CN114591922A - 一种表达狂犬病毒g蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备方法 - Google Patents

一种表达狂犬病毒g蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备方法，涉及生物技术领域。该腺病毒包括：密码子优化后的Gp基因、WPRE转录后调控元件以及包含KE、AK、XA和PX片段的AdC68基因组序列，AdC68基因组中第594‑3513位之间插入连接序列以替换第459‑3011位之间E1的部分序列。通过对Gp基因的密码子进行优化，并插入WPRE转录后调控元件，实现了狂犬病毒G蛋白的高水平分泌表达。得到的狂犬病毒G蛋白的结构和功能与天然状态完全一致，最大程度上保留了G蛋白的免疫原性，可以更好地被抗原呈递细胞识别。制备的狂犬疫苗也具有高度的免疫原性、低预存抗体性和安全性。

Description

一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备方法。
背景技术
狂犬病是人类和动物的一种共患但可预防的严重传染性疾病，可于恒温动物身上造成严重脑炎。没有接受疫苗免疫的感染者，当神经症状出现后几乎必然死亡，通常的死亡原因都是由于中枢神经(脑-脊髓)被病毒破坏。病毒大量存在于发病者的脑脊液、唾液和体液中，绝大部分通过咬伤传播。据统计，狂犬病每年在全世界造成26,000-55,000人死亡，其中，超过95％的死亡病例发生在亚洲与非洲，而死亡病例中绝大多数(97％)由狗引起。
狂犬病毒进入人体，沿周围传入神经而到达中枢神经系统，因此头、颈部、上肢等处咬伤和创口面积大而深者发病机会多。狂犬病毒主要存在于患病动物的延脑、大脑皮层、小脑和脊髓中。唾液腺和唾液中也常含有大量病毒，人被患狂犬病的动物咬伤、抓伤或经粘膜感染均可引起狂犬病，在特定条件下也可以通过呼吸道气溶胶传染。
临床上狂犬病是一种急性、进行性脑炎，通常分为躁狂或麻痹性脑炎。感染者发病时呈高度兴奋状态，并伴有发热、头痛、恐怖不安、惊风怕声、肢休发麻、吞咽困难，一旦喝水即引起严重痉挛等症状，出現恐水现象，故又称「恐水症」(hydrophobia)。3-5日后，病人转入麻痹、昏迷状态，最后呼吸、循环衰竭而死。
狂犬病的病原体是狂犬病病毒(Rabies virus)，狂犬病毒(Rabies virus,RV)属于弹状病毒科，弹状病毒属，是引起狂犬病的病原体。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。病毒颗粒外有囊膜，内有核蛋白壳。狂犬病病毒是一种包膜RNA病毒，其包含五种结构蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA聚合酶。其中，糖蛋白(G)被认为是诱导病毒中和抗体的保护性抗原。
狂犬病病毒基因组由11928或11932个核苷酸组成的单股负链不分节段的RNA，基因组从3′端至5′端的排列依次为N、P、M、G和L基因，分别编码5种结构蛋白，其阅读框大小依次为1353、894、609、1575、6429nt。
狂犬病病毒存在于世界大部分地区，但狂犬病病毒主要宿主的物种因地理区域而异，包括野狗、浣熊、臭鼬、狐狸、蝙蝠和雪貂等。狂犬病病毒最常见的传播方式是受感染动物的叮咬。一旦狂犬病病毒感染中枢神经系统，狂犬病的临床症状就会显现出来。
目前，针对狂犬病并无特效药，预防是关键。如果出现被猫狗等动物抓伤、咬伤，应及时接种疫苗。目前的狂犬疫苗大部分是灭活疫苗，也有部分重组疫苗及病毒载体疫苗进入临床及上市。如ONRAB，表达狂犬病的糖蛋白，用于狐狸、浣熊和臭鼬的口服免疫。
目前，尚无报道利用黑猩猩腺病毒开发出来的表达狂犬病毒G蛋白的狂犬病毒疫苗。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备方法以解决上述技术问题。
腺病毒(Ads)已被作为载体以表达外来抗原。Ad基因组可以通过将基因插入删除的早期(E)3域，该域包含对病毒生长无关的基因。或者可以将表达盒放入已删除的E1域中，而由E1编码的基因对于复制至关重要，它们的删除使矢量复制有缺陷。可以使用包装连接序列以转补删除的E1基因，从而允许E1删除的载体的有效生长。
腺病毒(Ads)是常见的物种特异性病原体，从人类到青蛙等不同类型的动物中都可以分离出来。大多数人类在很小的时候就感染了腺病毒(Ads)，并开发出特定于腺病毒(Ad)疫苗，从而抑制了对同一病毒的感染。因此，基于普通人类血清型的Ad疫苗的免疫反应通常因其预存的中和抗体而减弱，使用基于从黑猩猩等其他物种分离的腺病毒的疫苗则可以规避这一点，而且腺病毒载体疫苗具有滴度高，载量大，使用方便的特点。
虽然黑猩猩腺病毒(AdC)在人类腺病毒中按系统发育分组并具有许多共同的特点，但它们既不在人类中流通，根据已有的研究也没有表现出抗体对人类血清型腺病毒的交叉中和。基于此，本发明提出了一种以黑猩猩腺病毒为载体的狂犬疫苗。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒，其包括：密码子优化后的Gp基因、WPRE转录后调控元件以及包含KE、AK、XA和PX片段的AdC68基因组序列，AdC68基因组中第594-3513位之间插入连接序列以替换第594-3513位之间E1的大部分序列。
发明人发现，通过对Gp基因的密码子进行优化，并插入WPRE转录后调控元件，实现了狂犬病毒G蛋白的高水平分泌表达。得到的狂犬病毒G蛋白的结构和功能与天然状态完全一致，最大程度上保留了G蛋白的免疫原性，可以更好地被抗原呈递细胞识别。
发明人通过密码子优化，使得Gp基因更适合在293细胞中表达。编码同一氨基酸的密码子被称为同义密码子，生物体自然状态下编码同一氨基酸时使用同义密码子的频率是不同的，有的密码子很少使用，被称为稀有密码子，有的却使用非常频繁，且具有明显的物种特异性，表明同义密码子的使用具有偏好性。为了提高转基因的表达率，可根据密码子偏好性理论对目的基因进行优化，例如将低频使用的密码子替换为高频率密码子。
WPRE元件可增加病毒表达量，提高病毒滴度。
可以用于制备相应的狂犬疫苗，基于重组黑猩猩腺病毒特有的免疫原性，由其制备的狂犬疫苗也具有高度的免疫原性、低预存抗体性和安全性，能有效激活机体的免疫反应，刺激被免疫对象产生高水平的特异性中和抗体，对狂犬病毒发挥高效、优异的免疫保护效果。
通过在载体上插入连接序列以转补删除的E1基因，从而保证了E1删除后的病毒能正常扩增。
发明人发现，特定地在AdC68基因组中第594-3513位之间插入连接序列，用于替换第594-3513位之间E1的大部分序列，可以最大限定地保留黑猩猩源腺病毒的原始序列。
在本发明应用较佳的实施方式中，密码子优化后的Gp基因如SEQ ID NO.1所示，连接序列如SEQ ID NO.2所示。
针对腺病毒AdC68基因组，本发明人经过细致的序列比对，最终确定了应用酶切位点SceI和CeuI作为狂犬病毒G蛋白编码基因的插入位点，从而不会导致在腺病毒表达载体的其它位置造成剪切。
由于腺病毒的基因组比较大，大约有36kb，直接克隆重组腺病毒载体具有较大的技术瓶颈。因此，本发明人开发了能通过酶切连接的快速方法直接构建基于黑猩猩型腺病毒AdC68作为疫苗载体，即充分利用腺病毒基因组中存在的某些酶切位点。
根据对腺病毒AdC68整个基因组序列的分析，将其分成KE，AK，XA和PX四个片段，然后通过酶切连接的方法再逐步克隆到pNEB193的载体中，最终获得一个复制缺陷型的腺病毒克隆。其中在腺病毒AdC68的PX部分，利用Nde I和SnaB I两个酶切位点删除了与腺病毒复制相关的E1部分，大小约为2.5kb，将其替换为含有内切酶Ceu I和Sce I的连接片段。此方法构建的复制缺陷型腺病毒AdC68经过线性化能够在HEK293细胞中成功包装并扩增出遗传稳定的重组腺病毒。
在一种实施方式中，KE，AK，XA和PX四个片段之间可包括限制性的酶切位点，这样有利于各元件的有机连接。
在其他实施方式中，上述重组腺病毒还包括复制起点、复制终点、筛选或标记基因等。
筛选基因例如选自卡那霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、腐草霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因或新霉素抗性基因。
标记基因例如选自荧光标记基因(GFP、YFP等)。
在本发明应用较佳的实施方式中，重组黑猩猩源腺病毒的序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种重组黑猩猩源腺病毒的制备方法，其包括：将密码子优化后的Gp基因、WPRE转录后调控元件与包含连接序列、KE、AK、XA和PX片段的AdC68载体进行连接。
KE、AK、XA和PX片段分别如SEQ ID NO.3-6所示。
经验证，由上述制备方法制备的重组黑猩猩源腺病毒可以反复感染病毒生产细胞，持续传代，在20代时仍保留较高的感染能力。黑猩猩源腺病毒AdC68在人体及猫，狗体内预存中和抗少，可以高效地诱导免疫反应。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法包括先将密码子优化后的Gp基因和WPRE转录后调控元件进行酶切连接，获得重组中间载体1，经酶切，将密码子优化后的Gp基因和WPRE转录后调控元件连入腺病毒穿梭载体中，获得重组中间载体2。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法包括将中间载体2用EcoRI、KpnI、AscI、XbaI、PmeI、SnaBI和NdeI进行酶切，分布连入包含连接序列、KE、AK、XA和PX片段的AdC68载体中。
采用酶切连接的方法，极大程度上避免了腺病毒发生突变的可能，遗传稳定性好。具有载体构建效率高的优势。
在一种可选的实施方式中，上述中间载体1-2以及单独的KE、AK、XA和PX片段的中间载体构建均采用Stbl2感受态细胞进行转化，使得腺病毒发生突变的概率进一步降低。因此，采用本发明获得的重组腺病毒表达狂犬病毒G蛋白更稳定、高效。
本发明还提供了一种狂犬疫苗，由上述重组黑猩猩源腺病毒感染病毒生产细胞，经病毒包装获得。
该狂犬疫苗具有如下优势：(1)体内预存中和抗体少；(2)施打方便，可以注射、口服、鼻喷；(3)疫苗生产安全方便，载量大；(4)保质期长。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述病毒生产细胞选自293T细胞、293FTX细胞、Huh7细胞或HEK293细胞。
本发明还提供了一种狂犬疫苗的制备方法，将上述的重组黑猩猩源腺病毒感染病毒生产细胞，经病毒在细胞内包装，获得具有免疫原性的狂犬疫苗。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过对Gp基因的密码子进行优化，并插入WPRE转录后调控元件，实现了狂犬病毒G蛋白的高水平分泌表达。得到的狂犬病毒G蛋白的结构和功能与天然状态完全一致，最大程度上保留了G蛋白的免疫原性，可以更好地被抗原呈递细胞识别。此外，黑猩猩源腺病毒AdC68在人体及猫，狗体内预存中和抗少，可以高效诱导免疫反应。
利用重组腺病毒制备出相应的狂犬疫苗，基于重组黑猩猩腺病毒特有的免疫原性，由其制备的狂犬疫苗也具有高度的免疫原性、低预存抗体性和安全性，能有效激活机体的免疫反应，刺激被免疫对象产生高水平的特异性中和抗体，对狂犬病毒发挥高效、优异的免疫保护效果。该狂犬疫苗具有如下优势：(1)体内预存中和抗体少；(2)施打方便，可以注射、口服、鼻喷；(3)疫苗生产安全方便，载量大；(4)保质期长。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为重组质粒pUC57-0/Gp-WPRE和pAdshuttle-CMV/Gp-WPRE酶切鉴定结果图；
图2为重组腺病毒载体构建质粒pAdC68-Gp-WPRE和重组病毒基因组酶切鉴定结果图；
图3为重组腺病毒感染细胞后的结果图；
图4为重组病毒遗传稳定性检测结果图；
图5为通过western blot检测HEK293细胞中pAdC68-Gp-WPRE，pAdC68-Gp及pAdC68中Gp的表达量的结果图；
图6为检测免疫动物14天后，ELISA抗体水平检测结果图；
图7为pAdC68载体图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cel ls)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
所使用材料来源：
穿梭载体pShuttle-CMV购自Clontech Laboratories，Inc。
野生型腺病毒AdC68(GenBank登录号AC_000011)购于ATCC。
pNEB193质粒购自New England Biolabs。
携带有优化密码子的目的基因Gp(ERA株)且有WPRE序列的重组质粒pUC57-0/Gp-WPRE由生工生物公司合成。
感受态菌株Stbl2购自Invitrogen。
腺病毒包装细胞系HEK293(293A)细胞购自ATCC。
实施例1
本实施例提供了E1缺失的复制缺陷型腺病毒载体pAdC68(pAdC68-E1-deleted)构建方法，具体包括如下步骤：
(1)质粒pNEB193-KE的构建
根据pNEB193载体上的多克隆位点和腺病毒AdC68基因组的序列，设计扩增腺病毒AdC68基因组上的KE片段的引物(参照表1所示)，PCR扩增目的产物KE片段。PCR扩增体系总体积为50μL，反应循环参数为：95℃预变性5min；94℃变性1min；退火温度57℃，30s；72℃延伸2.2min。EcoRI和KpnI双酶切PCR扩增的KE片段，琼脂糖凝胶纯化KE片段，连接至经相同酶切的pNEB193载体，转化入DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆，经酶切和测序鉴定得到pNEB193-KE。
表1 PCR引物序列
Figure BDA0003573916780000031
Figure BDA0003573916780000041
下划线标示限制性内切酶位点。
(2)质粒pNEB193-KE-AK的构建
AscI和KpnI双酶切AdC68基因组，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收AK片段，连接至经相同酶切的pNEB193-KE载体，转化入Stbl2感受态细胞中，挑取阳性克隆，经酶切鉴定得到pNEB193-KE-AK。
(3)质粒pNEB193-KE-AK-XA的构建
XbaI和AscI双酶切AdC68基因组，由于AscI在腺病毒AdC68存在三个酶切位点，对AscI进行部分酶切，置于37℃酶切AdC68基因组10s，低熔点凝胶回收酶切的最大的XA片段，连接至经相同酶切的pNEB193-KE-AK载体，酶切鉴定得到pNEB193-KE-AK-XA。
(4)质粒pNEB193-PX的构建
根据pNEB193载体上的多克隆位点和腺病毒基因组的序列，设计扩增PX片段的引物(表1)，PCR扩增目的产物PX片段。PCR扩增体系总体积为50μL，反应循环参数为：95℃预变性5min；94℃变性1min；退火温度55℃，1min；72℃延伸6min。PmeI和XbaI双酶切PCR扩增回收的PX片段，琼脂糖凝胶回收目的产物PX片段，连接至经相同酶切的pNEB193载体，转化入Stbl2感受态细胞中，挑取阳性克隆，其中靠近腺病毒AdC68左端ITR的区域经测序鉴定。XbaI酶切腺病毒AdC68基因组，低熔点琼脂糖凝胶回收获得AdC68中的XbaI-XbaI部分，并替换连接至经XbaI酶切的pNEB193-PX载体中，转化入Stbl2感受态细胞中，挑取阳性克隆，酶切鉴定得到pNEB193-PX。
(5)删除pNEB193-PX质粒中AdC68基因组中E1部分
EcoRI和MfeI双酶切pShuttle-CMV质粒，依据同尾酶的性质将空载体连接，转化入DH5α感受态细胞中得到pShuttle-EM的质粒。根据pShuttle-EM质粒的序列设计扩增Linker的引物(参照表1所示)，PCR扩增Linker产物，PCR扩增体系总体积为50μL，反应循环参数为：95℃预变性5min；94℃变性1min；退火温度55℃，1min；72℃延伸1min。SnaBI和NdeI双酶切PCR扩增的Linker片段，琼脂糖凝胶回收Linker产物，连接至经相同酶切的pNEB193-PX载体(通过对AdC68基因组序列分析，利用SnaBI和NdeI两个酶切位点能将其E1部分序列删除)，转化入DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，经酶切鉴定得到pNEB193-PX-Linker。
Linker的序列插入在AdC68基因组第459-3011位之间，替换E1的大部分序列。
(6)复制缺陷型腺病毒pAdC68质粒构建XbaI和PmeI双酶切pNEB193-PX-Linker质粒DNA，并利用琼脂糖凝胶回收PX-Linker片段，连接至经相同酶切的低熔点琼脂糖凝胶回收的pNEB193-KE-AK-XA载体，转化入Stbl2感受态细胞中，挑取阳性克隆，经酶切鉴定得到pAdC68-E1-deleted(即为pAdC68)。
(7)pAdC68图谱参照图7所示。
实施例2
本实施例将狂犬病毒的G蛋白编码基因Gp基因和WPRE调控元件连入实施例1中的pAdC68-E1-deleted中。
(1)根据GenBank中狂犬病毒ERA株中Gp编码区的核酸序列，合成经密码子优化后的Gp基因(如SEQ ID NO.1所示),并在3’插入WPRE序列，并在已优化密码子的目的基因的5’端依次接入EcoRI和NheI酶切位点，3’端接入XbaI酶切位点(图1)，通过EcoRI和XbaI双酶切将优化后的Gp基因克隆到商品化载体pUC57载体，获重组质粒pUC57-0/Gp-WPRE。
(2)将pUC57-0/Gp-WPRE质粒经NheI和XbaI双酶切后形成带有粘性末端的目的基因，同时将腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV经NheI和XbaI双酶切得到线性化的载体，使用T4DNA连接酶对上述产物的粘端进行连接。按常规方法将连接产物转化，在含卡那霉素抗性的琼脂平板上筛选，在LB培养基中37℃过夜培养，提取质粒DNA。采用酶切、PCR等方法进行鉴定，得到阳性重组质粒，命名为pAdshuttle-CMV/Gp-WPRE。
(3)质粒pShuttle-CMV/Gp-WPRE经过PI-SceI和I-CeuI双酶切后形成带有粘性末端的目的基因，同时将腺病毒载体pAdC68-E1-deleted经过PI-SceI和I-CeuI双酶切得到线形化的载体。利用低熔点琼脂糖胶分离目的片段，将含有目的片段和载体的凝胶65℃孵育5min，待完全溶解后使用T4 DNA连接酶对上述产物的粘端进行连接。在感受态菌Stbl2中按常规方法将连接产物转化，取适量的转化产物涂至含氨苄抗性的琼脂平板上，于30℃培养24h，挑选氨苄抗性克隆，小量提取质粒DNA，用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析，并分别进行BglII、BamHI、XhoI酶切图谱分析。将所得的重组腺病毒质粒菌液扩大培养(1：1000)获得大量高质量的质粒DNA。获得含狂犬病毒基因的重组腺病毒载体命名为pAdC68-Gp-WPRE。
实施例3
用限制性内切酶PacI线性化实施例2中的重组腺病毒质粒pAdC68-Gp-WPRE，应用脂质体转染的方法将质粒转入HEK293细胞(6孔板)中，37℃孵育6-8天，出现明显的噬斑。待细胞变圆、悬浮后收集细胞，反复冻融三次后取病毒上清感染HEK293细胞(75ml细胞培养瓶)。重复以上步骤直至收集适量病毒(约20-40个150ml细胞培养瓶)，利用氯化铯密度梯度离心法纯化病毒，测定OD值，加入终浓度为10％的甘油存于-80℃。提取病毒基因组DNA(病毒含量1012vp)，并进行BglII、BamHI、NheI酶切图谱分析。利用CMV promoter通用引物检测目的片段的核酸序列。纯化后的病毒在HEK293细胞中连续传20代，验证重组载体的遗传稳定性。
对比例1
与实施例2相比，区别仅在于，仅将狂犬病毒的G蛋白编码基因Gp基因连入实施例1中的pAdC68-E1-deleted中，获得pAdC68-Gp载体。
实验例1
本实验例采用NheI和XbaI双酶切pUC57-0/Gp-WPRE、pAdshuttle-CMV、pAdshuttle-CMV/Gp-WPRE载体，采用NheI和EcoRI双酶切pAdshuttle-CMV/Gp-WPRE。
酶切结果参照图1所示，图1中A中泳道2为NheI和XbaI双酶切pUC57-0/Gp；泳道3为NheI和XbaI双酶切pAdshuttle-CMV.B：泳道1为DNA ladder marker；泳道2、3为NheI和XbaI单酶切pAdshuttle-CMV/Gp-WPRE；泳道4为NheI,XbaI双酶切pAdshuttle-CMV/Gp-WPRE.C：NheI和EcoRI双酶切pAdshuttle-CMV/Gp-WPRE。结果显示，pAdshuttle-CMV/Gp-WPRE构建成功。
实验例2
本实验例对pAdC68-Gp-WPRE和重组病毒基因组进行酶切鉴定。分别使用BglII,BamHI,XhoI单酶切AdC68-Gp基因组，分别使用BglII,BamHI,XhoI分别单酶切质粒pAdC68-Gp-WPRE。
结果参照图2所示，泳道1为DNA ladder marker；泳道2,3,4为分别使用BglII,BamHI,XhoI单酶切AdC68-Gp基因组；泳道5为DNA ladder marker；泳道6,7,8为使用BglII,BamHI,XhoI分别单酶切质粒pAdC68-Gp-WPRE。结果显示，pAdshuttle-CMV/Gp-WPRE构建成功。
实验例3
为检测重组pAdC68-Gp-WPRE的感染HEK293细胞的病毒感染力。发明人将滴度为106PFU/ml和108PFU/ml的重组腺病毒分别感染HEK293细胞，将滴度为106PFU/ml和108PFU/ml的重组腺病毒分别感染Huh7细胞。
结果参照图3所示，图3中，A:HEK293细胞分别感染24小时、48小时滴度为106PFU/ml和108PFU/ml的重组腺病毒。B:Huh7细胞分别感染24小时、48小时滴度为106PFU/ml和108PFU/ml的重组腺病毒。结果显示，本发明提供的重组pAdC68-Gp-WPRE可以保持良好的病毒感染力。
实验例4
为检测重组pAdC68-Gp-WPRE的遗传稳定性。本实验例对第5代病毒基因组和第20代病毒基因组进行但酶切，并观察第20代重组病毒分别感染细胞HEK293A和Huh7后24h细胞病变。
结果参照图4所示，A:泳道1,5为1Kb DNA ladder marker；泳道2,3,4分别为BglII,BamHI,XhoI酶切第5代病毒基因组，泳道6,7,8分别为BglII,BamHI,XhoI酶切第20代病毒基因组。B:108PFU/ml的第20代重组病毒分别感染细胞HEK293A和Huh7后24h细胞病变。结果显示，重组病毒的遗传稳定性良好。
实验例5
本实验例采用western blot检测HEK293细胞中pAdC68-Gp-WPRE，pAdC68-Gp及pAdC68中Gp的表达量。
参照图5所示，通过加入WPRE可以明显提高Gp的表达量。
实验例6
本实验例检测免疫动物14天后，通过ELISA方法进行抗体水平检测。分别将pAdC68-Gp-WPRE，pAdC68-Gp，及pAdC68免疫犬只后14天检测抗体水平，如图6所示，结果显示，与pAdC68-Gp，及pAdC68相比，pAdC68-Gp-WPRE能引起强烈的细胞免疫反应。表明本发明提供的重组腺病毒可以高效诱导免疫反应。
综上，本发明使用分子生物学手段与基因工程手段，能在黑猩猩源腺病毒AdC68中高效表达狂犬病毒G蛋白，黑猩猩源腺病毒AdC68在人体及猫，狗体内预存中和抗少，可以高效诱导免疫反应。该pAdC68-Gp-WPRE疫苗有如下优势：(1)体内预存中和抗体少；(2)施打方便，可以注射、口服、鼻喷；(3)疫苗生产安全方便，载量大；(4)保质期长。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 长睿生物技术（成都）有限公司
<120> 一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1575
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<210> 2
<211> 2920
<212> DNA
<213> 人工序列
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caaacacctc atttgcatat taacgcgcac aaaaagtttg aggtatatta ttgatgatgg 2340
ttaattaag 2349
<210> 4
<211> 16915
<212> DNA
<213> 人工序列
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gcggcgatcg gggcgatccc cggcattgct tccgtggcgg tgcaggcctc tcagcgccac 120
tgagacacac ttggaaacat cttgtaataa acccatggac tctgacgctc ctggtcctgt 180
gatgtgtttt cgtagacaga tggaagacat caatttttcg tccctggctc cgcgacacgg 240
cacgcggccg ttcatgggca cctggagcga catcggcacc agccaactga acgggggcgc 300
cttcaattgg agcagtctct ggagcgggct taagaatttc gggtccacgc ttaaaaccta 360
tggcagcaag gcgtggaaca gcaccacagg gcaggcgctg agggataagc tgaaagagca 420
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cgccgagttg caagatggcc accccatcga tgctgcccca gtgggcgtac atgcacatcg 1080
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actcctacat caacatcggg gcgcgctggt cgctggatcc catggacaac gtgaacccct 2580
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tccgcggctg gtccttcacg cgtctcaaga ccaaggagac gccctcgctg ggctccgggt 3060
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gaggaggtcc gcaaatgcaa attccaagaa ccctggaaat tcctcaaatg ctaccgccaa 13860
aaatcagaca tgcatcccag ctggatcatg atcattggga tcgtgaacat tctggcctgc 13920
accctcatct cctttgtgat ttacccctgc tttgactttg gttggaactc gccagaggcg 13980
ctctatctcc cgcctgaacc tgacacacca ccacagcaac ctcaggcaca cgcactacca 14040
ccactacagc ctaggccaca atacatgccc atattagact atgaggccga gccacagcga 14100
cccatgctcc ccgctattag ttacttcaat ctaaccggcg gagatgactg acccactggc 14160
caacaacaac gtcaacgacc ttctcctgga catggacggc cgcgcctcgg agcagcgact 14220
cgcccaactt cgcattcgcc agcagcagga gagagccgtc aaggagctgc aggatgcggt 14280
ggccatccac cagtgcaaga gaggcatctt ctgcctggtg aaacaggcca agatctccta 14340
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cacctgcctg gtcggagtca accccatcgt catcacccag cagtctggcg ataccaaggg 14460
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atattgatga tgattttaca gaaataaaaa ataatcattt gatttgaaat aaagatacaa 14640
tcatattgat gatttgagtt taacaaaaaa ataaagaatc acttacttga aatctgatac 14700
caggtctctg tccatgtttt ctgccaacac cacttcactc ccctcttccc agctctggta 14760
ctgcaggccc cggcgggctg caaacttcct ccacacgctg aaggggatgt caaattcctc 14820
ctgtccctca atcttcattt tatcttctat cagatgtcca aaaagcgcgt ccgggtggat 14880
gatgacttcg accccgtcta cccctacgat gcagacaacg caccgaccgt gcccttcatc 14940
aaccccccct tcgtctcttc agatggattc caagagaagc ccctgggggt gttgtccctg 15000
cgactggccg accccgtcac caccaagaac ggggaaatca ccctcaagct gggagagggg 15060
gtggacctcg attcctcggg aaaactcatc tccaacacgg ccaccaaggc cgccgcccct 15120
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tttgaagatg gagccatagc aaccaacatt ggaaatgggt tagagtttgg aagcagtagt 15480
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tttgacagta caggagccat aatggctggt aacaaagaag acgataaact cactttgtgg 15600
acaacacctg atccatcacc aaactgtcaa atactcgcag aaaatgatgc aaaactaaca 15660
ctttgcttga ctaaatgtgg tagtcaaata ctggccactg tgtcagtctt agttgtagga 15720
agtggaaacc taaaccccat tactggcacc gtaagcagtg ctcaggtgtt tctacgtttt 15780
gatgcaaacg gtgttctttt aacagaacat tctacactaa aaaaatactg ggggtatagg 15840
cagggagata gcatagatgg cactccatat accaatgctg taggattcat gcccaattta 15900
aaagcttatc caaagtcaca aagttctact actaaaaata atatagtagg gcaagtatac 15960
atgaatggag atgtttcaaa acctatgctt ctcactataa ccctcaatgg tactgatgac 16020
agcaacagta catattcaat gtcattttca tacacctgga ctaatggaag ctatgttgga 16080
gcaacatttg gggctaactc ttataccttc tcatacatcg cccaagaatg aacactgtat 16140
cccaccctgc atgccaaccc ttcccacccc actctgtgga acaaactctg aaacacaaaa 16200
taaaataaag ttcaagtgtt ttattgattc aacagtttta caggattcga gcagttattt 16260
ttcctccacc ctcccaggac atggaataca ccaccctctc cccccgcaca gccttgaaca 16320
tctgaatgcc attggtgatg gacatgcttt tggtctccac gttccacaca gtttcagagc 16380
gagccagtct cgggtcggtc agggagatga aaccctccgg gcactcccgc atctgcacct 16440
cacagctcaa cagctgagga ttgtcctcgg tggtcgggat cacggttatc tggaagaagc 16500
agaagagcgg cggtgggaat catagtccgc gaacgggatc ggccggtggt gtcgcatcag 16560
gccccgcagc agtcgctgcc gccgccgctc cgtcaagctg ctgctcaggg ggtccgggtc 16620
cagggactcc ctcagcatga tgcccacggc cctcagcatc agtcgtctgg tgcggcgggc 16680
gcagcagcgc atgcggatct cgctcaggtc gctgcagtac gtgcaacaca gaaccaccag 16740
gttgttcaac agtccatagt tcaacacgct ccagccgaaa ctcatcgcgg gaaggatgct 16800
acccacgtgg ccgtcgtacc agatcctcag gtaaatcaag tggtgccccc tccagaacac 16860
gctgcccacg tacatgatct ccttgggcat gtggcggttc accacctccc ggtac 16915
<210> 5
<211> 11260
<212> DNA
<213> 人工序列
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ctagaaacga ggaggatttg atattgacgg tgccggcgga gatgcctttc aagagcccct 60
cgtccatctg gtcagaaaag acgatctttt tgttgtcgag cttggtggcg aaggagccgt 120
agagggcgtt ggagaggagc ttggcgatgg agcgcatggt ctggtttttt tccttgtcgg 180
cgcgctcctt ggcggcgatg ttgagctgca cgtactcgcg cgccacgcac ttccattcgg 240
ggaagacggt ggtcagctcg tcgggcacga ttctgacctg ccagccccga ttatgcaggg 300
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gtccgccctt gcgcgagcag aaggggggca gggggtccag catgacctcg tcgggggggt 420
cggcatcgat ggtgaagatg ccgggcagga ggtcggggtc aaagtagctg atggaagtgg 480
ccagatcgtc cagggcagct tgccattcgc gcacggccag cgcgcgctcg tagggactga 540
ggggcgtgcc ccagggcatg ggatgggtaa gcgcggaggc gtacatgccg cagatgtcgt 600
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tggtgcgact gggcttttcg gcgcggtaga cgatctggcg gaaaatggca tgcgagttgg 780
aggagatggt gggcctttgg aagatgttga agtgggcgtg gggcagtccg accgagtcgc 840
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ccagagcgca gtagtcgagg gtctcctgga tgatgtcata cttgagctgt cccttttgtt 960
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acccgtcctg atctgcacgg taagagccta gcatgtagaa ctggttgacg gccttgtagg 1080
cgcagcagcc cttctccacg gggagggcgt aggcctgggc ggccttgcgc agggaggtgt 1140
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cgtgctgctc gagcgcccag tcggcgagat gggggttggc gcggaggaag gaagtccaga 1560
gatccacggc cagggcggtt tgcagacggt cccggtactg acggaactgc tgcccgacgg 1620
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catcgtaggt gaggaagagc ctttcggtgc gaggatgcga gccgatgggg aagaactgga 1860
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gacgtcctgg atctgacgcc tctgggtgaa ggccacggga cccgtgagtt tgaacctgaa 2640
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ggtgacgaag aaatacatga tccagcggcg gagcggcatc tcgctgacgt cgcccagcgc 3060
ctccaaacgt tccatggcct cgtaaaagtc cacggcgaag ttgaaaaact gggagttgcg 3120
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ccgctgaacg aaggcttcga gccagtcgca gtcgcaaggt aggctgagca cggtttcttc 3600
tggcgggtca tgttggttgg gagcggggcg ggcgatgctg ctggtgatga agttgaaata 3660
ggcggttctg agacggcgga tggtggcgag gagcaccagg tctttgggcc cggcttgctg 3720
gatgcgcaga cggtcggcca tgccccaggc gtggtcctga cacctggcca ggtccttgta 3780
gtagtcctgc atgagccgct ccacgggcac ctcctcctcg cccgcgcggc cgtgcatgcg 3840
cgtgagcccg aagccgcgct ggggctggac gagcgccagg tcggcgacga cgcgctcggc 3900
gaggatggct tgctggatct gggtgagggt ggtctggaag tcatcaaagt cgacgaagcg 3960
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cgtgagcggg gctggacaga gttatgatca ccagctggcc ttggaagagg gcgaggggct 4980
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gactacacca acttcatcag cgccctgcgc ctgatggtga ccgaggtgcc ccagagcgag 6540
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gtcaggatga gctgaagtat gaatgggtgg aatttgagct gcccgaaggc aacttctcgg 8400
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cggcaacccc acgccgagcc tcaagcccgt gaccttgcag caggtgctgc cgaccgcggc 10560
gccgcgccgg gggttcaagc gcgagggcga ggatctgtac cccaccatgc agctgatggt 10620
gcccaagcgc cagaagctgg aagacgtgct ggagaccatg aaggtggacc cggacgtgca 10680
gcccgaggtc aaggtgcggc ccatcaagca ggtggccccg ggcctgggcg tgcagaccgt 10740
ggacatcaag attcccacgg agcccatgga aacgcagacc gagcccatga tcaagcccag 10800
caccagcacc atggaggtgc agacggatcc ctggatgcca tcggctccta gtcgaagacc 10860
ccggcgcaag tacggcgcgg ccagcctgct gatgcccaac tacgcgctgc atccttccat 10920
catccccacg ccgggctacc gcggcacgcg cttctaccgc ggtcatacca gcagccgccg 10980
ccgcaagacc accactcgcc gccgccgtcg ccgcaccgcc gctgcaacca cccctgccgc 11040
cctggtgcgg agagtgtacc gccgcggccg cgcacctctg accctgccgc gcgcgcgcta 11100
ccacccgagc atcgccattt aaactttcgc cagctttgca gatcaatggc cctcacatgc 11160
cgccttcgcg ttcccattac gggctaccga ggaagaaaac cgcgccgtag aaggctggcg 11220
gggaacggga tgcgtcgcca ccaccaccgg cggcggcgcg 11260
<210> 6
<211> 7051
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cttaattaac catcttcaat aatatacctc aaactttttg tgcgcgttaa tatgcaaatg 60
aggcgtttga atttggggag gaagggcggt gattggtcga gggatgagcg accgttaggg 120
gcggggcgag tgacgttttg atgacgtggt tgcgaggagg agccagtttg caagttctcg 180
tgggaaaagt gacgtcaaac gaggtgtggt ttgaacacgg aaatactcaa ttttcccgcg 240
ctctctgaca ggaaatgagg tgtttctggg cggatgcaag tgaaaacggg ccattttcgc 300
gcgaaaactg aatgaggaag tgaaaatctg agtaatttcg cgtttatggc agggaggagt 360
atttgccgag ggccgagtag actttgaccg attacgtggg ggtttcgatt accgtgtttt 420
tcacctaaat ttccgcgtac ggtgtcaaag tccggtgttt ttacgtacga tatcatttcc 480
ccgaaaagtg ccacctgacc gtaactataa cggtcctaag gtagcgaaag ctcagatctc 540
ccgatcccct atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt 600
atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg cgcgagcaaa atttaagcta 660
caacaaggca aggcttgacc gacaattgca tgaagaatct gcttagggtt aggcgttttg 720
cgctgcttcg cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatt 780
aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 840
aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 900
taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 960
actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 1020
cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 1080
tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 1140
tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 1200
gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 1260
caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 1320
aggtctatat aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg 1380
aaattaatac gactcactat agggagaccc aagctggcta gcaccatggt ccctcaggct 1440
ctgctgtttg tccctctgct ggtgttccct ctgtgtttcg gcaagtttcc tatctatacc 1500
atcccagaca agctgggccc ctggagccct atcgatattc accatctgtc ctgccccaac 1560
aatctggtgg tcgaggatga agggtgtacc aacctgagcg gcttctccta catggagctg 1620
aaagtgggat atatcctggc tattaagatg aacgggttca catgcactgg cgtggtcacc 1680
gaggcagaaa cctacacaaa ttttgtgggc tatgtcacca caactttcaa gaggaaacac 1740
tttagaccaa cacccgacgc ctgtcgcgcc gcttacaact ggaaaatggc tggcgatcct 1800
cgatatgagg aaagcctgca caatccttac ccagactata gatggctgcg gactgtgaag 1860
accacaaaag agtccctggt catcatttcc ccttctgtcg cagacctgga tccatacgat 1920
agatctctgc acagtcgggt gtttccatcc ggaaagtgct ctggggtggc cgtcagctcc 1980
acttactgtt ctaccaacca tgattataca atctggatgc cagagaatcc caggctgggg 2040
atgagttgcg acattttcac aaattcacgc ggcaagcgag cctcaaaagg aagcgagact 2100
tgtgggtttg tggacgaaag gggactgtat aagagcctga aaggggcctg caagctgaaa 2160
ctgtgtggcg tgctgggact gagactgatg gatggcacct gggtcgctat gcagacatct 2220
aacgagacta agtggtgccc tcccgaccag ctggtgaatc tgcacgactt cagaagcgat 2280
gagatcgaac atctggtggt cgaggaactg gtgcgaaaaa gggaggaatg tctggatgct 2340
ctggaatcaa tcatgactac caagagcgtg agcttcagga gactgagcca cctgcggaag 2400
ctggtccctg ggttcggcaa agcatacacc atctttaaca agacactgat ggaggcagac 2460
gcccattata aatctgtgcg cacctggaat gaaattctgc ctagtaaggg atgcctgcga 2520
gtcggcggac gatgtcaccc acatgtgaac ggcgtcttct ttaatggaat cattctgggg 2580
cccgacggca acgtgctgat ccctgagatg cagtctagtc tgctgcagca gcacatggag 2640
ctgctggaat caagcgtgat tcctctggtc catccactgg cagatcccag cacagtgttc 2700
aaagacggag atgaggccga agactttgtg gaggtccacc tgcctgatgt gcataaccag 2760
gtgagtggcg tcgacctggg actgccaaat tggggcaagt acgtgctgct gtccgctgga 2820
gcactgactg ctctgatgct gatcattttc ctgatgacct gctgtcgacg agtgaaccga 2880
tccgagccaa ctcagcacaa tctgcgagga accgggagag aagtgtctgt cacacctcag 2940
agtggaaaaa tcattagcag ttgggagtca cacaaatctg gcggcgaaac aaggctgtaa 3000
tctagactcg agcggccgcc actgtgctgg atgatccgag ctcggtacca atcaacctct 3060
ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct 3120
atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat 3180
tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt 3240
caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat 3300
tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc 3360
ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga 3420
caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg cctatgttgc 3480
cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga 3540
ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc 3600
tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcgg taccaagctt aagtttaaac 3660
cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 3720
gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 3780
attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 3840
agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 3900
gcttctgagg cggaaagaac cagcagatct gcagatctga attcatctat gtcgggtgcg 3960
gagaaagagg taatgaaatg gcattatggg tattatgggt ctgcattaat gaatcggcca 4020
gatatcgaca tatgctggcc accgtacatg tggcttccca tgctcgcaag ccctggcccg 4080
agttcgagca caatgtcatg accaggtgca atatgcatct ggggtcccgc cgaggcatgt 4140
tcatgcccta ccagtgcaac ctgaattatg tgaaggtgct gctggagccc gatgccatgt 4200
ccagagtgag cctgacgggg gtgtttgaca tgaatgtgga ggtgtggaag attctgagat 4260
atgatgaatc caagaccagg tgccgagcct gcgagtgcgg agggaagcat gccaggttcc 4320
agcccgtgtg tgtggatgtg acggaggacc tgcgacccga tcatttggtg ttgccctgca 4380
ccgggacgga gttcggttcc agcggggaag aatctgacta gagtgagtag tgttctgggg 4440
cgggggagga cctgcatgag ggccagaata actgaaatct gtgcttttct gtgtgttgca 4500
gcagcatgag cggaagcggc tcctttgagg gaggggtatt cagcccttat ctgacggggc 4560
gtctcccctc ctgggcggga gtgcgtcaga atgtgatggg atccacggtg gacggccggc 4620
ccgtgcagcc cgcgaactct tcaaccctga cctatgcaac cctgagctct tcgtcgttgg 4680
acgcagctgc cgccgcagct gctgcatctg ccgccagcgc cgtgcgcgga atggccatgg 4740
gcgccggcta ctacggcact ctggtggcca actcgagttc caccaataat cccgccagcc 4800
tgaacgagga gaagctgttg ctgctgatgg cccagctcga ggccttgacc cagcgcctgg 4860
gcgagctgac ccagcaggtg gctcagctgc aggagcagac gcgggccgcg gttgccacgg 4920
tgaaatccaa ataaaaaatg aatcaataaa taaacggaga cggttgttga ttttaacaca 4980
gagtctgaat ctttatttga tttttcgcgc gcggtaggcc ctggaccacc ggtctcgatc 5040
attgagcacc cggtggatct tttccaggac ccggtagagg tgggcttgga tgttgaggta 5100
catgggcatg agcccgtccc gggggtggag gtagctccat tgcagggcct cgtgctcggg 5160
ggtggtgttg taaatcaccc agtcatagca ggggcgcagg gcatggtgtt gcacaatatc 5220
tttgaggagg agactgatgg ccacgggcag ccctttggtg taggtgttta caaatctgtt 5280
gagctgggag ggatgcatgc ggggggagat gaggtgcatc ttggcctgga tcttgagatt 5340
ggcgatgtta ccgcccagat cccgcctggg gttcatgttg tgcaggacca ccagcacggt 5400
gtatccggtg cacttgggga atttatcatg caacttggaa gggaaggcgt gaaagaattt 5460
ggcgacgcct ttgtgcccgc ccaggttttc catgcactca tccatgatga tggcgatggg 5520
cccgtgggcg gcggcctggg caaagacgtt tcgggggtcg gacacatcat agttgtggtc 5580
ctgggtgagg tcatcatagg ccattttaat gaatttgggg cggagggtgc cggactgggg 5640
gacaaaggta ccctcgatcc cgggggcgta gttcccctca cagatctgca tctcccaggc 5700
tttgagctcg gaggggggga tcatgtccac ctgcggggcg ataaagaaca cggtttccgg 5760
ggcgggggag atgagctggg ccgaaagcaa gttccggagc agctgggact tgccgcagcc 5820
ggtggggccg tagatgaccc cgatgaccgg ctgcaggtgg tagttgaggg agagacagct 5880
gccgtcctcc cggaggaggg gggccacctc gttcatcatc tcgcgcacgt gcatgttctc 5940
gcgcaccagt tccgccagga ggcgctctcc ccccagggat aggagctcct ggagcgaggc 6000
gaagtttttc agcggcttga gtccgtcggc catgggcatt ttggagaggg tttgttgcaa 6060
gagttccagg cggtcccaga gctcggtgat gtgctctacg gcatctcgat ccagcagacc 6120
tcctcgtttc gcgggttggg acggctgcgg gagtagggca ccagacgatg ggcgtccagc 6180
gcagccaggg tccggtcctt ccagggtcgc agcgtccgcg tcagggtggt ctccgtcacg 6240
gtgaaggggt gcgcgccggg ctgggcgctt gcgagggtgc gcttcaggct catccggctg 6300
gtcgaaaacc gctcccgatc ggcgccctgc gcgtcggcca ggtagcaatt gaccatgagt 6360
tcgtagttga gcgcctcggc cgcgtggcct ttggcgcgga gcttaccttt ggaagtctgc 6420
ccgcaggcgg gacagaggag ggacttgagg gcgtagagct tgggggcgag gaagacggac 6480
tcgggggcgt aggcgtccgc gccgcagtgg gcgcagacgg tctcgcactc cacgagccag 6540
gtgaggtcgg gctggtcggg gtcaaaaacc agtttcccgc cgttcttttt gatgcgtttc 6600
ttacctttgg tctccatgag ctcgtgtccc cgctgggtga caaagaggct gtccgtgtcc 6660
ccgtagaccg actttatggg ccggtcctcg agcggtgtgc cgcggtcctc ctcgtagagg 6720
aaccccgccc actccgagac gaaagcccgg gtccaggcca gcacgaagga ggccacgtgg 6780
gacgggtagc ggtcgttgtc caccagcggg tccacctttt ccagggtatg caaacacatg 6840
tccccctcgt ccacatccag gaaggtgatt ggcttgtaag tgtaggccac gtgaccgggg 6900
gtcccggccg ggggggtata aaagggtgcg ggtccctgct cgtcctcact gtcttccgga 6960
tcgctgtcca ggagcgccag ctgttggggt aggtattccc tctcgaaggc gggcatgacc 7020
tcggcactca ggttgtcagt ttctagaaac g 7051

Claims (10)

1.一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒，其特征在于，其包括：KE、AK、XA和PX片段的AdC68基因组序列，AdC68基因组中第594-3513位之间插入连接序列以替换第594-3513位之间E1的部分序列，所述PX片段包含密码子优化后的Gp基因、WPRE转录后调控元件。
2.根据权利要求1所述的重组黑猩猩源腺病毒，其特征在于，所述密码子优化后的Gp基因如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的重组黑猩猩源腺病毒，其特征在于，所述连接序列如SEQ IDNO.2所示。
4.根据权利要求1所述的重组黑猩猩源腺病毒，其特征在于，所述重组黑猩猩源腺病毒的KE、AK、XA和PX片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-6所示。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的重组黑猩猩源腺病毒的制备方法，其特征在于，其包括：将密码子优化后的Gp基因、WPRE转录后调控元件与包含连接序列、KE、AK、XA和PX片段的AdC68载体进行连接。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括先将密码子优化后的Gp基因和WPRE转录后调控元件进行酶切连接，获得重组中间载体1，经酶切，将所述密码子优化后的Gp基因和WPRE转录后调控元件连入腺病毒穿梭载体中，获得重组中间载体2。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将所述中间载体2用SceI和CeuI进行双酶切，然后连入包含连接序列、KE、AK、XA和PX片段的AdC68载体中。
8.一种狂犬疫苗，其特征在于，由权利要求1-4任一项所述的重组黑猩猩源腺病毒感染病毒生产细胞，经病毒包装获得。
9.根据权利要求8所述的狂犬疫苗，其特征在于，所述病毒生产细胞选自293T细胞、293FTX细胞、Huh7细胞或HEK293细胞。
10.一种狂犬疫苗的制备方法，其特征在于，将权利要求1-4任一项所述的重组黑猩猩源腺病毒感染病毒生产细胞，经病毒在细胞内包装，获得具有免疫原性的狂犬疫苗。
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