ES2836598T3 - Proteínas F de RSV prefusión estabilizadas - Google Patents

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Abstract

Una proteína de fusión (F) de virus sincitial respiratorio (RSV) prefusión recombinante que comprende una mutación del aminoácido S en la posición 215 a P (S215P), una mutación del aminoácido T en la posición 357 a K (T357K) y una mutación del aminoácido N en la posición 371 a Y (N371Y), facilitándose las posiciones de aminoácido con referencia a SEQ ID NO: 13.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas F de RSV prefusión estabilizadas
La presente invención se refiere al campo de la medicina. La invención se refiere en particular a proteínas F de RSV prefusión recombinantes, a moléculas de ácido nucleico que codifican para las proteínas F de RSV, y a usos de las mismas, por ejemplo en vacunas.
Antecedentes de la invención
Tras el descubrimiento del virus sincitial respiratorio (RSV) en la década de 1950, el virus se convirtió pronto en un patógeno reconocido asociado con infecciones del tracto respiratorio inferior y superior en seres humanos. A nivel mundial, se estima que se producen 64 millones de infecciones por RSV cada año dando como resultado 160.000 muertes (WHO Acute Respiratory Infections Update septiembre de 2009). La enfermedad más grave se produce particularmente en bebés prematuros, los ancianos e individuos inmunocomprometidos. En niños menores de 2 años, el RSV es el patógeno del tracto respiratorio más común, siendo la causa de aproximadamente el 50% de las hospitalizaciones debidas a infecciones respiratorias, y el pico de hospitalización se produce a los 2-4 meses de edad. Se ha notificado que casi todos los niños se han infectado con RSV a la edad de dos años. La infección repetida durante la vida se atribuye a una inmunidad natural inefectiva. En los ancianos, la carga de enfermedad por RSV es similar a las provocada por infecciones por gripe A no pandémica.
El RSV es un paramixovirus, que pertenece a la subfamilia de Pneumovirinae. Su genoma codifica para diversas proteínas, incluyendo las proteínas de membrana conocidas como glicoproteína (G) de RSV y proteína de fusión (F) de RSV que son las principales dianas antigénicas para neutralizar anticuerpos. Anticuerpos frente a la parte mediadora de la fusión de la proteína F1 pueden prevenir la captación del virus en la célula y por tanto tienen un efecto neutralizante.
La proteína F de RSV fusiona las membranas del virus y de la célula huésped mediante el replegamiento irreversible de proteínas de la conformación prefusión lábil a la conformación postfusión estable. Se han determinado las estructuras de ambas conformaciones para la proteína F de RSV (McLellan JS, et al. Science 342, 592-598 (2013); McLellan JS, et al. Nat Struct Mol Biol 17, 248-250 (2010); McLellan Js , et al. Science 340, 1113-1117 (2013); Swanson KA, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 9619-9624 (2011)), así como para las proteínas de fusión de paramixovirus relacionados, proporcionando el entendimiento del mecanismo de esta máquina de fusión compleja. Como otras proteínas de fusión de tipo I, el precursor inactivo, RSV F0 , requiere escisión durante la maduración intracelular mediante una proteasa de tipo furina. La proteína F de RSV contiene dos sitios de furina, lo que conduce a tres proteínas: F2, p27 y F1, conteniendo la última un péptido de fusión hidrófobo (FP) en su extremo N-terminal. Con el fin de replegar de la conformación prefusión a la postfusión, la región de replegamiento 1 (RR1) entre el residuo 137 y el 216, que incluye el FP y la repetición en héptada A (HRA), tiene que transformarse de un conjunto de hélices, bucles y hebras a una hélice continua larga. El FP, ubicado en el segmento N-terminal de RR1, es entonces capaz de extenderse alejándose de la membrana viral e insertarse en la membrana proximal de la célula diana. A continuación, la región de replegamiento 2 (RR2), que forma el tallo C-terminal en la espiga F prefusión e incluye la repetición en héptada B (HRB), se reubica en el otro lado de la cabeza F de RSV y se une al trímero de hélice superenrollada HRA con el dominio HRB para formar el haz de seis hélices. La formación de la hélice superenrollada de RR1 y la reubicación de RR2 para completar el haz de seis hélices son los cambios estructurales más drásticos que se producen durante el proceso de replegamiento.
Una vacuna frente a la infección por RSV no está disponible actualmente, pero se desea debido a la alta carga de enfermedad. La glicoproteína de fusión de RSV (F de RSV) es un antígeno de vacuna atractivo es la diana principal de los anticuerpos neutralizantes en los sueros humanos. La mayoría de los anticuerpos neutralizantes en los sueros humanos van dirigidos contra la conformación prefusión pero, debido a su inestabilidad, la conformación prefusión es propensa a replegarse prematuramente para dar la conformación postfusión, tanto en disolución y sobre la superficie de los viriones. Tal como se indicó anteriormente, estructuras cristalinas han revelado un gran cambios conformacional entre los estados prefusión y postfusión. La magnitud de la transposición sugirió que solo una parte de los anticuerpos dirigidos hacia la conformación postfusión de RSV-F serán capaces de reaccionar de manera cruzada con la conformación nativa de la espiga prefusión sobre la superficie del virus. Por consiguiente, los esfuerzos por producir una vacuna frente a RSV se han centrado en desarrollar vacunas que contienen formas prefusión de proteína F de RSV (véanse, por ejemplo, los documentos WO20101149745, WO2010/1149743, WO2009/1079796, WO2012/158613). Sin embargo, estos esfuerzos no han dado aún proteínas F de RSV prefusión estables que puedan usarse como candidatos para pruebas en seres humanos.
Por tanto, sigue habiendo una necesidad de vacunas eficientes frente a RSV, en particular vacunas que comprendan proteínas F de RSV en la conformación prefusión. La presente invención pretende proporcionar tales proteínas F de RSV prefusión estables para su uso en la vacunación frente a RSV de una manera segura y eficaz.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona proteínas de fusión (F) de virus sincitial respiratorio (RSV) prefusión, recombinantes, estables, es decir proteínas F de RSV recombinantes que están estabilizadas en la conformación prefusión tal como se define en las reivindicaciones, y fragmentos de las mismas. Las proteínas F de RSV, o fragmentos de las mismas, comprenden al menos un epítopo que es específico para la proteína F de conformación prefusión. En ciertas realizaciones, las proteínas F de RSV prefusión son proteínas solubles. En ciertas realizaciones, las proteínas F de RSV son trímeros. En ciertas realizaciones, las proteínas F de RSV son multímeros de proteínas F de RSV triméricas. La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican para las proteínas F de RSV prefusión, o fragmentos de las mismas, así como vectores que comprenden tales moléculas de ácido nucleico.
La invención también se refiere a composiciones, preferiblemente composiciones inmunogénicas, que comprenden una proteína F de RSV, una molécula de ácido nucleico y/o un vector, y a el uso de las mismas en la inducción de una respuesta inmunitaria frente una proteína F de RSV, en particular al uso de las mismas como vacuna. La invención se refiere también a métodos para inducir una respuesta inmunitaria anti-virus sincitial respiratorio (RSV) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una proteína F de RSV prefusión, una molécula de ácido nucleico que codifica para dicha proteína F de RSV y/o un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria inducida se caracteriza por anticuerpos neutralizantes para RSV y/o inmunidad protectora frente a RSV. En aspectos particulares, la divulgación se refiere a un método para inducir anticuerpos F anti-virus sincitial respiratorio (RSV) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición inmunogénica que comprende una proteína F de RSV prefusión, una molécula de ácido nucleico que codifica para dicha proteína F de RSV y/o un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico.
Breve descripción de las figuras
FIG. 1: Purificación de proteína F con mutaciones N67I, S215P, T357K, N371Y y D486N. Cromatograma de filtración en gel Superdex200 del eluato de la columna de intercambio iónico. La flecha indica el pico recogido.
FIG. 2: A) Análisis SDS-PAGE de la muestra de proteína F N67I, S215P, T357K, N371Y, D486N que contiene un pico del cromatograma SEC en condiciones reductoras (R) y no reductoras (NR). Los geles se tiñen con azul brillante de Coomassie.
FIG. 3 : La concentración de proteína de proteína F de RSV purificada F N67I, S215P, T357K, N371Y, D486N se midió mediante el ensayo Q Octet con los anticuerpos monoclonales CR9501 y CR9503. CR9501 solo se une a la proteína F de RSV en la conformación prefusión. CR9503 se une la proteína F de RSV tanto en la conformación prefusión como en la conformación postfusión. Se representa gráficamente como media±DE.
FIG. 4 : Estabilidad a la temperatura de la proteína F de RSV F N67I, S215P, T357K, N371Y, D486N. Temperatura de fusión (Tf °C) determinada mediante un ensayo de fluorimetría de barrido diferencial (DSF) con colorante fluorescente SyproOrange. La introducción de las sustituciones T357K y N371Y aumentó la Tf de PRPM de 3,5 grados a 68,5 grados.
Descripción detallada de la invención
La proteína de fusión (F) del virus sincitial respiratorio (RSV) está implicada en la fusión de la membrana viral con una membrana de célula huésped, lo que se requiere para la infección. El ARNm de la proteína F de RSV se traduce a una proteína precursora de 574 aminoácidos denominada F0, que contiene una secuencia de péptido señal en el extremo N-terminal (por ejemplo, residuos de aminoácido 1-26 de SEQ ID NO: 13) que se elimina mediante una peptidasa señal en el retículo endoplásmico. F0 se escinde en dos sitios (entre los residuos de aminoácido 109/110 y 136/137) mediante proteasas celulares (en particular furina, o de tipo furina)) eliminando una secuencia intercalada glicosilada corta (también denominada región p27, que comprende los residuos de aminoácido 110 a 136, y que genera dos dominios o subunidades denominados F1 y F2. El dominio F1 (residuos de aminoácido 137-574) contiene un péptido de fusión hidrófobo en su extremo N-terminal y el extremo C-terminal contiene la región transmembrana (TM) (residuos de aminoácido 530-550) y citoplásmica (residuos de aminoácido 551 -574). El dominio F2 (residuos de aminoácido 27-109) está ligado covalentemente a F1 mediante dos puentes disulfuro. Los heterodímeros F1-F2 se ensamblan como homotrímeros en el virión.
Una vacuna frente a la infección por RSV aún no está disponible actualmente. Un enfoque potencial a la producción de una vacuna es una vacuna subunitaria basada en proteína F de RSV purificada. Sin embargo, para este enfoque es deseable que la proteína F de RSV purificada esté en una conformación que se asemeje a la conformación del estado prefusión de la proteína F de RSV, que sea estable en el tiempo y que pueda producirse en cantidades suficientes. Además, para una vacuna de base subunitaria, soluble, es necesario truncar la proteína F de RSV mediante la deleción de la región transmembrana (TM) y la citoplásmica para crear una proteína F secretada soluble (sF). Dado que la región TM es responsable del anclaje en la membrana y la estabilidad, la proteína F soluble sin anclaje es considerablemente más lábil que la proteína de longitud completa y se replegará fácilmente para dar el estado final postfusión. Por tanto, con el fin de obtener proteína F soluble en la conformación prefusión estable que muestra altos niveles de expresión y alta estabilidad, es necesario estabilizar la conformación prefusión. Dado que también la proteína F de RSV de longitud completa (unida a membrana) es metaestable, la estabilización de la conformación prefusión también es deseable para la proteína F de RSV de longitud completa, por ejemplo, para cualquier enfoque atenuado vivo o basado en vector.
Para la estabilización de proteína F de RSV soluble, que se escinde para dar la subunidad F1 y F2, en la conformación prefusión, se fusionó un dominio de trimerización a base de fibritina con el extremo C-terminal del extremo C-terminal de RSV-F soluble (McLellan etal., Nature Struct. Biol. 17: 2-248-250 (2010); McLellan etal,, Science 340(6136): 1113­ 7 (2013)). Este dominio de fibritina o “Foldon” se deriva de fibritina T4 y se describió anteriormente como un dominio de trimerización natural artificial (Letarov et al., Biochemistry Moscow 64: 817-823 (1993); S-Guthe et al., J. Mol. Biol.
337: 905-915. (2004)). Sin embargo, el dominio de trimerización no da como resultado una proteína RSV-F prefusión estable (Krarup et al., Nature Comm. 6:8143, (2015)). Además, estos esfuerzos aún no han dado como resultado candidatos adecuados para pruebas en seres humanos.
Recientemente, hemos descritos combinaciones de varias mutaciones que son capaces de estabilizar la proteína F de RSV en la conformación prefusión (documentos WO2014/174018 y WO2014/202570). Por tanto, se han descrito proteínas F de RSV prefusión estables que comprenden una mutación del residuo de aminoácido en la posición 67 y/o una mutación del residuo de aminoácido en la posición 215, preferiblemente una mutación de residuo de aminoácido N/T en la posición 67 a I y/o una mutación de residuo de aminoácido S en la posición 215 a P. Además, se han descrito proteínas F de RSV prefusión solubles que comprenden un dominio F1 truncado, y que comprenden una mutación del residuo de aminoácido en la posición 67 y/o una mutación del residuo de aminoácido en la posición 215, preferiblemente una mutación de residuo de aminoácido N/T en la posición 67 a I y/o una mutación de residuo de aminoácido S en la posición 215 a P, comprendiendo la proteína un dominio de trimerización heterólogo ligado a dicho dominio F1 truncado. Se han descrito proteínas F de RSV prefusión adicionales, comprendiendo las proteínas al menos una mutación adicional, tal como una mutación del residuo de aminoácido D en la posición 486 a N.
Según la presente invención se ha encontrado que la introducción de otras dos mutaciones, es decir en las posiciones 357 y 371 (numeración según SEQ ID NO: 13) también estabiliza la proteína en la conformación prefusión.
Por tanto, la presente invención proporciona proteínas F prefusión recombinantes que comprenden una mutación del residuo de aminoácido en la posición 215, en particular una mutación del aminoácido S en la posición 215 a P (S215P), en combinación con una mutación de los aminoácidos en las posiciones 357, en particular una mutación del aminoácido T en la posición 357 a K (T357K) y una mutación del aminoácido en la posición 371, en particular una mutación del aminoácido N en la posición 371 a Y (N371Y).
Por tanto, la presente invención proporciona una combinación única de mutaciones para proporcionar proteínas F de RSV recombinantes prefusión estables, es decir proteínas F de RSV que están estabilizadas en la conformación prefusión, o fragmentos de las mismas. Las proteínas F de RSV prefusión estables de la invención, o fragmentos de las mismas, están en la conformación prefusión, es decir comprenden (presentan) al menos un epítopo que es específico para la proteína F de conformación prefusión. Un epítopo que es específico para la proteína F de conformación prefusión es un epítopo que no se presenta en la conformación postfusión. Sin querer restringirse a ninguna teoría particular, se cree que la conformación prefusión de proteína F de RSV puede contener epítopos que son los mismos que aquellos en la proteína F de RSV expresada en viriones de RSV naturales, y por tanto puede proporcionar ventajas para obtener anticuerpos neutralizantes protectores.
En ciertas realizaciones, las proteínas F de RSV prefusión de la invención, o fragmentos de las mismas, comprenden al menos un epítopo que se reconoce por un anticuerpo monoclonal específico prefusión, que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ iD NO: 2, una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 3 y una región CDR1 de cadena ligera de SEQ ID NO: 4, una región CDR2 de cadena ligera de SEQ ID NO: 5 y una región CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 6 (denominado a continuación en el presente documento CR9501) y/o un anticuerpo monoclonal específico prefusión, que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ iD NO: 7, una región CDR2 de cadena pesada de SeQ ID NO: 8, una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y una región CDR1 de cadena ligera de SEQ ID NO: 10, una región CDR2 de cadena ligera de SEQ ID NO: 11 y una región CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 12 (denominado CR9502). CR9501 y CR9502 comprenden las regiones variables de cadena pesada y ligera, y por tanto las especificidades de unión, de los anticuerpos 58C5 y 30D8, respectivamente, que se ha mostrado previamente que se unen específicamente a la proteína F de RSV en su conformación prefusión y no a la conformación postfusión (véase el documento WO2012/006596).
En ciertas realizaciones, las proteínas F de RSV prefusión recombinantes son triméricas.
Tal como se usa en toda la presente solicitud, las secuencias de nucleótidos se proporcionan en el sentido de 5’ a 3’, y las secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal al extremo C-terminal, como es habitual en la técnica.
Tal como se indicó anteriormente, los fragmentos de la proteína F de RSV prefusión también están abarcados por la presente invención. El fragmento puede resultar de cualquiera o ambas de deleciones aminoterminales (por ejemplo, eliminando mediante escisión la secuencia señal) y carboxiterminales (por ejemplo, delecionando la región transmembrana y/o cola citoplásmica). El fragmento puede elegirse para que comprenda un fragmento inmunológicamente activa de la proteína F, es decir una parte que dará lugar a una respuesta inmunitaria en un sujeto. Esto puede determinarse fácilmente usando métodos in síIíco , in vitro y/o in vivo, todos rutinarios para el experto en la técnica.
En ciertas realizaciones, las proteínas codificadas o fragmentos de las mismas según la invención comprenden una secuencia señal, también denominada secuencia líder o péptido señal, que corresponde a los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 13. Las secuencias señal son secuencias de aminoácidos normalmente cortas (por ejemplo, 5-30 aminoácidos de longitud) presentes en el extremo N-terminal de la mayoría de las proteínas sintetizadas últimamente que están destinadas a la vía secretora, y se escinden normalmente mediante la peptidasa señal para generar un péptido señal libre y una proteína madura.
En ciertas realizaciones, las proteínas o fragmentos de las mismas según la invención no comprenden una secuencia señal.
En ciertas realizaciones, las (fragmentos de las) proteínas F de RSV prefusión son solubles. En ciertas realizaciones, las proteínas F de RSV prefusión estables o fragmentos de las mismas según la invención comprenden un dominio F1 truncado, y comprenden un dominio de trimerización heterólogo ligado a dicho dominio F1 truncado. Según la invención, se mostró que ligando un dominio de trimerización heterólogo al residuo de aminoácido C-terminal de un dominio F1 truncado, combinado con la(s) mutación/mutaciones estabilizante(s), se proporcionan proteínas F de RSV solubles que muestran una alta expresión y que se unen a anticuerpos específicos prefusión, lo que indica que las proteínas están en la conformación prefusión. Además, las proteínas F de RSV están estabilizadas en la conformación prefusión, es decir incluso tras el procesamiento de las proteínas todavía se unen a los anticuerpos específicos prefusión CR9501 y/o CR9502, lo que indica que se conserva el epítopo específico prefusión.
En ciertas realizaciones, las proteínas F de RSV son multímeros de proteínas F de RSV triméricas. Por tanto, en algunas realizaciones, las proteínas F de RSV pueden comprender un dominio de ensamblaje para ensamblajes de orden superior de trímeros.
Se sabe que el RSV existe como serotipo único que tiene dos subgrupos antigénicos: A y B. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas F procesadas maduras de los dos grupos son idénticas en aproximadamente un 93%. Tal como se usa en toda la presente solicitud, las posiciones de aminoácido se facilitan con referencia a la secuencia de proteína F de RSV del subgrupo A (SEQ ID NO: 13). Por tanto, tal como se usa en la presente invención, la expresión “el aminoácido en la posición “x” de la proteína F de RSV significa el aminoácido correspondiente al aminoácido en la posición “x” en la proteína F de RSV de SEQ ID NO: 13. Obsérvese que, en el sistema de numeración usado en toda esta solicitud, 1 se refiere al aminoácido N-terminal de una proteína F0 inmadura (SEQ ID NO: 13). Cuando se usa otra cepa de RSV, las posiciones de aminoácido de la proteína F tienen que numerarse con referencia a la numeración de la proteína F de SEQ ID NO: 13 alineando las secuencias de la otra cepa de RSV con la proteína F de SEQ ID NO: 13 con la inserción de huecos según sea necesario. Los alineamientos de secuencia pueden realizarse usando métodos ampliamente conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante CLUSTALW, Bioedit o CLC Workbench.
En ciertas realizaciones, la cepa de RSV es la cepa de RSV de SEQ ID NO: 20.
En ciertas realizaciones, la cepa de RSV es una cepa de RSV B. En ciertas realizaciones, la cepa de RSV es la cepa de RSV B de SEQ ID NO: 15.
Un aminoácido según la invención puede ser cualquiera de los veinte que se producen de manera natural (o aminoácidos “estándar”) o variantes de los mismos, tal como por ejemplo, aminoácidos D (los enantiómeros D de aminoácidos con un centro quiral), o cualquier variante que no es encuentre de manera natural en proteínas, tales como, por ejemplo, norleucina. Los aminoácidos estándar pueden dividirse en varios grupos basándose en sus propiedades. Factores importantes son la carga, la hidrofilicidad o hidrofobicidad, el tamaño y los grupos funcionales. Estas propiedades son importantes para la estructura de la proteína y las interacciones proteína-proteína. Algunos aminoácidos tienen propiedades especiales tales como la cisteína, que puede formar enlaces disulfuro covalentes (o puentes disulfuro) con otros residuos de cisteína, la prolina, que induce giros de la estructura principal de la proteína, y la glicina, que es más flexible que otros aminoácidos. La tabla 1 muestra las abreviaturas y propiedades de los aminoácidos estándar.
Un experto en la técnica apreciará que las mutaciones pueden hacerse en la proteína mediante procedimientos de biología molecular rutinarios. Las mutaciones según la invención dan como resultado preferiblemente niveles de expresión aumentados y/o una estabilización aumentada de las proteínas F de RSV prefusión en comparación con proteínas F de RSV que no comprenden esta(s) mutación/mutaciones.
En ciertas realizaciones, las proteínas F de RSV prefusión o fragmentos de las mismas comprenden al menos una mutación adicional seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una mutación del residuo de aminoácido en la posición 67; y
(b) una mutación del residuo de aminoácido en la posición 486.
Según la invención, la al menos una mutación adicional se selecciona del grupo que consiste en:
(a) una mutación del residuo de aminoácido N/T en la posición 67 a I; y
(b) una mutación del residuo de aminoácido D en la posición 486 a N.
En ciertas realizaciones, las proteínas F de RSV prefusión o fragmentos de las mismas comprenden al menos cuatro mutaciones (en comparación con una proteína F de RV de tipo silvestre, por ejemplo, la que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 13). En ciertas realizaciones, las proteínas o fragmentos de las mismas comprenden al menos cinco mutaciones.
En ciertas realizaciones, las proteínas o fragmentos de las mismas comprenden al menos seis mutaciones.
Los polipéptidos F de RSV prefusión pueden comprender al menos una mutación adicional seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una mutación del residuo de aminoácido en la posición 46;
(b) una mutación del residuo de aminoácido en la posición 83;
(c) una mutación del residuo de aminoácido en la posición 92;
(d) una mutación del residuo de aminoácido en la posición 184;
(e) una mutación del residuo de aminoácido en la posición 203;
(f) una mutación del residuo de aminoácido en la posición 207; y
(g) una mutación del residuo de aminoácido en la posición 487.
La al menos una mutación adicional puede seleccionarse del grupo que consiste en:
(a) una mutación del residuo de aminoácido S en la posición 46 a G;
(b) una mutación del residuo de aminoácido L en la posición 83 a M:
(c) una mutación del residuo de aminoácido E en la posición 92 a D;
(d) una mutación del residuo de aminoácido G en la posición 184 a N;
(e) una mutación del residuo de aminoácido L en la posición 203 a I;
(f) una mutación del residuo de aminoácido V en la posición 207 a I: y
(g) una mutación del residuo de aminoácido E en la posición 487 a Q, N o I.
En ciertas otras realizaciones, el dominio de trimerización heterólogo comprende la secuencia de aminoácidos GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 14).
Tal como se describió anteriormente, en ciertas realizaciones, las proteínas de la invención o fragmentos de las mismas comprenden un dominio F1 truncado. Tal como se usa en el presente documento, un dominio F1 “truncado” se refiere a un dominio F1 que no es un dominio F1 de longitud completa, es decir en el que o bien de manera N-terminal o bien de manera C-terminal se han delecionado uno o más residuos de aminoácido. Según la invención, al menos el domino transmembrana y la cola citoplásmica se han delecionado para permitir la expresión como ectodominio soluble.
En ciertas otras realizaciones, el dominio de trimerización está ligado al residuo de aminoácido 513 del dominio F1 de RSV. Por tanto, en ciertas realizaciones, el dominio de trimerización comprende SEQ ID NO: 14 y está ligado al residuo de aminoácido 513 del dominio F1 de RSV.
En ciertas realizaciones, la proteína F de RSV de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
En ciertas realizaciones, el nivel de expresión de las proteínas F de RSV prefusión de la invención está aumentado, en comparación con una proteína F de RSV de tipo silvestre. En ciertas realizaciones, el nivel de expresión está aumentado al menos 5 veces, preferiblemente hasta 10 veces. En ciertas realizaciones, el nivel de expresión está aumentado más de 10 veces.
Las proteínas F de RSV prefusión según la invención son estables, es decir no cambian fácilmente a la conformación postfusión tras el procesamiento de las proteínas, tales como por ejemplo, purificación, ciclos de congelacióndescongelación y/o almacenamiento, etc.
En ciertas realizaciones, las proteínas F de RSV prefusión según la invención tienen una estabilidad aumentada tras el almacenamiento a 4°C en comparación con una proteína F de RSV sin la(s) mutación/mutaciones. En ciertas realizaciones, las proteínas son estables tras el almacenamiento a 4°C durante al menos 30 días, preferiblemente al menos 60 días, preferiblemente al menos 6 meses, incluso más preferiblemente al menos 1 año. Con “estables tras el almacenamiento” quiere decirse que las proteínas todavía presentan el al menos un epítopo específico para un anticuerpo específico prefusión (por ejemplo, CR9501) tras el almacenamiento de la proteína en disolución (por ejemplo, medio de cultivo) a 4°C durante al menos 30 días. En ciertas realizaciones, las proteínas presentan el al menos un epítopo específico prefusión durante al menos 6 meses, preferiblemente durante al menos 1 año tras el almacenamiento de las proteínas F de RSV prefusión a 4°C.
En ciertas realizaciones, las proteínas F de RSV prefusión según la invención tienen una estabilidad aumentada cuando se someten a calor, en comparación con proteínas F de RSV sin dicha(s) mutación/mutaciones. En ciertas realizaciones, las proteínas F de REV prefusión son estables al calor durante al menos 30 minutos a una temperatura de 55°C, preferiblemente a 58°C, más preferiblemente a 60°C. Con “estables al calor” quiere decirse que las proteínas todavía presentan el al menos un epítopo específico prefusión tras haberse sometido durante al menos 30 minutos a una temperatura aumentada (es decir a temperatura de 55°C o mayor), por ejemplo, tal como se determina usando un método tal como se describe en los ejemplos (véase la figura 4).
En ciertas realizaciones, las proteínas presentan el al menos un epítopo específico prefusión tras haberse sometido a de 1 a 6 ciclos de congelación-descongelación en un tampón de formulación apropiado.
Tal como se usa en toda la presente solicitud, las secuencias de nucleótidos se proporcionan en el sentido de 5’ a 3’, y las secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal al extremo C-terminal, tal como es habitual en la técnica.
En ciertas realizaciones, las proteínas codificadas según la invención comprenden además una secuencia líder, también denominada secuencia señal o péptido señal, que corresponde a los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 13. Este es un péptido corto (normalmente de 5-30 aminoácidos de longitud) presente en el extremo N-terminal de la mayoría de las proteínas sintetizadas últimamente que están destinadas a la vía secretora. En ciertas realizaciones, las proteínas según la invención no comprenden una secuencia líder.
En ciertas realizaciones, las proteínas comprenden una etiqueta HIS. Una etiqueta His o etiqueta de polihistidina es un motivo de aminoácido en proteínas que consiste en al menos cinco residuos de histidina (H), a menudo en el extremo N- o C-terminal de la proteína, que se usa generalmente con fines de purificación.
La presente invención proporciona además moléculas de ácido nucleico que codifican para las proteínas F de RSV según la invención.
En realizaciones preferidas, las moléculas de ácido nucleico que codifican para las proteínas según la invención están optimizadas por codón para la expresión en células de mamífero, preferiblemente células humanas. Métodos de optimización por codón se conocen y se han descrito previamente (por ejemplo, documento WO 96/09378). Una secuencia se considera optimizada por codón si al menos un codón no preferido en comparación con una secuencia de tipo silvestre está reemplazado por un codón que es más preferido. En el presente documento, un codón no preferido es un codón que se usa menos frecuentemente en un organismo que otro codón que codifica para el mismo aminoácido, y un codón que es más preferido es un codón que se usa más frecuentemente en un organismo que un codón no preferido. La frecuencia de utilización de codones para un organismo específico puede encontrarse en tablas de frecuencia de codones, tal como en http://www.kazusa.ojp/codon. Preferiblemente más de un codón no preferido, preferiblemente la mayoría de o todos los codones no preferidos, están reemplazados por codones que son más preferidos. Preferiblemente, los codones usados más frecuentemente en un organismo se usan en una secuencia optimizada por codón. El reemplazo por codones preferidos conduce generalmente a una mayor expresión.
Un experto en la técnica entenderá que numerosos polinucleótidos y moléculas de ácido nucleico diferentes pueden codificar para la misma proteína como resultado de la degeneración del código genético. También se entiende que los expertos en la técnica pueden, usando técnicas rutinarias, hacer sustituciones de nucleótido que no afecten a la secuencia de proteína codificada por las moléculas de ácido nucleico para reflejar la utilización de codones de cualquier organismos huésped particular en el que vayan a expresarse las proteínas. Por tanto, a menos que se especifique lo contrario, una “secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos” incluye todas las secuencias de nucleótidos que sean versiones degeneradas entre sí y que codifiquen para la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas y ARN pueden incluir o no intrones.
Las secuencias de ácido nucleico pueden clonarse usando técnicas de biología molecular rutinarias, o generarse de novo mediante síntesis de ADN, que puede realizarse usando procedimientos rutinarios mediante empresas de servicios que hacen negocio en el campo de la síntesis de ADN y/o la clonación molecular (por ejemplo, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).
La invención también proporciona vectores que comprenden una molécula de ácido nucleico tal como se describió anteriormente. Por tanto, en ciertas realizaciones, una molécula de ácido nucleico según la invención forma parte de un vector. Tales vectores pueden manipularse fácilmente mediante métodos ampliamente conocidos por el experto en la técnica, y pueden, por ejemplo, diseñarse para ser capaces de replicación en células procariotas y/o eucariotas. Además, pueden usarse muchos vectores para la transformación de células eucariotas y se integrarán en su totalidad o en parte en el genoma de tales células, dando como resultado células huésped estables que comprenden el ácido nucleico deseado en su genoma. El vector usado puede ser cualquier vector que sea adecuado para clonar ADN y que pueda usarse para la transcripción de un ácido nucleico de interés. Vectores adecuados según la invención son, por ejemplo, adenovectores, alfavirus, paramixovirus, virus Vaccinia, virus del herpes, vectores retrovirales, etc. El experto en la técnica es capaz de elegir vectores de expresión adecuados y de insertar las secuencias de ácido nucleico de la invención de una manera funcional.
Las células huésped que comprenden las moléculas de ácido nucleico que codifican para las proteínas F de RSV prefusión forman también parte de la invención. Las proteínas F de RSV prefusión pueden producirse a través de tecnología de ADN recombinante que implica la expresión de las moléculas en células huésped, por ejemplo, célula de ovario de hámster chino (CHO), líneas de células tumorales, células BHK, líneas cellares humanas tales como células HEK293, células PER.C6, o células de levadura, de hongo, de insecto, y similares, o plantas o animales transgénicos no humanos. En ciertas realizaciones, las células son de un organismo multicelular, en ciertas realizaciones son de origen vertebrado o invertebrado. En ciertas realizaciones, las células son células de mamífero. En ciertas realizaciones, las células son células humanas. En general, la producción de proteínas recombinantes, tales como las proteínas F de RSV prefusión de la invención, en una célula huésped comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica para la proteína en un formato expresable en la célula huésped, cultivando las células en condiciones que conducen a la expresión de la molécula de ácido nucleico y permitiendo la expresión de la proteína en dicha célula. La molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína en formato expresable puede estar en forma de un casete de expresión, y habitualmente requiere secuencias capaces de llevar a cabo la expresión del ácido nucleico, tal como potenciador(es), promotor, señal de poliadenilación y similares. El experto en la técnica es consciente de que pueden usarse diversos promotores para obtener la expresión de un gen en células huésped. Los promotores pueden ser constitutivos o regulados, y pueden obtenerse de diversas fuentes, incluyendo virus, fuentes procariotas o eucariotas, o diseñarse artificialmente.
Medios de cultivo celular están disponibles de diversos vendedores y un medio adecuado puede elegirse de manera rutinaria para una célula huésped para expresar la proteína de interés, en este caso las proteínas F de RSV prefusión. El medio adecuado puede contener o no suero.
Una “molécula de ácido nucleico heteróloga” (también denominada en el presente documento “transgén”) es una molécula de ácido nucleico que no está presente de manera natural en la célula huésped. Se introduce en, por ejemplo, un vector mediante técnicas de biología molecular estándar. Un transgén está generalmente ligado de manera operativa a secuencias de control de expresión. Esto puede realizarse, por ejemplo, colocando el ácido nucleico que codifica para el transgén/los transgenes bajo el control de un promotor. Pueden añadirse secuencias reguladoras adicionales. Pueden usarse muchos promotores para la expresión de un transgén (transgenes) y son conocidos para el experto en la técnica, por ejemplo, pueden comprender promotores sintéticos, de mamífero, virales, y similares. Un ejemplo no limitativo de un promotor adecuado para obtener la expresión en células eucariotas es un promotor de CMV (documento US 5.385.839), por ejemplo, el promotor temprano inmediato de CMV, por ejemplo, que comprende los nt. -735 a 95 del potenciador/promotor del gen temprano inmediato de CMV. Una señal de poliadenilación, por ejemplo, la señal poliA de hormona de crecimiento bovina (documento US 5.122.458), puede estar presente detrás del transgén/de los transgenes. Alternativamente, varios vectores de expresión ampliamente usados están disponibles en la técnica y de fuentes comerciales, por ejemplo, las series de vectores pcDNA y pEF de Invitrogen, pMSCV y pTK-Hyg de BD Sciences, pCMV-Script de Stratagene, etc., que pueden usarse para expresar de manera recombinante la proteína de interés, o para obtener promotores y/o secuencias de terminación de transcripción, secuencias de poliA, y similares adecuados.
El cultivo celular puede ser cualquier tipo de cultivo celular, incluyendo cultivo celular adherente, por ejemplo, células unidas a la superficie de un recipiente de cultivo o a microportadores, así como cultivo en suspensión. La mayoría de los cultivos en suspensión a gran escala se hacen funcionar como procesos por lotes o alimentados por lotes porque son los más directos de operar y aumentar a escala. Hoy en día, los procesos continuos basados en principios de perfusión están pasando a ser más comunes y también son adecuados. Medios de cultivo adecuados también los conoce ampliamente el experto en la técnica y pueden obtenerse generalmente de fuentes comerciales en grandes cantidades, o prepararse de manera personalizada según protocolos estándar. El cultivo puede realizarse, por ejemplo, en placas, frascos rotativos o en biorreactores, usando sistemas por lotes, alimentados por lotes, continuos y similares. Se conocen las condiciones adecuadas para cultivar células (véanse, por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Paterson, editores (1973), y R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, cuarta edición (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)).
La invención proporciona además composiciones que comprenden una proteína F de RSV prefusión y/o una molécula de ácido nucleico, y/o un vector, tal como se describió anteriormente. Por tanto, la invención proporciona composiciones que comprenden una proteína F de RSV prefusión que presenta un epítopo que está presente en una conformación prefusión de la proteína F de RSV, pero está ausente en la conformación postfusión. La invención también proporciona composiciones que comprenden una molécula de ácido nucleico y/o un vector, que codifica para tal proteína F de RSV prefusión. La invención proporciona además composiciones inmunogénicas que comprenden una proteína F de RSV prefusión, y/o una molécula de ácido nucleico y/o un vector, tal como se describió anteriormente. La invención también proporciona el uso de una proteína F de RSV prefusión estabilizada, una molécula de ácido nucleico y/o un vector, según la invención, para inducir una respuesta inmunitaria frente una proteína F de RSV en un sujeto. Se proporcionan además métodos para inducir una respuesta inmunitaria frente una proteína F de RSV en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una proteína F de RSV prefusión, y/o una molécula de ácido nucleico y/o un vector, según la invención. También se proporcionan proteínas F de RSV prefusión, moléculas de ácido nucleico y/o vectores, según la invención, para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria frente una proteína F de RSV en un sujeto. Se proporciona además el uso de las proteínas F de RSV prefusión, y/o moléculas de ácido nucleico y/o vectores según la invención para la fabricación de un medicamento para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria frente una proteína F de RSV en un sujeto.
Las proteínas F de RSV prefusión, moléculas de ácido nucleico o vectores de la invención pueden usarse para la prevención (profilaxis) y/o el tratamiento de infecciones por RSV. En ciertas realizaciones, la prevención y/o el tratamiento puede ir dirigido a grupos de pacientes que son susceptibles de infección por RSV. Tales grupos de pacientes incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, los ancianos (por ejemplo, > 50 años de edad, > 60 años de edad, y preferiblemente > 65 años de edad), los jóvenes (por ejemplo, < 5 años de edad, < 1 año de edad), pacientes hospitalizados y pacientes que han sido tratados con un compuesto antiviral pero han mostrado una respuesta antiviral inadecuada.
Las proteínas F de RSV prefusión, moléculas de ácido nucleico y/o vectores según la invención pueden usarse, por ejemplo, en el tratamiento y/o la profilaxis independiente de una enfermedad o estado provocado por RSV, o en combinación con otros tratamientos profilácticos y/o terapéuticos, tales como vacunas, agentes antivirales y/o anticuerpos monoclonales (existentes o futuros).
La invención proporciona además métodos para prevenir y/o tratar la infección por RSV en un sujeto utilizando las proteínas F de RSV prefusión, moléculas de ácido nucleico y/o vectores según la invención. En una realización específica, un método para prevenir y/o tratar la infección por RSV en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de una proteína F de RSV prefusión, molécula de ácido nucleico y/o un vector, tal como se describió anteriormente. Una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a una cantidad de una proteína, molécula de ácido nucleico o vector, que es efectiva para prevenir, mejorar y/o tratar una enfermedad o estado que resulta de la infección por RSV. La prevención abarca inhibir o reducir la propagación de RSV o inhibir o reducir la aparición, el desarrollo o la progresión de uno o más de los síntomas asociados con la infección por RSV. Mejora, tal como se usa en el presente documento, puede hacer referencia a la reducción de síntomas de enfermedad visibles o perceptibles, viremia o cualquier otra manifestación medible de infección por influenza.
Para la administración a sujetos, tales como seres humanos, la invención puede emplear composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína F de RSV prefusión, una molécula de ácido nucleico y/o un vector tal como se describe en el presente documento, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En el presente contexto, el término “farmacéuticamente aceptable” significa que el portador o excipiente, a las dosificaciones y concentraciones empleadas, no provocará ningún efecto no deseado o dañino en los sujetos a los que se administran. Tales portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen ampliamente en la técnica (véanse Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). Las proteínas F de RSV, o moléculas de ácido nucleico, se formulan y administran preferiblemente como disolución estéril, aunque también puede ser posible utilizas preparaciones liofilizadas. Las disoluciones estériles se preparan mediante filtración estéril o mediante otros métodos en sí conocidos en la técnica i. Las disoluciones se liofilizan o se cargan entonces en recipientes de dosificación farmacéuticos. El pH de la disolución está generalmente en el intervalo de pH 3,0 a 9,5, por ejemplo, de pH 5,0 a 7,5. Las proteínas F de RSV están normalmente en una disolución que tiene un tampón farmacéuticamente aceptable adecuado, y la composición también puede contener una sal. Opcionalmente puede estar presente agente estabilizante, tal como albúmina. En ciertas realizaciones se añade detergente. En ciertas realizaciones, las proteínas F de RSV pueden formularse en una preparación inyectable.
En ciertas realizaciones, una composición según la invención comprende además uno o más adyuvantes. Se conoce en la técnica que los adyuvantes aumentan adicionalmente la respuesta inmunitaria a un determinante antigénico aplicado. Los términos “adyuvante” y “estimulante inmunitario” se usan de manera intercambiable en el presente documento, y se definen como una o más sustancias que provocan la estimulación del sistema inmune. En este contexto, un adyuvante se usa para potenciar una respuesta inmunitaria a las proteínas F de RSV de la invención. Los ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen sales de aluminio tales como hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio; composiciones de emulsión en aceite (o composiciones de aceite en agua), incluyendo emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 (véase, por ejemplo, el documento WO 90/14837); formulaciones de saponina, tales como, por ejemplo, QS21 e Immunostimulating Complexes (ISCOMS) (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.057.540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); derivados bacterianos o microbianos, ejemplos de los cuales son monofosforil-lípido A (MPL), MPL 3-O-desacilado (3dMPL), oligonucleótidos que contienen motivo CpG, toxinas bacterianas de ribosilación de ADP o mutantes de los mismos, tal como enterotoxina termolábil LT de E. coIí , toxina CT de cólera, y similares; proteínas eucariotas (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de las mismos (por ejemplo, dirigidos contra el propio antígeno o CD1a, CD3, CD7, CD80) y ligandos a receptores (por ejemplo, CD40L, GMCSF, GCSF, etc.), que estimulan una respuesta inmunitaria tras la interacción con células receptoras. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden aluminio como adyuvante, por ejemplo, en forma de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de aluminio-potasio, o combinaciones de los mismos, en concentraciones de 0,05 - 5 mg, por ejemplo, de 0,075-1,0 mg, de contenido de aluminio por dosis.
Las proteínas F de RSV prefusión también pueden administrarse en combinación con o conjugadas a nanopartículas, tales como, por ejemplo, polímeros, liposomas, virosomas, partículas similares a virus. Las proteínas F prefusión pueden combinarse con, encapsidarse en o conjugarse con las nanopartículas con o sin adyuvante. La encapsulación dentro de liposomas se describe, por ejemplo, en el documento US 4.235.877. La conjugación con macromoléculas se da a conocer, por ejemplo, en los documentos US 4.372.945 o US 4.474.757. En otras realizaciones, las proteínas F de RSV se ensamblan en ensambles de orden superior de multímeros.
En otras realizaciones, las composiciones no comprenden adyuvantes.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona métodos para preparar una vacuna frente a virus sincitial respiratorio (RSV), que comprenden proporcionar una composición según la invención y formularla en una composición farmacéuticamente aceptable. El término “vacuna” se refiere a un agente o composición que contiene un componente activo efectivo para inducir un cierto grado de inmunidad en un sujeto frente a cierto patógeno o enfermedad, que dará como resultado al menos una disminución (hasta ausencia completa) de la gravedad, la duración u otra manifestación de síntomas asociados con la infección mediante el patógeno o la enfermedad. En la presente invención, la vacuna comprende una cantidad efectiva de una proteína F de RSV prefusión y/o una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína F de RSV prefusión y/o un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico, lo que da como resultado una respuesta inmunitaria frente a la proteína F de RSV. Esto proporciona un método de prevención de enfermedad del tracto respiratorio inferior grave que conduce a hospitalización y la disminución de la frecuencia de complicaciones tales como neumonía y bronquiolitis debido a infección por RSV y replicación en un sujeto. El término “vacuna” según la invención implica que es una composición farmacéutica, y por tanto incluye normalmente un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Puede comprender o no principios activos adicionales. En ciertas realizaciones, puede ser una vacuna de combinación que comprende además otros componentes que inducen una respuesta inmunitaria, por ejemplo, frente a otras proteínas de RSV y/o frente a otros agentes infecciosos. Las administración de componentes activos adicionales puede realizarse, por ejemplo, mediante administración separada o administrando productos de combinación de las vacunas de la invención y los componentes activos adicionales.
Las composiciones pueden administrarse a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano. La dosis total de las proteínas F de RSV en una composición para una única administración puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 gg a aproximadamente 10 mg, por ejemplo, de 1 gg - 1 mg, por ejemplo, de 10 gg - 100 gg. La determinación de la dosis recomendada se llevará a cabo mediante experimentación y es rutinaria para los expertos en la técnica.
La administración de las composiciones según la invención puede realizarse usando vías de administración estándar. Las realizaciones no limitativas incluyen administración parenteral, tal como administración intradérmica, intramuscular, subcutánea, transcutánea o mucosa, por ejemplo, intranasal, oral y similares. En una realización, una composición se administra mediante inyección intramuscular. El experto en la técnica conoce las diversas posibilidades para administrar una composición, por ejemplo, una vacuna, con el fin de inducir una respuesta inmunitaria para el/los antígeno(s) en la vacuna.
Un sujeto tal como se usa en el presente documento es preferiblemente un mamífero, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón, un sigmodon, o un primate no humano o un ser humano. Preferiblemente, el sujeto es un sujeto humano.
Las proteínas, moléculas de ácido nucleico, vectores y/o composiciones también pueden administrarse, ya sea como cebado o como refuerzo, en un régimen de cebado-refuerzo homólogo o heterólogo. Si se realiza una vacunación de refuerzo, normalmente, una vacunación de refuerzo de este tipo se administrará al mismo sujeto en un momento entre una semana y un año, preferiblemente entre dos semanas y cuatro meses, tras la administración de la composición al sujeto por primera vez (que en tales casos se denomina “vacunación de cebado”). En ciertas realizaciones, la administración comprende un cebado y al menos una administración de refuerzo.
Además, las proteínas de la invención pueden usarse como herramienta diagnóstica, por ejemplo, para someter a prueba el estado inmunitario de un individuo estableciendo si hay anticuerpos en el suero de tal individuo capaces de unirse a la proteína de la invención. Por tanto, la invención también se refiere a un método de diagnóstico in vitro para detectar la presencia de una infección por RSV en un paciente, comprendiendo dicho método las etapas de a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de dicho paciente con una proteína según la invención; y b) detectar la presencia de complejos anticuerpo-proteína.
Las proteínas F de RSV prefusión estabilizadas que pueden obtenerse y/u obtenidas mediante tal método también forman parte de la invención, así como los usos de las mismas tal como se describieron anteriormente.
Ejemplos
EJEMPLO 1: Preparación de polipéptido F de RSV prefusión estable de SEQ ID NO: 21
Para aumentar la estabilidad de RSV F en la conformación prefusión se introdujeron dos sustituciones de aminoácido adicionales en una variante de F RSV prefusión que se describió previamente (documentos WO2014/174018 y WO2014/202570). Los constructos se sintetizaron y optimizaron por codón en Gene Art (Life Technologies, Carlsbad, CA). Los constructos se clonaron en pCDNA2004 o se generaron mediante métodos estándar ampliamente conocidos en el campo que implican mutagénesis dirigida al sitio y PCR y se secuenciaron. La plataforma de expresión usada fueron las células 293Freestile (Life Technologies). Las células se transfectaron de manera transitoria usando 293Fectin (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante y se cultivaron durante 5 días a 37°C y CO2 al 10%. El sobrenadante del cultivo se recogió y se centrifugó durante 5 minutos a 300 g para eliminar las células y el desecho celular. El sobrenadante centrifugado se filtró posteriormente de manera estéril usando un filtro de vacío de 0,22 um y se almacenó a 4°C hasta su uso.
EJEMPLO 2: Purificación de proteína F de RSVFprefusión
El polipéptido recombinante se purificó mediante un protocolo de purificación de 2 etapas aplicando una columna de intercambio catiónico para la purificación inicial y posteriormente una columna superdex200 para la etapa de acabado para eliminar los contaminantes residuales. Para la etapa de intercambio iónico inicial se diluyó el sobrenadante del cultivo con 2 volúmenes de NaOAc 50 mM pH 5,0 y se hizo pasar por una columna HiTrap Capto S de 5 ml a 5 ml por minuto. Posteriormente, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna (CV) de NaOAc 20 mM, NaCl 50 mM, tween20 al 0,01% (v/v), pH 5 y se eluyeron 2 CV de NaOAc 20 mM, NaCl 1 M, tween20 al 0,01% (v/v), pH 5. El eluato se concentró usando un concentrador centrífugo y la proteína se purificó adicionalmente usando una columna superdex200 usando Tris 40 mM, NaCl 500 mM, tween20 al 0,01% (v/v), pH 7,4 como tampón de ejecución. En la Figura 1 se muestra el cromatograma de la columna de filtración en gel. El pico dominante contenía la proteína F de RSV prefusión. Las fracciones que contienen este pico se juntaron de nuevo y la concentración de proteína se determinó usando OD280 y se almacenó a 4°C hasta su uso. En la Figura 2 se muestra un análisis SDS-PAGE en condiciones no reducidas y reducidas de la preparación de proteína final y como puede verse la pureza era >95%. La identidad de la banda se verificó usando inmunotransferencia de tipo western y anticuerpos específicos para proteína F (no mostrados).
Se usó Octet cuantitativo (BioLayer Interferometry) para medir la concentración de proteína en los sobrenadantes. Se biotinilaron CR9501 (un anticuerpo que reconoce específicamente proteína F de RSV prefusión) y CR9503 (que reconoce proteína F de RSV postfusión) mediante protocolos estándar y se inmovilizaron en biosensores de estreptavidina (ForteBio, Portsmouth, R.U.). Después, los biosensores recubiertos se bloquearon en sobrenadante de cultivo celular simulado. Se realizó un experimento cuantitativo tal como sigue: temperatura 30C, velocidad de agitación 1000 rpm, tiempo del ensayo 300 s.
La concentración de la proteína se calculó usando una curva patrón. La curva patrón se preparó para cada anticuerpo recubierto usando la proteína F de RSV prefusión (Krarup et al., 2015, citado anteriormente) diluida en medio simulado (Figura 3). El análisis de datos se realizó usando el software ForteBio Data Analysis 6.4 (ForteBio).
EJEMPLO 3: Estabilidad a la temperatura de la proteína F de RSV
La estabilidad a la temperatura de la proteína purificada se determinó mediante fluorometría de barrido diferencial (DSF). La proteína F prefusión purificada se mezcló con colorante fluorescente naranja SYPRO (Life Technologies S6650) en una placa de qPCR óptica de 96 pocillos. La concentración de colorante y de proteína óptima se determinó experimentalmente (datos no mostrados). Se realizaron diluciones de proteína en PBS y se usó una muestra de control negativo que contenía el colorante solo como resta de referencia. La medición se realizó en un instrumento qPCR (Applied Biosystems ViiA 7) usando los siguientes parámetros: una rampa de temperatura de 25-95°C con una tasa de 0,015°C por segundo. Los datos se recogieron de manera continua. Las curvas de fusión se representaron

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. - Una proteína de fusión (F) de virus sincitial respiratorio (RSV) prefusión recombinante que comprende una mutación del aminoácido S en la posición 215 a P (S215P), una mutación del aminoácido T en la posición 357 a K (T357K) y una mutación del aminoácido N en la posición 371 a Y (N371Y), facilitándose las posiciones de aminoácido con referencia a SEQ ID NO: 13.
2. - Proteína F de RSV prefusión según la reivindicación 1, que comprende al menos una mutación adicional seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una mutación del residuo de aminoácido N/T en la posición 67 a I; y
(b) una mutación del residuo de aminoácido D en la posición 486 a N.
3. - Proteína F de RSV prefusión según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína comprende al menos un epítopo que es específico para la proteína F de conformación prefusión, en la que el al menos un epítopo se reconoce por un anticuerpo monoclonal específico prefusión, que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 2, una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 3 y una región CDR1 de cadena ligera de SEQ ID NO: 4, una región CDR2 de cadena ligera de SEQ ID NO: 5 y una región CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 6, y/o un anticuerpo monoclonal específico prefusión, que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 7, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 8, una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y una región CDR1 de cadena ligera de SEQ ID NO: 10, una región CDR2 de cadena ligera de SEQ ID NO: 67 y una región CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 11.
4. - Proteína F de RSV prefusión según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína es trimérica.
5. - Proteína F de RSV prefusión según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un dominio F1 truncado y un dominio de trimerización heterólogo ligado a dicho dominio F1 truncado.
6. - Proteína F de RSV prefusión según la reivindicación 5, en la que el dominio de trimerización heterólogo comprende la secuencia de aminoácidos GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 14).
7. - Proteína F de RSV prefusión según la reivindicación 5 o 6, en la que el dominio de trimerización está ligado al residuo de aminoácido 513 de la proteína F de RSV.
8. - Proteína F de RSV prefusión según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína F de RSV comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
9. - Molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína F de RSV prefusión según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1-8.
10. - Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9, en la que la molécula de ácido nucleico se ha optimizado por codón para la expresión en células de mamífero.
11. - Vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9 o la reivindicación 10.
12. - Composición que comprende una proteína F de RSV prefusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y/o un vector según la reivindicación 11.
13. - Proteína F de RSV prefusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y/o un vector según la reivindicación 11 para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria frente una proteína F de RSV.
14. - Proteína F de RSV prefusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y/o un vector según la reivindicación 11 para su uso como vacuna.
15. - Proteína F de RSV prefusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y/o un vector según la reivindicación 11 para su uso en la profilaxis y/o el tratamiento de infección por RSV.
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