CN111108192A - 非人类人猿腺病毒核酸序列和氨基酸序列、含有其的载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在普通人群中具有高免疫原性并且不具有预先存在的免疫力的新型腺病毒株。预先存在的免疫力的缺乏是由于腺病毒衣壳蛋白六邻体中存在新的高变区。新型腺病毒株也具有提高的繁殖能力。本发明提供了这些新型腺病毒株的核苷酸和氨基酸序列、以及基于这些株的重组病毒、病毒样颗粒和载体。还提供了用于治疗或预防疾病的药物组合物和医学用途、以及利用新序列、重组病毒、病毒样颗粒和载体来制备腺病毒或病毒样颗粒的方法。

Description

非人类人猿腺病毒核酸序列和氨基酸序列、含有其的载体及 其用途

本发明涉及在普通人群中具有高免疫原性并且不具有预先存在的免疫力的新型腺病毒株。预先存在的免疫力的缺乏是由于腺病毒衣壳蛋白六邻体中存在新的高变区。新型腺病毒株也具有提高的繁殖能力。本发明提供了这些新型腺病毒株的核苷酸和氨基酸序列、以及基于这些株的重组病毒、病毒样颗粒和载体。还提供了用于治疗或预防疾病的药物组合物和医学用途、以及利用新序列、重组病毒、病毒样颗粒和载体来制备腺病毒或病毒样颗粒的方法。

发明背景

腺病毒(Ads)包含在两栖动物、禽类和哺乳动物中发现的双链DNA病毒大家族，其具有非包封的二十面体衣壳结构(Straus，Adenovirus infections in humans；TheAdenoviruses，451-498，1984；Hierholzer等人，J.Infect.Dis.，158：804-813，1988；Schnurr和Dondero，Intervirology.，36：79-83，1993；Jong等人，J.Clin.Microbiol.，37：3940-3945：1999)。与逆转录病毒相反，腺病毒可以转导几种哺乳动物物种的多种细胞类型，包括分裂细胞和非分裂细胞，而无需整合到宿主细胞的基因组中。

一般而言，腺病毒DNA通常非常稳定并保持游离型(例如染色体外)，除非发生转化或肿瘤发生。另外，腺病毒载体可以在明确定义的制备系统中以高产量繁殖，该制备系统易于适应临床等级组合物的药物规模制备。这些特征及其充分表征的分子遗传学使得重组腺病毒载体成为用作疫苗载体的理想候选者。重组腺病毒载体的制备可能依赖于包装细胞系的使用，该包装细胞系能够补充已经缺失或工程改造为无功能的腺病毒基因产物的功能。

目前，两种表征良好的人类C亚型腺病毒血清型(即，hAd2和hAd5)被广泛用作用于基因治疗的大多数腺病毒载体的病毒骨架来源。复制缺陷型人腺病毒载体也已作为疫苗载体进行了测试，以用于递送衍生自多种感染因子的多种免疫原。在实验动物(例如啮齿动物、犬类和非人灵长类动物)中进行的研究表明，携带有编码免疫原以及其他抗原的转基因的重组复制缺陷型人腺病毒载体引起针对该转基因产物的体液和细胞介导的免疫应答。一般而言，研究人员已经报道了在非人类实验系统中使用人腺病毒载体作为疫苗载体的成功案例，其中通过使用预计会引发免疫反应的大剂量的重组腺病毒载体的免疫接种方案；或通过采用顺序施用衍生自不同血清型但携带与加强免疫接种相同的转基因产物的腺病毒载体的免疫接种方案进行免疫(Mastrangeli等人，Human Gene Therapy，7：79-87(1996))。

源自物种C腺病毒的载体(例如Ad5、Ad6和ChAd63)具有最高的免疫原性(Colloca等人，Sci.Transl.Med.4(115)，2012)。特别地，已经开发了用于基因治疗和疫苗应用的基于5型人腺病毒(Ad5)的病毒载体。尽管基于Ad5的载体在动物模型中极为有效，但在临床试验中已证明人类对Ad5野生型病毒的预先存在的免疫力的存在降低了基因转导的效率(Moore JP等人Science.2008 May 9；320(5877)：753-5)。因此，普通人群的免疫力限制了基于Ad5的Ad载体疫苗的广泛应用。另一方面，稀有的人腺病毒的免疫原性低于Ad5的免疫原性(Colloca等人，Sci.Transl.Med.4(115)，2012)。基于非人腺病毒的载体在普通人群中不具有预先存在的免疫力(Farina等人，J.Virol.75(23)，11603-11613，2001)。

因此，需要具有高免疫原性和在人类中具有低的或不存在预先存在的免疫力的腺病毒载体。优选地，这些腺病毒载体就其复制而言具有高生产率。

发明内容

在第一方面，本发明提供了编码腺病毒六邻体蛋白的分离的多核苷酸，其包含：

A)(i)第一高变区HVR1，其包含根据SEQ ID NO：11的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：11具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在27位上不为A，优选为V，

(ii)第二高变区HVR2，其包含根据SEQ ID NO：12的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：12具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在1位上不为L，优选为I，

(iii)第三高变区HVR3，其包含根据SEQ ID NO：13的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：13具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在7位上不为V，优选为A，

(iv)第四高变区HVR4，其包含根据SEQ ID NO：14的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：14具有至少85％的序列同一性的其变体，

(v)第五高变区HVR5，其包含根据SEQ ID NO：15的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：15具有至少85％的序列同一性的其变体，

(vi)第六高变区HVR6，其包含根据SEQ ID NO：16的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：16具有至少85％的序列同一性的其变体，和

(vii)第七高变区HVR7，其包含根据SEQ ID NO：17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：17具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在1位上不为I，优选为V，

B)(i)第一高变区HVR1，其包含根据SEQ ID NO：18的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：18具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在8位上不为V，优选为E，在12位上不为D，优选为E，在13位上不为E，优选为D，和/或在14位上不为L，优选为V，

(ii)第二高变区HVR2，其包含根据SEQ ID NO：19的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：19具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在10位上不为D，优选为E，

(iii)第三高变区HVR3，其包含根据SEQ ID NO：20的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：20具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在6位上不为T，优选为A，

(iv)第四高变区HVR4，其包含根据SEQ ID NO：21的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：21具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在9位上不为L，优选为M，

(v)第五高变区HVR5，其包含根据SEQ ID NO：22的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：22具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在3位上不为T，优选为S，

(vi)第六高变区HVR6，其包含根据SEQ ID NO：23的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：23具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在9位上不为I，优选为V，和

(vii)第七高变区HVR7，其包含根据SEQ ID NO：24的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：24具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在8位上不为I，优选为V，

C)(i)第一高变区HVR1，其包含根据SEQ ID NO：25的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：25具有至少85％的序列同一性的其变体，

(ii)第二高变区HVR2，其包含根据SEQ ID NO：26的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：26具有至少85％的序列同一性的其变体，

(iii)第三高变区HVR3，其包含根据SEQ ID NO：27的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：27具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在7位上不为V，优选为A，

(iv)第四高变区HVR4，其包含根据SEQ ID NO：28的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：28具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在10位上不为E，优选为Q，

(v)第五高变区HVR5，其包含根据SEQ ID NO：29的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：29具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在3位上不为T，优选为S，

(vi)第六高变区HVR6，其包含根据SEQ ID NO：30的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：30具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在9位上不为I，优选为V，和

(vii)第七高变区HVR7，其包含根据SEQ ID NO：31的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：31具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在8位上不为I，优选为V和/或在11位上不为T，优选为S；或

D)(i)第一高变区HVR1，其包含根据SEQ ID NO：32的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：32具有至少85％的序列同一性的其变体，

(ii)第二高变区HVR2，其包含根据SEQ ID NO：33的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：33具有至少85％的序列同一性的其变体，

(iii)第三高变区HVR3，其包含根据SEQ ID NO：34的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：34具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在6位上不为T，优选为A，

(iv)第四高变区HVR4，其包含根据SEQ ID NO：35的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：35具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在6位上不为Q，优选为K和/或在10位上不为E，优选为Q；

(v)第五高变区HVR5，其包含根据SEQ ID NO：36的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：36具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在3位上不为T，优选为S，

(vi)第六高变区HVR6，其包含根据SEQ ID NO：37的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：37具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在1位上不为K，优选为T和/或在9位上不为I，优选为V，和

(vii)第七高变区HVR7，其包含根据SEQ ID NO：38的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：38具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在8位上不为I，优选为V；或

E)(i)第一高变区HVR1，其包含根据SEQ ID NO：39的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：39具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在27位上不为A，优选为V，

(ii)第二高变区HVR2，其包含根据SEQ ID NO：40的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：40具有至少85％的序列同一性的其变体，

(iii)第三高变区HVR3，其包含根据SEQ ID NO：41的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：41具有至少85％的序列同一性的其变体，

(iv)第四高变区HVR4，其包含根据SEQ ID NO：42的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：42具有至少85％的序列同一性的其变体，

(v)第五高变区HVR5，其包含根据SEQ ID NO：43的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：43具有至少85％的序列同一性的其变体，

(vi)第六高变区HVR6，其包含根据SEQ ID NO：44的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：44具有至少85％的序列同一性的其变体，和

(vii)第七高变区HVR7，其包含根据SEQ ID NO：45的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：45具有至少85％的序列同一性的其变体，其中在1位上不为I，优选为V。

在第二方面，本发明提供了编码腺病毒，优选无复制能力的腺病毒的分离的多核苷酸，其包含第一方面的多核苷酸。

在第三方面，本发明提供了由第一方面的分离的多核苷酸编码的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽。

在第四方面，本发明提供了由第一方面的分离的多核苷酸编码的腺病毒或分离的腺病毒，优选无复制能力的腺病毒，其包含根据第一方面的分离的多核苷酸和/或根据第三方面的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽。

在第五方面，本发明提供了由第一方面的分离的多核苷酸编码的病毒样颗粒。

在第六方面，本发明提供了包含第一方面的分离的多核苷酸的载体。

在第七方面，本发明提供了一种组合物，其包含(i)佐剂，(ii)第一方面或第二方面的分离的多核苷酸、第三方面的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽、第四方面的腺病毒、第五方面的病毒样颗粒或第六方面的载体，和任选的(iii)药学上可接受的赋形剂。

在第八方面，本发明提供了一种细胞，其包含第一方面或第二方面的分离的多核苷酸、第三方面的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽、第四方面的腺病毒、第五方面的病毒样颗粒、或第六方面的载体。

在第九方面，本发明提供了第一方面或第二方面的分离的多核苷酸、第三方面的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽、第四方面的腺病毒、第五方面的病毒样颗粒、或第六方面的载体和/或第七方面的组合物用于治疗或预防疾病的用途。

在第十方面，本发明涉及用于制备腺病毒或腺病毒样颗粒的体外方法，其包括以下步骤：

(i)在细胞中表达第一方面或第二方面的分离的多核苷酸，从而在细胞中装配腺病毒或腺病毒样颗粒，

(ii)从细胞或细胞周围的培养基中分离腺病毒或腺病毒样颗粒。

具体实施方式

在下面详细描述本发明之前，应理解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

优选地，本文使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)”(Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.和Klbl，H.编辑(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland)和如Axel Kleemann和JurgenEngel的“Pharmaceutical Substances：Syntheses，Patents，Applications”，ThiemeMedical Publishing，1999；Susan Budavari等人编辑的“Merck Index：An Encyclopediaof Chemicals，Drugs，and Biologicals”，CRC Press，1996和the United StatesPharmcopeial Convention，Inc.出版的the United States Pharmacopeia-25/NationalFormulary-20，Rockville Md.，2001中所述进行定义。

在整个本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另外需要，否则单词“包含”将被理解为意味着收录所陈述的特征、整数或步骤或特征、整数或步骤组但不排除任何其他特征、整数或步骤或特征、整数或步骤组。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其他一个或多于一个方面结合，除非明确的相反指示。特别地，指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其他一个或多于一个特征组合。

在本说明书的全文中引用了若干文献。无论是上文还是下文，本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)均通过引用全文并入本文。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于此类公开内容。

附图说明

图1：BAC GAd-GAG A/L/S穿梭载体的示意图。

图2：E1和E3缺失的GAdNou19 GAG(DE1E3)BAC质粒的示意图。

图3：E1和E3缺失的GAdNou20 GAG(DE1E3)BAC质粒的示意图。

图4：与带有相同表达盒的基准Ad5载体相比，在Hek293中GADNOU19和GADNOU20的生产率。

图5：编码GAG抗原的GADNOU19和GADNOU20载体的免疫原性。GADNOU19 GAG(DE1DE3)和GADNOU20 GAG(DE1DE3)载体的免疫效力通过IFN-γELISpot测定。用3x10^7和3x10^6vp的每种载体免疫接种3周后测量T细胞应答。显示了响应于用编码CD8+表位的免疫显性gag肽的刺激，每百万个脾细胞中产生IFNγ的T细胞的数量。

核苷酸和氨基酸序列

下表1提供了本文所指序列的概述(GADNOU+编号：分离的腺病毒株；*：编码氨基酸序列的GADNOU基因组的相应核苷酸序列，序列一致性根据所列顺序，例如针对SEQ ID NO：11，HVR1 GADNOU 20对应于SEQ ID NO：1的x-x，HVR1 GADNOU 21对应于SEQ ID NO：2的x-x，HVR1 GADNOU 25对应于SEQ ID NO：3的x-x)。GADNOU是发明人的病毒株名称。以下给出的六邻体、五邻体、纤维的基因组坐标范围(GADNOU基因组中的SEQ ID NO：46至54)不包括最终终止密码子，当使用坐标提及编码六邻体、五邻体或纤维的多核苷酸时，该终止密码子任选地包括/添加在本公开中。

表1：本申请中提及的SEQ ID NO

下表2a和2b提供了GADNOU基因组中CDS、RNA和ITR的基因组边界/坐标。它们适用于在这些表中列出的本文中对基因组元件的任何引用，并且优选地并入各个实施方案中。

表2a：GADNOU19、GADNOU20、GANOU21、GADNOU29、GADNOU30、GADNOU31的CDS、RNA和ITR的基因组边界。E3_Orf2^*表示以GTG作为初始密码子的推定开放阅读框。rc表示反向互补序列。通过剪接生成的产物由多个坐标对表示。

表2b：GADNOU25、GADNOU26、GANOU27、GADNOU28的CDS、RNA和ITR的基因组边界。E3_Orf2^*表示以GTG作为初始密码子的推定开放阅读框。rc表示反向互补序列。通过剪接生成的产物由多个坐标对表示。

本发明的方面及其特定实施方案

本发明涉及以上在发明内容中阐述的几个方面。这些方面包括下面描述的替代实施方案和优选实施方案。

在第一方面，本发明提供了编码如上文发明内容中所定义的腺病毒六邻体蛋白的分离的多核苷酸。

在一个优选的实施方案中，HVR变体与相应的SEQ ID NO具有至少90％，更优选至少95％的序列同一性。除了通过序列同一性的百分比水平来定义之外，可以将HVR变体定义为在相应的SEQ ID NO中具有一定数量的氨基酸突变。那么突变的数量如下：代替至少85％的序列同一性，在任何HVR1中至多4个突变，在任何HVR2中至多2个突变，在任何HVR3中至多1个突变，在任何HVR4中至多1个突变，在任何HVR5中至多2个突变，在任何HVR6中至多1个突变，在任何HVR7中至多3个突变；代替至少90％的序列同一性，在任何HVR1中至多2个突变，在任何HVR2中至多1个突变，在任何HVR3中至多1个突变，优选没有突变，在任何HVR4中至多1个突变，在任何HVR5中至多1个突变，在任何HVR6中至多1个突变，优选没有突变，在任何HVR7中至多2个突变；代替至少95％的序列同一性，在任何HVR1中至多1个突变，在任何HVR2中至多1个突变，优选没有突变，在任何HVR3中至多1个突变，优选没有突变，在任何HVR4中至多1个突变，优选没有突变，在任何HVR5中至多1个突变，优选没有突变，在任何HVR6中至多1个突变，优选没有突变，在任何HVR7中至多1个突变。

如本领域已知的，例如根据Bradley等人(J Virol.，2012 Jan；86(2)：1267-72)，腺病毒中和抗体靶向六邻体高变区，并通过置换具有血清流行的腺病毒的HVR区来使腺病毒逃避免疫宿主的免疫系统。因此，尽管上述HVR可以与下面定义的各个六邻体蛋白一起使用，但是它们具有与那些六邻体蛋白以及下面的五邻体和纤维蛋白无关的效用，即通过在具有其他六邻体、五邻体和/或纤维蛋白的不同腺病毒中替换六邻体HVR。

在一个优选的实施方案中，六邻体蛋白

A)包含根据SEQ ID NO：46的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：46具有至少85％的序列同一性的其变体，

B)包含根据SEQ ID NO：47的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：47具有至少85％的序列同一性的其变体，

C)包含根据SEQ ID NO：48的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：48具有至少85％的序列同一性的其变体，

D)包含根据SEQ ID NO：49的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：49具有至少85％的序列同一性的其变体，和/或

E)包含根据SEQ ID NO：50的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：50具有至少85％的序列同一性的其变体。

在一个优选的实施方案中，六邻体变体与相应的SEQ ID NO具有至少90％，优选至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。除了通过序列同一性的百分比水平来定义之外，可以将六邻体变体定义为在相应的SEQ ID NO中具有一定数量的氨基酸突变。突变的数量如下：代替至少85％的序列同一性，在任何六邻体中至多143个突变；代替至少90％的序列同一性，在任何六邻体中至多95个突变；代替至少95％的序列同一性，在任何六邻体中至多47个突变；代替至少96％的序列同一性，在任何六邻体中至多38个突变；代替至少97％的序列同一性，在任何六邻体中至多28个突变；代替至少98％的序列同一性，在任何六邻体中至多19个突变；代替至少99％的序列同一性，在任何六邻体中至多9个突变。应当理解的是，与以上各个HVR的定义相比，六邻体变体没有更少的序列同一性，也不具有更多的突变。

在一个实施方案中，第一方面的分离的多核苷酸还编码腺病毒五邻体蛋白，其包含根据SEQ ID NO：51或52的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：51或52具有至少85％的序列同一性的其变体。在一个优选的实施方案中，五邻体变体与相应的SEQ ID NO具有至少90％，优选至少95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。除了通过序列同一性的百分比水平来定义之外，可以将五邻体变体定义为在相应的SEQ ID NO中具有一定数量的氨基酸突变。突变的数量如下：代替至少85％的序列同一性，在任何五邻体中至多97个突变；代替至少90％的序列同一性，在任何五邻体中至多65个突变；代替至少95％的序列同一性，在任何五邻体中至多32个突变；代替至少96％的序列同一性，在任何五邻体中至多26个突变；代替至少97％的序列同一性，在任何五邻体中至多19个突变；代替至少98％的序列同一性，在任何五邻体中至多13个突变；代替至少99％的序列同一性，在任何五邻体中至多6个突变。

优选地，SEQ ID NO：51和52的五邻体变体在289位分别不为D，优选为G，并且在341位不为D，优选为N。更优选地，SEQ ID NO：52的变体在442位也不为A，更优选为T。

在另一个实施方案中，第一方面的分离的多核苷酸还(即，毗邻六邻体并且可能是五邻体蛋白)编码腺病毒纤维蛋白，其包含根据SEQ ID NO：53或54的氨基酸序列，或与SEQID NO：53或54具有至少85％的序列同一性的其变体。在一个优选的实施方案中，纤维变体与相应的SEQ ID NO具有至少90％，优选至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。除了通过序列同一性的百分比水平来定义之外，可以将纤维变体定义为在相应的SEQ IDNO中具有一定数量的氨基酸突变。突变的数量如下：代替至少85％的序列同一性，在任何纤维中至多89个突变；代替至少90％的序列同一性，在任何纤维中至多59个突变；代替至少95％的序列同一性，在任何纤维中至多29个突变；代替至少96％的序列同一性，在任何纤维中至多23个突变；代替至少97％的序列同一性，在任何纤维中至多17个突变；代替至少98％的序列同一性，在任何纤维中至多11个突变；代替至少99％的序列同一性，在任何纤维中至多5个突变。

优选地，SEQ ID NO：53的纤维变体在181位不为A，优选为P，在474位不为V，优选为I，和/或在4位和5位之间没有S的插入，并且优选地没有氨基酸插入。优选地，SEQ ID NO：54的纤维变体在90位不为T，优选为I，和/或在7位为S(优选在4位至7位的每个为S)。

在另一个实施方案中，第一方面的分离的多核苷酸还(即，毗邻六邻体并且可能是五邻体和/或纤维蛋白)编码VA RNA II非编码RNA，其包含根据SEQ ID NO：57的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：57具有至少85％的序列同一性的其变体。替代地或另外地，其可以编码包含根据SEQ ID NO：55或56的核苷酸序列的VA RNA I非编码RNA，或分别与SEQ ID NO：55或56具有至少85％的序列同一性的其变体。在一个优选的实施方案中，VA RNA变体与相应的SEQ ID NO具有至少90％，优选至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。除了通过序列同一性的百分比水平来定义之外，可以将VA RNA变体定义为在相应的SEQ ID NO中具有一定数量的核苷酸突变。突变的数量如下：代替至少85％的序列同一性，在VA RNA I中至多25个突变且在VA RNA II中至多26个突变；代替至少90％的序列同一性，在VA RNA I中至多16个突变且在VA RNA II中至多17个突变；代替至少95％的序列同一性，在任何VA RNA中至多8个突变；代替至少96％的序列同一性，在任何VA RNA中至多6个突变；代替至少97％的序列同一性，在任何VA RNA中至多5个突变；代替至少98％的序列同一性，在任何VA RNA中至多3个突变；代替至少99％的序列同一性，在任何VA RNA中至多1个突变。

优选地，SEQ ID NO：57的VA RNA II变体(a)在79位不为C和/或在80位不为A，优选在79位为T和/或在80位为G，且(b)在81位不为A，优选在81位为G。SEQ ID NO：55的VA RNA I变体优选在80位不为G，优选在80位为A。

如实施例5所示，根据本发明的VA RNA导致改进的腺病毒或腺病毒样颗粒产生。

优选的是，第一方面的多核苷酸还包含其他腺病毒基因和核苷酸片段，其以SEQID NO：1至10为参照，与腺病毒基因组中的六邻体、五邻体和/或纤维基因相邻。特别优选的是，多核苷酸还包含将多核苷酸包装成腺病毒颗粒所需的序列。

通常，优选地，第一方面的分离的多核苷酸包含以下至少一种：

(a)腺病毒5′末端，优选腺病毒5′反向末端重复序列；

(b)腺病毒E1a区或其片段，所述片段选自13S、12S和9S区；

(c)腺病毒E1b区或其片段，所述片段选自小T、大T和IX区；

(d)腺病毒VA RNA区；或其片段，所述片段选自VA RNA I和VA RNA II区；

(e)腺病毒E2b区；或其片段，所述片段选自小pTP、聚合酶和IVa2区；

(f)腺病毒L1区或其片段，所述片段编码选自28.1kD蛋白、聚合酶、agnoprotein、52/55kDa蛋白和IIIa蛋白的腺病毒蛋白；

(g)腺病毒L2区或其片段，所述片段编码选自上述定义的五邻体蛋白、VII、V和X蛋白的腺病毒蛋白；

(h)腺病毒L3区或其片段，所述片段编码选自VI蛋白、如上定义的六邻体蛋白和内切蛋白酶的腺病毒蛋白；

(i)腺病毒E2a区或其片段，所述片段编码由DBP蛋白组成的腺病毒蛋白；

(j)腺病毒L4区或其片段，所述片段编码选自100kD蛋白、22kD同源物、33kD同源物和蛋白VIII的腺病毒蛋白质；

(k)腺病毒E3区或其片段，所述片段选自E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8和E3 ORF9；

(l)腺病毒L5区或其片段，所述片段编码如上定义的纤维蛋白；

(m)腺病毒E4区或其片段，所述片段选自E4 ORF6/7、E4 ORF6、E4 ORF5、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2和E4 ORF1；和/或

(n)腺病毒3′末端，优选腺病毒3′反向末端重复序列。

这些元件可以来自与根据表1的第一方面的多核苷酸的HVR和/或六邻体相同的腺病毒(即，来自相同的GADNOU)，或来自不同的腺病毒，特别是来自不同物种中的一个，例如人腺病毒，以形成嵌合腺病毒。

在前述多核苷酸的一些实施方案中，可能希望多核苷酸不包含如上所述的一个或多于一个基因组区域(如(a)至(m)中所述，例如区域E3和/或E4)和/或包含腺病毒基因，该腺病毒基因包含使至少一个基因丧失功能的缺失和/或突变。在这些优选的实施方案中，合适的腺病毒区域被修饰为不包括上述区域/基因，或者使所选区域/基因丧失功能。使它们丧失功能的一种可能性是将一种或多于一种人工终止密码子(例如TAA)引入这些基因的开放阅读框中。使病毒复制缺陷的方法是本领域众所周知的(参见例如Brody等人，1994 AnnNY Acad Sci.，716：90-101)。缺失可以留出空间以插入转基因，优选在表达盒例如本文所述的小基因盒内插入转基因。此外，如本领域众所周知的，缺失可用于产生腺病毒载体，该腺病毒载体在不使用包装细胞系或辅助病毒的情况下不能复制。因此，包含如上所述多核苷酸的最终重组腺病毒可以为例如基因治疗或疫苗接种提供更安全的重组腺病毒，该多核苷酸包含一种或多于一种特定基因/区域缺失或功能丧失的突变。

尽管多核苷酸可能不包含本文概述的至少一个基因组区域/基因(例如区域E3和/或E4)，特别是E1A、E1B、E2A、E2B、E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF6/7、E4 ORF6、E4 ORF5、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2和/或E4 ORF1，优选E1A、E1B、E2A、E2B、E3和/或E4，和/或包含腺病毒基因，该腺病毒基因包含使至少一个基因丧失功能的缺失和/或突变，但希望保留完整的E1a和/或E1b区域。这种完整的E1区可以位于其在腺病毒基因组中的天然位置，或者位于天然腺病毒基因组中的缺失位点(例如，在E3区)。

在一个优选的实施方案中，第一方面的分离的多核苷酸还编码一种或多于一种，优选所有以下腺病毒蛋白：蛋白VI、蛋白VIII、蛋白IX、蛋白IIIa和蛋白IVa2。

腺病毒领域的普通技术人员非常了解如何确定编码上述腺病毒蛋白的开放阅读框。他还了解腺病毒基因组的结构，并且可以在不产生过多负担的情况下将本文概述的单个腺病毒区域和ORF定位到任何腺病毒基因组。

在另一个实施方案中，第一方面的分离的多核苷酸还编码一种或多于一种异源蛋白质或其片段。一种或多于一种异源蛋白质或其片段优选为非腺病毒蛋白质或其片段。在一个优选的实施方案中，一种或多于一种非腺病毒蛋白或其片段是一种或多于一种抗原蛋白或其片段。优选地，一种或多于一种异源蛋白质或其片段是一种或多于一种表达盒的一部分。编码异源蛋白质的序列，优选包含这种编码异源蛋白质的序列的表达盒，可以插入例如本文定义的腺病毒基因组的缺失区域。示例性的异源蛋白是根据SEQ ID NO：74的多肽或与SEQ ID NO：74具有至少85％序列同一性的其变体。

在第二方面，本发明提供了编码腺病毒的分离的多核苷酸，其包含第一方面的多核苷酸，优选包含根据SEQ ID NO：1至10中任一项的腺病毒基因组，或分别与SEQ ID NO：1至10具有至少85％的序列同一性的其变体。

在一个优选的实施方案中，其编码无复制能力的腺病毒，优选包含SEQ ID NO：1至10中任一项的腺病毒基因组，其缺少基因组区域/基因E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4中的一个或多于一个。

最优选地，其编码重组腺病毒，优选包含根据SEQ ID NO：1至10中任一项的腺病毒基因组或分别与SEQ ID NO：1至10具有至少85％的序列同一性的其变体，优选向其中插入一种或多于一种异源蛋白质或其片段(载体腺病毒)。优选地，通过替换基因组区域/基因E1A、E1B、E2A、E2B、E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3ORF8、E3 ORF9、E4 ORF6/7、E4 ORF6、E4 ORF5、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2和E4 ORF1、更优选E1、E3和/或E4中的一个或多于一个，插入一个或多于一个异源蛋白质或其片段。异源蛋白质或其片段优选作为表达盒的一部分插入。任选地，载体腺病毒也是如本文所述无复制能力的，即，缺少基因组区域/基因E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4中的一个或多于一个。

在一个示例性的实施方案中，本发明提供了编码腺病毒的分离的多核苷酸，其包含根据SEQ ID NO：72或73的多核苷酸，或分别与SEQ ID NO：72或73具有至少85％的序列同一性的其变体。

在一个优选的实施方案中，代替与相应的SEQ ID NO：1具有至少85％，至少90％，优选至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的序列同一性，腺病毒基因组变体与SEQ ID NO：2具有至少90％，优选至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的序列同一性，与SEQ ID NO：3具有至少90％，优选至少95％、96％、97％、98％、99.5％或99％的序列同一性，与相应的SEQ ID NO：4具有至少为90％，优选至少为95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的序列同一性，与相应的SEQ ID NO：5具有至少为90％，优选至少为95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的序列同一性，与相应的SEQ ID NO：6具有至少为90％，优选至少为95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的序列同一性，与相应的SEQ ID NO：7具有至少90％，优选至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的序列同一性，与相应的SEQ ID NO：8具有至少90％，优选至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的序列同一性，与相应的SEQ ID NO：9具有至少90％，优选至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的序列同一性，或与相应的SEQ ID NO：10具有至少90％，优选至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的序列同一性(在每种情况下都考虑到如上定义的缺失)。

在一个实施方案中，第二方面的分离的多核苷酸编码重组腺病毒，其中重组腺病毒的至少一个腺病毒基因组区域衍生自不包含如上定义的六邻体HVR或六邻体蛋白的腺病毒(嵌合腺病毒)。优选地，嵌合腺病毒主要或优选仅对于六邻体HVR或六邻体蛋白以及任选地还与本文定义的五邻体和/或纤维蛋白嵌合。换句话说，多核苷酸编码如上定义的六邻体HVR或六邻体蛋白，并且任选地还编码如上定义的五邻体和/或纤维蛋白，但是一个或多于一个的，优选所有的其他基因组区域衍生自不同的腺病毒，尤其是与根据SEQ ID NO：1至10的腺病毒不同的腺病毒。不同的腺病毒优选是天然存在于不同宿主中的一种，更优选人腺病毒。该多核苷酸优选还编码一种或多于一种如上定义的异源非腺病毒蛋白或其片段。因此，将一种或多于一种异源非腺病毒基因插入嵌合腺病毒的腺病毒基因组中。因此，除了编码上述定义的六邻体HVR或六邻体蛋白的DNA以及任选地编码上述定义的五邻体和/或纤维蛋白的DNA之外，嵌合腺病毒的腺病毒基因组还衍生自非类人猿腺病毒，例如人腺病毒，优选非类人猿腺病毒载体，例如人腺病毒载体。

通常优选腺病毒是无复制能力的。为此，优选腺病毒缺少基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4中的一个或多于一个，或包含其中使基因组区域或由其编码的表达产物丧失功能的缺失和/或突变。

在一个特别优选的实施方案中，第一方面或第二方面的分离的多核苷酸，在本文所述的所有其变体中，可具有功能受损的IVa2基因，优选其中的缺失或无效突变。该基因涉及病毒DNA的包装，并且其损伤导致病毒样颗粒的产生。在该实施方案中，第一方面或第二方面的分离的多核苷酸优选编码一个或多于一个非腺病毒B细胞表位和/或T细胞表位。

在第三方面，本发明提供了至少一种由第一方面或第二方面的多核苷酸编码的分离的腺病毒衣壳多肽。至少一种分离的腺病毒衣壳多肽至少包含具有如上定义的HVR的六邻体，优选如上定义的六邻体蛋白，以及任选地还包含如上定义的五邻体和/或纤维蛋白。

可通过在细胞中表达获得至少一种分离的腺病毒衣壳多肽。可以使用标准技术任选地纯化表达的多肽。例如，可以在进行沉淀和层析步骤之前，通过机械裂解或渗压震扰来裂解细胞，其性质和顺序将取决于待回收的特定重组材料。替代地，如蛋白质表达领域中已知的，可以从其中已经培养了重组细胞的培养基中分泌并回收表达的多肽。

在第四方面，本发明提供了一种腺病毒(在本文中也称为腺病毒载体或腺病毒的载体)，其包含第一方面或第二方面的分离的多核苷酸和/或第三方面的腺病毒衣壳多肽。因此，腺病毒可以是，例如由SEQ ID NO：1至10中的任一个编码的腺病毒或重组腺病毒，例如如上定义的载体或嵌合腺病毒。优选地，腺病毒是分离的腺病毒。

在一个示例性的实施方案中，本发明提供了一种腺病毒，其包含根据SEQ ID NO：72或73的多核苷酸或分别与SEQ ID NO：72或73具有至少85％序列同一性的其变体。

腺病毒可以包含或可以不包含第一方面或第二方面的多核苷酸。如果该多核苷酸不包含在腺病毒中，则优选以反式提供(即，通过不是腺病毒基因组的遗传元件引入腺病毒)。其通常由辅助构建体(例如质粒或病毒)或由包装宿主细胞(本文所述的互补细胞)中的基因组或辅助构建体提供。还优选地，以反式提供的多核苷酸不包含在引入腺病毒的基因组中，包括这些多核苷酸的同源物或其他序列变体。例如，如果以反式提供的多核苷酸包含六邻体、五邻体和/或纤维基因，则引入腺病毒的基因组不包含分别编码六邻体、五邻体和/或纤维蛋白的任何多核苷酸。最优选地，以反式提供的多核苷酸编码如第三方面所定义的至少一种腺病毒衣壳多肽，即具有如第一方面或第二方面所定义的HVR的六邻体，优选如第一方面或第二方面所定义的六邻体蛋白，并且任选地还具有第一方面或第二方面定义的五邻体和/或纤维蛋白。

在构建用于将基因递送至宿主例如人或其他哺乳动物细胞的腺病毒载体时，可以使用一系列腺病毒核酸序列。例如，可以从形成重组病毒的一部分的腺病毒序列中消除全部或部分腺病毒延迟早期基因E3。认为类人猿E3的功能与重组病毒颗粒的功能和产生无关。在一些实施方案中，还可以构建具有至少E4基因的ORF6区域缺失的腺病毒载体，更理想的是整个E4区域缺失，因为该区域的功能丰余。本发明的另一个载体在延迟早期基因E2a中含有一个缺失。缺失也可以在类人猿腺病毒基因组的任何晚期基因L1至L5中进行。类似地，中间基因IX和IVa2中的缺失对于某些目的可能是有用的。其他缺失可以在其他结构或非结构腺病毒基因中进行。以上讨论的缺失可以单独使用，即用于本发明的腺病毒序列可以仅在单个区域中包含缺失。或者，可以以任何组合使用有效破坏其生物活性的整个基因或其部分的缺失。例如，腺病毒序列可具有E1和E4区或E1、E2a和E3区，或E1和E3区，或E1、E2a和E4区的缺失，同时具有或不具有E3的缺失，等等。此类缺失可与其他腺病毒基因突变例如温度敏感突变结合使用，以实现所需的结果。

缺少任何必需腺病毒序列(例如，选自E1a、E1b、E2a、E2b、E4 ORF6、L1或L4的区域)的腺病毒载体可在缺少腺病毒基因产物的情况下进行培养，而这些产物是腺病毒颗粒病毒感染性和繁殖需要的。这些辅助功能可以通过在一种或多于一种辅助构建体(例如质粒或病毒)或包装宿主细胞(如本文所述的互补细胞)存在下培养腺病毒载体来提供。参见，例如，描述的用于制备“最小”人腺病毒载体的技术(WO96/13597)。

有用的辅助构建体包含选择的腺病毒基因序列，该腺病毒基因序列与载体和转染载体的细胞缺失和/或未表达的各个基因互补。在一个实施方案中，辅助构建体是复制缺陷的，并且包含必需的和任选的其他腺病毒基因。

辅助构建体也可以形成为聚阳离子缀合物，如Wu等人J.Biol.Chem.，264：16985-16987(1989)；K.J.Fisher和J.M.Wilson，Biochem.J.，299：49(April 1，1994)中描述的。辅助构建体可任选地包含报告基因。许多这样的报告基因是本领域已知的。在与在腺病毒载体上的转基因不同的辅助构建体上的报告基因的存在使得腺病毒和辅助构建体都可以被独立地监测。该第二报告基因可用于促进纯化后所得重组腺病毒和辅助构建体之间的分离。优选的辅助构建体是辅助病毒。

为了产生在本文优选实施方案的上下文中描述的任何基因中缺失的重组腺病毒(Ad)，如果缺失的基因区的功能对于病毒的复制和感染性是必不可少的，则优选通过辅助构建体或细胞，即互补细胞或包装细胞将缺失的基因区的功能提供给重组病毒。在许多情况下，表达人E1的构建体/细胞可以用于对用于产生重组腺病毒的载体进行反式互补。这是特别有利的，因为由于本发明的多核苷酸序列与当前可得的包装构建体/细胞中发现的人腺病毒E1序列之间的多样性，使用当前包含人E1的构建体/细胞将阻止复制和生产过程中产生具有复制能力的腺病毒。然而，在某些情况下，将需要利用表达E1基因产物的构建体/细胞来生产缺失E1的重组腺病毒。

如果需要的话，可以利用本文提供的序列来产生辅助构建体/细胞或细胞系，其在用于表达的启动子的转录控制下在选定的亲代细胞系例如HeLa细胞中至少表达来自根据SEQ ID NO：1至10中任一项的腺病毒的腺病毒E1基因。诱导型或组成型启动子可用于该目的。例如在本文描述的实施例中提供了启动子的实例。这样的表达E1的细胞可用于产生重组腺病毒E1缺失的载体。另外地或可替代地，本发明提供了表达一种或多于一种腺病毒基因产物，例如E1a、E1b、E2a和/或E4 ORF6，优选Ad5 E4 ORF6的构建体/细胞，其可以使用基本相同的程序来构建，以用于重组腺病毒载体的产生。这样的构建体/细胞可用于对编码那些产物的必需基因中缺失的腺病毒载体进行反向互补，或提供包装依赖于辅助物的病毒(例如，腺相关病毒)所需的辅助功能。

通常，当通过转染来递送腺病毒载体时，载体以约0.1μg至约100μgDNA，优选约10μg至约50μg DNA的量递送至约1×10⁴个细胞至约1×10³个细胞，和优选约10⁵个细胞。然而，可以考虑例如选择的载体、递送方法和选择的宿主细胞等因素来调节载体DNA相对于宿主细胞的量。可以通过本领域已知的或本文公开的任何方式将载体引入宿主细胞，包括转染和感染，例如使用CaPO₄转染或电穿孔。

为了构建和组装所需的重组腺病毒，在一个实施例中，腺病毒载体可以在辅助构建体的存在下体外转染到包装细胞系中，从而允许在辅助和腺病毒载体序列之间发生同源重组，这允许载体中的腺病毒转基因序列被复制和包装到病毒体衣壳中，从而产生本领域众所周知的重组病毒载体颗粒。本发明的重组腺病毒可用于例如将选择的转基因转移至选择的宿主细胞中。

在一个优选的实施方案中，第四方面的腺病毒在少于5％的人类对象中具有血清阳性，并且优选在人类对象中没有血清阳性，最优选在先前未与非人类人猿腺病毒接触的人类对象中没有血清阳性，更优选没有与一种或多于一种腺病毒接触，特别是根据SEQ IDNO：1至10的所有腺病毒接触。在这种情况下，人类对象优选是选自欧洲人、非洲土著人、亚洲人、美洲土著人和大洋洲土著人的族裔群体。鉴定人类对象的种族起源的方法包括在本领域中(参见例如WO2003/102236)。

在重组腺病毒的另一个优选实施方案中，腺病毒DNA能够进入哺乳动物靶细胞，即具有感染性。本发明的感染性重组腺病毒可以用作疫苗，也可以用于基因治疗，如本文所述。因此，在另一个实施方案中，优选重组腺病毒包含用于递送至靶细胞的分子。优选地，靶细胞是哺乳动物细胞，例如非人类人猿细胞、啮齿动物细胞或人细胞。例如，用于递送至靶细胞的分子可以是编码本文定义的异源蛋白质的多核苷酸(即异源基因)，优选在表达盒内的多核苷酸。将表达盒引入腺病毒基因组的方法是本领域众所周知的。在一个实施例中，可以通过用所述表达盒替换选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的腺病毒基因组区域来产生包含编码例如异源基因的表达盒的本发明重组腺病毒。本发明的腺病毒的基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4可以通过与已知和注释的例如来自人Ad5的腺病毒基因组进行比对来轻松鉴定(参见：Birgitt

和Thomas Dobner，Oncogene(2001)20，p.7847-7854；以及Andrew J.Davison等人，“Genetic content and evolution of adenoviruses”，Journalof General Virology(2003)，84，p.2895-2908)。

递送至靶细胞的分子优选是异源多核苷酸，但也可以是多肽或小的化学化合物，优选具有治疗或诊断活性。在一个特别优选的实施方案中，用于递送至靶细胞的分子是异源多核苷酸，其包含腺病毒5′反向末端重复序列(ITR)和3′ITR。对于本领域技术人员明显的是，必须选择分子的分子大小，以使得当产生重组腺病毒时，例如在包装细胞中，衣壳可以在分子周围形成并包装分子。因此，优选地，异源基因是可以具有例如至多7000个和至多8000个碱基对的微小基因。

在第五方面，本发明提供了由第一方面或第二方面的多核苷酸编码的病毒样颗粒(VLP)。因此，VLP包含至少一种根据第三方面的分离的腺病毒衣壳多肽。在一个实施方案中，编码VLP的多核苷酸具有缺失的Iva2基因或在Iva2基因中具有无效突变。

根据以下VLP的定义，第五方面的VLP基本上不包含病毒基因组DNA。包括腺病毒VLP在内的VLP已用于疫苗接种、基因治疗或例如抗肿瘤药物的直接递送(Chroboczek等人，ACTA ABP BIOCHIMICA POLONICA，第61卷，第3/2014号)。因此，第五方面的VLP可包含一种或多于一种非腺病毒B细胞和/或非腺病毒T细胞表位、用于基因治疗的一种或多于一种非腺病毒基因和/或一种或多于一种药剂，例如抗癌药。在一个实施方案中，VLP引入，优选呈现一种或多于一种非腺病毒B细胞表位和/或引入一种或多于一种非腺病毒T细胞表位。

在第六方面，本发明提供了包含第一方面或第二方面的多核苷酸的载体。在一个优选的实施方案中，载体是质粒载体，例如表达载体。质粒载体可有利地用于产生如本文所述的重组腺病毒。由于提供了本发明的新颖的六邻体、五邻体和纤维蛋白以及VA RNA的序列信息，所述重组腺病毒可通过例如构建由第一方面或第二方面的多核苷酸和任何其他腺病毒基因组区编码的重组腺病毒来获得。构建重组腺病毒的方法是本领域众所周知的。用于制备重组腺病毒的有用技术，例如，在Graham和Prevec，1991 In Methods in MolecularBiology：Gene Transfer and Expression Protocols，(Ed.Murray，EJ.)，p.109；和Hitt等人，1997″Human Adenovirus Vectors for Gene Transfer into Mammalian Cells″Advances in Pharmacology 40：137-206中进行了综述。其他方法在WO 2006/086284中描述。

为了表达第一方面或第二方面的多核苷酸，可以将所述多核苷酸亚克隆到包含强启动子的表达载体中，以指导转录，优选地使用表达盒。合适的细菌启动子是本领域众所周知的，例如大肠杆菌、芽孢杆菌和沙门氏菌，并且用于这种表达系统的试剂盒是可商购获得的。类似的，用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统在本领域中是众所周知的，并且也是可商购获得的。有关表达盒的更多详细信息，请参见下文。

用于将遗传信息运输到细胞中的特定表达载体不是特别关键的。可以使用用于在真核或原核细胞中表达的任何常规载体。标准细菌表达载体包括质粒例如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D，以及融合表达系统例如GST和LacZ，但是本领域技术人员已知更多可以有效使用的表达系统。含有来自真核病毒的调节元件的表达载体通常用于真核表达载体，例如SV40载体、乳头瘤病毒载体和衍生自EB病毒的载体。其他示例性的真核载体包括pMSG、pAV009/A.sup.+、pMTO10/A.sup.+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE、pcDNA3.1、pIRES和任何其他允许在例如HCMV立即-早期启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他在真核细胞中显示出有效表达的启动子的指导下表达蛋白质的载体。一些表达系统具有提供基因扩增的标记，例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。替代地，不涉及基因扩增的高产量表达系统也是合适的。也可以包含在表达载体中的元件包括在大肠杆菌中起作用的复制子、编码抗药性以允许选择携带重组质粒的细菌的基因、以及质粒非必需区域中允许插入真核序列的独特限制性位点。选择的具体抗药性基因不是关键的——本领域已知的许多抗药性基因中的任一种都是合适的。任选地选择原核序列，使得它们在必要时不干扰真核细胞中DNA的复制。

在第七方面，本发明提供了一种组合物，其包含(i)佐剂，(ii)第一方面或第二方面的分离的多核苷酸、第三方面的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽、第四方面的腺病毒、第五方面的病毒样颗粒或第六方面的载体，和任选的(iii)药学上可接受的赋形剂。优选地，佐剂是受体的激动剂，该受体选自I型细胞因子受体、II型细胞因子受体、TNF受体、充当转录因子的维生素D受体、和Toll样受体1(TLR1)、TLR-2、TLR 3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7和TLR9。

包含佐剂的组合物可用作疫苗，例如用于人类对象。例如，特定受体的激活可以刺激免疫反应。这样的受体是本领域技术人员已知的，并且包括例如细胞因子受体，特别是I型细胞因子受体、II型细胞因子受体、TNF受体；和充当转录因子的维生素D受体；和Toll样受体1(TLR1)、TLR-2、TLR 3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7和TLR9。这类受体的激动剂具有佐剂活性，即具有免疫刺激性。在一个优选的实施方案中，组合物的佐剂可以是一种或多于一种Toll样受体激动剂。在一个更优选的实施方案中，佐剂是Toll样受体4激动剂。在一个特别优选的实施方案中，佐剂是Toll样受体9激动剂。有关佐剂的实例，请参见下文。另外，下面提到优选的药学上可接受的赋形剂。

在第八方面，本发明提供了一种细胞，其包含第一发明或第二方面的多核苷酸、第三方面的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽、第四方面的腺病毒、第五方面的病毒样颗粒或第六方面的载体。

优选地，细胞是表达至少一种腺病毒基因，或优选所有腺病毒基因的宿主细胞，该腺病毒基因如上所述地缺失或丧失功能以使腺病毒不能复制。通过表达该至少一种基因，宿主细胞优选能够复制原本不能复制的腺病毒。在一个实施方案中，宿主细胞表达至少一种选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的腺病毒基因。特别是，该至少一种腺病毒基因在腺病毒基因组中缺失或丧失功能。这样的互补细胞可用于无复制能力的腺病毒的繁殖和拯救，因为它们缺乏例如前述基因产物中的一种。

细胞可以选自细菌细胞如大肠杆菌细胞、酵母细胞例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，植物细胞，昆虫细胞例如SF9或Hi5细胞或哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的优选实例是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK293)细胞、HELA细胞、人肝癌细胞(例如Huh7.5)、Hep G2人肝癌细胞、Hep 3B人肝癌细胞等。

如果细胞包含根据第一方面或第二方面的多核苷酸，该多核苷酸可以存在于细胞中，或者(i)同样自由分散，或者(ii)整合到细胞基因组或线粒体DNA中。

在另一个优选的实施方案中，细胞是宿主细胞，优选293细胞或PER.C6^TM细胞，其表达至少一种选自E1a、E1b、E2a、E2b、E4、L1、L2、L3、L4和L5的腺病毒基因。

标准转染方法可用于制备细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系。可以使用任何已知的将外源多核苷酸序列引入宿主细胞的方法。例如，可商购获得的基于脂质体的转染试剂盒例如Lipofectamine^TM(Invitrogen)、可商购获得的基于脂质的转染试剂盒例如Fugene(Roche Diagnostics)、基于聚乙二醇的转染、磷酸钙沉淀、基因枪(biolistic)、电穿孔或病毒感染，以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外源遗传物质引入宿主细胞的任何其他众所周知的方法。仅需要所使用的特定基因工程程序能够将至少一种基因成功地引入能够表达受体的宿主细胞中。

关于上述本发明的第四方面描述了细胞的其他实施方案。

在第九方面，本发明提供了第一方面或第二方面的多核苷酸、第三方面的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽、第四方面的腺病毒、第五方面的病毒样颗粒、或第六方面的载体和/或第七方面的组合物，以用于治疗或预防疾病。在一个实施方案中，通过疫苗接种进行治疗或预防。在另一个实施方案中，通过基因疗法进行治疗。关于疫苗接种，该疾病是感染性疾病，优选由本文所述的病原体引起，或非感染性疾病，其优选以患病细胞为特征，该患病细胞表达健康细胞不表达的抗原(例如表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞)。关于基因治疗，疾病是由导致基因或蛋白质功能丧失或获得的一种或多于一种体细胞突变引起的可遗传疾病。

众所周知，腺病毒可用于基因治疗和用作疫苗。临床前和临床研究证明了使用该系统进行载体设计、稳定的抗原表达和保护性免疫的可行性。因此，该用途的优选实施方案是疫苗接种，例如用于人类对象。腺病毒如何被使用和制备用于疫苗接种的详细说明作为本领域所包含的大量文献提供，并且为本领域技术人员所知。基于例如非人类人猿腺病毒的病毒载体代表了使用人类来源的腺病毒载体开发基因疫苗的替代方案(Farina SF，JVirol.2001 Dec；75(23)：11603-13.；Fattori E，Gene Ther.2006 Jul；13(14)：1088-96)。从非人类人猿分离的腺病毒与从人类分离的腺病毒密切相关，正如它们在人类起源的细胞中的有效繁殖所证明的那样。但是，由于人类和非人类人猿腺病毒是相关的，因此两种病毒之间可能存在某种程度的血清学交叉反应或没有血清学交叉反应。分离和鉴定黑猩猩腺病毒时，已经证实了这种推测。因此，根据本发明的非人类人猿腺病毒提供了减少与人类预先存在的针对人类腺病毒的普通血清型的免疫力相关的不利影响的基础，从而提供了例如可用于免疫和/或基因治疗的有价值的医疗工具。

这是由于腺病毒衣壳蛋白的新序列，包括六邻体、五邻体和纤维蛋白，但特别是代表暴露于表面的腺病毒表位的新型六邻体HVR序列。因此，预期在人血血清中不存在或很少存在对衣壳蛋白特别是根据本发明的六邻体HVR特异的中和抗体。因此，新序列的一个优点是它们可以用于增强现有技术的腺病毒，该腺病毒已经被工程化用于例如医学目的。例如，序列可以用于例如替换/代替一种或多于一种主要结构衣壳蛋白，或特别是仅替换/代替不同的腺病毒的六邻体HVR例如现有技术的腺病毒，以获得在人中具有降低的血清阳性的改良的重组腺病毒(嵌合腺病毒)。由于按所述方法重新改造的新序列以及因此腺病毒在施用时不会在人体中遇到任何明显的抑制性免疫应答，因此它们的总体转导效率和感染性将得到增强。因此，预期这种改良的腺病毒将是更有效的疫苗，因为进入宿主细胞并且抗原的表达不会被任何显著效价的中和抗体所阻碍。

疫苗优选包含佐剂。优选的免疫佐剂在本文中提及并且可以用于此类疫苗中。

如果用途是疫苗接种，则可以以免疫和/或预防有效剂量施用本发明的重组腺病毒，该剂量优选为1x10⁸个至1x10¹¹个病毒颗粒(即1x10⁸个、5x10⁸个、1x10⁹个、5x10⁹个、1x10¹⁰个、2.5x10¹⁰个或5x10¹⁰个颗粒)。

此外，对于需要加强免疫的疫苗，优选采用“异源初免后加强免疫”方法：在疫苗接种中，第一方面或第二方面的多核苷酸、第三方面的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽、第四方面的腺病毒、第五方面的病毒样颗粒或第六方面的载体和/或者第七方面的组合物可以用于初免或加强，特别是用于异源初免后加强免疫接种。在异源初免后加强免疫的优选实施方案中，可以使用两种不同的疫苗例如腺病毒，其中特别有利的是由于例如在人类中缺乏或中和抗体，而使用第一方面或第二方面的多核苷酸、第三方面的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽、第四方面的腺病毒、第五方面的病毒样颗粒或第六方面的载体和/或第七方面的组合物作为加强疫苗。

使用根据本发明的多核苷酸或重组腺病毒蛋白或其片段制备的重组腺病毒可用于用多核苷酸例如DNA转导宿主细胞。因此，可以制备优选具有复制缺陷的，即使是具有感染性(即能够进入宿主细胞)的腺病毒，以在宿主细胞中表达任何定制的蛋白质或多肽。因此，在一个优选的实施方案中，在根据本发明的用途中列举的疗法是基因疗法。基因治疗可以是体内、离体或体外基因治疗。优选地，其是一种体细胞基因疗法。如果将根据本发明的分离的多核苷酸、分离的蛋白质、载体、重组腺病毒和/或药物组合物用于基因治疗并施用于待治疗的对象，则优选以足够的剂量施用，以使得在被转染，即被转导的患者的一个或多于一个细胞中获得治疗结果。如果通过本文公开的任何优选的施用方式施用根据本发明的重组腺病毒和/或药物组合物，则优选施用的有效剂量为1x10⁸个至5x10¹¹个病毒颗粒(即，1x10⁸个、5x10⁸个、1x10⁹个、5x10⁹个、1x10¹⁰个、2.5x10¹⁰个、5x10¹⁰个、1x10¹¹个或最优选5x10¹¹个颗粒)。在优选的实施方案中，包含在本发明的重组腺病毒中的优选异源多核苷酸能够在对象的宿主细胞中表达蛋白质或多肽，其中该蛋白质或多肽包含影响来自所述宿主细胞的蛋白质或多肽分泌的信号肽。例如，可以使用本发明的腺病毒治疗需要某种蛋白质的患者，该腺病毒包含编码该蛋白质的可分泌形式的cDNA。

在本发明的用途的另一个实施方案中，第一方面或第二方面的多核苷酸、第三方面的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽、第四方面的腺病毒、第五方面的病毒样颗粒、或第六方面的载体和/或第七方面的组合物(在下文中称为本发明的药物)经配制以进一步包含一种或多于一种药学上可接受的稀释剂；载剂；赋形剂，包括填充剂、黏合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂和吸附剂；和/或防腐剂。

根据本发明的药物可以通过各种众所周知的途径施用，包括口服、直肠、胃内和肠胃外施用，例如静脉内、肌内、鼻内、皮内、皮下和类似的施用途径。肠胃外、肌内和静脉内施用是优选的。优选地，根据本发明的药物被配制成糖浆剂、输注或注射溶液、片剂、胶囊剂、capslet、锭剂、脂质体、栓剂、膏药、创可贴、阻滞胶囊、散剂、或缓释制剂。优选地，稀释剂是水、缓冲剂、缓冲的盐溶液或盐溶液，并且载体优选地选自可可脂和维替贝索(vitebesole)。

在本发明的使用过程中用于施用根据本发明药物的特别优选的药物形式是适合注射使用的形式，包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。通常，这样的溶液或分散体包括溶剂或分散介质，包括例如水缓冲的水溶液，例如生物相容性缓冲液、乙醇、多元醇，例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、其合适的混合物、表面活性剂或植物油。

输注或注射溶液可以通过许多本领域公知的技术来实现，包括但不限于添加防腐剂，例如抗菌剂或抗真菌剂，例如对苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸或硫柳汞。此外，可以在输注或注射溶液中引入等渗剂，例如糖或盐，特别是氯化钠。

本发明优选的稀释剂是水、生理可接受的缓冲液、生理可接受的缓冲盐溶液或盐溶液。优选的载体是可可脂和维替贝索。可以与根据本发明的药物的各种药物形式一起使用的赋形剂可以选自以下非限制性列表：

a)黏合剂，例如乳糖、甘露醇、结晶山梨糖醇、磷酸氢盐、磷酸钙、糖、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等；

b)润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸、氢化植物油、亮氨酸、甘油酯和硬脂富马酸钠；

c)崩解剂，例如淀粉、交联羧甲基纤维素、甲基纤维素钠、琼脂、膨润土、藻酸、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

其他合适的赋形剂可以在美国药学会出版的Handbook of PharmaceuticalExcipients中找到。

某些量的根据本发明的药物优选用于治疗或预防疾病。然而，应当理解的是，根据疾病的严重程度、疾病的类型以及待治疗的相应患者，例如患者的总体健康状况等，需要不同剂量的根据本发明的药物来产生治疗效果或预防效果。合适剂量的确定由主治医师决定。如果要预防性地使用根据本发明的药物，则可以将其配制成疫苗。在这种情况下，根据本发明的药物优选以上述概述的优选和特别优选的剂量施用。优选地，疫苗的施用在限定的时间段内重复至少两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或至少10次，直到接种的对象产生足够的针对根据本发明的药物的抗体，从而降低发展相应疾病的风险。在这种情况下，取决于疫苗的抗原性，时间长短通常是可变的。优选地，时间长短不超过四周、三个月、六个月或三年。在一个实施方案中，如果将根据本发明的腺病毒用于疫苗接种目的，则六邻体蛋白的至少一个高变域可以被疫苗针对的相应疾病试剂的免疫原性表位代替。疫苗通常含有一种或多于一种如上所述的佐剂。腺病毒用于疫苗接种的详细概述及其相关方法在以下中提供：Bangari DS和Mittal SK(2006)Vaccine，24(7)，p.849-862；还参见：ZhouD，等人，Expert Opin Biol Ther.2006 Jan；6(1)：63-72；和：Folgori A，等人，NatMed.2006 Feb；12(2)：190-7.；还参见：Draper SJ，等人，Nat Med.2008 Aug；14(8)：819-21.Epub 2008 Jul 27。

在第十方面，本发明涉及一种用于制备腺病毒或腺病毒样颗粒的体外方法，其包括以下步骤：

(i)在细胞中表达第一方面或第二方面的分离的多核苷酸，从而在细胞中组装腺病毒或腺病毒样颗粒，

(ii)从细胞或细胞周围的培养基中分离腺病毒或腺病毒样颗粒。

方法任选地在步骤(i)之前包括将第一方面或第二方面的分离的多核苷酸或第六方面的载体引入细胞内的另一步骤，例如如上所述的。

通常优选的是，分离的多核苷酸编码第四方面的腺病毒或第五方面的病毒样颗粒。腺病毒优选是无复制能力的。细胞优选是第七方面的细胞。如本文所述，如果分离的多核苷酸编码无复制能力的腺病毒，则优选该细胞是辅助细胞或包含辅助构建体(例如辅助质粒或辅助病毒，例如在步骤(i)之前或期间用辅助构建体转导，优选用辅助病毒感染)，其中辅助细胞或辅助构建体分别表达导致腺病毒无复制能力的基因/基因组区域。

“在细胞中组装腺病毒或腺病毒样颗粒”指在步骤(i)中，如本文所述的组装腺病毒或腺病毒样颗粒所需的所有基因都在细胞中表达。如果要组装腺病毒，则这包括包装腺病毒(即将基因组包装到病毒衣壳中)所需的所有基因。

在一个优选的实施方案中，分离的多核苷酸编码如上所述的VA RNA II非编码RNA和/或VA RNA I非编码RNA。根据本发明的VA RNA导致如实施例1所示的方法提高腺病毒或腺病毒样颗粒产量。

本发明的定义和其他实施方案

在下文中，提供了本说明书中经常使用的术语的一些定义。在说明书的其余部分中，这些术语在其使用的每种情况下将分别具有限定的含义和优选的含义。

如本文所使用的，术语“分离的”指基本上不含与其天然缔合的其他分子的分子。特别地，分离是指分子不在动物体或动物体样品中。因此，分离的分子不含其在动物体内会遇到或接触的其他分子。分离并不意味着与本文所述的其它相关组分分离，例如，不与包含该分子的组合物的其它组分分离，或与包含该分子的载体或细胞分离。

术语“多核苷酸”指核酸，即由多个核苷酸组成的生物分子。其包括DNA、RNA和合成类似物，例如PNA。DNA是优选的。

术语“开放阅读框”(ORF)指可以翻译成氨基酸的核苷酸序列。通常，ORF在给定的阅读框中包含起始密码子、长度通常是3个核苷酸的倍数的后续区域，但不包含终止密码子(TAG、TAA、TGA、UAG、UAA或UGA)。ORF编码一种蛋白质，其中可以将其翻译成的氨基酸形成肽连接的链。

如本文所使用的，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”全文可互换使用。这些术语指天然存在的肽，例如天然存在的蛋白质和合成的肽，其可以包括天然或非天然存在的氨基酸。也可以通过修饰天然或非天然存在的氨基酸的侧链或游离氨基或羧基末端来化学修饰肽。该化学修饰包括添加其他化学部分以及修饰氨基酸侧链中的官能团，例如糖基化。肽是优选具有至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或至少100个氨基酸，最优选至少8个或至少30个氨基酸的聚合物。由于本文公开的多肽和蛋白质衍生自腺病毒，因此本文所用的分离的多肽或蛋白质的分子量优选不超过200kDa。

腺病毒(Ad)是一种非包封的二十面体病毒，已在数种禽类和哺乳动物宿主中发现。人腺病毒(hAd)属于哺乳动物腺病毒属，其包括所有已知的人源和许多动物源(例如牛、猪、犬、鼠、马、类人猿和绵羊)的腺病毒。人腺病毒通常根据许多生物学、化学、免疫学和结构标准分为六个亚组(A-F)，包括大鼠和恒河猴红细胞的血细胞凝集特性、DNA同源性、限制性内切酶切割模式、G+C百分比含量和致癌性(Straus，1984，in The Adenoviruses，编辑H.Ginsberg，451页-498页，New York：Plenus Press，和Horwitz，1990；in Virology，编辑B.N.Fields和D.M.Knipe，pps.1679-1721)。

腺病毒粒子具有二十面体对称性，并且取决于血清型，其直径为60nm至90nm。二十面体衣壳包含三种主要蛋白质，六邻体(II)、五邻体碱基(III)和带节纤维(IV)蛋白质(W.C.Russel，J.Gen.Virol.，81：2573-2604(2000))。更具体地，腺病毒衣壳包含252个壳粒，其中240个为六邻体，12个为五邻体。六邻体和五邻体衍生自三种不同的病毒多肽。六邻体包含三个相同的多肽，即多肽II。五邻体包含五邻体碱基和三聚体纤维蛋白，所述五邻体碱基提供与衣壳的连接点，所述三聚体纤维蛋白非共价地结合至五邻体碱基并从其伸出。其他蛋白质，即蛋白质IX、VI和IIIa通常也存在于腺病毒衣壳中。认为这些蛋白质可稳定病毒衣壳。

在人类中观察到的预先存在的免疫力的一个方面是体液免疫力，其可以导致对腺病毒蛋白特异性的抗体的产生和持续。腺病毒引起的体液反应主要针对结构蛋白六邻体的高变区。从非人类人猿分离的腺病毒与从人分离的腺病毒密切相关，正如它们在人类起源的细胞中的有效繁殖所证明的那样。

衣壳可以如本文所述通过引入非腺病毒多肽例如T细胞和/或B细胞表位进行修饰。

术语“六邻体蛋白”指腺病毒中包含的六邻体(II)蛋白。根据本发明的六邻体蛋白或其变体与感染性腺病毒病毒体中的六邻体蛋白或其片段具有相同的功能。因此，包含所述六邻体或其变体的优选作为衣壳蛋白的腺病毒能够进入宿主细胞。美国专利5922315中描述了产生六邻体蛋白变体的合适方法。在这种方法中，腺病毒六邻体的至少一个环区域被另一种腺病毒血清型的至少一个环区域改变。可以容易地确定重组腺病毒是否可以进入宿主细胞。例如，在使宿主细胞与腺病毒接触后，可以洗涤和裂解重组宿主细胞，并且可以使用例如对腺病毒RNA和/或DNA特异性的合适杂交探针来确定在宿主细胞中是否发现腺病毒RNA和/或DNA。替代地或另外地，与重组腺病毒接触后，可以洗涤、裂解宿主细胞和例如使用蛋白质印迹法用腺病毒特异性抗体探测宿主细胞。在又一个替代方案中，例如在体内，观察宿主细胞在被重组腺病毒感染时是否表达基因产物，例如荧光蛋白，所述重组腺病毒包含合适的表达盒以在宿主细胞中表达基因产物。

术语“高变区”指菌株间序列差异较大的结构域，其位于六邻体蛋白暴露于溶剂的表面，因此暴露于病毒衣壳的外部。它们是中和抗体的主要决定因素。可以例如通过与其他六邻体蛋白的序列比对来鉴定HVR。

“腺病毒五邻体蛋白”指腺病毒中包含的五邻体碱基(III)蛋白。腺病毒五邻体蛋白的特征在于其位于衣壳的二十面体对称的角。根据本发明的五邻体蛋白或其变体与感染性腺病毒病毒体中的五邻体蛋白具有相同的功能。因此，包含所述五邻体或其变体的优选作为衣壳蛋白的腺病毒能够进入宿主细胞，其可以如上所述地进行测试。此外，功能性五邻体对腺病毒纤维蛋白具有亲和力。普通技术人员非常了解如何测试蛋白质-蛋白质亲和力。为了确定第一蛋白质是否能够结合第二蛋白质，可以使用例如遗传酵母双杂交测定法或生物化学测定法，例如下拉法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、基于荧光激活细胞分选(FACS)测定法或等离子共振测定法。当使用下拉或等离子共振测定法时，例如生物化学领域众所周知的，将至少一种蛋白质融合至亲和标签例如HIS标签、GST标签或其他标签上是有用的。

术语“纤维蛋白”指腺病毒中包含的带节纤维(IV)蛋白。根据本发明的纤维蛋白或其片段与感染性腺病毒病毒体中的纤维蛋白或其片段具有相同的功能。因此，包含所述纤维或纤维变体的优选作为衣壳蛋白的腺病毒能够进入宿主细胞，其可以如上所述地进行测试。此外，功能性纤维蛋白对腺病毒五邻体蛋白具有亲和力。而且，糖基化形式的功能性腺病毒纤维蛋白能够三聚。因此，还优选变体能够被糖基化和/或形成三聚体。包括三聚作用在内的亲和性可以如上所述进行测试，并且糖基化测定法也是本领域众所周知的。

“VA(病毒相关)RNA”是腺病毒中发现的一种非编码类型。其在调节翻译中发挥作用。该RNA有两个拷贝，称为VAI或VA RNA I和VAII或VA RNA II。这两个VA RNA基因是腺病毒基因组中的不同基因。VA RNA I是VA RN AII表达水平较低的主要种类。两种转录物均未被聚腺苷酸化，并且均被PolIII转录。

术语“同一性”或“同一的”在多核苷酸、多肽或蛋白质序列的上下文中指两个序列中为了最大对应而比对时相同的残基数目。具体而言，无论是核酸序列还是氨基酸序列的两个序列的序列同一性百分比是两个比对序列之间精确匹配的数目除以较短序列的长度再乘以100。可以用于比对两个序列的比对工具是本领域技术人员众所周知的，并且可以例如在万维网上获得，例如Clustal Omega(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)以用于多肽比对或MUSCLE(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)或MAFFT(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)以用于多核苷酸比对或WATER(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/)以用于多核苷酸和多肽比对。两个序列之间的比对可以使用默认的参数设置来进行，例如，对于MAFFT，优选：Matrix：Blosum62、Gap Open1.53、Gap Extend 0.123，对于WATER多核苷酸，优选：MATRIX：DNAFULL、Gap Open：10.0、GapExtend 0.5，对于WATER多肽，优选MATRIX：BLOSUM62、Gap Open：10.0、Gap Extend：0.5。本领域技术人员理解，可能有必要以任一顺序引入空位以产生令人满意的比对。“最佳序列比对”被定义为产生最大数量的比对的相同残基，同时具有最小数量的空位的比对。优选地，其是在比对中的每个序列中包括每个残基的全局比对。

就多肽而言，术语“变体”通常指多肽的修饰版本，例如突变，因此多肽的一个或多于一个氨基酸可以缺失、插入、修饰和/或置换。通常，变体是功能性的，意味着包含功能性变体的腺病毒能够感染宿主细胞。本文定义了更具体的功能，并且优先于一般定义。“突变”或“氨基酸突变”可以是氨基酸置换、缺失和/或插入(如果存在多个突变，则可以适用“和”)。优选地，其为置换(即保守或非保守氨基酸置换)，更优选保守氨基酸置换。在一些实施方案中，置换还包括将天然存在的氨基酸与非天然存在的氨基酸交换。保守置换包括用化学性质类似于被置换的氨基酸的另一种氨基酸置换氨基酸。优选地，保守置换是选自以下的置换：

(i)用另一种不同的碱性氨基酸置换碱性氨基酸；

(ii)用另一种不同的酸性氨基酸置换酸性氨基酸；

(iii)用另一种不同的芳香族氨基酸置换芳香族氨基酸；

(iv)用另一种不同的非极性脂肪族氨基酸置换非极性脂肪族氨基酸；和

(v)用另一种不同的极性的不带电荷的氨基酸置换极性的不带电荷的氨基酸。

碱性氨基酸优选选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸优选为天冬氨酸或谷氨酸。芳香族氨基酸优选选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非极性脂肪族氨基酸优选选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸。极性的不带电荷的氨基酸优选选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。与保守氨基酸置换相反，非保守氨基酸置换是用一个氨基酸与不属于上述保守置换(i)至(v)的任何氨基酸的交换。

上面描述了确定序列同一性的手段。

蛋白质的氨基酸也可以被修饰，例如化学修饰。例如，蛋白质或多肽的侧链或氨基酸的游离氨基或羧基末端可以通过例如糖基化、酰胺化、磷酸化、泛素化等进行修饰。如本领域众所周知的，化学修饰也可以在体内进行，例如在宿主细胞中。例如，合适的化学修饰基序例如蛋白质氨基酸序列中存在的糖基化序列基序将导致蛋白质被糖基化。除非修饰导致修饰氨基酸同一性的改变(例如置换或缺失)，否则修饰多肽属于针对某个SEQ ID NO所述多肽的范围，即它不是本文定义的变体。

就多肽而言，术语“变体”通常指多核苷酸的修饰版本，例如突变，因此多核苷酸的一个或多于一个核苷酸可以缺失、插入、修饰和/或置换。通常，变体是功能性的，意味着包含功能性变体的腺病毒能够感染宿主细胞。本文定义了更具体的功能，并且优先于一般定义。“突变”可以是核苷酸置换、缺失和/或插入(如果存在多个突变，则可以适用“和”)。优选地，其为置换，更优选其引起氨基酸置换，最优选保守氨基酸置换。

“抗原蛋白或其片段”(其中片段也是抗原性的)能够在哺乳动物中引发免疫应答。优选地，其为肿瘤抗原或衍生自病原体的抗原。术语“病原体”指可能引起对象疾病的任何生物。其包括但不限于细菌、原生动物、真菌、线虫、类病毒、病毒和寄生虫，其中每种病原体本身或与另一种病原体共同具有致使脊椎动物中引起疾病的能力，所述脊椎动物包括但不限于哺乳动物，且包括但不限于人类。如本文所使用的，术语“病原体”还涵盖在非免疫受损的宿主中通常可能不是致病的但在免疫受损的宿主中是致病的生物。

一般而言，腺病毒基因组具有良好的特征。腺病毒基因组的整体组织相对于特定的开放阅读框以相似的方式定位，如每个病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5基因的位置。腺病毒基因组的每个末端都包含称为反向末端重复序列(ITR)的序列，其对于病毒复制是必需的。病毒还包含病毒编码的蛋白酶，其对于处理产生感染性病毒体所需的一些结构蛋白是必需的。根据宿主细胞转导后病毒基因表达的顺序来描述腺病毒基因组的结构。更具体地，根据转录是在DNA复制开始之前还是之后发生，将病毒基因称为早期(E)或晚期(L)基因。在转导的早期，表达腺病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4基因，以制备用于病毒复制的宿主细胞。在感染后期，激活了编码病毒颗粒结构成分的晚期基因L1至L5的表达。

本文所用的术语“载体”包括本领域技术人员已知的任何载体，包括质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体如λ噬菌体、病毒载体如腺病毒(Ad)载体(例如，现有技术例如WO 2005/071093 A2已知的非复制型Ad5、Ad11、Ad26、Ad35、Ad49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82载体或具有复制能力的Ad4和Ad7载体)、腺相关病毒(AAV)载体(例如，ALVAC型)、α病毒载体(例如，委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、辛德比斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)和VEE-SIN嵌合体)、疱疹病毒载体、麻疹病毒载体、痘病毒载体(例如，痘苗病毒、改良痘苗病毒安卡拉(MVA)、NYVAC(源自痘苗的哥本哈根株)和禽痘载体：金丝雀痘(ALVAC)和鸡痘(FPV)载体)和水泡性口炎病毒载体、病毒样颗粒或细菌孢子。载体还包括表达载体、克隆载体和可用于在宿主细胞中产生重组腺病毒的载体。

如上所述，“异源蛋白或其片段”可以是非腺病毒蛋白或其片段，特别是抗原蛋白或其片段。为此，编码异源蛋白的多核苷酸可以是待递送至靶细胞中的分子，例如编码抗原蛋白或其片段的多核苷酸，优选抗原蛋白或病原体片段、或肿瘤抗原，所述病原体例如病原病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫。“抗原”是指能够在哺乳动物中引起免疫应答的任何蛋白质或肽。抗原优选包含至少8个氨基酸，最优选包含8个至12个氨基酸。

术语“表达盒”指包含至少一个待表达的核酸序列及其转录和翻译控制序列的核酸分子。改变表达盒将导致引入它的载体指导不同序列或序列组合的表达。由于优选将限制位点设计为存在于5′和3′末端，所以盒可以容易地插入、移除或用另一盒替换。优选地，表达盒包括用于有效表达给定基因例如启动子、起始位点和/或聚腺苷酸化位点的顺式调节元件。关于本发明更具体的表达盒包含在宿主细胞中表达第一方面或第二方面的多核苷酸所需的所有其他元件。因此，典型的表达盒包含与第一方面或第二方面的多核苷酸可操作连接的启动子，以及转录物、核糖体结合位点和翻译终止的有效多聚腺苷酸化所需的信号。盒的附加元件可以包括例如增强子。表达盒还应该在结构基因的下游包含转录终止区，以提供有效的终止。终止区可以从与启动子序列相同的基因获得，或者可以从不同的基因获得。

如本文所使用的，术语“小基因”指异源基因构建体，其中相对于天然存在的基因而言，基因的一个或多于一个非必需功能区段缺失。“小基因盒”是包含用于表达的小基因的表达盒。

术语“具有复制能力”的重组腺病毒(AdV)指在宿主细胞中不含任何重组辅助蛋白的情况下能够复制的腺病毒。优选地，“具有复制能力”的腺病毒包含以下完整的或功能性的必需早期基因：E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4。从特定动物中分离出来的野生型腺病毒在该动物中具有复制能力。

术语“复制缺陷的”或“无复制能力的”重组AdV是指表现为不能复制的腺病毒，因为其至少包含功能缺失，即在不完全去除的情况下损害基因功能的缺失，例如引入人工终止密码子、活性位点或相互作用结构域的缺失或突变、基因调控序列的突变或缺失等，或完全去除编码病毒复制所必需的基因产物的基因，例如选自E1、E2、E3和E4的一个或多于一个腺病毒基因。本发明的重组腺病毒优选是复制缺陷的。

术语“重组腺病毒”特别指经修饰以包含异源多核苷酸和/或多肽序列的腺病毒。“异源的”可以指来自另一种腺病毒株，特别是来自不同宿主(例如，人宿主，因此来自人腺病毒，例如Ad3或Ad5)的病毒株，或者来自非腺病毒生物的病毒株，例如来自本文所述病原体的抗原，或者来自人，例如人肿瘤抗原。因此，该术语分别包括嵌合和载体腺病毒。重组腺病毒可以包含来自其他腺病毒或来自非腺病毒生物体的异源多核苷酸和/或多肽序列，即其既可以是嵌合腺病毒，也可以是载体腺病毒。

如本文所使用的，术语“病毒样颗粒”或“VLP”指非复制的空病毒壳，在这种情况下衍生自腺病毒。VLP通常由一种或多于一种病毒蛋白组成，例如但不限于那些被称为衣壳蛋白、外壳蛋白、壳蛋白、表面蛋白和/或包封蛋白的那些蛋白。它们包含负责病毒渗透细胞的功能性病毒蛋白，其可确保有效的细胞进入。在适当的表达系统中重组表达蛋白质后，可以自发形成VLP。产生特定VLP的方法是本领域已知的。特别地，腺病毒VLP可以通过功能损害例如在腺病毒的Iv2基因中缺失或引入无效突变来产生，该基因涉及病毒DNA的包装(Ostapchuk等人J Virol.2011 Jun；85(11)：5524-5531)。可以使用本领域已知的常规技术，例如通过电子显微镜、X射线晶体学等来检测VLP的存在，参见例如，Baker等人，Biophys.J.(1991)60：1445-1456；Hagensee等人，J.Virol.(1994)68：4503-4505。例如，可以对所讨论的VLP制剂的玻璃状的含水样品进行低温电子显微镜检查，并在适当的曝光条件下记录图像。

“基本上无病毒基因组DNA”包含在VLP中是指在VLP没有病毒基因组DNA，或者在VLP没有足够的病毒基因组DNA来允许病毒在被VLP感染的细胞中复制，并且不表达将与VLP的DNA互补的DNA，从而可以发生病毒复制。

除上述之外，“表位”，也称为抗原决定簇，是大分子的被免疫系统，特别是抗体、B细胞或T细胞识别的片段。在本发明的背景下，优选术语“表位”是指由免疫系统识别的蛋白质或多蛋白的片段。表位通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下失去与前者的结合而不失去与后者的结合。

“非腺病毒T细胞表位”是可以呈递在与MHC分子结合的抗原呈递细胞的表面上的表位。在人类中，专业的抗原呈递细胞专门呈递MHC II类肽，而大多数有核体细胞呈递MHCI类肽。由I类MHC分子呈递的T细胞表位通常是长度为8个至11个氨基酸的肽，而II类MHC分子呈递更长的肽，长度为13个至17个氨基酸。

“非腺病毒B细胞表位”是被B细胞识别为天然抗原表面上的三维结构的表位。

B细胞和T细胞表位可以用计算机工具预测，例如IEDB分析资源的在线B细胞或T细胞预测工具。

术语“呈递一种或多于一种非腺病毒B细胞表位”是指将一种或多于一种表位引入衣壳中，使得它们被B细胞识别。术语“引入一种或多于一种非腺病毒B-/T细胞表位”是指该表位包含在VLP中而不引入衣壳中、或引入衣壳中。如果将表位引入衣壳中，它可能会也可能不会呈递在外，从而被免疫细胞识别。

与单独施用抗原相比，“免疫佐剂”或简称为“佐剂”是加速、延长和/或增强对抗原/免疫原的免疫应答的质量和/或强度的物质，因此，减少了任何给定疫苗中所需的抗原/免疫原的量，和/或产生对目的抗原/免疫原的充分免疫应答所需的注射频率。可以在根据本发明的组合物中使用的佐剂的实例是氢氧化铝的凝胶状沉淀物(明矾)；AlPO₄；铝胶；来自革兰氏阴性细菌外膜的细菌产物，特别是单磷酰基脂质A(MPLA)、脂多糖(LPS)、胞壁酰二肽及其衍生物；弗氏不完全的佐剂；脂质体，特别是中性脂质体，含有该脂质体和任选的细胞因子的组合物；非离子嵌段共聚物；ISCOMATRIX佐剂(Drane等人，2007)；包含CpG二核苷酸(CpG基序)，特别是具有硫代磷酸酯(PTO)骨架(CpG PTO ODN)或磷酸二酯(PO)骨架(CpGPO ODN)的CpG ODN的未甲基化DNA；合成脂肽衍生物，特别是Pam₃Cys；脂阿拉伯甘露聚糖；肽聚糖；酵母聚糖；热激蛋白(HSP)，特别是HSP 70；dsRNA及其合成衍生物，特别是Poly I：poly C；聚阳离子肽，特别是聚-L-精氨酸；紫杉醇；纤连蛋白；鞭毛蛋白；咪唑并喹啉；具有佐剂活性的细胞因子，特别是GM-CSF、白介素-(IL-)2、IL-6、IL-7、IL-18，I和II型干扰素，特别是干扰素-γ、TNF-α；25-二羟基维生素D3(骨化三醇)；和合成的寡肽，特别是MHCII呈递的肽。可以将包含聚氧乙烯(POE)和聚氧丙烯(POP)的非离子嵌段聚合物，例如POE-POP-POE嵌段共聚物，用作佐剂(Newman等人，1998)。这种类型的佐剂对于包含核酸作为活性成分的组合物特别有用。

在本发明的上下文中，术语“疫苗接种”是主动免疫，即通过在合适的免疫原性制剂中施用(例如，皮下、皮内、肌内、口服、鼻内)抗原(作为接种个体的免疫系统外源的的物质，因此被认为具有免疫原性)来诱导特异性免疫应答。因此，抗原被用作免疫系统的触发器，以建立对该抗原的特异性免疫反应。原则上，本发明范围内的疫苗接种既可以在治疗意义上进行，也可以在预防意义上进行。其包括针对本文所述病原体的疫苗接种，以治疗或预防感染性疾病、或疫苗接种，以治疗或预防非感染性疾病，例如癌症。在非感染性疾病的情况下，抗原优选是细胞膜抗原，特别是仅由患病细胞而不是非患病细胞表达的抗原。一个实例是肿瘤相关抗原。在本文中，术语“肿瘤相关抗原”是指主要由肿瘤细胞呈递的结构，从而允许从非恶性组织中分化。优选地，这种与肿瘤相关的抗原位于肿瘤细胞的细胞膜之上或之中。与肿瘤相关的抗原的实例描述于例如DeVita等人(编辑，″Biological Therapy ofCancer″，第二版，Chapter 3：Biology of Tumor Antigens，Lippincott Company，ISBN 0-397-51416-6(1995))。

本文所用的“初免”是指施用用于诱导/产生哺乳动物免疫应答的疫苗，以及“加强”是指施用用于增强哺乳动物免疫应答的疫苗。术语“异源初免后加强免疫”是指用于在哺乳动物中诱导/产生免疫应答(初免)的疫苗和用于在哺乳动物中增强免疫应答(加强)的疫苗是不同的。如果对象例如，患者已经发展出针对第一种载体的抗体，并需要加强免疫，则异源初免后加强是有用的。在这种情况下，如果在由第一疫苗初免期间诱导的抗体应答不阻止用于加强免疫而施用的多于70％或优选多于80％的第二疫苗颗粒进入已经进行了初免和加强免疫的动物细胞核，则第一(初免)和第二(加强)疫苗，例如腺病毒，是足够不同的。

术语“基因治疗”可以广义地定义为如下概念：将外源遗传物质直接导入细胞、组织或器官中，以纠正缺陷基因，以改善患者的临床状况。如本文所用，术语“基因疗法”优选指“体细胞疗法”，而不是“种系疗法”，其将诱导代代相传的可遗传变化，其中体细胞疗法将治疗效果限制于被治疗的个体。基因治疗，优选体细胞治疗，可以通过快速和容易地将基因直接转移到生物体(“体内”)或复杂但更特异性和可控的基因转移到治疗后重新植入的外植细胞或组织(“离体”或“体外”)来进一步区分。

术语“中和抗体”是指结合腺病毒表位的抗体，并且其防止在宿主细胞中产生生产性感染或防止靶细胞用表达转基因的无复制能力的载体转导，例如腺病毒DNA能够进入细胞，特别是宿主细胞。

在不脱离本发明范围的情况下，本发明的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解的是，所要求保护的本发明不应不适当地限制于这样的特定实施方案。事实上，对于相关领域的技术人员来说显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改都将被本发明所涵盖。

***

通过以下实施例描述本发明，所述实施例应被解释为仅是示例性的，而并不限制本发明的范围。

实施例

实施例1：新型腺病毒载体的分离

pGADNOU19和pGADNOU20载体的构建按以下步骤进行。pGADNOU19和pGADNOU20载体衍生自野生型腺病毒株，该病毒株是从粪便样本中分离的，该粪便样本是使用标准程序从健康的非人类人猿获得的。通过用粪便提取物接种单层HEK 293和A549细胞来分离野生型病毒。每天观察细胞单层的致细胞病变效应外观。收集在显微镜下观察到为阳性的样品，然后通过冻融(-700℃/37℃)来裂解细胞。然后，通过感染新鲜细胞的单层，将澄清的细胞裂解物用于病毒繁殖。病毒扩增两代后，使用标准程序纯化腺病毒。通过SDS/蛋白酶K消化从纯化的病毒中提取病毒基因组，然后进行苯酚-氯仿提取。将纯化的腺病毒DNA克隆至穿梭质粒载体中，通过携带以下病毒基因组缺失进行修饰：

1)病毒基因组E1区(从461bp至3402bp)的缺失

2)病毒基因组E3区(从28472bp至31996bp)的缺失

实施例2：GADNOU穿梭载体的制备

首先对GADNOU病毒的纯化DNA基因组进行测序，然后将DNA序列信息用于构建穿梭载体，以通过同源重组克隆GAd的整个基因组。穿梭载体设计为引入E1区域缺失(核苷酸坐标：461-3402)。简而言之，用于克隆GADNOU病毒的穿梭载体(在此称为pGAd-GAG穿梭)如下构建：

a.GAd-GAG左末端使用寡核苷酸FW 5′-GAACTCCgaattcgtttaaaccatcatcaataatataccttattttggattgaggccaatatgataatgaggtgggcggggcgaggcggggcgggtgacgtagg-3′(SEQID NO：58)和RV 5′-cataatcGGCCGCAGCGGCCCGTCAG ATGACGGCGACAATAAA-3′(SEQ ID NO：59)进行PCR扩增，用EcoRI和SfiI消化，然后将其连接到用EcoRI和SfiI消化的pUC19 rc_MCS_Left end_PIX_Rightend_V1中，从而生成pUC19 L-ITR GAd-GAG。

b.然后GAd右末端使用寡核苷酸FW 5′-Cataatcgacccgagtcgcactctcacagcaccagca-3′(SEQ ID NO：60)和RV 5′-GAACTCCggatccgtttaaacCATCATCAATAATATACCTTATTTTG-3′(SEQ ID NO：61)通过PCR扩增，用PshA1和BamHI消化，然后连接到用PshA1和BamHI消化的pUC19 L-ITR GAd-GAG中，从而产生pUC19 L/R-ITR GAd-GAG。

c.含有pIX编码区的DNA片段用寡核苷酸FW 5′-Cataatcgcgatcgcgcttaggcctgaccatctgg-3′(SEQ ID NO：62)和RV 5′-GAACTCCggcgcgccTTAGGGGGAGGCAAGGCTG-3′(SEQ IDNO：63)通过PCR扩增，用AsisI-AscI消化，然后克隆到用AsisI-AscI消化的质粒pUC19 L/R-ITR GAd-GAG中，产生pUC19 L/R-ITR pIX GAd-GAG。

d.从用MscI-SfiI消化的质粒phCMV-GAG获得HCMV-GAG-BGHpolyA盒。将该盒克隆到用MscI-SfiI消化的pUC19 L/R-ITR pIX GAd-GAG中，然后钝化以产生pGAd-GAG穿梭载体。

e.通过用BAC区域替换质粒区域来构建穿梭BAC：BAC区域是从用PmeI消化的质粒pBELO BAC RDL中获得的，然后克隆到用PmeI消化的质粒pGAd-GAG穿梭载体中，从而产生BAC GAd-GAG穿梭载体。

f.在右端和pIX区域之间插入Amp-LacZ-SacB选择盒：使用寡核苷酸FW(5′-GAACTCCGGCGCGCCTAGG GATAACAGGGTAATACCCCTATTTGTTTATTTTTCT-3′，SEQ ID NO：64)和RV(5′-CATAATCGGCGCGCCATTACCCTGTTATCCCTATTATTTGTTAACTGTTAA TTGTC-3′，SEQ ID NO：65)通过PCR扩增，用AscI消化，从质粒pChAd穿梭质粒中获得Amp-LacZ-SacB选择盒。将选择盒克隆到用AscI消化的BAC GAd-GAG穿梭载体中，产生BAC GAd-GAG A/L/S穿梭载体(图1)。

穿梭质粒已被设计为包含仅在两个ITR末端存在的限制酶位点(PmeI)，以允许从质粒DNA释放病毒DNA。

实施例3：ΔE1载体的构建

通过蛋白酶K消化，然后通过苯酚/氯仿提取分离GADNOU wt基因组DNA。通过在大肠杆菌病毒株BJ5183中的同源重组获得pGADNOU19和pGADNOU20载体。通过将大肠杆菌病毒株BJ5183细胞与纯化的WT病毒DNA和BAC GAd-GAG A/L/S穿梭载体共转化，获得病毒DNA的克隆。pIX基因、存在于穿梭BAC末端的右ITR DNA序列(用AscI消化)和病毒基因组DNA之间的同源重组允许通过同时缺失被表达盒替代的E1区来将其插入BAC载体，生成ΔE1/GAG(BAC)载体GADNOU19 GAG BAC和GADNOU20 GAG BAC。通过限制性分析和六邻体区域PCR测序进行筛选。

实施例4：ΔE3载体的构建

构建策略基于以下两个连续步骤：

a)用Amp-LacZ-SacB选择盒替代E3区：

Amp-LacZ-SacB选择盒通过使用寡核苷酸FW(5′-GGATTACACCAAGATCTTTGCTGTCATTTGTGTGCTGAGTATAATAAAGGCTGAGATCAGAATCTACTCGACCCCTATTTGTTTATTTTTCT-3′，SEQ IDNO：66)和RV(5′-CTTGCTATCAGATTTCAAGTAAGTGATTTTTTATTGATTACAGTTATGATCAATTGAAAGGGATAAGGTCTTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3′，SEQ ID NO：67)通过PCR扩增从BAC GAD-GAD-GAGA/L/S穿梭载体获得。然后通过重组技术将通过PCR获得的DNA片段克隆到GAdNou19 GAGBAC和GAdNou20 GAG BAC中，获得GAdNou19 GAG(DE1E3)A/L/S BAC和GAdNou20 GAG(DE1E3)A/L/S BAC。

b)删除用于E3区缺失的Amp-lacZ-SacB选择盒：

使用单链寡核苷酸(5′ctgtcatttgtgtgctgagtataataaaggctgagatcagaatctactcggaccttatccctttcaattgatcataactgtaatcaataaaaaatcactt-3′，SEQ ID NO：68)删除Amp-LacZ-SacB选择盒，获得用ss寡核苷酸替代Amp-LacZ-SacB选择盒并随后缺失E3区。ss寡核苷酸用于通过重组技术将选择盒替换为GADNOU19 GAG(DE1E3)A/L/S BAC和GADNOU20 GAG(DE1E3)A/L/S BAC，以产生最终质粒GADNOU19 GAG(DE1E3)BAC(图2)和GADNOU20 GAG(DE1E3)BAC(图3)。

实施例5：新型腺病毒载体的改善的生产率

在Hek293贴壁细胞中评估了两个携带E1缺失并表达GAG抗原的非人类人猿腺病毒载体GADNOU19和GADNOU 20的生产率。与带有相同表达盒的基准Ad5载体相比，通过用MOI100和MOI 300vp/细胞的纯化病毒感染T25贴壁细胞来评估生产率。感染后三天收集感染的细胞，此时完全致细胞病变明显；通过三个冷冻/融化(-70℃/37℃)循环将病毒从感染的细胞中释放出来，然后通过离心澄清裂解物。用引物和与CMV启动子区域互补的探针通过定量PCR对澄清的裂解物进行定量。寡核苷酸序列如下：CMVfw为5′-CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3′(SEQ ID NO：69)，CMVrv为5′-GACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3(SEQ ID NO：70)，CMVFAM-TAMRA探针为5′-ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3′(SEQ ID NO：71)。QPCR在ABIPrism 7900序列检测器-Applied Biosystem上运行。表达GAG的GADNOU19和GADNOU的每细胞病毒颗粒(vp/细胞)所产生的特定生产率明显高于携带相同表达盒的基准Ad5载体(图1)。

提高生产率的基本原理：本发明的腺病毒基因组属于腺病毒的C组，已知其具有高的免疫学效力。同时，C组病毒的特点是生产率相对较低。发明人已经发现，本发明的腺病毒基因组包含不同于许多其他C组腺病毒的特定基因组特征。该特征由基因组中存在的一对非编码RNA(所谓的病毒相关(VA)RNA I和II)代表，它们各自的长度约为170个核苷酸，并相隔约60个核苷酸。通常，VA RNA I和II均存在，但在某些情况下(A组病毒和某些B组病毒)仅存在VA RNA I。已知这些RNA与病毒对细胞防御机制的干扰有关。另外，VA RNA I和II都被细胞酶进一步加工成微RNA。然而，这些微RNA的确切功能尚不清楚。

通过分析已知腺病毒的序列，发明人发现本发明基因组的VA RNA I和II与其他C组腺病毒(例如人Ad5和Ad2，也包括属于C组的许多黑猩猩分离物)，但更类似于来自B组和E组的VA RNA I和VA RNA II。已计算出组内和组间VA RNA I和II序列的平均序列同一性，并显示在下表3。

表3：C*组、B组、E组、D组、A组、C组中的VA RNA I和在C*组、B组、E组、D组、C组中的VA RNA II的平均序列同一性百分比以及C*组相对于其他组的平均序列同一性。C*组代表根据本发明的GADNOU病毒。

因此，认为这些RNA导致病毒的更高复制。根据发明人的最佳认知，VA RNA迄今为止从未与腺病毒的生产率提高相关。

实施例6：Gad载体的免疫原性

在BALB/c小鼠中评估编码HIV-1 gag(SEQ ID NO：74)的两种GADNOU载体(GADNOU19 GAG(DE1E3)，SEQ ID NO：72和GADNOU20 GAG(DE1E3)，SEQ ID NO：73)的免疫原性。每组六只动物以递增剂量的每种GADNOU载体进行肌内免疫。通过使用编码HIV gag主要H-2 Kd CD8+表位的9聚体肽(AMQMLKETI)作为抗原，对3周后收集的脾细胞进行ELISpot。数据显示在3x10^7vp(病毒颗粒)的最高测试剂量下，两种载体均诱导了较强的免疫原性。同样，在较低的3x10^6vp剂量下，两种载体仍然能够在50％的接种疫苗的小鼠中诱导HIV-1gag特异性T细胞应答(图5)。

Claims (15)

1.一种编码腺病毒六邻体蛋白的分离的多核苷酸，其包含：

A)(i)HVR1，其包含根据SEQ ID NO：11的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在27位不为A的其变体，

(ii)HVR2，其包含根据SEQ ID NO：12的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在1位不为L的其变体，

(iii)HVR3，其包含根据SEQ ID NO：13的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在7位不为V的其变体，

(iv)HVR4，其包含根据SEQ ID NO：14的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，

(v)HVR5，其包含根据SEQ ID NO：15的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，

(vi)HVR6，其包含根据SEQ ID NO：16的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，和

(vii)HVR7，其包含根据SEQ ID NO：17的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在1位不为I的其变体；或

B)(i)HVR1，其包含根据SEQ ID NO：18的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在8位不为V、在12位不为D、在13位不为E和/或在14位不为L的其变体，

(ii)HVR2，其包含根据SEQ ID NO：19的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在10位不为D的其变体，

(iii)HVR3，其包含根据SEQ ID NO：20的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在6位不为T的其变体，

(iv)HVR4，其包含根据SEQ ID NO：21的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在9位不为L的其变体，

(v)HVR5，其包含根据SEQ ID NO：22的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在3位不为T的其变体，

(vi)HVR6，其包含根据SEQ ID NO：23的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在9位不为I的其变体，和

(vii)HVR7，其包含根据SEQ ID NO：24的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在8位不为I的其变体；或

C)(i)HVR1，其包含根据SEQ ID NO：25的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，

(ii)HVR2，其包含根据SEQ ID NO：26的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，

(iii)HVR3，其包含根据SEQ ID NO：27的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在7位不为V的其变体，

(iv)HVR4，其包含根据SEQ ID NO：28的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在10位不为E的其变体，

(v)HVR5，其包含根据SEQ ID NO：29的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在3位不为T的其变体，

(vi)HVR6，其包含根据SEQ ID NO：30的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在9位不为I的其变体，和

(vii)HVR7，其包含根据SEQ ID NO：31的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在8位不为I和/或在11位不为T的其变体；或

D)(i)HVR1，其包含根据SEQ ID NO：32的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，

(ii)HVR2，其包含根据SEQ ID NO：33的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，

(iii)HVR3，其包含根据SEQ ID NO：34的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在6位不为T的其变体，

(iv)HVR4，其包含根据SEQ ID NO：35的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在6位不为Q和/或在10位不为E的其变体，

(v)HVR5，其包含根据SEQ ID NO：36的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在3位不为T的其变体，

(vi)HVR6，其包含根据SEQ ID NO：37的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在1位不为K的其变体，和

(vii)HVR7，其包含根据SEQ ID NO：38的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在8位不为I的其变体；或

E)(i)HVR1，其包含根据SEQ ID NO：39的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在27位不为A的其变体，

(ii)HVR2，其包含根据SEQ ID NO：40的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，

(iii)HVR3，其包含根据SEQ ID NO：41的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，

(iv)HVR4，其包含根据SEQ ID NO：42的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，

(v)HVR5，其包含根据SEQ ID NO：43的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，

(vi)HVR6，其包含根据SEQ ID NO：44的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，和

(vii)HVR7，其包含根据SEQ ID NO：45的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性且在1位不为I的其变体。

2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述六邻体蛋白

A)包含根据SEQ ID NO：46的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，

B)包含根据SEQ ID NO：47的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，

C)包含根据SEQ ID NO：48的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，

D)包含根据SEQ ID NO：49的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体，和/或

E)包含根据SEQ ID NO：50的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的分离的多核苷酸，其还编码包含根据SEQ ID NO：51或52的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体的腺病毒五邻体蛋白。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的多核苷酸，其还编码包含根据SEQ ID NO：53或54的氨基酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体的腺病毒纤维蛋白。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的多核苷酸，其还编码包含根据SEQ ID NO：57的核苷酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体的VA RNA II非编码RNA，和/或包含根据SEQ ID NO：55或56的核苷酸序列、或具有至少85％序列同一性的其变体的VA RNA I非编码RNA。

6.一种分离的多核苷酸，其编码腺病毒，优选无复制能力的腺病毒，所述腺病毒，优选无复制能力的腺病毒包含根据权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸。

7.根据权利要求6所述的分离的多核苷酸，其中所述腺病毒是嵌合腺病毒和/或携带非腺病毒基因、蛋白质或其片段。

8.通过根据权利要求1至4中任一项所述的分离的多核苷酸编码的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽。

9.一种分离的腺病毒，优选无复制能力的腺病毒，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的分离的多核苷酸和/或根据权利要求8所述的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽。

10.一种通过根据权利要求1至7中任一项所述的分离的多核苷酸编码的病毒样颗粒。

11.一种包含根据权利要求1至7中任一项所述的分离的多核苷酸的载体。

12.一种组合物，其包含(i)佐剂，(ii)根据权利要求1至7中任一项所述的分离的多核苷酸、根据权利要求8所述的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽、根据权利要求9所述的腺病毒、根据权利要求10所述的病毒样颗粒、或根据权利要求11所述的载体，和任选的(iii)药学上可接受的赋形剂。

13.一种细胞，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求8所述的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽、根据权利要求9所述的腺病毒、根据权利要求10所述的病毒样颗粒或根据权利要求11所述的载体。

14.根据权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求8所述的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽、根据权利要求9所述的腺病毒、根据权利要求10所述的病毒样颗粒、或根据权利要求11所述的载体和/或根据权利要求12所述的组合物用于治疗或预防疾病的用途。

15.一种用于制备腺病毒或腺病毒样颗粒的体外方法，其包括以下步骤：

(i)在细胞中表达根据权利要求1至7中任一项所述的分离的多核苷酸，从而在细胞中组装腺病毒或腺病毒样颗粒，

(ii)从细胞或细胞周围的培养基中分离腺病毒或腺病毒样颗粒。

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