CN113897388A - 一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113897388A
CN113897388A CN202110760033.6A CN202110760033A CN113897388A CN 113897388 A CN113897388 A CN 113897388A CN 202110760033 A CN202110760033 A CN 202110760033A CN 113897388 A CN113897388 A CN 113897388A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chimpanzee adenovirus
gene
psad
sequence
chimpanzee
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110760033.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113897388B (zh
Inventor
陈平
李娜
张婷婷
钟鑫涛
李楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd filed Critical Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd
Publication of CN113897388A publication Critical patent/CN113897388A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113897388B publication Critical patent/CN113897388B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供了一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用，具备更高的病毒滴度，并提供了其病毒滴度的测定方法；创造性地通过穿梭质粒构建了黑猩猩腺病毒环状载体，并通过CRISPR/Cas9敲除E1、E3，构建了复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体。所述黑猩猩腺病毒载体在人群中没有预存抗体存在，E1、E3的敲除具有安全性，同时与293细胞中人类腺病毒5型E1有显著差异性，可以极大地避免恢复突变(RCA)，更具有安全性。构建的新型冠状病毒疫苗，经过几十代的传代，疫苗的稳定性很强，不引起突变，在小鼠模型中能诱导很强的体液免疫以及细胞反应。

Description

一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用
本申请主张中国在先申请,申请号:2020106427453，申请日2020年7月6日的优先权；主张中国在先申请,申请号:202010945335.6，申请日2020年9月10日的优先权；其所有的内容作为本发明的一部分。
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域和免疫学领域，具体而言，涉及一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用。
背景技术
腺病毒是引起上呼吸道和肺部疾病的常见病毒，人体免疫系统会对腺病毒产生强烈的免疫应答。因此需要将腺病毒改造成无害化的疫苗载体，经过几十年的研发，市场运用较广范的即为人类腺病毒5型疫苗载体。腺病毒作为疫苗病毒大受欢迎，通常基因治疗采用的腺病毒载体以人5型腺病毒(AdHu5)为主，但人群中普遍存在针对AdHu5的中和抗体，约有三分之一的人群成年时已对其产生免疫性，这些人群的免疫系统会破坏疫苗而不是产生对抗携带插入基因的病毒的抗体。并且，AdHu5的Hexon蛋白与血液中的凝血因子X(FX)结合，导致该腺病毒在肝脏累积，影响AdHu5的肿瘤靶向性。因此，5型腺病毒的效能和靶向性有待进一步提高和完善。
黑猩猩腺病毒为我们提供另一种可行的方法，由于黑猩猩型腺病毒如AdC7、AdC23等在人群中很少流行，人群中一般不存在相应的中和抗体，也不会被针对人5型腺病毒(AdHu5)的抗体所中和，同时，黑猩猩腺病毒的Hexon蛋白也不与FX结合。因此，黑猩猩腺病毒载体可发展为一种理想的腺病毒载体平台，可用于制备更高质量的疫苗试剂，如新型冠状病毒疫苗等，而且保持固有的安全性。
2019新型冠状病毒(2019-nCoV)，从2019年开始在全球范围内大量爆发，引起了严重的疾病，造成了巨大的损失。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。
新冠病毒共表达29个蛋白、其中16个与其复制有关，4个是结构蛋白，刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)，包膜蛋白(Envelopeprotein，E蛋白)。S蛋白是冠状病毒最为重要的表面蛋白，S蛋白能与人体ACE2(宿主细胞受体血管紧张素转化酶2)结合，其亲和力要远高于严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)，S蛋白是进入细胞的钥匙、是抗体药物的靶点。N蛋白在冠状病毒中含量丰富，是一种高度免疫原性蛋白，参与基因组复制和细胞信号通路调节。
新冠肺炎患者体内的抗体会在数月内消失，而疫苗提供的抗体可能也会如此，这意味着人们无法通过一次性注射疫苗“一劳永逸”，抗体会在短时间内消退，消退早晚取决于最高点的抗体水平，这决定了抗体能在体内存留多久。因此如何提高患者体内新冠肺炎病毒的抗体水平，是制备新型冠状病毒疫苗需要考虑的首要问题。
经过检测，人群血清中不含有黑猩猩腺病毒的预存抗体，免疫系统就不会破坏疫苗，有助于目的抗原的有效表达，提高抗体的水平，因此黑猩猩腺病毒作为疫苗载体是一个很好的平台。现有的黑猩猩腺病毒的滴度普遍较低，构建成疫苗载体的工艺复杂，难以工厂化。因此急需找到滴度更高的黑猩猩腺病毒载体，形成完整工艺平台，从而用于新型冠状病毒疫苗等各类疫苗的制备。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种全新的病毒滴度更高的黑猩猩腺病毒，利用其制备的缺陷型黑猩猩腺病毒载体，可用于制备新型冠状病毒疫苗等各类疫苗，本发明提供的黑猩猩腺病毒疫苗载体在人群中没有预存抗体的存在，与293细胞中人类腺病毒5型E1有十分高的差异性，可以极大地避免恢复突变，更具有安全性；同时具有更好的稳定性；在小鼠模型中能诱导很强的体液免疫以及细胞反应。
一方面，本发明提供了一种黑猩猩腺病毒，所述的该病毒包括高变区HVR，其中，所述的高变区HVR包括如序列编号Seq ID NO.9、Seq ID NO.10、Seq ID NO.11、Seq IDNO.12、Seq ID NO.13、或者Seq ID NO.14所示的中的任意一条或多条所示的核苷酸序列，或者与以上序列具有同源性大于50％的核苷酸序列。
人腺病毒属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，到目前为止，人腺病毒共分离到52个血清型，分属于A～G7个亚属。目前腺病毒感染的诊断与分型主要应用病毒分离技术、抗体检测技术，以及分子生物学技术(如聚合酶链反应、限制性片段长度多态性分析技术、原位杂交技术、实时荧光定量PCR技术)等。
黑猩猩腺病毒同样具有不同的血清型，其基因序列包括高变区HVR1-9的序列和相对保守序列，相对保守序列可用于区别不同种属的腺病毒(如用于区别属于黑猩猩腺病毒还是人腺病毒)，而高变区序列可用于区别不同的腺病毒的血清型，即高变区的序列决定了腺病毒的具体血清型。
HVR1-9的序列示意图如图1所示，在高变区具有9个区域是变化的，这些高变区域的核酸序列的不同，从而表达的蛋白或者结构不同，决定了病毒的血清型的不同。一般腺病毒的高变区具有9个区域，这9个区域的排列方式如图1所示。所谓的“血清型”是指，微生物学上,可以用来鉴定同种类微生物的不同型别,通常可用血清学方法检测出来,谓之血清型。比如琏球菌主要通过O抗原和H抗原的滴定效价来确定其血清型。
本发明提供的新型黑猩猩腺病毒，其基因序列主要基于黑猩猩腺病毒的六邻体基因高变区HVR1-6的序列。本发明提供的黑猩猩腺病毒的六邻体基因高变区HVR1-6的序列中的每一个区域的序列与数据库(genebank)中的已知黑猩猩腺病毒的血清型HVR1-6序列完全不同，或者存在巨大的差异。所述的六邻体基因高变区HVR1-6的序列共包含六个突变序列，分别位于HVR1-6序列的每个序列中，其中HVR1如序列表编号Seq ID NO.9所示的序列、HVR2如序列编号Seq ID NO.10所示的序列、HVR3如序列Seq ID NO.11所示的序列、HVR4如序列表Seq ID NO.12所示的序列、HVR5如序列表Seq ID NO.13所示的序列、HVR6如序列表Seq ID NO.14所示的核苷酸序列。本发明的腺病毒在高变区HVR7-9位置的的序列并未发生突变，如序列表Seq ID NO.15所示。
本发明的一般技术人员可以理解，这些高变区的序列一旦公布，可以对其序列进行修饰，人工合成，或者在这些序列上增加其他无关的序列。这些经过修饰、人工合成、或者在本发明巩固的序列的3段或者5段增加的序列，从而形成了新的序列，这些新的序列虽然与本发明公布的序列并不100％一样，但是本发明的范围仍然可以覆盖于以上高变区1-6的序列具有同源性的序列，这些新的序列也是属于本发明保护的范围之一，这里的新的序列同源性可以是单个高变区域中的一个区的序列的同源性，例如，与序列编号Seq ID NO.9所示的序列具有50％以上的同源性序列，例如55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，88％，90％，95％，或者99％的序列。另外，还可以是这样的序列，例如，与本发明高变区1-6的序列具有50％的同源性序列，例如55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，88％，90％，95％，或者99％的序列，这些序列也是本发明的范围之一。另外，本发明的序列，或者与本发明序列具有50％以上同源性的序列所编码的蛋白序列，如果能够编码，也是本发明的保护范围之内，即这些序列所编码的蛋白，或者氨基酸序列，也是属于本发明的保护范围之内。
当然，这些新的序列可以包括本发明高变区中核酸序列中的一条或者多条，例如包括高变区1-6中所示的核酸序列的一条或者多条，后者包括与本发明高变区域1-6中的核酸序列具有50％以上同源性的序列，例如同源性55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，88％，90％，95％，或者99％的序列。
进一步地，所述的腺病毒包括高变区HVR7-9的区域，所述高变区HVR7-9具有如序列表Seq ID NO.15所示的核苷酸序列。
进一步地，高变区HVR具有如序列表Seq ID NO.7所示的核苷酸序列，或者与该序列同源性大于50％的核苷酸序列。
进一步地，所述高变区HVR具有如序列表Seq ID NO.7所示的核苷酸序列，或者与之具有同源性55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，88％，90％，95％，或者99％的核酸序列。
进一步地，所述的病毒还包括保守区域。
另一方面，本发明提供了一种黑猩猩腺病毒，该病毒的保藏编号为CCTCC NO：V202120，编号为sAd-AY01的毒株。
在一些方式中，本发明提供一种腺病毒，该腺病毒包括具有如序列表Seq ID NO.1所示的核苷酸序列，或者与该序列具有50％以上同源性的序列。
本发明提供了一种全新的黑猩猩腺病毒，将黑猩猩腺病毒基因组DNA进行全基因组测序，确定最终的病毒基因组序列。该黑猩猩腺病毒于2021年4月25日保藏至中国典型培养物保藏中心，分类命名为：猩猩腺病毒sAd-AY01，保藏编号为：CCTCC NO：V202120，保藏地址为中国武汉大学。这一全新的黑猩猩腺病毒sAd-AY01基因组全长36687bp。
本发明提供的全新的黑猩猩腺病毒，具有与现有抑制血清型完全不同的高变区HVR序列，基于其六邻体基因高变区HVR1-6的序列与数据库(genebank)中的已知黑猩猩腺病毒部分血清型HVR1-6序列、猴类腺病毒部分血清型HVR1-6序列、人类腺病毒部分血清型HVR1-6序列相比较，同源性在49～91％之间。
再基于其六邻体基因高变区HVR1-6的序列与数据库(genebank)中的已知黑猩猩腺病毒部分血清型HVR1-6序列、猴类腺病毒部分血清型HVR1-6序列、人类腺病毒部分血清型HVR1-6序列相比较，同源性在49～91％之间，使用DNAstar软件构建系统发育进化树(图5-2)，ClustalW的计算方法分析序列的同源性以及差异性，同源性最大的腺病毒序列为Pantroglodytes adenovirus clone 17.2major capsid protein gene(GenBank:MF176134.1)的部分基因，最大的同源性为91.63％，最终确定该黑猩猩腺病毒为尚未发现的新型腺病毒。
自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒至少具有52种，分为A、B、C、D、E、F和G七个亚群(subgroup)。基因治疗常用的人的2型及5型腺病毒在血清学分类上均属C亚群，在DNA序列上有95％的同源性。黑猩猩腺病毒根据其血细胞凝集特性，已将22种病毒株分为三大类，每种病毒株都具有腺病毒补体固定抗原(Hillis WD,Goodman R(1969)Serologic classification of chimpanzeeadenoviruses by hemagglutination and hemagglutination inhibition.)，腺病毒能被中和抗体识别的型特异性的抗原决定簇主要位于六邻体表面，六邻体蛋白的抗原决定簇会绘制成L1和L2两个Loops，并被分成7个高变区，HVR1-6(L1)和HVR7(L2)，高变区可导致异常重组，大多数情况下，HVR1-6序列测序可以明显区分血清型。基于六邻体基因HVR1-7的分子分型和用于腺病毒新的变异株的发现已经得到广泛应用。(Casas A,Avellon M,MosqueraO，et a1.Molecular typing of human adenoviruses by PCR and sequencing of apartial region of the hexon gene.Lu X，Erdman DD.Molecular typing of humanadenoviruses by PCR and sequencing of a partial region of the hexon gene.ArchViro1,2006,15l:l587-1602.)。
又根据参考文献Complete nucleotide sequences and genome organizationof four chimpanzee adenoviruses，将黑猩猩腺病毒血清型SAdV-22、SAdV-23、SAdV-24(simian adenovirus 22、simian adenovirus 23、simian adenovirus 24)分类至E亚型(如图5-1)，simian adenovirus 22和simian adenovirus26之间的同源性为91.1％，simian adenovirus 24和simian adenovirus 26之间的同源性为91.2％，simianadenovirus 22和simian adenovirus 24之间的同源性为98.5％，因此根据参考文献，将序列进行同源性比对，采用DNAStar Megalign软件，使用ClustalW算法将参考的序列进行同步比对，构建系统发育树。发现我们的血清型sAd-AY01，与参考文献中SAdV-22、SAdV-23、SAdV-24属于同一亚型——E亚型，为一种新型的黑猩猩腺病毒。
与本发明提供的猩猩腺病毒sAd-AY01，同源性最高的是Pan troglodytesadenovirus clone 17.2major capsid protein gene和Pan troglodytes adenovirusclone 17.2major capsid protein gene，这两种黑猩猩腺病毒目前没有任何保藏机构有保藏，而且也仅公开了2000bp的序列。
发明人经大量研究证明，本发明提供的新型黑猩猩腺病毒sAd-AY01具有非常高的病毒滴度，病毒滴度能达到5×108FFU/mL，远高于现有的黑猩猩腺病毒及人腺病毒的病毒滴度。
另一方面，本发明提供了一种黑猩猩腺病毒载体psAd，主要通过构建穿梭质粒psAd-shuttle，线性化后与如上所述的黑猩猩腺病毒基因进行同源重组，制备含有高变区域HVR序列的黑猩猩腺病毒载体psAd。
在一些方式中，所述的质粒含有荧光标记的核酸或者含有荧光蛋白的核酸；所述穿梭质粒psAd-shuttle具有如序列表Seq ID NO.3所示的核苷酸序列，包括复制子(pACYC)、抗性基因(kanamycin)、绿色荧光表达框(RSV promoter、EGFP、BGHpolyA)核酸。
进一步地，所述环状质粒psAd具有如序列表Seq ID NO.2所示的核苷酸序列，包括复制子(pACYC)、抗性基因(kanamycin)、绿色荧光表达框(RSV promoter、EGFP、BGHpolyA)核酸。
黑猩猩腺病毒(sAd)基因组是长度大于36kb的线性DNA，难以对其进行有效得编辑。因此，需要将在细菌中复制相关的元件，复制子(pACYC)、抗性基因(kanamycin)，连接在黑猩猩基因组上，构成环状的质粒。
现有的方法构建环状质粒是通常采用cosmid(噬菌体)的方法，需要购买相应的试剂盒，噬菌体还可能对实验室产生污染。
穿梭质粒通常用于表达载体，用于运载需要表达的基因至目的质粒中。本发明创造性地运用构建穿梭质粒来构建黑猩猩腺病毒载体环状质粒，通过构建包含复制子(pACYC)、抗性基因(kanamycin)、绿色荧光表达框(RSV promoter、EGFP、BGHpolyA)的穿梭质粒psAd-shuttle，再将其线性化后与黑猩猩腺病毒基因组进行同源重组，构成黑猩猩的环状质粒，能让其在细菌中有效复制；同时为了监测质粒在细胞中的转染效率，增加了绿色荧光表达框(RSV promoter、EGFP、BGHpolyA)，在转染到细胞后的TP0代通过荧光量的多少即可判断载体的转染效率。可以理解，这些并不是穿梭质粒所必须的，例如抗性基因(kanamycin)、绿色荧光表达框(RSV promoter、EGFP、BGHpolyA)，当然，最为不必须的是绿色荧光表达框(RSV promoter、EGFP、BGHpolyA)。
本发明构建环状质粒的方法优点在于：1、不需要购买试剂盒，也避免使用噬菌体可能对实验室的污染；2、增加了EGFP荧光序列，可以检验TP0的转染效率；3、更加灵活，可以根据自己的需要构建自己所需要的元件。
再一方面，本发明提供了一种复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，基于如上所述的黑猩猩腺病毒，保守区域缺失基因。
可以这样理解，在本发明提供的黑猩猩腺病毒sAd-AY01制备的环状质粒的基础上，缺失任意一段基因，都可以制得复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体。
在一些方式中，所述缺失的基因与黑猩猩腺病毒复制相关，缺失该基因后的载体为复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体。
在一些方式中，所述缺失的基因包括E1、E2A、E2B、E3、E4中的任意一种或多种。比如缺失E1、E2A、E2B、E3、E4区中的一种，或是缺失任意组合的多个区，如E1和E3；E1、E3和E4；E1、E2A、E3和E4；E1、E2A、E2B、E3和E4等等。
如图2所示，本发明提供的黑猩猩腺病毒载体的保守区基因包括E1、E2A、E2B、E3、E4。
在一些方式中，复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体缺失E1和E3区域的基因。
在一些方式中，构建复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体可以在缺失E1和E3区域的基础上，还缺失E2A、E2B、E4区域。
在一些方式中，缺失E1和E3基因，具有如序列表Seq ID NO.4所示的核苷酸序列。
进一步地，本发明提供了一种复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体psAdΔE1ΔE3，所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体基于如上所述的黑猩猩腺病毒，敲除其E1和E3基因，获得缺失E1和E3基因的黑猩猩腺病毒载体psAdΔE1ΔE3。
所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括上述高变区区域的序列，后者六邻高变区域中的一个区域的序列或者多个序列所示的区域。
所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体psAdΔE1ΔE3具有如序列表Seq ID NO.4所示的核苷酸序列。
野生型的黑猩猩腺病毒载体能够在普通细胞中进行复制扩增，该载体在应用上需要缺失其复制相关的元件，构建复制缺陷型的腺病毒载体，使其只能在特定的互补细胞系中复制包装，而在不能在普通细胞中复制包装。因此本发明特异性得敲除了黑猩猩腺病毒载体psAd的E1、E3基因，使其只能在特定的细胞系(如293细胞系)中包装，并将其命名为psAd△E1△E3。可以理解，本发明的腺病毒也敲除其它位点，或者其它位点缺失的腺病毒，比如E2A、E2B、E4位点的缺失，从而获得复制缺陷型腺病毒载体。
再一方面，本发明提供了一种复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建穿梭质粒psAd-shuttle，线性化后与前述任意实施方式之一中所述的黑猩猩腺病毒基因进行同源重组；优选的，该穿梭质粒包括荧光标记的环状质粒psAd；
(2)敲除psAd的E1基因，获得E1基因缺失的黑猩猩腺病毒载体psAdΔE1；可选的，引入酶切位点，例如酶切位点PsiI；
(3)敲除psAdΔE1的E3基因，获得缺失E1和E3基因的黑猩猩腺病毒载体psAdΔE1ΔE3。
进一步地，步骤1)所述的穿梭质粒psAd-shuttle具有如序列表Seq ID NO.3所示的核苷酸序列；环状质粒psAd具有如序列表Seq ID NO.2所示的核苷酸序列。
进一步地，步骤2)通过CRISPR/Cas9酶切psAd的E1基因，并插入含有PsiI酶切位点的HRPT序列，再经纯化和连接，获得psAdΔE1；所述HRPT序列具有如序列表Seq ID NO.5所示的核苷酸序列。
进一步地，步骤3)通过CRISPR/Cas9酶切psAd△E1，获得的产物与融合片段pVIII-U-exon进行无缝克隆，获得psAd△E1△E3；所述融合片段pVIII-U-exon具有如序列表SeqID NO.6所示的核苷酸序列。
现有的腺病毒载体构建普遍采用穿梭质粒，需要寻找单一的酶切位点。本发明创造性地采用CRISPR/cas9来构建重组腺病毒载体，通过比对，选择合适的E1、E3、E4、E2a敲除位点，根据E1、E3、E4、E2a序列的位置，敲除的基因碱基的数量，选择CRISPR位点，并设计了最佳的gRNA，从而完成重组腺病毒载体的构建。
再一方面，本发明提供了一种疫苗，在如上所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的基因缺失区，包含目的基因。
可以理解，缺失区域所插入的核酸序列可以是任何核酸序列，例如传染病、肿瘤等序列，这些序列可以通过该载体获得或者表达蛋白，从而制备疫苗试剂。
在一些方式中，所述基因缺失区包括E1、E2A、E2B、E3、E4中的任意一种或多种。
在一些方式中，所述目的基因为病毒、细菌、肿瘤的基因或基因片段。
在一些方式中，所述目的基因为新型冠状病毒S基因。
在一些方式中，所述目的基因位于缺陷型黑猩猩腺病毒载体的E1区，所示缺陷型黑猩猩腺病毒载体具有如序列表Seq ID NO.4所示的核苷酸序列。
在一些方式中，本发明提供了一种新型冠状病毒疫苗，通过构建一种表达新型冠状病毒S基因的重组黑猩猩腺病毒载体，再经293细胞包装而获得；所述S基因表达在如上的缺陷型黑猩猩腺病毒载体的E1区，构成重组腺病毒载体pSAd-S。
再一方面，本发明提供了一种表达新型冠状病毒S基因的重组黑猩猩腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
(a)构建如前述的黑猩猩腺病毒载体的E1区域穿梭质粒pSsAdE1；
(b)穿梭质粒pSsAdE1上增加WPRE元件获得pSsAdE1-WPRE元件；
(c)构建表达新冠病毒COVID-19完整S蛋白基因的穿梭质粒pSsAdE1-WPRE-S；
(d)穿梭质粒pSsAdE1-WPRE-S与腺病毒载体质粒psAd△E1△E3的同源重组，构成重组腺病毒载体pSAd-S。
进一步地，所示WPRE元件具有如序列表Seq ID NO.17所示的核苷酸序列。
再一方面，本发明提供了一种重组黑猩猩腺病毒的滴度测定方法，通过由六邻体hexon超变区HVR基因片段制备的特异性抗体，检测超变区HVR抗原表位的变化，从而检测黑猩猩腺病毒的滴度，所述HVR基因具有如序列表Seq ID NO.7所示的核苷酸序列。
进一步地，所述黑猩猩腺病毒为如上所述的黑猩猩腺病毒、或复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体、或如上所述的疫苗、或任意重组黑猩猩腺病毒载体等。
本发明的新型黑猩猩腺病毒与传统的人类5型腺病毒与传统的黑猩猩腺病毒有较大的差异，经过检测，本发明的黑猩猩腺病毒的滴度的检测需要制备其特有的抗体。新型黑猩猩腺病毒主要的外壳蛋白为hexon、penton、fiber，而hexon的超变区HVR是鉴定腺病毒血清型的关键区域，因此表达HVR蛋白，制备小鼠血清，可以检测该黑猩猩腺病毒的滴度。
本发明提供的黑猩猩腺病毒滴度的检测方法，可用于本发明提供的重组黑猩猩腺病毒psAd-S疫苗滴度的检测。
再一方面，本发明提供了一种重组黑猩猩腺病毒载体的包装方法，将pSAd-S用I-sceI酶切，线性化后的质粒用于转染；转染293细胞，收集细胞悬液。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)提供了一种全新的黑猩猩腺病毒，病毒滴度能达到5X10^8FFU/mL；
(2)创造性地通过穿梭质粒构建了黑猩猩腺病毒环状载体；
(3)提供了全新的重组黑猩猩腺病毒载体的CRISPR/cas9的构建方法，自主设计最佳敲除位点和gRNA，避免了过去载体构建用穿梭质粒敲除，需要找单一的酶切位点的困扰，构建方法简便高效，周期短；
(4)提供了一种全新的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，在人群中没有预存抗体存在，E1、E3的敲除具有安全性，同时与293细胞中人类腺病毒5型E1有十分高的差异性，可以极大地避免恢复突变(RCA)，更具有安全性；
(5)提供了全新的黑猩猩腺病毒的滴度测定方法；
(6)构建的新型冠状病毒疫苗，经过几十代的传代，疫苗的稳定性很强，不引起突变；
(7)构建的新型冠状病毒疫苗在小鼠模型中能诱导很强的体液免疫以及细胞反应。
附图说明
图1为黑猩猩腺病毒基因高变区HVR1-9序列示意图。
图2为黑猩猩腺病毒基因保守区的E1、E2A、E2B、E3、E4区示意图。
图3为实施例1中琼脂糖凝胶电泳确认黑猩猩腺病毒基因组DNA序列结果图，其中M：15000bp Marker；1、2：黑猩猩腺病毒基因组DNA。
图4为实施例2中黑猩猩腺病毒sAd-AY01的HVR1-6序列与部分已知血清型HVR1-6序列比较结果图。
图5-1为参考文献中的黑猩猩腺病毒血清型分型示意图
图5-2为实施例2中黑猩猩腺病毒sAd-AY01的HVR1-6序列与已知血清型HVR1-6序列构建进化树分析序列的同源性及差异性的过程示意图。
图6为实施例3中构建穿梭质粒psAd-shuttle的酶切鉴定电泳结果图，其中M:15000bp Marker；1：psAd-shuttle BamHI&EcoRI酶切
图7为实施例3中构建的腺病毒基因组DNA环状化穿梭质粒psAd-shuttle的质粒图谱。
图8为实施例3中构建黑猩猩腺病毒载体质粒psAd的酶切鉴定电泳结果图，其中M:15000bp Marker；1：psAd BamHI酶切；2：psAd XhoI酶切。
图9为实施例3中构建的黑猩猩腺病毒载体质粒psAd的质粒图谱。
图10为实施例4中CRISPR/Cas9“酶切”psAd质粒琼脂糖凝胶电泳结果图，其中M：15000bp Marker；1：psAd使用cas9“酶切”E1。
图11为实施例4中HRPT序列扩增片段凝胶电泳结果图，其中：M：15000bp Marker；1：HRPT片段。
图12为实施例4中构建psAdΔE1酶切后鉴定电泳结果图。
图13为实施例4中CRISPR/Cas9“酶切”psAd△E1质粒琼脂糖凝胶电泳结果图，其中M：15000bp Marker；1、2：psAd△E1使用cas9“酶切”E3。
图14为实施例4中pVIII和U-exon片段扩增凝胶电泳结果图，其中M：15000bpMarker；1：pVIII部分片段；2：U-exon部分片段。
图15为实施例4中融合PCR扩增pVIII-U-exon片段凝胶电泳结果图。
图16为实施例4中构建psAd△E1△E3的酶切鉴定电泳结果图，其中M：15000bpMarker；1：psAd△E1△E3 BamHI酶切；2：psAd△E1△E3 XhoI酶切；右图为psAd△E1△E3质粒酶切模拟图。
图17为实施例4中构建的psAd△E1△E3的质粒图谱。
图18为实施例5中PCR扩增left arm、puc&amp、right arm、CMV-MCS-SV40序列凝胶电泳结果图，其中：M：2000bp Marker；1为片段left arm；2为片段puc&amp；3为片段rightarm；4为片段CMV-MCS-SV40。
图19为实施例5中构建穿梭质粒pSsAdE1的酶切鉴定电泳结果图。
图20为实施例5中构建pSsAdE1-WPRE元件的酶切鉴定电泳结果图，其中M：15000bpMarker；1、2为pSsAdE1-WPRE NotI酶切鉴定；成功构建pSsAdE1-WPRE元件。
图21为实施例5中构建穿梭质粒pSsAdE1-WPRE-S的酶切鉴定电泳结果图，其中M：2000bp Marker；1、2为pSsAdE1-WPRE-S EcoRV&HindIII。
图22为实施例6中构建重组新型黑猩猩腺病毒载体psAd-S的酶切鉴定电泳结果图，其中M：15000bp Marker；1：psAd-S HindIII酶切鉴定；2：psAd-S BamHI。
图23为实施例7中TP0至TP2引起的细胞病变显微镜照片。
图24为实施例8中NI柱纯化获得sAd-HVR蛋白结果图，其中M：蛋白Maker；1、sAd-HVR菌液上清；2：纯化后的sAd-HVR蛋白；3：纯化后的sAd-HVR蛋白稀释液。
图25为实施例11中重组新型黑猩猩腺病毒psAd-S蛋白表达Western Blot检测结果图，其中：M：180kda maker；1、293空白细胞对照；2、3：psAd-S病毒感染293细胞的样品。
图26为实施例12中采用sAd-AY01中和抗体实验细胞病变情况示意图。
图27为实施例12中采用为hAd5中和抗体实验细胞病变情况示意图。
图28为实施例13的ELISA法检测小鼠肌肉注射psAd-S疫苗后的IgG抗体滴度结果示意图。
图29为实施例13的疫苗psAd-S诱导的CD8+T细胞反应结果示意图。
图30为实施例13的疫苗psAd-S诱导的CD4+T细胞反应结果示意图。
图31为实施例13的肌肉注射疫苗psAd-S后细胞免疫反应代表图。
图32为实施例13的空白对照免疫反应代表图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的优选实施例作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1新型黑猩猩病毒毒株的分离
采集黑猩猩的肛拭子，通过HEK293细胞(购于ATCC，批号70009859)培养其中的黑猩猩腺病毒。
首先，将采集回来的肛拭子在冰上融化，直至室温，放入5ml冻存管中，加入3mlDMEM，涡旋30s，4℃，2000rpm，离心5min，将上述上清经过0.2μm针孔滤膜过滤约200μl至无菌的48孔板中备用，然后接种于提前准备48孔的HEK293细胞中，每日观察其病变情况，若48小时细胞长满，则收集细胞悬液，冻融2次后冻存在-20℃，若没有长满，待第5日时收集细胞悬液，继续接种HEK293细胞，直至病变，提取病毒基因组进行PCR扩增鉴定。将鉴定正确的毒株进一步扩大，采用Hirt Virial DNA Extract方法(主要步骤为收集3.5ml感染的细胞反复冻融3次，加入20％SDS 87.5ul，20mg/mL Proteinase K 87.5ul，55℃孵育4h；往离心管中逐滴加入5mol/L的NaCl溶液1ml，混匀，55℃孵育4h；用酚︰氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，取上层水相，加入1/10体积的3mol/L NaAc和2倍体积的无水乙醇置-20℃30min，4℃，12 400r/min离心5min，缓慢弃掉上清，自然风干残留的酒精，然后加入50μL的Elution Buffer溶解DNA)提取黑猩猩腺病毒基因组。琼脂糖凝胶电泳确认黑猩猩腺病毒基因组DNA序列，结果如图3所示，其中M：15000bp Marker；1、2：黑猩猩腺病毒基因组DNA，大于15000bp的序列即为黑猩猩腺病毒的基因组。
实施例2新型黑猩猩腺病毒分类
将实施例1获得的黑猩猩腺病毒基因组DNA进行全基因组测序，由生工生物工程(上海)股份有限公司负责，确定最终的病毒基因组序列。该黑猩猩腺病毒保藏至中国典型培养物保藏中心，分类命名为：猩猩腺病毒sAd-AY01，保藏编号为：CCTCC NO：V202120。猩猩腺病毒sAd-AY01基因组全长36687bp。
人腺病毒属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，到目前为止，人腺病毒共分离到52个血清型，分属于A～G7个亚属。目前腺病毒感染的诊断与分型主要应用病毒分离技术、抗体检测技术，以及分子生物学技术(如聚合酶链反应、限制性片段长度多态性分析技术、原位杂交技术、实时荧光定量PCR技术)等。
本发明基于六邻体基因高变区HVR1-6的序列与数据库(genebank)中的已知血清型HVR1-6序列相比较(参考文献：Rika MO，Yasushi S，Tsunetada K，et a1.QuantitativeDetection and Rapid Identification of Human Adenoviruses.J ClinMicrobio1.2007.4 5：9 5 8.967.)，比较结果如图4所示，其中1～12代表12种已知血清型HVR1-6序列，13代表猩猩腺病毒sAd-AY01的HVR1-6序列，从图3可以看出，猩猩腺病毒sAd-AY01的HVR1-6序列与部分已知血清型HVR1-6序列的同源性在49.8～67.5％之间。再基于其六邻体基因高变区HVR1-6的序列与数据库(genebank)中的已知黑猩猩腺病毒部分血清型HVR1-6序列、猴类腺病毒部分血清型HVR1-6序列、人类腺病毒部分血清型HVR1-6序列相比较，同源性在49～91％之间，使用DNAstar软件构建系统发育进化树(图5-2)，ClustalW的计算方法分析序列的同源性以及差异性，同源性最大的腺病毒序列为Pan troglodytesadenovirus clone 17.2major capsid protein gene(GenBank:MF176134.1)的部分基因，最大的同源性为91.63％，最终确定该黑猩猩腺病毒为尚未发现的新型腺病毒。
实施例3构建含有荧光标记的新型黑猩猩腺病毒(psAd)载体
黑猩猩腺病毒(sAd)基因组是长度大于36kb的线性DNA，难以对其进行有效得编辑。因此，需要将在细菌中复制相关的元件，复制子(pACYC)、抗性基因(kanamycin)，连接在黑猩猩基因组上，构成环状的质粒。
因此，需要先将复制子(pACYC)、抗性基因(kanamycin)与黑猩猩基因组左臂(～1400bp)，与右臂(～1400bp)构建成大小约为6000bp的环状质粒，将其线性化后与黑猩猩腺病毒基因组共同转化至BJ5183感受态，进行同源重组，构成黑猩猩的环状质粒，能让其在细菌中有效复制；同时为了监测质粒在细胞中的转染效率，增加了绿色荧光表达框(RSVpromoter、EGFP、BGHpolyA)，在转染到细胞后的TP0代通过荧光量的多少判断大载体的转染效率。
3.1构建腺病毒基因组DNA环状化的穿梭质粒psAd-shuttle
①引物设计黑猩猩腺病毒sAd-AY01的左臂、右臂、以及细菌元件
pACYC-F：tttgaggtatattattgatgatgttaattaaTTGGTTCCACTGAGCGTCAGAC
BGHpolyA-R：tttgaggtatattattgatgatgttaattaaAGACGAAAGGGCCTCGTTTGTA
Left arm-F：catcatcaataatatacctcaaac
Left arm-BamHI-R：
CTTTGCTGGAAGCCACCGTGGAGGATCCAAGTAAACACACATGTGTGGCA
Right arm-F：TCCACGGTGGCTTCCAGCAA
Right arm-R：catcatcaataatatacctcaaac
②基因合成细菌元件，复制子(pACYC)、抗性基因(kanamycin)、绿色荧光表达框(RSV promoter、EGFP、BGHpolyA)；
③PCR扩增左臂、右臂、以及细菌元件这3个片段；
④使用博迈德BM smealess cloning kit将其进行无缝克隆；
⑤卡那霉素抗性进行筛选，挑选正确的菌落进行酶切鉴定，结果如图6所示，其中M:15000bp Marker；1：psAd-shuttle BamHI&EcoRI酶切鉴定。由图6可见，成功构建了穿梭质粒psAd-shuttle，构建的穿梭质粒psAd-shuttle图谱如图7所示。
3.2穿梭质粒psAd-shuttle与提取的黑猩猩腺病毒基因组进行同源重组获得黑猩猩腺病毒载体质粒psAd
①BamHI线性化穿梭质粒psAd-shuttle，酶切体系如下所示：
穿梭质粒psAd-shuttle 3μg；BamHI 2μL；buffer cutsmart 4μL；补水至40μL。反应条件37℃，1h；65℃，20min灭活；
②酶切产物去磷酸化反应体系：酶切反应液40μL；去磷酸化酶1μL；去磷酸化buffer 5μL；补水至50μL。反应条件37℃，1h；65℃，5min灭活；
③使用OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收；
④取100ng纯化后的穿梭质粒和100ng提取的腺病毒基因组DNA共转化BJ5183感受态细胞，转化产物涂布含有Kan的LB平板，37℃培养12～16h；
⑤挑取菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒进行酶切验证，结果如图8所示，其中M:15000bp Marker；1：psAd BamHI酶切；2：psAd XhoI酶切；由图8可见，成功构建了含有荧光标记的新型黑猩猩腺病毒psAd质粒，构建的质粒图谱如图9所示。
实施例4构建复制缺陷型的新型黑猩猩腺病毒载体psAd△E1△E3
4.1利用CRISPR/cas9的方法对黑猩猩腺病毒载体psAd的E1区域进行切除获得E1敲除的载体质粒psAd△E1并引进酶切位点PsiI
①目的基因E1 CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件确定了E1基因敲除的靶序列；
E1A：TCATTCACCGCCTCCTCGTT；
E1B：ggacctgcgacccgatcatt；
②sAd-E1A-gRNA和sAd-E1B-gRNA的DNA扩增
1)sAd-E1A-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGATTCACCGCCTCCTCGTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
2)sAd-E1B-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGacctgcgacccgatcattGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
③设计扩增sAd-E1A-gRNA和sAd-E1B-gRNA的DNA模板的上下游引物
sAd-E1A-gRNA-Forward：TAATACGACTCACTATAG ATTCACCGCCTCCTC
sAd-E1A-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAAC AACGAGGAGGCGGTGAAT
sAd-E1B-gRNA-Forward：TAATACGACTCACTATAGacctgcgacccgatc
sAd-E1B-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAACaatgatcgggtcgcaggt
④按照InvitrogenTMGeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit的说明，获得扩增sAd-E1A-gRNA和sAd-E1B-gRNA的DNA模板，体外转录获得sAd-E1A-gRNA和sAd-E1B-gRNA，并进行纯化，获得gRNA，其体外转录后的序列为：
sAd-E1A-gRNA：
GAUUCACCGCCUCCUCGUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
sAd-E1B-gRNA：
GaccUgcgacccgaUcaUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
⑤CRISPR/Cas9“酶切”psAd
使用sAd-E1A-gRNA、sAd-E1B-gRNA和cas9双酶切实施例3获得载体质粒psAd，反应体系为Cas9蛋白3μg，sAd-E1A-gRNA 3ug，sAd-E1B-gRNA 3ug，psAd载体质粒3ug，NEBbuffer 3.1 5uL，补充水至50uL。
反应于37℃孵育过夜，琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图10所示，其中M：15000bpMarker；1：psAd使用cas9“酶切”E1。由图10可见，成功获得CRISPR/Cas9“酶切”psAd质粒，使用Axygen胶回收试剂盒将载体进行纯化。
⑥扩增插入E1区域的HRPT序列，含有PsiI酶切位点
扩增引物：
sAd-E1-HRPT-F：atgtgcccgagaacgaccccaaccttgcatttctcagtcctaaac
sAd-E1-HRPT-R：cccgttgcaggacaacaccaaatcacttttgcatatagtatacatg
扩增序列为：
cttgcatttctcagtcctaaacagggtaatgggctggggctgaatcacatgaaggcaaggtcagatttttattattatgcacatctagcttgaaaattttccattaagtcaattacagtgaaaaacctcacctggtattgaatgcttgccttgtatgtctggctattctgtgtttttattttaaaattataatatcaaaatatttgtgttataaaatattctaactatggaggccataaacaagaagactaaagttctctcctttcagccttctgtacacatttcttctcaagcactggtttatgcatgtatactatatgcaaaagtg
PCR扩增片段，如图11所示，其中：M：15000bp Marker；1：HRPT片段；使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化。
⑦使用北京博迈德基因技术有限公司BM smealess cloning kit对载体与片段进行连接；酶切后鉴定结果如图12所示，成功获得E1基因缺失的黑猩猩腺病毒载体psAd△E1。
4.2利用CRISPR/cas9的方法对psAd△E1腺病毒E3区域进行切除获得E1E3同时敲除的载体质粒psAd△E1△E3
①目的基因E3 CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件确定了E1基因敲除的靶序列
sAd E3A：AGCGGCAGGGATACAAGTCC；
sAd E3B：GGGGAAATCACCCTCAAGCT；
②sAd-E3A-gRNA和sAd-E3B-gRNA的DNA扩增
1)sAd-E3A-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGCGGCAGGGATACAAGTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
2)sAd-E3B-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGGGAAATCACCCTCAAGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
③设计扩增sAd-E3A-gRNA和sAd-E3B-gRNA的DNA模板的上下游引物
sAd-E3A-gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGCGGCAGGGATACAAG
sAd-E3A-gRNA-R：TTCTAGCTCTAAAACGGACTTGTATCCCTGCCG
sAd-E3B-gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGGAAATCACCCTCAA
sAd-E3B-gRNA-R：TTCTAGCTCTAAAACAGCTTGAGGGTGATTTCC
④按照InvitrogenTMGeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit的说明，获得扩增sAd-E3A-gRNA和sAd-E3B-gRNA的DNA模板，体外转录获得sAd-E3A-gRNA和sAd-E3B-gRNA，并进行纯化，获得gRNA，其体外转录后的序列为：
sAd-E3A-gRNA：
GCGGCAGGGAUACAAGUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
sAd-E3B-gRNA：
GGGAAAUCACCCUCAAGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
⑤CRISPR/Cas9“酶切”psAd△E1的E3
使用sAd-E3A-gRNA、sAd-E3B-gRNA和cas9双“酶切”psAd△E1质粒，反应体系为Cas9蛋白3ug，sAd-E3A-gRNA 3ug，sAd-E3B-gRNA 3ug，psAd△E1载体质粒3ug，NEB buffer3.15μL，补充水至50μL。
酶切反应于37℃孵育过夜。使用Axygen胶回收试剂盒将载体进行纯化。酶切结果如图13所示：M：15000bp Marker；1、2：psAd△E1使用cas9“酶切”产物。
⑥PCR扩增切除的pVIII和U-exon区域，胶回收；
扩增引物为：
E3A-F：AGGAGCGGCAGGGATACAAG
E3A-R：TCAATCGTAGCCGTCCACCG
E3B-F：AGTCGGTGGACGGCTACGATTGATCACCCCCTTATCCAGTGAAAT
E3B-R：CGAGGTCCACCCCCTCTCC
扩增的片段为：
E3A-F和E3A-R为一对引物，扩增pVIII部分片段；E3B-F和E3B-R为一对引物，扩增U-exon部分片段。如图14所示，其中M：15000bp Marker；1：pVIII部分片段；2：U-exon部分片段。
⑦使用E3A-F和E3B-R融合PCR扩增pVIII-U-exon片段，胶回收；如图15所示，最终片段是1775bp的融合片段。
⑧使用北京博迈德基因技术有限公司BM smealess cloning kit对步骤⑤cas9“酶切”后的载体与步骤⑦的pVIII-U-exon融合片段进行无缝克隆；转化至DH5α感受态，卡那霉素抗性筛选，37℃培养过夜，挑取菌落，提取质粒，BamHI和XhoI酶切鉴定；如图16所示：M：15000bp Marker；1：psAd△E1△E3 BamHI酶切；2：psAd△E1△E3 XhoI酶切；右图为psAd△E1△E3质粒酶切模拟图；结果正确，成功构建质粒psAd△E1△E3，质粒图谱如图17所示。
实施例5构建新型黑猩猩腺病毒载体psAd△E1△E3的E1区域通用的穿梭质粒pSs23E1以及表达新冠病毒S基因的穿梭质粒pSsAdE1-S
新型黑猩猩腺病毒载体长达35kb，酶切位点众多，难以直接在载体上进行分子操作，需要构建其特殊的穿梭质粒，将需要表达的外源基因通过同源重组的方式整合到腺病毒载体上。
S蛋白是新冠病毒的主要抗原蛋白，在感染的过程中会引起主要的免疫反应，因此构建新型黑猩猩载体新冠疫苗选择COVID-19的S基因作为表达的外源基因。因此设计在E1区域使用CMV启动子驱动表达，可以产生大量的抗原，可引起较为强烈的免疫反应。
5.1构建新型黑猩猩腺病毒载体E1区域通用的穿梭质粒pSsAdE1
构建黑猩猩腺病毒载体的穿梭质粒需要质粒相关元件(复制子puc origin、抗性基因、真核系统外源基因表达框CMV-MCS-SV40 polyA)、E1区域的左臂右臂，以合适的顺序进行连接。
①PCR扩增黑猩猩E1区域的左臂、右臂、复制相关元件、抗性基因、CMV-MCS-SV40polyA，左臂、右臂的模板是黑猩猩腺病毒载体，复制相关元件、抗性基因、CMV-MCS-SV40polyA的模板则通过合成的方式获得。
引物设计如下
left-arm-F：TGGATCGGTGATCACCGATCCCGTTTCAAAGTGTAGATCTGACTC
left-arm-R：GTTAGCTCACTCATTAGGCACCCttaattaacatcatcaataatatacc
puc-F：GGGTGCCTAATGAGTGAGCTA
Amp-R：GACGTCAGGTGGCACTTTTC
right-arm-F：CCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTCTCGACCAGCCGGATGAGC
right-arm-R：CCCCGTAATTGATTACTATTAATAGAGTGAGTAGTGTTTGGGG
CMV-F：TTAATAGTAATCAATTACGGGGT
SV40-R：CGGGATCGGTGATCACCGAT
PCR扩增体系：left-arm-F、left-arm-R为一对引物扩增穿梭质粒的左臂，puc-F、Amp-R为一对引物扩增质粒所需的复制子和抗性基因，right-arm-F、right-arm-R为一对引物扩增穿梭质粒的右臂，CMV-F、SV40-R为一对引物扩增外源基因表达框CMV-MCS-SV40polyA(Seq ID NO.16)。
扩增结果如图18所示：M：2000bp Marker；1为片段left arm；2为片段puc&amp；3为片段right arm；4为片段CMV-MCS-SV40。
②使用Axygen胶回收试剂盒将以上4个片段进行纯化；
③使用北京博迈德基因技术有限公司BM smealess cloning kit对4个片段进行连接；
连接体系：left arm、puc&amp、right arm、CMV-MCS-SV40片段各2ul；2×Mease10ul；补水至20ul。
反应条件：50℃，40min。转化DH5α感受态细胞，LB固体培养基(氨苄抗性)涂布，37℃过夜培养。
④筛选后提取质粒酶切鉴定；结果如图19所示，成功获得穿梭质粒pSsAdE1。
5.2穿梭质粒上增加WPRE元件获得pSsAdE1-WPRE元件
WPRE具有保持mRNA稳定，提高的病毒产量的作用
①PCR扩增WPRE元件
引物设计
WPRE-NotI-F：ATATCCAGCACAGTGGCGGCCGGCGGCCGCTCGACAATCAACCTCTGGATTA
WPRE-NotI-R：TAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGGCGGCCGCCAGGCGGGGAGGCGGCCCA
②PCR扩增WPRE片段
③穿梭质粒pSsAdE1 NotI酶切，酶切反应体系：载体pSsAdE1，NotI 1ul；10×cutsmart buffer 5ul；补水至50ul。
④将WPRE与酶切后的pSsAdE1胶回收纯化；
⑤使用博迈德BM Smealess cloning kit将其进行无缝克隆；
反应体系：pSsAdE1-UCOE0.65、WPRE片段各2ul；2×BM smealess10ul；补水至20ul。反应条件：50℃，40min。
⑥转化DH5α感受态细胞，LB固体培养基(氨苄抗性)涂布，37℃过夜培养，筛选后提取质粒酶切鉴定；如图20所示：M：15000bp Marker；1、2为pSsAdE1-WPRE NotI酶切鉴定；成功构建pSsAdE1-WPRE元件。
5.3表达新冠病毒COVID-19完整S蛋白基因的穿梭质粒pSsAdE1-WPRE-S的构建
①PCR扩增COVID-19S蛋白基因，设计引物如下：
S-EcoRV-F：TCCCTGATCACTGCAGAATTCGATATCgccaccATGTTCGTGTTTCTGGTGCTG
S-WPRE-HindIII-R：ATTGTCGAGCGGCCGCAATCGATAAGCTTtcaGGTGTAGTGCAGCTTCAC
②EcoRV、HindIII酶切pSsAdE1-WPRE，酶切反应体系：载体pSsAdE1-WPRE，EcoRV、HindIII 1ul；10×cut smart buffer 5ul；补水至50ul。
③将S与酶切后的pSsAdE1胶回收纯化；
④使用博迈德BM Smealess cloning kit将其进行无缝克隆；
反应体系：pSsAdE1-WPRE、S片段各2ul；2X BM smealess 10ul；补水至20ul。反应条件：50℃，40min。
⑤转化DH5α感受态细胞，LB固体培养基(氨苄抗性)涂布，37℃过夜培养，筛选后提取质粒酶切鉴定；如图21所示：M：2000bp Marker；1、2为pSsAdE1-WPRE-S EcoRV&HindIII酶切鉴定；结果正确，成功构建穿梭质粒pSsAdE1-WPRE-S。
实施例6同源重组获得重组新型黑猩猩腺病毒载体psAd-S
6.1穿梭质粒pSs23E1-WPRE-S与腺病毒载体质粒psAd△E1△E3的同源重组
1)PacI和PsiI对穿梭质粒pSs23E1-WPRE-S和腺病毒载体质粒psAd△E1△E3进行酶切，酶切反应体系如下：
A、穿梭质粒pSs23E1-WPRE-S 3μg；PacI 2μL；buffer cutsmart 4μL；补水至40μL。
B、腺病毒载体质粒psAd△E1△E3 3ug；PsiI 2μL；buffer cutsmart 4μL；补水至40μL。
反应条件37℃，1h；65℃，20min灭活。
2)酶切产物去磷酸化
反应体系：酶切反应液37.5μL；去磷酸化酶1μL；去磷酸化buffer 5μL；补水至50μL。反应条件37℃，1h；65℃，5min灭活。
3)使用OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段。
4)取100ng纯化后的穿梭质粒和100ng纯化后的腺病毒载体共转化BJ5183感受态细胞，转化产物涂布含有Kan的LB平板，37℃培养12～16h。
5)挑取菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒进行XhoI酶切验证。
6)将阳性质粒转化至DH5a感受态，挑取一个菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒再次进行HindIII和BamHI酶切验证。如图22所示：M：15000bp Marker；1：psAd-S HindIII酶切鉴定；2：psAd-S BamHI酶切鉴定；成功构建重组新型黑猩猩腺病毒载体psAd-S。
实施例7重组新型黑猩猩腺病毒psAd-S的包装
使用293细胞(购于ATCC，批号70009859)包装psAd-S载体质粒，操作步骤如下所示：
①准备293细胞：转染前一天准备细胞，将待转染的293细胞接种到6孔板中，0.5x106/孔，于37℃，5％CO2静置培养24小时，转染当天细胞有40-50％汇合率。
②质粒psAd-S线性化：将待转染的质粒用I-sceI酶切，于37℃孵育40min后，65℃灭活20min。
③转染：用100μL无血清培养基将线性化的2μg质粒和PEI分别稀释；向PEI稀释液中加入质粒稀释液，反复吸取5次或涡旋10秒钟混匀，室温下孵育10分钟后形成转染复合物。孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出细胞培养液，加入新鲜的生长培养基2mL，10分钟后将转染复合物加到换了新鲜培养基的细胞中。
④细胞培养：将转染后的293细胞于37℃，5％CO2培养箱中静置培养72-96小时；病毒质粒转染72-96小时后收集6孔板细胞悬液于15ml离心管中即TP0。
⑤持续接毒：将收集的细胞悬液在-80℃反复冻融3次，4℃、2000g离心10分钟，取上清500μL感染293细胞(293细胞需要提前一天准备)，37℃、5％CO2孵育60分钟，补充2mL的FBS的培养基，37℃、5％CO2培养培养72小时，收集细胞悬液即TP1；重复之前的步骤，收集细胞悬液即TP2。持续接毒直至细胞出现病变。
⑥细胞病变：当293细胞培养从TP0至TP2后，细胞逐渐病变，直至293细胞完全病变。TP0至TP2引起的细胞病变情况分别如图23所示，TP2已完全病变。
实施例8重组新型黑猩猩腺病毒psAd-S疫苗滴度的检测
8.1新型黑猩猩腺病毒六邻体蛋白(hexon)超变区HVR抗原蛋白
①构建原核表达pET28b-sAd-HVR，pET28b质粒由北京博迈德基因技术有限公司赠与；
②PET-28a-sAd-HVR质粒转化至BL21(DE3)菌种；
③24℃IPTG过夜诱导表达；
④收获菌液，离心，将菌体沉淀用PBS重悬进行超声破碎；超速离心获得上清；
⑤将上清液经过NI柱纯化获得sAd-HVR蛋白，结果如图24所示，其中M：蛋白Marker；1、sAd-HVR菌液上清；2：纯化后的sAd-HVR蛋白；3：纯化后的sAd-HVR蛋白稀释液；
8.2新型黑猩猩腺病毒六邻体蛋白(hexon)超变区HVR抗体制备
①将HVR蛋白溶于生理盐水中；
②与等体积的弗氏完全佐剂双推法混匀(抗原浓度约0.1mg/mL)；
③皮下多点注射免疫BALB/C小鼠，注射0.2mL；
④3周后用等量抗原与不完全弗氏佐剂同上法混匀后免疫；
⑤4周后连续每周用以上方法加强免疫1次(不完全弗氏佐剂)，共3次；
⑥最后一次免疫3天后，通过断尾取血测血清效价，若达到预期目的，即可放血收集抗血清。
⑦经过间接ELISA检测，HVR抗体浓度达到1:200000，满足条件，终放；
8.3用新型黑猩猩腺病毒HVR抗体检测滴度
准备293细胞，取T75培养瓶中生长良好的细胞，弃上清，PBS洗细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，再加入含有10％胎牛血清的DMEM新鲜培养基10mL终止消化，然后吹打混匀，接种6孔板中(5×105/mL，每孔2ml)，于37℃，5％CO2二氧化碳培养箱中静置培养。24小时后，待细胞贴壁生长成单层细胞，弃去培养基，用无血清DMEM维持液对重组的腺病毒作10^-2～10^-6倍连续稀释，每个稀释度接种2孔，每孔250uL，感染1小时后，弃上清，补充完全培养基，然后于37℃，5％CO2二氧化碳培养箱中静置培养。24h后，弃上清，用PBS洗细胞，每孔1mL，弃PBS后，每孔加1mL冷甲醛固定，室温10min，弃甲醛，再用PBS洗细胞，每孔1mL，加黑猩猩腺病毒HVR抗体孵育，每孔1ml，室温1h后，再次用PBS洗细胞，每孔1mL，孵育羊抗兔-FITC二抗，室温1h后，弃上清，再次用PBS洗细胞，荧光显微镜下计数(200倍,10个连续视野)。计算：病毒滴度(FFU/mL)＝平均数×1013×4×10(-n)。psAd-S病毒的FFU为5×108FFU/mL。
8.4不同腺病毒载体滴度比对
使用本公司保存的腺病毒，以及市场上生产HAd26、HAd5、HAd28、进行病毒滴度的检测，结果如表1所示，sAd-AY01为本发明提供的新型黑猩猩腺病毒，其滴度最高，可以达到5×108FFU/mL，为实现黑猩猩腺病毒疫苗工厂化生产提供了最基本的保障。
表1、不通腺病毒载体滴度比对
病毒类型 sAd-AY01 HAd5 HAd26 HAd 28 Simian adenovirus 40.1
滴度FFU/mL 5×10<sup>8</sup> 1×10<sup>8</sup> 5×10<sup>7</sup> 4×10<sup>7</sup> 1×10<sup>8</sup>
实施例9重组新型黑猩猩腺病毒psAd-S疫苗稳定性的检测
准备293细胞，取T75培养瓶中生长良好的细胞，弃上清，PBS洗细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，再加入含有10％胎牛血清的DMEM新鲜培养基10mL终止消化，然后吹打混匀，将293细胞种入6孔板中(5×105cells/mL，2mL/孔)，室温孵育1小时使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度。用psAd-S病毒颗粒进行感染，感染的滴度为2MOI/孔。293细胞48小时后发生病变后，收集细胞，反复冻融3次后2000g离心，收集上清，将收集的上清检测FFU，后重新感染新的293细胞，直至30代。将收集的第5、10、15、20、25、30代次的病毒液进行检测，发现病毒的基因组仍然完整，说明复制缺陷型psAd-S病毒能够在293细胞中稳定包装。
实施例10重组新型黑猩猩腺病毒psAd-S恢复突变(RCA)的检测
psAd-S病毒RCA检测，检测方法如下：
1、准备psAd-S病毒液，并测其病毒滴度，测定病毒颗粒浓度，病毒液加1％Universal nuclease(Universal nuclease 7.5～15units/mL病毒液)消化宿主细胞的DNA，37℃水浴40min。用300Kd的超滤离心管，经1000g，30min离心，1×PBS洗脱收集病毒颗粒，测A260，颗粒浓度＝A260×1.1×1012VP/mL。
2、病毒感染，准备A549细胞的6孔板，每孔细胞为2.5×105/孔，弃培养基，PBS清洗一次，将腺病毒按照1×109vp/孔接种病毒，感染A549细胞，野生型sAd-AY01腺病毒为对照，37℃，5％CO2，1h后，弃去病毒液，补足5％完全培养基，37℃，5％CO2培养48h。
3、免疫染色，弃细胞上清，PBS表面冲洗细胞，用冰甲醛固定，放置-20℃，20min，1×PBS清洗三遍，每遍5min，每孔加入2ml 1％BSA-PBS溶液，放置摇床，孵育1h。弃去上清，加入腺病毒5型荧光抗体(1:500稀释)，孵育1h，1×PBS清洗三遍，每遍5min。
用10倍荧光显微镜观察，使用公式计算RCA
RCA＝(average positive cell field)×(374field/well)×(dilutionfactor))/Total VPs in 0.5ml viral sample
判断标准为RCA的水平小于1RCA/3×1010vp。经过统计psAd-S的RCA的水平小于1RCA/3×1010vp，说明本发明所制备的复制缺陷型psAd-S病毒在293细胞中能够稳定包装，不会转化为野生型或转化为野生型的几率较低。
实施例11重组新型黑猩猩腺病毒psAd-S蛋白表达检测
提前一天准备293细胞，置于12孔细胞培养板中，使用psAd-S病毒感染293细胞，48小时后细胞发生病变，收集全部的1ml细胞，使用PBS洗涤，制样，用于Western Blot检测；使用Spike的RBD蛋白抗体作为二抗，检测目的蛋白，RBD蛋白抗体购自北京义翘神州科技股份有限公司。Western Blot检测结果如图25所示：M：180kda marker；1、293空白细胞对照；2、3：psAd-S病毒感染293细胞的样品；结果说明黑猩猩腺病毒载体表达的S蛋白能够在293细胞中高效表达。
实施例12黑猩猩腺病毒预存免疫检测
人群中普遍存在针对AdHu5的中和抗体，约有三分之一的人群成年时已对其产生免疫性，而人群中却没有新型黑猩猩腺病毒的抗体，因此人体注射该新型黑猩猩腺病毒载体疫苗并不会被预存免疫中和，能产生足够的抗体。通过中和抗体实验，可以验证该结果。实验设计如表1所示，实验步骤如下：
(1)前一日铺96孔板，制备A549细胞悬液，使细胞浓度约为4.8×105个/mL(每个96孔板按照4.8×106个细胞准备)，用8道排枪加到96孔细胞培养板中，每孔100μl，置37℃，5％CO2培养箱中，静培；
(2)第二日，接种野生型病毒(sAd-AY01-TP5，Ad5-Wild-F2),取1.5ml灭菌EP管，稀释按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8(900μl无血清培养基+100μl病毒液)，倍比稀释，注意每步稀释更换Tip，并在涡旋振荡器上混匀5s，备用；
(3)96孔板的细胞，用真空泵连接200μl tip弃上清，然后1×PBS洗细胞，再次弃上清；
(4)感作细胞，100μl/孔，作用2h，弃上清，补充5％FBS的完全培养基，200μl/孔，37℃，5％CO2，静培，5-7日观察其病变，根据Reed-Muench法进行计算TCID50；
中和实验
(1)分装人血清1200μl/1.5EP管，兔血清500μl/1.5EP管，在水浴锅中进行56℃，30min灭活；
(2)稀释血清：8道移液器吸取110μl无血清F12K培养基至96孔板，其中第一列和第七列空着，待血清灭活后，分别取110μl血清至第一列和第二列中，将第二列混匀后取110μl到第三列，以此类推倍比稀释至第六列，弃最后的110μl的稀释液，共6个稀释度为2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6，以上所述准备两份，备用；
(3)稀释病毒：按照200TCID50/100μl，准备所用病毒液，
(4)混合物：病毒和血清，将稀释的病毒液吸到10cm平皿中，8道排枪吸取110μl病毒液到稀释好的待检血清中，(110μl血清+110μl病毒)，37℃，5％CO2，1hrs；
(5)2hrs后，用真空泵连接200μl Tip，弃96孔板的细胞上清，吸取200μl 1×PBS洗细胞，吸取上述混合物100μl感作细胞，平行2个孔，每个血清稀释度共计4孔37℃，5％CO2，反应2hrs；
(6)2hrs后，用真空泵连接200μl Tip，弃以上混合物，补充200μl 5％FBS,37℃，5％CO2静至培养，3-7日判定结果，以致使50％细胞病变的血清稀释度为中和效价；
(7)实验设置阴、阳性对照和空白对照，本次阳性血清对照为免疫野性型sAd-AY01和Ad5的兔血清。
分别采用黑猩猩腺病毒sAd-AY01和人类5型腺病毒进行中和抗体实验，阳性血清病毒液各个稀释度均未病变、阴性血清病毒液各个稀释度均病变，实验成立，具体结果如表2和表3、图26、图27所示，其中表2和图26为sAd-AY01中和抗体实验细胞病变情况，表3和图27为hAd5中和抗体实验细胞病变情况。
表2：sAd-AY01中和抗体实验细胞病变情况
Figure BDA0003149234230000181
Figure BDA0003149234230000191
表3：hAd5中和抗体实验细胞病变情况
Figure BDA0003149234230000192
Figure BDA0003149234230000201
结果说明：由表2和图26可以看出，使用新型的黑猩猩腺病毒sAd-AY01在人群的24个血清样本中，均未产生中和抗体，说明人群中没有新型黑猩猩腺病毒的抗体；由表3和图27可以看出，而使用人类5型腺病毒，24个血清样本中，有15人有中和抗体，中和效价为1:8～1:128以上，占总人数的62.5％。这说明若是使用新型的黑猩猩腺病毒sAd-AY01做为疫苗载体，可以避免人群中的预存抗体，达到更好的免疫效果。
实施例13重组新型黑猩猩腺病毒psAd-S疫苗在小鼠模型上的免疫学评价
13.1疫苗体液免疫反应检测
20只SPF级小鼠(6-8周龄)，随机分成3组，每组5只。根据表4所示分组情况对小鼠进行psAd-S疫苗免疫。注射方式为：后大腿内侧肌肉注射；注射剂量：100ul。
表4：疫苗免疫检测小鼠分组情况
Figure BDA0003149234230000202
小鼠于免疫后14天采血，分离血清，SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike S1抗体滴度检测试剂盒(小鼠)，货号：KIT007，用于检测小鼠血清样本中的anti-SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike S1抗体水平。
检测原理为：采用间接ELSA方法，包被新型冠状病毒S1蛋白于固相载体上,加入待检测样本进行孵育，样本中的抗新型冠状病毒的抗体与固相载体上的蛋白结合,经过洗板后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG的抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，读取450m吸光度(OD值)，450m处OD值与样品中的抗新型冠状病毒抗体含量呈正相关。
计算检测样本所需酶标条，从铝箔袋取出,剩余的酶标条放回铝箔袋中并封好袋口，低温保存，用1×洗涤缓冲液洗板,300μ/孔浸泡lmin，拍干酶标板,进行下一次清洗，共洗板5次加入待测样本，血清用1×稀释缓冲液进行1:2000稀释，100/孔，室温孵育2小时，弃去孔中液体，拍干酶标板，用1×洗涤缓冲液洗板，300uL/孔浸泡1min，拍干酶标板，进行下一次清洗，共洗板5次。用1x稀释缓冲液将抗小鼠IgG的抗体-HRP1:100稀释使用，100ul/孔加入酶标板中，混匀，室温孵育1小时。弃去孔中液体，拍干酶标板，用1×洗涤缓冲液洗板，300μl/孔浸泡lmin，拍干酶标板，进行下一次清洗，共洗板5次。将预先配制的底物液加入酶标板中，200μl/孔，混匀，室温避光孵育20分钟。加入50/孔终止液至酶标板中，轻轻震动酶标板至显色均匀。读取OD450mm的光吸收值。
检测结果如图28所示：小鼠肌肉注射psAd-S疫苗2周后，针对spike蛋白，能够产生较高浓度的IgG抗体。注射1*10^8FFU剂量疫苗的小鼠血清与阴性对照组有显著差异，注射1*10^7FFU剂量疫苗的小鼠血清与对照也有显著差异，且高剂量组引起的体液免疫反应更高。(ns,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001)
13.2细胞免疫反应检测
10只SPF级小鼠(6-8周龄)，随机分成2组，每组5只。根据表5所示分组情况对小鼠进行psAd-S疫苗免疫。注射方式为：后大腿内侧肌肉注射；注射剂量：100ul。
表5：疫苗免疫检测小鼠分组情况
Figure BDA0003149234230000211
免疫后14天处死小鼠，分离脾淋巴细胞，使用穿梭质粒pSsAdE1-WPRE-S转染的BHK21细胞刺激培养6小时，同时加入蛋白分泌阻断剂阻断细胞因子分泌。6小时后，阻断Fc受体，对死细胞和细胞表面分子标志物进行染色，细胞经固定和穿孔之后，对细胞内细胞因子进行染色。细胞表面标志物包括CD4、CD8，细胞内细胞因子包括IFNγ、IL2、TNF。使用流式细胞仪(CyExpert)分析CD4+T细胞和CD8+T细胞经目的蛋白刺激后表达IFNγ、IL2、TNF的水平。
psAd-S诱导的CD8+T细胞和CD4+T细胞免疫反应如图29、图30所示，代表性结果如图31、图32所示，其中图31为肌肉注射psAd-S后细胞免疫反应代表图，图32为空白对照免疫反应代表图。结果表示：小鼠免疫后14天，脾细胞经Spike蛋白刺激后，CD8+T细胞，其表达的IFNγ、TNFα和IL2水平均显著高于psAd△E1△E3载体对照组(Control)(P<0.05)。CD4+T细胞经过刺激后，其表达的IFNγ、TNFα和IL2水平也均显著高于psAd△E1△E3载体对照组(Control)(P<0.05)。
13.3SARS-CoV-2假病毒模拟中和抗体实验
SARS-CoV-2假病毒中和检测试剂盒，购自南京金斯瑞生物科技有限公司，其原理是：将慢病毒载体中的包膜糖蛋白用新冠病毒S蛋白替代，可形成模拟新冠病毒感染的假病毒。假病毒通过表面S蛋白感染靶细胞并表达报告荧光素酶基因。中和剂(如抗体)可以阻断S蛋白和ACE2的结合，从而阻止假病毒对宿主细胞的感染。通过检测报告基因荧光素酶的表达量，能推断出病毒被阻断的程度，从而进行中和剂的筛选或验证。
实验步骤为：将细胞免疫反应检测试验中采集的小鼠血清、阳性对照、阴性对照稀释后与稀释好的HRP-RBD以1:1的方式混合，37℃孵育30分钟；取100ul混合物于对应的孔板中，37℃孵育15分钟；用260ul的1X Wash缓冲液洗涤孔板4次；加入100ul TMB缓冲液，20-25℃避光孵育15分钟；加入50ul终止缓冲液；OD450读取吸光度。结果如表6所示：
表6：SARS-CoV-2假病毒模拟中和抗体实验
Figure BDA0003149234230000212
Figure BDA0003149234230000221
其中：质控：阳性对照<0.3，阴性对照>1.0；抑制率＝(1-样本OD值/阴性对照OD值)*100％；判定：抑制率≥20％为阳性，Inhibition<20％为阴性。
综上所述，小鼠注射总剂量为10^8FFU的疫苗(经PBS缓冲液稀释)、10^7FFU(经PBS缓冲液稀释)后，小鼠能够引起强烈的体液免疫反应，以及细胞免疫反应，与对照组均有显著的差异。同时，采集的血清在做模拟中和抗体实验中，能够起到阻断的作用。结果说明，我们的psad-S疫苗对新冠病毒能有保护作用，对新冠疫苗的开发具有指导性意义。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
序列表
<110> 嘉兴安宇生物科技有限公司
<120> 一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用
<150> 2020106427453
<151> 2020-07-06
<150> 2020109453356
<151> 2020-09-10
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36687
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catcatcaat aatatacctc aaacttttgg tgcgcgttaa tatgcaaatg aggtgtttga 60
atttggggat gcggggctgt gattggccga gagacgggcg accgttaggg gcggggcggg 120
tgacgttttg atgacgtggc cgtgaggcgg agccggtttg caagttctcg tgggaaaagt 180
gacgtcaaac gaggtgtggt ttgaacacgg aaatactcaa ttttcccgcg ctctctgaca 240
ggaaatgagg tgtttctggg cggatgcaag tgaaaacggg ccattttcgc gcgaaaactg 300
aatgaggaag tgaaaatctg agtaatttcg cgtttatggc agggaggagt atttgccgag 360
ggccgagtag actttgaccg attacgtggg ggtttcgatt accgtatttt tcacctaaat 420
ttccgcgtac ggtgtcaaag tccggtgttt ttacgtaggt gtcagctgat cgccagggta 480
tttaaacctg cgctctctag tcaagaggcc actcttgagt gccagcgagt agagttttct 540
cctccgcgcc gcgagtcaga tctacacttt gaaagatgag gcacctgaga gacctgcccg 600
gtaatgtttt cctggctact gggaacgaga ttctggaact ggtggtggac gccatgatgg 660
gtgacgaccc tcctgagccc cctaccccat ttgaggcgcc ttcgctgtac gatttgtatg 720
atctggaggt ggatgtgccc gagaacgacc ccaacgagga ggcggtgaat gatttgttta 780
gcgatgccgc gctgctggct gccgagcagg ctaatacgga ctctggctca gacagcgatt 840
cctctctcca taccccgaga cccggcagag gtgagaaaaa gatccccgag cttaaagggg 900
aagagctcga cctgcgctgc tatgaggaat gcttgcctcc gagcgatgat gaggaggacg 960
aggaggcgat tcgagctgca gcgagcgagg gagtgaaagc tgcgggcgag agctttagcc 1020
tggactgtcc tactctgccc ggacacggct gtaagtcttg tgaatttcat cgcatgaata 1080
ctggagataa gaatgtgatg tgtgccctgt gctatatgag agcttacaac cattgtgttt 1140
acagtaagtg tgattaactt tagctgggaa ggcagagggt gactgggtgc tgactggttt 1200
atttatgtat gtattcttta tgtgtaggtc ccgtctctga cgcagatgag acccccactt 1260
cagagtgcat ttcatcaccc ccagaaattg gcgaggaacc gcccgaagat attattcata 1320
gaccagttgc agtgagagtc accgggcgga gagcagctgt ggagagtttg gatgacttgc 1380
tacagggtgg ggatgaacct ttggacttgt gtacccggaa acgccccagg cactaagtgc 1440
cacacatgtg tgtttactta aggtgatgtc agtatttata gggtgtggag tgcaataaaa 1500
atatgtgttg actttaagtg cgtggtttat gactcagggg tggggactgt gggtatataa 1560
gcaggtgcag acctgtgtgg tcagttcaga gcaggactca tggagatctg gacggtcttg 1620
gaagactttc accagactag acagctgcta gagaactcat cggagggagt ctcttacctg 1680
tggagattct gcttcggtgg ggctctagct aagctagtcc atagggccaa acaggattat 1740
aaggatcaat ttgaggatat tttgagagag tgtcctggta tttttgactc tctcaacttg 1800
ggccatcagt ctcactttaa ccagagtatt ctgagagccc ttgacttttc tactcctggc 1860
agaactaccg ccgcggtagc cttttttgcc tttattcttg acaaatggag tcaagaaacc 1920
catttcagca gggattaccg tctggactgc ttagcagtag ctttgtggag aacatggagg 1980
tgccagcgcc tgaatgcaat ctccggctac ttgccagtac agccggtaga cacgctgagg 2040
atcctgagtc tccagtcacc ccaggaacac caacgccgcc agcagccgca gcaggagcag 2100
cagcaagagg aggaggagga tcgagaagag aacccgagag ccggtctgga ccctccggtg 2160
gcggaggagg aggagtagct gacttgtttc ccgagctgcg ccgggtgctg actaggtctt 2220
ccagtggacg ggagaggggg attaagcggg agaggcatga ggagactagt cacagaactg 2280
aactgactgt cagtctgatg agccgcaggc gcccagaatc ggtgtggtgg catgaggtgc 2340
agtcgcaggg gatagatgag gtctcggtga tgcatgagaa atattcccta gaacaagtca 2400
agacttgttg gttggagcct gaggatgatt gggaggtagc catcaggaat tatgccaagt 2460
tggctctgaa gccagataag aagtacaaga ttaccaaact gattaatatc agaaattcct 2520
gctacatttc ggggaatggg gccgaggtgg agatcagtac ccaggagagg gtggccttca 2580
gatgctgcat gatgaatatg tacccgggag tggtgggcat ggagggagtc acctttatga 2640
acgcgaggtt caggggtgat gggtataatg gggtggtctt tatggccaac accaagctga 2700
cagtgcacgg atgctccttc tttggcttca ataacatgtg catcgaggcc tggggcagtg 2760
tttcagtgag gggatgcagc ttttcagcca actggatggg ggtcgtgggc agaaccaaga 2820
gcaaggtgtc agtgaagaaa tgcctgttcg agaggtgcca cctgggggtg atgagcgagg 2880
gcgaagccaa agtcaaacac tgcgcctcta ccgagacggg ctgctttgtg ctgatcaagg 2940
gcaatgccaa agtcaagcat aatatgatct gtggggcctc ggatgagcgc ggctaccaga 3000
tgctgacctg cgccggtggg aacagccata tgctggccac cgtgcatgtg gcctcgcacc 3060
cccgcaagac atggcccgag ttcgagcaca acgtcatgac ccgctgcaat gtgcacctgg 3120
gttcccgccg aggcatgttc atgccctacc agtgcaacat gcaatttgtg aaggtgctgc 3180
tggagcccga tgccatgtcc agagtgagcc tgacgggggt gtttgacatg aatgtggagc 3240
tgtggaaaat tctgagatat gatgaatcca agaccaggtg ccgggcctgc gaatgcggag 3300
gcaagcacgc caggcttcag cccgtgtgtg tggaggtgac ggaggacctg cgacccgatc 3360
atttggtgtt gtcctgcaac gggacggagt tcggctccag cggggaagaa tctgactaga 3420
gtgagtagtg tttgggggtg ggtgggagcc tgcatgaggg gcagaatgac taaaatctgt 3480
gtttttctgt gtgttgcagc agcatgagcg gaagcgcctc ctttgaggga ggggtattca 3540
gcccttatct gacggggcgt ctcccctcct gggctggagt gcgtcagaat gtgatgggat 3600
ccacggtgga cggccggccc gtgcagcccg cgaactcttc aaccctgacc tacgcgaccc 3660
tgagctcctc gtccgtggac gcagctgccg ccgcagctgc tgcttccgcc gccagcgccg 3720
tgcgcggaat ggccctgggt gccggctact acagctctct ggtggccaac tcgagttcca 3780
ccaataatcc cgccagcctg aacgaggaga agctgctgct gctgatggcc cagctcgagg 3840
ccctgaccca gcgcctgggc gagctgaccc agcaggtggc tcagctgcag gcggagacgc 3900
gggccgcggt tgccacggtg aaaaccaaat aaaaaatgaa tcaataaata aacggagacg 3960
gttgttgatt ttaacacaga gtcttgaatc tttatttgat ttttcgcgcg cggtaggccc 4020
tggaccaccg gtctcgatca ttgagcaccc ggtggatttt ttccaggacc cggtagaggt 4080
gggcttggat gttgaggtac atgggcatga gcccgtcccg ggggtggagg tagctccatt 4140
gcagggcctc gtgctcgggg gtggtgttgt aaatcaccca gtcatagcag gggcgcaggg 4200
cgtggtgctg cacgatgtcc ttgaggagga gactgatggc cacgggcagc cccttggtgt 4260
aggtgttgac gaacctgttg agctgggagg gatgcatgcg gggggagatg agatgcatct 4320
tggcctggat cttgagattg gcgatgttcc cgcccagatc ccgccggggg ttcatgttgt 4380
gcaggaccac cagcacggtg tatccggtgc acttggggaa tttgtcatgc aacttggaag 4440
ggaaggcatg aaagaatttg gagacgccct tgtgaccgcc caggttttcc atgcactcat 4500
ccatgatgat ggcaatgggc ccgtgggcgg cggcctgggc aaagacgttt cgggggtcgg 4560
acacatcgta gttgtggtcc tgggtgagct cgtcataggc cattttaatg aatttgggac 4620
ggagggtgcc cgattggggg acgaaggtgc cctcgatccc gggggcgtag ttgccctcgc 4680
agatctgcat ctcccaggcc ttgagctcgg agggggggat catgtccacc tgcggggcga 4740
tgaaaaaaac ggtttccggg gcgggggaga tgagctgcgc cgaaagcagg ttccggagca 4800
gctgggactt gccgcagccg gtgggaccgt agatgacccc gatgaccggc tgcaggtggt 4860
agttgaggga gagacagctg ccgtcctcgc ggaggagggg ggccacctcg ttcatcatct 4920
cgcgcacatg catgttctcg cgcacgagtt ccgccaggag gcgctcgccc cccagcgaga 4980
ggagctcttg cagcgaggcg aagtttttca gcggcttgag cccgtcggcc atgggcattt 5040
tggagagggt ctgttgcaag agttccagac ggtcccagag ctcggtgatg tgctctaggg 5100
catctcgatc cagcagacct cctcgtttcg cgggttgggg cgactgcggg agtagggcac 5160
caggcgatgg gcgtccagcg aggccagggt ccggtccttc cagggccgca gggtccgcgt 5220
cagcgtggtc tccgtcacgg tgaaggggtg cgcgccgggc tgggcgcttg cgagggtgcg 5280
cttcaggctc atccggctgg tcgagaaccg ctcccggtcg gcgccctgcg cgtcggccag 5340
gtagcaattg agcatgagtt cgtagttgag cgcctcggcc gcgtggccct tggcgcggag 5400
cttacctttg gaagtgtgtc cgcagacggg acagaggagg gacttgaggg cgtagagctt 5460
gggggcgagg aagacggact cgggggcgta ggcgtccgcg ccgcagctgg cgcagacggt 5520
ctcgcactcc acgagccagg tgaggtcggg ccggtcgggg tcaaaaacga ggtttcctcc 5580
gtgctttttg atgcgtttct tacctctggt ctccatgagc tcgtgtcccc gctgggtgac 5640
aaagaggctg tccgtgtccc cgtagaccga ctttatgggt cggtcctcga gcggggtgcc 5700
gcggtcctcg tcgtagagga accccgccca ctccgagacg aaggcccggg tccaggccag 5760
cacgaaggag gccacgtggg aggggtagcg gtcgttgtcc accagcgggt ccaccttctc 5820
cagggtatgc aagcacatgt ccccctcgtc cacatccagg aaggtgattg gcttgtaagt 5880
gtaggccacg tgaccggggg tcccggccgg gggggtataa aagggggcgg gcccctgctc 5940
gtcctcactg tcttccggat cgctgtccag gagcgccagc tgttggggta ggtattccct 6000
ctcgaaggcg ggcatgacct cggcactcag gttgtcagtt tctagaaacg aggaggattt 6060
gatattgacg gtgccgttgg agacgccttt catgagcccc tcgtccatct ggtcagaaaa 6120
gacgatcttt ttgttgtcga gcttggtggc gaaggagccg tagagggcgt tggagagcag 6180
cttggcgatg gagcgcatgg tctggttctt ttccttgtcg gcgcgctcct tggcggcgat 6240
gttgagctgt acgtactcgc gcgccacgca cttccattcg gggaagacgg tggtgagctc 6300
gtcgggcacg attctgaccc gccagccgcg gttgtgcagg gtgatgaggt ccacgctggt 6360
ggccacctcg ccgcgcaggg gctcgttggt ccagcagagg cgcccgccct tgcgcgagca 6420
gaaggggggc agcgggtcca gcatgagctc gtcggggggg tcggcgtcca cggtgaagat 6480
gccgggcagg agctcggggt caaagtagct gatgcaggtg cccagatcgt ccagcgccgc 6540
ttgccagtcg cgcacggcca gcgcgcgctc gtaggggctg aggggcgtgc cccagggcat 6600
ggggtgcgtg agcgcggagg cgtacatgcc gcagatgtcg tagacgtaga ggggctcctc 6660
gaggacgccg atgtaggtgg ggtagcagcg ccccccgcgg atgctggcgc gcacgtagtc 6720
gtacagctcg tgcgagggcg cgaggagccc cgtgccgaga ttggagcgct gcggcttttc 6780
ggcgcggtag acgatctggc ggaagatggc gtgggagttg gaggagatgg tgggcctctg 6840
gaagatgttg aagtgggcgt ggggcaggcc gaccgagtcc ctgatgaagt gggcgtagga 6900
gtcctgcagc ttggcgacga gctcggcggt gacgaggacg tccagggcgc agtagtcgag 6960
ggtctcttgg atgatgtcat acttgagctg gcccttctgc ttccacagct cgcggttgag 7020
aaggaactct tcgcggtcct tccagtactc ttcgaggggg aacccgtcct gatcggcacg 7080
gtaagagccc accatgtaga actggttgac ggccttgtag gcgcagcagc ccttctccac 7140
ggggagggcg taagcttgcg cggccttgcg cagggaggtg tgggtgaggg cgaaggtgtc 7200
gcgcaccatg accttgagga actggtgctt gaagtcgagg tcgtcgcagc cgccctgctc 7260
ccagagttgg aagtccgtgc gcttcttgta ggcggggttg ggcaaagcga aagtaacatc 7320
gttgaagagg atcttgcccg cgcggggcat gaagttgcga gtgatgcgga aaggctgggg 7380
cacctcggcc cggttgttga tgacctgggc ggcgaggacg atctcgtcga agccgttgat 7440
gttgtgcccg acgatgtaga gttccacgaa tcgcgggcgg cccttgacgt ggggcagctt 7500
cttgagctcg tcgtaggtga gctcggcggg gtcgctgagg ccgtgctgct cgagggccca 7560
gtcggcgacg tgggggttgg cgctgaggaa ggaagtccag agatccacgg ccagggcggt 7620
ctgcaagcgg tcccggtact gacggaactg ctggcccacg gccatttttt cgggggtgac 7680
gcagtagaag gtgcgggggt cgccgtgcca gcggtcccac ttgagctgga gggcgaggtc 7740
gtgggcgagc tcgacgagcg gcgggtcccc ggagagtttc atgaccagca tgaaggggac 7800
gagctgcttg ccgaaggacc ccatccaggt gtaggtttcc acatcgtagg tgaggaagag 7860
cctttcggtg cgaggatgcg agccgatggg gaagaactgg atctcctgcc accagttgga 7920
ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa atgccgacgg cgcgccgagc actcgtgctt 7980
gtgtttatac aagcgtccgc agtgctcgca acgctgcacg ggatgcacgt gctgcacgag 8040
ctgtacctga gttcctttga cgaggaattt cagtgggcag tggagcgctg gcggctgcat 8100
ctggtgttgt actacgtcct ggccatcggc gtggccatcg tctgcctcga tggtggtcat 8160
gctgacgagg ccgcgcggga ggcaggtcca gacctcggct cggacgggtc ggagagcgag 8220
gacgagggcg cgcaggccgg agctgtccag ggtcctgaga cgctgcggag tcaggtcagt 8280
gggcagcggc ggcgcgcggt tgacttgcag gagcttttcc agggcgcgcg ggaggtccag 8340
atggtacttg atctccacgg cgccgttggt ggcaacgtcc acggcttgca gggtgccgtg 8400
cccctggggc gccaccaccg tgccccgttt ctttttgggc gctggcggcg gcggctccat 8460
gcttagaatc ggcggcgagg acgcgcgccg ggcggcaggg gcggctcggg gcccggaggc 8520
aggggcggca ggggcacgtc ggcgccgcgc gcgggcaggt tctggtactg cgcccggaga 8580
agactggcgt gagcgacgac gcgacggttg acgtcctgga tctgacgcct ctgggtgaag 8640
gccacgggac ccgtgagttt gaacctgaaa gagagttcga cagaatcaat ctcggtatcg 8700
ttgacggcag cctgccgcag gatctcttgc acgtcgcccg agttgtcctg gtaggcgatc 8760
tcggtcatga actgctcgat ctcctcctcc tgaaggtctc cgcggccggc gcgctcgacg 8820
gtggccgcga ggtcgttgga gatgcggccc atgagctgcg agaaggcgtt catgccggcc 8880
tcgttccaga cgcggctgta gaccacggct ccgtcggggt cgcgcgcgcg catgaccacc 8940
tgggcgaggt tgatctccac gtggcgcgtg aagaccgcgt agttgcagag gcgctggtag 9000
aggtagttga gcgtggtggc gatgtgctcg gtgacgaaga agtacatgat ccagcggcgg 9060
agcggcatct cgctgacgtc gcccagggct tccaagcgct ccatggcctc gtagaagtcc 9120
acggcgaagt tgaaaaactg ggagttgcgc gccgagacgg tcaactcctc ctccagaaga 9180
cggatgagct cggcgatggt ggcgcgcacc tcgcgctcga aggccccggg gggctcctct 9240
tcttccatct cctcctcctc ttcctcctcc tccactaaca tctcttctac ttcctcctca 9300
ggaggcggcg gcgggggagg ggccctgcgt cgccggcggc gcacgggcag acggtcgatg 9360
aagcgctcga tggtctcccc gcgccggcga cgcatggtct cggtgacggc gcgcccgtcc 9420
tcgcggggcc gcagcgtgaa gacgccgccg cgcatctcca ggtggccgcc gggggggtct 9480
ccgttgggca gggagagggc gctgacgatg catcttatca attggcccgt agggactccg 9540
cgcaaggacc tgagcgtctc gagatccacg ggatccgaaa accgctgaac gaaggcttcg 9600
agccagtcgc agtcgcaagg taggctgagc ccggtttctt gttcttcggg tatttggtcg 9660
ggaggcgggc gggcgatgct gctggtgatg aagttgaagt aggcggtcct gagacggcgg 9720
atggtggcga ggagcaccag gtccttgggc ccggcttgct ggatgcgcag acggtcggcc 9780
atgccccagg cgtggtcctg acacctggcg aggtccttgt agtagtcctg catgagccgc 9840
tccacgggca cctcctcctc gcccgcgcgg ccgtgcatgc gcgtgagccc gaacccgcgc 9900
tggggctgga cgagcgccag gtcggcgacg acgcgctcgg cgaggatggc ctgctggatc 9960
tgggtgaggg tggtctggaa gtcgtcgaag tcgacgaagc ggtggtaggc tccggtgttg 10020
atggtgtagg agcagttggc catgacggac cagttgacgg tctggtggcc ggggcgcacg 10080
agctcgtggt acttgaggcg cgagtaggcg cgcgtgtcga agatgtagtc gttgcaggtg 10140
cgcacgaggt actggtatcc gacgaggaag tgcggcggcg gctggcggta gagcggccat 10200
cgctcggtgg cgggggcgcc gggcgcgagg tcctcgagca tgaggcggtg gtagccgtag 10260
atgtacctgg acatccaggt gatgccggcg gcggtggtgg aggcgcgcgg gaactcgcgg 10320
acgcggttcc agatgttgcg cagcggcagg aagtagttca tggtggccgc ggtctggccc 10380
gtgaggcgcg cgcagtcgtg gatgctctag acatacgggc aaaaacgaaa gcggtcagcg 10440
gctcgactcc gtggcctgga ggctaagcga acgggttggg ctgcgcgtgt accccggttc 10500
gagtccctgc tcgaatcagg ctggagccgc agctaacgtg gtactggcac tcccgtctcg 10560
acccaagcct gctaacgaaa cctccaggat acggaggcgg gtcgttttgg caattttcgt 10620
caggccggaa atgaaactag taagcgcgga aagcggccgc ccgcgatggc tcgctgccgt 10680
agtctggaga aagaatcgcc agggttgcgt tgcggtgtgc cccggttcga gcctcggcgc 10740
tcgtgccggc cggattccgc ggctaacgtg ggcgtggctg ccccgtcgtt tccaagaccc 10800
cttagccagc cgacttctcc agttacggag cgagcccctc tttttttttt ttcttgtgtt 10860
tttgccagat gcatcccgta ctgcggcaga tgcgccccca ccctccacca caaccgcccc 10920
taccgcagca gcagcaacag ccggcgcttc tgcccccgcc ccagcagcag cagccagcca 10980
ctaccgcggc ggccgccgtg agcggagccg gcgttcagta tgacctggcc ttggaagagg 11040
gcgaggggct ggcgcggctg ggggcgtcgt cgccggagcg gcacccgcgc gtgcagatga 11100
aaagggacgc tcgcgaggcc tacgtgccca agcagaacct gttcagagac aggagcggcg 11160
aggagcccga ggagatgcgc gcctcccgct tccacgcggg gcgggagctg cggcgcggcc 11220
tggaccgaaa gcgggtgctg agggacgagg atttcgaggc ggacgagctg acggggatca 11280
gccccgcgcg cgcgcacgtg gccgcggcca acctggtcac ggcgtacgag cagaccgtga 11340
aggaggagag caacttccaa aaatccttca acaaccacgt gcgcacgctg atcgcgcgcg 11400
aggaggtgac cctgggcctg atgcacctgt gggacctgct ggaggccatc gtgcagaacc 11460
ccacgagcaa gccgctgacg gcgcagctgt ttctggtggt gcagcacagt cgggacaacg 11520
agacgttcag ggaggcgctg ctgaatatca ccgagcccga gggccgctgg ctcctggacc 11580
tggtgaacat tctgcagagc atcgtggtgc aggagcgcgg gctgccgctg tccgagaagc 11640
tggcggccat caacttctcg gtgctgagcc tgggcaagta ctacgctagg aagatctaca 11700
agaccccgta cgtgcccata gacaaggagg tgaagatcga cgggttttac atgcgcatga 11760
ccctgaaagt gctgaccctg agcgacgatc tgggggtgta ccgcaacgac aggatgcacc 11820
gcgcggtgag cgccagccgc cggcgcgagc tgagcgacca ggagctgatg cacagcctgc 11880
agcgggccct gaccggggcc gggaccgagg gggagagcta ctttgacatg ggcgcggacc 11940
tgcgctggca gcccagccgc cgggccttgg aagctgccgg cggttccccc tacgtggagg 12000
aggtggacga tgaggaggag gagggcgagt acctggaaga ctgatggcgc gaccgtattt 12060
ttgctagatg cagcaacagc caccgccgcc tcctgatccc gcgatgcggg cggcgctgca 12120
gagccagccg tccggcatta actcctcgga cgattggacc caggccatgc aacgcatcat 12180
ggcgctgacg acccgcaatc ccgaagcctt tagacagcag cctcaggcca accggctctc 12240
ggccatcctg gaggccgtgg tgccctcgcg ctcgaacccc acgcacgaga aggtgctggc 12300
catcgtgaac gcgctggtgg agaacaaggc catccgcggc gacgaggccg ggctggtgta 12360
caacgcgctg ctggagcgcg tggcccgcta caacagcacc aacgtgcaga cgaacctgga 12420
ccgcatggtg accgacgtgc gcgaggcggt gtcgcagcgc gagcggttcc accgcgagtc 12480
gaacctgggc tccatggtgg cgctgaacgc cttcctgagc acgcagcccg ccaacgtgcc 12540
ccggggccag gaggactaca ccaacttcat cagcgcgctg cggctgatgg tggccgaggt 12600
gccccagagc gaggtgtacc agtcggggcc ggactacttc ttccagacca gtcgccaggg 12660
cttgcagacc gtgaacctga gccaggcttt caagaacttg cagggactgt ggggcgtgca 12720
ggccccggtc ggggaccgcg cgacggtgtc gagcctgctg acgccgaact cgcgcctgct 12780
gctgctgctg gtggcgccct tcacggacag cggcagcgtg agccgcgact cgtacctggg 12840
ctacctgctt aacctgtacc gcgaggccat cgggcaggcg cacgtggacg agcagaccta 12900
ccaggagatc acccacgtga gccgcgcgct gggccaggag gacccgggca acctggaggc 12960
caccctgaac ttcctgctga ccaaccggtc gcagaagatc ccgccccagt acgcgctgag 13020
caccgaggag gagcgcatcc tgcgctacgt gcagcagagc gtggggctgt tcctgatgca 13080
ggagggggcc acgcccagcg ccgcgctcga catgaccgcg cgcaacatgg agcccagcat 13140
gtacgcccgc aaccgcccgt tcatcaataa gctgatggac tacttgcatc gggcggccgc 13200
catgaactcg gactacttta ccaacgccat cttgaacccg cattggctcc cgccgcccgg 13260
gttctacacg ggcgagtacg acatgcccga ccccaacgac gggttcctgt gggacgacgt 13320
ggacagcagc gtgttctcgc cgcgccccac cgccaccacc gtgtggaaga aagagggcgg 13380
ggaccggcgg ccgtcctcgg cgctgtccgg tcgcgcgggt gctgccgcgg cggtgcccga 13440
ggccgccagc cccttcccga gcctgccctt ttcgctgaac agcgtgcgca gcagcgagct 13500
gggtcggctg acgcggccgc gcctgctggg cgaggaggag tacctgaacg actccttgtt 13560
gaggcccgag cgcgagaaga acttccccaa taacgggata gagagcctgg tggacaagat 13620
gagccgctgg aagacgtacg cgcacgagca cagggacgag ccccgagcta gcagcagcgc 13680
cacccgtaga cgccagcggc acgacaggca gcggggactg gtgtgggacg atgaggattc 13740
cgccgacgac agcagcgtgt tggacttggg tgggagtggt ggtaacccgt tcgctcactt 13800
gcgcccccgt atcgggcgcc tgatgtaaga atctgaaaaa ataaaaaacg gtactcacca 13860
aggccatggc gaccagcgtg cgttcttctc tgttgtttgt agtagtatga tgaggcgcgt 13920
gtacccggag ggtcctcctc cctcgtacga gagcgtgatg cagcaggcgg tggcggcggc 13980
gatgcagccc ccgctggagg cgccttacgt gcccccgcgg tacctggcgc ctacggaggg 14040
gcggaacagc attcgttact cggagctggc acccttgtac gataccaccc ggttgtacct 14100
ggtggacaac aagtcggcgg acatcgcctc gctgaactac cagaacgacc acagcaactt 14160
cctgaccacc gtggtgcaga acaacgattt cacccccacg gaggccagca cccagaccat 14220
caactttgac gagcgctcgc ggtggggcgg ccagctgaaa accatcatgc acaccaacat 14280
gcccaacgtg aacgagttca tgtacagcaa caagttcaag gcgcgggtga tggtctcgcg 14340
caagaccccc aacggggtga cggtagggga tgattatgat ggtagtcagg acgagctgac 14400
ctacgagtgg gtggagtttg agctgcccga gggcaacttc tcggtgacca tgaccatcga 14460
tctgatgaac aacgccatca tcgacaacta cttggcggtg gggcggcaga acggggtgct 14520
ggagagcgac atcggcgtga agttcgacac gcgcaacttc cggctgggct gggaccccgt 14580
gaccgagctg gtgatgccgg gcgtgtacac caacgaggcc ttccaccccg acatcgtcct 14640
gctgcccggc tgcggcgtgg acttcaccga gagccgcctc agcaacctgc tgggcatccg 14700
caagcggcag cccttccagg agggcttcca gatcctgtac gaggacctgg aggggggcaa 14760
catccccgcg ctgctggacg tggacgccta tgagaaaagc aaggaggata gcgccgccgc 14820
ggcgaccgca gccgtggcca ccgcctctac cgaggtgcgg ggcgataatt ttactagcgc 14880
cgcagcagtg gccgaggcgg ctgaaaccga aagtaagata gtgatccagc cggtggagaa 14940
ggacagcaag gacaggagct acaacgtgct cgcggacaag aaaaacaccg cctaccgcag 15000
ctggtacctg gcctacaact acggcgaccc cgagaagggc gtgcgctcct ggacgctgct 15060
caccacctcg gacgtcacct gcggcgtgga gcaagtctac tggtcgctgc ccgacatgat 15120
gcaagacccg gtcaccttcc gctccacgcg tcaagttagc aactacccgg tggtgggcgc 15180
cgagctcctg cccgtctact ccaagagctt cttcaacgag caggccgtct actcgcagca 15240
gctgcgcgcc ttcacctcgc tcacgcacgt tttcaaccgc ttccccgaga accagatcct 15300
cgttcgcccg cccgcgccca ccattaccac cgtcagtgaa aacgttcctg ctctcacaga 15360
tcacgggacc ctgccgctgc gcagcagtat ccggggagtc cagcgcgtga ccgtcactga 15420
cgccagacgc cgcacctgcc cctacgtcta caaggccctg ggcgtagtcg cgccgcgcgt 15480
cctctcgagc cgcaccttct aaaaaatgtc cattctcatc tcgcccagta ataacaccgg 15540
ttggggcctg cgcgcgccca gcaagatgta cggaggcgct cgccaacgct ccacacaaca 15600
ccccgtgcgc gtgcgcgggc acttccgcgc tccctggggc gccctcaagg gccgcgtgcg 15660
ctcgcgcacc accgtcgacg acgtgatcga ccaggtggtg gccgacgcgc gcaactacac 15720
gcccgccgcc gcgcccgtct ccaccgtgga cgccgtcatc gacagcgtgg tggccgacgc 15780
gcgccggtac gcccgcgcca agagccggcg gcggcgcatc gcccggcggc accggagcac 15840
ccccgccatg cgcgcggcgc gagccttgct gcgcagggcc aggcgcacgg gacgcagggc 15900
catgctcagg gcggccagac gcgcggcctc cggcagcagc agcgccggca gaacccgcag 15960
acgcgcggcc acggcggcgg cggcggccat cgccagcatg tcccgcccgc ggcgcggcaa 16020
cgtgtactgg gtgcgcgacg ccgccaccgg tgtgcgcgtg cccgtgcgca cccgcccccc 16080
tcgcacttga agatgctgac ttcgcgatgt tgatgtgtcc cagcggcgag gaggatgtcc 16140
aagcgcaaat acaaggaaga gatgctccag gtcatcgcgc ctgagatcta cggccccgcg 16200
gcggcggtga aggaggaaag aaagccccgc aaactgaagc gggtcaaaaa ggacaaaaag 16260
gaggaggaag atgacggact ggtggagttt gtgcgcgagt tcgccccccg gcggcgcgtg 16320
cagtggcgcg ggcggaaagt gaaaccggtg ctgcggcccg gcaccacggt ggtcttcacg 16380
cccggcgagc gttccggctc cgcctccaag cgctcctacg acgaggtgta cggggacgag 16440
gacatcctcg agcaggcggt cgagcgtctg ggcgagtttg cttacggcaa gcgcagccgc 16500
cccgcgccct tgaaagagga ggcggtgtcc atcccgctgg accacggcaa ccccacgccg 16560
agcctgaagc cggtgaccct gcagcaggtg ctaccgagcg cggcgccgcg ccggggcttc 16620
aagcgcgagg gcggcgagga tctgtacccg accatgcagc tgatggtgcc caagcgccag 16680
aagctggagg acgtgctgga gcacatgaag gtggaccccg aggtgcagcc cgaggtcaag 16740
gtgcggccca tcaagcaggt ggctccgggc ctgggcgtgc agaccgtgga catcaagatc 16800
cccacggagc ccatggaaac gcagaccgag cccgtgaagc ccagcaccag caccatggag 16860
gtgcagacgg atccctggat gccagcggct tccaccacca ccacccgccg aagacgcaag 16920
tacggcgcga ccagcctgct gatgcccaac tacgcgctgc atccttccat catccccacg 16980
ccgggctacc gcggcacgcg cttctaccgc ggctacagca gccgccgcaa gaccaccacc 17040
cgccgccgcc gtcgtcgcac ccgccgcagc agcaccgcga cttccgccgc cgccttggtg 17100
cggagagtgt accgcagcgg gcgcgagcct ctgaccctgc cgcgcgcgcg ctaccacccg 17160
agcatcgcca tttaactctg ccgtcgcctc cttgcagata tggccctcac atgccgcctc 17220
cgcgtcccca ttacgggcta ccgaggaaga aagccgcgcc gtagaaggct gacggggaac 17280
gggctgcgtc gccatcacca ccggcggcgg cgcgccatca gcaagcggtt ggggggaggc 17340
ttcctgcccg cgctgatccc catcatcgcc gcggcgatcg gggcgatccc cggcatagct 17400
tccgtggcgg tgcaggcctc tcagcgccac tgagacacag cttggaaaat ttgtaataaa 17460
aaatggactg acgctcctgg tcctgtgatg tgtgttttta gatggaagac atcaattttt 17520
cgtccctggc accgcgacac ggcacgcggc cgtttatggg cacctggagc gacatcggca 17580
acagccaact gaacgggggc gccttcaatt ggagcagtct ctggagcggg cttaagaatt 17640
tcgggtccac gctcaaaacc tatggcaaca aggcgtggaa cagcagcaca gggcaggcgc 17700
tgagggaaaa gctgaaagag cagaacttcc agcagaaggt ggtcgatggc ctggcctcgg 17760
gcatcaacgg ggtggtggac ctggccaacc aggccgtgca gaaacagatc aacagccgcc 17820
tggacgcggt cccgcccgcg gggtccgtgg agatgcccca ggtggaggag gagctgcctc 17880
ccctggacaa gcgcggcgac aagcgaccgc gtcccgacgc ggaggagacg ctgctgacgc 17940
acacggacga gccgcccccg tacgaggagg cggtgaaact gggtctgccc accacgcggc 18000
ccgtggcgcc tctggccacc ggggtgctga aacccagcag cagcagcagc cagcccgcga 18060
ccctggactt gcctccgcct gcttcccgcc cctccacagt ggctaagccc ctgccgccgg 18120
tggccgtcgc gtcgcgcgcc ccccgaggcc gcccccaggc gaactggcag agcactctga 18180
acagcatcgt gggtctggga gtgcagagtg tgaagcgccg ccgctgctat taaaagacac 18240
tgtagcgctt aacttgcttg tctgtgtgta tatgtatgtc cgccgaccag aaggaggagg 18300
aagaggcgcg tcgccgagtt gcaagatggc caccccatcg atgctgcccc agtgggcgta 18360
catgcacatc gccggacagg acgcttcgga gtacctgagt ccgggtctgg tgcagttcgc 18420
ccgcgccaca gacacctact tcagtctggg gaacaagttt aggaacccca cggtggcgcc 18480
cacgcacgat gtgaccaccg accgcagcca gcggctgacg ctgcgcttcg tgcccgtgga 18540
ccgcgaggac aacacctact cgtacaaagt gcgctacacg ctggccgtgg gcgacaaccg 18600
cgtgctggac atggccagca cctactttga catccgcggc gtgctggacc ggggccccag 18660
cttcaaaccc tactccggca ccgcctacaa cagtctggct cccaagggag cgcccaacac 18720
ctcacagtgg ataaccaaag acaatggaac tgataagaca tacagttttg gaaatgctcc 18780
agtcagagga ttggacatta cagaagaggg tctccaaata ggaaccgatg agtcaggggg 18840
tgaaagcaag aaaatttttg cagacaaaac ctatcagcct gaacctcagc ttggagatga 18900
ggaatggcat gatactattg gagctgaaga caagtatgga ggcagagcgc ttaaacctgc 18960
caccaacatg aaaccctgct atgggtcttt cgccaagcca actaatgcta agggaggtca 19020
ggctaaaagc agaaccaagg acgatggcac tactgagcct gatattgaca tggccttctt 19080
tgacgatcgc agtcagcaag ctagtttcag tccagaactt gttttgtata ctgagaatgt 19140
cgatctggac accccggata cccacattat ttacaaacct ggcactgatg aaacaagttc 19200
ttctttcaac ttgggtcagc agtccatgcc caacagaccc aactacattg ggttcagaga 19260
caactttatc ggtctcatgt actacaacag cactggcaat atgggtgtgc tggctggaca 19320
ggcctcccag ctgaatgctg tggtggactt gcaggacaga aacactgaac tgtcctacca 19380
gctcttgctt gactctctgg gtgacagaac taggtatttc agtatgtgga atcaggcggt 19440
ggacagctac gaccccgatg tgcgcattat tgaaaatcac ggtgtggagg atgaactccc 19500
caactattgc ttccctttga atggtgtggg ctttacagat acattccagg gaattaaggt 19560
taaaactacc aataacggaa cagcaaatgc tacagagtgg gaatctgata cctctgtcaa 19620
taatgctaat gagattgcca agggcaatcc tttcgccatg gagatcaaca tccaggccaa 19680
cctgtggcgg aacttcctct acgcgaacgt ggcgctgtac ctgcccgact cctacaagta 19740
cacgccggcc aacatcacgc tgcccaccaa caccaacacc tacgattaca tgaacggccg 19800
cgtggtggcg ccctcgctgg tggacgccta catcaacatc ggggcgcgct ggtcgctgga 19860
ccccatggac aacgtcaacc ccttcaacca ccaccgcaac gcgggcctgc gctaccgctc 19920
catgctcctg ggcaacgggc gctacgtgcc cttccacatc caggtgcccc aaaagttttt 19980
cgccatcaag agcctcctgc tcctgcccgg gtcctacacc tacgagtgga acttccgcaa 20040
ggacgtcaac atgatcctgc agagctccct cggcaacgac ctgcgcacgg acggggcctc 20100
catcgccttc accagcatca acctctacgc caccttcttc cccatggcgc acaacaccgc 20160
ctccacgctc gaggccatgc tgcgcaacga caccaacgac cagtccttca acgactacct 20220
ctcggcggcc aacatgctct accccatccc ggccaacgcc accaacgtgc ccatctccat 20280
cccctcgcgc aactgggccg ccttccgcgg atggtccttc acgcgcctca agacccgcga 20340
gacgccctcg ctcggctccg ggttcgaccc ctacttcgtc tactcgggct ccatccccta 20400
ccttgacggc accttctacc tcaaccacac cttcaagaag gtctccatca ccttcgactc 20460
ctccgtcagc tggcccggca acgaccgcct cctgacgccc aacgagttcg aaatcaagcg 20520
caccgtcgac ggagaggggt acaacgtggc ccagtgcaac atgaccaagg actggttcct 20580
ggtccagatg ctggcccact acaacatcgg ctaccagggc ttctacgtgc ccgagggcta 20640
caaggaccgc atgtactcct tcttccgcaa cttccagccc atgagccgcc aggtcgtgga 20700
cgaggtcaac tacaaggact accaggccgt caccctggcc taccagcaca acaactcggg 20760
cttcgtcggc tacctcgcgc ccaccatgcg ccagggccag ccctaccccg ccaactaccc 20820
ctacccgctc atcggcaaga gcgccgtcgc cagcgtcacc cagaaaaagt tcctctgcga 20880
ccgggtcatg tggcgcatcc ccttctccag caacttcatg tccatgggcg cgctcaccga 20940
cctcggccag aacatgctct acgccaactc cgcccacgcg ctagacatga atttcgaagt 21000
cgaccccatg gatgagtcca cccttctcta tgttgtcttc gaagtcttcg acgtcgtccg 21060
agtgcaccag ccccaccgcg gcgtcatcga ggccgtctac ctgcgcacgc ccttctcggc 21120
cggcaacgcc accacctaag cctcttgctt cttgcaagat atggcctgtg cgggctccgg 21180
cgagcaggag ctcagggcca tcctccgcga cctgggctgc gggccctgct tcctgggcac 21240
cttcgacaag cgcttcccgg gattcatggc cccgcacaag ctggcctgcg ccattgtcaa 21300
cacggccggc cgcgagaccg ggggcgagca ctggctggcc ttcgcctgga acccgcgctc 21360
ccacacctgc tacctcttcg acccctttgg gttctcggac gagcgcctca agcagatcta 21420
ccagttcgag tacgagggcc tgctgcgtcg cagcgccctg gccaccgagg accgctgcgt 21480
caccctggaa aagtccaccc agaccgtgca gggtccgcgc tcggccgcct gcgggctctt 21540
ctgctgcatg ttcctgcacg ccttcgtgca ctggcccgac cgccccatgg acaagaaccc 21600
caccatgaac ttgctgacgg gggtgcccaa cggcatgctc cagtcgcccc aggtggaacc 21660
caccctgcgc cgcaaccagg aggcgctcta ccgcttcctc aacgcccact ccgcctactt 21720
tcgatcccac cgcgcgcgca tcgagaaggc caccgccttc gaccgcatga atcaagacat 21780
gtaaaccgtg tgtgtatgtg aatgctttat tcataataaa cagcacatgt ttatgccacc 21840
ttctctgagg ctctgacttt atttagaaat cgaaggggtt ctgccggctc tcggcgtgcc 21900
ccgcgggcag ggatacgttg cggaactggt acttgggcag ccacttgaac tcggggatca 21960
gcagcttggg cacggggagg tcggggaacg agtcgctcca cagcttgcgc gtgagttgca 22020
gggcgcccag caggtcgggc gcggagatct tgaaatcgca gttgggaccc gcgttctgcg 22080
cgcgagagtt gcggtacacg gggttgcagc actggaacac catcagggcc gggtgcttca 22140
cgctcgccag caccgtcgcg tcggtgatgc cctccacgtc cagatcctcg gcgttggcca 22200
tcccgaaggg ggtcatcttg caggtctgcc gccccatgct gggcacgcag ccgggcttgt 22260
ggttgcaatc gcagtgcagg gggatcagca tcatctgggc ctgctcggag ctcatgcccg 22320
ggtacatggc cttcatgaaa gcctccagct ggcggaaggc ctgctgcgcc ttgccgccct 22380
cggtgaagaa gaccccgcag gacttgctag agaactggtt ggtggcgcag ccggcgtcgt 22440
gcacgcagca gcgcgcgtcg ttgttggcca gctgcaccac gctgcgcccc cagcggttct 22500
gggtgatctt ggcccggtcg gggttctcct tcagcgcgcg ctgcccgttc tcgctcgcca 22560
catccatctc gatcgtgtgc tccttctgga tcatcacggt cccgtgcagg caccgcagct 22620
tgccctcggc ctcggtgcag ccgtgcagcc acagcgcgca gccggtgctc tcccagttct 22680
tgtgggcgat ctgggagtgc gagtgcacga agccctgcag gaagcggccc atcatcgcgg 22740
tcagggtctt gttgctggtg aaggtcagcg ggatgccgcg gtgctcctcg ttcacataca 22800
ggtggcagat gcggcggtac acctcgccct gctcgggcat cagctggaag gcggacttca 22860
ggtcgctctc cacgcggtac cggtccatca gcagcgtcat cacttccatg cccttctccc 22920
aggccgaaac gatcggcagg ctcagggggt tcttcaccgc cattgtcatc ttagtcgccg 22980
ccgccgaagt cagggggtcg ttctcgtcca gggtctcaaa cactcgcttg ccgtccttct 23040
cggtgatgcg cacggggggg aaggcgaagc ccacggccgc cagctcctcc tcggcctgcc 23100
tttcgtcctc gctgtcctgg ctgatgtctt gcaaaggcac atgcttggtc ttgcggggtt 23160
tctttttggg cggcagaggc ggcggcggag acgtgctggg cgagcgcgag ttctcgctca 23220
ccacgactat ttcttctcct tggccgtcgt ccgagaccac gcggcggtag gcatgcctct 23280
tctggggcag aggcggaggc gacgggctct cgcggttcgg cgggcggctg gcagagcccc 23340
ttccgcgttc gggggtgcgc tcctggcggc gctgctctga ctgacttcct ccgcggccgg 23400
ccattgtgtt ctcctaggga gcaagcatgg agactcagcc atcgtcgcca acatcgccat 23460
ctgcccccgc cgccgccgac gagaaccagc agaatgaaag cttaaccgcc ccgccgccca 23520
gccccacctc cgacgcggcc ccagacatgc aagagatgga ggaatccatc gagattgacc 23580
tgggctacgt gacgcccgcg gagcacgagg aggagctggc agcgcgcttt tcagccccgg 23640
aagagaacca ccaagagcag ccagagcagg aagcagagag cgagcagcag caggctgggc 23700
tcgagcatgg cgactacctg agcggggcag aggacgtgct catcaagcat ctggcccgcc 23760
aatgcatcat cgtcaaggac gcgctgctcg accgcgccga ggtgcccctc agcgtggcgg 23820
agctcagccg cgcctacgag cgcaacctct tctcgccgcg cgtgcccccc aagcgccagc 23880
ccaacggcac ctgcgagccc aacccgcgcc tcaacttcta cccggtcttc gcggtgcccg 23940
aggccctggc cacctaccac ctctttttca agaaccaaag gatccccgtc tcctgccgcg 24000
ccaaccgcac ccgcgccgac gccctgctca acctgggccc cggcgcccgc ctacctgata 24060
tcgcctcctt ggaagaggtt cccaagatct tcgagggtct gggcagcgac gagactcggg 24120
ccgcgaacgc tctgcaagga agcggagagg agcatgagca ccacagcgcc ctggtggagt 24180
tggaaggcga caacgcgcgc ctggcggtgc tcaagcgcac ggtcgagctg acccacttcg 24240
cctacccggc gctcaacctg ccccccaagg tcatgagcgc cgtcatggac caggtgctca 24300
tcaagcgcgc ctcgcccctc tcggaggagg agatgcagga ccccgagagc tcggacgagg 24360
gcaagcccgt ggtcagcgac gagcagctgg cgcgctggct gggagcgagt agcacccccc 24420
agagcctgga agagcggcgc aagctcatga tggccgtggt cctggtgacc gtggagctgg 24480
agtgtctgcg ccgcttcttc gccgacgcgg agaccctgcg caaggtcgag gagaacctgc 24540
actacctctt caggcacggg ttcgtgcgcc aggcctgcaa gatctccaac gtggagctga 24600
ccaacctggt ctcctacatg ggcatcctgc acgagaaccg cctggggcag aacgtgctgc 24660
acaccaccct gcgcggggag gcccgccgcg actacatccg cgactgcgtc tacctgtacc 24720
tctgccacac ctggcagacg ggcatgggcg tgtggcagca gtgcctggag gagcagaacc 24780
tgaaagagct ctgcaagctc ctgcagaaga acctcaaggc cctgtggacc gggttcgacg 24840
agcgcaccac cgcctcggac ctggccgacc tcatcttccc cgagcgcctg cggctgacgc 24900
tgcgcaacgg gctgcccgac tttatgagcc aaagcatgtt gcaaaacttt cgctctttca 24960
tcctcgaacg ctccgggatc ctgcccgcca cctgctccgc gctgccctcg gacttcgtgc 25020
cgctgacctt ccgcgagtgc cccccgccgc tctggagcca ctgctacctg ctgcgcctgg 25080
ccaactacct ggcctaccac tcggacgtga tcgaggacgt cagcggcgag ggcctgctcg 25140
agtgccactg ccgctgcaac ctctgcacgc cgcaccgctc cctggcctgc aacccccagc 25200
tgctgagcga gacccagatc atcggcacct tcgagttgca aggccccggc gacagcgagg 25260
gcaagggggg tctcaaactc accccggggc tgtggacctc ggcctacttg cgcaagttcg 25320
tgcccgagga ctaccatccc ttcgagatca ggttctacga ggaccaatcc cagccgccca 25380
aggccaagct gtcggcctgc gtcatcaccc agggggccat cctggcccaa ttgcaagcca 25440
tccagaaatc ccgccaagaa tttctgctga aaaagggcca cggggtctac ttggaccccc 25500
agaccggaga ggagctcaac cccagcttcc cccaggatgc cccgaggaag cagcaagaag 25560
ctgaaagtgg agctgccgcc gccggaggat ttggaggaag actgggagag cagtcaggca 25620
gaggagatgg aagactggga cagcactcag gcagaggagg acagcctgca agacagtctg 25680
gaggaggaag acgaggtgga ggaggaggca gaggaagaag cagccgccgc cagaccgtcg 25740
tcctcggcgg aggagaaagc aagcagcacg gataccatct ccgctccggg tcggggtcgc 25800
ggcggccggg cccacagtag gtgggacgag accgggcgct tcccgaaccc caccacccag 25860
accggtaaga aggagcggca gggatacaag tcctggcggg ggcacaaaaa cgccatcgtc 25920
tcctgcttgc aagcctgcgg gggcaacatc tccttcaccc ggcgctacct gctcttccac 25980
cgcggggtga acttcccccg caacatcttg cattactacc gtcacctcca cagcccctac 26040
tactgtttcc aagaagaggc agaaacccag cagcagcagc agaaaaccag cgacagctag 26100
aaaatccaca gcggcggcgg caggtggact gaggatcgcg gcgaacgagc cagcgcagac 26160
ccgggagctg aggaaccgga tctttcccac cctctatgcc atcttccagc agagtcgggg 26220
gcaggagcag gaactgaaag tcaagaaccg ttctctgcgc tcgctcaccc gcagttgtct 26280
gtatcacaag agcgaagacc aacttcagcg cactctcgag gacgccgagg ctctcttcaa 26340
caagtactgc gcgctcactc ttaaagagta gcccgcgccc gcccacacac ggaaaaaggc 26400
gggaattacg tcaccacctg cgcccttcgc ccgaccatca tgagcaaaga gattcccacg 26460
ccttacatgt ggagctacca gccccagatg ggcctggccg ccggcgccgc ccaggactac 26520
tccacccgca tgaactggct cagtgccggg cccgcgatga tctcacgggt gaatgacatc 26580
cgcgcccacc gaaaccagat actcctagaa cagtcagcga tcaccaccac gccccgccat 26640
caccttaatc cgcgtaattg gcccgccgcc ctggtgtacc aggaaattcc ccagcccacg 26700
accgtactac ttccgcgaga cgcccaggcc gaagtccagc tgactaactc aggtgtccag 26760
ctggccggcg gcgccgccct gtgtcgtcac cgccccgctc agggtataaa gcggctggtg 26820
atccgaggca gaggcacaca gctcaacgac gaggtggtga gctcttcgct gggtctgcga 26880
cctgacggag tcttccaact cgccggatcg gggagatctt ccttcacgcc tcgtcaggcc 26940
gtcctgactt tggagagttc gtcctcgcag ccccgctcgg gcggcatcgg cactctccag 27000
ttcgtggagg agttcactcc ctcggtctac ttcaacccct tctccggctc ccccggccac 27060
tacccggacg agttcatccc gaacttcgac gccatcagcg agtcggtgga cggctacgat 27120
tgaatgtccc atggtggcgc agctgaccta gctcggcttc gacacctgga ccactgccgc 27180
cgcttccgct gcttcgctcg ggatctcgcc gagtttgcct actttgagct gcccgaggag 27240
caccctcagg gcccggccca cggagtgcgg atcgtcgtcg aagggggcct cgactcccac 27300
ctgcttcgga tcttcagcca gcgaccgatc ctggtcgagc gcgagcaagg acagacccgt 27360
ctgaccctgt actgcatctg caaccacccc ggcctgcatg aaagtctttg ttgtctgctg 27420
tgtactgagt ataataaaag ctgagatcag cgactactcc ggacttccgt gtgttcctga 27480
atccatcaac cagtctttgt tcttcaccgg gaacgagacc gagctccagc tccagtgtaa 27540
gccccacaag aagtacctca cctggctgtt ccagggctct ccgatcgccg ttgtcaacca 27600
ctgcgacaac gacggagtcc tgctgagcgg ccctgccaac cttacttttt ccacccgcag 27660
aagcaagctc cagctcttcc aacccttcct ccccgggacc tatcagtgcg tctcgggacc 27720
ctgccatcac accttccacc tgatcccgaa taccacagcg gcgctccccg ctactaacaa 27780
ccaaactacc caccaacgac accgtcgcga cctttcctct gggtctaata ccactaccgg 27840
aggtgagctc cgaggtcaac caacctctgg gatttactac ggcccctggg aggtggtagg 27900
gttaatagcg ctaggcctag ttgcgggtgg gcttttggct ctctgctacc tatacctccc 27960
ttgctgttcg tacttagtgg tgctgtgttg ctggtttaag aaatggggaa gatcacccta 28020
gtgagctgcg gtgcgctggt ggcggtggtg ctttcgattg tgggactggg cagcgcggct 28080
gtagtgaagg agaaggccga tccctgcttg catttcaatc ccgacaaatg ccagctgagt 28140
tttcagcccg atggcaatcg gtgcgcggtg ctgatcaagt gcggatggga atgcgagaac 28200
gtgagaatcg agtacaataa caagactcgg aacaatactc tcgcgtccgt gtggcagccc 28260
ggggaccccg agtggtacac cgtctctgtc cccggtgctg acggctcccc gcgcaccgtg 28320
aataatactt tcatttttgc gcacatgtgc gacacggtca tgtggatgag caagcagtac 28380
gatatgtggc cccccacgaa ggagaacatc gtggtcttct ccatcgctta cagcgtgtgc 28440
acggtgctaa tcaccgctat cgtgtgcctg agcattcaca tgctcatcgc tattcgcccc 28500
agaaataatg ccgaaaaaga gaaacagcca taacacgttt tttcacacac ctttttcaga 28560
ccatggcctc tgttactgcc ctatttattt ttttgggcct tgtgggcact agcagcactt 28620
ttgatcataa aaacctaact gtttttgttg gttctgatgt tacactacct gggcatcaat 28680
cgcaccagag ggtttcatgg tatcatttta ataaacagaa cacagcttat acactttgca 28740
aaggttatca gcaagccaca tatcgcagtg gtctttatta cagatgcaat aacaataacc 28800
tcacactact ctcagttaat gcaaattatt ctggcacata ctatggaacc aattttaacg 28860
caaaacagga cacttactat agtgtcaaag tattgaatcc aacctctcct agaactacca 28920
ctaagcctac caccaccact actactgcga aacccactac acctaaaact accaagaaaa 28980
ccactgtgaa aactacaaca actaggacca ccacaactac agaggctacc accagcacaa 29040
cacttgctac cactacacac acacacactg agctaacctt acagaccact aatgatttga 29100
tcgccctgtt gcaaaagggg gataacagca ccacttccaa tgaggagata cccaaatcca 29160
tgattggcat tattgttgct gtagtggtgt gcatgttgat catcgccttg tgcatggtgt 29220
actatgcctt ctgctacaga aagcacagac tgaacgacaa gctggaacac ttactaagtg 29280
ttgaatttta attttttaga accatgaaga tcctaggcct tttagttttt tctatcatta 29340
cctctgctct atgcaattct gacaatgagg acgttactgt cgttgtcgga tcaaattata 29400
cactaaaagg tccagcaaaa ggtatgcttt cgtggtattg ttggttcgga actgacgagc 29460
aacagacaga actttgcaat gctcaaaaag gcaaaacctc aaattctaaa atctctaatt 29520
atcaatgcaa tggcactgac ttagtattgc tcaatgtcac gaaagcatat gctggcagtt 29580
acacctgccc tggagatgat gccgacaata tgatttttta caaagtggaa gtggttgatc 29640
ccactactcc accgcccacc accacaacta ctcataccac acacacagaa caaacaccag 29700
aggcagcaga agcagagttg gccttccagg ttcacggaga ttcctttgct gtcaataccc 29760
ctacacccga tcagcggtgt ccggggctgc tcgtcagcgg cattgtcggt gtgctttcgg 29820
gattagcagt tataatcatc tgcatgttca tttttgcttg ctgctataga aggctttacc 29880
gacaaaaatc agacccactg ctgaacctct atgtttaatt ttttccagag ccatgaaggc 29940
agttagcact ctagtttttt gttctttgat tggcattgtt ttttgcaatc ctattcctag 30000
agttagcttt attaaagatg tgaatgttac tgaggggggc aatgtgacac tggtaggtgt 30060
agagggtgct gaaaacacca cctggacaaa ataccacctc aatgggtgga aagatatttg 30120
caattggagt gtattagttt atacatgtga gggagttaat cttaccattg tcaatgccac 30180
ctcagctcaa aatggtagaa ttcaaggaca aagtgtcagt gtatctaatg ggtattttac 30240
ccaacatact tttatctatg acgttaaagt cataccactg cctacgccta gcccacctag 30300
cactaccaca cagacaacca catacagtac atcaaatcag cctaccacca ctacagcagc 30360
agaggttgcc agctcgtctg gggtccgagt ggcatttttg atgttggccc catctagcag 30420
tcccactgct agtaccaatg agcagactac tgaatttttg tccactgtcg agagccacac 30480
cacagctacc tcgagtgcct tctctagcac cgccaatctc tcctcgcttt cctctacacc 30540
aatcagtccc gctactactc ctagccccgc tcctcttccc actcccctga agcaaactga 30600
ggacagcggc atgcaatggc agatcaccct gctcattgtg atcgggttgg tcatcctggc 30660
cgtgttgctc tactacatct tctgccgccg cattcccaac gcgcaccgca agccggccta 30720
caagcccatc gttatcgggc agccggagcc gcttcaggtg gaagggggtc taaggaatct 30780
tctcttctct tttacagtat ggtgattgaa ctatgattcc tagacaattc ttgatcacta 30840
ttcttatctg cctcctccaa gtctgtgcca ccctcgctct ggtggccaac gccagtccag 30900
actgtattgg gcccttcgcc tcctacgtgc tctttgcctt catcacctgc atctgctgct 30960
gtagcatagt ctgcctgctt atcaccttct tccagttcat tgactggatc tttgtgcgca 31020
tcgcctacct gcgccaccac ccccagtacc gcgaccagcg agtggcgcgg ctgctcaggc 31080
tcctctgata agcatgcggg ctctgctact tctcgcgctt ctgctgttag tgctcccccg 31140
tcccgtcgac ccccggtccc ccactcagtc ccccgaggag gtccgcaaat gcaaattcca 31200
agaaccctgg aaattcctca aatgctaccg ccaaaaatca gacatgcatc ccagctggat 31260
catgatcatt gggatcgtga acattctggc ctgcaccctc atctcctttg tgatttaccc 31320
ctgctttgac tttggttgga actcgccaga ggcgctctat ctcccgcctg aacctgacac 31380
accaccacag cagcaacctc aggcacacgc actaccacca ccacagccta ggccacaata 31440
catgcccata ttagactatg aggccgagcc acagcgaccc atgctccccg ctattagtta 31500
cttcaatcta accggcggag atgactgacc cactggccaa caacaacgtc aacgaccttc 31560
tcctggacat ggacggccgc gcctcggagc agcgactcgc ccaacttcgc attcgccagc 31620
agcaggagag agccgtcaag gagctgcagg acggcatagc catccaccag tgcaagaaag 31680
gcatcttctg cctggtgaaa caggccaaga tctcctacga ggtcacccag accgaccatc 31740
gcctctccta cgagctcctg cagcagcgcc agaagttcac ctgcctggtc ggagtcaacc 31800
ccatcgtcat cacccagcag tcgggcgata ccaaggggtg catccactgc tcctgcgact 31860
cccccgactg cgtccacact ctgatcaaga ccctctgcgg cctccgcgac ctcctcccca 31920
tgaactaatc acccccttat ccagtgaaat aaagatcata ttgatgatga tttaaataaa 31980
aaaaaaaaaa aaataatcat ttgatttgaa ataaagatac aatcatattg atgatttgag 32040
ttttaaaaaa ataaagaatc acttacttga aatctgatac caggtctctg tccatgtttt 32100
ctgccaacac cacttcactc ccctcttccc agctctggta ctgcaggccc cggcgggctg 32160
caaacttcct ccacacgctg aaggggatgt caaattcctc ctgtccctca atcttcattt 32220
tatcttctat cagatgtcca aaaagcgcgt ccgggtggat gatgacttcg accccgtcta 32280
cccctacgat gcagacaacg caccgaccgt gcccttcatc aaccccccct tcgtctcttc 32340
agatggattc caagagaagc ccctgggggt gctgtccctg cgactggccg accccgtcac 32400
caccaagaac ggggaaatca ccctcaagct gggagagggg gtggacctcg actcctcggg 32460
aaaactcatc tccaacacgg ccaccaaggc cgccgcccct ctcagttttt ccaacaaatt 32520
tcccttaaca tggatacccc tttttacacc aaagatggaa aattaaccat gcaggtcact 32580
gcaccgctaa agttagcaaa cacagccata ttgaacacac tagccatggc atatggaaat 32640
ggattagggc taagcaacaa cgctcttacc gttcagttac aatctccact cacctttaac 32700
aacagcaagg ttgctatcaa cctggaaaat ggaccactaa acgtgacatc aaatagactt 32760
agcattaatt gcaagagggg tgtctatgtc accaccacag gagatgcaat cgaaaccaac 32820
ataagttggc caaatgctat taaatttata ggaaatgcaa tgggtgtcaa tattgataca 32880
aacaaaggct tgcaatttgg caccaccagc actgtcacag atgtgaccga tgctttcccc 32940
atacaagtca aacttggggc tggtcttgca tttgatagca ctggagctat tgttgcatgg 33000
aacaaagagg atgacagtct cactttgtgg actacaccag atccatctcc aaattgcaag 33060
atagcatctg acaaagatgc taaactcaca ctttgcttga caaagtgtgg aagtcaaatt 33120
ctgggtactg tgactgtatt ggcagtgaat aatggaagtc tcaacccaat cacaaacaca 33180
gtaagcactg cccttgtatc acttaaattc gacgccaatg gagcactctt ggaaaaatca 33240
accctaaaca gagaatattg gaactacaga caaggagatc tcattccagg tacaccatat 33300
acccatgcag taggtttcat gcccaacaag aaagcctacc ctaaaaacac aactgcagct 33360
tccaaaagcc acattgtggg ggacgtctat ctagacgggg atgtagataa gcccctatct 33420
ctcataatca cttttaatga aactgatgat gaatcatgtg actattgcat gaactttcaa 33480
tggaaatggg gtgctgatca atacaaggac aaaacactcg ctaccagctc cttcaccttc 33540
tcctacatcg cccaagaatg aacactgtat cccaccctgc atgccaaccc ttcccacccc 33600
actctgtctg tggaaaaaac tctgaaacac aaaataaaat aaagttcaag tgttttattg 33660
attcaacagt tttacaggat tcgagcagtt atttttcctc caccctccca ggacatggaa 33720
tacaccaccc tctccccccg cacagccttg aacatctgaa tgccattggt gatggacatg 33780
cttttggtct ccacgttcca cacagtttca gagcgagcca gtctcgggtc ggtcagggag 33840
atgaaaccct ccgggcactc ccgcatctgc acctcacagc tcaacagctg aggattgtcc 33900
tcggtggtcg ggatcacggt tatctggaag aagcagaaga gcggcggtgg gaatcatagt 33960
ccgcgaacgg gatcggccgg tggtgccgca tcaggccccg cagcagtcgc tgccgccgcc 34020
gctccgtcaa gctgctgctc agggggtccg ggtccaggga ctccctcagc atgatgccca 34080
cggccctcag catcagtcgt ctggtgcggc gggcgcagca gcgcatgcgg atctcgctca 34140
ggtcgctgca gtacgtgcaa cacaggacca ccaggttgtt caacagtcca tagttcaaca 34200
cgctccagcc gaaactcatc gcgggaagga tgctacccac gtggccgtcg taccagatcc 34260
tcaggtaaat caagtggcgc cccctccaga acacgctgcc cacgtacatg atctccttgg 34320
gcatgtggcg gttcaccacc tcccggtacc acatcaccct ttggttgaac atgcagcccc 34380
ggatgatcct gcggaaccac agggccagca ccgccccgcc cgccatgcag cgaagagacc 34440
ccgggtcccg acaatggcaa tggaggaccc accgctcgta cccgtggatc atctgggagc 34500
tgaacaagtc tatgttggca cagcacaggc acacgctcat gcatctcttc agcactctca 34560
gctcctcggg ggtcaaaacc atatcccagg gcacggggaa ctcttgcagg acagcgaacc 34620
ccgcagaaca gggcaatcct cgcacataac ttacattgtg catggacagg gtatcgcaat 34680
caggcagcac cgggtgatcc tccaccagag aagcgcgggt ctcggtctcc tcacagcgtg 34740
gtaagggggc cggccgatac gggtgatggc gggacgcggc tgatcgtgtt cgcgaccgtg 34800
tcatgatgca gttgctttcg gacattttcg tacttgctgt agcagaacct ggtccgggcg 34860
ctgcacaccg atcgccggcg gcggtctcgg cgcttggaac gctcggtgtt gaaattgtaa 34920
aacagccact ctctcagacc gtgcagcaga tctagggcct caggagtgat gaagatccca 34980
tcatgcctga tggctctgat cacatcgacc accgtggaat gggccagacc cagccagatg 35040
atgcaatttt gttgggtttc ggtgacggcg ggggagggaa gaacaggaag aaccatgatt 35100
aacttttaat ccaaacggtc tcggagtact tcaaaatgaa gatcgcggag atggcacctc 35160
tcgcccccgc tgtgttggtg gaaaataaca gccaggtcaa aggtgatacg gttctcgaga 35220
tgttccacgg tggcttccag caaagcctcc acgcgcacat ccagaaacaa gacaatagcg 35280
aaagcgggag ggttctctaa ttcctcaatc atcatgttac actcctgcac catccccaga 35340
taattttcat ttttccagcc ttgaatgatt cgaactagtt cctgaggtaa atccaagcca 35400
gtcatgataa agagctcgcg cagagcgccc tccaccggca ttcttaagca caccctcata 35460
attccaagat attctgctcc tggttcacct gcagcagatt gacaagcgga atatcaaaat 35520
ctctgccgcg atccctgagc tcctccctca gcaataactg taagtactct ttcatatcct 35580
ctccgaaatt tttagccata ggaccaccag gaataagatt agggcaagcc acagtacaga 35640
taaaccgaag tcctccccag tgagcattgc caaatgcaag actgctataa gcatgctggc 35700
tagacccggt gatatcttcc agataactgg acagaaaatc acccaggcaa tttttaagaa 35760
aatcaacaaa agaaaaatcc tccaggtgca cgtttagggc ctcgggaaca acgatggagt 35820
aaacgcaagc ggtgcgttcc agcatggtta gttagctgat ctgtaaaaaa acaaaaaata 35880
aaacattaaa ccatgctagc ctggcgaaca ggtgggtaaa tcgttctctc cagcaccagg 35940
caggccacgg ggtctccggc gcgaccctcg taaaaattgt cgctatgatt gaaaaccatc 36000
acagagagac gttcccggtg gccggcgtga atgattcgac aagatgaata cacccccgga 36060
acattggcgt ccgcgagtga aaaaaagcgc ccgaggaagc aataaggcac tacaatgctc 36120
agtctcaagt ccagcaaagc gatgccatgc ggatgaagca caaaattctc aggtgcgtac 36180
aaaatgtaat tactcccctc ctgcacaggc agcaaagccc ccgatccctc caggtacaca 36240
tacaaagcct cagcgtccat agcttaccga gcagcagcac acaacaggcg caagagtcag 36300
agaaaggctg agctctaacc tgtccacccg ctctctgctc aatatatagc ccagatctac 36360
actgacgtaa aggccaaagt ctaaaaatac ccgccaaata atcacacacg cccaacacac 36420
gcccagaaac cggtgacaca ctcagaaaaa tacgcgcact tcctcaaacg cccaaactgc 36480
cgtcatttcc gggttcccac gctacgtcat cagaattcga ctttcaaatt ccgtcgaccg 36540
ttaaaaacgt cacccgcccc gcccctaacg gtcgcccgtc tctcggccaa tcacagcccc 36600
gcatccccaa attcaaacac ctcatttgca tattaacgcg caccaaaagt ttgaggtata 36660
ttattgatga tgttaattaa ttggttc 36687
<210> 2
<211> 40224
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttaattaatt ggttccactg agcgtcagac cccttaataa gatgatcttc ttgagatcgt 60
tttggtctgc gcgtaatctc ttgctctgaa aacgaaaaaa ccgccttgca gggcggtttt 120
tcgaaggttc tctgagctac caactctttg aaccgaggta actggcttgg aggagcgcag 180
tcaccaaaac ttgtcctttc agtttagcct taaccggcgc atgacttcaa gactaactcc 240
tctaaatcaa ttaccagtgg ctgctgccag tggtgctttt gcatgtcttt ccgggttgga 300
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcggac tgaacggggg gttcgtgcat 360
acagtccagc ttggagcgaa ctgcctaccc ggaactgagt gtcaggcgtg gaatgagaca 420
aacgcggcca taacagcgga atgacaccgg taaaccgaaa ggcaggaaca ggagagcgca 480
cgagggagcc gccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 540
actgatttga gcgtcagatt tcgtgatgct tgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 600
gctttgccgc ggccctctca cttccctgtt aagtatcttc ctggcatctt ccaggaaatc 660
tccgccccgt tcgtaagcca tttccgctcg ccgcagtcga acgaccgagc gtagcgagtc 720
agtgagcgag gaagcggaat atatcctgta tcacatattc tgctgacgca ccggtgcagc 780
cttttttctc ctgccacatg aagcacttca ctgacaccct catcagtgcc aacatagtaa 840
gccagtatac actccgctag cgctgaggtc tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat 900
accaggcctg aatcgcccca tcatccagcc agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag 960
ctttgttgta ggtggaccag ttggtgattt tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg 1020
cgttgtcggg aagatgcgtg atctgatcct tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac 1080
aaagccacgt tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat 1140
catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 1200
ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat 1260
atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt 1320
atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg 1380
atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca 1440
tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga 1500
aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gctgatgcgc 1560
tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg 1620
atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga 1680
gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata 1740
agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 1800
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 1860
accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 1920
agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 1980
atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 2040
gcattacgct gacttgacgg gacggcttag ggttaggcgt tttgcgctgc ttcgcgatgt 2100
acgggccaga tatacgcaat gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta 2160
acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg 2220
gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt 2280
ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac 2340
ataaacctct ggctaactag agaacccact gcttactggc ttatcgaaat taatacgact 2400
cactataggg agacccagcc accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 2460
tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 2520
agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 2580
agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 2640
gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 2700
acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 2760
tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 2820
aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 2880
tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 2940
aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 3000
ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 3060
acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 3120
gcatggacga gctgtacaag taaagcggcc gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg 3180
ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 3240
gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 3300
tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 3360
caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc 3420
ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg 3480
cgcattaata gggataacag ggtaatatac aaacgaggcc ctttcgtctt taattaacat 3540
catcaataat atacctcaaa cttttggtgc gcgttaatat gcaaatgagg tgtttgaatt 3600
tggggatgcg gggctgtgat tggccgagag acgggcgacc gttaggggcg gggcgggtga 3660
cgttttgatg acgtggccgt gaggcggagc cggtttgcaa gttctcgtgg gaaaagtgac 3720
gtcaaacgag gtgtggtttg aacacggaaa tactcaattt tcccgcgctc tctgacagga 3780
aatgaggtgt ttctgggcgg atgcaagtga aaacgggcca ttttcgcgcg aaaactgaat 3840
gaggaagtga aaatctgagt aatttcgcgt ttatggcagg gaggagtatt tgccgagggc 3900
cgagtagact ttgaccgatt acgtgggggt ttcgattacc gtatttttca cctaaatttc 3960
cgcgtacggt gtcaaagtcc ggtgttttta cgtaggtgtc agctgatcgc cagggtattt 4020
aaacctgcgc tctctagtca agaggccact cttgagtgcc agcgagtaga gttttctcct 4080
ccgcgccgcg agtcagatct acactttgaa agatgaggca cctgagagac ctgcccggta 4140
atgttttcct ggctactggg aacgagattc tggaactggt ggtggacgcc atgatgggtg 4200
acgaccctcc tgagccccct accccatttg aggcgccttc gctgtacgat ttgtatgatc 4260
tggaggtgga tgtgcccgag aacgacccca acgaggaggc ggtgaatgat ttgtttagcg 4320
atgccgcgct gctggctgcc gagcaggcta atacggactc tggctcagac agcgattcct 4380
ctctccatac cccgagaccc ggcagaggtg agaaaaagat ccccgagctt aaaggggaag 4440
agctcgacct gcgctgctat gaggaatgct tgcctccgag cgatgatgag gaggacgagg 4500
aggcgattcg agctgcagcg agcgagggag tgaaagctgc gggcgagagc tttagcctgg 4560
actgtcctac tctgcccgga cacggctgta agtcttgtga atttcatcgc atgaatactg 4620
gagataagaa tgtgatgtgt gccctgtgct atatgagagc ttacaaccat tgtgtttaca 4680
gtaagtgtga ttaactttag ctgggaaggc agagggtgac tgggtgctga ctggtttatt 4740
tatgtatgta ttctttatgt gtaggtcccg tctctgacgc agatgagacc cccacttcag 4800
agtgcatttc atcaccccca gaaattggcg aggaaccgcc cgaagatatt attcatagac 4860
cagttgcagt gagagtcacc gggcggagag cagctgtgga gagtttggat gacttgctac 4920
agggtgggga tgaacctttg gacttgtgta cccggaaacg ccccaggcac taagtgccac 4980
acatgtgtgt ttacttaagg tgatgtcagt atttataggg tgtggagtgc aataaaaata 5040
tgtgttgact ttaagtgcgt ggtttatgac tcaggggtgg ggactgtggg tatataagca 5100
ggtgcagacc tgtgtggtca gttcagagca ggactcatgg agatctggac ggtcttggaa 5160
gactttcacc agactagaca gctgctagag aactcatcgg agggagtctc ttacctgtgg 5220
agattctgct tcggtggggc tctagctaag ctagtccata gggccaaaca ggattataag 5280
gatcaatttg aggatatttt gagagagtgt cctggtattt ttgactctct caacttgggc 5340
catcagtctc actttaacca gagtattctg agagcccttg acttttctac tcctggcaga 5400
actaccgccg cggtagcctt ttttgccttt attcttgaca aatggagtca agaaacccat 5460
ttcagcaggg attaccgtct ggactgctta gcagtagctt tgtggagaac atggaggtgc 5520
cagcgcctga atgcaatctc cggctacttg ccagtacagc cggtagacac gctgaggatc 5580
ctgagtctcc agtcacccca ggaacaccaa cgccgccagc agccgcagca ggagcagcag 5640
caagaggagg aggaggatcg agaagagaac ccgagagccg gtctggaccc tccggtggcg 5700
gaggaggagg agtagctgac ttgtttcccg agctgcgccg ggtgctgact aggtcttcca 5760
gtggacggga gagggggatt aagcgggaga ggcatgagga gactagtcac agaactgaac 5820
tgactgtcag tctgatgagc cgcaggcgcc cagaatcggt gtggtggcat gaggtgcagt 5880
cgcaggggat agatgaggtc tcggtgatgc atgagaaata ttccctagaa caagtcaaga 5940
cttgttggtt ggagcctgag gatgattggg aggtagccat caggaattat gccaagttgg 6000
ctctgaagcc agataagaag tacaagatta ccaaactgat taatatcaga aattcctgct 6060
acatttcggg gaatggggcc gaggtggaga tcagtaccca ggagagggtg gccttcagat 6120
gctgcatgat gaatatgtac ccgggagtgg tgggcatgga gggagtcacc tttatgaacg 6180
cgaggttcag gggtgatggg tataatgggg tggtctttat ggccaacacc aagctgacag 6240
tgcacggatg ctccttcttt ggcttcaata acatgtgcat cgaggcctgg ggcagtgttt 6300
cagtgagggg atgcagcttt tcagccaact ggatgggggt cgtgggcaga accaagagca 6360
aggtgtcagt gaagaaatgc ctgttcgaga ggtgccacct gggggtgatg agcgagggcg 6420
aagccaaagt caaacactgc gcctctaccg agacgggctg ctttgtgctg atcaagggca 6480
atgccaaagt caagcataat atgatctgtg gggcctcgga tgagcgcggc taccagatgc 6540
tgacctgcgc cggtgggaac agccatatgc tggccaccgt gcatgtggcc tcgcaccccc 6600
gcaagacatg gcccgagttc gagcacaacg tcatgacccg ctgcaatgtg cacctgggtt 6660
cccgccgagg catgttcatg ccctaccagt gcaacatgca atttgtgaag gtgctgctgg 6720
agcccgatgc catgtccaga gtgagcctga cgggggtgtt tgacatgaat gtggagctgt 6780
ggaaaattct gagatatgat gaatccaaga ccaggtgccg ggcctgcgaa tgcggaggca 6840
agcacgccag gcttcagccc gtgtgtgtgg aggtgacgga ggacctgcga cccgatcatt 6900
tggtgttgtc ctgcaacggg acggagttcg gctccagcgg ggaagaatct gactagagtg 6960
agtagtgttt gggggtgggt gggagcctgc atgaggggca gaatgactaa aatctgtgtt 7020
tttctgtgtg ttgcagcagc atgagcggaa gcgcctcctt tgagggaggg gtattcagcc 7080
cttatctgac ggggcgtctc ccctcctggg ctggagtgcg tcagaatgtg atgggatcca 7140
cggtggacgg ccggcccgtg cagcccgcga actcttcaac cctgacctac gcgaccctga 7200
gctcctcgtc cgtggacgca gctgccgccg cagctgctgc ttccgccgcc agcgccgtgc 7260
gcggaatggc cctgggtgcc ggctactaca gctctctggt ggccaactcg agttccacca 7320
ataatcccgc cagcctgaac gaggagaagc tgctgctgct gatggcccag ctcgaggccc 7380
tgacccagcg cctgggcgag ctgacccagc aggtggctca gctgcaggcg gagacgcggg 7440
ccgcggttgc cacggtgaaa accaaataaa aaatgaatca ataaataaac ggagacggtt 7500
gttgatttta acacagagtc ttgaatcttt atttgatttt tcgcgcgcgg taggccctgg 7560
accaccggtc tcgatcattg agcacccggt ggattttttc caggacccgg tagaggtggg 7620
cttggatgtt gaggtacatg ggcatgagcc cgtcccgggg gtggaggtag ctccattgca 7680
gggcctcgtg ctcgggggtg gtgttgtaaa tcacccagtc atagcagggg cgcagggcgt 7740
ggtgctgcac gatgtccttg aggaggagac tgatggccac gggcagcccc ttggtgtagg 7800
tgttgacgaa cctgttgagc tgggagggat gcatgcgggg ggagatgaga tgcatcttgg 7860
cctggatctt gagattggcg atgttcccgc ccagatcccg ccgggggttc atgttgtgca 7920
ggaccaccag cacggtgtat ccggtgcact tggggaattt gtcatgcaac ttggaaggga 7980
aggcatgaaa gaatttggag acgcccttgt gaccgcccag gttttccatg cactcatcca 8040
tgatgatggc aatgggcccg tgggcggcgg cctgggcaaa gacgtttcgg gggtcggaca 8100
catcgtagtt gtggtcctgg gtgagctcgt cataggccat tttaatgaat ttgggacgga 8160
gggtgcccga ttgggggacg aaggtgccct cgatcccggg ggcgtagttg ccctcgcaga 8220
tctgcatctc ccaggccttg agctcggagg gggggatcat gtccacctgc ggggcgatga 8280
aaaaaacggt ttccggggcg ggggagatga gctgcgccga aagcaggttc cggagcagct 8340
gggacttgcc gcagccggtg ggaccgtaga tgaccccgat gaccggctgc aggtggtagt 8400
tgagggagag acagctgccg tcctcgcgga ggaggggggc cacctcgttc atcatctcgc 8460
gcacatgcat gttctcgcgc acgagttccg ccaggaggcg ctcgcccccc agcgagagga 8520
gctcttgcag cgaggcgaag tttttcagcg gcttgagccc gtcggccatg ggcattttgg 8580
agagggtctg ttgcaagagt tccagacggt cccagagctc ggtgatgtgc tctagggcat 8640
ctcgatccag cagacctcct cgtttcgcgg gttggggcga ctgcgggagt agggcaccag 8700
gcgatgggcg tccagcgagg ccagggtccg gtccttccag ggccgcaggg tccgcgtcag 8760
cgtggtctcc gtcacggtga aggggtgcgc gccgggctgg gcgcttgcga gggtgcgctt 8820
caggctcatc cggctggtcg agaaccgctc ccggtcggcg ccctgcgcgt cggccaggta 8880
gcaattgagc atgagttcgt agttgagcgc ctcggccgcg tggcccttgg cgcggagctt 8940
acctttggaa gtgtgtccgc agacgggaca gaggagggac ttgagggcgt agagcttggg 9000
ggcgaggaag acggactcgg gggcgtaggc gtccgcgccg cagctggcgc agacggtctc 9060
gcactccacg agccaggtga ggtcgggccg gtcggggtca aaaacgaggt ttcctccgtg 9120
ctttttgatg cgtttcttac ctctggtctc catgagctcg tgtccccgct gggtgacaaa 9180
gaggctgtcc gtgtccccgt agaccgactt tatgggtcgg tcctcgagcg gggtgccgcg 9240
gtcctcgtcg tagaggaacc ccgcccactc cgagacgaag gcccgggtcc aggccagcac 9300
gaaggaggcc acgtgggagg ggtagcggtc gttgtccacc agcgggtcca ccttctccag 9360
ggtatgcaag cacatgtccc cctcgtccac atccaggaag gtgattggct tgtaagtgta 9420
ggccacgtga ccgggggtcc cggccggggg ggtataaaag ggggcgggcc cctgctcgtc 9480
ctcactgtct tccggatcgc tgtccaggag cgccagctgt tggggtaggt attccctctc 9540
gaaggcgggc atgacctcgg cactcaggtt gtcagtttct agaaacgagg aggatttgat 9600
attgacggtg ccgttggaga cgcctttcat gagcccctcg tccatctggt cagaaaagac 9660
gatctttttg ttgtcgagct tggtggcgaa ggagccgtag agggcgttgg agagcagctt 9720
ggcgatggag cgcatggtct ggttcttttc cttgtcggcg cgctccttgg cggcgatgtt 9780
gagctgtacg tactcgcgcg ccacgcactt ccattcgggg aagacggtgg tgagctcgtc 9840
gggcacgatt ctgacccgcc agccgcggtt gtgcagggtg atgaggtcca cgctggtggc 9900
cacctcgccg cgcaggggct cgttggtcca gcagaggcgc ccgcccttgc gcgagcagaa 9960
ggggggcagc gggtccagca tgagctcgtc gggggggtcg gcgtccacgg tgaagatgcc 10020
gggcaggagc tcggggtcaa agtagctgat gcaggtgccc agatcgtcca gcgccgcttg 10080
ccagtcgcgc acggccagcg cgcgctcgta ggggctgagg ggcgtgcccc agggcatggg 10140
gtgcgtgagc gcggaggcgt acatgccgca gatgtcgtag acgtagaggg gctcctcgag 10200
gacgccgatg taggtggggt agcagcgccc cccgcggatg ctggcgcgca cgtagtcgta 10260
cagctcgtgc gagggcgcga ggagccccgt gccgagattg gagcgctgcg gcttttcggc 10320
gcggtagacg atctggcgga agatggcgtg ggagttggag gagatggtgg gcctctggaa 10380
gatgttgaag tgggcgtggg gcaggccgac cgagtccctg atgaagtggg cgtaggagtc 10440
ctgcagcttg gcgacgagct cggcggtgac gaggacgtcc agggcgcagt agtcgagggt 10500
ctcttggatg atgtcatact tgagctggcc cttctgcttc cacagctcgc ggttgagaag 10560
gaactcttcg cggtccttcc agtactcttc gagggggaac ccgtcctgat cggcacggta 10620
agagcccacc atgtagaact ggttgacggc cttgtaggcg cagcagccct tctccacggg 10680
gagggcgtaa gcttgcgcgg ccttgcgcag ggaggtgtgg gtgagggcga aggtgtcgcg 10740
caccatgacc ttgaggaact ggtgcttgaa gtcgaggtcg tcgcagccgc cctgctccca 10800
gagttggaag tccgtgcgct tcttgtaggc ggggttgggc aaagcgaaag taacatcgtt 10860
gaagaggatc ttgcccgcgc ggggcatgaa gttgcgagtg atgcggaaag gctggggcac 10920
ctcggcccgg ttgttgatga cctgggcggc gaggacgatc tcgtcgaagc cgttgatgtt 10980
gtgcccgacg atgtagagtt ccacgaatcg cgggcggccc ttgacgtggg gcagcttctt 11040
gagctcgtcg taggtgagct cggcggggtc gctgaggccg tgctgctcga gggcccagtc 11100
ggcgacgtgg gggttggcgc tgaggaagga agtccagaga tccacggcca gggcggtctg 11160
caagcggtcc cggtactgac ggaactgctg gcccacggcc attttttcgg gggtgacgca 11220
gtagaaggtg cgggggtcgc cgtgccagcg gtcccacttg agctggaggg cgaggtcgtg 11280
ggcgagctcg acgagcggcg ggtccccgga gagtttcatg accagcatga aggggacgag 11340
ctgcttgccg aaggacccca tccaggtgta ggtttccaca tcgtaggtga ggaagagcct 11400
ttcggtgcga ggatgcgagc cgatggggaa gaactggatc tcctgccacc agttggagga 11460
atggctgttg atgtgatgga agtagaaatg ccgacggcgc gccgagcact cgtgcttgtg 11520
tttatacaag cgtccgcagt gctcgcaacg ctgcacggga tgcacgtgct gcacgagctg 11580
tacctgagtt cctttgacga ggaatttcag tgggcagtgg agcgctggcg gctgcatctg 11640
gtgttgtact acgtcctggc catcggcgtg gccatcgtct gcctcgatgg tggtcatgct 11700
gacgaggccg cgcgggaggc aggtccagac ctcggctcgg acgggtcgga gagcgaggac 11760
gagggcgcgc aggccggagc tgtccagggt cctgagacgc tgcggagtca ggtcagtggg 11820
cagcggcggc gcgcggttga cttgcaggag cttttccagg gcgcgcggga ggtccagatg 11880
gtacttgatc tccacggcgc cgttggtggc aacgtccacg gcttgcaggg tgccgtgccc 11940
ctggggcgcc accaccgtgc cccgtttctt tttgggcgct ggcggcggcg gctccatgct 12000
tagaatcggc ggcgaggacg cgcgccgggc ggcaggggcg gctcggggcc cggaggcagg 12060
ggcggcaggg gcacgtcggc gccgcgcgcg ggcaggttct ggtactgcgc ccggagaaga 12120
ctggcgtgag cgacgacgcg acggttgacg tcctggatct gacgcctctg ggtgaaggcc 12180
acgggacccg tgagtttgaa cctgaaagag agttcgacag aatcaatctc ggtatcgttg 12240
acggcagcct gccgcaggat ctcttgcacg tcgcccgagt tgtcctggta ggcgatctcg 12300
gtcatgaact gctcgatctc ctcctcctga aggtctccgc ggccggcgcg ctcgacggtg 12360
gccgcgaggt cgttggagat gcggcccatg agctgcgaga aggcgttcat gccggcctcg 12420
ttccagacgc ggctgtagac cacggctccg tcggggtcgc gcgcgcgcat gaccacctgg 12480
gcgaggttga tctccacgtg gcgcgtgaag accgcgtagt tgcagaggcg ctggtagagg 12540
tagttgagcg tggtggcgat gtgctcggtg acgaagaagt acatgatcca gcggcggagc 12600
ggcatctcgc tgacgtcgcc cagggcttcc aagcgctcca tggcctcgta gaagtccacg 12660
gcgaagttga aaaactggga gttgcgcgcc gagacggtca actcctcctc cagaagacgg 12720
atgagctcgg cgatggtggc gcgcacctcg cgctcgaagg ccccgggggg ctcctcttct 12780
tccatctcct cctcctcttc ctcctcctcc actaacatct cttctacttc ctcctcagga 12840
ggcggcggcg ggggaggggc cctgcgtcgc cggcggcgca cgggcagacg gtcgatgaag 12900
cgctcgatgg tctccccgcg ccggcgacgc atggtctcgg tgacggcgcg cccgtcctcg 12960
cggggccgca gcgtgaagac gccgccgcgc atctccaggt ggccgccggg ggggtctccg 13020
ttgggcaggg agagggcgct gacgatgcat cttatcaatt ggcccgtagg gactccgcgc 13080
aaggacctga gcgtctcgag atccacggga tccgaaaacc gctgaacgaa ggcttcgagc 13140
cagtcgcagt cgcaaggtag gctgagcccg gtttcttgtt cttcgggtat ttggtcggga 13200
ggcgggcggg cgatgctgct ggtgatgaag ttgaagtagg cggtcctgag acggcggatg 13260
gtggcgagga gcaccaggtc cttgggcccg gcttgctgga tgcgcagacg gtcggccatg 13320
ccccaggcgt ggtcctgaca cctggcgagg tccttgtagt agtcctgcat gagccgctcc 13380
acgggcacct cctcctcgcc cgcgcggccg tgcatgcgcg tgagcccgaa cccgcgctgg 13440
ggctggacga gcgccaggtc ggcgacgacg cgctcggcga ggatggcctg ctggatctgg 13500
gtgagggtgg tctggaagtc gtcgaagtcg acgaagcggt ggtaggctcc ggtgttgatg 13560
gtgtaggagc agttggccat gacggaccag ttgacggtct ggtggccggg gcgcacgagc 13620
tcgtggtact tgaggcgcga gtaggcgcgc gtgtcgaaga tgtagtcgtt gcaggtgcgc 13680
acgaggtact ggtatccgac gaggaagtgc ggcggcggct ggcggtagag cggccatcgc 13740
tcggtggcgg gggcgccggg cgcgaggtcc tcgagcatga ggcggtggta gccgtagatg 13800
tacctggaca tccaggtgat gccggcggcg gtggtggagg cgcgcgggaa ctcgcggacg 13860
cggttccaga tgttgcgcag cggcaggaag tagttcatgg tggccgcggt ctggcccgtg 13920
aggcgcgcgc agtcgtggat gctctagaca tacgggcaaa aacgaaagcg gtcagcggct 13980
cgactccgtg gcctggaggc taagcgaacg ggttgggctg cgcgtgtacc ccggttcgag 14040
tccctgctcg aatcaggctg gagccgcagc taacgtggta ctggcactcc cgtctcgacc 14100
caagcctgct aacgaaacct ccaggatacg gaggcgggtc gttttggcaa ttttcgtcag 14160
gccggaaatg aaactagtaa gcgcggaaag cggccgcccg cgatggctcg ctgccgtagt 14220
ctggagaaag aatcgccagg gttgcgttgc ggtgtgcccc ggttcgagcc tcggcgctcg 14280
tgccggccgg attccgcggc taacgtgggc gtggctgccc cgtcgtttcc aagacccctt 14340
agccagccga cttctccagt tacggagcga gcccctcttt tttttttttc ttgtgttttt 14400
gccagatgca tcccgtactg cggcagatgc gcccccaccc tccaccacaa ccgcccctac 14460
cgcagcagca gcaacagccg gcgcttctgc ccccgcccca gcagcagcag ccagccacta 14520
ccgcggcggc cgccgtgagc ggagccggcg ttcagtatga cctggccttg gaagagggcg 14580
aggggctggc gcggctgggg gcgtcgtcgc cggagcggca cccgcgcgtg cagatgaaaa 14640
gggacgctcg cgaggcctac gtgcccaagc agaacctgtt cagagacagg agcggcgagg 14700
agcccgagga gatgcgcgcc tcccgcttcc acgcggggcg ggagctgcgg cgcggcctgg 14760
accgaaagcg ggtgctgagg gacgaggatt tcgaggcgga cgagctgacg gggatcagcc 14820
ccgcgcgcgc gcacgtggcc gcggccaacc tggtcacggc gtacgagcag accgtgaagg 14880
aggagagcaa cttccaaaaa tccttcaaca accacgtgcg cacgctgatc gcgcgcgagg 14940
aggtgaccct gggcctgatg cacctgtggg acctgctgga ggccatcgtg cagaacccca 15000
cgagcaagcc gctgacggcg cagctgtttc tggtggtgca gcacagtcgg gacaacgaga 15060
cgttcaggga ggcgctgctg aatatcaccg agcccgaggg ccgctggctc ctggacctgg 15120
tgaacattct gcagagcatc gtggtgcagg agcgcgggct gccgctgtcc gagaagctgg 15180
cggccatcaa cttctcggtg ctgagcctgg gcaagtacta cgctaggaag atctacaaga 15240
ccccgtacgt gcccatagac aaggaggtga agatcgacgg gttttacatg cgcatgaccc 15300
tgaaagtgct gaccctgagc gacgatctgg gggtgtaccg caacgacagg atgcaccgcg 15360
cggtgagcgc cagccgccgg cgcgagctga gcgaccagga gctgatgcac agcctgcagc 15420
gggccctgac cggggccggg accgaggggg agagctactt tgacatgggc gcggacctgc 15480
gctggcagcc cagccgccgg gccttggaag ctgccggcgg ttccccctac gtggaggagg 15540
tggacgatga ggaggaggag ggcgagtacc tggaagactg atggcgcgac cgtatttttg 15600
ctagatgcag caacagccac cgccgcctcc tgatcccgcg atgcgggcgg cgctgcagag 15660
ccagccgtcc ggcattaact cctcggacga ttggacccag gccatgcaac gcatcatggc 15720
gctgacgacc cgcaatcccg aagcctttag acagcagcct caggccaacc ggctctcggc 15780
catcctggag gccgtggtgc cctcgcgctc gaaccccacg cacgagaagg tgctggccat 15840
cgtgaacgcg ctggtggaga acaaggccat ccgcggcgac gaggccgggc tggtgtacaa 15900
cgcgctgctg gagcgcgtgg cccgctacaa cagcaccaac gtgcagacga acctggaccg 15960
catggtgacc gacgtgcgcg aggcggtgtc gcagcgcgag cggttccacc gcgagtcgaa 16020
cctgggctcc atggtggcgc tgaacgcctt cctgagcacg cagcccgcca acgtgccccg 16080
gggccaggag gactacacca acttcatcag cgcgctgcgg ctgatggtgg ccgaggtgcc 16140
ccagagcgag gtgtaccagt cggggccgga ctacttcttc cagaccagtc gccagggctt 16200
gcagaccgtg aacctgagcc aggctttcaa gaacttgcag ggactgtggg gcgtgcaggc 16260
cccggtcggg gaccgcgcga cggtgtcgag cctgctgacg ccgaactcgc gcctgctgct 16320
gctgctggtg gcgcccttca cggacagcgg cagcgtgagc cgcgactcgt acctgggcta 16380
cctgcttaac ctgtaccgcg aggccatcgg gcaggcgcac gtggacgagc agacctacca 16440
ggagatcacc cacgtgagcc gcgcgctggg ccaggaggac ccgggcaacc tggaggccac 16500
cctgaacttc ctgctgacca accggtcgca gaagatcccg ccccagtacg cgctgagcac 16560
cgaggaggag cgcatcctgc gctacgtgca gcagagcgtg gggctgttcc tgatgcagga 16620
gggggccacg cccagcgccg cgctcgacat gaccgcgcgc aacatggagc ccagcatgta 16680
cgcccgcaac cgcccgttca tcaataagct gatggactac ttgcatcggg cggccgccat 16740
gaactcggac tactttacca acgccatctt gaacccgcat tggctcccgc cgcccgggtt 16800
ctacacgggc gagtacgaca tgcccgaccc caacgacggg ttcctgtggg acgacgtgga 16860
cagcagcgtg ttctcgccgc gccccaccgc caccaccgtg tggaagaaag agggcgggga 16920
ccggcggccg tcctcggcgc tgtccggtcg cgcgggtgct gccgcggcgg tgcccgaggc 16980
cgccagcccc ttcccgagcc tgcccttttc gctgaacagc gtgcgcagca gcgagctggg 17040
tcggctgacg cggccgcgcc tgctgggcga ggaggagtac ctgaacgact ccttgttgag 17100
gcccgagcgc gagaagaact tccccaataa cgggatagag agcctggtgg acaagatgag 17160
ccgctggaag acgtacgcgc acgagcacag ggacgagccc cgagctagca gcagcgccac 17220
ccgtagacgc cagcggcacg acaggcagcg gggactggtg tgggacgatg aggattccgc 17280
cgacgacagc agcgtgttgg acttgggtgg gagtggtggt aacccgttcg ctcacttgcg 17340
cccccgtatc gggcgcctga tgtaagaatc tgaaaaaata aaaaacggta ctcaccaagg 17400
ccatggcgac cagcgtgcgt tcttctctgt tgtttgtagt agtatgatga ggcgcgtgta 17460
cccggagggt cctcctccct cgtacgagag cgtgatgcag caggcggtgg cggcggcgat 17520
gcagcccccg ctggaggcgc cttacgtgcc cccgcggtac ctggcgccta cggaggggcg 17580
gaacagcatt cgttactcgg agctggcacc cttgtacgat accacccggt tgtacctggt 17640
ggacaacaag tcggcggaca tcgcctcgct gaactaccag aacgaccaca gcaacttcct 17700
gaccaccgtg gtgcagaaca acgatttcac ccccacggag gccagcaccc agaccatcaa 17760
ctttgacgag cgctcgcggt ggggcggcca gctgaaaacc atcatgcaca ccaacatgcc 17820
caacgtgaac gagttcatgt acagcaacaa gttcaaggcg cgggtgatgg tctcgcgcaa 17880
gacccccaac ggggtgacgg taggggatga ttatgatggt agtcaggacg agctgaccta 17940
cgagtgggtg gagtttgagc tgcccgaggg caacttctcg gtgaccatga ccatcgatct 18000
gatgaacaac gccatcatcg acaactactt ggcggtgggg cggcagaacg gggtgctgga 18060
gagcgacatc ggcgtgaagt tcgacacgcg caacttccgg ctgggctggg accccgtgac 18120
cgagctggtg atgccgggcg tgtacaccaa cgaggccttc caccccgaca tcgtcctgct 18180
gcccggctgc ggcgtggact tcaccgagag ccgcctcagc aacctgctgg gcatccgcaa 18240
gcggcagccc ttccaggagg gcttccagat cctgtacgag gacctggagg ggggcaacat 18300
ccccgcgctg ctggacgtgg acgcctatga gaaaagcaag gaggatagcg ccgccgcggc 18360
gaccgcagcc gtggccaccg cctctaccga ggtgcggggc gataatttta ctagcgccgc 18420
agcagtggcc gaggcggctg aaaccgaaag taagatagtg atccagccgg tggagaagga 18480
cagcaaggac aggagctaca acgtgctcgc ggacaagaaa aacaccgcct accgcagctg 18540
gtacctggcc tacaactacg gcgaccccga gaagggcgtg cgctcctgga cgctgctcac 18600
cacctcggac gtcacctgcg gcgtggagca agtctactgg tcgctgcccg acatgatgca 18660
agacccggtc accttccgct ccacgcgtca agttagcaac tacccggtgg tgggcgccga 18720
gctcctgccc gtctactcca agagcttctt caacgagcag gccgtctact cgcagcagct 18780
gcgcgccttc acctcgctca cgcacgtttt caaccgcttc cccgagaacc agatcctcgt 18840
tcgcccgccc gcgcccacca ttaccaccgt cagtgaaaac gttcctgctc tcacagatca 18900
cgggaccctg ccgctgcgca gcagtatccg gggagtccag cgcgtgaccg tcactgacgc 18960
cagacgccgc acctgcccct acgtctacaa ggccctgggc gtagtcgcgc cgcgcgtcct 19020
ctcgagccgc accttctaaa aaatgtccat tctcatctcg cccagtaata acaccggttg 19080
gggcctgcgc gcgcccagca agatgtacgg aggcgctcgc caacgctcca cacaacaccc 19140
cgtgcgcgtg cgcgggcact tccgcgctcc ctggggcgcc ctcaagggcc gcgtgcgctc 19200
gcgcaccacc gtcgacgacg tgatcgacca ggtggtggcc gacgcgcgca actacacgcc 19260
cgccgccgcg cccgtctcca ccgtggacgc cgtcatcgac agcgtggtgg ccgacgcgcg 19320
ccggtacgcc cgcgccaaga gccggcggcg gcgcatcgcc cggcggcacc ggagcacccc 19380
cgccatgcgc gcggcgcgag ccttgctgcg cagggccagg cgcacgggac gcagggccat 19440
gctcagggcg gccagacgcg cggcctccgg cagcagcagc gccggcagaa cccgcagacg 19500
cgcggccacg gcggcggcgg cggccatcgc cagcatgtcc cgcccgcggc gcggcaacgt 19560
gtactgggtg cgcgacgccg ccaccggtgt gcgcgtgccc gtgcgcaccc gcccccctcg 19620
cacttgaaga tgctgacttc gcgatgttga tgtgtcccag cggcgaggag gatgtccaag 19680
cgcaaataca aggaagagat gctccaggtc atcgcgcctg agatctacgg ccccgcggcg 19740
gcggtgaagg aggaaagaaa gccccgcaaa ctgaagcggg tcaaaaagga caaaaaggag 19800
gaggaagatg acggactggt ggagtttgtg cgcgagttcg ccccccggcg gcgcgtgcag 19860
tggcgcgggc ggaaagtgaa accggtgctg cggcccggca ccacggtggt cttcacgccc 19920
ggcgagcgtt ccggctccgc ctccaagcgc tcctacgacg aggtgtacgg ggacgaggac 19980
atcctcgagc aggcggtcga gcgtctgggc gagtttgctt acggcaagcg cagccgcccc 20040
gcgcccttga aagaggaggc ggtgtccatc ccgctggacc acggcaaccc cacgccgagc 20100
ctgaagccgg tgaccctgca gcaggtgcta ccgagcgcgg cgccgcgccg gggcttcaag 20160
cgcgagggcg gcgaggatct gtacccgacc atgcagctga tggtgcccaa gcgccagaag 20220
ctggaggacg tgctggagca catgaaggtg gaccccgagg tgcagcccga ggtcaaggtg 20280
cggcccatca agcaggtggc tccgggcctg ggcgtgcaga ccgtggacat caagatcccc 20340
acggagccca tggaaacgca gaccgagccc gtgaagccca gcaccagcac catggaggtg 20400
cagacggatc cctggatgcc agcggcttcc accaccacca cccgccgaag acgcaagtac 20460
ggcgcgacca gcctgctgat gcccaactac gcgctgcatc cttccatcat ccccacgccg 20520
ggctaccgcg gcacgcgctt ctaccgcggc tacagcagcc gccgcaagac caccacccgc 20580
cgccgccgtc gtcgcacccg ccgcagcagc accgcgactt ccgccgccgc cttggtgcgg 20640
agagtgtacc gcagcgggcg cgagcctctg accctgccgc gcgcgcgcta ccacccgagc 20700
atcgccattt aactctgccg tcgcctcctt gcagatatgg ccctcacatg ccgcctccgc 20760
gtccccatta cgggctaccg aggaagaaag ccgcgccgta gaaggctgac ggggaacggg 20820
ctgcgtcgcc atcaccaccg gcggcggcgc gccatcagca agcggttggg gggaggcttc 20880
ctgcccgcgc tgatccccat catcgccgcg gcgatcgggg cgatccccgg catagcttcc 20940
gtggcggtgc aggcctctca gcgccactga gacacagctt ggaaaatttg taataaaaaa 21000
tggactgacg ctcctggtcc tgtgatgtgt gtttttagat ggaagacatc aatttttcgt 21060
ccctggcacc gcgacacggc acgcggccgt ttatgggcac ctggagcgac atcggcaaca 21120
gccaactgaa cgggggcgcc ttcaattgga gcagtctctg gagcgggctt aagaatttcg 21180
ggtccacgct caaaacctat ggcaacaagg cgtggaacag cagcacaggg caggcgctga 21240
gggaaaagct gaaagagcag aacttccagc agaaggtggt cgatggcctg gcctcgggca 21300
tcaacggggt ggtggacctg gccaaccagg ccgtgcagaa acagatcaac agccgcctgg 21360
acgcggtccc gcccgcgggg tccgtggaga tgccccaggt ggaggaggag ctgcctcccc 21420
tggacaagcg cggcgacaag cgaccgcgtc ccgacgcgga ggagacgctg ctgacgcaca 21480
cggacgagcc gcccccgtac gaggaggcgg tgaaactggg tctgcccacc acgcggcccg 21540
tggcgcctct ggccaccggg gtgctgaaac ccagcagcag cagcagccag cccgcgaccc 21600
tggacttgcc tccgcctgct tcccgcccct ccacagtggc taagcccctg ccgccggtgg 21660
ccgtcgcgtc gcgcgccccc cgaggccgcc cccaggcgaa ctggcagagc actctgaaca 21720
gcatcgtggg tctgggagtg cagagtgtga agcgccgccg ctgctattaa aagacactgt 21780
agcgcttaac ttgcttgtct gtgtgtatat gtatgtccgc cgaccagaag gaggaggaag 21840
aggcgcgtcg ccgagttgca agatggccac cccatcgatg ctgccccagt gggcgtacat 21900
gcacatcgcc ggacaggacg cttcggagta cctgagtccg ggtctggtgc agttcgcccg 21960
cgccacagac acctacttca gtctggggaa caagtttagg aaccccacgg tggcgcccac 22020
gcacgatgtg accaccgacc gcagccagcg gctgacgctg cgcttcgtgc ccgtggaccg 22080
cgaggacaac acctactcgt acaaagtgcg ctacacgctg gccgtgggcg acaaccgcgt 22140
gctggacatg gccagcacct actttgacat ccgcggcgtg ctggaccggg gccccagctt 22200
caaaccctac tccggcaccg cctacaacag tctggctccc aagggagcgc ccaacacctc 22260
acagtggata accaaagaca atggaactga taagacatac agttttggaa atgctccagt 22320
cagaggattg gacattacag aagagggtct ccaaatagga accgatgagt cagggggtga 22380
aagcaagaaa atttttgcag acaaaaccta tcagcctgaa cctcagcttg gagatgagga 22440
atggcatgat actattggag ctgaagacaa gtatggaggc agagcgctta aacctgccac 22500
caacatgaaa ccctgctatg ggtctttcgc caagccaact aatgctaagg gaggtcaggc 22560
taaaagcaga accaaggacg atggcactac tgagcctgat attgacatgg ccttctttga 22620
cgatcgcagt cagcaagcta gtttcagtcc agaacttgtt ttgtatactg agaatgtcga 22680
tctggacacc ccggataccc acattattta caaacctggc actgatgaaa caagttcttc 22740
tttcaacttg ggtcagcagt ccatgcccaa cagacccaac tacattgggt tcagagacaa 22800
ctttatcggt ctcatgtact acaacagcac tggcaatatg ggtgtgctgg ctggacaggc 22860
ctcccagctg aatgctgtgg tggacttgca ggacagaaac actgaactgt cctaccagct 22920
cttgcttgac tctctgggtg acagaactag gtatttcagt atgtggaatc aggcggtgga 22980
cagctacgac cccgatgtgc gcattattga aaatcacggt gtggaggatg aactccccaa 23040
ctattgcttc cctttgaatg gtgtgggctt tacagataca ttccagggaa ttaaggttaa 23100
aactaccaat aacggaacag caaatgctac agagtgggaa tctgatacct ctgtcaataa 23160
tgctaatgag attgccaagg gcaatccttt cgccatggag atcaacatcc aggccaacct 23220
gtggcggaac ttcctctacg cgaacgtggc gctgtacctg cccgactcct acaagtacac 23280
gccggccaac atcacgctgc ccaccaacac caacacctac gattacatga acggccgcgt 23340
ggtggcgccc tcgctggtgg acgcctacat caacatcggg gcgcgctggt cgctggaccc 23400
catggacaac gtcaacccct tcaaccacca ccgcaacgcg ggcctgcgct accgctccat 23460
gctcctgggc aacgggcgct acgtgccctt ccacatccag gtgccccaaa agtttttcgc 23520
catcaagagc ctcctgctcc tgcccgggtc ctacacctac gagtggaact tccgcaagga 23580
cgtcaacatg atcctgcaga gctccctcgg caacgacctg cgcacggacg gggcctccat 23640
cgccttcacc agcatcaacc tctacgccac cttcttcccc atggcgcaca acaccgcctc 23700
cacgctcgag gccatgctgc gcaacgacac caacgaccag tccttcaacg actacctctc 23760
ggcggccaac atgctctacc ccatcccggc caacgccacc aacgtgccca tctccatccc 23820
ctcgcgcaac tgggccgcct tccgcggatg gtccttcacg cgcctcaaga cccgcgagac 23880
gccctcgctc ggctccgggt tcgaccccta cttcgtctac tcgggctcca tcccctacct 23940
tgacggcacc ttctacctca accacacctt caagaaggtc tccatcacct tcgactcctc 24000
cgtcagctgg cccggcaacg accgcctcct gacgcccaac gagttcgaaa tcaagcgcac 24060
cgtcgacgga gaggggtaca acgtggccca gtgcaacatg accaaggact ggttcctggt 24120
ccagatgctg gcccactaca acatcggcta ccagggcttc tacgtgcccg agggctacaa 24180
ggaccgcatg tactccttct tccgcaactt ccagcccatg agccgccagg tcgtggacga 24240
ggtcaactac aaggactacc aggccgtcac cctggcctac cagcacaaca actcgggctt 24300
cgtcggctac ctcgcgccca ccatgcgcca gggccagccc taccccgcca actaccccta 24360
cccgctcatc ggcaagagcg ccgtcgccag cgtcacccag aaaaagttcc tctgcgaccg 24420
ggtcatgtgg cgcatcccct tctccagcaa cttcatgtcc atgggcgcgc tcaccgacct 24480
cggccagaac atgctctacg ccaactccgc ccacgcgcta gacatgaatt tcgaagtcga 24540
ccccatggat gagtccaccc ttctctatgt tgtcttcgaa gtcttcgacg tcgtccgagt 24600
gcaccagccc caccgcggcg tcatcgaggc cgtctacctg cgcacgccct tctcggccgg 24660
caacgccacc acctaagcct cttgcttctt gcaagatatg gcctgtgcgg gctccggcga 24720
gcaggagctc agggccatcc tccgcgacct gggctgcggg ccctgcttcc tgggcacctt 24780
cgacaagcgc ttcccgggat tcatggcccc gcacaagctg gcctgcgcca ttgtcaacac 24840
ggccggccgc gagaccgggg gcgagcactg gctggccttc gcctggaacc cgcgctccca 24900
cacctgctac ctcttcgacc cctttgggtt ctcggacgag cgcctcaagc agatctacca 24960
gttcgagtac gagggcctgc tgcgtcgcag cgccctggcc accgaggacc gctgcgtcac 25020
cctggaaaag tccacccaga ccgtgcaggg tccgcgctcg gccgcctgcg ggctcttctg 25080
ctgcatgttc ctgcacgcct tcgtgcactg gcccgaccgc cccatggaca agaaccccac 25140
catgaacttg ctgacggggg tgcccaacgg catgctccag tcgccccagg tggaacccac 25200
cctgcgccgc aaccaggagg cgctctaccg cttcctcaac gcccactccg cctactttcg 25260
atcccaccgc gcgcgcatcg agaaggccac cgccttcgac cgcatgaatc aagacatgta 25320
aaccgtgtgt gtatgtgaat gctttattca taataaacag cacatgttta tgccaccttc 25380
tctgaggctc tgactttatt tagaaatcga aggggttctg ccggctctcg gcgtgccccg 25440
cgggcaggga tacgttgcgg aactggtact tgggcagcca cttgaactcg gggatcagca 25500
gcttgggcac ggggaggtcg gggaacgagt cgctccacag cttgcgcgtg agttgcaggg 25560
cgcccagcag gtcgggcgcg gagatcttga aatcgcagtt gggacccgcg ttctgcgcgc 25620
gagagttgcg gtacacgggg ttgcagcact ggaacaccat cagggccggg tgcttcacgc 25680
tcgccagcac cgtcgcgtcg gtgatgccct ccacgtccag atcctcggcg ttggccatcc 25740
cgaagggggt catcttgcag gtctgccgcc ccatgctggg cacgcagccg ggcttgtggt 25800
tgcaatcgca gtgcaggggg atcagcatca tctgggcctg ctcggagctc atgcccgggt 25860
acatggcctt catgaaagcc tccagctggc ggaaggcctg ctgcgccttg ccgccctcgg 25920
tgaagaagac cccgcaggac ttgctagaga actggttggt ggcgcagccg gcgtcgtgca 25980
cgcagcagcg cgcgtcgttg ttggccagct gcaccacgct gcgcccccag cggttctggg 26040
tgatcttggc ccggtcgggg ttctccttca gcgcgcgctg cccgttctcg ctcgccacat 26100
ccatctcgat cgtgtgctcc ttctggatca tcacggtccc gtgcaggcac cgcagcttgc 26160
cctcggcctc ggtgcagccg tgcagccaca gcgcgcagcc ggtgctctcc cagttcttgt 26220
gggcgatctg ggagtgcgag tgcacgaagc cctgcaggaa gcggcccatc atcgcggtca 26280
gggtcttgtt gctggtgaag gtcagcggga tgccgcggtg ctcctcgttc acatacaggt 26340
ggcagatgcg gcggtacacc tcgccctgct cgggcatcag ctggaaggcg gacttcaggt 26400
cgctctccac gcggtaccgg tccatcagca gcgtcatcac ttccatgccc ttctcccagg 26460
ccgaaacgat cggcaggctc agggggttct tcaccgccat tgtcatctta gtcgccgccg 26520
ccgaagtcag ggggtcgttc tcgtccaggg tctcaaacac tcgcttgccg tccttctcgg 26580
tgatgcgcac gggggggaag gcgaagccca cggccgccag ctcctcctcg gcctgccttt 26640
cgtcctcgct gtcctggctg atgtcttgca aaggcacatg cttggtcttg cggggtttct 26700
ttttgggcgg cagaggcggc ggcggagacg tgctgggcga gcgcgagttc tcgctcacca 26760
cgactatttc ttctccttgg ccgtcgtccg agaccacgcg gcggtaggca tgcctcttct 26820
ggggcagagg cggaggcgac gggctctcgc ggttcggcgg gcggctggca gagccccttc 26880
cgcgttcggg ggtgcgctcc tggcggcgct gctctgactg acttcctccg cggccggcca 26940
ttgtgttctc ctagggagca agcatggaga ctcagccatc gtcgccaaca tcgccatctg 27000
cccccgccgc cgccgacgag aaccagcaga atgaaagctt aaccgccccg ccgcccagcc 27060
ccacctccga cgcggcccca gacatgcaag agatggagga atccatcgag attgacctgg 27120
gctacgtgac gcccgcggag cacgaggagg agctggcagc gcgcttttca gccccggaag 27180
agaaccacca agagcagcca gagcaggaag cagagagcga gcagcagcag gctgggctcg 27240
agcatggcga ctacctgagc ggggcagagg acgtgctcat caagcatctg gcccgccaat 27300
gcatcatcgt caaggacgcg ctgctcgacc gcgccgaggt gcccctcagc gtggcggagc 27360
tcagccgcgc ctacgagcgc aacctcttct cgccgcgcgt gccccccaag cgccagccca 27420
acggcacctg cgagcccaac ccgcgcctca acttctaccc ggtcttcgcg gtgcccgagg 27480
ccctggccac ctaccacctc tttttcaaga accaaaggat ccccgtctcc tgccgcgcca 27540
accgcacccg cgccgacgcc ctgctcaacc tgggccccgg cgcccgccta cctgatatcg 27600
cctccttgga agaggttccc aagatcttcg agggtctggg cagcgacgag actcgggccg 27660
cgaacgctct gcaaggaagc ggagaggagc atgagcacca cagcgccctg gtggagttgg 27720
aaggcgacaa cgcgcgcctg gcggtgctca agcgcacggt cgagctgacc cacttcgcct 27780
acccggcgct caacctgccc cccaaggtca tgagcgccgt catggaccag gtgctcatca 27840
agcgcgcctc gcccctctcg gaggaggaga tgcaggaccc cgagagctcg gacgagggca 27900
agcccgtggt cagcgacgag cagctggcgc gctggctggg agcgagtagc accccccaga 27960
gcctggaaga gcggcgcaag ctcatgatgg ccgtggtcct ggtgaccgtg gagctggagt 28020
gtctgcgccg cttcttcgcc gacgcggaga ccctgcgcaa ggtcgaggag aacctgcact 28080
acctcttcag gcacgggttc gtgcgccagg cctgcaagat ctccaacgtg gagctgacca 28140
acctggtctc ctacatgggc atcctgcacg agaaccgcct ggggcagaac gtgctgcaca 28200
ccaccctgcg cggggaggcc cgccgcgact acatccgcga ctgcgtctac ctgtacctct 28260
gccacacctg gcagacgggc atgggcgtgt ggcagcagtg cctggaggag cagaacctga 28320
aagagctctg caagctcctg cagaagaacc tcaaggccct gtggaccggg ttcgacgagc 28380
gcaccaccgc ctcggacctg gccgacctca tcttccccga gcgcctgcgg ctgacgctgc 28440
gcaacgggct gcccgacttt atgagccaaa gcatgttgca aaactttcgc tctttcatcc 28500
tcgaacgctc cgggatcctg cccgccacct gctccgcgct gccctcggac ttcgtgccgc 28560
tgaccttccg cgagtgcccc ccgccgctct ggagccactg ctacctgctg cgcctggcca 28620
actacctggc ctaccactcg gacgtgatcg aggacgtcag cggcgagggc ctgctcgagt 28680
gccactgccg ctgcaacctc tgcacgccgc accgctccct ggcctgcaac ccccagctgc 28740
tgagcgagac ccagatcatc ggcaccttcg agttgcaagg ccccggcgac agcgagggca 28800
aggggggtct caaactcacc ccggggctgt ggacctcggc ctacttgcgc aagttcgtgc 28860
ccgaggacta ccatcccttc gagatcaggt tctacgagga ccaatcccag ccgcccaagg 28920
ccaagctgtc ggcctgcgtc atcacccagg gggccatcct ggcccaattg caagccatcc 28980
agaaatcccg ccaagaattt ctgctgaaaa agggccacgg ggtctacttg gacccccaga 29040
ccggagagga gctcaacccc agcttccccc aggatgcccc gaggaagcag caagaagctg 29100
aaagtggagc tgccgccgcc ggaggatttg gaggaagact gggagagcag tcaggcagag 29160
gagatggaag actgggacag cactcaggca gaggaggaca gcctgcaaga cagtctggag 29220
gaggaagacg aggtggagga ggaggcagag gaagaagcag ccgccgccag accgtcgtcc 29280
tcggcggagg agaaagcaag cagcacggat accatctccg ctccgggtcg gggtcgcggc 29340
ggccgggccc acagtaggtg ggacgagacc gggcgcttcc cgaaccccac cacccagacc 29400
ggtaagaagg agcggcaggg atacaagtcc tggcgggggc acaaaaacgc catcgtctcc 29460
tgcttgcaag cctgcggggg caacatctcc ttcacccggc gctacctgct cttccaccgc 29520
ggggtgaact tcccccgcaa catcttgcat tactaccgtc acctccacag cccctactac 29580
tgtttccaag aagaggcaga aacccagcag cagcagcaga aaaccagcga cagctagaaa 29640
atccacagcg gcggcggcag gtggactgag gatcgcggcg aacgagccag cgcagacccg 29700
ggagctgagg aaccggatct ttcccaccct ctatgccatc ttccagcaga gtcgggggca 29760
ggagcaggaa ctgaaagtca agaaccgttc tctgcgctcg ctcacccgca gttgtctgta 29820
tcacaagagc gaagaccaac ttcagcgcac tctcgaggac gccgaggctc tcttcaacaa 29880
gtactgcgcg ctcactctta aagagtagcc cgcgcccgcc cacacacgga aaaaggcggg 29940
aattacgtca ccacctgcgc ccttcgcccg accatcatga gcaaagagat tcccacgcct 30000
tacatgtgga gctaccagcc ccagatgggc ctggccgccg gcgccgccca ggactactcc 30060
acccgcatga actggctcag tgccgggccc gcgatgatct cacgggtgaa tgacatccgc 30120
gcccaccgaa accagatact cctagaacag tcagcgatca ccaccacgcc ccgccatcac 30180
cttaatccgc gtaattggcc cgccgccctg gtgtaccagg aaattcccca gcccacgacc 30240
gtactacttc cgcgagacgc ccaggccgaa gtccagctga ctaactcagg tgtccagctg 30300
gccggcggcg ccgccctgtg tcgtcaccgc cccgctcagg gtataaagcg gctggtgatc 30360
cgaggcagag gcacacagct caacgacgag gtggtgagct cttcgctggg tctgcgacct 30420
gacggagtct tccaactcgc cggatcgggg agatcttcct tcacgcctcg tcaggccgtc 30480
ctgactttgg agagttcgtc ctcgcagccc cgctcgggcg gcatcggcac tctccagttc 30540
gtggaggagt tcactccctc ggtctacttc aaccccttct ccggctcccc cggccactac 30600
ccggacgagt tcatcccgaa cttcgacgcc atcagcgagt cggtggacgg ctacgattga 30660
atgtcccatg gtggcgcagc tgacctagct cggcttcgac acctggacca ctgccgccgc 30720
ttccgctgct tcgctcggga tctcgccgag tttgcctact ttgagctgcc cgaggagcac 30780
cctcagggcc cggcccacgg agtgcggatc gtcgtcgaag ggggcctcga ctcccacctg 30840
cttcggatct tcagccagcg accgatcctg gtcgagcgcg agcaaggaca gacccgtctg 30900
accctgtact gcatctgcaa ccaccccggc ctgcatgaaa gtctttgttg tctgctgtgt 30960
actgagtata ataaaagctg agatcagcga ctactccgga cttccgtgtg ttcctgaatc 31020
catcaaccag tctttgttct tcaccgggaa cgagaccgag ctccagctcc agtgtaagcc 31080
ccacaagaag tacctcacct ggctgttcca gggctctccg atcgccgttg tcaaccactg 31140
cgacaacgac ggagtcctgc tgagcggccc tgccaacctt actttttcca cccgcagaag 31200
caagctccag ctcttccaac ccttcctccc cgggacctat cagtgcgtct cgggaccctg 31260
ccatcacacc ttccacctga tcccgaatac cacagcggcg ctccccgcta ctaacaacca 31320
aactacccac caacgacacc gtcgcgacct ttcctctggg tctaatacca ctaccggagg 31380
tgagctccga ggtcaaccaa cctctgggat ttactacggc ccctgggagg tggtagggtt 31440
aatagcgcta ggcctagttg cgggtgggct tttggctctc tgctacctat acctcccttg 31500
ctgttcgtac ttagtggtgc tgtgttgctg gtttaagaaa tggggaagat caccctagtg 31560
agctgcggtg cgctggtggc ggtggtgctt tcgattgtgg gactgggcag cgcggctgta 31620
gtgaaggaga aggccgatcc ctgcttgcat ttcaatcccg acaaatgcca gctgagtttt 31680
cagcccgatg gcaatcggtg cgcggtgctg atcaagtgcg gatgggaatg cgagaacgtg 31740
agaatcgagt acaataacaa gactcggaac aatactctcg cgtccgtgtg gcagcccggg 31800
gaccccgagt ggtacaccgt ctctgtcccc ggtgctgacg gctccccgcg caccgtgaat 31860
aatactttca tttttgcgca catgtgcgac acggtcatgt ggatgagcaa gcagtacgat 31920
atgtggcccc ccacgaagga gaacatcgtg gtcttctcca tcgcttacag cgtgtgcacg 31980
gtgctaatca ccgctatcgt gtgcctgagc attcacatgc tcatcgctat tcgccccaga 32040
aataatgccg aaaaagagaa acagccataa cacgtttttt cacacacctt tttcagacca 32100
tggcctctgt tactgcccta tttatttttt tgggccttgt gggcactagc agcacttttg 32160
atcataaaaa cctaactgtt tttgttggtt ctgatgttac actacctggg catcaatcgc 32220
accagagggt ttcatggtat cattttaata aacagaacac agcttataca ctttgcaaag 32280
gttatcagca agccacatat cgcagtggtc tttattacag atgcaataac aataacctca 32340
cactactctc agttaatgca aattattctg gcacatacta tggaaccaat tttaacgcaa 32400
aacaggacac ttactatagt gtcaaagtat tgaatccaac ctctcctaga actaccacta 32460
agcctaccac caccactact actgcgaaac ccactacacc taaaactacc aagaaaacca 32520
ctgtgaaaac tacaacaact aggaccacca caactacaga ggctaccacc agcacaacac 32580
ttgctaccac tacacacaca cacactgagc taaccttaca gaccactaat gatttgatcg 32640
ccctgttgca aaagggggat aacagcacca cttccaatga ggagataccc aaatccatga 32700
ttggcattat tgttgctgta gtggtgtgca tgttgatcat cgccttgtgc atggtgtact 32760
atgccttctg ctacagaaag cacagactga acgacaagct ggaacactta ctaagtgttg 32820
aattttaatt ttttagaacc atgaagatcc taggcctttt agttttttct atcattacct 32880
ctgctctatg caattctgac aatgaggacg ttactgtcgt tgtcggatca aattatacac 32940
taaaaggtcc agcaaaaggt atgctttcgt ggtattgttg gttcggaact gacgagcaac 33000
agacagaact ttgcaatgct caaaaaggca aaacctcaaa ttctaaaatc tctaattatc 33060
aatgcaatgg cactgactta gtattgctca atgtcacgaa agcatatgct ggcagttaca 33120
cctgccctgg agatgatgcc gacaatatga ttttttacaa agtggaagtg gttgatccca 33180
ctactccacc gcccaccacc acaactactc ataccacaca cacagaacaa acaccagagg 33240
cagcagaagc agagttggcc ttccaggttc acggagattc ctttgctgtc aataccccta 33300
cacccgatca gcggtgtccg gggctgctcg tcagcggcat tgtcggtgtg ctttcgggat 33360
tagcagttat aatcatctgc atgttcattt ttgcttgctg ctatagaagg ctttaccgac 33420
aaaaatcaga cccactgctg aacctctatg tttaattttt tccagagcca tgaaggcagt 33480
tagcactcta gttttttgtt ctttgattgg cattgttttt tgcaatccta ttcctagagt 33540
tagctttatt aaagatgtga atgttactga ggggggcaat gtgacactgg taggtgtaga 33600
gggtgctgaa aacaccacct ggacaaaata ccacctcaat gggtggaaag atatttgcaa 33660
ttggagtgta ttagtttata catgtgaggg agttaatctt accattgtca atgccacctc 33720
agctcaaaat ggtagaattc aaggacaaag tgtcagtgta tctaatgggt attttaccca 33780
acatactttt atctatgacg ttaaagtcat accactgcct acgcctagcc cacctagcac 33840
taccacacag acaaccacat acagtacatc aaatcagcct accaccacta cagcagcaga 33900
ggttgccagc tcgtctgggg tccgagtggc atttttgatg ttggccccat ctagcagtcc 33960
cactgctagt accaatgagc agactactga atttttgtcc actgtcgaga gccacaccac 34020
agctacctcg agtgccttct ctagcaccgc caatctctcc tcgctttcct ctacaccaat 34080
cagtcccgct actactccta gccccgctcc tcttcccact cccctgaagc aaactgagga 34140
cagcggcatg caatggcaga tcaccctgct cattgtgatc gggttggtca tcctggccgt 34200
gttgctctac tacatcttct gccgccgcat tcccaacgcg caccgcaagc cggcctacaa 34260
gcccatcgtt atcgggcagc cggagccgct tcaggtggaa gggggtctaa ggaatcttct 34320
cttctctttt acagtatggt gattgaacta tgattcctag acaattcttg atcactattc 34380
ttatctgcct cctccaagtc tgtgccaccc tcgctctggt ggccaacgcc agtccagact 34440
gtattgggcc cttcgcctcc tacgtgctct ttgccttcat cacctgcatc tgctgctgta 34500
gcatagtctg cctgcttatc accttcttcc agttcattga ctggatcttt gtgcgcatcg 34560
cctacctgcg ccaccacccc cagtaccgcg accagcgagt ggcgcggctg ctcaggctcc 34620
tctgataagc atgcgggctc tgctacttct cgcgcttctg ctgttagtgc tcccccgtcc 34680
cgtcgacccc cggtccccca ctcagtcccc cgaggaggtc cgcaaatgca aattccaaga 34740
accctggaaa ttcctcaaat gctaccgcca aaaatcagac atgcatccca gctggatcat 34800
gatcattggg atcgtgaaca ttctggcctg caccctcatc tcctttgtga tttacccctg 34860
ctttgacttt ggttggaact cgccagaggc gctctatctc ccgcctgaac ctgacacacc 34920
accacagcag caacctcagg cacacgcact accaccacca cagcctaggc cacaatacat 34980
gcccatatta gactatgagg ccgagccaca gcgacccatg ctccccgcta ttagttactt 35040
caatctaacc ggcggagatg actgacccac tggccaacaa caacgtcaac gaccttctcc 35100
tggacatgga cggccgcgcc tcggagcagc gactcgccca acttcgcatt cgccagcagc 35160
aggagagagc cgtcaaggag ctgcaggacg gcatagccat ccaccagtgc aagaaaggca 35220
tcttctgcct ggtgaaacag gccaagatct cctacgaggt cacccagacc gaccatcgcc 35280
tctcctacga gctcctgcag cagcgccaga agttcacctg cctggtcgga gtcaacccca 35340
tcgtcatcac ccagcagtcg ggcgatacca aggggtgcat ccactgctcc tgcgactccc 35400
ccgactgcgt ccacactctg atcaagaccc tctgcggcct ccgcgacctc ctccccatga 35460
actaatcacc cccttatcca gtgaaataaa gatcatattg atgatgattt aaataaaaaa 35520
aaaaaaaaaa taatcatttg atttgaaata aagatacaat catattgatg atttgagttt 35580
taaaaaaata aagaatcact tacttgaaat ctgataccag gtctctgtcc atgttttctg 35640
ccaacaccac ttcactcccc tcttcccagc tctggtactg caggccccgg cgggctgcaa 35700
acttcctcca cacgctgaag gggatgtcaa attcctcctg tccctcaatc ttcattttat 35760
cttctatcag atgtccaaaa agcgcgtccg ggtggatgat gacttcgacc ccgtctaccc 35820
ctacgatgca gacaacgcac cgaccgtgcc cttcatcaac ccccccttcg tctcttcaga 35880
tggattccaa gagaagcccc tgggggtgct gtccctgcga ctggccgacc ccgtcaccac 35940
caagaacggg gaaatcaccc tcaagctggg agagggggtg gacctcgact cctcgggaaa 36000
actcatctcc aacacggcca ccaaggccgc cgcccctctc agtttttcca acaaatttcc 36060
cttaacatgg ataccccttt ttacaccaaa gatggaaaat taaccatgca ggtcactgca 36120
ccgctaaagt tagcaaacac agccatattg aacacactag ccatggcata tggaaatgga 36180
ttagggctaa gcaacaacgc tcttaccgtt cagttacaat ctccactcac ctttaacaac 36240
agcaaggttg ctatcaacct ggaaaatgga ccactaaacg tgacatcaaa tagacttagc 36300
attaattgca agaggggtgt ctatgtcacc accacaggag atgcaatcga aaccaacata 36360
agttggccaa atgctattaa atttatagga aatgcaatgg gtgtcaatat tgatacaaac 36420
aaaggcttgc aatttggcac caccagcact gtcacagatg tgaccgatgc tttccccata 36480
caagtcaaac ttggggctgg tcttgcattt gatagcactg gagctattgt tgcatggaac 36540
aaagaggatg acagtctcac tttgtggact acaccagatc catctccaaa ttgcaagata 36600
gcatctgaca aagatgctaa actcacactt tgcttgacaa agtgtggaag tcaaattctg 36660
ggtactgtga ctgtattggc agtgaataat ggaagtctca acccaatcac aaacacagta 36720
agcactgccc ttgtatcact taaattcgac gccaatggag cactcttgga aaaatcaacc 36780
ctaaacagag aatattggaa ctacagacaa ggagatctca ttccaggtac accatatacc 36840
catgcagtag gtttcatgcc caacaagaaa gcctacccta aaaacacaac tgcagcttcc 36900
aaaagccaca ttgtggggga cgtctatcta gacggggatg tagataagcc cctatctctc 36960
ataatcactt ttaatgaaac tgatgatgaa tcatgtgact attgcatgaa ctttcaatgg 37020
aaatggggtg ctgatcaata caaggacaaa acactcgcta ccagctcctt caccttctcc 37080
tacatcgccc aagaatgaac actgtatccc accctgcatg ccaacccttc ccaccccact 37140
ctgtctgtgg aaaaaactct gaaacacaaa ataaaataaa gttcaagtgt tttattgatt 37200
caacagtttt acaggattcg agcagttatt tttcctccac cctcccagga catggaatac 37260
accaccctct ccccccgcac agccttgaac atctgaatgc cattggtgat ggacatgctt 37320
ttggtctcca cgttccacac agtttcagag cgagccagtc tcgggtcggt cagggagatg 37380
aaaccctccg ggcactcccg catctgcacc tcacagctca acagctgagg attgtcctcg 37440
gtggtcggga tcacggttat ctggaagaag cagaagagcg gcggtgggaa tcatagtccg 37500
cgaacgggat cggccggtgg tgccgcatca ggccccgcag cagtcgctgc cgccgccgct 37560
ccgtcaagct gctgctcagg gggtccgggt ccagggactc cctcagcatg atgcccacgg 37620
ccctcagcat cagtcgtctg gtgcggcggg cgcagcagcg catgcggatc tcgctcaggt 37680
cgctgcagta cgtgcaacac aggaccacca ggttgttcaa cagtccatag ttcaacacgc 37740
tccagccgaa actcatcgcg ggaaggatgc tacccacgtg gccgtcgtac cagatcctca 37800
ggtaaatcaa gtggcgcccc ctccagaaca cgctgcccac gtacatgatc tccttgggca 37860
tgtggcggtt caccacctcc cggtaccaca tcaccctttg gttgaacatg cagccccgga 37920
tgatcctgcg gaaccacagg gccagcaccg ccccgcccgc catgcagcga agagaccccg 37980
ggtcccgaca atggcaatgg aggacccacc gctcgtaccc gtggatcatc tgggagctga 38040
acaagtctat gttggcacag cacaggcaca cgctcatgca tctcttcagc actctcagct 38100
cctcgggggt caaaaccata tcccagggca cggggaactc ttgcaggaca gcgaaccccg 38160
cagaacaggg caatcctcgc acataactta cattgtgcat ggacagggta tcgcaatcag 38220
gcagcaccgg gtgatcctcc accagagaag cgcgggtctc ggtctcctca cagcgtggta 38280
agggggccgg ccgatacggg tgatggcggg acgcggctga tcgtgttcgc gaccgtgtca 38340
tgatgcagtt gctttcggac attttcgtac ttgctgtagc agaacctggt ccgggcgctg 38400
cacaccgatc gccggcggcg gtctcggcgc ttggaacgct cggtgttgaa attgtaaaac 38460
agccactctc tcagaccgtg cagcagatct agggcctcag gagtgatgaa gatcccatca 38520
tgcctgatgg ctctgatcac atcgaccacc gtggaatggg ccagacccag ccagatgatg 38580
caattttgtt gggtttcggt gacggcgggg gagggaagaa caggaagaac catgattaac 38640
ttttaatcca aacggtctcg gagtacttca aaatgaagat cgcggagatg gcacctctcg 38700
cccccgctgt gttggtggaa aataacagcc aggtcaaagg tgatacggtt ctcgagatgt 38760
tccacggtgg cttccagcaa agcctccacg cgcacatcca gaaacaagac aatagcgaaa 38820
gcgggagggt tctctaattc ctcaatcatc atgttacact cctgcaccat ccccagataa 38880
ttttcatttt tccagccttg aatgattcga actagttcct gaggtaaatc caagccagtc 38940
atgataaaga gctcgcgcag agcgccctcc accggcattc ttaagcacac cctcataatt 39000
ccaagatatt ctgctcctgg ttcacctgca gcagattgac aagcggaata tcaaaatctc 39060
tgccgcgatc cctgagctcc tccctcagca ataactgtaa gtactctttc atatcctctc 39120
cgaaattttt agccatagga ccaccaggaa taagattagg gcaagccaca gtacagataa 39180
accgaagtcc tccccagtga gcattgccaa atgcaagact gctataagca tgctggctag 39240
acccggtgat atcttccaga taactggaca gaaaatcacc caggcaattt ttaagaaaat 39300
caacaaaaga aaaatcctcc aggtgcacgt ttagggcctc gggaacaacg atggagtaaa 39360
cgcaagcggt gcgttccagc atggttagtt agctgatctg taaaaaaaca aaaaataaaa 39420
cattaaacca tgctagcctg gcgaacaggt gggtaaatcg ttctctccag caccaggcag 39480
gccacggggt ctccggcgcg accctcgtaa aaattgtcgc tatgattgaa aaccatcaca 39540
gagagacgtt cccggtggcc ggcgtgaatg attcgacaag atgaatacac ccccggaaca 39600
ttggcgtccg cgagtgaaaa aaagcgcccg aggaagcaat aaggcactac aatgctcagt 39660
ctcaagtcca gcaaagcgat gccatgcgga tgaagcacaa aattctcagg tgcgtacaaa 39720
atgtaattac tcccctcctg cacaggcagc aaagcccccg atccctccag gtacacatac 39780
aaagcctcag cgtccatagc ttaccgagca gcagcacaca acaggcgcaa gagtcagaga 39840
aaggctgagc tctaacctgt ccacccgctc tctgctcaat atatagccca gatctacact 39900
gacgtaaagg ccaaagtcta aaaatacccg ccaaataatc acacacgccc aacacacgcc 39960
cagaaaccgg tgacacactc agaaaaatac gcgcacttcc tcaaacgccc aaactgccgt 40020
catttccggg ttcccacgct acgtcatcag aattcgactt tcaaattccg tcgaccgtta 40080
aaaacgtcac ccgccccgcc cctaacggtc gcccgtctct cggccaatca cagccccgca 40140
tccccaaatt caaacacctc atttgcatat taacgcgcac caaaagtttg aggtatatta 40200
ttgatgatgt taattaattg gttc 40224
<210> 3
<211> 6451
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccacggtgg cttccagcaa agcctccacg cgcacatcca gaaacaagac aatagcgaaa 60
gcgggagggt tctctaattc ctcaatcatc atgttacact cctgcaccat ccccagataa 120
ttttcatttt tccagccttg aatgattcga actagttcct gaggtaaatc caagccagtc 180
atgataaaga gctcgcgcag agcgccctcc accggcattc ttaagcacac cctcataatt 240
ccaagatatt ctgctcctgg ttcacctgca gcagattgac aagcggaata tcaaaatctc 300
tgccgcgatc cctgagctcc tccctcagca ataactgtaa gtactctttc atatcctctc 360
cgaaattttt agccatagga ccaccaggaa taagattagg gcaagccaca gtacagataa 420
accgaagtcc tccccagtga gcattgccaa atgcaagact gctataagca tgctggctag 480
acccggtgat atcttccaga taactggaca gaaaatcacc caggcaattt ttaagaaaat 540
caacaaaaga aaaatcctcc aggtgcacgt ttagggcctc gggaacaacg atggagtaaa 600
cgcaagcggt gcgttccagc atggttagtt agctgatctg taaaaaaaca aaaaataaaa 660
cattaaacca tgctagcctg gcgaacaggt gggtaaatcg ttctctccag caccaggcag 720
gccacggggt ctccggcgcg accctcgtaa aaattgtcgc tatgattgaa aaccatcaca 780
gagagacgtt cccggtggcc ggcgtgaatg attcgacaag atgaatacac ccccggaaca 840
ttggcgtccg cgagtgaaaa aaagcgcccg aggaagcaat aaggcactac aatgctcagt 900
ctcaagtcca gcaaagcgat gccatgcgga tgaagcacaa aattctcagg tgcgtacaaa 960
atgtaattac tcccctcctg cacaggcagc aaagcccccg atccctccag gtacacatac 1020
aaagcctcag cgtccatagc ttaccgagca gcagcacaca acaggcgcaa gagtcagaga 1080
aaggctgagc tctaacctgt ccacccgctc tctgctcaat atatagccca gatctacact 1140
gacgtaaagg ccaaagtcta aaaatacccg ccaaataatc acacacgccc aacacacgcc 1200
cagaaaccgg tgacacactc agaaaaatac gcgcacttcc tcaaacgccc aaactgccgt 1260
catttccggg ttcccacgct acgtcatcag aattcgactt tcaaattccg tcgaccgtta 1320
aaaacgtcac ccgccccgcc cctaacggtc gcccgtctct cggccaatca cagccccgca 1380
tccccaaatt caaacacctc atttgcatat taacgcgcac caaaagtttg aggtatatta 1440
ttgatgatgt taattaattg gttccactga gcgtcagacc ccttaataag atgatcttct 1500
tgagatcgtt ttggtctgcg cgtaatctct tgctctgaaa acgaaaaaac cgccttgcag 1560
ggcggttttt cgaaggttct ctgagctacc aactctttga accgaggtaa ctggcttgga 1620
ggagcgcagt caccaaaact tgtcctttca gtttagcctt aaccggcgca tgacttcaag 1680
actaactcct ctaaatcaat taccagtggc tgctgccagt ggtgcttttg catgtctttc 1740
cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcggact gaacgggggg 1800
ttcgtgcata cagtccagct tggagcgaac tgcctacccg gaactgagtg tcaggcgtgg 1860
aatgagacaa acgcggccat aacagcggaa tgacaccggt aaaccgaaag gcaggaacag 1920
gagagcgcac gagggagccg ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1980
ttcgccacca ctgatttgag cgtcagattt cgtgatgctt gtcagggggg cggagcctat 2040
ggaaaaacgg ctttgccgcg gccctctcac ttccctgtta agtatcttcc tggcatcttc 2100
caggaaatct ccgccccgtt cgtaagccat ttccgctcgc cgcagtcgaa cgaccgagcg 2160
tagcgagtca gtgagcgagg aagcggaata tatcctgtat cacatattct gctgacgcac 2220
cggtgcagcc ttttttctcc tgccacatga agcacttcac tgacaccctc atcagtgcca 2280
acatagtaag ccagtataca ctccgctagc gctgaggtct gcctcgtgaa gaaggtgttg 2340
ctgactcata ccaggcctga atcgccccat catccagcca gaaagtgagg gagccacggt 2400
tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt gaacttttgc tttgccacgg 2460
aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt caactcagca aaagttcgat 2520
ttattcaaca aagccacgtt gtgtctcaaa atctctgatg ttacattgca caagataaaa 2580
atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca aggggtgtta 2640
tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg 2700
ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct 2760
atcgattgta tgggaagccc gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg 2820
ttgccaatga tgttacagat gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc 2880
ttccgaccat caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga 2940
tccccgggaa aacagcattc caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg 3000
ctgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt 3060
ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg 3120
ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag 3180
aaatgcataa gcttttgcca ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac 3240
ttgataacct tatttttgac gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg 3300
gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc 3360
cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat 3420
tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt tctaatcaga attggttaat tggttgtaac 3480
actggcagag cattacgctg acttgacggg acggcttagg gttaggcgtt ttgcgctgct 3540
tcgcgatgta cgggccagat atacgcaatg tagtcttatg caatactctt gtagtcttgc 3600
aacatggtaa cgatgagtta gcaacatgcc ttacaaggag agaaaaagca ccgtgcatgc 3660
cgattggtgg aagtaaggtg gtacgatcgt gccttattag gaaggcaaca gacgggtctg 3720
acatggattg gacgaaccac tgaattgccg cattgcagag atattgtatt taagtgccta 3780
gctcgataca taaacctctg gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt 3840
aatacgactc actataggga gacccagcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca 3900
ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg 3960
tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca 4020
ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc 4080
agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc 4140
ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc 4200
gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg 4260
acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca 4320
acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc 4380
acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg 4440
gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca 4500
aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga 4560
tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaagcggccg ctcgagtcta gagggcccgt 4620
ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 4680
ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 4740
tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 4800
gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg 4860
ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agggggtatc cccacgcgcc 4920
ctgtagcggc gcattaatag ggataacagg gtaatataca aacgaggccc tttcgtcttt 4980
aattaacatc atcaataata tacctcaaac ttttggtgcg cgttaatatg caaatgaggt 5040
gtttgaattt ggggatgcgg ggctgtgatt ggccgagaga cgggcgaccg ttaggggcgg 5100
ggcgggtgac gttttgatga cgtggccgtg aggcggagcc ggtttgcaag ttctcgtggg 5160
aaaagtgacg tcaaacgagg tgtggtttga acacggaaat actcaatttt cccgcgctct 5220
ctgacaggaa atgaggtgtt tctgggcgga tgcaagtgaa aacgggccat tttcgcgcga 5280
aaactgaatg aggaagtgaa aatctgagta atttcgcgtt tatggcaggg aggagtattt 5340
gccgagggcc gagtagactt tgaccgatta cgtgggggtt tcgattaccg tatttttcac 5400
ctaaatttcc gcgtacggtg tcaaagtccg gtgtttttac gtaggtgtca gctgatcgcc 5460
agggtattta aacctgcgct ctctagtcaa gaggccactc ttgagtgcca gcgagtagag 5520
ttttctcctc cgcgccgcga gtcagatcta cactttgaaa gatgaggcac ctgagagacc 5580
tgcccggtaa tgttttcctg gctactggga acgagattct ggaactggtg gtggacgcca 5640
tgatgggtga cgaccctcct gagcccccta ccccatttga ggcgccttcg ctgtacgatt 5700
tgtatgatct ggaggtggat gtgcccgaga acgaccccaa cgaggaggcg gtgaatgatt 5760
tgtttagcga tgccgcgctg ctggctgccg agcaggctaa tacggactct ggctcagaca 5820
gcgattcctc tctccatacc ccgagacccg gcagaggtga gaaaaagatc cccgagctta 5880
aaggggaaga gctcgacctg cgctgctatg aggaatgctt gcctccgagc gatgatgagg 5940
aggacgagga ggcgattcga gctgcagcga gcgagggagt gaaagctgcg ggcgagagct 6000
ttagcctgga ctgtcctact ctgcccggac acggctgtaa gtcttgtgaa tttcatcgca 6060
tgaatactgg agataagaat gtgatgtgtg ccctgtgcta tatgagagct tacaaccatt 6120
gtgtttacag taagtgtgat taactttagc tgggaaggca gagggtgact gggtgctgac 6180
tggtttattt atgtatgtat tctttatgtg taggtcccgt ctctgacgca gatgagaccc 6240
ccacttcaga gtgcatttca tcacccccag aaattggcga ggaaccgccc gaagatatta 6300
ttcatagacc agttgcagtg agagtcaccg ggcggagagc agctgtggag agtttggatg 6360
acttgctaca gggtggggat gaacctttgg acttgtgtac ccggaaacgc cccaggcact 6420
aagtgccaca catgtgtgtt tacttggatc c 6451
<210> 4
<211> 33146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaattaatt ggttccactg agcgtcagac cccttaataa gatgatcttc ttgagatcgt 60
tttggtctgc gcgtaatctc ttgctctgaa aacgaaaaaa ccgccttgca gggcggtttt 120
tcgaaggttc tctgagctac caactctttg aaccgaggta actggcttgg aggagcgcag 180
tcaccaaaac ttgtcctttc agtttagcct taaccggcgc atgacttcaa gactaactcc 240
tctaaatcaa ttaccagtgg ctgctgccag tggtgctttt gcatgtcttt ccgggttgga 300
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcggac tgaacggggg gttcgtgcat 360
acagtccagc ttggagcgaa ctgcctaccc ggaactgagt gtcaggcgtg gaatgagaca 420
aacgcggcca taacagcgga atgacaccgg taaaccgaaa ggcaggaaca ggagagcgca 480
cgagggagcc gccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 540
actgatttga gcgtcagatt tcgtgatgct tgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 600
gctttgccgc ggccctctca cttccctgtt aagtatcttc ctggcatctt ccaggaaatc 660
tccgccccgt tcgtaagcca tttccgctcg ccgcagtcga acgaccgagc gtagcgagtc 720
agtgagcgag gaagcggaat atatcctgta tcacatattc tgctgacgca ccggtgcagc 780
cttttttctc ctgccacatg aagcacttca ctgacaccct catcagtgcc aacatagtaa 840
gccagtatac actccgctag cgctgaggtc tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat 900
accaggcctg aatcgcccca tcatccagcc agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag 960
ctttgttgta ggtggaccag ttggtgattt tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg 1020
cgttgtcggg aagatgcgtg atctgatcct tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac 1080
aaagccacgt tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat 1140
catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 1200
ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat 1260
atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt 1320
atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg 1380
atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca 1440
tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga 1500
aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gctgatgcgc 1560
tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg 1620
atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga 1680
gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata 1740
agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 1800
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 1860
accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 1920
agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 1980
atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 2040
gcattacgct gacttgacgg gacggcttag ggttaggcgt tttgcgctgc ttcgcgatgt 2100
acgggccaga tatacgcaat gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta 2160
acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg 2220
gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt 2280
ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac 2340
ataaacctct ggctaactag agaacccact gcttactggc ttatcgaaat taatacgact 2400
cactataggg agacccagcc accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 2460
tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 2520
agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 2580
agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 2640
gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 2700
acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 2760
tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 2820
aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 2880
tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 2940
aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 3000
ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 3060
acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 3120
gcatggacga gctgtacaag taaagcggcc gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg 3180
ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 3240
gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 3300
tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 3360
caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc 3420
ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg 3480
cgcattaata gggataacag ggtaatatac aaacgaggcc ctttcgtctt taattaacat 3540
catcaataat atacctcaaa cttttggtgc gcgttaatat gcaaatgagg tgtttgaatt 3600
tggggatgcg gggctgtgat tggccgagag acgggcgacc gttaggggcg gggcgggtga 3660
cgttttgatg acgtggccgt gaggcggagc cggtttgcaa gttctcgtgg gaaaagtgac 3720
gtcaaacgag gtgtggtttg aacacggaaa tactcaattt tcccgcgctc tctgacagga 3780
aatgaggtgt ttctgggcgg atgcaagtga aaacgggcca ttttcgcgcg aaaactgaat 3840
gaggaagtga aaatctgagt aatttcgcgt ttatggcagg gaggagtatt tgccgagggc 3900
cgagtagact ttgaccgatt acgtgggggt ttcgattacc gtatttttca cctaaatttc 3960
cgcgtacggt gtcaaagtcc ggtgttttta cgtaggtgtc agctgatcgc cagggtattt 4020
aaacctgcgc tctctagtca agaggccact cttgagtgcc agcgagtaga gttttctcct 4080
ccgcgccgcg agtcagatct acactttgaa agatgaggca cctgagagac ctgcccggta 4140
atgttttcct ggctactggg aacgagattc tggaactggt ggtggacgcc atgatgggtg 4200
acgaccctcc tgagccccct accccatttg aggcgccttc gctgtacgat ttgtatgatc 4260
tggaggtgga tgtgcccgag aacgacccca accttgcatt tctcagtcct aaacagggta 4320
atgggctggg gctgaatcac atgaaggcaa ggtcagattt ttattattat gcacatctag 4380
cttgaaaatt ttccattaag tcaattacag tgaaaaacct cacctggtat tgaatgcttg 4440
ccttgtatgt ctggctattc tgtgttttta ttttaaaatt ataatatcaa aatatttgtg 4500
ttataaaata ttctaactat ggaggccata aacaagaaga ctaaagttct ctcctttcag 4560
ccttctgtac acatttcttc tcaagcactg gtttatgcat gtatactata tgcaaaagtg 4620
atttggtgtt gtcctgcaac gggacggagt tcggctccag cggggaagaa tctgactaga 4680
gtgagtagtg tttgggggtg ggtgggagcc tgcatgaggg gcagaatgac taaaatctgt 4740
gtttttctgt gtgttgcagc agcatgagcg gaagcgcctc ctttgaggga ggggtattca 4800
gcccttatct gacggggcgt ctcccctcct gggctggagt gcgtcagaat gtgatgggat 4860
ccacggtgga cggccggccc gtgcagcccg cgaactcttc aaccctgacc tacgcgaccc 4920
tgagctcctc gtccgtggac gcagctgccg ccgcagctgc tgcttccgcc gccagcgccg 4980
tgcgcggaat ggccctgggt gccggctact acagctctct ggtggccaac tcgagttcca 5040
ccaataatcc cgccagcctg aacgaggaga agctgctgct gctgatggcc cagctcgagg 5100
ccctgaccca gcgcctgggc gagctgaccc agcaggtggc tcagctgcag gcggagacgc 5160
gggccgcggt tgccacggtg aaaaccaaat aaaaaatgaa tcaataaata aacggagacg 5220
gttgttgatt ttaacacaga gtcttgaatc tttatttgat ttttcgcgcg cggtaggccc 5280
tggaccaccg gtctcgatca ttgagcaccc ggtggatttt ttccaggacc cggtagaggt 5340
gggcttggat gttgaggtac atgggcatga gcccgtcccg ggggtggagg tagctccatt 5400
gcagggcctc gtgctcgggg gtggtgttgt aaatcaccca gtcatagcag gggcgcaggg 5460
cgtggtgctg cacgatgtcc ttgaggagga gactgatggc cacgggcagc cccttggtgt 5520
aggtgttgac gaacctgttg agctgggagg gatgcatgcg gggggagatg agatgcatct 5580
tggcctggat cttgagattg gcgatgttcc cgcccagatc ccgccggggg ttcatgttgt 5640
gcaggaccac cagcacggtg tatccggtgc acttggggaa tttgtcatgc aacttggaag 5700
ggaaggcatg aaagaatttg gagacgccct tgtgaccgcc caggttttcc atgcactcat 5760
ccatgatgat ggcaatgggc ccgtgggcgg cggcctgggc aaagacgttt cgggggtcgg 5820
acacatcgta gttgtggtcc tgggtgagct cgtcataggc cattttaatg aatttgggac 5880
ggagggtgcc cgattggggg acgaaggtgc cctcgatccc gggggcgtag ttgccctcgc 5940
agatctgcat ctcccaggcc ttgagctcgg agggggggat catgtccacc tgcggggcga 6000
tgaaaaaaac ggtttccggg gcgggggaga tgagctgcgc cgaaagcagg ttccggagca 6060
gctgggactt gccgcagccg gtgggaccgt agatgacccc gatgaccggc tgcaggtggt 6120
agttgaggga gagacagctg ccgtcctcgc ggaggagggg ggccacctcg ttcatcatct 6180
cgcgcacatg catgttctcg cgcacgagtt ccgccaggag gcgctcgccc cccagcgaga 6240
ggagctcttg cagcgaggcg aagtttttca gcggcttgag cccgtcggcc atgggcattt 6300
tggagagggt ctgttgcaag agttccagac ggtcccagag ctcggtgatg tgctctaggg 6360
catctcgatc cagcagacct cctcgtttcg cgggttgggg cgactgcggg agtagggcac 6420
caggcgatgg gcgtccagcg aggccagggt ccggtccttc cagggccgca gggtccgcgt 6480
cagcgtggtc tccgtcacgg tgaaggggtg cgcgccgggc tgggcgcttg cgagggtgcg 6540
cttcaggctc atccggctgg tcgagaaccg ctcccggtcg gcgccctgcg cgtcggccag 6600
gtagcaattg agcatgagtt cgtagttgag cgcctcggcc gcgtggccct tggcgcggag 6660
cttacctttg gaagtgtgtc cgcagacggg acagaggagg gacttgaggg cgtagagctt 6720
gggggcgagg aagacggact cgggggcgta ggcgtccgcg ccgcagctgg cgcagacggt 6780
ctcgcactcc acgagccagg tgaggtcggg ccggtcgggg tcaaaaacga ggtttcctcc 6840
gtgctttttg atgcgtttct tacctctggt ctccatgagc tcgtgtcccc gctgggtgac 6900
aaagaggctg tccgtgtccc cgtagaccga ctttatgggt cggtcctcga gcggggtgcc 6960
gcggtcctcg tcgtagagga accccgccca ctccgagacg aaggcccggg tccaggccag 7020
cacgaaggag gccacgtggg aggggtagcg gtcgttgtcc accagcgggt ccaccttctc 7080
cagggtatgc aagcacatgt ccccctcgtc cacatccagg aaggtgattg gcttgtaagt 7140
gtaggccacg tgaccggggg tcccggccgg gggggtataa aagggggcgg gcccctgctc 7200
gtcctcactg tcttccggat cgctgtccag gagcgccagc tgttggggta ggtattccct 7260
ctcgaaggcg ggcatgacct cggcactcag gttgtcagtt tctagaaacg aggaggattt 7320
gatattgacg gtgccgttgg agacgccttt catgagcccc tcgtccatct ggtcagaaaa 7380
gacgatcttt ttgttgtcga gcttggtggc gaaggagccg tagagggcgt tggagagcag 7440
cttggcgatg gagcgcatgg tctggttctt ttccttgtcg gcgcgctcct tggcggcgat 7500
gttgagctgt acgtactcgc gcgccacgca cttccattcg gggaagacgg tggtgagctc 7560
gtcgggcacg attctgaccc gccagccgcg gttgtgcagg gtgatgaggt ccacgctggt 7620
ggccacctcg ccgcgcaggg gctcgttggt ccagcagagg cgcccgccct tgcgcgagca 7680
gaaggggggc agcgggtcca gcatgagctc gtcggggggg tcggcgtcca cggtgaagat 7740
gccgggcagg agctcggggt caaagtagct gatgcaggtg cccagatcgt ccagcgccgc 7800
ttgccagtcg cgcacggcca gcgcgcgctc gtaggggctg aggggcgtgc cccagggcat 7860
ggggtgcgtg agcgcggagg cgtacatgcc gcagatgtcg tagacgtaga ggggctcctc 7920
gaggacgccg atgtaggtgg ggtagcagcg ccccccgcgg atgctggcgc gcacgtagtc 7980
gtacagctcg tgcgagggcg cgaggagccc cgtgccgaga ttggagcgct gcggcttttc 8040
ggcgcggtag acgatctggc ggaagatggc gtgggagttg gaggagatgg tgggcctctg 8100
gaagatgttg aagtgggcgt ggggcaggcc gaccgagtcc ctgatgaagt gggcgtagga 8160
gtcctgcagc ttggcgacga gctcggcggt gacgaggacg tccagggcgc agtagtcgag 8220
ggtctcttgg atgatgtcat acttgagctg gcccttctgc ttccacagct cgcggttgag 8280
aaggaactct tcgcggtcct tccagtactc ttcgaggggg aacccgtcct gatcggcacg 8340
gtaagagccc accatgtaga actggttgac ggccttgtag gcgcagcagc ccttctccac 8400
ggggagggcg taagcttgcg cggccttgcg cagggaggtg tgggtgaggg cgaaggtgtc 8460
gcgcaccatg accttgagga actggtgctt gaagtcgagg tcgtcgcagc cgccctgctc 8520
ccagagttgg aagtccgtgc gcttcttgta ggcggggttg ggcaaagcga aagtaacatc 8580
gttgaagagg atcttgcccg cgcggggcat gaagttgcga gtgatgcgga aaggctgggg 8640
cacctcggcc cggttgttga tgacctgggc ggcgaggacg atctcgtcga agccgttgat 8700
gttgtgcccg acgatgtaga gttccacgaa tcgcgggcgg cccttgacgt ggggcagctt 8760
cttgagctcg tcgtaggtga gctcggcggg gtcgctgagg ccgtgctgct cgagggccca 8820
gtcggcgacg tgggggttgg cgctgaggaa ggaagtccag agatccacgg ccagggcggt 8880
ctgcaagcgg tcccggtact gacggaactg ctggcccacg gccatttttt cgggggtgac 8940
gcagtagaag gtgcgggggt cgccgtgcca gcggtcccac ttgagctgga gggcgaggtc 9000
gtgggcgagc tcgacgagcg gcgggtcccc ggagagtttc atgaccagca tgaaggggac 9060
gagctgcttg ccgaaggacc ccatccaggt gtaggtttcc acatcgtagg tgaggaagag 9120
cctttcggtg cgaggatgcg agccgatggg gaagaactgg atctcctgcc accagttgga 9180
ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa atgccgacgg cgcgccgagc actcgtgctt 9240
gtgtttatac aagcgtccgc agtgctcgca acgctgcacg ggatgcacgt gctgcacgag 9300
ctgtacctga gttcctttga cgaggaattt cagtgggcag tggagcgctg gcggctgcat 9360
ctggtgttgt actacgtcct ggccatcggc gtggccatcg tctgcctcga tggtggtcat 9420
gctgacgagg ccgcgcggga ggcaggtcca gacctcggct cggacgggtc ggagagcgag 9480
gacgagggcg cgcaggccgg agctgtccag ggtcctgaga cgctgcggag tcaggtcagt 9540
gggcagcggc ggcgcgcggt tgacttgcag gagcttttcc agggcgcgcg ggaggtccag 9600
atggtacttg atctccacgg cgccgttggt ggcaacgtcc acggcttgca gggtgccgtg 9660
cccctggggc gccaccaccg tgccccgttt ctttttgggc gctggcggcg gcggctccat 9720
gcttagaatc ggcggcgagg acgcgcgccg ggcggcaggg gcggctcggg gcccggaggc 9780
aggggcggca ggggcacgtc ggcgccgcgc gcgggcaggt tctggtactg cgcccggaga 9840
agactggcgt gagcgacgac gcgacggttg acgtcctgga tctgacgcct ctgggtgaag 9900
gccacgggac ccgtgagttt gaacctgaaa gagagttcga cagaatcaat ctcggtatcg 9960
ttgacggcag cctgccgcag gatctcttgc acgtcgcccg agttgtcctg gtaggcgatc 10020
tcggtcatga actgctcgat ctcctcctcc tgaaggtctc cgcggccggc gcgctcgacg 10080
gtggccgcga ggtcgttgga gatgcggccc atgagctgcg agaaggcgtt catgccggcc 10140
tcgttccaga cgcggctgta gaccacggct ccgtcggggt cgcgcgcgcg catgaccacc 10200
tgggcgaggt tgatctccac gtggcgcgtg aagaccgcgt agttgcagag gcgctggtag 10260
aggtagttga gcgtggtggc gatgtgctcg gtgacgaaga agtacatgat ccagcggcgg 10320
agcggcatct cgctgacgtc gcccagggct tccaagcgct ccatggcctc gtagaagtcc 10380
acggcgaagt tgaaaaactg ggagttgcgc gccgagacgg tcaactcctc ctccagaaga 10440
cggatgagct cggcgatggt ggcgcgcacc tcgcgctcga aggccccggg gggctcctct 10500
tcttccatct cctcctcctc ttcctcctcc tccactaaca tctcttctac ttcctcctca 10560
ggaggcggcg gcgggggagg ggccctgcgt cgccggcggc gcacgggcag acggtcgatg 10620
aagcgctcga tggtctcccc gcgccggcga cgcatggtct cggtgacggc gcgcccgtcc 10680
tcgcggggcc gcagcgtgaa gacgccgccg cgcatctcca ggtggccgcc gggggggtct 10740
ccgttgggca gggagagggc gctgacgatg catcttatca attggcccgt agggactccg 10800
cgcaaggacc tgagcgtctc gagatccacg ggatccgaaa accgctgaac gaaggcttcg 10860
agccagtcgc agtcgcaagg taggctgagc ccggtttctt gttcttcggg tatttggtcg 10920
ggaggcgggc gggcgatgct gctggtgatg aagttgaagt aggcggtcct gagacggcgg 10980
atggtggcga ggagcaccag gtccttgggc ccggcttgct ggatgcgcag acggtcggcc 11040
atgccccagg cgtggtcctg acacctggcg aggtccttgt agtagtcctg catgagccgc 11100
tccacgggca cctcctcctc gcccgcgcgg ccgtgcatgc gcgtgagccc gaacccgcgc 11160
tggggctgga cgagcgccag gtcggcgacg acgcgctcgg cgaggatggc ctgctggatc 11220
tgggtgaggg tggtctggaa gtcgtcgaag tcgacgaagc ggtggtaggc tccggtgttg 11280
atggtgtagg agcagttggc catgacggac cagttgacgg tctggtggcc ggggcgcacg 11340
agctcgtggt acttgaggcg cgagtaggcg cgcgtgtcga agatgtagtc gttgcaggtg 11400
cgcacgaggt actggtatcc gacgaggaag tgcggcggcg gctggcggta gagcggccat 11460
cgctcggtgg cgggggcgcc gggcgcgagg tcctcgagca tgaggcggtg gtagccgtag 11520
atgtacctgg acatccaggt gatgccggcg gcggtggtgg aggcgcgcgg gaactcgcgg 11580
acgcggttcc agatgttgcg cagcggcagg aagtagttca tggtggccgc ggtctggccc 11640
gtgaggcgcg cgcagtcgtg gatgctctag acatacgggc aaaaacgaaa gcggtcagcg 11700
gctcgactcc gtggcctgga ggctaagcga acgggttggg ctgcgcgtgt accccggttc 11760
gagtccctgc tcgaatcagg ctggagccgc agctaacgtg gtactggcac tcccgtctcg 11820
acccaagcct gctaacgaaa cctccaggat acggaggcgg gtcgttttgg caattttcgt 11880
caggccggaa atgaaactag taagcgcgga aagcggccgc ccgcgatggc tcgctgccgt 11940
agtctggaga aagaatcgcc agggttgcgt tgcggtgtgc cccggttcga gcctcggcgc 12000
tcgtgccggc cggattccgc ggctaacgtg ggcgtggctg ccccgtcgtt tccaagaccc 12060
cttagccagc cgacttctcc agttacggag cgagcccctc tttttttttt ttcttgtgtt 12120
tttgccagat gcatcccgta ctgcggcaga tgcgccccca ccctccacca caaccgcccc 12180
taccgcagca gcagcaacag ccggcgcttc tgcccccgcc ccagcagcag cagccagcca 12240
ctaccgcggc ggccgccgtg agcggagccg gcgttcagta tgacctggcc ttggaagagg 12300
gcgaggggct ggcgcggctg ggggcgtcgt cgccggagcg gcacccgcgc gtgcagatga 12360
aaagggacgc tcgcgaggcc tacgtgccca agcagaacct gttcagagac aggagcggcg 12420
aggagcccga ggagatgcgc gcctcccgct tccacgcggg gcgggagctg cggcgcggcc 12480
tggaccgaaa gcgggtgctg agggacgagg atttcgaggc ggacgagctg acggggatca 12540
gccccgcgcg cgcgcacgtg gccgcggcca acctggtcac ggcgtacgag cagaccgtga 12600
aggaggagag caacttccaa aaatccttca acaaccacgt gcgcacgctg atcgcgcgcg 12660
aggaggtgac cctgggcctg atgcacctgt gggacctgct ggaggccatc gtgcagaacc 12720
ccacgagcaa gccgctgacg gcgcagctgt ttctggtggt gcagcacagt cgggacaacg 12780
agacgttcag ggaggcgctg ctgaatatca ccgagcccga gggccgctgg ctcctggacc 12840
tggtgaacat tctgcagagc atcgtggtgc aggagcgcgg gctgccgctg tccgagaagc 12900
tggcggccat caacttctcg gtgctgagcc tgggcaagta ctacgctagg aagatctaca 12960
agaccccgta cgtgcccata gacaaggagg tgaagatcga cgggttttac atgcgcatga 13020
ccctgaaagt gctgaccctg agcgacgatc tgggggtgta ccgcaacgac aggatgcacc 13080
gcgcggtgag cgccagccgc cggcgcgagc tgagcgacca ggagctgatg cacagcctgc 13140
agcgggccct gaccggggcc gggaccgagg gggagagcta ctttgacatg ggcgcggacc 13200
tgcgctggca gcccagccgc cgggccttgg aagctgccgg cggttccccc tacgtggagg 13260
aggtggacga tgaggaggag gagggcgagt acctggaaga ctgatggcgc gaccgtattt 13320
ttgctagatg cagcaacagc caccgccgcc tcctgatccc gcgatgcggg cggcgctgca 13380
gagccagccg tccggcatta actcctcgga cgattggacc caggccatgc aacgcatcat 13440
ggcgctgacg acccgcaatc ccgaagcctt tagacagcag cctcaggcca accggctctc 13500
ggccatcctg gaggccgtgg tgccctcgcg ctcgaacccc acgcacgaga aggtgctggc 13560
catcgtgaac gcgctggtgg agaacaaggc catccgcggc gacgaggccg ggctggtgta 13620
caacgcgctg ctggagcgcg tggcccgcta caacagcacc aacgtgcaga cgaacctgga 13680
ccgcatggtg accgacgtgc gcgaggcggt gtcgcagcgc gagcggttcc accgcgagtc 13740
gaacctgggc tccatggtgg cgctgaacgc cttcctgagc acgcagcccg ccaacgtgcc 13800
ccggggccag gaggactaca ccaacttcat cagcgcgctg cggctgatgg tggccgaggt 13860
gccccagagc gaggtgtacc agtcggggcc ggactacttc ttccagacca gtcgccaggg 13920
cttgcagacc gtgaacctga gccaggcttt caagaacttg cagggactgt ggggcgtgca 13980
ggccccggtc ggggaccgcg cgacggtgtc gagcctgctg acgccgaact cgcgcctgct 14040
gctgctgctg gtggcgccct tcacggacag cggcagcgtg agccgcgact cgtacctggg 14100
ctacctgctt aacctgtacc gcgaggccat cgggcaggcg cacgtggacg agcagaccta 14160
ccaggagatc acccacgtga gccgcgcgct gggccaggag gacccgggca acctggaggc 14220
caccctgaac ttcctgctga ccaaccggtc gcagaagatc ccgccccagt acgcgctgag 14280
caccgaggag gagcgcatcc tgcgctacgt gcagcagagc gtggggctgt tcctgatgca 14340
ggagggggcc acgcccagcg ccgcgctcga catgaccgcg cgcaacatgg agcccagcat 14400
gtacgcccgc aaccgcccgt tcatcaataa gctgatggac tacttgcatc gggcggccgc 14460
catgaactcg gactacttta ccaacgccat cttgaacccg cattggctcc cgccgcccgg 14520
gttctacacg ggcgagtacg acatgcccga ccccaacgac gggttcctgt gggacgacgt 14580
ggacagcagc gtgttctcgc cgcgccccac cgccaccacc gtgtggaaga aagagggcgg 14640
ggaccggcgg ccgtcctcgg cgctgtccgg tcgcgcgggt gctgccgcgg cggtgcccga 14700
ggccgccagc cccttcccga gcctgccctt ttcgctgaac agcgtgcgca gcagcgagct 14760
gggtcggctg acgcggccgc gcctgctggg cgaggaggag tacctgaacg actccttgtt 14820
gaggcccgag cgcgagaaga acttccccaa taacgggata gagagcctgg tggacaagat 14880
gagccgctgg aagacgtacg cgcacgagca cagggacgag ccccgagcta gcagcagcgc 14940
cacccgtaga cgccagcggc acgacaggca gcggggactg gtgtgggacg atgaggattc 15000
cgccgacgac agcagcgtgt tggacttggg tgggagtggt ggtaacccgt tcgctcactt 15060
gcgcccccgt atcgggcgcc tgatgtaaga atctgaaaaa ataaaaaacg gtactcacca 15120
aggccatggc gaccagcgtg cgttcttctc tgttgtttgt agtagtatga tgaggcgcgt 15180
gtacccggag ggtcctcctc cctcgtacga gagcgtgatg cagcaggcgg tggcggcggc 15240
gatgcagccc ccgctggagg cgccttacgt gcccccgcgg tacctggcgc ctacggaggg 15300
gcggaacagc attcgttact cggagctggc acccttgtac gataccaccc ggttgtacct 15360
ggtggacaac aagtcggcgg acatcgcctc gctgaactac cagaacgacc acagcaactt 15420
cctgaccacc gtggtgcaga acaacgattt cacccccacg gaggccagca cccagaccat 15480
caactttgac gagcgctcgc ggtggggcgg ccagctgaaa accatcatgc acaccaacat 15540
gcccaacgtg aacgagttca tgtacagcaa caagttcaag gcgcgggtga tggtctcgcg 15600
caagaccccc aacggggtga cggtagggga tgattatgat ggtagtcagg acgagctgac 15660
ctacgagtgg gtggagtttg agctgcccga gggcaacttc tcggtgacca tgaccatcga 15720
tctgatgaac aacgccatca tcgacaacta cttggcggtg gggcggcaga acggggtgct 15780
ggagagcgac atcggcgtga agttcgacac gcgcaacttc cggctgggct gggaccccgt 15840
gaccgagctg gtgatgccgg gcgtgtacac caacgaggcc ttccaccccg acatcgtcct 15900
gctgcccggc tgcggcgtgg acttcaccga gagccgcctc agcaacctgc tgggcatccg 15960
caagcggcag cccttccagg agggcttcca gatcctgtac gaggacctgg aggggggcaa 16020
catccccgcg ctgctggacg tggacgccta tgagaaaagc aaggaggata gcgccgccgc 16080
ggcgaccgca gccgtggcca ccgcctctac cgaggtgcgg ggcgataatt ttactagcgc 16140
cgcagcagtg gccgaggcgg ctgaaaccga aagtaagata gtgatccagc cggtggagaa 16200
ggacagcaag gacaggagct acaacgtgct cgcggacaag aaaaacaccg cctaccgcag 16260
ctggtacctg gcctacaact acggcgaccc cgagaagggc gtgcgctcct ggacgctgct 16320
caccacctcg gacgtcacct gcggcgtgga gcaagtctac tggtcgctgc ccgacatgat 16380
gcaagacccg gtcaccttcc gctccacgcg tcaagttagc aactacccgg tggtgggcgc 16440
cgagctcctg cccgtctact ccaagagctt cttcaacgag caggccgtct actcgcagca 16500
gctgcgcgcc ttcacctcgc tcacgcacgt tttcaaccgc ttccccgaga accagatcct 16560
cgttcgcccg cccgcgccca ccattaccac cgtcagtgaa aacgttcctg ctctcacaga 16620
tcacgggacc ctgccgctgc gcagcagtat ccggggagtc cagcgcgtga ccgtcactga 16680
cgccagacgc cgcacctgcc cctacgtcta caaggccctg ggcgtagtcg cgccgcgcgt 16740
cctctcgagc cgcaccttct aaaaaatgtc cattctcatc tcgcccagta ataacaccgg 16800
ttggggcctg cgcgcgccca gcaagatgta cggaggcgct cgccaacgct ccacacaaca 16860
ccccgtgcgc gtgcgcgggc acttccgcgc tccctggggc gccctcaagg gccgcgtgcg 16920
ctcgcgcacc accgtcgacg acgtgatcga ccaggtggtg gccgacgcgc gcaactacac 16980
gcccgccgcc gcgcccgtct ccaccgtgga cgccgtcatc gacagcgtgg tggccgacgc 17040
gcgccggtac gcccgcgcca agagccggcg gcggcgcatc gcccggcggc accggagcac 17100
ccccgccatg cgcgcggcgc gagccttgct gcgcagggcc aggcgcacgg gacgcagggc 17160
catgctcagg gcggccagac gcgcggcctc cggcagcagc agcgccggca gaacccgcag 17220
acgcgcggcc acggcggcgg cggcggccat cgccagcatg tcccgcccgc ggcgcggcaa 17280
cgtgtactgg gtgcgcgacg ccgccaccgg tgtgcgcgtg cccgtgcgca cccgcccccc 17340
tcgcacttga agatgctgac ttcgcgatgt tgatgtgtcc cagcggcgag gaggatgtcc 17400
aagcgcaaat acaaggaaga gatgctccag gtcatcgcgc ctgagatcta cggccccgcg 17460
gcggcggtga aggaggaaag aaagccccgc aaactgaagc gggtcaaaaa ggacaaaaag 17520
gaggaggaag atgacggact ggtggagttt gtgcgcgagt tcgccccccg gcggcgcgtg 17580
cagtggcgcg ggcggaaagt gaaaccggtg ctgcggcccg gcaccacggt ggtcttcacg 17640
cccggcgagc gttccggctc cgcctccaag cgctcctacg acgaggtgta cggggacgag 17700
gacatcctcg agcaggcggt cgagcgtctg ggcgagtttg cttacggcaa gcgcagccgc 17760
cccgcgccct tgaaagagga ggcggtgtcc atcccgctgg accacggcaa ccccacgccg 17820
agcctgaagc cggtgaccct gcagcaggtg ctaccgagcg cggcgccgcg ccggggcttc 17880
aagcgcgagg gcggcgagga tctgtacccg accatgcagc tgatggtgcc caagcgccag 17940
aagctggagg acgtgctgga gcacatgaag gtggaccccg aggtgcagcc cgaggtcaag 18000
gtgcggccca tcaagcaggt ggctccgggc ctgggcgtgc agaccgtgga catcaagatc 18060
cccacggagc ccatggaaac gcagaccgag cccgtgaagc ccagcaccag caccatggag 18120
gtgcagacgg atccctggat gccagcggct tccaccacca ccacccgccg aagacgcaag 18180
tacggcgcga ccagcctgct gatgcccaac tacgcgctgc atccttccat catccccacg 18240
ccgggctacc gcggcacgcg cttctaccgc ggctacagca gccgccgcaa gaccaccacc 18300
cgccgccgcc gtcgtcgcac ccgccgcagc agcaccgcga cttccgccgc cgccttggtg 18360
cggagagtgt accgcagcgg gcgcgagcct ctgaccctgc cgcgcgcgcg ctaccacccg 18420
agcatcgcca tttaactctg ccgtcgcctc cttgcagata tggccctcac atgccgcctc 18480
cgcgtcccca ttacgggcta ccgaggaaga aagccgcgcc gtagaaggct gacggggaac 18540
gggctgcgtc gccatcacca ccggcggcgg cgcgccatca gcaagcggtt ggggggaggc 18600
ttcctgcccg cgctgatccc catcatcgcc gcggcgatcg gggcgatccc cggcatagct 18660
tccgtggcgg tgcaggcctc tcagcgccac tgagacacag cttggaaaat ttgtaataaa 18720
aaatggactg acgctcctgg tcctgtgatg tgtgttttta gatggaagac atcaattttt 18780
cgtccctggc accgcgacac ggcacgcggc cgtttatggg cacctggagc gacatcggca 18840
acagccaact gaacgggggc gccttcaatt ggagcagtct ctggagcggg cttaagaatt 18900
tcgggtccac gctcaaaacc tatggcaaca aggcgtggaa cagcagcaca gggcaggcgc 18960
tgagggaaaa gctgaaagag cagaacttcc agcagaaggt ggtcgatggc ctggcctcgg 19020
gcatcaacgg ggtggtggac ctggccaacc aggccgtgca gaaacagatc aacagccgcc 19080
tggacgcggt cccgcccgcg gggtccgtgg agatgcccca ggtggaggag gagctgcctc 19140
ccctggacaa gcgcggcgac aagcgaccgc gtcccgacgc ggaggagacg ctgctgacgc 19200
acacggacga gccgcccccg tacgaggagg cggtgaaact gggtctgccc accacgcggc 19260
ccgtggcgcc tctggccacc ggggtgctga aacccagcag cagcagcagc cagcccgcga 19320
ccctggactt gcctccgcct gcttcccgcc cctccacagt ggctaagccc ctgccgccgg 19380
tggccgtcgc gtcgcgcgcc ccccgaggcc gcccccaggc gaactggcag agcactctga 19440
acagcatcgt gggtctggga gtgcagagtg tgaagcgccg ccgctgctat taaaagacac 19500
tgtagcgctt aacttgcttg tctgtgtgta tatgtatgtc cgccgaccag aaggaggagg 19560
aagaggcgcg tcgccgagtt gcaagatggc caccccatcg atgctgcccc agtgggcgta 19620
catgcacatc gccggacagg acgcttcgga gtacctgagt ccgggtctgg tgcagttcgc 19680
ccgcgccaca gacacctact tcagtctggg gaacaagttt aggaacccca cggtggcgcc 19740
cacgcacgat gtgaccaccg accgcagcca gcggctgacg ctgcgcttcg tgcccgtgga 19800
ccgcgaggac aacacctact cgtacaaagt gcgctacacg ctggccgtgg gcgacaaccg 19860
cgtgctggac atggccagca cctactttga catccgcggc gtgctggacc ggggccccag 19920
cttcaaaccc tactccggca ccgcctacaa cagtctggct cccaagggag cgcccaacac 19980
ctcacagtgg ataaccaaag acaatggaac tgataagaca tacagttttg gaaatgctcc 20040
agtcagagga ttggacatta cagaagaggg tctccaaata ggaaccgatg agtcaggggg 20100
tgaaagcaag aaaatttttg cagacaaaac ctatcagcct gaacctcagc ttggagatga 20160
ggaatggcat gatactattg gagctgaaga caagtatgga ggcagagcgc ttaaacctgc 20220
caccaacatg aaaccctgct atgggtcttt cgccaagcca actaatgcta agggaggtca 20280
ggctaaaagc agaaccaagg acgatggcac tactgagcct gatattgaca tggccttctt 20340
tgacgatcgc agtcagcaag ctagtttcag tccagaactt gttttgtata ctgagaatgt 20400
cgatctggac accccggata cccacattat ttacaaacct ggcactgatg aaacaagttc 20460
ttctttcaac ttgggtcagc agtccatgcc caacagaccc aactacattg ggttcagaga 20520
caactttatc ggtctcatgt actacaacag cactggcaat atgggtgtgc tggctggaca 20580
ggcctcccag ctgaatgctg tggtggactt gcaggacaga aacactgaac tgtcctacca 20640
gctcttgctt gactctctgg gtgacagaac taggtatttc agtatgtgga atcaggcggt 20700
ggacagctac gaccccgatg tgcgcattat tgaaaatcac ggtgtggagg atgaactccc 20760
caactattgc ttccctttga atggtgtggg ctttacagat acattccagg gaattaaggt 20820
taaaactacc aataacggaa cagcaaatgc tacagagtgg gaatctgata cctctgtcaa 20880
taatgctaat gagattgcca agggcaatcc tttcgccatg gagatcaaca tccaggccaa 20940
cctgtggcgg aacttcctct acgcgaacgt ggcgctgtac ctgcccgact cctacaagta 21000
cacgccggcc aacatcacgc tgcccaccaa caccaacacc tacgattaca tgaacggccg 21060
cgtggtggcg ccctcgctgg tggacgccta catcaacatc ggggcgcgct ggtcgctgga 21120
ccccatggac aacgtcaacc ccttcaacca ccaccgcaac gcgggcctgc gctaccgctc 21180
catgctcctg ggcaacgggc gctacgtgcc cttccacatc caggtgcccc aaaagttttt 21240
cgccatcaag agcctcctgc tcctgcccgg gtcctacacc tacgagtgga acttccgcaa 21300
ggacgtcaac atgatcctgc agagctccct cggcaacgac ctgcgcacgg acggggcctc 21360
catcgccttc accagcatca acctctacgc caccttcttc cccatggcgc acaacaccgc 21420
ctccacgctc gaggccatgc tgcgcaacga caccaacgac cagtccttca acgactacct 21480
ctcggcggcc aacatgctct accccatccc ggccaacgcc accaacgtgc ccatctccat 21540
cccctcgcgc aactgggccg ccttccgcgg atggtccttc acgcgcctca agacccgcga 21600
gacgccctcg ctcggctccg ggttcgaccc ctacttcgtc tactcgggct ccatccccta 21660
ccttgacggc accttctacc tcaaccacac cttcaagaag gtctccatca ccttcgactc 21720
ctccgtcagc tggcccggca acgaccgcct cctgacgccc aacgagttcg aaatcaagcg 21780
caccgtcgac ggagaggggt acaacgtggc ccagtgcaac atgaccaagg actggttcct 21840
ggtccagatg ctggcccact acaacatcgg ctaccagggc ttctacgtgc ccgagggcta 21900
caaggaccgc atgtactcct tcttccgcaa cttccagccc atgagccgcc aggtcgtgga 21960
cgaggtcaac tacaaggact accaggccgt caccctggcc taccagcaca acaactcggg 22020
cttcgtcggc tacctcgcgc ccaccatgcg ccagggccag ccctaccccg ccaactaccc 22080
ctacccgctc atcggcaaga gcgccgtcgc cagcgtcacc cagaaaaagt tcctctgcga 22140
ccgggtcatg tggcgcatcc ccttctccag caacttcatg tccatgggcg cgctcaccga 22200
cctcggccag aacatgctct acgccaactc cgcccacgcg ctagacatga atttcgaagt 22260
cgaccccatg gatgagtcca cccttctcta tgttgtcttc gaagtcttcg acgtcgtccg 22320
agtgcaccag ccccaccgcg gcgtcatcga ggccgtctac ctgcgcacgc ccttctcggc 22380
cggcaacgcc accacctaag cctcttgctt cttgcaagat atggcctgtg cgggctccgg 22440
cgagcaggag ctcagggcca tcctccgcga cctgggctgc gggccctgct tcctgggcac 22500
cttcgacaag cgcttcccgg gattcatggc cccgcacaag ctggcctgcg ccattgtcaa 22560
cacggccggc cgcgagaccg ggggcgagca ctggctggcc ttcgcctgga acccgcgctc 22620
ccacacctgc tacctcttcg acccctttgg gttctcggac gagcgcctca agcagatcta 22680
ccagttcgag tacgagggcc tgctgcgtcg cagcgccctg gccaccgagg accgctgcgt 22740
caccctggaa aagtccaccc agaccgtgca gggtccgcgc tcggccgcct gcgggctctt 22800
ctgctgcatg ttcctgcacg ccttcgtgca ctggcccgac cgccccatgg acaagaaccc 22860
caccatgaac ttgctgacgg gggtgcccaa cggcatgctc cagtcgcccc aggtggaacc 22920
caccctgcgc cgcaaccagg aggcgctcta ccgcttcctc aacgcccact ccgcctactt 22980
tcgatcccac cgcgcgcgca tcgagaaggc caccgccttc gaccgcatga atcaagacat 23040
gtaaaccgtg tgtgtatgtg aatgctttat tcataataaa cagcacatgt ttatgccacc 23100
ttctctgagg ctctgacttt atttagaaat cgaaggggtt ctgccggctc tcggcgtgcc 23160
ccgcgggcag ggatacgttg cggaactggt acttgggcag ccacttgaac tcggggatca 23220
gcagcttggg cacggggagg tcggggaacg agtcgctcca cagcttgcgc gtgagttgca 23280
gggcgcccag caggtcgggc gcggagatct tgaaatcgca gttgggaccc gcgttctgcg 23340
cgcgagagtt gcggtacacg gggttgcagc actggaacac catcagggcc gggtgcttca 23400
cgctcgccag caccgtcgcg tcggtgatgc cctccacgtc cagatcctcg gcgttggcca 23460
tcccgaaggg ggtcatcttg caggtctgcc gccccatgct gggcacgcag ccgggcttgt 23520
ggttgcaatc gcagtgcagg gggatcagca tcatctgggc ctgctcggag ctcatgcccg 23580
ggtacatggc cttcatgaaa gcctccagct ggcggaaggc ctgctgcgcc ttgccgccct 23640
cggtgaagaa gaccccgcag gacttgctag agaactggtt ggtggcgcag ccggcgtcgt 23700
gcacgcagca gcgcgcgtcg ttgttggcca gctgcaccac gctgcgcccc cagcggttct 23760
gggtgatctt ggcccggtcg gggttctcct tcagcgcgcg ctgcccgttc tcgctcgcca 23820
catccatctc gatcgtgtgc tccttctgga tcatcacggt cccgtgcagg caccgcagct 23880
tgccctcggc ctcggtgcag ccgtgcagcc acagcgcgca gccggtgctc tcccagttct 23940
tgtgggcgat ctgggagtgc gagtgcacga agccctgcag gaagcggccc atcatcgcgg 24000
tcagggtctt gttgctggtg aaggtcagcg ggatgccgcg gtgctcctcg ttcacataca 24060
ggtggcagat gcggcggtac acctcgccct gctcgggcat cagctggaag gcggacttca 24120
ggtcgctctc cacgcggtac cggtccatca gcagcgtcat cacttccatg cccttctccc 24180
aggccgaaac gatcggcagg ctcagggggt tcttcaccgc cattgtcatc ttagtcgccg 24240
ccgccgaagt cagggggtcg ttctcgtcca gggtctcaaa cactcgcttg ccgtccttct 24300
cggtgatgcg cacggggggg aaggcgaagc ccacggccgc cagctcctcc tcggcctgcc 24360
tttcgtcctc gctgtcctgg ctgatgtctt gcaaaggcac atgcttggtc ttgcggggtt 24420
tctttttggg cggcagaggc ggcggcggag acgtgctggg cgagcgcgag ttctcgctca 24480
ccacgactat ttcttctcct tggccgtcgt ccgagaccac gcggcggtag gcatgcctct 24540
tctggggcag aggcggaggc gacgggctct cgcggttcgg cgggcggctg gcagagcccc 24600
ttccgcgttc gggggtgcgc tcctggcggc gctgctctga ctgacttcct ccgcggccgg 24660
ccattgtgtt ctcctaggga gcaagcatgg agactcagcc atcgtcgcca acatcgccat 24720
ctgcccccgc cgccgccgac gagaaccagc agaatgaaag cttaaccgcc ccgccgccca 24780
gccccacctc cgacgcggcc ccagacatgc aagagatgga ggaatccatc gagattgacc 24840
tgggctacgt gacgcccgcg gagcacgagg aggagctggc agcgcgcttt tcagccccgg 24900
aagagaacca ccaagagcag ccagagcagg aagcagagag cgagcagcag caggctgggc 24960
tcgagcatgg cgactacctg agcggggcag aggacgtgct catcaagcat ctggcccgcc 25020
aatgcatcat cgtcaaggac gcgctgctcg accgcgccga ggtgcccctc agcgtggcgg 25080
agctcagccg cgcctacgag cgcaacctct tctcgccgcg cgtgcccccc aagcgccagc 25140
ccaacggcac ctgcgagccc aacccgcgcc tcaacttcta cccggtcttc gcggtgcccg 25200
aggccctggc cacctaccac ctctttttca agaaccaaag gatccccgtc tcctgccgcg 25260
ccaaccgcac ccgcgccgac gccctgctca acctgggccc cggcgcccgc ctacctgata 25320
tcgcctcctt ggaagaggtt cccaagatct tcgagggtct gggcagcgac gagactcggg 25380
ccgcgaacgc tctgcaagga agcggagagg agcatgagca ccacagcgcc ctggtggagt 25440
tggaaggcga caacgcgcgc ctggcggtgc tcaagcgcac ggtcgagctg acccacttcg 25500
cctacccggc gctcaacctg ccccccaagg tcatgagcgc cgtcatggac caggtgctca 25560
tcaagcgcgc ctcgcccctc tcggaggagg agatgcagga ccccgagagc tcggacgagg 25620
gcaagcccgt ggtcagcgac gagcagctgg cgcgctggct gggagcgagt agcacccccc 25680
agagcctgga agagcggcgc aagctcatga tggccgtggt cctggtgacc gtggagctgg 25740
agtgtctgcg ccgcttcttc gccgacgcgg agaccctgcg caaggtcgag gagaacctgc 25800
actacctctt caggcacggg ttcgtgcgcc aggcctgcaa gatctccaac gtggagctga 25860
ccaacctggt ctcctacatg ggcatcctgc acgagaaccg cctggggcag aacgtgctgc 25920
acaccaccct gcgcggggag gcccgccgcg actacatccg cgactgcgtc tacctgtacc 25980
tctgccacac ctggcagacg ggcatgggcg tgtggcagca gtgcctggag gagcagaacc 26040
tgaaagagct ctgcaagctc ctgcagaaga acctcaaggc cctgtggacc gggttcgacg 26100
agcgcaccac cgcctcggac ctggccgacc tcatcttccc cgagcgcctg cggctgacgc 26160
tgcgcaacgg gctgcccgac tttatgagcc aaagcatgtt gcaaaacttt cgctctttca 26220
tcctcgaacg ctccgggatc ctgcccgcca cctgctccgc gctgccctcg gacttcgtgc 26280
cgctgacctt ccgcgagtgc cccccgccgc tctggagcca ctgctacctg ctgcgcctgg 26340
ccaactacct ggcctaccac tcggacgtga tcgaggacgt cagcggcgag ggcctgctcg 26400
agtgccactg ccgctgcaac ctctgcacgc cgcaccgctc cctggcctgc aacccccagc 26460
tgctgagcga gacccagatc atcggcacct tcgagttgca aggccccggc gacagcgagg 26520
gcaagggggg tctcaaactc accccggggc tgtggacctc ggcctacttg cgcaagttcg 26580
tgcccgagga ctaccatccc ttcgagatca ggttctacga ggaccaatcc cagccgccca 26640
aggccaagct gtcggcctgc gtcatcaccc agggggccat cctggcccaa ttgcaagcca 26700
tccagaaatc ccgccaagaa tttctgctga aaaagggcca cggggtctac ttggaccccc 26760
agaccggaga ggagctcaac cccagcttcc cccaggatgc cccgaggaag cagcaagaag 26820
ctgaaagtgg agctgccgcc gccggaggat ttggaggaag actgggagag cagtcaggca 26880
gaggagatgg aagactggga cagcactcag gcagaggagg acagcctgca agacagtctg 26940
gaggaggaag acgaggtgga ggaggaggca gaggaagaag cagccgccgc cagaccgtcg 27000
tcctcggcgg aggagaaagc aagcagcacg gataccatct ccgctccggg tcggggtcgc 27060
ggcggccggg cccacagtag gtgggacgag accgggcgct tcccgaaccc caccacccag 27120
accggtaaga aggagcggca gggatacaag tcctggcggg ggcacaaaaa cgccatcgtc 27180
tcctgcttgc aagcctgcgg gggcaacatc tccttcaccc ggcgctacct gctcttccac 27240
cgcggggtga acttcccccg caacatcttg cattactacc gtcacctcca cagcccctac 27300
tactgtttcc aagaagaggc agaaacccag cagcagcagc agaaaaccag cgacagctag 27360
aaaatccaca gcggcggcgg caggtggact gaggatcgcg gcgaacgagc cagcgcagac 27420
ccgggagctg aggaaccgga tctttcccac cctctatgcc atcttccagc agagtcgggg 27480
gcaggagcag gaactgaaag tcaagaaccg ttctctgcgc tcgctcaccc gcagttgtct 27540
gtatcacaag agcgaagacc aacttcagcg cactctcgag gacgccgagg ctctcttcaa 27600
caagtactgc gcgctcactc ttaaagagta gcccgcgccc gcccacacac ggaaaaaggc 27660
gggaattacg tcaccacctg cgcccttcgc ccgaccatca tgagcaaaga gattcccacg 27720
ccttacatgt ggagctacca gccccagatg ggcctggccg ccggcgccgc ccaggactac 27780
tccacccgca tgaactggct cagtgccggg cccgcgatga tctcacgggt gaatgacatc 27840
cgcgcccacc gaaaccagat actcctagaa cagtcagcga tcaccaccac gccccgccat 27900
caccttaatc cgcgtaattg gcccgccgcc ctggtgtacc aggaaattcc ccagcccacg 27960
accgtactac ttccgcgaga cgcccaggcc gaagtccagc tgactaactc aggtgtccag 28020
ctggccggcg gcgccgccct gtgtcgtcac cgccccgctc agggtataaa gcggctggtg 28080
atccgaggca gaggcacaca gctcaacgac gaggtggtga gctcttcgct gggtctgcga 28140
cctgacggag tcttccaact cgccggatcg gggagatctt ccttcacgcc tcgtcaggcc 28200
gtcctgactt tggagagttc gtcctcgcag ccccgctcgg gcggcatcgg cactctccag 28260
ttcgtggagg agttcactcc ctcggtctac ttcaacccct tctccggctc ccccggccac 28320
tacccggacg agttcatccc gaacttcgac gccatcagcg agtcggtgga cggctacgat 28380
tgatcacccc cttatccagt gaaataaaga tcatattgat gatgatttaa ataaaaaaaa 28440
aaaaaaaata atcatttgat ttgaaataaa gatacaatca tattgatgat ttgagtttta 28500
aaaaaataaa gaatcactta cttgaaatct gataccaggt ctctgtccat gttttctgcc 28560
aacaccactt cactcccctc ttcccagctc tggtactgca ggccccggcg ggctgcaaac 28620
ttcctccaca cgctgaaggg gatgtcaaat tcctcctgtc cctcaatctt cattttatct 28680
tctatcagat gtccaaaaag cgcgtccggg tggatgatga cttcgacccc gtctacccct 28740
acgatgcaga caacgcaccg accgtgccct tcatcaaccc ccccttcgtc tcttcagatg 28800
gattccaaga gaagcccctg ggggtgctgt ccctgcgact ggccgacccc gtcaccacca 28860
agaacgggga aatcaccctc aagctgggag agggggtgga cctcgactcc tcgggaaaac 28920
tcatctccaa cacggccacc aaggccgccg cccctctcag tttttccaac aacaccattt 28980
cccttaacat ggatacccct ttttacacca aagatggaaa attaaccatg caggtcactg 29040
caccgctaaa gttagcaaac acagccatat tgaacacact agccatggca tatggaaatg 29100
gattagggct aagcaacaac gctcttaccg ttcagttaca atctccactc acctttaaca 29160
acagcaaggt tgctatcaac ctggaaaatg gaccactaaa cgtgacatca aatagactta 29220
gcattaattg caagaggggt gtctatgtca ccaccacagg agatgcaatc gaaaccaaca 29280
taagttggcc aaatgctatt aaatttatag gaaatgcaat gggtgtcaat attgatacaa 29340
acaaaggctt gcaatttggc accaccagca ctgtcacaga tgtgaccgat gctttcccca 29400
tacaagtcaa acttggggct ggtcttgcat ttgatagcac tggagctatt gttgcatgga 29460
acaaagagga tgacagtctc actttgtgga ctacaccaga tccatctcca aattgcaaga 29520
tagcatctga caaagatgct aaactcacac tttgcttgac aaagtgtgga agtcaaattc 29580
tgggtactgt gactgtattg gcagtgaata atggaagtct caacccaatc acaaacacag 29640
taagcactgc ccttgtatca cttaaattcg acgccaatgg agcactcttg gaaaaatcaa 29700
ccctaaacag agaatattgg aactacagac aaggagatct cattccaggt acaccatata 29760
cccatgcagt aggtttcatg cccaacaaga aagcctaccc taaaaacaca actgcagctt 29820
ccaaaagcca cattgtgggg gacgtctatc tagacgggga tgtagataag cccctatctc 29880
tcataatcac ttttaatgaa actgatgatg aatcatgtga ctattgcatg aactttcaat 29940
ggaaatgggg tgctgatcaa tacaaggaca aaacactcgc taccagctcc ttcaccttct 30000
cctacatcgc ccaagaatga acactgtatc ccaccctgca tgccaaccct tcccacccca 30060
ctctgtctgt ggaaaaaact ctgaaacaca aaataaaata aagttcaagt gttttattga 30120
ttcaacagtt ttacaggatt cgagcagtta tttttcctcc accctcccag gacatggaat 30180
acaccaccct ctccccccgc acagccttga acatctgaat gccattggtg atggacatgc 30240
ttttggtctc cacgttccac acagtttcag agcgagccag tctcgggtcg gtcagggaga 30300
tgaaaccctc cgggcactcc cgcatctgca cctcacagct caacagctga ggattgtcct 30360
cggtggtcgg gatcacggtt atctggaaga agcagaagag cggcggtggg aatcatagtc 30420
cgcgaacggg atcggccggt ggtgccgcat caggccccgc agcagtcgct gccgccgccg 30480
ctccgtcaag ctgctgctca gggggtccgg gtccagggac tccctcagca tgatgcccac 30540
ggccctcagc atcagtcgtc tggtgcggcg ggcgcagcag cgcatgcgga tctcgctcag 30600
gtcgctgcag tacgtgcaac acaggaccac caggttgttc aacagtccat agttcaacac 30660
gctccagccg aaactcatcg cgggaaggat gctacccacg tggccgtcgt accagatcct 30720
caggtaaatc aagtggcgcc ccctccagaa cacgctgccc acgtacatga tctccttggg 30780
catgtggcgg ttcaccacct cccggtacca catcaccctt tggttgaaca tgcagccccg 30840
gatgatcctg cggaaccaca gggccagcac cgccccgccc gccatgcagc gaagagaccc 30900
cgggtcccga caatggcaat ggaggaccca ccgctcgtac ccgtggatca tctgggagct 30960
gaacaagtct atgttggcac agcacaggca cacgctcatg catctcttca gcactctcag 31020
ctcctcgggg gtcaaaacca tatcccaggg cacggggaac tcttgcagga cagcgaaccc 31080
cgcagaacag ggcaatcctc gcacataact tacattgtgc atggacaggg tatcgcaatc 31140
aggcagcacc gggtgatcct ccaccagaga agcgcgggtc tcggtctcct cacagcgtgg 31200
taagggggcc ggccgatacg ggtgatggcg ggacgcggct gatcgtgttc gcgaccgtgt 31260
catgatgcag ttgctttcgg acattttcgt acttgctgta gcagaacctg gtccgggcgc 31320
tgcacaccga tcgccggcgg cggtctcggc gcttggaacg ctcggtgttg aaattgtaaa 31380
acagccactc tctcagaccg tgcagcagat ctagggcctc aggagtgatg aagatcccat 31440
catgcctgat ggctctgatc acatcgacca ccgtggaatg ggccagaccc agccagatga 31500
tgcaattttg ttgggtttcg gtgacggcgg gggagggaag aacaggaaga accatgatta 31560
acttttaatc caaacggtct cggagtactt caaaatgaag atcgcggaga tggcacctct 31620
cgcccccgct gtgttggtgg aaaataacag ccaggtcaaa ggtgatacgg ttctcgagat 31680
gttccacggt ggcttccagc aaagcctcca cgcgcacatc cagaaacaag acaatagcga 31740
aagcgggagg gttctctaat tcctcaatca tcatgttaca ctcctgcacc atccccagat 31800
aattttcatt tttccagcct tgaatgattc gaactagttc ctgaggtaaa tccaagccag 31860
tcatgataaa gagctcgcgc agagcgccct ccaccggcat tcttaagcac accctcataa 31920
ttccaagata ttctgctcct ggttcacctg cagcagattg acaagcggaa tatcaaaatc 31980
tctgccgcga tccctgagct cctccctcag caataactgt aagtactctt tcatatcctc 32040
tccgaaattt ttagccatag gaccaccagg aataagatta gggcaagcca cagtacagat 32100
aaaccgaagt cctccccagt gagcattgcc aaatgcaaga ctgctataag catgctggct 32160
agacccggtg atatcttcca gataactgga cagaaaatca cccaggcaat ttttaagaaa 32220
atcaacaaaa gaaaaatcct ccaggtgcac gtttagggcc tcgggaacaa cgatggagta 32280
aacgcaagcg gtgcgttcca gcatggttag ttagctgatc tgtaaaaaaa caaaaaataa 32340
aacattaaac catgctagcc tggcgaacag gtgggtaaat cgttctctcc agcaccaggc 32400
aggccacggg gtctccggcg cgaccctcgt aaaaattgtc gctatgattg aaaaccatca 32460
cagagagacg ttcccggtgg ccggcgtgaa tgattcgaca agatgaatac acccccggaa 32520
cattggcgtc cgcgagtgaa aaaaagcgcc cgaggaagca ataaggcact acaatgctca 32580
gtctcaagtc cagcaaagcg atgccatgcg gatgaagcac aaaattctca ggtgcgtaca 32640
aaatgtaatt actcccctcc tgcacaggca gcaaagcccc cgatccctcc aggtacacat 32700
acaaagcctc agcgtccata gcttaccgag cagcagcaca caacaggcgc aagagtcaga 32760
gaaaggctga gctctaacct gtccacccgc tctctgctca atatatagcc cagatctaca 32820
ctgacgtaaa ggccaaagtc taaaaatacc cgccaaataa tcacacacgc ccaacacacg 32880
cccagaaacc ggtgacacac tcagaaaaat acgcgcactt cctcaaacgc ccaaactgcc 32940
gtcatttccg ggttcccacg ctacgtcatc agaattcgac tttcaaattc cgtcgaccgt 33000
taaaaacgtc acccgccccg cccctaacgg tcgcccgtct ctcggccaat cacagccccg 33060
catccccaaa ttcaaacacc tcatttgcat attaacgcgc accaaaagtt tgaggtatat 33120
tattgatgat gttaattaat tggttc 33146
<210> 5
<211> 328
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttgcatttc tcagtcctaa acagggtaat gggctggggc tgaatcacat gaaggcaagg 60
tcagattttt attattatgc acatctagct tgaaaatttt ccattaagtc aattacagtg 120
aaaaacctca cctggtattg aatgcttgcc ttgtatgtct ggctattctg tgtttttatt 180
ttaaaattat aatatcaaaa tatttgtgtt ataaaatatt ctaactatgg aggccataaa 240
caagaagact aaagttctct cctttcagcc ttctgtacac atttcttctc aagcactggt 300
ttatgcatgt atactatatg caaaagtg 328
<210> 6
<211> 1775
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggagcggca gggatacaag tcctggcggg ggcacaaaaa cgccatcgtc tcctgcttgc 60
aagcctgcgg gggcaacatc tccttcaccc ggcgctacct gctcttccac cgcggggtga 120
acttcccccg caacatcttg cattactacc gtcacctcca cagcccctac tactgtttcc 180
aagaagaggc agaaacccag cagcagcagc agaaaaccag cgacagctag aaaatccaca 240
gcggcggcgg caggtggact gaggatcgcg gcgaacgagc cagcgcagac ccgggagctg 300
aggaaccgga tctttcccac cctctatgcc atcttccagc agagtcgggg gcaggagcag 360
gaactgaaag tcaagaaccg ttctctgcgc tcgctcaccc gcagttgtct gtatcacaag 420
agcgaagacc aacttcagcg cactctcgag gacgccgagg ctctcttcaa caagtactgc 480
gcgctcactc ttaaagagta gcccgcgccc gcccacacac ggaaaaaggc gggaattacg 540
tcaccacctg cgcccttcgc ccgaccatca tgagcaaaga gattcccacg ccttacatgt 600
ggagctacca gccccagatg ggcctggccg ccggcgccgc ccaggactac tccacccgca 660
tgaactggct cagtgccggg cccgcgatga tctcacgggt gaatgacatc cgcgcccacc 720
gaaaccagat actcctagaa cagtcagcga tcaccaccac gccccgccat caccttaatc 780
cgcgtaattg gcccgccgcc ctggtgtacc aggaaattcc ccagcccacg accgtactac 840
ttccgcgaga cgcccaggcc gaagtccagc tgactaactc aggtgtccag ctggccggcg 900
gcgccgccct gtgtcgtcac cgccccgctc agggtataaa gcggctggtg atccgaggca 960
gaggcacaca gctcaacgac gaggtggtga gctcttcgct gggtctgcga cctgacggag 1020
tcttccaact cgccggatcg gggagatctt ccttcacgcc tcgtcaggcc gtcctgactt 1080
tggagagttc gtcctcgcag ccccgctcgg gcggcatcgg cactctccag ttcgtggagg 1140
agttcactcc ctcggtctac ttcaacccct tctccggctc ccccggccac tacccggacg 1200
agttcatccc gaacttcgac gccatcagcg agtcggtgga cggctacgat tgatcacccc 1260
cttatccagt gaaataaaga tcatattgat gatgatttaa ataaaaaaaa aaaaaaaata 1320
atcatttgat ttgaaataaa gatacaatca tattgatgat ttgagtttta aaaaaataaa 1380
gaatcactta cttgaaatct gataccaggt ctctgtccat gttttctgcc aacaccactt 1440
cactcccctc ttcccagctc tggtactgca ggccccggcg ggctgcaaac ttcctccaca 1500
cgctgaaggg gatgtcaaat tcctcctgtc cctcaatctt cattttatct tctatcagat 1560
gtccaaaaag cgcgtccggg tggatgatga cttcgacccc gtctacccct acgatgcaga 1620
caacgcaccg accgtgccct tcatcaaccc ccccttcgtc tcttcagatg gattccaaga 1680
gaagcccctg ggggtgctgt ccctgcgact ggccgacccc gtcaccacca agaacgggga 1740
aatcaccctc aagctgggag agggggtgga cctcg 1775
<210> 7
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgaacacct cacagtggat aaccaaagac aatggaactg ataagacata cagttttgga 60
aatgctccag tcagaggatt ggacattaca gaagagggtc tccaaatagg aaccgatgag 120
tcagggggtg aaagcaagaa aatttttgca gacaaaacct atcagcctga acctcagctt 180
ggagatgagg aatggcatga tactattgga gctgaagaca agtatggagg cagagcgctt 240
aaacctgcca ccaacatgaa accctgctat gggtctttcg ccaagccaac taatgctaag 300
ggaggtcagg ctaaaagcag aaccaaggac gatggcacta ctgagcctga tattgacatg 360
gccttctttg acgatcgcag tcagcaagct agtttcagtc cagaacttgt tttgtatact 420
gagaatgtcg atctggacac cccggatacc cacattattt acaaacctgg cactgatgaa 480
acaagttctt ctttcaactt gggtcagcag tccatgccca acagacccaa ctacattggg 540
ttcagagaca actttatcgg tctcatgtac tacaacagca ctggcaatat gggtgtgctg 600
gctggacagg cctcccagct gaatgctgtg gtggactaa 639
<210> 8
<211> 3822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160
agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220
tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280
acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400
aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460
ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580
ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640
acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700
caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760
aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820
acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880
acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940
ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000
cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060
tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120
gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180
gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240
atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300
cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360
tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420
ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480
tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540
aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600
caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720
tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780
tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ataaccaaag acaatggaac tgataag 27
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagtcagggg gtgaaagcaa gaaa 24
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catgatacta ttggagctga agacaag 27
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaggacgatg gcactact 18
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agtcagcaag ctagt 15
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggcactgatg aaacaagt 18
<210> 15
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aatggtgtgg gctttacaga tacattccag ggaattaagg ttaaaactac caataacgga 60
acagcaaatg ctacagagtg ggaatctgat acctctgtca ataatgctaa tgag 114
<210> 16
<211> 1126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 60
ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 120
aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 180
ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 240
gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 300
cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 360
gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 420
aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 480
tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 540
ggaggtctat ataagcagag ctcgtcgacg agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg 600
gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg 660
cggccgggaa cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg taagtaccgc 720
ctatagagtc tataggccca cccccttggc ttcacttgag gtgtggcagg cttgagatct 780
ggccatacac ttgagtgaca atgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc 840
ccaggtccaa ctgcagccgg tacctaatac gactcactat acggatccct gatcactgca 900
gaattcgata tcaagcttat cgattgcggc cgctctcgag tctagctagt ctagactagc 960
tagaaagatc cgggaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 1020
tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 1080
tcatcaatgt atcttatcat gtctggatcg gtgatcaccg atcccg 1126
<210> 17
<211> 597
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcgacaatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg 60
ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt 120
cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg 180
agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc 240
ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc 300
tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc 360
ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc tttccatggc 420
tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg 480
ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc 540
gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctg 597

Claims (20)

1.一种黑猩猩腺病毒，其特征在于，所述的该病毒包括高变区HVR，其中，所述的高变区HVR包括如序列编号Seq ID NO.9、Seq ID NO.10、Seq ID NO.11、Seq ID NO.12、Seq IDNO.13、或者Seq ID NO.14所示的中的任意一条或多条所示的核苷酸序列，或者与以上序列具有同源性大于50％的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的黑猩猩腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒包括高变区HVR7-9的区域，所述高变区HVR7-9具有如序列表Seq ID NO.15所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1-2任一项所述的黑猩猩腺病毒，其特征在于，高变区HVR具有如序列表Seq ID NO.7所示的核苷酸序列，或者与该序列同源性大于50％的核苷酸序列。
4.如权利要求1-3任一项所述的黑猩猩腺病毒，其特征在于，所述的病毒还包括保守区域。
5.一种黑猩猩腺病毒，其特征在于，该病毒的保藏编号为CCTCC NO：V202120，编号为sAd-AY01的毒株。
6.如权利要求5所述的黑猩猩腺病毒，其特征在于，具有如序列表Seq ID NO.1所示的核苷酸序列。
7.一种复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，其特征在于，如权利要求1～6任一项所述的黑猩猩腺病毒，保守区域缺失基因。
8.如权利要求7所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，其特征在于，所述缺失的基因包括E1、E2A、E2B、E3、E4中的任意一种或多种。
9.如权利要求8所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，其特征在于，缺失E1和E3基因，具有如序列表Seq ID NO.4所示的核苷酸序列。
10.一种复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建穿梭质粒psAd-shuttle，线性化后与如权利要求1～6任一项所述的黑猩猩腺病毒基因进行同源重组，制备环状质粒psAd；
(2)敲除psAd的E1基因，获得E1基因缺失的黑猩猩腺病毒载体psAd△E1；
(3)敲除psAd△E1的E3基因，获得缺失E1和E3基因的黑猩猩腺病毒载体psAd△E1△E3。
11.如权利要求10所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述的穿梭质粒psAd-shuttle具有如序列表Seq ID NO.3所示的核苷酸序列；环状质粒psAd具有如序列表Seq ID NO.2所示的核苷酸序列。
12.如权利要求11所述的构建方法，其特征在于，步骤2)通过CRISPR/Cas9酶切psAd的E1基因，并插入含有PsiI酶切位点的HRPT序列，再经纯化和连接，获得psAd△E1；所述HRPT序列具有如序列表Seq ID NO.5所示的核苷酸序列。
13.如权利要求12所述的构建方法，其特征在于，步骤3)通过CRISPR/Cas9酶切psAd△E1，获得的产物与融合片段pVIII-U-exon进行无缝克隆，获得psAd△E1△E3；所述融合片段pVIII-U-exon具有如序列表Seq ID NO.6所示的核苷酸序列。
14.一种疫苗，其特征在于，在如权利要求7～9任一项所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的基因缺失区，包含目的基因。
15.如权利要求14所示的疫苗，其特征在于，所述基因缺失区包括E1、E2A、E2B、E3、E4中的任意一种或多种。
16.如权利要求15所示的疫苗，其特征在于，所述目的基因为病毒、细菌、肿瘤的基因或基因片段。
17.如权利要求16所示的疫苗，其特征在于，所述目的基因为新型冠状病毒S基因。
18.如权利要求17所示的疫苗，其特征在于，所述目的基因位于复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的E1区，所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体具有如序列表Seq ID NO.4所示的核苷酸序列。
19.一种黑猩猩腺病毒的滴度测定方法，其特征在于，通过由六邻体hexon超变区HVR基因片段制备的特异性抗体，检测超变区HVR抗原表位的变化，从而检测黑猩猩腺病毒的滴度，所述HVR基因具有如序列表Seq ID NO.7所示的核苷酸序列。
20.如权利要求19所述的滴度测定方法，其特征在于，所述黑猩猩腺病毒为如权利要求1～6任一项所述的黑猩猩病毒、或如权利要求7～9任一项所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体、或如权利要求14～18任一项所述的疫苗。
CN202110760033.6A 2020-07-06 2021-07-06 一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用 Active CN113897388B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2020106427453 2020-07-06
CN202010642745 2020-07-06
CN202010945335 2020-09-10
CN2020109453356 2020-09-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113897388A true CN113897388A (zh) 2022-01-07
CN113897388B CN113897388B (zh) 2024-05-31

Family

ID=

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591922A (zh) * 2022-03-30 2022-06-07 长睿生物技术(成都)有限公司 一种表达狂犬病毒g蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备方法
CN117143833A (zh) * 2023-08-21 2023-12-01 暨南大学 一种猴腺病毒毒株及其应用
CN117143833B (zh) * 2023-08-21 2024-06-04 暨南大学 一种猴腺病毒毒株及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112428A (zh) * 2009-02-02 2015-12-02 葛兰素史密斯克莱生物公司 猿腺病毒核酸和氨基酸序列，包含其的载体及其用途
CN107723298A (zh) * 2004-01-23 2018-02-23 Msd意大利有限公司 黑猩猩腺病毒疫苗载运体
WO2019076882A1 (en) * 2017-10-16 2019-04-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa ADENOVIRAL VECTORS COMPRISING TWO EXPRESSION CASSETTES ENCODING RSV ANTIGENIC PROTEINS OR FRAGMENTS THEREOF
CN111108192A (zh) * 2017-07-05 2020-05-05 Nouscom股份公司 非人类人猿腺病毒核酸序列和氨基酸序列、含有其的载体及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107723298A (zh) * 2004-01-23 2018-02-23 Msd意大利有限公司 黑猩猩腺病毒疫苗载运体
CN105112428A (zh) * 2009-02-02 2015-12-02 葛兰素史密斯克莱生物公司 猿腺病毒核酸和氨基酸序列，包含其的载体及其用途
CN111108192A (zh) * 2017-07-05 2020-05-05 Nouscom股份公司 非人类人猿腺病毒核酸序列和氨基酸序列、含有其的载体及其用途
WO2019076882A1 (en) * 2017-10-16 2019-04-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa ADENOVIRAL VECTORS COMPRISING TWO EXPRESSION CASSETTES ENCODING RSV ANTIGENIC PROTEINS OR FRAGMENTS THEREOF

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIM, Y.C.等: "COVID-19 Vaccines: Breaking Record Times To First-in-human Trials", 《NPJ VACCINES》 *
NCBI: "Expression vector pAPG1, complete sequence GenBank: KJ814975.1", 《NCBI》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591922A (zh) * 2022-03-30 2022-06-07 长睿生物技术(成都)有限公司 一种表达狂犬病毒g蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备方法
CN117143833A (zh) * 2023-08-21 2023-12-01 暨南大学 一种猴腺病毒毒株及其应用
CN117143833B (zh) * 2023-08-21 2024-06-04 暨南大学 一种猴腺病毒毒株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022007774A1 (zh) 2022-01-13
EP4177347A1 (en) 2023-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019204982B2 (en) Recombinant HCMV and RhCMV Vectors and Uses Thereof
RU2762854C2 (ru) Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности аденовирусов человекообразных обезьян, исключая человека, содержащие их векторы, и их применения
KR102535670B1 (ko) 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드
KR102205908B1 (ko) 아데노바이러스 벡터
CN1833027B (zh) 产生嵌合腺病毒的方法及这种嵌合腺病毒的用途
KR100987360B1 (ko) 원숭이 아데노바이러스 핵산과 아미노산 서열, 이를함유하는 벡터 및 사용방법
KR101761425B1 (ko) 시미안 아데노바이러스 핵산- 및 아미노산-서열, 이를 포함하는 벡터 및 이의 용도
RU2731342C1 (ru) Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)
US20040136963A1 (en) Simian adenovirus vectors and methods of use
CN101213204A (zh) 丙型肝炎病毒核酸疫苗
CN108135991A (zh) 新型腺病毒
KR101668163B1 (ko) Cmv용 백신으로서의 조건부 복제 시토메갈로바이러스
KR102403547B1 (ko) 외인성 항원을 포함하는 인간 시토메갈로바이러스
CN107574154A (zh) 猴(大猩猩)腺病毒或腺病毒载体及其使用方法
KR20150014505A (ko) 아과 e 원숭이 아데노바이러스 a1302, a1320, a1331 및 a1337 및 이것들의 사용
CN107937440A (zh) 猴腺病毒(大猩猩)或腺病毒载体及其使用方法
RU2731356C1 (ru) Экспрессионный вектор для создания иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)
CN110564768A (zh) 一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法
CN109797168A (zh) 一种重组腺病毒的表达载体SAd23-L
KR20200066349A (ko) 복제 가능 아데노바이러스 벡터
AU2003262790A1 (en) Adenovirus serotype 24 vectors, nucleic acids and virus produced thereby
US20040106194A1 (en) Methods for propagating adenovirus and virus produced thereby
KR20200083540A (ko) 시토메갈로바이러스의 안정한 제형
CN113897388B (zh) 一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用
CN113897388A (zh) 一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant