KR102421049B1 - 안정화된 융합-전 rsv f 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 안정화된 융합-전 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) F 단백질, 상기 단백질을 포함하는 면역원성 조성물 및 RSV 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 이의 용도를 제공한다.

Description

안정화된 융합-전 RSV F 단백질
본 발명은 의학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 특히 재조합 융합-전 RSV F 단백질, RSV F 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 및 예를 들어 백신에서의 이의 용도에 관한 것이다.
1950년대에 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV)의 발견 이후, 이 바이러스는 곧 인간에서 하부 및 상부 호흡기도 감염과 연관된 병원균으로 인식되었다. 전 세계적으로, 매년 6,400만 건의 RSV 감염이 발생하고 있으며, 160,000명이 사망하는 것으로 추정된다(2009년 9월 WHO 급성 호흡기 감염 최신정보). 가장 심각한 질환은 특히 미숙아, 노인 및 면역손상된 개체에서 일어난다. 2세 미만의 아동에서, RSV는 가장 흔한 호흡기도 병원균으로서, 호흡기 감염으로 인한 입원의 대략 50%를 차지하며, 2 내지 4개월령에서 입원이 정점에 이른다. 거의 모든 아동이 2세까지 RSV에 감염된 적이 있는 것으로 보고된 바 있다. 일생 동안 반복되는 감염은 비효과적인 자연 면역에 기인한다. 노인에서, RSV 질환 부담은 비-유행성 인플루엔자 A 감염에 의해 야기되는 것과 유사하다.
RSV는 뉴모비리네(pneumovirinae)의 아과에 속하는 파라믹소바이러스이다. 이의 게놈은 중화 항체에 대한 주요 항원 표적인 RSV 당단백질(G) 및 RSV 융합(F) 단백질로 알려져 있는 멤브레인 단백질을 포함하는 다양한 단백질을 암호화한다. F1 단백질의 융합-매개 부분에 대한 항체는 세포에서 바이러스 섭취를 방해하여 중화 효과를 가질 수 있다.
RSV F는 불안정한 융합-전 형태로부터 안정한 융합-후 형태로의 비가역적 단백질 재접힘에 의해 바이러스와 숙주-세포 멤브레인을 융합한다. 두 가지 형태 모두의 구조가 RSV F에서(McLellan JS, et al. Science 342, 592-598 (2013); McLellan JS, et al. Nat Struct Mol Biol 17, 248-250 (2010); McLellan JS, et al. Science 340, 1113-1117 (2013); Swanson KA, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 9619-9624 (2011)), 그리고 관련된 파라믹소바이러스로부터의 융합 단백질에서 결정되어 있어, 이 복합체 융합 기구의 기전에 대한 이해를 제공한다. 다른 I형 융합 단백질과 마찬가지로, 비활성 전구체 RSV F0는 세포내 성숙 중에 퓨린(furin)-유사 프로테아제에 의한 절단을 필요로 한다. RSV F는 두 개의 퓨린 부위를 함유하여, 이는 3종 단백질: F2, p27 및 F1을 야기하는데, 후자는 이의 N-말단에 소수성 융합 펩티드(FP)를 함유한다. 융합-전 형태로부터 융합-후 형태로의 재접힘을 위해서는, FP 및 7가 반복 A(heptad repeat A, HRA)를 포함하는 잔기 137 내지 216 사이의 재접힘 영역 1(RR1)이 나선, 루프 및 가닥의 조립체로부터 긴 연속적 나선으로 변환되어야 한다. RR1의 N-말단 분절에 위치한 FP가 다음에 바이러스 멤브레인으로부터 연장되고 표적 세포의 근위 멤브레인에 삽입될 수 있다. 다음에, 융합-전 F 스파이크에서 C-말단 줄기를 형성하고 7가 반복 B(HRB)를 포함하는 재접힘 영역 2(RR2)가 RSV F 헤드의 다른 쪽으로 이동하고 HRA 이중 코일(coiled-coil) 삼량체를 HRB 도메인에 결합시켜 6-나선 다발을 형성한다. 6-나선 다발을 완성하기 위한 RR1 이중 코일의 형성 및 RR2의 이동은 재접힘 과정 중에 일어나는 가장 극적인 구조적 변화이다.
RSV 감염에 대한 백신은 현재 이용 가능하지 않지만 높은 질환 부담으로 인해 요망된다. RSV 융합 당단백질(RSV F)은 매력적인 백신 항원으로 인간 혈청에서 중화 항체의 주요 표적이다. 인간 혈청에서 대부분의 중화 항체는 융합-전 형태에 대하여 지시되지만, 그 불안정성으로 인해 융합-전 형태는 용액 및 비리온의 표면 둘 다에서 융합-후 형태로 일찍 재접힘되는 경향을 갖는다. 위에 나타낸 바와 같이, 결정 구조는 융합-전 상태와 융합-후 상태 사이의 큰 형태 변화를 보여주었다. 재배열의 규모는, RSV-F의 융합-후 형태에 대하여 지시되는 항체의 일부만이 바이러스 표면에서 천연 형태의 융합-전 스파이크(spike)와 교차 반응할 수 있을 것임을 시사하였다. 따라서, RSV에 대한 백신을 제조하려는 노력은 융합-전 형태의 RSV F 단백질을 함유하는 백신을 개발하는 데 초점을 맞춰 왔다(예를 들어, 국제 공개 제20101149745호, 국제 공개 제2010/1149743호, 국제 공개 제2009/1079796호, 국제 공개 제2012/158613호 참조). 그러나, 아직까지 이들 노력은 인간에서의 시험에 후보로서 사용될 수 있는 안정한 융합-전 RSV F 단백질을 제공하지 못하였다.
따라서, RSV에 대한 효율적인 백신, 특히 융합-전 형태의 RSV F 단백질을 포함하는 백신에 대한 필요성이 남아 있다. 본 발명은 안전하고 효과적인 방식의 RSV에 대한 백신접종에 사용하기 위한, 이러한 안정한 융합-전 RSV F 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 안정한 재조합 융합-전 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 융합(F) 단백질, 즉 융합-전 형태에서 안정화된 재조합 RSV F 단백질, 및 이의 단편을 제공한다. RSV F 단백질, 또는 이의 단편은 융합-전 형태 F 단백질에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. 특정 구현예에서, 융합-전 RSV F 단백질은 가용성 단백질이다. 특정 구현예에서, RSV F 단백질은 삼량체이다. 특정 구현예에서, RSV F 단백질은 삼량체 RSV F 단백질의 다량체이다. 본 발명은 또한, 융합-전 RSV F 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자, 그리고 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, RSV F 단백질, 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 조성물, 바람직하게는 면역원성 조성물, 그리고 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 있어서의 이의 용도, 특히 백신으로서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 유효량의 융합-전 RSV F 단백질, 상기 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 항-호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 유도된 면역 반응은 RSV에 대한 중화 항체 및/또는 RSV에 대한 보호 면역을 특징으로 한다. 특정 양태에서, 본 발명은 융합-전 RSV F 단백질, 상기 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 항-호흡기 세포융합 바이러스(RSV) F 항체를 유도하는 방법에 관한 것이다.
도 1: 돌연변이 N67I, S215P, T357K, N371Y, 및 D486N이 있는 단백질 F의 정제. 이온-교환 컬럼으로부터의 용출액의 Superdex200 겔 여과 크로마토그램. 화살표는 수집된 피크를 나타낸다.
도 2: A) 환원(R) 및 비-환원(NR) 하에서의 SEC 크로마토그램으로부터의 피크를 함유하는 F N67I, S215P, T357K, N371Y, D486N 단백질 샘플의 SDS-PAGE 분석. 겔은 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색된다.
도 3: 정제된 RSV F 단백질 F N67I, S215P, T357K, N371Y, D486N의 단백질 농도는 CR9501 및 CR9503 단클론 항체를 가지고 Q 옥텟(Octet) 분석에 의해 측정되었다. CR9501은 융합-전 형태의 RSV F에만 결합한다. CR9503은 융합-전 형태 및 융합-후 형태 둘 다의 RSV F와 결합한다. 평균±SE로서 표시됨.
도 4: RSV F 단백질 F N67I, S215P, T357K, N371Y, D486N의 온도 안정성. 사이프로오랜지(SyproOrange) 형광 염료로 시차 주사 형광측정(differential scanning fluorimetry, DSF) 분석에 의해 결정된 융해 온도(melting temperature, Tm ℃). T357K 및 N371Y 치환의 도입은 PRPM의 Tm을 68.5도까지 3.5도만큼 증가시켰다.
호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 융합 단백질(F)은 바이러스 멤브레인과 숙주 세포 멤브레인의 융합에 연루되는데, 이는 감염에 요구된다. RSV F mRNA는 F0으로 지정된 574개 아미노산 전구체 단백질로 번역되는데, 이는 N-말단에 소포체에서 신호 펩티다아제에 의해 제거되는 신호 펩티드 서열(즉, 서열번호: 13의 아미노산 잔기 1 내지 26)을 포함한다. F0은 세포 프로테아제(특히 퓨린, 또는 퓨린-유사)에 의해 2 부위(아미노산 잔기 109/110과 136/137 사이)에서 절단되어, (p27 영역으로도 불리는, 아미노산 잔기 110 내지 136을 포함하는, 짧은 글리코실화된 개재 서열을 제거하고, F1 및 F2로 지정된 2개 도메인 또는 서브유닛을 생성한다. F1 도메인(아미노산 잔기 137 내지 574)은 이의 N-말단에 소수성 융합 펩티드를 포함하고 C-말단은 막관통(TM)(아미노산 잔기 530 내지 550) 및 세포질 영역(아미노산 잔기 551 내지 574)을 포함한다. F2 도메인(아미노산 잔기 27 내지 109)은 2개의 디술피드 가교체에 의해 F1에 공유적으로 연결된다. F1-F2 헤테로이량체는 비리온에서 호모삼량체로서 조립된다.
RSV 감염에 대한 백신은 현재 아직 이용 가능하지 않다. 백신을 생산하기 위한 하나의 가능성이 있는 접근법으로는 정제된 RSV F 단백질을 기반으로 하는 서브유닛 백신이 있다. 그러나, 이 접근법에 있어서는 정제된 RSV F 단백질이 시간이 지나도 안정하고 충분한 양으로 생산될 수 있는 융합-전 상태의 RSV F 단백질의 형태와 유사한 형태인 것이 바람직하다. 또한, 가용성 서브유닛-기반 백신의 경우, RSV F 단백질은 가용성의 분비된 F 단백질(sF)을 생성하도록 막관통(TM) 및 세포질 영역의 결실에 의해 절단될 필요가 있다. TM 영역은 막 고정 및 안정성을 담당하기 때문에, 비고정된 가용성 F 단백질은 전장 단백질보다 상당히 더 불안정하고 융합-후 최종-상태로 용이하게 재접힘될 것이다. 높은 발현 수준 및 높은 안정성을 보이는 안정한 융합-전 형태의 가용성 F 단백질을 얻기 위해서는, 융합-전 형태가 이에 따라 안정화될 필요가 있다. 또한, 전장(멤브레인-결합된) RSV F 단백질은 준안정성이므로 융합-전 형태의 안정화는 전장 RSV F 단백질에서, 예를 들어 임의의 생 약독화 또는 벡터 기반의 백신 접근법에서 또한 요망된다.
F1 및 F2 서브유닛으로 절단되는 가용성 RSV F의 융합-전 형태에서의 안정화를 위해, 피브리틴-기반의 삼량체화 도메인이 가용성 RSV-F C-말단 단부의 C-말단에 융합되었다(McLellan et al., Nature Struct. Biol.17. 2-248-250 (2010); McLellan et al., Science 340(6136):1113-7 (2013)). 이러한 피브리틴 도메인 또는 '폴돈(Foldon)'은 T4 피브리틴으로부터 유래되며, 이전에 인공적인 천연 삼량체화 도메인으로서 기술되었다(Letarov et al., Biochemistry Moscow 64: 817-823 (1993); S-Guthe et al., J.Mol.Biol. 337: 905-915. (2004)). 그러나, 삼량체화 도메인은 안정한 융합-전 RSV-F 단백질을 초래하지 못한다(Krarup et al., Nature Comm. 6:8143, (2015)). 더욱이, 이들 노력은 아직 인간에서의 시험에 적합한 후보를 야기하지 못하였다.
최근, 본 발명자들은 RSV F 단백질을 융합-전 형태에서 안정화시킬 수 있는 몇 가지 돌연변이의 조합을 기술하였다(국제 공개 제O2014/174018호 및 국제 공개 제O2014/202570호). 이에 따라, 위치 67에서의 아미노산 잔기의 돌연변이 및/또는 위치 215에서의 아미노산 잔기의 돌연변이, 바람직하게는 위치 67에서의 아미노산 잔기 N/T의 I로의 돌연변이 및/또는 위치 215에서의 아미노산 잔기 S의 P로의 돌연변이를 포함하는 안정한 융합-전 RSV F 단백질이 기술되었다. 또한, 절단된 F1 도메인을 포함하고, 위치 67에서의 아미노산 잔기의 돌연변이 및/또는 위치 215에서의 아미노산 잔기의 돌연변이, 바람직하게는 위치 67에서의 아미노산 잔기 N/T의 I로의 돌연변이 및/또는 위치 215에서의 아미노산 잔기 S의 P로의 돌연변이를 포함하는 가용성 융합-전 RSV F 단백질이 기술되었는데, 여기에서 단백질은 상기 절단된 F1 도메인에 연결된 이종 삼량체화 도메인을 포함한다. 추가의 융합-전 RSV F 단백질이 기술되었는데, 여기에서 단백질은 적어도 하나의 추가 돌연변이, 예를 들어 위치 486에서의 아미노산 잔기 D의 N으로의 돌연변이를 포함한다.
본 발명에 따르면, 2개의 다른 돌연변이, 즉 위치 357 및 371(서열번호: 13에 따른 넘버링)에서의 도입 또한 융합-전 형태의 단백질을 안정화하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 이에 따라, 위치 215에서의 아미노산 잔기의 돌연변이, 특히 위치 215에서의 아미노산 S의 P로의 돌연변이(S215P)를, 위치 357에서의 아미노산의 돌연변이, 특히 위치 357에서의 아미노산 T의 K로의 돌연변이(T357K) 및 위치 371에서의 아미노산의 돌연변이, 특히 위치 371에서의 아미노산 N의 Y로의 돌연변이(N371Y)와 조합으로 포함하는 재조합 융합-전 F 단백질을 제공한다.
본 발명은 이에 따라, 안정한 재조합 융합-전 RSV F 단백질, 즉 융합-전 형태에서 안정화된 RSV F 단백질, 또는 이의 단편을 제공하기 위한 독특한 돌연변이의 조합을 제공한다. 본 발명의 안정한 융합-전 RSV F 단백질, 또는 이의 단편은 융합-전 형태로 존재하며, 즉 이들은 융합-전 형태 F 단백질에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 포함한다(나타낸다). 융합-전 형태 F 단백질에 특이적인 에피토프는 융합-후 형태에서는 제시되지 않는 에피토프이다. 임의의 특정 이론에 구애되고자 함이 없이, RSV F 단백질의 융합-전 형태는 천연 RSV 비리온에서 발현되는 RSV F 단백질에서의 에피토프와 동일한 에피토프를 포함할 수 있고, 따라서 보호 중화 항체를 이끌어내기 위한 이점을 제공할 수 있는 것으로 여겨진다.
특정 구현예에서, 본 발명의 융합-전 RSV F 단백질, 또는 이의 단편은, 서열번호: 1의 중쇄 CDR1 영역, 서열번호: 2의 중쇄 CDR2 영역, 서열번호: 3의 중쇄 CDR3 영역 및 서열번호: 4의 경쇄 CDR1 영역, 서열번호: 5의 경쇄 CDR2 영역, 및 서열번호: 6의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 융합-전 특이적 단클론 항체(이하, CR9501로 칭해짐), 및/또는 서열번호: 7의 중쇄 CDR1 영역, 서열번호: 8의 중쇄 CDR2 영역, 서열번호: 9의 중쇄 CDR3 영역 및 서열번호: 10의 경쇄 CDR1 영역, 서열번호: 11의 경쇄 CDR2 영역, 및 서열번호: 12의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 융합-전 특이적 단클론 항체(이하, CR9502로 칭해짐)에 의해 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. CR9501 및 CR9502는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 따라서 각각 항체 58C5 및 30D8의 결합 특이성을 포함하는데, 이는 이의 융합-전 형태의 RSV F 단백질에는 특이적으로 결합하지만 융합-후 형태에는 그렇지 않음을 이전에 보여주었다(국제 공개 제2012/006596호 참조).
특정 구현예에서, 재조합 융합-전 RSV F 단백질은 삼량체이다.
본 출원 전체에서 사용되는 바와 같이, 본 기술 분야에서의 관습대로, 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 방향으로 제공되고, 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 제공된다.
위에 나타낸 바와 같이, 융합-전 RSV F 단백질의 단편 또한 본 발명에 포함된다. 단편은 아미노-말단 결실(예를 들어, 신호 서열의 절단에 의함) 및 카복시-말단 결실(예를 들어, 막관통 영역 및/또는 세포질 꼬리의 결실에 의함) 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 야기될 수 있다. 단편은 F 단백질의 면역학적 활성 단편, 즉, 대상에서 면역 반응을 야기하게 될 부분을 포함하도록 선택될 수 있다. 이는 컴퓨터 가상 실험(in silico), 시험관내(in vitro) 및/또는 생체내(in vivo) 방법을 사용하여 용이하게 결정될 수 있으며, 이들 전부는 당업자에게 일상적인 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 암호화된 단백질 또는 이의 단편은 서열번호: 13의 아미노산 1 내지 26에 상응하는, 리더 서열 또는 신호 펩티드로도 불리는 신호 서열을 포함한다. 신호 서열은 전형적으로, 분비 경로를 향하도록 예정되고 전형적으로 신호 펩티다아제에 의해 절단되어 유리 신호 펩티드 및 성숙 단백질을 생성하는 대다수의 새로 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은(예를 들어, 5 내지 30개 아미노산의 길이) 아미노산 서열이다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편은 신호 서열을 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 융합-전 RSV F 단백질(의 단편)은 가용성이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안정한 융합-전 RSV F 단백질 또는 이의 단편은 절단된 F1 도메인을 포함하고, 상기 절단된 F1 도메인에 연결되는 이종 삼량체화 도메인을 포함한다. 본 발명에 따르면, 안정화 돌연변이(들)와 조합하여, 이종 삼량체화 도메인을 절단된 F1 도메인의 C-말단 아미노산 잔기에 연결하는 것에 의해, 높은 발현을 보여주고 융합-전-특이적 항체에 결합하여 단백질이 융합-전 형태인 것을 나타내는 가용성 RSV F 단백질이 제공된다. 또한, RSV F 단백질은 융합-전 형태에서 안정화되어, 즉 단백질의 처리 후에도 이들은 여전히 융합-전 특이적 항체 CR9501 및/또는 CR9502에 결합하여, 융합-전 특이적 에피토프가 유지되는 것을 나타낸다.
특정 구현예에서, RSV F 단백질은 삼량체 RSV F 단백질의 다량체이다. 따라서, 일부 구현예에서, RSV F 단백질은 삼량체의 더 높은 차수 조립체를 위한 조립 도메인을 포함할 수 있다.
RSV는 두 개의 항원 서브그룹: A 및 B를 갖는 단일 항원형으로서 존재하는 것으로 알려져 있다. 두 그룹의 성숙한 처리된 F 단백질의 아미노산 서열은 약 93% 동일하다. 본 출원 전체에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 위치는 서브그룹 A의 RSV F 단백질의 서열(서열번호: 13)과 관련하여 주어진다. 본 발명에서 사용되는 표현 "RSV F 단백질의 위치 "x"에서의 아미노산"은 이에 따라 서열번호: 13의 RSV F 단백질에서 위치 "x"에서의 아미노산에 상응하는 아미노산을 의미한다. 본 출원 전체에서 사용되는 넘버링 시스템에서 1은 미성숙 F0 단백질(서열번호: 13)의 N-말단 아미노산을 의미하는 것임이 주목된다. 다른 RSV 균주가 사용될 때, F 단백질의 아미노산 위치는 다른 RSV 균주의 서열을 서열번호: 13의 F 단백질과 필요에 따라 갭을 삽입하여 정렬함으로써, 서열번호: 13의 F 단백질의 넘버링을 참고하여 넘버링될 것이다. 서열 정렬은 해당 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 CLUSTALW, Bioedit 또는 CLC Workbench에 의해 수행될 수 있다.
특정 구현예에서, RSV 균주는 서열번호: 20의 RSV 균주이다.
특정 구현예에서, RSV 균주는 RSV B 균주이다. 특정 구현예에서, RSV 균주는 서열번호: 15의 RSV B 균주이다.
본 발명에 따른 아미노산은 천연적으로 존재하는 임의의 20개(또는 '표준' 아미노산) 또는, 예를 들어 D-아미노산(키랄 중심을 갖는 아미노산의 D-거울상이성질체)과 같은 이의 변이체, 또는, 예를 들어 노르류신과 같은, 단백질에서 천연적으로 발견되지 않는 임의의 변이체일 수 있다. 표준 아미노산은 이들의 특성을 기반으로 몇 개의 군으로 분류될 수 있다. 중요한 인자는 전하, 친수성 또는 소수성, 크기 및 기능기이다. 이들 특성은 단백질 구조 및 단백질-단백질 상호작용에 중요하다. 다른 시스테인 잔기와 공유적 이황화 결합(또는 이황화 가교)를 형성할 수 있는 시스테인, 단백질 골격의 방향 전환을 유도하는 프롤린, 그리고 다른 아미노산보다 더 유연한 글리신과 같이, 일부 아미노산은 특별한 특성을 갖는다. 표 1는 표준 아미노산의 약어 및 특성을 나타낸다.
일상적인 분자 생물학 절차에 의해 단백질에 돌연변이가 만들어질 수 있음은 당업자에 의해 인정될 것이다. 본 발명에 따른 돌연변이는 바람직하게는, 이들 돌연변이(들)를 포함하지 않는 RSV F 단백질과 비교하여, 융합-전 RSV F 단백질의 증가된 안정성 및/또는 증가된 발현 수준을 야기한다.
특정 구현예에서, 융합-전 RSV F 단백질 또는 이의 단편은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 돌연변이를 포함한다:
(a) 위치 67에서의 아미노산 잔기의 돌연변이; 및
(b) 위치 486에서의 아미노산 잔기의 돌연변이.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 추가 돌연변이는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
(a) 위치 67에서의 아미노산 잔기 N/T의 I로의 돌연변이; 및
(b) 위치 486에서의 아미노산 잔기 D의 N으로의 돌연변이.
특정 구현예에서, 융합-전 RSV F 단백질 또는 이의 단편은 (예를 들어, 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는, 야생형 RV F 단백질과 비교하여) 적어도 4종의 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 적어도 5종의 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 적어도 6종의 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 이에 따라 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 돌연변이를 포함한다:
(a) 위치 46에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;
(b) 위치 83에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;
(c) 위치 92에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;
(d) 위치 184에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;
(e) 위치 203에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;
(f) 위치 207에서의 아미노산 잔기의 돌연변이; 및
(g) 위치 487에서의 아미노산 잔기의 돌연변이.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 추가 돌연변이는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
(a) 위치 46에서의 아미노산 잔기 S의 G로의 돌연변이;
(b) 위치 83에서의 아미노산 잔기 L의 M으로의 돌연변이;
(c) 위치 92에서의 아미노산 잔기 E의 D로의 돌연변이;
(d) 위치 184에서의 아미노산 잔기 G의 N으로의 돌연변이;
(e) 위치 203에서의 아미노산 잔기 L의 I로의 돌연변이:
(f) 위치 207에서의 아미노산 잔기 V의 I로의 돌연변이: 및
(g) 위치 487에서의 아미노산 잔기 E의 Q, N 또는 I로의 돌연변이.
다른 특정 구현예에서, 이종 삼량체화 도메인은 아미노산 서열 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(서열번호: 14)을 포함한다.
위에 기술된 바와 같이, 특정 구현예에서, 본 발명의 단백질 또는 이의 단편은 절단된 F1 도메인을 포함한다. 본원에서 사용되는 "절단된" F1 도메인은 전장 F1 도메인이 아닌 F1 도메인을 말하는데, 즉 여기에서는 N-말단 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실된다. 본 발명에 따르면, 적어도 막관통 도메인 및 세포질 꼬리가 결실되어 가용성 엑토도메인으로서의 발현이 허용된다.
다른 특정 구현예에서, 삼량체화 도메인은 RSV F1 도메인의 아미노산 잔기 513에 연결된다. 특정 구현예에서, 삼량체화 도메인은 이에 따라 서열번호: 14를 포함하며, RSV F1 도메인의 아미노산 잔기 513에 연결된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 RSV F 단백질은 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 융합-전 RSV F 단백질의 발현 수준은, 야생형 RSV F 단백질과 비교하여 증가된다. 특정 구현예에서 발현의 수준은 적어도 5배, 바람직하게는 10배까지 증가된다. 특정 구현예에서, 발현의 수준은 10배보다 많이 증가된다.
본 발명에 따른 융합-전 RSV F 단백질은 안정적, 즉, 예를 들어 정제, 동결-해동 주기, 및/또는 저장 등과 같은 단백질의 처리시 융합-후 형태로 쉽게 변화되지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 융합-전 RSV F 단백질은 돌연변이(들)가 없는 RSV F 단백질과 비교하여, 4℃에서 저장시 증가된 안정성을 갖는다. 특정 구현예에서, 단백질은 4℃에서 저장시 적어도 30일, 바람직하게는 적어도 60일, 바람직하게는 적어도 6개월, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 1년 동안 안정하다. "저장시 안정한"은 4℃에서 적어도 30일 동안 용액(예를 들어, 배양 배지)에서 단백질의 저장시 단백질이 융합-전 특이적 항체(예를 들어, CR9501)에 대하여 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 여전히 나타내는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 단백질은 4℃에서 융합-전 RSV F 단백질의 저장시 적어도 6개월 동안, 바람직하게는 적어도 1년 동안 적어도 하나의 융합-전 특이적 에피토프를 나타낸다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 융합-전 RSV F 단백질은, 상기 돌연변이(들)가 없는 RSV F 단백질과 비교하여, 열을 받을 때 증가된 안정성을 갖는다. 특정 구현예에서, 융합-전 REV F 단백질은 55℃의 온도에서, 바람직하게는 58℃에서, 더욱 바람직하게는 60℃에서 적어도 30분 동안 열 안정성이다. "열 안정성"은, 예를 들어 실시예에서 기술하는 방법을 사용하여 결정되는 바와 같이, 단백질이 적어도 30분 동안 증가된 온도(즉, 55℃ 이상의 온도)로 처리된 후 적어도 하나의 융합-전 특이적 에피토프를 여전히 나타내는 것을 의미한다(도 4 참조).
특정 구현예에서, 단백질은 적절한 제형 완충액에서 1 내지 6 동결-해동 주기로 처리된 후 적어도 하나의 융합-전 특이적 에피토프를 나타낸다.
본 출원 전체에서 사용되는 바와 같이, 본 기술 분야에서의 관습대로, 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 방향으로 제공되고, 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 제공된다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 암호화된 단백질은, 서열번호: 13의 아미노산 1 내지 26에 상응하는, 신호 서열 또는 신호 펩티드로도 지칭되는 리더 서열을 추가로 포함한다. 이것은 분비 경로를 향하도록 예정된, 대부분의 새로 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은(전형적으로 5 내지 30개 아미노산 길이) 펩티드이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 단백질은 리더 서열을 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 단백질은 HIS-태그를 포함한다. His-태그 또는 폴리히스티딘-태그는, 일반적으로 정제 목적을 위해 사용되는, 종종 단백질의 N- 또는 C-말단에서의 적어도 5개 히스티딘(H) 잔기로 구성되는 단백질에서의 아미노산 모티프이다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 코돈 최적화의 방법은 공지되어 있고 이전에 기술되었다(예를 들어, 국제 공개 제96/09378호). 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 비-우선적 코돈이 더 우선적인 코돈에 의해 교체된 경우 서열은 코돈 최적화된 것으로 간주된다. 본원에서, 비-우선적 코돈은 동일한 아미노산을 암호화하는 또 다른 코돈보다 유기체에서 덜 빈번하게 사용되는 코돈이고, 더 우선적인 코돈은 비-우선적 코돈보다 유기체에서 더 빈번하게 사용되는 코돈이다. 특정 유기체에서 코돈 사용의 빈도는, http://www.kazusa.or.jp/codon에서와 같이, 코돈 빈도표에서 발견될 수 있다. 바람직하게는 하나보다 많은 비-우선적 코돈이, 바람직하게는 대부분의 또는 모든 비-우선적 코돈이 더 우선적인 코돈으로 교체된다. 바람직하게는 유기체에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈이 코돈-최적화된 서열에서 사용된다. 우선적 코돈에 의한 교체는 일반적으로 더 높은 발현으로 이어진다.
유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)의 결과로 많은 상이한 폴리뉴클레오티드 및 핵산 분자가 동일 단백질을 암호화할 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 당업자라면 일상적인 기법을 사용하여, 단백질이 발현되는 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 사용을 반영하도록 핵산 분자에 의해 암호화되는 단백질 서열에 영향을 주지 않는 뉴클레오티드 치환을 만들 수 있음이 또한 이해된다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 상호 축퇴 버전인, 그리고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. RNA 및 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
핵산 서열은 일상적인 분자 생물학 기법을 사용하여 클로닝되거나, DNA 합성에 의해 드노보(de novo)로 생성될 수 있는데, 이는 DNA 합성 및/또는 분자 클로닝 분야에서 사업을 하는 용역 회사(예를 들어, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins)에 의해 일상적인 절차를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 위에 기술된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 따라서, 특정 구현예에서 본 발명에 따른 핵산 분자는 벡터의 일부이다. 이러한 벡터는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 용이하게 조작될 수 있고, 예를 들어 원핵 및/또는 진핵 세포에서 복제될 수 있도록 설계될 수 있다. 또한, 많은 벡터가 진핵 세포의 형질전환에 사용될 수 있고 이러한 세포의 게놈 내로 전체 또는 일부가 통합되어, 게놈 내에 원하는 핵산을 포함하는 안정한 숙주 세포를 생성할 것이다. 사용되는 벡터는 DNA 클로닝에 적합하고 관심 핵산의 전사에 사용될 수 있는 임의의 벡터일 수 있다. 본 발명에 따른 적합한 벡터는 예를 들어, 아데노벡터, 알파바이러스, 파라믹소바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 벡터 등이다. 당업자는 적합한 발현 벡터를 선택하고, 본 발명의 핵산 서열을 기능적인 방식으로 삽입할 수 있다.
융합-전 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포도 본 발명의 일부를 형성한다. 융합-전 RSV F 단백질은 숙주 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 종양 세포주, BHK 세포, 인간 세포주, 예를 들어 HEK293 세포, PER.C6 세포, 또는 효모, 진균류, 곤충 세포 등, 또는 유전자이식(transgenic) 동물 또는 식물에서의 분자의 발현을 포함하는 재조합 DNA 기술을 통해 생산될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 다세포 유기체로부터 유래되고, 특정 구현예에서 세포는 척추동물 또는 무척추동물 기원의 것이다. 특정 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 특정 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일반적으로, 숙주 세포에서 본 발명의 융합-전 RSV F 단백질과 같은 재조합 단백질의 생산은, 발현 가능한 구성 방식으로 단백질을 암호화하는 이종 핵산 분자를 숙주 세포로 도입하고, 핵산 분자의 발현을 조장하는 조건 하에 세포를 배양하고, 상기 세포에서 단백질이 발현되도록 하는 것을 포함한다. 발현 가능한 구성 방식으로 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 발현 카세트의 형태로 존재할 수 있고, 보통 핵산의 발현을 유발할 수 있는 서열, 예를 들어 인핸서(들), 프로모터, 폴리아데닐화 신호 등을 필요로 한다. 당업자라면 숙주 세포에서 유전자의 발현을 얻기 위해 다양한 프로모터가 사용될 수 있음을 알고 있다. 프로모터는 구성적 프로모터이거나 조절될 수 있고, 바이러스, 원핵, 또는 진핵 공급원을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻어질 수 있거나 인공적으로 설계될 수 있다.
세포 배양 배지는 다양한 판매자로부터 입수 가능하고, 적합한 배지는 관심 단백질, 여기에서는 융합-전 RSV F 단백질을 발현시키도록 숙주 세포에 대하여 일상적으로 선택될 수 있다. 적합한 배지는 혈청을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
"이종 핵산 분자"(본원에서 '이식유전자'로도 칭해짐)는 숙주 세포에 천연적으로 존재하지 않는 핵산 분자이다. 이것은, 예를 들어 표준 분자 생물학 기법에 의해 벡터 내로 도입된다. 이식유전자는 일반적으로 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 이것은, 예를 들어 이식유전자(들)를 암호화하는 핵산을 프로모터의 제어 하에 위치시킴으로써 행해질 수 있다. 추가의 조절 서열이 부가될 수 있다. 많은 프로모터가 이식유전자(들)의 발현을 위해 사용될 수 있고, 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 프로모터는 바이러스, 포유류, 합성 프로모터 등을 포함할 수 있다. 진핵 세포에서의 발현을 얻는 데 적합한 프로모터의 비제한적 예로는 CMV-프로모터(미국 특허 제5,385,839호), 예를 들어 CMV 즉시형 초기 프로모터, 예를 들어 CMV 즉시형 초기 유전자 인핸서/프로모터로부터의 뉴클레오티드 -735 내지 +95를 포함하는 것이 있다. 폴리아데닐화 신호, 예를 들어 소 성장 호르몬 폴리A 신호(미국 특허 제5,122,458호)가 이식유전자(들) 뒤에 존재할 수 있다. 대안적으로, 몇 가지의 널리 사용되는 발현 벡터가 본 기술 분야에서, 그리고 상업적 공급처로부터 입수 가능하며, 예를 들어 Invitrogen의 pcDNA 및 pEF 벡터 시리즈, BD Sciences로부터의 pMSCV 및 pTK-Hyg, Stratagene으로부터의 pCMV-Script 등은 관심 단백질의 재조합적 발현을 위해, 또는 적합한 프로모터 및/또는 전사 종결 서열, 폴리A 서열 등을 얻기 위해 사용될 수 있다.
세포 배양물은, 유착성 세포 배양물, 예를 들어 배양 용기의 표면 또는 마이크로캐리어에 부착된 세포뿐만 아니라 현탁 배양물을 포함하는 임의 유형의 세포 배양물일 수 있다. 대부분의 대규모 현탁 배양은 배치식 또는 유가식(fed-batch) 공정으로 작동되는데, 이들이 작동 및 규모 확대가 가장 간단하기 때문이다. 최근에는, 관류 원리를 기반으로 하는 연속식 공정이 더 보편화되고 있고 적합하기도 하다. 적절한 배양 배지는 또한 당업자에게 잘 알려져 있고 일반적으로 상업적 공급원으로부터 대량으로, 또는 표준 프로토콜에 따라 주문-제작으로 얻을 수 있다. 배양은, 예를 들어 접시, 회전 병 또는 생물반응기에서 배치, 유가식, 연속 시스템 등을 사용하여 수행될 수 있다. 세포 배양에 적합한 조건은 공지되어 있다(예를 들어, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973) 및 R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9) 참조).
추가로 본 발명은 위에 기술된 바와 같이 융합-전 RSV F 단백질 및/또는 핵산 분자, 및/또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 RSV F 단백질의 융합-전 형태에 존재하지만 융합-후 형태에 부재인 에피토프를 나타내는 융합-전 RSV F 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 이러한 융합-전 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로, 위에 기술되는 바와 같이, 융합-전 RSV F 단백질, 및/또는 핵산 분자, 및/또는 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 대상에서 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하기 위한, 본 발명에 따른 안정화된 융합-전 RSV F 단백질, 핵산 분자, 및/또는 벡터의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 융합-전 RSV F 단백질, 및/또는 핵산 분자, 및/또는 벡터를 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 추가로 제공된다. 대상에서 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 융합-전 RSV F 단백질, 핵산 분자, 및/또는 벡터가 또한 제공된다. 대상에서 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 본 발명에 따른 융합-전 RSV F 단백질, 및/또는 핵산 분자, 및/또는 벡터의 용도가 추가로 제공된다.
본 발명의 융합-전 RSV F 단백질, 핵산 분자, 또는 벡터는 RSV 감염의 방지(예방) 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 방지 및/또는 치료는 RSV 감염에 취약한 환자군을 표적으로 할 수 있다. 이러한 환자군은, 예를 들어 노인(예를 들어, 50세 이상, 60세 이상, 그리고 바람직하게는 65세 이상), 어린이(예를 들어, 5세 이하, 1세 이하), 입원 환자 및 항바이러스 화합물 처치를 받지만 부적절한 항바이러스 반응을 나타낸 환자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 융합-전 RSV F 단백질, 핵산 분자 및/또는 벡터는, 예를 들어 RSV에 의해 야기되는 질환 또는 병태의 독립 치료 및/또는 예방에, 또는 (기존 또는 향후) 백신, 항바이러스제 및/또는 단클론 항체와 같은 다른 예방적 및/또는 치료적 처치와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로, 본 발명에 따른 융합-전 RSV F 단백질, 핵산 분자 및/또는 벡터를 이용하여 대상에서 RSV 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 대상에서 RSV 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법은, 이를 필요로 하는 대상에 위에 기술된 바와 같은, 유효량의 융합-전 RSV F 단백질, 핵산 분자 및/또는 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 치료적 유효량은 RSV에 의한 감염에서 생기는 질환 또는 병태를 예방, 개선 및/또는 치료하는 데 유효한 단백질, 핵산 분자 또는 벡터의 양을 말한다. 예방은 RSV의 확산을 억제 또는 감소시키는 것, 또는 RSV에 의한 감염과 연관된 하나 이상의 증상의 개시, 발생 또는 진행을 억제 또는 감소시키는 것을 포괄한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 개선은 인플루엔자 감염의 가시적이거나 또는 감지 가능한 질환 증상, 바이러스 혈증, 또는 임의의 다른 측정 가능한 징후의 감소를 의미할 수 있다.
인간과 같은 대상에 투여하기 위해, 본 발명은 본원에 기술되는 것과 같은 융합-전 RSV F 단백질, 핵산 분자 및/또는 벡터, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 이용할 수 있다. 본 맥락에서, "약제학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 담체 또는 부형제가 이용되는 투여량 및 농도에서 이들이 투여되는 대상에 임의의 원치 않거나 유해한 효과를 야기하지 않을 것임을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000] 참조). RSV F 단백질, 또는 핵산 분자는, 비록 동결건조 제제를 이용하는 것도 가능할 수 있지만, 바람직하게는 멸균 용액으로 제형화되고 투여된다. 멸균 용액은 멸균 여과에 의하거나 본 기술 분야에서 그 자체가 공지된 다른 방법에 의해 제조된다. 이어서, 용액은 동결건조되거나 약제 투약 용기에 충전된다. 용액의 pH는 일반적으로 pH 3.0 내지 9.5, 예를 들어 pH 5.0 내지 7.5의 범위이다. RSV F 단백질은 전형적으로 약제학적으로 허용 가능한 완충제를 갖는 용액에 존재하고, 조성물은 또한 염을 함유할 수 있다. 선택적으로, 알부민과 같은 안정화제가 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 세제가 첨가된다. 특정 구현예에서, RSV F 단백질은 주사 가능한 제제로 제형화될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 애주번트를 추가로 포함한다. 애주번트는 적용되는 항원성 결정 부위(antigenic determinant)에 대한 면역 반응을 더욱 증가시키는 것으로 본 기술 분야에 알려져 있다. 용어 "애주번트" 및 "면역 자극제"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되고, 면역계의 자극을 야기하는 하나 이상의 물질로서 정의된다. 이와 관련하여, 애주번트는 본 발명의 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 향상시키기 위해 사용된다. 적합한 애주번트의 예는 수산화알루미늄 및/또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄 염; MF59와 같은 스쿠알렌-물 에멀젼을 포함하는 오일-에멀젼 조성물(또는 수중유 조성물)(예를 들어, 국제 공개 제90/14837호 참조); 예를 들어 QS21 및 면역자극 복합체(ISCOMS)와 같은 사포닌 제형(예를 들어, 미국 특허 제5,057,540호; 국제 공개 제90/03184호, 국제 공개 제96/11711호, 국제 공개 제2004/004762호, 국제 공개 제2005/002620호 참조); 박테리아 또는 미생물 유도체(이의 예로는 모노포스포릴 지질 A(MPL), 3-O-탈아실화 MPL(3dMPL), CpG-모티프 함유 올리고뉴클레오티드, ADP-리보실화 박테리아 독소 또는 이의 돌연변이체, 예를 들어 대장균(E. coli) 열 불안정 장독소 LT, 콜레라 독소 CT 등이 있음); 진핵 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 항원 자체 또는 CD1a, CD3, CD7, CD80에 대하여 유도됨) 및 수용 세포와의 상호작용시 면역 반응을 자극하는 수용체에 대한 리간드(예를 들어, CD40L, GMCSF, GCSF 등)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 애주번트로서 알루미늄을, 예를 들어 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 인산알루미늄칼륨, 또는 이의 조합의 형태로, 용량 당 알루미늄 함량 0.05 내지 5 mg, 예를 들어, 0.075 내지 1.0 mg의 농도로 포함한다.
융합-전 RSV F 단백질은 또한, 예를 들어 폴리머, 리포솜, 바이로솜, 바이러스-유사 입자와 같은 나노입자와 조합하거나 이에 접합하여 투여될 수 있다. 융합-전 F 단백질은 애주번트와 함께 또는 애주번트 없이 나노입자와 조합되거나, 나노입자 내에 캡시드화되거나, 나노입자에 접합될 수 있다. 리포좀 내의 캡슐화는, 예를 들어 미국 특허 제4,235,877호에 기술되어 있다. 거대분자에의 접합은, 예를 들어 미국 특허 제4,372,945호 또는 미국 특허 제4,474,757호에 개시되어 있다. 다른 구현예에서, RSV F 단백질은 더 높은 차수의 다량체의 조립체로 조립된다.
다른 구현예에서, 조성물은 애주번트를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서 본 발명은, 본 발명에 따른 조성물을 제공하는 단계 및 이를 약제학적으로 허용 가능한 조성물로 제형화하는 단계를 포함하는, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 백신을 제조하는 방법을 제공한다. "백신"이라는 용어는 특정 병원체 또는 질환에 대하여 대상에서 특정한 정도의 면역성을 유도하는 데 효과적인 활성 성분을 함유하는 물질 또는 조성물을 말하는데, 이는 질환 또는 병원체에 의한 감염과 연관된 증상의 중증도, 지속 기간 또는 다른 징후의 적어도 저하(완전한 부재까지)를 초래할 것이다. 본 발명에서, 백신은 RSV의 F 단백질에 대한 면역 반응을 초래하는, 유효량의 융합-전 RSV F 단백질 및/또는 융합-전 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 이것은 입원으로 이어지는 중증의 하부 호흡기도 질환을 예방하는 방법 및 대상에서 RSV 감염 및 복제로 인한 폐렴 및 세기관지염과 같은 합병증의 빈도의 저하를 제공한다. 본 발명에 따른 "백신"이라는 용어는 이것이 약제학적 조성물이고, 따라서 전형적으로 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 것을 시사한다. 백신은 추가의 활성 성분을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 특정 구현예에서 백신은, 예를 들어 RSV의 다른 단백질 및/또는 다른 감염성 물질에 대한 면역 반응을 유도하는 다른 성분을 추가로 포함하는 조합 백신일 수 있다. 추가 활성 성분의 투여는, 예를 들어 별개의 투여에 의하거나 본 발명의 백신과 추가 활성 성분의 조합 제품을 투여하는 것에 의해 행해질 수 있다.
조성물은 대상, 예를 들어 인간 대상에 투여될 수 있다. 단일 투여용 조성물 중 RSV F 단백질의 총 용량은, 예를 들어 약 0.01 ㎍ 내지 약 10 mg, 예를 들어 1 ㎍ 내지 1 mg, 예를 들어 10 ㎍ 내지 100 ㎍일 수 있다. 권고 용량의 결정은 실험에 의해 실시될 것이고 당업자에게 일상적인 것이다.
본 발명에 따른 조성물의 투여는 표준 투여 경로를 사용하여 수행될 수 있다. 비-제한적 구현예는 비경구 투여, 예를 들어 피부내, 근육내, 피하, 경피, 또는 점막 투여, 예를 들어 비강내, 경구 등을 포함한다. 일 구현예에서 조성물은 근육내 주사에 의해 투여된다. 당업자라면 백신에서 항원(들)에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 조성물, 예를 들어 백신을 투여하기 위한 다양한 가능성을 알고 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대상은 바람직하게는 포유류, 예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스, 코튼 래트 또는 비인간 영장류, 또는 인간이다. 바람직하게는, 대상은 인간 대상이다.
단백질, 핵산 분자, 벡터, 및/또는 조성물은 또한, 동종 또는 이종 프라임-부스트 요법에서 프라임으로서, 또는 부스트로서 투여될 수 있다. 부스팅 백신 접종이 수행될 경우, 전형적으로, 이러한 부스팅 백신 접종은 조성물을 대상에 최초로 투여한 후(이러한 경우 '프라이밍 백신 접종'으로 칭해짐) 1주 내지 1년 사이, 바람직하게는 2주 내지 4개월 사이의 시점에서 동일한 대상에 투여될 것이다. 특정 구현예에서, 투여는 프라임 및 적어도 1회의 부스터 투여를 포함한다.
또한, 본 발명의 단백질은, 예를 들어 본 발명의 단백질에 결합할 수 있는 항체가 개체의 혈청에 존재하는지 여부를 확립하는 것에 의해, 이러한 개체의 면역 상태를 시험하기 위한 진단 도구로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 환자에서 RSV 감염의 존재를 검출하기 위한 시험관내 진단 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 a) 상기 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 단백질과 접촉시키는 단계; 및 b) 항체-단백질 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
이러한 방법에 의해 얻을 수 있고/있거나 얻어지는 안정화된 융합-전 RSV F 단백질뿐만 아니라, 위에 기술된 이의 용도 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
실시예
실시예 1: 서열번호: 21의 안정한 융합-전 RSV F 폴리펩티드의 제조
융합-전 형태의 RSV F의 안정성을 증가시키기 위해, 2개의 추가 아미노산 치환을 앞서 기술된 융합-전 RSV F 변이체(국제 공개 제2014/174018호 및 국제 공개 제2014/202570호)에 도입하였다. Gene Art(Life Technologies, Carlsbad, CA)에서 구성체를 합성하고 코돈-최적화하였다. 구성체를 pCDNA2004에 클로닝하거나, 부위-특이적 돌연변이유발 및 PCR을 포함하는 분야 내에서 널리 알려진 표준 방법에 의해 생성하고 서열 결정하였다. 사용된 발현 플랫폼은 293Freestyle 세포(Life Technologies)였다. 293Fectin(Life Technologies)을 제조자의 지침에 따라 사용하여 세포를 일시적으로 형질감염시키고, 37℃ 및 10% CO2에서 5일 동안 배양하였다. 배양 상등액을 수확하고, 300g에서 5분 동안 회전시켜, 세포 및 세포 잔해를 제거하였다. 이후, 회전 상등액을 0.22 um 진공 필터를 사용하여 멸균 여과하고, 사용할 때까지 4℃에 보관하였다.
실시예 2: 융합-전 RSV F 단백질의 정제
재조합 폴리펩타이드를, 초기 정제용 양이온 교환 컬럼 및 후속 연마(polishing) 단계용 superdex200 컬럼을 적용하는 2-단계 정제 프로토콜에 의해 정제하여 잔류하는 오염물을 제거하였다. 초기 이온교환 단계에서, 배양 상등액을 2부피의 50 mM NaOAc pH 5.0으로 희석시키고, 5 mL HiTrap Capto S 컬럼에 분당 5 mL로 통과시켰다. 이어서 컬럼을 10 컬럼 용적(CV)의 20 mM NaOAc, 50 mM NaCl, 0.01%(v/v) 트윈20, pH 5로 세척하고 2 CV의 20 mM NaOAc, 1 M NaCl, 0.01%(v/v) 트윈20, pH 5로 용출시켰다. 용출액을 회전 농축기를 사용하여 농축하고 단백질을 운전 완충액(running buffer)으로서 40mM 트리스, 500mM NaCl, 0.01%(v/v) 트윈20, pH 7.4를 사용하여 superdex200 컬럼으로 추가 정제하였다. 도 1에서는 겔 여과 컬럼의 크로마토그램을 보여준다. 우세한 피크는 융합-전 RSV F 단백질을 포함하였다. 이 피크를 포함하는 분획을 다시 모으고, 단백질 농도를 OD280을 사용하여 결정하고, 사용할 때까지 4℃에 보관하였다. 도 2에서는 최종 단백질 조제물의 비-환원 및 환원 SDS-PAGE 분석을 보여주고, 확인되는 바와 같이 순도는 95% 초과였다. 밴드의 확인은 웨스턴 블로팅 및 단백질 F 특이적 항체를 사용하여 검증하였다(미도시).
상등액에서 단백질 농도를 측정하기 위해 정량적 옥텟(Quantitive Octet, BioLayer 간섭법)을 사용하였다. CR9501(융합-전 RSV F 단백질을 특이적으로 인식하는 항체) 및 CR9503(융합-후 RSV F 단백질을 인식함)을 표준 프로토콜에 의해 비오티닐화하고 스트렙타비딘 바이오센서(ForteBio, Portsmouth, UK)에서 부동화시켰다. 이후, 코팅된 바이오센서를 모의(mock) 세포 배양 상등액에서 차단하였다. 정량적 실험을 다음과 같이 수행하였다: 온도 30℃, 진탕 속도 1000 rpm, 분석 시간 300초.
단백질의 농도는 표준 곡선을 사용하여 계산하였다. 표준 곡선은 모의(mock) 배지로 희석된 융합-전 RSV F 단백질(Krarup et. al., 2015, supra )을 사용하여 각각 코팅된 항체로 제작하였다(도 3). 데이터 분석은 ForteBio Data Analysis 6.4 소프트웨어(ForteBio)를 사용하여 수행하였다.
실시예 3: RSV F 단백질의 온도 안정성
정제된 단백질의 온도 안정성을 시차 주사 형광분석(DSF)에 의해 측정하였다. 정제된 융합-전 F 단백질을 96-웰 광학 qPCR 플레이트에서 SYPRO 오랜지 형광 염료(Life Technologies S6650)와 혼합하였다. 최적 염료 및 단백질 농도를 실험적으로 결정하였다(데이터 미도시). 단백질 희석은 PBS에서 수행하였고, 염료만을 함유하는 음성 대조 샘플을 기준 감산으로 사용하였다. 측정은 qPCR 기기(Applied Biosystems ViiA 7)에서 다음 파라미터를 사용하여 수행하였다: 온도 램프 25 내지 95℃ 초당 0.015℃ 속도. 데이터를 연속적으로 수집하였다. 융해 곡선을 GraphPad PRISM 소프트웨어(버전 5.04)를 사용하여 표시하였다. 비-선형 EC50 시프트 방정식을 사용하여 50% 최대 형광에서 융해 온도를 계산하였다. 서열번호: 21의 RSV F 단백질의 융해 온도는 68.5도였다(도 4). 위치 357 및 371에서의 치환이 없는 기준 융합-전 RSV F는 65.0의 융해 온도를 가졌는데, 이는 이중 돌연변이가 융해 온도를 3.5도 증가시켰음을 의미한다.
Figure 112018128383222-pct00001
Figure 112018128383222-pct00002
서열
RSV F 단백질 전장 서열 서브그룹 A(서열번호: 13)
Figure 112018128383222-pct00003
RSV F 단백질 B1 전장 서열(서열번호: 15)
Figure 112018128383222-pct00004
서열번호: 14( 피브리틴 )
Figure 112018128383222-pct00005
RSV F 단백질 CL57-v224 전장 서열(서열번호: 20)
Figure 112018128383222-pct00006
RSV F, N67I , S215P , D486N , 및 357K 및 371Y(서열번호: 21)
Figure 112018128383222-pct00007
CR9501 중쇄 (서열번호: 16):
Figure 112018128383222-pct00008
CR9501 경쇄 (서열번호: 17):
Figure 112018128383222-pct00009
CR9502 중쇄 (서열번호: 18):
Figure 112018128383222-pct00010
CR9502 경쇄 (서열번호: 19):
Figure 112018128383222-pct00011
SEQUENCE LISTING <110> Crucell Holland B.V. <120> Stabilized pre-fusion RSV F proteins <130> 0274 EP P00 PRI <140> EP16172008.1 <141> 2016-05-30 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 HCDR1 <400> 1 Gly Ala Ser Ile Asn Ser Asp Asn Tyr Tyr Trp Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 HCDR2 <400> 2 His Ile Ser Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 HCDR3 <400> 3 Cys Gly Ala Tyr Val Leu Ile Ser Asn Cys Gly Trp Phe Asp Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 LCDR1 <400> 4 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 LCDR2 <400> 5 Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 LCDR3 <400> 6 Gln Gln Tyr Gln Tyr Leu 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Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Ala Val Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 14 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fibritin <400> 14 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 <210> 15 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV F protein B1 full length sequence <400> 15 Met Glu Leu Leu Ile His Arg Leu Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala 1 5 10 15 Ile Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro 100 105 110 Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser 115 120 125 Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Asn Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly 450 455 460 Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ile 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Lys 565 570 <210> 16 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 heavy chain <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ala Leu Thr Cys Asn Val Ser Gly Ala Ser Ile Asn Ser Asp 20 25 30 Asn Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Arg Pro Gly Gly Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile Ser Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Ser Met Ser Leu Glu Thr Ser Gln Ser Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Ser Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Ala Cys Gly Ala Tyr Val Leu Ile Ser Asn Cys Gly Trp Phe 100 105 110 Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys 225 <210> 17 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 light chain <400> 17 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Ser Val Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Tyr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Ala Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 18 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9502 heavy chain <400> 18 Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly His 20 25 30 Thr Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Val Ser Thr Asn Asn Gly Asn Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Ile 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Met Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Trp Leu Val Met Gly Gly Phe Ala Phe Asp His Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 <210> 19 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9502 light chain <400> 19 Gln Ser Val Leu Thr Gln Ala Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Asn Asn Ile Gly Ser Gln Asn Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Arg Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Arg Asp Gln 85 90 95 Ala Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105 110 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 115 120 125 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 130 135 140 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 145 150 155 160 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 165 170 175 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 180 185 190 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 195 200 205 Ile Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 20 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV F protein CL57-v224 full length sequence <400> 20 Met Glu Leu Pro Ile Leu Lys Thr Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Ala 1 5 10 15 Ala Val Thr Leu Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Asn Asn Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Ile 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Val Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Leu Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Phe Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 21 <211> 544 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV F, N67I, S215P, D486N, and 357K and 371Y <400> 21 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Ile Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Pro Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Lys Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Tyr Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asn Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln 515 520 525 Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 530 535 540

Claims (22)

  1. 위치 67에서의 아미노산 N의 I로의 돌연변이(N67I), 위치 215에서의 아미노산 S의 P로의 돌연변이(S215P), 위치 357에서의 아미노산 T의 K로의 돌연변이(T357K), 위치 371에서의 아미노산 N의 Y로의 돌연변이(N371Y) 및 위치 486에서의 아미노산 D의 N으로의 돌연변이(D486N)을 포함하는 재조합 융합-전 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV) 융합(F) 단백질로, 상기 아미노산 위치는 서열번호: 13을 참조로 부여되는 것인, 융합-전 RSV F 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 단백질은 융합-전 형태 F 단백질에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 포함하는데, 적어도 하나의 에피토프는
    서열 번호 1의 중쇄 CDR1 영역, 서열 번호: 2의 중쇄 CDR2 영역, 서열 번호: 3의 중쇄 CDR3 영역 및 서열 번호: 4의 경쇄 CDR1 영역, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 영역, 및 서열 번호: 6의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 융합-전 특이적 단클론 항체; 및
    서열 번호: 7의 중쇄 CDR1 영역, 서열 번호: 8의 중쇄 CDR2 영역, 서열 번호: 9의 중쇄 CDR3 영역 및 서열 번호: 10의 경쇄 CDR1 영역, 서열 번호: 11의 경쇄 CDR2 영역, 및 서열 번호: 12의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 융합-전 특이적 단클론 항체; 중 하나 이상에 의해 인식되는 융합-전 RSV F 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 단백질은 삼량체인 융합-전 RSV F 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 절단된 F1 도메인 및 상기 절단된 F1 도메인에 연결된 이종 삼량체화 도메인을 포함하는 융합-전 RSV F 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 이종 삼량체화 도메인은 아미노산 서열 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(서열번호: 14)을 포함하는 융합-전 RSV F 단백질.
  6. 제4항에 있어서, 삼량체화 도메인은 RSV F 단백질의 아미노산 잔기 513에 연결되는 융합-전 RSV F 단백질.
  7. 제1항에 있어서, RSV F 단백질은 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합-전 RSV F 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합-전 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, 핵산 분자는 포유류 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 것인 핵산 분자.
  10. 제8항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  11. 제9항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합-전 RSV F 단백질;
    제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합-전 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산 분자; 및
    제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합-전 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터; 중 하나 이상을 포함하는 RSV 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한 것인, 융합-전 RSV F 단백질.
  14. 제8항에 있어서, RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한 것인, 핵산 분자.
  15. 제9항에 있어서, RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한 것인, 핵산 분자.
  16. 제10항에 있어서, RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한 것인, 벡터.
  17. 제11항에 있어서, RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한 것인, 벡터.
  18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한 융합-전 RSV F 단백질.
  19. 제8항에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한, 핵산 분자.
  20. 제9항에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한, 핵산 분자.
  21. 제10항에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한, 벡터.
  22. 제11항에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한, 벡터.

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