CN118126202A

CN118126202A - 一种诺如病毒类病毒颗粒及其应用

Info

Publication number: CN118126202A
Application number: CN202410552825.8A
Authority: CN
Inventors: 祝先潮; 汤书兵; 陈华根; 毛意芝; 刘畅; 夏清风
Original assignee: Shanghai Weizhou Biotechnology Co ltd; Shanghai Ruizhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Weizhou Biotechnology Co ltd; Shanghai Ruizhou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-05-07
Filing date: 2024-05-07
Publication date: 2024-06-04

Abstract

本发明涉及诺如病毒类病毒颗粒及其应用，具体提供一种重组诺如病毒VP1蛋白或与其具有至少80%序列相同性并保留免疫原性的变体，包含S’区域和P’区域，所述S’区域是一种基因型诺如病毒VP1蛋白的包含S区域的片段，所述P’区域是GII.3基因型诺如病毒VP1蛋白的P区域。本发明的诺如病毒类病毒颗粒结构稳定，而且具有良好的免疫原性。

Description

一种诺如病毒类病毒颗粒及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及嵌合类病毒颗粒及其应用。

背景技术

诺如病毒（Norovirus, NoV）归属于杯状病毒科，其基因由一种单股正链RNA组成，GII.4和GII.3等基因型是国内主要流行毒株。诺如病毒表面结构是由病毒表面蛋白VP1形成的90个二聚体组成，介导病毒的入侵，是疫苗设计的主要靶标抗原。VP1蛋白可自组装成类病毒颗粒，其N端的S区域组成内壳，C端的P区域展示在类病毒颗粒表面。S区域和P区域相对独立，S区域原核表达自组装成60聚体的纳米颗粒，P区域原核表达自组装成24聚体的纳米颗粒。S区域保守性高，毒株的突变位点主要集中在P区域，尤其是和受体结合的P2区域。然而，不同基因型或同一基因型的不同毒株的VP1类病毒颗粒在结构、稳定性及免疫原性并不一样。通过将一种诺如病毒的VP1的S内壳替换为其它基因型诺如病毒的内壳，是提高诺如病毒类病毒颗粒稳定性和免疫原性的创新策略，具有重要的意义。

重组蛋白在酵母中表达是一种常见可行的方法。该表达体系生产周期短、发酵工艺简单、菌体密度大、产量高、成本低，已被大量用于重组蛋白的生产制备。在使用毕赤酵母工程菌生产制备GII.3的类病毒颗粒过程中，我们发现单体蛋白不但容易降解，而且自组装的类病毒颗粒结构不稳定，均一性较差。所以，在重组表达诺如病毒类病毒颗粒时，构建稳定的具有生物活性的类病毒颗粒至关重要。

发明内容

为了解决在生产类病毒颗粒中单体蛋白容易降解，且自组装的类病毒颗粒结构不稳定，均一性较差的问题，本发明提供了一种重组蛋白，即诺如病毒特定基因型VP1蛋白，VP1蛋白通过基因工程技术与其他基因型的VP1蛋白序列重组，将GII.3的S内壳替换为其它基因型的内壳，改造构建新型类病毒颗粒。新构建的嵌合诺如病毒类病毒颗粒结构稳定，均一性好，避免了类病毒颗粒蛋白降解，而且具有良好的免疫原性。

本发明第一方面提供一种重组诺如病毒VP1蛋白或与其具有至少80%序列相同性并保留免疫原性的变体，包含S’区域和P’区域，S’区域位于P’区域的N端并与其操作性连接，所述S’区域是以下任一种基因型诺如病毒VP1蛋白的包含S区域的片段：（1）GI.1、（2）GII.2、（3）GII.4、（4）GII.6、（5）GII.17，所述P’区域是GII.3基因型诺如病毒VP1蛋白的P区域。

在一个或多个实施方案中，GI.1诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:1的第1-211所示。

在一个或多个实施方案中，GII.2诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:2的第1-208所示。

在一个或多个实施方案中，GII.4诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:4的第1-208所示。

在一个或多个实施方案中，GII.6诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:5的第1-207所示。

在一个或多个实施方案中，GII.17诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:6的第1-208所示。

在一个或多个实施方案中，所述S’区域的序列如SEQ ID NO:1的第1-n位氨基酸所示，n是211-251的整数；所述S’区域的序列如SEQ ID NO:5的第1-n位氨基酸所示，n是207-251的整数；或者，所述S’区域的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6的第1-n位氨基酸所示，n是208-251的整数。

在一个或多个实施方案中，所述P’区域的序列如SEQ ID NO:3的第209-548位氨基酸所示或与其具有至少80%序列相同性。

在一个或多个实施方案中，所述操作性连接是直接连接或通过由多个氨基酸组成的铰链区连接。优选地，所述多个氨基酸的个数为8个。

在一个或多个实施方案中，所述重组蛋白具有：（1）SEQ ID NO:7-9和11中任一序列所示的序列，（2）与（1）具有99%、95%、90%、80%、70%或50%相同性的序列。

本发明还提供类病毒颗粒，其包含本发明第一方面所述的重组诺如病毒VP1蛋白。所述类病毒颗粒由本发明第一方面所述的重组诺如病毒VP1蛋白自组装形成。

本发明第二方面提供核酸分子，其包含：

（1）本文任一实施方案所述的重组诺如病毒VP1蛋白的编码序列，或

（2）（1）的互补序列。

本发明还提供核酸构建物，其包含本文第二方面所述的核酸分子。该核酸序列编码本发明所述重组蛋白。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或重组载体，优选地，所述核酸构建物是病毒载体。

在一个或多个实施方案中，所述病毒载体是重组病毒载体。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子与表达控制序列操作性连接。

本发明还提供宿主细胞，其表达本文任一实施方案所述的重组诺如病毒VP1蛋白，或包含本文任一实施方案所述的核酸分子或核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞，例如毕赤酵母细胞。

本申请还提供制备本文第一方面所述重组诺如病毒VP1蛋白的方法，包括步骤：在适合所述蛋白表达的条件下孵育本文任一实施方案所述的宿主细胞，和收集所述蛋白。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括：

（1）通过基因克隆技术构建含所述重组诺如病毒VP1蛋白的编码序列的重组质粒，

（2）将重组质粒转化到工程菌中，筛选表达目的蛋白的菌种，

（3）对筛选出的菌种进行培养，

（4）收集所述蛋白。

在一个或多个实施方案中，所述转化为电转化。

在一个或多个实施方案中，所述工程菌为毕赤酵母菌，优选地，所述工程菌为毕赤酵母GS115。

在一个或多个实施方案中，步骤（2）还包括采用甲醇进行诱导表达检测。

在一个或多个实施方案中，所述步骤（3）包括在一定条件下培养菌体；优选地，所述条件为：YPD液体培养基，培养温度30±1℃，保持DO大于20%，培养至菌体密度在OD₆₀₀大于2.0以上。

在一个或多个实施方案中，步骤（3）所述发酵包括4个阶段，分别为基础培养基培养阶段、甘油补料培养阶段、甲醇诱导阶段和收获放罐阶段。

优选地，所述基础培养基培养阶段的培养参数为：温度30±1℃，DO保持在20-30%；所述甘油补料培养阶段培养条件为：补料培养3~4h左右，菌体湿重到150 g/L左右；所述甲醇诱导阶段包括步骤：检测甲醇含量，调节补料速度，持续发酵至菌体湿重300-350 g/L。

本发明还提供一种免疫原性组合物，其含有（1）本文任一实施方案所述的重组诺如病毒VP1蛋白或重组病毒颗粒，和（2）药学上可接受的辅料。

本发明还提供一种疫苗，其含有（1）本文任一实施方案所述的重组诺如病毒VP1蛋白、重组病毒颗粒、核酸分子或核酸构建物，和（2）药学上可接受的辅料。

本发明还提供本文任一实施方案所述的重组诺如病毒VP1蛋白、重组病毒颗粒、核酸分子或核酸构建物在制备用于预防诺如病毒感染的药物中的用途。

本发明还提供一种免疫哺乳动物对抗重组病毒颗粒感染的方法，该方法包括给予个体致免疫量的本文任一实施方案所述的重组蛋白、重组病毒颗粒、核酸分子或核酸构建物。在一个或多个实施方案中，所述哺乳动物是小鼠、大兔或人。

本发明优点：发明首次发现诺如病毒特定基因型VP1蛋白（如GII.3的VP1）可以通过基因工程技术，与其他基因型的VP1蛋白序列重组，改造构建新型类病毒颗粒。新构建的嵌合诺如病毒类病毒颗粒结构稳定，而且具有良好的免疫原性，为开发诺如病毒疫苗提供一个切实可行的途径。

附图说明

图1：嵌合GII.3设计原理示意图。

图2：SDS-PAGE电泳分析纯化后GII.3和嵌合GII.3-1、GII.3-17、GII3-2、GII.3-4、GII.3-6的VP1蛋白。

图3：SEC-HPLC分析纯化后GII.3和嵌合GII.3-1、GII.3-17、GII.3-2、GII.3-4、GII.3-6的VP1蛋白纯度。

图4：DLS分析纯化后GII.3和嵌合GII.3-1、GII.3-17、GII.3-2、GII.3-4、GII.3-6的VP1的聚集程度。

图5：TEM分析GII.3和嵌合GII.3-1的VP1的形态。

图6：嵌合GII.3-1 VLPs与PGM的结合力。

图7：嵌合GII.3-1 VLPs免疫小鼠的血清IgG抗体滴度水平。

图8：嵌合GII.3-1 VLPs免疫小鼠的血清阻断效果。

具体实施方式

本发明首次发现诺如病毒特定基因型VP1蛋白（如GII.3的VP1）可以通过基因工程技术，与其他基因型的VP1蛋白序列重组，将GII.3的S内壳替换为其它基因型的内壳，改造构建新型类病毒颗粒。新构建的嵌合诺如病毒类病毒颗粒结构稳定，均一性好，避免了类病毒颗粒蛋白降解，而且具有良好的免疫原性，为疫苗抗原的制备奠定良好基础。

重组蛋白

本发明提供一种重组蛋白。本发明的重组蛋白，结构稳定，而且组装成的嵌合类病毒颗粒均一性高，具有良好的抗原性的免疫原性，能解决单一蛋白易降解、变性聚集、组装成的类病毒颗粒不完整、或均一性差等问题。

本发明第一方面提供一种重组蛋白，包含S’区域和P’区域，在一个或多个实施方案中，S’区域位于P’区域的N端，S’区域与P’区域操作性连接。所述重组蛋白是病毒衣壳蛋白VP1，优选地，所述重组蛋白是诺如病毒的衣壳蛋白VP1。

在一个或多个实施方案中，所述S’区域是以下任一种基因型病毒的S区域：（1）GI.1、（2）GII.2、（3）GII.4、（4）GII.6、（5）GII.17。在一个或多个实施方案中，GI.1诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:1的第1-211所示。在一个或多个实施方案中，GII.2诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:2的第1-208所示。在一个或多个实施方案中，GII.4诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:4的第1-208所示。在一个或多个实施方案中，GII.6诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:5的第1-207所示。在一个或多个实施方案中，GII.17诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:6的第1-208所示。

本文所述“S区域”、“S’区域”、“P区域”、或“P’区域”是指病毒VP1衣壳蛋白的壳域（Shell domain，S区）或突出域（Protruding domain，P区），S区由衣壳蛋白的前225个氨基酸组成，形成病毒内壳，围绕病毒RNA。P区由剩余的氨基酸组成，进一步分为两个亚区P1区和P2区。

在一个或多个实施方案中，所述S’区域的序列如SEQ ID NO:1的第1-n位氨基酸所示，n是211-251的整数；所述S’区域的序列如SEQ ID NO:5的第1-n位氨基酸所示，n是207-251的整数；或者，所述S’区域的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的第1-n位氨基酸所示，n是208-251的整数。

在一个或多个实施方案中，当S区域是GI.1基因型的S区域时，所述S区域是SEQ IDNO:1序列的具有第1-211位氨基酸的截短变体。

在一个或多个实施方案中，当S区域是GII.2基因型的S区域时，所述S区域是SEQID NO:2序列的具有第1-208位氨基酸的截短变体。

在一个或多个实施方案中，当S区域是GII.4基因型的S区域时，所述S区域具有SEQID NO:4序列的具有第1-208位氨基酸的截短变体。

在一个或多个实施方案中，当S区域是GII.6基因型的S区域时，所述S区域具有SEQID NO:5序列的具有第1-207位氨基酸的截短变体。

在一个或多个实施方案中，当S区域是GII.17基因型的S区域时，所述S区域具有SEQ ID NO:6序列的具有第1-208位氨基酸的截短变体。

在一个或多个实施方案中，所述P区域是病毒GII.3基因型的P区域，优选地，所述P区域是（a）SEQ ID NO:3序列的具有第209-548位氨基酸的截短变体；或是（b）与（a）的序列具有至少70%序列相同性并保留（a）所述序列功能的序列。

在一个或多个实施方案中，所述操作性连接是由多个氨基酸组成的铰链区连接。优选地，所述多个氨基酸的个数为8个。

在一个或多个实施方案中，所述重组蛋白具有：（1）SEQ ID NO:7-11中任一序列所示，（2）与（1）具有99%、95%、90%、80%、70%或50%相同性的序列。

本发明还提供嵌合病毒类病毒颗粒，其包含本发明第一方面所述的重组蛋白，在一个或多个实施方案中，所述重组蛋白是病毒衣壳蛋白VP1，优选地，所述重组蛋白是诺如病毒的衣壳蛋白VP1。在一个或多个实施方案中，所述嵌合病毒类病毒颗粒是嵌合诺如病毒类病毒颗粒。

在一个或多个实施方案中，所述嵌合病毒类病毒颗粒还包括病毒颗粒所需的其他蛋白，包括但不限于强碱性微小结构蛋白VP2。

核酸

本发明所用术语“核酸”或“核苷酸”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。在两种或多种多肽或核酸分子序列中，术语“相同性”或“相同性百分数”指在比较窗口或指定区域上，采用本领域已知方法如序列比较算法，通过手工比对和目测检查来比较和比对最大对应性时，两个或多个序列或子序列相同或其中在指定区域有一定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同）。例如，适合测定序列相同性百分数和序列相似性百分数的优选算法是BLAST和BLAST 2.0算法，分别可参见Altschul等（1977） Nucleic Acids Res.25:3389和Altschul等（1990） J. Mol. Biol. 215:403。

本发明提供的核酸分子，其包括（1）本文任一实施方案所述的重组诺如病毒VP1蛋白的编码序列，或（2）（1）的互补序列。如本领域技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，可制得极大量的核酸，它们全部编码本发明的重组诺如病毒VP1蛋白。因此，在已鉴定特定氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸。所以，本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的核酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

核酸构建物

本发明在获得编码重组蛋白的核苷酸序列后，将编码所述重组蛋白的核苷酸序列纳入表达载体，得到重组表达载体。本文所用的术语“表达载体”和“重组载体”可互换使用，指本领域熟知的原核或真核载体，例如细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体，这些载体能够在宿主体内复制和稳定表达，这些重组载体的一个重要特征是通常含有表达控制序列。本文所用术语“表达控制序列”指调控目的基因的转录、翻译和表达的可以与目的基因操作性连接的元件，可以是复制起点、启动子、标记基因或翻译控制元件，包括增强子、操纵子、终止子、核糖体结合位点等，表达控制序列的选择取决于所用的宿主细胞。在本发明中适用的重组载体包括但不限于类病毒颗粒。在重组表达载体中，“操作性连接”是指目的的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接。本领域的技术人员熟知能用于构建含本发明融合蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体的方法。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列（在某些实施方案中总称为“侧翼序列”）通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的蛋白的核酸的多连接子区和可选标记元件。

载体可任选地含有“标签”编码序列，即位于融合多肽的5'或3'末端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列编码聚组氨酸（诸如6His）或另一种“标签”，诸如FLAG、HA或myc。此标签在表达多肽时典型地与多肽融合，且可充当用于从宿主细胞亲和力纯化或检测蛋白的一种方式。亲和力纯化例如可通过使用针对此标签的抗体作为亲和力基质的柱色谱法来完成。标签任选地可随后通过诸如使用某些用于裂解的肽酶的各种方式从经过纯化的蛋白除去。

侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即，来自除宿主细胞物种或菌株以外的物种)、杂合的(即，来自一种以上来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然的。同样地，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或无脊椎动物生物体或任何植物，条件是侧翼序列在宿主细胞机制中起作用且可由宿主细胞机制活化。

可选的标记基因编码对于在选择性培养基中生长的宿主细胞的存活和生长而言必要的一种蛋白质。典型的选择标记基因编码(a)赋予对于抗生素或其它毒素(例如，对于原核宿主细胞而言为氨苄青霉素、四环素或卡那霉素)的抗性；(b)补足细胞的营养缺陷型；或(c)提供无法从复合物或确定的培养基获得的重要营养素的蛋白质。特异性的可选标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利的是，新霉素抗性基因也可以用于在原核和真核宿主细胞中进行选择。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTR和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。在一个或多个实施方案中，表达载体可采用市售的pCDF载体，无其他特殊要求。示例性地，采用HindIII和XhoI分别对编码所述光学探针的核苷酸序列和表达载体进行双酶切，然后将二者的酶切产物连接得到重组表达载体。本发明对酶切和连接的具体步骤和参数没有特殊限定，采用本领域常规的步骤和参数即可。

细胞

在获得重组表达载体后，将该载体转化到工程菌中，在一个或多个实施方案中，工程菌是毕赤酵母GS115菌株，用含遗传霉素的YPD平板进行抗性筛选。将筛选高水平表达目标蛋白的菌种进行高密度培养和发酵，放罐收获菌体。在一个或多个实施方案中，所述转化为电转化。在一个或多个实施方案中，所述步骤（3）包括在一定条件下培养菌体；优选地，所述条件为：YPD液体培养基，培养温度30±1℃，保持DO大于20%，培养至菌体密度在OD₆₀₀大于2.0以上。在一个或多个实施方案中，步骤（3）所述发酵包括4个阶段，分别为基础培养基培养阶段、甘油补料培养阶段、甲醇诱导阶段和收获放罐阶段。

优选地，所述基础培养基培养阶段的培养参数为：温度30±1℃，DO保持在20-30%；所述甘油补料培养阶段培养条件为：补料培养3~4h左右，菌体湿重到150 g/L左右；所述甲醇诱导阶段包括步骤：检测甲醇含量，调节补料速度，持续发酵至菌体湿重300-350 g/L。发酵技术也可参考专利CN200810212868.2和CN200510025862，公布了重组毕赤酵母的高密度发酵工艺。

收获的菌体还包括纯化和质量分析步骤，VLPs的纯化技术在公开文献中多有报道（如专利CN 114085273 A），对所得类病毒颗粒进行质量分析的方法本领域已知，例如通过蛋白分析法定量、通过SDS-PAGE分析纯度。

理想的宿主细胞应满足易于获取和增殖两个条件。本发明的“宿主细胞”可为原核细胞和真核细胞，包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。所述宿主细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用。本文中，宿主细胞是指能够表达本文任一实施方案所述的重组诺如病毒VP1蛋白，或包含本文任一实施方案所述的核酸分子或核酸构建物的细胞，例如毕赤酵母细胞。本文所述宿主细胞不包括植物细胞或动物的受精卵。

转化宿主细胞后，获得的转化子可以用常规方法培养，以允许其表达本文所述的诺如病毒的VP1蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。可利用本领域已知的各种分离方法分离和纯化本文的VP1蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的，包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC）和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

因此，本文也包括含本文所述蛋白或其编码序列或表达载体的宿主细胞。这种宿主细胞可组成型表达本文所述的蛋白，也可在一定的诱导条件下表达本文所述的蛋白，还可以在不同的宿主细胞类型中特异性表达本文所述的蛋白。如何使宿主细胞组成型表达、诱导表达或特异性表达本发明蛋白的方法是本领域周知的。例如，在某些实施方案中，使用诱导型启动子构建本发明的表达载体，从而实现蛋白的诱导表达。在某些实施方案中，使用组织特异性表达启动子或将蛋白的编码序列与组织特异性基因关联，实现蛋白的组织特异性表达。示例性地的宿主细胞是酵母细胞；优选地，所述酵母细胞是毕赤酵母细胞。

药物组合物及其制备

所述重组蛋白、重组病毒类病毒颗粒或核酸构建物可用作疫苗，进一步含有佐剂如基于铝的佐剂（氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝）。本发明的重组蛋白、重组病毒类病毒颗粒或核酸构建物和疫苗可通过将类病毒颗粒分散到适宜的药学上可接受的辅料而典型地形成。所述辅料包括但不限于稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。辅料优选地在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，例如：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。在某些实施方案中，组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的物质。这些物质为现有技术已知。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。也可以存在疫苗中常用的添加剂，例如稳定剂如乳糖或山梨糖醇和佐剂如磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝、CpG、单磷酰基脂A、QS21、MF59或硬脂酰酪氨酸。对于被动保护，免疫抗体是通过用本发明的重组蛋白、重组病毒类病毒颗粒或核酸构建物制成的疫苗来免疫哺乳动物，然后从哺乳动物回收免疫抗体来生产的。本发明还提供了通过给予免疫有效量的本发明的组合物来免疫对象抵抗病毒感染的方法，该方法包括给予个体致免疫量的本文任一实施方案所述的重组蛋白、重组病毒颗粒、核酸分子或核酸构建物。在一个或多个实施方案中，所述哺乳动物是小鼠、大兔或人。术语“有效量”是指可实现治疗、预防、缓解和/或缓解本文所述受试者的疾病或状况的剂量。本文有效量指能使免疫对象抵抗病毒感染的剂量。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。

实施例

实施例1，诺如类病毒颗粒（VLPs）的制备

1.1嵌合类病毒颗粒VP1蛋白的设计

本发明通过对VP1蛋白序列和结构分析，设计新的嵌合GII3 VP1蛋白，涉及使用不同基因型VP1蛋白（如GI.1/GII.2/GII.4/GII.6/GII.17）N端的片段，如（1-207/208/209/210/211/214/215…/251）替换GII.3的S结构域序列（如图1所示）。表1列出GI和GII基因型VP1的氨基酸序列号、以及构建的部分嵌合GII.3 VP1的氨基酸序列号。相应的核酸表达序列由DNA合成及分子克隆得到。

新设计的嵌合VP1重组蛋白维持原有蛋白免疫原性，可自组装成纳米颗粒，不易降解且均一性更高。

表1

1.2重组毕赤酵母工程菌的构建

通过基因克隆技术构建野生型GII.3和嵌合GII.3 VP1的重组质粒（均使用pPIC3.5质粒（SNAPGENE公司）和AOX1启动子，启动子序列如SEQ ID NO:12所示），大量抽提后线性化处理，再电转化到毕赤酵母GS115（购自ThermoFisher）。用含1 mg/mL遗传霉素的YPD平板进行抗性筛选，若干个阳性转化子经培养扩增后采用甲醇进行诱导表达检测，优选高水平表达目的蛋白的菌种作为工程菌。

1.3类病毒颗粒蛋白的表达培养

诺如类病毒颗粒是通过毕赤酵母工程菌的高密度培养和发酵得到的。此发酵技术成熟（如专利CN200810212868.2和CN200510025862公布了重组毕赤酵母的高密度发酵工艺）。一般来说，将菌种接种至发酵罐中以基础培养培养扩增菌体，保持一定温度和溶氧，待菌体湿重达到一定量时，添加甲醇诱导，并继续培养，直至菌体湿重达到一定量时，放罐收获菌体。

将培养后的液体菌种转入装有YPD液体培养基的发酵罐中培养，培养温度30±1℃，调节转速和通气保持DO大于20%，培养至菌体密度在OD₆₀₀大于2.0以上。

发酵过程：菌种培养完成后转入发酵罐中开始发酵。毕赤酵母的发酵可分为4个阶段：第一个是基础培养基培养阶段，培养参数为：温度30±1℃，DO保持在20-30%，培养过程中检测甘油浓度，待甘油消耗完后进入第二个阶段甘油补料培养阶段，补加甘油补料培养基，补料培养3~4h左右，待菌体湿重到150 g/L左右时进入第三个阶段即甲醇诱导阶段，加入甲醇诱导诱导培养，培养过程中检测甲醇含量，调节补料速度，持续发酵至菌体湿重300-350 g/L时进入第四个阶段，即收获放罐阶段。

离心菌体收获：放罐后菌悬液使用离心机7000 rpm，离心35 min，倒掉上清，即收集到菌体。

1.4类病毒颗粒的纯化

VLPs的纯化技术在公开文献中多有报道（如专利CN 114085273 A）。将发酵收集的菌体加入裂解液后，以高压均质机破碎菌体，经离心后收集上清。上清液经硫酸铵盐析，离心收集沉淀，沉淀以缓冲液重悬，再经阴离子交换层析分离、分子筛层析分离得到VLPs样品，样品通过蛋白分析法定量、通过SDS-PAGE分析纯度，纯度在90%以上。

实施例2，质量分析

2.1 SDS-PAGE分析

野生型GII.3 VP1蛋白表达存在降解问题。通过基因工程手段用GI.1、GII.2、GII.4、GII.6或GII.17的S壳替换GII.3相应区域，制备嵌合GII.3-1、GII.3-2、GII.3-4、GII.3-6、GII.3-17，然后将纯化得到的野生型和不同嵌合的诺如病毒VP1蛋白通过SDS-PAGE分析蛋白的纯度（图2）。通过比较可以看出野生GII.3 VP1蛋白有明显的蛋白降解条带（图2的星号标示），而不同嵌合GII.3 VP1蛋白均表现出更好的蛋白稳定性和均一性，不存在降解问题。

2.2 SEC-HPLC分析

通过使用分子排阻色谱（SEC-HPLC）对野生GII.3蛋白和嵌合GII.3蛋白进行分析，发现在溶液中，所有嵌合GII.3蛋白与野生GII.3蛋白在HPLC中的峰图类似，反映了结构的相似性（图3）。

2.3动态光散射（Dynamic Light Scattering，DLS）分析

使用DLS对纯化后的蛋白在溶液中的大小进行分析，结果显示GII.3 VP1蛋白组装成平均大小约为45 nm颗粒，分散系数为0.1871；嵌合GII.3-1 VP1蛋白组装成平均大小约为50 nm颗粒，分散系数约为0.0849（图4）。嵌合GII.3-17、GII.3-6、GII.3-2和GII.3-4亦组成纳米颗粒。相比较而言，嵌合GII.3-1形成的纳米颗粒均一性高于其它GII.3纳米颗粒，稳定性更好。这些结果表明，所有5种嵌合VP1蛋白都能稳定表达，组装成与野生型GII.3类似的VLP颗粒。

2.4透射电镜（Transmission Electron Microscope, TEM）分析

使用TEM对野生型及GII.3-1蛋白组装的VLP形态进行分析，进一步发现嵌合GII.3-1 VP1与GII.3的VP1类似，均能正确组装成球形纳米颗粒（图5）。

实施例3，类病毒颗粒与受体结合试验

有文献报道（Lindesmith, L.C., et al., Monoclonal antibody-basedantigenic mapping of norovirus GII.4-2002. J Virol, 2012. 86(2): p. 873-83），证明PGM TypeIII的HBGAs分布，含较高水平的H和A抗原，中等水平的Lewis Y抗原，所以PGM可以替代化学合成的HBGAs作为评价诺如类病毒颗粒VLPs的生物活性。在试验中，将PGM包被于酶标板中，再加入不同浓度的VLPs蛋白与PMG结合，再加入各基因型VLPs蛋白相应的特异性抗体，测量在405 nm的吸光度。以VLPs蛋白浓度为横轴、OD405 nm吸光度为纵轴绘制类病毒颗粒与受体结合效率曲线（图6）。由图6可知，类病毒颗粒与受体结合有良好的浓度依赖关系，而且嵌合GII.3-1和GII.3相比，其与PGM有更高结合效力，证明了嵌合GII.3类病毒颗粒结构的可靠性和完整性。

实施例4，类病毒颗粒在小鼠中的免疫实验

小鼠免疫实验方案：将GII.3和嵌合GII.3-1的VLPs蛋白加入铝佐剂，配制成免疫抗原，选择6-8周龄的Balb/c小鼠进行接种免疫，每组5个小鼠，每次免疫剂量为5μg/剂，分别在0天、28天进行免疫，生理盐水为阴性对照。在免疫前及第42天点抽血评价其蛋白的免疫原性。

实施例5，免疫血清抗体滴度水平评价

将野生GII.3VP1蛋白或嵌合GII.3-1 VP1蛋白用包被缓冲液稀释，包被到96孔酶标板，100 µL/孔，并在37°C孵育后洗板。将小鼠、大兔抗血清以1：100稀释，后2.5倍梯度稀释，稀释8个梯度，再加入酶标板中，每孔50µL，孵育过夜。洗板后，将二抗以1：20000稀释后加入酶标板中，每孔100µL，孵育2小时后洗板，然后加入1 mg/mL的PNPP-Na显色底物，每孔100µL，孵育2小时后，以50μL/孔加入3M NaOH中止反应，上机读取OD405数值。测定孔OD值与阴性孔OD值比值大于或等于2.1判定为阳性，以稀释最大倍数为阳性的稀释度定为每个血清的抗体滴度，并计算每组免疫动物的抗体滴度几何平均值，利用单因素分析不同组别间的统计学意义。由图7，可知嵌合GII.3-1和GII.3疫苗都有较好的免疫原性，免疫二剂后第42天血清IgG抗体滴度水平均显著高于生理盐水阴性对照组，P＜0.05。

实施例6，免疫血清的阻断效果比较

为了评价野生GII.3VLP免疫血清及嵌合GII.3-1VLP免疫血清对结合受体的阻断效果，将10μg/mL的PGM包被于酶标板中，适量稀释的血清样本与0.4μg/mL的VLPs共同孵育后1小时后入到酶标板中与PGM结合，以未加血清样本的VLPs作为对照，再加入经适量稀释的兔抗VLPs抗血清，接着用AP标记的山羊抗兔IgG进行孵育，加入显色底物PNPP-Na经终止后用405 nm波长的酶标仪读数。由图8可知，嵌合GII.3-1相比GII.3免疫小鼠的血清有更高的阻断VLPs与PGM结合效果。

本文序列

SEQ ID NO:1- GI.1 VP1氨基酸序列

MMMASKDATSNVDGASGAGQLVPEANTSDPLAMDPVAGSSTAVATAGQVNPIDPWIINNFVQAPQGEFTISPNNTPGDVLFDLSLGPHLNPFLLHLSQMYNGWVGNMRVRIMLAGNAFTAGKIIVSCIPPGFGSHNLTIAQSTLFPHVIADVRTLDPIEVPLEDVRNVLFHNNDRNQQTMRLVCMLYTPLRTGGGTGDSFVVAGRVMTCPSPDFNFLFLVPPTVEQKTRPFTLPNLPLSSLSNSRAPLPIGSMGISPDNVQSVQFQNGRCTLDGRLVGTTPVSLSQVAKIRGTSNGTVINLTELDGTPFHPFEGPAPIGFPDLGGCDWHVNMTQFGHSSQTQFDVDTTPETFVPHLGSIQANGIGSGNYIGVLSWISPPSHPSGSQVDLWKIPNYGSSVTEATHLAPSVFPPGFGEVLVFFMSKMPGPGAYNLPCLLPQEYISHFASEQAPTVGEAALLHYVDPDTGRNLGEFKAYPDGFLTCVPNGASSGPQQLPINGVFVFVSWVSRFYQLKPVGTASSARGRLGLRR

SEQ ID NO:2- GII.2 VP1氨基酸序列

MKMASNDAAPSTDGAAGLVPESNNEVMALEPVAGAALAAPVTGQTNIIDPWIRANFVQAPNGEFTVSPRNAPGEVLLNLELGPELNPYLAHLARMYNGYAGGMEVQVMLAGNAFTAGKLVFAAVPPHFPVENLSPQQITMFPHVIIDVRTLEPVLLPLPDVRNNFFHYNQKDDPKMRIVAMLYTPLRSNGSGDDVFTVSCRVLTRPSPDFDFTYLVPPTVESKTKPFTLPILTLGELSNSRFPVSIDQMYTSPNEIISVQCQNGRCTLDGELQGTTQLQVSGICAFKGEVTAHLHDNDHLYNVTITNLNGSPFDPSEDIPAPLGVPDFQGRVFGIISQRDKHNSPGHNEPANRGHDAVVPTYTAQYTPKLGQIQIGTWQTDDLTVNQPVKFTPVGLNDTEHFNQWVVPRYAGALNLNTNLAPSVAPVFPGERLLFFRSYIPLKGGYGNPAIDCLLPQEWVQHFYQEAAPSMSEVALVRYINPDTGRALFEAKLHRAGFMTVSSNTSAPVVVPANGYFRFDSWVNQFYSLAPMGTGNGRRRVQ

SEQ ID NO:3- GII.3 VP1氨基酸序列

MKMASNDATPSNDGAAGLVPEINNEAMALDPVAGAAIAAPLTGQQNIIDPWIMNNFVQAPGGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPEINPYLAHLARMYNGYAGGFEVQVVLAGNAFTAGKIIFAAIPPNFPIDNLSAAQITMCPHVIVDVRQLEPVNLPMPDVRNNFFHYNQGSDSRLRLIAMLYTPLRANNSGDDVFTVSCRVLTRPSPEFSFNFLVPPTVESKTKPFTLPILTISEMSNSRFPVPIDSLHTSPTENIVVQCQNGRVTLDGELMGTTQLLPSQICAFRGVLTRSTSRASDQADTATPRLFNYYWHIQLDNLNGTPYDPAEDIPGPLGTPDFRGKVFGVASQRNPDSTTRAHEAKVDTTSGRFTPKLGSLEISTESDDFDQNQPTRFTPVGIGVDHEADFQQWSLPDYSGQFTHNMNLAPAVAPNFPGEQLLFFRSQLPSSGGRSNGILDCLVPQEWVQHFYQESAPAQTQVALVRYVNPDTGRVLFEAKLHKLGFMTIAKNGDSPITVPPNGYFRFESWVNPFYTLAPMGTGNGRRRVQ

SEQ ID NO:4- GII.4 VP1氨基酸序列

MKMASSDANPSDGSAANLVPEVNNEVMALEPVVGAAIAAPVAGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPRNAPGEILWSAPLGPDLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKVIFAAVPPNFPTEGLSPSQVTMFPHIVVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYHYNQSNDPTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPDFDFIFLVPPTVESRTKPFSVPVLTVEEMTNSRFPIPLEKLFTGPSSAFVVQPQNGRCTTDGVLLGTTQLSPVNICTFRGDVTHITGSHNYTMNLASQNWSNYDPTEEIPAPLGTPDFVGKVQGVLTQTTRTDGSTRGHKATVYTGSADFAPKLGRVQFETDTNHDFEANQNTKFTPVGVIQDGGTTHRNEPQQWVLPSYSGRNTPNVHLAPAVAPTFPGEQLLFFRSTMPGCSGYPNMDLDCLLPQEWVQYFYQEAAPAQSDVALLRFVNPDTGRVLFECKLHKSGYVTVAHTGQHDLVIPPNGYFRFDSWVNQFYTLAPMGNGTGRRRAL

SEQ ID NO:5- GII.6 VP1氨基酸序列

MKMASNDAAPSNDGAANLVPEATNEVMALEPVVGASIAAPVVGQQNIIDPWIRENFVQAPQGEFTVSPRNSPGEMLLNLELGPELNPYLSHLSRMYNGYAGGMQVQVVLAGNAFTAGKIIFAAVPPHFPVENISAAQITMCPHVIVDVRQLEPVLLPLPDIRNRFFHYNQENTPRMRLVAMLYTPLRANSGEDVFTVSCRVLTRPAPDFEFTFLVPPTVESKTKPFTLPILTLGELSNSRFPAPIDMLYTDPNEAIVVQPQNGRCTLDGTLQGTTQLVPTQICSFRGTLISQTSRSADSTDSAPRVRNHPLHVQLKNLDGTPYDPTDEVPAVLGAIDFKGTVFGVASQRNTTGNSIGATRAHEVHIDTTNPRYTPKLGSVLMYSESSDFDDGQPTRFTPIGMGADDWHQWELPEYSGHLTLNMNLAPAVAPAFPGERILFFRSVVPSAGGYGSGHIDCLIPQEWVQHFYQEAAPSQSAVALIRYVNPDTGRNIFEAKLHREGFITVANSGNNPIVVPPNGYFRFEAWVNQFYTLTPMGTGQGRRRVQ

SEQ ID NO:6- GII.17 VP1氨基酸序列

MKMASNDAAPSNDGAAGLVPEGNNETLPLEPVAGAAIAAPVTGQNNIIDPWIRTNFVQAPNGEFTVSPKNSPGEILLNLELGPDLNPYLAHLSRMYNGYAGGVEVQVLLAGNAFTAGKILFAAVPPNFPVEFLSPAQITMLPHLIVDVRTLEPIMIPLPDVRNTFFHYSNQPNSRMRLVAMLYTPLRSNGSGDDVFTVSCRVLTRPTPDFEFTYLVPPSVESKTKPFSLPILTLSELTNSRFPVPIDSLFTAQNNVLQVQCQNGRCTLDGELQGTTQLLPSGICAFRGRVTAQINQRDRWHMQLQNLNGTTYDPTDDVPAPLGTPDFKGVVFGMVSQRNVGNDAPGSTRAQQAWVSTYSPQFVPKLGSVNLRISDNDDFQFQPTKFTPVGVNDDDDGHPFRQWELPNYSGELTLNMNLAPPVAPNFPGEQLLFFRSFVPCSGGYNQGIIDCLIPQEWIQHFYQESAPSQSDVALIRYVNPDTGRTLFEAKLHRSGYITVAHSGDYPLVVPANGHFRFDSWVNQFYSLAPMGTGNGRRRAQ

SEQ ID NO:7-嵌合GII.3-1序列

MMMASKDATSNVDGASGAGQLVPEANTSDPLAMDPVAGSSTAVATAGQVNPIDPWIINNFVQAPQGEFTISPNNTPGDVLFDLSLGPHLNPFLLHLSQMYNGWVGNMRVRIMLAGNAFTAGKIIVSCIPPGFGSHNLTIAQSTLFPHVIADVRTLDPIEVPLEDVRNVLFHNNDRNQQTMRLVCMLYTPLRTGGGTGDSFVVAGRVMTCPSEFSFNFLVPPTVESKTKPFTLPILTISEMSNSRFPVPIDSLHTSPTENIVVQCQNGRVTLDGELMGTTQLLPSQICAFRGVLTRSTSRASDQADTATPRLFNYYWHIQLDNLNGTPYDPAEDIPGPLGTPDFRGKVFGVASQRNPDSTTRAHEAKVDTTSGRFTPKLGSLEISTESDDFDQNQPTRFTPVGIGVDHEADFQQWSLPDYSGQFTHNMNLAPAVAPNFPGEQLLFFRSQLPSSGGRSNGILDCLVPQEWVQHFYQESAPAQTQVALVRYVNPDTGRVLFEAKLHKLGFMTIAKNGDSPITVPPNGYFRFESWVNPFYTLAPMGTGNGRRRVQ

SEQ ID NO:8-嵌合GII.3-2序列

MKMASNDAAPSTDGAAGLVPESNNEVMALEPVAGAALAAPVTGQTNIIDPWIRANFVQAPNGEFTVSPRNAPGEVLLNLELGPELNPYLAHLARMYNGYAGGMEVQVMLAGNAFTAGKLVFAAVPPHFPVENLSPQQITMFPHVIIDVRTLEPVLLPLPDVRNNFFHYNQKDDPKMRIVAMLYTPLRSNGSGDDVFTVSCRVLTRPSPEFSFNFLVPPTVESKTKPFTLPILTISEMSNSRFPVPIDSLHTSPTENIVVQCQNGRVTLDGELMGTTQLLPSQICAFRGVLTRSTSRASDQADTATPRLFNYYWHIQLDNLNGTPYDPAEDIPGPLGTPDFRGKVFGVASQRNPDSTTRAHEAKVDTTSGRFTPKLGSLEISTESDDFDQNQPTRFTPVGIGVDHEADFQQWSLPDYSGQFTHNMNLAPAVAPNFPGEQLLFFRSQLPSSGGRSNGILDCLVPQEWVQHFYQESAPAQTQVALVRYVNPDTGRVLFEAKLHKLGFMTIAKNGDSPITVPPNGYFRFESWVNPFYTLAPMGTGNGRRRVQ

SEQ ID NO:9-嵌合GII.3-4序列

MKMASSDANPSDGSAANLVPEVNNEVMALEPVVGAAIAAPVAGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPRNAPGEILWSAPLGPDLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKVIFAAVPPNFPTEGLSPSQVTMFPHIVVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYHYNQSNDPTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPEFSFNFLVPPTVESKTKPFTLPILTISEMSNSRFPVPIDSLHTSPTENIVVQCQNGRVTLDGELMGTTQLLPSQICAFRGVLTRSTSRASDQADTATPRLFNYYWHIQLDNLNGTPYDPAEDIPGPLGTPDFRGKVFGVASQRNPDSTTRAHEAKVDTTSGRFTPKLGSLEISTESDDFDQNQPTRFTPVGIGVDHEADFQQWSLPDYSGQFTHNMNLAPAVAPNFPGEQLLFFRSQLPSSGGRSNGILDCLVPQEWVQHFYQESAPAQTQVALVRYVNPDTGRVLFEAKLHKLGFMTIAKNGDSPITVPPNGYFRFESWVNPFYTLAPMGTGNGRRRVQ

SEQ ID NO:10-嵌合GII.3-6序列

MKMASNDAAPSNDGAANLVPEATNEVMALEPVVGASIAAPVVGQQNIIDPWIRENFVQAPQGEFTVSPRNSPGEMLLNLELGPELNPYLSHLSRMYNGYAGGMQVQVVLAGNAFTAGKIIFAAVPPHFPVENISAAQITMCPHVIVDVRQLEPVLLPLPDIRNRFFHYNQENTPRMRLVAMLYTPLRANSGEDVFTVSCRVLTRPAPEFSFNFLVPPTVESKTKPFTLPILTISEMSNSRFPVPIDSLHTSPTENIVVQCQNGRVTLDGELMGTTQLLPSQICAFRGVLTRSTSRASDQADTATPRLFNYYWHIQLDNLNGTPYDPAEDIPGPLGTPDFRGKVFGVASQRNPDSTTRAHEAKVDTTSGRFTPKLGSLEISTESDDFDQNQPTRFTPVGIGVDHEADFQQWSLPDYSGQFTHNMNLAPAVAPNFPGEQLLFFRSQLPSSGGRSNGILDCLVPQEWVQHFYQESAPAQTQVALVRYVNPDTGRVLFEAKLHKLGFMTIAKNGDSPITVPPNGYFRFESWVNPFYTLAPMGTGNGRRRVQ

SEQ ID NO:11-嵌合GII.3-17序列

MKMASNDAAPSNDGAAGLVPEGNNETLPLEPVAGAAIAAPVTGQNNIIDPWIRTNFVQAPNGEFTVSPKNSPGEILLNLELGPDLNPYLAHLSRMYNGYAGGVEVQVLLAGNAFTAGKILFAAVPPNFPVEFLSPAQITMLPHLIVDVRTLEPIMIPLPDVRNTFFHYSNQPNSRMRLVAMLYTPLRSNGSGDDVFTVSCRVLTRPTPEFSFNFLVPPTVESKTKPFTLPILTISEMSNSRFPVPIDSLHTSPTENIVVQCQNGRVTLDGELMGTTQLLPSQICAFRGVLTRSTSRASDQADTATPRLFNYYWHIQLDNLNGTPYDPAEDIPGPLGTPDFRGKVFGVASQRNPDSTTRAHEAKVDTTSGRFTPKLGSLEISTESDDFDQNQPTRFTPVGIGVDHEADFQQWSLPDYSGQFTHNMNLAPAVAPNFPGEQLLFFRSQLPSSGGRSNGILDCLVPQEWVQHFYQESAPAQTQVALVRYVNPDTGRVLFEAKLHKLGFMTIAKNGDSPITVPPNGYFRFESWVNPFYTLAPMGTGNGRRRVQ

SEQ ID NO:12-AOX1启动子

agatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcgccataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattcgaa。

Claims

1.一种重组蛋白，其是重组诺如病毒VP1蛋白或与其具有至少80%序列相同性并保留免疫原性的变体，包含S’区域和P’区域，S’区域位于P’区域的N端并与其操作性连接，所述S’区域是以下任一种基因型诺如病毒VP1蛋白的包含S区域的片段：GI.1、GII.2、GII.4、GII.6、GII.17，所述P’区域是GII.3基因型诺如病毒VP1蛋白的P区域。

2. 如权利要求1所述的重组蛋白，其中，所述P’区域的序列如SEQ ID NO:3的第209-548位氨基酸所示或与其具有至少80%序列相同性。

3. 如权利要求1-2中任一项所述的重组蛋白，其中，

GI.1诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:1的第1-211所示，和/或

GII.2诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:2的第1-208所示，和/或

GII.4诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:4的第1-208所示，和/或

GII.6诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:5的第1-207所示，和/或

GII.17诺如病毒VP1蛋白的S区域如SEQ ID NO:6的第1-208所示。

4. 如权利要求1-2中任一项所述的重组蛋白，其中，所述S’区域的序列如SEQ ID NO:1的第1-n位氨基酸所示，n是211-251的整数，或，

所述S’区域的序列如SEQ ID NO:5的第1-n位氨基酸所示，n是207-251的整数，或，

所述S’区域的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的第1-n位氨基酸所示，n是208-251的整数。

5. 如权利要求1-2中任一项所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白具有：

（1）SEQ ID NO:7-9和11中任一序列所示的序列，或

（2）与（1）具有99%、95%、90%、80%、70%或50%相同性的序列。

6.一种类病毒颗粒，其包含权利要求1-5中任一项所述的重组蛋白，所述类病毒颗粒由权利要求1-5中任一项所述的重组蛋白自组装形成。

7. 核酸分子，其包含：

（1）权利要求1-5中任一项所述的重组蛋白的编码序列，或

（2）（1）的互补序列。

8.核酸构建物，其包含权利要求7所述的核酸分子。

9.如权利要求8所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或重组载体。

10.如权利要求8所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是病毒载体。

11.如权利要求10所述的核酸构建物，其特征在于，所述病毒载体是重组病毒载体。

12.一种宿主细胞，其表达权利要求1-5中任一项所述的重组蛋白，或包含权利要求7所述的核酸分子或权利要求8-11中任一项所述的核酸构建物。

13.如权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是酵母细胞。

14.如权利要求13所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是毕赤酵母细胞。

15.制备权利要求1-5中任一项所述重组蛋白的方法，包括步骤：在适合所述蛋白表达的条件下孵育权利要求12所述的宿主细胞，和收集所述蛋白。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）构建含所述重组蛋白的编码序列的载体，

（2）将载体转化到工程菌中，筛选表达所述重组蛋白的菌种，

（3）对筛选出的菌种进行培养，和

（4）收集所述重组蛋白。

17. 一种免疫原性组合物，其含有：

（1）权利要求1-5中任一项所述的重组蛋白和/或权利要求6所述的类病毒颗粒，和

（2）药学上可接受的辅料。

18. 一种疫苗，其含有：

（1）权利要求1-5中任一项所述的重组蛋白、权利要求6所述的类病毒颗粒、权利要求7所述的核酸分子和/或权利要求8-11中任一项所述的核酸构建物，和

（2）药学上可接受的辅料。

19.权利要求1-5中任一项所述的重组蛋白、权利要求6所述的类病毒颗粒、权利要求7所述的核酸分子或权利要求8-11所述的核酸构建物在制备用于预防诺如病毒感染的药物中的用途。