ES2871907T3 - Portadores de vacuna de adenovirus de chimpancé - Google Patents

Portadores de vacuna de adenovirus de chimpancé Download PDF

Info

Publication number
ES2871907T3
ES2871907T3 ES17156766T ES17156766T ES2871907T3 ES 2871907 T3 ES2871907 T3 ES 2871907T3 ES 17156766 T ES17156766 T ES 17156766T ES 17156766 T ES17156766 T ES 17156766T ES 2871907 T3 ES2871907 T3 ES 2871907T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
replication
adenoviral
vector
immune response
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17156766T
Other languages
English (en)
Inventor
Agostino Cirillo
Stefano Colloca
Bruno Bruni Ercole
Annalisa Meola
Alfredo Nicosia
Elisabetta Sporeno
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MSD Italia SRL
Original Assignee
MSD Italia SRL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MSD Italia SRL filed Critical MSD Italia SRL
Application granted granted Critical
Publication of ES2871907T3 publication Critical patent/ES2871907T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación (ChAd) que comprende un genoma adenoviral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido como se expone en SEC ID nº 57 o 96 y un transgén que codifica por lo menos un inmunógeno, en el que dicho vector está modificado en que por lo menos un gen adenoviral seleccionado de entre el grupo que consiste en E1, E2, E3 y E4 adenovirales es eliminado funcionalmente.

Description

DESCRIPCIÓN
Portadores de vacuna de adenovirus de chimpancé
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de vectores recombinantes y más específicamente a la producción y a la utilización de vectores adenovirales de chimpancé defectuosos para la replicación recombinantes para producir respuestas inmunitarias en hospedadores mamíferos.
Antecedentes de la invención
Los adenovirus (Ad) comprenden una gran familia de virus de ADN bicatenario que se encuentran en anfibios, aves y mamíferos que presentan una estructura de cápside icosaédrica sin envuelta (Straus, Adenovirus infections in humans. En The Adenoviruses. 451-498, 1984; Hierholzer et al., J. Infect. Dis., 158: 804-813, 1988; Schnurr y Dondero, Intervirology., 36: 79-83, 1993; Jong et al., J Clin Microbiol., 37:3940-3945:1999). A diferencia de los retrovirus, los adenovirus pueden transducir numerosos tipos de células de varias especies de mamíferos, incluyendo tanto células que se dividen como células que no se dividen, sin integrarse en el genoma de la célula hospedadora.
En términos generales, el ADN adenoviral es normalmente muy estable y permanece episómico (es decir, extracromosómico), a menos que se haya producido transformación o tumorigénesis. Además, los vectores adenovirales pueden propagarse con altos rendimientos en sistemas de producción bien definidos que son fácilmente susceptibles de producción a escala farmacéutica de composiciones de calidad clínica. Estas características y su genética molecular bien caracterizada les hace buenos candidatos para vectores adenovirales recombinantes para su utilización como portadores de vacunas. Normalmente, la producción de vectores adenovirales recombinantes se basa en la utilización de una línea celular de empaquetamiento que puede complementar las funciones de los productos génicos adenovirales que o bien se han eliminado o bien se han modificado mediante ingeniería genética para que no sean funcionales.
En la actualidad, se utilizan ampliamente dos serotipos de adenovirus del subgrupo C humano bien caracterizados (es decir, hAd2 y hAd5) como fuentes de la estructura principal del virus para la mayoría de los vectores adenovirales que se utilizan para terapia génica. También se han sometido a prueba vectores adenovirales humanos defectuosos para la replicación como portadores de vacuna para el suministro de una variedad de inmunógenos derivados de una variedad de agentes infecciosos (por ejemplo, virus, parásitos o patógenos bacterianos) y células tumorales, incluyendo antígenos asociados a tumor (TAA). Estudios realizados en animales experimentales (por ejemplo, roedores, perros y primates no humanos) indican que los vectores adenovirales humanos defectuosos para la replicación recombinantes que portan transgenes que codifican para inmunógenos derivados de las oncoproteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano (VPH-16) (He, Z et al., (2001) Virology, 270:3583-3590, la glicoproteína del virus de la rabia (Xiang, Z. et al (1996) Virology, 219:220-227), la proteína del circumsporozoíto de Plasmodium falciparum (Rodriguez, E. et al. (1997) J. Immunol. 158:1268-1274) así como otros antígenos heterólogos producen respuestas inmunitarias tanto humorales como mediadas por células contra el producto transgénico. En términos generales, los investigadores han notificado el éxito en la utilización de vectores adenovirales humanos como portadores de vacuna en sistemas experimentales no humanos o bien utilizando protocolos de inmunización que utilizan altas dosis de vectores adenovirales recombinantes que se pronostica que producen respuestas inmunitarias; o bien utilizando protocolos de inmunización que emplean la administración secuencial de vectores adenovirales que se derivan de diferentes serotipos pero que portan el mismo producto transgénico como inmunizaciones de refuerzo (Mastrangeli, et al., Human Gene Therapy, 7: 79­ 87 (1996).
Sin embargo, se pronostica que los portadores de vacuna derivados de serotipos humanos ubicuos, tales como los tipos 2 y 5, se encontrarán con una inmunidad humoral y celular preexistente en la población humana. Por tanto, aunque se han empleado con éxito adenovirus humanos recombinantes defectuosos para la replicación como portadores de vacuna en sistemas experimentales que emplean hospedadores roedores, caninos y primates no humanos; se espera que la inmunidad adaptativa e innata humana limite significativamente la utilidad de estos serotipos como portadores de vacuna. Estas expectativas se basan en el hecho de que la infección adenoviral de subgrupo C, que incluye el tipo 2 y el tipo 5, es endémica en la población humana. Como consecuencia, en la mayoría de los seres humanos se produce seroconversión en los primeros cinco años de vida como resultado de una infección natural. Por tanto, los vectores derivados de virus que infectan de manera natural y se replican en seres humanos pueden no ser candidatos óptimos para su utilización como portadores de vacuna.
Otro problema asociado con la utilización de vectores derivados de adenovirus humanos es el riesgo de que el procedimiento de producción utilizado para propagar los virus recombinantes dé lugar a reservas de vectores que se contaminan con adenovirus competente para la replicación (RCA). Esto está provocado por la recombinación homóloga entre secuencias solapantes del vector recombinante y los genes adenovirales que están presentes en las líneas celulares auxiliares de complementación de E1 tales como células 293 humanas (Graham, F.L. et al, (1977) J. Gen. Virol. 36:59-72.). La presencia de RCA en reservas de vectores preparados para su utilización en ensayos clínicos constituye un riesgo de seguridad porque puede promover la movilización y propagación del virus defectuoso para la replicación. La propagación del virus defectuoso puede agravar la respuesta inmunitaria del hospedador y provocar otras consecuencias inmunopatológicas adversas (Fallux, F. J., et al. Human Gene Therapy 9: 1909-1917 (1998). Por consiguiente, la Food and Drug Administration (FDA) y otros organismos reguladores han promulgado directrices que establecen límites sobre los niveles de RCA que pueden estar presentes en preparaciones de vectores destinadas a utilización clínica. El intento de imponer límites de RCA es para garantizar una exposición limitada de los pacientes a adenovirus en replicación en composiciones que se utilizan en ensayos clínicos.
Por tanto, sigue habiendo una necesidad del desarrollo de portadores de vacuna adenovirales que sean adecuados para su utilización en hospedadores mamíferos que sean: fáciles de manipular, susceptibles de producción a escala farmacéutica y almacenamiento a largo plazo, que puedan replicarse a alto nivel en líneas celulares de complementación humanas, sumamente inmunógenos, que carezcan de epítopos de células B neutralizantes que reaccionen de manera cruzada con los serotipos comunes de adenovirus humanos, que cumplan con las normas de seguridad de RCA promulgadas por agencias reguladoras y que sean susceptibles de utilización en protocolos de sensibilización/refuerzo que sean adecuados para su utilización en seres humanos.
El documento WO9844121 divulga una fibra de adenovirus modificada mediante la mutación de uno o más residuos, un fragmento de ADN, un vector de expresión, y una línea celular que expresa dicha fibra. El documento WO03000851 divulga proteínas de serotipo de chimpancé C68, péptidos, y polipéptidos. El documento WO03062400 divulga los vectores adenovirales y la producción de dichos vectores. El documento WO9840509 divulga una proteína de cubierta adenoviral quimérica. Farina, S. F. et al, J. Virol., (2001), vol. 75, n° 23, páginas 11603-11613 divulga un vector defectuoso para la replicación basado en un adenovirus de chimpancé. Crawford-Miksza, L; D.P. Schnurr, J. Virol, (1996), vol. 70, páginas 1836-1844 divulga el análisis de 15 proteínas de hexón de adenovirus. Gall J G D et al Journal of Virology (1998), vol. 72, n° 12, páginas 10260-10264 divulga la construcción y la caracterización de adenovirus hexón-quiméricos.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación (CdAd) que comprende un genoma adenoviral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido como se expone en SEC ID n° 57 o 96 y un transgén que codifica por lo menos un inmunogén, en el que dicho vector es modificado en cuanto a que por lo menos un gen adenoviral seleccionado de entre el grupo que consiste en E1, E2, E3 y E4 adenoviral es eliminado funcionalmente. La solicitud divulga unos procedimientos para generar reservas de vectores de calidad clínica adecuados para su utilización en seres humanos y medios para utilizar los vectores dados a conocer como portadores de vacuna para producir respuestas inmunitarias protectoras y/o terapéuticas. La solicitud divulga además procedimientos para utilizar los adenovirus recombinantes de la invención para preparar composiciones de vacunas diseñadas para suministrar, y dirigir la expresión de, transgenes que codifican para inmunógenos. En una forma de realización, la invención contempla la utilización de los vectores dados a conocer como portadores de vacuna para la administración de vacunas que comprenden transgenes que codifican para inmunógenos derivados de un agente infeccioso. Se divulga en la presente memoria la utilización de los vectores dados a conocer para preparar y administrar vacunas contra el cáncer. En particular se divulga la preparación y la administración de una vacuna contra el cáncer que comprende un transgén que codifica para un TAA.
Se divulga la secuencia genómica completa de cinco adenovirus de chimpancé (ChAd), denominadas en la presente memoria ChAd3 (SEC ID n° 1) (figuras 5A-5K), ChAd6 (SEC ID n° 2) (figuras 6A-6K, CV32 (SEC ID n° 3) (figuras 7A-7K), CV33 (SEC ID n° 4) (figuras 8A-8K) y CV23 (SEC ID n° 5) (figuras 9A-9J).
ChAd3 y ChAd6 representan adenovirus novedosos aislados según los procedimientos dados a conocer en la presente memoria. Los genomas de ChAd3 y ChAd6 presentan 37741 y 36648 pares de bases de longitud, respectivamente. El gen de hexones de ChAd3 (SEC ID n° 41) comprende los nucleótidos (nt) 19086-21965 de SEC ID n° 1 (excluido el codón de terminación) y el gen de fibras de ChAd3 (SEC ID n° 42) comprende los nt 32805-34487 de SEC ID n° 1 (excluido el codón de terminación). El gen de hexones de ChAd6 comprende los nt 18266-21124 (SEC ID n° 43) de SEC ID n° 2 (excluido el codón de terminación) y su gen de fibras (SEC ID n° 44) comprende los nt 32218-33552 de SEC ID n° 2 (excluido el codón de terminación). Basándose en la homología de secuencia deducida a partir de una alineación de secuencias múltiples de péptidos hexones de longitud completa, se ha clasificado ChAd3 en el subgrupo C humano y se ha clasificado ChAd6 en el subgrupo E humano.
Los genomas de los adenovirus CV32, CV33 y CV23 presentan 36.606, 36.535 y 32.020 pares de bases de longitud, respectivamente. Se ha determinado que CV32 (Pan 6) (ATCC N. VR-592), CV33 (Pan 7) (ATCC N. VR-593) y CV23 (Pan 5) (Esoterix Inc.,) están relacionados todos con Ad4 humano (hAd4) (subgrupo E) (Wigand, R et al. Intervirology 1989, 30:1-9). Sin embargo, basándose en la alineación de secuencias de hexones, se ha caracterizado posteriormente que CV32 es más estrechamente análogo a los miembros del subgrupo D humano que a hAd4.
Se divulgan en la presente memoria unas secuencias de nucleótidos para los genes de fibras y hexones de 21 adenovirus de chimpancé adicionales (ChAd20, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82) aislados según los procedimientos dados a conocer en la presente memoria.
Las secuencias de nucleótidos de los genes de fibras para ChAd20, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19 se exponen en las figuras 10-19, respectivamente, y se denominan en la presente memoria SEQ ID NOS: 6-15: (SEC ID n° 6, ChAd20); (SEC ID n° 7, ChAd4); (SEC ID n° 8, ChAd5); (SEC ID n° 9, ChAd7); (SEC ID n° 10, ChAd9); (SEC ID n° 11, ChAd10); (SEC ID n° 12, ChAd11); (SEC ID n° 13, ChAd16) (SEC ID n° 14, ChAd17) y (SEC ID n° 15, ChAd19).
Las secuencias de nucleótidos de los genes de fibras para ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 se denominan en la presente memoria: (SEC ID n° 58, ChAd8), (SEC ID n° 60, ChAd22), (SEC ID n° 62, ChAd24), (SEC ID n° 64, ChAd26), (SEC ID n° 66, ChAd30), (SEC ID n° 68, ChAd31), (SEC ID n° 70, ChAd37), (SEC ID n° 72, ChAd38), (SEC ID n° 74, ChAd44), (SEC ID n° 76, ChAd63) y (SEC ID n° 78, ChAd82) y se exponen en la lista de secuencias.
Las secuencias de nucleótidos de los genes de hexones para ChAd20, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19 se exponen en las figuras 21-30, respectivamente, y se denominan en la presente memoria SEQ ID NOS: 16-25: (SEC ID n° 16, ChAd20); (SEC ID n° 17, ChAd4); (SEC ID n° 18, ChAd5); (SEC ID n° 19, ChAd7); (SEC ID n° 20, ChAd9); (SEC ID n° 21, ChAd10); (SEC ID n° 22, ChAd11); (SEC ID n° 23, ChAd16); (SEC ID n° 24, ChAd17) y (SEC ID n° 25, ChAd19).
Las secuencias de nucleótidos de los genes de hexones para ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 se denominan en la presente memoria: (SEC ID n° 97, ChAd8), (SEC ID n° 99, ChAd22), (SEC ID n° 101, ChAd24), (SEC ID n° 103, ChAd26), (SEC ID n° 105, ChAd30), (SEC ID n° 107, ChAd31), (SEC ID n° 109, ChAd37), (SEC ID n° 111, ChAd38), (SEC ID n° 113, ChAd44), (SEC ID n° 115, ChAd63) y (SEC ID n° 117, ChAd82) y se exponen en la lista de secuencias.
Se dan a conocer en la presente memoria secuencias de aminoácidos para las proteínas de fibras y hexones de 21 adenovirus de chimpancé adicionales (ChAd20, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82) aisladas según los procedimientos dados a conocer en la presente memoria.
Las proteínas de fibras que se dan a conocer en la presente memoria son como se denominan: (SEC ID n° 83, ChAd3), (SEC ID n° 84, ChAd6), (SEC ID n° 48, ChAd20), (SEC ID n° 49, ChAd4), (SEC ID n° 50, ChAd5), (SEC ID n° 51, ChAd7), (SEC ID n° 52, ChAd9), (SEC ID n° 53, ChAd10), (SEC ID n° 54, ChAd11), (SEC ID n° 55, ChAd16), (SEC ID n° 56, ChAd17), (SEC ID n° 57, ChAd19), (SEC ID n° 59, ChAd8), (SEC ID n° 61, ChAd22), (SEC ID n° 63, ChAd24), (SEC ID n° 65, ChAd26), (SEC ID n° 67, ChAd30), (SEC ID n° 69, ChAd31), (SEC ID n° 71, ChAd37), (SEC ID n° 73, ChAd38), (SEC ID n° 75, ChAd44), (SEC ID n° 77, ChAd63) y (SEC ID n° 79, ChAd82). Las figuras 20A-20G proporcionan una alineación que compara las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fibras dadas a conocer en la presente memoria con las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fibras de: C1 (SEC ID n° 85), CV68 (SEC ID n° 86), Pan5 (denominado alternativamente CV23) (SEC ID n° 80), Pan6 (denominado alternativamente CV32) (SEC iD n° 81) y Pan7 (denominado alternativamente Cv 33) (SEC ID n° 82).
Las proteínas de hexones que se dan a conocer en la presente memoria son como se denominan: (SEC ID n° 122, ChAd3), (SEC ID n° 123, ChAd6), (SEC ID n° 87, ChAd20), (SEC ID n° 88, ChAd4), (SEC ID n° 89, ChAd5), (SEC ID n° 90, ChAd7), (SEC ID n° 91, ChAd9), (SEC ID n° 92, ChAd10), (SEC ID n° 93, ChAd11), (SEC ID n° 94, ChAd16), (SEC ID n° 95, ChAd17), (SEC ID n° 96, ChAd19), (SEC ID n° 98, ChAd8), (SEC ID n° 100, ChAd22), (SEC ID n° 102, ChAd24), (SEC ID n° 104, ChAd26), (SEC ID n° 106, ChAd30), (SEC ID n° 108, ChAd31), (SEC ID n° 110, ChAd37), (SEC ID n° 112, ChAd38), (SEC ID n° 114, ChAd44), (SEC ID n° 116, ChAd63) y (SEC ID n° 118, ChAd82). Las figuras 31A-31J proporcionan una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de hexones dadas a conocer en la presente memoria con las secuencias de aminoácidos de las proteínas de hexones de: C1 (SEC ID n° 124), CV68 (SEC ID n° 125), Pan5 (denominado alternativamente CV23) (SEC ID n° 119), Pan6 (denominado alternativamente CV32) (SEC iD n° 120) y Pan7 (denominado alternativamente CV33) (SEC ID n° 121). Una alineación de secuencias múltiples de proteínas de hexones permite al experto en la materia realizar un análisis filogenético de esto que es consecuente con la clasificación propuesta de serotipos adenovirales humanos (Rux, J.J., et al (2003) J. Virol. 77:9553-9566).
Se dan a conocer en la presente memoria 21 aislados de adenovirus de chimpancé adicionales. Las muestran que comprenden ChAd20, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17 y ChAd19 se depositaron el 12 de diciembre de 2003 en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido) como depósito original según el Tratado de Budapest. Se asignaron a los depósitos números de registro: 03121201 (ChAd4), 03121202 (ChAd5), 03121203 (ChAd7), 03121204 (ChAd9), 03121205 (ChAd10), 03121206 (ChAd11), 03121207 (ChAd16), 03121208 (ChAd17), 03121209 (ChAd19) y 03121210 (ChAd20).
Las muestras que comprenden ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 se depositaron en la ECACC (Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido) como depósito original según el Tratado de Budapest el 12 de enero de 2005. Se asignaron a estos depósitos números de registro: 05011201 (ChAd8), 05011202 (ChAd22), 05011203 (ChAd24), 05011204 (ChAd26), 05011205 (ChAd30), 05011206 (ChAd31), 05011207 (ChAd37), 05011208 (ChAd38), 05011209 (ChAd44), 05011210 (ChAd63) y 05011211 (ChAd82).
Estos depósitos se mantendrán según los términos del T ratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los fines del Procedimiento en Materia de Patentes. Estos depósitos se realizaron simplemente para comodidad de los expertos en la materia y no son un admisión de que se requiera un depósito según la ley 35 U.S.C. §112. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público del material depositado se eliminarán irrevocablemente, excepto para los requisitos especificados en la ley 37 C.F.R. §1.808(b), sobre la concesión de una patente.
Se divulgan asimismo vectores adenovirales recombinantes defectuosos para la replicación que pueden infectar células de mamífero, preferiblemente células humanas, y dirigir la expresión de producto(s) transgénico(s) codificado(s). Tal como se demuestra en la presente memoria, los vectores dados a conocer son adecuados para su utilización como portadores de vacuna para el suministro de transgenes que comprenden inmunógenos contra los que se desea una respuesta inmunitaria. Se divulgan en la presente memoria unos vectores adenovirales de chimpancé defectuosos para la replicación recombinantes que pueden producir una replicación de alto nivel en líneas celulares que expresan E1 humano (es decir, de empaquetamiento). Se divulgan en la presente memoria unos adenovirus recombinantes que pueden replicarse en células PER.C6™.
En términos generales, los vectores recombinantes comprendidos en la invención proporcionan portadores de vacuna que evadirán la inmunidad preexistente frente a los serotipos de adenovirus que se encuentran normalmente en la población humana. Más específicamente, los vectores recombinantes de la invención comprenden secuencias de estructura principal de vector que se muestran en la presente memoria que carecen de epítopos B neutralizantes que reaccionan de manera cruzada con los serotipos comunes de vectores derivados de adenovirus humanos.
Son divulgados unos vectores lanzadera específicos de grupo que incluyen una parte adenoviral y una parte de plásmido, en los que dicha parte adenoviral comprende generalmente: a) extremo izquierdo viral (ITR y señal de empaquetamiento), parte del gen pIX y extremo derecho del genoma viral; y b) un casete de expresión génica. Los vectores lanzadera específicos de grupo se diseñan para aprovechar la homología de secuencia de nucleótidos que se observa entre adenovirus que se asignan al mismo subgrupo de serotipos (es decir, subgrupos A, B, C, D o E), y pueden utilizarse para manipular las secuencias de nucleótidos dadas a conocer en la presente memoria y/o para clonar otros adenovirus de chimpancé que pertenecen al mismo subgrupo generando un preplásmido de adenovirus que contiene un genoma adenoviral de chimpancé eliminado en la región E1.
Se divulgan células hospedadoras que comprenden los vectores de vacunas adenovirales, y/o los vectores preplásmido de adenovirus, procedimientos de producción de los vectores que comprenden introducir el vector de vacuna adenoviral de chimpancé en una célula hospedadora que expresa la proteína E1 adenoviral y recoger los vectores de vacunas adenovirales resultantes. En una forma de realización, la invención proporciona un procedimiento de producción de un vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación que comprende introducir uno de los vectores adenovirales dados a conocer en una célula humana que expresa E1 adenoviral, y recoger los adenovirus recombinantes resultantes.
Son divulgadas unas composiciones de vacuna que comprenden un vector adenoviral de la invención. Pueden administrarse composiciones que comprenden vectores adenovirales de chimpancé recombinantes solas o en combinación con otras vacunas de proteínas/ADN basadas en virus o no basadas en virus. También pueden administrarse como parte de un régimen de tratamiento más amplio. Estas composiciones pueden administrarse a hospedadores mamíferos, preferiblemente hospedadores humanos, en un entorno o bien profiláctico o bien terapéutico. Tal como se muestra en la presente memoria, la administración de las composiciones de vacuna dadas a conocer, o bien solas o bien en una modalidad combinada, tal como un régimen de sensibilización y refuerzo o inyecciones múltiples de vectores Ad serológicamente distintos, da como resultado la inducción de una respuesta inmunitaria en un mamífero que puede reconocer específicamente el inmunógeno codificado por el transgén.
Uno de los procedimientos dados a conocer la presente memoria comprende administrar a un mamífero (que o bien no ha recibido tratamiento previo o bien está sensibilizado para que sea inmunorreactivo frente a un antígeno diana) una cantidad suficiente de un vector adenoviral de chimpancé recombinante, que contiene por lo menos una eliminación funcional de su gen E1 de tipo natural, que porta una secuencia que comprende un promotor que puede dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica para el menor antígeno diana, en el que la administración del vector recombinante produce (o sensibiliza) una respuesta inmunitaria específica de antígeno.
Se divulga en la presente memoria un procedimiento concebido para inducir una respuesta inmunitaria (profiláctica o terapéutica) contra un agente infeccioso (por ejemplo, un patógeno viral o bacteriano o un parásito de mamíferos). Es divulgado asimismo un procedimiento diseñado para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero que romperá la tolerancia a un autoantígeno, tal como un TAA. Este aspecto de la divulgación contempla la utilización de los vectores dados a conocer como un portador de vacuna para la preparación y administración de vacunas contra el cáncer.
Aún otras ventajas y formas de realización de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un dibujo esquemático que resume la estrategia de clonación utilizada para construir un vector lanzadera de ChAd6 (pARS ChAd6-3).
La figura 2 es un dibujo esquemático que ilustra la estrategia de clonación utilizada para clonar el genoma viral de ChAd6 mediante recombinación homóloga en la cepa BJ5183 de E. coli.
La figura 3 es un dibujo esquemático que ilustra los elementos de diversos plásmidos lanzadera de ChAd6 incluyendo: pARS ChAd6-3 GAG; pARS ChAd6-3 SEAP; pARS ChAd6-3 EGFP; y pARS ChAd6-3 NS MUT. La figura 4 es un dibujo esquemático que ilustra el esquema de recombinación homóloga utilizado para clonar los vectores de expresión ChAd6A E1.
Las figuras 5A-5K proporcionan la secuencia de nucleótidos genómica de ChAd3 (SEC ID n° 1).
Las figuras 6A-6K proporcionan la secuencia de nucleótidos genómica de ChAd6 (SEC ID n° 2).
Las figuras 7A-7K proporcionan la secuencia de nucleótidos genómica de CV32 (SEC ID n° 3).
Las figuras 8A-8K proporcionan la secuencia de nucleótidos genómica de CV33 (SEC ID n° 4).
Las figuras 9A-9J proporcionan la secuencia de nucleótidos genómica de CV23 (SEC ID n° 5).
La figura 10 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd20 (SEC ID n° 6).
La figura 11 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd4 (SEC ID n° 7).
La figura 12 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd5 (SEC ID n° 8).
La figura 13 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd7 (SEC ID n° 9).
La figura 14 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd9 (SEC ID n° 10).
La figura 15 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd10 (SEC ID n° 11).
La figura 16 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd11 (SEC ID n° 12).
La figura 17 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd16 (SEC ID n° 13).
La figura 18 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd17 (SEC ID n° 14).
La figura 19 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd19 (SEC ID n° 15).
Las figuras 20A-20G proporcionan una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fibras de: ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8,ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17 ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 con las secuencias de proteínas de fibras de referencia de C1 (SEC ID n° 85), CV68 (SEC ID n° 86), PAN5 (también denominado CV23) (SEC ID n° 80), PAN6 (también denominado CV32)-(SEC iD n° 81) y Pan7 (también denominado CV33) (SEC ID n° 82).
La figura 21 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd20 (SEC ID n° 16).
La figura 22 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd4 (SEC ID n° 17).
La figura 23 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd5 (SEC ID n° 18).
La figura 24 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd7 (SEC ID n° 19).
La figura 25 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd9 (SEC ID n° 20).
La figura 26 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd10 (SEC ID n° 21).
La figura 27 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd11 (SEC ID n° 22).
La figura 28 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd16 (SEC ID n° 23).
La figura 29 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd17 (SEC ID n° 24).
La figura 30 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd19 (SEC ID n° 25).
Las figuras 31A-31J proporcionan una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de hexones de ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8,ChAd9, ChAd10, ChAd11 ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 con las secuencias de proteínas de fibras de referencia de C1 (SEC ID n° 124), CV68 (SEC ID n° 125), PAN5 (también denominado CV23) (SEC ID n° 119), PAN6 (también denominado CV32) (SEC ID n° 120) y Pan7 (también denominado CV33) (SEC ID n° 121).
La figura 32 proporciona una lista de las secuencias artificiales SEQ ID NOS: 26-40 y SEQ ID NOS: 45 y 46, incluyendo oligómeros y cebadores, dadas a conocer en la presente memoria.
La figura 33 es una representación gráfica del punto de rotura de la inmunización de vectores de ChAd que pertenecen a diferentes subgrupos de serotipos (es decir, subgrupos C, E y D). Se determinó la dosis más baja que provocaba una respuesta inmunitaria medible realizando experimentos de titulación en ratones inmunizados con vectores de ChAd3, ChAd11, ChAd20, CV33, CV68, ChAd6, ChAd9, ChAd10 CV32, ChAd4, ChAd7 y ChAd16 que expresaban gag.
La figura 34 proporciona una representación gráfica de una respuesta de células T específica de CEA provocada en macacos Rhesus inmunizados secuencialmente con un vector adenoviral humano (MRKAd5 RhCEA) seguido por un vector adenoviral de chimpancé (CV33 RhCEA) tras un intervalo de 12 semanas. Se evaluaron las respuestas inmunitarias mediante ensayo ELISPOT de IFN-y, y los datos ilustran el número de células que formaban puntos (SFC) por millón de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) tras la incubación en ausencia (DMSO) y presencia de los conjuntos de péptidos C y D de CEA de Rhesus.
La figura 35 proporciona un árbol filogenético de adenovirus de chimpancé y humanos deducido a partir de una alineación de secuencias múltiples de secuencias de péptidos de hexones de longitud completa utilizando PAUPSEARCH (Wisconsin Package versión 10.3, Accelrys Inc.) y visualizado y manipulado con TREEVIEW. La figura 36 es una representación gráfica de los resultados de inmunización obtenidos en respuesta a la administración de vectores de ChAd3 y hAd5 gag a ratones que se expusieron previamente a hAd5. Se evaluó la inmunidad mediada por células 3 semanas tras la inmunización mediante ELISPOT de IFN-y utilizando esplenocitos purificados.
La figura 37 es una representación gráfica de la cinética de CMI anti-CEA producida en ratones transgénicos para CEA humano inmunizados con ChAd3hCEA y Ad5hCEA. Se evaluó la c M i mediante ICS de PBMC estimuladas con el conjunto de péptidos CEA. Los resultados se expresan como el % de IFNy+ CD8+/ PBMC totales.
Las figuras 38 A-D son una representación gráfica de la eficacia de infección de diferentes células primarias humanas expuestas a moi 50, 250 y 1250 de diferentes vectores de ChAd que expresan EGFP y que pertenecen a diferentes subgrupos (B, C, D, E). Los resultados se expresan como el % de células fluorescentes /sobre células totales.
Descripción detallada de la invención
Tal como se utiliza en toda la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, se aplican las siguientes definiciones y abreviaturas:
El término “casete” se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos una secuencia de ácido nucleico que va a expresarse, junto con sus secuencias de control de la transcripción y traducción. El cambio de casete provocará que el vector en el que se incorpora dirija la expresión de una secuencia o combinación de secuencias diferente. En el contexto de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico presentes en el casete codificarán habitualmente para un inmunógeno. Debido a los sitios de restricción que están presentes por modificación mediante ingeniería genética en los extremos 5' y 3', el casete puede insertarse, eliminarse o sustituirse fácilmente por otro casete.
La expresión “elemento de acción en cis” se refiere a secuencias de nucleótidos que regulan genes a los que están unidos. Los elementos de acción en cis presentes en el ADN regulan la transcripción, y los que se transcriben en ARNm pueden regular el procesamiento del ARN, el recambio y la síntesis de proteínas.
El término “vector” se refiere a algunos medios mediante los cuales pueden introducirse fragmentos de ADN en un organismo hospedador o tejido hospedador. Hay varios tipos de vectores incluyendo plásmidos, virus (incluyendo adenovirus), bacteriófagos y cósmidos.
El término “promotor” se refiere a un sitio de reconocimiento en una cadena de ADN al que se une una ARN polimerasa. El promotor forma un complejo de iniciación con la ARN polimerasa para iniciar y dirigir la actividad de transcripción. El complejo puede modificarse activando secuencias tales como potenciadores, o inhibiendo secuencias tales como silenciadores.
La expresión “cantidad farmacéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de adenovirus recombinante que es eficaz en una vía de administración particular para transducir células hospedadoras y proporcionar niveles suficientes de expresión transgénica para producir una respuesta inmunitaria.
La expresión adenovirus (AdV) recombinante de “competente para la replicación” se refiere a un adenovirus con genes tempranos esenciales intactos o funcionales (es decir, E1A, E1B, E2A, E2B y E4). Los adenovirus de tipo natural son competentes para la replicación.
La expresión AdV recombinante “defectuoso para la replicación” se refiere a un adenovirus que se ha hecho que no pueda replicarse debido a que se ha modificado mediante ingeniería genética para que presente por lo menos una eliminación funcional, o una eliminación completa, de un producto génico que es esencial para la replicación viral. Los vectores adenovirales de chimpancé recombinantes de la invención son defectuosos para la replicación.
El término “mamífero” se refiere a cualquier mamífero, incluyendo un ser humano.
La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” o “idéntico” en el contexto de secuencias de ácido nucleico se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para obtener una correspondencia máxima. Se desea que la longitud de la comparación de identidad de secuencia pueda ser con respecto a la longitud completa del genoma (por ejemplo, aproximadamente 36 kpb), la longitud completa de un marco de lectura abierto de un gen, una proteína, una subunidad o una enzima [véanse, por ejemplo, las tablas que proporcionan las regiones codificantes adenovirales], o un fragmento de por lo menos aproximadamente 500 a 5000 nucleótidos. Sin embargo, también puede desearse la identidad entre fragmentos más pequeños, por ejemplo de por lo menos aproximadamente nueve nucleótidos, habitualmente por lo menos de aproximadamente 20 a 24 nucleótidos, por lo menos de aproximadamente 28 a 32 nucleótidos, por lo menos de aproximadamente 36 o más nucleótidos. De manera similar, puede determinarse fácilmente el “porcentaje de identidad de secuencia” para secuencias de aminoácidos, con respecto a la longitud completa de una proteína, o un fragmento de la misma. Adecuadamente, un fragmento presenta por lo menos aproximadamente 8 aminoácidos de longitud, y puede presentar hasta aproximadamente 700 aminoácidos. Se describen ejemplos de fragmentos adecuados en la presente memoria.
Se determina fácilmente la identidad utilizando algoritmos y programas informáticos tales como los definidos en la presente memoria con parámetros por defecto. Preferiblemente, tal identidad es con respecto a la longitud completa de la proteína, enzima, subunidad, o con respecto a un fragmento de por lo menos aproximadamente 8 aminoácidos de longitud. Sin embargo, la identidad puede basarse en regiones más cortas, cuando sea adecuado para la utilización a la que está destinándose el producto génico idéntico.
En general, los constructos adenovirales y los constructos génicos se nombran en referencia a los genes contenidos en los mismos. Por ejemplo, “pChAd3 A E1gag” se refiere a un constructo de plásmido que comprende un genoma adenoviral de chimpancé de ChAd3 eliminado en la región E1. En este plásmido, la región E1 se sustituye por un casete de expresión de inmunógeno que comprende un gen gag de VIH bajo el control de un promotor de CMV humano seguido por una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. De manera similar, pCV33DE1-E3 NSmut se refiere a un segundo constructo de plásmido dado a conocer en la presente memoria que comprende un genoma adenoviral de chimpancé de CV33, eliminado en las regiones de E1 y E3, que se sustituyen por un casete de expresión de inmunógeno que comprende genes no estructurales de VHC bajo el control de un promotor de CMV humano seguido por una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina.
La abreviatura “Ag” se refiere a un antígeno.
Tal como se utiliza en toda la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen la referencia al plural a menos que el contexto dictamine claramente lo contrario.
Los adenovirus (Ad) son virus icosaédricos, sin envuelta que se han identificado en varios hospedadores mamíferos y aviares. Los Ad humanos (hAd) pertenecen al género Mastadenovirus que incluye todos los Ad humanos conocidos y muchos Ad de origen animal (por ejemplo, bovino, porcino, canino, murino, equino, simio y ovino). Los adenovirus humanos se dividen en seis subgrupos (A-F) basándose en varios criterios biológicos, químicos, inmunológicos y estructurales que incluyen las propiedades de hemaglutinación de eritrocitos de mono Rhesus y rata, homología del ADN, patrones de escisión mediante enzimas de restricción, porcentaje de contenido en C+G y oncogenicidad (Straus, 1984, en The Adenoviruses, ed. H. Ginsberg, págs. 451-498, Nueva York: Plenus Press, y Horwitz, 1990 en Virology, eds. B.N. Fields y D.M. Knipe, págs. 1679-1721). Hasta la fecha, se han reconocido 51 serotipos distintos y se han agrupado en subgrupos basándose en sus propiedades de hemaglutinación y criterios biofísicos y bioquímicos.
El virión adenoviral presenta una simetría icosaédrica y, dependiendo del serotipo, un diámetro de 60-90 nm. La cápside icosaédrica consiste en tres proteínas principales, hexón (II), base de pentones (III) y una fibra redondeada (IV) así como varias proteínas minoritarias (es decir, VI, VIII, IX, IIIa y IVa2) (W.C. Russel, J. Gen. Virol., 81: 2573­ 2604 (2000). Un aspecto de la inmunidad preexistente que se observa en seres humanos es la inmunidad humoral, que puede dar como resultado la producción y persistencia de anticuerpos que son específicos para proteínas virales. La respuesta humoral producida por adenovirus se dirige principalmente contra las proteínas estructurales principales: hexón, pentón y fibra.
Informes publicados han establecido que son comunes títulos que comprenden anticuerpos contra múltiples serotipos (Dambrosio, E. (1982) J. Hyg. (Londres) 89: 209-219) y que una parte sustancial de los títulos preexistentes presentan actividad neutralizante. La inmunidad neutralizante frente a adenovirus es específica de tipo, y la infección con un serotipo particular de adenovirus confiere inmunidad sólo frente a ese serotipo. Varios informes han sugerido que anticuerpos dirigidos contra el hexón son los más fuertes y los más neutralizantes (Toogood, C.I.A., Crompton, J. y Hay R.T. (1992) J.Gen. Virol. 73, 1429-1435). Por tanto, es razonable suponer que los epítopos responsables de la neutralización específica de tipo están ubicados dentro de siete regiones hipervariables identificadas mediante alineación de las secuencias de hexones que se derivan de diferentes serotipos. (Crawford-Miksza, L y D. P. Schnurr. (1996) J. Virol. 70:1836-1844).
Se ha establecido una correlación directa entre la presencia de anticuerpos neutralizantes específicos de tipo y la incapacidad de producir una respuesta inmunitaria con un vector basado en el mismo serotipo mediante diferentes procedimientos, incluyendo la transferencia pasiva de sueros inmunitarios desde animales tratados hasta animales no tratados previamente. En términos generales, la inmunidad humoral preexistente para un serotipo viral específico reduce la eficacia terapéutica de la administración del vector. Además, la administración de un vector basado en un serotipo viral específico produce una respuesta inmunitaria contra el vector que impide la readministración del mismo serotipo.
Se divulga en la presente memoria un procedimiento para burlar los efectos adversos asociados con las consecuencias de la inmunidad preexistente frente a serotipos comunes de hAd. Más específicamente, se divulga en la presente memoria la utilización de vectores adenovirales de chimpancé caracterizados por un serotipo que no circula en absoluto en seres humanos. Se divulgan en la presente memoria vectores adenovirales (Chad) que carecen de epítopos de células B neutralizantes que reaccionan de manera cruzada con los de serotipos humanos comunes como portadores de vacuna.
Aunque se ha notificado que la inmunidad mediada por células (CMI) específica de adenovirus puede producir reacciones cruzadas, estudios de vacunación basados en inyecciones repetidas de serotipos múltiples demostraron una mayor eficacia que programas de inmunización basados en un único vector. Estos experimentos demuestran además que la principal limitación de una administración de vectores para fines de vacuna es la inmunidad humoral preexistente contra el vector. Las posibles soluciones a los problemas asociados con la utilización de un adenovirus humano como portador de vacuna incluyen la administración de una dosis superior de un adenovirus (por ejemplo, un serotipo del subgrupo C) que se pronostica que se encuentra con una respuesta inmunitaria preexistente, y la utilización de vectores basados en serotipos humanos poco comunes. Sin embargo, la utilización de dosis superiores de vacunas aumenta el coste de la vacuna y el riesgo de efectos secundarios no deseados y los resultados de las pruebas preclínicas sugieren que los serotipos humanos alternos son menos inmunógenos que hAd5 y hAd6.
En un intento por evitar los problemas de las respuestas inmunitarias humorales y celulares en el hospedador contra los elementos de la estructura principal de los adenovirus del vector, y para minimizar el riesgo de utilizar reservas de vectores derivados de adenovirus humanos que puedan estar contaminados con adenovirus competente para la replicación (RCA), se han caracterizado y desarrollado varios adenovirus no humanos como portadores de vacuna (Soudois, C. et al (2000) J. Virology, 74:10639-10649; Farina, S. F. et al (2001) J. Virology, 75:11603-11613; Cohen, C. J. et al (2002) J. Gen. Virology, 83:151-155). La premisa subyacente a la utilización de secuencias adenovirales no humanas para burlar los problemas asociados con la inmunidad preexistente se basa en la observación de que no es probable que los anticuerpos neutralizantes frente a serotipos de adenovirus humanos comunes neutralicen de manera cruzada virus no humanos. Sin embargo, la incompatibilidad de factores virales y celulares impone una limitación práctica sobre la gran mayoría de sistemas de vector alternativos (bovinos, ovinos, caninos) que se caracterizan por la desventaja de tener que propagarse en líneas celulares no humanas.
Wilson et al. han publicado un artículo que describe la caracterización de un vector defectuoso para la replicación basado en el adenovirus de chimpancé tipo 68 (CV68) C68, que se aisló originalmente a partir de un ganglio linfático mesentérico de un chimpancé (Basnight, M., et al. (1971) Am. J. Epidemiol. 94:166-171). CV68 se secuenció completamente y se encontró que era similar en su estructura global a los adenovirus humanos (Farina, S. F. et al., J. Virol. 75(23): 11603-11613 (2001). El genoma del virus presenta 36.521 pares de bases de longitud y se ha descrito como el más similar al subgrupo E de adenovirus humanos, con un 90% de identidad con la mayoría de los marcos de lectura abiertos de Ad4 humano que se han secuenciado. Las ITR de CV68 presentan 130 pares de bases de longitud, y están presentes todos los genes tempranos y tardíos adenovirales principales. CV68 se caracteriza por un serotipo que no circula en seres humanos y que carece de epítopos de células B neutralizantes que reaccionan de manera cruzada con los de serotipos humanos comunes. Aunque los adenovirus de chimpancé son similares a los adenovirus humanos, no se ha documentado en seres humanos inmunidad neutralizante que produzca reacción cruzada contra serotipos de chimpancé (Farina, S. F. et al. J. Virol. (2001) 75(23):11603-13).
Los vectores recombinantes derivados de CV68 se describen como suficientemente similares a serotipos humanos como para ayudar en la transducción de células que expresan el receptor de adenovirus y virus de Coxsackie (Cohen, C. et al., J. Gen. Virol. 83: 151-155 (2002). De manera significativa, CV68 se caracteriza por un nivel de similitud suficiente con los adenovirus humanos como para ayudar en su replicación a células 293 que albergan E1 del adenovirus humano tipo 5 (Farina, S. F. et al., J. Virol. 75(23): 11603-11613 (2001). Además, basándose en la observación de que las secuencias flanqueantes de E1 del serotipo humano 5 no son homólogas con las de las secuencias de vectores derivados de CV68, se pronostica que no se producirá recombinación homóloga. Por tanto, se ha pronosticado que hay una baja probabilidad de que reservas de vacunas derivadas de CV68 estén contaminadas con RCA.
El mismo grupo de investigadores notificó posteriormente la utilización de secuencias adenovirales derivadas de CV68 como portador de vacuna para la inducción de anticuerpos frente a la glicoproteína del virus de la rabia en ratones. Se creó una versión defectuosa para la replicación de CV68 sustituyendo los genes E1A y E1B por un casete de minigén. Ratones inmunizados con un vector recombinante adenoviral (AdC68rab.gp) que contenía eliminación de E1 que comprendía un producto transgénico que codificaba para la glicoproteína del virus de la rabia desarrollaron inmunidad protectora frente al virus de la rabia y siguieron siendo resistentes a la exposición a una dosis por lo demás letal del virus de la rabia (Xiang, Z et al., J. Virol. 76(5): 2667-2675 (2002). Recientemente, se notificó que un segundo constructo de CV68 que expresaba una forma truncada, con codones optimizados de gag de VIH-1 inducía una vigorosa respuesta de células T CD8+ específica de gag en ratones. Se mostró que la respuesta inducida por la vacuna proporcionaba protección frente a la exposición a un virus vaccinia recombinante para gag (Fitzgerald, J. C. et al., J. Immunol. 170: 1416-1422 (2003). La vacunación experimental de ratones preinmunizados frente al serotipo 5 de adenovirus humano con los vectores CV68gag o Ad5gag demostró una reducción más pronunciada de células T específicas de gag y protección contra la exposición viral producida por la vacuna de Ad5 que por la vacuna de CV68. La reducción de la eficacia de la vacuna de C68gag se atribuyó a una reactividad cruzada de células T CD8+ específicas de Ad5 (Id.).
Considerados juntos, estos datos sugieren que los vectores adenovirales defectuosos para la replicación derivados de simios pueden ser más adecuados para su utilización como portadores de vacunas humanas que los vectores basados en serotipos humanos comunes. Tal como se muestra en la presente memoria, los resultados de experimentos en los que ratones que se inmunizaron fuertemente contra Ad5 humano (figura 3) pueden inmunizarse con vectores adenovirales ChAd3-gag indican que la inmunidad anti-Ad5 humano no redujo la respuesta de CMI específica de gag producida por los vectores de ChAd. Estos resultados son consecuentes con la conclusión de que no están presentes epítopos de células T y B que producen reacciones cruzadas frente a Ad5 humano en los vectores de ChAd3 o ChAd6.
En términos generales, el genoma adenoviral está muy bien caracterizado y a pesar de la existencia de varios serotipos distintos, hay algo de conservación general en la organización global del genoma adenoviral colocándose funciones específicas de manera similar. Las secuencias de nucleótidos de los adenovirus de chimpancé C1 y CV68 dadas a conocer por Wilson et al., y la ubicación de los genes E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, l4 y L5 de cada virus se proporcionan en la patente US n° 6.083.716 (Vectores de adenovirus de chimpancé), y en la solicitud PCT publicada W o 03/000851 (Methods for Rapid Screening of Bacterial Trnasformants and Novel Simion Adenoviral Proteins, Procedimientos para la selección rápida de transformantes bacterianos y proteínas adenovirales de simios novedosas).
Cada extremo del genoma adenoviral comprende una secuencia conocida como repetición terminal invertida (ITR), que es necesaria para la replicación viral. Este virus también comprende una proteasa codificada por el virus, que es necesaria para procesar algunas de las proteínas estructurales requeridas para producir viriones infecciosos. La estructura del genoma adenoviral se describe basándose en el orden en el que los genes virales se expresan tras la transducción de la célula hospedadora. Más específicamente, los genes virales se denominan genes tempranos (E) o tardíos (L) dependiendo de si la transcripción se produce antes o tras el inicio de la replicación del ADN. En la fase temprana de la transducción, se expresan los genes E1, E2, E3 y E4 de adenovirus para preparar a la célula hospedadora para la replicación viral. El virus puede hacerse defectuoso para la replicación mediante la eliminación de la región temprana 1 esencial (E1) del genoma viral. Brody et al, 1994 Ann N Y Acad Sci., 716:90-101. Durante la fase tardía, se activa la expresión de los genes tardíos L1-L5, que codifican para los componentes estructurales de las partículas de virus. Todos los genes tardíos están bajo el control de un único promotor y codifican para proteínas que incluyen el pentón (L2), el hexón (L3), la proteína de andamiaje de 100 kDa (L4) y la proteína de fibras (L5), que forman la nueva partícula de virus en la que se encapsida el ADN adenoviral. Dependiendo del serotipo del virus, pueden generarse 10.000-100.000 partículas de adenovirus de la progenie en una única célula hospedadora. Por último, el proceso de replicación adenoviral produce la lisis de las células.
Los vectores adenovirales defectuosos para la replicación dados a conocer en la presente memoria se construyeron mediante la eliminación de secuencias de nucleótidos específicas a partir de las secuencias de ácido nucleico de chimpancé dadas a conocer y la inserción de las secuencias derivadas de otras secuencias de ADN que son útiles para la expresión, inserción transgénica u otras manipulaciones genéticas. Por consiguiente, los adenovirus de chimpancé recombinantes descritos en la presente memoria pueden contener secuencias adenovirales derivadas de uno o varios adenovirus de chimpancé, o secuencias de un adenovirus de chimpancé y de un adenovirus humano. Pueden producirse secuencias de polinucleótidos adecuados de manera recombinante, sintética o aislarse de fuentes naturales. Las secuencias adenovirales adecuadas para su utilización en aspectos particulares de la invención incluyen secuencias que carecen de epítopos de células B neutralizantes que producen reacciones cruzadas con serotipos humanos comunes.
Como mínimo, los adenovirus de chimpancé recombinantes (por ejemplo, vectores) divulgados en la presente memoria contienen los elementos de acción en cis de adenovirus de chimpancé necesarios para la replicación y la encapsidación del virión, en combinación con por lo menos un casete de expresión de inmunógeno. Normalmente, los elementos de acción en cis flanquean el casete de expresión que comprende un transgén que codifica para por lo menos un antígeno. Más específicamente, los vectores contienen las secuencias de repetición terminal invertida (ITR) en 5' de acción en cis requeridas de los adenovirus (que funcionan como orígenes de replicación), secuencias de ITR en 3', dominios potenciadores/de empaquetamiento y una secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula heteróloga. Independientemente de si el vector recombinante comprende sólo las secuencias adenovirales mínimas o un genoma adenoviral completo con sólo eliminaciones funcionales en genes particulares (por ejemplo, las regiones E1 y/o E3 o E4), los vectores comprenden una cápside de adenovirus de chimpancé.
En términos generales, los vectores adenovirales dados a conocer en la presente memoria comprenden un genoma adenoviral defectuoso para la replicación, en los que el genoma adenoviral no presenta un gen E1 funcional, y un casete de expresión de inmunógeno que comprende: a) un ácido nucleico que codifica para por lo menos un inmunógeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria; y b) un promotor heterólogo (es decir, con respecto a la secuencia adenoviral) funcionalmente unido a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el/los inmunógeno(s); y un terminador de la transcripción.
Más específicamente, la invención proporciona vectores defectuosos para la replicación adenovirales de chimpancé que consisten en un genoma adenoviral recombinante que carece de por lo menos un gen temprano seleccionado de entre el grupo constituido por E1, E2, E3 y E4. Se divulga en la presente memoria que se prepara un vector defectuoso para la replicación sustituyendo, o alterando, el gen E1 de uno de los aislados adenovirales divulgados en la presente memoria (por ejemplo ChAd3, ChAd6, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 o ChAd82) con un casete de expresión de inmunógeno. Por ejemplo, puede prepararse un vector eliminando/alterando el gen E1 de ChAd 3 (SEC ID n° 1) o ChA6 (SEC ID n°: 2). Alternativamente, puede prepararse un vector defectuoso para la replicación a partir de cualquiera de los otros aislados de adenovirus divulgados en la presente memoria, incluyendo ChAd3, ChAd6, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 o ChAd20. Se divulgan en la presente memoria unos vectores defectuosos para la replicación que comprenden un genoma adenoviral derivado de uno de los ChAd divulgados en la presente memoria que opcionalmente se ha modificado mediante ingeniería genética para que carezca de un gen E3 funcional. Debe entenderse que las secuencias adenovirales de chimpancé dadas a conocer en la presente memoria pueden hacerse defectuosas para la replicación o bien eliminando completamente un gen temprano o bien haciendo que el gen no sea operativo ni funcional.
Debe entenderse que la invención abarca vectores que se caracterizan por presentar modificaciones, tales como una “deleción funcional” que destruye la capacidad del adenovirus para expresar uno o varios productos génicos seleccionados. La expresión “deleción funcional” tal como se utiliza en la presente memoria abarca en sentido amplio modificaciones que presentan el efecto de hacer que un producto génico particular no sea funcional. En términos generales, las eliminaciones funcionales toman la forma de una eliminación parcial o total de un gen adenoviral. Sin embargo, un experto en la materia admitirá fácilmente que otras modificaciones, incluyendo pero sin limitarse a realizar una modificación que introduzca una mutación de desplazamiento del marco de lectura, también lograrán una eliminación funcional. Por ejemplo, los vectores adenovirales de chimpancé recombinantes de la invención pueden hacerse defectuosos para la replicación introduciendo una modificación que se diseña para interferir con, o para eliminar funcionalmente, la capacidad del virus para expresar E1A y/o E1B adenovirales.
Es bien sabido que pueden obtenerse vectores adenovirales defectuosos para la replicación introduciendo una modificación que esté diseñada para interferir con, o para eliminar funcionalmente la expresión de uno o varios genes del grupo de genes E2. Más en detalle, puede construirse un vector defectuoso para la replicación inactivando el gen de la polimerasa, o el gen de la proteína preterminal o el gen de la proteína de unión al ADN. Además, la eliminación o inactivación de genes expresados mediante la región E4 es una estrategia alternativa para construir vectores Ad de chimpancé defectuosos para la replicación. Puede combinarse la inactivación o eliminación de genes tempranos con el fin de producir más vectores atenuados. Alternativamente, los vectores de ChAd defectuosos para la replicación también pueden comprender modificaciones adicionales en otros genes virales, tales como los genes tardíos L1 a L5. Además, pueden generarse portadores de vacuna adenovirales novedosos combinando genes de hexones y fibras de diferentes serotipos. La utilización de una estrategia de intercambio de genes de hexones y fibras permitirá también a un investigador cambiar las propiedades biológicas de un ChAd y facilitar la producción de vectores con un tropismo diferente o con nuevas características serológicas.
Se entiende que la presente invención abarca vectores adenovirales de chimpancé recombinantes que comprenden eliminaciones de genes enteros o partes de los mismos que destruyen eficazmente la actividad biológica del gen modificado o bien solo o bien en cualquier combinación. Alternativamente, puede eliminarse la función del gen E3 temprano retrasado adenoviral; sin embargo, debido a que la función de E3 no es necesaria para la producción de una partícula adenoviral recombinante, no es necesario sustituir este producto génico con el fin de producir un recombinante que pueda empaquetar un virus útil en la invención.
En una forma de realización de la presente invención, el vector adenoviral defectuoso para la replicación utilizado es un adenovirus del subgrupo C de chimpancé que contiene eliminaciones en E1 y opcionalmente en E3. Por ejemplo, para ChAd3, puede introducirse una eliminación/alteración de E1 adecuada en la región desde el pb 460 hasta el pb 3542 (con referencia a SEC ID n° 1). Para ChAd6, puede introducirse una eliminación/alteración de E1 adecuada en la región desde el pb 457 hasta el pb 3425 (con referencia a SEC ID n° 2). Para CV32, la eliminación de E1 es preferiblemente desde el pb 456 hasta el pb 3416 (con referencia a SEC ID n°3); para CV33, la eliminación de E1 es preferiblemente desde el pb 456 hasta el pb 3425 (con referencia a SEC ID n° 4) y para CV23, la eliminación de E1 es preferiblemente desde el pb 456 hasta el pb 3415 (con referencia a SEC ID n° 5). Las eliminaciones de E3 para CV32 y CV33 son preferiblemente desde el pb 27446 hasta el pb 31911 (con referencia a SEC ID n° 3); desde el pb 27146 hasta el pb 31609 (con referencia a SEC ID n° 4) respectivamente. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente las secuencias equivalentes para otros aislados de chimpancé basándose en las homologías de secuencia y alineaciones de secuencias múltiples.
Un experto en la materia admitirá fácilmente que con el fin de construir un vector adenoviral eliminado en E1, deben tomarse varias decisiones referentes a la estructura de la estructura principal del vector y la composición de la secuencia de ácido nucleico que comprende el transgén. Por ejemplo, un investigador debe determinar si el tamaño de la eliminación de E1 se adaptará al tamaño del transgén. Si no es así, entonces tendrán que introducirse eliminaciones adicionales en la estructura principal del vector.
La secuencia de ácido nucleico que constituye el transgén puede ser un gen, o una parte funcional de un gen y normalmente existirá en forma de un casete de expresión. Normalmente, un casete de expresión génica incluye: (a) ácido nucleico que codifica para una proteína o un antígeno de interés; (b) un promotor heterólogo funcionalmente unido al ácido nucleico que codifica para la proteína; y (c) una señal de terminación de la transcripción. El ácido nucleico puede ser ADN y/o ARN, puede ser mono o bicatenario. El ácido nucleico puede presentar codones optimizados para su expresión en el hospedador deseado (por ejemplo, un hospedador mamífero).
También deben tomarse decisiones referentes al sitio dentro de la estructura principal en el que se introducirá el transgén y la orientación del transgén. Más específicamente, el transgén puede insertarse en una orientación paralela a E1 (transcrito de 5' a 3') o antiparalela (transcrito en una dirección de 3' a 5' en relación con la estructura principal del vector). Además, elementos reguladores transcripcionales apropiados que puedan dirigir la expresión del transgén en las células hospedadoras de mamífero que está preparándose el vector para su utilización como portador de vacuna necesitan identificarse y unirse funcionalmente al transgén. Secuencias “funcionalmente unidas” incluyen tanto secuencias de control de la expresión que están contiguas a las secuencias de ácido nucleico que regulan como secuencias reguladoras que actúan en trans, o a una distancia para controlar la secuencia de ácido nucleico regulada.
Las secuencias reguladoras incluyen: secuencias de control de la expresión apropiadas, tales como secuencias promotoras, potenciadoras, de terminación y de iniciación de la transcripción, señales de procesamiento del ARN eficaces, tales como señales de poliadenilación y de corte y empalme; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (por ejemplo, secuencias consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas y opcionalmente secuencias que promueven la secreción de proteínas. La selección de estos y otros elementos de vectores comunes es convencional y los expertos en la materia conocen bien muchas secuencias adecuadas (véase, por ejemplo, Sambrook et al, y la bibliografía citada en, por ejemplo, las páginas 3.18-3.26 y 16.17-16.27 y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1989).
En formas de realización específicas, el promotor es un promotor heterólogo (es decir, con respecto a las secuencias de adenovirus) que es reconocido por una ARN polimerasa eucariota. En una forma de realización preferida, el promotor es un promotor “fuerte” o “eficaz”. Un ejemplo de un promotor fuerte es el promotor de citomegalovirus humano temprano inmediato (Chapman et al, 1991 Nucl. Acids Res 19:3979-3986, que se incorpora como referencia). El promotor de CMV humano puede utilizarse sin (CMV) o con la secuencia del intrón A (CMV-intA), aunque los expertos en la materia reconocerán que puede utilizarse cualquiera de varios otros promotores conocidos, tales como el promotor de inmunoglobulinas fuerte u otros promotores de genes eucariotas, incluyendo el promotor de EF1 alfa, el promotor de CMV murino, el promotor del virus del sarcoma de Rous (VSR), los promotores temprano/tardío de SV40 y el promotor de beta-actina.
Ejemplos adicionales de promotores que pueden utilizarse en la presente invención son el promotor de inmunoglobulinas fuerte, el promotor de EF1 alfa, el promotor de CMV murino, el promotor del virus del sarcoma de Rous, los promotores temprano/tardío de SV40 y el promotor de beta actina, aunque los expertos en la materia pueden apreciar que cualquier promotor que pueda efectuar la expresión en el hospedador pretendido puede utilizarse según los procedimientos de la divulgación. El promotor puede comprender una secuencia regulable tal como la secuencia de operador Tet. Secuencias tales como éstas que ofrecen la posibilidad de regulación de la transcripción y expresión son útiles en casos en los que se busca la represión de la transcripción génica.
Los casetes de expresión génica adecuados comprenderán también una secuencia de terminación de la transcripción. Un terminador transcripcional preferido es el terminador de la hormona de crecimiento bovina. La combinación de promotor/terminación de la transcripción de terminador de CMVintA-BGH se prefiere particularmente aunque también pueden utilizarse otras combinaciones de promotor/terminador. Tal como se muestra en la presente memoria, la señal de poliadenilación/terminación de la hormona de crecimiento bovina (bGHpA) o la señal de poliA sintética corta (SPA) de 50 nucleótidos de longitud definida tal como sigue :
AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG (SEC ID n° 26). En términos generales, muestra a modo de ejemplo secuencias de terminación adecuadas. La señal de poliA se inserta tras la secuencia de ácido nucleico que comprende el transgén y antes de la secuencia de ITR de adenovirus en 3'.
Los vectores adenovirales recombinantes descritos en la presente memoria pueden contener secuencias adenovirales derivadas de una o varias cepas de adenovirus. Pueden obtenerse secuencias adecuadas a partir de fuentes naturales, producidas de manera recombinante, sintética o mediante otros procedimientos químicos o de modificación mediante ingeniería genética. En una forma de realización particular, el adenovirus de chimpancé recombinante es un recombinante quimérico que comprende secuencias de polinucleótido adenovirales que no son de chimpancé. Pueden obtenerse secuencias adenovirales que no son de chimpancé adecuadas a partir de cepas adenovirales humanas. Por ejemplo, puede sustituirse la región E4 nativa por E4 de hAd5 (nt 32816 a nt 35619 de Ad5) o por Ad5E4orf6 (nt 33193 a nt 34077 de Ad5) (número de registro de GenBank de Ad5: M73260).
En términos generales, el inmunógeno (molécula antigénica) suministrada por el vector adenoviral recombinante de chimpancé de la invención comprende un producto enzimático, proteico o polipeptídico que está codificado por un transgén en combinación con una secuencia de nucleótidos que proporciona las secuencias reguladoras necesarias para dirigir la transcripción y/o traducción del producto codificado en una célula hospedadora. La composición del transgén depende de la utilización prevista del vector. Por ejemplo, si la composición inmunogénica divulgada está diseñándose para producir una respuesta de anticuerpos o una respuesta inmunitaria mediada por células en un hospedador mamífero que es específico para un agente infeccioso, entonces es apropiado utilizar una secuencia de ácido nucleico que codifica para por lo menos un producto inmunogénico que se pronostica que confiere inmunidad específica de patógeno al receptor. Alternativamente, si la composición divulgada está preparándose para su utilización como vacuna contra el cáncer, un transgén adecuado puede comprender una parte inmunogénica de un autoantígeno, tal como un TAA, que se ha seleccionado con el objetivo de producir una respuesta inmunitaria protectora de potencia suficiente tanto para romper la tolerancia del hospedador a un TAA particular como para producir una respuesta de larga vida (por ejemplo, memoria) que será suficiente para prevenir el inicio del cáncer o para prevenir la evolución del tumor. Por consiguiente, pueden obtenerse productos génicos inmunogénicos adecuados a partir de una amplia variedad de agentes patógenos (tales como, pero sin limitarse a virus, parásitos, bacterias y hongos) que infectan hospedadores mamíferos, o a partir de una célula cancerosa o tumoral. Aunque la invención se ilustra en la presente memoria con un conjunto particular de inmunógenos de prueba, debe entenderse que la invención no se limita a la utilización de los antígenos mostrados como ejemplo en la presente memoria. Más específicamente, la invención contempla la utilización tanto de antígenos heterólogos como autoantígenos como inmunógenos, incluyendo pero sin limitarse a TAA.
Se divulga en la presente memoria una composición inmunogénica (por ejemplo, una vacuna) para inducir una respuesta inmunitaria contra antígenos (es decir, inmunógenos) expresados por un agente infeccioso. Por ejemplo, es deseable producir una respuesta inmunitaria contra un virus que infecta seres humanos y/o especies animales no humanas. Los ejemplos de familias de virus contra las que sería deseable una respuesta inmunitaria profiláctica y/o terapéutica incluyen la familia Picornaviridae que incluye seis géneros diferentes tales como Aphtovirus, Cardiovirus, Enterovirus, Hepatovirus, Parechovirus, Rhinovirus. Ejemplos de Picornavirus contra los que sería deseable una respuesta inmunitaria: virus de la fiebre aftosa, virus de encefalomiocarditis, poliovirus, virus de Coxackie, virus de la hepatitis A humana, parechovirus humanos, rhinovirus. La familia Caliciviridae incluye diferentes géneros asociados con gastroenteritis epidémica en seres humanos provocada por el grupo de virus Norwalk y otros síndromes en animales como la enfermedad hemorrágica en conejos asociada con el virus de la enfermedad hemorrágica de conejos o enfermedad respiratoria en gatos provocada por calicivirus felino.
Otra familia de virus, contra la que puede ser deseable producir una respuesta inmunitaria, es la Astroviridae, que comprende virus aislados de seres humanos así como muchas especies animales diferentes. Los astrovirus humanos están asociados con gastroenteritis y diarrea en niños pequeños. Alternativamente, puede ser deseable conferir a los hospedadores mamíferos inmunidad frente a miembros de la familia Togaviridae de virus que comprende dos géneros: alfavirus y rubivirus. Los alfavirus están asociados con enfermedades humanas y veterinarias tales como artritis (es decir, virus Chikungunya, virus Sindbis) o encefalitis (es decir, virus de la encefalitis equina oriental, virus de la encefalitis equina occidental).
El virus de la rubéola proporciona una diana viral alternativa contra la que el único miembro del género rubivirus es responsable de los brotes de una enfermedad exantemática leve asociada con fiebre y linfoadenopatía. La infección por el virus de la rubéola está asociada también con anomalías en el feto cuando la adquiere la madre durante el embarazo temprano. Flaviviridae es otra familia de virus que consiste en tres géneros: los flavivirus, los pestivirus y los hepacivirus que incluyen patógenos humanos así como animales importantes. Muchos de los miembros del género flavivirus son patógenos humanos transmitidos por artrópodos que provocan una variedad de enfermedades incluyendo fiebre, encefalitis y fiebres hemorrágicas. Los virus de la fiebre del dengue, el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la fiebre del Nilo occidental, el virus de la encefalitis transmitido por garrapatas son patógenos de interés global principal o de interés regional (endémicos). El género pestivirus incluye patógenos animales de importancia económica principal tales como el virus de la diarrea viral bovina, el virus de la fiebre porcina clásica, el virus de la enfermedad de la frontera. El virus de la hepatitis C es el único miembro del género hepacivirus responsable de hepatitis aguda y crónica. Las proteínas del VHC expresadas por un adenovirus recombinante pueden producir una respuesta inmunitaria protectora así como terapéutica que limita las consecuencias de una infección viral que afecta a 170 millones de personas en todo el mundo.
Alternativamente, pueden expresarse antígenos derivados de miembros de la familia Coronaviridae mediante vectores de adenovirus recombinantes con el fin de obtener protección contra la infección. Puede obtenerse protección contra el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (virus SARS-Co) inmunizando con uno o varios adenovirus de chimpancé elegidos del grupo que incluye ChAd3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 16, 17, 19, 20, ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 que expresan una 0 varias proteínas de SARS-CoV incluyendo sin limitaciones proteína de la nucleocápside (N), proteína polimerasa (P), glicoproteína de membrana (M), glicoproteína de la espícula (S), proteína de la envuelta pequeña (E) o cualquier otro polipéptido expresado por el virus. Los miembros de la familia Rhabdoviridae incluyendo el virus de la rabia pueden ser la diana de una vacuna recombinante que expresa proteínas virales.
Otras posibles dianas incluyen la familia Filoviridae que comprende géneros de virus similares al Ébola y similares al Marburg, que son responsables de brotes de fiebre hemorrágica grave; la familia Paramyxoviridae que comprende algunos de los virus más prevalentes conocidos en seres humanos como virus del sarampión, virus respiratorio sincitial, virus parainfluenza y virus de interés veterinario como el virus de la enfermedad de Newcastle y el virus de la peste bovina; la familia Orthomyxoviridae que incluye los virus de la gripe A, B, C; la familia Bunyaviridae transmitida principalmente por artrópodos a hospedadores vertebrados que comprende importantes patógenos humanos como el virus de la fiebre del valle del Rift, virus Sin Nombre, virus Hantaan, virus Puumala; la familia Arenaviridae que comprende el virus de la coriomeningitis linfocítica, el virus de la fiebre de Lassa, el virus de la fiebre hemorrágica argentina, el virus de la fiebre hemorrágica boliviana; la familia Bornaviridae que comprende virus que provocan enfermedades del sistema nervioso central principalmente en caballos y ovejas; la familia Reoviridae que incluye rotavirus, la causa más importante de enfermedad diarreica grave en lactantes y niños pequeños en todo el mundo, orbivirus que pueden afectar tanto a seres humanos como a otros mamíferos (virus de la lengua azul, virus de la enfermedad hemorrágica epizoótica); la familia Retroviridae, un gran grupo de virus que comprende importantes patógenos humanos como el virus de la inmunodeficiencia humana 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2) y el virus de la leucemia de células T humanas tipo 1 y 2 (VLTH 1 y 2) así como lentivirus no humanos tales como virus Maedi/Visna que afecta a ovejas y cabras, virus de la anemia infecciosa equina que afecta a caballos, virus de la inmunodeficiencia bovina que afecta al ganado, virus de la inmunodeficiencia felina que afecta a gatos; grupos de la familia Polyomaviridae de virus oncogénicos de ADN pequeño, virus prototipo son polioma y SV40 que infectan a ratones y monos rhesus respectivamente, (se aislaron virus b K y j C estrechamente relacionados con SV40 de pacientes humanos); la familia Papillomaviridae consiste en un grupo de virus de ADN que infectan vertebrados superiores incluyendo seres humanos generando verrugas y condilomas. La infección por el virus del papiloma está asociada con el desarrollo de cáncer tanto en seres humanos como animales. Los virus del papiloma humano están asociados con cáncer de cuello uterino, cáncer vaginal y cáncer cutáneo. La familia Herpesviridae incluye subfamilias en las que se clasifican varios patógenos importantes para seres humanos y otros mamíferos. Fuentes adecuadas de antígenos pueden ser pero no se limitan a virus del herpes simple 1 y 2, virus de la varicela zóster, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, virus del herpes humano 6A, 6B y 7, virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi. Fuentes adecuadas adicionales de antígenos son miembros de la familia Poxviridae como el virus de la viruela del mono, virus Molluscum contagiosum, virus de la viruela; virus de la hepatitis B, el miembro prototipo de la familia Hepadnaviridae así como otros virus que provocan hepatitis aguda y/o crónica como el virus de la hepatitis delta, el virus de la hepatitis E.
Los vectores adenovirales de chimpancé de la presente invención son también adecuados para la preparación de composiciones inmunogénicas diseñadas para estimular una respuesta inmunitaria en seres humanos o animales contra proteínas expresadas por patógenos no virales incluyendo patógenos bacterianos, fúngicos y parasitarios. Por ejemplo, los vectores dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse para preparar vacunas contra, pero sin limitarse a: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae, Clostridium tetani, Neisseria meningitis, Corynebacterium diphteriae, Mycobacteria tuberculosis y leprae, Listeria monocytogenes y Legionella pneumofila. Los ejemplos de hongos y parásitos de mamíferos para los que puede ser deseable preparar vacunas profilácticas o terapéuticas incluyen: Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Histoplasma capsulatum, Plasmodium malariae, Leishmania major, Trypanosome cruz y brucei, Schistosoma haematobium, mansoni y japonicum; Entamoeba histolytica y numerosas especies de Filaria que se sabe que son responsables de filariasis humana.
El cáncer implica normalmente la desregulación de genes que codifican para polipéptidos que contribuyen a mantener el ciclo celular o a controlar la proliferación celular (por ejemplo, factores de crecimiento, oncogenes, receptores y supresores de tumores). Los productos de muchos de los genes implicados en el cáncer se expresan en la superficie de una amplia variedad de células tumorales. Se ha identificado una variedad de antígenos tumorales que pueden ser reconocidos por linfocitos T y B en cáncer humano y animal. La gran mayoría de antígenos asociados a tumores humanos (TAA) que son adecuados para su utilización en un ensayo de vacuna contra el cáncer se describen como “autoantígenos” debido al hecho de que además de expresarse en células tumorales, también se expresan en tejido normal y/o durante el desarrollo fetal. La inmunotolerancia de la población diana a TAA puede explicar por qué muchas vacunas contra el cáncer han demostrado ser ineficaces.
Pueden producirse antígenos tumorales mediante mutantes oncogénicos de protooncogenes alterados de genes celulares normales o genes supresores de tumores tales como Ras, las proteínas p53 o Bcr-Abl son ejemplos de proteínas celulares alteradas que pueden estimular la respuesta de células T/B. Los antígenos tumorales pueden ser proteínas celulares normales que se sobreexpresan en células tumorales (tirosinasa, GP100, mAr T se expresan normalmente a bajos niveles en melanocitos y se sobreexpresan en melanoma) o se expresan de manera aberrante en células tumorales (MAGE, BAGE, GAGE se expresan en melanomas y muchos carcinomas pero se expresa normalmente en los testículos y la placenta). Los antígenos tumorales pueden ser productos de virus oncogénicos: proteínas E6 y E7 del virus del papiloma expresadas por carcinomas de cuello uterino; proteína EBNA-1 del VEB producida por carcinomas nasofaríngeos y linfomas VEB+; antígeno T de SV40 en tumores experimentales inducidos por SV40. Se expresan antígenos oncofetales en altos niveles en células cancerosas y en tejidos en desarrollo normales (fetales) pero no en tejidos adultos. El antígeno carcinoembrionario (CEA) y la alfa-fetoproteína (AFP) son ejemplos de antígenos oncofetales bien caracterizados.
Pruebas recientes apoyan la existencia de TAA que pueden producir una respuesta inmunitaria, haciendo así que esta clase de antígenos sean inmunógenos adecuados para la terapia con vacunas. Sin embargo, como clase de antígenos, los TAA son inmunógenos notoriamente malos y las células T que son sumamente específicas para TAA o bien se eliminan o bien se energizan durante el desarrollo de células T. Por consiguiente, existe la expectativa de que la respuesta inmunitaria de un hospedador que porta un tumor frente a un TAA particular será extremadamente baja. Debido a la necesidad inherente de romper la tolerancia del hospedador a un TAA diana, los estudios de vacunas clínicas experimentales se centran particularmente en el desarrollo de estrategias de inmunización que potencien respuestas de células T específicas de TAA. En términos generales, una vacuna contra el cáncer eficaz debe superar tanto la inmunotolerancia como potenciar la respuesta inmunitaria del hospedador hasta un nivel que sea preventivo y/o protector. En muchos estudios de vacunas experimentales, se han correlacionado los efectos antitumorales con respuestas de células T frente a TAA.
Es divulgada en la presente memoria una composición inmunogénica (por ejemplo, una vacuna contra el cáncer) que puede utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria contra antígenos tumorales. Una composición adecuada contendría un adenovirus de chimpancé recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un antígeno tumoral y un vehículo fisiológicamente aceptable. El elemento de secuencia codificante del casete puede codificar para un único inmunógeno, tal como una secuencia de péptido inmunogénico derivado de un autoantígeno, tal como un antígeno asociado a tumor. La secuencia de ácido nucleico que codifica para el inmunógeno (es decir, el transgén) puede presentar codones optimizados para su expresión en una especie de mamífero particular. La secuencia codificante puede codificar para más de un inmunógeno, tal como uno o varios antígenos tumorales con codones optimizados. Por ejemplo, una vacuna contra el cáncer que utiliza los vectores adenovirales dados a conocer puede codificar para una combinación de autoantígenos tales como: HER2/neu, CEA, Hepcam, PSA, PSMA, Telomerasa, gp100, Melan-A/MART-1, Muc-1, NY-ESO-1, Survivina, Estromelisina 3, Tirosinasa, MAGE3, CML68, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NY-CO-58, NY-BR-62, hKLP2, VEGF.
El desarrollo de una vacuna contra el cáncer eficaz requiere la identificación de una estrategia que produzca inmunidad específica de antígeno en pacientes vacunados y la generación de una respuesta inmunitaria que persista tras haber finalizado la inmunización activa. El éxito de la estrategia dependerá de si una respuesta inmunitaria medible dirigida contra un antígeno diana se correlaciona con la protección contra la aparición o recidiva del cáncer. Se ha mostrado que los mecanismos efectores tanto de la inmunidad mediada por células como de la inmunidad humoral son la destrucción de células tumorales. Sin embargo, datos de sistemas experimentales sugieren que las células T específicas de antígeno representan el mecanismo inmunológico más poderoso para la eliminación de células tumorales. Se pronostica que el reconocimiento de antígenos específicos de tumor (por ejemplo, TAA) por células T efectoras permite al TAA funcionar como antígeno de rechazo de tumores. Estudios publicados sugieren que la estimulación de respuestas de células T auxiliares CD8+ y CD4+ es importante para lograr una eliminación óptima del tumor ((Greenberg, P. D. (1991) Adv. Immunol. 49: 281-355; Pardoll, D. M. et al. (1998) Curr. Opin. Immunol. 10: 588-94). La respuesta clínica (es decir, la eficacia) se ha asociado con aumentos en células T citotóxicas que secretan interferón y. La aparición de ensayos, tales como el ensayo ELISPOT utilizado en la presente memoria, para demostrar la eficacia de los presentes portadores de vacuna, permite a los investigadores medir las respuestas de células T frente a regímenes de vacunación y de este modo facilita el desarrollo de vacunas contra el cáncer.
Las vacunas contra el cáncer pueden ser o bien profilácticas o bien terapéuticas. La suposición general que subyace a la utilización profiláctica de vacunas contra el cáncer es que los TAA son inmunógenos extremadamente débiles o son funcionalmente no inmunogénicos en sujetos que portan tumores. Más específicamente, en el campo de la inmunología del cáncer, pueden utilizarse vacunas como inmunoterapia en pacientes aquejados de cáncer. Por consiguiente, pueden diseñarse vacunas contra el cáncer para producir una respuesta inmunitaria que se dirige contra un TAA que se expresa por un tumor maligno o tumor preexistente. Por tanto, las vacunas contra el cáncer terapéuticas están destinadas para su utilización en pacientes que portan tumores que han desarrollado resistencia a regímenes de tratamiento convencionales o que presentan una alta probabilidad de desarrollar una recidiva tras el tratamiento convencional.
La alta inmunogenicidad de los adenovirus hace que los vectores adenovirales sean candidatos particularmente buenos para su utilización en el contexto de un portador de vacuna diseñado para romper la tolerancia del hospedador a un autoantígeno. El fenómeno de propagación de determinantes o epítopos, que se describió por primera vez en enfermedades autoinmunitarias, se ha asociado con respuestas restringidas tanto por el CMH de clase I como por el CMH de clase II y se ha correlacionado con el desarrollo de inmunidad de células T específica de proteína HER-2/neu. La propagación de epítopos representa la generación de una respuesta inmunitaria frente a una parte particular de una proteína inmunogénica seguido por la propagación natural de la inmunidad a otros determinantes antigénicos presentes en la misma proteína. Por ejemplo, Disis et al. observaron propagación de epítopos en el 84% de los pacientes aquejados de tumores malignos que sobreexpresaban HER-2/neu a los que se les administraron vacunas que comprendían péptidos derivados de posibles epítopos auxiliares T de la proteína HER-2 mezclados con factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrófagos (J. Clin. Oncol. (2002) 20(11): 2624-2632). De manera importante, se correlacionó la propagación de epítopos con la generación de una respuesta frente al dominio de proteína HER-2/neu y sugiere que la inmunización burló de manera eficaz la tolerancia inmunológica.
Los TAA que son adecuados para su utilización en los vectores adenovirales de chimpancé dados a conocer como diana para una vacuna contra el cáncer deben poseer varias características. Por ejemplo, un TAA diana debe presentar un perfil de expresión favorable, lo que significa que debe expresarse o sobreexpresarse preferentemente en el tumor o tejido maligno en comparación con el tejido normal. Además, debido a que los TAA que desempeñan un papel en la tumorigénesis es más probable que se conserven durante los diferentes estadios de la evolución del cáncer, un TAA diana adecuado debe conservarse también durante toda la metástasis y la evolución del tumor. Los TAA diana adecuados deben expresarse también de manera homogénea dentro del tumor. En tercer lugar, los TAA diana adecuados no deben ser sujeto de tolerancia inmunológica absoluta. Más específicamente, debe haber algunas pruebas de que las células T que pueden tanto reconocer como responder frente al TAA de interés no se han eliminado por completo del repertorio de células T del hospedador (Berinstein, N. L., J. Clin. Oncol. 29(8): 2197 (2002).
El antígeno carcinoembrionario (CEA) presenta muchas características que lo hacen atractivo como TAA para su utilización como antígeno diana para una vacuna contra el cáncer. Es un miembro de la superfamilia de Ig que se caracteriza por un patrón de expresión favorable. Se expresa en más del 50% de todos los cánceres humanos y se ha implicado en el proceso de tumorigénesis, lo que sugiere que su expresión puede seleccionarse y conservarse durante toda la evolución del cáncer. Además, se ha establecido que la tolerancia inmunológica a CEA no es absoluta. Estudios publicados establecen que las células T humanas pueden reconocer, activarse frente y lisar células cancerosas que expresan CEA (Berinstein, N. L., J. Clin. Oncol. 29(8): 2197 (2002). Por ejemplo, la inmunización de pacientes con virus vaccinia recombinante que expresa CEA, combinada con estimulaciones in vitro posteriores a base de péptidos, generaba CTL restringidos por el CMH CD8+ que podían lisar tumores autólogos (Tsang, K. Y. et al. J. Natl. Cancer Inst., (1995) 87:982-990). Alternativamente, se notificó que la inmunización de pacientes con carcinoma colorrectal tras la cirugía con CEA recombinante inducía respuestas celulares y de anticuerpos débiles frente a CEA recombinante (Samanci, A., et al. (1998) Cancer Immunol. Immunother. 47: 131-142.) Además, la administración de anticuerpos antiidiotípico anti-CEA a pacientes con diagnóstico de cáncer colorrectal generaba anticuerpos anti-CEA y proliferación de células T específicas de idiotipo (Foon, L, A. et al. (1995) J. Clin. Invest., 96: 334-342). La bibliografía indica también que la tolerancia a CEA en pacientes con cáncer puede superarse con varios enfoques de vacunación diferentes (es decir, vacunación con CEA recombinante o virus orthopox o avipox-CEA recombinantes, administración de anticuerpos anti-idiotipo, pulsado de células dendríticas con epítopos agonistas de CEA).
CEA es una glicoproteína oncofetal que se expresa en colon fetal normal y en un grado mucho menor en mucosa colónica normal. Se sobreexpresa también en la gran mayoría de adenocarcinomas, particularmente los del colon, páncreas, mama, pulmón, recto y estómago. Muchos cánceres colorrectales y algunos carcinomas producen altos niveles de CEA que pueden medirse en suero, lo que le convierte en uno de los marcadores serológicos de tumores malignos más ampliamente utilizados, especialmente en pacientes con cáncer colorrectal.
Un segundo TAA divulgado en la presente memoria es un producto del protooncogén HER2/erb-2 (también denominado neu). Como CEA, HER2/neu presenta un patrón de expresión favorable y no es sujeto de tolerancia absoluta. Más específicamente, se detectan bajos niveles de expresión del transcrito HER2/neu, y el producto de polipéptido de 185 kD, en células epiteliales adultas normales de diversos tejidos, incluyendo la piel y las mamas, y tejidos del tubo digestivo, las vías reproductivas y las urinarias; se detectan niveles de expresión superiores en los tejidos fetales correspondientes durante el desarrollo embrionario (Press et al., Oncogene 5: 953-962 (1990). Varios conjuntos de pruebas sugieren un vínculo entre la amplificación de HER-2 y la transformación neoplásica en tumores de mama, pulmón, próstata, ovarios, endometriales y colorrectales humanos (Disis y Cheever, Adv. Cancer Research 71: 343-371(1997). En términos generales, la sobreexpresión de HER2/neu se correlaciona con un mal pronóstico y una tasa de recidiva superior para pacientes con cáncer (Slamon et al., Science 244: 707-712 (1989). Por tanto, una vacuna específica para la proteína HER-2/neu podría presentar una amplia aplicación y utilidad en la prevención de la recidiva de la enfermedad en muchos tumores malignos humanos diferentes.
HER2/neu codifica para una glicoproteína transmembrana que posee actividad tirosina cinasa intrínseca y que presenta homología extensa con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Akiyama, T et al., (1986) Science 232: 1644-1646). Uno de los primeros estudios clínicos que utilizaron HER2 como diana para la inmunoterapia contra el cáncer empleó el anticuerpo monoclonal específico de HER-2 Herceptina para el tratamiento del cáncer de mama (Goldenberg MM (1999) Clin. Ther. 21: 309-318). Esto condujo a esfuerzos posteriores que se centraron en la utilización de HER-2 como diana para que la rama de células T del sistema inmunitario produjese respuestas antitumorales eficaces, incluyendo la utilización de proteínas de fusión recombinantes que comprenden dominios de HER-2 para activar células presentadoras de antígeno autólogas. Informes publicados establecen que numerosos pacientes con cáncer aquejados de cánceres de ovarios y mama que expresan neu montaron respuestas inmunitarias (por ejemplo, producción de células T y anticuerpos específicos de antígeno) contra el producto proteico del oncogen HER2/neu.
El ensamblaje de las secuencias adenovirales recombinantes, el transgén y otros elementos del vector para dar diversos plásmidos intermedios y vectores lanzadera, y la utilización de los plásmidos y vectores para producir una partícula viral recombinante, se logran todos utilizando técnicas convencionales descritas en manuales convencionales que conocen bien los expertos en la materia (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a técnicas de clonación de ADNc convencionales, utilización de secuencias de oligonucleótidos solapantes derivadas del genoma adenoviral, recombinación homóloga, reacción en cadena de la polimerasa, técnicas de transfección convencionales, formación de placas de virus en recubrimiento de agar y otras metodologías relacionadas.
Para ayudar en la preparación de polinucleótidos en células procariotas, se prepara a menudo una versión de plásmido del vector de adenovirus (preplásmido de adenovirus). El preplásmido de adenovirus contiene una parte adenoviral y una parte de plásmido. La parte adenoviral es esencialmente igual que la parte adenoviral contenida en los vectores adenovirales de la invención (que contienen secuencias adenovirales con regiones E1 y opcionalmente E3 no funcionales o eliminadas) y un casete de expresión de inmunógeno, flanqueado por sitios de restricción convenientes.
La parte de plásmido del preplásmido de adenovirus contiene a menudo un marcador de resistencia a antibióticos bajo el control transcripcional de un promotor procariota de modo que la expresión del antibiótico no se produce en absoluto en células eucariotas. Pueden utilizarse genes de resistencia a ampicilina, genes de resistencia a neomicina y otros marcadores de resistencia a antibióticos farmacéuticamente aceptables. Para ayudar en el alto nivel de producción del polinucleótido mediante fermentación en organismos procariotas, es ventajoso que el preplásmido de adenovirus contenga un origen de replicación procariota y presente un alto número de copias. Varios vectores de clonación procariotas comercialmente disponibles proporcionan estos beneficios. Es deseable eliminar secuencias de ADN no esenciales. También es deseable que los vectores no puedan replicarse en células eucariotas. Esto minimiza el riesgo de integración de las secuencias de vacunas polinucleotídicas en el genoma de los receptores. Pueden utilizarse potenciadores o promotores específicos de tejido siempre que sea deseable para limitar la expresión del polinucleótidos a un tipo de tejido particular.
Pueden generarse preplásmidos de adenovirus (plásmidos que comprenden el genoma del adenovirus de replicación defectuosa con inserciones y eliminaciones deseadas) mediante recombinación homóloga utilizando a Dn de estructuras principales de adenovirus y un vector lanzadera apropiado (diseñado para seleccionar como diana eliminaciones específicas e incorporar sitios de restricción deseados en el plásmido resultante). Pueden generarse vectores lanzadera de utilización en este procedimiento utilizando procedimientos generales ampliamente entendidos y apreciados en la técnica, por ejemplo, PCR de los extremos terminales adenovirales teniendo en cuenta las eliminaciones deseadas, y la clonación secuencial de los segmentos respectivos en un plásmido de clonación apropiado. El preplásmido adenoviral puede digerirse y transfectarse entonces en la línea celular de complementación mediante coprecipitación con fosfato de calcio u otros medios adecuados. Se produce entonces amplificación y replicación del virus, un fenómeno que se hace evidente por el notable efecto citopático. Se recogen entonces los medios y las células infectadas tras completarse la replicación viral (generalmente, 7-10 días tras la transfección).
En términos generales, tras la construcción y el ensamblaje de los preplásmidos de adenovirus deseados, se rescatan los preplásmidos de adenovirus en los virus transfectando una línea celular humana que expresa E1 adenoviral. La complementación entre la línea celular de empaquetamiento y los genes virales del vector permite que las secuencias de adenovirus-transgén del vector se repliquen y empaqueten en cápsides de viriones, dando como resultado la producción de adenovirus recombinantes. Los virus resultantes pueden aislarse y purificarse mediante cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en la materia para su utilización en los procedimientos de la invención.
Resultará evidente para los expertos en la materia que cuando una o varias eliminaciones seleccionadas de entre genes adenovirales de chimpancé se introducen en un vector viral, la función del producto génico eliminado puede suministrarse durante el procedimiento de producción por secuencias presentes en la línea celular de producción. Por tanto, la función de los genes manipulados puede proporcionarse mediante una línea celular transformada de manera permanente que se caracteriza por alguna o todas las funciones adenovirales que se requieren para el empaquetamiento pero que no son funcionales en el vector (por ejemplo, cualquiera de E1A, E1B, E2A, E2B E4). Alternativamente, las funciones adenovirales requeridas pueden proporcionarse a una línea celular de empaquetamiento adecuada infectando o transfectando de manera transitoria una célula adecuada con un constructo que comprende el gen requerido para proporcionar la función.
Por consiguiente, es divulgado en la presente memoria un procedimiento de producción de vectores adenovirales de chimpancé en líneas celulares humanas que expresan E1. Más específicamente, los vectores dados a conocer pueden propagarse en una línea celular de complementación de E1, incluyendo las líneas celulares conocidas 293 y PER.C6™. Ambas líneas celulares expresan el producto génico E1 adenoviral. PER.C6™ se describe en el documento WO 97/00326, publicado el 3 de enero de 1997, que se incorpora a la presente memoria como referencia. Es una línea celular de retinoblasto humano primario transducida con un segmento del gen E1 que complementa la producción de adenovirus de la primera generación defectuoso para la replicación, pero se diseña para impedir la generación de adenovirus competente para la replicación mediante recombinación homóloga. Las células 293 se describen en Graham et al (1977) J. Gen. Virol 36:59-72, que también se incorpora a la presente memoria como referencia. Un experto en la materia reconocerá que la expresión “adenovirus de la primera generación” se refiere a un adenovirus defectuoso para la replicación que presenta una región E1 o bien no funcional o bien eliminada, y opcionalmente una región E3 no funcional o eliminada.
Debe comprobarse que los lotes de vectores adenovirales defectuosos para la replicación que están destinados a su utilización como composición de vacuna en un ensayo clínico estén libres de RCA (Fallaux, F.J. et al (1998) Human Gene Therapy, 9:1909-1917). En la práctica, esto es un procedimiento laborioso que requiere establecer y utilizar un programa de selección caro. Un experto en la materia admitirá que una alta frecuencia de generación de RCA no sólo da como resultado una alta tasa de fallo para los lotes producidos, sino que también limita gravemente los esfuerzos de aumento a escala. La eliminación de la homología de secuencia entre la secuencia de nucleótidos del vector y las secuencias adenovirales presentes en el genoma de la línea celular de empaquetamiento/producción auxiliar debe limitar la posibilidad de producir lotes del vector que estén contaminados con RCA producidos mediante recombinación homóloga.
Normalmente, los vectores adenovirales defectuosos para la replicación recombinantes se propagan en líneas celulares que proporcionan productos génicos de E1 en trans. La suplementación de los productos génicos de E1 esenciales en trans es muy eficaz cuando los vectores son del mismo serotipo o uno muy similar. Por ejemplo, es bien sabido que los vectores de serotipo del grupo C (Ad2 y Ad5) eliminados en E1 (es decir, AE1) pueden propagarse en células 293 o PER.C6 que contienen y expresan la región E1 de Ad5. Sin embargo, se ha observado que las secuencias de E1 de Ad5 presentes en las células de producción 293 y PER.C6 no siempre complementan totalmente la replicación de serotipos que no son del grupo C. Por consiguiente, los serotipos eliminados en E1 fuera del subgrupo C, por ejemplo los de los subgrupos A, B, D, E y F, pueden replicarse con una eficacia inferior respecto al virus de tipo natural correspondiente o pueden no replicarse en absoluto en las células 293 o PER.C6. Esto puede deberse a la incapacidad del producto génico de E1 B 55 K de Ad5 (grupo C) para establecer una interacción funcional con el producto génico de E4 orf6 de los serotipos que no son del grupo C.
La disminución de la eficacia de replicación en células que expresan E1 de Ad5 es variable considerando vectores de diferentes subgrupos. Mientras que los vectores AE1 que se derivan de adenovirus del subgrupo D y E pueden rescatarse y propagarse en células 293 y Per.C6™ con eficacia variable, la propagación de vectores AE1 del subgrupo B está completamente alterada (Vogels R, et al. (2003) Aug. Replication-deficient human adenovirus type 35 vectors for gene transfer and vaccination: efficient human cell infection and bypass of preexisting adenovirus immunity. J Virol. 77 (15):8263-71).
Aunque la interacción entre E1b 55 k de Ad5 y el vector que expresa la proteína E4 orf6 se conserva dentro de los miembros del mismo subgrupo, puede no ser suficientemente estable cuando se expresa la proteína E4 orf6 de un serotipo que no es C. Esta formación ineficaz o inestable del complejo E1B-55K/E4-orf6 conduce a una ausencia de propagación reducida del vector AE1. Por consiguiente, se ha determinado empíricamente que con el fin de rescatar satisfactoria y eficazmente adenovirus recombinantes de serotipos del grupo B, puede ser necesario generar una línea celular que exprese la región E1 del serotipo de interés. En células que expresan Ad5E1 como 293 o Per.C6™, la expresión puede limitarse a la proteína E1b 55K. Alternativamente, podría modificarse una línea celular adecuada que expresa Ad5E1 para que exprese la región E4 de Ad5 completa (o E4 orf6 sólo) además de Ad5E1. La generación de líneas celulares que expresan tanto E1 de Ad5 como orf6 es útil en la complementación de serotipos de adenovirus alternativos; véase, por ejemplo, Abrahamsen et al., 1997 J. Virol. 8946-8951. Se muestra la incorporación de E4 (orf6) en líneas celulares de complementación de Ad5, como en la generación de líneas celulares específicas de serotipo proporcionan producto(s) génico(s) de E1 específico(s) de serotipo en trans. Alternativamente, puede mejorarse la eficacia de la propagación de un vector que no es del grupo C mediante la modificación de la estructura principal viral sustituyendo la región E4 nativa por Ad5 orf6. Pueden lograrse resultados similares sustituyendo sólo el orf6 nativo por un orf6 que se deriva de Ad5 u otros virus del subgrupo C (Ad1, Ad2, Ad6). La patente US n° 5.849.561 da a conocer la complementación de un vector de adenovirus que no es del grupo C eliminado en E1 en una línea celular de complementación de Ad5-E1 que también expresa parte del gen Ad5-E4.
La patente US n° 6.127.175, concedida a Vigne, et al., da a conocer una línea celular de mamífero transfectada de manera estable que expresa una parte de la región E4 de adenovirus, preferiblemente orf6/orf6/7. Una línea celular de este tipo es útil para la complementación de genomas Ad recombinantes deficientes en la región E4.
Son divulgadas en la presente memoria las composiciones, incluyendo composiciones de vacuna, que comprenden los vectores adenovirales dados a conocer. Estas composiciones pueden administrarse a hospedadores mamíferos, preferiblemente hospedadores humanos, en un entorno o bien profiláctico o bien terapéutico. Los posibles hospedadores/vacunados incluyen pero no se limitan a primates y especialmente seres humanos y primates no humanos, e incluyen cualquier mamífero no humano de importancia veterinaria doméstica o comercial. Pueden administrarse composiciones que comprenden vectores adenovirales de chimpancé recombinantes solas o en combinación con otras vacunas de proteínas/ADN basadas en virus o no basadas en virus. También pueden administrarse como parte de un régimen de tratamiento más amplio.
Los vectores dados a conocer pueden utilizarse en un protocolo de inmunización diseñado para romper la tolerancia del hospedador a un autoantígeno o un antígeno asociado a tumor. La identificación de varios TAA ha permitido el desarrollo de enfoques de vacunación activa para la terapia del cáncer. Tanto antígenos de la superficie celular como antígenos intracelulares que se procesan y presentan proporcionan dianas útiles. En términos generales, el procedimiento dado a conocer de rotura de la tolerancia del hospedador a un autoantígeno comprende: (a) estimular una respuesta específica de antígeno frente a un autoantígeno administrando una primera composición de vacuna que comprende un primer vector de ChAd o un vector de plásmido que porta una secuencia de nucleótidos que codifica para el autoantígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria específica de antígeno, y (b) sostener y expandir la respuesta inmunitaria de (a) administrando una segunda composición de vacuna que comprende un vector de ChAd recombinante de un serotipo diferente que contiene por lo menos una eliminación funcional de su gen E1 genómico, y en el sitio del gen E1, una secuencia que comprende un promotor que puede dirigir la expresión de ADN que codifica para el mismo autoantígeno suministrado en la etapa de sensibilización, mediante lo cual el hospedador monta una respuesta inmunitaria que presenta el efecto de romper la tolerancia al autoantígeno.
Por consiguiente, un experto en la materia puede utilizar esta descripción para diseñar varios protocolos de inmunización diferentes que pueden ser adecuados para su utilización para romper la tolerancia del hospedador. Por ejemplo, puede ser posible utilizar un protocolo en el que la primera, o la inmunización de sensibilización, comprende un ADN de plásmido que codifica para un autoantígeno particular, tal como TAA y cualquier inmunización posterior comprende un vector de ChAd. Las secuencias de ADN de plásmido que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para autoantígenos pueden suministrarse por vía intramuscular, con o sin electroestimulación, en una o varias inyecciones. Por ejemplo, el procedimiento general dado a conocer y reivindicado en la presente memoria abarca un protocolo de inmunización basado en inyecciones intramusculares múltiples (por ejemplo, 3 ó 4 ó 5) de ADN de plásmido que codifica para un TAA mediante electroporación seguido por una o varias inyecciones intramusculares de un vector de ChAd que comprende un transgén que codifica para el mismo TAA.
Alternativamente, un protocolo adecuado para romper la tolerancia podría implicar una o varias inmunizaciones de sensibilización con un vector de ChAd o hAd que comprende un transgén que codifica para un autoantígeno, seguido por una o varias inmunizaciones de refuerzo con o bien el mismo o bien un vector de ChAd diferente que se sabe que no produce reacción cruzada con el vector utilizado para la(s) inmunización/inmunizaciones de sensibilización. Por ejemplo, podría utilizarse un protocolo de inmunización que utiliza ChAd3 para la sensibilización y ChAd6 para el refuerzo, o ChAd3 para la sensibilización seguido por ChAd6 y ChAd9 para el refuerzo, para romper la tolerancia del hospedador. En formas de realización particulares, la invención contempla la utilización de autoantígenos que comprenden por lo menos un antígeno asociado a tumor seleccionado de entre el grupo constituido por: HER2/neu, CEA, EpCAM, PSA, PSMA, Telomerasa, gp100, Melan-A/MART-1, Muc-1, NY-ESO- 1, Survivina, Estromelisina 3, Tirosinasa, MAGE3, CML68, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NY-CO-58, NY-BR-62, hKLP2, VEGF. En una forma de realización particular, la invención proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria (por ejemplo humoral o mediada por células) frente a un antígeno asociado a tumor que es específico para un tumor maligno seleccionado suministrando un adenovirus de chimpancé recombinante que codifica para el TAA a un mamífero aquejado de cáncer. En una forma de realización preferida de este aspecto de la invención, la respuesta inmunitaria producida constituye una respuesta inmunitaria caracterizada por la producción de células T CD4+ y CD8+ específicas de antígeno.
Las composiciones inmunogénicas divulgadas en la presente memoria pueden administrarse a hospedadores mamíferos, preferiblemente hospedadores humanos, en un entorno o bien profiláctico o bien terapéutico. Los posibles hospedadores/vacunados incluyen pero no se limitan a primates y especialmente seres humanos y primates no humanos, e incluyen cualquier mamífero no humano de importancia veterinaria doméstica o comercial. Pueden administrarse composiciones que comprenden vectores adenovirales de chimpancé recombinantes solas o en combinación con otras vacunas de proteínas/ADN basadas en virus o no basadas en virus. También pueden administrarse como parte de un régimen de tratamiento más amplio. Las composiciones adecuadas, para su utilización en los procedimientos divulgados en la presente memoria, pueden comprender los vectores virales recombinantes de la invención en combinación con componentes fisiológicamente aceptables, tales como un tampón, solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato, sacarosa, otras sales y polisorbato. No provoca irritación de los tejidos tras su inyección intramuscular. Preferiblemente, se congela hasta su utilización. Opcionalmente, puede formularse una composición de vacuna para que contenga otros componentes, tales como pero sin limitarse a, un adyuvante, un estabilizador, un agente de ajuste del pH o un conservante. Tales componentes los conoce bien el experto en la materia.
Se prevé que los adenovirus de chimpancé recombinantes de la invención se administren a hospedadores humanos o veterinarios en una “cantidad eficaz”, es decir, una cantidad de virus recombinante que sea eficaz en una vía de administración elegida para transducir células hospedadores y proporcione niveles de expresión suficientes del transgén para provocar una respuesta inmunitaria que confiera un beneficio terapéutico o inmunidad protectora al receptor/vacunado.
La cantidad de partículas virales en la composición de vacuna que va a introducirse en un receptor de la vacuna dependerá de la fuerza de los promotores de la transcripción y traducción utilizados y de la inmunogenicidad del producto génico expresado. En general, se administra directamente en el tejido muscular una dosis inmunológica o profilácticamente eficaz de 1x107 a 1x1012 partículas (es decir, 1x 107, 2x107, 3x107, 5x1071x108, 2x108, 3x108, 5x108 ó 1x109, 2x109, 3x109, 5x109) y preferiblemente de aproximadamente 1x1010 a 1x1011 partículas. También se contemplan inyección subcutánea, introducción intradérmica, impresión a través de la piel y otros modos de administración tales como administración intraperitoneal, intravenosa o por inhalación.
Los vectores adenovirales de chimpancé recombinantes de la presente invención pueden administrarse solos, como parte de un régimen de vacunación de sensibilización/refuerzo de modalidad mixta o en un régimen de vacunación basado en la combinación de múltiples inyecciones de diferentes serotipos de vectores. Normalmente, se administra(n) una(s) dosis de sensibilización que comprende(n) por lo menos un inmunógeno a un hospedador mamífero que necesita una respuesta inmunitaria eficaz frente a un autoantígeno o patógeno particular. Esta dosis sensibiliza de manera eficaz la respuesta inmunitaria de modo que, tras la identificación posterior del/de los antígeno(s), el hospedador puede montar inmediatamente una respuesta inmunitaria potenciada o reforzada frente al inmunógeno. Un esquema de vacunación de modalidad mixta que utiliza formulaciones alternativas para la sensibilización y el refuerzo puede dar como resultado una respuesta inmunitaria potenciada. Las administraciones de sensibilización-refuerzo implican normalmente la sensibilización del sujeto (mediante un vector viral, plásmido, proteína, etc.) por lo menos una vez, dejando que pase un periodo de tiempo predeterminado, y entonces realizar el refuerzo (mediante un vector viral, plásmido, proteína, etc.). Se emplean habitualmente inmunizaciones múltiples, normalmente 1-4, aunque pueden utilizarse más. El periodo de tiempo entre la sensibilización y el refuerzo puede variar normalmente desde aproximadamente cuatro meses hasta un año, aunque pueden utilizarse otros marcos de tiempo tal como apreciará un experto habitual en la materia. Pueden administrarse inyecciones múltiples de cada vector en el plazo de aproximadamente un marco de tiempo de 2 semanas, antes de que la inmunidad neutralizante se haga evidente.
Se divulga que una vacuna se administra más de una administración de vector de vacuna de adenovirus, y puede administrarse en un régimen acompañado por la administración de una vacuna de plásmido. Las vacunas de plásmidos adecuadas para su utilización en combinación con los vectores dados a conocer en la presente memoria comprenden un plásmido que codifica para por lo menos un inmunógeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria sensibilizada o reforzada, en combinación con un promotor heterólogo, que puede dirigir la expresión de las secuencias de ácido nucleico que codifican para el/los inmunógeno(s), funcionalmente unido a la secuencia que codifica para el inmunógeno, y una secuencia de terminador de la transcripción.
Por ejemplo, puede utilizarse un régimen de dosificación que utiliza inyecciones múltiples de diferentes serotipos de vectores adenovirales de chimpancé defectuosos para la replicación. Alternativamente, puede administrarse a un individuo una primera dosis (es decir, una dosis de sensibilización) de una vacuna de plásmidos, y una segunda dosis (es decir, una dosis de refuerzo) que comprende un vector adenoviral de chimpancé recombinante defectuoso para la replicación que comprende una secuencia que codifica para el mismo inmunógeno que se suministró en la vacuna de plásmidos. Alternativamente, puede administrarse al individuo una primera dosis de un vector de vacuna de adenovirus humano que codifica para por lo menos un inmunógeno, seguido por una segunda dosis que comprende un vector adenoviral de chimpancé recombinante defectuoso para la replicación dado a conocer en la presente memoria, que comprende una secuencia codificante para el mismo inmunógeno que se suministró en la dosis de sensibilización. Alternativamente, puede administrarse en primer lugar una composición de vacuna que comprende un vector de la invención, seguido por la administración de una vacuna de plásmidos. En cualquiera de estas divulgaciones, pueden administrarse a un individuo múltiples dosis del mismo inmunógeno o bien en forma de plásmido o bien de vector viral. Puede haber una cantidad de tiempo mínima predeterminada que separa las administraciones.
Además de administrarse una única proteína o antígeno de interés mediante los vectores de adenovirus de chimpancé defectuosos para la replicación, recombinantes, de la presente invención pueden administrarse dos o más proteínas o antígenos o bien mediante vehículos separados o bien administrarse mediante el mismo vehículo. Pueden ligarse múltiples genes/equivalentes funcionales en un plásmido lanzadera apropiado para la generación de un preplásmido de adenovirus que comprende múltiples marcos de lectura abiertos. Los marcos de lectura abiertos para los múltiples genes/equivalentes funcionales pueden estar funcionalmente unidos a distintos promotores y secuencias de terminación de la transcripción.
Tal como se muestra en la presente memoria, los regímenes de inmunización adecuados pueden emplear diferentes serotipos adenovirales. Un ejemplo de un protocolo de este tipo sería una(s) dosis de sensibilización que comprende(n) un vector adenoviral recombinante de un primer serotipo, por ejemplo un ChAd3 o ChAd6 seguido por una dosis de refuerzo que comprende un vector adenoviral de chimpancé recombinante de un segundo serotipo. En una forma de realización alternativa, la dosis de sensibilización puede comprender una mezcla de vehículos adenovirales de chimpancé separadas que comprenden cada uno un gen que codifica para una proteína/un antígeno diferente. En tal caso, la dosis de refuerzo comprendería también una mezcla de vectores que comprende cada uno un gen que codifica para una proteína/un antígeno separado, siempre que la(s) dosis de refuerzo administre(n) vectores virales recombinantes que comprenden material genético que codifica para el mismo conjunto o similar de antígenos que se administraron en la(s) dosis de sensibilización. Estas modalidades de administración de genes/vectores múltiples pueden combinarse adicionalmente. Está adicionalmente dentro del alcance de la divulgación emprender regímenes de modalidad combinada que incluyen componentes múltiples aunque distintos de un antígeno específico.
La utilización de vectores recombinantes derivados de adenovirus de chimpancé que no se neutralizan por la inmunidad preexistente dirigidos contra los elementos virales de vector humano ofrece una alternativa a la utilización de vectores de Ad humanos como portadores de vacuna. Debido a que los adenovirus son sumamente inmunogénicos, los vectores adenovirales son candidatos particularmente buenos para su utilización en el contexto de un portador de vacuna diseñado para romper la tolerancia del hospedador a un autoantígeno. Además, la capacidad para propagar los virus de chimpancé en células humanas, particularmente en la línea celular Per.C6™, con una eficacia comparable a virus humanos, ofrece ventajas considerables tanto desde un punto de vista regulatorio como para la producción a gran escala de compuestos terapéuticos o vacunas. Por consiguiente, la presente invención proporciona una colección de plásmidos, vectores y secuencias adenovirales de chimpancé que permiten la preparación de virus recombinantes que pueden utilizarse, solos o en combinación, como portador de vacuna para vacunación genética.
Los siguientes ejemplos ilustran, pero no limitan la invención.
Ejemplo 1: Aislamiento, clonación, secuenciación y caracterización de ChAd
Aislamiento de adenovirus de chimpancé
Se recogieron muestras de deposiciones en medio de transporte viral (VTM; Microtest M4-R Multi-Microbe Transport Medium, Remel Inc.), luego se congelaron o se congelaron directamente a -70°C en el NIRC (New Iberia Research Center 4401 W. Admiral Doyle Drive New Iberia, LA 70560). Se mantuvieron congeladas las muestras a < -70°C hasta que se procesaron para su inoculación en cultivos celulares. En ese momento, se descongelaron las muestras y entonces se agitaron con vórtex en exceso de medio de transporte viral enfriado. Tras haberse disociado las muestras en suspensiones, se centrifugaron durante 10 min. a 1500-1800 rpm. Se filtraron los sobrenadantes a través de filtros de jeringa de 0,8 y 0,2 pm en serie y entonces se inoculó el material filtrado en cultivos celulares (200-250 pl en viales con tapa y 250-300 pl en cultivos en tubo). Se inoculó cada muestra procesada en cultivos en tubo y cultivos en viales con tapa sembrados con células 293 o células A549.
Se prepararon cultivos control (positivo y negativo) cada vez que se inoculó un conjunto de muestras. Una vez que se habían inoculado todos los viales con tapa en un sistema, se centrifugaron a temperatura ambiente durante 60 10 min. a 2000 rpm (900 x g). Se retiraron los viales de la centrífuga inmediatamente tras detener la rotación del rotor para evitar el daño por calor en los cultivos. Tras la centrifugación, se aspiraron los inóculos de los viales con tapa, utilizando una pipeta Pasteur estéril nueva en cada vial para evitar la contaminación cruzada. Se lavaron los cultivos tres veces utilizando 1,0 ml de medio de cultivo nuevo para cada lavado. Se pipeteó medio nuevo (1,0 ml) en cada vial tras el tercer lavado y se colocaron los viales con tapa en un incubador a 35-37°C durante de tres a cuatro días (aproximadamente 96 h).
Al final del periodo de cultivo, se aspiraron los sobrenadantes de los cultivos y se lavó la capa de células de cada vial dos veces con tampón de ensayo de inmunofluorescencia (IFA) utilizando aproximadamente 1,0 ml de tampón con cada lavado. Se fijaron las células añadiendo 1,0 ml de acetona refrigerada a cada vial (10 min. a 2-8°C). Se marcaron portaobjetos limpiados con acetona con el/los número(s) de identificación de la muestra asociado(s) con los cubreobjetos de vial con tapa. Se procesaron los cubreobjetos de vial con tapa para el marcaje mediante fluorescencia de células infectadas por adenovirus utilizando un anticuerpo de ratón primario anti-adenovirus [MAB8052, Chemicon]. Se evaluaron los portaobjetos con la ayuda de un microscopio de fluorescencia. Se exploró cada preparación utilizando el objetivo 10X observando el grado de cobertura de inmunofluorescencia a través del pocillo (de 1+ a 4+). Se confirmó la presencia o ausencia de inmunofluorescencia específica utilizando el objetivo 40X. Se inocularon cultivos en tubo en la misma secuencia que se describió para los viales con tapa (por ejemplo, control negativo primero, seguido por muestras clínicas y controles positivos). Se dejó que los inóculos se adsorbieran durante 60-120 min. a 36-38°C. Tras el periodo de adsorción, se aspiraron las muestras/los controles de los tubos y se sustituyeron por medio de cultivo nuevo.
De tres a cuatro días tras la inoculación, y una vez a la semana después de eso, se aspiró el medio de los tubos de cultivo y se sustituyó por 1,5 ml de medio nuevo. Se monitorizaron visualmente los tubos de cultivo para detectar CPE por lo menos cada dos días durante por lo menos 21 días tras la inoculación. Los cultivos inoculados con muestras de chimpancé se compararon con los controles y se clasificaron observando el grado de CPE. Los cultivos que no mostraban CPE se pasaron a cultivos en tubo nuevos tras 14 días; los tubos de cultivo que eran negativos para CPE tras 21 días se consideraron negativos. Los tubos de cultivo con CPE 3-4+ se agitaron con vórtex durante 10 segundos. Se rasparon las células de la pared del tubo utilizando una pipeta serológica de 1,0 ml estéril y se suspendieron en el sobrenadante de cultivo. Tras marcar un tubo con tapón a presión de 5 ml con la fecha y el número de identificación de la muestra y almacenarse a -70°C, se transfirieron 500 pl de la suspensión celular del tubo de cultivo al tubo con tapón a presión y se almacenó durante hasta un día a 2-8°C hasta que se procesó utilizando una técnica de anticuerpos inmunofluorescente indirecta para detectar adenovirus (equivalente al procedimiento para teñir viales con tapa).
Amplificación de adenovirus de chimpancé
Se adquirieron adenovirus de chimpancé de tipo natural CV32, CV33, CV23 y CV68 de la ATCC (números de registro de la ATCC: CV32, VR-592; CV-33, v R-593;) o de Esoterix Inc. Austin, Texas y se propagaron aislados originales tal como sigue utilizando la línea celular de expresión de E1 humano PER.C6™ o 293. En resumen, se cultivaron células en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; GibcoBRL, Life Technologies) complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS GibcoBRL, Life Technologies), penicilina-estreptomicina al 1%, glutamina 2 mM y MgCl2 10 mM (Per.C6™). Se llevó a cabo la infección por adenovirus en DMEM complementado con suero de caballo al 5% (GibcoBRL, Life Technologies). Se recogieron el medio y las células infectadas cuando el 100% de las células mostraban efecto citopático (CPE) inducido por el virus y se lisaron mediante tres ciclos de congelación y descongelación.
Se clonaron todas las reservas adenovirales de chimpancé (CV) de tipo natural infectando células 293 sembradas en placas de 96 pocillos, tras el primer pase de amplificación. Se realizó la clonación del virus limitando la dilución del lisado celular obtenido en el primer pase de la amplificación del virus. Se recogieron cinco clones aislados y se propagaron en serie. Tras 3-4 pases de amplificación en serie, se realizó una preparación de adenovirus a gran escala en células plantadas en 5 factorías celulares de dos capas (NUNC) (200 millones de células/factoría celular).
Se obtuvieron partículas virales purificadas del lisado celular mediante dos etapas de ultracentrifugación en gradientes de densidad de cloruro de cesio.
Secuenciación de ADN genómico viral
Se aisló ADN genómico a partir de 3 X 1012 pp de preparación de virus purificado mediante digestión con proteinasa K (0,5 mg/ml) en SDS-TEN al 1 % (2 h a 55°C). T ras una extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol, se resuspendió el ADN genómico en agua y se sometió a secuenciación genómica.
Para la secuenciación del genoma de Ad de longitud completa, se nebulizó el ADN viral purificado para producir fragmentos aleatoriamente cortados. Se hicieron romos los extremos de los fragmentos de ADN con el fragmento klenow de polinucleótido cinasa y ADN polimerasa de E. coli. Se procesaron los fragmentos de extremos romos en un gel de agarosa de bajo punto de fusión para purificar los fragmentos en el intervalo de tamaño de 1-3 kb y se clonaron en el sitio de Smal del vector pUC19 para crear una biblioteca al azar. Se utilizaron los ligamientos para transformar XL1-Blue MRF' competente. Se identificaron colonias positivas mediante selección blanco/azul en agar LB que contenía X-gal e IPTG. Se aislaron de tres a cuatro bloques de 96 pocillos de ADN de plásmido de la biblioteca y se secuenciaron con cebadores directos e inversos pUC. Se examinaron todas las lecturas de secuenciación para determinar la calidad y la secuencia del vector utilizando el paquete de software Phred-Phrap. Las lecturas que pasaron el examen se ensamblaron en cóntigos. Se diseñaron cebadores para secuenciar directamente el a Dn adenoviral para cerrar los huecos y determinar la secuencia de ADN de ambos extremos.
Se obtuvo la secuenciación del genoma viral completo para virus seleccionados incluyendo ChAd3 (SEC ID n° 1), ChAd6 (SEC ID n° 2), CV32 (SEC ID n° 3), CV33 (SEC ID n° 4) y CV23 (SEC ID n° 5). La tabla 1 proporciona datos que resumen el porcentaje de identidad entre las secuencias de nucleótidos de los genomas adenovirales de ChAd3, ChAd6, Pan5 (c V23), Pan6 (CV32), Pan7 (CV33), C1 y C68. Se calcularon alineaciones utilizando el programa ALIGN como parte del paquete FASTA versión 2 (William R. Penson, University of Virginia; Myers & Miller, CABIOS 1989, 4:11-17).
Tabla 1. Porcentaje de identidad de la secuencia de nucleótidos entre genomas de adenovirus de chimpancé
Figure imgf000023_0001
Para caracterizar los nuevos aislados adenovirales (por ejemplo, ChAd20, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82), se determinó también la secuencia de nucleótidos de los genes de hexones y fibras mediante paseo con cebador. Gen de fibras: SEQ ID NOS: 6-15: (SEC ID n° 6, ChAd20); (SEC ID n° 7, ChAd4); SEC ID n°8, ChAd5); SEC ID n° 9, ChAd7); SEC ID n° 10, ChAd9); SEC ID n° 11, ChAd10); SEC ID n° 12, ChAd11); SEC ID n° 13, ChAd16), SEC ID n° 14, ChAd17), SEC ID n° 15, ChAd19) y (SEC ID n° 58, ChAd8), (SEC ID n° 60, ChAd22), (SEC ID n° 62, ChAd24), (SEC ID n° 64, ChAd26), (SEC ID n° 66, ChAd30), (SEC ID n° 68, ChAd31), (SEC ID n° 70, ChAd37), (SEC ID n° 72, ChAd38), (SEC ID n° 74, ChAd44), (SEC ID n° 76, ChAd63) y (SEC ID n° 78, ChAd82). Las figuras 20A-20G proporcionan una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fibras de los aislados de ChAd dados a conocer y reivindicados en la presente memoria.
Las secuencias de genes de hexones se exponen en SEQ ID NOS: 16-25: (SEC ID n° 16, ChAd20); SEC ID n° 17, ChAd4); SEC ID n° 18, ChAd5); SEC ID n° 19, ChAd7); SEC ID n° 20, ChAd9); SEC ID n° 21, ChAd10) SEC ID n° 22, ChAd11); SEC ID n° 23, ChAd16); SEC ID n° 24, ChAd17), SEC ID n° 25, ChAd19), (SEC ID n° 97, ChAd8), (SEC ID n° 99, ChAd22), (SEC ID n° 101, ChAd24), (SEC ID n° 103, ChAd26), (SEC ID n° 105, ChAd30), (SEC ID n° 107, ChAd31), (SEC ID n° 109, ChAd37), (SEC ID n° 111, ChAd38), (SEC ID n° 113, ChAd44), (SEC ID n° 115, ChAd63) y (SEC ID n° 117, ChAd82). Las figuras 31A-31J proporcionan una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de hexones de los aislados de ChAd dados a conocer y reivindicados en la presente memoria.
Clasificación de adenovirus de chimpancé
La clasificación de las diferentes cepas adenovirales de chimpancé sigue la clasificación ya propuesta de serotipos de adenovirus humanos en 6 subgrupos (Horowitz, MS (1990) Adenoviridae and their replication. En Virology B.N. Fields y D.M. Knipe, eds (Raven Press, Nueva York) págs.1679-1740) y se obtuvo mediante alineación de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos utilizando el programa Align X (Informax, Inc).
Se obtuvo una clasificación inicial de los nuevos aislados estudiando el patrón de restricción del genoma viral con diferentes endonucleasas de restricción y mediante análisis de secuencia de la región hipervariable 7 (HVR7) del gen de hexones. Para este fin, se diseñaron dos cebadores en las regiones sumamente conservadas que flanqueaban HVR7: TGTCCTACCARCTCTTGCTTGA (SEQ ID NO. 45) y GTGGAARGGCACGTAGCG (SEQ ID NO. 46). Se amplificó la HVR7 mediante PCR utilizando ADN viral purificado o lisado de 293 bruto como molde y entonces se secuenció. Basándose en el análisis de secuencia de HVR7, se clasificaron los nuevos virus aislados en los subgrupos (A-F) propuestos para virus Ad humanos (Horowitz, MS (1990) Adenoviridae and their replication. En Virology B.N. Fields y D.M. Knipe, eds (raven Press, Nueva York) págs.1679-1740).
Se obtuvo el árbol filogenético presentado en la figura 35 mediante alineación de las secuencias de aminoácidos de hexones de adenovirus de chimpancé y humanos. Los resultados concuerdan con la clasificación inicial basada en la alineación de la secuencia de nucleótidos limitada a HVR7 de hexones utilizando el programa Align X (Informax, Inc). Se dedujo el árbol a partir de una alineación de secuencias múltiples de secuencias de péptidos de hexones de longitud completa utilizando PAUPSEARCH (Wisconsin Package versión 10.3, Accelrys Inc.) y se visualizó y manipuló con TREEVIEW. Se realizó análisis de confianza bootstrap utilizando el programa PAUPSEARCH tal como se implementa en el paquete Wisconsin. Para cada una de las alineaciones, se ejecutó el programa en 1000 duplicados utilizando la “búsqueda heurística” como criterio de búsqueda y la parsimonia máxima como el criterio de optimalidad y se tomaron valores de confianza notificados a partir de un consenso según la regla de la mayoría del 50%.
Ejemplo 2: Vector lanzadera de ChAd y construcción y rescate del vector de expresión
Construcción y rescate de vector
Se clonó ADN genómico viral en un vector de plásmido convencional mediante recombinación homóloga con un vector lanzadera apropiado que contenía secuencias de ADN viral derivadas tanto del extremo izquierdo como del extremo derecho del genoma viral (figura 2). Tal como se describe más en detalle a continuación, se aprovechó la homología de secuencia observada entre virus clasificados en el mismo subgrupo de serotipo para desarrollar vectores lanzadera específicos de grupo. El ADN genómico viral de adenovirus de chimpancé clasificado en el subgrupo D y E resultó ser suficientemente homólogo como para permitir la construcción de un vector lanzadera común con el fin de clonar virus que pertenecen a ambos subgrupos.
Construcción de un vector lanzadera del subgrupo E/D
Se secuenció completamente el genoma viral de ChAd6 (SEC ID n° 2) y se utilizó la información obtenida para construir un vector lanzadera para facilitar la clonación mediante recombinación homóloga de adenovirus de chimpancé del subgrupo D y E.
La construcción del vector lanzadera de ChAd6, denominado en la presente memoria pARS ChAd6-3, se describe en figura 1. La figura 32 proporciona una lista de las secuencias de oligonucleótidos (SEQ ID NOS: 26-40 y SEQ ID NOS: 45-46) utilizadas en los experimentos de clonación descritos en la presente memoria. En resumen, se amplificaron 457 pb que se derivaban del extremo izquierdo del ADN de ChAd6 mediante PCR con los oligonucleótidos 5' -AT GGAATT CGTTTAAAC CATCAT C AATAATATACCTC-3 (SEC ID n° 27) y 5'-CGCTGGCACTCAAGAGTGGCCTC-3' (SEC ID n° 28) digeridos con EcoRI y SnaBI y se clonaron en pNEBAd35-2 cortado con EcoRI-SnaBI, generando pNEBChAd6-LI. Se amplificó la It R derecha de ChAd6 (pb 36222 a pb 36648) mediante PCR utilizando los oligonucleótidos: 5'-ATGAAGCTTGTTTAAACCCAT CATCAATAATATACCT-3 '(SEC ID n° 29) y 5'-ATCTAGACAGCGTCCATAGCTTACCG-3' (SEC ID n° 30) digeridos con las enzimas de restricción HindIII y XbaI y se clonó en pNEBChAd6-LI digerido con HindIII-XbaI generando así pNEBChAd6-RLI. Finalmente, se amplificó el fragmento de ADN correspondiente a los nucleótidos 3426-3813 de la secuencia de ADN genómico de ChAd6 con los oligonucleótidos: 5' AT GCT ACGTAGCGATCGCGT GAGT AGT GTTT GGGGGT GGGT GGG-3' (SEC ID n° 31) y 5'-TAGGCGCGCCGCTTCTCCTCGTTCAGGCTGGCG-3' (SEC ID n° 32), digeridos con SnaBI y AscI, entonces se ligó con pNEBChAd6-RLI digerido con SnaBI-AscI generando así pNEBChAd6-RLIdE1.
Para mejorar la eficacia de la recombinación y la propagación de plásmidos en la cepa de E. coli DH5a, se cortó el fragmento de 1306 pb que contenía las ITR tanto izquierda como derecha de ChAd6 así como el fragmento del gen pIX mediante digestión con PmeI a partir de pNEBChAd6-RLIdE1 y se transfirió a un vector de plásmido diferente obtenido mediante amplificación por PCR con los oligonucleótidos 5'-GATCTAGTTAGTTTAAACGAATTCGGATCTGCGACGCG-3' (SEC ID n° 33) y 5' TTCGATCATGTTTAAACGAAATTAAGAATTCGGATCC-3' (SEC ID n° 34) a partir de pMRKAd5SEAP. Esta etapa de ligamiento final generó el vector lanzadera de ChAd6 pARSChAd6-3.
Construcción de un vector lanzadera del subgrupo C
Se secuenció completamente el genoma viral de ChAd3 (SEC ID n° 1) y se utilizó la información obtenida para construir un vector lanzadera para facilitar la clonación mediante recombinación homóloga de adenovirus de chimpancé del subgrupo C.
En resumen, el vector lanzadera utilizado para clonar adenovirus de chimpancé del subgrupo C, denominado en la presente memoria pChAd3EGFP, se construyó tal como sigue: se amplificó un fragmento de ADN de ChAd3 (nt 3542-4105) que contenía la región codificante de pIX mediante PCR con los oligonucleótidos 5'-T ATT CT GCGATCGCTGAGGT GGGT GAGT GGGCG-3' (SEC ID n° 35) y 5'-TAGGCGCGCCCTTAAACGGCATTTGTGGGAG-3' (SEC ID n° 36) digeridos con Sgfl-AscI, entonces se clonó en pARSCV32-3 digerido con SgfI-AscI, generando pARS-ChAd3D. Se amplificó el extremo derecho de ChAd3 (nt 37320-37441) mediante PCR con los oligonucleótidos 5'-CGTCTAGAAGACCCGAGTCTTACCAGT-3' (SEC ID n° 37) y 5'-CGGGATCCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTTATT-3' (SEC ID n° 38) digeridos con XbaI y BamHI, entonces se ligó con pARS-ChAd3D restringido con XbaI y BamHI, generando pARS-ChAd3RD. Se amplificó el extremo izquierdo del ADN viral de ChAd3 (nt 1-460) mediante PCR con los oligonucleótidos 5'-AT GGAATTCGTTT AAACCAT CAT CAAT AAT AT ACCTT-3' (SEC ID n° 39) y 5'-ATGACGCGATCGCTGATATCCTATAATAATAAAACGCAGACTTTG-3' (SEC ID n° 40) digeridos con EcoRI y SgfI, entonces se clonó en pARS-ChAd3RD digerido con EcoRI y Sgfl, generando así pARS-ChAd3RLD. Se diseñó también el casete de ADN viral para que contuviese sitios de enzimas de restricción (PmeI) ubicados en el extremo de ambas ITR de modo que la digestión liberase ADN viral a partir de ADN de plásmido.
Construcción de un vector lanzadera del subgrupo B
La construcción de una lanzadera del subgrupo B siguió la estrategia ya descrita para las construcciones de lanzadera de los subgrupos C y D/E. En resumen, se modificó pARS-ChAd3RLD sustituyendo el extremo izquierdo, la región de pIX, el extremo derecho con los fragmentos correspondientes de ChAd30. Además, se sustituyó la región E4 de ChAd30 con E4orf6 de Ad5 que se clonó bajo el control del promotor de E4 de ChAd30. El plásmido lanzadera se denominó plásmido lanzadera pChAd30 EGFP.
Construcción de vectores adenovirales de chimpancé AE1
Subgrupo B: Se construyeron vectores de adenovirus de chimpancé del subgrupo B mediante recombinación homóloga en la cepa BJ5183 de E. coli. Se cotransformaron células BJ5183 con el vector lanzadera pChAd30EGFP digerido con BstEII y Bst1107I y ADN viral purificado de ChAd8 y ChAd30. La recombinación homóloga entre genes pIX, secuencias de ADN de la ITR derecha presentes en los extremos de la lanzadera pChAd30EGFP linealizada y ADN genómico viral permitió su inserción en el vector de plásmido, eliminando al mismo tiempo la región E1 que se sustituyó por el casete de expresión de EGFP. Se construyeron casetes de expresión basados en el promotor de citomegalovirus humano (CMVH) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (Bgh poliA) para expresar fosfatasa alcalina secretada (SEAP), EGFP, gag de VIH, región NS de VHC (tal como se describe en la figura 3 para vectores lanzadera de ChAd6) así como antígenos asociados a tumor como CEA y HER2/neu de origen humano y de mono rhesus. Se insertaron todos los casetes de expresión en vectores de ChAd30 mediante recombinación homóloga.
Subgrupo C: Se construyeron vectores de adenovirus de chimpancé del subgrupo C mediante recombinación homóloga en la cepa BJ5183 de E. coli. Se cotransformaron células BJ5183 con el vector lanzadera pChAd3EGFP digerido con BstEII y Bst1107I y ADN viral purificado de ChAd3, ChAd11, ChAd19 y ChAd20. La recombinación homóloga entre genes pIX, secuencias de ADN de ITR derecha presentes en los extremos de pChAd3EGFP linealizado y ADN genómico viral permitió su inserción en el vector de plásmido, eliminando al mismo tiempo la región E1 que se sustituyó por el casete de expresión de EGFP. Se construyeron casetes de expresión basados en el promotor de citomegalovirus humano (CMVH) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (Bgh poliA) para expresar fosfatasa alcalina secretada (SEAP), EGFP, gag de VIH, región NS de VHC (tal como se describe en la figura 3 para vectores lanzadera de ChAd6) así como antígenos asociados a tumor como CEA y HER2/neu de origen humano y de mono rhesus.
Subgrupos D y E: Con el fin de construir vectores AE1 basados en adenovirus de chimpancé del subgrupo D y E, se digirió el vector lanzadera pARS ChAd6-3 con AscI y se cotransformó en la cepa BJ5183 de E. coli con ADN viral purificado de CV32, CV33, CV68, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd9, ChAd10 y ChAd16. La recombinación homóloga entre secuencias de ADN de genes pIX e ITR derecha presente en los extremos de pARS ChAd6-3 linealizado y ADN genómico viral permitió su inserción en el vector de plásmido, eliminando al mismo tiempo la región E1 (figuras 2 y 4). Se construyeron casetes de expresión basados en el promotor de citomegalovirus humano (CMVH) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (Bgh poliA) para expresar fosfatasa alcalina secretada (SEAP), EGFP, gag de VIH, región NS de VHC (figura 3) así como antígenos asociados a tumor como CEA y HER2/neu de origen humano y de mono rhesus. Se insertaron todos los casetes de expresión en el sitio SnaBI único del vector pARS ChAd6-3 que va a transferirse mediante recombinación homóloga en los preplásmidos de adenovirus AE1 tal como se describe en la figura 4.
Rescate y amplificación de vectores AE1
Se transfectaron 5X106 células PER.C6™ plantadas en placas de cultivo celular de 6 cm con 10 microgramos de vector viral clonado liberado de secuencias de plásmido mediante digestión con endonucleasas. Se realizó la transfección del ADN utilizando lipofectamina (Invitrogen). Se recogieron el medio de cultivo y las células transfectadas 5-10 días tras la transfección y se lisaron mediante congelación-descongelación. Se amplificaron entonces los vectores rescatados mediante pase en serie en células 293 o PER.C6™. Se realizó una amplificación a gran escala infectando células plantadas en 5-10 factorías celulares (NUNC, Inc.) sobre un total de 1-2x109 células. Se obtuvo una preparación de vector purificado en gradiente de cloruro de cesio mediante dos rondas de ultracentrifugación, se dializó frente a PBS que contenía glicerol al 10% y se almacenó a -70°C en alícuotas.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación (ChAd) que comprende un genoma adenoviral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido como se expone en SEC ID n° 57 o 96 y un transgén que codifica por lo menos un inmunógeno, en el que dicho vector está modificado en que por lo menos un gen adenoviral seleccionado de entre el grupo que consiste en E1, E2, E3 y E4 adenovirales es eliminado funcionalmente.
2. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación según la reivindicación 1, en el que el genoma adenoviral comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido como se expone en s Ec ID n°: 57.
3. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación según la reivindicación 1, en el que el genoma adenoviral comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido como se expone en s Ec ID n°: 96.
4. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación según la reivindicación 1, en el que el genoma adenoviral comprende una secuencia de nucleótidos que codifica péptidos como se expone en SEC ID n°: 57 y 96.
5. Vector adenoviral defectuoso para la replicación según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, en el que el genoma adenoviral comprende la secuencia de nucleótidos como se expone en SEC ID n°: 25.
6. Vector adenoviral defectuoso para la replicación según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4, en el que el genoma adenoviral comprende la secuencia de nucleótidos como se expone en SEC ID n°: 15.
7. Vector adenoviral defectuoso para la replicación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por una eliminación funcional en la secuencia de nucleótidos de E1.
8. Célula hospedadora que comprende un vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha célula hospedadora expresa una o más regiones adenovirales seleccionadas de entre el grupo que consiste en E1a, E1b, E2a, E2b, E4 orfs 1,2, 3, 4, 5, 6, 6/7, pIX, IVa2, regiones L1, L2, L3, L4, L5.
9. Genoma de adenovirus recombinante aislado que comprende:
a) una secuencia de gen de hexón que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEC ID n°: 25; y/o
b) una secuencia de gen de fibra que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEC ID n°: 15.
10. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación según la reivindicación 7, para su utilización en un procedimiento de refuerzo de una respuesta inmunitaria específica de antígeno en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad suficiente de dicho vector de ChAd, en el que la administración de dicho vector de ChAd produce una respuesta reforzada.
11. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación para su utilización en un procedimiento según la reivindicación 10, en el que el vector de ChAd comprende una eliminación completa de sus genes E1 y en el que además el vector comprende opcionalmente una eliminación de sus genes E3.
12. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación para su utilización en un procedimiento según la reivindicación 9 o 10, en el que la respuesta inmunitaria reforzada comprende la producción de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno.
13. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su utilización en un procedimiento de producción de una respuesta inmunitaria en un mamífero sin tratamiento previo que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad suficiente de dicho vector de ChAd, en el que la administración de dicho vector de ChAd produce una respuesta inmunitaria primaria.
14. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación para su utilización en un procedimiento según la reivindicación 13, en el que la respuesta inmunitaria primaria es específica para un antígeno derivado de un agente infeccioso tal como, pero no limitado a, VIH, VHC, VPH, VHS1, VHS2, SARS CoV, Plasmodium malariae, virus del Ébola, virus del Nilo Occidental, virus del Dengue, gripe A, gripe B, Mycobacterium tuberculosis.
15. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su utilización en un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria contra un antígeno derivado de un agente infeccioso seleccionado de entre el grupo que consiste en: VIH, VHC, VPH, VHS1, VHS2, SARS, Plasmodium malariae, virus del Ébola, virus del Nilo Occidental, virus del Dengue, gripe A, gripe B y Mycobacterium tuberculosis mediante:
(a) sensibilización de un hospedador para responder a un agente infeccioso-antígeno administrando una primera composición de vacuna que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un agente infeccioso-antígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria específica de antígeno; y
(b) refuerzo de la respuesta inmunitaria de la etapa (a) administrando una segunda composición de vacuna que comprende el vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación según las reivindicaciones 1 a 7 que contiene por lo menos una eliminación funcional de su gen E1, y en el sitio de la eliminación del gen E1, una secuencia que comprende un promotor que puede dirigir la expresión de ADN que codifica el mismo agente infeccioso-antígeno suministrado en la etapa de sensibilización.
16. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su utilización en un procedimiento de rotura de la tolerancia del hospedador a un autoantígeno mediante: (a) sensibilización de un hospedador para responder a un autoantígeno administrando una primera composición de vacuna que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un autoantígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria específica de antígeno, produciendo así una respuesta sensibilizada; y (b) refuerzo de la respuesta inmunitaria sensibilizada de la etapa (a) administrando una segunda composición de vacuna que comprende el vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación según las reivindicaciones 1 a 7 que contiene por lo menos una eliminación funcional de su gen E1, y en el sitio de la eliminación del gen E1, una secuencia que comprende un promotor que puede dirigir la expresión de ADN que codifica el mismo autoantígeno suministrado en la etapa de sensibilización, en el que la administración de la composición de refuerzo produce una respuesta inmunitaria que presenta el efecto de rotura de la tolerancia del hospedador al autoantígeno.
17. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación para su utilización en un procedimiento según la reivindicación 16 en el que la segunda composición de vacuna comprende un vector de ChAd que comprende ADN que codifica un autoantígeno seleccionado de entre el grupo que consiste en: HER2 NEU, CEA, HEPCAM, PSA, PSMA, TELOMERASA, GP100, MELAN-A/MART-1, MUC-1, NY-ESO-1, SURVIVINA, ESTROMELISINA 3, TIROSINASA, MAGE3, CML68, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NY-CO-58, NY-BR-62, HKLP2, 5T4 y VEGFR2
18. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación para su utilización en un procedimiento según la reivindicación 15 o 16, en el que la respuesta inmunitaria comprende la producción de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno.
19. Vector adenoviral de chimpancé defectuoso para la replicación para su utilización en un procedimiento según la reivindicación 16 o 17 en el que las primera y segunda composiciones de vacuna son ambas unos vectores adenovirales caracterizados por diferentes serotipos.
ES17156766T 2004-01-23 2005-01-18 Portadores de vacuna de adenovirus de chimpancé Active ES2871907T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53879904P 2004-01-23 2004-01-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2871907T3 true ES2871907T3 (es) 2021-11-02

Family

ID=34807229

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17156766T Active ES2871907T3 (es) 2004-01-23 2005-01-18 Portadores de vacuna de adenovirus de chimpancé
ES05701091T Active ES2337374T3 (es) 2004-01-23 2005-01-18 Portadores de vacunas de adenovirus de chimpance.
ES09176105.6T Active ES2627288T3 (es) 2004-01-23 2005-01-18 Portadores de vacuna de adenovirus de chimpancé

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05701091T Active ES2337374T3 (es) 2004-01-23 2005-01-18 Portadores de vacunas de adenovirus de chimpance.
ES09176105.6T Active ES2627288T3 (es) 2004-01-23 2005-01-18 Portadores de vacuna de adenovirus de chimpancé

Country Status (17)

Country Link
US (2) US8216834B2 (es)
EP (3) EP3269390B1 (es)
JP (4) JP4814800B2 (es)
CN (3) CN101014613B (es)
AT (1) ATE449105T1 (es)
AU (2) AU2005206292B2 (es)
CA (5) CA2880061C (es)
CY (2) CY1109841T1 (es)
DE (1) DE602005017743D1 (es)
DK (2) DK1711518T3 (es)
ES (3) ES2871907T3 (es)
HU (1) HUE033576T2 (es)
LT (1) LT2163260T (es)
PL (2) PL1711518T3 (es)
PT (2) PT1711518E (es)
SI (2) SI1711518T1 (es)
WO (1) WO2005071093A2 (es)

Families Citing this family (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2880061C (en) * 2004-01-23 2018-03-13 Agostino Cirillo Chimpanzee adenovirus vaccine carriers
US9056090B2 (en) 2005-06-17 2015-06-16 Msd Italia Srl Hepatitis C virus nucleic acid vaccine
US20090104153A1 (en) * 2005-12-21 2009-04-23 Barber Karen A Method of eliciting immune response
GB0706914D0 (en) 2007-04-10 2007-05-16 Isis Innovation Novel adenovirus vectors
GB0719526D0 (en) 2007-10-05 2007-11-14 Isis Innovation Compositions and methods
US20100285050A1 (en) 2007-10-05 2010-11-11 Isis Innovation Limited Compositions and Methods
DK2220241T3 (en) * 2007-11-28 2017-01-09 Univ Pennsylvania Adenovirus comprising a simian adenovirus E-SAdV-39-capsidhexonprotein and uses thereof
KR101614362B1 (ko) 2007-11-28 2016-04-22 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 유인원 아과 ｂ 아데노바이러스 ｓａｄｖ-28,27,-29,-32,-33, 및 -35 및 그것의 사용
EP2463362B1 (en) * 2007-11-28 2017-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian subfamily c adenovirus SAdv-31 and uses thereof
AU2014203073B2 (en) * 2007-11-28 2016-07-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian E adenovirus SAdV-30
WO2009071613A2 (en) * 2007-12-06 2009-06-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
US8470310B2 (en) 2008-03-04 2013-06-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses SAdV-36, -42.1, -42.2, and -44 and uses thereof
US9758794B2 (en) 2008-04-22 2017-09-12 Rutgers, The State University Of New Jersey HCV E2 construct compositions and methods
CA2722423A1 (en) * 2008-04-22 2009-10-29 Rutgers, The State University Hcv e2 construct compositions and methods
EP2350269B1 (en) * 2008-10-31 2015-09-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses with sadv-46 hexon capsid proteins and uses thereof
US20110229508A1 (en) 2008-11-26 2011-09-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Polypeptides for inducing a protective immune response against staphylococcus aureus
CN102292105A (zh) 2008-11-26 2011-12-21 默沙东公司 用于诱导抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽
WO2010085984A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Okairos Ag Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
LT2391638T (lt) * 2009-02-02 2018-10-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Beždžionių adenoviruso nukleorūgšties ir aminorūgščių sekos, vektoriai, turintys sekas ir jų panaudojimas
JP5882741B2 (ja) * 2009-02-02 2016-03-09 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム サルアデノウイルスの核酸配列及びアミノ酸配列、それを含有するベクター、並びにその使用
US8846031B2 (en) * 2009-05-29 2014-09-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus 41 and uses thereof
WO2011057254A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
WO2011057248A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 Genvec, Inc. Simian adenovirus and methods of use
EP3466440A1 (en) * 2010-04-16 2019-04-10 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Chimpanzee adenoviral vector-based filovirus vaccines
JP2012044910A (ja) * 2010-08-25 2012-03-08 Chubu Food & Environmental Safety Center Co Ltd ネコカリシウイルス遺伝子の発現用ベクター及びこれを用いたウイルスの製造方法
SI3536703T1 (sl) 2010-11-12 2022-04-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Konsenzni prostatični antigeni, molekule nukleinske kisline, ki jih kodirajo in uporabe le-teh
AU2011332025B2 (en) 2010-11-23 2015-06-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily E simian adenoviruses A1321, A1325, A1295, A1309 and A1322 and uses thereof
WO2012089231A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Okairòs Ag Paramyxovirus vaccines
US10183069B2 (en) * 2011-03-21 2019-01-22 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
KR102104650B1 (ko) * 2011-03-21 2020-04-24 알티뮨 인크. 급속 및 지속적 면역학적제제-치료제
GB201108879D0 (en) 2011-05-25 2011-07-06 Isis Innovation Vector
CN103702683B (zh) 2011-07-01 2017-07-04 生物权威(澳大利亚)有限责任公司 联合治疗
TWI623618B (zh) 2011-07-12 2018-05-11 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
WO2013045668A2 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
WO2013045658A1 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
BR112014008249B1 (pt) * 2011-10-05 2022-03-15 Genvec Inc Adenovírus ou vetor adenoviral e composição com os mesmos
US20130122038A1 (en) 2011-11-14 2013-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
SI2825640T1 (sl) 2012-03-12 2016-08-31 Crucell Holland B.V. Šarže rekombinantnega adenovirusa s spremenjenimi konci
SG11201406592QA (en) 2012-05-04 2014-11-27 Pfizer Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens
WO2013173702A2 (en) 2012-05-18 2013-11-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily e simian adenoviruses a1302, a1320, a1331 and a1337 and uses thereof
WO2014005643A1 (en) 2012-07-05 2014-01-09 Okairos Ag Novel prime-boosting regimens involving immunogenic polypeptides encoded by polynucleotides
HRP20211756T1 (hr) 2012-07-05 2022-02-18 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novi senzibilizacijsko-pojačivački režimi koji uključuju imunogene polipeptide koje kodiraju polinukleotidi
WO2014009433A1 (en) 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant
CN104640564B (zh) 2012-07-10 2020-08-04 特兰斯吉恩股份有限公司 分枝杆菌抗原疫苗
GB201217868D0 (en) * 2012-10-05 2012-11-21 Isis Innovation Staphyolococcus aureus antigens
CN105189755A (zh) * 2013-01-15 2015-12-23 加利福尼亚大学董事会 腺病毒及其用途
US9402888B2 (en) 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
WO2014153204A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
WO2014139587A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Okairòs Ag Improved poxviral vaccines
PT2988780T (pt) 2013-04-25 2019-03-25 Janssen Vaccines & Prevention Bv Polipeptídeos f de pré-fusão do rsv solúveis estabilizados
GB201310031D0 (en) * 2013-06-05 2013-07-17 Pirbright Inst The Cell
US9592327B2 (en) 2013-09-06 2017-03-14 Cardiac Pacemakers, Inc. Systems and methods for heart failure management
SG11201602625YA (en) * 2013-11-01 2016-05-30 Pfizer Vectors for expression of prostate-associated antigens
US10765731B2 (en) 2014-01-09 2020-09-08 Transgene Sa Fusion of heterooligomeric mycobacterial antigens
US11571472B2 (en) 2014-06-13 2023-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combinations
SI3656395T1 (sl) 2014-09-03 2024-03-29 Bavarian Nordic A/S Metode in sestavki za spodbujanje zaščitne imunosti pred okužbo s filovirusom
MX2017002890A (es) 2014-09-03 2017-11-13 Bavarian Nordic As Métodos y composiciones para potenciar respuestas inmunitarias.
WO2017025782A1 (en) 2014-09-17 2017-02-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Improved poxviral vaccines
KR101971808B1 (ko) 2014-09-26 2019-04-23 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터 인크 인간 면역 결핍 바이러스 감염에 대한 방어 면역을 유도하기 위한 방법 및 조성물
SI3200815T1 (sl) 2014-10-02 2021-11-30 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Postopki in sestavki za zdravljenje raka
EP3242940B1 (en) * 2015-01-09 2023-03-29 Etubics Corporation Methods and compositions for combination immunotherapy
GB201501523D0 (en) * 2015-01-30 2015-03-18 Univ Plymouth Differential immune response modulation
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
EP3283634B1 (en) 2015-04-14 2019-05-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter
US11149087B2 (en) 2015-04-20 2021-10-19 Etubics Corporation Methods and compositions for combination immunotherapy
US11000560B2 (en) * 2015-05-04 2021-05-11 Vcn Biosciences, S.L. Oncolytic adenoviruses with mutations in immunodominant adenovirus epitopes and their use in cancer treatment
US11559570B2 (en) 2015-05-15 2023-01-24 CureVac SE Prime-boost regimens involving administration of at least one mRNA construct
CA2988654A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Adenovirus polynucleotides and polypeptides
GB201514772D0 (en) * 2015-08-19 2015-09-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Adenovirus polynucleotides and polypeptides
BE1024824B1 (fr) * 2015-06-12 2018-07-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Polynucleotides et polypeptides d'adenovirus
ES2839880T3 (es) 2015-07-07 2021-07-06 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vacuna contra el VRS
CA2991540A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized soluble pre-fusion respiratory syncytial sirus polypeptides
GB201513010D0 (en) * 2015-07-23 2015-09-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel formulation
GB201513176D0 (en) * 2015-07-27 2015-09-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
SG10202109457RA (en) 2015-12-15 2021-10-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Human immunodeficiency virus antigens, vectors, compositions, and methods of use thereof
AU2017208848A1 (en) 2016-01-19 2018-07-12 Pfizer Inc. Cancer vaccines
EP3416668A4 (en) 2016-02-18 2020-02-19 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF MELANOMA
JP7015551B2 (ja) 2016-02-23 2022-02-15 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ ウイルス動態への影響を最小限にするための治療用アデノウイルスにおける外因性遺伝子発現
CA3013637A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
HRP20230197T1 (hr) 2016-03-31 2023-03-31 The European Molecular Biology Laboratory Nosači za dostavu izvedeni iz omotača adenovirusnog proteina
EA039095B1 (ru) 2016-04-05 2021-12-03 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Стабилизированные растворимые f-белки rsv до слияния
SG11201807912SA (en) 2016-04-05 2018-10-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vaccine against rsv
US20190134190A1 (en) 2016-05-04 2019-05-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
CN109154000B (zh) 2016-05-12 2022-07-05 扬森疫苗与预防公司 有效和平衡的双向启动子
KR102421049B1 (ko) 2016-05-30 2022-07-15 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 융합-전 rsv f 단백질
AU2017283118B2 (en) 2016-06-20 2019-02-07 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
GB2549809C (en) 2016-06-23 2022-11-30 Univ Oxford Innovation Ltd Vector
US10925955B2 (en) 2016-07-15 2021-02-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against a Marburg virus infection
EP3484507A1 (en) 2016-07-15 2019-05-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection
CN107753941A (zh) * 2016-08-19 2018-03-06 中国科学院上海巴斯德研究所 基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗
WO2018037045A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Fusion peptides with antigens linked to short fragments of invariant chain (cd74)
US11466292B2 (en) 2016-09-29 2022-10-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions and methods of treatment
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
WO2018069316A2 (en) 2016-10-10 2018-04-19 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
CN110545810A (zh) * 2016-11-23 2019-12-06 磨石肿瘤生物技术公司 新抗原的病毒递送
GB201620968D0 (en) 2016-12-09 2017-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adenovirus polynucleotides and polypeptides
BR112019010275A2 (pt) * 2016-12-09 2019-09-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa adenovírus recombinante, composição, uso do adenovírus ou composição, método de induzir uma resposta imune em um paciente, e, adenovírus de símio não humano
WO2018111767A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
GB201701239D0 (en) * 2017-01-25 2017-03-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel formulation
AU2018217935B2 (en) 2017-02-09 2020-04-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
WO2018185732A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Mva-bn and ad26.zebov or ad26.filo prime-boost regimen
PE20191842A1 (es) 2017-05-08 2019-12-31 Gritstone Oncology Inc Vectores de neoantigeno de alfavirus
WO2018210871A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
US11229692B2 (en) 2017-05-17 2022-01-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against RSV infection
CN110958887B (zh) 2017-06-15 2023-10-31 扬森疫苗与预防公司 编码hiv抗原的痘病毒载体及其使用方法
BR112020000145A2 (pt) 2017-07-05 2020-07-14 Nouscom Ag polinucleotídeos, adenovírus isolado, partícula semelhante a vírus, vetor, composição, célula e método in vitro para a produção de um adenovírus ou de uma partícula semelhante a adenovírus
AU2018300295A1 (en) 2017-07-11 2020-01-23 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising CEA MUC1 and TERT
EP3651798A1 (en) 2017-07-12 2020-05-20 Nouscom AG Neoantigen vaccine composition for treatment of cancer
WO2019016756A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa ANTIGEN CONSTRUCTS OF CHIKUNGUNYA VIRUSES
BR112020001052A2 (pt) 2017-07-28 2020-09-08 Janssen Vaccines & Prevention B.V. métodos e composições para imunizações heterólogas com reprna
SG11202001458SA (en) 2017-09-15 2020-03-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Method for the safe induction of immunity against rsv
SG11202003609VA (en) * 2017-10-25 2020-05-28 Nouscom Ag Eukaryotic cell line
JP7285833B2 (ja) 2017-10-31 2023-06-02 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー アデノウイルス及びその用途
EP3703722A1 (en) 2017-10-31 2020-09-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
US11459583B2 (en) 2017-10-31 2022-10-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
WO2019086456A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
AU2018358019B2 (en) 2017-11-03 2023-05-11 Nouscom Ag Vaccine T cell enhancer
US10864263B2 (en) 2017-11-20 2020-12-15 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Method of providing safe administration of adenoviral vectors encoding a zika virus antigen
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
MA51312A (fr) 2017-12-19 2020-10-28 Bavarian Nordic As Méthodes et compositions permettant d'induire une réponse immunitaire contre le virus de l'hépatite b (vhb)
BR112020012361A2 (pt) 2017-12-20 2020-11-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. constructos de antígeno do vírus epstein-barr
CN111818943A (zh) 2018-01-04 2020-10-23 伊科尼克治疗公司 抗组织因子抗体、抗体-药物缀合物及相关方法
JP2021525076A (ja) * 2018-05-23 2021-09-24 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド 共有抗原
MX2020013553A (es) * 2018-06-12 2021-02-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Polinucleotidos y polipeptidos de adenovirus.
EP3581201A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof
CN110616198B (zh) * 2018-06-19 2021-02-19 清华大学 一种基于黑猩猩腺病毒68型和MERS-CoV全长膜蛋白的新型冠状病毒疫苗
EP3587581A1 (en) 2018-06-26 2020-01-01 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Formulations for simian adenoviral vectors having enhanced storage stability
US11713469B2 (en) 2018-07-20 2023-08-01 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant adenoviral vector expressing Zika antigen with improved productivity
GB201812647D0 (en) * 2018-08-03 2018-09-19 Chancellor Masters And Scholars Of The Univ Of Oxford Viral vectors and methods for the prevention or treatment of cancer
CN112955177A (zh) 2018-10-19 2021-06-11 Nouscom股份公司 真骨鱼恒定链癌症疫苗
CN113424264B (zh) 2018-11-15 2024-04-12 Nouscom股份公司 用于生成个性化癌症疫苗的癌症突变选择
EP3897846A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 GlaxoSmithKline Biologicals SA Methods of inducing an immune response
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2020178359A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b immunisation regimen and compositions
AU2020282369A1 (en) * 2019-05-30 2022-01-20 Gritstone Bio, Inc. Modified adenoviruses
CN112410375A (zh) * 2019-08-22 2021-02-26 苏州相奕生物技术有限公司 腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用
AR120096A1 (es) * 2019-09-30 2022-02-02 Gilead Sciences Inc Vacunas para vhb y métodos de tratamiento de vhb
AU2020358474A1 (en) 2019-10-03 2022-04-07 Batavia Biosciences B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
CA3161800A1 (en) 2019-11-18 2021-05-27 Janssen Biotech, Inc. Vaccines based on mutant calr and jak2 and their uses
WO2021119545A1 (en) * 2019-12-11 2021-06-17 Gritstone Bio, Inc. Durable vaccination
CN113088538A (zh) * 2020-01-08 2021-07-09 怡道生物科技(苏州)有限公司 一种基于黑猩猩ChAd3型腺病毒的表达载体及其构建方法
CN113088530A (zh) * 2020-01-08 2021-07-09 怡道生物科技(苏州)有限公司 一种基于黑猩猩ChAd63型腺病毒的表达载体及其构建方法
CN111394334B (zh) * 2020-01-10 2022-02-15 中山大学 抑制ezh2活性的抗肿瘤多肽及其应用
US11498944B2 (en) 2020-01-31 2022-11-15 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing and treating coronavirus infection—SARS-CoV-2 vaccines
IL293571A (en) 2020-02-04 2022-08-01 Curevac Ag Corona virus vaccine
TW202144389A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途
TW202144388A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途
US20210283244A1 (en) * 2020-02-23 2021-09-16 Guangzhou N Biomed Ltd. Adenovirus-vectored vaccine for preventing sars-cov-2 infection
IL296752A (en) * 2020-04-03 2022-11-01 Gritstone Bio Inc Antigens and vaccines for infectious diseases
WO2021209897A1 (en) 2020-04-13 2021-10-21 Janssen Biotech, Inc. Psma and steap1 vaccines and their uses
WO2021228842A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized coronavirus spike protein fusion proteins
AU2021279312A1 (en) 2020-05-29 2022-12-15 CureVac SE Nucleic acid based combination vaccines
US20230233661A1 (en) 2020-06-29 2023-07-27 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine combination against repiratory syncytial virus infection
CN113897388A (zh) * 2020-07-06 2022-01-07 嘉兴安宇生物科技有限公司 一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用
US20230035403A1 (en) 2020-07-06 2023-02-02 Janssen Biotech, Inc. Method For Determining Responsiveness To Prostate Cancer Treatment
EP4175664A2 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
US20230024133A1 (en) 2020-07-06 2023-01-26 Janssen Biotech, Inc. Prostate Neoantigens And Their Uses
BR112022026974A2 (pt) 2020-07-06 2023-01-24 Janssen Pharmaceuticals Inc Proteínas de fusão estabilizadas de proteínas de pico de coronavírus
WO2022008613A1 (en) 2020-07-08 2022-01-13 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Rna replicon vaccines against hbv
US20230256057A1 (en) 2020-07-13 2023-08-17 Transgene Treatment of immune depression
EP4172194A1 (en) 2020-07-31 2023-05-03 CureVac SE Nucleic acid encoded antibody mixtures
EP4192496A2 (en) 2020-08-06 2023-06-14 Gritstone bio, Inc. Multiepitope vaccine cassettes
CN112220921B (zh) * 2020-08-25 2022-08-16 北京交通大学 一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗
CN112226450B (zh) * 2020-08-25 2022-10-14 北京交通大学 一种共表达呼吸道合胞病毒融合前蛋白和黏附糖蛋白的复制缺陷型腺病毒载体疫苗
US20240066114A1 (en) 2020-08-31 2024-02-29 CureVac SE Multivalent nucleic acid based coronavirus vaccines
GB202016604D0 (en) 2020-10-20 2020-12-02 Univ Of Oxford Compositions and methods for inducing an immune response
CN112138150A (zh) * 2020-11-26 2020-12-29 怡道生物科技(苏州)有限公司 基于黑猩猩腺病毒载体的治疗性hpv疫苗、其制备方法及应用
TW202237164A (zh) * 2020-12-04 2022-10-01 美商磨石生物公司 組合物及其使用方法
US20220194999A1 (en) 2020-12-23 2022-06-23 Janssen Biotech, Inc. Neoantigen Peptide Mimics
IT202100003470A1 (it) 2021-02-16 2022-08-16 Fond Toscana Life Sciences Vaccines against sars-cov-2
EP4294436A1 (en) 2021-02-19 2023-12-27 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion rsv fb fantigens
WO2022175479A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine combinations against respiratory syncytial virus strain a and b infections
EP4314019A2 (en) 2021-04-01 2024-02-07 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion piv3 f proteins
WO2022218997A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Novel universal vaccine presenting system
CA3221363A1 (en) 2021-06-21 2022-12-29 Nouscom Ag Vaccine composition comprising encoded adjuvant
WO2023020939A1 (en) 2021-08-17 2023-02-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023026182A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023047348A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized corona virus spike protein fusion proteins
WO2023047349A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized coronavirus spike protein fusion proteins
WO2023111725A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023110618A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins
WO2023196634A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
WO2023198815A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Sequential administration of adenoviruses
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
WO2024030856A2 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024061759A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized coronavirus s proteins
WO2024061757A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Pre-fusion human piv1 f proteins
WO2024074584A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion piv3 f proteins

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
US6019978A (en) 1995-06-05 2000-02-01 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
US5994128A (en) 1995-06-15 1999-11-30 Introgene B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
WO1998010087A1 (en) * 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
US5922315A (en) 1997-01-24 1999-07-13 Genetic Therapy, Inc. Adenoviruses having altered hexon proteins
FR2761689B1 (fr) * 1997-04-02 1999-06-25 Transgene Sa Fibre adenovirale modifiee et adenovirus cibles
US5849561A (en) 1997-05-22 1998-12-15 Cornell Research Foundation, Inc. Method for the production of non-group C adenoviral vectors
US20040136963A1 (en) * 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
NZ530245A (en) 2001-06-22 2007-04-27 Wistar Inst Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
ATE530672T1 (de) * 2001-06-22 2011-11-15 Univ Pennsylvania Rekombinante adenoviren mit affen-adenovirus proteinen und verwendung davon.
HU230364B1 (hu) * 2001-11-21 2016-03-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
JP4488290B2 (ja) * 2002-01-24 2010-06-23 ザ・スクリップス・リサーチ・インスティテュート 効率的ターゲティングのためのファイバーシャフト変異
EP1636370B1 (en) 2003-06-20 2014-04-16 The Trustees of The University of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
CA2880061C (en) * 2004-01-23 2018-03-13 Agostino Cirillo Chimpanzee adenovirus vaccine carriers

Also Published As

Publication number Publication date
CA2880060A1 (en) 2005-08-04
JP2007518414A (ja) 2007-07-12
CN102719478A (zh) 2012-10-10
CA2553541C (en) 2015-04-21
JP2012110326A (ja) 2012-06-14
EP3269390A2 (en) 2018-01-17
AU2005206292A1 (en) 2005-08-04
JP2011120588A (ja) 2011-06-23
WO2005071093A3 (en) 2006-03-30
AU2011247884A1 (en) 2011-12-01
CY1109841T1 (el) 2014-09-10
SI1711518T1 (sl) 2010-04-30
PT1711518E (pt) 2010-02-26
CY1119285T1 (el) 2018-02-14
CA2880060C (en) 2018-03-13
ATE449105T1 (de) 2009-12-15
CA2880061A1 (en) 2005-08-04
SI2163260T1 (sl) 2017-07-31
WO2005071093A2 (en) 2005-08-04
PL1711518T3 (pl) 2010-06-30
HUE033576T2 (en) 2017-12-28
EP2163260A2 (en) 2010-03-17
EP1711518B1 (en) 2009-11-18
US20110217332A1 (en) 2011-09-08
CN101014613B (zh) 2012-09-05
DE602005017743D1 (de) 2009-12-31
EP2163260B1 (en) 2017-03-15
EP2163260A3 (en) 2010-06-23
US20120328651A1 (en) 2012-12-27
JP5753377B2 (ja) 2015-07-22
EP3269390A3 (en) 2018-04-18
CN101014613A (zh) 2007-08-08
JP2014158467A (ja) 2014-09-04
LT2163260T (lt) 2017-06-26
JP4814800B2 (ja) 2011-11-16
US8673319B2 (en) 2014-03-18
CA3028774A1 (en) 2005-08-04
CA2553541A1 (en) 2005-08-04
CA2993042A1 (en) 2005-08-04
EP3269390B1 (en) 2021-02-17
US8216834B2 (en) 2012-07-10
PL2163260T3 (pl) 2017-12-29
PT2163260T (pt) 2017-06-08
JP5427874B2 (ja) 2014-02-26
EP1711518A2 (en) 2006-10-18
AU2005206292B2 (en) 2011-09-29
ES2627288T3 (es) 2017-07-27
CN107723298A (zh) 2018-02-23
DK2163260T3 (en) 2017-06-19
AU2011247884B2 (en) 2014-11-20
DK1711518T3 (da) 2010-04-06
ES2337374T3 (es) 2010-04-23
CA2880061C (en) 2018-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2871907T3 (es) Portadores de vacuna de adenovirus de chimpancé
US11214599B2 (en) Recombinant simian adenoviral vectors encoding a heterologous fiber protein and uses thereof
ES2906441T3 (es) Secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del adenovirus de los grandes simios no humanos, vectores que las contienen y usos de las mismas
HU228327B1 (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
JP2008538894A (ja) アデノウイルス血清型２６ベクター、核酸およびそれにより製造されたウイルス
AU2011247887B2 (en) Chimpanzee adenovirus vaccine carriers
Patterson et al. Live adenovirus recombinants as vaccine vectors
Mittal et al. Adenoviral vectors: Potential and challenges as a gene delivery system
JP2018078894A (ja) サルアデノウイルスの核酸配列及びアミノ酸配列、それを含有するベクター、並びにその使用