ES2959811T3 - Construcciones de adenovirus de chimpancé con antígenos de Lyssavirus - Google Patents

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Abstract

La invención proporciona vectores adenovirales que comprenden transgenes que codifican antígenos lisavirales. Los vectores pueden usarse para producir vacunas para la profilaxis, mejora y tratamiento de enfermedades causadas por enfermedades lisavirales, por ejemplo, rabia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Construcciones de adenovirus de chimpancé con antígenos de Lyssavirus
Campo de la Invención
La presente invención se encuentra en el campo de mejora de la enfermedad y tratamiento y prevención de infecciones virales. En particular, la presente invención se refiere a vectores adenovirales de chimpancé que codifican para un antígeno deLyssavirus.Incluye el uso de antígenos deLyssaviruspara mejorar las enfermedades porLyssavirusy tratar y prevenir las infecciones por rabia.
Antecedentes
El lisavirus es un virus de ARN monocatenario envuelto de la familia Rhabdoviridae. Los miembros del géneroLyssaviruscausan rabia y tienen la tasa de mortalidad más alta de todos los patógenos virales humanos conocidos. La rabia se transmite a través de la saliva de los mamíferos infectados. Un virus neurotrópico, entra en el sistema nervioso de su huésped, causando una encefalomielitis que es casi invariablemente fatal. Actualmente hay aproximadamente 60.000 muertes por rabia en todo el mundo cada año, en su mayoría causadas por mordeduras de perro en países en desarrollo de Asia y África y por la vida silvestre y los murciélagos en América del Norte.
La rabia se presenta ya sea en una forma furiosa o paralítica. El período de incubación varía entre aproximadamente cinco días y varios años, pero generalmente es entre aproximadamente 20 y 90 días. La enfermedad clínica suele comenzar con quejas prodrómicas de malestar, anorexia, fatiga, dolor de cabeza y fiebre, seguidas de dolor o parestesia en el sitio de exposición. La ansiedad, la agitación o la irritabilidad pueden ser prominentes durante este período, seguidas de hiperactividad, desorientación, convulsiones, hidrofobia, hipersalivación y, finalmente, parálisis, coma y muerte.
El adenovirus se ha utilizado ampliamente para aplicaciones de transferencia génica debido a su capacidad para lograr una transferencia génica altamente eficiente en una variedad de tejidos diana y una gran capacidad transgénica. Convencionalmente, los genes E1 de adenovirus se eliminan y reemplazan con un casete transgénico que consiste en un promotor de elección, una secuencia de ADNc del gen de interés y una señal poli A, dando como resultado un virus recombinante de replicación defectuosa.
Los adenovirus recombinantes son útiles tanto en terapia génica como en vacunas. Los vectores virales basados en adenovirus de simio no humano representan una alternativa al uso de vectores derivados de humanos para el desarrollo de vacunas genéticas. Ciertos adenovirus aislados de simios no humanos están estrechamente relacionados con los adenovirus aislados de humanos, como se demuestra por su propagación eficiente en células de origen humano.
Existe una demanda de vectores que puedan administrar antígenos de vacuna de manera efectiva. Específicamente, la rabia sigue siendo una zoonosis viral importante en todo el mundo. En tanto que la profilaxis está actualmente disponible, se requiere un alto número de dosis tanto antes como después de la exposición, y el cumplimiento es bajo, lo que disminuye el beneficio médico. Existe una necesidad de una vacuna contra la rabia mejorada con un programa de dosificación simplificado, mayor seguridad y un perfil de fabricación mejorado. La fabricación de adenovirus es más segura y menos costosa que las vacunas contra la rabia humanas existentes, que se basan en virus de la rabia inactivado. Por consiguiente, existe una necesidad insatisfecha de desarrollar vectores adenovirales para su uso en una vacuna contra la rabia.
WO2015/189425A1 divulga combinaciones inmunogénicas que incluyen a) un componente inmunogénico que contiene un antígeno peptídico o polipeptídico de un patógeno respiratorio; y b) un componente inmunogénico que contiene un ácido nucleico que codifica para un antígeno del mismo patógeno respiratorio, en donde los componentes inmunogénicos se formulan para administración concurrente, por ejemplo, colocalizada.
WO2009/105084A2 divulga un vector recombinante que comprende secuencias de adenovirus de simio SAdV-40, SAdV-31 o SAdV-34 y un gen heterólogo bajo el control de secuencias reguladoras.
WO2005/071093A2 divulga vectores adenovirales recombinantes de replicación defectuosa derivados de adenovirus de chimpancé y métodos para generar adenovirus recombinantes en líneas celulares que expresan E1 humano.
WO2010/086189A2 divulga nuevas cepas de adenovirus con una seroprevalencia mejorada WO03/000283A1 divulga un método para inducir una respuesta T CD8+ contra una molécula seleccionada mediante la administración de la molécula a través de un adenovirus de simio recombinante.
Xiang, Z. Q., et al. Virology 450 (2014): 243-249 divulga la inmunización con una dosis de un vector de adenovirus de chimpancé SAd-V24 que expresa la glicoproteína del virus de la rabia. Ertl, Hildegund CJ. PLoS neglected tropical diseases 3.9 (2009): e515 divulga nuevas vacunas contra la rabia humana.
Breve descripción de la invención
Los presentes inventores proporcionan construcciones útiles como componentes de composiciones inmunogénicas para la inducción de una respuesta inmunitaria en un sujeto contra enfermedades porLyssaviruse infección viral de la rabia, métodos para su uso en el tratamiento y procesos para su fabricación.
Se proporciona un adenovirus recombinante que comprende:
a) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO:<1>y
b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3 y
c) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 5;
en donde el adenovirus comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un antígeno deLyssavirus,en donde la secuencia de ácido nucleico está ligada operativamente a una o más secuencias que dirigen la expresión del antígeno deLyssavirusen una célula hospedadora;
en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica para un antígeno deLyssaviruscodifica para un antígeno derivado de la glicoproteína viral de la rabia (G).
Los adenovirus y composiciones recombinantes pueden ser para su uso como un medicamento, en particular para la estimulación de una respuesta inmunitaria contra enfermedades porLyssavirus,tal como una infección por rabia.
Típicamente, la invención se utiliza para inducir una respuesta inmunitaria protectora, es decir, para inmunizar o vacunar al sujeto contra un patógeno relacionado. Por lo tanto, la invención puede ser para su uso en la profilaxis, tratamiento o mejora de enfermedades debidas a la infección por enfermedades porLyssavirus, tal como la infección por un virus de la rabia.
En algunos aspectos, las composiciones divulgadas en la presente son composiciones inmunogénicas que, cuando se administran a un sujeto, inducen una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, es decir, una respuesta inmunitaria que reconoce específicamente un polipéptido Lyssaviral de origen natural. Por ejemplo, una composición inmunogénica puede inducir una población de células T y/o B de memoria con respecto a un sujeto no tratado después de la infección viral, particularmente en aquellas realizaciones donde la composición comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para un antígeno deLyssavirus.
La invención se puede proporcionar con el propósito tanto de la profilaxis previa a la exposición como de la profilaxis posterior a la exposición a enfermedades causadas por enfermedades porLyssavirus.En algunas realizaciones, el sujeto se ha vacunado previamente con una vacuna contra la rabia. Los enfoques de la presente invención se pueden utilizar, por ejemplo, para un sujeto al menos un año después de la vacunación contra la rabia, al menos dos años después de la vacunación contra la rabia, al menos cinco años después de la vacunación contra la rabia o al menos diez años después de la vacunación contra la rabia.
El antígeno deLyssaviruses una secuencia antigénica, es decir, una secuencia de una proteína deLyssavirusque comprende al menos un epítopo de células B o T. Adecuadamente, el antígeno deLyssaviruscomprende al menos un epítopo de células T. En una realización de la invención, el adenovirus comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un antígeno deLyssavirus.En una realización específica de la invención, el adenovirus comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido derivado de SEQ ID NO: 37. En otra realización específica de la invención, el adenovirus comprende un ácido nucleico derivado de SEQ ID NO: 38.
En otra realización de la invención, el adenovirus puede comprender un ácido nucleico que codifica para un polipéptido derivado de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, o SEQ ID NO: 45. En una realización específica adicional de la invención, el adenovirus puede comprender un ácido nucleico derivado de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 46.
La respuesta inmunitaria provocada puede ser una respuesta de células B específica de antígeno, que produce anticuerpos neutralizantes. La respuesta inmunitaria provocada puede ser una respuesta de células T específica de antígeno, que puede ser una respuesta sistémica y/o local. La respuesta de células T específicas de antígeno puede comprender una respuesta de células T CD4+, tal como una respuesta que implica células T CD4+ que expresan una pluralidad de citocinas, por ejemplo, IFNgamma, factor de necrosis tumoral alfa (TNFalfa) y/o IL2. De manera alternativa o adicional, la respuesta de células T específicas de antígeno comprende una respuesta de células T CD8+, tal como una respuesta que implica células T CD8+ que expresan una pluralidad de citocinas, por ejemplo, IFNgamma, TNFalfa y/o IL2.
Descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama de la glicoproteína de la rabia que indica los principales epítopos antigénicos. La figura 1 divulga las SEQ ID NO 94, 64 y 78, respectivamente, en orden de aparición.
Las figuras 2A-2C son una alineación de secuencias de proteínas de fibra de los adenovirus de simio indicados.
ChAd3 (SEQ ID NO:27)
PanAd3 (SEQ ID NO:28)
ChAd17 (SEQ ID NO:29)
ChAd19 (SEQ ID NQ:30)
ChAd24 (SEQ ID NO:31) ChAd155 (SEQ ID NO:1) ChAd11 (SEQ ID NO:32)ChAd20 (SEQ ID NO:33)
ChAd31 (SEQ ID NO:34)
PanAd1 (SEQ ID NO:35)
PanAd2 (SEQ ID NO:36)
La figura 3 es un diagrama de flujo para la producción de vectores de plásmidos y ChAd155 BAG específicos
La figura 4 es un esquema de lanzadera de BAG de especie C #1365
La figura 5 es un esquema de pArsChAd155 Ad5E4orf6-2 (#1490).
La figura 6 es un esquema de pChAd155/RSV
La figura 7 es un esquema de BAG ChAd155/RSV
La figura 8 es un esquema de E4 Ad5E4orf6/ TetO hCMV RG WPRE (#1509)
La figura 9 muestra la productividad de los vectores ChAd3 y ChAd155 que expresan un transgén Gag de VIH
La figura 10 muestra los niveles de expresión de los vectores ChAd155 y PanAd3 que expresan un transgén de RSV -transferencia Western
La figura 11 muestra la inmunogenicidad de los vectores ChAd3 y ChAd155 que expresan un transgén Gag de VIH - IFN-gamma ELISpot
La figura 12 muestra la inmunogenicidad de los vectores PanAd3 y ChAd155 que expresan un transgén de RSV - IFN-gamma ELISpot
La figura 13 muestra la inmunogenicidad del vector ChAd155 que expresa un transgén de proteína G de la rabia en ratones - (A) neutralización de anticuerpos y (B) IFN-gamma ELISpot
La figura 14 muestra la estabilidad de la respuesta inmunitaria inducida por el vector ChAd155 que expresa un transgén de proteína G de la rabia
La figura 15 muestra la potencia del vector ChAd155 que expresa un transgén de proteína G de la rabia en comparación con las vacunas disponibles comercialmente
La figura 16 muestra las tasas de seroconversión y protección del vector ChAd155 que expresa un transgén de proteína G de la rabia en ratones
La figura 17 muestra las tasas de seroconversión y protección del vector ChAd155 que expresa un transgén de proteína G de la rabia en ratones
La figura 18 muestra la respuesta de anticuerpos neutralizantes al vector ChAd155 que expresa un transgén de proteína G de la rabia en primates no humanos
La figura 19 muestra las respuesta de células T al vector ChAd155 que expresa un transgén de proteína G de la rabia en primates no humanos
Descripción de las secuencias
SEQ ID NO: 1 - Secuencia polipeptídica de fibra ChAd155
SEQ ID NO: 2- Secuencia de polinucleótidos que codifica para fibra ChAd155
SEQ ID NO: 3- Secuencia polipeptídica de pentón ChAd155
SEQ ID NO: 4- Secuencia de polinucleótidos que codifica para pentón ChAd155
SEQ ID NO: 5- Secuencia polipeptídica de hexón ChAd155
SEQ ID NO: 6- Secuencia de polinucleótidos que codifica para hexón ChAd155
SEQ ID NO: 7- Secuencia de polinucleótidos que codifica para ChAd155#1434
SEQ ID NO: 8- Secuencia de polinucleótidos que codifica para ChAd155#1390
SEQ ID NO: 9- Secuencia de polinucleótidos que codifica para ChAd155#1375
SEQ ID NO: 10- Secuencia de polinucleótidos que codifica para ChAd155 de tipo silvestre
SEQ ID NO: 11 - Secuencia de polinucleótidos que codifica para ChAd155/RSV
SEQ ID NO: 12 - Secuencia de polinucleótidos que codifica para el promotor CASI
SEQ ID NO: 13- Secuencia de polinucleótidos de cebador 1 de Ad5orf6
SEQ ID NO: 14- Secuencia de polinucleótidos de cebador 2 de Ad5orf6
SEQ ID NO: 15- Secuencia de polinucleótidos de cebador 1 de BAC/CHAd155 AE1_TetO hCMV RpsL-Kana
SEQ ID NO: 16- Secuencia de polinucleótidos de cebador 2 de BAC/CHAd155 AE1_TetO hCMV RpsL-Kana (#1375)
SEQ ID NO: 17- Secuencia de polinucleótidos de cebador de 1021 -FW E4 Del Stepl
SEQ ID NO: 18- Secuencia de polinucleótidos de cebador de 1022-RW E4 Del Stepl
SEQ ID NO: 19- Secuencia de polinucleótidos de cebador de 1025-FW E4 Del Step2
SEQ ID NO: 20- Secuencia de polinucleótidos de cebador de 1026-RW E4 Del Step2
SEQ ID NO: 21 - Secuencia de polinucleótidos de cebador de 91 -SubMonte FW
SEQ ID NO: 22 - Secuencia de polinucleótidos de cebador de 90-BghPolyA RW
SEQ ID NO: 23- Secuencia de polinucleótidos de cebador de CMVfor
SEQ ID NO: 24- Secuencia de polinucleótidos de cebador de CMVrev
SEQ ID NO: 25- Secuencia de polinucleótidos de sonda de CMVFAM-TAMRA qPCR
SEQ ID NO: 26- Secuencia de polinucleótidos del elemento regulador postranscripcional (WPRE) del virus de la hepatitis de la marmota
SEQ ID NO: 27- Secuencia de aminoácidos para la proteína de fibra de ChAd3
SEQ ID NO: 28- Secuencia de aminoácidos para la proteína de fibra de PanAd3
SEQ ID NO: 29- Secuencia de aminoácidos para la proteína de fibra de ChAd17
SEQ ID NO: 30- Secuencia de aminoácidos para la proteína de fibra de ChAd19
SEQ ID NO: 31 - Secuencia de aminoácidos para la proteína de fibra de ChAd24
SEQ ID NO: 32 - Secuencia de aminoácidos para la proteína de fibra de ChAdl 1
SEQ ID NO: 33- Secuencia de aminoácidos para la proteína de fibra de ChAd20
SEQ ID NO: 34- Secuencia de aminoácidos para la proteína de fibra de ChAd31
SEQ ID NO: 35- Secuencia de aminoácidos para la proteína de fibra de PanAd1
SEQ ID NO: 36- Secuencia de aminoácidos para la proteína de fibra de PanAd2
SEQ ID NO: 37 - Secuencia de aminoácidos para el antígeno medoide RG
SEQ ID NO: 38- Secuencia de nucleótidos para el antígeno medoide RG
SEQ ID NO: 39- Secuencia de aminoácidos para RG AA098
SEQ ID NO: 40- Secuencia de ácido nucleico para RG AA098
SEQ ID NO: 41 - Secuencia de aminoácidos para RG AA0093
SEQ ID NO: 42 - Secuencia de ácido nucleico para RG AA0093
SEQ ID NO: 43- Secuencia de aminoácidos para RG AA0094
SEQ ID NO: 44- Secuencia de ácido nucleico para RG AA0094
SEQ ID NO: 45- Secuencia de aminoácidos para RG AA0095
SEQ ID NO: 46- Secuencia de ácido nucleico para RG AA0095
SEQ ID NO: 47 - Secuencia de aminoácidos para cepa AdC68rab.gp - ERA
SEQ ID NO: 48 - Secuencia de nucleótidos para cepa AdC68rab.gp - ERA
SEQ ID NO: 49- Polihistidina
SEQ ID NO: 50-63- Epítopos antigénicos de sitio lib de proteína G de la rabia
SEQ ID NO: 64-77- Epítopos antigénicos de sitio I de proteína G de la rabia
SEQ ID NO: 78-91- Epítopos antigénicos de sitio III de proteína G de la rabia
SEQ ID NO: 92- Cebador directo de pvjTetOhCMV_WPRE_BghPolyA
SEQ ID NO: 93- Cebador inverso de pvjTetOhCMV_WPRE_BghPolyA
Descripción detallada de la invención
Vectores adenovirales
El adenovirus se ha utilizado ampliamente para aplicaciones de transferencia génica debido a su seguridad comprobada, su capacidad para lograr una transferencia génica altamente eficiente en una variedad de tejidos diana y su gran capacidad transgénica. Los vectores adenovirales de uso en la presente invención se pueden derivar de una variedad de huéspedes mamíferos. Se han aislado más de 100 serotipos distintos de adenovirus que infectan varias especies de mamíferos. Estos serotipos adenovirales se han clasificado en seis subgéneros (A-F; B se subdivide en B1 y B2) de acuerdo con la homología de secuencia y su capacidad para aglutinar glóbulos rojos.
Se han aislado numerosos adenovirus de simios no humanos tal como chimpancés, bonobos, macacos rhesus y gorilas, y los vectores derivados de estos adenovirus inducen fuertes respuestas inmunitarias a los transgenes codificados por estos vectores (Colloca et al. (2012) Sci. Transl. Med. 4:1-9; Roy et al. (2004) Virol.324: 361-372; Roy et al. (2010) J. of Gene Med. 13:17-25). Determinadas ventajas de los vectores basados en adenovirus de simio no humanos incluyen la falta relativa de anticuerpos de neutralización cruzada para estos adenovirus en la población diana, por lo que su uso supera la inmunidad preexistente a los adenovirus humanos. Por ejemplo, la reacción cruzada de ciertos adenovirus de chimpancé con respuestas de anticuerpos neutralizantes preexistentes solo está presente en el 2% de la población diana en comparación con el 35% en el caso de ciertos vectores de adenovirus humanos candidatos.
Estructura de vector adenoviral
Los adenovirus tienen una morfología característica con una cápside icosaédrica que comprende tres proteínas principales, hexón (II), pentón base (III) y una fibra con botón (IV), junto con una serie de otras proteínas menores, VI, VIII, IX, Illa e IVa2. El hexón representa la mayoría de los componentes estructurales de la cápside, que consiste en 240 capsómeros de hexón triméricos y 12 bases de pentón. El hexón tiene tres barriles dobles conservados, en tanto que la parte superior tiene tres torres, cada torre contiene un asa de cada subunidad que forma la mayor parte de la cápside. La base del hexón está altamente conservada entre los serotipos adenovirales, en tanto que las asas de superficie son variables. El pentón es otra proteína de la cápside adenoviral que forma una base pentamérica a la que se une la fibra. La proteína de fibra trimérica sobresale de la base pentónica en cada uno de los 12 vértices de la cápside y es una estructura en forma de varilla con botón. El papel principal de la proteína de fibra es el anclaje de la cápside viral a la superficie celular a través de la interacción de la región de botón con un receptor celular, y las variaciones en el eje flexible, así como las regiones de botón de fibra son características de los diferentes serotipos.
El genoma adenoviral ha sido bien caracterizado. El ADN bicatenario lineal se asocia con la proteína VII altamente básica y un pequeño péptido pX (también denominado mu). Otra proteína, V, se empaqueta con este complejo ADN-proteína y proporciona un enlace estructural a la cápside a través de la proteína VI. Existe una conservación general en la organización general del genoma adenoviral con respecto a los marcos de lectura abiertos específicos que se posicionan de manera similar, por ejemplo, la ubicación de los genes E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 y L5 de cada virus. Cada extremo del genoma adenoviral comprende una secuencia conocida como una repetición terminal invertida (ITR), que es necesaria para la replicación viral. El extremo 5’ del genoma adenoviral contiene los elementos cis 5' necesarios para el empaquetamiento y replicación; es decir, las secuencias ITR 5’ (que funcionan como orígenes de replicación) y los dominios potenciadores de empaquetamiento 5' nativos (que contienen secuencias necesarias para empaquetar genomas adenovirales lineales y elementos potenciadores para el promotor E1). El extremo 3’ del genoma adenoviral incluye los elementos cis 3' (incluidas las ITR) necesarios para el empaquetamiento y encapsidación. El virus también comprende una proteasa codificada por virus, que es necesaria para procesar algunas de las proteínas estructurales necesarias para producir viriones infecciosos.
La estructura del genoma adenoviral se describe con base en el orden en el que se expresan los genes virales después de la transducción de la célula hospedadora. Más específicamente, los genes virales se denominan genes tempranos (E) o tardíos (L) de acuerdo con si la transcripción ocurre antes o después del inicio de la replicación del ADN. En la fase temprana de la transducción, los genes E1 A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4 de adenovirus se expresan para preparar la célula hospedadora para la replicación viral. Durante la fase tardía de la infección, se activa la expresión de los genes tardíos L1-L5, que codifican para los componentes estructurales de las partículas víricas.
Proteínas de cápside de adenovirus y sus polinucleótidos codificantes
Como se describió anteriormente, la cápside adenoviral comprende tres proteínas principales, hexón, pentón y fibra. El hexón representa la mayoría de los componentes estructurales de la cápside, que consiste en 240 capsómeros de hexón triméricos y 12 bases de pentón. El hexón tiene tres barriles dobles conservados, en tanto que la parte superior tiene tres torres, cada torre contiene un asa de cada subunidad que forma la mayor parte de la cápside. La base del hexón está altamente conservada entre los serotipos adenovirales, en tanto que las asas de superficie son variables.
El pentón es otra proteína de la cápside adenoviral que forma una base pentamérica a la que se une la fibra. La proteína de fibra trimérica sobresale de la base pentónica en cada uno de los 12 vértices de la cápside y es una estructura en forma de varilla con botón. Una diferencia notable en la superficie de las cápsides de adenovirus en comparación con la de la mayoría de los otros virus icosaédricos es la presencia de la proteína de fibra larga y delgada. El papel principal de la proteína de fibra es el anclaje de la cápside viral a la superficie celular a través de su interacción con un receptor celular.
Las proteínas de fibra de muchos serotipos de adenovirus comparten una arquitectura común: una cola N-terminal, un eje central hecho de secuencias repetidas y un dominio de botón globular C-terminal (o "cabeza"). El dominio de eje central consiste en un número variable de repeticiones beta. Las repeticiones beta se conectan para formar una estructura alargada de tres hebras en espiral entrelazadas que es altamente rígida y estable. El eje conecta la cola N-terminal con la estructura de botón globular, que es responsable de la interacción con el receptor celular diana. La naturaleza globular del dominio de botón de adenovirus presenta grandes superficies para unirse al receptor lateral y apicalmente. El efecto de esta arquitectura es proyectar el sitio de unión al receptor lejos de la cápside del virus, liberando así al virus de las restricciones estéricas presentadas por la superficie relativamente plana de la cápside.
Aunque las fibras de muchos serotipos de adenovirus tienen la misma arquitectura general, tienen secuencias de aminoácidos variables que influyen en su función y estructura. Por ejemplo, varias regiones expuestas en la superficie del botón de fibra presentan un sitio de unión al receptor fácilmente adaptable. La forma globular del botón de fibra permite que los receptores se unan a los lados del botón o en la parte superior del botón de fibra. Estos sitios de unión típicamente se encuentran en asas expuestas en la superficie que conectan hebras beta que están mal conservadas entre los adenovirus humanos. Las cadenas laterales expuestas en estas asas le dan al botón una variedad de características de superficie en tanto que conservan la estructura terciaria y cuaternaria. Por ejemplo, el potencial electrostático y las distribuciones de carga en las superficies de botón pueden variar debido a la amplia gama de puntos isoeléctricos en las secuencias de botón de fibra, que varían de un pl de aproximadamente 9 para el adenovirus "Ad" 8, Ad 19 y Ad 37 a aproximadamente 5 para los adenovirus del subgrupo B. Como un ligando de virus estructuralmente complejo, la proteína de fibra permite la presentación de una variedad de superficies de unión (botón) en varias orientaciones y distancias (eje) de la cápside viral.
Una de las variaciones más obvias entre algunos serotipos es la longitud de la fibra. Los estudios han demostrado que la longitud del eje de la fibra influye fuertemente en la interacción del botón y el virus con sus receptores diana. Además, las proteínas de fibra entre serotipos también pueden variar en su capacidad de doblarse. Aunque las repeticiones beta en el eje forman una estructura altamente estable y regular, los estudios de microscopía electrónica (EM) han demostrado distintas bisagras en la fibra. El análisis de la secuencia de proteínas de varias fibras de serotipo de adenovirus señala una interrupción en las secuencias de repetición del eje en la tercera betarepetición de la cola N-terminal, que se correlaciona fuertemente con una de las bisagras en el eje, como se ve por EM. Las bisagras en la fibra permiten que el botón adopte una variedad de orientaciones con respecto a la cápside del virus, lo que puede eludir los obstáculos estéricos para el acoplamiento de receptor que requiere la presentación correcta del sitio de unión al receptor en el botón. Por ejemplo, las fibras rígidas de los Ad de subgrupo D requieren, por lo tanto, un receptor flexible o uno preposicionado para la unión del virus, ya que no pueden doblarse.
La identificación de receptores celulares específicos para diferentes serotipos de Ad y el conocimiento de cómo contribuyen al tropismo tisular se han logrado mediante el uso de tecnología de pseudotipado de fibra. Aunque los Ad de algunos subgrupos utilizan el virus de Coxsackie y el receptor de adenovirus ("CAR") como receptor primario, queda claro que muchos Ad utilizan receptores primarios alternativos, lo que conduce a un tropismo muy diferente in vitro e in vivo. Las fibras de estos serotipos muestran claras diferencias en sus estructuras primarias y terciarias, tal como la rigidez de eje de fibra, la longitud del eje de la fibra y la falta de un sitio de unión de CAR y/o el supuesto motivo de unión de HSPG, junto con las diferencias en la carga neta dentro del botón de fibra. Por lo tanto, la pseudotipificación de partículas de Ad 5 con un eje y botón de fibra alternativos proporciona una oportunidad para eliminar dominios de unión a células importantes y, además, puede permitir una administración transgénica más eficiente (y potencialmente más selectiva de células) a tipos de células definidos en comparación con la lograda con Ad 5. La neutralización de partículas de Ad de fibras pseudotipadas también se puede reducir si las fibras utilizadas son de los Ad con menor seroprevalencia en humanos o modelos experimentales, una situación que favorece la administración exitosa del vector. Además, la fibra de longitud completa, así como las regiones de botón de fibra aisladas, pero no hexón o pentón solo, son capaces de inducir la maduración de células dendríticas y se asocian con la inducción de una potente respuesta de células T CD8+. En conjunto, la fibra adenoviral juega un papel importante en al menos la unión al receptor y la inmunogenicidad de los vectores adenovirales.
“Baja seroprevalencia" puede significar tener un nivel reducido de anticuerpos neutralizantes preexistentes en comparación con el adenovirus humano 5 (Ad5). De manera similar o alternativa, "baja seroprevalencia" puede significar menos de aproximadamente 20% de seroprevalencia, menos de aproximadamente 15% de seroprevalencia, menos de aproximadamente 10% de seroprevalencia, menos de aproximadamente 5% de seroprevalencia, menos de aproximadamente 4% de seroprevalencia, menos de aproximadamente 3% de seroprevalencia, menos de aproximadamente 2% de seroprevalencia, menos de aproximadamente 1% de seroprevalencia o no seroprevalencia detectable. La seroprevalencia se puede medir como el porcentaje de individuos que tienen un título de neutralización clínicamente relevante (definido como un título de neutralización de 50% >200) usando métodos como se describe en Aste-Amezaga et al., Hum. Gene Ther. (2004) 15(3):293-304.
La alineación proporcionada en la figura 1 ilustra las diferencias entre las proteínas de fibra de los adenovirus de simio del grupo C. Una característica sorprendente es que las secuencias de fibra de estos adenovirus se pueden agrupar ampliamente en tener una fibra larga, tal como ChAd155, o una fibra corta, tal como ChAd3. Este diferencial de longitud se debe a una deleción de 36 aminoácidos en aproximadamente la posición 321 en la fibra corta con respecto a la fibra larga. Además, hay una serie de sustituciones de aminoácidos que difieren entre el subgrupo de fibras cortas versus largas, pero son consistentes dentro de cada subgrupo. En tanto que la función exacta de estas diferencias aún no se ha dilucidado, dada la función e inmunogenicidad de la fibra, es probable que sean significativas. Se ha demostrado que uno de los determinantes del tropismo viral es la longitud del eje de la fibra. Se ha demostrado que un vector Ad5 con un eje más corto tiene una menor eficiencia de unión al receptor CAR y una menor infectividad. Se ha especulado que este deterioro es el resultado de una mayor rigidez de la fibra más corta que conduce a una unión menos eficiente al receptor celular. Estos estudios pueden explicar las propiedades mejoradas de ChAd155 que lleva una fibra más larga y más flexible en comparación con ChAd3 y PanAd3 descritas anteriormente que portan una fibra con un eje más corto.
Un polinucleótido "aislado" es uno que se elimina de su entorno original. Por ejemplo, un polinucleótido que se presenta de manera natural se aísla si se separa de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Se considera que un polinucleótido está aislado si, por ejemplo, se clona en un vector que no es parte de su entorno natural o si está comprendido dentro del ADNc.
Se espera que las tres proteínas de la cápside contribuyan a una baja seroprevalencia.
Transgenes
Los vectores adenovirales se pueden usar para administrar secuencias de ARN o proteína deseadas, por ejemplo, secuencias heterólogas, para la expresiónin vivo.Un vector puede incluir cualquier elemento genético que incluye ADN desnudo, un fago, transposón, cósmido, episoma, plásmido o virus. Estps vectores contienen ADN de ChAd155 como se divulga en la presente y un casete de expresión. Por "casete de expresión" (o "minigén") se entiende la combinación de un gen heterólogo seleccionado ("transgén") y los otros elementos reguladores necesarios para impulsar la traducción, transcripción y/o expresión del producto génico en una célula hospedadora.
Típicamente, "heterólogo" significa derivado de una entidad genotípicamente distinta de la del resto de la entidad con la que se compara. Una secuencia de ácido nucleico heteróloga se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que no se aísla de, deriva de o se basa en una secuencia de ácido nucleico de origen natural del vector adenoviral. “De origen natural" significa una secuencia que se encuentra en la naturaleza y no se prepara o modifica sintéticamente. Una secuencia se "deriva" de una fuente cuando se aísla de una fuente pero se modifica (por ejemplo, por deleción, sustitución (mutación), inserción u otra modificación), de manera adecuada para no alterar la función normal del gen fuente.
Típicamente, un vector adenoviral se diseña de manera que el casete de expresión se ubica en una molécula de ácido nucleico que contiene otras secuencias adenovirales en la región nativa de un gen adenoviral seleccionado. El casete de expresión se puede insertar en una región génica existente para interrumpir la función de esa región, si se desea. De manera alternativa, el casete de expresión se puede insertar en el sitio de un gen adenoviral parcial o totalmente eliminado. Por ejemplo, el casete de expresión se puede ubicar en el sitio de una mutación, inserción o deleción que hace no funcional al menos un gen de una región genómica seleccionada del grupo que consiste en E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4. El término "hace no funcional" significa que se elimina o se altera de otro modo una cantidad suficiente de la región génica, de modo que la región génica ya no es capaz de producir productos funcionales de expresión génica. Si se desea, toda la región génica se puede eliminar (y reemplazar adecuadamente con el casete de expresión). Adecuadamente, los genes E1 de adenovirus se eliminan y reemplazan con un casete de expresión que consiste en un promotor de elección, una secuencia de ADNc del gen de interés y una señal poli A, dando como resultado un virus recombinante de replicación defectuosa.
El transgén codificado por el vector adenoviral es una secuencia que codifica para un producto que es útil en biología y medicina, tal como una o más de una proteína o proteínas terapéuticas o inmunogénicas, ARN o enzimas. Las moléculas de ARN deseables incluyen ARNt, ARNbc, ARN ribosómico, ARN catalíticos, aptámeros de ARN y ARN antisentido. Un ejemplo de una secuencia de ARN útil es una secuencia que extingue la expresión de una secuencia de ácido nucleico dirigida en el animal tratado.
El transgén es una secuencia de ácido nucleico, heteróloga a las secuencias de vector que flanquean el transgén, que codifica para una proteína de interés. La secuencia codificante de ácido nucleico está ligada operativamente a componentes reguladores de una manera que permite la transcripción, traducción y/o expresión del transgén en una célula hospedadora.
El transgén puede codificar para un polipéptido o proteína utilizado para el tratamiento, mejora o profilaxis de enfermedades, para la inducción de una respuesta inmunitaria y/o para fines de vacuna profiláctica. Como se usa en la presente, la inducción de una respuesta inmunitaria se refiere a la capacidad de una proteína, también conocida como un "antígeno" o "inmunógeno", para inducir una célula T y/o una respuesta inmunitaria humoral a la proteína.
En una realización, la amplitud de protección cruzada de una construcción de vacuna se puede incrementar al comprender una secuencia medoide de un antígeno. Por "medoide" se entiende una secuencia deLyssaviruscon una disimilitud mínima con otras secuencias deLyssavirus.En una realización particular, un vector de la invención comprende una secuencia medoide de la glicoproteína G. En una realización particular, un vector de primate no humano de la invención comprende una secuencia medoide de la glicoproteína G. En una realización particular, un vector ChAd155 de la invención comprende una secuencia medoide de la glicoproteína G. En una realización particular, la secuencia medoide se deriva de una cepa viral natural con el porcentaje promedio más alto de identidad de aminoácidos entre todas las secuencias de proteína G anotadas en la base de datos NCBI. En una realización particular, la secuencia medoide de la glicoproteína G es la cepa NCBI AGN94271.
De manera alternativa o adicional, una secuencia transgénica puede incluir una secuencia indicadora, que tras la expresión produce una señal detectable. Estas secuencias indicadoras incluyen, sin limitación, secuencias de ADN que codifican para p-lactamasa, p-galactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, timidina cinasa, proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, proteínas unidas a la membrana que incluyen, por ejemplo, CD2, CD4, CD8, la proteína hemaglutinina de la influenza y otras bien conocidas en la técnica, para las cuales existen o se pueden
producir por medios convencionales, y proteínas de fusión que comprenden una proteína unida a membrana fusionada apropiadamente a un dominio de etiqueta de antígeno de, entre otros, hemaglutinina o Myc. Estas secuencias codificantes, cuando se asocian con elementos reguladores que impulsan su expresión, proporcionan señales detectables por medios convencionales, que incluyen ensayos enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescencia u otros ensayos espectrográficos, ensayos de clasificación de células activadoras fluorescentes y ensayos inmunológicos, que incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) e inmunohistoquímica.
Además del transgén, el casete de expresión también puede incluir elementos de control convencionales que están unidos operativamente al transgén de una manera que permite su transcripción, traducción y/o expresión en una célula transfectada con el vector adenoviral. Como se usa en la presente, las secuencias "unidas operativamente" incluyen tanto secuencias de control de expresión que son contiguas con el gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.
Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de transcripción apropiadas; señales de procesamiento de ARN eficientes tal como señales de empalme y poliadenilación (poli A) que incluyen poli A de beta-globina de conejo; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficiencia de la traducción (por ejemplo, secuencia de consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de la proteína; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. Entre otras secuencias, se pueden usar intrones quiméricos.
Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que permite la unión de la ARN polimerasa y dirige la transcripción de un gen. Típicamente, un promotor se ubica en la región 5' no codificante de un gen, proximal al sitio de inicio transcripcional del gen. Los elementos de secuencia dentro de los promotores que funcionan en el inicio de la transcripción a menudo se caracterizan por secuencias de nucleótidos de consenso. Ejemplos de promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores de bacterias, levaduras, plantas, virus y mamíferos (incluyendo humanos). Un gran número de secuencias de control de expresión, que incluyen promotores que son internos, nativos, constitutivos, inducibles y/o específicos de tejido, se conocen en la técnica y se pueden utilizar.
Ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el promotor de TBG, el promotor de LTR del virus de sarcoma de Rous retroviral (opcionalmente con el potenciador), el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV, véase, por ejemplo, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)), el promotor de CASI (WO2012/115980), el promotor de SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de p-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK) y el promotor de EF1a (Invitrogen).
Los promotores inducibles permiten la regulación de la expresión génica y se pueden regular mediante compuestos suministrados de forma exógena, factores ambientales tal como temperatura o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula o solo en células replicantes. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles están disponibles de una variedad de fuentes comerciales, que incluyen, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito muchos otros sistemas y se pueden seleccionar fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, los promotores inducibles incluyen el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc y el promotor del virus del tumor mamario de ratón inducible por dexametasona (Dex) (MMTV). Otros sistemas inducibles incluyen el sistema promotor de la polimerasa T7; el promotor de insecto de ecdisona, el sistema reprimible por tetraciclina y el sistema inducible por tetraciclina. Otros sistemas incluyen el dímero FK506, VP16 o p65 usando castradiol, difenol murislerona, el sistema inducible por RU486 y el sistema inducible por rapamicina. La eficacia de algunos promotores inducibles incrementa con el tiempo. En estos casos, se puede mejorar la eficacia de estos sistemas insertando múltiples represores en tándem, por ejemplo, TetR unido a un TetR por un IRES.
En otra realización, se puede usar el promotor natural para el transgén. Se puede preferir el promotor nativo cuando se desea que la expresión del transgén imite la expresión nativa. El promotor nativo se puede usar cuando la expresión del transgén se debe regular de forma temporal o de desarrollo, o de una manera específica de tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una realización adicional, también se pueden usar otros elementos de control de la expresión nativa, tal como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias de consenso de Kozak para imitar la expresión nativa.
El transgén se puede unir operativamente a un promotor específico de tejido. Por ejemplo, si se desea la expresión en el músculo esquelético, se debe usar un promotor activo en el músculo. Estos incluyen los promotores de genes que codifican para p-actina esquelética, cadena ligera de miosina 2A, distrofina, creatina quinasa muscular, así como promotores musculares sintéticos con actividades más altas que los promotores de origen natural. Se conocen ejemplos de promotores que son específicos de tejido para el hígado; núcleo de virus de la hepatitis B; alfa-fetoproteína, osteocalcina ósea; sialoproteína ósea, linfocitos, cadena pesada de inmunoglobulina; cadena de receptor de células T), neuronal tal como promotor de enolasa específica de neurona (NSE), gen de cadena ligera de neurofilamento y el gen vgf específico de neurona, entre otros.
En algunas realizaciones, el elemento regulador postranscripcional (WPRE) del virus de la hepatitis de la marmota (Zuffrey et al. (1999) J. Virol.; 73(4): 2886-9) pueden estar ligados operativamente al transgén.
El transgén se puede utilizar para el tratamiento, por ejemplo, como una vacuna, para la inducción de una respuesta inmunitaria y/o para fines de vacuna profiláctica. Como se usa en la presente, la inducción de una respuesta inmunitaria se refiere a la capacidad de una proteína para inducir una célula T y/o una respuesta inmunitaria humoral a la proteína.
Construcción de vector adenoviral
Los vectores adenovirales se generan modificando adenovirus de tipo silvestre para expresar genes heterólogos y/o eliminar o inactivar secuencias adenovirales indeseables. Los vectores adenovirales también pueden tener una competencia de replicación alterada. Por ejemplo, el vector puede ser defectuoso en la replicación o tener una replicación limitada de modo que tenga una capacidad reducida para replicarse en células no complementarias, en comparación con el virus de tipo silvestre. Esto se puede lograr al mutar el virus, por ejemplo, eliminando un gen involucrado en la replicación, por ejemplo, eliminando el gen E1A, E1B, E3 o E4.
Los vectores adenovirales de acuerdo con la presente invención pueden comprender una deleción de E1 funcional. Por lo tanto, los vectores adenovirales de acuerdo con la invención pueden ser defectuosos en la replicación debido a la ausencia de la capacidad de expresar E1A y/o E1B adenovirales. Los adenovirus recombinantes también pueden portar deleciones funcionales en otros genes, por ejemplo, deleciones en los genes E3 o E4. El gen temprano retrasado de adenovirus E3 se puede eliminar de la secuencia de adenovirus que forma parte del virus recombinante. La función de E3 no es necesaria para la producción de la partícula de adenovirus recombinante. Por lo tanto, no es necesario reemplazar la función de este producto génico para empaquetar un adenovirus recombinante útil en la invención. En una realización particular, los adenovirus recombinantes tienen genes E1 y E3 eliminados funcionalmente. La construcción de estos vectores se describe en Roy et al., Human Gene Therapy 15:519-530, 2004.
Los adenovirus recombinantes también se pueden construir con una deleción funcional del gen E4. En una realización particular, los adenovirus recombinantes tienen genes E1 y E4 eliminados funcionalmente como se describe en Colloca et al. (2012) Sci. Transl. Med. 4:1-9; Roy et al. (2004) Virol.324: 361-372. En algunas realizaciones, puede ser deseable retener la función ORF6 de E4. En una realización, la región ORF6 de E4 se puede reemplazar por una ORF6 de E4 heteróloga, tal como de adenovirus humano 5 (Ad5). Por lo tanto, en una realización particular, el vector adenoviral se puede eliminar funcionalmente en E1 y tener la región ORF6 de E4 de Ad5. Los vectores de adenovirus de acuerdo con la invención también pueden contener una deleción funcional en el gen temprano retrasado E2A. También se pueden realizar deleciones en cualquiera de los genes tardíos L1 a L5 del genoma de adenovirus. De manera similar, las deleciones en los genes intermedios IX y IVA pueden ser útiles.
Se pueden realizar otras deleciones en los otros genes de adenovirus estructurales o no estructurales. Las deleciones anteriores se pueden usar individualmente, por ejemplo, una secuencia de adenovirus para su uso en la presente invención puede contener deleciones de E1 solamente. De manera alternativa, las deleciones de genes enteros o porciones de los mismos eficaces para destruir su actividad biológica se pueden usar en cualquier combinación. Por ejemplo, en un vector de ejemplo, las secuencias de adenovirus pueden tener deleciones de los genes E1 y el gen E4, o de los genes E1, E2A y E3, o de los genes E1 y E3 (tal como deleciones funcionales en E1A y E1b, y una deleción de al menos parte de E3), o de los genes E1, E2A y E4, con o sin deleción de E3 y así sucesivamente. Estas deleciones pueden ser deleciones parciales o totales de estos genes y se pueden usar en combinación con otras mutaciones, tal como mutaciones sensibles a la temperatura para lograr un resultado deseado.
Estos vectores se generan usando técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica. Estas técnicas incluyen técnicas de clonación de ADNc convencionales tal como aquellas descritas en textos, el uso de secuencias de oligonucleótidos superpuestas de los genomas de adenovirus, reacción en cadena de la polimerasa y cualquier método adecuado que proporcione la secuencia de nucleótidos deseada. Métodos particularmente adecuados incluyen métodos de recombinación homóloga estándar tal como aquellos proporcionados en Colloca et al. (2012) Sci. Transl. Med. 4 : 1 -9; Roy et al. (2004) Virol. 324: 361-372; Roy et al. (2010) J. of Gene Med. 13:17-25; y WO2010/085984 o métodos de recombinación como se describe en Warming et ál. Nuc. Res. Ácidos (2005) 33:e36.
Producción de vector adenoviral
Los vectores adenovirales se pueden producir en cualquier línea celular adecuada en la que el virus sea capaz de replicación. En particular, se pueden utilizar líneas celulares complementarias que proporcionan los factores que faltan en el vector viral que dan como resultado sus características de replicación alteradas (tal como E1). Sin limitación, esta línea celular puede ser HeLa (Núm. de Acceso ATCC CCL 2), A549 (Núm. de Acceso ATCC CCL 185), HEK 293, KB (CCL 17), Detroit (por ejemplo,
Detroit 510, CCL 72) y células WI-38 (CCL 75), entre otras. Estas líneas celulares están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EUA. Otras líneas celulares parentales adecuadas se pueden obtener de otras fuentes, tal como retinoblastos PGK-E1, por ejemplo, células PER.C6™, como se representa por las células depositadas bajo ECACC no. 96022940 en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC) en el Centro de Microbiología Aplicada e Investigación (CAMR, Reino Unido) o células Her 96 (Crucell).
En muchas circunstancias, se puede usar una línea celular que expresa el uno o más genes faltantes que son esenciales para la replicación e infectividad del virus, tal como E1 humano, para transcomplementar un vector adenoviral de chimpancé. Esto es particularmente ventajoso porque, debido a la diversidad entre las secuencias de adenovirus de chimpancé de la invención y las secuencias de adenovirus humano que se encuentran en las células de empaquetamiento disponibles actualmente, el uso de las células que contienen E1 humano actuales evita la generación de adenovirus competentes para replicación durante el proceso de replicación y producción.
De manera alternativa, si se desea, se pueden utilizar las secuencias proporcionadas en la presente para generar una célula o línea celular de empaquetamiento que exprese, como mínimo, el gen E1 de ChAd155 bajo el control transcripcional de un promotor para la expresión en una línea celular parental seleccionada. Se pueden emplear promotores inducibles o constitutivos para este propósito. Ejemplos de estos promotores se describen en detalle en otra parte de este documento. Se selecciona una célula parental para la generación de una línea celular novedosa que expresa cualquier gen ChAd155 deseado. Sin limitación, esta línea celular parental puede ser HeLa [Núm. de Acceso ATCC CCL 2], A549 [Núm. de Acceso ATCC CCL 185], HEK293, KB [CCL 17], Detroit [por ejemplo, Detroit 510, CCL 72] y WI-38 [CCL 75], entre otras. Estas líneas celulares están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, e Ua .
Estas líneas celulares que expresan E1 son útiles en la generación de vectores eliminados de E1 de adenovirus recombinante. Adicional o alternativamente, las líneas celulares que expresan uno o más productos génicos adenovirales, por ejemplo, E1A, E1B, E2A, E3 y/o E4, se pueden construir usando esencialmente los mismos procedimientos que se usan en la generación de vectores virales recombinantes. Estas líneas celulares se pueden utilizar para transcomplementar vectores de adenovirus eliminados en los genes esenciales que codifican para esos productos, o para proporcionar funciones auxiliares necesarias para el empaquetamiento de un virus dependiente de auxiliares (por ejemplo, virus adenoasociado). La preparación de una célula hospedadora implica técnicas tal como el ensamblaje de secuencias de ADN seleccionadas.
En una realización, los productos génicos adenovirales esenciales se proporcionan en trans por el vector adenoviral y/o virus auxiliar. En este caso, una célula hospedadora adecuada se puede seleccionar de cualquier organismo biológico, que incluye células procariotas (por ejemplo, bacterianas) y células eucariotas, que incluyen células de insecto, células de levadura y células de mamífero.
Las células hospedadoras se pueden seleccionar de entre cualquier especie de mamífero, que incluye, sin limitación, células tal como células A549, WEHI, 3T3, 10TI/2, HEK 293 o Per.C6 (las dos últimas de las cuales expresan E1 adenoviral funcional), Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG2 y fibroblastos primarios, hepatocitos y mioblastos derivados de mamíferos que incluyen humanos, monos, ratones, ratas, conejos y hámsteres.
Una línea celular de complementación particularmente adecuada es la línea celular Procell92. La línea celular Procell92 se basa en células HEK 293 que expresan genes E1 adenovirales, transfectadas con el represor Tet bajo el control del promotor de fosfoglicerato quinasa-1 (PGK) humano y el gen de resistencia a G418 (Vitelli et al. PLOs One (2013) 8(e55435):1-9). Procell92.S está adaptado para el crecimiento en condiciones de suspensión y también es útil para producir vectores adenovirales que expresan proteínas tóxicas (www.okairos.com/e/inners.php?m=00084, consultado por última vez el 13 de abril de 2015).
Métodos de administración adenoviral y dosificación
Los vectores adenovirales pueden ser como se administran en composiciones inmunogénicas. Una composición inmunogénica como se describe en la presente es una composición que comprende uno o más vectores recombinantes capaces de inducir una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta humoral (por ejemplo, anticuerpo) y/o mediada por células (por ejemplo, una célula T citotóxica), contra un producto transgénico administrado por el vector después de la administración a un mamífero, adecuadamente un humano. Un adenovirus recombinante puede comprender (adecuadamente en cualquiera de sus deleciones génicas) un gen que codifica para un inmunógeno deseado y, por lo tanto, se puede usar en una vacuna. Los adenovirus recombinantes se pueden utilizar como vacunas profilácticas o terapéuticas contra cualquier patógeno para el cual el o los antígenos cruciales para la inducción de una respuesta inmunitaria puedan limitar la propagación del patógeno y para el cual esté disponible el ADNc.
Esta vacuna u otras composiciones inmunogénicas se pueden formular en un vehículo de administración adecuado. Los niveles de inmunidad del gen seleccionado se pueden monitorear para determinar la necesidad, si la hay, de refuerzos. Después de una evaluación de los títulos de anticuerpos en el suero, se pueden desear inmunizaciones de refuerzo opcionales.
Opcionalmente, una vacuna o composición inmunogénica de la invención se puede formular para que contenga otros componentes, que incluyen, por ejemplo, adyuvantes, estabilizadores, ajustadores de pH, conservantes y similares. Ejemplos de adyuvantes adecuados se proporcionan más adelante en "Adyuvantes". Este adyuvante se puede administrar con una vacuna de ADN de cebado que codifica para un antígeno para potenciar la respuesta inmunitaria específica de antígeno en comparación con la respuesta inmunitaria generada tras el cebado con una vacuna de ADN que codifica para solo el antígeno. Alternativamente, este adyuvante se puede administrar con un antígeno polipeptídico que se administra en un régimen de administración que implica los vectores de la invención.
El vector adenoviral se puede preparar para administración suspendiéndolo o disolviéndolo en un portador farmacéutica o fisiológicamente aceptable tal como solución salina isotónica, sal isotónica, solución u otras formulaciones que serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. El portador apropiado será evidente para aquellos expertos en la técnica y dependerá en gran parte de la vía de administración. Las composiciones descritas en la presente se pueden administrar a un mamífero en una formulación de liberación sostenida usando un polímero biocompatible biodegradable o mediante administraciónin situusando micelas, geles y liposomas.
En algunas realizaciones, el adenovirus recombinante de la invención se administra a un sujeto por inyección intramuscular, inyección intravenosa, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, administración epicutánea, administración intradérmica, administración transdérmica, administración intravaginal, administración nasal, administración rectal o administración oral.
Si el régimen terapéutico implica la administración conjunta de uno o más vectores adenovirales y un componente adicional, cada uno formulado en diferentes composiciones, se administran favorablemente de forma conjunta en o cerca del mismo sitio. Por ejemplo, los componentes se pueden administrar (por ejemplo, a través de una vía de administración seleccionada de intramuscular, transdérmica, intradérmica, subcutánea) al mismo lado o extremidad (administración “colateral”) o a lados o extremidades opuestas (administración “contralateral”).
Las dosificaciones del vector viral dependerán principalmente de factores tal como la afección que se está tratando, la gravedad de la afección que se está tratando y la edad, peso y salud del paciente, por lo tanto, pueden variar entre los pacientes. Por ejemplo, una dosificación humana adulta terapéuticamente efectiva del vector viral generalmente contiene 1x105 a 1x1015 partículas virales, tal como de 1x108 a 1x1012 (por ejemplo, 1x108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 2,5x1010, 5x1010, 1x10115x1011 o 1x1012 partículas). Alternativamente, un vector viral se puede administrar a una dosis que es típicamente de 1x105 a 1x1010 unidades formadoras de placa (PFU), tal como 1x105 PFU, 5x105 PFU, 1x106 PFU, 5x106 PFU, 1x107 PFU, 5x107 PFU, 1x108 PFU, 5x108 PFU, 1x109 PFU, 5x109 PFU o 1x1010 PFU. Las dosis variarán dependiendo del tamaño del sujeto y la vía de administración. Por ejemplo, una dosificación humana adecuada (para aproximadamente un sujeto de 80 kg) para inyección intramuscular se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1x105 a aproximadamente 5x1012 partículas por ml, para un solo sitio. Opcionalmente, se pueden usar múltiples sitios de administración. En otro ejemplo, una dosificación humana o veterinaria adecuada puede estar en el intervalo de aproximadamente 1x107 a aproximadamente 1x1015 partículas para una formulación oral.
El vector adenoviral se puede cuantificar mediante análisis de PCR cuantitativa (Q-PCR), por ejemplo, con cebadores y sondas diseñados en función de la región promotora de CMV, utilizando como la curva estándar diluciones en serie de ADN plasmídico que contiene el genoma de vector con el casete de expresión, incluido el promotor de CMV humano (hCMV). El número de copias en la muestra de prueba se determina mediante el método de análisis de líneas paralelas. Los métodos alternativos para la cuantificación de partículas de vector incluyen HPLC analítica o métodos espectrofotométricos basados en A260 nm.
Una cantidad inmunológicamente efectiva de un ácido nucleico puede estar adecuadamente entre 1 ng y 100 mg. Por ejemplo, una cantidad adecuada puede ser de 1 pg a 100 mg. Por "cantidad inmunológicamente efectiva" se entiende que la administración de esa cantidad a un sujeto es efectiva para inducir una respuesta inmunitaria medible contraLyssavirusen el sujeto.
Una cantidad apropiada del ácido nucleico particular (por ejemplo, vector) se puede determinar fácilmente por aquellos expertos en la técnica.
Cantidades efectivas de ejemplo de un componente de ácido nucleico pueden ser entre 1 ng y 100 pg, tal como entre 1 ng y 1 pg (por ejemplo, 100 ng-1 pg), o entre 1 pg y 100 pg, tal como 10 ng, 50 ng, 100 ng, 150 ng, 200 ng, 250 ng, 500 ng, 750 ng o 1 pg.
Cantidades efectivas de un ácido nucleico también pueden incluir de 1 pg a 500 pg, tal como entre 1 pg y 200 pg, tal como entre 10 y 100 pg, por ejemplo 1 pg, 2 pg, 5 pg, 10 pg, 20 pg, 50 pg, 75 pg, 100 pg, 150 pg o 200 pg. De manera alternativa, una cantidad eficaz de ejemplo de un ácido nucleico puede ser entre 100 pg y 1 mg, tal como de 100 pg a 500 gg, por ejemplo, 100 pg, 150 gg, 200 gg, 250 gg, 300 gg, 400 gg, 500 gg, 600 gg, 700 gg, 800 gg, 900 gg o 1 mg.
En general, una dosis humana estará en un volumen de entre 0,1 ml y 2 ml, tal como 0,5 ml y 2 ml. Por lo tanto, la composición descrita en la presente se puede formular en un volumen de, por ejemplo 0,1,0,25, 0,5, 1,0, 1,5 o 2,0 ml de dosis humana por componente inmunogénico individual o combinado.
Un experto en la técnica puede ajustar estas dosis, dependiendo de la vía de administración y la aplicación terapéutica o de vacuna para la que se emplea el vector recombinante. Los niveles de expresión del transgén, o para un adyuvante, el nivel de anticuerpo circulante, se pueden monitorear para determinar la frecuencia de administración de dosis.
Si se utilizan uno o más pasos de cebado y/o refuerzo, este paso puede incluir una dosis única que se administra cada hora, diariamente, semanalmente o mensualmente, o anualmente. Como ejemplo, los mamíferos pueden recibir una o dos dosis que contienen entre aproximadamente 10 gg a aproximadamente 50 gg de plásmido en portador. La cantidad o el sitio de administración se selecciona deseablemente con base en la identidad y condición del mamífero.
El nivel terapéutico de, o el nivel de respuesta inmunitaria contra, la proteína codificada por el transgén seleccionado se puede monitorear para determinar la necesidad, si la hay, de refuerzos. Después de una evaluación de la respuesta de las células T CD8+, u opcionalmente, los títulos de anticuerpos, en el suero, se pueden desear inmunizaciones de refuerzo opcionales. Opcionalmente, el vector adenoviral se puede administrar en una administración única o en diversos regímenes de combinación, por ejemplo, en combinación con un régimen o curso de tratamiento que implica otros ingredientes activos o en un régimen de sensibilización-refuerzo.
Adenovirus recombinantes o composiciones que comprenden secuencias polipeptídicas recombinante significa que el polinucleótido es el producto de al menos uno de los pasos de clonación, restricción o ligación, u otros procedimientos que dan como resultado un polinucleótido que es distinto de un polinucleótido encontrado en la naturaleza. Un adenovirus recombinante es un adenovirus que comprende un polinucleótido recombinante. Un vector recombinante es un vector que comprende un polinucleótido recombinante. Un “virus recombinante” incluye la progenie del virus recombinante original. Un “vector recombinante” incluye réplicas del vector recombinante original. Un “polinucleótido recombinante” incluye réplicas del polinucleótido recombinante original.
Un "derivado funcional" de un polipéptido se refiere adecuadamente a una versión modificada de un polipéptido, por ejemplo, en donde uno o más aminoácidos del polipéptido se pueden eliminar, insertar, modificar y/o sustituir. Un derivado de una proteína de la cápside adenoviral no modificada se considera funcional si, por ejemplo:
(a) un adenovirus que comprende la proteína de cápside derivada dentro de su cápside retiene sustancialmente la misma o una seroprevalencia menor en comparación con un adenovirus que comprende la proteína de la cápside no modificada y/o
(b) un adenovirus que comprende la proteína de cápside derivada dentro de su cápside retiene sustancialmente la misma o una mayor infectividad de la célula hospedadora en comparación con un adenovirus que comprende la proteína de cápside no modificada y/o
(c) un adenovirus que comprende la proteína de cápside derivada dentro de su cápside retiene sustancialmente la misma inmunogenicidad o una mayor en comparación con un adenovirus que comprende la proteína de cápside no modificada y/o
(d) un adenovirus que comprende la proteína de cápside derivada dentro de su cápside retiene sustancialmente el mismo nivel o un nivel más alto de productividad transgénica en comparación con un adenovirus que comprende la proteína de cápside no modificada.
Cadenas principales de ChAd155
La presente solicitud describe secuencias de polinucleótidos aisladas de ChAd155 de adenovirus de chimpancé, que incluyen la de ChAd155 no modificada de tipo silvestre (SEQ ID NO: 10) y construcciones de cadenas principales modificadas de ChAd155. Estas construcciones de cadenas principales modificadas incluyen ChAd155#1434 (SEQ ID NO: 7), ChAd155#1390 (SEQ ID NO: 8) y ChAd155#1375 (SEQ ID NO: 9). Se pueden usar cadenas principales de ChAd155 en la construcción de adenovirus recombinantes competentes para la replicación o incompetentes para la replicación para la administración de transgenes.
El término “construcción” se refiere a un ácido nucleico que codifica para secuencias de polipéptidos descritas en la presente y puede comprender ADN o monómeros de ácido nucleico de origen no natural.
El término adenovirus "competente para replicación" se refiere a un adenovirus que se puede replicar en una célula hospedadora en ausencia de cualquier proteína auxiliar recombinante comprendida en la célula. Adecuadamente, un adenovirus "competente para la replicación" comprende los siguientes genes tempranos esenciales intactos o funcionales: E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4. Los adenovirus de tipo silvestre aislados de un animal particular serán competentes para la replicación en ese animal.
El término adenovirus "incompetente para replicación" o "defectuoso para replicación" se refiere a un adenovirus que es incapaz de replicarse porque se ha diseñado para comprender al menos una deleción funcional (o mutación de "pérdida de función"), es decir, una deleción o mutación que altera la función de un gen sin eliminarlo por completo, por ejemplo, introducción de codones de terminación artificiales, deleción o mutación de sitios activos o dominios de interacción, mutación o deleción de una secuencia reguladora de un gen, etc., o una eliminación completa de un gen que codifica para un producto génico que es esencial para la replicación viral, tal como uno o más de los genes adenovirales seleccionados de E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4 (tal como E3 ORF1, E3 ORF2, E3 ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8, E3 ORF9, E4 ORF7, E4 ORF6, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2 y/o E4 ORF1). De manera particularmente adecuada, se eliminan E1, y opcionalmente E3 y/o E4. Si se elimina, la región génica eliminada mencionada anteriormente no se considerará adecuadamente en la alineación al determinar el % de identidad con respecto a otra secuencia.
Las secuencias de la invención son útiles como agentes terapéuticos y en la construcción de una variedad de sistemas de vectores, adenovirus recombinantes y células hospedadoras. De manera adecuada, el término "vector" se refiere a un ácido nucleico que se ha alterado sustancialmente (por ejemplo, un gen o región funcional que se ha eliminado y/o inactivado) con respecto a una secuencia de tipo silvestre y/o incorpora una secuencia heteróloga, es decir, ácido nucleico obtenido de una fuente diferente (también llamado un "inserto"), y replicar y/o expresar la secuencia de polinucleótidos insertada, cuando se introduce en una célula (por ejemplo, una célula hospedadora). Por ejemplo, el inserto puede ser toda o parte de las secuencias de ChAd155 descritas en la presente. Además o alternativamente, un vector ChAd155 puede ser un adenovirus ChAd155 que comprende una o más deleciones o inactivaciones de genes virales, tal como E1 u otro gen viral o región funcional descrita en la presente. Este ChAd155, que puede o no comprender una secuencia heteróloga, a menudo se denomina "estructura principal" y se puede utilizar tal cual o como un punto de partida para modificaciones adicionales al vector.
La anotación de la secuencia de tipo silvestre de ChAd155 (SEQ ID NO: 10) se proporciona más adelante.
LOCUS ChAd155 37830 bp ADN lineal 10-JUN-2015
DEFINICIÓN Adenovirus de chimpancé 155, genoma completo.
Comentario
Anotación de acuerdo con alineación de ChAd155 contra el humano
Cepa de referencia de adenovirus 2 NC 001405
Dos supuestos ORF en la región de E3 añadidos manualmente
CARACTERÍSTICAS Ubicación/Calificadores
fuente 1..37830
/organism="Adenovirus de chimpancé 155"
/mol_type="ADN genómico"
/acronym="ChAd 155"
repeat_region
1..101
/standard_name="ITR"
/rpt_type=inverted
gene
466.. 1622
/gene="E1A"
TATA_Signal
466.. 471
/gene="E1A"
Prim_transcript
497.. 1622
/gene="E1A"
CDS
join (577..1117,1231..1532)
/gene="E1A"
/product="E1A_280R"
CDS
join (577..979, 1231. .1532)
/gene="E1A"
/product="E1A_243R"
polyA_signal
1600..1605
/gene="E1A"
gene
1662..4131
/gene="E1 B"
TATA_Signal
1662..1667
/gene="E1B"
prim_transcript
1692..4131
/gene="E1 B"
CDS
1704..2267
/gene="E1B"
/product="E1 B_19K"
CDS
2009. .3532
/gene="E1B"
/product="E1 B_55K"
gene
3571..4131
/gene="IX"
TATA_Signal
3571. .3576
/gene="IX"
prim_transcript
3601..4131
/gene="IX"
CDS
3628..4092
/gene="IX"
/product="IX"
polyA_signal 4097..4102
/note="ELB, IX"
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Identidad de secuencia
La identidad con respecto a una secuencia se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a la secuencia de aminoácidos de referencia después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia.
La identidad de secuencia se puede determinar mediante métodos estándar que se usan comúnmente para comparar la similitud en la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. Usando un programa informático tal como BLAST o FASTA, dos polipéptidos se alinean para una coincidencia óptima de sus respectivos aminoácidos (ya sea a lo largo de la longitud completa de una o ambas secuencias o a lo largo de una porción predeterminada de una o ambas secuencias). Los programas proporcionan una penalización de apertura predeterminada y una penalización de espacio predeterminada, y una matriz de puntuación tal como PAM 250 (se puede usar una matriz de puntuación estándar junto con el programa informático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad se puede calcular como el número total de coincidencias idénticas multiplicado por 100 y luego dividido por la suma de la longitud de la secuencia más larga dentro del intervalo coincidente y el número de espacios introducidos en las secuencias más cortas para alinear las dos secuencias.
Donde la presente divulgación se refiere a una secuencia por referencia a un código de acceso de UniProt o Genbank, la secuencia a la que se hace referencia es la versión actual a partir de la fecha de presentación de la presente solicitud.
El experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una proteína que altera, añade o elimina un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos es un "derivado inmunogénico" donde la o las alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido funcionalmente similar o la sustitución/eliminación/adición de residuos que no afectan sustancialmente la función inmunogénica.
Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la técnica. En general, estas sustituciones conservadoras caerán dentro de uno de los grupos de aminoácidos especificados más adelante, aunque en algunas circunstancias pueden ser posibles otras sustituciones sin afectar sustancialmente las propiedades inmunogénicas del antígeno. Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son típicamente sustituciones conservativas entre sí:
1) Alanina (A), Glicina (G);
2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);
7) Serina (S), Treonina (T); y
8) Cisteína (C), Metionina (M).
De manera adecuada, estas sustituciones no se producen en la región de un epítopo y, por lo tanto, no tienen un impacto significativo en las propiedades inmunogénicas del antígeno.
Los derivados inmunogénicos también pueden incluir aquellos en donde se insertan aminoácidos adicionales en comparación con la secuencia de referencia. Adecuadamente, estas inserciones no se producen en la región de un epítopo y, por lo tanto, no tienen un impacto significativo en las propiedades inmunogénicas del antígeno. Un ejemplo de inserciones incluye un tramo corto de residuos de histidina (por ejemplo, 2-6 residuos) (SEQ ID NO: 49) para ayudar a la expresión y/o purificación del antígeno en cuestión.
Los derivados inmunogénicos incluyen aquellos en donde los aminoácidos se han eliminado en comparación con la secuencia de referencia. De manera adecuada, estas deleciones no se producen en la región de un epítopo y, por lo tanto, no tienen un impacto significativo en las propiedades inmunogénicas del antígeno.
El experto reconocerá que un derivado inmunogénico particular puede comprender sustituciones, deleciones y adiciones (o cualquier combinación de las mismas).
Antígenos y vacunas deLyssavirus
El lisavirus, un género de la familia Rhabdoviridae, es un virus envuelto con un genoma de ARN antisentido monocatenario. El ARN codifica para cinco proteínas estructurales en el orden de una nucleoproteína (N), una fosfoproteína (P), una proteína de matriz (M), una glicoproteína (G) y una ARN polimerasa viral (L). La proteína P es un componente estructural de la ribonucleoproteína y desempeña un papel en la formación de partículas virales y la síntesis de ARN viral. Se cree que la proteína G es importante en la patogenicidad viral y la inmunidad protectora; es un objetivo importante de los anticuerpos neutralizantes protectores. ElLyssaviruses un virus neurotrópico que se propaga a través del sistema nervioso central causando una inflamación severa del cerebro y la médula espinal.
El géneroLyssaviruscomprende siete genotipos, los siguientes seis de los cuales se han asociado con casos de rabia humana: virus de la rabia (RABV, genotipo 1), virus Mokola (genotipo 3), virus Duvenhage (genotipo 4),Lyssavirusde murciélago europeo (genotipo 5),Lyssavirusde murciélago europeo 2 (genotipo 6) yLyssavirusde murciélago australiano (genotipo 7) (Jackson (2016) Curr Infec Dis Rep 18:38). Una vez que se desarrollan los síntomas, la rabia es casi cien por ciento mortal.
Se han identificado epítopos antigénicos presentes en la proteína G de la rabia en múltiples cepas de virus de la rabia. Se clasifican como Sitio I, Sitio Ila, Sitio lIb, Sitio III, Sitio IV y Sitio a y se enumeran en la Tabla 1. Esta tabla divulga las secuencias de 'Sitio IIb' como SEQ ID NO 50-63, las secuencias de 'Sitio I' como SEQ ID NO 64-77 y las secuencias de 'Sitio III' como SEQ ID NO 78-91, respectivamente, en orden de aparición.
Tabla 1. Epítopos antigénicos de proteína G de la rabia
Epítopos antigénicos presentes en la proteína G de la rabia correspondientes a SEQ ID NO: 37 se muestran en la figura 1. El sitio antigénico I alberga epítopos conformacionales y lineales y se ubica en los residuos de aminoácidos 226-231. El sitio antigénico II es un epítopo conformacional discontinuo en los residuos 34-42 (lIb) y 198-200 (Ila). El sitio antigénico III es un epítopo conformacional continuo en los residuos 330-338. El sitio antigénico IV se ubica en los residuos 263-264. El sitio antigénico a se ubica en los residuos 342-343.
Las vacunas contra la rabia se utilizan actualmente principalmente para la profilaxis posterior a la exposición, solo un pequeño porcentaje de las dosis de vacuna contra la rabia se utilizan para la profilaxis previa a la exposición. El programa de intervención se define por la Organización Mundial de la Salud con base en la gravedad y el tipo de herida a través de la cual el virus ingresa y puede incluir tratamiento adicional con inmunoglobulina antirrábica. La profilaxis previa a la exposición generalmente implica de dos a tres visitas para dos a tres dosis intramusculares con refuerzos programados de acuerdo con el riesgo de exposición. La profilaxis posterior a la exposición generalmente implica de tres a cinco visitas para cuatro a cinco dosis intramusculares o cuatro visitas para cuatro dosis intradérmicas. En algunos países menos desarrollados, la inmunización todavía se realiza propagando el virus de la rabia en los cerebros de un animal infectado, inactivando el virus y proporcionando 14-21 inyecciones diarias administradas por vía subcutánea en la pared abdominal.
Actualmente hay varias vacunas contra la rabia disponibles para uso humano tanto en la profilaxis previa como posterior a la exposición. IMOVAX (Sanofi Pasteur) se proporciona como virus de la rabia liofilizado preparado a partir de la cepa PM-1503-3M obtenida del Instituto Wistar. Se recolecta de células diploides humanas infectadas y luego se inactiva. T anto la profilaxis previa como la posterior a la exposición consisten en tres dosis administradas por vía intramuscular en los días 0, 7 y 21 o 28. VERORAB (Sanofi Pasteur) se proporciona como virus de la rabia liofilizado preparado a partir de la cepa PM/W i 381503-3M obtenida del Instituto Wistar. Se recolecta de células Vero y luego se inactiva. La profilaxis previa a la exposición consiste en tres dosis administradas por vía intramuscular en los días 0, 7 y 21 o 28. La profilaxis posterior a la exposición consiste en cinco dosis administradas por vía intramuscular en los días 0, 3, 7, 14 y 28. VAXIRAB/ LYSSAVAC (Zydus Cadila/ Novavax) se proporciona como virus de la rabia liofilizado preparado a partir de la cepa Pitman Moore del virus de la rabia. Se produce en células embrionarias de pato y luego se inactiva. La profilaxis previa a la exposición consiste en tres dosis administradas por vía intramuscular en los días 0, 7 y 21 o 28. La profilaxis posterior a la exposición consiste en cinco dosis administradas por vía intramuscular en los días 0, 3, 7, 14 y 28. La profilaxis posterior a la exposición también se puede administrar por vía intradérmica, inyectada en cada uno de los dos sitios en los días 0, 3, 7 y 28. RABI Pur/ RABAVERT (GSK) se proporciona como un virus de la rabia liofilizado preparado a partir de la cepa Flury LEP (bajo pasaje de huevos). Se cultiva en cultivos primarios de fibroblastos de pollo y luego se inactiva. La profilaxis previa a la exposición consiste en tres dosis administradas por vía intramuscular en los días 0, 7 y 21 o 28. La profilaxis posterior a la exposición consiste en cinco dosis administradas por vía intramuscular en los días 0, 3, 7, 14 y 28.
Se ha reportado evidencia preclínica de apoyo para las vacunas contra la rabia adenovectorizadas en la literatura. El vector viral recombinante adenoviral SAdV24, también denominado AdC68 o ChAd68, modificado para ser defectuoso en la replicación y para expresar la glicoproteína de longitud completa (G) de la cepa de rabia Evelyn Rokitniki Abelseth (ERA) mostró cierto grado de inmunogenicidad en monos cinomólogos cuando se administró antes de una exposición a la rabia, pero no proporcionó una protección confiable después de una exposición a la rabia (Xiang et al. (2014) Virol.
450451:243-249). Un vector ChAd68 defectuoso de replicación similar que expresa la glicoproteína de longitud completa (G) de la cepa de rabia Evelyn Rokitniki Abelseth (ERA), administrada por vía intramuscular, indujo un grado de protección contra una exposición a la rabia (Zhou et al. (2006) Mol. Ther. 14:662-672; reproducido en parte en la figura 16).
Adyuvantes
Un “adyuvante” como se usa en la presente se refiere a una composición que mejora la respuesta inmunitaria a un inmunógeno. Una composición de acuerdo con la invención que comprende un adyuvante se puede usar como una vacuna, por ejemplo, para sujetos humanos. El adyuvante acelera, prolonga y/o mejora la calidad y/o la fuerza de una respuesta inmunitaria a un antígeno/inmunógeno en comparación con la administración del antígeno solo, por lo tanto, reduce la cantidad de antígeno/inmunógeno necesaria en cualquier vacuna dada, y/o la frecuencia de inyección necesaria para generar una respuesta inmunitaria adecuada al antígeno/inmunógeno de interés.
Ejemplos de adyuvantes que se pueden usar en el contexto de las composiciones de la invención incluyen adyuvantes inorgánicos (por ejemplo, sales metálicas inorgánicas tales como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio), precipitados similares a gel de hidróxido de aluminio (alumbre); AIPO4; alhidrogel; productos bacterianos de la membrana externa de bacterias Gram-negativas, en particular monofosforil lípido A (MPLA), lipopolisacáridos (LPS), muramil dipéptidos y derivados de estos; adyuvante incompleto de Freund; liposomas, en particular liposomas neutros, liposomas que contienen la composición y opcionalmente citocinas; AS01B, AS01E, AS02; copolímeros de bloque no iónicos; adyuvante ISCOMATRIX; ADN no metilado que comprende dinucleótidos CpG (motivo CpG), en particular CpG ODN con una estructura principal de fosforotioato (PTO) (CpG PTO ODN) o estructura principal de fosfodiéster (PO) (CpG PO ODN); derivados lipopéptidos sintéticos, en particular PamsCys; lipoarabinomanano; peptidoglicano; zimosano; proteínas de choque térmico (HSP), en particular HSP 70; ARNbc y derivados sintéticos de los mismos, en particular Poli l:poli C; péptidos policatiónicos, en particular poli-L-arginina; taxol; fibronectina; flagelina; imidazoquinolina; citocinas con actividad adyuvante, en particular GM-CSF, interleucina- (IL-)2, IL-6, IL-7, IL-18, interferones de tipo I y II, en particular interferón gamma (IFN-gamma), TNF-alfa; 25-dihidroxivitamina D3 (calcitriol); y oligopéptidos sintéticos, en particular péptidos presentados por MHCII. Los polímeros de bloque no iónicos que contienen polioxietileno (POE) y polioxipropileno (POP), tal como copolímeros de bloque POE-POP-POE se pueden utilizar como un adyuvante.
Ejemplos adicionales de adyuvantes incluyen adyuvantes inorgánicos (por ejemplo, sales metálicas inorgánicas tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio), adyuvantes orgánicos (por ejemplo, saponinas, tal como QS21 o escualeno), adyuvantes a base de aceite (por ejemplo, adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund), citocinas (por ejemplo, IL-1 p, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, GM-CFS e INF-y) adyuvantes particulados (por ejemplo, complejos inmunoestimuladores (ISCOMS), liposomas, microesferas biodegradables, virosomas, adyuvantes bacterianos (por ejemplo, monofosforil lípido A, tal como monofosforil lípido A 3-de-O-acilado (3D-MPL) o péptidos de muramilo), adyuvantes sintéticos (por ejemplo, monofosforil lípido A (MPL), en particular monofosforil lípido A 3-de-O-acilado (3D-MPL y análogos de péptidos de muramilo, o lípido A sintético, y adyuvantes de polinucleótidos sintéticos, por ejemplo, poliarginina o polilisina.
Las saponinas también son adyuvantes adecuados, por ejemplo, la saponina Quil A, derivada de la corteza del árbol sudamericanoQuillaja saponaria molina,y fracciones de la misma. Las fracciones purificadas de Quil A también se conocen como inmunoestimulantes, tal como escualeno, QS21, QS17 y QS7, una fracción no hemolítica de Quil-A. Las combinaciones de QS21 y polisorbato o ciclodextrina también son adecuadas.
Otro ejemplo de un adyuvante es un oligonucleótido inmunoestimulador que contiene motivos dinucleotídicos de citosinaguanosina no metilados presentes en el ADN (''CpG''). El CpG se conoce como adyuvante cuando se administra por vía sistémica y mucosa. Cuando se formula en vacunas, se puede administrar en solución libre junto con antígeno libre o conjugado covalentemente con un antígeno o formulado con un portador tal como hidróxido de aluminio.
La activación de receptores específicos puede estimular una respuesta inmunitaria. Estos receptores son conocidos por el experto en la técnica y comprenden, por ejemplo, receptores de citocinas, en particular receptores de citocinas de tipo I, receptores de citocinas de tipo II, receptores de TNF; y un receptor de vitamina D que actúa como factor de transcripción; y los receptores de tipo Toll 1 (TLR1),<t>L<r>-2, TLR 3, TLR4, TLR5, TLR-6, TLR7 y TLR9. Los agonistas de estos receptores tienen actividad adyuvante, es decir, son inmunoestimuladores. Otros adyuvantes adecuados incluyen fosfatos de alquil glucosaminida (AGP) o sales farmacéuticamente aceptables de AGP. Algunos
AGP son agonistas de TLR4, y algunos son antagonistas de TLR4. Un adyuvante de la composición de la presente invención puede ser uno o más agonistas de receptores de tipo Toll. En una realización más preferida, el adyuvante es un agonista del receptor 4 tipo Toll. En una realización preferida particular, el adyuvante es un agonista del receptor tipo Toll 9.
Los adyuvantes tal como aquellos descritos anteriormente se pueden formular junto con portadores, tal como liposomas, emulsiones de aceite en agua y/o sales metálicas (incluidas sales de aluminio tal como hidróxido de aluminio). Por ejemplo, 3D-MPL se puede formular con hidróxido de aluminio o emulsiones de aceite en agua; QS21 se puede formular con liposomas que contienen colesterol, emulsiones de aceite en agua o alumbre; CpG se puede formular con alumbre o con otros portadores catiónicos.
Se pueden utilizar combinaciones de adyuvantes en la presente invención, en particular una combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, más particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL o una composición donde el QS21 se inactiva en liposomas que contienen colesterol (DQ). De manera alternativa, una combinación de CpG más una saponina tal como QS21 es un adyuvante adecuado para su uso en la presente invención, al igual que una formulación adyuvante potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua. Los adyuvantes de saponina se pueden formular en un liposoma y combinar con un oligonucleótido inmunoestimulador. Por lo tanto, los sistemas adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferentemente 3D-MPL, junto con una sal de aluminio. Un adyuvante de ejemplo adicional comprende QS21 y/o MPL y/o CpG. QS21 se puede inactivar en liposomas que contienen colesterol.
La fusión de la cadena invariante a un antígeno que está comprendido por un sistema de expresión utilizado para vacunación incrementa la respuesta inmunitaria contra el antígeno, si se administra con un adenovirus. Por consiguiente, en una realización de la invención, el transgén inmunogénico se puede coexpresar con una cadena invariante en un vector viral ChAd155 recombinante.
General
A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica al que pertenece esta divulgación. Los términos singulares "un", "una" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, se pretende que la palabra "o" incluya "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "pluralidad" se refiere a dos o más. Además, se pretende que las limitaciones numéricas dadas con respecto a las concentraciones o niveles de una sustancia, tal como concentraciones de componentes de solución o relaciones de los mismos, y condiciones de reacción tal como temperaturas, presiones y tiempos de ciclo sean aproximadas. El término “aproximadamente” utilizado en la presente pretende significar la cantidad ± 10%.
La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos y figuras.
Ejemplos
Ejemplo 1: Aislamiento de ChAd155
El adenovirus de chimpancé de tipo silvestre tipo 155 (ChAd155) se aisló de un chimpancé joven sano alojado en las instalaciones del New Iberia Research Center (New Iberia Research Center, The University of Louisiana at Lafayette) utilizando procedimientos estándar como se describe en Collocaet al.(2012) Sci. Transl. Med. 4:1 -9 y WO 2010086189, que describe técnicas de aislamiento y caracterización adenoviral.
Ejemplo 2: Construcción de vector ChAd155-RG
El genoma viral de ChAd155 se clonó luego en un plásmido o en un vector BAC y posteriormente se modificó como se muestra en la figura 3:
a) deleción de la región de E1 (de bp 449 a bp 3529) del genoma viral;
b) deleción de la región de E4 (de bp 34731 a bp 37449) del genoma viral;
c) inserción del E4orf6 derivado de Ad5 humano; y
d) inserción de casete de expresión hCMV-RG-WPRE.
2.1: Deleción de región de E1: Construcción de BAC/ChAd155 AE1_TetO hCMV RpsL- Kana#1375
El genoma viral de ChAd155 se clonó en un vector BAC mediante recombinación homóloga en células competentes para la electroporación de la cepa BJ5183 de E. coli (Catálogo de Stratagene núm. 2000154) cotransformadas con ADN viral de ChAd155 y lanzadera de BAC de subgrupo C (#1365). Como se muestra en el esquema de la figura 4, la lanzadera de subgrupo C es un vector de BAC derivado de pBeloBACH (GenBank U51113, NEB). Se dedica a la clonación de adenovirus de chimpancé pertenecientes a la especie C y, por lo tanto, contiene el gen pIX y fragmentos de ADN derivados de los extremos derecho e izquierdo (incluidas las ITR derecha e izquierda) de los virus ChAd de especie C.
La lanzadera de BAG de especie C también contiene un casete RpsL-Kana insertado entre el extremo izquierdo y el gen pIX. Además, un casete de selección Amp-LacZ-SacB, flanqueado por sitios de restricción IScel, está presente entre el gen pIX y el extremo derecho del genoma viral. En particular, la lanzadera de BAG comprendía las siguientes características: ITR izquierda: bp 27 a 139, casete hCMV(tetO) RpsL-Kana: bp 493 a 3396, gen pIX: bp 3508 a 3972, sitios de restricción IScel: bp 3990 y 7481, casete de selección Amp-LacZ-SacB: bp 4000 a 7471, ITR derecha: bp 7805 a 7917.
Las células BJ5183 se cotransformaron mediante electroporación con ADN viral purificado de ChAd155 y vector de lanzadera de BAG de subgrupo C digerido con enzima de restricción IScel y luego purificado en gel. La recombinación homóloga que ocurre entre el gen pIX y las secuencias de ITR derechas (presentes en los extremos del ADN linealizado de lanzadera de BAG de especie C) y las secuencias homólogas presentes en el ADN viral de ChAd155 conducen a la inserción del ADN genómico viral de ChAd155 en el vector de lanzadera de BAG. Al mismo tiempo, la región viral E1 se eliminó y se sustituyó por el casete RpsL-Kana, generando BAC/ChAd155 AE1/ TetO hCMV RpsL-Kana#1375.
2.2: Construcción de plásmidos mediante recombinación homóloga en E. coli B J5183
2.2.1: Eliminación de la región de E4 - Construcción de pChAd155 AE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (#1434)
Para mejorar la propagación del vector, se introdujo una deleción de la región de E4 que abarca desde el nucleótido 34731-37449 (secuencia de tipo silvestre de ChAd155) en la estructura principal del vector reemplazando la región de E4 nativa con la secuencia codificante de E4orf6 de Ad5 utilizando una estrategia que implica varios pasos de clonación y recombinación homóloga en E. coli. La región codificante de E4 se eliminó completamente en tanto que el promotor nativo de E4 y la señal de poliadenilación se conservaron. Con este fin, se construyó un vector de lanzadera para permitir la inserción de Ad5orf6 reemplazando la región de E4 nativa de ChAd155 por recombinación homóloga en E. coll BJ5183 como se detalla más adelante.
Construcción de pARS Especie C Ad5E4orf6-1
Se obtuvo un fragmento de ADN que contenía Ad5orf6 mediante PGR utilizando ADN de Ad5 como plantilla, con los oligonucleótidos 5'-AT ACGGACT AGTGGAGAAGT ACTCGCCT ACAT G-3' (SEQ ID NO: 13) y 5'-ATACGGAAGATCTAAGACTTCAGGAAATATGACTAC-3' (SEQ ID NO: 14). El fragmento de PGR se digirió con Bglll y Spel y se clonó en la lanzadera de RLD-EGFP de Especie C digerida con Bglll y Spel, generando el plásmido pARS Especie C Ad5orf6-1. Los detalles con respecto a la lanzadera se pueden encontrar en Colloca et al., Sci. Transl. Med. (2012) 4:115ra2.
Construcción de pARS Especie C Ad5E4orf6-2
Para eliminar la región de E4, un fragmento de ADN de 177 bp que abarca bp 34586 a 34730 bp de la secuencia de ChAd155 wt (SEQ ID NO: 10) se amplificó mediante PCR utilizando el plásmido BAC/ChAd155 AE1_TetO hCMV RpsL-Kana (#1375) como plantilla con los siguientes oligonucleótidos: 5’-ATTCAGT GT ACAGGCGCGCCAAAGCATGACGCT GTTGATTT GATT C-3’ (SEQ ID NO: 15) y 5’-ACTAGGACTAGTTATAAGCTAGAATGGGGCTTTGC-3’ (SEQ ID NO: 16). El fragmento de PCR se digirió con BsrGI y Spel y se clonó en pARS subgrupo C Ad5orf6-1 digerido con BsrGI y Spel, generando el plásmido pARS especie C Ad5orf6-2 (#1490). En la figura 5 se proporciona un diagrama esquemático de este plásmido de lanzadera. En particular, el plásmido de lanzadera comprendía las siguientes características: ITR izquierda: bp 1 a 113, Especie C primera 460 bp: bp 1 a 460, ChAd155 wt (bp 34587 a bp 34724 de SEQ ID NO: 10) : bp 516 a 650, Ad5 orf6: bp 680 y 1561, especie C última 393 bp: bp 1567 a 1969, ITR derecha: bp 1857 a 1969.
Construcción de pChAd155 AE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (#1434)
El plásmido resultante pARS subgrupo C Ad5orf6-2 se utilizó luego para reemplazar la región de E4 dentro de la estructura principal de ChAd155 con Ad5orf6. Con este fin, el plásmido BAC/ChAd155 AE1_TetO hCMV RpsL-Kana (#1375) se digirió con Pacl/Pmel y se cotransformó en células BJ5183 con el plásmido digerido pARS subgrupo C Ad5orf6-2 BsrGI/AscI, para obtener el plásmido preadeno pChAd155 AE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (#1434).
2.2.2:Inserción de casete de expresión de hCMV-RG - Construcción de pChAd155 A E1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV-RG#1481
Se clonó el casete de hCMV-RG en un vector pre-adeno aceptor linealizado mediante recombinación homóloga en E. coli explotando la homología existente entre el promotor de hCMV y la secuencia de poliA de BGH. El plásmido pvjTetOhCMV_RG_bghpolyA, que se muestra en la figura 6, se escindió con Spel, SphI y AsiSI para escindir el fragmento de 2.58 Kb que contiene el promotor de hCMV con la secuencia tetO, RG y BGHpolyA. El fragmento de 2.58 Kb resultante se clonó mediante recombinación homóloga en el vector aceptor de pChAd155 AE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (#1434) que porta el casete de selección de RpsL-Kana bajo el control de HCMV y BGHpA. El plásmido pre-adeno aceptor se linealizó con la endonucleasa de restricción SnaBI. La construcción resultante fue el vector pChAd155 AE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV-RG (#1481) (figura 7).
2.2.3: Inserción de casete de expresión de hCMV-RG-WPRE - Construcción de pChAd155 AE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV-RG-WPRE#1509
Se clonó una secuencia de WPRE en un vector pre-adeno aceptor mediante recombinación homóloga enE. colimediante la explotación de la homología existente entre las bases 2840-2939 y 3180-3279 del vector pChAd155 AE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV-RG (#1481). Se amplificó un fragmento de ADN de 1031 pb mediante PCR y contiene WPRE, BGHpolyA y brazos de recombinación correspondientes a las bases 2840-2939 y 3180-3279 del vector pAdeno #1481. La PCR se realizó utilizando el plásmido pvjTetOhCMV_WPRE_BghPolyA (#1478) como plantilla y con los siguientes oligonucleótidos FW 5’-ggaaggtcagcgtgaccagccagtcggcaaagtgatttcctcctgggagagctataaaagcggcgagagagaccaggctgtgatgagcgccggatctgtaatcaacct ctggattaca -3’ (SEQ ID NO: 92) y RW 5’-ATGGCTCCGGCGGTCTCTGCAACACAAATAAAGAGACCCTAAGACCCCCAACTTATATATTTTCATGACCACCCCAG GCCACGCCCACTCACCCACCTCACCATAGAGCCCACCGCATCC-3’ (SEQ ID NO: 93). El fragmento de 1.03 Kb resultante se clonó mediante recombinación homóloga en el vector aceptor de vector pChAd155 AE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV-RG (#1481) que porta el transgén RG (SEQ ID NO: 38) bajo el control del promotor de hCMV y BGHpA. El plásmido pre-adeno aceptor se digirió con la endonucleasa de restricción AsiSI. La construcción resultante fue el vector pChAd155 AE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV-RG-WPRE (#1509), que se muestra en la figura 8.
Ejemplo 3: Producción de vector ChAd155-RG
La productividad de ChAd155 se evaluó en comparación con ChAd3 y PanAd3 en la línea celular Procell 92.
3.1: Producción de vectores que comprenden un transgén Gag de VIH
Los vectores que expresan la proteína Gag de VIH se prepararon como se describió anteriormente (ChAd155/GAG) o previamente como para ChAd3/GAG (Colloca et al, Sci. Transl. Med. (2012) 4:115ra2). Se rescataron ChAd3/GAG y ChAd155/GAG y se amplificaron en Procell 92 hasta la pasada 3 (P3); se utilizaron lisados de P3 para infectar dos matraces T75 de células Procell 92 cultivadas en monocapa con cada vector. Se utilizó una multiplicidad de infección (MOI) de 100 vp/célula para ambos experimentos de infección. Las células infectadas se recolectaron cuando el efecto citopático completo fue evidente (72 horas después de la infección) y se agruparon; los virus se liberaron de las células infectadas mediante tres ciclos de congelación/descongelación (-70737 °C) y luego el lisado se aclaró mediante centrifugación. Los lisados clarificados se cuantificaron mediante análisis de PCR cuantitativa (QPCR) con cebadores y sonda complementarios a la región promotora de CMV. Las secuencias de oligonucleótidos son las siguientes: CMV para<5'- CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3' (SEQ ID NO: 23), CMVrev 5'- GACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3' (SEQ>ID NO: 24), sonda CMVFAM-TAMRA 5'- ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3' (SEQ ID NO: 25) (las QPCR se ejecutaron en un detector de Secuencias ABI Prism 7900-Applied Biosystem). Los títulos volumétricos resultantes (vp/ml) medidos en lisados clarificados y la productividad específica de la célula expresada en partículas víricas por célula (vp/célula) se proporcionan en la tabla 2 más adelante.
Tabla 2. Productividad de vector a partir de lisados P3
Para confirmar la mayor productividad del vector ChAd155 que expresa el transgén Gag de VIH, se realizó un segundo<experimento al usar virus purificados como inóculo. Con este fin, las células Procell 92 se sembraron en un matraz T25 y>se infectaron con ChAd3/GAG y ChAd155/GAG cuando la confluencia de las células fue de aproximadamente 80%, usando una MOI=100 vp/célula. Las células infectadas se recolectaron cuando el efecto citopático completo fue evidente; los virus se liberaron de las células infectadas mediante congelación/descongelación y se aclararon mediante centrifugación. Los lisados clarificados se cuantificaron mediante análisis de PCR cuantitativa utilizando los siguientes<cebadores y sonda: CMV para 5'- CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3' (SEQ ID NO: 23), CMV rev>GACTT GGAAAT CCCCGTGAGT (SEQ ID NO: 24), CMV FAM-TAMRA sonda 5'- ACAT CAAT GGGCGTGGAT AGCGGTT -3' (SEQ ID NO: 25) complementarios a la región promotora de CMV (las muestras se analizaron en un detector de Secuencias ABI Prism 7900-Applied Biosystems). Los títulos volumétricos resultantes (vp/ml) medidos en lisados clarificados y la productividad específica de la célula expresada en partículas víricas por célula (vp/célula) se proporcionan<en la tabla 3.>
Tabla 3. Productividad de vector a partir de virus purificados
<3.2: Producción de vectores que comprenden un transgén de RSV>
Se realizó un conjunto diferente de experimentos para evaluar la productividad de vectores de vacuna de RSV en células Procell 92.S cultivadas en suspensión. El experimento comparó PanAd3/RSV (descrito en WO2012/089833) y ChAd155/RSV en paralelo al infectar Procell 92.S a una densidad celular de 5x105 células/ml. Las células infectadas se<recolectaron tres días después de la infección; el virus se liberó de las células infectadas mediante tres ciclos de>congelación/descongelación y el lisado se aclaró mediante centrifugación. Los lisados clarificados se cuantificaron luego mediante análisis de PCR cuantitativa como se informó anteriormente. Los títulos volumétricos resultantes (vp/ml) medidos en lisados clarificados y la productividad específica de la célula expresada en partículas víricas por célula (vp/célula) se proporcionan en la tabla 4.
Tabla 4. Productividad de vector a partir de virus purificados
Ejemplo 4: Niveles de expresión de transgén
4.1: Nivel de expresión del transgén Gag de VIH
Los niveles de expresión se compararon en experimentos paralelos infectando células HeLa con los vectores ChAd3 y ChAd155 que comprenden un transgén Gag de VIH. Las células HeLa se sembraron en placas de 24 pocillos y se<infectaron por duplicado con virus purificados ChAd3/GAG y ChAd155/GAG usando una MOI=250 vp/célula. Los>sobrenadantes de las células infectadas con HeLa se recolectaron 48 horas después de la infección y la producción de proteína Gag de VIH secretada se cuantificó mediante el uso de un kit de ELISA comercial (kit de ELISA p24 de VIH-1, PerkinElmer Life Science). La cuantificación se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante mediante el uso de una curva estándar de antígeno p24 de VIH-1. Los resultados, expresados en pg/ml de proteína Gag, se ilustran en la figura 9.
4.2: Nivel de expresión del transgén F de RSV
Los niveles de expresión se compararon en experimentos paralelos infectando células HeLa con los vectores PanAd3 y ChAd155 descritos anteriormente que comprenden un transgén F de RSV. Con este fin, las células HeLa se sembraron en placas de 6 pocillos y se infectaron por duplicado con virus purificados PanAd3/RSV y ChAd155/RSV usando una MOI=500 vp/célula. Los sobrenadantes se recolectaron 48 horas después de la infección y la producción de proteína F de RSV secretada se cuantificó mediante ELISA. Se transfirieron cinco diluciones diferentes de los sobrenadantes a pocillos de microplaca que se revistieron con un anticuerpo monoclonal F anti-RSV de ratón comercial. El antígeno capturado se reveló usando un antisuero de conejo F anti-RSV secundario seguido de IgG anti-conejo conjugado con biotina, luego al añadir conjugado de estreptavidina-AP (BD Pharmingen cat. 554065). La cuantificación se realizó al usar una proteína F de RSV (Sino Biological cat. 11049-V08B) curva estándar. Los resultados obtenidos, expresados como mg/ml de proteína F de RSV, se proporcionan en la Tabla 5.
Tabla 5. Nivel de expresión del transgén F de RSV
También se realizó un análisis de transferencia Western para confirmar el mayor nivel de expresión transgénica proporcionada por el vector de RSV ChAd155 en relación con el vector de RSV PanAd3. Las células HeLa sembradas en placas de 6 pocillos se infectaron con virus purificados PanAd3/RSV y ChAd155/RSV usando una MOI=250 y 500 vp/célula. Los sobrenadantes de las células infectadas con HeLa se recolectaron y la producción de proteína F de RSV secretada se analizó mediante electroforesis en gel de SDS no reductora seguida de análisis de transferencia Western. Se cargaron cantidades equivalentes de sobrenadantes en un gel de SDS no reductor; después de la separación por electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa que se va a sondear con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-RSV F (clon RSV-F-3 catálogo núm.: ABIN308230), disponible en antibodies-online.com (consultado por última vez el 13 de abril de 2015). Después de la incubación con anticuerpo primario, la membrana se lavó y luego se incubó con anticuerpo secundario conjugado de HRP anti-ratón. Finalmente, el ensayo se desarrolló mediante electroquimioluminiscencia (ECL) utilizando técnicas estándar (reactivos de detección de ECL, catálogo de Pierce núm. W3252282). Los resultados de la transferencia Western se muestran en la figura 10. Una banda de aproximadamente 170 kD indicada por la flecha se reveló por el anticuerpo monoclonal mAb 13 generado contra la proteína F, que corresponde al peso esperado de la proteína F trimérica. Se puede observar que el vector ChAd155 RSV produjo una banda más oscura que PanAd3RSV a MOI tanto de 250 como 500 vp/célula.
Ejemplo 5: Evaluación de potencia inmunológica mediante experimentos de inmunización en ratones
5.1: Inmunogenicidad de vectores que comprenden el transgén Gag de VIH
La inmunogenicidad del vector ChAd155/GAG se evaluó en paralelo con el vector ChAd3/GAG en ratones BALB/c (cinco por grupo). El experimento se realizó inyectando 106 partículas virales por vía intramuscular. La respuesta de las células T se midió tres semanas después de la inmunización mediante Inmunospot ligado a enzimas IFN-gammaex vivo(ELISpot) utilizando un epítopo de células T GAG CD8+ mapeado en ratones BALB/c. Los resultados se muestran en la figura 11, expresados como células formadoras de manchas (SFC) de IFN-gamma por millón de esplenocitos. Cada punto representa la respuesta en un solo ratón, y la línea corresponde a la media para cada grupo de dosis. Cuatro de cada cinco ratones respondieron positivamente al péptido inmunodominante CD8 en respuesta a ambos vectores.
5.2: Inmunogenicidad de vectores que comprenden el transgén de RSV
La potencia inmunológica de los vectores PanAd3/RSV y ChAd155/RSV se evaluó en ratones BALB/c. Ambos vectores se inyectaron por vía intramuscular a dosis de 108, 107 y 3x106 vp. Tres semanas después de la vacunación, los esplenocitos de los ratones inmunizados se aislaron y analizaron mediante IFN-gamma-ELISpot utilizando como antígenos epítopos de péptidos inmunodominantes F y M mapeados en ratones BALB/c. Los niveles de las respuestas inmunitarias se redujeron de acuerdo con la disminución de la dosis (como se esperaba), pero las respuestas inmunitarias fueron claramente más altas en los grupos de ratones inmunizados con el vector ChAd155/RSV en comparación con los grupos equivalentes de ratones inmunizados con la vacuna PanAd3/RSV (figura 12). Los símbolos muestran datos de ratones individuales, expresados como células formadoras de manchas (SFC) de IFN-gamma/millón de esplenocitos, calculados como la suma de respuestas a los tres epítopos inmunodominantes (F<51-66>, F<85-93>y M<2>- I<282-290>) y corregidos por el fondo. Las líneas horizontales representan el número medio de IFN-gamma SFC/millón de esplenocitos para cada grupo de dosis.
Tomados en conjunto, los resultados informados anteriormente demostraron que ChAd155 es un vector adenoviral mejorado en comparación con los vectores ChAd3 y PanAd3. Se demostró que ChAd155 es más productivo, lo que facilita el proceso de fabricación, y se demostró que puede expresar un mayor nivel de transgén tantoin vitrocomoin vivo,proporcionando una respuesta de células T más fuerte contra los antígenos expresados en modelos animales.
Ejemplo 6. ChAd155-RG es inmunogénico y protector contra un desafío de rabia
6.1: Inmunogenicidad del vector ChAd155-AG
La potencia inmunológica del vector ChAd155-RG se evaluó en ratones CD1 y los resultados se muestran en la figura 13. El experimento se realizó inyectando 109 vp por vía intramuscular. Cada punto representa la respuesta de un solo ratón. La figura 13 demuestra que una única administración de un vector adenoviral defectuoso de replicación que codifica para el antígeno de proteína G viral de la rabia indujo una potente respuesta inmunitaria. El vector indujo niveles protectores de anticuerpos neutralizantes (figura 13A) e indujo células T específicas de rabia circulante (figura 13B).
Se realizó un ensayo de neutralización de virus de anticuerpos fluorescentes (FAVN) como se describe en Cliquet F. et al., J. Immunol. Methods (1998) 212:79-87. La figura 13A demuestra que se detectaron anticuerpos neutralizantes funcionales en el suero dentro de las dos semanas posteriores a una única administración de ChAd155-RG de replicación defectuosa. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en cantidades muy por encima del nivel umbral de protección de 0,5 lU/ml, como se establece en las pautas de la Organización Mundial de la Salud (línea punteada) en la segunda semana después de la administración que no muestra indicios de una disminución en la semana cuatro. La figura 13B demuestra que se detectaron células T específicas de rabia en los bazos de ratones CD1 inyectados con 10-9 pfu/ml de ChAd155-RG. Un ensayo ELISpot de interferón gamma realizado como se describió anteriormente en péptidos superpuestos que abarcan la secuencia de la proteína G de la rabia demostró la presencia de células T específicas de la rabia.
La cinética del anticuerpo se siguió hasta 21 semanas después de una sola inyección de vacuna; los títulos alcanzaron su punto máximo en la semana 8 y luego disminuyeron, pero se mantuvieron muy por encima del umbral de seroconversión (línea de puntos), como se muestra en la figura 14.
La potencia inmunológica de ChAd155-RG se comparó luego con las vacunas contra la rabia disponibles comercialmente en un régimen de dosis única y los resultados se muestran en la figura 15. El panel izquierdo muestra los resultados de la inmunización de ratones Balb/c con una dosis estimada de 1/500 de una dosis humana de ChAd155-RG (5 x 108 partículas virales) o 1/10 de la dosis canina de la vacuna veterinaria contra la rabia NOBIVAC. El panel derecho muestra los resultados de la inmunización de ratones CD1 con 1/1000 de una dosis humana estimada de ChAd155-RG (108 partículas virales) o 1/10 de la dosis humana de RABIPUR. Los títulos de anticuerpos neutralizantes de virus se midieron como se describió anteriormente, descritos como IU/ML, y los títulos se mostraron dos meses después de la vacunación de dosis única. A pesar de los grandes excesos de las vacunas comerciales, la inmunidad inducida por el vector ChAd155-RG demostró ser superior a las vacunas contra la rabia veterinaria y humana disponibles comercialmente.
6.2: Capacidad del vector ChAd155-AG para proteger contra un desafío de rabia
La figura 16 demuestra que una dosis única de ChAd155-RG protege contra una exposición a la rabia. Ratones ICR exogámicos, de cuatro a seis semanas de edad, se inyectaron en el músculo gastrocnemio con ChAd155-RG, vector de control ChAd155 o RABIPUR a las dosis que se muestran en la Tabla 6. Cada uno de los grupos 1-6 consistió en diez ratones. A los ratones se les administraron tres dosis de RABIPUR en los días 0, 7 y 21 o una dosis única de ChAd155 o ChAd155-RG a las dosis mostradas en la tabla 6.
Tabla 6. Una dosis única de ChAd155-RG protege contra un desafío de rabia
Luego, los ratones se expusieron a un aislado humano de una variante del virus de la rabia de murciélago y se les realizó un seguimiento durante 90 días. El virus de desafío fue la variante de RABV callejera Ps P4 aislada de un caso humano fatal asociado con la exposición a un murciélago rabioso. La dosis de desafío, calculada en un experimento previo en animales no vacunados sin tratamiento previo, fue 100% letal. En este estudio, la misma dosis fue 60% letal. La serología se realizó mediante una prueba rápida de inhibición de foco fluorescente para rabia (RFFIT), realizada como se describe por Smith et al. (1973) Bol. Organización Mundial de la Salud. 48:535-541, para detectar anticuerpos neutralizantes específicos de la rabia. Además, se realizó inmunofluorescencia directa utilizando el reactivo DFA policlonal de la rabia de LIGHT DIAGNOSTICS (Millipore Cat # 5199) para detectar el antígeno viral en el tejido cerebral.
La figura 16 muestra el nivel de anticuerpos neutralizantes específicos de la rabia para cada ratón individual. Los ratones del Grupo 1, a los que se les administró un vector de control negativo que no comprendía antígeno de la rabia, no se seroconvirtieron y el 60% del grupo sobrevivió. A los ratones de los Grupos 3-6 se les administraron cargas de partículas virales decrecientes de ChAd155-RG. Todos los ratones se seroconvirtieron y sobrevivieron cuando se les administraron 108 o 107 partículas víricas. Los ratones inyectados con 106 partículas víricas tuvieron una tasa de seroconversión de 90% y el 90% sobrevivió. Los ratones inyectados con 105 partículas víricas tuvieron una tasa de seroconversión de 20% y el 60% sobrevivió. Esto demuestra que una única vacunación intramuscular de ChAd155-RG provocó títulos de anticuerpos neutralizantes por encima del umbral de 0,5 lU/ml en un amplio intervalo de dosis y confirió protección contra una exposición letal a la rabia. Por lo tanto, la figura 16 y la tabla 6 demuestran que una única administración de ChAd155-RG recombinante puede ser al menos tan eficaz en la protección contra la rabia como una vacuna viral inactivada convencional, actualmente utilizada.
Ejemplo 7. ChAd155-RG es más potente que AdC68rab.gp en la protección contra un desafío de rabia
La potencia del vector ChAd155-RG para proteger contra un desafío de virus de la rabia se comparó con la potencia, como se informa en la literatura, para el vector AdC68 rab.gp. Los ratones Balb/c se inmunizaron por vía intramuscular con una dosis única de ChAd155-RG, como se muestra en la tabla 7. Los niveles de anticuerpos neutralizantes virales previos a la exposición fueron dependientes de la dosis y se muestran en la figura 17A. Luego, estos ratones se expusieron a un aislado humano de una variante del virus de la rabia de murciélago, como se describe en el ejemplo 6. Como se muestra en la tabla 7, el 60% de los ratones que recibieron el vector ChAd155 de control sobrevivieron. Los ratones Balb/c inmunizados con 108 o 107 vp de ChAd155-RG tuvieron una tasa de supervivencia del 100%, los ratones inmunizados con 106 vp de ChAd155-RG tuvieron una tasa de supervivencia del 90% y los ratones inmunizados con 106 vp de ChAd155-RG tuvieron una tasa de supervivencia del 60%, y los títulos de anticuerpos neutralizantes cayeron a casi el umbral de seroconversión.
Estos resultados se correlacionaron con los resultados publicados por Zhou (2006) Mol. Ther. 14:662 en 670 (figura 17B). Zhou et al. informaron sobre la inmunización intramuscular de ratones ICR con el vector viral recombinante adenoviral AdC68rab.gp, y luego la exposición intranasal al virus de la rabia CVS-N2C. Los animales de control no se vacunaron y tuvieron una tasa de mortalidad del 100%. Cuarenta y cinco por ciento de los ratones inmunizados con 5x105 pfu de AdC68rab.gp se seroconvirtieron y mostraron una tasa de supervivencia de 77% (panel izquierdo 17B), en tanto que los ratones inmunizados con 5x104 pfu de ChAd155-RG (panel derecho 17B) mostraron una seroconversión del 90% y tuvieron una tasa de supervivencia de 60%.
Se obtuvieron datos de eficacia serológica y protectora similares en el presente estudio del inventor y el estudio informado por Zhou et al., cuando se usó una dosis cincuenta veces más pequeña (AdC68rab.gp a 5x105 pfu en comparación con ChAd155-RG a 104 pfu). Por lo tanto, ChAd155-RG es aproximadamente cincuenta veces más potente que AdC68rab.gp.
Tabla 7. Potencia de ChAd155-RG y AdC68rab.gp
Ejemplo 8. ChAd155-RG proporciona inmunogenicidad a largo plazo a primates no humanos.
Para evaluar la cinética, amplitud y longevidad de la inmunogenicidad de ChAd155-RG en primates no humanos, se trataron tres grupos de cinco monos cinomólogos(Macaca fascicularis)como sigue. El grupo 1 se inmunizó con 5x1010 partículas virales de ChAd155-RG IM seguido de una dosis de refuerzo de 5x1010 partículas virales de ChAd155-RG IM en la semana 48. El Grupo 2 se inmunizó con 5x1010 partículas virales de ChAd155-RG IM, seguido de una dosis de refuerzo de vacunación RABIPUR en la semana 24 y una dosis de refuerzo de 5x1010 partículas virales de ChAd155-RG IM en la semana 48. El grupo 3 recibió la mitad de una dosis humana de RABIPUR administrada por vía intramuscular y una dosis de refuerzo de la misma los días 7 y 21. Se recolectaron muestras de suero a intervalos y se recolectó sangre completa para el análisis de células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
La inmunogenicidad, hasta 48 semanas, inducida por una dosis única de ChAd155-RG se comparó con un ciclo completo de RABIPUR. Se introdujeron refuerzos con RABIPUR en la semana 24 o ChAd155 en la semana 48 para evaluar la compatibilidad de las dos vacunas y la capacidad de estimular las respuestas inmunitarias a mediano y largo plazo.
Los títulos de anticuerpos neutralizantes inducidos por una única inmunización con ChAd155-RG se compararon con los inducidos con un ciclo completo de tres dosis de RABIPUR. La figura 18 muestra la comparación de las respuestas de anticuerpos neutralizantes, tal como se midieron mediante el ensayo FAVN, de los monos inmunizados con ChAd155-RG recombinante (Grupos 1 y 2) con los inmunizados con la vacuna de virus de cultivo celular fijo RABIPUR (Grupo 3) hasta seis meses después de la vacunación. Una dosis única de 1010 partículas virales de ChAd155-RG indujo la misma respuesta inmunitaria que tres dosis de RABIPUR.
Estos resultados muestran que una sola administración de ChAd155-RG fue capaz de provocar títulos de anticuerpos neutralizantes muy por encima del umbral de seroconversión que son estables durante al menos 48 semanas y comparables a tres dosis de RABIPUR. La seroconversión inducida por ChAd155-RG fue rápida. Todos los animales inmunizados con ChAd155-RG excedieron el umbral dos semanas después de la inmunización, momento en el cual los animales inmunizados con RABIPUR ya habían recibido una segunda dosis.
El refuerzo de los animales en el Grupo 2 con RABIPUR en la semana 24 (figura 18 - cuadrados) fue altamente efectivo para incrementar los anticuerpos neutralizantes del virus muy por encima del nivel máximo alcanzado después de la administración de ChAd155-RG en el día 0. Esto demuestra que el antígeno de lisado viral RABIPUR es completamente capaz de reforzar la inmunidad inducida por el antígeno codificado de ácido nucleico ChAd155-RG.
El refuerzo de los animales tanto en el Grupo 1 (figura 18 - triángulos) como en el Grupo 2 (figura 18 - triángulos invertidos) con ChAd155-RG también fue altamente efectivo. Los animales inmunizados con ChAd155-RG, independientemente de si se les administró o no un refuerzo intermedio con RABIPUR, montaron una respuesta inmunitaria robusta al refuerzo de ChAd155-RG en la semana 48. Esto demuestra que el antígeno codificado de ácido nucleico ChAd155-RG se puede volver a administrar de manera eficaz. También demuestra que el antígeno codificado por ácido nucleico ChAd155-RG es eficaz para reforzar la respuesta inmunitaria después de la administración del antígeno de lisado viral RABIPUR. En conclusión, la figura 18 demuestra la compatibilidad de un adenovirus de simio ChAd155 que codifica para el antígeno G de la rabia con una vacuna contra la rabia convencional que comprende un antígeno de lisado viral.
Ejemplo 9. ChAd155-RG induce una respuesta inmunitaria celular en primates no humanos.
Además de la respuesta de anticuerpos humorales demostrada en el Ejemplo 8, ChAd155-RG indujo una fuerte respuesta inmunitaria celular. La figura 19 muestra que una dosis única de ChAd155-RG indujo un nivel sostenido de células T secretoras de IFNgamma específicas de glicoproteína de la rabia en la sangre periférica de animales vacunados, como se detecta mediante el ensayo IFNgamma-ELIspot. En contraste, las respuestas inmunitarias celulares estuvieron por debajo del límite de detección en los animales vacunados con RABIPUR.
Los animales en el grupo 1, inmunizados con ChAd155-RG y reforzados con ChAd155-RG en la semana 48, como se describe en el ejemplo 8, demostraron que el refuerzo reamplificó los niveles de IFN gamma. Los animales en el grupo 2, inmunizados con ChAd155-RG y reforzados primero con RABIPUR en la semana 24 y luego con ChAd155-RG en la semana 48 no mostraron incremento en los niveles de IFN gamma en respuesta al refuerzo de RABI PUR, pero una respuesta robusta al refuerzo de ChAd155-RG. Esto demuestra que un refuerzo de ChAd155-RG puede expandir las células T de memoria en animales maduros. No se detectaron respuestas de interleucina 4 durante todo el curso del seguimiento.
Ejemplo 10. Estudio de escalada de dosis para seguridad en humanos
Para evaluar la seguridad de ChAd155-RG en humanos, se iniciará un estudio de fase I. Los sujetos serán hombres y mujeres adultos sanos normales sin antecedentes de vacunación contra la rabia, exposición a animales rabiosos o recepción de una vacuna en investigación basada en adenovirus. El tamaño del estudio será lo suficientemente grande como para determinar el resultado del criterio de valoración principal del estudio, la seguridad. Se realizarán análisis estadísticos estándar, que incluyen intervalos de confianza del 95%.
Los sujetos recibirán una o más inyecciones intramusculares de ChAd155-RG; RABIPUR se utilizará como comparador. Se administrará una dosis baja de la vacuna ChAd155-RG y, después de la revisión y aprobación de los datos, luego se incrementará la dosis. Se seguirá a los sujetos después de la administración para detectar eventos adversos sistémicos y locales, que incluyen pero no se limitan a fiebre, dolor de cabeza, náuseas, vómitos, malestar y mialgia; y dolor,<sensibilidad, induración, enrojecimiento o hinchazón en el sitio de la inyección. Se examinarán los parámetros sanguíneos>y se registrará cualquier síntoma adicional no solicitado.
El estudio puede evaluar adicionalmente la inmunogenicidad mediante la evaluación de las respuestas inmunitarias relacionadas con la vacuna. Las mediciones de resultado pueden incluir, pero no se limitan a, niveles de anticuerpos<neutralizantes en suero, cuantificación de anticuerpos secretados por células B circulantes y cuantificación de respuestas>de células T contra unantígenoLyssaviral.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un adenovirus recombinante, que comprende:
a) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO:<1>y
b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3 y
c) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 5;
donde el adenovirus comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un antígeno deLyssavirus,donde la secuencia de ácido nucleico está ligada operativamente a una o más secuencias que dirigen la expresión del antígeno deLyssavirusen una célula hospedadora;
donde la secuencia de ácido nucleico que codifica para un antígeno deLyssaviruscodifica para un antígeno derivado de la glicoproteína viral de la rabia (G).
2. El adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, donde el polinucleótido comprende al menos uno de los siguientes:
a) una repetición terminal invertida 5’ adenoviral;
b) una región de EIA adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionado de entre las regiones de E1 A_280R y E1A_243R;
c) una región de EIB o IX adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionado del grupo que consiste en las regiones de E1B_19K, E1B_55K o IX;
d) una región de E2b adenoviral; o un fragmento de la misma seleccionado del grupo que consiste en las regiones de E2B_pTP, E2B_Polimerasa y E2B_IVa2;
e) una región de L1 adenoviral, o un fragmento de la misma, el fragmento que codifica para una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína L1_13.6k, la proteína L1_52k y la proteína L1_llla;
f) una región de L2 adenoviral, o un fragmento de la misma, el fragmento que codifica para una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína L2_pentona, la proteína L2_pVII, la proteína L2_V y la proteína L2_pX; g) una región de L3 adenoviral, o un fragmento de la misma, el fragmento que codifica para una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína L3_pVI, la proteína L3_hexon y L3_protease;
h) una región de E2A adenoviral;
i) una región de L4 adenoviral, o un fragmento de la misma, el fragmento que codifica para una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína L4_100k, la proteína L4_33k y la proteína L4_VI 11;
j) una región de E3 adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionado del grupo que consiste en E3 ORF1, E3 ORF2, E3 ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8 y E3 ORF9;
k) una región L5 adenoviral, o un fragmento de la misma, el fragmento que codifica para la proteína de fibra L5_fiber;<l>) una región de E4 adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionado del grupo que consiste en E4 ORF7, E4 ORF6, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2, and E4 ORF1;
m) un extremo 3’ adenoviral, preferentemente una repetición terminal invertida 3’ adenoviral; y/o
n) una región de ARN de VAI o VAI I adenoviral, preferentemente una región de ARN de VAI o VAI I adenoviral de un adenovirus distinto de ChAd155.
3. El adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde:
a) la secuencia de ácido nucleico que codifica para el antígeno deLyssaviruses al menos 98,6% idéntica a SEQ ID NO: 38; y
b) el adenovirus comprende el pentón de SEQ ID NO: 3, el hexón de SEQ ID NO: 5 y la fibra de SEQ ID NO: 1 y el antígeno deLyssaviruscomprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 37.
4. El adenovirus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un adenovirus de replicación deficiente.
5. El adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, donde el adenovirus comprende:
a) una inactivación funcional (tal como deleción) de los genes E1, E3 y/o E4; y/o
b) una sustitución del gen Ad5E4orf6.
6. El adenovirus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el adenovirus es capaz de infectar una célula de mamífero.
7. Una composición, que comprende el adenovirus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. La composición de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende un adyuvante.
9. El adenovirus recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la composición de acuerdo con cualquiera de una de las reivindicaciones 7 a 8 para su uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, el método que comprende administrar el adenovirus o la composición al sujeto.
<10. El adenovirus recombinante o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde el sujeto se infecta>con unLyssavirus.
11. El adenovirus recombinante o la composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, donde el sujeto es un humano.
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