CN105189755A - 腺病毒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了狒狒腺病毒(BaAdV)-2/4和BaAdV-3。本发明还公开了BaAdV-2/4和BaAdV-3多核苷酸、多肽，以及特异性结合BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的抗体。本发明还公开了检测BaAdV-2/4和BaAdV-3的方法。本发明还公开了治疗、预防和诱导对BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的免疫应答的方法。本发明还提供了试剂盒。

Description

腺病毒及其用途
优先权声明
本申请要求2013年1月15日提交的美国临时申请61/752,876的优先权，在此通过引用结合入本发明。
政府支持的声明
本发明是根据是美国国立卫生研究院授予的批准号U54-AI057156、U54-AI57168、R56-AI089532和R01-HL105704，在政府支持下做出的。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
本发明涉及腺病毒的技术领域，包括病毒本身、病毒载体、检测方法和治疗方法。
背景技术
在人类中，许多新发传染病，包括由Ebola病毒和H5N1禽流感引起的那些，是人畜共患的(Morens等，2004，Nature430：242-249)。鉴于人类与非人灵长类动物(NHPs)之间的密切亲缘关系，人特别容易跨物种感染隐藏在猿和猴中的病原体(PedersenandDavies，Ecohealth6：496-508)。NHPs和人类之间的疾病传播风险在热点地区是最大的，如中部和西部非洲的森林和亚马逊河流域，在这些地方人类频繁接触各种各样的NHPs密切相关物种(PedersenandDavies，supra)。动物园和研究机构的房内圈养的NHPs也代表其中可能发生病原体跨物种传播的地点(Chen等，2011，PLoSPathog7：e1002155；MillerandFowler，2012，Fowler′szooandwildanimalmedicine：currenttherapy.St.Louis，Mo.：Elsevier/Saunders，xviii，669p.；Murphy等，2006，JZooWildlMed37：219-233)。
腺病毒(AdVs)是自然感染广泛范围的脊椎动物宿主的双链DNA病毒，包括人类和NHPs(WoldandHorwitz，2007，Adenoviruses.In：FieldsBN，KnipeDM，HowleyPM，editors.FieldsVirology.第五版.Philadelphia：WoltersKluwerHealth/LippincottWilliams&Wilkins.pp.2395-2436)。在人类中，由AdVs引起的感染包括结膜炎、胃肠炎、肝炎、心肌炎和肺炎(WoldandHorwitz，2007，supra；Lewis等，2009JInfectDis199：1427-1434；Louie等，2008，ClinInfectDis46：421-425)。哺乳动物腺病毒类的成员涵盖了感染灵长类动物的AdVs，按国际病毒分类学委员会(ICTV)的分类包括7种人AdV物种A-G(HAdV-A至HAdV-G)和1种猴AdV物种A(SAdV-A)(Harrach等，2011，FamilyAdenoviridae.In：KingA，AdamsM，CarstensE，LefkowitzE，editors.VirusTaxonomy：ClassificationandNomenclatureofVirusesNinthReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses.SanDiego：Elsevier，pp.95-111)。最近，系统发育(phylogenetically)不同的AdV物种组的成员，SAdV-B，也在来自无症状圈养猕猴的粪便样本中被发现(Roy等，2012，EmergInfectDis18：1081-1088)。虽然公认AdVs由于与它们各自的宿主共同进化，表现出非常窄的宿主范围(WoldandHorwitz，2007，supra；Roy等，2009，PLoSPathog5：e1000503)，但越来越多的证据支持了AdVs在猴子和人类之间跨物种传播的潜在可能性。已发现从NHPs的粪便样品中确定的AdVs共享与人类菌株的显著相似性，并可以按系统发育分入传统的“人”物种组HAdV-A至HAdV-E中(Roy等，2011，supra；Wevers等，2011，JVirol85：10774-10784)。大规模血清学调查已在生活在流行区的人类中检测到猴AdVs的抗体(Ersching等，2010，Virology407：1-6；Xiang等，2006，EmergInfectDis12：1596-1599)。此外，新的AdV，伶猴腺病毒(TMAdV)，先前被描述为新世界伶猴群体中肺炎和肝炎毁灭性爆发的原因，但根据科学家对爆发和家族成员的调查，该病毒也是与跨物种呼吸道感染相关的(Chen等，2011，supra)。但仍需要识别NHP腺病毒和确定这些病毒中的哪些可感染人类。
发明内容
本发明公开了分离的狒狒腺病毒(BaAdV)-2/4和BaAdV-3。在一些实施方案中，公开了BaAdV-2/4和BaAdV-3多核苷酸、多肽、以及特异性结合BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的抗体。在另外的实施方案中，还公开了检测BaAdV-2/4和BaAdV-3的方法。在进一步的实施方案中，还公开了治疗、预防和诱导对BaAdV-2/4和/或BaAdV-3感染的免疫应答的方法。
在一些实施方案中，提供分离的核酸，其包括长度为至少100个核苷酸的核苷酸序列，并且在长度上与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3或其互补物(complement)具有至少90％的序列同一性。在其他实施方案中，分离的核酸包括：(a)核酸序列，与阐述为SEQIDNO：1的核酸序列的核苷酸1-29686和29812-34402具有至少90％的同一性；(b)核酸序列，其与阐述为SEQIDNO：2的核酸序列的核苷酸1-11334和13060-34391具有至少90％的同一性；或(c)核苷酸序列，与阐述为SEQIDNO：3的核苷酸1-11334和13060-34391的核苷酸序列具有至少90％的同一性。在一些具体的非限制性实施例中，这些核酸可以是重组核酸。在另外的非限制性实施例中，这些核酸是cDNA。本发明还提供了包括这些多核苷酸的病毒，该病毒包括复制缺陷型病毒。在另外的实施方案中，还公开了表达载体和宿主细胞，所述表达载体编码由这些核酸编码的多肽，所述宿主细胞由这些核酸进行转化。
另外的实施方案包括由这些多核苷酸编码的多肽，和结合这些多肽的抗体。
这些核酸、多肽、病毒、表达载体、宿主细胞和抗体用在检测、治疗、预防和产生对BaAdV-2/4和/或BaAdV-3感染的免疫应答的方法中。
根据下面的几个实施方案的详细说明，并参照附图，本发明的上述的和其它的特征和优点将变得更加明显。
附图说明
图1A-1B.狒狒腺病毒爆发的流行病学特征。(A)一只成年雌性狒狒和她的婴儿的图像。在先前的健康新生儿狒狒中，爆发与毁灭性肺炎的病例(case)相关。(B)在爆发期间的狒狒饲养场(nursery)的地图，其中笼子位于两个单独的房间，该地图显示死于肺炎的狒狒(骨架)、具有临床呼吸道疾病症状但存活的狒狒(黑色)和无症状狒狒(灰色)的位置。在本研究中，基因表征的(geneticallycharacterized)新型AdVs(BaAdV1，2，3，4)是从患病(B5)和无症状(B4、B8和B9)狒狒的鼻拭物(nasalswab)中提纯得到的。
图2.通过深度测序确定新型狒狒腺病毒(BaAdV1，2，3，4)的基因组(genomic)覆盖度。病毒基因组的部分是使用从头组装(assembly)的方式(黑色柱)通过深度测序读取结果直接获得的(recovered)。在基因组完成并通过Sanger测序确认后，深度测序读取结果被映射(mapped)至相应的AdV基因组。按对数刻度绘制在沿着基因组(x轴)的各位置所达到的覆盖度(y轴)。缩写：nt，核苷酸。
图3A-3B.BaAdV1和BaAdV2，4的基因组组织，以及与相关腺病毒的成对比对。所展示的是对应于两种狒狒AdVs的基因组组织图，即BaAdV1(A)，SAdV-BAdV物种，和BaAdV2，4(B)，HAdV物种。在中间黑线上面的方框表示在正向链上编码的开放阅读框架(ORF)，而黑线下面的方框表示在反向链上编码的ORF。早期区域的ORF有灰色阴影。按总同一性百分比的降序展示与选定的人(浅灰色)、猿猴(深灰色)或新型狒狒(中等灰色)AdVs相关的BaAdV1(A)和BaAdV2，4(B)的扫描核苷酸成对同一性(pairwiseidentities)。x轴是指沿着基因组的核苷酸位置。
图4A-4D.与其他腺病毒相关的BaAdV1、BaAdV2，4和BaAdV3的氨基酸系统发育分析。(A)六邻体，(B)五邻体碱基(base)，(C)DNA聚合酶，（Ｄ）纤维。在A-G、SAdV-A和SAdV-B物种中代表性的灵长类ＡdVs，以及非灵长类AdVs，被纳入系统发育分析中。Bayesian支持水平显示在每个分支点处。在这项研究中确定的4种新型BaAdVs，和提议的名称“物种Ｈ”以粗体显示。缩写和登录号在本文中有描述。
图5A-5B.与其他腺病毒相关的BaAdV1、BaAdV2，4的氨基酸成对同一性。对代表性的人、猴和鼠AdVs做比较。以热图显示氨基酸成对同一性表，灰阶对应于10-100％(bar)的成对确认。
图6A-6B.物种H腺病毒BaAdV3的重组证据。(A)本图展示了在与BaAdV3相关的物种SAdV-B、F、G和H中AdVs的相似度(上部)和靴扫描(bootscanning)(下部)点。靴扫描分析显示了在对应于相异的(divergent)短纤维基因(星号)的区域中可能的重组断点。x轴指的是核苷酸的位置。基因组组织图以与图3相同的方式注释。(B)本图展示的是假设的模式，其中BaAdV3由重组事件产生，该重组事件涉及BaAdV2，4和来自尚未确认的AdV的和短纤维基因。缩写：nt，核苷酸。
序列表
随本发明一同提交的序列表是ASCII兼容文本文件，名称为“Sequence_Listing.txt”，创建于2014年1月15日，大小约564千字节，并符合37CFR1.821(c)的规定。上述材料通过引用整体结合入本发明。使用核苷酸碱基的标准字母缩写表示核酸和氨基酸，并以三个或一个字母代码表示氨基酸，如37C.F.R.1.822所定义的。每个核酸序列只有一条链被表示出，但根据对显示链的任何参考，可理解为包括互补链。
SEQIDNO：1是BaAdV-2的核酸序列。
SEQIDNO：2是BaAdV-4的核酸序列。
SEQIDNO：3是BaAdV-3的核酸序列。
SEQIDNO：4是BaAdV-1的核酸序列。
SEQIDNO：5-39是由BaAdV-2编码的多肽的氨基酸序列。
SEQIDNO：40-74是由BaAdV-4编码的多肽的氨基酸序列。
SEQIDNO：75-109是由BaAdV-3编码的多肽的氨基酸序列。
SEQIDNO：110-143是由BaAdV-1编码的多肽的氨基酸序列。
在实施例部分中提供了SEQIDNO：1-4的开放阅读框架的位置。
具体实施方式
在本发明中公开了狒狒腺病毒，其在人类和非人灵长类动物中引起了流感样症状。这些腺病毒都与狒狒腺病毒(BaAdV)-1相关，但它们处于新型腺病毒组，是在狒狒腺病毒组F和G之间的中间组(intermediate)。这些腺病毒包括BaAdV-2和BaAdv-2/4。
本发明还公开了BaAdV-2/4和BaAdV-3多核苷酸、多肽和特异性结合BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的抗体。在另外的实施方案中，本发明还公开了用于检测BaAdV-2/4和BaAdV-3的方法。本发明还公开了检测BaAdV-3、BaAdV-2/4、BaAdV核酸(BaAdV-3和BaAdV-2/4的基因组和基因)，BaAdV-2/4和BaAdV-3抗体，BaAdV-2/4和BaAdV-3多肽的诊断分析方法。该方法可用于在受试者中较早诊断BaAdV-2/4和/或BaAdV-3感染。
在进一步的实施方案中，本发明还公开了在受试者中对BaAdV-2/4和/或BaAdV-3感染的治疗、预防和诱导免疫应答的方法。
II.术语
除非另外指明，否则技术术语按照常规用法使用。分子生物学常用术语的定义在BenjaminLewin，GenesV，牛津大学出版社出版，1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等.(编辑)，TheEncyclopediaofMolecularBiology，BlackwellScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；和RobertA.Meyers(ed.)，MolecularBiologyandBiotechnology：aComprehensiveDeskReference，VCHPublishers，Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8)中可见。为了便于了解本发明公开的各实施方案，这里为特定术语提供了下列解释：
腺病毒：包含DNA的二十面体(20面)病毒家族。哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个种类都包含在腺病毒家族中。尽管腺病毒具有超过40个血清型的菌株，其中大部分引起人类的良性呼吸道感染，但亚群C血清型2或5主要作为载体(vector)使用。该生命循环通常不涉及整合到宿主基因组中，也不涉及在宿主细胞的核中作为游离基因元件的腺病毒复制体，并且不插入基因组中。“腺病毒载体”是从可公开获得的腺病毒DNA衍生的载体。至少腺病毒载体包括腺病毒的反相终端重复。
施用(administering或administration)：在治疗过程中治疗性施用或预防性施用有效量的组合物或药物。可在腺病毒感染的特征性症状表现之前进行预防性施用。
动物：活的多细胞脊椎动物生物体，这是一个包括例如哺乳动物和鸟类的类别。
抗体：是基本上由免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因编码的多肽或其抗原结合片段，该抗体，特异性结合并识别分析物(抗原)，如腺病毒多肽或其抗原片段。免疫球蛋白基因包括k、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。
抗体的存在形式是例如完整的免疫球蛋白和许多由各种肽酶消化产生的良好表征的片段。例如，特异性结合腺病毒的Fab、Fv和单链Fv(scFv)可作为腺病毒特异性结合剂。scFv蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过连接子(linker)结合，而在dsFv中，链是突变的，以引入二硫键来稳定链的连接(association)。该术语也包括基因工程形式，例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)，异源偶联抗体(例如双特异性抗体)。也可见：PierceCatalogandHandbook，1994-1995(PierceChemicalCo.，Rockford，IL)；Kuby，J.，Immunology，第3版，W.H.Freeman&Co.，纽约，1997。
抗体片段的定义如下：(1)Fab，是包括抗体分子的单价抗原结合片段的片段，其通过以酶木瓜蛋白酶消化整个抗体来产生，以产生完整轻链和一个重链的部分；(2)Fab′，是抗体分子片段，其是通过使用胃蛋白酶处理整个抗体，随后经过还原，产生完整轻链和重链的部分获得的；两个Fab′片段，是由每个抗体分子得到的；(3)(Fab′)2，是抗体片段，其是通过用胃蛋白酶处理整个抗体得到，但不经随后的还原；(4)F(ab′)2，是两个Fab′片段的二聚体，由两个二硫键连在一起；(5)Fv，是基因工程片段，含有表达为两条链的轻链可变区和重链可变区；和(6)单链抗体(“SCA”)，是遗传工程分子，含有轻链可变区、重链可变区，所述轻链可变区和重链可变区通过合适的多肽连接子连接为基因融合单链分子。本发明的术语“抗体”，也包括抗体片段，所述抗体片段或是通过修饰整个抗体生成的，或是用重组DNA方法从头合成的。
通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。有两种类型的轻链，lambda(λ)和kappa(k)。有五种主要的重链类型(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其用于测定抗体分子的功能活性。
每个重链和轻链都包括恒定区和可变区(该区域也称为“结构域(domains)”)。在组合(combination)中，重链和轻链可变区特异性结合抗原。轻链和重链可变区包括被三个高变区中断的一个“框架”区，也称为“互补决定区”或“CDRs”。框架区和CDRs的范围已有定义(见Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，1991，在此通过引用全部结合入其内容)。数据库Kabat现在在网上维护。其它数据库包括IMGT数据库。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内是相对保守的。抗体的框架区，即构成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和对齐CDRs。
CDRs主要负责结合抗原的表位。每条链的CDRs通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始依次编号，并且通常还通过特定CDR所位于的链来识别。这样，VHCDR3位于抗体的重链的可变结构域中，在此其被发现，而VLCDR1是来自抗体的轻链的可变结构域的CDR1，在此其被发现。轻链CDRs有时被称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。重链CDRs有时被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3。
提及“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体片段的可变区，所述抗体片段例如为Fv、scFv，dsFv或Fab。提及“VL”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。
“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆体或由细胞生成的抗体，在该细胞中单个抗体的轻链和重链基因已被转染。单克隆抗体是通过本领域技术人员已知的技术方法而产生，例如由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合生成杂交抗体形成细胞。这些融合细胞和它们的后代称为“杂交瘤。单克隆抗体包括人源化的单克隆抗体。在一些实施例中单克隆抗体是分离自受试者。这样分离的单克隆抗体的氨基酸序列可被确定。
“多克隆”抗体是从不同的B淋巴细胞得到的抗体，这些B淋巴细胞特异性结合相同的抗原；所述抗体可以结合相同抗原的几个表位。在一些实施方案中，这些抗体是通过向合适的哺乳动物，例如小鼠、兔或山羊，接种抗原而生产的。用于生产多克隆抗体的许多方法是本领域已知的，这些方法用于生产高效价、高亲和力的抗血清。
“人源化”免疫球蛋白是包括人类框架区和来自非人类(例如小鼠的、大鼠的或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDRs的免疫球蛋白。提供CDRs的非人类免疫球蛋白被称为“供体”，并且提供框架的人免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实施例中，所有的CDRs来自人源化免疫球蛋白的供体免疫球蛋白。恒定区无需存在，但如果存在，它们必须是与人免疫球蛋白恒定区基本相同的，例如至少约85-90％相同，例如约95％以上相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分，除了可能的CDR外，基本上与天然人免疫球蛋白序列的相应部分是相同的。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体结合至与提供CDRd的供体抗体相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可能具有有限数量的取代物(substitutions)，该取代物是取自供体框架的氨基酸。人源化的或其他单克隆抗体可以具有另外的保守氨基酸取代物，该取代物基本上对抗原结合或其他免疫球蛋白功能没有影响。人源化免疫球蛋白可通过基因工程的方法来构造(例如见美国专利号5,585,089)。
抗体亲和力是抗体与其抗原的特异性结合的测量结果。在一个实施方案中，通过Frankel等.，Mol.Immunol.，16：101-106，1979所描述的更正Scatchard方法来计算亲和力。在另一个实施方案中，是通过抗原/抗体解离速率测定结合亲和力。在又一个实施方案中，通过竞争放射免疫分析测定高结合亲和力。在几个实施例中，高结合亲和力是至少约1×10-8M。在其他实施方案中，高结合亲和力是至少约1.5×10-8、至少约2.0×10-8、至少约2.5×10-8、至少约3.0×10-8、至少约3.5×10-8、至少约4.0×10-8、至少约4.5×10-8、或至少约5.0×10-8M。
短语“特异性(或选择性)结合”或“与……发生特异性(或选择性)免疫反应”，在涉及蛋白质或肽时，是指对蛋白质通常在蛋白质的异质群体和其它生物制品中的存在起决定作用的结合反应。因此，在指定的免疫分析条件下，特异性抗体与特定蛋白质的结合是背景的至少两倍，更通常是大于10倍至100倍的背景。在这样的条件下特异性结合抗体需要选择对特定蛋白质具有特异性的抗体。例如，特异性结合BaAdV-3、多态变体、等位基因、直向同源物、和保守修饰变体、或剪接变体、或其部分的抗体，可以被选择以获得仅与BaAdV-3特异性免疫反应，而不与其它蛋白质，例如BaAdV-1和/或BaAdV-2/4的蛋白质特异性免疫反应的那些抗体。同样地，特异性结合BaAdV-2/4、多态变体、等位基因、直向同源物、和保守修饰变体、或剪接变体、或其部分的抗体，可以被选择以仅获得仅与BaAdV-2/4特异性免疫反应，而不与其它蛋白质，例如BaAdV-1和/或BaAdV-3的蛋白质特异性免疫反应的那些抗体。这个选择可通过减去与其它分子交叉反应的抗体来实现。多种免疫分析形式可用于选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体，如本发明所述。
反义、正义和反基因(Antisense，Sense，andAntigene)：双链DNA(dsDNA)具有两条链，5′-＞3′链，称为正链，和3′-＞5′链，称为负链。因为RNA聚合酶在5′-＞3′方向增加核酸，DNA的负链作为转录期间的RNA模板。因此，形成的RNA将具有与负链互补的序列，并且与正链是相同的(除了碱基尿嘧啶被替换为胸腺嘧啶)。
反义(Antisense)分子是与RNA或DNA的正链特异性杂交或特异性互补的分子。正义(Sense)分子是与DNA的负链特异性杂交或特异性互补的分子。反基因(Antigene)分子是定向到DNA靶(target)的反义或正义分子。
适体：对靶具有期望的作用的非天然存在核酸。期望的作用包括但不限于：结合靶，催化改变靶，以改性/改变靶或靶的功能活性的方式与靶反应，作为自杀抑制剂共价连接至靶，促进靶与另一个分子之间的反应。适体的作用可以是对靶分子的特异性结合亲和力，这样的靶分子是三维化学结构，而不是多核苷酸，该多核苷酸通过主要取决于Watson/Crick碱基配对或三螺旋的结合机制结合核酸配体，其中核酸配体不是具有已知的受靶分子束缚的生理功能的核酸。
“siRNA”分子或“RNAi”分子是指形成双链RNA的核酸，当siRNA在与基因或靶基因相同的细胞中表达时，该双链RNA具有降低或抑制基因或靶基因表达的能力。“siRNA”因此是指由互补链形成的双链RNA。杂交形成双链分子的siRNA的互补部分通常具有实质上的或完全的同一性。在一个实施方案中，siRNA是指核酸，其与靶基因具有实质上的或完全的同一性，并形成双链siRNA。siRNA的序列可对应于全长靶基因，或其子序列。通常，siRNA是至少约15-50个核苷酸的长度(例如双链siRNA的每条互补序列是15-50个核苷酸长度，并且双链siRNA是约15-50个碱基对的长度，优选约20-30个碱基核苷酸，更优选约20-25或约24-29个核苷酸长度，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。也见PCT/US03/07237，其全部内容通过引用结合入本发明。
术语“反义”是指寡聚化合物或分子，其至少部分地与所杂交的靶核酸分子互补。反义化合物或分子可以包括但不限于：寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物和嵌合组合(combination)。
当siRNA或RNAi在表达靶核酸的细胞中被表达时，如果siRNA或反义分子或RNAi分子降低了核酸的至少约10％的表达，则siRNA或反义分子或RNAi分子就是“特异性”于靶核酸的。
狒狒腺病毒(BaAdV)：其是用于指病毒的基因成分(component)的术语，例如基因组及其RNA转录物、由基因组编码的蛋白(包括结构和非结构蛋白)和狒狒腺病毒的病毒粒子，例如B。当指向BaAdV，如BaAdV-3和BaAdV-2/4时，核酸序列可以是指核酸和多肽的多态性变体、等位基因、突变体和种间同系物(homologs)，其：(1)具有核苷酸序列，优选在具有至少约25、50、100、200、500、1000个或更多个核酸的区域上，直至在序列全长上，与核苷酸序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3，具有大于约90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的核苷酸序列同一性；(2)结合至抗体，例如多克隆或单克隆抗体，该抗体是针对免疫原产生的，该免疫原包括由SEQIDNO：1-3的开放阅读框架(ORF)编码的蛋白质的氨基酸序列；及其保守修饰的变体；(3)在严格杂交条件下特异性杂交到对应于SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3及其变体的核酸序列的反义链上；(4)编码蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列优选在具有至少约25、50、100、200、500、1000或更多的氨基酸的区域上，与由SEQIDNO：1、2和3的开放阅读框架编码的多肽(如短纤维，E1、E3、E4等蛋白质)，具有大于约60％的核苷酸序列同一性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的核苷酸序列同一性。开放阅读框架的位置显示在所附的附录中，并提供了编码的多肽的氨基酸序列。
包括与BaAdV开放阅读框架(ORF)的同一性的“BaAdV编码的多肽”或“由核苷酸序列编码的多肽”，是指结构和非结构的腺病毒蛋白，该腺病毒蛋白：(1)由核苷酸编码，该核酸的核酸序列优选在具有至少约25、50、100、200、500、1000个或更多个核酸的区域上，直至在序列全长上，与核苷酸序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3具有大于约60％的核苷酸序列同一性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的核苷酸序列同一性；(2)特异性结合至抗体，例如多克隆或单克隆抗体，该抗体是针对免疫原产生的，该免疫原包括由SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3的开放阅读框架编码的蛋白质的氨基酸序列；及其保守修饰的变体；(3)编码蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列优选在具有至少约25、50、100、200、500、1000个或更多个氨基酸的区域上，与由SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3的开放阅读框架编码的蛋白质(如与SEQIDNO：5-109之一)具有大于约60％的核苷酸序列同一性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的核苷酸序列同一性。结构和非结构的病毒蛋白的氨基酸序列可以使用本发明公开的算法，通过将本发明公开的序列与其它腺病毒序列比对，由本领域技术人员很容易地确定。
“BaAdV感染”是指由在细胞或受试者中BaAdV的繁殖和/或存在而引起的入侵。
结合或稳定结合：如果足够量的寡核苷酸形成碱基对，寡核苷酸就结合或稳定地结合至该靶核酸，或杂交至其靶核酸，从而可以检测到该结合。可通过靶：寡核苷酸复合物的物理或功能性质检测结合。靶和寡核苷酸之间的结合可以通过本领域技术人员已知的任意程序检测，包括功能或物理结合分析。通过确定结合是否在生物合成过程中具有可观察的效果，可以功能性检测结合，所述生物合成过程如为基因表达、DNA复制、转录、翻译等。
检测DNA或RNA的互补链的结合的物理方法是在本领域已知的，还包括这样的方法如DNaseI或化学足迹法、凝胶迁移法和亲和力裂解分析、Northern印迹法、斑点印迹法和光吸收检测程序。例如，由于它简单可靠，一种方法是广泛使用的，该方法包括观察含寡核苷酸(或类似物)和靶核酸的溶液在220至300nm下随着温度缓慢增加的光吸收的变化。如果寡核苷酸或类似物已结合到其靶上，当寡核苷酸(或类似物)和靶解离或熔化时，就会存在一个吸收突然增加的特征温度。
低聚物和其靶核酸之间的结合经常以50％低聚物自靶熔化的温度(Tm)为特征。相对于较低(Tm)的复合物，较高(Tm)表明了更强或更稳定的复合物(complex)。
生物样品：来自活的生物体的样品，包括如活检样品和尸检样品的组织切片，以及用于组织学目的的冷冻切片。这样的样品包括血液和血液组分或产品(例如血清、血浆、血小板、红细胞等)、痰、泄殖腔拭物(cloacalswabs)、粘膜、组织、培养的细胞(例如原代培养物、外植体)和转化的细胞、生物体液、粪便、尿液等。生物样品通常从真核生物体获得。取样的组织可以是例如皮肤、脑(例如大脑、小脑、视叶)、脊髓、肾上腺、胸肌、肺、心脏、肝脏、嗉囊、腺胃、脑室、十二指肠、小肠、大肠、泄殖腔、肾、法氏囊(bursaoffabricus)、脾、胰腺、肾上腺、骨髓、腰骶脊髓或血液。接触样品是指在适于反应发生的条件下暴露样品。
衣壳：病毒颗粒的蛋白质覆盖或外层。衣壳是覆盖病毒体的核蛋白芯或核酸的蛋白质外壳。衣壳通常显示出二十面体对称，并在某些病毒(非腺病毒)中是封闭在包膜(envelope)中。衣壳是由亚基构成的(60的某些整数倍，该数量需要给出严格的二十面体对称)，并自组装成特定病毒的通常样式。在较小的衣壳中，亚基常常封装成5或6元环(五聚体或六聚体)，构成形态单元(壳粒)。细胞的病毒感染需要衣壳。
检测：利用任何方法，确定病毒或病毒颗粒(包括病毒肽)，在细胞内、在细胞上和/或在介质(medium)中的存在，该介质与细胞或病毒相接触。该方法的示例是但不限于：观察细胞病变效应；检测病毒蛋白，如通过免疫荧光法、ELISA或Western印迹杂交法；检测病毒核酸序列，例如通过PCR、RT-PCR、Southern印迹法和Northern印迹法、核酸杂交法、核酸阵列法等。
表达载体：本领域中已知的质粒、病毒或另一种介质，用于编码期望的蛋白质的核酸序列可以插入或引入其中。
必需基因：病毒复制、包装或感染所需的基因。必需基因的缺失导致病毒复制缺陷。例如在腺病毒中，E1和E2是必需基因。
功能缺失：其是序列中的突变，该突变具有的效果相当于序列缺失，例如通过缺失、插入或取代消除了包装信号或必需基因产物的功能。
功能效果：在对于测试调节BaAdV活性的试剂、或对于治疗或预防BaAdV感染的分析的情况中，包括在BaAdV的影响下间接或直接地确定参数，例如表型或化学效应，如增加或减少病毒基因组的复制、病毒RNA和蛋白质生产、病毒包装、病毒颗粒生产(特别是有复制能力的病毒颗粒的生产)、细胞受体结合、病毒转导、细胞感染、抗体结合、诱导细胞或体液免疫反应、病毒蛋白酶活性等。“功能效应”包括体外、体内和离体活性。这样的功能效果可通过本领域技术人员已知的任何手段测定，例如光谱特性(例如荧光、吸收、折射率)的变化；流体动力学(例如形状)；色谱；或蛋白质的溶解特性；测量诱导标志物或蛋白质的转录激活；测量结合活性；或结合分析，例如结合抗体；测量配体或底物(substrate)结合活性的变化；测量病毒复制；测量细胞表面标记物表达；测量蛋白水平的变化；测量RNA的稳定性；识别下游或报告基因表达(CAT、荧光素酶、0-gal，GFP等)，例如通过化学发光、荧光、比色反应、抗体结合和可诱导标志物。
功能上等效：无论是在转移(transfer)中还是在包装载体序列中的序列改变，产生了与本发明所述相同的结果。这样的序列改变可以包括但不限于：保守取代、缺失、突变、移码和插入。在删除了E1的本发明腺病毒载体中，另一种基因(如E4)的缺失，其在功能上与包括E3缺失的相似载体是等效的。此外，腺病毒载体序列的改变带来了转移载体基因组的衣壳化(encapsidation)增强，这在功能上与本发明的转移载体是等效的。
异源：异源序列是与第二序列不正常(即在野生型序列中)相邻的序列。在一个实施方案中，与第二序列相比，该序列来自不同的基因来源，如病毒或生物体。
宿主细胞：一种细胞，易于与外源核酸构造体(construct)或表达载体发生转化、转染、转导、接合等。宿主细胞可以来自哺乳动物、植物、细菌、酵母、真菌、昆虫、动物等。宿主细胞可以来自人或非人灵长类。
感染：在病毒或载体转导细胞、复制和(没有任何补充的病毒或载体的帮助(benefit))向生物体或细胞培养物中的其它细胞传播与原始转导病毒或载体相同类型的子代载体或病毒时，病毒或载体是“感染性”的，其中子代载体或病毒在整个生物体或细胞培养物中以相同的能力复制和传播。因此，例如，如果核酸不能包装(例如，如果腺病毒颗粒缺乏包装点)，即使该核酸可用于转染细胞，编码腺病毒粒子的核酸也不是传染性的。同样地，如果腺病毒粒子包装的腺病毒核酸不编码将它包装在内的腺病毒衣壳蛋白时，则由腺病毒粒子包装的腺病毒核酸不是感染性的。
免疫应答：免疫系统对宿主体内抗原的反应，包括产生抗原特异性抗体和/或细胞毒性应答。该术语还指免疫系统应答，该免疫系统应答导致了诱导对免疫原性产物敏感性的条件。
反向末端重复(ITR)：在腺病毒中发现的位于每条链的末端的序列，这些序列反向重复。在病毒变性时，重复使100-140bp的“锅柄(panhandle)”结构从单个核酸链形成。
分离的：“分离的”核酸已经基本上从其他核酸序列中分离或纯化出来，并且在核酸所天然存在于的生物体的细胞中，即其它的染色体和染色体外DNA和RNA。术语“分离的”因此包括通过标准的核酸纯化方法纯化的核酸。该术语还涵盖由宿主细胞中的重组表达制备的核酸，以及化学合成的核酸。本发明的术语“分离的”也用于核酸，如DNA或RNA，是指将存在于天然来源的大分子中的分子从其它DNA或RNA中分别分离出来。提纯意在包括核酸片段，其不是天然存在的片段，也不会在自然状态下发现。在通过重组DNA技术生产时、或在通过化学前体、其他化学制品进行化学合成时，本发明的术语提纯也指基本上不含细胞材料、病毒材料或培养介质的核酸或肽。
标记：可检测部分或其任何原子、分子、部分，其存在、不存在或水平是可直接或间接监测的。多种可检测部分是本领域技术人员已知的，并且可以是通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何材料。这样的可检测标记可包括但不限于：磁珠、荧光染料、放射性标记、酶和比色标记，如胶体金或有色玻璃或塑料珠。
哺乳动物：该术语包括人类和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人类和兽医对象。
核酸：单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，及其互补物。除非另外指出，特定的核酸序列还暗示涵盖其保守修饰变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，可通过其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代产生的序列实现简并密码子取代(Batzeretal，NucleicAcidRes.19：5081(1991)；Ohtsukaetal，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolinietal，Mol.Cell.Probes8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。特定核苷酸序列也隐含地涵盖“剪接变体”，它顾名思义是一个基因的选择性剪接产物。转录后，最初的核酸转录物是可拼接的，使得不同的(候补的)核酸剪接产物编码不同的多肽。产生剪接变体的机制各不相同，但包括外显子的选择性剪接。通过通读转录衍生白相同核酸的替代(alternate)多肽也包括在该定义中。剪接反应的任何产物，包括重组形式的剪接产物，都包括在该定义中。多核苷酸通常是线性核苷酸序列，包括长度大于100个核苷酸碱基的序列。
可操作地连接：当第一核酸序列位于与第二核酸序列发生功能关系的位置时，第一核酸序列就是可操作地与第二核酸序列连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，启动子就是可操作地连接于编码序列。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白编码区时，在同一个阅读框架内。
ORF(开放阅读框架)：一系列没有任何终止密码子的核苷酸三联(密码子)编码氨基酸。这些序列通常是可翻译成肽的。一般来说，这些能够被翻译成肽的DNA或RNA序列的长度通常位于开始或起始信号和终止信号之间。示例性的非限制性开放阅读框架编码如SEQIDNO：5-109之一所述的多肽。
包装细胞：为用转移载体引入细胞的基因提供提供反式包装功能，但不壳体化其自身的基因组。
包装载体：包装载体核酸缺乏包装DNA进入腺病毒衣壳必需的核酸，该DNA对应于包装载体核酸。这就是说，包装载体核酸本身没有壳体化在它们编码的病毒颗粒中，即它们不是传染性的。包装载体可选地包括生产病毒颗粒必需的所有成分(component)，或可选地包括病毒包装必需成分的子集。例如，包装细胞可用一个以上包装载体转化，其每一个在腺病毒颗粒的生产中具有互补作用。
当它们一起编码腺病毒包装必需的所有功能时，两个(或更多)的腺病毒基包装载体是“互补”的，并且单独每个不编码包装必需的所有功能。例如，当两个载体转导单细胞和它们一起编码腺病毒包装颗粒生产的信息时，这两个载体是“互补的”。互补载体的使用增加了由包装载体转化的任何包装细胞的安全性，这是通过减少重组事件产生感染性病毒的可能性实现的。
腺病毒包装细胞系是包括核酸分子的细胞，该核酸分子编码可用于形成腺病毒颗粒的腺病毒衣壳蛋白。腺病毒颗粒有能力包装有包装点的靶腺病毒。
多肽或肽或蛋白质：氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应于天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。大分子结构，例如多肽结构可在各种组织水平的方面进行说明。对于这个组织的一般性讨论例如见Albertsetal.，MolecularBiologyoftheCell(3rded.，1994)和CantorandSchimmel，BiophysicalChemistryPartI：TheConformationofBiologicalMacromolecules(1980)。“主结构”是指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”是指多肽之内的局部有序三维结构。这些结构通常称为结构域，例如酶结构域、胞外结构域、跨膜结构域、孔隙结构域和胞质尾结构域。结构域是形成多肽紧凑单元的多肽部分，并且通常是15至350个氨基酸长。示例性结构域包括具有酶活性的结构域。典型结构域是由较小组织的部分制成的，例如3片和1个螺旋的伸展。“三级结构”是指多肽单体的完整三维结构。“四级结构”是指由独立的三级单位非共价结合形成的三维结构。各向异性术语(term)也称为能量术语。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其作用方式类似于天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸是由基因密码编码的。本发明的氨基酸通常由通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号指代。同样地，核苷酸可以通过其普遍接受的单字母代码指代。编码序列中个别或小百分比氨基酸的氨基酸取代、缺失或加入得到的是一个保守修饰的变体，其中用化学上相似的氨基酸替换氨基酸导致改变。保守替换表提供了现有技术中已知的功能相似的氨基酸。此类保守修饰的变体是新增的，并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。以下八个基团每个都含有氨基酸，这是彼此保守取代的：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(w)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(例如见Creighton，Proteins(1984))。
重组：非天然存在的分子，如核酸分子或蛋白质。在一些实施方案中，非天然存在的核酸分子是可操作地连接至异源调节元件(heterologousregulatoryelement)(如启动子或增强子)的编码蛋白质的DNA、cDNA分子或已被工程化以对特定核酸序列缺陷化的病毒基因组，例如包括核酸的病毒颗粒，该核酸是复制缺陷的、减毒的和/或缺陷的，该缺陷来自通常由病毒编码的蛋白质的生产。
序列同一性：在本发明中，彼此对应的两个或更多个核酸或多肽序列是指两个或更多个序列或亚序列，该序列或亚序列是相同的或具有特定相同百分比的氨基酸残基或核苷酸(即在比较窗口或指定区域上最大对应地比较和比对(aligned)时，在特定区域上具有约60％的同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)，测定使用的是，例如如下所述的使用默认参数的BLAST或BLAST2.0序列比较算法，或通过手工比对和目测(例如见NCBlwebsitencbi.nlm.nih.gov/BLAST等)。这样的序列则被称为“实质上相同”，并使用术语“实质上相同”。这一定义也指，或可以用于，测试序列的评价(compliment)。该定义还包括具有缺失和/或加入的序列，以及具有替换的序列。如下所述，优选的算法可以考虑空位(gap)等。优选地，同一性存在于特定的整个序列或其特定部分或至少约25个氨基酸或核苷酸长度的序列的区域上，或更优选在50-100个氨基酸或核苷酸长度的区域上。相应的区域是参考序列内的任何区域。
对于序列比较而言，通常将一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行比较。在使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，指定序列坐标，如果必要的话，指定序列算法程序参数。优选使用默认程序参数，或可以指定替代参数。然后在程序参数的基础上，将测试序列相对于参考序列，用序列比较算法计算序列同一性百分比。比较窗口包括参考选自由20-600组成的组中任一数量的连续位置的区段，通常是约50至约200，更通常是约100至约150，其中在两个序列最佳比对后，序列可以与相同数量的连续位置的参照序列比较。用于比较的序列比对方法是已知的现有技术。可以构建用于比较的序列的最佳比对(例如通过Smith&Waterman，Adv.AppLMath.2：482(1981)的局部同源算法、通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源排列算法、通过Pearson&Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的检索同一性方法、通过这些算法的计算机化执行(WisconsinGeneticsSoftwarePackage的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，WI)、或通过人工比对和目测，例如在分子生物学中的当前程序(Ausubel等，eds.1995增刊))。
适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个例子是BLAST和BLAST2.0算法，其在Altschul等，Nuc.AcidsRes.25：3389-3402(1977)和Altschul等，JMoLBiol.215：403-410(1990)中各有描述。使用BLAST和BLAST2.0，利用本发明描述的参数，以确定本发明的核酸和蛋白质的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件是公众可通过NationalCenterforBiotechnologyInformation(ncbi.nlm.nih.gov)获得的。该算法包括通过在查询序列中识别长度w的短字而首先识别高分序列对(HSPs)，当与数据库中具有相同长度的字比对时，这些高分序列对或匹配或满足一些正值阈值分数T。T被称作邻近字分阈值(Altschul等，supra)。这些初始邻近字的命中(hits)作为起始检索的种子，以发现包含它们的更长HSPs。该字的命中在两个方向沿着每条序列延伸，直到累积比对分可以增加。对于核苷酸序列，累积分的计算使用参数M(一对匹配残基的奖励分；总是＞0)和N(不匹配残基罚分；总是＜0)。对于氨基酸序列，得分矩阵用于计算累积分。当：累积比对分从其最大获得值下降了数量X；由于一个或多个负分残基比对的累积，累积分达到0或者0以下；或到达任一序列的末端时，字命中的延伸在每个方向上暂停。BLAST算法参数w、T和X决定了排列的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用如下默认参数：字长(w)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认的3字长，和期望值(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。
药学上可接受的载体：用在本发明中的药学上可接受的载体是常规的。Remington′sPharmaceuticalSciences，byE.W.Martin，MackPublishingCo.，Easton，PA，第15版(1975)描述了适用于本发明公开的融合蛋白的药物传输的组合物和制剂。
在一般情况下，载体(carrier)的性质取决于所采用的施用的特定模式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，该流体包括药学上和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水、甘油等作为媒介物(vehicle)。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式的)，常规的无毒固体载体可以包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体，施用的药物组合物可含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨醇酐单月桂酸酯。
严格条件：在这一条件下探针与通常在核酸的复杂混合物中的靶亚序列杂交，但不与其它序列杂交。术语“杂交”指的是一个过程，通过该过程核酸序列单链通过互补核苷酸之间的氢键形成双螺旋片段。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下不同。更长的序列特异性杂交在较高的温度下进行。核酸杂交的广泛教导见Tijssen，TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicProbes.″OverviewOfprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays″(1993)。一般而言，严格条件被选择为在限定的离子强度pH下低于特定序列的热熔点(Tm)约5-10℃。T.是在平衡状态下50％的与靶互补的探针杂交至靶序列的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)(当靶序列过量存在时，在Tm，50％的探针在平衡状态下是被占用的)。严格条件也可以通过加入去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景的2倍，优选是背景杂交的10倍。示例性的严格杂交条件可以如下：50％甲酰胺(fonnamide)，5×SSC和1％SDS，42℃培养，或5×SSC，1％SDS，65℃培养，和用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃洗涤。如果它们编码的多肽是基本相同的，在严格条件下不相互杂交的核酸仍然是基本相同的。例如，当使用由基因代码允许的最大密码子简并产生核酸的拷贝(copy)时，会出现这种情况。在这种情况下，核酸通常在中等严格杂交条件下杂交。示例性的“中等严格杂交条件”包括在40％甲酰胺缓冲液、1MNaCl、1％SDS和37℃的条件下杂交，并在45℃的条件下在1×SSC中清洗。阳性杂交是背景的至少两倍。那些普通技术人员会容易认识到，替代性杂交和清洗条件可用于提供类似的严格条件。众多的参考文献提供了用于确定杂交参数的附加教导(例如CurrentProtocolsinMolecularBiology，ed.Ausubel，等.)。
受试者：任何动物，包括但不限于人、狒狒和其他非人灵长类动物，其呈现一个或多于一个的指示BaAdV感染的症状。
测试药剂或药剂：其是针对直接或间接调节肿瘤细胞增殖的能力的而将要被测试的任何分子或化合物，无论是天然存在的或合成的，例如蛋白质、寡肽(例如约5至约25个氨基酸长度，优选约10至20或12到18个氨基酸长度，优选12、15或18个氨基酸长度)、小有机分子、多糖、脂质、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等。测试药剂可以是测试化合物库(library)的形式，例如提供了足够多样性范围的组合库或随机库。测试药剂可选地连接至融合伴侣，例如靶向化合物、拯救化合物(rescuecompound)、二聚化合物、稳定化合物、可寻址化合物(addressablecompound)以及其他功能部分。以往，具有有用特性的新化学实体通过以下方式产生：识别具有一些期望的性质或活性(例如抑制活性)的测试药剂(称为“先导药剂”)，产生先导化合物的变体，并评估这些变体化合物的性质和活性。通常情况下，高通量筛选(HTS)方法用于这种分析。药剂可以是BaAdV核酸和多肽序列的酶抑制剂、激活剂或调节剂，并用来指使用BaAdV核酸和多肽序列的体外和体内分析识别的活化、抑制或调节分子。抑制剂是例如结合至BaAdV、部分或完全阻断活性、降低、防止、延迟活化、失活、脱敏或下调BaAdV的活性或表达的药剂，例如拮抗剂。活化剂是增加、开放、活化、促进、增强激活、敏化、激动(agonize)或上调BaAdV的活性的药剂，例如激动剂。抑制剂，激活剂或调节剂还包括基因修饰形式的BaAdV，例如具有改变的活性的形式，以及例如天然存在的和合成的配体、底物、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环肽、核酸、反义分子、核酶或小化学分子。
短语“小的有机分子”是指有机分子，无论是天然存在的或合成的，其具有大于约50道尔顿至小于约2500道尔顿的分子量，优选小于约2000道尔顿，优选在约100至约1000道尔顿之间，更优选在约200至约500道尔顿之间。
治疗有效量：产生效果的施用剂量。确切的剂量将取决于治疗的目的，而且由本领域技术人员使用本领域中已知的技术确定(见例如Lieberman，PharmaceuticalDosageForms(vols.1-3，1992)；Lloyd，TheArt，ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding(1999)；andPickar，DosageCalculations(1999))。
治疗或治疗：包括将组合物应用或施用至受试者，或将组合物应用或施用至已感染BaAdV、或具有BaAdV感染症状的受试者的细胞或组织，目的是医治、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾病或病症，疾病或病症的症状，或疾病或病症的危险。“预防”(preventing或prevention)一词包括在完全发展之前停止或阻碍与BaAdV感染相关的疾病、紊乱或症状。
疫苗：其是药物组合物，包含至少一种在动物中诱导免疫应答的免疫学活性成分，并且可以是但不必须是一种或多种可增强活性成分的免疫活性的附加组分。疫苗还可以包括药物组合物的其它通常成分。疫苗的免疫活性成分可以包括原始形式的完整病毒颗粒或在所谓的经修饰的活疫苗(MLV)中的减毒颗粒形式的完整病毒颗粒，或者在所谓的灭活疫苗中由适当的方法灭活的颗粒。可以施用包含抗原性物质的疫苗，以用于诱导针对由BaAdV感染引起的疾病的特定和活性免疫的目的。疫苗还可以提供抗体形式的被动免疫，该抗体是在之前针对BaAdV抗原产生的。
载体：引入宿主细胞，从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包括核酸序列，该核酸序列允许它在宿主细胞中复制，如作为复制的起点。载体也可包括编码一种或多种治疗性基因和/或可选择的标记基因和本领域已知的其他遗传元件的序列。载体可转导、转化或感染细胞，从而使细胞表达不同于细胞原生的那些的核酸和/或蛋白质。载体任选地包括帮助实现核酸进入细胞内的材料，例如病毒颗粒、脂质体、蛋白涂层等。载体可以是衍生自病毒的病毒载体，例如腺病毒载体。
除非另有说明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解相同的含义。单数术语“a”、“an”和“the”包括复数个对象，除非上下文另有明确说明。类似地，单词“或”意在包括“和”，除非上下文另有明确说明。还应该理解的是，对于给定的核酸或多肽而言，所有碱基大小或氨基酸大小，和所有分子量或分子质量值，都是近似的，并是出于说明的目的提供的。虽然类似于或等同于本发明所述的方法和材料可在本发明公开的实践或测试中使用，但合适的方法和材料如下所述。术语“包括(comprise)”的意思是“包含(include)”。所有的出版物、专利申请、专利和本发明提及的其它参考文献都通过引用整体结合入本发明。在冲突的情况下，以本说明书包括的术语解释为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不是意在限制。
狒狒腺病毒(BaAdV)核酸
本发明的狒狒腺病毒(BaAdV)核酸序列包括与BaAdV-3(SEQIDNO：3)的核苷酸1-34402和/或BaAdV-2/4(SEQIDNO：1和SEQIDNO：2)的核苷酸1-34391具有至少约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性，或约100％同一性的核酸序列，或核苷酸是至少100、至少200、至少300、至少400或至少500个核苷酸长度。在本发明中也提供了核酸序列和腺病毒，包括与SEQIDNO：1、2和3的开放阅读框架具有至少约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％同一性的核酸序列。本发明还提供了核酸序列，它们是互补于SEQIDNO：1、2和3的序列、以及互补于相应于开放阅读框架和它们的互补链的RNA和cDNA序列的链。本发明进一步包括核酸序列，该核酸序列具有大于95％至98％，例如约99％至99.9％的与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3的同源性或同一性。本发明还提供核酸，该核酸包括或由下列物质组成：如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3之一所述的核酸序列，及其简并变体。I
本发明提供的核酸包括或由下列核酸序列组成：(a)与如SEQIDNO：1所述的核酸序列的核苷酸1-29685和29867-34391具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列；(b)与如SEQIDNO：2所述的核酸序列的核苷酸1-29865和29867-34391具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列；(c)与如SEQIDNO：3所述的核苷酸1-28677和29812-34402的核苷酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。本发明还提供了核酸，包括或由以下核酸序列组成：与SEQIDNO1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的开放阅读框架具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。本发明还提供了核酸，其包括SEQIDNO1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的开放阅读框架或由SEQIDNO1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的开放阅读框架组成。
本发明还提供了编码多肽的核酸，该多肽与如SEQIDNO：5-109之一所述的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明还提供了编码多肽的核酸，该多肽包括如SEQIDNO：5-10之一的氨基酸序列，或由该序列组成。在一些实施方案中，本发明提供了编码多肽的cDNA，该多肽与如SEQIDNO：5-109之一所述的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供了编码多肽的核酸或其简并变体，该多肽具有如SEQIDNO：5-109之一所述的氨基酸序列。这些核酸可以是cDNA。
在一些实施方案中，提供的核酸分子含有BaAdV-1和/或BaAdV-2/4的AdITR序列。在其他实施方案中，本发明提供了核酸，其包括BaAdV-1和BaAdV-2/4核酸序列，该核酸序列编码期望的基因产物，包括但不限于早期或晚期基因产物、长纤维或短纤维，或聚合酶。这些核酸可以是cDNA。根据本发明提供的信息，使用本发明公开的序列构成的其它核酸分子对于本领域技术人员而言是显而易见的。例如，本发明提供的核酸，包括至少50、至少100、至少250、至少500、至少1000、至少1500、至少2000或至少3000个核苷酸长度的核苷酸序列，该核苷酸序列在长度上与SEQIDNO：l和/或SEQIDNO：2和/或SEQIDNO：3、和/或它们的互补物具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在具体的非限制性实施例中，这些核酸是非天然存在的。
BaAdV-1和BaAdV-2/4腺病毒核酸序列可以用作治疗剂(如通过包括编码治疗性部分的核酸)，并构造各种载体系统和宿主细胞。如本发明所述，载体包括任何合适的核酸分子，其包括裸DNA、质粒、病毒、粘粒或游离基因。这些序列和产物可单独使用或与其它腺病毒序列或片段结合使用、或与来自其它腺病毒或非腺病毒序列的元件结合使用。腺病毒序列可用作反义递送(delivery)载体、基因治疗载体或疫苗载体。
在一个实施方案中，本发明中确定的狒狒Ad基因区域可用于各种载体中，以将异源分子递送至细胞。例如生成用于表达腺病毒衣壳蛋白(或其片段)的载体，目的是在包装宿主细胞中产生病毒载体。这些载体可设计用于反式表达。可选地，这样的载体被设计为提供细胞，该细胞稳定地含有表达期望的腺病毒功能的序列，例如一个或多个E1a、E1b，末端重复序列，E2a、E2b、E4、E4ORF6区域。
此外，腺病毒基因序列及其片段可用于提供生产辅助依赖性病毒(例如，删除基本功能的腺病毒载体或腺相关病毒(AAV))所必需的辅助功能。使用腺病毒辅助功能生产rAAV的方法在与人腺病毒血清型相关的文献中已有详细描述(见美国专利号6,258,595；美国专利号5,871,982；PCT公开号WO99/14354；PCT公开号WO99/15685；和PCT公开号WO99/47691)。狒狒腺病毒基因序列提供了必要的辅助功能(如E1a、E1b、E2a和/或E4ORF6)，这在提供必要的腺病毒功能时是有用的，同时减少或消除了与任何其它腺病毒重组的可能性，该其它腺病毒存在于rAAV-包装细胞中，通常是人源的。
可选地，重组腺病毒狒狒载体可用于这些方法中。这些重组腺病毒狒狒载体可包括例如杂交狒狒Ad/AAV，其中狒狒Ad序列在侧面与rAAV表达盒(cassette)相接，该rAAV表达盒由如下物质组成：例如AAV3′和/或5′ITR，和在控制表达的调控序列控制下的转基因。本领域的技术人员可以认识到，其他狒狒腺病毒载体和/或基因序列可用于生产依赖腺病毒辅助功能的rAAV和其它病毒。
在又一实施方案中，核酸分子被设计为在宿主细胞中传送和表达一个或多个选定的腺病毒基因产物，以实现期望的生理效应。例如，含有编码腺病毒E1a蛋白的序列的核酸分子可以被传送至受试者，以用于治疗癌症。任选地，这样的分子被配制在脂质基载体中并且和优先靶向癌细胞。这样的制剂可与其它癌症治疗剂(例如顺铂、紫杉醇等)相结合。本发明提供的腺病毒序列的其它用途对于本领域技术人员也是显而易见的。
此外，本领域技术人员容易理解，本发明公开的腺病毒序列可容易地适用于各种病毒和非病毒载体系统中，以进行治疗性和免疫原性分子的体外、离体或体内传送。例如，本发明公开的基因组可用于各种重组腺病毒(rAd)和非rAd型载体系统中。这种载体系统可以包括但不限于质粒、慢病毒、逆转录病毒、痘病毒、牛痘病毒和腺相关病毒系统等。包括该多核苷酸的分子可以是裸DNA、质粒、病毒或任何其它遗传元件的形式，该多核苷酸包括本发明公开的狒狒AdDNA序列，。
在一个实施方案中，本发明确定的狒狒腺病毒基因区域可用作各种载体，或在各种载体中使用，以传送异源分子至细胞。例如，生成用于表达腺病毒衣壳蛋白(或其片段)的载体，其目的是在包装宿主细胞中产生病毒载体。这些载体可设计用于反式表达。可选地，这样的载体被设计为提供细胞，该细胞稳定地含有表达期望的腺病毒功能的序列，例如一个或多个E1a、E1b，末端重复序列，E2a、E2b、E4、E4ORF区域。
利用人类腺病毒血清型，使用腺病毒辅助功能生产重组(r)AAV的方法已有描述(例如见U.S.专利号6,258,595；U.S.专利号5,871,982；PCT公开号WO99/14354；PCT公开号WO99/15685；和PCT公开号WO99/47691)。这些方法也可用在生产非人血清型AAV中，包括非人灵长类动物AAV血清型。在提供必需的腺病毒功能时，提供了必需的辅助功能的狒狒腺病毒基因(例如E1a、E1b、E2a和/或E4ORF6)可以是特别有用的。不受理论束缚，它们可以最小化或消除与任何其它腺病毒重组的可能性，该其它腺病毒存在于rAAV-包装细胞中，通常是人源的。因此，本发明的腺病毒序列的选定基因或开放阅读框架可用在这些rAAV生产方法中。重组腺病毒猿猴载体包括例如：杂交狒狒腺病毒(Ad)/AAV，其中狒狒腺病毒Ad序列在侧面与rAAV表达盒(cassette)相接，该rAAV表达盒由如下物质组成：例如AAV3′和/或5′ITR，和在控制表达的调控序列控制下的转基因。本领域技术人员可认识到，本发明的其它猿猴腺病毒载体和/或基因序列可用于生产依赖腺病毒辅助物的rAAV和其它病毒。
用于生产多肽的分子也在本发明中被公开了。包括该多核苷酸的这样的分子可以是裸DNA、质粒、病毒或任何其它遗传元件的形式，该多核苷酸包括本发明的狒狒腺病毒核酸序列。任何蛋白质都可以通过这些载体编码，包括标记物和治疗性蛋白质。因此，载体可用于在靶细胞中传送异源多肽。在一些实施方案中，编码异源多肽的核酸可操作地连接到一个或多个表达控制序列上，如启动子和/或增强子。本领域技术人员可容易地工程化(engineer)本发明公开的腺病毒核酸，以包括编码目标的多肽的异源核酸序列，并在宿主细胞中表达多肽。类似地，异源启动子和增强子可以可操作地连接到编码腺病毒多肽的核酸上。
表达
为了获得克隆基因或基因组的高水平表达，如由本发明公开的开放阅读框架编码的多肽，例如但不限于与SEQIDNO：5-109之一具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，人们将通常将核酸亚克隆到表达载体中，该表达载体含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子，并且如果是编码蛋白质的核酸，还包含用作翻译起点的核糖体结合位点。开放阅读框架包括任何在所附序列信息中列出的那些。合适的细菌启动子是本领域已知的，并有描述(例如Sambrook等，和Ausubel等，supra.)。用于表达蛋白质的细菌表达系统是可用的，例如大肠杆菌、芽孢杆菌属和沙门氏菌(Palva等，Gene22：229-235(1983)；Mosbach等，Nature302：543-545(1983))。用于此类表达系统的试剂盒是市售的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统在本领域中是已知的，并也是市售的。逆转录病毒表达系统也是可用的。
用于异源核酸的直接表达的启动子的选择依赖于特定的应用。启动子优选位于距离异源转录起始点和天然设置的转录起始位置约相同的距离处。然而，如本领域已知的，该距离的一些变化是可以被调节的并且不损失启动子功能。异源是指核酸的部分，这表明核酸包含本质上未发现有相同的相互关系的两个或更多个子序列。例如，核酸通常是重组产生的，具有两个或更多个来自无关基因的序列，排列成新的功能性核酸，例如，来自一个来源的启动子和来自另一来源的编码区。类似地，异源蛋白表示该蛋白包含本质上未发现有相同的相互关系的两个或更多个子序列(例如融合蛋白)。
除了启动子，表达载体还通常包括转录单位或表达盒，该转录单位或表达盒含有核酸在宿主细胞中表达必需的所有附加元件。典型的表达盒因此包含可操作地连接到核酸序列上的启动子、核糖体结合位点和翻译终止子，该核酸序列编码在转录中有效多腺苷酸化所需的选择的核酸和信号。表达盒的附加元件可以包括增强子，以及如果基因组DNA用作结构基因的话，还包括具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
除了启动子序列，表达盒还包含在结构基因下游的转录终止区，以提供有效的终止。该终止区可以从与启动子序列相同的基因获得，或者可以从不同的基因获得。
用来输送基因信息进入细胞的具体表达载体不是特别关键的。任何用于真核或原核细胞表达的常规载体都可使用。标准细菌表达载体包括质粒，如pBR322基质粒、pSKF、pET23D，和融合表达系统，如MBP、GST和LacZ。表位标签(tag)也可加入到重组蛋白中，以提供分离的简便方法，例如c-myc。可以使用异源腺病毒载体。序列标签可以包含在用于核酸救援(rescue)的表达盒中。载体可包括例如荧光蛋白、绿色或红色荧光蛋白、13-gal、CAT等的标记物(marker)，作为载体转导的标记物。
包括来自真核病毒的调节元件的表达载体通常用作真核表达载体，例如SV40载体、乳头状瘤病毒载体、逆转录病毒载体和衍生自爱泼斯坦一巴尔二氏病毒(Epstein-Barr)病毒的载体。其他示例性的真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMT010/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和任何其它载体，这些其它载体允许在如下的启动子的引导下表达蛋白质：CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子、或在真核细胞中对表达显示有效的其它启动子。
来自真核载体的蛋白质表达也可以使用诱导型启动子调节。在诱导型启动子的存在下，通过将诱导剂的响应元素并入启动子中，表达水平依赖于诱导剂的浓度，例如四环素。通常，仅在诱导剂的存在下，就从诱导型启动子得到了高水平表达，而基础表达水平是微乎其微的。
载体可以有可调节的启动子，例如四环素调控系统和RU-486系统(例如见Gossen&Bujard，PNAS89：5547(1992)；Oligino等，GeneTher.5：491-496(1998)；Wang等，GeneTher.4：432-441(1997)；Neering等，Blood88：1147-1155(1996)；和Rendahl等，Nat.Biotechnol.16：757-761(1998))。这些赋予(impart)小分子对候选靶核酸的表达的控制。这种有益的特征可用来确定期望的表型，其是由转染cDNA引起的，而不是体细胞突变。
一些表达系统具有标记物，该标记物提供基因扩增，例如胸苷激酶和二氢叶酸还原酶。可选地，不涉及基因扩增的高产量表达系统也是合适的，例如在多角体蛋白启动子或其它强杆状病毒启动子的引导下，用选定的序列，在昆虫细胞中使用杆状病毒载体。
通常包括在表达载体中的元件也包括在大肠杆菌中发挥功能复制子，包括编码抗生素抗性的基因，以允许选择藏有重组质粒的细菌，以及包括在质粒的非必需区域的独特限制性位点，以允许插入真核生物序列。选择的具体抗生素抗性基因不是关键的，因为现有技术已知的许多抵抗基因的任何基因都是合适的。如果必要的话，优选地选择原核序列，以使得它们不干扰真核细胞中的DNA复制。
标准转染方法用于生产表达大量蛋白质的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后使用标准技术纯化(例如见Colley等，J.Biol.Chem.264：17619-17622(1989)；GuidetoProteinPurification，inMethodsinEnzymology，vol.182(Deutscher，ed.，1990))。真核和原核细胞的转化是按照标准技术进行的(例如见Morrison，JBact.132：349-351(1977)；Clark-Curtiss&Curtiss，MethodsinEnzymology101：347-362(Wu等.，编，1983))。
任何用于将外源核苷酸序列导入宿主细胞中的已知方法都可以使用。这些方法包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、基因枪、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体和任何其它的用于将克隆基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其他外来基因材料引入宿主细胞的方法(例如见Sambrook等，supra)。只需要所用的特定基因工程方法能够成功地将至少一种基因引入能够表达BaAdV蛋白质和核酸的宿主细胞中。宿主细胞可以是人细胞，或非人灵长类动物细胞。
在表达载体引入细胞中之后，在有利于选定蛋白表达的条件下培养转染的细胞，使用以下确定的标准技术从培养物中进行回收。
天然存在或重组BaAdV蛋白可被纯化用于诊断分析、用于制备抗体(用于诊断和治疗)和疫苗，和用于分析抗病毒化合物。天然存在的蛋白质可从例如灵长类组织样品中纯化。重组蛋白质可以从任何合适的表达系统中纯化。
BaAdV多肽
BaAdV多肽，例如由本发明确定的开放阅读框架编码的多肽，及其功能性片段，可通过标准技术纯化至基本纯的，这些标准技术包括使用如硫酸铵的物质选择性沉淀、柱色谱法、免疫纯化法和其它方法(例如见Scopes，ProteinPurification：PrinciplesandPractice(1982)；U.S.PatentNo.4,673,641；Ausubel等，supra；和Sambrook等，supra)。本发明提供了示例性的BaAdV多肽，诸如与SEQIDNO：5-109之一具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多肽。在具体的非限制性实施例中，多肽包括或由以下序列组成：如SEQIDNO：5-109之一所述的氨基酸序列。
在纯化重组蛋白时，可以采用一系列程序。例如，具有已建立的分子粘附性的蛋白质可以可逆地融合至蛋白质。使用适当的配体或底物，特定蛋白可以选择性地吸附至纯化柱上，然后以相对纯的形式从该柱释放。随后通过酶活性除去融合蛋白。最后，可以使用免疫亲和柱纯化蛋白。重组蛋白质可以是从任何合适的来源纯化的，包括酵母、昆虫、细菌和哺乳动物细胞。
通常在启动子诱导后，可以通过大量的转化细菌表达和纯化重组蛋白质，但表达可以是构成的。使用IPTG诱导启动子是可诱导启动子系统的一个例子。细菌根据本领域的标准方法生长。新鲜或冷冻的细菌细胞用于蛋白质分离。
在细菌中表达的蛋白质可形成不溶性聚集物(“包涵体”)。几个程序(protocol)适合于蛋白质包涵体的纯化。例如，包涵体的纯化通常涉及通过破坏细菌细胞提取、分离和/或纯化包涵体，例如在50mMTRIS/HCLpH7.5、50mMNaCl、5mMMgCl2、1mMDTT、0.1mMATP和1mMPMSF的缓冲液中培育。使用2-3个通道的FrenchPress裂解细胞悬浮液，使用Polytron(BrinkmanInstruments)或冰上超声进行均匀化。裂解细菌的备选方法本领域技术人员显而易见的(例如见Sambrooketal.，supra；AusubeletaLsupra)。
如果必要的话，包涵体被溶解，并且溶解的细胞的悬浮液通常经离心除去不希望的不溶性物质。形成包涵体的蛋白可通过稀释或透析用相容的缓冲液复性。合适的溶剂包括但不限于：尿素(约4M-约8M)、甲酰胺(至少约80％，体积/体积计)，和盐酸胍(约4M-约8M)。某些溶剂能够增溶形成聚集体的蛋白质，例如SDS(十二烷基硫酸钠)、70％的甲酸，但它们不适合在此过程中使用，这是由于蛋白质的不可逆变性可能性，并伴随着缺乏免疫原性和/或活性。虽然盐酸胍及类似药剂是变性剂，但此变性不是不可逆的，复性可以在除去(例如通过透析)或稀释变性剂时发生，从而允许重新形成免疫和/或生物活性的蛋白质。其他合适的缓冲液是本领域技术人员已知的。从其它细菌蛋白中通过标准的分离技术分离人类蛋白质，例如用Ni-NTA琼脂糖树脂。
可选地，也可以从细菌周质中纯化重组蛋白。细菌裂解后，除了本领域技术人员已知的其他方法外，细菌的周质部分还可以通过冷渗压休克(shock)分离。为了从周质中分离重组蛋白，离心细菌细胞以形成粒料。将粒料重新悬浮于含有20％蔗糖的缓冲液中。为了溶解(lyse)细胞，离心细菌，将粒料重新悬浮于冰冷的5mMMgSO4中并保持冰浴约10分钟。离心细胞悬浮液，将上清液倒出并保存。存在于上清液中的重组蛋白可通过本领域技术人员已知的标准分离技术从宿主蛋白中分离。
溶解度分级可作为标准的蛋白分离技术用于纯化蛋白质。作为初始步骤，特别是如果蛋白质混合物较复杂，初始盐分级可以从目标的重组蛋白中分离出许多不需要的宿主细胞蛋白质(或来生自细胞培养基(media)的蛋白质)。优选的盐是硫酸铵。硫酸铵通过有效地减少了蛋白质混合物的水量来沉淀蛋白质。蛋白质然后基于其溶解性发生沉淀。更疏水的蛋白质更有可能在较低的硫酸铵浓度下沉淀。通常程序包括加入饱和硫酸铵至蛋白质溶液中，以使得到的硫酸铵浓度在20-30％之间。该浓度将沉淀出疏水性最强的蛋白质。然后将该沉淀物弃去(除非目标蛋白质是疏水性的)，并在上清液中加入硫酸铵至已知的沉淀目标蛋白质的浓度。然后将沉淀溶解在缓冲液中，并且如果需要的话通过透析或渗滤除去过量的盐。依赖蛋白质的溶解性的其它方法，如冷乙醇沉淀，是本领域技术人员已知的，并且可用于分级分离复杂的蛋白质混合物。
蛋白质的分子量可用于通过不同孔径大小的膜(例如Amicon或Millipore薄膜)采用超滤技术从较大和较小尺寸的蛋白质中分离该蛋白质。作为第一步，通过具有一定孔径的膜超滤蛋白质混合物，该膜的截留分子量小于目标的蛋白质的分子量。超滤的滞留物然后由另一膜超滤，该膜的截留分子量大于目标的蛋白质的分子量。重组蛋白将透过滤膜进入滤液。然后可以如下所述地色谱分离滤液。
也可以根据大小、净表面电荷、疏水性和对配体或底物的亲和性，使用柱色谱从其他蛋白质中分离该蛋白质。另外，针对蛋白质产生的抗体可以缀合至柱基质和免疫纯化的蛋白。所有这些方法是本领域中已知的。对于本领域技术人员显而易见的是，色谱技术可以以任何规模、并且使用来自许多不同的制造商(例如PharmaciaBiotech)的设备来执行。
本发明所公开的多肽可以用于检测特异性结合BaAdV-2/4或BaAdV-3抗体的抗体在来自受试者的生物样品中的存在。该生物样品可以是任何样品，包括但不限于血液或血清样品。该方法包括用本发明公开的一种或多种多肽接触生物样品足够长的时间，以使任何抗体与一种或多种多肽形成免疫复合物，并检测该免疫复合物的存在。检测免疫复合物存在的方法是本领域已知的，并如下所述。在几个实施方案中，该方法包括使用特异性结合人抗体的第二抗体。在一些实施中，第二抗体被标记。
探针、引物和检测BaAdV核酸
在生物样品中，BaAdV感染，如BaAdV-2/4和BaAdV-3感染，可基于特定BaAdVRNA或DNA的水平进行检测。引物和探针是特异于BaAdV的，其可用于检测BaAdV，诊断BaAdV感染，确认早期感染，和确定BaAdV病毒载量(load)。在一些实施方案中，特异性结合BaAdV-2/4的探针和/或引物可用于检测BaAdV-2/4，诊断和确定BaAdV-2/4病毒载量。在其他实施方案中，特异性结合BaAdV-3的探针和/或引物可用于检测BaAdV-3，诊断，和确定BaAdV-3病毒载量。在进一步的实施方案中，这些方法区分BaAdV-3感染与如BaAdV-2/4感染和/或BaAdV-1感染。在进一步的实施方案中，来自BaAdV-2/4的引物可用于检测BaAdV-2/4，诊断，和确定BaAdV-2/4病毒载量。在进一步的实施方案中，这些方法区分BaAdV-2/4感染与如BaAdV-3感染和/或BaAdV-1感染。在一些实施方案中，该方法区分BaAdV-2/4和/或BaAdV-3与BaAdV-1。在另外的实施方案中，该分析是多重分析。
任何合适的引物都可用于检测基因组、核酸子序列、ORF或选定蛋白，例如使用美国公开的专利申请号2003/0104009中所述的方法。在一些实施例中，在生物样品中(如人细胞的提取物)存在的所获得(asobtained)受试者核酸组合物可用作单链或双链探针或引物，以检测从这样的mRNA产生的BaAdV-2/4mRNA或cDNA。在其它实施例中，在生物样品中(如人细胞的提取物)存在的所获得受试者核酸组合物可以用作单链或双链探针或引物，以检测从这样的mRNA产生的BaAdV-3mRNA或cDNA。在一些实施方案中，探针或引物特异于BaAdV-2/4或BaAdV-3的短纤维基因。
BaAdV-2/4和BaAdV-3的多核苷酸也可用于产生多核苷酸的附加拷贝，以产生反义寡核苷酸，和作为三链形成寡核苷酸。例如，在聚合酶链反应(PCR)基分析中可利用两个寡核苷酸引物扩增来自生物样品的BaAdVcDNA的部分，其中寡核苷酸引物的至少一种特异于(即杂交至)BaAdV多核苷酸。在一些实施例中，引物特异性结合BaAdV-3核酸，并且因此可用于从BaAdV-2/4和/或BaAdV-1确定(delineate)BaAdV-3。在其它实施例中，引物特异性结合BaAdV-2/4核酸，并且因此可用于从BaAdV-3和/或BaAdV-1确定BaAdV-2/4。在具体的非限制性实施例中，探针和/或引物特异性结合编码短纤维多肽的核酸。
引物可以是至少或约12、15、16、18、20、22、24、25、30、35、40、45或50个核苷酸(nt)，或是例如连续序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、或其它编码BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽的多核苷酸序列的约12至50个nt长度、15至30个nt长度、15至25个nt长度或20至30个nt长度的片段。扩增的cDNA然后被分离并使用本领域已知的技术检测，如凝胶电泳。同样地，特异性杂交BaAdV-2/4或BaAdV-3多核苷酸的寡核苷酸探针可分别用于杂交分析，以检测BaAdV-2/4或BaAdV-3多核苷酸在生物样品中的存在。
对于PCR，尽管退火温度可以根据引物长度而在约32℃-48℃之间变化，约36℃的温度是通常用于低严格性扩增。对于高严格性PCR扩增，尽管高严格性退火温度可以根据引物长度和特异性在约50℃-65℃之间，约62℃的温度是通常用于高严格性扩增的。高的和低的严格扩增的通常循环条件包括90℃-95℃的30s-2min的变性阶段、持续30s-2min的退火阶段、和在约72℃下的1-2min的扩展阶段。本发明还提供了用于高的和低的严格扩增反应的程序和指南(例如Innis等.(1990)PCRProtocols，AGuidetoMethodsandApplications，AcademicPress，Inc.N.Y.)。
在一些实施方案中，提供了用于检测狒狒腺病毒(BaAdV)-3或BaAdV-2/4核酸的方法。该方法包括以下步骤：(a)使疑似包括腺病毒核酸的样品与至少一个引物接触，该引物在严格的条件下与阐明为SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和/或SEQIDNO：3的核苷酸序列杂交；(b)进行PCR反应；和(c)检测来自PCR反应的反应产物的存在或不存在，其中反应产物的存在检测BaAdV-3或BaAdV-2/4腺病毒。
BaAdV-2/4和BaAdV-3多核苷酸(天然的或衍生的)的探针是一定长度的或具有序列，该序列允许通过杂交检测独特的病毒序列。尽管约6-8个核苷酸可能是有用的，但更长的序列可能是更有效的，例如约10-12个核苷酸，或约15、16、17、18、19、20个核苷酸或更多个核苷酸的序列。在一些实施方案中，这些序列来自病毒分离物的缺乏异质性的区域。
特异性于BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的核酸探针或引物可以由本发明公开的多核苷酸序列生成。在一些实施方案中，探针是连续序列的至少约12、15、16、18、20、22、24或25个核苷酸(nt)的片段，该连续序列是SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3或其它编码BaAdV多肽(如BaAdV-2/4和/或BaAdV-3简并变体)的多核苷酸序列。核酸探针可以在长度上小于约200bp、150bp、100bp、75bp、50bp、60bp、40bp、30bp、25/2(25除以2)kb、1.5kb、1kb、0.5kb、0.25kb、0.1kb或0.05kb。该探针的制备可通过例如化学合成、PCR扩增、使用限制酶从较长的多核苷酸产生，或本领域已知的其它方法。通常，引物和探针是与BaAdV核酸序列具有同一性的，并且不同于非BaAdV序列。如上所述，引物和探针可以用于将BaAdV-2/4和BaAdV-3从彼此、和从BaAdV-1区分。
本发明所述的多核苷酸，特别是用作诊断分析的探针时，可以被可检测地标记。示例性的检测标记包括但不限于放射性标记、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明，德克萨斯红、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、6-羧基荧光素(6-FAM)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-2′，4′，T，4，7-六氯荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA))、放射性标记物(例如.sup.32p、.sup.35S和sup.3H)等。可检测标记可涉及两阶段(twostage)系统(例如生物素-抗生物素蛋白、半抗原-抗半抗原抗体等)。
非基于PCR的序列特异性的DNA扩增技术也可用于本发明中检测BaAdV序列。这种技术的例子包括但不限于侵入(invader)分析(例如见Kwiatkowski等.MolDiagn.1999年12月，4：353-64和美国专利号5,846,717)。
在其他实施方案中，提供了固体底物(substrates)，如阵列(array)，其包括本发明所述的任何多核苷酸。使用本领域已知的方法将多核苷酸固定在阵列上。阵列可具有一个或多个不同的多核苷酸。
本领域已知的用于检测特定BaAdV核酸(例如RNA或DNA)的任何合适的定性或定量的方法都可以使用。可通过例如原位杂交在组织切片上来检测BaAdV核酸，使用的方法是通过逆转录酶-PCR，或含有聚AmRNA的蛋白质印迹法，以及本领域已知的其他方法，检测杂交的核酸之间单碱基对差异(使用例如U.S.Pat.No.5,846,717所述的技术)。对于血液或血液衍生样品的BaAdV-2/4和BaAdV-3多核苷酸检测而言，优选使用允许检测单碱基对错配的方法。
以BaAdV-2/4和BaAdV-3核酸为基础，或通过自重组多核苷酸切除或通过合成，可以制备核酸探针(例如包括至少约8个核苷酸或更多个核苷酸的低聚物，如上)，该探针与期望的BaAdV核酸杂交，因此它们可用于在样品中检测特定的BaAdV病毒，和识别被感染的个人，以及进一步表征病毒基因组。在一些实施例中，探针和引物可被设计成检测BaAdV-2/4和BaAdV-3二者。在一些实施例中，探针和引物从BaAdV-1区分BaAdV-2/4和BaAdV-3。在其他实施方案中，探针和引物可被设计为仅检测BaAdV-2/4。在一些实施例中，探针和引物从BaAdV-3和BaAdV-1区分BaAdV-2/4。在进一步的实施方案中，探针和引物可被设计为仅检测BaAdV-3。在一些实施例中，探针和引物从BaAdV-2/4和BaAdV-1区分BaAdV-3。
核酸探针可使用常规方法制备，包括自动寡核苷酸合成方法。BaAdV-2/4和/或BaAdV-3基因组的任何独特部分的互补物将是令人满意的，例如允许从可能存在于样品中的其它病毒中区分目标的BaAdV的基因组的部分，该其它病毒例如是其他BaAdV，如BaAdV-1或其他腺病毒。用作探针时，完全互补是期望的，虽然随着片段长度的增加这可以是不必要的。
这样的探针用于诊断时，待分析的生物样本，如血液或血清，如果需要的话可经受处理，以提取包含在其中的核酸。从样品中得到的核酸可以经凝胶电泳或其他尺寸分离技术处理；可选地，核酸样品可以被斑点杂交(dotblotted)，而不经尺寸分离。探针通常标有可检测标记。合适的标记，以及用于标记探针的方法是本领域已知的，可以包括例如经缺口翻译(nicktranslation)或致活酶(kinasing)而结合的放射性标记、生物素、荧光探针和化学发光探针。然后从样品中提取的核酸在合适的严格性杂交条件下经标记探针处理。
探针可完全互补于BaAdV-2/4和/或BaAdV-3基因组或其部分(例如编码BaAdV多肽的序列的全部或部分)。因此，通常高严格条件是期望的，以防止或至少最小化假阳性。然而，如果探针是与在BaAdV病毒分离物之间缺乏异质性的病毒基因组的区域互补的，则应仅可使用高严格条件。杂交的严格性是由杂交和清洗过程中的若干因素确定的，包括温度、离子强度、时间长短和甲酰胺浓度(Sambrook等.(1989)，″MolecularCloning；ALaboratoryManual，″第二版(ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，N.Y.))。
一般地，预计BaAdV-2/4或BaAdV-3序列将以较低的水平存在于获得自感染的个体生物样品中(例如血液、细胞等)，如约每106个细胞含102-104个BaAdV-2/4或BaAdV-3序列。这个水平可以要求在杂交分析中使用扩增技术。这样的技术是本领域已知的。
例如，Enzo生物化学品公司的“Bio-Bridge”系统使用末端脱氧核苷酸转移酶来将未修饰的3′-聚-dT-尾部加到DNA探针上。具有聚dT-尾部的探针杂交至靶核苷酸序列，然后杂交至生物素-修饰的聚-A。PCT公开号WO84/03520和欧洲申请号EPA124221描述了一种DNA杂交分析方法，其中：(1)将分析物退火成与酶标记寡核苷酸互补的单链DNA探针；和(2)将得到的有尾部的双链杂交至酶标记的寡核苷酸。欧洲公开专利申请号204510描述了DNA杂交分析，其中分析物DNA与能够结合多个标记链的探针相接触，该探针具有尾部(如聚-dT尾部)、扩增链，该扩增链具有杂交至探针尾部的序列，如聚-A序列。
一种技术可以首先涉及在血清中扩增目标BaAdV-2/4和/或BaAdV-3序列约10,000倍，例如至约10序列/mL。这可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)技术(Saiki等.(1986)，Mullis的U.S.Pat.No.4,683,195，和Mullis等的U.S.Pat.No.4,683,202)实现。其它扩增方法是现有技术已知的。
探针，或替代性地，来自样品的核酸，在上述分析中可在溶液中提供，或者可被固定到支持物上(例如固体或半固体支持物)。可以使用的支持物的例子是硝酸纤维素(例如以膜或微量滴定孔(microtiterwell)的形式)、聚氯乙烯(例如片或微量滴定孔)、聚苯乙烯胶乳(例如珠或微量滴定板、聚偏二氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、活化珠和蛋白A珠)。
探针(或样品核酸)可在阵列上提供以用于检测。阵列可通过以下方式创建，例如在二维矩阵或阵列形式的底物(例如玻璃、硝基纤维素等)上点样(spotting)多核苷酸探针。探针可以通过共价键或通过非特异性相互作用(如疏水相互作用)而结合到底物上。多核苷酸的样品可被检测性标记(例如使用放射性或荧光标记)，然后杂交至探针上。双链多核苷酸包括结合至探针多核苷酸的标记样品多核苷酸，一旦样品的未结合部分被洗掉就可以检测到该双链多核苷酸。用于构造阵列的技术和使用这些阵列的方法如EP799897；WO97/29212；WO97/27317；EP785280；WO97/02357；U.S.Pat.No.5,593,839；U.S.Pat.No.5,578,832；EP728520；U.S.Pat.No.5,599,695；EP721016；U.S.Pat.No.5,556,752；WO95/22058；和U.S.Pat.No.5,631,734所述。在例如将要分析单个样本以确定两个或更多个核酸靶区域存在时，阵列是特别有用的，因为用于每个靶区域的探针以及对照物(正和负)可以在单个阵列上提供。因此阵列有助于快速和方便的分析。
BaAdV抗体
所产生的针对BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的抗体可以作为各种各样的目的，如本发明所述，包括但不限于：用于检测BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的诊断分析。这些抗体也可用于治疗。抗体特异性结合BaAdV-2/4的多肽、或作为BaAdV-3多肽。具体的非限制性实施例包括特异性结合与SEQIDNO：5-109之一具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的多肽的抗体。抗体包括多克隆或单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体特异性结合由SEQIDNO：1-3编码的多肽，其中抗体不特异性结合由SEQIDNO：4编码的多肽。
包含BaAdV-2/4和/或BaAdV-3蛋白、病毒或核酸的部分的许多免疫原可用于产生与BaAdV-2/4和/或BaAdV-3特异性反应的抗体。在一些实施方案中，抗体特异性结合BaAdV-2/4，而不是BaAdV-3或BaAdV-1。在其他实施方案中，抗体特异性结合BaAdV-3，而不是BaAdV-2/4或BaAdV-1。在进一步的实施方案中，抗体特异性结合BaAdV-3和BaAdV-2/4，而不是BaAdV-1。在一些非限定性实施例中，抗体特异性结合SEQIDNO：5-109之一。抗体可以是单克隆抗体或其片段，其特异性结合SEQIDNO：5-109之一。
在一些实施方案中，重组的BaAdV-2/4或BaAdV-3蛋白或其抗原片段，可以如本发明所述地分离。重组蛋白质可以在真核或原核细胞中如上所述地表达，并如上总体描述地进行纯化。重组蛋白质可用来作为免疫原用于生产单克隆抗体或多克隆抗体。可选地，衍生自本发明所公开的序列，并缀合至载体蛋白的合成肽，可作为免疫原使用。天然存在的蛋白质也可以以纯的或不纯的形式使用。然后将产物注入能产生抗体的动物中。单克隆或多克隆抗体都可被产生，以供在后续的免疫分析中测量多肽。
本发明也公开了产生特异性结合BaAdV-2/4或BaAdV-3的抗体的方法。为了制备抗体，例如重组的、单克隆或多克隆抗体，许多技术都是可以使用(例如见Kohler&Milstein，Nature256：495-497(1975)；Kozbor等，ImmunologyToday4：72(1983)；Cole等，pp.77-96inMonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，Inc.(1985)；Coligan，CurrentProtocolsinImmunology(1991)；Harlow&Lane，Antibodies，ALaboratoryManual(1988)；和Goding，MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice(第2版.1986))。
生产多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。采用标准佐剂(如Freund佐剂)和标准免疫程序，用蛋白免疫小鼠(例如BALB/C小鼠)或兔的近交系(inbredstrain)。针对免疫原制剂的动物免疫响应是通过取测试放血、并测定针对β亚基的反应性效价来监测的。当获得了针对免疫原的抗体的合适高效价时，从动物收集血液并制备抗血清。如果需要的话，可以完成进一步分级抗血清，以针对对蛋白质有反应性的抗体进行富集(见Harlow&Lane，supra)。
单克隆抗体可以通过本领域技术人员熟悉的各种技术获得。简言之，通常通过与骨髓瘤细胞的融合，使来自以期望的抗原(如BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽)免疫的动物的脾细胞永生化(见Kohler&Milstein，Eur.J.Immunol.6：511-519(1976))。永生化的可选方法包括用EpsteinBarr病毒、癌基因或逆转录病毒转化，或本领域已知的其他方法。从单个永生化细胞产生的克隆体经筛选产生对抗原具有期望的特异性和亲和力的抗体，以及由这种细胞产生的单克隆抗体的产率可通过各种技术提高，包括注射到脊椎动物宿主的腹膜空腔中。可选地，本领域技术人员可以根据Huse，等，Science246：1275-1281(1989)提出的通用程序，通过筛选来自人的B细胞DNA库来分离DNA序列，该DNA序列编码单克隆抗体或其结合片段。
收集单克隆抗体和多克隆血清，并在免疫分析中针对抗免疫原蛋白确定效价(titered)，例如用固定在固体载体上的免疫原进行固相免疫分析。通常，使用竞争性结合免疫分析法，选择具有104或更大的效价的多克隆抗血清，并测试其针对非BaAdV蛋白质和核酸的交叉反应性。特异性多克隆抗血清和单克隆抗体通常在为下述的Kd下结合：至少约0.1mM的，更通常至少约1μM的、优选至少约0.1μM或更好、并且最优选0.01μM或更好。仅特异性于特定BaAdV蛋白的抗体也可通过减去其它交叉反应的蛋白来制备。以这种方式，可以得到只结合于选定蛋白的抗体。
可使用噬菌体展示技术确定抗体和异聚Fab片段，其特异性结合选定的抗原，如BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽(例如见McCafferty等，Nature348：552-554(1990)；Marks等，Biotechnology10：779-783(1992))。抗体也可制备成双特异性的，即能够识别两种不同的抗原(例如见WO93/08829，Traunecker等，EMBOJ.10：3655-3659(1991)；和Suresh等，MethodsinEnzymology121：210(1986))。抗体还可以是异源偶联物，例如两个共价连接的抗体或免疫毒素(例如见美国专利号4,676,980，WO9I/00360；WO92/200373；和EP03089)。
可使用嵌合抗体，其是抗体分子，其中：(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，使得抗原结合点(可变区)连接至不同的或改变的类(class)、效应子功能和/或物种(species)的恒定区，或连接至完全不同的、为嵌合抗体赋予新的性质的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分，用具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。
人源化或灵长化抗体可以被使用。通常，人源化抗体中具有引入其中的来自非人源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为输入残基，其通常取自输入可变结构域。人源化或灵长动物化(primatizing)非人抗体的方法是现有技术已知的。通过用人类抗体的相应序列取代啮齿类的CDR序列，人源化可基本上按照如下的Winter和co-workers方法进行(例如见Jones等，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science239：1534-1536(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))。因此，这类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中实质上少于完整人类可变区的部分被来自非人物种(species)的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿类抗体的类似点的残基取代。
本公开的内容包括抗体片段，例如Fab、F(ab′)2和Fv，它们都包括重链和轻链可变区。这些抗体片段保留了与抗原选择性结合的能力。这些片段包括：
(1)Fab，包括抗体分子的单价抗原结合片段的片段，其通过木瓜蛋白酶消化整个抗体而产生完整轻链和一个重链的部分来生成；
(2)Fab′，抗体分子片段，其是通过使用胃蛋白酶处理整个抗体来获得，随后经过还原，产生完整轻链和重链的部分获得的；两个Fab′片段，由每个抗体分子得到；
(3)(Fab′)2，抗体片段，通过用胃蛋白酶处理整个抗体得到，但不经随后的还原；F(ab′)2，是两个Fab′片段的二聚体，由两个二硫键连在一起；
(4)Fv，基因工程片段，含有表达为两条链的轻链可变区和重链可变区；
(5)单链抗体(如scFv)，基因工程分子，含有轻链可变区、重链可变区，所述轻链可变区和重链可变区通过合适的多肽连接子而连接为基因融合单链分子。
(6)单链抗体(scFv2)的二聚体，定义为scFv二聚体。这也称为“微型抗体(miniantibody)”。
制备这些片段的方法是本领域已知的(见例如Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，纽约，1988)。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以缀合至效应分子，如标记或毒素。有用的检测药剂包括荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系磷光体等。生物发光标记物也可使用如荧光素酶、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白。抗体或其抗原结合片段也可用酶标记，它对于检测是有用的，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体或其抗原结合片段用可检测的酶标记时，它可以通过加入另外的药剂检测，该酶用于产生可辨识的反应产物。例如，当药剂辣根过氧化物酶存在时，加入的过氧化氢和二氨基联苯胺氢带来了有色反应产物，这是视觉可检测的。抗体或其抗原结合片段也可用生物素标记，并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉亲和素(streptavidin)的结合进行检测。应当指出的是，抗生物素蛋白本身可以用酶或荧光标记标记。
抗体或其抗原结合片段可以标记有磁力剂，例如钆。抗体和抗原结合片段也可以标记有镧系元素(如铕和镝)，和锰。顺磁性颗粒如超顺磁性氧化铁也可用作标记。抗体或抗原结合片段也可以标记有由次级报告子(repoter)识别的预定多肽表位(如亮氨酸拉链对序列、第二抗体结合点、金属结合结构域、表位标签(tag))。在一些实施方案中，通过各种长度的间隔臂来附接(attached)标记以减少潜在的空间位阻。
抗体也可以用放射性标记氨基酸标记。放射性标记可以用于诊断和治疗目的。用于多肽的标记的例子包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：3H、14C、15N、35S、90y、99Tc、111In、125I、131I。
抗体或抗原结合片段也可与化学基团衍生化，例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基团。这些基团对于改善抗体的生物学特征是有用的，如提高血清半衰期或增加组织结合。
检测这种标记的装置是技术人员已知的。因此，例如放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计数器检测，荧光标记的检测可使用光电检测器检测发出的照明。酶标记物的检测一般通过提供具有底物的酶和检测由酶对底物的作用产生的反应产物，并且通过简单地目测颜色标记检测比色标记。
检测BaAdV多肽
BaAdV感染，如BaAdV-2/4和BaAdV-3感染，可基于特定BaAdV多肽样品的水平检测。特异于BaAdV的抗体可用于检测BaAdV，诊断BaAdV感染，确认早期感染，和确定BaAdV病毒载量。在一些实施方案中，特异性结合BaAdV-2/4的抗体可用于检测BaAdV-2/4、诊断和确定BaAdV-2/4病毒载量。在其他实施方案中，特异性结合BaAdV-3的抗体可用于检测BaAdV-3，诊断和确定BaAdV-3病毒载量。在进一步的实施方案中，这些方法区分BaAdV-3感染，如将BaAdV-3感染与BaAdV-2/4感染和/或BaAdV-1感染进行区分。在进一步的实施方案中，特异性结合BaAdV-2/4的抗体可用于检测BaAdV-2/4、诊断和确定BaAdV-2/4病毒载量。在进一步的实施方案中，这些方法区分BaAdV-2/4感染，如将BaAdV-2/4感染与BaAdV-3感染和/或BaAdV-1感染进行区分。在一些实施方案中，该方法从BaAdV-1区分BaAdV-2/4和/或BaAdV-3。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了方法，其利用特异性结合BaAdV-2/4而不是BaAdV-3或BaAdV-1多肽的抗体，因此可用于BaAdV-2/4的特异性检测。因此，该抗体可用于从BaAdV-3和BaAdV-1感染区分(划出)BaAdV-2/4感染。在其他实施方案中，本发明提供了方法，其利用特异性结合BaAdV-3而不是BaAdV-2/4或BaAdV-1多肽的抗体，因此可用于BaAdV-3的特异性检测。因此，该抗体可用于从BaAdV-1和BaAdV-2/4感染区分(划出)BaAdV-3感染。在进一步的实施方案中，本发明提供的方法提供了利用特异性结合BaAdV-3和BaAdV-2/4多肽的抗体，并且因此可用于特异性检测BaAdV-3和BaAdV-2/4而不是BaAdV-1。因此，该抗体可用于从BaAdV-1感染区分(划出)BaAdV-3/BaAdV-2/4感染。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在其他实施方案中，该抗体被直接标记。在一些非限制性实施例中，抗体特异性结合BaAdV-2/4多肽和/或BaAdV-3多肽，如与SEQIDNO：5-109之一具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
一旦针对BaAdV蛋白质、病毒或核酸的特异性抗体是可用的，可使用一系列公认的免疫结合分析中的任一种检测和/或定量抗原(见例如美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。可以基于抗原决定基检测BaAdV病毒颗粒，该抗原决定基是由在病毒颗粒中的病毒蛋白限定，和/或抗原决定基是由从病毒颗粒分离的病毒蛋白限定。如在本发明的上下文中所用，“抗原”是指BaAdV多肽以及BaAdV病毒颗粒。通常的免疫分析综述也见MethodsinCellBiology：AntibodiesinCellBiology，第37卷(Asai，ed.1993)；BasicandClinicalImmunology(Stites&Terr，编，第7版，1991)。免疫结合分析(或免疫分析)通常使用特异性结合选定的蛋白或抗原的抗体。可以使用如上所述的一系列本领域技术人员已知的手段中的任一种生产抗体。检测样品中BaAdV蛋白、病毒和核酸的免疫分析法可以是竞争性的或非竞争性的，并且可以是定量的或非定量的。
非竞争性免疫分析法是直接检测抗原的分析法，并且在某些情况下直接测量抗原量。酶介导的免疫分析法如免疫荧光测定法(IFA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹法(蛋白质)、捕获测定法，这些可容易地适合于实现非竞争性检测BaAdV蛋白质。
对于BaAdV检测有效的ELISA法例如如下：(1)结合抗体或抗原至底物；(2)使结合受体与含病毒、病毒抗原或病毒抗体的流体或组织样品相接触；(3)使上述物质与结合至可检测部分(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗体相接触；(4)使上述物质与酶的底物相接触；(5)使上述物质与显色剂相接触；(6)观察颜色变化。上述方法可以容易地修改，以在样品中检测抗BaAdV抗体的存在，以及特定BaAdV多肽和病毒的存在。
蛋白质印迹(免疫印迹)分析可以用来检测和量化BaAdV抗原在样品中的存在。该技术一般包括通过凝胶电泳在分子量的基础上分离样品蛋白，将分离的蛋白传送至合适的固体载体上(如硝酸纤维素滤膜、尼龙滤膜或衍生的尼龙过滤器)，和采用特异性结合BaAdV抗原的抗体培育样品。抗BaAdV抗原抗体特异性结合在固体载体上的BaAdV抗原。这些抗体可直接标记或可选地使用特异性结合抗BaAdV抗原抗体的标记抗体(例如标记的绵羊抗小鼠抗体)以便随后检测。
其它分析形式包括脂质体免疫分析(LIA)，该方法使用设计为结合特定分子(例如抗体)并释放包封的药剂或标记物的脂质体。随后按照标准技术检测被释放的化学物质(见Monroe等，Amer.CIM.Prod.Rev.5：34-41(1986))。
可利用捕获分析法检测BaAdV抗原和/或患者的病毒抗体。简要地说，为在患者样品中检测BaAdV抗体、患者免疫球蛋白的抗体，例如抗IgG(或IgM)，结合至固相底物并用于从血清中捕获患者的免疫球蛋白。BaAdV，或BaAdV的反应片段，然后与固相接触，随后加入标记抗体。患者BaAdV特异性抗体的量可随后通过标记抗体结合的量进行定量。在一些实施方案中，提供了方法，其用于检测受试者的狒狒腺病毒(BaAdV)-3或BaAdV-2/4感染。该方法包括以下步骤：(a)使来自怀疑患有由BaAdV-3或BaAdV-2/4引起的感染的受试者的样品与BaAdV-3或BaAdV-2/4多肽相接触，其中所述样品包括来自受试者的抗体；和(b)检测抗体与多肽的结合，从而检测BaAdV-3或BaAdV-2/4感染。
在竞争性分析中，存在于样品中的BaAdV抗原可通过检测可检测信号的下降来间接检测，该可检测信号与已知的、加入的(外源性)BaAdV抗原相关联，该已知的、加入的(外源性)BaAdV抗原自存在于样品中的未知BaAdV抗原的抗BaAdV抗原抗体移位(displaced)(竞争远离)。
竞争性分析法也可适于提供用于间接测量在样品中存在的BaAdV抗原的量。简单地说，来自受试者的血清或其它体液与结合在衬底(例如ELISA96孔板)上的抗体反应。过量血清彻底冲走。标记的(酶联、荧光、放射性等)单克隆抗体然后与先前反应的BaAdV病毒-抗体复合物反应。相对于对照物测量抑制单克隆抗体结合的量。MABs也可通过与抗体-病毒复合物的特异性反应的、用于MABs的IFA来用于样品的直接检测。
半抗原抑制分析是另一种竞争性分析。在该分析中，已知BaAdV抗原可固定在固体底物上。将已知量的抗BaAdV抗体加入到样品中，样品然后与固定的BaAdV抗原接触。结合至已知的固定BaAdV抗原的抗BaAdV抗体的量与存在于样品中的BaAdV抗原的量成反比。可以通过检测抗体的固定部分或留在溶液中的抗体部分检测固的定抗体的量。可以通过标记的抗体直接检测，或通过随后加入标记部分来间接检测，该标记的部分如上所述地特异性结合至抗体上。
在竞争性结合方式(format)中的免疫分析也可用于交叉反应性确定。例如，BaAdV抗原可以固定在固相支持物(support)上。可以在分析中加入蛋白，该蛋白与抗血清和固定抗原的结合相竞争。所加入的蛋白质与抗血清和固定蛋白的结合相竞争的能力是与BaAdV抗原和自身竞争的能力相比较的。使用标准计算法计算上述蛋白质的交叉反应百分比。选择和汇集(pooled)那些与上面列出的每种加入蛋白质具有小于10％交叉反应性的抗血清。交叉反应抗体可选地从汇集的抗血清中通过与加入的所认定的(considered)蛋白(例如远亲同源物)的免疫吸附而除去。
免疫吸附和汇集的抗血清然后可以在竞争性结合免疫分析中如上所述地使用，以比较第二蛋白质与免疫原蛋白，该第二蛋白被认为可能是等位基因或BaAdV抗原的多态变体。为了进行比较，两种蛋白质分别在宽范围的浓度下分析，并且确定抑制50％的抗血清与固定蛋白质结合需要的各蛋白量。如果抑制50％结合所需要的第二蛋白的量比抑制50％结合所需要的BaAdV抗原的量小于10倍，则第二蛋白可以说是特异性结合于针对BaAdV抗原所产生的多克隆抗体。
免疫分析法(包括竞争性和非竞争性)也经常使用标记药剂以特异性结合并标记由抗体和抗原形成的复合物。标记药剂本身可以是包含抗体/抗原复合物的部分之一。因此，标记药剂可以是经标记的BaAdV核酸蛋白或标记的抗BaAdV抗体。可选地，标记药剂可以是第三部分，例如特异性结合抗体/抗原复合物的第二抗体(第二抗体通常特异于第一抗体衍生自的物种的抗体)。能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的其它蛋白，例如蛋白A或蛋白G，也可以用作标记药剂。这些蛋白质表现出与来自各物种的免疫球蛋白恒定区的很强的非免疫原性反应性(例如见Kronval等，J.Immunol.111：1401-1406(1973)；Akerstrom等，J.Immunol.135：2589-2542(1985))。标记药剂可用可检测部分修饰，例如生物素，另一分子可以特异性结合该可检测部分，例如链霉亲和素。多种可检测部分是本领域技术人员已知的，并且可以是通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何材料。这样的可检测标记已在免疫分析领域良好发展，并可包括但不限于：磁珠(例如DYNABEADSTM)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(例如3H、125j35s、14，，e或--12P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及在ELISA法中常用的其他物质)和比色标记，如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)。
根据本领域已知的方法，标记可直接或间接耦合到期望分析的成分上。如上所述，各种各样的标记可与选定的标记使用，这取决于所需的灵敏度、偶联化合物的容易性、稳定性要求、可用的仪器和处理规定。
非放射性标记经常通过间接手段附接。一般地，配体分子(例如生物素)共价结合至分子。然后配体与另一分子(如链霉亲和素分子)结合，该分子可以是固有地可检测的或共价结合至信号系统，如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物。配体和它们的靶可以以与抗体或第二抗体(secondaryantibodies)的任何合适的组合的方式使用，该抗体识别抗BaAdV抗原，该第二抗体识别BaAdV抗原。
所述分子还可以直接偶联至信号产生化合物，例如与酶或荧光团偶联，如上文。作为标记的目标的酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化酶(oxidotases)，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素和2，3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。对于可用的各种标记或信号产生系统的综述，见美国专利号4,391,904。
检测标记的装置是技术人员已知的。因此，例如当标记是放射性标记时，用于检测的装置包括闪烁计数器或放射自显影的照相胶片。当标记是荧光标记时，它可以通过用合适波长的光激发荧光染料并检测产生的荧光来检测。荧光可以视觉检测、通过使用电子检测器如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增管等检测。同样地，酶标记可以通过提供合适的酶底物和检测产生的反应产物来检测。比色或化学发光标记可简单地通过观察与标记相关联的颜色来检测。因此，在各种试纸分析法中，缀合的金经常表现出粉红色，而各种缀合珠显示珠的颜色。
一些分析方式不需要使用标记组分。例如微凝集试验也可用于检测测试样品中BaAdV的存在。简言之，乳胶珠涂有抗体并与测试样品混合，使得与抗体特异性反应的组织或体液中的BaAdV与受体交联，引起凝集。沉淀内的凝集抗体-病毒复合物是用肉眼或通过分光光度计可见的。其它分析包括血清学分析，其中测量IgG和IgM的相对浓度。
本领域技术人员可理解，在免疫分析中最小化非特异性结合是通常希望的。特别是，当分析涉及固定化在固体底物上的抗原或抗体时，最小化与底物的非特异性结合的量是期望的。减少这种非特异性结合的手段是本领域技术人员已知的。通常情况下，这种技术包括用蛋白质组合物涂覆底物。特别地，蛋白质组合物如牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉和明胶是广泛地使用的，其中奶粉是最优选的。
在上述的诊断方法中，样品可以直接从受试者取得或是部分纯化的形式。样品可以是任何感兴趣的样品，包括血液，血清或血浆。特异于特定BaAdV(主反应)的抗体通过结合到病毒上发生反应。此后，可以增加与结合至或标记有可检测部分的抗体的二次反应，以增强主反应的检测。通常，在二次反应中，对于病毒的不同结合点(表位)是特异性的或非特异性的反应性的抗体或其它配体，是根据其与抗体和病毒的复合物(complex)上的多个点反应的能力选择出来的。因此，例如，在二次反应中抗体的几种分子可以与由主反应形成的各复合物反应，使主反应更可检测。
BaAdV调节剂的分析
BaAdV，如BaAdV-2/4或BaAdV-3的调节，可以使用多种体外和体内分析法进行评估，包括基于细胞的模型。此类分析可用于测试BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的抑制剂和活化剂。使用选择的重组或天然存在的选定的蛋白质测试BaAdV-2/4和/或BaAdV-3调节剂。调节可包括但不限于感染、复制、受体结合、细胞进入、颗粒形成等调节。
测量对BaAdV-2/4和/或BaAdV-3多肽、或表达BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的细胞的调节，无论是重组的或天然存在的，都可以使用多种分析法来进行，如体外的、体内的和离体的，如本发明所述。影响活性的(例如酶活性)、细胞表面标志物表达、病毒复制和增殖的合适的物理、化学或表型变化可用于评估测试化合物对本发明多肽的影响。当使用完整细胞或动物确定功能效应时，还可以测量各种影响。
确定具有BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的调节活性的化合物的分析可以在体外进行。此分析可以使用全长的BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽或其变体，或其突变体，或其片段。纯化的重组或天然存在的蛋白质可在本发明的体外方法中使用。重组或天然存在的蛋白质可以是细胞裂解物或细胞膜的部分。如下所述，结合分析可以是固态或可溶的。优选蛋白或膜共价地或非共价地结合于固体支持物。通常情况下，本发明的体外分析法是底物或配体的结合或亲和力分析，是非竞争性地或竞争性地。其它体外分析法包括测量蛋白质在光谱(例如荧光、吸收、折射率)、流体动力学(例如形状)、色谱或溶解度性质方面的变化。
高通量结合分析可如下进行：蛋白质或其片段与潜在的调节剂接触，并培养合适的时间。在一个实施方案中，所述潜在的调节剂结合于固体支持物，并加入蛋白质。在另一个实施方案中，所述蛋白结合于固体支持物。各种各样的调节剂都可以使用，如下所述，包括小有机分子、肽、抗体等。多种分析法可用于确定BaAdV-2/4和/或BaAdV-3调节剂的结合，包括标记蛋白质-蛋白质结合分析、电泳迁移率变化、免疫分析、酶测定等。在一些情况下，候选调节剂的结合是通过使用竞争性结合分析法确定的，其中在潜在调节剂的存在下测量对已知配体或底物的结合的干扰。任一调节剂、已知配体或底物首先被结合，然后加入竞争者(competitor)。在洗涤蛋白后，确定对潜在调节剂或已知配体或底物的结合的干扰。通常情况下，无论是潜在的调节剂或已知配体或底物，都是被标记的。
基于细胞的分析可用在BaAdV-2/4或BaAdV-3在细胞中表达的情况下，并检测功能性、物理、化学和表型的改变，以确定病毒的调节剂。如本发明所述，除了病毒抑制分析是本领域已知的外，还可以测量本发明所述的任何合适的功能效果。BaAdV-2/4或BaAdV-3可以是天然存在的或重组的。另外，BaAdV-2/4或BaAdV-3片段或嵌合蛋白可以在基于细胞的分析中使用。另外，催化点所需要的必要残基中的点突变可以在这些分析中使用。
在一个实施方案中，高通量筛选方法包括提供一种组合的小有机分子或肽库，其含有大量的潜在治疗化合物(潜在的调节剂或配体化合物)。此类“组合化学库”或“配体库”然后经如本发明所述的一种或多种分析筛选，以确定显示期望的特征活性的那些库成员(特定的化学物种(species)或亚类)。由此确定的化合物可以作为常规的“先导化合物”或者其本身可以用作潜在的或实际的治疗剂。
组合化学库是不同化合物的集合，这些化合物通过化学合成或生物合成，组合许多化学“构建模块”(如试剂)而产生。例如，线性组合化学库如多肽库是通过以各种可能的方式将一组化学构建模块(氨基酸)组合成给定的化合物长度(即多肽化合物中氨基酸的数量)。数以百万计的化学化合物可以通过化学构建块的这种组合混合来合成。该分析还可以用于筛选分子药剂库，如抗体或抑制性RNA，或筛选小分子库。
组合化学库的制备和筛选是本领域技术人员已知的。这种组合化学库(library)包括但不限于：肽库(library)(例如见美国专利号5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)和Houghtonetal.，Nature354：84-88(1991))。也可使用其它化学物质(chemistries)产生化学多样性库。这些化学物质包括但不限于：类肽(例如PCT公开号WO91/19735)，编码的肽(例如PCT公开号WO93/20242)，随机生物寡聚体(例如PCT公开号WO92/00091)，苯并二氮(例如U.S.专利号5,288,514)，多样体(diversomers)例如乙内酰脲、苯二氮卓和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA90：6909-6913(1993))，插烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))，具有葡萄糖支架的非肽的(nonpeptidal)肽模拟物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))，小化合物库的类似有机合成物(Chen等，IAmer.Chem.Soc.116：2661(1994))，寡聚氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho等，Science261：1303(1993))，和/或肽基膦酸酯(Campbell等，IOrg.Chem.59：658(1994))，核酸库(见Ausubel，Berger和Sambrook，allsupra)，肽核酸库(library)(例如见美国专利5,539,083)，抗体库(例如见Vaughn等，NatureBiotechnology，14(3)：309-314(1996))，碳水化合物库(例如见Liang等，Science，274：1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)，小有机分子库(例如见苯二氮卓，BaumC&EN，Jan18，page33(1993)；类异戊二烯，美国专利5,569,588；噻唑烷酮和间噻嗪酮(metathiazanones)，美国专利5,549,974；吡咯烷，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉化合物，美国专利5,506,337；苯二氮卓类，5,288,514等)。
用于组合库的制备的设备是市售的(例如见357MPS，390MPS，AdvancedChemTech，LouisvilleKY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433AAppliedBiosystems，FosterCity，CA，9050Plus，Millipore，Bedford，MA)。
此外，许多组合库(library)本身是市售的(例如见ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3DPharmaceuticals，Exton，PA，MartekBiosciences，Columbia，MD，etc.)。
使用BaAdV-2/4或BaAdV-3，或表达BaAdV-2/4或BaAdV-3蛋白的细胞或组织的固态或可溶高通量分析是可用的。以高通量形式使用的固相基体外分析是可用的，其中BaAdV-2/4和/或BaAdV-3附接至固相上。任一本发明所述的分析法都可适于高通量筛选。
在高通量分析中，无论可溶的或固态的，在一天内可以筛选多达数千种的不同调节剂或配体。这种方法可用于体外的BaAdV-2/4或BaAdV-3，或者用于包括BaAdV的细胞基或膜基分析中。特别是，微量滴定板的各孔可用于运行针对选定潜在调节剂的分别(separate)分析，或者如果观察到了浓度或培养时间效应，每5-10孔可以用于测试单一的调节剂。因此，单一标准微量滴定板可测定约100个(例如96个)调节剂。如果使用1536孔板，则单个板可以很容易地分析约100-约1500种不同的化合物。使用本发明的集成系统，有可能一天分析许多板；分析筛选多至约6000、20000、50000或超过100000种不同的化合物也是有可能的。
对于固态反应，目标的蛋白质或其片段，例如细胞外结构域或包含目标的蛋白或其作为融合蛋白的部分的片段的细胞或膜，可直接地或间接地，通过共价或非共价键，结合到固态成分上。用于共价或非共价结合的标签(tag)可以是各种成分中的任一种。在一般情况下，结合标签的分子(标签粘合剂)固定于固体支持物上，并且标记的分子通过标签和标签粘合剂的相互作用附接到固体支持物上。
基于文献中所很好描述的已知的分子相互作用，可以使用许多标签和标签粘合剂。例如，当一个标签具有天然粘合剂，例如生物素、蛋白A或蛋白G时，它可以与适当的标签结合剂(亲和素、链霉亲和素、中性抗生物素蛋白、免疫球蛋白的Fc区等)一起使用。具有天然粘合剂如生物素的分子的抗体也是广泛使用的，且是合适的标签粘合剂(见SIGMAImmunochemicals1998catalogueSIGMA，St.LouisMO)。
类似地，任何半抗原或抗原化合物可以与适当的抗体组合使用，以形成标签/标签粘合剂对。数以千计的特异性抗体是市售的，并且许多附加的抗体在文献中有所描述。例如，在一种常见的构造中，标签是第一抗体，并且标签粘合剂是能识别第一抗体的第二抗体。除了抗体-抗原相互作用，受体-配体相互作用也适合作为标签和标签粘合剂对。例如，细胞膜上的受体的激动剂和拮抗剂(例如细胞受体-配体相互作用，如转铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘着蛋白家族、整联蛋白家族，选择素家族等(例如见Pigott&Power，TheAdhesionMoleculeFactsBookI(1993))。类似地，毒素和毒液、病毒表位、激素(例如鸦片制剂、类固醇等)、细胞内受体(例如介导各种小配体影响的受体，包括类固醇、甲状腺激素、类视色素和维生素D；肽)、药物、凝集素、糖、核酸(线性和环状聚合物构型)、寡糖、蛋白质、磷脂和抗体，这些都可以与各种细胞受体相互作用。
合成聚合物，如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚亚芳基硫醚、聚硅氧烷、聚酰亚胺和聚乙酸酯也可形成适当的标签或标签粘合剂。许多其他标签/标签粘合剂对在在本发明的分析系统中也是有用的，根据本发明公开的内容这对于本领域技术人员是清楚的。
常见的连接子，例如肽、聚醚等也可以作为标签，并包括多肽序列，如约5-200个氨基酸的聚甘氨酸序列。这种柔性连接子是本领域技术人员已知的。例如，聚乙二醇连接子可从ShearwaterPolymers，Inc.Huntsville，Alabama获得。这些连接子任选地具有酰胺键(linkages)、巯基键或杂官能键(heterofunctionallinkages)。
标签粘合剂通过使用任何各种现有方法而固定到固体底物上。固体底物通常是通过暴露所有或部分底物至固定化学基团至表面的化学药剂而实现衍生化或功能化，该表面与标签粘合剂的部分是反应性的。例如，适于附接至长链部分的基团包括胺、羟基、巯基和羧基。氨基烷基硅烷和羟基烷基硅烷可用于功能化各种表面，如玻璃表面。这样的固相生物聚合物阵列的构造在文献中是有良好描述的(例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963)(描述了例如肽的固相合成)；Geysen等.，J.Immun.Meth.102：259-274(1987)(描述了在引脚(pins)上的固相成分合成)；Frank&Doring，Tetrahedron44：60316040(1988)(描述了在纤维素盘上合成各种肽序列)；Fodor等，Science，251：767-777(1991)；Sheldon等，ClinicalChemistry39(4)：718-719(1993)；和Kozal等.，NatureMedicine2(7)：753759(1996)(都描述了固定至固体底物的生物聚合物的阵列))。固定标签粘合剂到底物的非化学方法包括其它常用的方法，如热的、通过UV辐射交联等。
进行测试的作为BaAdV-2/4或BaAdV-3调节剂的化合物可以是任何小有机分子，或生物实体，例如蛋白质、例如抗体或肽、糖、核酸，例如反义寡核苷酸或核酶或siRNA，或脂质。
可选地，调节剂可以是BaAdV的基因改变形式。通常测试化合物是小有机分子、肽、圆形肽、siRNA、反义分子、核酶和脂质。
尽管最经常使用的化合物可以溶解在水或有机(特别是DMSO基的)溶液中，但基本上任何化学化合物都可以用作本发明分析的潜在调节剂或配体。分析设计为通过自动化的分析步骤和对分析提供来自任何方便来源的化合物，而筛选大规模的化学库，这这一般是平行进行的(例如以机器人分析测定中的微量滴定板上的微量滴定的形式)。应当理解，存在许多化学化合物的供应商，包括Sigma(St.Louis，MO)，Aldrich(St.Louis，MO)，Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，FlukaChemika-BiochemicaAnalytika(BuchsSwitzerland)等。
治疗/预防BaAdV和药物组合物
本发明的实施方案进一步涉及治疗、预防，并研究了使用各种技术来阻断或调节BaAdV-2/4和/或BaAdV-3病毒蛋白的表达或病毒的传播。本发明还提供了诱导对BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的免疫应答的方法。可用于治疗或预防BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的调节剂可以包括但不限于：基因修饰形式的BaAdV-2/4和/或BaAdV-3，例如具有改变活性的版本，热处死和减毒的病毒，以及天然存在的和合成的配体、底物、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环肽、适体、核酸、反义分子、核酶、siRNA分子、miRNA分子和小化学分子，如现有技术已知的。
本发明提供了治疗或预防受试者的狒狒腺病毒(BaAdV)-2/4或BaAdV-3感染的方法。这些方法包括给受试者施用治疗有效剂量的一种或多种由本发明公开的分析法确定的药剂、本发明公开的核酸分子、本发明公开的多肽或其免疫原性片段、本发明公开的复制缺陷型腺病毒、或本发明公开的抗体。
本发明还公开了诱导对狒狒腺病毒(BaAdV)-2/4或BaAdV-3的免疫应答的方法。这些方法包括给受试者施用治疗有效剂量的一种或多种由本发明公开的分析法确定的药剂、本发明公开的核酸分子、本发明公开的多肽或其免疫原性片段、本发明公开的复制缺陷型腺病毒、或本发明公开的抗体。受试者可以是任何感兴趣的受试者，包括人类或非人灵长类动物。
在一些实施方案中，向受试者施用适体。适体是siRNA或反义分子，包含约15-约60个核苷酸长度的双链区域，并在长度上与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的对应片段具有至少90％的同一性。
本发明进一步公开了用于治疗或预防目的BaAdV-2/4和BaAdV-3疫苗。在某些方面，BaAdV-2/4和/或BaAdV-3病毒、蛋白质或肽及其免疫原性片段，和/或多核苷酸，以及抗BaAdV-2/4和抗BaAdV-3的抗体和/或T细胞，可掺入药物组合物或免疫原性组合物中。全病毒疫苗(活的和减毒的，或复制缺陷的，或杀死的)或亚单位疫苗，例如结构或非结构BaAdV-2/4和/或BaAdV-3蛋白或其免疫原性片段，通过分别在受试者中引发免疫应答，而可用于治疗或预防BaAdV-2/4和/或BaAdV-3感染。可选地，药物组合物可包含转染了BaAdV-2/4或BaAdV-3多核苷酸的抗原呈递细胞(例如树突细胞)，使得抗原呈递细胞分别表达BaAdV-2/4或BaAdV-3肽。
编码BaAdV-2/4和/或BaAdV-3的基因组、结构蛋白或非结构蛋白或其片段的核酸疫苗也可以分别用于引发免疫应答以治疗或预防BaAdV-2/4和/或BaAdV-3感染。许多基因传送技术是本领域已知的，如在Rolland(1998)Crit.Rev.Therap.DrugCarrierSystems15：143-198及其引用的文献中所述的。合适的核酸表达系统包含在患者体内表达所必需的DNA序列(例如合适的启动子和终止信号)。在优选的实施方案中，该DNA可利用病毒表达系统(例如牛痘、痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入，该病毒表达系统可包括使用非致病性(缺陷)的、有复制能力的病毒。合适的系统公开在例如Fisher-Hoch等.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：317-321；Flexner等.(1989)Ann.N.Y.Acad.Sci.569：86-103；Flexner等.(1990)Vaccine8：17-21；美国专利号4,603,112，4,769,330，4,777,127和5,017,487；PCT公开号WO89/01973；英国公开号2,200,651；欧洲公开号0,345,242；PCT公开号WO9I/02805；Berkner(1988)Biotechniques6：616-627；Rosenfeld等.(1991)Science252：431-434；Kolls等.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：215-219；Kass-Eisler等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：11498-11502；Guzman等.(1993)Circulation88：2838-2848；和Guzman等.(1993)Cir.Res.73：1202-1207中。将DNA引入这类表达系统中的技术是本领域技术人员已知的。如本发明所述，DNA也可以是“裸”的，例如在Ulmer等.(1993)Science259：1745-1749和Cohen的综述(1993)Science259：1691-1692中公开的。裸DNA摄入的提高可通过将DNA涂覆在可生物降解的小珠上，其可有效地运输到细胞中。明显的是，疫苗可以包括多核苷酸和多肽两种成分。这样的疫苗可提供增强的免疫应答。
疫苗的制备通常描述在例如Powell和Newman，编，VaccineDesign(thesubunitandadiuvantapproach)，PlenumPress(NY，1995)中。疫苗可设计为产生抗体免疫和/或细胞免疫，如由CTL或CD4+T细胞培养的那些。
非特异性免疫应答增强剂可以是增强对外源抗原的免疫应答的任何物质。非特异性免疫应答增强剂的例子包括佐剂、可生物降解的微球体(例如聚乳酸galactide)和脂质体(化合物结合入其中，例如见美国专利号4,235,877)。大多数佐剂含有设计用来保护抗原免于快速分解代谢的物质(如氢氧化铝或矿物油)，以及免疫应答的刺激剂(如脂质A，百日咳杆菌(Bortadellapertussis)或结核分枝杆菌衍生的蛋白质)。合适的佐剂是可商购的，例如Freund不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories，Detroit，MI)；Merck佐剂65(MerckandCompany，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKlineBeecham)；铝盐，例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子性或阴离子性的衍生多糖；聚磷腈；可生物降解微球；单磷酰脂质A和quilA。细胞因子，如GM-CSF或白介素-2、-7或-12也可以用作佐剂。这些用于诱导免疫应答。
药物组合物和疫苗也可含有其它化合物，其可具有生物活性或无活性。例如，结合入融合多肽或作为单独的化合物的其它抗原的一个或多个免疫原性部分可以存在于组合物或疫苗中。多肽可以但不必须是缀合至如所述的其它大分子上，例如美国专利号4,372,945和4,474,757所述的其它大分子。药物组合物和疫苗一般可用于预防和治疗目的。
适于口服施用的制剂可由以下物质构成：(a)液体溶液，如悬浮在稀释剂中的治疗有效量的包装核酸，所述稀释剂如为水、盐水或PEG400；(b)胶囊、药囊(sachets)或片剂，其各自含有预定量的活性成分，如液体、固体、颗粒或明胶；(c)在合适液体中的悬浮液；和(d)合适的乳液。片剂形式可包括一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、填料、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学上相容的载体。锭剂形式可以包括调味剂中的活性成分，例如蔗糖、以及软锭剂，软锭剂包括惰性基质中的活性成分，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳液、凝胶，以及类似物，其含有除活性成分外的本领域已知的载体。
气雾剂制剂(即它们可以被“雾化”)经由吸入施用。气雾剂制剂可以加入可接受的加压推进剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
适合于肠胃外施用的制剂，例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径施用的制剂，包括水性的和非水性的等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及水性的和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。组合物可以通过例如静脉内输注、吸入、肠胃外、口服、局部、皮内、腹膜内、静脉内、膀胱内、直肠内或鞘内施用。制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶中。药学上可接受的载体部分地通过施用的特定组合物(例如核酸、蛋白质、调节化合物或转导的细胞)，以及通过用于施用组合物的具体方法来确定。因此，存在各种各样的本发明药物组合物的合适制剂(例如见Remington′sPharmaceuticalSciences，第17版，1989)。
这样的组合物也可以包含缓冲液(例如中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸(例如甘氨酸)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽、佐剂(例如氢氧化铝)、使制剂与接受者的血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。可选地。本发明的组合物可以配制成冻干物。也可以使用已知的技术在脂质体内包封化合物。
注射溶液和悬浮液可以从无菌粉末、颗粒和如前所述种类的片剂来制备。由核酸转导的用于离体治疗的细胞还可以通过静脉内或肠胃外施用。
施用给受试者的剂量应足以影响受试者体内的有益治疗反应一段时间，和/或诱导免疫应答。根据所使用的特定药剂的效果和受试者的状况，以及待治疗的受试者的体重或表面积，来确定剂量。还可以通过在特定受试者中的伴随特定载体或转导的细胞类型的施用的任何不良副作用的存在、性质和程度，来确定剂量的大小。在一些实施方案中，药剂是口服、局部、关节内、静脉内、肌内、皮内、腹膜内或皮下施用的药剂。
对于施用而言，根据病人的质量(mass)和总体健康状况，本发明的化合物和转导的细胞可以以确定的速率施用，该速率根据抑制剂、载体或转导的细胞类型的的LD-50，以及处于各种浓度的抑制剂、载体或细胞类型的副作用来确定。施用可以通过单次或分次剂量来完成。
药物和疫苗组合物可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿或小瓶中。这种容器最好密封以直至使用时保持制剂无菌。在一般情况下，制剂可以作为在油性或水性媒介(vehicles)中的悬浮液、溶液或乳液存储。可选地，疫苗或药物组合物可储存在冷冻干燥条件下，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体。
额外的诊断和治疗方法
本发明还提供了用于确定受试者和管理受试者的治疗的方法，例如那些BaAdV-2/4或BaAdV-3感染的风险增加的受试者。在一些实施方案中，方法包括使用本发明公开的BaAdV-2/4或BaAdV-3核酸、多肽或抗体以检测受试者的BaAdV-2/4或BaAdV-3感染。受试者可以是处于增加的感染风险中，如在灵长类动物群体中的工人，例如圈养狒狒的人。受试者也可以是接触灵长类动物群体中的工人的人，例如但不限于家庭成员。在一些实施方案中，受试者可以是无症状的。
提供的识别BaAdV-2/4或BaAdV-3的方法可用于帮助临床医师选择对感染受试者的疗法。这些疗法包括但不限于：治疗有效量的抗病毒剂和/或BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽、多核苷酸和/或抗体，该治疗有效量足以诱导对BaAdV-2/4或BaAdV-3的免疫应答。
在一些实施方案中，所公开的识别BaAdV-2/4或BaAdV-3的方法可用于识别处于症状性感染的增长性风险的受试者。如果对象被确定为具有BaAdV-2/4或BaAdV-3感染(例如通过检测BaAdV-2/4或BaAdV-3核酸、多肽或抗体)，但不是症状性的，则治疗对象。
在几个实施方案中，所公开的识别BaAdV-2/4或BaAdV-3的方法可用于帮助临床医生选择和/或监控受试者的治疗。在另外的实施方案中，接受治疗的受试者(例如BaAdV-2/4或BaAdV-3感染的受试者)可针对BaAdV-2/4和/或BaAdV-3多核苷酸、多肽和/或抗体在来自受试者的生物样品中的存在而被监控。在一些实施方案中，受试者被初步确定为具有BaAdV-2/4或BaAdV-3感染(例如在来自受试者的生物样品中检测BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽、多核苷酸或抗体，如本发明所述)。向受试者施用目标的治疗剂。在一些实施例中，如果在治疗剂施用后，BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽、多核苷酸或抗体的水平与对照相比是下降的，那么治疗是有效的。在其它实施例中，如果在治疗剂施用后，BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽、多核苷酸或抗体的水平与对照物相比是增加的或没有变化的，则该治疗是无效的。在一些实施例中，如果在受试者身上BaAdV-2/4或BaAdV-3的感染表现出更严重的症状，则治疗可以停止，或者治疗剂的剂量可以增加。
对照可以是标准值。对照可以是在对照样品中的BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽、多核苷酸或抗体的水平，该对照样品例如但不限于，在先前的时间点来自受试者的样品，如开始治疗前，或者可以是在来自已知感染的受试者的样品中，BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽、多核苷酸或抗体的水平。
本发明还提供了用于确定BaAdV-2/4或BaAdV-3感染的预后的方法。在一些实施例中，如果BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽、多核苷酸或抗体的水平，与对照相比是下降的，则受试者将不会罹患BaAdV-2/4或BaAdV-3的活性感染。在其它实施例中，如果BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽、多核苷酸或抗体的水平，与对照相比是增加的(或不变化)，则受试者将会罹患BaAdV-2/4或BaAdV-3的活性感染。对照可以是标准值。对照可以是在对照样品中的BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽、多核苷酸或抗体的水平，该对照样品例如但不限于：来自感染前受试者的样品，或者可以是在已知未感染的受试者的样品中，BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽、多核苷酸或抗体的水平。
在一些实施方案中，可以每天、每周、每两周、每月、每两个月、每季或每年监测受试者。
试剂盒(kits)
本发明进一步提供了诊断药剂和试剂盒，该试剂盒包含一种或多种在各种诊断分析中使用的药剂，这些诊断分析包括例如：免疫分析，如ELISA型和“三明治”型免疫分析，以及核酸分析，如PCR分析。在相关的实施方案中，在流动通过(flow-through)或条带测试方式下分析，其中结合剂固定在膜上，如硝酸纤维素。
在一些实施方案中，试剂盒包括容器以及使用该试剂盒的说明书，该容器包括如本发明公开的核酸分子，由核酸编码的多肽或其免疫原性片段，包括核酸的载体，包括载体宿主细胞，包括核酸的腺病毒，或特异性结合多肽的抗体，在高度严格的条件下杂交至如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所述的核苷酸序列的引物。
在另外的实施方案中，试剂盒可以包括如本发明所述的多肽，以及检测抗体存在的说明书，该抗体特异性结合来自受试者的样品中的狒狒腺病毒(BaAdV)-3或BaAdV-4。在进一步的实施方案中，试剂盒包括如本发明公开的抗体，和在来自受试者的样品中检测狒狒腺病毒(BaAdV)-3或BaAdV-4多肽存在的说明。
该试剂盒可以包括一种或多种特异于BaAdV-3或BaAdV-2/4核酸序列的探针或引物。该试剂盒可以包括一种或多种抗体，如特异性结合BaAdV-3或BaAdV-2/4多肽的单克隆抗体或多克隆抗体。该试剂盒还可以包括一种或多种BaAdV-2/4或BaAdV-3多肽。
在几个实施方案中，这样的试剂盒可包括至少本发明的第一肽、第一抗体或抗原结合片段，其功能性片段或其混合物(cocktail)，或第一核酸分子，以及生成信号的装置。在试剂盒被使用时，试剂盒的组分可以被预先附接至固体支持物，或者可以应用到固体支持物的表面上。在使用前，该信号产生装置可以与本发明的抗体或核酸预关联，或者可要求与一种或多种组分相组合，例如缓冲剂、核酸、抗体-酶缀合物、酶底物等。
试剂盒还可以包括另外的药剂，例如用于降低非特异性结合至固相表面的封闭药剂、洗涤药剂、酶底物、酶等。固相表面可以是微量滴定板、微球或适合于固定核酸、蛋白质、肽或多肽的其它材料的形式。催化化学发光或显色产物形成，或催化化学发光或显色底物还原的酶是信号发生装置的一个这样的组分。这类酶是现有技术已知的。其中，放射性标记、发色、荧光生成或其它类型的可检测标记或检测装置包括在试剂盒中，标记药剂可以或者在同一容器中作为诊断或治疗组合物本身提供，或者可选地放置在第二不同容器装置中，其中该第二组合物可以被放置并适当地等分。可选地，检测药剂和标记物可以在单个容器装置中制备，并在大多数情况下，该试剂盒通常还包括紧密约束地包含小瓶的装置，以用于商业销售和/或方便包装和输送。
该试剂盒可以包括一个或多个容器，用于存储所公开的抗体、核酸或多肽，以及在容器上或与容器关联的标记或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由各种材料如玻璃或塑料制成。该容器装有组合物，它可有效地诊断和/或治疗。在一些实施方案中，容器可具有无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋，或具有经皮下注射针头可刺穿的塞子的小瓶)。所述标记或包装说明书指明用于治疗特定病症或用于检测/诊断的内容。
在一些实施方案中，试剂盒包括教学材料，如包装说明书，其公开了使用BaAdV-3或BaAdV-2/4多肽、核酸或抗体的手段。说明材料可以是以电子形式(如计算机磁盘或光盘)写入的或可以是视觉资料(如视频文件)。试剂盒还可以包括附加的部件，以便于试剂盒用于设定的特定应用中。因此，例如试剂盒可另外含有检测标记的装置(如用于酶标记的酶底物、检测荧光标记的滤波器装置(filtersets)、适当的第二标记如第二抗体等)。试剂盒可另外包括缓冲剂和通常用于特定方法的实施的其他药剂。
通过以下的非限制性实施例说明本发明公开的内容。
实施例
腺病毒(AdV)是DNA病毒，其感染并在包括人类和非人灵长类动物的脊椎动物宿主中导致广泛的临床疾病。在下文中，确定了一个新的腺病毒种类，暂时命名为“物种H”，在灵长类动物研究机构中导致了圈养狒狒(4/9)的急性呼吸道疾病的爆发，病死率50％。在爆发期间，从狒狒，包括两只死于肺炎的狒狒中分离的AdVs(BaAdVs)，通过使用对HAdV物种A-F和SAdV-A有反应性的血清的中和分析是无法确定种类的(untypeable)。在通过整个基因组测序表征的4个BaAdVs中，一个(BaAdV1)是最近描述的猴SAdV-B物种的成员，而剩余的3个AdVs-BaAdV2、BaAdV3和BaAdV4(基因上相同于BaAdV2)是物种H的成员。BaAdV3，其是与BaAdV2，4紧密相关的物种HAdV，是来自临床病狒狒的4个分离物中唯一的AdV，并且因此被认为是肺炎爆发的原因。虽然BaAdV3与BaAdV2，4在整体上共享＞90％的基因组序列同一性，在短纤维蛋白中的显著差异(约58％的氨基酸同一性)和靴扫描分析表明，BaAdV3是不明来源的稀有物种H重组体。为了支持这一可能性，在目前健康狒狒和在灵长类研究所的职员中，检测对BaAdV1和BaAdV2，4，但不对BaAdV3的特异性中和抗体。这些结果表明新的物种HAdV存在于狒狒群体的致命肺炎爆发中，并进一步在人类与非人灵长类动物之间建立了AdVs的跨物种传播可能性。
实施例1
材料和方法
动物：所有研究均按照既定教导进行。没有使用动物研究协议，因为只分析了过量(excess)的临床样品。
生物安全：在本研究中描述的后尸检组织分析和新狒狒腺病毒培养是在生物安全(Biosafety)等级2(BSL-2)或BSL-3条件下进行的。
爆发管理和研究：原爆发持续了约3个星期。受影响的狒狒在呼吸道症状发展后立即被隔离。2例致命性病例死亡，或在出现临床症状后的5天和13天人道地安乐死。由兽医人员和管理人员对每日报告的临床和流行病学参数进行跟踪和记录。
为应对爆发，所有培育房间都经多聚甲醛气体消毒。笼子、墙壁、地板和所有外露的工作区表面都经2.6％的戊二醛缓冲液(METRICIDETM)或漂白剂清洗。在至少2周的时间内，在喂养时或与婴儿狒狒接触时，任何时候都戴着一次性防护服和手套。进行血液学测试和培养细菌、支原体和真菌。样品还用于测试RSV、流感、副流感、人腺病毒和包括CMV的疱疹病毒。此外，呼吸样品也送到外部实验室中并测试百日咳杆菌、衣原体属、枝原体属、脲原体属、军团菌属、汉坦病毒。经使用对HAdV物种A-F和SAdV-A病毒有反应性的血清的病毒中和测试来确定AdV的类型。
病理：尸检组织的大体(Gross)和病理组织学分析是由委员会认证的兽医病理学家进行。尸检组织固定在10％福尔马林中并包埋于石蜡中。使用显微镜用薄片切片机切出5μm的片，并用苏木精和伊红(H&E)染色，并在光学显微镜下观察。
核酸提取：使用市售的试剂盒(Oiagen，Valencia，CA)，从培养的AdV上清液中提取总核酸。使200μL的样品通过0.4μm的过滤器以除去细菌和细胞碎片，然后用RNA酶(RNase)(Invitrogen，Carlsbad，CA)处理。
病毒培养：使用初级鼻拭子样本进行猴细胞(PMK，或主猴肾；CyMK，或食蟹猴肾；和Vero，非洲绿猴肾)的所有接种。在猴细胞的单个传代后使用P1病毒进行人类细胞和细胞系的接种。细胞或细胞系在由Hank介质(对于A549细胞)或Dulbecco改性Eagle培养基(DMEM)(对于其它细胞)构成的培养基中生长，该培养基用1X非必需氨基酸(Invitrogen，Carlsbad，CA)、10％胎牛血清、100U青霉素/mL和100μg链霉素/mL补充。在实现80-90％汇合(confluency)后，将细胞培养基改变为维持培养基具有2％FBS，并使用200μL的临床样品或100μL的传代(passaged)病毒上清液接种。在接种前，鼻腔样品离心澄清10分钟×4000g；在5体积的缓冲液中使用组织匀浆均匀化肺组织。在传代之前，细胞培养上清液经3次冻融循环并如上所述地进行澄清。针对细胞病变效应(CPE)，在光学显微镜下通过目视检查监测病毒复制2周。病毒上清液通过终点稀释分析法定量。
深测序库(Library)制备：使用TruSeq协议的变体(Illumina，SanDiego，CA)，制备用于全基因组AdV测序的深度测序库(Chen等，2011，PLoSPathog7：e1002155)。简要地说，如前所述，使用循环(Round)A/B程序将核酸提取物随机扩增成cDNA(Chen等，2011，J.Vis.Exp.；Greninger等，2010，PLoSOne5：e13381)，然后用限制性酶Bpml在37℃下消化2小时(NewEngladnBiolabs，Ipswich，MA)，随后经末端修复并分别用Klenow和Taq聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)作A-尾部处理。然后使用珠选择大小200-300bp的片段，随后使用DNA连接酶附接含有6-核苷酸条形码标签的适体。使用生物分析仪DNA12000芯片(Agilent)和SYBRqPCR系统(KAPABiosystems)定量最终库，汇集在单一的通道(lane)内，并在IlluminaHiSeq2000设备上测序(100-bp配对末端测序)。
从头的病毒基因组组装：原始深度测序读取结果最初通过除去适体、引物以及低复杂度/低质量的序列进行修整。使用PRICE组装器从头组装部分腺病毒基因组(Grard等，2012，PloSPathogens8：el002924)。通过深度测序读取结果的BLASTn或BLASTx比对填充空位，以在中引用猿猴和人类的AdVs(Altschul等.，1990，JMolBiol215：403-410)，随后使用软件手工装配(Drummond等.，2010，Geneiousv5.6.3.可在互联网上从geneious.com获得，如2012年11月的下载)。很少或没有序列覆盖的区域通过PCR和Sanger测序证实。在对应于4个AdV分离物BaAdV1，2，3，4的全病毒基因组的组装之后，然后将修整的深度测序读取结果使用软件映射(mapped)到AdV基因组上，该软件使用以下参数(允许的无缺口，为5％的每个读取结果的允许的最大不匹配，并且最大模糊度是1)。
结构特点及系统发育分析：使用在中的物种F和GAdVs的完全注释基因组序列作为参考，在BaAdV1，2，3，4基因组中确定预测的编码区域。首先，将各BaAdV基因组对准至在中的最相似的参照基因组，随后使用确定所有开放阅读框架(ORF)。选出与注释参考基因组中的相应ORF最佳匹配的候选ORF。GT-AG内含子的启动停止信号用来精确定位正确的ORF，用于剪接基因。为了确认预测的编码区的准确性，将每个所识别的ORF然后与由GenBank的所有腺病毒蛋白质构成的参考数据库利用BLASTx进行比对。全基因组核苷酸成对(pairwise)同一性图(窗口大小为100)和氨基酸成对同一性的计算是在Geneious中进行的。使用1000bp窗口大小和50bp的步长，通过(Lole等，1999，JVirol73：152-160)产生相似性和靴扫描图(plots)。
为构造对应于所述六邻体、五邻体碱基(base)的氨基酸系统发育树，首先从下载DNA聚合酶、短/长纤维蛋白、对应于在物种组A-G、SAdV-A和SAdV-B中的代表性人类和猴AdVs的翻译蛋白质序列，以及非灵长类AdVs。然后使用MAFFT的FFT-NS-I×l000算法，在默认参数下执行多序列比对(Katoh等，2002，NucleicAcidsRes30：3059-3066)。使用Jukes-Cantor邻接法和100,000个引导程序(bootstrap)复制体，并使用鼠腺病毒A(MADV-A)作为外群，在Geneious中构建系统发育树，。
狒狒腺病毒中和试验(人类和狒狒血清)：BaAdV1、BaAdV2和BaAdV3的病毒原液经VeroE6细胞的传代产生，并等分，和通过终点稀释定量。为了执行病毒中和分析，100μL的病毒上清液或对照血清被混合至正确的稀释度，并在37℃下培育1小时。在培育后，将混合物接种到每孔包含4000个VeroE6细胞的孔中，并在37℃、5％CO2下培育。每隔一天观察在板孔中的细胞的CPE证据。对于在1∶10的筛选稀释下表现出抑制病毒CPE的孔，相应的血清样品以六个2倍的步骤稀释，然后重新测试。当表现出＜3+CPE的孔单层复制时，取最高稀释度的倒数作为中和抗体效价。
人类腺病毒型A-F交叉中和分析(兔血清分型)：集合地包含对人AdV血清型1-41(物种A-F)的抗体的CaliforniaDPH的兔超免疫参考血清的7种库(pools)，是可用于测试的。对各库而言，100μL的兔血清和100μL的TCID50为103/mL的病毒上清液相混合至1∶10的筛选稀释，并用于接种VeroE6细胞。隔日观察在板孔中的细胞2周以寻找CPE证据。对于在1∶10的筛选稀释下表现出抑制病毒CPE的孔，相应的血清样品在六个2倍的步骤中稀释，然后重新测试。与HAdV-40和HAdV-41(物种FAdVs)有反应性的个体兔血清用于确认测试。
人腺病毒G型间接交叉中和分析(狒狒血清)：由于对人HAdV-52(物种G)的中和参考血清是不可用的，来自狒狒B107的血清样品，之前对SAdV-B和HAdVs(表2)的中和抗体表现为阳性，这里在间接中和分析中测试对HAdV-52的交叉中和。为进行分析，100μL的TCID50为103/mL的HAdV-52上清液与来自狒狒B107的血清相混合至1∶10的筛选稀释度，并用于接种VeroE6细胞。隔日观察在板孔中的细胞2周以寻找CPE证据。
核苷酸序列的登录号：用于图3、4和5中的腺病毒序列的登录号如下：CAdV-1(犬腺病毒1)，AC_000003；NC_002501；HAdV-1，AC_000017；HAdV-3，DQ086466；HAdV-4，AY458656；HAdV-7，AC_000018；HAdV-8，AF532578；HAdV-12，NC_001460；HAdV-14，FJ822614；HAdV-18，GU191019；HAdV-21，AY601633；HADV-36，GQ384080；HAdV-40，NC_001454；HAdV-41，DQ315364；HAdV-48，EF153473；HAdV-49，DQ393829；HAdV-50，AY737798；HAdV-52，DQ923122；MADV-2(鼠腺病毒2)，NC_014899；PAdV-A(猪腺病毒A)，AC_000009；SAdV-1，AY771780；SAdV-3，NC_006144；SAdV-6，JQ776547；SAdV-7，DQ792570；SAdV-18，FJ025931；SAdV-20，HQ605912；SAdV-21，AC_000010；SAdV-22，AY530876；SAdV-48，HQ241818；SAdV-49，NC_015225；SAdV-50，HQ241820；SAdV-A1139，JN880448；SAdV-A1163，JN880449；SAdV-A1173，JN880450；SAdVA1258，JN880451；SAdV-A1312，JN880454；SAdV-A1335，JN880456；TMAdV(伶猴腺病毒)，HQ913600；TSAdV(树鼩腺病毒)，NC_004453。在2013年1月2日可用的这些序列通过引用整体结合入本发明。
实施例2
致命肺炎在狒狒群体中的爆发
在一次爆发中，在为呼吸道合胞病毒的研究准备时，婴儿狒狒自诞生就隔离之后，很快TBRI的9个婴儿狒狒中的4个罹患了急性呼吸道传染病(图1A和B)。指示病例(图1B，B1)是女婴狒狒。出生后，她住进了托儿所，保持在培育器中1周，然后转移到一个单独的位于专门托儿所隔区(bay)的笼子中。在12天的年龄，注意到她打喷嚏排出清澈的粘液。无发热存在。实验室显示了正常的全血计数(CBC)，白细胞(WBC)读数为5.6×106/mL(57％嗜中性粒细胞)。她的病情在未来的4天迅速恶化，发展为全身乏力，食欲不振，体重损失＞20％，且呼吸急促(呼吸困难)。体温降到低于95°F。胸部X线检查显示双侧间质性肺炎。尽管用抗生素(氨苄青霉素和庆大霉素)、氧气、静脉输液积极治疗，她发病13天后、在25日龄时死亡。
尸检表明，肺组织是出血的，具有实变(consolidation)的斑片状区域。中性粒细胞明显地存在于气道中，并扩展至小气道、间质和肺泡空间内。值得注意的是，在整个呼吸道上皮细胞上核内包涵体是明显的，并且在主气道中最为明显。扁桃体包含具有增加的嗜中性粒细胞数量的坏死的多焦点区域，以及纵隔淋巴结含有过量的炎症细胞。在肝脏中注意到轻度细胞坏死。在心脏、肾脏、肾上腺或脾中没有观察到组织学病变。最后的病理诊断是支气管性间质性(bronchointerstitial)肺炎，病因可能是病毒，伴随扁桃体炎、淋巴结炎、轻度肝坏死。虽然肺组织的革兰氏染色是生物体阴性的，细菌培养物生长出甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)和稀有的抗坏血酸克吕沃尔氏菌(Kluyveraascorbata)(Sania等，2001，ClinInfectDis33：E69-74)。肺组织的测试对百日咳杆菌、衣原体属、支原体属、脲原体属、军团菌属、汉坦病毒呈阴性。肺组织的呼吸道病毒培养物对于AdV是阳性的。在外部实验室中，使用对HAdV物种A-F和SAdV-A有反应性的血清进行的病毒中和测试不能确定分离物的类型。
第二病例(图1B，B2)是男性婴儿狒狒。他也在出生后送至托儿所，在生命的第一周保持在培育器中，然后转移到托儿所隔区的单独笼中。在16天龄时，他开始打喷嚏，并从鼻子咳嗽出了牛奶。WBC数值是正常的，5.8×106/mL(46％中性粒细胞)，但也有少数异型淋巴细胞存在。该动物在临床上恶化，嗜睡、重量损失＞20％、异常低体温、呼吸困难。当时采集的鼻拭物是MSSA阳性，但支气管肺泡灌洗液和血液的培养物均为MSSA阴性。虽然用静脉输液、氧气、抗生素积极治疗，他在发生肌肉痉挛(角弓反张)的三天后被人道地安乐死，这是出现症状后的5天，日龄21天。
尸检表明，肺透显示出支气管性间质性肺炎，伴随充血(水肿)和实变的显著区。炎症浸润中性粒细胞是在主气道上是很明显的，并扩展到间质和肺泡空间中。内包涵体在上皮细胞和气管下(subtracheal)腺上皮中很明显，并且在纵隔淋巴结中可见过量的炎症细胞。其他组织对组织损伤是阴性的，除了与应力(stress)一致的胸腺髓质坏死。革兰氏染色和肺组织的培养物均为细菌或真菌阴性的，虽然可见稀有的白细胞。肺组织的呼吸道病毒培养物对AdV呈阳性，并且分离物也是通过中和测试无法确定类型的。
在房间里的另外两个动物也被注意到在带有致命肺炎的B1和B2病例存在的大约同一时间打喷嚏和咳嗽(图1B，B3和B5)。从这两个有症状的个体之一收集的鼻拭物对于腺病毒是阳性的培养物(图1B，BaAdV3)。也作为有症状病例从同一个房间的唯一剩下的无症状狒狒上收集鼻拭物(图1B，室1，B4)，并从附近的、但在单独房间内的无症状狒狒上收集(图1B，室2)。从这些鼻拭物，得到了另外3个腺病毒分离物(图1B，BaAdV1，BaAdV2和BaAdV4)。房间1的两个有症状狒狒，病例B3和B5，被隔离，并在1周内在包括静脉输液、吸氧和经验性抗生素的支持性治疗(care)下完全恢复。根据此时的中和测试，4个狒狒AdV分离物(BaAdV1，2，3，4)中没有一个是HAdV物种A-F或SAdV-A型的。
实施例3
新型狒狒腺病毒(BaAdV-1至BaAdV-4)的细胞培养物趋性(Tropism)
将分离自首次爆发期间的患病的和无症状的狒狒的4种腺病毒培养在多种人类和猴细胞系中。测试的大多数细胞和细胞系都导致了生产性感染，如通过细胞病变效应(CPE)的大小来确定(表1)。
+++，强细胞病变效应(CPE)；++，中等CPE；-，无CPE表1.4种新型狒狒腺病毒在人类和猴细胞中的趋性
所有4种狒狒腺病毒成功地在来自其他旧世界猴物种(恒河猴，食蟹猴，非洲绿猴)的细胞中传播。测试了BaAdVs在人类细胞系中的生长；所有4种都在人肺腺癌A549细胞系中有效生长，该细胞系通常是在人类AdVs的分离中使用(Lipson等.，1993，FEMSMicrobiolLett113：175-18)。值得注意的是，不像其他3种AdV菌株，BaAdV3还成功地从另外两种人细胞系中培养得到。在来自狨猴的淋巴母细胞B95a中没有观察到增长，狨猴是新世界猴。
实施例4
从头组装和新型狒狒腺病毒(BaAdV-1至BaAdV-4)的全基因组系统发育分析
4种从狒狒分离的腺病毒还通过全基因组测序和系统发育而分析进一步特征化。腺病毒六邻体、聚合酶和纤维的序列通过Sanger测序而初始获得(initiallyrecovered)。为测序整个基因组，对对应于BaAdV-1至BaAdV-4分离物的早期传代培养物在IlluminaHiSeq2000上进行无偏差深度测序(图2)。在32.9-45.2百万的原始读取结果中，对于4种腺病毒株的每一个而言，基因组的61.3％-93.1％是从头组装的；然后根据用于填充空位的Sanger测序法的深度测序读取结果，对基因组的剩余部分手动组装。
在装配基因组上扫描核苷酸成对同一性图，其表明所有4种狒狒腺病毒株保留了主要核心腺病毒蛋白质，并且类似于物种SAdV-B、F和G的AdVs，所有4种株都含有两种纤维蛋白，长纤维和短纤维(图3)。BaAdV1，是从爆发的房间(图1B，B4)的无症状狒狒分离的菌株，被发现是与先前描述的分离自圈养猕猴的粪便的SAdV-B物种AdV密切相关的(SAdV-A1335，登录号JN880456，97.8％同一性)(图3A))(Roy等，2009，PLoSPathog5：el000503)。株BaAdV2和BaAdV4，都是从在单独的房间中的远离爆发地点居住的无症状狒狒分离的(图1B、B8和B9)，彼此是100％相同的，而BaAdV3株，分离自靠近两只死于腺病毒性肺炎的狒狒的有症状狒狒(图1B，B5)，与BaAdV2，4菌株具有91.2％同一性(图3B)。与BaAdV2，4和BaAdV3最近的亲系物是腺病毒物种F和G的成员(图3B和图4A-D)。个体六邻体、五邻体碱基、DNA聚合酶的系统发育分析，以及纤维蛋白和氨基酸成对同一性比较，表明BaAdV1是SAdV-B物种组的一员(图4A-D和5A)，而BaAdV2，4和BaAdV3表现为在F和G中间的新种的成员，暂时命名为“物种H”(图4A-D和图5B)。2012年的重复血清学检测使用含有针对物种A-G的人AdVs的中和抗体的血清(表2)，表明物种FAdVs与BaAdV1(SAdV-B)和BaAdV2，4(物种Ｈ）仅具有低水平的交叉中和活性。物种A-G的人AdVs与BaAdV3未观察到交叉反应性。
值得注意的是，尽管在基因组上共享91.2％的总核苷酸同一性(图3B)，为在分离自有症状的狒狒的4种AdV中的唯一的AdV的BaAdV3的序列，与BaAdV2，4在短纤维区域有显著差异。尽管其它主要腺病毒蛋白质具有＞90％的同一性，而BaAdV3短纤维与BaAdV2，4短纤维的氨基酸同一性只有58％(图5B)。这有力地暗示涉及BaAdV2，4和BaAdV3短纤维的重组事件的可能性。BaAdV3相对于BaAdV2，4(物种H)和物种SAdV-A、F、G的相关AdVs的相似性和靴扫描图确认了重组事件的可能性(图6A)。然而，由于BaAdV3短纤维被发现缺少任何密切相关的系统发育邻居(neighbors)(与BaAdV2，4是约58％，并且与的其它测序纤维蛋白的氨基酸同一性≤50％)，因此假定的短纤维AdV供体菌株还有待确定。
实施例5
在狒狒和人类中BaAdV1、BaAdV3和BaAdV2，4的血清阳性率
值得注意的是，有传言称许多工作人员报道在狒狒爆发的时间左右经历“流感样”症状。为了研究这种可能性，即跨物种传播的事件，无论是动物传染病型(从狒狒至人类)或人类传染病型(anthroponotic)(从人类至狒狒)，都可能已经发生，来自可能暴露的TBRI人类工作人员的爆发前和爆发后的血清(表2，H1-H6)以盲测的方式通过病毒中和来测试针对BaAdV1、BaAdV3和BaAdV2，4的抗体。作为用于基准血清阳性率的另外的对照物，来自随机选择的5个小于5岁的儿童的血清，和可用的(available)来自与感染肺炎的狒狒大约相同的时间出生的、但不是爆发区域的狒狒的血清，被进行测试。显著地，证据表明，6个中的5个(83％)和6个中的6个(100％)的人员，在爆发之前是血清反应阴性的，在爆发之后分别中和BaAdV1和BaAdV2，4的抗体效价。中和抗体应答的最大值是≥1∶80，对应于在爆发期间与生病狒狒接近接触的研究人员(表2，H1)。有趣的是，在任何工作人员中没有观察到对BaAdV3的中和。中和分析法的特异性是通过5个5岁以下的不相关儿童的流行病学筛选来进一步证实的，他们都是对针对BaAdV1、BaAdV2，4和BaAdV3的中和抗体呈阴性的(表2，H8-H12)。在聚居区的10个健康的未参与爆发的狒狒中，10个中的4个(40％)和10个中的3个(30％)分别藏有针对BaAdV1和BaAdV2，4的抗体(表2，B100-B110)。很少甚至没有观察到针对BaAdV3的中和，仅在一只狒狒B107中检测到了1∶10效价的中和抗体，而对密切相关的株BaAdV2，4存在1∶80的高效价
表2在针对HAdV物种A-F的兔中和血清、实验室工作人员(H1-H6)、幼童(H8-H12)和目前居住的狒狒(B100-B110)中，针对BaAdV1、BaAdV2，4和BaAdV3的中和抗体效价。使用针对HAdV物种F的兔中和血清，除了低水平的BaAdV1和BaAdV2/4但不是BaAdV3的交叉中和外，未观察到与HAdV物种A-F的交叉反应性。在使用与BaAdV1、BaAdV3和BaAdV2，4(B107)反应的狒狒血清样品的间接中和分析中，也没有证据表明与物种G腺病毒HAdV-52的交叉反应性。缩写：N/A，不适用。
因此，迅速致命腺病毒肺炎的爆发在婴儿狒狒中爆发。主要AdV感染的诊断是由外周循环的异型淋巴细胞、肺和肝脏的出血坏死性病变、在支气管上皮上的内包涵体的存在支持的，并随后由肺组织的AdV的直接分离物确认。4只狒狒中表现出急性呼吸道感染的2只(50％)在爆发中死亡。虽然数量不高，50％的病死率对于AdV感染是很高的，这在易得病的人类儿童中通常引起的死亡率很低，是＜15％(Hong等，2001，ClinInfectDis32：1423-1429；Siminovich等，2011，PediatrDevPathol14：214-217；Murtagh等，2009，PediatrPulmonol44：450-456)。一种对高死亡率的解释是细菌的并发确定(identification)，如在2只狒狒的至少1只上的MSSA，这可能使具有严重的和潜在的肺致命细菌超感染(Bakaletz，1995，TrendsMicrobiol3：110-114)的狒狒易于被AdV感染。也可能新生狒狒通常是高度易受AdVs严重感染的，这会在免疫功能低下者(immunocompromised)、老年人或非常年轻的人中导致更严重的疾病(WoldW，HorwitzM(2007)Adenoviruses.In：FieldsBN，KnipeDM，HowleyPM，editors.FieldsVirology.第5版Philadelphia：WoltersKluwerHealth/LippincottWilliams&Wilkins.pp.2395-24361Echavarria，2008，ClinMicrobiolRev21：704-715)。
从来自于死于肺炎的两只狒狒的肺组织分离的AdV株是通过针对HAdV物种A-F和SAdV-A的AdVs的病毒中和测试无法确定类型的，HAdV物种A-F包括物种B、C和E的HAdVs，通常与人体呼吸疾病和肺炎有关(Echavarria等.，2006，JClinMicrobiol44：625-627)。这一发现提出了一种可能性，即爆发的病原体可能是未知致病性的新AdV株。由于来自两例死亡病例的组织和初级(primary)培养物已送到外部实验室，且不可用于进一步的分析，所以分离自爆发中的其它有症状和/或无症状狒狒(BaAdVs)的AdVs被表征。4个AdV分离物(BaAdV1，2，3，4)已经从鼻拭物成功培养，其中只有一种BaAdV3是来自幸存的急性呼吸道症状狒狒。与来自死去狒狒的两个AdV菌株相似，在爆发时，通过病毒中和测试不能在HAdV物种A-F和SAdV-A中确认该4株的类型(尽管随后的针对HAdV物种A-G的重复中和测试中发现BaAdV1或BaAdV2，4与物种FHAdVs之间的低水平血清学交叉反应)(表2)。
为了进一步表征这些未确定类型的AdVs，经组合深度测序、传统Sanger测序和从头组装方式获得(recovered)对应于所有4个分离物的基因组(图2)。BaAdV1被发现是最近描述的SAdV-B物种的成员(Roy等，2012，EmergInfectDis18：1081-1088)，但BaAdV2、BaAdV3和BaAdV4(同一于BaAdV2)被发现是潜在的新物种的代表成员(图3B和图4)。BaAdV2，4和BaAdV3二者符合新AdV物种的两条ICTV标准之一，与它们最近的AdV邻居，物种F和G的成员，展示出了＞10％的系统发育距离(图3B)。其他标准，缺乏与其他AdVs的交叉中和，似乎至少BaAdV3是满足的(表2)。目前还不清楚这些新AdVs在原始上是人的还是猿的，但指定的“物种H”已经被认为是这一新物种的成员。
有趣的是，BaAdV3，尽管是物种HAdV，与BaAdV2，4具有91.2％的总核苷酸同一性(图3B)，但在人和狒狒血清的测试中与BaAdV2，4显示出很少或没有交叉反应性(表2)。此血清特异性的依据(basis)可能是短纤维的序列，其在BaAdV3中相对于BaAdV2，4和所有其他测序的(sequenced)AdVs具有显著差异(在氨基酸水平是同一性≤58％)(图5B)。靴扫描分析表明，BaAdV3可能是从涉及物种HAdV(如BaAdV2，4)的重组事件产生的，并且尚未确定藏有有差异的BaAdV3短纤维的供体株(图6)。因为在两个人胎细胞系中观察到了BaAdV3的生产性感染(表1)，而不是BaAdV2，4，该供体菌株可能潜在地是人腺病毒，或至少是人嗜的。
在狒狒爆发时，在工作人员中传闻报告的“流感样”症状促使调查对群体中的当前狒狒和潜在的暴露人员中BaAdV1、BaAdV2，4和BaAdV3的血清学响应。在狒狒和人类中检测了对BaAdV1(物种SAdV-B)和BaAdV2，4(物种H)的中和抗体效价(表2)。虽然可能这些效价可反映与人物种FAdVs的边缘交叉反应性(表1)，但更有可能BaAdV1(物种SAdV-B)和BaAdV2，4(物种H)是与HAdV-F血清学区分的，这是考虑到(given)与物种FAdVs的低蛋白同源性(图5)，以及在暴露的工作人员中的高血清转化率和抗体效价的量在相对较短的时间内上升(表2)。因此，血清学结果有可能提供第一手资料，表明假定的猿AdV(物种SAdV-B系，BaAdV1)人畜共患传播至暴露的人类。观察到的暴露于BaAdV2，4的工作人员的血清转化也提高了对新物种HAdV感染人类的致病性的关注。由于该物种HAdVs的起源和寄存宿主尚不清楚，目前还不清楚BaAdV2，4的传播方向是动物传染病型还是人类传染病型。这些研究结果继续强调潜在的致病AdVs的威胁，其有能力在猴子和人类之间跨物种传播。
在之前的狒狒的呼吸道和肠道疾病爆发中(Eugster等，1969，ArchGesamteVirusforsch26：260-270)，原因被认为是SAdV-20，其是物种SAdV-AAdV，其已被初始(originally)分离为V340株，该株与长尾黑颚猴的肺肠炎(pneumoenteritis)爆发有关(Kim等.，JInfectDis117：292-300，1967)。本发明所呈现的数据表明，BaAdV3，一个新物种HAdV，就是这种肺炎爆发的最可能的原因。在获得的物种H和SAdV-BAdVs中，BaAdV3是唯一测序的AdV，其从生病的狒狒分离，并且两只死于肺炎的狒狒，在爆发时，对HAdV物种A-F和SAdV-A的先前的测试是阴性的。血清学检测的收集结果(Collectively)显示在目前的圈养狒狒和人类工作人员中，几乎没有对BaAdV3的血清反应性，这些数据表明，BaAdV3可能是稀有的致病物种H重组体，其出现促使了爆发。
实施例6
注释序列信息
下面提供了在SEQIDNO：1-4中的开放阅读框架的位置(编码序列，CDS)，连同编码蛋白质同一性的信息。还提供终端重复(ITR)的位置。BaAdV-2(SEQIDNO：1)
BaAdV-4(SEQIDNo：2)
BaAdV-3(SEQIDNo：3)
BaAdV-1(SEQIDNo：4)
/标记＝"ITR重复″
实施例7
下表提供了对序列表中所列分子的同一性
SEQ ID N0： 狒狒腺病毒 分子
1 BaAdV-2 病毒基因组
2 BaAdV-4 病毒基因组
3 BaAdV-3 病毒基因组
4 BaAdV-1 病毒基因组
5 BaAdV-2 100K_蛋白_CDS_翻译
6 BaAdV-2 22K_蛋白_CDS_翻译
7 BaAdV-2 33K_蛋白_CDS_翻译
8 BaAdV-2 52K_CDS_翻译
9 BaAdV-2 DBP_CDS_翻译
1O BaAdV-2 E1A_CDS_翻译
11 BaAdV-2 E1B_55K_CDS_翻译
12 BaAdV-2 E3_12.5K_CDS_翻译
13 BaAdV-2 E3_14.7_CDS_翻译
14 BaAdV-2 E3_CR1-α_CDS_翻译
15 BaAdV-2 E3_CR1-β_CDS_翻译
16 BaAdV-2 E3_RID-α_CDS_翻译
17 BaAdV-2 E3_RID-β_CDS_翻译
18 BaAdV-2 E4_34K_CDS_翻译
19 BaAdV-2 E4_ORF_6/7_CDS_翻译
20 BaAdV-2 E4_ORF1_CDS_翻译
21 BaAdV-2 E4_ORF2_CDS_翻译
22 BaAdV-2 E4_ORF3_CDS_翻译
23 BaAdV-2 E4_ORF4_CDS_翻译
24 BaAdV-2 II_(六邻体)_CDS_翻译
25 BaAdV-2 III_(五邻体)_CDS_翻译
26 BaAdV-2 IV_(纤维_1)_CDS_翻译
27 BaAdV-2 IV_(纤维_2)_CDS_翻译
28 BaAdV-2 IVa2_CDS_翻译
29 BaAdV-2 IX_CDS_翻译
30 BaAdV-2 pIIIa_CDS_翻译
31 BaAdV-2 pol_CDS_翻译
32 BaAdV-2 蛋白酶_CDS_翻译
33 BaAdV-2 pTP_CDS_翻译
34 BaAdV-2 pV_CDS_翻译
35 BaAdV-2 pVI_CDS_翻译
36 BaAdV-2 pVII_CDS_翻译
37 BaAdV-2 pVIII_CDS_翻译
38 BaAdV-2 pX_CDS_翻译
39 BaAdV-2 U_外显子_CDS_翻译
40 BaAdV-4 U_外显子_CDS_翻译
41 BaAdV-4 pX_CDS_翻译
42 BaAdV-4 pVIII_CDS_翻译
43 BaAdV-4 pVII_CDS_翻译
44 BaAdV-4 pVI_CDS_翻译
45 BaAdV-4 pV_CDS_翻译
46 BaAdV-4 pTP_CDS_翻译
47 BaAdV-4 蛋白酶_CDS_翻译
48 BaAdV-4 pol_CDS_翻译
49 BaAdV-4 pIIIa_CDS_翻译
50 BaAdV-4 IX_CDS_翻译
51 BaAdV-4 IVa2_CDS_翻译
52 BaAdV-4 IV_(纤维_1)_CDS_翻译
53 BaAdV-4 IV_(纤维_2)_CDS_翻译
54 BaAdV-4 III_(五邻体)_CDS_翻译
55 BaAdV-4 II_(六邻体)_CDS_翻译
56 BaAdV-4 E4_ORF4_CDS-翻译
57 BaAdV-4 E4_ORF3_CDS_翻译
58 BaAdV-4 E4_ORF2_CDS_翻译
59 BaAdV-4 E4-ORF1_CDS_翻译
60 BaAdV-4 E4_ORF_6/7_CDS_翻译
61 BaAdV-4 E4_34K_CDS_翻译
62 BaAdV-4 E3_RID-β_CDS_翻译
63 BaAdV-4 E3_RID-α_CDS_翻译
64 BaAdV-4 E3_CR1-β_CDS_翻译
65 BaAdV-4 E3_CR1-α_CDS_翻译
66 BaAdV-4 E3_14.7_蛋白_CDS_翻译
67 BaAdV-4 E3_12.5K_CDS_翻译
68 BaAdV-4 E1B_55K_CDS_翻译
69 BaAdV-4 E1A_CDS_翻译
70 BaAdV-4 DBP_CDS_翻译
71 BaAdV-4 52K_CDS_翻译
72 BaAdV-4 33K_蛋白_CDS_翻译
-3 BaAdV-4 22K_蛋白_CDS_翻译
74 BaAdV-4 100K_蛋白_CDS_翻译
75 BaAdV-3 100K_蛋白_CDS_翻译
76 BaAdV-3 22K_蛋白_CDS_翻译
77 BaAdV-3 33K_蛋白_CDS_翻译
78 BaAdV-3 52K_CDS_翻译
79 BaAdV-3 DBP_CDS_翻译
80 BaAdV-3 E1A_CDS_翻译
81 BaAdV-3 E1B_55K_CDS_翻译
82 BaAdV-3 E3_12.5K_CDS_翻译
83 BaAdV-3 E3_14.7_蛋白_CDS_翻译
84 BaAdV-3 E3_CR1-β_CDS_翻译
85 BaAdV-3 E3_RID-α_CDS_翻译
86 BaAdV-3 E3_RID-β_CDS_翻译
87 BaAdV-3 E3_CR1-α_CDS_翻译
88 BaAdV-3 E4_34K_CDS_翻译
89 BaAdV-3 E4_ORF_6/7_CDS_翻译
90 BaAdV-3 E4_ORF1_CDS_翻译
91 BaAdV-3 E4_ORF2_CDS_翻译
92 BaAdV-3 E4_ORF3_CDS_翻译
93 BaAdV-3 E4_ORF4_CDS_翻译
94 BaAdV-3 pII_(六邻体)_CDS_翻译
95 BaAdV-3 pIII_(五邻体)_CDS_翻译
96 BaAdV-3 pIV_(纤维_2)_CDS_翻译
97 BaAdV-3 pIV_(纤维)_CDS_翻译
98 BaAdV-3 pIVa2_CDS_翻译
99 BaAdV-3 pIIIa_CDS_翻译
100 BaAdV-3 pIX_CDS_翻译
101 BaAdV-3 pol_CDS_翻译
102 BaAdV-3 蛋白酶_CDS_翻译
103 BaAdV-3 pTP_CDS_翻译
104 BaAdV-3 pV_CDS_翻译
105 BaAdV-3 pVI_CDS_翻译
106 BaAdV-3 pVII_CDS_翻译
107 BaAdV-3 pVIII_CDS_翻译
108 BaAdV-3 pX_CDS_翻译
109 BaAdV-3 U_外显子_CDS_翻译
11O BaAdV-1 100K_蛋白_CDS_翻译
111 BaAdV-1 22K_蛋白_CDS_翻译
112 BaAdV-1 33K_蛋白_CDS_翻译
113 BaAdV-1 52K_CDS_翻译
114 BaAdV-1 DBP_CDS_翻译
115 BaAdV-1 E1A_CDS_翻译
116 BaAdV-1 E1B_55K_CDS_翻译
117 BaAdV-1 E3_12.5K_CDS_翻译
118 BaAdV-1 E3_14.7_蛋白_CDS_翻译
119 BaAdV-1 E3_CR1-α-1β_CDS_翻译
120 BaAdV-1 E3_RID-α_CDS_翻译
121 BaAdV-1 E3_RID-β_CDS_翻译
122 BaAdV-1 E4_34K_CDS_翻译
123 BaAdV-1 E4_ORF_6/7_CDS_翻译
124 BaAdV-1 E4_ORF1_CDS_翻译
125 BaAdV-1 E4_ORF2_CDS_翻译
126 BaAdV-1 E4_ORF3_CDS_翻译
127 BaAdV-1 E4_ORF4_CDS_翻译
128 BaAdV-1 II_(六邻体)_CDS_翻译
129 BaAdV-1 III_(五邻体)_CDS_翻译
130 BaAdV-1 IV_(纤维_1)_CDS_翻译
131 BaAdV-1 IV_(纤维_2)_CDS_翻译
132 BaAdV-1 IVa2_CDS_翻译
133 BaAdV-1 pIIIa_CDS_翻译
134 BaAdV-1 pIX_CDS_翻译
135 BaAdV-1 pol_CDS_翻译
136 BaAdV-1 蛋白酶_CDS_翻译
137 BaAdV-1 pTP_CDS_翻译
138 BaAdV-1 pV_CDS_翻译
139 BaAdV-1 pVI_CDS_翻译
140 BaAdV-1 pVII_CDS_翻译
141 BaAdV-1 pVIII_CDS_翻译
142 BaAdV-1 pX_CDS_翻译
143 BaAdV-1 U_外显子_CDS_翻译
显而易见的是，本发明描述的方法或组合物的精确细节可以被改变或修改，而不脱离本发明的精神。我们要求保护落入下述的权利要求的范围和精神内的所有这样的修改和变化。

Claims (50)

1.分离的核酸分子，其包括至少100个核苷酸长度的核酸序列，该核酸序列在长度上与SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或其互补物具有至少90％的序列同一性。
2.分离的核酸分子，其包括：
(a)核酸序列，所述核酸序列与阐明为SEQIDNO:1的核酸序列的核苷酸1-29685和29867-34391具有至少90％的同一性；
(b)核酸序列，所述核酸序列与阐明为SEQIDNO:2的核酸序列的核苷酸1-29865和29867-34391具有至少90％的同一性；
(c)核苷酸序列，所述核苷酸序列与阐明为SEQIDNO:3的核苷酸1-28677和29812-34402的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
3.如权利要求1或权利要求2所述的分离的核酸分子，其包括阐明为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或其简并变体的核酸序列。
4.分离的核酸分子，其包括与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的开放阅读框架具有至少90％的同一性的核酸序列。
5.如权利要求4所述的分离的核苷酸分子，其包括阐明为SEQIDNO1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的核酸序列的开放阅读框架。
6.由权利要求1-5任一项所述的核酸序列编码的分离的多肽。
7.如权利要求6所述的分离的多肽，其包括与阐明为SEQIDNO:5-109的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列。
8.分离的多肽，其包括由权利要求5的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
9.分离的表达载体，其包括权利要求1-5任一项所述的核酸序列或编码权利要求6-8任一项所述的多肽。
10.分离的宿主细胞，其包括权利要求9所述的表达载体。
11.如权利要求10所述的分离的宿主细胞，其中所述细胞是人细胞。
12.如权利要求10所述的分离的宿主细胞，其中所述细胞是非人灵长类动物细胞。
13.分离的腺病毒载体，其包括权利要求1-5任一项所述的核苷酸序列或编码权利要求6-8任一项所述的多肽。
14.如权利要求13所述的分离的腺病毒载体，其中所述腺病毒是复制缺陷型。
15.如权利要求13-14任一项所述的分离的腺病毒载体，其中所述腺病毒具有El、E3或E4缺失。
16.如权利要求13-15任一项所述的分离的腺病毒载体，其编码异源蛋白质。
17.分离的抗体，其特异性结合权利要求6-8任一项所述的多肽。
18.如权利要求17所述的分离的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
19.如权利要求17所述的分离的抗体，其中所述抗体被标记。
20.组合物，其包括有效量的权利要求1-5任一项所述的核酸分子，权利要求6-8的多肽、或权利要求9的载体、权利要求10-12的宿主细胞、权利要求13-16的腺病毒、或权利要求17-19的抗体，和药学上可接受的载体。
21.检测狒狒腺病毒(BaAdV)-3或BaAdV-2/4腺病毒的方法，包括：
(a)使疑似包括腺病毒核酸的样品与权利要求1、4或5任一项所述的核酸在严格的条件下接触；和
(b)检测核苷酸序列与样品的杂交的存在或不存在，其中所述杂交的存在检测BaAdV-3或BaAdV-2/4腺病毒。
22.检测狒狒腺病毒(BaAdV)-3或BaAdV-2/4核酸的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使疑似包括腺病毒核酸的样品与至少一个引物接触，该引物在严格的条件下与阐明为SEQIDNO:l、SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3的核苷酸序列杂交；
(b)进行PCR反应；和
(c)检测PCR反应的反应产物的存在或不存在，其中反应产物的存在检测BaAdV-3或BaAdV-2/4腺病毒。
23.检测受试者感染狒狒腺病毒(BaAdV)-3或BaAdV-2/4的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使来自疑似患有由BaAdV-3或BaAdV-2/4引起的感染的受试者的样品与权利要求6-8之一的多肽接触，其中所述样品包括来自受试者的抗体；和
(b)检测所述抗体与所述多肽的结合；从而检测BaAdV-3或BaAdV-2/4感染。
24.检测受试者感染狒狒腺病毒BaAdV-3或BaAdV-2/4的方法，包括：
(a)使来自怀疑患有由BaAdV-3或BaAdV-2/4引起的感染的受试者的样品与权利要求17-19任一项所述的抗体接触；和
(b)检测所述抗体与样品中多肽的结合，其中所述抗体与所述多肽的结合检测BaAdV-3或BaAdV-2/4感染的存在。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述抗体被标记。
26.如权利要求21-25任一项所述的方法，其中所述样品来自人。
27.如权利要求21-25任一项所述的方法，其中所述样品来自非人灵长类动物。
28.如权利要求21-27任一项所述的方法，其中所述样品是血液、血清或血浆样品。
29.如权利要求21-28任一项所述的方法，其中所述方法区分BaAdV-2/4和/或BaAdV-3。
30.检测抑制狒狒腺病毒(BaAdV-2/4)和/或BaAdV-3的药剂的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使包括权利要求13-16任一项所述的腺病毒载体的样品与药剂接触；和
(b)确定所述化合物是否抑制腺病毒多肽、病毒包装或病毒复制的功能；
(c)从而确认所述化合物为抑制BaAdV-2/4或BaAdV-3腺病毒。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述药剂是抗体。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述药剂是一种抑制的mRNA或小分子。
33.在受试者中治疗或预防狒狒腺病毒(BaAdV)-2/4或BaAdV-3感染的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效剂量的下述的一种或多种：由权利要求30的方法确定的药剂、权利要求1-5任一项所述的核酸分子、权利要求6-8任一项所述的多肽或其免疫原性片段、权利要求14或15的复制缺陷型腺病毒、权利要求17-19任一项所述的抗体、从而治疗或预防受试者的感染。
34.诱导受试者的对狒狒腺病毒(BaAdV)-2/4或BaAdV-3感染的免疫应答的方法，其包括向受试者施用治疗有效剂量的下述的一种或多种：由权利要求30的方法确定的药剂、权利要求1-5任一项所述的核酸分子、权利要求6-8任一项所述的多肽或其免疫原性片段、权利要求14或15的复制缺陷型腺病毒、权利要求17-19任一项所述的抗体，从而诱导免疫应答。
35.如权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述受试者是人。
36.如权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述受试者是非人灵长类动物。
37.如权利要求34-36任一项所述的方法，其包括向受试者施用所述多肽或其免疫原性片段。
38.如权利要求34-36任一项所述的方法，其包括向受试者施用抗体。
39.如权利要求34-36任一项所述的方法，其中所述药剂包括适体。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述适体是siRNA或反义分子，并在它的长度上与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的相应片段具有至少90％同一性，所述siRNA或反义分子包括约15个-约60个核苷酸长度的双链区域。
41.如权利要求33-40任一项所述的方法，其中所述药剂是口服、局部、关节内、静脉内、肌内、皮内、腹膜内或皮下施用的。
42.试剂盒，包括：
容器，该容器包括权利要求1-5任一项所述的核酸分子、引物、权利要求6-8任一项所述的多肽或其免疫原性片段、或权利要求17-19任一项所述的抗体，所述引物与阐明为SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的核苷酸序列在高度严格的条件下杂交；和
试剂盒使用说明。
43.试剂盒，包括：
权利要求6-8任一项所述的多肽，和
用于在来自受试者的样品中检测抗体存在的说明，该抗体特异性结合狒狒腺病毒(BaAdV)-3或BaAdV-4。
44.试剂盒，包括：
权利要求17-19任一项所述的抗体；和
用于在来自受试者的样品中检测狒狒腺病毒(BaAdV)-3或BaAdV-4多肽存在的说明。
45.表达蛋白质的方法，包括培养权利要求10-12任一项所述的宿主细胞。
46.产生抗体的方法，其包括用权利要求6-8任一项所述的多肽或其免疫原性片段使哺乳动物免疫，从而产生抗体，其中该抗体特异性结合多肽。
47.分离的多肽，其包括阐明为SEQIDNO:5-109之一的氨基酸序列。
48.如权利要求47所述的分离的多肽，其由阐明为SEQIDNO:5-109之一的氨基酸序列构成。
49.腺病毒，其包括权利要求47或权利要求48的多肽。
50.腺病毒，其包括权利要求13-16任一项所述的载体。
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