CN115161343B - 一种重组腺病毒表达载体及以其制备的多价诺如病毒疫苗 - Google Patents

一种重组腺病毒表达载体及以其制备的多价诺如病毒疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组腺病毒表达载体，以及以该一种重组腺病毒表达载体为活性成分的多价诺如病毒疫苗。本发明的重组腺病毒表达载体，可同时表达诺如病毒GI.1、GII.3、GII.4、GII.17亚型主要病毒衣壳蛋白VP1，小鼠实验表明该重组腺病毒表达载体可诱导小鼠产生针对以上四种亚型的高滴度特异性结合抗体，这为临床上多价诺如病毒疫苗研发提供一种新的方案并具有开发为多价诺如病毒候选疫苗的潜力。

Description

一种重组腺病毒表达载体及以其制备的多价诺如病毒疫苗
技术领域
本发明涉及医药生物领域中一种重组腺病毒表达载体及以其制备的多价诺如病毒疫苗。
背景技术
诺如病毒是一种RNA病毒，根据RNA聚合酶和衣壳蛋白的序列同源性不同分为7个基因型(I-VII)，即I-VII型诺如病毒(简称为GI、GII、GIII、GIV、GV、GVI、GVII)，GI、GII、GIV主要感染人和非人灵长类，其中，GII是世界范围内最主要的流行株，90％的诺如病毒疫情主要由GII基因型引起。人诺如病毒最早发现于1972年，是引起急性病毒性胃肠炎的主要病原体。诺如病毒各基因型间差异较大，不断进化、突变和重组，新毒株的流行对人类健康造成很大威胁。由于缺乏人诺如病毒体外培养的成熟系统、人诺如病毒的动物感染模型等问题，针对诺如病毒的灭活和减毒疫苗仍不能生产。且广谱疫苗各基因型之间序列只有51％-56％的同源性，没有交叉保护；病毒抗原不断发生突变和重组等也为广谱诺如疫苗带来巨大挑战。使得人诺如疫苗研发面临很多困难，迄今为止仍没有有效的诺如病毒疫苗上市。
发明内容
本发明所要解决的问题是如何制备对多种亚型诺如病毒均有效的疫苗。
本发明的第一个目的是提供一种重组腺病毒表达载体，其为将多种不同亚型诺如病毒的VP1基因序列克隆到同一腺病毒载体中，获得同时表达多个亚型诺如病毒VP1蛋白的的重组腺病毒表达载体。
所述多种不同亚型诺如病毒具体可为3-6种不同亚型诺如病毒。
上述重组腺病毒表达载体中，其具体为将GI.1VP1基因序列、GII.3VP1基因序列、GII.4VP1基因序列、GII.17VP1基因序列全部或部分克隆到同一腺病毒载体中，获得表达全部或部分GI.1VP1蛋白、GII.3VP1蛋白、GII.4VP1蛋白和GII.17VP1蛋白的重组腺病毒表达载体；
所述GI.1VP1蛋白的序列为序列表的序列2；
所述GII.3VP1蛋白的序列为序列表的序列3；
所述GII.4VP1蛋白的序列为序列表的序列4；
所述GII.17VP1蛋白的序列为序列表的序列5。
上述重组腺病毒表达载体中，所述GI.1VP1基因序列的基因Bank收录号为KT943503.1；所述GII.3VP1基因序列的基因Bank收录号为KJ499444.1；所述GII.4VP1基因序列在基因Bank收录号为KC631827.1的基因序列的基础上，将编码其表达的蛋白序列第309位丝氨酸的密码子核苷酸AGC替换为天冬酰胺的密码子核苷酸AAC；所述GII.17VP1基因序列的基因Bank收录号为KP698928.1。
上述重组腺病毒表达载体中，所述将GI.1VP1基因序列、GII.3VP1基因序列、GII.4VP1基因序列、GII.17VP1基因序列克隆到同一腺病毒载体中，按照如下任一方式进行：
1)将GI.1VP1基因序列、GII.3VP1基因序列、GII.4VP1基因序列、GII.17VP1基因序列两两连接得到两种蛋白的融合基因序列，再将两种融合基因序列先后克隆到同一腺病毒载体中；
2)将GI.1VP1基因序列、GII.3VP1基因序列、GII.4VP1基因序列、GII.17VP1基因序列中的任三种连接得到三种蛋白的融合基因序列，再将融合基因序列和余下的一种基因序列先后克隆到同一腺病毒载体中；
3)将GI.1VP1基因序列、GII.3VP1基因序列、GII.4VP1基因序列、GII.17VP1基因序列分别克隆到同一腺病毒载体中。
上述重组腺病毒表达载体中，所述腺病毒载体可为不同血清型腺病毒载体，例如AdC68(为E1、E3区均部分删除的复制缺陷型腺病毒载体)、AdHu5、AdHu26、AdC6等。
上述重组腺病毒表达载体中，所述克隆到同一腺病毒载体中，连接位置可为E1、E3、E4等中的任一个或多个。
上述重组腺病毒表达载体中，所述重组腺病毒表达载体具体为：将GI.1VP1基因序列、GII.3VP1基因序列去除终止密码子后连接得到融合基因序列一，将GII.4VP1基因序列、GII.17VP1基因序列去除终止密码子后连接得到融合基因序列二；将融合基因序列一连接到AdC68XY4载体的E1区，将融合基因序列二连接到AdC68XY4载体的E3区，获得的表达GI.1VP1蛋白、GII.3VP1蛋白、GII.4VP1蛋白和GII.17VP1蛋白的重组腺病毒表达载体；所述融合基因序列一为编码GI.1VP1蛋白和GII.3VP1蛋白的核苷酸序列；所述融合基因序列二为编码GII.4VP1蛋白和GII.17VP1蛋白的核苷酸序列。
上述重组腺病毒表达载体中，所述去除终止密码子后连接，为以通过F2A序列的编码序列连接。
上述重组腺病毒表达载体中，所述融合基因序列一和所述融合基因序列二均进行密码子人源优化。
上述重组腺病毒表达载体中，所述融合基因序列一为如序列表序列1第1446-4784位所示的核苷酸序列，所述融合基因序列二为如序列表序列1第29495-32839位所示的核苷酸序列。
上述重组腺病毒表达载体中，所示重组表达腺病毒的核苷酸序列如序列表的序列1所示，共37221bp，其中，第1446-4784位为GI.1VP1、GII.3VP1融合基因序列，位于AdC68XY4载体的E1区；第29495-32839位为GII.4VP1、GII.17VP1融合基因序列，位于AdC68XY4载体的E3区。
本发明的第二个目的是提供一种多价诺如病毒疫苗，其为利用所述的重组腺病毒表达载体包装得到。
上述多价诺如病毒疫苗，它的活性成分为所述的重组腺病毒表达载体或所述重组腺病毒。
上述多价诺如病毒疫苗可用于预防和/或治疗诺如病毒引起的急性病毒性胃肠炎。使用时可单次或多次免疫，每次免疫剂量可为1.7×109vp(virus partical)/kg体重。
上述多价诺如病毒疫苗优选为四价诺如病毒疫苗。
本发明的第三个目的是提供多价诺如病毒疫苗的制备方法，包括将所述的重组腺病毒表达载体或所述重组腺病毒作为活性成分，和佐剂以一定比例混合，得到的多价诺如病毒疫苗。
本发明的第四个目的是提供应用，具体为所述的重组腺病毒表达载体在制备治疗和/或预防诺如病毒所致疾病产品中的应用，
或，所述的重组腺病毒表达载体在制备诺如病毒抗血清中的应用，
或，所述重组腺病毒在制备治疗和/或预防诺如病毒所致疾病产品中的应用，
或，所述重组腺病毒在制备治疗和/或预防诺如病毒所致疾病产品中的应用。
在本发明中，我们以复制缺陷型黑猩猩型腺病毒载体为平台，成功构建了四价诺如病毒疫苗AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17。Western Blot结果表明该四价诺如病毒疫苗可同时表达诺如病毒GI.1、GII.3、GII.4、GII.17亚型主要病毒衣壳蛋白VP1。在小鼠体内，进一步评价了其是否能够引起有效的免疫反应，结果表明该疫苗可诱导小鼠产生针对以上四种亚型的高滴度特异性结合抗体，这为临床上多价诺如病毒疫苗研发提供一种新的方案并具有开发为多价诺如病毒候选疫苗的潜力。
附图说明
图1为本发明实施例1中四种腺病毒质粒及四种腺病毒基因组酶切鉴定示意图。其中，图1的A为四种重组腺病毒质粒酶切后的1％琼脂糖凝胶电泳图，图1的B为四种重组腺病毒基因组酶切后的1％琼脂糖凝胶电泳图。图中，M为GeneStar 1kb ladder，BglII为以BglII酶切，MfeI为以MfeI酶切，XhoI为以XhoI酶切。
图2为本发明实施例1中各种腺病毒感染HEK293细胞后的VP1蛋白表达检测结果图。其中，图2的A为用Anti-GI.1抗体检测VP1蛋白表达的结果图；图2的B为用Anti-GII.3抗体检测VP1蛋白表达的结果图；图2的C为用Anti-GII.4抗体检测VP1蛋白表达的结果图；图2的D为用Anti-GII.17抗体检测VP1蛋白表达的结果图。图中，M为蛋白marker。
图3为本发明实施例1中夹心ELISA法检测各亚型诺如病毒结合抗体及分型的结果图。其中，图3的A为对各亚型诺如病毒VLP特异性的总IgG抗体水平；图3的B为对各亚型诺如病毒VLP特异性的IgG1抗体水平；图3的C为对各亚型诺如病毒VLP特异性的IgG2a抗体水平；图3的D为对各亚型诺如病毒VLP特异性的IgG2b抗体水平。图中，GI.1为GI.1VLP，GII.3为GII.3VLP，GII.4为GII.4VLP，GII.17为GII.17VLP。
图4为本发明实施例1中夹心ELISA法检测各亚型诺如病毒结合抗体滴度的结果图。其中，图4的A为对GI.1VLP特异性的IgG抗体滴度结果；图4的B为对GII.3VLP特异性的IgG抗体滴度结果；图4的C为对GII.4VLP特异性的IgG抗体滴度结果；图4的D为对GII.17VLP特异性的IgG抗体滴度结果。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为3，以One-wayANOVA分析各组显著性差异，ns代表无显著性差异，**代表显著性分析结果为P<0.01，***代表显著性分析结果为P<0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1质粒载体
以下实施例中的pShuttle是穿梭载体，为宝生物产品，货号PT3414-1(092412)。
以下实施例中的AdC68XY4载体为E1、E3区均部分删除的复制缺陷型腺病毒质粒载体，构建方法记载于专利申请文件“腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用(申请号：201910777937.2，申请公布号：CN 112410375)”，公众可从苏州相奕生物技术有限公司获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
2菌株
以下实施例中的大肠杆菌DH5α(MD101-1)为新赛美生物技术有限公司产品。
3细胞株
以下实施例中的人胚肾细胞株HEK 293为ATCC产品。
4实验动物
以下实施例中C57BL/6雌性小鼠为标准品系，为上海吉辉实验动物饲养有限公司产品。
5酶和抗体
NheI酶(R3131S)、KpnI酶(R3142S)、PI-SceI酶(R0696S)、I-ceuI酶(R0699S)、BglII酶(R0144S)、MfeI酶(R3589S)、XhoI酶(R0146S)和PacI酶(R0547S)均为NEB公司产品。
Anti-GI.1(mouse serum)和Anti-GII.3(mouse serum)均为金斯瑞生物科技有限公司产品。
Anti-GII.4(GeneTex rabbitpolyclonal antibody：GTX134380)和Anti-GII.17(GeneTex rabbitpolyclonal antibody：GTX134382)均为GeneTex公司产品。
anti-mouse-H&L-HRP(SAB4600082)为Sigma-Aldrich公司产品。
anti-rabbit-H&L-HRP(SA00001-2)和goat-anti-mouse-IgG-HRP(SA00001-1)均为Proteintech公司产品。
human-anti-mouse-IgG1-HRP(1071-05)、human-anti-mouse-IgG2a-HRP(1080-05)和human-anti-mouse-IgG2b-HRP(1091-05)均为Sourthern Biotechnology公司产品。
6分子生物学试剂
以下实施例中的FBS(胎牛血清)(04-001-1ACS)为Biological Industries公司产品。
以下实施例中的转染试剂X-tremeGENE(6366236001)为Roche公司产品。
以下实施例中的DNeasy Tissue Kit为QIAGEN,Valencia,CA产品。
7培养基
以下实施例中的DMEM培养基(SH30243.01)为Hyclone公司产品。
以下实施例中的无血清无抗生素的DMEM培养基为在DMEM培养基中不添加血清和抗生素。
以下实施例中的含5％FBS、1％双抗的DMEM培养基为在DMEM基础培养基中添加FBS和双抗(青霉素和链霉素)得到的液体培养基。所述含5％FBS、1％双抗的DMEM培养基中FBS的体积百分含量为5％，双抗(青霉素和链霉素)的质量百分含量为1％。
下述实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的所有数据均采用One-way ANOVA进行显著性分析。
实施例1
1、重组腺病毒AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17的构建：
从NCBI GeneBank中获得以下四种诺如病毒VP1基因序列：NorovirusGI.1strain，TF1/USA/2008(GenBank:KT943503.1，updated on 29-MAR-2016)；NorovirusGII.3strain，GII/Hu/HKG/2014/GII.3/CUHK-NS-227(GenBank:KJ499444.1，updated on12-MAY-2014)；Norovirus GII.4strain，Norovirus Hu/GII.4/Hong Kong/CUHK6080/2012/CHN(GenBank:KC631827.1，updated on 05-JUN-2013),其中编码第309位丝氨酸的密码子作了点突变，由AGC(编码丝氨酸)变为AAC(编码天冬酰胺)，即S309N；NorovirusGII.17strain，GII/Hu/HKG/2014/GII.17/CUHK-NS-491(GenBank:KP698928.1，updated on08-MAR-2016)。将GI.1VP1基因序列(Norovirus GI.1strain)去除终止密码子后与GII.3VP1基因序列(Norovirus GII.3strain)通过F2A序列的编码序列连接形成GI.1-F2A-GII.3融合基因序列。在该序列上游均加上Kozak序列且并引入NheI酶识别位点，在序列终止密码子下游引入KpnI酶识别位点。将设计的以上序列人源优化后，得到GI.1-F2A-GII.3密码子人源优化基因序列。
将GII.4VP1基因序列(Norovirus GII.4strain，带有S309N点突变)去除终止密码子后与GII.17VP1基因序列(Norovirus GII.17strain)通过F2A序列的编码序列连接，形成GII.4-F2A-GII.17融合基因序列。在序列上游均加上Kozak序列且并引入NheI酶识别位点，在序列终止密码子下游引入KpnI酶识别位点。将设计的以上序列人源优化后，得到GII.4-F2A-GII.17密码子人源优化基因序列。
由金斯瑞生物股份技术有限公司合成GI.1-F2A-GII.3密码子人源优化基因片段和GII.4-F2A-GII.17密码子人源优化基因片段。
将合成的GI.1-F2A-GII.3密码子人源优化基因片段通过NheI酶和KpnI酶双酶切连接的方法克隆至穿梭载体pShuttle上，获得pShuttle-CMV-GI.1-GII.3；将合成的GII.4-F2A-GII.17密码子人源优化基因片段通过NheI酶和KpnI酶双酶切连接的方法克隆至穿梭载体pShuttle上，获得pShuttle-CMV-GII.4-GII.17。
以稀有酶PI-SceI酶和I-ceuI酶分别双酶切pShuttle-CMV-GI.1-GII.3和AdC68XY4载体，然后通过T4 DNA连接酶连接，获得E1区表达GI.1VP1蛋白和GII.3VP1蛋白的腺病毒质粒，命名为AdC68-GI.1-GII.3(E1)。
以稀有酶PI-SceI酶和I-ceuI酶分别双酶切pShuttle-CMV-GII.4-GII.17和AdC68XY4载体，然后通过T4 DNA连接酶连接，获得E1区表达GII.4VP1蛋白和GII.17VP1蛋白的腺病毒质粒，命名为AdC68-GII.4-GII.17(E1)。
通过设计携带AdC68 E3区SWAI酶切位点处同源臂的引物，以pShuttle-CMV-GII.4-GII.17为模板进行PCR扩增，将得到的PCR产物与SWAI酶切的AdC68XY4载体进行同源重组，实现将GII.4-GII.17表达框以同源重组的方式无缝克隆至AdC68XY4载体的E3区，获得E3区表达GII.4-GII.17的腺病毒质粒，命名为AdC68-GII.4-GII.17(E3)。所用引物为：
正向引物：5’-cactgcgacaacgactatttaaatcgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatca-3’；
反向引物：5’-tgggcatgtattgtggatttctgctattgtcttcccaatcctcc-3’。
将以上获得的PCR产物与SWAI酶切质粒AdC68-GI.1-GII.3(E1)，进行同源重组，实现将GII.4-GII.17表达框以同源重组的方式无缝克隆至AdC68-GI.1-GII.3(E1)质粒的E3区，获得E3区表达GII.4-GII.17的腺病毒质粒，命名为AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17(核苷酸序列如序列表的序列1所示)。序列表序列1中，第1446-4784位为GI.1VP1基因与GII.3VP1基因所形成的融合基因(记为GI.1-GII.3)，编码GI.1VP1蛋白(氨基酸序列如序列2所示)和GII.3VP1蛋白(氨基酸序列如序列3所示)。序列表序列1中，第29495-32839位为GII.4VP1基因与GII.17VP1基因所形成的融合基因(记为GII.4-GII.17)，编码GII.4VP1蛋白(氨基酸序列如序列4所示)和GII.17VP1蛋白(氨基酸序列如序列5所示)。
将质粒AdC68-GI.1-GII.3(E1)、AdC68-GII.4-GII.17(E1)、AdC68-GII.4-GII.17(E3)和AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17分别都用BglII酶，MfeI酶，XhoI酶进行酶切鉴定，结果如图1的A所示，酶切条带符合预期，进一步送至金唯智公司测序，确定无碱基发生突变。
2、重组腺病毒AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17的包装，扩增，纯化及滴度测定：
用PacI酶酶切步骤1获得的腺病毒质粒AdC68XY4，AdC68-GI.1-GII.3(E1)，AdC68-GII.4-GII.17(E1)，AdC68-GII.4-GII.17(E3)及AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17各6μg。将质粒线性化后65℃灭活30分钟，使PacI酶失活。提前一天铺HEK293细胞于6孔板中，所用培养基为DMEM完全培养基，待细胞汇合至70％-80％，将培养基换成无血清无抗生素的DMEM培养基，分别转染上述5种质粒，转染试剂X-tremeGENE与线性化质粒的质量比为1:1，即转染6μg质粒需6μl转染试剂。转染6-8小时后，换液为含5％FBS、1％双抗的DMEM培养基。当60％-80％细胞发生病变飘起来的时候，收集细胞和上清，在-80℃与室温之间反复冻融3次，3000rpm，离心5分钟，去除细胞碎片后，将上清感染至新的HEK293细胞，感染24小时后，按上述方法收集后再以合适的比例进行新一轮感染，最终扩增感染至35盘150mm2的HEK293细胞，收集所有细胞，重悬于10ml无血清无抗生素的DMEM培养基中，在-80℃与室温之间反复冻融3次，3000rpm，离心5分钟，去除细胞碎片后，采用氯化铯密度梯度离心法进行腺病毒纯化。
按上述方法，转染质粒AdC68XY4后得到的是AdC68XY4病毒，转染质粒AdC68-GI.1-GII.3(E1)后得到的是AdC68-GI.1-GII.3(E1)病毒，转染质粒AdC68-GII.4-GII.17(E1)后得到的是AdC68-GII.4-GII.17(E1)病毒，转染质粒AdC68-GII.4-GII.17(E3)后得到的是AdC68-GII.4-GII.17(E3)病毒，转染质粒AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17后得到的是AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17病毒。
将纯化后的5种腺病毒用Nanodrop分光光度计测得A260的吸光值，腺病毒粒子数(vp/ml)即为A260的数值乘以1.1×1012。
用DNeasy Tissue Kit(QIAGEN,Valencia,CA)试剂盒分别提取AdC68XY4病毒，AdC68-GI.1-GII.3(E1)病毒，AdC68-GII.4-GII.17(E1)病毒，AdC68-GII.4-GII.17(E3)病毒及AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17病毒的基因组DNA，并再次用BglII酶、MfeI酶、XhoI酶切鉴定，进一步检测获得的腺病毒是否发上重组或突变，结果如图1的B所示，条带正确无误。
3、重组腺病毒AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17的表达分析：
提前一天铺HEK293细胞于6孔板中，每孔1×106个细胞。第二天将五种腺病毒以每孔5×109vp剂量分别感染HEK293细胞，进行如下5组处理：
AdC68XY4：以AdC68XY4病毒感染HEK293细胞；
AdC68-GI.1-GII.3(E1)(对照组)：以AdC68-GI.1-GII.3(E1)病毒感染HEK293细胞；
AdC68-GII.4-GII.17(E1)：以AdC68-GII.4-GII.17(E1)病毒感染HEK293细胞；
AdC68-GII.4-GII.17(E3)(二价对照组)：以AdC68-GII.4-GII.17(E3)病毒感染HEK293细胞；
AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17(四价处理组)：以AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17病毒感染HEK293细胞。
各个处理感染前将培养基换为含5％FBS、1％双抗的DMEM培养基。在24小时后，收集所有细胞，PBS洗2次，各个处理每个样品加入200μlRIPA裂解液(已加入蛋白酶抑制剂)，冰上裂解20分钟后，4℃，12000rpm离心20分钟，取上清。分别加入还原性loadingbuffer，然后金属浴100℃10分钟，等样品冷却后瞬离，进行Westernblot检测：样品上10％分离胶，电泳结束后转印至PVDF膜上，快速封闭液(新赛美生物技术公司)室温封闭10分钟，TBST洗5次，分别用1:1000稀释的Anti-GI.1(mouse serum)、Anti-GII.3(mouse serum)、Anti-GII.4(GeneTexrabbitpolyclonal antibody：GTX134380)、Anti-GII.17(GeneTexrabbitpolyclonal antibody：GTX134382)抗体室温孵育2小时，1:5000稀释的anti-mouse-H&L-HRP或anti-rabbit-H&L-HRP二抗直接室温孵育1小时，TBST洗5次，进行化学发光检测Nivolumab蛋白表达。
检测结果见图2，四价处理组AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17与二价对照组AdC68-GII.4-GII.17(E3)相比，可同时检测到GI.1，GII.3，GII.4，GII.17的VP1的表达，蛋白条带在55-70KD之间，与目的蛋白大小一致。且四价处理组的VP1蛋白表达量与二价对照组相比，并无减弱。为进一步分析克隆在E1区或E3区的GII.4-GII.17是否会因为区域不同，表达量产生区别，从图2的C和图2的D结果可看出，在E3区表达GII.4，GII.17VP1蛋白与在E1区表达量相当，说明四价的重组腺病毒E3区表达GII.4，GII.17VP1蛋白设计是可行的，可同时实现四种型别的VP1蛋白高效表达。
4、重组腺病毒疫苗AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17免疫效果检测：
C57BL/6雌性小鼠共20只，6-8周龄，每只体重18±2g，分为4组，分别以下四种腺病毒免疫(由于步骤3的Westernblot试验表明GII.4-GII.17在E3区表达与E1区相当，为与四价疫苗一致，选择在E3区表达GII.4-GII.17的二价疫苗作为对照进行免疫)：
AdC68XY4(对照)：每只小鼠肌肉注射100μl含有5×1010vp AdC68XY4病毒(稀释液用PBS)的溶液；
AdC68-GI.1-GII.3：每只小鼠肌肉注射100μl含有5×1010vp AdC68-GI.1-GII.3(E1)病毒(稀释液用PBS)的溶液；
AdC68-GII.4-GII.17(二价对照组)：每只小鼠肌肉注射100μl含有5×1010vpAdC68-GII.4-GII.17(E3)病毒(稀释液用PBS)的溶液；
AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17(四价处理组)：每只小鼠肌肉注射100μl含有5×1010vp AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17病毒(稀释液用PBS)的溶液。
分别在免疫2周、4周、6周，通过颌下静脉丛进行采血。分离的血清56℃灭活30分钟，冻存-80℃备用，之后进行抗体检测。
4.1免疫2周和4周后特异性结合抗体及分型检测
将免疫2周和4周的血清通过夹心ELISA法检测针对各个亚型诺如病毒的结合抗体及分型，探究四价疫苗能否引起体内免疫反应。具体如下：
分别用50ng/well的GI.1VLP蛋白、GII.3VLP蛋白、GII.4VLP蛋白、GII.17VLP蛋白(VLP蛋白是由VP1形成的病毒样颗粒VLP(Virus likepartical，使用的为毕赤酵母系统纯化的VLP)包被ELISA板，100μl/well，4℃过夜，PBST洗5次，加入5％牛奶，200μl/well，37℃封闭2小时，PBST洗5次。免疫2周和4周的血清用PBS进行1:300稀释。以上稀释的血清100μl/well，37℃孵育2小时，PBST洗5次。分别用100μl/well 1:10000稀释的goat-anti-mouse-IgG-HRP(标为IgG)、human-anti-mouse-IgG1-HRP(标为IgG1)、human-anti-mouse-IgG2a-HRP(标为IgG2a)、human-anti-mouse-IgG2b-HRP(标为IgG2b)，37℃孵育1小时后，PBST洗5次。每孔加入50μl TMB显色，待呈现明显梯度变化后，每孔加入50μl 2M磷酸终止液终止颜色反应，检测OD450读值。针对上面用的4种抗原均做抗体分型检测，相同样品做的复板，分别孵育不同的二抗，检测该血清样品中抗体亚型。
结果如图3所示：免疫2周以后，与对照组相比，二价疫苗AdC68-GI.1-GII.3，AdC68-GII.4-GII.17，与四价疫苗AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17均产生了针对GI.1、GII.3、GII.4、GII.17结合抗体，且四价疫苗AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17诱导的总IgG水平与相应的二价疫苗水平相当(图3的A)。图3的B和图3的C表明，疫苗免疫组没有产生对各亚型诺如病毒特异性IgG1，IgG2a的分型抗体。图3的D表明，与对照组相比，疫苗免疫组对各亚型诺如病毒均产生了较高水平特异性的IgG2b的分型抗体。二价疫苗与四价疫苗免疫组，针对GII.3和GII.17在4周时抗体水平都有所提高。以上分型抗体结果表明四价疫苗与二价疫苗相比，能显著激活针对四种亚型诺如病毒的Th1免疫反应。
4.2重组腺病毒疫苗免疫6周后特异性结合抗体终点滴度检测
将免疫6周的血清通过夹心ELISA法检测针对各个亚型诺如病毒的结合抗体终点滴度。
分别用50ng/well的GI.1VLP蛋白、GII.3VLP蛋白、GII.4VLP蛋白、GII.17VLP蛋白包被ELISA板，100μl/well，4℃过夜，PBST洗5次，加入5％牛奶，200μl/well，37℃封闭2小时，PBST洗5次。免疫6周的血清从1:200起始以2倍梯度稀释，稀释至1028倍，共稀释至8个梯度。以上稀释的血清100μl/well,37℃孵育2小时，PBST洗5次。分别用100μl/well 1:10000稀释的goat-anti-mouse-IgG-HRP(标为IgG)、human-anti-mouse-IgG1-HRP(标为IgG1)、human-anti-mouse-IgG2a-HRP(标为IgG2a)、human-anti-mouse-IgG2b-HRP(标为IgG2b)，37℃孵育1小时后,PBST洗5次。每孔加入50μlTMB显色，待呈现明显梯度变化后，每孔加入50μl 2M磷酸终止液终止颜色反应，检测OD450读值。针对上面用的4种抗原均做抗体分型检测，相同样品做的复板，分别孵育不同的二抗，检测该血清样品中抗体亚型。
结果如图4所示：四价疫苗组AdC68-GI.1-GII.3-GII.4-GII.17针对GI.1的特异性结合抗体滴度与二价疫苗组AdC68-GI.1-GII.3抗体滴度没有显著性差异(图4的A)。图4的B表明，四价疫苗引起的对GII.3的特异性结合抗体滴度，与二价疫苗AdC68-GII.4-GII.17抗体滴度有显著性差异，且与二价疫苗AdC68-GI.1-GII.3抗体滴度没有显著性差异。图4的C和图4的D表明，四价疫苗对GII.4、GII.17的特异性结合抗体滴度，与二价疫苗AdC68-GI.1-GII.3抗体滴度有显著性差异，且与二价疫苗AdC68-GII.4-GII.17抗体滴度没有显著性差异。
目前，人诺如病毒疫苗研发的主要方向为重组蛋白亚单位疫苗，P颗粒疫苗和重组腺病毒载体疫苗，大部分是基于GI.1，GII.4的单价或双价疫苗。腺病毒作为疫苗载体具有易于操作，可插入外源基因容量大，感染细胞范围广，安全性高，能同时激活体液和细胞免疫反应等多种优势，广泛应用于临床及临床前研究，其中应用最多的是AdHu5和AdHu2型腺病毒载体。由于人群中普遍存在对以上人型腺病毒的中和抗体，会在一定程度上削弱其效果，所以为避免预存中和抗体的影响，本发明中我们选择黑猩猩型腺病毒载体，经过改造，可同时表达四种亚型诺如病毒主要衣壳蛋白VP1，且如图2所示该蛋白大小与目的蛋白大小一致。并且小鼠仅单次免疫即可在2周检测到针对四种亚型诺如病毒的特异性结合抗体(图3)。尤其在免疫6周后(图4)，四价重组腺病毒诺如疫苗免疫组结合抗体终点滴度与相对应的二价疫苗免疫对照组没有显著性差异。在此基础上，后续会进一步检测阻断抗体的情况来深入评价该疫苗功能，这将为临床上多价诺如病毒疫苗研发提供一种新的方案。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本发明欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本发明中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 苏州相奕生物技术有限公司
<120> 一种重组腺病毒表达载体及以其制备的多价诺如病毒疫苗
<130> GNCSY211192
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37221
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taaccatctt caataatata cctcaaactt tttgtgcgcg ttaatatgca aatgaggcgt 60
ttgaatttgg ggaggaaggg cggtgattgg tcgagggatg agcgaccgtt aggggcgggg 120
cgagtgacgt tttgatgacg tggttgcgag gaggagccag tttgcaagtt ctcgtgggaa 180
aagtgacgtc aaacgaggtg tggtttgaac acggaaatac tcaattttcc cgcgctctct 240
gacaggaaat gaggtgtttc tgggcggatg caagtgaaaa cgggccattt tcgcgcgaaa 300
actgaatgag gaagtgaaaa tctgagtaat ttcgcgttta tggcagggag gagtatttgc 360
cgagggccga gtagactttg accgattacg tgggggtttc gattaccgtg tttttcacct 420
aaatttccgc gtacggtgtc aaagtccggt gtttttacgt acgatatcat ttccccgaaa 480
gtgccacctg accgtaacta taacggtcct aaggtagcga aagctcagat ctcccgatcc 540
cctatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatctgct 600
ccctgcttgt gtgttggagg tcgctgagta gtgcgcgagc aaaatttaag ctacaacaag 660
gcaaggcttg accgacaatt gcatgaagaa tctgcttagg gttaggcgtt ttgcgctgct 720
tcgcgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta 780
atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac 840
ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac 900
gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt 960
acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat 1020
tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga 1080
ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt 1140
ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca 1200
ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg 1260
tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta 1320
tataagcaga gctctctggc taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa 1380
tacgactcac tatagggaga cccaagctgg ctagcgttta aacgggcccg cccgggcgcg 1440
ccaccatgat gatggcctct aaggacgcca catctagcgt ggatggcgct tctggcgctg 1500
gacagctggt ccctgaggtg aatgccagtg atcctctggc tatggaccct gtggccggca 1560
gcagtacagc cgtggccacc gccggccagg tcaaccccat cgacccctgg atcattaaca 1620
atttcgttca agctcctcag ggcgagttca ccatttctcc aaacaacacc cctggcgacg 1680
tgctgttcga cctgtctctg ggccctcacc tgaacccttt tctgctgcac ctcagccaga 1740
tgtacaacgg atgggtggga aacatgcggg tgcggatcat gctggccggc aacgccttca 1800
ccgccggcaa aatcatcgtg agctgcatcc cccctggctt tggcagccac aacctgacca 1860
tcgcccaggc cacactgttt cctcacgtca tcgctgatgt gcgcaccctg gaccccatcg 1920
aggtgcccct ggaagatgtg cggaatgtgc tgttccacaa caacgacaga aaccagcaaa 1980
ccatgagact ggtgtgtatg ctgtacaccc cactgagaac cggcggagga acaggcgata 2040
gcttcgtggt ggccggcaga gttatgacat gtccttctcc cgacttcaac ttcctgtttc 2100
tggtgccacc aaccgtggaa cagaaaacaa gacctttcac cctgcctaac ctgccactga 2160
gcagcctgtc caactcccgg gcccctctgc ctatcagcag catgggaatc tctcccgaca 2220
acgtgcagag cgtgcaattt cagaacggca gatgcaccct cgacggcaga ctggtgggca 2280
ctaccccagt gagcctgagc catgtggcca agatcagagg aacaagcaac ggcacagtga 2340
tcaatctgac cgagctggat ggcacacctt tccacccctt cgagggcccc gcccctatcg 2400
gcttccctga tctcggcggc tgcgactggc acatcaacat gacccagttc ggccacagct 2460
ctcagaccca gtacgacgtg gacacaaccc ctgacacctt cgtgccacat ctgggcagca 2520
tccaggccaa tggaatcggc agcggcaact acgtgggcgt gctgagctgg atcagccctc 2580
ctagccaccc tagcggcagc caggtcgacc tgtggaagat tcccaattat ggcagcagca 2640
tcaccgaggc cacacacctg gccccatcag tgtacccccc cggcttcggc gaagtgctgg 2700
tttttttcat gagcaagatg cctggtcctg gcgcttataa cctgccgtgc ctgctgcctc 2760
aggagtacat cagccacctg gcatctgaac aggcccctac cgtgggagaa gctgcactgc 2820
tccactacgt ggaccctgac accggcagaa atctggggga gttcaaggcc taccctgatg 2880
gattcctgac ctgcgtgcct aacggcgcca gctccggccc ccagcagctg cctatcaacg 2940
gcgtgttcgt gttcgtgtcc tgggtctcca gattctacca gctgaagcct gtgggcaccg 3000
cctcttccgc cagaggccgg ctgggtctga ggcggagaaa gcgccggtcc ggatctggag 3060
caccagtgaa gcagaccctg aatttcgatc tgctgaagct ggccggcgac gtggagtcca 3120
acccaggacc cgccaccatg aagatggcct ccaacgatgc cacaccttct aatgacggag 3180
cagcaggact ggtgccagag atcaacaatg aggccatggc cctggatcct gtggcaggcg 3240
ccgcaatcgc agcaccactg acaggccagc agaacatcat cgacccctgg atcatgaaca 3300
attttgtgca ggcacctgga ggagagttca ccgtgtcccc caggaactct cctggcgagg 3360
tgctgctgaa tctggagctg ggcccagaga tcaaccccta cctggcccac ctggcccgca 3420
tgtacaatgg ctatgcagga ggattcgagg tgcaggtggt gctggccgga aacgccttta 3480
cagccggcaa gatcatcttc gccgccatcc cccctaactt tccaatcgac aatctgtccg 3540
ccgcccagat caccatgtgc ccacacgtga tcgtggacgt gaggcagctg gagcccgtga 3600
atctgcctat gccagatgtg cgcaacaatt tctttcacta caaccaggga agcgactcca 3660
ggctgagact ggtggccatg ctgtataccc ctctgcgggc caacaatagc ggcgacgacg 3720
tgttcaccgt gagctgtcgg gtgctgacaa gacccagccc tgagttttcc ttcaattttc 3780
tggtgccacc cacagtggag tctaagacca agccttttac actgccaatc ctgaccatca 3840
gcgagatgtc taacagccgg ttcccagtgc ccatcgattc tctgcacacc agccccacag 3900
agaacatcgt ggtgcagtgc cagaatggca gagtgaccct ggacggcgag ctgatgggca 3960
ccacacagct gctgcccagc cagatctgtg cctttagggg cgtgctgacc aggtccacat 4020
ctagggcctc cgatcaggca gacaccgcaa cacctaggct gttcaactac tattggcaca 4080
tccagctgga taacctgaat ggcacacctt acgatccagc agaggacatc cctggaccac 4140
tgggcacccc agacttcaga ggcaaggtgt ttggcgtggc cagccagagg aatcctgatt 4200
ccaccacaag ggcacacgag gcaaaggtgg acaccacagc aggcaggttc accccaaagc 4260
tgggaagcct ggagatctct acagagagcg gcgattttga ccagaaccag cccacccgct 4320
tcacacctgt gggcatcggc gtggatcacg aggccgactt tcagcagtgg tccctgcctg 4380
attattctgg ccagttcacc cacaacatga atctggcccc agccgtggcc cccaattttc 4440
ctggagaaca gctgctgttc tttcggtctc agctgccctc ctctggcggc agaagcaacg 4500
gcatcctgga ctgcctggtg cctcaggaat gggtccagca cttctaccag gagtccgccc 4560
cagcacagac acaggtggcc ctggtgaggt acgtgaatcc cgataccggc cgcgtgctgt 4620
ttgaggccaa gctgcacaag ctgggcttca tgaccatcgc caagaacggc gactccccca 4680
tcacagtgcc tccaaatggc tacttcagat ttgagtcttg ggtgaaccct ttctataccc 4740
tggcccctat gggcacaggc aacggcagaa ggcgcgtgca gtgaggcccg ggcaagctta 4800
agtttaaacc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 4860
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aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 4980
gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg 5040
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ccttgcagca ggtgctgccg accgcggcgc cgcgccgggg gttcaagcgc gagggcgagg 18300
atctgtaccc caccatgcag ctgatggtgc ccaagcgcca gaagctggaa gacgtgctgg 18360
agaccatgaa ggtggacccg gacgtgcagc ccgaggtcaa ggtgcggccc atcaagcagg 18420
tggccccggg cctgggcgtg cagaccgtgg acatcaagat tcccacggag cccatggaaa 18480
cgcagaccga gcccatgatc aagcccagca ccagcaccat ggaggtgcag acggatccct 18540
ggatgccatc ggctcctagt cgaagacccc ggcgcaagta cggcgcggcc agcctgctga 18600
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gctttgcaga tcaatggccc tcacatgccg ccttcgcgtt cccattacgg gctaccgagg 18900
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ccactgagac acacttggaa acatcttgta ataaaccaat ggactctgac gctcctggtc 19140
ctgtgatgtg ttttcgtaga cagatggaag acatcaattt ttcgtccctg gctccgcgac 19200
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ccggctccgt ggagatgccg caggtggagg aggagctgcc tcccctggac aagcggggcg 19560
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cgtacgagga ggcggtgaaa ctgggtctgc ccaccacgcg gcccatcgcg cccctggcca 19680
ccggggtgct gaaacccgaa aagcccgcga ccctggactt gcctcctccc cagccttccc 19740
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tgtgtgtgta tgtattatgt cgccgccgcc gctgtccacc agaaggagga gtgaagaggc 19980
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atcgccggac aggacgcttc ggagtacctg agtccgggtc tggtgcagtt tgcccgcgcc 20100
acagacacct acttcagtct ggggaacaag tttaggaacc ccacggtggc gcccacgcac 20160
gatgtgacca ccgaccgcag ccagcggctg acgctgcgct tcgtgcccgt ggaccgcgag 20220
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tggacatata aagccgatgg tgaaactgcc acagaaaaaa cctatacata tggaaatgca 20460
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cagccaatct acgcagataa aacctatcag cctgaacctc aagtgggtga tgctgaatgg 20580
catgacatca ctggtactga tgaaaagtat ggaggcagag ctcttaagcc tgataccaaa 20640
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ctgcccacca acaccaacac ctacgattac atgaacggcc gggtggtggc gccctcgctg 21480
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cccttcaacc accaccgcaa tgcggggctg cgctaccgct ccatgctcct gggcaacggg 21600
cgctacgtgc ccttccacat ccaggtgccc cagaaatttt tcgccatcaa gagcctcctg 21660
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gatgagactg gtggccatgc tgtatacacc cctgagatct aacggcagtg gcgacgacgt 31800
gttcaccgtg agctgtcggg tgctgaccag acccacacct gactttgagt tcacctatct 31860
ggtgccaccc tccgtggagt ctaagacaaa gcctttctct ctgccaatcc tgaccctgag 31920
cgagctgaca aattccaggt ttccagtgcc catcgacagc ctgttcacag cccagaacaa 31980
tgtgctgcag gtgcagtgcc agaacggccg ctgtaccctg gatggcgagc tgcagggcac 32040
cacacagctg ctgccatccg gcatctgtgc ctttagggga agggtgaccg cacagatcaa 32100
ccagcgggac agatggcaca tgcagctgca gaacctgaat ggcaccacat acgacccaac 32160
cgacgatgtg cctgcaccac tgggcacacc tgacttcaag ggcgtggtgt tcggcatggt 32220
gtcccagagg aacgtgggca atgacgcacc aggatctacc agggcacagc aggcctgggt 32280
gagcacatat tccccccagt tcgtgcctaa gctgggctcc gtgaacctga ggatctctga 32340
taatgacgat tttcagttcc agcctaccaa gtttacacca gtgggcgtga atgacgatga 32400
cgatggccac cctttccgcc agtgggagct gccaaactac agcggcgagc tgaccctgaa 32460
catgaatctg gcccctccag tggcccccaa ttttcctgga gaacaattac tgttctttag 32520
atctttcgtg ccttgcagcg gcggctataa ccagggcatc atcgactgtc tgatccctca 32580
ggagtggatc cagcactttt accaggagtc cgccccatcc cagtctgatg tggccctgat 32640
cagatatgtg aatccagaca ccggacgcac actgttcgag gcaaagctgc accggtccgg 32700
ctacatcaca gtggcccact ctggcgacta tccactggtg gtgcccgcca acggccactt 32760
tagattcgat agctgggtga atcagttcta ctccctggcc ccaatgggca ccggaaacgg 32820
cagaaggcgc gcacagtgag gtaccaagct taagtttaaa ccgctgatca gcctcgactg 32880
tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 32940
aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 33000
gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 33060
aagacaatag cagatttaaa tatgactgac ccactggcca acaacaacgt caacgacctt 33120
ctcctggaca tggacggccg cgcctcggag cagcgactcg cccaacttcg cattcgccag 33180
cagcaggaga gagccgtcaa ggagctgcag gatgcggtgg ccatccacca gtgcaagaga 33240
ggcatcttct gcctggtgaa acaggccaag atctcctacg aggtcactcc aaacgaccat 33300
cgcctctcct acgagctcct gcagcagcgc cagaagttca cctgcctggt cggagtcaac 33360
cccatcgtca tcacccagca gtctggcgat accaaggggt gcatccactg ctcctgcgac 33420
tcccccgact gcgtccacac tctgatcaag accctctgcg gcctccgcga cctcctcccc 33480
atgaactaat caccccctta tccagtgaaa taaagatcat attgatgatg attttacaga 33540
aataaaaaat aatcatttga tttgaaataa agatacaatc atattgatga tttgagttta 33600
acaaaaaaat aaagaatcac ttacttgaaa tctgatacca ggtctctgtc catgttttct 33660
gccaacacca cttcactccc ctcttcccag ctctggtact gcaggccccg gcgggctgca 33720
aacttcctcc acacgctgaa ggggatgtca aattcctcct gtccctcaat cttcatttta 33780
tcttctatca gatgtccaaa aagcgcgtcc gggtggatga tgacttcgac cccgtctacc 33840
cctacgatgc agacaacgca ccgaccgtgc ccttcatcaa cccccccttc gtctcttcag 33900
atggattcca agagaagccc ctgggggtgt tgtccctgcg actggccgac cccgtcacca 33960
ccaagaacgg ggaaatcacc ctcaagctgg gagagggggt ggacctcgat tcctcgggaa 34020
aactcatctc caacacggcc accaaggccg ccgcccctct cagtttttcc aacaacacca 34080
tttcccttaa catggatcac cccttttaca ctaaagatgg aaaattatcc ttacaagttt 34140
ctccaccatt aaatatactg agaacaagca ttctaaacac actagcttta ggttttggat 34200
caggtttagg actccgtggc tctgccttgg cagtacagtt agtctctcca cttacatttg 34260
atactgatgg aaacataaag cttaccttag acagaggttt gcatgttaca acaggagatg 34320
caattgaaag caacataagc tgggctaaag gtttaaaatt tgaagatgga gccatagcaa 34380
ccaacattgg aaatgggtta gagtttggaa gcagtagtac agaaacaggt gttgatgatg 34440
cttacccaat ccaagttaaa cttggatctg gccttagctt tgacagtaca ggagccataa 34500
tggctggtaa caaagaagac gataaactca ctttgtggac aacacctgat ccatcaccaa 34560
actgtcaaat actcgcagaa aatgatgcaa aactaacact ttgcttgact aaatgtggta 34620
gtcaaatact ggccactgtg tcagtcttag ttgtaggaag tggaaaccta aaccccatta 34680
ctggcaccgt aagcagtgct caggtgtttc tacgttttga tgcaaacggt gttcttttaa 34740
cagaacattc tacactaaaa aaatactggg ggtataggca gggagatagc atagatggca 34800
ctccatatac caatgctgta ggattcatgc ccaatttaaa agcttatcca aagtcacaaa 34860
gttctactac taaaaataat atagtagggc aagtatacat gaatggagat gtttcaaaac 34920
ctatgcttct cactataacc ctcaatggta ctgatgacag caacagtaca tattcaatgt 34980
cattttcata cacctggact aatggaagct atgttggagc aacatttggg gctaactctt 35040
ataccttctc atacatcgcc caagaatgaa cactgtatcc caccctgcat gccaaccctt 35100
cccaccccac tctgtggaac aaactctgaa acacaaaata aaataaagtt caagtgtttt 35160
attgattcaa cagttctaca tgggggtaga gtcataatcg tgcatcagga tagggcggtg 35220
gtgctgcagc agcgcgcgaa taaactgctg ccgccgccgc tccgtcctgc aggaatacaa 35280
catggcagtg gtctcctcag cgatgattcg caccgcccgc agcataaggc gccttgtcct 35340
ccgggcacag cagcgcaccc tgatctcact taaatcagca cagtaactgc agcacagcac 35400
cacaatattg ttcaaaatcc cacagtgcaa ggcgctgtat ccaaagctca tggcggggac 35460
cacagaaccc acgtggccat cataccacaa gcgcaggtag attaagtggc gacccctcat 35520
aaacacgctg gacataaaca ttacctcttt tggcatgttg taattcacca cctcccggta 35580
ccatataaac ctctgattaa acatggcgcc atccaccacc atcctaaacc agctggccaa 35640
aacctgcccg ccggctatac actgcaggga accgggactg gaacaatgac agtggagagc 35700
ccaggactcg taaccatgga tcatcatgct cgtcatgata tcaatgttgg cacaacacag 35760
gcacacgtgc atacacttcc tcaggattac aagctcctcc cgcgttagaa ccatatccca 35820
gggaacaacc cattcctgaa tcagcgtaaa tcccacactg cagggaagac ctcgcacgta 35880
actcacgttg tgcattgtca aagtgttaca ttcgggcagc agcggatgat cctccagtat 35940
ggtagcgcgg gtttctgtct caaaaggagg tagacgatcc ctactgtacg gagtgcgccg 36000
agacaaccga gatcgtgttg gtcgtagtgt catgccaaat ggaacgccgg acgtagtcat 36060
atttcctgaa gcaaaaccag gtgcgggcgt gacaaacaga tctgcgtctc cggtctcgcc 36120
gcttagatcg ctctgtgtag tagttgtagt atatccactc tctcaaagca tccaggcgcc 36180
ccctggcttc gggttctatg taaactcctt catgcgccgc tgccctgata acatccacca 36240
ccgcagaata agccacaccc agccaaccta cacattcgtt ctgcgagtca cacacgggag 36300
gagcgggaag agctggaaga accatgtttt ttttttttat tccaaaagat tatccaaaac 36360
ctcaaaatga agatctatta agtgaacgcg ctcccctccg gtggcgtggt caaactctac 36420
agccaaagaa cagataatgg catttgtaag atgttgcaca atggcttcca aaaggcaaac 36480
ggccctcacg tccaagtgga cgtaaaggct aaacccttca gggtgaatct cctctataaa 36540
cattccagca ccttcaacca tgcccaaata attctcatct cgccaccttc tcaatatatc 36600
tctaagcaaa tcccgaatat taagtccggc cattgtaaaa atctgctcca gagcgccctc 36660
caccttcagc ctcaagcagc gaatcataac agtcagcctt accagtaaaa aagaaaacct 36720
attaaaaaaa caccactcga cacggcacca gctcaatcag tcacagtgta aaaaagggcc 36780
aagtgcagag cgagtatata taagcttacc gagcagcagc acacaacagg cgcaagagtc 36840
agagaaaggc tgagctctaa cctgtccacc cgctctctgc tcaatatata gcccagatct 36900
acactgacgt aaaggccaaa gtctaaaaat acccgccaaa taatcacaca cgcccagcac 36960
acgcccagaa accggtgaca cactcaaaaa aatacgcgca cttcctcaaa cgcccaaaac 37020
tgccgtcatt tccgggttcc cacgctacgt catcaaaaca cgactttcaa attccgtcga 37080
ccgttaaaaa cgtcacccgc cccgccccta acggtcgccc gtctctcagc caatcagcgc 37140
cccgcatccc caaattcaaa cacctcattt gcatattaac gcgcacaaaa agtttgaggt 37200
atattattga tgatggttaa t 37221
<210> 2
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Met Met Ala Ser Lys Asp Ala Thr Ser Ser Val Asp Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gly Gln Leu Val Pro Glu Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu Ala
20 25 30
Met Asp Pro Val Ala Gly Ser Ser Thr Ala Val Ala Thr Ala Gly Gln
35 40 45
Val Asn Pro Ile Asp Pro Trp Ile Ile Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro
50 55 60
Gln Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp Val Leu
65 70 75 80
Phe Asp Leu Ser Leu Gly Pro His Leu Asn Pro Phe Leu Leu His Leu
85 90 95
Ser Gln Met Tyr Asn Gly Trp Val Gly Asn Met Arg Val Arg Ile Met
100 105 110
Leu Ala Gly Asn Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile Val Ser Cys Ile
115 120 125
Pro Pro Gly Phe Gly Ser His Asn Leu Thr Ile Ala Gln Ala Thr Leu
130 135 140
Phe Pro His Val Ile Ala Asp Val Arg Thr Leu Asp Pro Ile Glu Val
145 150 155 160
Pro Leu Glu Asp Val Arg Asn Val Leu Phe His Asn Asn Asp Arg Asn
165 170 175
Gln Gln Thr Met Arg Leu Val Cys Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Thr
180 185 190
Gly Gly Gly Thr Gly Asp Ser Phe Val Val Ala Gly Arg Val Met Thr
195 200 205
Cys Pro Ser Pro Asp Phe Asn Phe Leu Phe Leu Val Pro Pro Thr Val
210 215 220
Glu Gln Lys Thr Arg Pro Phe Thr Leu Pro Asn Leu Pro Leu Ser Ser
225 230 235 240
Leu Ser Asn Ser Arg Ala Pro Leu Pro Ile Ser Ser Met Gly Ile Ser
245 250 255
Pro Asp Asn Val Gln Ser Val Gln Phe Gln Asn Gly Arg Cys Thr Leu
260 265 270
Asp Gly Arg Leu Val Gly Thr Thr Pro Val Ser Leu Ser His Val Ala
275 280 285
Lys Ile Arg Gly Thr Ser Asn Gly Thr Val Ile Asn Leu Thr Glu Leu
290 295 300
Asp Gly Thr Pro Phe His Pro Phe Glu Gly Pro Ala Pro Ile Gly Phe
305 310 315 320
Pro Asp Leu Gly Gly Cys Asp Trp His Ile Asn Met Thr Gln Phe Gly
325 330 335
His Ser Ser Gln Thr Gln Tyr Asp Val Asp Thr Thr Pro Asp Thr Phe
340 345 350
Val Pro His Leu Gly Ser Ile Gln Ala Asn Gly Ile Gly Ser Gly Asn
355 360 365
Tyr Val Gly Val Leu Ser Trp Ile Ser Pro Pro Ser His Pro Ser Gly
370 375 380
Ser Gln Val Asp Leu Trp Lys Ile Pro Asn Tyr Gly Ser Ser Ile Thr
385 390 395 400
Glu Ala Thr His Leu Ala Pro Ser Val Tyr Pro Pro Gly Phe Gly Glu
405 410 415
Val Leu Val Phe Phe Met Ser Lys Met Pro Gly Pro Gly Ala Tyr Asn
420 425 430
Leu Pro Cys Leu Leu Pro Gln Glu Tyr Ile Ser His Leu Ala Ser Glu
435 440 445
Gln Ala Pro Thr Val Gly Glu Ala Ala Leu Leu His Tyr Val Asp Pro
450 455 460
Asp Thr Gly Arg Asn Leu Gly Glu Phe Lys Ala Tyr Pro Asp Gly Phe
465 470 475 480
Leu Thr Cys Val Pro Asn Gly Ala Ser Ser Gly Pro Gln Gln Leu Pro
485 490 495
Ile Asn Gly Val Phe Val Phe Val Ser Trp Val Ser Arg Phe Tyr Gln
500 505 510
Leu Lys Pro Val Gly Thr Ala Ser Ser Ala Arg Gly Arg Leu Gly Leu
515 520 525
Arg Arg
530
<210> 3
<211> 548
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Lys Met Ala Ser Asn Asp Ala Thr Pro Ser Asn Asp Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Leu Val Pro Glu Ile Asn Asn Glu Ala Met Ala Leu Asp Pro Val
20 25 30
Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ala Pro Leu Thr Gly Gln Gln Asn Ile Ile
35 40 45
Asp Pro Trp Ile Met Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro Gly Gly Glu Phe
50 55 60
Thr Val Ser Pro Arg Asn Ser Pro Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Glu
65 70 75 80
Leu Gly Pro Glu Ile Asn Pro Tyr Leu Ala His Leu Ala Arg Met Tyr
85 90 95
Asn Gly Tyr Ala Gly Gly Phe Glu Val Gln Val Val Leu Ala Gly Asn
100 105 110
Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile Phe Ala Ala Ile Pro Pro Asn Phe
115 120 125
Pro Ile Asp Asn Leu Ser Ala Ala Gln Ile Thr Met Cys Pro His Val
130 135 140
Ile Val Asp Val Arg Gln Leu Glu Pro Val Asn Leu Pro Met Pro Asp
145 150 155 160
Val Arg Asn Asn Phe Phe His Tyr Asn Gln Gly Ser Asp Ser Arg Leu
165 170 175
Arg Leu Val Ala Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ser Gly
180 185 190
Asp Asp Val Phe Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Ser Pro
195 200 205
Glu Phe Ser Phe Asn Phe Leu Val Pro Pro Thr Val Glu Ser Lys Thr
210 215 220
Lys Pro Phe Thr Leu Pro Ile Leu Thr Ile Ser Glu Met Ser Asn Ser
225 230 235 240
Arg Phe Pro Val Pro Ile Asp Ser Leu His Thr Ser Pro Thr Glu Asn
245 250 255
Ile Val Val Gln Cys Gln Asn Gly Arg Val Thr Leu Asp Gly Glu Leu
260 265 270
Met Gly Thr Thr Gln Leu Leu Pro Ser Gln Ile Cys Ala Phe Arg Gly
275 280 285
Val Leu Thr Arg Ser Thr Ser Arg Ala Ser Asp Gln Ala Asp Thr Ala
290 295 300
Thr Pro Arg Leu Phe Asn Tyr Tyr Trp His Ile Gln Leu Asp Asn Leu
305 310 315 320
Asn Gly Thr Pro Tyr Asp Pro Ala Glu Asp Ile Pro Gly Pro Leu Gly
325 330 335
Thr Pro Asp Phe Arg Gly Lys Val Phe Gly Val Ala Ser Gln Arg Asn
340 345 350
Pro Asp Ser Thr Thr Arg Ala His Glu Ala Lys Val Asp Thr Thr Ala
355 360 365
Gly Arg Phe Thr Pro Lys Leu Gly Ser Leu Glu Ile Ser Thr Glu Ser
370 375 380
Gly Asp Phe Asp Gln Asn Gln Pro Thr Arg Phe Thr Pro Val Gly Ile
385 390 395 400
Gly Val Asp His Glu Ala Asp Phe Gln Gln Trp Ser Leu Pro Asp Tyr
405 410 415
Ser Gly Gln Phe Thr His Asn Met Asn Leu Ala Pro Ala Val Ala Pro
420 425 430
Asn Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu Phe Phe Arg Ser Gln Leu Pro Ser
435 440 445
Ser Gly Gly Arg Ser Asn Gly Ile Leu Asp Cys Leu Val Pro Gln Glu
450 455 460
Trp Val Gln His Phe Tyr Gln Glu Ser Ala Pro Ala Gln Thr Gln Val
465 470 475 480
Ala Leu Val Arg Tyr Val Asn Pro Asp Thr Gly Arg Val Leu Phe Glu
485 490 495
Ala Lys Leu His Lys Leu Gly Phe Met Thr Ile Ala Lys Asn Gly Asp
500 505 510
Ser Pro Ile Thr Val Pro Pro Asn Gly Tyr Phe Arg Phe Glu Ser Trp
515 520 525
Val Asn Pro Phe Tyr Thr Leu Ala Pro Met Gly Thr Gly Asn Gly Arg
530 535 540
Arg Arg Val Gln
545
<210> 4
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Lys Met Ala Ser Ser Asp Ala Asn Pro Ser Asp Gly Ser Ala Ala
1 5 10 15
Asn Leu Val Pro Glu Val Asn Asn Glu Val Met Ala Leu Glu Pro Val
20 25 30
Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Pro Val Ala Gly Gln Gln Asn Val Ile
35 40 45
Asp Pro Trp Ile Arg Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro Gly Gly Glu Phe
50 55 60
Thr Val Ser Pro Arg Asn Ala Pro Gly Glu Ile Leu Trp Ser Ala Pro
65 70 75 80
Leu Gly Pro Asp Leu Asn Pro Tyr Leu Ser His Leu Ala Arg Met Tyr
85 90 95
Asn Gly Tyr Ala Gly Gly Phe Glu Val Gln Val Ile Leu Ala Gly Asn
100 105 110
Ala Phe Thr Ala Gly Lys Val Ile Phe Ala Ala Val Pro Pro Asn Phe
115 120 125
Pro Thr Glu Gly Leu Ser Pro Ser Gln Val Thr Met Phe Pro His Ile
130 135 140
Val Val Asp Val Arg Gln Leu Glu Pro Val Leu Ile Pro Leu Pro Asp
145 150 155 160
Val Arg Asn Asn Phe Tyr His Tyr Asn Gln Ser Asn Asp Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Leu Ile Ala Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ala Gly
180 185 190
Asp Asp Val Phe Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Ser Pro
195 200 205
Asp Phe Asp Phe Ile Phe Leu Val Pro Pro Thr Val Glu Ser Arg Thr
210 215 220
Lys Pro Phe Ser Val Pro Val Leu Thr Val Glu Glu Met Thr Asn Ser
225 230 235 240
Arg Phe Pro Ile Pro Leu Glu Lys Leu Phe Thr Gly Pro Ser Ser Ala
245 250 255
Phe Val Val Gln Pro Gln Asn Gly Arg Cys Thr Thr Asp Gly Val Leu
260 265 270
Leu Gly Thr Thr Gln Leu Ser Pro Val Asn Ile Cys Thr Phe Arg Gly
275 280 285
Asp Val Thr His Ile Thr Gly Ser Arg Asn Tyr Thr Met Asn Leu Ala
290 295 300
Ser Gln Asn Trp Asn Asn Tyr Asp Pro Thr Glu Glu Ile Pro Ala Pro
305 310 315 320
Leu Gly Thr Pro Asp Phe Val Gly Lys Ile Gln Gly Val Leu Thr Gln
325 330 335
Thr Thr Arg Thr Asp Gly Ser Thr Arg Gly His Lys Ala Thr Val Tyr
340 345 350
Thr Gly Ser Ala Asp Phe Ala Pro Lys Leu Gly Arg Val Gln Phe Glu
355 360 365
Thr Asp Thr Asp His Asp Phe Glu Ala Asn Gln Asn Thr Lys Phe Thr
370 375 380
Pro Val Gly Val Ile Gln Asp Gly Ser Thr Thr His Arg Asn Glu Pro
385 390 395 400
Gln Gln Trp Val Leu Pro Ser Tyr Ser Gly Arg Asn Thr Pro Asn Val
405 410 415
His Leu Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu
420 425 430
Phe Phe Arg Ser Thr Met Pro Gly Cys Ser Gly Tyr Pro Asn Met Asp
435 440 445
Leu Asp Cys Leu Leu Pro Gln Glu Trp Val Gln Tyr Phe Tyr Gln Glu
450 455 460
Ala Ala Pro Ala Gln Ser Asp Val Ala Leu Leu Arg Phe Val Asn Pro
465 470 475 480
Asp Thr Gly Arg Val Leu Phe Glu Cys Lys Leu His Lys Ser Gly Tyr
485 490 495
Val Thr Val Ala His Thr Gly Gln His Asp Leu Val Ile Pro Pro Asn
500 505 510
Gly Tyr Phe Arg Phe Asp Ser Trp Val Asn Gln Phe Tyr Thr Leu Ala
515 520 525
Pro Met Gly Asn Gly Thr Gly Arg Arg Arg Ala Leu
530 535 540
<210> 5
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Lys Met Ala Ser Asn Asp Ala Ala Pro Ser Asn Asp Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Leu Val Pro Glu Gly Asn Asn Glu Thr Leu Pro Leu Glu Pro Val
20 25 30
Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ala Pro Val Thr Gly Gln Asn Asn Ile Ile
35 40 45
Asp Pro Trp Ile Arg Thr Asn Phe Val Gln Ala Pro Asn Gly Glu Phe
50 55 60
Thr Val Ser Pro Arg Asn Ser Pro Gly Glu Ile Leu Leu Asn Leu Glu
65 70 75 80
Leu Gly Pro Asp Leu Asn Pro Tyr Leu Ala His Leu Ser Arg Met Tyr
85 90 95
Asn Gly Tyr Ala Gly Gly Val Glu Val Gln Val Leu Leu Ala Gly Asn
100 105 110
Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Leu Phe Ala Ala Val Pro Pro Asn Phe
115 120 125
Pro Val Glu Phe Leu Ser Pro Ala Gln Ile Thr Met Leu Pro His Leu
130 135 140
Ile Val Asp Val Arg Thr Leu Glu Pro Ile Met Ile Pro Leu Pro Asp
145 150 155 160
Val Arg Asn Thr Phe Phe His Tyr Ser Asn Gln Pro Asn Ser Arg Met
165 170 175
Arg Leu Val Ala Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ser Asn Gly Ser Gly
180 185 190
Asp Asp Val Phe Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Thr Pro
195 200 205
Asp Phe Glu Phe Thr Tyr Leu Val Pro Pro Ser Val Glu Ser Lys Thr
210 215 220
Lys Pro Phe Ser Leu Pro Ile Leu Thr Leu Ser Glu Leu Thr Asn Ser
225 230 235 240
Arg Phe Pro Val Pro Ile Asp Ser Leu Phe Thr Ala Gln Asn Asn Val
245 250 255
Leu Gln Val Gln Cys Gln Asn Gly Arg Cys Thr Leu Asp Gly Glu Leu
260 265 270
Gln Gly Thr Thr Gln Leu Leu Pro Ser Gly Ile Cys Ala Phe Arg Gly
275 280 285
Arg Val Thr Ala Gln Ile Asn Gln Arg Asp Arg Trp His Met Gln Leu
290 295 300
Gln Asn Leu Asn Gly Thr Thr Tyr Asp Pro Thr Asp Asp Val Pro Ala
305 310 315 320
Pro Leu Gly Thr Pro Asp Phe Lys Gly Val Val Phe Gly Met Val Ser
325 330 335
Gln Arg Asn Val Gly Asn Asp Ala Pro Gly Ser Thr Arg Ala Gln Gln
340 345 350
Ala Trp Val Ser Thr Tyr Ser Pro Gln Phe Val Pro Lys Leu Gly Ser
355 360 365
Val Asn Leu Arg Ile Ser Asp Asn Asp Asp Phe Gln Phe Gln Pro Thr
370 375 380
Lys Phe Thr Pro Val Gly Val Asn Asp Asp Asp Asp Gly His Pro Phe
385 390 395 400
Arg Gln Trp Glu Leu Pro Asn Tyr Ser Gly Glu Leu Thr Leu Asn Met
405 410 415
Asn Leu Ala Pro Pro Val Ala Pro Asn Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu
420 425 430
Phe Phe Arg Ser Phe Val Pro Cys Ser Gly Gly Tyr Asn Gln Gly Ile
435 440 445
Ile Asp Cys Leu Ile Pro Gln Glu Trp Ile Gln His Phe Tyr Gln Glu
450 455 460
Ser Ala Pro Ser Gln Ser Asp Val Ala Leu Ile Arg Tyr Val Asn Pro
465 470 475 480
Asp Thr Gly Arg Thr Leu Phe Glu Ala Lys Leu His Arg Ser Gly Tyr
485 490 495
Ile Thr Val Ala His Ser Gly Asp Tyr Pro Leu Val Val Pro Ala Asn
500 505 510
Gly His Phe Arg Phe Asp Ser Trp Val Asn Gln Phe Tyr Ser Leu Ala
515 520 525
Pro Met Gly Thr Gly Asn Gly Arg Arg Arg Ala Gln
530 535 540

Claims (9)

1.一种重组腺病毒表达载体，其特征在于：其为将GI.1VP1基因序列、GII.3VP1基因序列、GII.4VP1基因序列、GII.17VP1基因序列全部或部分克隆到同一腺病毒载体中，获得表达全部或部分GI.1VP1蛋白、GII.3VP1蛋白、GII.4VP1蛋白和GII.17VP1蛋白的重组腺病毒表达载体；
所述GI.1VP1蛋白的序列为序列表的序列2；
所述GII.3VP1蛋白的序列为序列表的序列3；
所述GII.4VP1蛋白的序列为序列表的序列4；
所述GII.17VP1蛋白的序列为序列表的序列5；
所述GI.1VP1基因序列的基因Bank收录号为KT943503.1；所述GII.3VP1基因序列的基因Bank收录号为KJ499444.1；所述GII.4VP1基因序列在基因Bank收录号为KC631827.1的基因序列的基础上，将编码其表达的蛋白序列第309位丝氨酸的密码子核苷酸AGC替换为天冬酰胺的密码子核苷酸AAC；所述GII.17VP1基因序列的基因Bank收录号为KP698928.1；
所述将GI.1VP1基因序列、GII.3VP1基因序列、GII.4VP1基因序列、GII.17VP1基因序列克隆到同一腺病毒载体中，按照如下任一方式进行：
1)将GI.1VP1基因序列、GII.3VP1基因序列、GII.4VP1基因序列、GII.17VP1基因序列两两连接得到两种蛋白的融合基因序列，再将两种融合基因序列先后克隆到同一腺病毒载体中；
2)将GI.1VP1基因序列、GII.3VP1基因序列、GII.4VP1基因序列、GII.17VP1基因序列中的任三种连接得到三种蛋白的融合基因序列，再将融合基因序列和余下的一种基因序列先后克隆到同一腺病毒载体中；
3)将GI.1VP1基因序列、GII.3VP1基因序列、GII.4VP1基因序列、GII.17VP1基因序列分别克隆到同一腺病毒载体中。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于：所述腺病毒载体为任一血清型腺病毒载体。
3.根据权利要求2所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于：所述克隆到同一腺病毒载体中，连接位置为E1、E3、E4中的任一个或多个。
4.根据权利要求3所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于：其为将GI.1VP1基因序列、GII.3VP1基因序列去除终止密码子后连接得到融合基因序列一，将GII.4VP1基因序列、GII.17VP1基因序列去除终止密码子后连接得到融合基因序列二；将融合基因序列一连接到AdC68XY4载体的E1区，将融合基因序列二连接到AdC68XY4载体的E3区，获得的表达GI.1VP1蛋白、GII.3VP1蛋白、GII.4VP1蛋白和GII.17VP1蛋白的重组腺病毒表达载体；
所述融合基因序列一为编码GI.1VP1蛋白和GII.3VP1蛋白的核苷酸序列；所述融合基因序列二为编码GII.4VP1蛋白和GII.17VP1蛋白的核苷酸序列。
5.一种重组腺病毒，利用权利要求1-4任一项所述的重组腺病毒表达载体包装得到。
6.一种多价诺如病毒疫苗，其特征在于：所述多价诺如病毒疫苗的活性成分为权利要求1-4任一项所述的重组腺病毒表达载体或权利要求5所述重组腺病毒。
7.制备权利要求6所述的多价诺如病毒疫苗的方法，其特征在于：包括将权利要求1-4任一项所述的重组腺病毒表达载体或权利要求5所述重组腺病毒作为活性成分，和佐剂混合，得到的多价诺如病毒疫苗。
8.权利要求1-4任一项所述的重组腺病毒表达载体在制备治疗和/或预防诺如病毒所致疾病产品中的应用。
9.权利要求1-4任一项所述的重组腺病毒表达载体在制备诺如病毒抗血清中的应用。
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