ES2906441T3

ES2906441T3 - Secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del adenovirus de los grandes simios no humanos, vectores que las contienen y usos de las mismas

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Publication number: ES2906441T3
Application number: ES18737898T
Authority: ES
Inventors: Alfredo Nicosia; Stefano Colloca; Armin Lahm
Original assignee: Nouscom AG
Current assignee: Nouscom AG
Priority date: 2017-07-05
Filing date: 2018-07-05
Publication date: 2022-04-18
Anticipated expiration: 2038-07-05
Also published as: WO2019008111A1; IL271835B1; NZ759892A; AU2018295421A1; PL3649237T3; RU2762854C2; KR102582561B1; CN111108192A; IL271835A; CA3066962A1; JP7274222B2; US11098324B2; RU2019144161A; US20210130848A1; CN111108192B; HUE058778T2; JP2020530761A; EP3649237B1; AU2018295421B2; KR20200024296A

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica una proteína hexón de adenovirus que comprende: (i) una HVR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11 (ii) una HVR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, (iii) una HVR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 13, (iv) una HVR4 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 14, (v) una HVR5 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 15, (vi) una HVR6 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 16, y (vii) una HVR7 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 17.

Description

DESCRIPCIÓN

Secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del adenovirus de los grandes simios no humanos, vectores que las contienen y usos de las mismas

La presente enseñanza se refiere a nuevas cepas de adenovirus con alta inmunogenicidad y sin inmunidad preexistente en la población humana general. La falta de inmunidad preexistente se debe a nuevas regiones hipervariables de la proteína hexón de la cápside adenoviral. Las nuevas cepas de adenovirus también tienen una capacidad de reproducción mejorada. La presente enseñanza proporciona secuencias de nucleótidos y aminoácidos de estas nuevas cepas de adenovirus, así como virus recombinantes, partículas similares a virus y vectores basados en estas cepas. Además se proporcionan composiciones farmacéuticas y usos médicos en la terapia o profilaxis de una enfermedad, y métodos para producir un adenovirus o partículas similares a virus utilizando secuencias novedosas, virus recombinantes, partículas similares a virus y vectores.

Introducción

Los adenovirus (Ads) comprenden una gran familia de virus de ADN de doble cadena que se encuentran en anfibios, aves y mamíferos que tengan una estructura de cápside icosaédrica sin envoltura (Straus, Adenovirus infections in humans; The Adenoviruses, 451-498, 1984; Hierholzer et al., J. Infect.Dis.,158: 804-813,1988; Schnurr y Dondero, Intervirology., 36: 79-83,1993; Jong et al., J. Clin. Microbiol., 37: 3940-3945: 1999). A diferencia de los retrovirus, los adenovirus pueden transducir numerosos tipos de células de varias especies de mamíferos, incluidas células en división y no en división, sin integrarse en el genoma de la célula huésped.

En términos generales, el ADN adenoviral suele ser muy estable y permanece episomal (p. ej., extracromosómico), a menos que se produzca transformación o tumorigénesis. Además, los vectores adenovirales se pueden propagar con altos rendimientos en sistemas de producción bien definidos que se prestan fácilmente a la producción a escala farmacéutica de composiciones de grado clínico. Estas características y su genética molecular bien caracterizada hacen que los vectores adenovirales recombinantes sean buenos candidatos para su uso como portadores de vacunas. La producción de vectores adenovirales recombinantes puede basarse en el uso de una línea celular de empaquetamiento que sea capaz de complementar las funciones de los productos génicos adenovirales que se han eliminado o manipulado para que no sean funcionales.

En la actualidad, dos serotipos de adenovirus del subgrupo C humano bien caracterizados (es decir, hAd2 y hAd5) se usan ampliamente como fuentes de la cadena principal del virus para la mayoría de los vectores adenovirales que se usan para la terapia génica. Los vectores adenovirales humanos con replicación defectuosa también se han probado como portadores de vacunas para el suministro de una variedad de inmunógenos derivados de una variedad de agentes infecciosos. Los estudios realizados en animales de experimentación (p. ej., roedores, caninos y primates no humanos) indican que los vectores adenovirales humanos recombinantes defectuosos en la replicación que portan transgenes que codifican inmunógenos, así como otros antígenos, provocan respuestas inmunitarias humorales y mediadas por células contra el producto transgénico. En términos generales, los investigadores han informado sobre el éxito en el uso de vectores adenovirales humanos como portadores de vacunas en sistemas experimentales no humanos mediante el uso de protocolos de inmunización que utilizan altas dosis de vectores adenovirales recombinantes que se prevé que provocarán respuestas inmunitarias; o mediante el uso de protocolos de inmunización que emplean la administración secuencial de vectores adenovirales que se derivan de diferentes serotipos pero que portan el mismo producto transgénico que las inmunizaciones de refuerzo (Mastrangeli, et. al., Human Gene Therapy, 7: 79-87 (1996)).

Los vectores derivados de adenovirus de la especie C (p. ej., Ad5, Ad6 y ChAd63) son los más inmunogénicos (Colloca et al., Sci. Transl. Med. 4 (115), 2012). En particular, se han desarrollado vectores virales basados en adenovirus humano tipo 5 (Ad5) para aplicaciones de terapia génica y vacunas. Aunque los vectores basados en Ad5 son extremadamente eficientes en modelos animales, se ha demostrado en ensayos clínicos que la presencia de una inmunidad preexistente en humanos contra el virus de tipo silvestre Ad5 reduce la eficiencia de la transducción génica. Moore JP et al., Science. 9 de mayo de 2008; 320(5877): 753-5). Por lo tanto, la inmunidad en la población general limita la amplia aplicación de vacunas con vectores Ad basadas en Ad5. Por otro lado, los adenovirus humanos raros son menos inmunogénicos que Ad5 (Colloca et al., Sci. Transl. Med. 4 (115), 2012). Los vectores basados en adenovirus no humanos no tienen una inmunidad preexistente en la población humana general (Farina et al., J. Virol.

75 (23), 11603-11613, 2001). El documento WO 2010/051367 A1 divulga adenovirus de simio y usos de los mismos.

No obstante, existe la necesidad de vectores de adenovirus con alta inmunogenicidad y una inmunidad preexistente baja o ausente en humanos. Preferiblemente, estos vectores de adenovirus tienen una alta productividad en términos de su replicación.

Sumario de la invención

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas y se basa en las enseñanzas generales que incluyen los diversos aspectos y facetas que se describen a continuación.

Antecedentes en el estado de la técnica

En un primer aspecto, la enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una proteína hexón de adenovirus que comprende:

A)

(i) una primera región hipervariable HVR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11 y sin A y preferiblemente con V en la posición 27,

(ii) una segunda región hipervariable HVR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 12 y sin L y preferiblemente con una I en la posición 1,

(iii) una tercera región hipervariable HVR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 13, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 13 y sin V y preferiblemente con A en la posición 7,

(iv) una cuarta región hipervariable HVR4 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 14, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14, (v) una quinta región hipervariable HVR5 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 15, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 15, (vi) una sexta región hipervariable HVR6 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 16, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 16, y (vii) una séptima región hipervariable HVR7 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 17, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 17 sin I y preferiblemente con V en la posición 1; o

B)

(i) una primera región hipervariable HVR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 18, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 18 sin V y preferiblemente con una E en la posición 8, sin D y preferiblemente con una E en la posición 12, sin E y preferiblemente con una D en la posición 13, y/o sin L y preferiblemente con una V en la posición 14,

(ii) una segunda región hipervariable HVR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 19, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 19 sin D y preferiblemente con una E en la posición 10,

(iii) una tercera región hipervariable HVR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 20, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 20 sin T y preferiblemente con A en la posición 6,

(iv) una cuarta región hipervariable HVR4 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 21, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 21 sin L y preferiblemente con una M en la posición 9,

(v) una quinta región hipervariable HVR5 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 22, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 22 sin T y preferiblemente con una S en la posición 3,

(vi) una sexta región hipervariable HVR6 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 23, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 23 sin I y preferiblemente con V en la posición 9, y

(vii) una séptima región hipervariable HVR7 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 24, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 24 sin I y preferiblemente con V en la posición 8; o

C)

(i) una primera región hipervariable HVR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 25, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 25, (ii) una segunda región hipervariable HVR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 26, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 26, (iii) una tercera región hipervariable HVR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 27, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 27 sin V y preferiblemente con una A en la posición 7,

(iv) una cuarta región hipervariable HVR4 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 28, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 28 sin E y preferiblemente con una Q en la posición 10,

(v) una quinta región hipervariable HVR5 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 29, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 29 sin T y preferiblemente con una S en la posición 3,

(vi) una sexta región hipervariable HVR6 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 30, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 30 sin I y preferiblemente con V en la posición 9, y

(vii) una séptima región hipervariable HVR7 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 31, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 31 sin I y preferiblemente con V en la posición 8 y/o sin T y preferiblemente con S en la posición 11; o

D)

(i) una primera región hipervariable HVR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 32, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 32, (ii) una segunda región hipervariable HVR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 33, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 33, (iii) una tercera región hipervariable HVR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 34, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 34 sin T y preferiblemente con A en la posición 6,

(iv) una cuarta región hipervariable HVR4 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 35, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 35 sin Q y preferiblemente con una K en la posición 6 y/o sin E y preferiblemente con una Q en la posición 10,

(v) una quinta región hipervariable HVR5 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 36, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 36 sin T y preferiblemente con una S en la posición 3,

(vi) una sexta región hipervariable HVR6 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 37, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 37 sin K y preferiblemente con T en la posición 1 y/o sin I y preferiblemente con V en la posición 9, y

(vii) una séptima región hipervariable HVR7 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 38, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 38 sin I y preferiblemente con V en la posición 8; o

E)

(i) una primera región hipervariable HVR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 39, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 39 sin A y preferiblemente con V en la posición 27,

(ii) una segunda región hipervariable HVR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 40, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 40, (iii) una tercera región hipervariable HVR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 41, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 41, (iv) una cuarta región hipervariable HVR4 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 42, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 42, (v) una quinta región hipervariable HVR5 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 43, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 43, (vi) una sexta región hipervariable HVR6 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 44, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 44, y (vii) una séptima región hipervariable HVR7 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 45, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 45 sin I y preferiblemente con V en la posición 1.

En un segundo aspecto, la enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica un adenovirus, preferiblemente un adenovirus incompetente para la replicación que comprendel polinucleótido del primer aspecto.

En un tercer aspecto, la enseñanza proporciona al menos una cápside adenoviral aislada codificada por un polinucleótido aislado del primer aspecto.

En un cuarto aspecto, la enseñanza proporciona un adenovirus codificado por un polinucleótido aislado del primer aspecto o un adenovirus aislado, preferiblemente un adenovirus incompetente para la replicación, que comprende al menos una cápside adenoviral aislada de acuerdo con el tercer aspecto.

En un quinto aspecto, la enseñanza proporciona una partícula similar a virus codificada por un polinucleótido aislado del primer aspecto.

En un sexto aspecto, la enseñanza proporciona un vector que comprende un polinucleótido aislado del primer aspecto.

En un séptimo aspecto, la enseñanza proporciona una composición que comprende (i) un adyuvante, (ii) un polinucleótido aislado del primer o segundo aspecto, al menos una cápside adenoviral aislada del tercer aspecto, un adenovirus del cuarto aspecto, una partícula similar a virus del quinto aspecto, o un vector del sexto aspecto, y opcionalmente (iii) un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En un octavo aspecto, la enseñanza proporciona una célula que comprende un polinucleótido aislado del primer o segundo aspecto, al menos una cápside adenoviral aislada del tercer aspecto, un adenovirus del cuarto aspecto, una partícula similar a virus del quinto aspecto, o un vector del sexto aspecto.

En un noveno aspecto, la enseñanza proporciona un polinucleótido aislado del primer o segundo aspecto, al menos una cápside adenoviral aislada del tercer aspecto, un adenovirus del cuarto aspecto, una partícula similar a virus del quinto aspecto, o un vector del sexto aspecto y/o la composición del séptimo aspecto para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad.

En un décimo aspecto, la enseñanza se relaciona con un método in vitro para producir un adenovirus o una partícula similar a adenovirus, que comprende las etapas de

(i) expresar un polinucleótido aislado del primer o segundo aspecto en una célula de manera que se ensamble en la célula un adenovirus o una partícula similar a un adenovirus,

(ii) aislar el adenovirus o la partícula similar a adenovirus de la célula o del medio que rodea a la célula.

Descripción detallada

Antes de que la presente enseñanza se describa en detalle a continuación, debe entenderse que esta enseñanza no se limita a la metodología, los protocolos y los reactivos particulares descritos en este documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir facetas particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente enseñanza que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la materia. Preferiblemente, los términos utilizados en este documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza) y como se describe en "Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications" por Axel Kleemann y Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999; el "Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals", editado por Susan Budavari et al., CRC Press, 1996, y la Farmacopea de los Estados Unidos-25/Formulario nacional-20, publicada por United States Pharmcopeial Convention, Inc., Rockville Md., 2001.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende" y variaciones tales como "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de una característica, número entero o etapa o grupo de características, números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de ninguna otra característica, número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. En los siguientes pasajes se definen con más detalle diferentes aspectos de la enseñanza. Cada aspecto así definido puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.

Leyendas de cada una de las figuras

Figura 1: Vista esquemática del vector lanzadera BAC de GAd-GAG A/L/S.

Figura 2: Vista esquemática del plásmido BAC de GAG GAdNou19 con eliminación de E1 y E3 (DE1E3).

Figura 3: Vista esquemática del plásmido BAC de GAG GAdNou20 con eliminación E1 y E3 (DE1E3).

Figura 4: Productividad de GADNOU19 y GADNOU20 en Hek293 en comparación con el vector Ad5 de referencia que porta el mismo casete de expresión.

Figura 5: Inmunogenicidad de los vectores GADNOU19 y GADNOU20 que codifican el antígeno GAG. La potencia inmunológica de los vectores GADNOU19 (DE1DE3) y GAG GADNOU20 (DE1DE3) se determinó mediante ELISpot IFN-y. Las respuestas de las células T se miden 3 semanas después de la inmunización con 3x107 y 3x106 vp de cada vector. Se muestra el número de células T que producen IFNy por millones de esplenocitos en respuesta a la estimulación con el péptido gag inmunodominante que codifica un epítopo CD8+.

Secuencias de nucleótidos y aminoácidos

La siguiente Tabla 1 proporciona una descripción general de las secuencias a las que se hace referencia en este documento (GADNOU número: cepa adenoviral aislada; *: secuencia de nucleótidos correspondiente del genoma de GADNOU que codifica la secuencia de aminoácidos, la correspondencia de la secuencia es de acuerdo con el orden indicado, por ejemplo, para la SEQ ID NO: 11, HVR1 GADNOU 20 corresponde a x-x de la SEQ ID NO: 1, HVR1 GADNOU 21 corresponde a x-x de la SEQ ID NO: 2, y HVR1 GADNOU 25 corresponde a x-x de la SEQ ID NO: 3). GADNOU es la designación de cepa de los inventores. La extensión de las coordenadas genómicas para el hexón, pentón, fibra que se proporciona a continuación (las SEQ ID NOs: 46-54 en los genomas de GADNOU) no incluye el codón de parada final, que se incluye/añade opcionalmente en esta divulgación cuando se hace referencia a un polinucleótido que codifica hexón, pentón o fibra usando las coordenadas.

Tabla 1: las SEQ ID NOs a las que se hace referencia en la solicitud

Las siguientes Tablas 2a y 2b proporcionan los límites/coordenadas genómicos de CDS, ARN e ITR en los genomas de GADNOU. Se aplican a cualquier referencia a los elementos genómicos del presente documento que se enumeran en estas tablas y se incorporan como se prefiera en las facetas respectivas.

Tabla 2a: Límites genómicos de CDS, ARN e ITR para GADNOU19, GADNOU20, GADNOU21, GADNOU29, GADNOU30, GADNOU31. E3_Orf2* denota un marco de lectura abierto putativo que tenga un GTG como codón inicial. rc denota complemento inverso. Los productos generados por empalme se indican mediante múltiples pares de coordenadas.

Tabla 2b: Límites genómicos de los CDS, ARN e ITR para GADNOU25, GADNOU26, GANOU27, GADNOU28. E3_Orf2* denota un marco de lectura abierto putativo que tenga un GTG como codón inicial. rc denota complemento inverso. Los productos generados por empalme se indican mediante múltiples pares de coordenadas.

Aspectos de la enseñanza y facetas particulares de la misma

La enseñanza se relaciona con varios aspectos como se establece anteriormente en el resumen de la enseñanza. Estos aspectos comprenden facetas alternativas y facetas preferidas, que se describen a continuación.

En un primer aspecto, la enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una proteína hexón de adenovirus como se define en el sumario de la enseñanza anterior.

En una faceta preferida, las variantes de HVR tienen al menos un 90%, y más preferiblemente al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO respectiva. Como alternativa a la definición por un nivel porcentual de identidad de secuencia, las variantes de HVR se pueden definir para que tengan un cierto número de mutaciones de aminoácidos dentro de la SEQ ID NO respectiva. El número de mutaciones es entonces el siguiente: en lugar de al menos un 85% de identidad de secuencia, hasta 4 mutaciones en cualquier HVR1, hasta 2 mutaciones en cualquier HVR2, hasta 1 mutación en cualquier HVR3, hasta 1 mutación en cualquier HVR4, hasta 2 mutaciones en cualquier HVR5, hasta 1 mutación en cualquier HVR6 y hasta 3 mutaciones en cualquier HVR7; en lugar de al menos un 90% de identidad de secuencia, hasta 2 mutaciones en cualquier HVR1, hasta 1 mutación en cualquier HVR2, hasta 1 mutación y preferiblemente sin mutación en cualquier HVR3, hasta 1 mutación en cualquier HVR4, hasta 1 mutación en cualquier HVR5, hasta 1 mutación y preferiblemente sin mutación en cualquier HVR6, y hasta 2 mutaciones en cualquier HVR7; en lugar de al menos 95% de identidad de secuencia, hasta 1 mutación en cualquier HVR1, hasta 1 mutación y preferiblemente ninguna mutación en cualquier HVR2, hasta 1 mutación y preferiblemente ninguna mutación en cualquier HVR3, hasta 1 mutación y preferiblemente ninguna mutación en cualquier HVR4, hasta 1 mutación y preferiblemente ninguna mutación en cualquier HVR5, hasta 1 mutación y preferiblemente ninguna mutación en cualquier HVR6, y hasta 1 mutación en cualquier HVR7.

Como se conoce en la técnica, por ejemplo, de Bradley et al. (J Virol., enero de 2012; 86(2): 1267-72), los anticuerpos neutralizantes de adenovirus se dirigen a las regiones hipervariables de hexón, y al reemplazar las regiones HVR de un adenovirus con prevalencia en suero, ese adenovirus puede evadir el sistema inmunitario en el huésped inmunitario. Por lo tanto, aunque las HVR anteriores se pueden usar con las respectivas proteínas hexón definidas a continuación, tienen una utilidad independiente de esas proteínas hexón y también de las siguientes proteínas pentón y de fibra, es decir, reemplazando las HVR del hexón en un adenovirus diferente que tenga otro hexón, pentón y/o proteínas de fibra.

En una faceta preferida, la proteína hexón de acuerdo con

A) comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 46, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 46,

B) comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 47, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 47,

C) comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO : 48, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 48,

D) comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO : 49, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 49, y/o

E) comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 50, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 50

En una faceta preferida, las variantes de hexón tienen al menos un 90%, y preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO respectiva. Como alternativa a la definición por un nivel porcentual de identidad de secuencia, las variantes de hexón se pueden definir para que tengan un cierto número de mutaciones de aminoácidos dentro de la SEQ ID NO respectiva. El número de mutaciones es entonces el siguiente: en lugar de al menos un 85% de identidad de secuencia, hasta 143 mutaciones en cualquier hexón; en lugar de al menos 90% de identidad de secuencia, hasta 95 mutaciones en cualquier hexón; en lugar de al menos 95% de identidad de secuencia, hasta 47 mutaciones en cualquier hexón; en lugar de al menos 96% de identidad de secuencia, hasta 38 mutaciones en cualquier hexón; en lugar de al menos 97% de identidad de secuencia, hasta 28 mutaciones en cualquier hexón; en lugar de al menos 98% de identidad de secuencia, hasta 19 mutaciones en cualquier hexón; en lugar de al menos 99% de identidad de secuencia, hasta 9 mutaciones en cualquier hexón. Debe entenderse que las variantes de hexón no tienen menos identidad de secuencia ni más mutaciones en sus HVR que las definidas para las respectivas HVR anteriores.

En una faceta, el polinucleótido aislado del primer aspecto codifica además una proteína pentón adenoviral que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 51 o 52, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 51 o 52. En una faceta preferida, las variantes de pentón tienen al menos un 90%, y preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO respectiva. Como alternativa a la definición por un nivel porcentual de identidad de secuencia, las variantes de pentón se pueden definir para que tengan un cierto número de mutaciones de aminoácidos dentro de la SEQ ID NO respectiva. El número de mutaciones es entonces el siguiente: en lugar de al menos un 85% de identidad de secuencia, hasta 97 mutaciones en cualquier pentón; en lugar de al menos un 90% de identidad de secuencia, hasta 65 mutaciones en cualquier pentón; en lugar de al menos un 95% de identidad de secuencia, hasta 32 mutaciones en cualquier pentón; en lugar de al menos un 96% de identidad de secuencia, hasta 26 mutaciones en cualquier pentón; en lugar de al menos un 97% de identidad de secuencia, hasta 19 mutaciones en cualquier pentón; en lugar de al menos un 98% de identidad de secuencia, hasta 13 mutaciones en cualquier pentón; en lugar de al menos un 99% de identidad de secuencia, hasta 6 mutaciones en cualquier pentón.

Preferiblemente, las variantes de pentón de la SEQ ID NO 51 y 52 no tienen ninguna D y preferiblemente una G en la posición 289 y ninguna D y preferiblemente una N en la posición 341. Más preferiblemente, la variante de la SEQ ID NO: 52 tampoco tiene A y más preferiblemente tiene una T en la posición 442.

En otra faceta, el polinucleótido aislado del primer aspecto además (es decir, junto al hexón y posiblemente la proteína pentón) codifica una proteína de fibra adenoviral que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 53 o 54, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 53 o 54. En una faceta preferida, las variantes de fibra tienen al menos un 90%, y preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO respectiva. Como alternativa a la definición por un nivel porcentual de identidad de secuencia, las variantes de fibra se pueden definir para que tengan un cierto número de mutaciones de aminoácidos dentro de la SEQ ID NO respectiva. El número de mutaciones es entonces el siguiente: en lugar de al menos un 85% de identidad de secuencia, hasta 89 mutaciones en cualquier fibra; en lugar de al menos 90% de identidad de secuencia, hasta 59 mutaciones en cualquier fibra; en lugar de al menos 95% de identidad de secuencia, hasta 29 mutaciones en cualquier fibra; en lugar de al menos 96% de identidad de secuencia, hasta 23 mutaciones en cualquier fibra; en lugar de al menos 97% de identidad de secuencia, hasta 17 mutaciones en cualquier fibra; en lugar de al menos 98% de identidad de secuencia, hasta 11 mutaciones en cualquier fibra; en lugar de al menos 99% de identidad de secuencia, hasta 5 mutaciones en cualquier fibra.

Preferiblemente, las variantes de fibra de la SEQ ID NO: 53 no tienen A y preferiblemente una P en la posición 181, no tienen V y preferiblemente una I en la posición 474 y/o no tienen inserción de una S y preferiblemente no tienen inserción de aminoácidos entre las posiciones 4 y 5. Preferiblemente, las variantes de fibra de la SEQ ID NO: 54 no tienen T y preferiblemente una I en la posición 90 y/o una S en la posición 7 (preferiblemente una S en cada una de las posiciones 4-7).

En otra faceta, el polinucleótido aislado del primer aspecto además (es decir, junto al hexón y posiblemente el pentón y/o la proteína de fibra) codifica un ARN no codificante de ARN II VA que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 57, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 57. Alternativamente o además, puede codificar un ARN no codificante de ARN I VA que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la s Eq ID NO: 55 o 56, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 55 o 56, respectivamente. En una faceta preferida, las variantes de ARN VA tienen al menos un 90%, y preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO respectiva. Como alternativa a la definición por un nivel porcentual de identidad de secuencia, las variantes de ARN VA se pueden definir para tener un cierto número de mutaciones de nucleótidos dentro de la SEQ ID NO respectiva. El número de mutaciones es entonces el siguiente: en lugar de al menos un 85% de identidad de secuencia, hasta 25 mutaciones en ARN I VA y hasta 26 mutaciones en ARN II VA; en lugar de al menos un 90% de identidad de secuencia, hasta 16 mutaciones en ARN I VA y hasta 17 mutaciones en ARN II VA; en lugar de una identidad de secuencia de al menos el 95%, hasta 8 mutaciones en cualquier ARN VA; en lugar de al menos un 96% de identidad de secuencia, hasta 6 mutaciones en cualquier ARN VA; en lugar de una identidad de secuencia de al menos el 97%, hasta 5 mutaciones en cualquier ARN VA; en lugar de una identidad de secuencia de al menos el 98%, hasta 3 mutaciones en cualquier ARN VA; en lugar de al menos un 99% de identidad de secuencia, hasta 1 mutación en cualquier ARN VA.

Preferiblemente, la variante de ARN II VA de la SEQ ID NO: 57 tiene (a) ninguna C en la posición 79 y/o ninguna A en la posición 80, y preferiblemente una T en la posición 79 y/o una G en la posición 80, y (b) ninguna A en la posición 81, y preferiblemente una G en la posición 81. La variante de ARN I VA de la SEQ ID NO: 55 preferiblemente no tiene G en la posición 80 y preferiblemente tiene una A en la posición 80.

Un ARN VA de acuerdo con la enseñanza conduce a una producción mejorada de adenovirus o partículas similares a adenovirus como se muestra en el Ejemplo 5.

Se prefiere que el polinucleótido del primer aspecto comprenda además otros genes adenovirales y segmentos de nucleótidos, que son adyacentes al gen del hexón, pentón y/o fibra en el genoma del adenovirus, usando las SEQ ID NOs 1-10 como referencia. Se prefiere particularmente que el polinucleótido también comprenda las secuencias requeridas para empaquetar el polinucleótido en una partícula adenoviral.

Generalmente, se prefiere que el polinucleótido aislado del primer aspecto comprenda al menos uno de los siguientes:

(a) un extremo 5' adenoviral, preferiblemente una repetición terminal invertida 5' adenoviral;

(b) una región E1a adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionado entre las regiones 13S, 12S y 9S;

(c) una región E1b adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionado entre el grupo que consiste en las regiones T pequeña, T grande y IX;

(d) una región de ARN VA adenoviral; o un fragmento de la misma seleccionada entre el grupo que consiste en las regiones ARN I VA y ARN II VA;

(e) una región E2b adenoviral; o un fragmento de la misma seleccionada entre el grupo que consiste en las regiones pTP pequeña, Polimerasa e IVa2;

(f) una región L1 adenoviral, o un fragmento de la misma, codificando dicho fragmento una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en proteína de 28.1 kD, polimerasa, agnoproteína, proteína de 52/55 kDa y proteína IIIa;

(g) una región L2 adenoviral, o un fragmento de la misma, codificando dicho fragmento una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína pentón como se definió anteriormente, proteína VII, V y X;

(h) una región L3 adenoviral, o un fragmento de la misma, codificando dicho fragmento una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína VI, la proteína hexón como se definió anteriormente y la endoproteasa;

(i) una región E2a adenoviral, o un fragmento de la misma, codificando dicho fragmento una proteína adenoviral que consta de la proteína DBP;

(j) una región L4 adenoviral, o un fragmento de la misma, codificando dicho fragmento una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína de 100 kD, el homólogo de 22 kD, el homólogo de 33 kD y la proteína VIII;

(k) una región E3 adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionada del grupo que consiste en E3 ORF1, E3 ORF2, E3 ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8 y E3 ORF9;

(l) una región L5 adenoviral, o un fragmento de la misma, codificando dicho fragmento la proteína de fibra como se definió anteriormente;

(m) una región E4 adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionada del grupo que consiste en E4 ORF6/7, E4 ORF6, E4 ORF5, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2 y E4 ORF1; y/o

(n) un extremo 3' adenoviral, preferiblemente una repetición terminal invertida 3' adenoviral.

Estos elementos pueden ser del mismo adenovirus que las HVR y/o hexón del polinucleótido del primer aspecto de acuerdo con la Tabla 1 (es decir, del mismo GADNOU), o de un adenovirus diferente, en particular de una especie diferente, por ejemplo un adenovirus humano, para formar un adenovirus quimérico.

En algunas facetas del polinucleótido mencionado anteriormente, puede ser deseable que el polinucleótido no comprenda una o más regiones genómicas como se describió anteriormente (como en (a) a (m), tal como por ejemplo, la región E3 y/o E4) y/o comprende un gen adenoviral que comprende una eliminación y/o mutación que hace que al menos un gen no sea funcional. En estas facetas preferidas, las regiones adenovirales adecuadas se modifican para no incluir la región o regiones/gen o genes antes mencionados o para hacer que la región o regiones/gen o genes seleccionados no sean funcionales. Una posibilidad para hacerlos no funcionales es introducir uno o más codones de parada artificiales (por ejemplo, TAA) en el marco de lectura abierto de estos genes. Los métodos para hacer que la replicación del virus sea defectuosa son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Brody et al., 1994 Ann NY Acad Sci., 716: 90-101). Una eliminación puede crear espacio para insertar transgenes, preferiblemente dentro de un casete de expresión, tal como un casete de minigenes como se describe en este documento. Además, las eliminaciones pueden usarse para generar vectores adenovirales que son incapaces de replicarse sin el uso de una línea celular de empaquetamiento o un virus auxiliar como es bien conocido en la técnica. Por lo tanto, un adenovirus recombinante final que comprende un polinucleótido como se describió anteriormente que comprende una o más de las eliminaciones de gen/región especificadas o mutaciones de pérdida de función puede proporcionar un adenovirus recombinante más seguro para, por ejemplo, terapia génica o vacunación.

Si bien el polinucleótido puede no comprender al menos una región genómica/gen como se describe en este documento (tal como, por ejemplo, la región E3 y/o E4), específicamente E1A, E1B, E2A, E2B, E3 ORF1, E3 ORF2, E3 ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8, E3 ORF9, E4 ORF6/7, E4 ORF6, E4 ORF5, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2 y/o E4 ORF1, preferiblemente E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y /o E4, y/o comprende un gen adenoviral que comprende una eliminación y/o mutación que hace que al menos un gen no funcional, sea deseable que retenga una región E1a y/o E1b intacta. Dicha región E1 intacta puede ubicarse en su ubicación nativa en el genoma adenoviral 0 colocarse en el sitio de una eliminación en el genoma adenoviral nativo (p. ej., en la región E3).

En una faceta preferida, el polinucleótido aislado del primer aspecto codifica además una o más, preferiblemente todas, de las siguientes proteínas adenovirales: proteína VI, proteína VIII, proteína IX, proteína IIIa y proteína IVa2.

Una persona experta promedio en la técnica de los adenovirus es muy consciente de cómo determinar los marcos de lectura abiertos que codifican las proteínas adenovirales especificadas anteriormente. También conoce la estructura de los genomas adenovirales y puede mapear, sin carga indebida, las regiones adenovirales individuales y los ORF descritos en este documento para cualquier genoma adenoviral.

En otra faceta, el polinucleótido aislado del primer aspecto codifica además una o más proteínas heterólogas o fragmentos de las mismas. La una o más proteínas heterólogas o fragmentos de las mismas son preferiblemente proteínas no adenovirales o fragmentos de las mismas. En una faceta preferida, la una o más proteínas no adenovirales o fragmentos de las mismas son una o más proteínas antigénicas o fragmentos de las mismas. Preferiblemente, la una o más proteínas heterólogas o fragmentos de las mismas forman parte de uno o más casetes de expresión. Las secuencias que codifican una proteína heteróloga y preferiblemente un casete de expresión que comprende dicha secuencia o secuencias que codifican una proteína heteróloga pueden insertarse en, por ejemplo, regiones eliminadas de un genoma adenoviral definido en este documento. Una ejemplo de proteína heteróloga es el polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 74 o variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 74.

En un segundo aspecto, la enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica un adenovirus, que comprende un polinucleótido del primer aspecto, que comprende preferiblemente un genoma adenoviral de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NOs 1-10, o una variante de las mismas que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs 1-10, respectivamente.

En una faceta preferida, codifica un adenovirus incompetente para la replicación, que comprende preferiblemente un genoma adenoviral de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOs 1-10 que carece de una o más de las regiones genómicas/genes E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4.

Lo más preferiblemente, codifica un adenovirus recombinante, preferiblemente que comprende un genoma adenoviral de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOs 1-10, o una variante de las mismas que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs 1-10, respectivamente, preferiblemente en las que se insertan una o más proteínas heterólogas o fragmentos de las mismas (adenovirus portador). Preferiblemente, la una o más proteínas heterólogas o fragmentos de las mismas se insertan reemplazando una o más de las regiones genómicas/genes E1A, E1B, E2A, E2B, E3 ORF1, E3 ORF2, E3 ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8, E3 ORF9, E4 ORF6/7, E4 ORF6, E4 ORF5, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2 y E4 ORF1, más preferiblemente E1, E3 y/o E4. Las proteínas heterólogas o fragmentos de las mismas se insertan preferiblemente como parte de un casete de expresión. Opcionalmente, el adenovirus portador también es incompetente para la replicación como se describe en el presente documento, es decir, carece de una o más regiones genómicas/genes E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4.

En un ejemplo de faceta, la enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica un adenovirus, que comprende un polinucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO 72 o 73, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 72 o 73, respectivamente.

En una faceta preferida, las variantes del genoma adenoviral tienen, en lugar de al menos el 85%, al menos el 90% y preferiblemente al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5 o 99.9% de identidad de secuencia con la SEQ ID n O 1 respectiva, al menos 90% y preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5 o 99.9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 2, al menos 90% y preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5 o 99.9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 3, al menos 90%, y preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5 o 99.9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 4 respectiva, al menos 90% y preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5 o 99.9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 5 respectiva, al menos 90% y preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5 o 99.9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 6 respectiva, al menos 90% y preferiblemente al menos 95%, 96% , 97%, 98%, 99%, 99.5 o 99.9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 7 respectiva, al menos 90%, y preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5 o 99.9% identidad de secuencia con la SEQ ID NO 8 respectiva, al menos 90%, y preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5 o 99.9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 9 respectiva, o al menos 90%, y preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5 o 99.9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 10 respectiva (en cada caso teniendo en cuenta las eliminaciones definidas anteriormente).

En una faceta, el polinucleótido aislado del segundo aspecto codifica un adenovirus recombinante, en el que al menos una región genómica adenoviral del adenovirus recombinante se deriva de un adenovirus que no comprende HVR de hexón o una proteína de hexón como se definió anteriormente (adenovirus quimérico). Preferiblemente, el adenovirus quimérico es quimérico principalmente o preferiblemente solo para una HVR de hexón o proteína hexón y opcionalmente también un pentón y/o proteína de fibra como se define en el presente documento. En otras palabras, el polinucleótido codifica las HVR de hexón o la proteína hexón como se definió anteriormente y, opcionalmente, también para la proteína pentón y/o de fibra como se definió anteriormente, pero una o más, preferiblemente todas las demás regiones genómicas, se derivan de un adenovirus diferente, en particular diferente de un adenovirus de acuerdo con las SEQ ID NOs 1-10. El adenovirus diferente es preferiblemente uno que se encuentra naturalmente en un huésped diferente, más preferiblemente un adenovirus humano. Este polinucleótido preferiblemente codifica también para una o más proteínas heterólogas no adenovirales o fragmentos de las mismas como se definió anteriormente. Por lo tanto, se insertan uno o más genes no adenovirales heterólogos en el genoma adenoviral del adenovirus quimérico. En consecuencia, el genoma adenoviral del adenovirus quimérico es, excepto el ADN que codifica las HVR de hexón o la proteína hexón como se definió anteriormente y opcionalmente el ADN que codifica las proteínas pentón y/o de fibra como se definió anteriormente, derivado de un adenovirus que no es de simio, por ejemplo, un adenovirus humano, preferiblemente un portador no simio, por ejemplo adenovirus humano.

Generalmente se prefiere que el adenovirus sea incompetente para la replicación. Para ello, se prefiere que el adenovirus carezca de una o más de las regiones genómicas E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4 o que presente una eliminación y/o mutación en las mismas que haga que la región genómica o un producto de expresión codificado por ella no sea funcional.

En una faceta particularmente preferida, el polinucleótido aislado del primer o segundo aspecto, en todas sus variantes descritas en el presente documento, puede tener un gen IVa2 funcionalmente debilitado, preferiblemente una eliminación o una mutación nula en él. Este gen está involucrado en el empaquetamiento del ADN viral y su deterioro conduce a la producción de partículas similares a virus. En esta faceta, el polinucleótido aislado del primer o segundo aspecto codifica preferiblemente uno o más epítopos de células B y/o epítopos de células T no adenovirales.

En un tercer aspecto, la enseñanza proporciona al menos una cápside adenoviral aislada codificada por un polinucleótido del primer o segundo aspecto. La al menos una cápside adenoviral aislada comprende al menos un hexón con las HVR como se definió anteriormente, preferiblemente la proteína hexón definida anteriormente, y opcionalmente también la proteína pentón y/o de fibra definida anteriormente.

Al menos una cápside adenoviral aislada puede obtenerse por expresión en una célula. El polipéptido polipéptidos expresados se pueden purificar opcionalmente usando técnicas estándar. Por ejemplo, las células pueden lisarse mecánicamente o por choque osmótico antes de someterse a las etapas de precipitación y cromatografía, cuya naturaleza y secuencia dependerán del material recombinante particular que se va a recuperar. Alternativamente, el polipéptido o polipéptidos expresados pueden secretarse y recuperarse del medio de cultivo en el que se han cultivado las células recombinantes como se conoce en la técnica de la expresión de proteínas.

En un cuarto aspecto, la enseñanza proporciona un adenovirus (también denominado vector de adenovirus o vector adenoviral en este documento) que comprende la cápside adenoviral del tercer aspecto. En consecuencia, el adenovirus puede ser, por ejemplo, un adenovirus codificado por cualquiera de las SEQ ID NOs 1-10 o un adenovirus recombinante, tal como un portador o un adenovirus quimérico como se definió anteriormente. Preferiblemente, el adenovirus es un adenovirus aislado.

En un ejemplo de faceta, la enseñanza proporciona un adenovirus que comprende un polinucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO 72 o 73, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 72 o 73, respectivamente.

El adenovirus puede comprender o no un polinucleótido del primer o segundo aspecto. En caso de que este polinucleótido no esté comprendido en el adenovirus, se prefiere que se proporcione en trans (es decir, mediante un elemento genético que no sea el genoma del adenovirus incorporado en el adenovirus). Por lo general, lo proporciona un constructo auxiliar (p. ej., un plásmido o un virus) o el genoma o un constructo auxiliar en una célula huésped de empaquetamiento (célula complementaria como se describe en el presente documento). Se prefiere además que los polinucleótidos proporcionados en trans no estén comprendidos en el genoma incorporado en el adenovirus, incluidos los homólogos u otras variantes de secuencia de estos polinucleótidos. Por ejemplo, si el polinucleótido proporcionado en trans comprende un gen de hexón, pentón y/o fibra, el genoma incorporado en el adenovirus no comprende ningún polinucleótido que codifique una proteína de hexón, pentón y/o fibra, respectivamente. Lo más preferiblemente, el polinucleótido provisto en trans codifica al menos una cápside adenoviral como se define en el tercer aspecto, es decir, un hexón con las HVR como se define en el primer o segundo aspecto, preferiblemente la proteína hexón como se define en el primer o segundo aspecto, y opcionalmente también la proteína pentón y/o de fibra como se define en el primer o segundo aspecto.

En la construcción de vectores de adenovirus para la administración de un gen a un huésped, por ejemplo, una célula humana o de otro mamífero, se puede emplear una variedad de secuencias de ácido nucleico de adenovirus. Por ejemplo, la totalidad o una parte del gen E3 temprano retardado de adenovirus puede eliminarse de la secuencia de adenovirus que forma parte del virus recombinante. Se cree que la función de E3 de simio es irrelevante para la función y producción de la partícula de virus recombinante. En algunas facetas, los vectores de adenovirus también pueden construirse con una eliminación de al menos la región ORF6 del gen E4, y más deseablemente debido a la redundancia en la función de esta región, la región E4 completa. Todavía otro vector de esta enseñanza contiene una eliminación en el gen E2a temprano retardado. También se pueden realizar eliminaciones en cualquiera de los genes tardíos L1 a L5 del genoma del adenovirus de simio. De manera similar, las eliminaciones en los genes intermedios IX y IVa2 pueden ser útiles para algunos fines. Se pueden realizar otras eliminaciones en los otros genes de adenovirus estructurales o no estructurales. Las eliminaciones discutidas anteriormente pueden usarse individualmente, es decir, una secuencia de adenovirus para usar en la presente enseñanza puede contener eliminaciones en una sola región. Alternativamente, pueden usarse en cualquier combinación eliminaciones de genes completos o porciones de los mismos eficaces para destruir su actividad biológica. Por ejemplo, la secuencia de adenovirus puede tener eliminaciones de la región E1 y E4, o de la región E1, E2a y E3, o de las regiones E1 y E3, o de las regiones E1, E2a y E4, con o sin eliminación de E3, etc.. Dichas eliminaciones se pueden usar en combinación con otras mutaciones genéticas adenovirales, tales como mutaciones sensibles a la temperatura, para lograr el resultado deseado.

Un vector adenoviral que carece de secuencias adenovirales esenciales (p. ej., una región seleccionada de E1a, E1b, E2a, E2b, E4 ORF6, L1 o L4) puede cultivarse en presencia de los productos génicos adenovirales que faltan y que son necesarios para la infectividad y la propagación viral de una partícula adenoviral. Estas funciones auxiliares pueden proporcionarse cultivando el vector adenoviral en presencia de uno o más constructos auxiliares (por ejemplo, un plásmido o virus) o una célula huésped de empaquetamiento (célula complementaria como se describe en este documento). Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas para la preparación de un vector de adenovirus humano "mínimo" en el documento WO96/13597).

Los construcctos auxiliares útiles contienen secuencias de genes de adenovirus seleccionadas que complementan los genes respectivos que se eliminan y/o que no se expresan por el vector y la célula en la que se transfecta el vector. En una faceta, el constructo auxiliar es defectuoso en la replicación y contiene genes de adenovirus esenciales y, opcionalmente, adicionales.

Los constructos auxiliares también se pueden formar en conjugados de policationes como se describe en Wu et al., J. Biol. Chem., 264: 16985-16987 (1989); KJ Fisher y JM Wilson, Biochem. J., 299: 49 (1 de abril de 1994). Un constructo auxiliar puede contener opcionalmente un gen informador. Se conocen en la técnica varios de tales genes informadores. La presencia de un gen informador en el constructo auxiliar que es diferente del transgén en el vector de adenovirus permite controlar de forma independiente tanto el adenovirus como el constructo auxiliar. Este segundo informador puede usarse para facilitar la separación entre el adenovirus recombinante resultante y el constructo auxiliar tras la purificación. Una constructo auxiliar preferido es un virus auxiliar.

Para generar adenovirus recombinantes (Ad) eliminados en cualquiera de los genes descritos en el contexto de las facetas preferidas del presente documento, la función de la región del gen eliminado, si es esencial para la replicación y la infectividad del virus, se suministra preferiblemente al virus recombinante mediante una célula o constructo auxiliar, es decir, una célula de complementación o de empaquetamiento. En muchas circunstancias, se puede usar un constructo/célula que exprese la E1 humana para transcomplementar el vector usado para generar adenovirus recombinantes. Esto es particularmente ventajoso porque, debido a la diversidad entre las secuencias de polinucleótidos de la enseñanza y las secuencias de E1 adenoviral humano que se encuentran en los constructos/ células de empaquetamiento actualmente disponibles, el uso de los constructos/células actuales que contienen E1 humana evitará la generación de adenovirus competentes para replicación durante el proceso de replicación y producción. Sin embargo, en determinadas circunstancias, será deseable utilizar un constructo/célula que exprese los productos del gen E1 para la producción de un adenovirus recombinante con E1 suprimida.

Si se desea, se pueden utilizar las secuencias proporcionadas en el presente documento para generar un constructo /célula auxiliar o línea celular que exprese, como mínimo, el gen E1 de adenovirus de un adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NOS 1-10 bajo el control transcripcional de un promotor para la expresión en una línea celular parental seleccionada, tal como, por ejemplo, una célula HeLa. Pueden emplearse promotores inducibles o constitutivos para este fin. Se proporcionan ejemplos de promotores, por ejemplo, en los ejemplos descritos en este documento. Tales células que expresan E1 son útiles en la generación de vectores de adenovirus recombinantes con E1 eliminada. Además, o alternativamente, la enseñanza proporciona constructos/células que expresan uno o más productos génicos adenovirales, por ejemplo, E1a, E1b, E2a y/o E4 ORF6, preferiblemente Ad5 E4 ORF6, que pueden construirse utilizando esencialmente los mismos procedimientos para uso en la generación de vectores adenovirales recombinantes. Dichos constructos/células se pueden utilizar para transcomplementar vectores de adenovirus eliminados en genes esenciales que codifican esos productos, o para proporcionar funciones auxiliares necesarias para el empaquetamiento de un virus dependiente del auxiliar (p. ej., virus adenoasociado).

Generalmente, cuando se administra un vector de adenovirus por transfección, el vector se administra en una cantidad de aproximadamente 0,1 |jg a aproximadamente 100 |jg de ADN, y preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 jg de ADN a aproximadamente 1 x 104 células a aproximadamente 1 x 103 células, y preferiblemente aproximadamente 105 células. Sin embargo, las cantidades relativas de ADN del vector con respecto a las células huésped pueden ajustarse, teniendo en cuenta factores tales como el vector seleccionado, el método de administración y las células huésped seleccionadas. La introducción del vector en una célula huésped se puede lograr por cualquier medio conocido en la técnica o como se describe en este documento, incluida la transfección y la infección, por ejemplo, usando transfección o electroporación con CaPO4.

Para la construcción y ensamblaje del adenovirus recombinante deseado, el vector de adenovirus se puede transfectar en un ejemplo in vitro en presencia de una constructo auxiliar en la línea celular de empaquetamiento, lo que permite que se produzca una recombinación homóloga entre las secuencias del vector auxiliar y del adenovirus, lo que permite que las secuencias del transgén del adenovirus en el vector se repliquen y se empaqueten en las cápsides del virión, lo que da como resultado partículas del vector viral recombinante como es bien conocido en la técnica. Un adenovirus recombinante de la enseñanza es útil, por ejemplo, en la transferencia de un transgén seleccionado a una célula huésped seleccionada.

En una faceta preferida, el adenovirus del cuarto aspecto tiene una seroprevalencia en menos del 5% de los sujetos humanos y preferiblemente ninguna seroprevalencia en sujetos humanos, más preferiblemente ninguna seroprevalencia en sujetos humanos que no han estado previamente en contacto con adenovirus de grandes simios no humanos, más preferiblemente con uno o más, particularmente todos los adenovirus de acuerdo con las SEQ ID NOs 1-10. En este contexto, se prefiere que los sujetos humanos pertenezcan a un grupo étnico seleccionado de europeos, indígenas de África, asiáticos, indígenas de América e indígenas de Oceanía. Los métodos para la identificación del origen étnico de un sujeto humano están comprendidos en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO2003/102236).

En otra faceta preferida de un adenovirus recombinante, el ADN del adenovirus es capaz de entrar en una célula diana de mamífero, es decir, es infeccioso. Los adenovirus recombinantes infecciosos de la enseñanza se pueden usar como vacuna y para terapia génica como también se describe en este documento. Por lo tanto, en otra faceta, se prefiere que el adenovirus recombinante comprenda una molécula para el suministro a una célula diana. Preferiblemente, la célula diana es una célula de mamífero, por ejemplo, una célula de grandes simios no humanos, una célula de roedor o una célula humana. Por ejemplo, la molécula para el suministro a una célula diana puede ser un polinucleótido que codifica una proteína heteróloga (es decir, un gen heterólogo) como se define en el presente documento, preferiblemente dentro de un casete de expresión. Los métodos para introducir un casete de expresión en el genoma de un adenovirus son bien conocidos en la técnica. En un ejemplo, un adenovirus recombinante de la presente enseñanza que comprende un casete de expresión, que codifica por ejemplo, un gen heterólogo, puede generarse reemplazando una región genómica del adenovirus seleccionado de E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4 con dicho casete de expresión. Las regiones genómicas E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4 de los adenovirus de la enseñanza se pueden identificar fácilmente mediante una alineación con genomas adenovirales conocidos y anotados, tal como el Ad5 humano (véase: Birgitt Tauber y Thomas Dobner, Oncogene (2001) 20, páginas 7847 - 7854; y también: Andrew J. Davison, et al., "Genetic content and evolution of adenoviruses", Journal of General Virology (2003), 84, páginas 2895-2908).

La molécula para el suministro a una célula diana es preferiblemente un polinucleótido heterólogo pero también puede ser un polipéptido o un compuesto químico pequeño, preferiblemente con actividad terapéutica o diagnóstica. En una faceta particularmente preferida, la molécula para el suministro a una célula diana es un polinucleótido heterólogo que comprende una secuencia repetida terminal invertida (ITR) 5' y una ITR 3' de adenovirus. Será evidente para el experto en la materia que el tamaño molecular de la molécula tiene que elegirse de modo que la cápside pueda formarse alrededor y empaquetar la molécula, cuando se produce el adenovirus recombinante, por ejemplo, en una célula de empaquetamiento. Por lo tanto, preferiblemente el gen heterólogo es un minigén que puede tener, por ejemplo, hasta 7000 y como máximo hasta 8000 pares de bases.

En un quinto aspecto, la enseñanza proporciona una partícula similar a virus (VLP) codificada por un polinucleótido del primer o segundo aspecto. En consecuencia, la VLP comprende al menos una cápside adenoviral aislada de acuerdo con el tercer aspecto. En una faceta, el polinucleótido que codifica la VLP tiene el gen Iva2 eliminado o tiene una mutación nula en el gen Iva2.

De acuerdo con la definición de VLP a continuación, la VLP del quinto aspecto no comprende sustancialmente ADN genómico viral. Las VLP, incluidas las VLP de adenovirus, se han utilizado para vacunación, terapia génica o para la administración directa de fármacos, por ejemplo, fármacos contra el cáncer (Chroboczek et al., ACTA ABP BIOCHIMICA POLONICA, vol. 61, No. 3/2014). En consecuencia, la VLP del quinto aspecto puede comprender uno o más epítopos de células B no adenovirales y/o células T no adenovirales, uno o más genes no adenovirales para terapia génica, y/o uno o más agentes farmacéuticos, por ejemplo, agentes anticancerígenos. En una faceta, la VLP incorpora, preferiblemente presenta uno o más epítopos de células B no adenovirales y/o incorpora uno o más epítopos de células T no adenovirales.

En un sexto aspecto, la enseñanza proporciona un vector que comprende un polinucleótido del primer o segundo aspecto. En una faceta preferida, el vector es un vector plasmídico, por ejemplo, un vector de expresión. Se puede usar ventajosamente un vector de plásmido para generar un adenovirus recombinante como se describe en el presente documento. Como se proporciona la información de secuencia de las nuevas proteínas hexón, pentón y de fibra y los ARN VA de la enseñanza, dicho adenovirus recombinante se puede obtener, por ejemplo, mediante la construcción de un adenovirus recombinante que está codificado por el polinucleótido del primer o segundo aspecto y cualquier otra región genómica adenoviral. Los métodos para la construcción de adenovirus recombinantes son bien conocidos en la técnica. Las técnicas útiles para la preparación de adenovirus recombinantes se revisan, por ejemplo, en Graham & Prevec, 1991 en Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols, (Ed. Murray, EJ.), página 109; y Hitt et al., 1997 "Human Adenovirus Vectors for Gene Transfer into Mammalian Cells" Advances in Pharmacology 40: 137-206. Otros métodos se describen en el documento WO 2006/086284.

Para expresar un polinucleótido del primer o segundo aspecto, se puede subclonar dicho polinucleótido en un vector de expresión que contiene un promotor fuerte para dirigir la transcripción, preferiblemente con un casete de expresión. Los promotores bacterianos adecuados son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, E. coli, Bacillus sp. y Salmonella, y los kits para dichos sistemas de expresión están disponibles comercialmente. De manera similar, los sistemas de expresión eucariotas para células de mamífero, levadura y células de insecto son bien conocidos en la técnica y también están disponibles comercialmente. Véase a continuación para obtener más detalles sobre los casetes de expresión.

El vector de expresión particular útil para transportar la información genética al interior de la célula no es particularmente crítico. Puede usarse cualquiera de los vectores convencionales usados para la expresión en células eucariotas o procariotas. Los vectores de expresión bacterianos estándar incluyen plásmidos tales como plásmidos basados en pBR322, pSKF, pET23D y sistemas de expresión de fusión tales como GST y LacZ, pero hay muchos más conocidos en la técnica por los expertos que pueden emplearse de manera útil. Los vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas se usan típicamente en vectores de expresión eucariotas, por ejemplo, vectores de SV40, vectores del virus del papiloma y vectores derivados del virus de Epstein-Barr. Otros ejemplos de vectores eucariotas incluyen pMSG, pAV009/A.sup+., pMTO10/A.sup+., pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus, pcDNA3.1, pIRES y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección de por ejemplo, el promotor temprano inmediato de HCMV, el promotor temprano de SV40, el promotor tardío de SV40, el promotor de metalotioneína, el promotor del virus del tumor mamario murino, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor de la polihedrina u otros promotores que han demostrado ser eficaces para la expresión en células eucariotas. Algunos sistemas de expresión tienen marcadores que proporcionan amplificación génica, como la timidina quinasa, la higromicina B fosfotransferasa y la dihidrofolato reductasa. Alternativamente, también son adecuados los sistemas de expresión de alto rendimiento que no implican la amplificación génica. Los elementos que también se pueden incluir en los vectores de expresión incluyen un replicón que funciona en E. coli, un gen que codifica la resistencia a fármacos para permitir la selección de bacterias que albergan plásmidos recombinantes y sitios de restricción únicos en regiones no esenciales del plásmido para permitir la inserción de secuencias de eucariotas. El gen de resistencia a fármacos particular elegido no es crítico, cualquiera de los muchos genes de resistencia a fármacos conocidos en la técnica es adecuado. Las secuencias de procariotas se eligen opcionalmente de modo que no interfieran con la replicación del ADN en células eucariotas, si es necesario.

En un séptimo aspecto, la enseñanza proporciona una composición que comprende (i) un adyuvante, (ii) un polinucleótido aislado del primer o segundo aspecto, al menos una cápside adenoviral aislada del tercer aspecto, el adenovirus del cuarto aspecto, una partícula similar a virus del quinto aspecto, o un vector del sexto aspecto, y opcionalmente (iii) un excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el adyuvante es un agonista para un receptor seleccionado del grupo que consiste en receptores de citoquinas tipo I, receptores de citoquinas tipo II, receptores de TNF, receptor de vitamina D que actúa como factor de transcripción y los receptores tipo Toll 1 (TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7 y TLR9.

Una composición que comprende un adyuvante puede usarse como vacuna, por ejemplo, para sujetos humanos. Por ejemplo, la activación de receptores específicos puede estimular una respuesta inmunitaria. Dichos receptores son conocidos por los expertos en la materia y comprenden, por ejemplo, receptores de citoquinas, en particular receptores de citoquinas de tipo I, receptores de citoquinas de tipo II, receptores de TNF; y receptor de vitamina D que actúa como factor de transcripción; y los receptores tipo Toll 1 (TLR1), Tl R2, TLR 3, TLR4, t Lr 5, TLR6, TLR7 y TLR9. Los agonistas de dichos receptores tienen actividad adyuvante, es decir, son inmunoestimuladores. En una faceta preferida, el adyuvante de la composición puede ser uno o más agonistas del receptor de tipo Toll. En una faceta más preferida, el adyuvante es un agonista del receptor tipo Toll 4. En una faceta particular preferida, el adyuvante es un agonista del receptor tipo Toll 9. Para ejemplos de adyuvantes, véase a continuación. Además, los excipientes farmacéuticamente aceptables preferidos se mencionan a continuación.

En un octavo aspecto, la enseñanza proporciona una célula que comprende un polinucleótido del primer o segundo aspecto, al menos una cápside adenoviral aislada del tercer aspecto, el adenovirus del cuarto aspecto, una partícula similar a virus del quinto aspecto, o un vector del sexto aspecto.

Preferiblemente, la célula es una célula huésped que expresa al menos un gen adenoviral, o preferiblemente todos los genes adenovirales, que se eliminan o se vuelven no funcionales como se explicó anteriormente para hacer que la replicación del adenovirus sea incompetente. Mediante la expresión de este al menos un gen, la célula huésped preferiblemente permite la replicación del adenovirus que de otro modo sería incompetente para la replicación. En una faceta, la célula huésped que expresa al menos un gen adenoviral seleccionado del grupo que consiste en E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4. En particular, este al menos un gen adenoviral se elimina o se vuelve no funcional en el genoma adenoviral. Tal célula del complemento puede usarse para la propagación y el rescate de adenovirus que son incompetentes para la replicación, porque carecen, por ejemplo de uno de los productos génicos antes mencionados.

La célula puede seleccionarse de una célula bacteriana tal como una célula de E. coli, una célula de levadura ta como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, una célula vegetal, una célula de insecto tal como células SF9 o Hi5, o una célula de mamífero. Los ejemplos preferidos de células de mamífero son células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (HEK 293), células HELA, células de hepatoma humano (por ejemplo, Huh7.5), células de hepatoma humano Hep G2, células de hepatoma humano Hep 3B y similares.

Si la célula comprende un polinucleótido de acuerdo con el primer o segundo aspecto, este polinucleótido puede estar presente en la célula (i) libremente disperso como tal o (ii) integrado en el genoma celular o en el ADN mitocondrial.

En una faceta preferida adicional, la célula es una célula huésped, preferiblemente una célula 293 o una célula PER.C6MR, que expresa al menos un gen adenoviral seleccionado del grupo que consiste en E1a, E1b, E2a, E2b, E4, L1, L2, L3, L4 y L5.

Pueden usarse métodos de transfección estándar para producir líneas celulares de bacterias, mamíferos, levaduras o insectos. Puede usarse cualquiera de los procedimientos bien conocidos para introducir secuencias polinucleotídicas foráneas en células huésped. Por ejemplo, los kits de transfección basados en liposomas disponibles comercialmente tales como LipofectamineMR (Invitrogen), kits de transfección basados en lípidos disponibles comercialmente tales como Fugene (Roche Diagnostics), transfección basada en polietilenglicol, precipitación con fosfato de calcio, pistola génica (biolística), electroporación o infección viral y cualquiera de los otros métodos bien conocidos para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genético extraño en una célula huésped. Solo es necesario que el procedimiento de ingeniería genética particular utilizado sea capaz de introducir con éxito al menos un gen en la célula huésped capaz de expresar el receptor.

Se describen facetas adicionales de la célula con respecto al cuarto aspecto de la enseñanza anterior.

En un noveno aspecto, la enseñanza proporciona un polinucleótido del primer o segundo aspecto, al menos una cápside adenoviral aislada del tercer aspecto, el adenovirus del cuarto aspecto, una partícula similar a virus del quinto aspecto, o un vector del sexto aspecto y/o la composición del séptimo aspecto para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad. En una faceta, el tratamiento o prevención es mediante vacunación. En otra faceta, el tratamiento es mediante terapia génica. Con respecto a la vacunación, la enfermedad es una enfermedad infecciosa, preferiblemente causada por un patógeno como se describe en el presente documento, o una enfermedad no infecciosa, preferiblemente caracterizada por células enfermas que expresan antígenos no expresados por células sanas (tales como células tumorales que expresan antígenos asociados a tumores). Con respecto a la terapia génica, la enfermedad es una enfermedad hereditaria causada por una o más mutaciones somáticas que conducen a una pérdida o ganancia de función de un gen o proteína.

Es bien sabido que los adenovirus son útiles en terapia génica y como vacunas. Los estudios preclínicos y clínicos han demostrado la viabilidad del diseño de vectores, la expresión robusta de antígenos y la inmunidad protectora utilizando este sistema. Por lo tanto, una faceta preferida del uso es en la vacunación, por ejemplo, para sujetos humanos. Las instrucciones detalladas de cómo se utilizan y preparan los adenovirus para la vacunación se proporcionan en la amplia bibliografía comprendida en la técnica y conocida por el experto en la materia. Los vectores virales basados, por ejemplo, en un adenovirus de simios grandes no humanos representan una alternativa al uso de vectores Ad derivados de humanos para el desarrollo de vacunas genéticas (Fariña SF, J Virol. Diciembre de 2001, 75 (23): 11603-13.; Fattori E, Gene Ther. Julio de 2006; 13 (14): 1088 - 96). Los adenovirus aislados de grandes simios no humanos están estrechamente relacionados con los adenovirus aislados de humanos, como lo demuestra su eficaz propagación en células de origen humano. Sin embargo, dado que los adenovirus de humanos y de simios no humanos están relacionados, puede haber algún grado de reactividad cruzada serológica o no existir entre las dos especies de virus. Esta presunción se confirmó cuando se aislaron y caracterizaron adenovirus de chimpancé. Por lo tanto, un adenovirus de grandes simios no humanos de acuerdo con la enseñanza proporciona una base para reducir los efectos adversos asociados con la inmunidad preexistente en humanos a los serotipos comunes de adenovirus humanos y, por lo tanto, una herramienta médica valiosa que puede, por ejemplo, utilizarse para inmunización y/o terapia génica.

Esto se debe a las nuevas secuencias de proteínas de la cápside de adenovirus que incluyen proteína hexón, pentón y de fibra, pero en particular a las nuevas secuencias de HVR de hexón que representan los epítopos de adenovirus más expuestos en la superficie. En consecuencia, no se espera que estén presentes en el suero sanguíneo humano, o muy pocos, anticuerpos neutralizantes específicos para las proteínas de la cápside y, en particular, las HVR de hexón de acuerdo con la enseñanza. Por lo tanto, una ventaja de las secuencias novedosas es que se pueden usar para mejorar los adenovirus de la técnica anterior, que se han modificado para, por ejemplo, propósitos médicos. Por ejemplo, las secuencias se pueden utilizar para, por ejemplo reemplazar/sustituir una o más de las principales proteínas estructurales de la cápside o, en particular, solo las HVR de hexón de un adenovirus diferente, por ejemplo, un adenovirus de la técnica anterior, para obtener adenovirus recombinantes mejorados con una seroprevalencia reducida en humanos (adenovirus quiméricos). Dado que las nuevas secuencias y, por lo tanto, los adenovirus que han sido rediseñados como se describe no encontrarán ninguna respuesta inmunitaria inhibitoria significativa en humanos cuando se administren, se mejorará su eficacia de transducción global y su infectividad. Por lo tanto, se espera que dichos adenovirus mejorados sean vacunas más eficaces ya que la entrada en las células huésped y la expresión de antígenos no se verán obstaculizadas por ningún título significativo de anticuerpos neutralizantes.

Se prefiere que la vacuna comprenda un adyuvante. Los adyuvantes inmunológicos preferidos se mencionan en este documento y se pueden usar en dicha vacuna.

Si el uso es una vacunación, un adenovirus recombinante de la enseñanza puede administrarse en una dosis inmunológica y/o profilácticamente efectiva que es preferiblemente 1 * 108 a 1 * 1011 partículas virales (es decir, 1 * 108, 5 * 108, 1 * 109, 5 * 109, 1 * 1010, 2.5 * 1010 o 5 * 1010 partículas).

Además, para una vacunación que requiere un refuerzo, se prefiere aplicar una metodología de "refuerzo principal heterólogo": En vacunación, el polinucleótido del primer o segundo aspecto, al menos una cápside adenoviral aislada del tercer aspecto, el adenovirus del cuarto aspecto, una partícula similar a virus del quinto aspecto, o un vector del sexto aspecto y/o la composición del séptimo aspecto pueden usarse para cebado o refuerzo, en particular para una vacunación heteróloga de cebado-refuerzo. En una faceta preferida de cebado-refuerzo heterólogo, pueden usarse dos vacunas diferentes, por ejemplo, adenovirus, en los que es particularmente ventajoso que el polinucleótido del primer o segundo aspecto, al menos una cápside adenoviral aislada del tercer aspecto, el adenovirus del cuarto aspecto, una partícula similar a virus del quinto aspecto, o un vector del sexto aspecto y/o la composición del séptimo aspecto se usa como vacuna de refuerzo debido a la falta de anticuerpos neutralizantes en, por ejemplo, humanos.

Un adenovirus recombinante preparado usando un polinucleótido o una proteína adenoviral recombinante o un fragmento de la misma de acuerdo con las enseñanzas puede usarse para transducir una célula huésped con un polinucleótido, por ejemplo, ADN. Por lo tanto, se puede preparar un adenovirus preferiblemente deficiente en replicación, aunque infeccioso (es decir, capaz de entrar en una célula huésped) para expresar cualquier proteína o polipéptido personalizado en una célula huésped. Así, en una faceta preferida, la terapia citada en el uso de acuerdo con la enseñanza es la terapia génica. La terapia génica puede ser una terapia génica in vivo, ex vivo, o in vitro. Preferiblemente, es una terapia génica somática. Si un polinucleótido aislado, una proteína aislada, un vector, un adenovirus recombinante y/o una composición farmacéutica de acuerdo con las enseñanzas se usa para terapia génica y se administra a un sujeto a tratar, se prefiere que se administre en una cantidad dosis suficientemente grande tal que el tratamiento da como resultado que una o más células del paciente sean transfectadas, es decir, transducidas. Si un adenovirus recombinante y/o una composición farmacéutica de acuerdo con la enseñanza se administra por cualquiera de los medios de administración preferidos descritos en el presente documento, se prefiere administrar una dosis efectiva que sea preferiblemente 1 * 108 a 5 * 1011 partículas virales (es decir, 1 x 108, 5 * 108, 1 * 109, 5 * 109, 1 * 1010, 2.5 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o, más preferiblemente, 5 x 1011 partículas). En facetas preferidas, el polinucleótido preferiblemente heterólogo que está comprendido en el adenovirus recombinante de la enseñanza es capaz de expresar una proteína o polipéptido en una célula huésped del sujeto, en el que la proteína o polipéptido comprende un péptido señal que efectúa la secreción de la proteína o polipéptido de dicha célula huésped. Por ejemplo, un paciente que necesite cierta proteína puede tratarse usando un adenovirus de la presente enseñanza que comprende un ADNc que codifica una forma secretable de esa proteína.

En otra faceta del uso de la presente enseñanza, un polinucleótido del primer o segundo aspecto, al menos una cápside adenoviral aislada del tercer aspecto, el adenovirus del cuarto aspecto, una partícula similar a virus del quinto aspecto, o un vector del sexto aspecto y/o la composición del séptimo aspecto (en lo sucesivo denominada producto farmacéutico de acuerdo con las enseñanzas) se formula para comprender además uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables; portadores; excipientes, incluidos rellenos, aglutinantes, lubricantes, deslizantes, desintegrantes y adsorbentes; y/o conservantes.

El producto farmacéutico de acuerdo con la enseñanza puede administrarse por diversas vías bien conocidas, que incluyen administración oral, rectal, intragástrica y parenteral, por ejemplo, vías de administración intravenosa, intramuscular, intranasal, intradérmica, subcutánea y similares. Se prefiere la administración parenteral, intramuscular e intravenosa. Preferiblemente, el producto farmacéutico de acuerdo con la enseñanza se formula como jarabe, solución para infusión o inyección, una comprimido, una cápsula, comprimido oblongo, pastilla, un liposoma, un supositorio, un emplasto, una venda adhesiva, una cápsula retardante, un polvo, o una formulación de liberación lenta. Preferiblemente, el diluyente es agua, un tampón, una solución salina tamponada o una solución salina y el vehículo se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en manteca de cacao y vitebesol.

Las formas farmacéuticas preferidas particulares para la administración del producto farmacéutico de acuerdo con la enseñanza durante el uso de la presente enseñanza son formas adecuadas para uso inyectable e incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Normalmente, dicha solución o dispersión incluirá un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, soluciones acuosas tamponadas con agua, por ejemplo tampones biocompatibles, etanol, poliol, tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, mezclas adecuadas de los mismos, tensioactivos o aceites vegetales.

Las soluciones de infusión o inyección se pueden lograr mediante cualquier cantidad de técnicas reconocidas en el arte que incluyen, entre otras, la adición de conservantes tal como agentes antibacterianos o antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico o timerosal. Además, los agentes isotónicos, como azúcares o sales, en particular cloruro de sodio, pueden incorporarse en soluciones para infusión o inyección.

Los diluyentes preferidos de la presente enseñanza son agua, tampones fisiológicos aceptables, soluciones salinas tampón fisiológicamente aceptable o soluciones salinas. Los vehículos preferidos son manteca de cacao y vitebesol. Los excipientes que se pueden utilizar con las diversas formas farmacéuticas del fármaco de acuerdo con la enseñanza se pueden elegir de la siguiente lista no limitativa:

a) aglutinantes tales como lactosa, manitol, sorbitol cristalino, fosfatos dibásicos, fosfatos de calcio, azúcares, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares;

b) lubricantes tales como estearato de magnesio, talco, estearato de calcio, estearato de zinc, ácido esteárico, aceite vegetal hidrogenado, leucina, glicéridos y estearilfumaratos de sodio,

c) desintegrantes tales como almidones, croscarmelosa, metilcelulosa sódica, agar, bentonita, ácido algínico, carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Otros excipientes adecuados se pueden encontrar en el Handbook of Pharmaceutical Excipients, publicado por la Asociación Farmacéutica Estadounidense.

Ciertas cantidades del fármaco de acuerdo con las enseñanzas son preferidas para la terapia o profilaxis de una enfermedad. Sin embargo, se entiende que, dependiendo de la gravedad de la enfermedad, el tipo de enfermedad, así como el paciente respectivo a tratar, por ejemplo, el estado de salud general del paciente, etc., se requieren diferentes dosis del fármaco de acuerdo con la enseñanza para provocar un efecto terapéutico o profiláctico. La determinación de la dosis adecuada queda a discreción del médico tratante. Si el fármaco de acuerdo con las enseñanzas se va a usar profilácticamente, se puede formular como una vacuna. En este caso, el producto farmacéutico de acuerdo con la enseñanza se administra preferiblemente en las dosis preferidas y particularmente preferidas indicadas anteriormente. Preferiblemente, la administración de la vacuna se repite al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o al menos 10 veces en el transcurso de un período de tiempo definido, hasta que el sujeto vacunado haya generado suficientes anticuerpos contra el compuesto farmacéutico de acuerdo con la enseñanza para que el riesgo de desarrollar la enfermedad respectiva haya disminuido. El periodo de tiempo en este caso suele ser variable dependiendo de la antigenicidad de la vacuna. Preferiblemente, el período de tiempo no es superior a cuatro semanas, tres meses, seis meses o tres años. En una faceta, si se usa un adenovirus de acuerdo con la enseñanza para propósitos de vacunación, al menos uno de los dominios hipervariables de la proteína hexón puede ser reemplazado por un epítopo inmunogénico del respectivo agente de la enfermedad contra el que se dirige la vacunación. Las vacunas contienen típicamente uno o más adyuvantes como se describió anteriormente. Un resumen detallado del uso de adenovirus para vacunación y métodos relacionados con el mismo se proporcionan en: Bangari DS y Mittal SK (2006) Vaccine, 24(7), páginas 849-862; vease también: Zhou D, et al., Expert Opin Biol Ther. enero de 2006; 6(1):63-72; y: Folgori A, et al., Nat Med. Febrero de 2006; 12 (2): 190-7.; vease también: Draper SJ et al., Nat Med. Agosto de 2008; 14(8):819-21. Epub 27 de julio de 2008.

En un décimo aspecto, la presente enseñanza se refiere a un método in vitro para producir un adenovirus o una partícula similar a un adenovirus, que comprende las etapas de

El método comprende opcionalmente una etapa adicional antes de la etapa (i) de introducir el polinucleótido aislado del primer o segundo aspecto o un vector del sexto aspecto en la célula, por ejemplo, como se describió anteriormente.

Generalmente se prefiere que el polinucleótido aislado codifique un adenovirus del cuarto aspecto o una partícula similar a virus del quinto aspecto. El adenovirus es preferiblemente incompetente para la replicación. La célula es preferiblemente una célula del séptimo aspecto. Si el polinucleótido aislado codifica un adenovirus incompetente para la replicación, se prefiere que la célula sea una célula auxiliar o comprenda una constructo auxiliar (por ejemplo, un plásmido auxiliar o un virus auxiliar, por ejemplo, como se transduce con un constructo auxiliar, preferiblemente infectado con un virus auxiliar, antes o durante la etapa (i)) como se describe en el presente documento, en el que la célula auxiliar o el constructo auxiliar, respectivamente, expresan los genes/regiones genómicas que hacen que la replicación del adenovirus sea incompetente.

"Tal que un adenovirus o una partícula similar a un adenovirus se ensambla en la célula" significa que en la etapa (i), todos los genes necesarios para ensamblar el adenovirus o la partícula similar a un adenovirus, como se describe en este documento, se expresan en la célula. Esto comprende todos los genes necesarios para empaquetar el adenovirus (es decir, empaquetar el genoma en la cápside del virus) si se va a ensamblar un adenovirus.

En una faceta preferida, el polinucleótido aislado codifica un ARN no codificante de ARN II VA y/o un ARN no codificante de ARN I VA como se definió anteriormente. Un ARN VA de acuerdo con la enseñanza conduce a un rendimiento mejorado de adenovirus o partículas similares a adenovirus del método como se muestra en el Ejemplo 1.

Definiciones y otras facetas de la enseñanza

A continuación, se proporcionan algunas definiciones de términos utilizados con frecuencia en esta memoria descriptiva. Estos términos tendrán, en cada instancia de su uso, en el resto de la memoria descriptiva, el significado definido y los significados preferidos respectivamente.

Como se usa en el presente documento, el término "aislado" se refiere a una molécula que está sustancialmente libre de otras moléculas con las que está asociada de forma natural. En particular, aislada significa que la molécula no está en el cuerpo de un animal o en una muestra del cuerpo de un animal. Por lo tanto, una molécula aislada está libre de otras moléculas con las que se encontraría o entraría en contacto en un animal. Aislado no significa aislado de otros componentes asociados como se describe en este documento, por ejemplo, no aislado de otros componentes de una composición en la que está incluida la molécula, o aislado de un vector o célula en la que está incluida.

El término "polinucleótido" pretende hacer referencia a un ácido nucleico, es decir, una molécula biológica formada por una pluralidad de nucleótidos. Incluye ADN, ARN y análogos sintéticos, por ejemplo, PNA. Se prefiere ADN.

El término "marco de lectura abierto" (ORF) se refiere a una secuencia de nucleótidos que se puede traducir a aminoácidos. Por lo general, un ORF contiene un codón de inicio, una región posterior que generalmente tiene una longitud que es un múltiplo de 3 nucleótidos, pero no contiene un codón de terminación (TAG, TAA, TGA, UAG, UAA o UGA) en el marco de lectura dado. Un ORF codifica una proteína en la que los aminoácidos en los que se puede traducir forman una cadena unida a un péptido.

Como se usa en el presente documento, los términos "proteína", "péptido", "polipéptido", "péptidos" y "polipéptidos" se usan indistintamente en todo el documento. Estos términos se refieren tanto a péptidos naturales, por ejemplo, proteínas de origen natural y péptidos sintetizados que pueden incluir aminoácidos de origen natural o no natural. Los péptidos también se pueden modificar químicamente mediante la modificación de una cadena lateral o un extremo terminal amino o carboxilo libre de un aminoácido natural o no natural. Esta modificación química incluye la adición de fracciones químicas adicionales, así como la modificación de grupos funcionales en las cadenas laterales de los aminoácidos, tales como una glicosilación. Un péptido es un polímero que tiene preferiblemente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o al menos 100 aminoácidos, lo más preferiblemente al menos 8 o al menos 30 aminoácidos. Dado que los polipéptidos y las proteínas divulgados en el presente documento se derivan de adenovirus, se prefiere que la masa molecular de un polipéptido o proteína aislada tal como se utiliza en el presente documento no supere los 200 kDa.

Un adenovirus (Ad) es un virus icosaédrico sin envoltura que se ha identificado en varios huéspedes aviares y mamíferos. Los adenovirus humanos (hAd) pertenecen al género Mastadenovirus que incluye todos los Ad humanos conocidos y muchos Ad de origen animal (por ejemplo, bovino, porcino, canino, murino, equino, simio y ovino). Los adenovirus humanos generalmente se dividen en seis subgrupos (AF) en función de una serie de criterios biológicos, químicos, inmunológicos y estructurales que incluyen propiedades de hemaglutinación de eritrocitos de rata y mono rhesus, homología de a Dn , patrones de escisión de enzimas de restricción, porcentaje de contenido de G+C y oncogenicidad (Straus, 1984, en The Adenoviruses, ed. H. Ginsberg, páginas. 451-498, Nueva York: Plenus Press, y Horwitz, 1990; en Virology, eds. B. N. Fields y D. M. Knipe, páginas 1679-1721).

El virión adenoviral tiene una simetría icosaédrica y, dependiendo del serotipo, un diámetro de 60-90 nm. La cápside icosaédrica comprende tres proteínas principales, hexón (II), base de pentón (III) y una proteína de fibra nudosa (IV) (WC Russel, J. Gen. Virol., 81: 2573-2604 (2000)). Más específicamente, la cápside adenoviral comprende 252 capsómeros, de los cuales 240 son hexones y 12 son pentones. Los hexónes y pentones se derivan de tres polipéptidos virales diferentes. El hexón comprende tres polipéptidos idénticos, concretamente el polipéptido II. El pentón comprende una base de pentón, que proporciona un punto de unión a la cápside, y una proteína de fibra trimérica, que se une de forma no covalente y se proyecta desde la base de pentón. Otras proteínas, concretamente las proteínas IX, VI y IIIa, normalmente también están presentes en la cápside adenoviral. Se cree que estas proteínas estabilizan la cápside viral.

Un aspecto de la inmunidad preexistente que se observa en humanos es la inmunidad humoral, que puede resultar en la producción y persistencia de anticuerpos que son específicos para proteínas adenovirales. La respuesta humoral provocada por el adenovirus se dirige principalmente contra las regiones hipervariables de la proteína estructural hexón. Los adenovirus aislados de grandes simios no humanos están estrechamente relacionados con los adenovirus aislados de humanos, como lo demuestra su eficaz propagación en células de origen humano.

La cápside se puede modificar como se describe en este documento mediante la incorporación de polipéptidos no adenovirales, tales como epítopos de células T y/o B.

El término "proteína hexón" se refiere a la proteína hexón (II) comprendida en un adenovirus. Una proteína hexón o una variante de la misma de acuerdo con la enseñanza tiene la misma función que una proteína hexón o un fragmento de la misma en un virión de adenovirus infeccioso. Por lo tanto, un adenovirus que comprende dicho hexón o variante de la misma, preferiblemente como una proteína de la cápside, es capaz de entrar en una célula huésped. Un método adecuado para generar variantes de una proteína hexón se describe en la patente de los Estados Unidos No.

5,922,315. En este método, al menos una región de bucle de hexón de adenovirus se cambia con al menos una región de bucle de otro serotipo de adenovirus. Puede determinarse fácilmente si un adenovirus recombinante puede entrar en una célula huésped. Por ejemplo, después de poner en contacto una célula huésped con el adenovirus, la célula huésped recombinante se puede lavar y lisar y se puede determinar si se encuentra ARN y/o ADN adenoviral en la célula huésped usando, por ejemplo, una sonda de hibridación apropiada específica para ARN y/o ADN adenoviral. Como alternativa o adicionalmente, la célula huésped después de haber sido puesta en contacto con el adenovirus recombinante puede lavarse, lisarse y sondearse con anticuerpos específicos de adenovirus, por ejemplo, utilizando transferencia Western. En otra alternativa más, se observa, por ejemplo, in vivo, si la célula huésped expresa un producto génico, por ejemplo, una proteína fluorescente tras la infección con un adenovirus recombinante que comprende un casete de expresión adecuado para expresar el producto génico en la célula huésped.

El término "región hipervariable" se refiere a dominios con alta variación de secuencia entre cepas, ubicados en la superficie expuesta al solvente de la proteína hexón, así expuesta en el exterior de la cápside viral. Son los principales determinantes de los anticuerpos neutralizantes. Las HVR se pueden identificar, por ejemplo, mediante el alineamiento de secuencias con otras proteínas hexón.

Por “proteína pentón adenoviral” se entiende la proteína a base de pentón (III) comprendida en un adenovirus. Una proteína pentón adenoviral se caracteriza porque se localiza en las esquinas de la simetría icosaédrica de la cápside. Una proteína pentón o una variante de la misma de acuerdo con la enseñanza tiene la misma función que una proteína pentón en un virión de adenovirus infeccioso. Por lo tanto, un adenovirus que comprende dicho pentón o una variante de la misma, preferiblemente como una proteína de la cápside, es capaz de entrar en una célula huésped, que puede analizarse como se describió anteriormente. Además, un pentón funcional tiene afinidad por una proteína de fibra adenoviral. El experto medio sabe muy bien cómo probar las afinidades proteína-proteína. Para determinar si una primera proteína es capaz de unirse a una segunda proteína, puede usar, por ejemplo, un ensayo de doble híbrido de levadura genética o un ensayo bioquímico tal como una extracción de péptidos, un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un ensayo basado en la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o un ensayo de resonancia de plasmón. Cuando se usan ensayos de extracción de péptidos o de resonancia de plasmón, es útil fusionar al menos una de las proteínas con una etiqueta de afinidad tal como una etiqueta HIS, etiqueta GST u otra, como es bien conocido en el campo de la bioquímica.

El término "proteína de fibra" se refiere a la proteína de fibra nudosa (IV) comprendida en un adenovirus. Una proteína de fibra o una variante de la misma de acuerdo con la enseñanza tiene la misma función que una proteína de fibra o un fragmento de la misma en un virión de adenovirus infeccioso. Por lo tanto, un adenovirus que comprende dicha fibra o variante de fibra, preferiblemente como una proteína de la cápside, es capaz de entrar en una célula huésped, que puede analizarse como se describió anteriormente. Además, una proteína de fibra funcional tiene afinidad por una proteína pentón adenoviral. Además, una proteína de fibra adenoviral funcional en su forma glicosilada es capaz de trimerizarse. Por lo tanto, también se prefiere que la variante sea capaz de glicosilarse y/o formar un trímero. La afinidad, incluida la trimerización, se puede probar como se describió anteriormente, y los ensayos de glicosilación también son bien conocidos en la técnica.

El "ARN VA (asociado a virus)" es un tipo no codificante que se encuentra en los adenovirus. Desempeña un papel en la regulación de la traducción. Hay dos copias de este ARN llamadas VAI o ARN I VA y VAII o ARN II VA. Los dos genes de ARN VA son genes distintos en el genoma del adenovirus. ARN I VA es la especie principal con ARN II VA expresado en un nivel más bajo. Ninguno de los transcritos está poliadenilado y ambos son transcritos por PolIII.

El término "identidad" o "idéntico" en el contexto de secuencias de polinucleótidos, polipéptidos o proteínas se refiere al número de residuos en las dos secuencias que son idénticos cuando se alinean para una máxima correspondencia. Específicamente, el porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias, ya sean secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido por la longitud de la secuencia más corta y multiplicado por 100. Las herramientas de alineación que se pueden usar para alinear dos secuencias son bien conocidas por el experto en la materia y se pueden obtener, por ejemplo, en la World Wide Web, por ejemplo, Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk)./Tools/msa/clustalo/) para alineaciones de polipéptidos o MUSCLE (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) o MAFFT (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/) para alineaciones de polinucleótidos o WATER (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/) para alineaciones de polinucleótidos y polipéptidos. Las alineaciones entre dos secuencias pueden llevarse a cabo utilizando la configuración de parámetros predeterminada, por ejemplo, para MAFFT preferiblemente: Matriz: Blosum62, Apertura de Hueco 1.53, Extensión de Hueco 0.123, para polinucleótidos WATER preferiblemente: MATRIZ: DNAFULL, Apertura de Hueco: 10.0, Extensión de Hueco 0.5 y para polipéptidos WATER preferiblemente MATRIZ: BLOSUM62, Apertura de Hueco: 10.0, Extensión de Hueco: 0.5. Los expertos en la materia entienden que puede ser necesario introducir huecos en cualquier secuencia para producir una alineación satisfactoria. El "mejor alineamiento de secuencias" se define como el alineamiento que produce el mayor número de residuos idénticos alineados mientras tiene un número mínimo de huecos. Preferiblemente, es un alineamiento global, que incluye cada residuo en cada secuencia en el alineamiento.

El término "variante" se refiere, con respecto a un polipéptido, generalmente a una versión modificada del polipéptido, por ejemplo, una mutación, por lo que uno o más aminoácidos del polipéptido pueden eliminarse, insertarse, modificarse y/o sustituirse. Generalmente, la variante es funcional, lo que significa que un adenovirus que comprende la variante funcional es capaz de infectar una célula huésped. Las funciones más específicas se definen en el presente documento y tienen precedencia sobre la definición general. Una "mutación" o "mutación de un aminoácido" puede ser una sustitución, eliminación y/o inserción de un aminoácido (puede aplicarse "y" si hay más de una mutación). Preferiblemente, es una sustitución (es decir, una sustitución de aminoácidos conservadora o no conservadora), más preferiblemente una sustitución de aminoácidos conservadora. En algunas facetas, una sustitución también incluye el intercambio de un aminoácido de origen natural con un aminoácido de origen no natural. Una sustitución conservadora comprende la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tenga una propiedad química similar al aminoácido que se sustituye. Preferiblemente, la sustitución conservadora es una sustitución seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una sustitución de un aminoácido básico por otro aminoácido básico diferente;

(ii) una sustitución de un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido diferente;

(iii) una sustitución de un aminoácido aromático con otro aminoácido aromático diferente;

(iv) una sustitución de un aminoácido alifático no polar por otro aminoácido alifático no polar diferente; y

(v) una sustitución de un aminoácido polar sin carga por otro aminoácido polar diferente sin carga.

Un aminoácido básico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en arginina, histidina y lisina. Un aminoácido ácido es preferiblemente aspartato o glutamato. Un aminoácido aromático se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en fenilalanina, tirosina y triptófano. Un aminoácido alifático no polar se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en glicina, alanina, valina, leucina, metionina e isoleucina. Un aminoácido polar sin carga se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en serina, treonina, cisteína, prolina, asparagina y glutamina. A diferencia de una sustitución de aminoácido conservadora, una sustitución de aminoácido no conservadora es el intercambio de un aminoácido con cualquier aminoácido que no esté incluido en las sustituciones conservadoras descritas anteriormente (i) a (v).

Los medios para determinar la identidad de la secuencia se describieron anteriormente.

Los aminoácidos de una proteína también pueden modificarse, por ejemplo, modificarse químicamente. Por ejemplo, la cadena lateral o un extremo terminal amino o carboxilo libre de un aminoácido de la proteína o polipéptido puede modificarse, por ejemplo, mediante glicosilación, amidación, fosforilación, ubiquitinación, etc. La modificación química también puede tener lugar in vivo, por ejemplo, en una célula huésped, como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, un motivo de modificación química adecuado, por ejemplo, el motivo de la secuencia de glicosilación presente en la secuencia de aminoácidos de la proteína hará que la proteína sea glicosilada. A menos que una modificación conduzca a un cambio en la identidad de un aminoácido modificado (por ejemplo, una sustitución o eliminación), un polipéptido modificado está dentro del alcance del polipéptido como se menciona con respecto a una determinada SEQ ID NO, es decir, no es una variante tal como se define en el presente documento.

El término "variante" se refiere, con respecto a un polinucleótido, generalmente a una versión modificada del polinucleótido, por ejemplo, una mutación, por lo que uno o más nucleótidos del polinucleótido pueden eliminarse, insertarse, modificarse y/o sustituirse. Generalmente, la variante es funcional, lo que significa que un adenovirus que comprende la variante funcional es capaz de infectar una célula huésped. Las funciones más específicas se definen en el presente documento y tienen precedencia sobre la definición general. Una "mutación" puede ser una sustitución, eliminación y/o inserción de un nucleótido ("y" puede aplicarse si hay más de una mutación). Preferiblemente, es una sustitución, más preferiblemente provoca una sustitución de aminoácidos, más preferiblemente una sustitución de aminoácidos conservadora.

Una "proteína antigénica o un fragmento de la misma" (en la que el fragmento también es antigénico) es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero. Preferiblemente, es un antígeno tumoral o un antígeno derivado de un patógeno. El término "patógeno" se refiere a cualquier organismo que puede provocar una enfermedad en un sujeto. Incluye, entre otros, bacterias, protozoos, hongos, nematodos, viroides, virus y parásitos, en los que cada patógeno es capaz, ya sea por sí mismo o junto con otro patógeno, de provocar enfermedades en vertebrados, incluidos, entre otros, mamíferos, e incluye pero no se limita a seres humanos. Como se usa en el presente documento, el término "patógeno" también abarca organismos que normalmente no pueden ser patógenos en un huésped no inmunocomprometido, pero que lo son en un huésped inmunocomprometido.

En términos generales, el genoma adenoviral está bien caracterizado. Hay una conservación general en la organización general del genoma adenoviral con respecto a los marcos de lectura abiertos específicos que están posicionados de manera similar, por ejemplo, la ubicación de los genes E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 y L5 de cada virus. Cada extremo del genoma adenoviral comprende una secuencia conocida como repetición terminal invertida (ITR), que es necesaria para la replicación viral. El virus también comprende una proteasa codificada por virus, que es necesaria para procesar algunas de las proteínas estructurales requeridas para producir viriones infecciosos. La estructura del genoma adenoviral se describe sobre la base del orden en que se expresan los genes virales después de la transducción de la célula huésped. Más específicamente, los genes virales se denominan genes tempranos (E) o tardíos (L) de acuerdo con si la transcripción se produce antes o después del inicio de la replicación del ADN. En la fase inicial de la transducción, los genes E1A, e 1b , E2A, E2B, E3 y E4 del adenovirus se expresan para preparar la célula huésped para la replicación viral. Durante la fase tardía de la infección, se activa la expresión de los genes tardíos L1-L5, que codifican los componentes estructurales de las partículas del virus.

El término "vector", como se usa en el presente documento, incluye cualquier vector conocido por el experto en la materia, incluidos vectores de plásmidos, vectores de cósmidos, vectores de fagos como el fago lambda, vectores virales como vectores de adenovirus (Ad) (por ejemplo, Ad5, Ad11, Ad26, Ad35, Ad49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 no replicantes o vectores Ad4 y Ad7 competentes para la replicación conocidos del estado de la técnica, por ejemplo, el documento WO 2005/071093 A2), vectores de virus adenoasociados (AAV) (por ejemplo, AAV tipo 5), vectores de virus alfa (por ejemplo, virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), virus sindbis (SIN), virus del bosque Semliki (SFV) y quimeras de VEE-SIN), vectores del virus del herpes, vectores del virus del sarampión, vectores del virus de la viruela (por ejemplo, virus vaccinia, virus vaccinia modificado Ankara (MVA), NYVAC (derivado de la cepa de vacuna de Copenhague) y vectores de la viruela aviar: vectores de la viruela del canario (ALVAC) y viruela aviar (FPV)) y vectores del virus de la estomatitis vesicular, partículas similares a virus o esporas bacterianas. Un vector también incluye vectores de expresión, vectores de clonación y vectores que son útiles para generar adenovirus recombinantes en células huésped.

Como se indicó anteriormente, una "proteína heteróloga o un fragmento de la misma" puede ser una proteína no adenoviral o un fragmento de la misma, en particular una proteína antigénica o un fragmento de la misma. Con este fin, el polinucleótido que codifica una proteína heteróloga puede ser una molécula para administrarse en una célula diana, por ejemplo, un polinucleótido que codifica una proteína antigénica o un fragmento de la misma, preferiblemente una proteína antigénica o un fragmento de un patógeno tal como un virus, bacteria, hongo, protozoo o parásito patógeno, o un antígeno tumoral. "Antígeno" se refiere a cualquier proteína o péptido capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero. Un antígeno comprende preferiblemente al menos 8 aminoácidos y más preferiblemente comprende entre 8 y 12 aminoácidos.

El término "casete de expresión" se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que se va a expresar, junto con sus secuencias de control de transcripción y traducción. Cambiar el casete de expresión hará que el vector en el que se incorpora dirija la expresión de una secuencia o combinación de secuencias diferente. Debido a que los sitios de restricción están preferiblemente diseñados para estar presentes en los extremos 5' y 3', el casete puede insertarse, retirarse o reemplazarse fácilmente por otro casete. Preferiblemente, un casete de expresión incluye elementos reguladores en cis para la expresión eficaz de un gen dado, tal como un promotor, un sitio de iniciación y/o un sitio de poliadenilación. Más específicamente con respecto a la presente enseñanza, un casete de expresión contiene todos los elementos adicionales necesarios para la expresión del polinucleótido del primer o segundo aspecto en las células huésped. Por lo tanto, un casete de expresión típico contiene un promotor unido operativamente al polinucleótido del primer o segundo aspecto y las señales requeridas para la poliadenilación eficaz del transcrito, los sitios de unión al ribosoma y la terminación de la traducción. Los elementos adicionales del casete pueden incluir, por ejemplo, potenciadores. Un casete de expresión también debe contener una región de terminación de la transcripción secuencia abajo del gen estructural para proporcionar una terminación eficaz. La región de terminación puede obtenerse del mismo gen que la secuencia promotora o puede obtenerse de diferentes genes.

Como se usa en el presente documento, el término "minigén" se refiere a un constructo de gen heterólogo en la que uno o más segmentos funcionalmente no esenciales de un gen se eliminan con respecto al gen que se produce de forma natural. Un "casete de minigén" es un casete de expresión que comprende un minigén para la expresión.

El término adenovirus (AdV) recombinante "competente para la replicación" se refiere a un adenovirus que puede replicarse en una célula huésped en ausencia de cualquier proteína auxiliar recombinante contenida en la célula. Preferiblemente, un adenovirus "competente para la replicación" comprende los siguientes genes tempranos esenciales intactos o funcionales: E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4. Los adenovirus de tipo silvestre aislados de un animal particular serán competentes para la replicación en ese animal.

El término AdV recombinante "defectuoso para la replicación" o "incompetente para la replicación" se refiere a un adenovirus que se ha vuelto incapaz de replicarse porque ha sido diseñado para comprender al menos una eliminación funcional, es decir, una eliminación que altera la función de un gen sin eliminarlo por completo, por ejemplo, introducción de codones de parada artificiales, eliminación o mutación de sitios activos o dominios de interacción, mutación o eliminación de una secuencia reguladora de un gen, etc., o eliminación completa de un gen que codifica un producto génico que es esencial para replicación viral, tal como uno o más de los genes adenovirales seleccionados de E1, E2, E3 y E4. Los virus adenovirales recombinantes de la enseñanza son preferiblemente defectuosos para replicación.

El término "adenovirus recombinante" se refiere en particular a un adenovirus que se modifica para comprender una secuencia polinucleotídica y/o polipeptídica heteróloga. "Heterólogo" puede significar de otra cepa de adenovirus, en particular una cepa de un huésped diferente (por ejemplo, un huésped humano, por ejemplo, de un adenovirus humano tal como Ad3 o Ad5), o de un organismo no adenoviral como un antígeno derivado de un patógeno como se describe en el presente documento, o de humano tal como un antígeno tumoral humano. Como tal, el término comprende adenovirus quiméricos y portadores, respectivamente. Un adenovirus recombinante puede comprender una secuencia polinucleotídica y/o polipeptídica heteróloga de otros adenovirus o de organismos no adenovirales, es decir, puede ser un adenovirus tanto quimérico como portador.

Como se usa en el presente documento, el término "partícula similar a virus" o "VLP" se refiere a una cubierta viral vacía, no replicante, derivada en este caso de un adenovirus. Las VLP generalmente están compuestas por una o más proteínas virales, tales como, pero sin limitación, aquellas proteínas denominadas proteínas de cápside, cubierta, caparazón, superficie y/o envoltura. Contienen proteínas virales funcionales responsables de la penetración celular del virus, lo que asegura una entrada celular eficiente. Las VLP pueden formarse espontáneamente tras la expresión recombinante de la proteína en un sistema de expresión apropiado. Los métodos para producir VLP particulares son conocidos en la técnica. Las VLP de adenovirus en particular se pueden producir alterando funcionalmente, por ejemplo, eliminando o introduciendo una mutación nula en el gen Iva2 de un adenovirus, que está involucrado en el empaquetamiento del ADN viral (Ostapchuk et al., J Virol. Junio de 2011, 85 (11): 5524-5531). La presencia de las VLP se puede detectar utilizando técnicas convencionales conocidas en el arte, tal como microscopía electrónica, cristalografía de rayos X y similares. Véase, por ejemplo, Baker et al., Biophys. J. (1991) 60:1445-1456; Hagensee et al., J. Virol. (1994) 68:4503-4505. Por ejemplo, se puede realizar microscopía crioelectrónica en muestras acuosas vitrificadas de la preparación de VLP en cuestión, y se pueden registrar imágenes en condiciones de exposición apropiadas.

"ADN genómico sustancialmente no viral" contenido en una VLP significa que no hay ADN genómico viral en la VLP o que no hay suficiente ADN viral en la VLP para permitir la replicación del virus en una célula infectada con la VLP y que no expresa ADN que complementaría el ADN en la VLP de modo que pueda ocurrir la replicación del virus.

Además de lo anterior, un "epítopo", también conocido como determinante antigénico, es el segmento de una macromolécula que es reconocido por el sistema inmunológico, específicamente por anticuerpos, células B o células T. En el contexto de la presente enseñanza, se prefiere que el término "epítopo" se refiera al segmento de proteína o poliproteína que es reconocido por el sistema inmunitario. Los epítopos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y suelen tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión a los primeros pero no a los últimos se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.

Un "epítopo de células T no adenoviral" es un epítopo que se puede presentar en la superficie de una célula presentadora de antígeno, en la que se une a una molécula del MHC. En humanos, las células presentadoras de antígeno profesionales están especializadas para presentar péptidos de MHC de clase II, mientras que la mayoría de las células somáticas nucleadas presentan péptidos del MHC de clase I. Los epítopos de células T presentados por moléculas del MHC de clase I son típicamente péptidos de entre 8 y 11 aminoácidos de longitud, mientras que las moléculas del MHC de clase II presentan péptidos más largos, de 13 a 17 aminoácidos de longitud.

Un "epítopo de células B no adenovirales" es un epítopo que las células B reconocen como estructuras tridimensionales en la superficie de antígenos nativos.

Los epítopos de células B y T se pueden predecir con herramientas in silico, por ejemplo, las herramientas de predicción de células B o T en línea del IEDB Analysis Resource.

El término "presenta uno o más epítopos de células B no adenovirales" significa que uno o más epítopos se incorporan en la cápside de manera que sean reconocidos por las células B. El término "incorpora uno o más epítopos de células B/T no adenovirales" significa que el epítopo está contenido en la VLP sin estar incorporado en la cápside, o está incorporado en la cápside. Si está incorporado en la cápside, puede o no presentarse al exterior de manera que pueda ser reconocido por las células inmunitarias.

Un "adyuvante inmunológico" o simplemente "adyuvante" es una sustancia que acelera, prolonga y/o mejora la calidad y/o la fuerza de una respuesta inmune a un antígeno/inmunógeno, en comparación con la administración del antígeno solo, reduciendo así la cantidad de antígeno/inmunógeno necesaria en cualquier vacuna determinada y/o la frecuencia de inyección necesaria para generar una respuesta inmunitaria adecuada al antígeno/inmunógeno de interés. Ejemplos de adyuvantes que pueden usarse en el contexto de la composición de acuerdo con la presente enseñanza son precipitados de tipo gel de hidróxido de aluminio (alumbre); APO4; alhidrogel; productos bacterianos de la membrana externa de bacterias Gram-negativas, en particular monofosforil lípido A (MPLA), lipopolisacáridos (LPS), dipéptidos de muramilo y derivados de los mismos; adyuvante incompleto de Freund; liposomas, en particular liposomas neutros, liposomas que contienen la composición y opcionalmente citoquinas; copolímeros de bloques no iónicos; adyuvante ISCOMATRIX (Drane et al., 2007); ADN no metilado que comprende dinucleótidos CpG (motivo CpG), en particular ODN CpG con una cadena principal de fosforotioato (PTO) (CpG PTO ODN) o una cadena principal de fosfodiéster (PO) (CpG PO ODN); derivados de lipopéptidos sintéticos, en particular Pam3cis; lipoarabinomanano; peptidoglicano; zimosano; proteínas de choque térmico (HSP), en particular HSP 70; ARNbc y derivados sintéticos del mismo, en particular Poly I:poly C; péptidos policatiónicos, en particular poli-L-arginina; taxol; fibronectina; flagelina; imidazoquinolina; citocinas con actividad adyuvante, en particular GM-CSF, interleucina IL-2, IL-6, IL-7, IL-18, interferones tipo I y II, en particular interferón gamma, TNF-alfa; 25-dihidroxivitamina D3 (calcitriol); y oligopéptidos sintéticos, en particular péptidos presentados por el MHC clase II. Los polímeros en bloque no iónicos que contienen polioxietileno (POE) y polioxipropileno (POP), como los copolímeros en bloque POE-POP-POE, pueden usarse como adyuvante (Newman et al., 1998). Este tipo de adyuvante es particularmente útil para composiciones que comprenden ácidos nucleicos como ingrediente activo.

El término "vacunación" en el contexto de la presente enseñanza es una inmunización activa, es decir, una inducción de una respuesta inmunitaria específica mediante la administración (por ejemplo, por vía subcutánea, intradérmica, intramuscular, oral, nasal) de un antígeno (una sustancia que el sistema inmunitario es del individuo vacunado como extraño y por lo tanto reconocido inmunogénico) en una formulación inmunogénica adecuada. Por lo tanto, el antígeno se usa como un disparador para que el sistema inmunitario genere una respuesta inmunitaria específica al antígeno. Una vacunación dentro del alcance de la presente enseñanza puede llevarse a cabo en principio tanto en el sentido terapéutico, como también en el sentido profiláctico. Incluye vacunación contra patógenos como se describe en este documento para tratar o prevenir enfermedades infecciosas, o vacunación para tratar o prevenir enfermedades no infecciosas, tales como el cáncer. En el caso de enfermedades no infecciosas, el antígeno es preferiblemente un antígeno de membrana celular, en particular uno que se expresa solo por una célula enferma, pero no por células no enfermas. Un ejemplo es un antígeno asociado a un tumor. En este contexto, el término "antígeno asociado a tumor" significa una estructura que es predominantemente presentada por células tumorales y por lo tanto permite una diferenciación de tejido no maligno. Preferiblemente, dicho antígeno asociado a un tumor se localiza sobre o dentro de la membrana celular de una célula tumoral. Se describen ejemplos de antígenos asociados a tumores, por ejemplo, en De Vita et al., (Eds., "Biological Therapy of Cancer", segunda edición, Capítulo 3: Biología de antígenos tumorales, Lippincott Company, ISBN 0-397-51416-6 (1995)).

Cebado, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de una vacuna para inducir/generar una respuesta inmunitaria en un mamífero, y "refuerzo" a la administración de una vacuna para potenciar una respuesta inmunitaria en un mamífero. La frase "cebado-refuerzo heterólogo" significa que la vacuna para inducir/generar una respuesta inmunitaria (cebado) en un mamífero y la vacuna para potenciar la respuesta inmunitaria (refuerzo) en un mamífero son diferentes. El cebado-refuerzo heterólogo es útil si un sujeto, por ejemplo, el paciente ha desarrollado anticuerpos contra un primer vector y se requiere un refuerzo. En este contexto, una primera vacuna (cebado) y una segunda vacuna (refuerzo), por ejemplo, adenovirus, son suficientemente diferentes, si la respuesta de anticuerpos inducida durante el cebado por la primera vacuna no impide que más del 70% o preferiblemente más del 80% de las partículas de la segunda vacuna administradas para el refuerzo entren en el núcleo de las células del animal que ha sido sometido a cebado y refuerzo.

El término "terapia génica" puede definirse ampliamente como el concepto de introducción dirigida de material genético extraño en una célula, tejido u órgano para la corrección de genes defectuosos con el objetivo de mejorar el estado clínico de un paciente. Tal como se usa en el presente documento, el término "terapia génica" se refiere preferiblemente a "terapia somática" y no a "terapia de línea germinal", que induciría cambios hereditarios transmitidos de generación en generación, en los que la terapia somática restringe el efecto terapéutico al individuo tratado. La terapia génica, preferiblemente la terapia somática, puede discriminarse aún más mediante una transferencia directa de genes rápida y fácil de realizar al organismo. ("in vivo") o una transferencia de genes sofisticada pero más específica y controlable a células o tejidos explantados ("ex-vivo" o "in vitro"), que se reimplantan después del tratamiento.

El término "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que se une a un epítopo del adenovirus y evita que produzca una infección productiva en una célula huésped o evita la transducción de una célula diana con un vector incapaz de replicación que expresa un transgén, por ejemplo, el ADN de adenovirus es capaz de entrar en una célula, en particular en una célula huésped.

Varias modificaciones y variaciones de la enseñanza serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance de la enseñanza. Aunque la enseñanza se ha descrito en relación con facetas preferidas específicas, debe entenderse que la enseñanza reivindicada no debe limitarse indebidamente a tales facetas específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la enseñanza que son obvias para los expertos en los campos relevantes pretenden ser cubiertas por la presente enseñanza.

Ejemplo 1: Aislamiento de nuevos vectores adenovirales

La construcción de los vectores pGADNOU19 y pGADNOU20 siguió los pasos que se indican a continuación. Los vectores pGADNOU19 y pGADNOU20 se derivaron de las cepas de adenovirus de tipo silvestre aisladas de muestras de heces obtenidas de grandes simios no humanos sanos utilizando procedimientos estándar. Los virus de tipo silvestre se aislaron inoculando monocapas de células HEK 293 y A549 con extractos de heces. Las monocapas celulares se observaron diariamente para detectar la aparición de un efecto citopático. Las muestras calificadas como positivas por observación bajo el microscopio se recogieron y luego las células se lisaron por congelacióndescongelación (-700°C/37°C). El lisado celular clarificado se usó luego para la propagación del virus infectando monocapas de células frescas. Después de dos pases de amplificación del virus, el adenovirus se purificó usando procedimientos estándar. El genoma viral se extrajo de virus purificados mediante digestión con SDS/proteinasa K seguida de extracción con fenol-cloroformo. El a Dn de adenovirus purificado se clonó en un vector de plásmido lanzadera para modificarlo realizando las siguientes eliminaciones del genoma viral:

1) eliminación de la región E1 (desde pb 461 hasta el pb 3402) del genoma viral

2) eliminación de la región E3 (desde pb 28472 hasta el pb 31996) del genoma viral

Ejemplo 2: Generación de vectores lanzadera GADNOU

Primero se secuenciaron los genomas de ADN purificados de los virus GADNOU y luego se usó la información de la secuencia de ADN para construir un vector lanzadera para clonar el genoma completo de GAd mediante recombinación homóloga. El vector lanzadera se diseñó para introducir la eliminación de la región E1 (coordenadas de nucleótidos: 461-3402). Brevemente, el vector lanzadera utilizado para clonar los virus GADNOU (denominado en el presente documento lanzadera pGAd-GAG) se construyó de la siguiente manera:

a. el extremo izquierdo de GAd-GAG se amplificó mediante PCR con oligonucleótidos 5'-GAACTCC

gaattcgtttaaaccatcatcaataatataccttattttggattgaggccaatatgataatgaggtgggcggggcgaggc ggggcgggtgacgtagg-3' directo (SEQ ID NO: 58) y 5'-cataatcGGCCGCAGCGGCCCGTCAG ATGACGGCGACAATAAA-3' inverso (SEQ ID NO: 59) digerido con EcoRI y Sfil luego ligado en pUC19 rc_MCS_Extremo izquierdo_PIX_Extremo derecho_V1 digerido con EcoRI y Sfil, generando así pUC19 L-ITR GAd-GAG.

b. Luego se amplificó el extremo derecho de GAd por PCR con oligonucleótidos 5'-Cataatcgacccgagtcgcactctcacagcaccagca-3' directo (SEQ ID NO: 60) y 5'-GAACTCCggatccgtttaaacCATCATCAATAATATACCTTATTTTG -3' inverso (SEQ ID NO: 61) digerido con PshA1 y BamHI luego ligado en pUC19 L-ITR GAd-GAG digerido con PshA1 y BamHI, generando así pUC19 L/R-ITR GAd-GAG.

c. El fragmento de ADN que contenía la región codificante de pIX se amplificó por PCR con los oligonucleótidos 5'-Cataatcgcgatcgcgcttaggcctgaccatctgg-3' directo (SEQ ID NO: 62) y 5'- GAACTCCggcgcgccTTAGGGGGAGGCAAGG CTG-3' inverso (SEQ ID NO: 63) digerido con AsisI-AscI y luego clonado en el plásmido pUC19 L/R-ITR GAd-GAG digerido con AsisI-AscI, generando pUC19 L/R-ITR pIX GAd-GAG.

d. El casete HCMV-GAG-BGHpoliA se obtuvo a partir de un plásmido phCMV-GAG digerido con MscI-SfiI. El casete se clonó en pUC19 L/R-ITR pIX GAd-GAG digerido con MscI-SfiI y luego se tornó romo generando la lanzadera pGAd-GAG.

e. Construcción de la lanzadera BAC reemplazando la región del plásmido con la región BAC: La región BAC se obtuvo de un plásmido pBELO BAC RDL digerido con PmeI y luego clonado en el plásmido pGAd-GAG lanzadera digerido con PmeI y generando así la lanzadera BAC de GAd-GAG

f. Inserción del casete de selección Amp-LacZ-SacB entre el extremo derecho y la región pIX: El casete de selección Amp-LacZ-SacB se obtuvo a partir del plásmido lanzadera pChAd mediante PCR utilizando los oligonucleótidos (5'-GAACTCCGGCGCGCCTAGG GATAACAGGGTAAT ACCCCTATTTGTTTATTTTTCT -3' directo, SEQ ID NO: 64) y (5'-CATAATCGGCGCGCCATTACCCTGTTATCCCTATTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3' inverso, SEQ ID NO: 65) digerido con AscI. El casete de selección se clonó en la lanzadera BAC de GAd-GAG digerida con AscI que generó la lanzadera BAC de GAd-GAG A/L/S (Figura 1).

El plásmido lanzadera ha sido diseñado para contener sitios de enzimas de restricción (PmeI) que están presentes solo al final de ambas ITR para permitir la liberación de ADN viral del ADN del plásmido.

Ejemplo 3: Construcción de vectores AE1

El ADN genómico de GADNOU de tipo silvestre se aisló mediante digestión con proteinasa K seguida de extracción con fenol/cloroformo. Los vectores pGADNOU19 y pGADNOU20 se obtuvieron por recombinación homóloga en la cepa BJ5183 de E. coli. La clonación del ADN viral se obtuvo transformando conjuntamente células de la cepa BJ5183 de E. coli con ADN viral de tipo silvestre purificado y la lanzadera BAC de GAd-GAG A/L/S. La recombinación homóloga entre los genes pIX, las secuencias de ADN ITR a la derecha presentes en los extremos de la lanzadera BAC (digerido con AscI) y el a Dn genómico viral permitió su inserción en el vector BAC, al eliminar al mismo tiempo la región E1 que fue sustituida por el casete de expresión, generando los vectores de AE1/GAG (BAC) GADNOU19 GAG Ba C y GADNOU20 GAG BAC. El cribado se realizó mediante análisis de restricción y secuenciación por PCR en la región del hexón.

Ejemplo 4: Construcción de vectores AE3

La estrategia de construcción se basó en dos etapas consecutivas como se describe a continuación:

a) Sustitución de la región E3 por el casete de selección Amp-LacZ-SacB:

El casete de selección Amp-LacZ-SacB se obtuvo de la lanzadera BAC de GAd-GAG A/L/S mediante PCR utilizando los oligonucleótidos (5'-GGATTACACCAAGATCTTTGCTGTCATTTGTGTGCTGAGTATAATAAAGGCTGAGATCAG AATCTACTCGACCCCTATTTGTTTATTTTTTCT-3' directo, SEQ ID NO: 66) y (5'-CTTGCTATCAGATTTCAAGTAAG TGATTTTTTATTGATTACAGTTATGATCAATTGAAAGGGATAAGGTCTTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3' inverso, SEQ ID NO: 67). El fragmento de ADN obtenido por PCR fue luego clonado en GAdNou19 GAG BAC y GAdNou20 GAG BAC por técnica de recombinación obteniendo GAdNou19 GAG (DE1E3) A/L/S BAC y GAdNou20 GAG (DE1E3) A/L/S BAC

b) Eliminación del casete de selección Amp-lacZ-SacB para la eliminación de la región E3:

El casete de selección Amp-LacZ-SacB se eliminó utilizando el oligonucleótido monocatenario (5' ctgtcatttgtgtgctgagtataataaaggctgagatcagaatctactcggaccttatccctttcaattgatcataactgtaatcaataaaaaatcactt-3', SEQ ID NO: 68) obteniendo la sustitución del casete de selección Amp-LacZ-SacB con oligo ss y la posterior eliminación de la región E3. El oligo ss se usó para reemplazar el casete de selección en GADNOU19 GAG (DE1E3) A/L/S BAC y GADNOU20 GAG (DE1E3) A/L/S BAC mediante técnicas de recombinación, para crear el plásmido final GADNOUl9 GAG (DE1E3) BAC ( Figura 2) y GADNOU20 GAG (DE1E3) BAC (Figura 3).

Ejemplo 5: Productividad mejorada de los nuevos vectores adenovirales

Se evaluó la productividad de dos vectores adenovirales de grandes simios no humanos, GADNOU19 y GADNOU 20, que portan la eliminación E1 y expresan el antígeno GAG en células adherentes Hek293. La productividad se evaluó infectando las células adherentes T25 con virus purificados con un MOI 100 y MOI 300 vp/células, en comparación con el vector Ad5 de referencia que porta el mismo casete de expresión. Las células infectadas se recogieron tres días después de la infección, cuando era evidente el efecto citopático total; el virus se liberó de las células infectadas

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido aislado que codifica una proteína hexón de adenovirus que comprende:

(i) una HVR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11

(ii) una HVR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12,

(iii) una HVR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 13,

(iv) una HVR4 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 14,

(v) una HVR5 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 15,

(vi) una HVR6 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 16, y

(vii) una HVR7 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 17.

2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en el que la proteína hexón comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 46, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la misma.

3. El polinucleótido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que además codifica una proteína pentón adenoviral que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 51 o 52, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la misma.

4. El polinucleótido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además codifica una proteína de fibra adenoviral que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 53 o 54, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la misma.

5. El polinucleótido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además codifica un ARN no codificante de a Rn II VA que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 57, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia, y/o un ARN no codificante de ARN I VA que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 55 o 56, o una variante de la misma que tenga al menos un 85% de identidad de secuencia con la misma.

6. Un polinucleótido aislado que codifica un adenovirus que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. El polinucleótido aislado de la reivindicación 6, en el que el adenovirus es un adenovirus quimérico, porta un gen, una proteína o un fragmento del mismo que no es adenoviral, y/o es incompetente para la replicación.

8. Una proteína hexón adenoviral aislada codificada por un polinucleótido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

9. Un adenovirus aislado que comprende al menos una proteína hexón adenoviral aislada de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Una partícula similar a virus codificada por un polinucleótido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 5, en la que la partícula similar a virus comprende al menos una proteína hexón adenoviral de acuerdo con la reivindicación 8.

11. Un vector que comprende un polinucleótido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

12. Una composición que comprende (i) un adyuvante, (ii) un polinucleótido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, al menos una proteína hexón adenoviral aislada de la reivindicación 8, un adenovirus de la reivindicación 9, una partícula similar a virus de la reivindicación 10, o un vector de la reivindicación 11, y opcionalmente (iii) un excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. Una célula que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, al menos una proteína hexón adenoviral aislada de la reivindicación 8, un adenovirus de la reivindicación 9, una partícula similar a virus de la reivindicación 10 o un vector de la reivindicación 11.

14. Un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, al menos una proteína hexón adenoviral aislada de la reivindicación 8, un adenovirus de la reivindicación 9, una partícula similar a virus de la reivindicación 10, o un vector de la reivindicación 11 y/o la composición de la reivindicación 12 para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad.

15. Un método in vitro para producir un adenovirus o una partícula similar a un adenovirus, que comprende las etapas de

(i) expresar un polinucleótido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en una célula de manera que se ensamble en la célula un adenovirus o una partícula similar a un adenovirus,