20、24或26个氨基酸残基。
本发明VP1蛋白的P1-2亚结构域相对于天然或参照P1-2亚结构域为全长或接近全长，有N或C末端或两者的序列截断和/或内部删除。因此，所述P1-2亚结构域可以包含天然产生P1-2结构域的全长序列、片段、截短的和部分序列，以及类似物和前体形式。在一些实施方式中，本发明VP1蛋白的P1-2亚结构域在其N末端截断1-约26个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、16、20、24或26个氨基酸残基。或者或另外，本发明VP1蛋白的P1-2亚结构域在其C末端截断1-约26个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、16、20、24或26个氨基酸残基。或者或另外，本发明VP1蛋白的P1-2亚结构域包含1-约26个氨基酸的内部删除，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、16、20、24或26个氨基酸残基。
在某些实施方式中，本发明嵌合VP1蛋白的P结构域(包含P1-1、P2和P1-2亚结构域)能包含其他多肽部分的氨基酸序列插入或取代，例如嵌合VP1上展示的多肽。例如，所述P结构域能与另一多肽或另一多肽部分融合。例如式1B能是在嵌合VP1上展示的另一多肽的氨基酸序列。在这种情况下，另一种多肽能在包含嵌合VP1蛋白的VLP表面上展示。
本发明的嵌合VP1蛋白能通过在合适的重组宿主细胞如酵母细胞中使用合适方法（包含本文所述那些）表达生成。
B.核酸
本发明还提供了编码本文所述嵌合诺如病毒VP1蛋白的重组核酸。这些核酸包含编码第一诺如病毒株VP1的S结构域的第一核苷酸序列，编码包含至少一部分第二诺如病毒株P结构域的P结构域的第二核苷酸序列，和可选分别编码接头肽和氨基酸A及B的第三、第四和第五核苷酸序列。操作性连接核酸序列从而所述核酸能转录和/或翻译以生成能自体组装成VLP的嵌合VP1蛋白。能使用编码来自所需诺如病毒株VP1的S结构域和P结构域的任意合适核酸序列。例如，能使用的核酸具有与所需诺如病毒株或其密码子优化变体的基因组中ORF2内对应序列相同的核苷酸序列，所述密码子优化变体就所需宿主细胞如酵母细胞中重组表达而优化。
来自雪山株的代表性诺如病毒ORF2序列已知，并且示于图4A。很多其他诺如病毒株ORF2的核苷酸序列为本领域已知，例如诺沃克病毒的ORF2序列，GenBank登录号M87661,夏威夷病毒;GenBank登录号U07611,以及在下面专利公开中公开的序列：WO05/030806、WO00/79280、JP2002020399、US2003129588、美国专利号6,572,862、WO94/05700和WO05/032457。也参见Green等(2000)J.Infect.Dis.181(增刊2):S322-330;Wang等(1994)J.Virol.68:5982-5990;Chen等(2004)J.Virol.78:6469-6479;Chakravarty等(2005)J.Virol.79:554-568;和Fankhauser等(1998)J.Infect.Dis.178:1571-1578;用于不同诺如病毒株的序列比较。关于诺如病毒核苷酸序列的其他信息能获自GenBank数据库(ncbi.nlm.nih.gov)、国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）的分类学数据库（Taxonomy Database）(ncbi.nlm.nih.gov)或杯状病毒的pathosystems资源整合中心数据库（PathoSystemsResource Integration Center Database）(patric.vbi.vt.edu)。
在一些方面，重组核酸编码本文所述的嵌合VP1蛋白，例如式I所述的嵌合VP1蛋白。例如，所述重组核酸能包含以下式LIV所述的编码序列。
A’—S’—L’—P’—B’  (XLVII)
其中：
A’和B’各自缺失或是编码任意所需氨基酸序列的核苷酸序列；
S’是编码第一诺如病毒株VP1的S结构域的核苷酸序列；
L’不存在或是编码接头肽的核苷酸序列和；
P是编码诺如病毒VP1P结构域的核苷酸序列，其中至少一部分P来自第二诺如病毒株的P结构域。
由L’编码的接头肽，和由A’、S’、P’和B’编码的氨基酸序列如本文所述分别用于L、A、S、P和B。
在特定实施方式中，所述重组核酸包含编码式I–XLVI中任意一个所述嵌合VP1蛋白的编码序列。
在其他特定实施方式中，所述重组核酸包含编码有图7所示任意一级结构的嵌合VP1蛋白的编码序列。
编码包含雪山株S序列和诺沃克株P序列的嵌合VP1蛋白的代表性重组核酸;或者雪山株S序列和GII.42006a.OPTI.P株P序列分别示于图5和6。在雪山序列情况下，所述S结构域包含残基1-216和所述接头包含残基217–226。对诺沃克而言，P序列包含残基231-530。对2006a序列而言，P序列包含残基227-541。其他代表性诺如病毒序列是诺沃克病毒，GenBank登录号M87661,雪山病毒,GenBank登录号U70059;雪山病毒,GenBank登录号AY134748,夏威夷病毒;GenBank登录号U07611,以及在下面专利公开中公开的序列:WO05/030806、WO00/79280、JP2002020399、US2003129588、美国专利号6,572,862、WO94/05700和WO05/032457。也参见Green等(2000)J.Infect.Dis.181(增刊2):S322-330;Wang等(1994)J.Virol.68:5982-5990;Chen等(2004)J.Virol.78:6469-6479;Chakravarty等(2005)J.Virol.79:554-568;和Fankhauser等(1998)J.Infect.Dis.178:1571-1578;用于不同诺如病毒株的序列比较。
编码嵌合VP1蛋白的核酸能是RNA或DNA，能使用任意合适方法(例如通过化学合成，使用重组DNA技术)构建，并能采取多种形式(如单链、双链、载体等)。生成重组构建物的很多合适方法是本领域熟知和传统方法。例如，重组核酸能从两种或更多种寡核苷酸中生成，所述寡核苷酸包含编码嵌合VP1蛋白的部分，或使用标准分子生物学技术通过连接寡核苷酸以形成全长嵌合VP1蛋白的编码序列。参见例如，美国专利号6,632,601和美国专利号6,630,298。优选核酸以基本纯化形式制备(即基本上不含其他宿主细胞或非宿主细胞核酸)。
编码感兴趣VP1蛋白的多核苷酸能从例如传染个体的粪便或呕吐样品中所存在病毒RNA的基因组库中分离。或者，诺如病毒核酸能从传染的人或其他哺乳动物或从传染个体收集的粪便或呕吐样品中分离，如描述于例如Estes等美国专利号6,942,865;Guntapong等.(2004)Jpn J.Infect.Dis.57:276-278;Harrington等(2004)J.Virol.78:3035-3045;Fankhauser等(1998)J.Infect.Dis.178:1571-1578;和Dolin等(1971)J.Infect.Dis.123:307-312。猪病毒能在包含胆酸的肠液存在下生长于LLC-PK细胞中(Chang等.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:8733-8738)。扩增方法如PCR能用于从诺如病毒基因组RNA或其编码cDNA中扩增多核苷酸。或者，多核苷酸能化学合成。能用对所需特定氨基酸序列合适的密码子设计核苷酸序列。优选地，合成构建物会包含在生成嵌合VP1蛋白的预期宿主细胞中就表达优化的密码子。感兴趣多核苷酸的完整序列能从标准方法制备的重叠寡核苷酸中组装并且装配成完整编码序列。参见例如Edge(1981)Nature292:756;Nambair等(1984)Science223:1299;Jay等(1984)J.Biol.Chem.259:6311;Stemmer等(1995)Gene164:49-53。多核苷酸能是RNA或者单链或双链DNA。优选地，分离多核苷酸，没有其他成分如蛋白和脂质。
或者，特定核苷酸序列能从有所需序列的载体中获得，或者使用本领域已知的各种寡核苷酸合成技术全部或部分合成，例如合适时的定点诱变和聚合酶链反应(PCR)技术。参见，例如Sambrook，同上。特别地，一种获得编码所需序列的核苷酸序列的方法是通过退火重叠合成寡核苷酸的互补组，然后用合适的DNA连接酶连接并且通过PCR扩增连接的核苷酸序列。参见例如，Jayaraman等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：4084-4088。另外，能使用寡核苷酸定向合成(Jones等(1986)Nature54:75-82),已存在核苷酸区的寡核苷酸定向突变(Riechmann等(1988)Nature332:323-327和Verhoeyen等(1988)Science239:1534-1536),和使用T4DNA聚合酶的缺口寡核苷酸酶补平（filling-in）(Queen等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033)。
编码嵌合VP1蛋白的重组构建物能在合适载体例如表达载体中使用传统方法构建。所述重组构建物例如表达载体包含编码嵌合诺如病毒VP1蛋白的核酸序列。重组构建物能是DNA、RNA的形式，并且能是单链或双链。例如，所述构建物能是质粒形式。所需宿主细胞中用于重组蛋白表达的许多合适载体为本领域熟知且常规。合适的载体可含许多组分，包括但不限于以下一种或多种：复制起点；可选的标记基因；一种或多种表达控制元件如转录控制元件（如启动子、增强子、终止子），和/或一种或多种翻译信号；和选定宿主细胞（如具有哺乳动物起源或来自异源哺乳动物或非哺乳动物物种）中用于靶向分泌途径的信号序列或前导序列。例如，为了在昆虫细胞中表达，使用合适的杆状病毒表达载体如pFastBac（英杰公司（Invitrogen））生产重组杆状病毒颗粒。所述杆状病毒颗粒经扩增，用于传染昆虫细胞以表达重组蛋白。为了在哺乳动物细胞中表达，使用会驱动所述构建体在所需哺乳动物宿主细胞（如中华仓鼠卵巢细胞）中表达的载体。类似地，对于酵母中的表达，使用会驱动在所需酵母宿主细胞中表达的载体(如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），白色念珠菌（Candida albicans），麦芽糖假丝酵母（Candida maltosa），多形汉森酵母（Hansenualpolymorpha），脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis），乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis），季也蒙毕赤酵母（Pichia guillerimondii），巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）)。
病毒载体能用于在真核细胞中生成本发明的VLP，例如获自痘病毒家族的那些，包含痘苗病毒和禽痘病毒。另外，基于疫苗的传染/转染系统还在本发明中获得应用，如描述于Tomei等(1993)J.Virol.67:4017-4026和Selby等(1993)J.Gen.Virol.74:1103-1113。在这个系统中，首先体外使用编码噬菌体T7RNA聚合酶的疫苗病毒重组物传染细胞。这个聚合酶显示了精细（exquisite）特异性，因为其仅转录载有T7启动子的模板。传染后，用由T7启动子驱动的感兴趣DNA转染细胞。来自疫苗病毒重组体的胞质中表达聚合酶将转染的DNA转录成RNA，然后由宿主翻译机制翻译成蛋白。或者，T7能如“起源”系统中作为纯化蛋白或酶加入(Studier和Moffatt(1986)J.Mol.Biol.189:113-130)。所述方法提供了高水平、短暂、胞质生成大量RNA和其翻译产物。
重组核酸能是载体表达系统形式或其组分，例如自体复制核酸分子(如RNA)，α病毒颗粒，α病毒复制子等。
若需要，所述载体能包含可检测的标记。例如，所述可检测的标记能是赋予一种或多种抗生素抗性的多肽。关于本发明载体的其他信息在下面C部分提供。
C.生成病毒样颗粒(VLP)和相同的宿主细胞
本发明还提供了包含编码嵌合诺如病毒VP1蛋白的核酸的重组宿主细胞，和制备嵌合诺如病毒VP1蛋白和包含病毒VP1蛋白的VLP的方法。所述嵌合VP1蛋白能使用任意合适方法生成。通常，其通过在合适的重组宿主细胞中表达编码嵌合VP1蛋白的重组构建物来生成，所述宿主细胞例如昆虫细胞（如埃及伊蚊（Aedes aegypti）、苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica,）、家蚕蛾（Bombyx mori）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni））、哺乳动物细胞（如人、非人灵长类、马、牛、羊、狗、猫和啮齿类（如仓鼠））、禽类细胞（如鸡、鸭、鹅）、细菌（如大肠杆菌（E.coli）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）和链球菌（Streptococcus）属）、酵母细胞（如酿酒酵母、白色念珠菌、麦芽糖假丝酵母、多形汉森酵母、脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、季也蒙毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母和解脂耶氏酵母）、四膜虫细胞（如嗜热四膜虫）或其组合。本领域熟知许多合适的昆虫细胞和哺乳动物细胞。合适的昆虫细胞包括例如，Sf9细胞、Sf21细胞、Tn5细胞、Schneider S2细胞和High Five细胞（源自亲本粉纹夜蛾BTI-TN-5B1-4细胞系的克隆分离物（英杰公司(Invitrogen)））。合适的哺乳动物细胞包括例如，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾细胞（HEK293细胞，通常由剪切的腺病毒5型DNA转化）、NIH-3T3细胞、293-T细胞、Vero细胞、HeLa细胞、PERC.6细胞（ECACC保藏号96022940）、Hep G2细胞、MRC-5（ATCC CCL-171）、WI-38（ATCC CCL-75）、胎猕猴肺细胞细胞（ATCC CL-160）、马-达二氏牛肾（“MDBK”）细胞、马-达二氏犬肾(“MDCK”)细胞（如MDCK(NBL2)、ATCC CCL34；或MDCK33016、DSM ACC2219）、幼仓鼠肾(BHK)细胞如BHK21-F、HKCC细胞等。合适的禽类细胞包括例如，鸡胚胎干细胞（如细胞）、鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎生殖细胞、鸭细胞（例如Vaccine27:4975-4982(2009)和WO2005/042728中描述的AGE1.CR和AGE1.CR.pIX细胞系（ProBioGen））、EB66细胞等。
合适的昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统为本领域技术人员已知，描述于例如Summers和Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法以药盒形式购自加利福尼亚州圣迭戈的英杰公司等。禽类细胞表达系统也为本领域技术人员已知，描述于例如美国专利号5,340,740;5,656,479;5,830,510;6,114,168;和6,500,668;欧洲专利号EP0787180B;欧洲专利公开号EP1500699;WO03/043415;和WO03/076601。相似地，酵母、细菌和哺乳动物细胞表达系统也为本领域已知，描述于例如Yeast Genetic Engineering（《酵母遗传工程》）(Barr等编，1989)伦敦的巴特沃思公司（Butterworths）。
在一些方面，生成嵌合诺如病毒VP1蛋白的方法包含在适于表达核酸的条件下培养用编码嵌合VP1蛋白的重组核酸转化的宿主细胞，从而生成诺如病毒VP1蛋白。嵌合VP1蛋白能自体组装以形成VLP，并且优选在适合VLP形成的条件下维持所述宿主细胞。熟知适合VLP形成的条件并且易由本领域普通技术人员测定。参见例如描述在酵母细胞(酿酒酵母)和昆虫细胞(SF9)中生成病毒颗粒的美国专利号7,527,801，和描述在HEK293T细胞中生成VLP的Taube,S.等(2005)Archives ofVirology150:1425-1431。若需要，所述方法还能包含从培养基或细胞中分离或纯化所述嵌合诺如病毒VP1蛋白、包含嵌合VP1蛋白的VLP、或其组合的步骤。在一些优选的实施方式中，用于生成嵌合VP1蛋白和/或包含嵌合VP1蛋白的VLP的所述宿主细胞是酵母细胞、昆虫细胞或其组合。
本发明也提供了生成多价VLP的方法。多价VLP能通过维持包含编码两种不同嵌合VLP的重组核酸的宿主细胞来制备。例如这能使用双顺反子病毒载体例如用于酵母中表达的pCDC.7来完成。或者，能制备两种或更多种单价VLP，可选加以纯化，并且然后混合以生成多价VLP的制剂。
所述诺如病毒嵌合VP1蛋白和VLP也能在给予哺乳动物重组核酸后通过哺乳动物细胞表达编码诺如病毒嵌合VP1蛋白的重组核酸分子来生成，例如以载体表达系统的形式或作为载体表达系统的组分。
D.分离和纯化VLP
本发明还提供了从培养基、宿主细胞或其组合中分离或纯化诺如病毒VLP的方法。优选所述VLP直接从所述宿主细胞培养基即条件培养基中分离或纯化。然而，若需要，所述宿主细胞能恢复，例如通过离心，宿主细胞匀浆物或裂解物能使用任意合适方法形成，并且能分离VLP。裂解细胞但保持VLP基本完整的合适化学、物理或机械方法为本领域已知，并且描述于如Protein Purification Applications:APractical Approach（《蛋白纯化应用：实用方法》）,(E.L.V.Harris和S.Angal编1990)。
VLP能使用任意合适方法从培养基或宿主细胞（如细胞裂解物或匀浆物）中分离。能使用维持VLP完整性的合适方法例如密度梯度离心如蔗糖梯度、PEG沉淀、沉淀（pelleting）等(见如Kirnbauer等.(1993)J.Virol.67:6929-6936)以及标准纯化技术，包含例如离子交换和凝胶过滤色谱。蔗糖垫或蔗糖梯度离心是从VP1单体或低聚物和从其他细胞组分中分离VLP的便捷方法。这些方法能单独、连续使用，并且能整合到更大纯化方案中。例如，若需要，在蔗糖垫或蔗糖梯度上纯化的VLP随后还能进一步纯化，例如使用离子交换色谱、尺寸排阻色谱法或任意其他合适的方法。在特定示例中，诺如病毒样颗粒(VLP)能从表达诺如病毒VP1蛋白的酵母细胞培养基中纯化。低速离心(15,000xg)能在培养基上进行以除去多余细胞或细胞碎片。这个步骤后，能进行通过40%蔗糖垫的高速离心(100,000xg)以分离病毒样颗粒与游离蛋白和其他材料。包含VLP的团块（pellet）能在缓冲液(50mM Tris pH7.5,100mMNaCl)中重新悬浮并且加载入离子交换柱。VLP能使用盐梯度从柱中洗脱。最终，包含VLP的洗脱部分能加以浓缩和在低盐缓冲液(20mM Tris pH7.5,100mM NaCl)中进行缓冲液交换，并且4°C保存直到需要时。
E.免疫原性组合物
如前面所述，本发明也提供了包含一种或多种嵌合VP1蛋白的免疫原性组合物，优选VLP的形式。两种或更多种不同的嵌合VP1蛋白、单价VLP或多价VLP可以混合在一起生成包含两种或更多种不同VP1P结构域的多价免疫原性组合物。
所述免疫原性组合物可以包含嵌合VP1蛋白、VLP和核酸的混合物，进而可使用相同或不同的载剂递送。可以单独或组合给予抗原，例如预防性(即预防传染)或治疗性(治疗传染)免疫原性组合物。多于一次给予所述免疫原性组合物(例如“初次（prime）”给予然后一种或多种“加强（boost）”)以实现所需效果。以一种或多种初次（priming）和一种或多种加强（boosting）步骤给予相同的组合物。或者，不同的组合物能用于初次和加强免疫（priming and boosting）。
若需要，所述免疫原性组合物还可以包含一种或多种来自诺如病毒或另一病原体的其他抗原。例如，免疫原性组合物的组合能包含含有嵌合VP1蛋白的诺如病毒VLP和一种或多种来自另一病原体例如细菌、病毒或真菌病原体的抗原。例如，本发明的免疫原性组合物能包含含有本文所述嵌合VP1蛋白的诺如病毒VLP，一种或多种轮状病毒抗原例如活减毒轮状病毒(如ROTARIX(轮状病毒疫苗、活、口服;葛兰素史克公司（GlaxoSmithKline）)),一种或多种活重配轮状病毒(如ROTATEQ(轮状病毒疫苗、活、口服、五价;默克公司（Merck）),ROTASHIELD(轮状病毒疫苗、活、口服、四价;WL公司（Wyeth-Lederle）)),非人轮状病毒(如羔羊(兰州（Lanzhou）)、牛、猕猴),重配轮状病毒(如人-牛、人-羊、人-猕猴),灭活轮状病毒(如热灭活),轮状病毒亚基(如VP2、VP4、VP6、VP7或其任意组合),轮状病毒亚基VLP或疫苗。
另一方面，免疫原性组合物包含编码诺如病毒嵌合VP1蛋白的重组核酸分子。若需要，这种免疫原性组合物能包含合适的核酸递送系统，例如脂质体、脂复合体、乳液(纳米乳液、微乳液)、颗粒(纳米颗粒、微粒)、载体、如病毒颗粒、复制子等。
所述免疫原性组合物通常包含一种或多种单独或组合的“药学上可接受赋形剂或载剂”例如水、盐水、甘油、乙醇等。除了上述组分外，免疫原性组合物通常包含一种或多种“药学上可接受的载体”。这些包括本身不诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体产生的任意载体。合适的载体通常是较大、代谢慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体（如油滴或脂质体）。这种载体为本领域普通技术人员熟知。此外，可存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。关于药学上可接受组分的充分讨论参见Gennaro(2000)《雷明登：药物科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》，第20版,ISBN:0683306472。
药学上可接受盐也能用于本发明的免疫原性组合物，例如矿物盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐，以及有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或安息香酸盐。
若需要，抗原能吸附、俘获到脂质体和微粒运载体内或另外与之相连，如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒或纳米颗粒。抗原能偶联运载蛋白以增强免疫原性。参见Ramsay等(2001)Lancet357(9251):195-196;Lindberg(1999)Vaccine17增刊2:S28-36;Buttery和Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond34:163-168;Ahmad和Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am13:113-133,vii;Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47:563-567;欧洲专利0477508;美国专利第5,306,492号;WO98/42721;《偶联疫苗（Conjugate Vaccines）》(Cruse等编)ISBN3805549326,特别是在卷10:48-114;Hermanson(1996)《生物偶联技术（Bioconjugate Techniques）》ISBN:0123423368或012342335X。
本发明的免疫原性组合物可与其它免疫调节剂联用。例如，本发明的免疫原性组合物能包含佐剂。优选佐剂包括但不限于一种或多种下述佐剂类型。本发明的免疫原性组合物也可以在给予前与佐剂预先混合。
明矾
在一个实施方式中，用于本发明的佐剂是明矾（硫酸钾铝（AlK(SO4)2））或明矾衍生物，如通过将抗原与明矾在磷酸盐缓冲液中混合然后用碱如氢氧化铵或氢氧化钠滴定和沉淀来原位形成。
视黄酸
在一个实施方式中，用于本发明的佐剂是视黄酸、维生素A的氧化形式，仅有部分维生素A功能。
MF59C.1
在一个实施方式中，用于本发明的佐剂是MF59C.1，柠檬酸缓冲液中的水包油乳液（鲨烯）。MF59C.1显示为有效佐剂，并且增强针对细小病毒B19的高效价中和抗体生成(Ballou等(2003)JID,187:675-678)。
含矿物质的组合物
适用作本发明佐剂的含矿物质组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。合适的矿物盐包含氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等(例如参见Vaccine Design…(《疫苗设计…》)(1995)，Powell和Newman编，ISBN：030644867X.普莱努出版社（Plenum）,第8和9章)，或不同矿物质化合物的混合物(例如，磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选有过量磷酸盐)，所述化合物采用任意合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，优选吸附盐。所述含矿物质的组合物也可配制为金属盐颗粒(WO00/23105)。
称为"氢氧化铝"的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。羟基氧化铝以分子式AlO(OH)表示，能与其它铝化合物例如氢氧化铝Al(OH)3通过红外(IR)光谱区分，特别是在1070cm-1处存在吸收带和在3090-3100cm-1处存在强烈的肩峰[Vaccine Design…（《疫苗设计…》）(1995)Powell和Newman编，ISBN:030644867X.普莱努出版社（Plenum）,第9章]。衍射带半高宽(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂通常呈纤维形态(例如透射电子显微图中所见)。氢氧化铝佐剂的pI通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH7.4时氢氧化铝佐剂的吸附容量为1.8-2.6毫克蛋白质/毫克Al+++。
称为"磷酸铝"的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。其可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。羟基磷酸盐的PO4/Al摩尔比通常为0.3-1.2。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO4。例如，3164cm-1处的IR光谱带(例如，加热至200℃时)表明存在结构性羟基[Vaccine Design（《疫苗设计…》）（1995）Powell和Newman编，ISBN:030644867X.普莱努出版社（Plenum）,第9章]。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形羟基磷酸铝，包含0.6mg Al3+/ml。磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微图上观察到的板状形态)。抗原吸附后的典型颗粒直径范围是0.5-20μm(如约5-10μm)。据报道，pH7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5毫克蛋白质/毫克Al+++。
磷酸铝的零电点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度逆相关，且这种取代程度可根据用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而变化。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根=更酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)来改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选为5.0-6.5，例如约为5.7。
用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可以但不必定含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)。该悬浮液优选无菌且无热原。悬浮液可含有游离的水性磷酸根离子，如存在浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM。该悬浮液也可含有氯化钠。
在一个实施方式中，佐剂组分包括氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝多于氢氧化铝，例如重量比为至少2:1，例如，≥5:1、≥6:1、≥7:1、≥8:1、≥9:1等。
给予患者的组合物中Al+++浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。优选最大值<0.85mg/剂。
油乳剂
适用作本发明佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59[Vaccine Design…（《疫苗设计…》）(1995)第10章，Powell和Newman编.ISBN:030644867X，普莱努出版社(Plenum)](5%鲨烯、0.5%吐温80和0.5%司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。也可以使用完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）。
已知各种合适的水包油乳剂，它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中的油滴直径通常小于5μm，乳剂宜包含具有亚微米直径的油滴，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。
本发明可使用诸如来自动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是种籽油中天然产生。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是本文可使用的几种鱼油示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，即2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯。其它优选油是生育酚（见下）。特别优选包含鲨烯的水包油乳液。可以使用油的混合物。
表面活性剂可以按其‘HLB’(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWF AX出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(总称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80（聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯）、司盘85（脱水山梨糖醇三油酸酯）、卵磷脂和曲通X100。如上所述，诸如吐温80等去污剂可提供下文实施例所见的热稳定性。
可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
优选的表面活性剂含量（重量%）为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯（如吐温80）0.01-1%，特别是约0.1%；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇（如曲通X100或曲通系列的其它去污剂）0.001-0.1%，特别是0.005-0.02%；聚氧乙烯醚（如月桂醇聚醚9）0.1-20%，优选0.1-10%，特别是0.1-1%或约0.5%。
本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
·鲨烯、吐温80(Tween80)和司盘(Span)85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5%鲨烯、约0.5%聚山梨酯80和约0.5%司盘85。以重量计，这些比例为4.3%鲨烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盘85。这种佐剂称为‘MF59’。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。
·包含鲨烯、α生育酚和聚山梨酯80的乳液。这些乳液可含有2-10%鲨烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐温80，鲨烯:生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)，因为这能提供更稳定的乳液。鲨烯和吐温80存在的体积比可以约为5:2，或者重量比约为11:5。可通过将吐温80溶解于PBS产生2%溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，随后使该混合物微流体化来制备一种这类乳液。得到的乳液可含有如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。
·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。
·含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如α-生育酚琥珀酸盐)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/mlα-生育酚琥珀酸酯)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。所述乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。
·鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“普流罗尼克TML121”("PluronicTML121"))的乳液。所述乳液可用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，且已与含苏氨酰基-MDP的“SAF-1”佐剂(0.05-1%Thr-MDP、5%鲨烯、2.5%普流罗尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)一起使用。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用“AF”佐剂(5%鲨烯、1.25%普流罗尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)。优选微流体化。
·含有鲨烯、水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90%油滴(以体积计)的尺寸小于200nm。该乳液也可含有以下一种或多种以下物质：糖醇；低温保护剂(例如糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。这类乳液可冻干。
·含有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子型表面活性剂的乳液。优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。
·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N,N-双十八烷基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺。
·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液(见WO2006/113373)。
·包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液(见WO2006/113373)。
·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液。
通常在传递给病人时混合组合物中的抗原(VLP)和佐剂。可以在生产中或在递送时将该乳液与抗原(VLP)临时混合。因此，在包装或出售的疫苗中该佐剂和抗原(VLP)可分开保存，使用时能配制成最终制剂。所述抗原(VLP)通常是水性形式，从而最终通过混合两种液体制备疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如5:1-1:5)，但通常约为1:1。
皂苷制剂（见Vaccine Design…（《疫苗设计……》）(1995)，Powell和Newman编，ISBN:030644867X，普莱努出版社（Plenum），第22章）。
皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多植物物种的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的得自皂皮树（Quillaia saponaria Molina）树皮的皂苷。皂苷也可市售获自丽花菝葜（Smilaxornata）（墨西哥菝葜）、满天星（Gypsophilla paniculata）（婚纱花）和肥皂草（Saponaria officianalis）（皂根）。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以StimulonTM出售。
已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂苷优选QS21。制备QS21的方法公开于美国专利号5,057,540。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物（ISCOM）的独特颗粒（Vaccine Design…（《疫苗设计……》）(1995)Powell和Newman编，ISBN:030644867X，普莱努出版社，第23章）。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任意已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。WO96/33739中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂。
病毒体和病毒样颗粒(VLP)
病毒体和病毒样颗粒（VLP）也可以用作本发明的佐剂。这些结构通常包含一种或多种任选与磷脂组合或一起配制的病毒蛋白质。其通常无病原性，不能复制，且通常不含任意天然病毒基因组。所述病毒蛋白可重组生成或分离自全病毒。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括源自流感病毒（例如HA或NA）、乙肝病毒（例如核心蛋白或衣壳蛋白）、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体（如外壳蛋白）、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty（如反转录转座子Ty蛋白p1）的蛋白。
细菌或微生物衍生物
适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌脂多糖（LPS）的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。
LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A（MPL）和3-O-脱酰基MPL（3dMPL）。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。EP-A-0689454中公开了3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以通过0.22μm膜过滤除菌(EP A0689454)。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC-529。
脂质A衍生物包括大肠杆菌（Escherichia coli）的脂质A衍生物，如OM-174。OM-174描述于例如Meraldi等，(2003)Vaccine21:2485-2491和Pajak等(2003)Vaccine21:836-842。
适用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列（含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列）。含回文结构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。
CpG可以包含核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸酯修饰，且可以是双链或单链。参考Kandimalla等(2003)Nucleic Acids Research31:2393-2400,WO02/26757和WO99/62923公开了可能的类似物取代，例如用2'-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。CpG寡核苷酸的佐剂作用详见Krieg(2003)Nature Medicine9:831-835，McCluskie等(2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology32:179-185；WO98/40100；US6,207,646；US6,239,116和US6,429,199。
CpG序列可能针对TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT(Kandimalla等(2003)Biochemical Society Transactions31(第3部分):654-658)。CpG序列可特异性诱导Th1免疫反应，如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞反应，如CpG-B ODN。Blackwell等(2003)J Immunol170:4061-4068；Krieg(2002)Trends Immunol23:64-65和WO01/95935中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选CpG为CpG-A ODN。
优选构建CpG寡核苷酸从而5’末端可被受体识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，Kandimalla等(2003)Biochemical SocietyTransactions31(第3部分):654-658,Kandimalla等(2003)BBRC306:948-953,Bhagat等(2003)BBRC300:853-861和WO03/035836。
基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂称为IC-31TM（Schellack等(2006)Vaccine24:5461-5472）。因此，本发明使用的佐剂可以包含(i)和(ii)的混合物：(i)含有至少一个（优选多个）CpI基序（即胞嘧啶与肌苷相连形成二核苷酸）的寡核苷酸（例如15-40个核苷酸），和(ii)聚阳离子聚合物，如含有至少一个（优选多个）Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽（如5-20个氨基酸）。所述寡核苷酸可以是包含26聚体序列5'-(IC)13-3'（SEQ ID NO:9）的脱氧核苷酸。聚阳离子聚合物可以是含有11聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO:10)的肽。
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可以用作本发明的佐剂。优选所述蛋白衍生自大肠杆菌（大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”）、霍乱菌（“CT”）或百日咳菌（“PT”）。脱毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用描述于WO95/17211，作为胃肠道外佐剂的应用描述于WO98/42375。所述毒素或类毒素优选全毒素形式，包含A和B亚基。A亚基优选含有脱毒突变；B亚基优选不突变。所述佐剂优选为脱毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用可参见Beignon等，(2002)Infect Immun70(6):3012-3019；Pizza等，(2001)Vaccine19:2534-2541；Pizza等，(2000)Int.J.Med.Microbiol290(4-5):455-461；Scharton-Kersten等，(2000)Infect Immun68:5306-5313；Ryan等，(1999)Infect Immun67:6270-6280，Partidos等，(1999)Immunol.Lett.67:209-216；Peppoloni等，(2003)Expert Rev Vaccines2(2):285-293；Pine等，(2002)J.Control Release85:263-270和Tebbey等(2000)Vaccine18:2723-34。一种有用的CT突变体是CT-E29H。优选根据Domenighini等，(1995)Mol.Microbiol15:1165-1167提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基排列对氨基酸取代编号，该文献特定通过引用全文纳入本文。
人免疫调节剂
适用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO99/40936和WO99/44636)、干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。优选的免疫调节剂是IL-12。
生物粘着剂和粘膜粘着剂
生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球(Singh等(2001)J.Cont.Release70:267-276)或粘膜粘着剂如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明佐剂(WO99/27960)。
微粒
微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒（即直径为～100nm至～150μm，更优选直径～200nm至～30μm，最优选直径～500nm至～10μm的颗粒）由生物可降解的无毒材料（例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等）形成，优选丙交酯乙交酯共聚物，并任选经处理而具有带负电表面（例如用SDS处理）或带正电表面（例如用阳离子去污剂如CTAB处理）。
脂质体（Vaccine Design…（《疫苗设计……》）(1995)Powell和Newman编，ISBN:030644867X，普莱努出版社，第13和14章）。
适用作佐剂的脂质体制剂示例描述于US6,090,406，US5,916,588和EP-A-0626169。
聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂
适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯（WO99/52549）。这种制剂还包括聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇(WO01/21207)以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子型表面活性剂如辛苯糖醇(WO01/21152)。优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚（月桂醇聚醚9）、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
聚磷腈(PCPP)
例如PCPP制剂描述于Andrianov等(1998)Biomaterials19:109-115和Payne等(1998)Adv Drug Delivery Review31:185-196。
胞壁酰肽
适用作本发明佐剂的胞壁酰肽示例包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺（thr-MDP）、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺（去甲-MDP）和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE）。
咪唑并喹诺酮化合物
适用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物示例包含咪喹莫特及其同源物(如“瑞喹莫德3M”)，其进一步描述于Stanley(2002)Clin Exp Dermatol27:571-577和Jones(2003)Curr Opin Investig Drugs4:214-218。
苯并萘啶
适用作本发明佐剂的苯并萘啶化合物示例描述于WO2009/111337。
脂肽
已知脂肽（即含一种或多种脂肪酸残基和两种或更多氨基酸残基的化合物）有免疫刺激特性。基于甘油半胱氨酸的脂肽特别适用于本发明的佐剂。该肽的特定示例包括具有下式的化合物：
其中R1和R2各代表具有8-30，优选11-21个碳原子的饱和或不饱和，脂族或混合的脂族-脂环族烃基，其也任选地由氧功能团取代，R3代表氢或基团R1-CO-O-CH2-，其中R1与上述相同，且X代表肽键结合且具有游离、酯化或酰胺化羧基的氨基酸或末端羧基基团为游离、酯化或酰胺化形式的2-10个氨基酸的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列含D-氨基酸，例如D-谷氨酸(D-Glu)或D-γ-羧基-谷氨酸(D-Gla)。
细菌脂肽通常识别TLR2，不需要TLR6参与。（TLR协同操作以提供各种激发物的特异识别，TLR2和TLR6一起识别肽聚糖，而TLR2识别脂肽但不需要TLR6。）这些有时分类为天然脂肽和合成脂肽。合成脂肽往往表现相似，且主要被TLR2识别。
适用作本发明佐剂的脂肽包含有下式的化合物：
其中*标记的手性中心和***标记的手性中心都处于R构型；
**标记的手性中心为R或S构型；
R1a和R1b各自独立为具有7-21个碳原子的脂族或脂环族-脂族烃基基团，任选由氧功能团取代，或者R1a和R1b之一但非全部是H；
R2是具有1-21个碳原子的脂族或脂环族烃基基团且任选由氧功能团取代；
n是0或1;
As代表–O-Kw-CO-或–NH-Kw-CO-，其中Kw是具有1-12碳原子的脂族烃基基团。
As1是D-或L-α-氨基酸；
Z1和Z2各自独立代表–OH或者氨基-(低级烷烃)-磺酸的D-或L-α-氨基酸N末端基团或选自D-和L-α氨基羧酸和氨基-低级烷基-磺酸的至多6个氨基酸的肽的N末端基团；和
Z3为H或–CO-Z4，其中Z4为–OH或者氨基-(低级烷烃)-磺酸的D-或L-α-氨基酸N末端基团或选自D-和L-α氨基羧酸和氨基-低级烷基-磺酸的至多6个氨基酸的肽的N末端基团；或从所述化合物的羧酸形成的酯或酰胺。合适的酰胺包含–NH2和NH（低级烷基），合适的酯包含C1-C4烷基酯。（本文所用的低级烷基或低级烷烃指C1-C6直连或支链烷基）。
所述化合物在US4,666,886中更详细描述。适用作本发明佐剂的脂肽化合物示例是有下式的脂肽：
脂肽种类的另一示例称为LP40，且其是TLR2的激动剂。Akdis等,(2003)Eur.J.Immunology,33:2717-2726。
这些涉及来自大肠杆菌的已知脂肽种类，称为胞壁质脂肽。这些蛋白的某些部分降解产物称为胞壁质脂肽,描述于Hantke等,(1973)Eur.J.Biochem.,34:284-296。这些包含连接N-乙酰胞壁酸的肽且因此涉及胞壁酰肽，描述于Baschang等,Tetrahedron,(1989)45(20):6331-6360。
本发明也可包含以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，可将以下佐剂组合物用于本发明：(1)皂苷和水包油乳剂(WO99/11241)；(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)(WO94/00153)；(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任选+固醇)(WO98/57659)；(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合（欧洲专利申请0835318、0735898和0761231）；(6)SAF，含有10%鲨烯、0.4%吐温80TM、5%普流罗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流体化为亚微米乳液或涡旋振荡产生粒度较大的乳液；(7)RibiTM佐剂系统(RAS)(瑞比免疫化学公司(Ribi Immunochem))，含有2%鲨烯、0.2%吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；和(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。
Powell和Newman编著的Vaccine Design…（《疫苗设计……》）(1995)，ISBN:030644867X，普莱努出版社，第7章公开了其它起免疫刺激剂作用的试剂。
使用氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂特定在儿童中有效，且抗原通常吸附于这些盐。也优选水包鲨烯乳液，特定在老年人中。有用的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，如CpG和明矾或雷西莫特和明矾。可以使用磷酸铝和3dMPL的组合。
在一些实施方式中，本发明是包含如本文所述VP1和VP2的细小病毒VLP以及佐剂如MF59的免疫原性组合物。所述VLP和佐剂(如MF59)能预混合并作为单个组合物提供，或者作为给予前混合的分开组合物提供。
E.给予
通常直接给予患者本发明组合物(如包含诺如病毒嵌合VP1蛋白、VLP和编码诺如病毒嵌合VP1蛋白的核酸的组合物)。可通过胃肠道外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙)，或通过粘膜，如通过直肠、口腔(如片剂、喷雾)、阴道、局部、透皮（参见如WO99/27961）或经皮（参见如WO02/074244和WO02/064162）、鼻内（参见如WO03/028760）、眼部、耳部、肺部或其它粘膜途径完成直接递送。例如使用微针能实现透皮递送。也能通过直接转移到皮肤表面来局部给予免疫原性复合物。不使用任意设备或通过使用绷带或类似绷带的设备使裸露皮肤接触免疫原性复合物来完成局部给予(见例如美国专利号6,348,450)。
优选给予模式是胃肠外、粘膜或粘膜和胃肠外免疫的组合。甚至更优选地，给予模式是间隔1-3周总共1-2次疫苗接种的胃肠外、粘膜或粘膜和胃肠外免疫的组合。优选给予途径包括但不限于口服递送、肌肉内递送以及口服和肌肉内递送的组合。
已经显示了针对粘膜病原体抗原（如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)抗原）的粘膜和系统免疫反应能通过粘膜初次免疫然后系统加强免疫来增强(见Vajdy等(2003)Immunology110:86-94)。在一些实施方式中，治疗或预防诺如病毒传染的方法包含粘膜给予所需患者包含一种或多种诺如病毒抗原的第一免疫原性组合物，然后肠胃外给予治疗有效量的含有一种或多种诺如病毒抗原的第二免疫原性组合物。
所述免疫原性组合物可用于引起全身和/或粘膜免疫，优选引起增强的全身和/或粘膜免疫。
优选免疫反应的特征是诱导血清IgG和/或肠道IgA免疫反应。
如上所述，优选使用初次-加强方法，其中一种或多种基因递送载体和/或多肽抗原在“初次”步骤中递送，并且随后一种或多种基因递送载体和/或多肽抗原在“加强”步骤中递送。在某些实施方式中，用本文所述一种或多种基因递送载体或多肽抗原进行初次和加强后，再用一种或多种包含多肽的组合物(例如包含诺如病毒抗原的多肽)加强。
在任意涉及共给予的方法中，多种组合物能以任意顺序递送。因此，在包含递送多个不同组合物或分子的实施方式中，不需要在多肽前递送全部核酸。例如，初次步骤可以包含递送一种或多种多肽，和加强步骤可以包含递送一种或多种核酸和/或一种或多种多肽。给予多种多肽后，能以任意顺序给予多种核酸或者给予多肽和核酸。因此，能以任意顺序和通过任意给予路径共给予本文所述的一种或多种基因递送载体和本文所述的一种或多种多肽。因此，能使用本文所述多核苷酸和多肽的任意组合以引起免疫反应。
(i)剂量方案（Regime）
剂量治疗可依照单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初免方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径给予多个剂量，如胃肠道外初次和粘膜加强、粘膜初次和胃肠道外加强等。
优选所述剂量方案增强抗体反应的亲合力，产生有中和特性的抗体。
在一些示例中，血清抗体水平与保护免受诺如病毒引起的疾病有关。例如，在多攻击研究中，血清抗体水平与用高剂量诺沃克病毒重复(2-3)口服攻击后的保护有关(Johnson等(1990)J.Infect.Dis.161:18-21)。在另一个研究中，没有已存在抗体的23例婴儿中18例发展出人杯状病毒造成的胃肠炎，而有已存在抗体水平的18例中15例没有生病(Ryder等(1985)J.Infect.Dis.151:99-105)。在另一个研究中，相较基线抗体效价大于1:100的人的13%，基线诺沃克抗体效价小于1:100的人的47%发生诺沃克传染，(p<0.001)(Ryder等(1985)J.Infect.Dis.151:99-105)。因为一些个体不生成某些诺如病毒株的受体并且因而对那些诺如病毒株有先天抗性，能观察到异常结果，其中存在抗体与对某些毒株的易感性而不是保护相关。参见Parrino等(1997)N.Engl.J.Med.297:86-89。
能给予哺乳动物（如小鼠、狒狒、黑猩猩或人）上述嵌合诺如病毒VP1蛋白和VLP以体内活化诺如病毒特异性T细胞。能以本领域已知的任意方式给予，包含胃肠外、鼻内、肌肉内或皮下注射，包含使用上述弹道枪（ballistic gun）注射。
包含嵌合诺如病毒VP1蛋白或VLP的本发明组合物以与所用特定组合物相容的方式和有效诱导免疫反应(如T细胞反应和/或体液免疫)（优选保护性免疫反应）的量给予。
诺如病毒特异T细胞反应能通过51Cr释放试验、淋巴增殖试验或IFN-γ胞内染色等测量。所述蛋白能给予没有传染诺如病毒的哺乳动物，或能给予传染诺如病毒的哺乳动物。组合物中融合蛋白的特定剂量取决于很多因素，包括但不限于给予组合物的哺乳动物的物种、年龄和一般情况，和所述组合物的给予模式。能仅使用常规实验容易测定本发明组合物的有效量。体外和体内模式能用于鉴定合适剂量。通常，0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、5或10mg诺如病毒多肽或VLP会给予较大哺乳动物如狒狒、黑猩猩或人。若需要，共刺激分子或佐剂也能在所述组合物之前、之后或一起提供。
递送本发明组合物（包含活化诺如病毒特异T细胞）产生的哺乳动物免疫反应能通过改变的剂量、给予途径或增强方案加强。本发明组合物可以单剂量方案或优选多剂量方案给予，其中疫苗接种的初级过程可以包含1-10个单独剂量，然后以保持和/或强化免疫反应所需的后续时间间隔给予其他剂量，例如1-4个月的第二剂量，且若需要，在数月后给予一个或多个后续剂量。
F.测定免疫反应功效的测试
检测治疗性治疗功效的一种方式包括在给予本发明组合物后监测传染。检测预防性治疗功效的另一种方式涉及在给予组合物后监测针对本发明所述组合物中抗原的全身免疫反应(例如监测IgG1和IgG2a产生水平)和粘膜免疫反应(例如监测IgA产生水平)。通常，血清特异性抗体反应在免疫后但攻击前进行确定，而粘膜特异性抗体反应在免疫后且攻击后测定。
评价本发明免疫原性组合物的组分蛋白质的免疫原性的另一种方式是重组表达蛋白并通过免疫印迹方法筛选患者血清或粘膜分泌物。蛋白质和患者血清之间的阳性反应表明该患者已对所研究蛋白质产生免疫反应，即该蛋白是免疫原。也可利用该方法鉴定优势免疫蛋白质和/或表位。
体内功效模型包含由NIH和疾病控制中心（Center for Disease Control）(CDC)支持的人攻击模型(参见例如Lindesmith等(2003)Nat.Med.9:548-553和Lindesmith等(2005)J.Virol.79:2900-2909)。
所述免疫反应可以是TH1免疫反应和TH2免疫反应之一或两种。免疫反应可以是改善的、或增强的、或改变的免疫反应。所述免疫反应可以是全身免疫反应和粘膜免疫反应其中之一或两者兼有。优选所述免疫反应为增强的全身和/或粘膜反应。
增强的全身和/或粘膜免疫体现为增强的TH1和/或TH2免疫反应。增强的免疫反应优选包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA生成增加。优选粘膜免疫反应为TH2免疫反应。粘膜免疫反应优选包括IgA生成增加。
活化的TH2细胞提高抗体生成，因此对响应胞外传染具有价值。活化的TH2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫反应可引起IgG1、IgE、IgA和用于未来保护的记忆B细胞生成。
TH2免疫反应可包括以下一种或多种：与TH2免疫反应相关的一种或多种细胞因子（如IL-4，IL-5，IL-6和IL-10）增加，或者IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞生成增加。增强的TH2免疫反应优选包括IgG1生成增加。
TH1免疫反应可包括以下一种或多种：CTL增加，与TH1免疫反应相关的一种或多种细胞因子（如IL-2、IFNγ和TNFβ）增加，活化的巨噬细胞增加，NK活性增加，或者IgG2a生成增加。增强的TH1免疫反应优选包括IgG2a生成增加。
本发明免疫原性组合物特别是包含一种或多种本发明抗原的免疫原性组合物，可单独使用或与其他抗原以及任选地与能够引发Th1和/或Th2反应的免疫调节剂联用。
本发明还包含含有一种或多种免疫调节剂如无机盐例如铝盐和含有CpG基序的寡核苷酸的免疫原性组合物。更优选所述免疫组合物同时包含铝盐和含CpG基序的寡核苷酸。或者所述免疫原性组合物包含ADP核糖基化毒素如脱毒ADP核糖基化毒素和含CpG基序的寡核苷酸。优选地，一种或多种免疫调节剂包括佐剂。所述佐剂可选自上面进一步讨论的TH1佐剂和TH2佐剂中的一种或多种。
本发明的免疫原性组合物优选同时引发细胞介导的免疫反应以及体液免疫反应，以有效抵御传染。该免疫反应优选诱导持久（如中和性）抗体和可在接触一种或多种传染抗原后迅速响应的细胞介导免疫。
G.使用免疫原性组合物作为药物
本发明还提供本发明组合物作为药物的应用，特别是生成或用作疫苗。药物优选能够引起哺乳动物的免疫反应(即它是一种免疫原性组合物)，并且更优选是疫苗。本发明也提供本发明组合物在制备引起哺乳动物免疫反应的药物中的应用。所述药物优选为疫苗。疫苗优选用于预防和/或治疗肠传染，例如胃肠炎，优选急性胃肠炎。所述胃肠炎可由离子和/或水转移的失衡引起，造成水泻和/或肠蠕动和/或运动。胃肠炎也可以造成呕吐。
本发明提供采用上述组合物诱导或增强免疫反应的方法。所述免疫反应优选为保护性，并可包括抗体和/或细胞介导的免疫（包括全身和粘膜免疫）。免疫反应包括加强反应。
本发明还提供了引起哺乳动物免疫反应的方法，包括给予有效量的本发明组合物的步骤。所述免疫反应优选为保护性，并优选涉及抗体和/或细胞介导免疫。所述免疫反应优选包含TH1免疫反应和TH2免疫反应之一或两种。该方法可以引起增强的反应。
所述哺乳动物优选人。当所述免疫原性组合物优选疫苗用于预防用途时，人优选是儿童(如幼儿或幼童、学龄前儿童，如1岁或更小、1-3岁、或4岁、或5岁、或6岁、或7岁、或8岁、或9岁、或10岁以上（onwards）儿童)、青少年、老年人(如约60岁或更老人)或处于高风险组的人，如军人、旅行者、健康护理工作者、儿童护理(日间护理)提供者和食品处理者。也能给予这类个体所述免疫原性组合物或疫苗以用于治疗用途。用于儿童的疫苗也可给予成年人（例如用以评估安全性、剂量、免疫原性等）。
本发明免疫原性组合物（如疫苗）的其他靶标群包含：如上讨论的移植和免疫受损个体;在如美国、加拿大和欧洲的成人和儿童，包括但不限于下列:食品处理者;保健护理人员例如但不限于医院和疗养院人员;日间护理提供者;旅行者，包括大型游轮旅行者;军人;和儿童和/或老年群体。
(i)诺如病毒特异T细胞
由体内或体外所表达嵌合VP1蛋白或VLP活化的诺如病毒特异T细胞优选识别VP1的P结构域的表位。诺如病毒特异T细胞能是CD8+或CD4+。
诺如病毒特异CD8+T细胞能是能杀死诺如病毒传染细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，所述诺如病毒传染细胞展示与MHC I类分子复合的任意这些表位。诺如病毒特异CD8+T细胞能通过例如51Cr释放试验检测。51Cr释放试验测量诺如病毒特异CD8+T细胞裂解展示一种或多种这些表位的靶标细胞的能力。本文也考虑了表达抗病毒剂如IFN-γ的诺如病毒特异CD8+T细胞，并且也能通过免疫学方法检测，优选通过用一种或多种诺如病毒多肽（如本文所述那些）体外刺激后胞内染色IFN-γ或类似细胞因子。
诺如病毒特异CD4+T细胞也能通过淋巴增殖试验检测。淋巴增殖试验测量诺如病毒特异CD4+T细胞响应例如VP1而增殖的能力。
(ii)活化诺如病毒特异T细胞的方法
嵌合诺如病毒VP1蛋白和VLP能用于体外或体内活化诺如病毒特异T细胞。能使用诺如病毒特异T细胞活化等来提供模型系统以优化对诺如病毒的CTL反应并且提供针对诺如病毒传染的预防或治疗处理。对于体外活化，优选通过质粒或病毒载体如上述腺病毒载体向T细胞供应蛋白。
T细胞的多克隆群能获自血液，并且优选来自已经传染诺如病毒的哺乳动物的外周淋巴器官如淋巴结、脾或胸腺。优选的哺乳动物包含小鼠、黑猩猩、狒狒和人。诺如病毒传染用于扩增哺乳动物中经活化诺如病毒特异T细胞的数目。然后能通过加入本发明所述诺如病毒免疫原性多肽和/或融合蛋白体外重新刺激获自哺乳动物的所述诺如病毒特异T细胞。然后能测试所述诺如病毒特异T细胞的增殖、IFN-γ生成和体外裂解展示例如VP1多肽表位的靶标细胞的能力。
H.药盒
本发明还提供包括一个或多个本发明免疫原性组合物容器的药盒。组合物可为液体形式或可为冻干形式，各个抗原也可如此。合适的组合物容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由各种材料形成，包括玻璃或塑料。容器可具有无菌进入端口（例如，所述容器可以是具有皮下注射针可刺穿塞子的静脉输液袋或小瓶)。
所述药盒还可包括含有药学上可接受的缓冲剂如磷酸盐缓冲盐水、林格溶液或右旋糖溶液的第二容器。其还可包括用于最终使用者的其它材料，包括其它药学上可接受的配制溶液，如缓冲剂、稀释剂、滤器、针和注射器或其他递送设备。所述药盒还可以包含含有佐剂的第三组分。
所述药盒还可包括产品说明书，其包含诱导免疫或者用于治疗传染的方法书面说明书。所述产品说明书可以是未经批准的产品说明书草案，或可以是经食品药物管理局(FDA)或其他管理机构批准的产品说明书。
本发明还提供了一种预填充有本发明免疫原性组合物的递送装置。
III.实验
以下为实施本发明的具体实施方式的示例。提供实施例仅用于说明目的，并非旨在以任意方式限制本发明的范围。
实施例1
雪山/诺沃克嵌合VP1蛋白的表达构建物
生成嵌合诺如病毒VP1蛋白、包含嵌合蛋白的VLP、酿酒酵母株AD3的构建物通过将编码嵌合VP1蛋白的序列克隆到酵母表达载体pBS24.1中产生。pBS24.1载体详细描述于1989年7月19日提交的共同拥有的美国专利申请序列号382,805，所述申请通过引用全文纳入本文。所述pBS24.1载体包含在酵母中自主复制的2微米序列，和作为选择标记的酵母基因leu2d和URA3。表达载体上也存在细菌内质粒复制所需的β内酰胺酶基因和ColE1复制起点。表达调节受杂合ADH2/GAPDH启动子(描述于美国专利号6,183,985)和α因子终止子的控制。
生成构建物并且用于表达雪山(SMV0/诺沃克VP1蛋白，包含图6所示多核苷酸序列(SEQ ID NO:16)。为此，前面由限制性酶HindIII和Acc651剪切生成的雪山基因S结构域的相应片段连接到使用限制性酶Alw211和Sal1生成的诺沃克基因P结构域的相应片段上。这个新的嵌合DNA连接到pMADC5亚克隆载体(图1)的HindIII-SalI位点并且扩增。所述扩增的片段(示于图5)然后克隆到表达载体pBS24.1(图2)的BamHI+SalI位点，以在啤酒酵母菌株AD3中表达SMV/诺沃克嵌合VP1蛋白。
实施例2
雪山/GII.4.2006a嵌合体的表达构建物
此实施例中，表达载体pBS24.1用于在啤酒酵母菌株AD3中生成雪山/GII.4.2006aVLP(SMV/GII.4.2006a/嵌合体)。用于表达嵌合SMV/GII.4.2006a VP1蛋白的编码序列示于图7。基于雪山和GII.4.2006a病毒的VP1 S和P结构域的cDNA序列，使用合成寡核苷酸生成编码序列。
此实施实施例中，前面由限制性酶HindIII和Acc651剪切生成的雪山基因S结构域的相应片段连接到使用限制性酶Xbal-SalI生成的GII.4.2006a基因P结构域的相应片段上。这个新的嵌合DNA连接到pMADC5亚克隆载体(图1)的HindIII-SalI位点并且扩增。所述扩增的片段(示于图6)然后克隆到表达载体pBS24.1(图2)的BamHI+SalI位点，以在啤酒酵母菌株AD3中表达SMV/诺沃克嵌合VP1蛋白。
实施例3
酵母中嵌合VLP的表达
使用上述表达质粒转化酿酒酵母菌株AD3(MATa,leu2,ura3-52,prb1-1122,pep4-3,prc1-407,gal2,[cir0],::pDM15(pGAP/ADR1::G418R),::Yip5ΔleuAD)。转化前，酵母细胞在YEPD(酵母膏细菌用蛋白胨2%葡萄糖)平板上划线培养，并且选择单个菌落以制备转化的感受态细胞。
使用英杰公司S.c.EasyCompTM转化试剂盒进行酵母转化。转化后，数个Ura转化体在Ura-8%葡萄糖平板上划线培养以获得单个菌落。单个菌落然后封接（patch）到Leu-8%葡萄糖平板上增加质粒拷贝数目。Leu起子（starter）培养物在30°C下生长24小时，然后在YEPD(酵母膏细菌用蛋白胨2%葡萄糖)或Veggie(Novagen Veggie蛋白胨和Veggie酵母提取物)培养基中1:20稀释。细胞在30°C生长48-72小时以耗尽培养基中的葡萄糖并且随后收集。培养基中耗尽葡萄糖后开始诱导。这个系统提供了外源基因诱导前的高细胞质量。
实施例4
嵌合VLP的纯化
诺如病毒病毒样颗粒(VLP)从表达诺如病毒嵌合VP1蛋白的酵母细胞培养基中纯化。低速离心(15,000xg)在培养基上进行以除去多余细胞或细胞碎片。这个步骤后，上清液进行通过40%蔗糖垫的4小时高速离心(100,000xg)以分离病毒样颗粒与游离蛋白和其他材料。包含VLP的团块（pellet）在缓冲液(50mM Tris pH7.5,100mM NaCl)重新悬浮并且加载到CaptoTM Q柱，并用高盐洗脱。用增加的盐梯度从柱上洗脱VLP。最终，包含VLP的洗脱部分加以浓缩和在低盐缓冲液(20mM Tris pH7.5,100mMNaCl)中进行缓冲液交换，并且4°C保存直到需要时。
表1:诺如病毒株

Claims (34)

1.一种嵌合诺如病毒病毒蛋白1(即VP1)，所述嵌合诺如病毒VP1包含第一诺如病毒株VP1的S结构域和诺如病毒VP1P结构域，所述P结构域全部或部分来自第二诺如病毒株，表达后的所述诺如病毒VP1蛋白能够自体组装成病毒样颗粒(即VLP)。
2.如权利要求1所述的嵌合诺如病毒VP1，其特征在于，所述嵌合诺如病毒VP1还包含操作性连接S结构域和P结构域的接头肽。
3.如权利要求2所述的嵌合诺如病毒VP1，其特征在于，所述接头肽是来自第一诺如病毒株、第二诺如病毒株、或第三诺如病毒株的VP1的接头肽。
4.如权利要求1所述的嵌合诺如病毒VP1，其特征在于，所述嵌合诺如病毒VP1具有以下表示式：
A—S—L—P—B
其中，
A和B各自缺失或是任意所需氨基酸序列；
S是来自第一诺如病毒株VP1的S结构域；
L不存在或是接头肽；
P是诺如病毒VP1P结构域，其中至少一部分P结构域来自第二诺如病毒株。
5.如权利要求4所述的嵌合诺如病毒VP1，其特征在于，L是来自第一诺如病毒株、第二诺如病毒株、或第三诺如病毒株的VP1的接头肽。
6.如权利要求4或5所述的嵌合诺如病毒VP1，其特征在于，P是来自第二诺如病毒株的完整P结构域。
7.如权利要求4或5所述的嵌合诺如病毒VP1，其特征在于，P包含来自第一诺如病毒株的P1亚结构域或其部分，和来自第二诺如病毒株的P2亚结构域。
8.如权利要求1所述的嵌合诺如病毒VP1蛋白，其特征在于，所述第一诺如病毒株选自表1列举的诺如病毒株。
9.如权利要求1所述的嵌合诺如病毒VP1蛋白，其特征在于，所述第一诺如病毒株是雪山株。
10.如权利要求1所述的嵌合诺如病毒VP1蛋白，其特征在于，所述第二诺如病毒株选自表1列举的诺如病毒株。
11.如权利要求9所述的嵌合诺如病毒VP1蛋白，其特征在于，所述第二诺如病毒株选自基因群GII、基因群GI的诺如病毒株和基因群GIV的诺如病毒株。
12.如权利要求9所述的嵌合诺如病毒VP1蛋白，其特征在于，所述第二诺如病毒株选自基因群GII的诺如病毒株和基因群GI的诺如病毒株。
13.如权利要求12所述的嵌合诺如病毒VP1蛋白，其特征在于，所述第二诺如病毒株是诺沃克病毒、GII.4.2006a或新奥尔良(New Orleans)病毒。
14.一种包含如权利要求1-13中任一项所述的嵌合VP1蛋白的诺如病毒病毒样颗粒(VLP)。
15.一种包含如权利要求1-13中任一项所述的嵌合VP1蛋白的单价诺如病毒病毒样颗粒(VLP)。
16.一种包含如权利要求1-13中任一项所述的嵌合VP1蛋白的多价诺如病毒病毒样颗粒(VLP)。
17.如权利要求16所述的多价VLP，其特征在于，所述VLP包含两种或更多种不同的嵌合VP1蛋白。
18.一种包含如权利要求1-13中任一项所述的嵌合诺如病毒VP1蛋白的免疫原性组合物。
19.一种包含如权利要求14-17中任一项所述的诺如病毒VLP的免疫原性组合物。
20.一种包含如权利要求15所述的单价诺如病毒VLP的免疫原性组合物。
21.一种包含如权利要求16或17所述的多价诺如病毒VLP的免疫原性组合物。
22.一种包含两种或更多种不同的如权利要求15所述的单价诺如病毒VLP的免疫原性组合物。
23.一种编码权利要求1-13中任一项所述的嵌合诺如病毒VP1蛋白的重组核酸。
24.如权利要求23所述的重组核酸，其特征在于，所述重组核酸包含载体。
25.如权利要求23所述的重组核酸，其特征在于，所述重组核酸自体复制。
26.一种包含如权利要求23-25中任一项所述的重组核酸的免疫原性组合物。
27.一种包含如权利要求23-25中任一项所述的重组核酸的重组宿主细胞。
28.如权利要求27所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、细菌、酵母细胞、四膜虫细胞。
29.一种生成嵌合诺如病毒VP1蛋白和/或诺如病毒VLP的方法，所述方法包含在表达所述重组核酸和生成嵌合诺如病毒VP1蛋白的条件下培养如权利要求28所述的重组宿主细胞。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，在将宿主细胞维持在适合形成诺如病毒VLP的条件下。
31.如权利要求29或30所述的方法，其特征在于，所述方法还包含从培养基和/或所述重组宿主细胞中分离所述嵌合诺如病毒VP1蛋白和/或诺如病毒VLP。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述诺如病毒VLP是分离的。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述诺如病毒VLP使用蔗糖垫或蔗糖梯度分离。
34.如权利要求1所述的诺如病毒VP1，所述第二诺如病毒株VP1的P结构域包含第二诺如病毒株VP1的P结构域的免疫原性部分。
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Multivalent norovirus vaccines induce strong mucosal and systemicblocking antibodies against multiple strains;Anna D. LoBue, ET AL;《Vaccine》;20060418;第24卷;5220-5234 *

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