HU230364B1 - Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására - Google Patents

Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására Download PDF

Info

Publication number
HU230364B1
HU230364B1 HU0500987A HUP0500987A HU230364B1 HU 230364 B1 HU230364 B1 HU 230364B1 HU 0500987 A HU0500987 A HU 0500987A HU P0500987 A HUP0500987 A HU P0500987A HU 230364 B1 HU230364 B1 HU 230364B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sequences
gene
recombinant
vector
cells
Prior art date
Application number
HU0500987A
Other languages
English (en)
Inventor
James M Wilson
Guangping Gao
Soumitra Roy
Original Assignee
The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Trustees Of The University Of Pennsylvania filed Critical The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Publication of HUP0500987A2 publication Critical patent/HUP0500987A2/hu
Publication of HUP0500987A3 publication Critical patent/HUP0500987A3/hu
Publication of HU230364B1 publication Critical patent/HU230364B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/235—Adenoviridae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/17011—Spumavirus, e.g. chimpanzee foamy virus
    • C12N2740/17022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

SLMÍAA AIJENOYÚU S MLKhEINSAV ÉS AMIXOSAV-SXEXVLAO A, AZT TARTALMAZÓ VEKTOROK, ÉS ELJÁRÁSOK ANNAK AI..KAt,M ÁZÁSÁRA
A talÁmsny tárgyat képezik rékombmáns ndesovírusok, amelyeknek a következőket tartalmazó kspszldja vau: .A^W?-te:cmfetejet :Steprotó« és pemonporteía, ahol a hbeo· és pen&mpxo < m k egyesként embert vagy sinusa eredetűek, továbbá amely adenoviras tart&fen&z olyas adetíovims-szekveav i s- Ί, amelyekből az Eta- ésAfsgy Ela-genek funkcionál t.wt defeíalva. vannak, 5’ és 3’ adeuovhus eisz-eKm.v'vet., amelyek replikádéhoz és kaptáidba. osoniagolódiáslíoz szükségesek, valamint :sz adehovírus szeatpontjáhői heteroióg trasrszgení a gén gazáaseltheo történő exptesszlőját irányító szekvenciákhoz kapcsoltan. A találmány tárgyát képezik továbbá sinrian adesovírusgénfeke}} expresszáló gazdasejtek és eljárások 3 sejívooaiak -és a vektorok alkalmazására, továbbá a testiek alkalmazásai és a feaheket tartalmazó készítmények.
Az adenüvfasnk iietíÖsszálá, kőrüibelul 3ó kilöbázís (kb) kőrőlbolal geuomot tartalmazó DNS-vírusok, amelyeket széles köttet. használnak gésírsttszferre a vírus azon képességeit ktítasznáíva, hogy nagy hatékonysággal juttat génete különböző céiszövétekbe, és transzgénfceíógado kanaestasa nagy \ habban e&> art x rt hegy az adeuovírusók El-géajét eltávolítják, és a \ábszu«t örömökrt. s k^tde^s gutacK megtűrte cP\Kszekvenciát és poliadexúlezéss helye; magában foglak'· tmaszgen kwft„n.u hehertesmk tepljkacK-dehesens mhostfehthsts: vírust hozva létre.
Az adcnovirusok .jellemző mörtbiÖgiájóak, báron; jelentősebb proteint, hexorst dl}, penítmhsxlsé ííll) és gőinhdoínéaben végződő ísberpretdnjét (..knobbed Éber”, nyúlvány proteinje), valamim több kisebb jelentőségű proteint - VI, VíH, IX, illa és LVa2 - tartalmazó ikozaédere» kapsziádal [W.C, Réssel; J. öem Vírol. 81, 2573 <281)0, november)]:. A virnsgeaom lineáris, ketíósszálű DNS, amelynek ö'-vegéhez kovalens módon protein kapcsolódik, és. amely invertált terminális ismétlődő egységeket (.artvertírt temtel nymon.·, TTR) tamlreaz. A vdrtís-DNS szorosan kapcsolódik az Igen bázikus Víi-protehtart és egy kisebb, /»« elnevezesö proteinnel. Egy további protein, az V, a fenti: DNS-taoietn komplexbe van osonsagolvíí, és a VI. proteinen keresztül struksumlis kapcsolato t létesít a knpszíddhf A vírus; a vírus által kíkiöií proteázt is tartalmaz, amely a több strukturális preteln átalakításához, ezáltal érett, fertőző vitások keletkezéséhez szükséges,
Tekemb, mos adukor íns'.'íi ? ka naztu't mar )ert.«. vök törtek be a *. távé. í ;a d;x tűkbe l ,00. a ő 1)83 716 szántó amerikai egyesük államokbeli szabadalmi leírást, amelyben két csimpánz adnnovstwvektor leírását találjuk
A tecboika: állásit szeriut hatekönyobb vektorokra van szükség, amelyek ellett a populációban eredetileg nem mutatható ki immunválasz különböző :aáenéV-lte-8zseroíipusokkal történő korábbi találkozás által Indukált immunválasz következtében, és-Tagy kívánt esetben alkalmasak ismételt beadásra es második vakdnáasfesal titeremelkedést célzó megerősítő oltásra.
Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldás lényegét.
A tsláimarty tárgyát hat. \.n tan atew&nshól származó izolált nukieotidrsxekvetíőiák és amísosaysxekvenciák, a szekveudákat: íartateszó vektorok, és simtas adenovírttsgeuekeí expresszáló sejtvopalak képezik,
Llgyaaesak a találmány tárgyát képezik eljárások a találmány szerinti vektorok es sejtek alkalmazására.
A unalmam vermit eijarssbaít egy sagj több heteroiog gént rutaiunk emlős betegbe a talalmanv s?onntt vektor beadásával. Mivel a különböző vektorkonstrakciok humán adesrovírusok helyett majd® (simiao)
1Ő0445-Ő1321SG ·>
aáerovdxwölcből -származnak. a :e majom humán vagy állati gazdaszervezet korábbi találkozás hiányában nem reagál .azonnali immunválasszal az idege·?, antigénként prezentálőóó vektorra. A találmány szerinti készítmenyek alkalmazása tehát sem majom betegnek beadva a kiválasztott öanszgén sokkal stabilabb expresszióját teszt lehetővé. A találmány vzcrínt» készítmények alkalmazása ?u?kcinaként lehetővé teszi a kiválasztott antigén prezentálását, ezáltal projektív íaunuaváiusz kiváltását. Anélkül hogy Igényünket bármilyen elméletre korlátoznánk, a találmány' szerinti adeaovírtisok humán dendritikus sejteket transzdukáló képessége felelős legalább részben azért, hogy a találmány szerinti rekotnbínáns konstrukciók immun választ válianak ki. A találmány s;·:·:;-rintí rekombináns simian adenovirasok heterológ géntermékek itt r?7w előállítására is· .alkalmazhatók. Ilyen g< «termékek maguk is alkalmazhatók különböző célokra az alább ismertetettek, szerint.
A találmány fenti és egyéb előnyős megvalósítási módjaá, z a’abbtakban részletesebben is ismertetjük.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatoltál· ákat
Az. 1, ábrán a Cl csimpánz adenoviros 113. azonosítószámú ϊ-.zek? ojk-ju], Co$ csimpánz:·zdenoww (Pars9) [14, azonosítószámú szekvencia], és a találmány szerinti új P,tn$ f 15 a/vncsmSs^ámú. szekvencia], Parts [ló. azonosítószámú szekvencia], és Pan? [17. azonosítószámú szekvencia] csmtparrs adenovkasok hexán·kapszidproteirtjei !.. I -hurokregiójának aminosav-szekvenetáját es ,:z L2-hurok egy részének amínosav-szekveociájót rendeztük páronként! szekvencia-összerendezéssel egymás módé. A kézbe ikta tóit konzervált régió a. különböző adenovlrus-szerottpusok esetében konzervált aiapdomén egy része.
A 2. ábrán a Céh csimpánz adenovírus (Pan-9) flg. azonosltészámö szekvencia], Paa-ö [19, azswssűószámú szekvencia], a Pan-7 [20. azonosítószámú szekvencia], a Pan-5 [21, azonosítószámú szekvencia] és a humán adenovírus 2, szerotípas [22. azonosítószámú szekvencia] és 5. szeroopus- (23, azonosltőszfená szekvencia] llbexgöofedomémat amínosav-szekvencűijának szekvencia-csszeretKÍezését mutatjuk be.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldás lényegét.
A -találmány tárgyát az Ad Pan5 (1-4., 15 és 21, azonosítószámú szekvenciák]. Ad Paa-ó [5-8., 1 ő. és 19, szoooslíószámú szekvenciák] és Ad Pan? [9-12,, 17, és 20. azonosítószámú szekvenciák] szerotípusokböl származó új nukleinsav- és aminosav-szekvencláfc képezik, amelyek eredetileg csimpátiz nyirokcsomóból lettekizolálva. A leírás további részében ezekét az adenoviraxokat esetenként <25, €ő és <27 adenovirusoknak nevezzük. Szirtié?? a találmány tárgyár képezik az eredetileg cynomolgus majom vesesejtekböl izolált SV1adenovtrasból származó szekvenciák [24-28. azonosítószámú szekvenciák Ugyancsak a tedalmaoy tárgyát képezik az eredetileg rhesasmígotn yesesejtekbSl izolált SY-25»atfcpov'n^hol származó szekvenciák [29-33, azonositőszámó szekvenciák] és SV-39-aáenovfesból származó szekv-eacsík [34-37; az»«osiíőszámá szefevenciákl.
A találmány tárgy át képezik új adenovirusvektorok, valamint becsomagoló sejfvoea-lak s vektorok dőúlIrtására,.amelyek alkalmasak rekombmáas proteinek vagy fragmentumok wgy más reagensek /« uíAu tsztnelésére. Ezen felül. ,t találmány tárgyát képezik készítmények heteroíon ntvlekubk bejuttatására, terápiás vagy vákeiaázasi célzatul. Az ilyen terápiás vagy vukctnakészilmények mwrúh heterológ moiékúlát tartalmazó aderu'ftdiijsvektort tartalmaznak, A találmány szerinti új szekvenciák a mkombnwns aílesovints-asszoeiáls virusvektőrok (AAV) termelődése szempomjából koferfönfesságú keiper végitől tunkciók^ is ellátják, A találmány tárgyát képezik a festi szekvenciák- alkalmazásán alapuló beíper konstrukciók, -eljárások és sejtvonalak.
Akkor rsc!-?djuk, hogy nákíeirísav-szekveedák. vagy azok fragmentumai “lényegében Irömolőgok’ vagy lényegében hasonlók”, ha optimális páronkáííti szekvenciaxóiMeí’eadezés esetért - megfelelő súklelssaví-Q844M13.2']SG tsszerclok és -deíéciok közbeiktatásával - legaiább körülbelül 95-9§% azonosság matatható Isi az összerendezett nukleinsav-szekvene iák Ivagy komplementer szálaik) közt.
Akkor mosdjuk, hogy ammosav-szokvenciák vagy azok “lényegében honmlógok'’ vagy ‘•lényegében hasonlók, ha optimális párodként! szekvencin-összerendezés esetén - megfelelő asrínosíivinszsreiók és -deléeiók közbeiktatásával - legalább körülbelül 95-99% azonosság stafatteé ki az összerendezett :turn:nostiv-szok venciák közt
Előnyösen, a hotnolögís a teljes szekvencia vagy általa kódolt protein mentén kimutatható. vagy annak legalább 8 atninosavból álló fragmentuma mentén, előnyösebben .1.5 aminosavból álló fragmentuma, mentén kimnfaíhato. Ilyen feagrnentumcka· ismertetünk az alábbiakban.
Nuktómv-szekveseták vonatkozásában “százalékban kifejezetett szekvencia-azcmosságon” vagy “azouosságörf' a. szekvenciák optimális páronkéttit összerendezése mellett a két: szekvenciában megegyező nnkleotidokat értünk, A székvencia-azotiosságbt vlzsgáihafiak a genom teljes ho^za mentén (például körülbelül tó kbp ne.'U v e>< yen p öten hezwzg v-r, er/mt jv-tod vttasa-i s, cv. n cnter fesd pJeaul ? adestövirns kódúié tevtőkat '-merteíő táblázatokat], vagy kívánt esetben, amt.sk legalább 500-5000 nukleoíid hosszúságú fragsnezn sn„ n euU n,
Áz azonosságot megállapíthatjuk azonban kisebb fragmentumok. például legalább 9 nakleotíd, tipikusa» legalább 20-24 nukleodd, legalább körülbelül 2S-32 oukleortd, és legalább körülbelül 36 vagy söbb nukleotid .mentén. A hasonlóságom “százalékban megadott azonosságot amiuosav-szekveuctákra is egyszerűen megadhatjuk a teljes protein hossza vagy annak ímgtueummn menten. A tl.tgtuennnn legalább S amirsosav hosszúságú, de lehat akar körülbelül 70Ö asnsosav hosszúságú u, Ilyen fragmentumokat az alábbiakban ismertetünk.
Az azonosság; lokál algoritmusok és szánaiogerc- program, -R alkalmazásával határozhatjuk meg egyszerűen,.alapértelmezett patuorétetem meikit FJoovöseo. az azonosság a protein, enzim, alegység vagy legalább -8 aminosav hosszúsága fisgtseatam teljes hosszára vonatkozik. Az azonosságot azonban az azonosságot .matató gétriermék felhasználásának megfelelően rövihebb régiókra & megadhat] A.
feivást esetben, az: összerendezést végezhetjük térítés nélkül vagy kereskedelemben hozzáférhető “Moltiple Seqeenee Altgmení Program*. például a Clustal W* alkalmazásával, amely hozzáférhető a Web szervereken keresztül az interneten, Alkafejnzhalluk a vector 19ΤΓ' alkalmazásokat is. A technika állasa szedni számos algoritmus istneZt, amely alkalmas a nnkleoddszekvencta-azonosság tneghatározásárs, például a fenti programok által tartalmazóit algoritmusok. Poltnukleobd-szekvenciák ossz éhalom thatök még a Fasta, a „GCG Vsamon o.l m^zét kepezó program alkalmazásával. A faxra az összelnivonbtu-dö ás adatbázisban szereplő ah fego us.oah'fe' < ''etcndcA^c mértét v<g/> el ez ,t íeco reg'oktxn t patai tere összerendezést, és ha-áto/za meg a százalékos ^kvenuu-azono^cot Például. nukletnsav-szekvenciák százalékban. megadott szekvencm azonosságát meghníáto/hutmk a 1 afeu segítséget el. a .AaCG Version fel' a lupe rtel mezeit paraméteri mellett (szonosszösagyő; u pontozásos tnábwu SuPkM-&k’<?rl. unefe teljes terjedelmében a kítanltás részét képezi. Hasonló programok állnak saudclkezesrc .onux-sus s/ekvenentk összerendezésére. Általánosságban, ezeket a pAgyatnokát alapértelmezett jurát né terek melleit alkalnuzzuk, bar a beállításokat szakember igény szerint megváltoztathatja. Szakember alkaítnazfeámás-algoritmusokat vagy szátníté;gépes programokat is, amelyek a referencia algoritmussal vagy programmal megállapított azonosság! szinttel legalább megegyező fokú azonosságot képesek megkeresni.
A leíráslm és a. csatok igézsypordőkban .garíaiínaz” kifejezés és: annak változatai (,,cömprises’\
100445-6132/513 „Böísprisísg;”) más komponensek, elemek, iutegerek, lépesek és hasonlók jelenlétére js vonatozik. A „valamiből áll’’ „valamiből felépíti'” kifejezés kizárja egyéb komponensek, elemek, integerek, lépesek és hasonlók jeleslések
A találmánytátgyát a természetben előforduló környezet ükből azokkal asszociált más vírusoktól Izolált Pas5, Panő, Pan7, SVL SV25 és SV39 rtnkicíítsav-szekvencíák és atKÍaosav-szekveociák képezik,.
A,.ltóAfem^y^zelcéenctók
A laláhuásy szeriről PanS nukissusav~szetó.encta az 1, azonosítószámú szekvencia 1-36 462. nokleoiidjak tartalmazza. A találmány szerinti Panó nuklemsav-szekveneia az 5. azonosítószámú szekvencia í36 644 tmkleöúdjnh tartalmazza. A találmány szerint! Pás7 aukleinsav-szekvencia a'9. azonosítószámú szekuma 1-36 .te nakio>„h<ot ScPajpíz. i \ '>d.s,m<m\ «.-mt! Ά 1 tu.k emots s/ekicxwa ?4 ,!Zvuovío»/anuvr wun te 'tó tik,, uk ,ut tóg’uln t.'tgfom \ * d o ‘ *n\ ve tűt 3\ 2? u ,x,mrsa\-sz< '.xsvi a 24 azonoMkwzániu szekvencia 1-31 044 nukk-oodjaa íoglaja magában. A találmány szerinti SV39 nukietosavszekseneu: a 34, azonoshotzunm szekvencia 1-34 115 nnkleotidjalt foglalja magában. Lásd a szekveociaüsíát, amely teljes terjedelmében a kúanítás részét képez·.
A találmány szerinti ötskleissav-szekveneia kifejezés vonatkozik az 5., 9., 24., 29. és 34. azonosítószámú szekvenciákkal komplementer szálakra, a szekvenciáknak üteg felelő RNS- és cDNS-szekvenciákra, és azokkal komplementer szálakra, Szintéit a találmány tárgyát képezik a. szekvencia!istában szereplő szekvenciákkal 9595%-nál nagyobb mértékben, előnyösest körúlbeiül 99-99,9%-ban homológ vagy azonos nukleinsavszekvenciák, Ugytíuesak s íalálmány tárgyát képeztk az 5 , 9., 24., 29. és M azonosítószámú szekvenciák természetes variánsai, és komplementer szálai. Ilyen módosulások lehetnek például a technika állása szerint ismert jelölések, sneíilálás, és egy vagv több természetben előforduló mtkleotid szubsztitúciója ílegeneralt nukleonodat,
A találmány tárgyat kepe/ k továbbá a PanS, Panó. Pan7, SVL SV25 és SV39 szekvenciák IragmcnmmaLazeh köötöfemenfor szálsí, és azoknak megfelelő cDNS és RNS-szckveueták. A fragmentumok előnyősön legalább 15 n«klo<!tid bosszöságúak, és azok tehetnek funkcionális fragmcnlsmok, azaz bíotógíni szempontból érdekes Aagmentómok. Ilyen fenkeionális ifagmenhstn esprssszáihat például kívánt adenovúus-termékeL vagy alkalmazható lehet rekernbináns vírusvektorok előállítására, ilyen fragmentumok például az alábbi táblázatokban felsorolt génszekvenciák és fragmentumok.
.Az, alábbi táblázatokban a találmány szerinti sióban adenovirtts szekvenciák átírt régióit és nyitóit olvasási kereteit adjuk meg. Lgye-s gének esetében a transzkóptótsok és nyitott olvasási keretek IOR.F’} az; 5,, 9,, 24,, 29. és 34. azcnosiíószátnu szekvenciákkal komplementer szálon találhatók Lásd például, E'b. E4 és E2a. A kódolt proteinek számított molekulatősnegői is megadtuk, h'elhivjnk a figyelmet arra, hogy a Fané lila nyitott olvasási kerete (az 1. azortostiószámtl szekvencia 576-14,36. nukieoíidjai]. a Parió E1 a nyitott olvasási kerete (az 5, azonosítószámú szekvencia 576-1437, aukleotsdiai], és a Paa? Pia nyitott olvasási kerete [a 9. azonosítószámú szekvencia 57,6-1437. rmkleotidiaij belső hasítási helyeket tartalmaznak. Ezeket a rasőusí helyeket a táblázatokban. jelöltök.
199445-6152.50
Ad Pa«-5 ÍSEQ ID NO:Í]
Régiók Kezdetet) Vág (t«) Mí&&?/íRe8«!g (DiOíoxs)
H.R I 120 -
Ela 'Tnsnszkdptufn 478
135 576-664,1233-1436 28/20
I2S 576-IWö, 1253-1456 24389
ÖS 5^44,1253-143;' 9882
I nr.vknphKH 1516 -
Ob Ti’a-wzkripEu-H 1552 -.................................................................
K.cU T 1399 2Π 225/7
Nagy T 1964 5412 55595
IX 3432 5'RO 14427
TraiLszknptKSH 395'»
F2b 7r;u!szkripteí5 10349 5'
FTP 10349 8451 72950
Polimeráz 3443 5083 /27237
FVa2 5604 3980 50466
Transzkriphsn'! 3960
28.1 kj D 5155 5979 28141
Agnofehérje 7864 8580........................... 25755
Π Transzkriptuni 10849
5275 SD 10851 12025
ííia 12050 13819 65668
'Fran&'zkfípnua 13632 -
Trat5szknpün$} 13894
I..2 :.Penio« 13398 15490 58292
vn i 5494 16078 21478
V 16123 17166 59568
Mu 17139 17422 8524
TraaszkíiptuíH 17442
Tnntszkriptuia 17438 -
1.3 VI 17491 10222 26/82
Bex.orí 18315 21116 /84874
EndopnMe&2 20030 21783 .26304
Transzfaipnini 21311
JE2a Traasdsriptea 20782 v
DBF 23386 21845 57558
10Ö445-61327SG:
AdFaa-S[SEQíDNO:l|
Régiok Kezdet (m} Vég (ni)
'fraaszkrtp túra 21788 -
1,4 T r sxtszk Hpftssíi 23406 -
100RD 23412 25805 68325
33 kD homolog 25525 26356 74156
VHJ 26428 27111 24 768
Traaszkriptuta 27421
E3 Traaszknptuai 2o7.1$
OrfM 2~112 27432 12098
OrföŐ 27330 28012 23046
Od/0 279<μ 28527 39525
Orü?4 28557 29156 02567
Orf#5 20169 29783 22267
Orfró 20798 30673 3/458
Orf#? 30681 30956 10477
ÖriA 30062 31306 16523
OrB 31289 31796 15236
I rsnszkrsptum 31837 -
L5 :Trc:rh./knp.uis 32032 :·“
/sóét 32035 33372 47670
Trasszfeipísra 33443
B4 ’íranszkriptusu 36135 -
Orí7 33710 33462 9/9/
006 34415 33710 55905
Ün4 34886 34521 /5878
OrB 35240 34896 13641
Orl2 35635 35246 14384
Öxíl 36050 35676 13772
Transzkrípmm 33437 -
íi'R 36343 36462 -
Ad Pan-6 [SEQ lö NO:5)
Régiók Kezdet pu) Vég (rd)
1TR 1 123.....................................
Ela Tfasiszkiiptura 4 78
138 576-1143, 1229- 1437 48201
I2S 576-1050, 1229- 143? 04654
i0Ö445-6132/$<3
Ad Pan-Ó [$EQ ÍD NO:S.Í
(Régiek Kezdet (nt> Vég t ni i I/b/kkíikiíb/aeg ;'2?if.6oA!s./
9S 576-645. 1229-1437 /0/02
Transzkriptuns 1516 -
Eib raiiszkripíum 1553 -
Kicsi I 1600 2172 223/5
Nagyi 1905 3413 55594
IX 3498 3926 /4427
IraníZKTicuni 396.5
E2b 1 firs/su jptusr 10341 (-
RTF 10340 8451 (©>.....................................
Poiüneráz 8445 5089 /56907
iVa2 5610 3986 50452
I raaszkríptam 3066 (-
Π Traaszkriptear 10838
52/55 k© 10840 12012 44205
liia 12036 13799 65460
írass zkripkcs 13812 :*·
28.1 kd 5161 5985 260/2
Agnopro-etn 7870 8530 25542
1.2 1 rsTiszkríptufr; 13874
Fenson 13878 15467 595/4
vn 15471 16055 2/506
(V 16100 17137 59566
;Míi 17160 17393 6506
(Transekripöm- 17415
L3 íranszkripkira 17466 -
vi 17469 18188 55666
Hexon 18384 21112 /06/32
EfiíiopfOsüÚX 21134 21754 25445
Tsamdmpöm 21803 -
E2a TrspszXfíptupr 26780 (-
DBF 23375 21837 57299
T rax-szknplun} 21780
U TríínszicripiiiSK 23393 (~ (
IÖ0W 23404 25806 86577
53 lei) howoiog 25523 26357 24699
Vili 26426 27109 2-^-Vi
100445-6132'SÖ
Ad Pan-6 ISÉQ ÍD N0:5]
Régiók Kezdet O Vég(r;;5 Mí/AíWltGítv foíí&Cw
franszkriptöm 27419 -
03 Tr&Bszkriptum 26786
Ortól 271ÍO 27430 /2098
Orf#2 27384 28007 22880
Or&S 27989 23519 /9-/66
OtlW4 28553 29236 2.065
OrffG 29249 29860 22356
Or&6 29875 30741 5/038
OrOG 3Ö749 31024 /6-/69
Orft/8 31030 31464 /65-/0
OrO?9 3145? 31864 /5264
Tranüzkripáíns 31907 6
15 I ranszkriptum 32159
Fiber 32162 33493 -/7564.........................................................
Traaszkripíatn 33574 -
E4 Tra5&2knpasni 36276 -
007 33841 33593 95 77
GtR> 34746 33841 55OV4
Orf4 35017 34652 ;5v'5~
örÖ 35380 35027 5?ft2~
on 35766 35377 /4*7”
Orí! 36181 35807 /.5/09
Iranszkriptum 33558 -
ŰR 36482 36604 *»
z\áPan-7[SEQIDNO:9]
Régiók Kezdet (aukleeüd) Vég (nuklöoödí AfííA?.6?.s'/«.>'i.>»?eg / /><?/.%<«.$'/
ITR í 132
Eb Transzkriptun} 478 -
13S 576-1143,1229-1457 282/8
I2S 576- 1050,1229-1437 2456/
9S 576-645, 1229-1437 50/62
Ibmszkriptem 1516 -
Eib Transzkhptuín 1553 ói
Kicsi T 1600 2178 22559
190445-Μ 32 SG
Ad Paa-7 [SEQ ÍD NO:9]
Régiók Kezdet i sukkénál Vég (sukleotid) á/a/ektt/őftwgs (Z>«6o«.y
NsgyT h<5 3419 55698
IVa2 5 )«2 561.6 562/6
1 ransi&nctijm 3971 *·
62b I ΐ<ϊίΙϊΐϊί·Χ.Ϊ i|3:Vl£íü 10341 -
btp 10340 8457 7529
Poíisseráz 3451 5095 /26994
IX. 3504 3932 34447
Transzkripiutn 3972. -
V8.1kö 5i67 5901
Agnoproteis 7876 8586 25424
U ; ra&»2.knptsm 10834
55 55 kD 10836 12011 44562
Ou 12035 13795 65359
Traaszkripásm 13808 <
L2 Trasszkriptum Ö870
Festőn 13874 15469 5!'4f-’4
VII 15473 16057 5/359
V 16102 17139 53474
Me 17167 17400 8566
Í'rasiízkripíiím 17420
u Fraaszkrspiíiro 17467 *
VI 47470 18108 26/65
rlsxon 18288 21086 /64765
Eadoproteáz· 2110o 21732 23626
/Fóaszknpfenn 21781 -
E2a Transzkriptnni 26764 -
DBF 21815 57/92
Transzkriptuís 2i?55 -
64 Trasázkdpíam 23370
iOOkD 23376 25781 88556
33 kl> höísolog 25489 2ö3?8 25/55
vm 26410 2 095 54749
Tfsíji&zkripíiss 2-403
63 Trasszk-riptast 26770 -
OrR; 27004 27414 /5656
ÖrV2 27368 27988 55667
|O0445-nI32 Sö
AdPaa-7{SEQíDNO:9]
Régiók Kezdet (nakjectid) Vég (stukleodd) Afe·/s?kií Zaíöfljeg 60«úö«s)
OrO?3 27970 28500 ,/9462
OríV4 28530 29150 22999
O:&5 29163 29777 23224
OrOfö 29792 30679 5.2/55
Of 07 30687 30962 /05//
OrO?-8 30968 31399 /6586
OríWO 35392 55799 /5205
'Praíjszkriptum 37842 -
L5 TnaszkrípSum 32091 -
fiber 32094 33425 47544
(ransámptos 33517
E4 Traaszkripföstt 36208 -
Of? 33784 33536 9/9/
066 5468^ 33784 25065
Ort'4 349ö0 34595 /5879
063 35323 34970 /564/
062 35709 35320 /4644
Orf 1 36(23 35749 /5746
Tranízkr-p-um 33501
ll'R 36404 36535
AdSV-l|SEQ 1D NO:24] Ad SV-25 [SEQID NO29; AdSV-39[SEQIDNO:34]
Region Kezdet Vég Keidet ÍVég Kezdet Vég
l'TR 1 106 1 p.33 1 150...............................
Ela 352 1120 404 1409
Eib 1301 2891 ív) Í2273 :1518 3877
w 9257 .2882 9087 j.í/54 * 10143 3s»8
E2a 24415 20281 24034 120086 25381 21228
E3 24974 27886 24791 pS;9z 25790 29335
E4 33498 30881 30696 |2§163 33896 31157
ITR 34145 34264 30912 jj 10*t4 33966 34115
Ad SV-( 1SEQ1DNO241 AdSV-25 iSEQ 1D NO291 Ad SV-39 f$EQ ID NO: 34)
Regtett Kezdet Vég Kezdet iVég Kezdet Vég
(ÍR 1 106 1 :13:3 ? 150
106445-6132/80 π
1.1 95 53 12376 934 3 |12206 10416 13383
L2 12453 15858 12283 15696 13444 16877
1..3 15910 20270 15748 20080 17783 21192
1..4 21715 25803 21526 125420 22659 26427
L5 28059 30899 25320 |28172 | ....... 29513 31170
ll'R. 34145 34264 30912 |3W44 33966 34115
télteds z\;l 3V-1.5IQ ID NO: 24
Kezdői. Vég
1TR 1 iiö6 -
lila 13S 459 953 76037
125
Ete Kiess T
Nagy.!' 1301 2413 -V203
IX 2391 2825 76552
E2b S'Víi2 4354 2024 54987
Poliraerá;·: 6750 4027 702683
PÍ.P 9257 7371 72413
Agao-ptWHS 6850 7455 20984
B 52/55 kD 9515 10642 42675
Illa 10663 12372 5.V565
L2 Pánton 12454 13965 56725
Vll 13968 ia-531 29397
V 14588 Í15625 393 74
Mu 15645 Í15857 7568
Ϊ...3 2s...................... VJ 15911 16753 304!8
Hexoo. 116841 1 %3n 1/)4494
Eadoproteáz DBP 19645 21721 202n2 29312 24009 .......; 2.U67 52107
L4 loOLD 35508
VJH i24591 25292 123390 25809 1 .< J 5?59
E3 Oröö.................................... '25292
Orff?2 25583 26081 18040 30452
OrÜG 26084 26893
Orf#4 2690.3 27180 10252
Or0?5 27177 17512 12640
Orf#6 27505 27873 /3659
1O0445-M5? $G
1.5 F iber «2 2S059 29150 59472
Fiber .91 20183 30867 6//28
E4 Orí.7 31 098 50892 7857
Orib 31982 3? Í22 5592/
0-44 32277 31915 /4558
Orí3 52629 32279 /3586
0:0 33018 52626 /4755
ürí 1 53423 33045 7459/.....................
1TR 34145 34264
fehérje Ad SV-25, SEQ 1DNO:29 AdSV-30. SEQ ÍDNO:34
Kezdet Vég ?4:?/e,fe/«í<feíeg Keste- Vég A/íj/tíí.';.;Oíítí»ít?g'
1TR 1 133 1 130 .........
Ha S3S 492 1:358 28555
125 492 1355 25005
no Kicsi T 478 1030 202 74 1518 2078 2/652
Nagy T 829 2244 525/0 1825 3349 55559
IX 2306 2716 /5059 3434 3844 /4075
F2b IVa2 4208 2755 54675 3912 5141 46/69
PoKrcteráz: 6581 3858 /02050 7753 503.3 /05988
FTP 9087 7207 7/526 10143 8335 89279
Agáé- fehérje 6681 7139 /6925
Lí 52/55 IcD 9345 10472 427-95 10418 11608 49252
Ha 10493 122O2 65594 51574 13364 66076
L2 Penton 12284 13801 56999 13448 14959 56292
VII 13806 54369 20369 14960 15517 20574
V 14426 15463 59269 15567 16628 .19676
M:i 15483 15695 7598 16650 16871 7497
L3 VI 15749 16591 50547 16925 17695 28045
Hföxon 16681 19446 /04035 17785 20538 /0257.9
EiKSopTOteáz 19455 20072 25538 20573 21181 227/6
2a DBF 21511 20123 52/59 22631 21231 .55/60
1.4 li'iOkl) 21532 23829 85970 22659 2535.5 /0056.2
\ Hl 24408 25109 25547 25410 26108 25229
& Ürfeí 25109 :25426 //890 26375 27484 42257
Orf#2 27580 2835? 29785
Orfe3 28370 24645 /05/4
< )ff*4 28363 29533 /8855
100445-6132/80
fehérje Ad Sv-25, SEQ IDNO:29 AoSV-39, SEQlDNÖja
Kezdet Vég iéfefefeőöteisJííg : Kezdet Vég MteteOteíitg Ί
Orl;?5
Orfeő
1..5 fehér ·»?. 35380 26423 57329
f iber 41 26457 28136 :0(/707 29515 31116 56552
134 Őri? 31-41 31118 / /656
Orfó 29255 28395 33 ??Ö5 32292 31438 55457
Ori4 29550 29188 /4399 32587 32222 /599/
Orí.3 29902 29552 /5754 32954 32607 /3153
Őrt? Wto 29899 .teó’.fe 33348 /482!
Orf i 30316 30696 2430/ 33764 /3735
ÍTR 30912 31044 33966 34115
A F'aöS, Panő, Patt?, SV1, SV25 ás SV39 -adesovíras •nukl.etasav-szekwnisíák: aíkabuszhatök terápiás ágeosekkéní ás különböző vektorrenászerek és gazdasejtek előállítására. A. leírás szerinti értelemben, vektoron értünk forrod' ihen ttroteK' betöltésem képes nukieámv-moletoW, «zen beid -.csupasz ©298-1, plsmtridöt, vírusa Vvnrdd \ag> vpwvmt L/ek a szekvenciák és termetek alkalmazhatók egyroagakh&m vagy más adeJiovroís \aov nem ckrovjus a/ekvenciákka; vagy fragmentumokkal. tembínáiva; vagy más adesoviras vagy r.ctn adcno\ tras szeX'.zncsak .temesse! kombinálva. A tnlsíntány szériád- adeítevíras-szekvexteiák asdszetw szállttá ekv't<.-kkeut, ccnterapiás vektorokként vagy· vskcim vetorkkánt is ttlkaimazltaíők, Szintén s íalábtány tárgy st kept-zte tetei a ♦alabtuny szerinti' adenovírus-szekvenctáfcb terísiuiaző nttóeínssv-roelételák, génszálhtó \ck!vn'k es g,vdavqtek íalúkaúnv targval kepe/ik tekhul a telátmány szerinti simian Aő fíR-szekveneiákaí tartalmazó nukteInsav-tnotíkulaL Lzvn lé.ul, a taldássásty tárgyai tepezik lávám Ad-gétnermékeí kódoló majom Adsztekvene-akm tartalmaz»» nuklcrosat. -ntólekttltUc. A lalátaáay szériád .szekvenciák aíkateazasávsl. dőáíBható egycb nulferosr»-ax. lekula», ,·. íen.is ik prm -zárnám uyth írnak ak
A taláfottey egy további előnyös megvalósítási módja- szerint, az: általunk azonosított majom- A.dgénrégiok aikateazfeatók különböző vektorokban. beterológ. molekulák eljuttatására a sejtekhez. Vektorokat •elMriiífeaómk például adettoviras kapsridproiein (vagy arrnak ftagmsntamaj expresszáltatáste. tecsemagolö gazdasejtekben alkalmazható vtrasvektorok létrehozására. ilyen vektörokst ntegtervezbehtek úgy, hogy azok á kívánt terméket transz módon expreswzáyák. Ilyen vektorokat nregíervezheíthik ágy is, hogy kívánt .adéao-v&ns funkciókat - példán! az Eía, Eífe, a terminális ísttellódö szekvenciákat,-.az.8253, B2b, E4 és/vagy> E4ÖÜE6:régiókat - exprssszátó szekvenciákat stabil módon tartalmazó sejtvonaláí kaptunk.
Áz aáenovirus génszekvenciák és azok fragmentumai site-niazhalők továbbá be’perhrakciő-fílggő vírusok (például esszenciális funkciókat ellátó régiókban áeköálí adeuövbwwfóóiök vagy adeno-asszodáh vírusok; A A V) előállításához szükséges tóper·· (segítő) funkciók ellátására. Ilyen vírusok előállítására, a találmány szerinti ssntinn adesovínts-szekvenciákat humán Ad-szefcveneiákboz hasonló módos altelstszhaíiuk, A majom és hűmén. Aö-ssekvosoiák ás: a íaísímásy szériád majom adenovirus-szekvencták eltéréseinek kovelteztében azonban a találmány ..szerinti szekvenciák alkalmazása lényegében kiküszöböli a homológtekerohisófcté leheíő<·»' > y u
ségét-t?«n?ta Ad El-tenkciót höráozó gazdasejtek, például 293-sejtek helpernsukciéivaL atni esetleg.fertőző adenovíms-kornaminámiokkelelkezéséhez vezetne rÁAV-vfrusok előállítása során.
Ilyen rAAV-virusok, adenovírm helperfunkclók segítségével történő előáll iitara sdkaimtótató eljárások • tarnál? .adeixsvínxs-szerotípusok alkalmazásával tatása a szakírodalotabaa bőségeset? liozzaíerbetök. Lásd példásai a é 258 595 számú amarikaí egyesíílf államokbeli sztibaáaltn; leírást és abban idézett hivstkozásokat Lásd még. az 5 871982 számú amerikai «gyesük áibmokbeM szabadalmi leírási; és s WC? 99/14354, Wö 99 15 685, WO 99/47 691 számú nemzetközi közzétételi iratokat Ezek az eljárások sem-tatnán ÁÁVszerotípusok, például nem-tanán, .főemlős Á&V-szerntípusók előállítására Is alkalmazhatók, Á szükséges talperfünkciók ellátására képes találmány szerinti tanán sdertovrras .génszekwneiák {például Eía, Ele, 322a és/vagy E4 ORLói alkalmazta különöset? dö?v o\ ,,-lu* a v ’ukséges aáeaovtas-fsmkeiők koosplerasniáíására a tipikusan humán eredeid r&ÁV beesomúgoíe m, .fekbvn te edévő egyéb aéenovbasokkai történő rekombisádö lehetőségének minimalizálása vagy fókstavbetat .'eseti k találmány szerinti adanovíms-^ekvetaák kiválasa?ort génje? vagy nyitott olvasást keretet áSuhnataatok az d>en rÁAV-fermeiő eljártakban.
További lehetőség szerint, a találmány- szeritó rekomtaáns .tartan. admovíms-vektorok: alkalmazhatók a2 ilyen eljárásokban, ilyen rekombínáns tanán afatorinís^vektorok lehetnek' például hibrid csiíspánz Ad'AAV-vektorok. amelyekben a csimpánz Ad-szekveneiák fogják közre például az AAV3' és/'vagy 5' 1TRrégiókat és annak expressztóját szabályozó szekvenciák ellenőrzése alatt álló íraoszgém: szagukba foglaló rAAV expressziós kazettát. Szakettrher számta nyilvánvaló, hogy más Salálmáuy .szeritó tartan- adenovíras-vektorok és/vagy aéntermékek is alkalmazhatók rAAV vagy egyéb, adenovtas heipsrfbnkeíéiői függő vírusok előállításúin.
A találmány egy további előnyős megvalósítási módja szerint, sükleíasavonoÍKkutákaf kívánt adéaovfes géntermekek sazdasejtekhe történő szállítására, és azok expmsstatatásta tervezőnk, hogy ezéhal kívánt élettani hatást érjönk el. Például. a találmány szerion, adenov-áus ΈIá-proteint kóxlolő szekvenciákat tartalmazó tófcleinsav-molekulákat egyénekbe jutaihahatk tmeorterápíás. óéiból. Adott esett», ilyen ísotaadákaí lípldbázisú hordozóanyagban TormuiazunL és azokat «tótat»» temorsejtekhez: juttatjuk el. Ilyen ktaíttaénysta suás mmorterápíás szerekkel , példád rumímmad, <a\otat vagy hasoniókkall 'tambiaáSttank.. A találmány szerinti adetxjvúus-szekvenci&k további alkalmaza»! lehetőséget szakember számára világosak..
Ezen leiül, szakember 'Somára.az ?> o> Avarnak·, hogy- a találmány szerisíi Ad-ezekveneiák 'könnyenadaptálhatók különböző vitális és nem-virábs vektorretstazerekte terápiás és tómuaogén molekulák ír; ta», sít tw vagy fo vivő szállítására. A találmány szerinti PanS, Pasú, .Pari?, ÉVI, SV25 és/vagy SV39 sísdas Aógeiiomok alkalmazhatok például kúlöítbőzó rAd- és sem-rAd-vektortesászert-kbéx;, Ilyen vekíerrendszerek lehetnek többek. között plazmmok, ksuvlnss, reirovims, poxvirusok, vaceiniavírus és sde&o-asszedáfi virissretxlszerek. A találmány szénát? megoldás nem korlátozódik valamely meghatározottvektorrötószerre.
Ugyancsak a mlátaánv hagyat kcjwsk a íaiáteáay szerinti májon? és majömeredélö proteinek előállítására alkalmas molekulák. Ilyen „tuoicknUk, amelyek a simias Ad DNS-szekvesciáktn 'tartalmazó poiin;rktetldnfet hordoznak, lehetnek osupssr ÖN S, pfezród, vbua vagy báí'snely más .genetikai etem fors?3ígábím.
Saraién- a találmány iárgyás: képezik: .a. terai adenovhusők gésíerrhdkel, például a mláhnány szerinti adenovuus-nuklelnsavak által kódolt proteinek, enzimek és azok fragmentumai. A találnaány tárgyit; képezik továbbá a találmány .szerinti: wtainov^szekwtaák állal kódolt a?nínosav-szekveociájú. de más eljárással elő10Ó445-ÓÖ2/SG állított PauS, Fané, Fan?, SV1, SV25 és/vagy 5V39 proteáiek, erttom, h es 3zok fragmentumai. Mye® proteinek például 3/ ;. és 2. ábrán beutuürtéíl: ttyitotí olvasási keretek állal kódok orctemek e» azok fragmentumai.
A találmány egy szempontja szerint, z találmtay tárgyát képezik izolált tatas aáenövnnspreteiöek, amelyek lényegében tiszták, azaz más vírus és proteinszera komponensektől mentesek. Előnyösen, ezek a proteinek legalább tört-benhomogének,.előnyösebben őö'ks-ban homogének, és legelőnyösebben 95%~b;m homogének.
A találmány egy előnyös megvalósítási média szerint, a találmány tárgyát képezik izolált majmnemdetS aáertovlsís-kapszidproietrték, A leírás szerimi értelemben, majomeredetü adenovtrus-kapszidproteine® a Pata. Fano Van, Ά 1 S\ 25 es\ug', S\ to k.'P^.'jdp-oíen.ek bármelyikét wcy .rmok fragmentuma: antídniazó tsdenovfrss-kapsztdpFoíeta ériünk, például, de anélkSi, hogy igényünké· a íelsortaakra korlátoznánk, kanéra kapszidproteinekeí, fúziós proteineket, mesterséges úton e kiáll bolt kapszsdprotetatat, szintetikus kapszldprotemeket ás rekomhínáns/kapszidprtnelnekes. tekintet nélkül a proteinek előállításának módjára.
Ennek megfelelően, ezek a majomeredein kapszídproteínek egy vagy több Pnn5, Pata, Part?, SV1, SV25 és/vags Ά te égiót vagy fragmentumot {például hexost peatont, ftbert vagy azok fragaamttumát) Urtataaznak egyéb adenovirtts-szerefentsokból származó kauszidrégiókkal vagy fragmentimrokkat vagy jnodosltott simian adesovtas eredeti, kapszidpr-oíeinckkri vagy fragínesíustokkal kombinálva. A teás szerinti értelemben kapszláproteín megváltozóit trógszísassai asszociált módosításán” módosított kcptedprofeiu (például pentoa-, hexon- vagy Itarprotetafegió vagy Ilyen fragmentum. például f'lborrégjó-gőrabdonfen, vagy a felsoroltakat kódoló poliuuktettdá létrehozását értjük. amelynek specifitása a módosítás következtében megváltozott. A majoraeredsril kapszldoí elbábíthatjak egy vagy több találmány szerinti símian-Ad vagy más, tamást vagy aera barnán eredeté Ad-szeroripasok: alkalmazásával. Ilyen Ad különböző forrásokból szerezhető te például sz: ATCC gy&jtoményébőb kereskedelmi (teásból vagy kutatási intézményekből; vagy az Ad-szokvertera tazzáférheid a Gertitek adalbázttabui vagy más fe«dshek
A lalátaány szerinti statusa adsrtovtaá peníonprötetek wmssav-szskveneíátí esstahuk. Az Adhasdperrtonprottet szekvenciáját. a 2, azemöstíószáte szekvencia tartalmazza. Az AáFss?-peaton szeteeteűsat a ó. azoaosbószáírtá szekvencián adtuk .meg. Az AdPanó-pemon o 10. azonosítószámú, szekvenciáid. Az SY1pato szekvenciája a 25. azenosltószásná szekvencia. Az SA25-penk<npro;ehs szekvenciáját a 30.. azonosítószámú szekvestaa mutatja. Az .Wófepenten a 35. azonosiíószámü szekvenciája. A itatí. pontoaproisefe bármelyike vagy azok fragmentum kiilörtbozö célokra s&almaziíatd. Alkalmazhattuk, például a feliekben és a 2., ó.,
25., 31). és 35. ttzonoriíöszáísó szekvenciákon alkalmazón annnosavszámozáa szerte a pentoo N-termioáiís és/vagy C-tenrtaális végéről körülbelül 50, ΙΟΙ). 150 vagy 200 amíaosav deléeiót íartalmgzó csoskiíoíl tagmentumokaí. Alkalmazhatnak továbbá tövüteb itasd, C-termínális vagy N-lenatafc fragmentumokat, Ezen felöl, a pentortpröíeint szakember szán-ára isméd módon külöshözö célból íuődosíthalfek,.
Ilgyanesak a inláhfehty tárgyát képezi a Pata hexonpretem (3. azonosítószámú szekvenciái, Pata tetőzetei |7, azonosltcszítaú szekvencia], Fan? hexonproteia [11. azonoshószáíte szekvencia],, §VÍhexonprotoía [26. azonosítószámú szekvencia], SA'25-hexonprotein (3.1. azososltőszáte szekvencia: és/vagy SV39-hexö®ptaem |3ö. ;rzouostaszamú szekveaeial amínossv-szefcvettaáía. A fetí 'fetonproteinek bártttayíke vagy azok izolált fragmertama különbőzé célokra alkalmazható. Alkalmazhattuk példátd a lentiekben és a 5, ?., ll.„ 2b., 31. és 36. azonosfeószáms szekvenciákon alkalmazott anttfesavszáatozáS szerta a hexon Nlemnnábs és/vagy í,-terratehs végéről kdrülbeluí 50, lőtt, 150, :2bö, 3ÖÖ, 400 vagy 560 atanosav deléciőt
100445-61 32/SG ίο tartalmazó csonkítod fragniefiímnotóií. Alkalmazhatunk továbbá rövidebb belső, C-tenrna&lis vagy N-termísáks :fragi»entesnoksí, Afatandsatjuk például a bexonp rőtéin burokrégsójásak (áoménjának) D£l és FGl el nevezes&ín.H' j í ’&a arntó. I, pu\v tbil· vcmpt hm eg\A v dóul <· n ej >í< Uízocib otm m
7., 11,, 26„ 30, és 36. szosositőszámú szekvenciákban alkalmazott számozás szerint · körülbelül 125-443., körülbelül 138-441. amhosavau átfedő fragmenrnmok, vagy kisebb fragmentumok, például a 138-163. arassosavakat, körülbelül a 170-176. ammosavakal: körülbelül a 195-203. ammosavakst; körülbelül a 233-264. amlőősavakáí; körülbelül 353-264. smmos&vakat; körülbelül a 287-297. amínosavakat, és körülbelül 404-430. amisósavakat átfedő fragmentumok. Más alkáhw fragmentumok azonosítása, szakember számára ismert. Á hexeoproíeisr szakember számára ismert különböző alkahnszási céloknak megfelelően mőáostífeaíő. Mtveí a. hexonproteia határozza meg sz aáenowus szerötípnsát. ilyen mesterséges hesonproteinek beépítése természetben elő nem forduló mesterséges szerotipusü adenov busókat erefeéayezne. Más mesterséges kspszidproteineket is előállíthatunk a csimpánz Ad-peaiönszekveseiák és/vagy a találmány-szerinti vagy azok fragmentumainak alkalmazásával.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, módosított .hsx&npröbeínl: tartalmazó adenovfrast állítunk elő a találmány szerinti hexor.proíein-ssekv-enciák alkalmsizásával. tiexenproteinek módosítására alkklmazbátő eljárás ismertetését találjuk például a? 5 922 315 számú amerikai egyesüli államokbeli szabadalmi leifásban, amely teljes tejedet méhen a kitamtás részét képezi. Ebben az eljárásbsn az aáenovfes i5.ex.0n legalább egy harokréglőjáí másik adenovíms-szeratípus legalább egy hurokrégiöjával helyettesítjük. .Az Ilyen inödösltott adeoovírus bexonprotelejének legalább egy burokrégiója tehát a találmány szerinti, -majomereáető Aöhöxon-barökrégió (például Pan7>. .A találmány egy előnyös megvalósítást módja szerint, aóP.aá?-hex.otg>mmhi hurokrégiójáí helyettesítjük más sáenovírus-szsrotípus megfelelő hurökregiitjával, A tafelmany egy további előnyös megvalósítási módja szerint, más adenovirus-szerotlpus- megfelelő hnKtkrégsóját helyeáestpük a Pan7hexon buroioóvK tat al Megfelelő adenovirus-szerotipusok; választhatók barnás vagy sem humán szetofípusok közül, pétó'ul az ívme* tettek közül. .A PaaT-hexom esak a szemléltetés kedvéért választattak;: a találmány szerbül egyéb simias Ad-hextmprötemék hasonló módon módosíthatók, vagy alkalssazbatók más .Ad-hexon módosítására. A falábnáísy szerinti megoldásnál a megfelelő szerotipus kivákisztása m koriátosó tényező. A taláisnásy szerinti hexonprotein-szekveneiak további alkalmazási lehetőségei szakember számára nyilvánvalóak,
Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti sinmn. aáenovírssok: Sberproteípjeí. Az .AdíbsnS í'sberproteiísje a 4, azonosítószámú aminosav-szekvenciáid. .Az AdPauő filjesprötainjének am-hösávszekvenciáját 2 8. azonosítószántsi szekveneián rnutáljnk be. Az AdPas? fiberproíeia amínösáv-szekveneiája a
12.. azone»tiosí.ájsú szekvencián látható. Az SV-1 két fíberproteint tartalmaz; a riher-S msttnosav-szekvenojáját a 27. azonosítószámú szekvencia, a líber-l «inosav-azekveneiáját: a 28. azonosítószámú szekvencia mutatja. Az SV-25 szintén két íiberprotemnel rendelkezik; a frher~2 a 32. asötwkószfaü ammossv-szekvendájú. a frben-l a 53 azösoskészámúatnipösav-szekveöciéjé. Az SV-39 fíberprotetnjéoek ammosav-szekvetó^át a 37. azonositoszamu szekvencia stmíaíja.
A ilberprofein vsgy annak izolált fragmentuma különböző célőkraalknííuazható. Alkalmazhatjuk például ;t tlbergömbdómént, mely s 4,,..8,, 12,, 28., 32,, 33. és 37. azonosítószámú szekvenciák körülbelül 247-4-25. amirtösavait fedi át, Lásd 2. árira. .Aikahnaxhstjok példán! a fentiekben és a 4., 8., 12., 28., 32.. 33. és 37. azonositőszámü szekvenciákon alkalmazott: amínosavszamözás szerint 3 fiberprmein N-tenttinábs és vagy Ctemtioálís végéről körülhelid 50, löd, !5ö vagy 2ÖÖ amfemsav deledet tartalmazó csonkított fragsneatuínoknf.
W.Ő445-6I32/SG
Alkalmazhatunk továbbá belső fmgmenmmokat. Ezen felül, a Sbt toro «»«. zu\e«'íber számára ismert módea sriódosúhatfek.
Szintén a találmány tárgyát képezik a trtáiniáay szerinti proteinek legalább 8 sndnosav-.hosszúságú izolált fragmentumai. Kivárt esetben afamazh&iaak azonban más hosszúságú feíjünertrtookai is. Az enrtiíeítekan felül, a .találmány tárgyát Képezik a Pásé, Panő. Fan?, SVi, SV25 és/vagy SV39gértsnnékek slőálhtásrtrtk hatásfokát nevelő és vagy expteswoját fokozó módosítások. példáéi fúziós- molekulák döátbtása, .amelyekben a Pan5. Parti, Fan?. SVI, SV.35 és vagy SV39 géntetmék egésze vagy fragmentuma.{közvetlenül vagy bskerea keresztül) a hatásfokot vagy expressziét fokozó tartós parrterrel feztosáit. További előnyös módosítások példasl, <fe anélkül, hogy rgőnyaaket a felsoroltak··;; korlátoznánk, a kódoló régió (például protein vagy enzan) csonkítása, hogy a pre- vagy pro-protein hasításának szükségességét kikószSbÖljídí, és érett protein vagy enzim keletkezését biztosítsuk; vagy a kódoló régió mutációja, hogy szclsrrtálődó génteméket kapjunk. További módosítások szakember számára ismertek, a találmány tárgyát képezik továbbá a Tané, Fané, Paá7, SVI, SV25 vagy SV39 proteinekkel legalább körülbelül 05~99%-ban azonos profeioek.
á már ismertetettek szériát, a találmány szerinti ádenovlrtís-kapszidpröieíaakfit tartalmazó vektorok át\d n/.sa \ük Ovn elosné- uhi> ·.><. ekbu emum ikuri aíö ellenem ások űrt s< -< gv^'k v >gv más vimsvektorok alkalmazásán alapuló vektorok hatását semfegesheaék. A.taWmásy szérfeít rAá-vefetorok vu onbscn uoojo^n , h; s \ ;to\ s vd, b. ide- a gv-tompias a.kai nazásra, vagy immunválasz: megerősítésére (vakcinatiter emelésére)·
Bizonyos körülmények melleit, előnyös lehet a PanS, Panó, Fan?, SVI, SV25 és/vagy SV39 gértermék (péíáátd kapsrtdprotei© vagy annak ftagmenrttoa) aikaknazása ellenanyagok termelődésének kiváltására. A leírás szerinti érteleidben „el lenanyagcssf> valamely epitóphoz specifikus' módon kötődni képes rtuiKtoglöbuimtruk. v„at enr\ \ tel, »tűn ·,·„!>-/ Jk« ruju enrt F<»n F;r Pv' Ά. ö\ 's e\ -vg\ Ά epitópokhoz körödnek, előnyösen specifikus módon és keresztreaktivitas nélkül, A találmány szerinti ellenanyagok különböző Tornába® létezhetnek, példánk de anélkül, hogy Igényünket a felsoroltakra korfeiozíKoát, nagy atfínitású pölíkloBális ellenanyagokként, mosíoklortdis elleosnyagoklíért, szintetikus eüesanyagökkért, lóméra ellenanyagokként, rekombináns ellenanyagokként vagy hnnunüzalí ellénanyggökkéük Az efaaayagők származhatnak IgG, ígM. Ig.fe. IgO vagy Igii immunglobulin-osztályokból.
Ilyen ellenanyagokat a technika állása szerint Ismert módon ábífbrttmk elő. «faanyagokat elöálliíhatsmk jő? ismert hagyományos technológiákkal.,. például Xofelér és feíltem. áM felírtak szerint, és az általuk ismerteted eljárás számos módosított változatának báóHelyikéxreÍ.:
Hasonlóképp, magas bterú ellenanyag áílitbaló elő az antigénekkel szemben kapott memkíonáiÍs vagy poüklonálls ellenanyagok alapján ismert rekonibíttáns technológiák. ítlkallmazásával (lásd például a FCT/<3B$5/üö392 számú PCT közzétételi iratot; a GB2188638A számú Angol szabadalmi beielentést; Amit és «sásai.: Science 233, 747 (1986): Qneen és mtsal.:: Froc. Matt .Teád. Sei. (IJSA> 8Ő, 1ŐÖ29 (1989 i; a FCT/WOdöO/höl számú PCT közzétételi iratot; Riechntannés másak: Natee 333, 323 (1988); Huse és tntsai.: Science 24ő, I2?5 (I988á)l. További lehetőség szerint sz elfeasnyagökst előállíthatjuk a találmány szerinti antigén ellesi állsti vagy humán ellenanyagok•.'kompfemeatentást meghatározó régióinak módosításával. Lásd Mark és Pád, n Jfenssnizatíon of Monnelömd Artibodfes”, 4. fejezek „The Haxtdbook of Experimental Pharmacolögy' 113, The Fhaarmaeology of Moseefesal Astibodies, Springer-Verlag (1994); Harlovv és tntsai.: .Xfertg Attttbodles;: A LábmWry MmtsáF,. Coiá Sprtog Harbor Laboratory Press. NY (1999); Marlow és :100445-61:.32/50 mtsaí.vAnubodies: A Labot?aíoiv Massal·’, Cold Sprhtg Harbor Labcantory Press, Ne® York (1989); Houstoo és mísat; Froc. Matt Acad. Seb (USA) 85, 5879 11.988): valamístt Btrd és rutsai,: 'Sctoaee 242. 423 (1988). A találmány tárgyát képezik továbbá anti-tdlotipás ellentmvsg&k (Afe2) és sub-anti-idiotipus ellenanyagok (Ab3). lásd például Wetiendoríi' M. és mtsai.:: „Modnlatlcn of sníi-hunör smíauniry by aml-idlotypic amibodies”, .dÖlotypfe Network arf Ikseasesfe szerte.; Cetay J. és Hieniaox J„ J. Ara. Söe, MierobiöL Washington IX? 203 <1996). Ezeket az ami-idiötiptis ebeaaayagokat és aoti-auh-idlosipus ellenanyagokat szakember számára ómért eljárásokkal állíthatjuk elő. Az ellenanyagok különböző célra alkalmazhatóak, például diagnosztikus és klinikai eljárásokban és késKlefekóen.
Bizsuyos körülmények melleit előnyös lehet, ha kimutatható jelölés· vagy címkét adunk a PasS. Faso, Fa»?, SVA SV25 és/vagy SV39 génsermékhez, ellenanyaghoz vagy sás találmány szerinti konstrukcióhoz. .A lelrás szerinti értelemben khnutafhafe jelölésen olyan molekylát értünk, amely egymagában vagy másik molekuIával kölcsönhatásba lépve képes felmutatható szignált generálni. Legelőnyösebben, a jelölés viználúsn detektálható, például riuoreszeencia alapján. példán; mmtutíinszíokétmai analízisekben vagy immosfluoreszeens n s es -ops .-,-j A'bL'^t vafe' hat. •midé, f „ ,->?<., π ιζ.» o<.,uu* t KA ρη^καη.! ;ΡΓ$ allophyeoelamn (APC), eoriphesplhn-0 (GFO) vagy tandem festékek, PE-ciamn-5 (FC5) vagy Tex&s-Red (ÉGD). Az említett Enoreszcens: festékek a kereskedelemben hozzáférhetőek, és alkalmazások a teclmika. állása szerint ismert. További jelölések például kolioiéáhs arany. Jelölésként alkmhnazhahmk még raíköátóv vegyülőteket vagy elemeket. Jelölésként alkaimazhatauk feölönböáő euzlmrenfeZerekeí, amelyek kolorirnetrtás úton detektálható szignál keletkezéséhez vezetnek a vizsgálatban; a glukóz: oxidáz: például (amely glukózként sztibsztrátoí használ) tormákként jmroxidot szabadit Ibi, amely peroxidáz: és bldrogéndonor, például tetramefilheuzidin ITMB) jelenlétében kék szinti étidéit ΊΜΒ keletkezéséhez vezet. Alkalmazható továbbá torntaperoxldáz (DBF)' vagy afelikás feszfetáz <AP), és hexokináz glükóz-ó-foszfát tfehidrogenázzs;|: együtt, amely ATF-vel, glükózzal és ΜΑΙΑ-dal \p reakv oNt, más termékek mellett 340 ntn uuilátnhosszon inért .ab^>fhwta»?mo8ítoittos:^a^'áató»títodutó S \PH keletkezéséhez vezetve.
A. taláhsány szerinti eljárásokban aktt raztntö további jtdölőrendszerek más tnódoa öetektálhatók, alfcahnazhainuk például szúrna latex mikrmes széket (Baags Laiboratories, Indiasa), amelyben enzimek helyett beépített festéket alkalmazunk, hogy a eél.Yvkszuctakkal kosjsgfeumot képezve, megfelelő tesztrendszerekben a komplex jelenlétére utaló, vizuális úton detektálható szignált kapjunk.
A jdötőanysg kívánt molekulához: történő kapcsolására vagy azzal történő asszodálására alkalmazható eljárássá szakember számára ismertek, Jelölőanyagm hozzákapcsolhatunk az alább IsmerfelAt eljárásokkal: „Handbeok of Flsorescent peches and Resssreb Chemicals”, 6. kiadás, xzerk,: Hanugland R.F.M., Moleeulsr Frobes, Inc., lengene, OR GANeL Fíeeee Catalog aad Bandkimk, Life Science and Analytlcai Beseamh Froducts, Pierce Chemical Company, Rockford. 11- i 199a |995). A jelöiöanyag kiválasztása ás az összekapcsoló eharus a tál ti n írv v„ nft megoldás s/emum ( .thói nem koriatozo tenvezó
A találmány szerinti szekvenciák, proteinek és azok fragmentuma; bármely alkalmas eljárással előállithatok. például rekonrbmáns technológiákkal, kéatiaí sziotézis-íechnológiákkak vagy más szmfetikús eljáoíssaL \fe ttcfelo .'ha-rsok szakemde-s/d tt sa Ό huivrtek 1 ásd pcafeul bamhroos es- mttm .Ahrieeular Clorrng Lahoratóry Marsnál”, Coíd Spring Harbor Press {Coki Spring Harbor, NY). Feptldeket szintetizálhatunk szdáM fázisú szintczistcchnológiákkal [lásd például MvtrBiekl·. .1. Am. Chem. Soc. SS, 2149(1902): Stervarí és Yo;mg: Soiid Phase Peptide Syfeesis (Freeman, San Franetsee) 27-62. oldal. (19Ö9)]. .Ezek, és egyéb hasonló eljárások ;OÖ44:S-Ö)o2/SG szakember simára ismeriek, és s találmány szerinti megoldás szempo®tsáfeöl nem. korlámzőak.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a talólmáuy szerinti Ad-sasátwndák könnyen ndapiálhatőlc különböző yfeáíts és aem-viráhs veJdstrradszerekhez terápiás és ttnmunogea molekulák őt vkre, .«se vív© vagy h? vivő szállítására. Például a -alálmáns egy előnyös megvalósítási módja szériái, a simlan Ad-kapszidpioteíneket és a leíráshajs ismerteted: egyéb siskán adenovtrus proteineket nem-virálús protein alapít szállítórendszerekben alkalmazzuk: gének, proteinek és más diagnosztikus, terápiás és ímrnunogén molekulák szállítására. A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti proteint közvetlenül vagy közvetett módon, & vírust adenovírus-receplor· hordozó sejtekhez irányító molekulákhoz kapcsoljak.
Előnyösen, a eélbajottáíó molekulaként sejtfelszíni receptor számára Ugandámat tartálmazö fcapszsrfproteiní, például hexánt, pontont, ithort vagy azok íragnterdumát válaszrurk Azokat előnyösen s festi ismertetett terápiás 'molekulák és ááok génísrinéfeirtek szállítására alkalmazzuk. Kapcsoló régióként í'líiikerként} Hpldefcet, polyLys-Uken és hasonlókat alkalmazhatunk. Ilyen célra alkalmazhatjuk példáéi a sírnia» peafenprateím oly módon, hogy a majomeredetö pemonszekvencia alkalmazásával, Medma-Kamve IX. és mmskatársaí által .Ismertetettek szerint fúziós proteint állítunk eíó [Medina Kauoe I.K. és mtsat,; Gone User. ót 1 C\ 'Vf (30öl}: Medina Kauwe ÍX. és mtsai.: Gene Ther. 8110). 1753 (2001}]. Vektorokat célzottan sej belszínt mccptotvkhoz trányíteunk a sdntian AdlX-ptotem amhx^av-szdrvenciájáuak alkalmazásával is, a 2Öől ÖÖ47Ö81 szarná amerikai egyesült államokbelii «zahadalrm Icú.s.'.b'i.t· ismertetetlek szerint, A irgandatú szerepét betöltheti CMih&ntigén. egy R6D- vagy txdiliztn-tartalnstt szekvencia. és hasonlók, ilyen és hasonló célokra alkalmazhatunk egyéb simían Ari-ptoíeineket ·.», például Isexenproteint ésA'agy fiherprotemt
A találmány szerimi egyéb adenovírus-protcísek ís alkalmazhatok egytagúkban vagy más aáenov'irasproíeinekkel kombihálva szakember szamára ismert különböze célokra. A találmány szerinti adenövirnsproíeínek további alkalmazási lehetőségei szakember számára nyilvánvalóak.
B_^^^^te^feo3.ÍrtiS_v?klöh?.k ' iáin raov s/.nna -.esz tueve*. Uáua.s pdoaul ^khzo nmebck t,epev.t neXrókg mvkkukk c juttatására sejtekhez terápiás vagy vakcinázási célból. A leírás szerinti esteiemben vektoron genetikai elemet értünk, például, de anélkül. hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, csupasz DNS-t, tagot, transzpezooí, taaűdöt, epíszörnál, pteaídot vagy vírust, Ilyen vektorok Paso, Fartő, Psm7, SV1. SV25 és/vagy SV39 .ónban nderíövjíus ÖN'S-t és mimgéní tartalmaznak. A leírás szerinti értelemben „mraigénen a választott heteroióg. gén és a. géntermék gazdasejtekben történő transzlációjának, transzkrípdójásak és/vagy expressziójának trártysíásás\>' szükséges m\s -zababe/o elemek koxrh’-u.nojj* crtfuk
Tipikusan, a taiálntimy szerinti adenoMo^vektert r.gy iene-zuk meg,, hogy a mínígén a választott adenovirusgén vonatkozásában natív légióban egy eb udenosmis-szektencahsat is iaöahsasó uakieiswmolekulában legyen jelen. Kíván· esetben, a mnigént ,n»zertú'hat{uk egv tn.d' létező génrágíőba ógy, itngy az adott régió működését megszakítjuk. Más eljárás szerint, a n-mecm ms?lenesen vagy teljesen deleiáít sdettevirusgén helyére mszertálíuk. Λ mmígóa többől, kozott gien lehet lunkeOuaksan deietált El vagy íhnkcionálisan deletált E3 helyén. /k leuás szerinti értelemben „fűnkétetuhsan deletált kifejezésen azt értjük,, hogy a génrégió elegendő mennyiségét távolítottak el vagy károsítottuk más módon -- például mstáeióval vagy módoshással - ahhoz, hogy az többé ne legyen kqx^ a génexpressziö fhnkcionáhs: termékeit: előállítani. Kívánt esetben, a teljes génrégsót eiíávoisthatjuk. Gémnegszakitásra vagy detetáfesra alkalmas helyeket a leírás ntár részeiben tárgyalunk.
! 00445-6132/SG
Rekembmáns vteok. előállítására alkalmas; vektort léfeehozhstnnk például ágy, hogy a mkúgést azatfeaov&us genom S’-végére, S-végre, vagy anaak maá az 5’~, mind F-végére mszertáljuk. Az adsnövires genoxn 5'-vége a becsomagoiódáshpz és .repiikátáéhsre szükséges 5’-cisz elemeket íartataz;' azas .az T invertált; ístnétlódő egység íiTR) szekveassá&at (mdyefc repllkáeíós origóként; Ibnkeiossátnak), a natív 5’ becsomagoló dométtt (amely a lineáris Ad-genorn kapszidba történő osomsgslőíláséhoz rséiht'ilözheíeilon szekvenciákat és az EI~pi'ömőter eítítsntszer eleméit tartalmazza). Az adenövtros genomT-vege a.becsomgolödás&oz és kapsztdd&l történő kmubmálődáshöz szükséges 3’-ehcz elemeket tartalmas (ezen belül az ÍTR-eket). EÍÓnyősea, a. rekemhínsus sdbnövínts 5’- és 3’ iufatsvirus elsz-etemelígí, és. az 5’~ és 3' adenovims-szekvenciák közt. mbúgém tartalmaz, A mlálmáay szerbül adesovlmsvektar további sósrmvi?os--szek veneiákat is tartalmazhat
Előnyösen, a találutáíty szerinri admovkusvsta egy vagy több, a találmány szennti adenovírus genomból szártsuzó aoesovlrus elemei tartalmaz,. A találmány egy előnyős mégvulörítási módja szerint, a tektowk PanS, Panő, Pari?, RVE SV2S vagy SV39 adenoviresokbol származó ITR-szekvenciákat és egy .utazott adettovlrus-szertítípusbél száratszó egyéb adeartvíius-szákveoeiákai tartalmaznak. A találmány egy tovább; előnyős megvalósítási módja szeriül, a vektorok az ITlGszekveociákut szolgáltató ndenovartts-szeretípuslól éltére adeisovlrus-szsrolípusből származó adsnevírtis-szekvemóákai tartaltaazmk, Adeoovtnts-pszeudetípusnak olyas sdmovfesst oevezösA, amely más uáeretvlrínoszertüípusirel származó ktwszidpreteinr tartalmaz,, rinát amilyen szerollgnsbél az rfR-szekvemóák szárnntsaak. Az ITR-t szolgáltató szerotipus kiválasztása és a vektorban található egyéb adenovbus-szekvenciák szeroőpnsa a /találmány szériád megoldás; szempontjából nem kos , <. (. \ MA 1 V - s m ! pA J jv/dk st r· s>_>ru>.'s >ο^;·ί!θΛ..;Όΐ \ ^’υ.χ\',π.ιν^Άν hozzáférhető, vagy ilyenek beszerezhetők, kereskedelemből vagy tudományos; kutatást végző intézetekből. Ezen felül, számos Ilyen tőr®? szekvenciája h&zzaR'rheíö különböző adatbázisokból,: például a IhsbMed es GettBask adatbázisából. Más majom vagy bntnán ;sá«novfeusokhöí elöálikotí homológ adorsovlraa-v-ektorek leirasa megtalálható a szakirodalomban flásd; például az 5 24Ö346 számé autós-lkai egyesült államokbeli szabadalmi leírást j. Számos adetmvfensMpss Ori'S-szekveneíája hazzáisrisetS a. GenRaak adatbázisából ilyenek példáid az AdS (GenBank nyilvántartási; szám: No. M7326bj. Az; adesovfessok-szekveaeíák szánttazhaüsak bármely ismert szeroiipusbóL például a 2„, 3., 4,, 7,, 12. és 4Ö. stzeroíigusokből, vagy bármely újabban azotsosuod. humán s/eroofdsbóh A találmány szerinti vektorkonsírabelőkban álkalmazhamnk nem Inasán állatokat (például, majt ttokat} fertőző ádenovírnsokat is.. Lásd példán! a ő ÖS3 7ló számé amerikai egyesült államokbeli szabadalmi k'trtsA
A találmány szerinií vektorok előállítására leihasznélí vtrusszekveseíákat, halper vírusokat - amennyiben ezekre. szükség van -, rekombináns vóosreszeeskéket, és a konstrukciókba!?, ailíalmazoá egyéb vektorkomponenseket és szekvenciákat a leírásban ismertetjük,, és azokat a fentiekben leírtak szerint kaphatjuk meg. A találmány szerinti Pan5, Báné, Pao?, SV), SV2.5 és/vagy SV39 simian adeneviras-szekvenciák DNS· szekvenciáiéi alkalmazhatjuk ilyen vektorrendszerekben tdkahsazható vektorok és sejtvonalak előállítására,
A találmány szerinti vektorokban alkalmazert nuklehtsav-szekvenoiákba-t módosításokat, például szekveneia-deléclőkaí, -inszeresókafc es más mniáeléktu ismert molekuláris biológiai technológiákkal hozhatunk létre, és azok szintén a találstány tárgykörébe tartoznak,
A..A.^riégá£
A transzgéa kiválasztására, a „nrinigétÁ klónozására és előállítására, valamint annak a vlrusvektorba.tőrtétül inszertálására alkalmazott eljárások a kitanítás alapján szakember számára ismertek.
>00445-6:3 ASG
Ι:.Α transzgés
A tmaszgén az azt határoló vcktorszekveueíákhoz képest .hetoxológ, a kívánt poiípepttáeí, proteáit, vágy más tenaőket kódoló nukkmsv-sz^rvescfe. A «nktóasav kódoló szsfcmciát flmkciesális módos szabályozó elemekkel kapcsoljuk Össze úgy, hogy azok lehetővé tegyék a transzgén átiródását, sanszlálódását és/vagy expresszáiódását a gazdasejtekben.
A transígfe-szskvmcíz összetétele adől függ, kegy a kapod vetett milyen célra kívánjuk Tasználak Tmrsszgéu-szskvehcia lehet például ripörterázekvenete, antelynök exptéssziöju detektálható szignál keletkezéséhez vezet, ilyen riponerszskvestásk poklául, deanélktŐ, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk. a következők: P-kktamaz, 3 g.ikktoz'.daz íLocZk alkalikus foszfatáz, nmidsn kiaáz, zöld fluoreszcens protein (GÉP), klörsmlenikoi acctUtrar^ztoaz (í AQ, laekeráz, jneuéaáohoz: kötöd proteinek, például CD2, CD4, CDS, az feíluenza hoeaaagglwisiö protein. és a techmka állasa swxuí issnert egyéb gének, amelyekkel szemben nagy sfíloliásó ellenanyagok állnak rendelkezések® vagy állíthatók elő szokásos eljárásokkal; valamint membránhoz kötött proteineket antigéncimke domeahoz, például haemsgglufkinböi vagy Mye-ből származó ilyen: démonhoz íuziouálun tartalmazó fúziós proteinek. Ezek a kódoló szekvenciák, expresszlójúkat trányitő szabályozó elemekkel kapesoltaa, ssokúsos: módors, például enzímattkus, radolográílás, kolerimeíriás, fluoreszcens vagy más spektogtáőás eljárással; fluoreszcens aktívak sejtoszíályozóval, iínmatsológtai ellátásokkal, például enzimes tsmtranoxzorhens vizsgálattal í ELlSAj, radiuímmun s iZs-gálaí-ai i RÍ A) vagy iínmunhisztokéjniZí el;,.rásokkal detektálható szignálok, keletkezéséhez vezetnek. Amennyiben például ruazkerszéfcvesehkésí laeZ-gest alkalmazunk, a szignált generáló vektor jelenlétét a béta-palaktoztdáz aktivitás alapját! mutathatjuk ki. Amenynylbeu a tr&nszgén GÉP vagy Ineiferáz. a szignál keletkezéséhez tezető szekvenciát hordozó vektort vizuális: úton, szinreakció, vagy fényjelenség alapján, inminonfétenei mutathatjuk ki,
A transzgén azonban előnyösen nem markor szekvencia, amely biológiai vagy orvosi jelentőségű terméke!, például proteineket, peptideket. RNS-t, enzimeket vagy katalitikus RRS-ekei kódol. Előnyösen, az ENSmolekula tfiNS, dsRNS, ríboszomálls RNS, katalitikus RNS vagy -anflszeosx RNS, A találmány egy eiösyös megvalósítási módja szerint, az RNS-ssekveocia a kezek, állatbau egy célzott atddeinssv-szekvetxda eípress/Kuái ktoho szökvén.ia.
Λ tnoszgent adsHrnazhaijuk terápiás: célra, például genetikai de&leucíák kezelésére, iumoríeráptára vagy tumor ellem vaké mázasra, immunválasz- kiváltására, ésteagy proitfakbkus vaké mázasra. A leírás szerinti értelemben immunválasz- kiváltásán a molekula {például hústermék) azon tulajdoaságát értjük, hogy képes az. adott molekulával szemben T-sejtes és-'vagy humorális Immunválaszt kiváltani. Szintén s találmány tárgyát: képezt több transzgén alkalmazása, például töbfe alegységből felépülő proteinnel kapcsolatos· resdelleuesség helyre-állítására vagy enyhítésére. Bizonyos sörülnteuyek mellett, különböze transzgéneket alkalmazhatunk a protein egyes alegységeinek vagy peptldjmek kódolására. Ekkor előnyös, ha .a proteinalegységeí kódoló: DNS mérete nagy, például immunglobulinok, vérlemezke eredetű növekedési faktor, vagy diszPóíta protein esetében. Ahhoz, hogy a sejt termelje a több alegységből álló proteint, azt. a különböző alegységeket kódoló rekombmáns vírussal fenőzzSk. Más lehetőség szerinti a protein külöitbőzö alegységeit azonos íranszgéu kődrdhatia 1 hoc® az: esetben, egyetlen ttanszgén hordozza az egyes alegységeket kódoló DNS-eket, és szók belső ttboztm fölismerő helyek, (..róteroud ?yytepi®e ezí.w ,ό.Ο'.Ά: 1RES) által vannak elválasztva. Ez a megoldás előnyös, ha az egyes alegységeket kódoló DNS mérete kicsi,, például az alegységet és IRE5-; kódoló) DNS mérete összeses kisebb mint: 5 kilobázis. IRES-szekveneiák helyett, a DRS-eket 2A-peptiőet kódol<á szekvenciákkal is elválaszt?
100445-6132. SG hatjuk egyórástól. amely a transzlációt kővetően önmagát hasíijs. Lásd például Donnelly MA és mísai.: 1. öen. Virul. 2S( 1 s, 13 (1997); Furler S. és tntsal: Geue Thsr.- 8(11), 864 (2(X)i); Klursp El. és írásai,.; Gene Ther. 8(11). 811 (2001), Ez a 2A-peptid lényegesen kisebb, mint az IR.ES, amely alkalmazását teföaosea etonv‘v,se teszi akkor, ha a tvndeRezesre álló heh korlátod tényező.
•\ v álaszictt transzgén bármely biológiailag: aktív terméket vagy más íertuéket is kódolhat, példáid olyan
Megfelelő uanszgor sk kiválasztass szakember szárasra nem jelent gondot, A danszgéíi kiválasztása a találmány szerinti« goldas szempontjából nem korlátozó fekte.
A tnioígén fent ismertetett io koinpongfisein felől, a vektor a transzgérmei funkcionálisan kapcsoltan szokásos szabályozó elemeket Is tartalmaz, atnelyek jelenléte lehetővé tesz) a teszgén transzkripcióját. transzlációját és/vagy expressxiójáí: a találmány szerinti plazmidvektorrsl írasszlektáh: vagy vírussal fertőzött sejtekben. Akkor uiondjyk, hogy szekvenciák „fenkssonábsan kapcsoltak5’, ha az expresszit szabályozó szekvenciák az adott génnel felymnatössfc, vagy hatásukat transz módon kifejtve, vagy bizonyos távolságból irányítják a kívánt gén expresszióját.
Expressziöt szabályozó szekvenciák példáid megfelelő transzkripciós kezdő vek véne iák, termisóriós helyek, pröKtóferek, eohanssev-szekvengíák:; hatékony RNS-érésl szekvenciák, például összeül htódási és polisdenilezódóst IpolyAj szignálok;.a cifeplasaua fefeS-t stabilizáló szignálok; transzláció hatékonyságát növeld szignálok «száz Kozák konszenzus szekvenciák); a protein stabilitását fokozó szekvenciák; valamint - kívánt esetben - a kódolt tennék szekretálódását fokozó szignálok. Expressziül: szabályozó szekvenciák a technika állása szerint nagy szánrhíts ismertek, például natív, kouslkuuv, isnlnkáíhasö és/vagy «zövetspecíllkus profséterek, és azok bármelyikéi slkahnazfiafiuk ismert konstitutív promőterek példáid, de asé&st hogy Igényünket a felsoroltakra korlátoznánk. & retrovlrus eredetű Kous-szarkoma víxas: (RSV) LTR-prombter (adoö esetben RNS-eubanszeíTel együtt), a Citoniegalorirus (CMV) promóter (adott esetben a. CMV-erfeanszerrel együtt) [lásd például Boshsirt és mtsak; Coli 41. 521 (198:5)), az SVdö-prnmöter, a dibidrofeíát reduktáz gronróíer, a β-aktin promóter, a fezfesglieerol ktnáz t EGK) promóter, és az EE1et-promöter [fuvhrogenj.
indukálható-.pramötek alkalmazása lehetővé teszt .a géne.xpresszió .szabályozását ősegén úton hozzáadod kompöíssnsek hozzáadásával; környezeti faktorok, például hó-nérséklet módosításával: vagy meghatározóit feiolögial áikipofhsm, például akut fázis; a sejt. adott differenciálódási iazisában; vagy csak. replikáiddá sejtekben. Indukálható promóferek és ifidukálható rendszerek a kereskedelemben különböző forrásokból hozzáférhetőek, például, de afiélkhk hogy igényijüket.a fefeómltakra korlátoznánk, az Invtfrogen, Clontech, és Áriad, cégektől. Száram egyéb rendszer ismert, és alkalmazható szakember számára ismert modort. ludukálbaté pramóterek példán! a cink által indukált birka aíetalleíkionine (MT) promóler és a dexamethasoa (Dos) által Indukák egér emlőtumor vírus (MMTV) promptét, További htdukáihátö rendszerek a. T~ pohmeráz promóter rendszer [Lásd WO 98/10 088 számú nemzetközi közzététel! irat], sz sedysons ravsípronxoter [No és misah; Proc. Natl. Acad. Sri. (USA) 93. 3346 (ifeló!: a tetrarikimnel. repmsszállxaiö rendszer (Gossen és ndsai,: Frac. Natl. Acad. Sci. (USA) 89. 5547 (1992); s tetmcikiinnel indukálható rendszer (Gosseu; Science 208, !7á! íl995)j; valamint llarvey és mtsai.: Cucr. üpín. Chcut. Bioi. 2, 512 (1998)], További ilyen rendszerek az FKSOö-diraer, VPlö vagy póö, amely castradlol. dl- diphenoí-rau.^fejette alkaltnazásán. alapul, az E.U48Ö100445-6132/SG utdukátaö rendszer [Wsns és sasai.:: Nat. Biotech, .1.5, 239 (19271; valamint Wsssg és mtsai.: Gene Tfesr. 4, 432 (1997)), és a tg^rnycia-indukálbató rendszer (Magari és mtsai.; 5, Cím. luvest HXh 2865 (I 997}]. Egyes isdnkálható promóterek hatékonysága az idő függvényében rö. Ilyen esetekben, a műszer hatékonyságot fokozhatjuk, &a több represszoB msséríálank tandem elrendezésben. például TetR-szefcv«sciát IRBS-en keresztül TetR-szekvcnciához kapcsolva. További lehetőség szerint, legalább 3 napot várunk a hívást foskeiö tesztelését megelőzőéit, A kívánt protein express2ióját ismert eljárásokkal fokozhatjuk a rendszer hatékonyságántsk: növelésének példán;, a Woodchoek Hepatitis Vírus poszttranszkripciós szabályozó etem (WPRE.) alkalmazásával.
A találmány egy további előnyös megvalősitásl módja szerbi, a trttstszgén nstiv promöístéí aWmamk. A natív promóter alkalmazása előnyös. ha a íranszgén exptessziólának níártozoia kell a natív gén expressziójáí. A natív prontőtert alkalmazzuk, amennyiben a. mmszgén expressziólát időben korlátozottan, fejlődési szakasszal összefüggésben. szővetspeeiítkus Riódon, vagy specifikus, trasszkxipetől indukáló shmsfossítl szabályozol kívánjuk. A találmány egy további előnyős meg valósítási módja szerint, tnás natív expressztes szabályozó elemeket, például euhanszer elemeket, pohadeníloződésí szignálokat, vagy Kozák konszenzns szekvenciákat altodmázhatunk a nanv ?\prt\-<zió uján/axtra
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a transzként fonkctoonhsan .szöveíspecilikns promótorhes kapcsoljuk. Amennyiben például a traoszgésh vázizomban kívánjuk oxpresszáltalm, izomban aktív proíHótert alkalmazunk. ilyen preatóter például a. vázizotn d-akti«, «tón kőnoyütáuc 2A, distrophya, team kreadu khfex gének proutetofei, valamim, a íerefeszeíben előforduló protsőferetotél nagyobb aktivitású szlnsetikus izom prowto-ereh lasi ti és mtsai.: Nat Biotech. 1.7, 241 (1999)). Szövetspecifíkus promóterek ismének például májban történő express2áltatásra [albumán, Miyatake és mtvai.: Virul. 21, 51.24 (1997): Hepatitis B vírus „core grometer, Sasdig és mísak: Geue Tlrer., 3, 10Ó2 ( 1496); g{fo foteproteiu (AlFk .Arbudmot és mtsai,; Hw. €*eae 'ffeer. 7, íSí)3 (1996); osont oszteokafem, Stem es mtsai.: Moí/öiol. Rop. 24, 185 (1997), osont sztetekalcm. -Cbon és nrisai.:: X Boné Miner R.es. 1:1, 654 ξ, Hteótj; ismfeKttákban történő expresszáltetásta [Cöz, Haosal és iutsaí.: 5. Immunoi. .1.61., W63 (1998); immunglobulin nchézlánc; T-sej; rsceptoríánc]; neuronokbán történő exprosszáltatasra, példás! ueuros-speeífikus eooiáz (NSbt promoter (Andersen és mtsai.: Coll Mól. Nesrobiol. .1.3, 503 (1993)1; asurolilsmeotom könuyülánc gén [Bteeloi; és mtsai.: Proe. Mail, Aead. Sci.
ί V 8$ 5611 (1991)]- és ameareííspeaiiíkös vgf-gén promósere IFieeioii és masai.; Neuron 15.37.3 (1995)1.
Adott: esetben, terápiás óéba alkalmazható vagy mamursogén terméket kódoló íranszgfou hordozó vektorok szelektálható· markereket vagy dportergérteket is tartalmazhatnak, amelyek geneticnt-, fodrosáéin- vagy puriurycis-rezisztesctát: kódoló szekvenciákat foglalhatnak magukba®. Rzoka szdektálfouó riporíergének vagy msirkorgések (amelyek előnyösen a vinssfoszeeskéhe: csomagolandó vdrasgenomos ktvhl helyezkedünk «1), például ampteilíin-rezlsztettefo alapján jetezhetlk S plazmád jelenteiét a bakteriális sejtekben. A vektor egyéb kompöitesskéíú retrlskációs origót íattuimazhat. Ilyen és egyéb promó-erek és vektoretemek kn átesztása szakember szamára sem jelem nehézséget, e-s iheo szekvenciák rendelteveste aílsak [lásd például Sambrook cs mtsaf: és abban idézed blvatkozásofel,
Ezeket a vektorok;?,: a találmány szentai eljárások és szekvenciák és szakember számára ismert eljárások kombinációjának alkalmazásával állítjuk elő. Ilyen technológiák például a szokásos eDMS-klönozási eljárások, példán! Sambrook és misül. kézikönyv eben ismertetett eljárások foMoleeaiar Cteuíng, A laboratoiy Marnak', Coki Sptiog Harbor Press, Coki Spring Harbor. NY), az adenovírus genomok átfedő oilgosnkleölidszekveuciáinak sfalímszása, ppliutefoz-lánereakció, vagy bármely alkalmas eljárás, amely a, kívánt:stukleotíd1ŐŐ445-6152 SG szekvenciát erefenenysz,.
A teláhsásy egy előnyös megvalósítási módja szerint. a súnian adenoviros szekvenciákat tarisiíszző plazmidot (vagy más vektort) alkalmazunk rekombináns adettovíros-részecskék előállítására. A. találmány egy előnyős sr^''\.<ix -> tso trodja αγ 't o -ekettbíssan- ,den< < erokx hí/H; ·. sg'· tlb „tnekei m 'Lt-ma^sa' xieUu >í. adott x.·>?.><:' «zakbtn ) <n »teuo\et pc d ,td 'src'-cket - etv>?t\ n.uunLt rag-, dómokat létrehozunk. A találmány egy további előnyös «-egvalósitási módja szerint, az £la és/vagy Eib-régáők megtartása előnyös (ebet a -rekonsbínáns adettovirusokban. Intakt El-régió jelen lehet annak eredeti helyén az sdewwíis gesOTsban, vagy azt áíhelyezhe^k & -natív adesovirus- getmm deletáh régiójába (például annak E3régiójábts).
Gének humán (vagy más emlős) sejtekhez történd eljuttatására alkalmas stmían adenoviros vektorok létrehozása során adenoviros nukleinsav-szekvencták széles skáláját aik;dms.zb.aij:!.k a vektorokban. Például, az £3 elnevezésit adenoviros késleltetett korai gát) egészét vagy részét deietálhatjuk a rekoniblnáns vírus részét képező sutban.adénovlrus-szekvenciábof. A ntajomeredető E3-gén a rekombináns vs'rosrészeeske ftmkeióképesscge és töriuokOose ;-/eínposí-jábóí lényegtelen. A sisnian adenoviros vektorokat előáll írhatunk úgy is. hogy az: E4-gén legalább ORfo-régióját deietáljuk, és előnyösebben, a fenti régió funkciójának redundanciája miatt, a teljes E4régsót «Metéljük. A találmány szentül továbbs vektor az E2& késlelteteti komi génben hordoz deléciót. öeléeiőkat a.sanía» adenoviros gettóm L1-L5 késői génjeinek bármelyikében is létrehozhatunk. Hasonlóképp, a IX'és IVa2 intermedier géneké- is deletálhatjnk hasonló célból. További deléciokal hozhatunk létre egyéb stnácturáiis vagy sem sintkturális adenovirosgenekben. A lenti deléciökat alkalmazhatjuk kólós-kűlon, .ahol a találmány szerinti adenoviros-szekvencia csak egyeben régióban tartalmaz delédor. További lehetőség szerint, teljes géneket iielelábuk, vagy azoknak a biológiai aktivitás megszüntetéséhez elegendő részeit deletábuk valamilyen kombinációban. A vektorban az: adenovlros-szekveseia deléciót hordozhat például az El. -gének ben, és az E4genbeís·: vagy az El-, E2a- és E3- génekben; vagy az El- és E3- génekben; vagy az El-. E2a- és E4- génekben, az E3-géa deléciójával tan&idálva vagy anélkül, stb. A lentiekben már említettek szerűn, 3íven deléciók más mutációkkal, például höu-érsékiet-^zetsztttv mutációkkal kombinálva is alkalmazhatók a kívánt eredmény elérésére.
Az esszenciális adenevíros-szekveimlákfcaa (például El a. >- io. E2,i. >;?h, í 1 ORVA, El. 1,2, 1.3, E4 és I..S) defckíiv adenovírusvoktorok a táros tnfckuvitásáhez. es a; adenoviros-iós/cc'-kék szaporodásához szükséges hiányzó ademmlros-géntertstekek jelenlétében tenyészthetek 1 /eket 3 og-to (hetper> teakeiókot ágy szolgáltathatjuk, hogy az adesovsáusvektott egy vagy több helper xvnxtrakcio tpeloául plaztmd vagy vírus) jelestiétében ienvésztjök, vagy azokat szolgáltathatja a beasomagoie sejivonsi. Lásd például a. WO 36/13 397 szásnú nemzetközi közzétételi Írathass isssserteteh:, „tnaútnális” humás Ad-vekíor előállítására alkalmazott eljfcísökaí (közzététel napja; 1996, atájus iLrautdy teljes: íerjodehsébes a ktdstsissis részét képezi),
1, Helper vírusok
A minigént hordozó vir-n.vektorok majom íídoísomrosgési-lsrtahssatől függően, helper adestovírosrs vagy :ndsa. rephkálődó vkusfragmentumra lehet szükség ahhoz, hogy elegendő majom .afetovfeus gétsszekvessesa legyen jelen a usistmesu tartalmazó, infektív rekotofeioáas virssreszeeskék termelődéséhez. A helpetvírosok az ade3söv3rus--vekíette>os.trakciőbí'>i hiányzó és/vagy :a vektorral írasszfektálí becsomagoló sejtvonal által aenx espresszálí odesovÍRts-géitszekvouciákas: tamlwzoak, A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, s
106445-6132/80
-*5^
Itelpervims repllkáeló-deficjens. és a fenti szekvenciákon leiül különböző adeno vírusgén eket tartalmaz; ilyes helpcrvírusokéi előnyösen £ I -expresszáló sejtvönuíakkal kombmáeióhsa alkalmazunk.
iteipervirnsok poli-katioríos kotyugtosat^tet is: eiöáliítbatek: például Wt; és «mali. ától ísmsrieteíiek chur 264 1ov$s «vb teher te I > Wki 'Μ 3ίλΚη J 2te tb'tej A
Mpervíim adott esetkört egy második riporter rusnigént is tartalmaz. A technika állása szerint számos dyea riportergén: ismert. A az adettsvíras vektoronjelenlévő tcasszgéstől eltérő rlporíergén jelesléte a tepemőrusbat? lehetővé teszi, hogy az Ad-vekior és a heípervltax jelenlétét egymástól íőggerienií! kövessék. A második íiporíergént lehetővé teszi a rekombínáns vírus és a hdpetvlrus elkülőnitásét a tisztítás során.
Ú.Kotekmeteló <ggte<ietek
A terít \nek h n test kében ee úri t.ko tb t »>> m ar ,uenovno.ohe\ ( V) e o.i idvna ? délen h génregié fmtkesőját - itowíovber ez < \ rto r-plsLae o te)z sági tttekítvtusához cwenute teripe titu·» vagy sejívonai alkaimttzásávaí, azaz: kompfemestálással vagy beesotnagoló sejtvonai alkalmazásával a rekombitets: varas számára pőtotenk keik Az: esetek többségében, a tette E i -proteint cxpresszátó sejtvoaaiat alkalntetaiask csimpánz: Ad-vstor transzkomptenreteálására. Ezkőlöoőses előnyős, mivel - figyelembe véve a találmány szerte esintpánz Ad-saékveacíák és jelenleg rendelkezésre álló feeesotnagoló seiívonakvkban alkalmazási tetteti Ad Efeszebvendák közit eltéréseket - a «yakoriatbss elterjedi tetet EI-tartalmú sejtek alkalmazása megakadályozza .repííkáeiékompetens adenovírusok keletkezéséi a replikádé és virostermelödés során;. Bizonyos esetekben azonban előnyös lehet az E l-génterméket expresszáló sejtvon&l alkatetzása, például El-deleiáii slmian adenovirnsok előállítására. Ilyen sejteonaiak leírását találjuk például a 6083? 16 számé amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.
Kívánt esetben, a találmány szeritm szekvenciák alkalmazásával minimálisan a PanS, Eas6, Ean'7, SV1, SV2.5 vagy SY39 aáenovíms El-géni. adok szőlői sfijtvonalbaa tunkteonatis protteer szabályozása alatt expresszáíö becsomagoló sejteket vagy sejivortaktes állíthatunk elő. Erre a célra indukálható vagy konstítutiv proutőiereket alkaímazbteutik, Ilyen promterek részletes ismertetését találjuk a bírás más részeiben Szülőt sejtve akíruis'unk k s uá Vrikte teő tete 1 te 2^ ,ag\ 'te 3K< unt esp e-.- nlo jj ^ρνοη,ίΙ <1 te í is< ra. Például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátozitek, szülői sejtekként alkalmazhatunk 1-lel.a [ATCC nyilvántartási szátte Őio €€1..2(, A549 [ATCC: nyilvántartási szánt: CCL 1851, BEK 293, KB [CCL 17|s Deteott (például Deíroií 510, CCt ?2j. és WI-38 [CCE: 75]l sejteket. Ezek a sejtvonalak hozzáférhetők az ATCC gyűjteményéből {Amerre;® Type Cuiíare Goliectlon, IÖSÖ1 Universíty Boubvard, Mmtassas, Virginia 201102209). Más. alkalmas: szülői smtvonalak egyéb teásokból szerezhetők be.
Ilyen, El-expresszáló sejtveteak alkalmazhatok rekonrhmáas, El -ddetetálí stean adenovírusvektonak elöálíitására. Szintén a találmány tárgyát képezi egy vagy több siustaa aőendvirus génterméket, például Ela, Elő, E2a és/vagy E4öRbő-géste.onéket expresszálő sejteatri, amely lényegében a rekombtnáns, stean vlmsvektor •esetében ismertetettek szerint:állítható elő; Ilyen sejsvötmlak alkalmasak a fenő gentermékekst kódoló esszenciális: génekben defetált adeaovírasvefcrorek rmtiszkomplementálásám, vagy hrfper-áependens vírusok (például adoso-asszocsált vírusok) becsomagolásához szükségps heiper funkciók szolgáltatására. Λ találmány szerinti gazáaseji; elöálíitására például ÖNS-szesveneisk iSsszeálhtására alkalmas eljárásokat. alkalmazunk, A szekvem eisk öss/tehtasát szokásos eljárásokkal végezhetjük, ilyen eharasvk például a cÖlSlb és geuorni DNS klónozása, amely iedmolögia jól ismeri, és smelyaek leírása megtalálteé például Sambroók és latsai, kézikönyvében (lásd fent); az adenodros genom at fertő oitzonakleotid-szekvcnciáinak alkalmazása pohmeráz-lánereakciőval
100445-6132/SÖ kombbáivst színtézisíechsofégiák;· és bármely akis, tt teás# milrieoíid-szekvenciát emdményező pljáfás.
További lehetőség szerint, az esszenciális adenovirus-gérrierméket ót rimts szolgáltatjuk adéwvtesv«;teF vagy htripervirus áltel, Ebben az esetben, megfelelő gazdasejtet váfesztfeatenk bármely biológiai organizmusból például prokarlots (például bakteriális) sejteket, euknriota sejteket, például twarsej leket, e.e-íXo'.eps.e: v,g\ e nk ·> serieket <,azdzsv!tes.kcní IJe töven e onvoser esr.os őrieket t k tímárunk r<. dattí de anélkül hogy igényünket a felsoroltakra konátozaánk, A549-, WEHi-, 3T3-, ÍOT112-, BEK 293-sej leket vagy PERCó-sejteket (amely utóbbiak fuaküteólh títtenovinis EI -gén-ermákst expresszáhjak) [Fsdlaux EJ, és ori-tt Hu Kere 2b vf y siÍ5-»s <2< k t-xv ΗΪ1 Η,οίΚ ev p n <t t 1 iob>av 1 sejteket, vagy emlősök bók például emberből majomból egérből, patkányból, nystíböl vagy hörcsögből származó hepatoclta vagy utyoblasl sejteket. A sejtek forrásául szolgáié emlős fáj, vagy emlőssejtek típusa - például fjbroblaszt, bepatocite, tutnorsejt, stb, - a találmány szerinti megoldás s/xunpontjábél nem korlátozó.
Általánosság hsa, a. mjnígőnt tamlmazó vektor transzfekciéval íoriénő bejuttatásakor a vektort kStülbeilil 5 pg - iOé pg DNS mennyiségben, előnyösen körülbelül sö-50 ug DNS mennyiségben, adjuk köoiibeiül I s 1Ö* sejthez, körülbelül Ixlll' sejthez, és előnyösebben 10' sejthez. A vektor-DNS és gazdasejt aránya azonban változtatható a választott vektor, a tnskleíasav bejuttatására alkalmazott eljárás és a gazdasejt figyelembe vételével.
A vektor a techstktt állása szerint ismert, vagy a lentiekben említett bárnseiy vektor lehet. ezen beiül csupasz DNS, plazíirid. rág, trtmszpozou, kozmid, episzoma, vírus, stb, A vektort á gazdasejtekbe juttathatjuk bártnely, a iedmika állása szerint Ismert, vagy fentiekben említett eljárással például wtszfekeiöval vagy fertőzéssel Egy vagy több adsnovírusgém stabil módon a gazáasejt genomjába építhetünk, stabil módon episzomaként sxpresszáftathatunk, vagy tranziens módon expresszáhathatunk. Valamennyi génterméket tranziens tnődoty expresszáltstlmtjak eplssomáről, vagy stabilan integrálhatjuk; vagy eljárhatunk úgy, hogy a génterosókek egy részét stabil módon expresszáiSatjuk, míg más részét tranziens módon expressa&ittüjuk. As: egyes adcoovirosgéjlek proniólereikent - egymástól függetlersül - választhatunk konstitutív promóteretoel mdekálhntő promöíerokel vagy natív adeoovíms promőtert, .A promótort szabályozhatja az organizmus vagy sejt meghatározott fiziológiás állapota (például differenciálódási fázis, vagy replikádé, vagy a sejtek osztódása), vagy exogés fosásból származó fater.
A molekulákat (például pk-zmidokat vagy vírusokat) szakember számára ismeri módon, a leírásban ismertetettel szerint juttathatjuk gazdasejtekbe, A találmány egy előnyös megvalósítás» módja szénát szokásos trsmszfékeiós eljáráíiokat. például CaPCb-írax-szfekcsót vagy ek-ktroporáciéí aikairuazunk.
A választón adenovirus DNS-szekvmxdák, valamint a rranszgén és egyéb vektorelensek összeállkását különböző köztes pkiztnidokká, valamint a plsznndok. és vektorok összeépítését re-kombináns vinisrészeeskéhké szokásos eljárásokkal végezzük, ilyen eljárások példán; szokásosan alkalmazott cDNS-ll'mozó eljárások, például Sasnbrook kézikönyvében ismertetettek (lásd fent), az adenovirus genomok étiedé ohgenukleotidszekvenciálnak alkalmazása. poltmeraz-k-navakao, és bármely egyéb, a kívánt nuideotíd-szckveueiáí eredményező eljárás. Ismert transzfekeiős és kotrtmszfékelós eljárásokat sllalmtszbatunk, például CáKÁ-preelpttáeíés technológiákat. További szokásosan alkalmazok eljárások példád « vfrnsgeaomok homológ mkotnhlnácsójáR, agarlemezre öntött lágyagarbaú vírusplakkok képződéséit, vagy szignálok keietkezéséoek teresé», és basönlólon alttpuinak.
100445-6132. SO
Például, a kívánt mmigémartalmó összeállítását követőm a vektorral in stoe becsomagoló sejtvGaaíat tr&oszfektáhmk a helpervims jelenlétében,. A. helper- és tidetmvlrus-szekvenciák közt homológ rekombimkló megy végbe, ami lehetővé íe$2tk. hogy a vektorba építette adsnovíms trsnszgén szekvenciák mphkáiódj&uak, és vírionkapszS^^ esomagolódjsaak, ••ekedbátís vfersrészecskék kefetkszését eredménjezve. llvert víntsrészecskék előállítására brassz&kción alapuló eljárást alkalmaztunk. A találmány .szemű megoldás azonban nem korlátozódik ilye» eljárások alkalmazására.
A lenti módé® kapstkeefcöntfctnfes, simia®adenevlrasok alkalmasak a választod kaaszgé» választott sejtekbe törteit·® feejotlaíására, A becsomagoló sejtekben szaporított rekembíuáns vhusok alkalmazásával végzett m vrw klsériefökbe®, a találmány szerinti El -dsletált, rekembsnáns, sóiban aáeuovkusvéktorok alkalmasnak bizonyuliak transzgén sem-tnajom, előnyösen sémán sejtekbe rőriétiö bejadstásáríí,
A felnimátjy szerinti refcomfcmans, sírnia® adenovfensvetóorok alkalmasak ín riw, ex· vöm vagy ó? víio géslmoszfenv humán betegekbe vagy séta hunra®, -beteg állatokba. Az: ismertetett mkwthiaáw adesovimsvektorok expressziós vektorokként is alkalmazhatóak a heterelóg gén által kódolt termék is vtó® előállítására. Például, a® El-deléció helyére inszeriáií gént tartalmazó rekombnums adenovírnsok a föntiekben leírtak szerint bl-expresszáló sejtvonalba traríssíbkiáihaiők. kiás eljárás szerint, repllkáciőkempeteas adet-oviruseka· alkalsiazlsatosk egyéb sejívmíalskban, Ezután, a fnmszföktált sejteket szokásos módon íenyésztjök, lehetővé töve, begy « mkötobsnárts adeuovírasok a promőtenől expresszálják- a génierméket Ezt követően, a géufennékel a teave-otn mokózegből proteinizöláiásra és tenyészetből történő izolálásra alkalmas ismert cbar tsekkalfeiuyerj,k.
A találmány szerinti Panó, Panő, Pas7, SV1, SV25 ésföagy SV39 eredetű rekomhmárss, sámán adenovirusvektorok hatékonya® alkaltuazhatók géöíranszferre, azaz kívánt transzgént hatékonyan képesek út wvo vagy «x w a választott gazdaseitekbe juttatni még abban az esetben is. ha az organizmus nemmi izáló ellmíanyagoknt tartalmaz egy vagy több AAV-szeroísptts ellen, A találmány egy előnyös- megvalósítási módja szerint, az rAAV-részeeskéket és a sejteket ex ?A-o érmtkozíetjök; a fertőződ sejteket szokásos módon tenyésztjük: és a temmizdakált sejteket risszalnfönááljuk: a 'betegbe. Ilyen készítmények különösen alkalmasak íetáptás célra és iuztoumzalasra, például prosekkv immunválasz kiváltására,
Tipíknsahbtm, a fentiekben -már ismertetetlek szerint, a találmány szerinti PaaS, Parte. Pan7, SV1, SV2S és/vagy -Λ lo rekombisáss sdesovírusvekíorokate terápiás vagy immunssgén molekulák bejuttatására alkalmazzak. Mindkét ulkaitsazás esetén nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti relsonsblnáns adenovirusvektorek alkalmazása különösen előnyős olyat! beadási rendeknél, ahol a mkombövnts adenovírusve-ktorok Ismételt híradására van. szükség. Ilyen beadási remfökoél tipikusan ágy járnak el. hogy sorozatban több, irsegváitoztaíoit vkuskapszidöt tartalmazó ylrosvekíotr adunk he. A vlraskapsziáot mindegyik beadás alkalmával, vagy hizouyos szerotipusá kapszid meghatározott, számú (például eav M három, rtégy vagy több alkalommal végzett) beadását követően rtregváltoztathaijuk. A beadási rend szc m ehárhatonk ágy, hogy egy első majomereáetü kapszídot hordozó rAd-t adunk be, majd egy második tnalemoredetú kapszidot hordozó rAd~? adunk be, végül egy barma dili majotnoredeíö-kapszidothördozó rAd-t ndank be. Más beadási rendek, melyekben a találmány szerinti Atlfcnpszidoknt alkalmazzuk egymagákban, egymással kombinálva, vagy más szerotipusú kapsridokkal kosubíuálva, szakember számára nyilvánvalóak. Adott esetben, a beadási rend szerint más nem humán főemlős adecovirusábői, humán, adenovirusbéi, vagy mesterséges Ád-szerotípusböl származó kapszidot hordozó rAD-t
100445-6152’SG adunk be a már ismertetitek szerint. A beadási rend misben egyes szakaszában egyetlen Ad-szerotipnskapszídoi adunk bo több injekcióval (vagy más beadási át alkalmazásával), majd további sotozafot adunk he egy másik zkd-szerotípsrs alkalmazásával, A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti rekorobmáos Aá-vektoróktú más, sem abésovi'rss által közvetített szállítórendszerek, például más vkáiis vekíorreadszerek, siess vitális szállítórendszerek, proteinek, pepttdek vagy más biológiailagaktív molektdák alkalmazásán alapuld beadási mtdfeea alkalmazzuk. A következő fejezetbet! a találmány szerinti adenoviíosvektórök alkalmazásával bejuttatható molekulák ísruerfetősére sssspoatósítunk.
A, ,Térápiás molekulák Ad által kör veidet; bejuttatása
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti rekömbiaáns vektorokat a s/A ro.ki\ n bői iMm rt ou r>í js epzrascwa. „dm*. r>v „rüu rrca V t aus/aett v tóv/v ma ént okion betegnek adjuk be, előnyösen biológiailag kompuübibv oldatban vagy győgyászaiibg: -elfogadható hordozóanyagban szuszpendálva. Hordozóanyag kén· alkalmazhatunk például steril fiziológiás sőoldatot. Erre a célra alkalmazhatunk szakember szántára gyógyászatiéig elfogadható hordozóanyagokként jói ismert egyéb vizes és nem mzos izotonú?. sterd tmekcms oldatokat; vagy vizes és nem vizes, steril szoszpemdőte
A tuieiutany s/ennít smuan ndeno'.imssektotok.tí eleecnőó menne végben ao-nk be ahhoz, hogy .·. cetrotl sejteket Ermuzduk-ükiL es a kh ant terápiás hatás eléréshez megfelelő szintit gestrattszfert és génev ptesszíol idézzenek elő káros vagy gyógyászatukig elfogadhatatlan fiziológiás mellékhatások nélkül; az ilye, dó/ssok szakember számára ismert módon meghatározhatók Szokásos, gyogyászafifeg elfogadható beadási utak például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a kővetkezők: a készítmény közvetlenül a szivárvüuyhásíyára történő juttatása és más intraokuláris beadási utak; a készítmény közvetlen bejuttatása a májba; inhalálás; rofí'ííítíízáib, intravénás, mtramuszkuláns, iotmtheoáíis, szabkutáu, mfraderrnáfis, rectábs, orális és más parenterális beadást utak, A különböző beadási utak kívánt esetbenegymással kombinálhatok vagy snődoss'íhatők a tranőzgérmek vagy a körülményeknek megfő leiden. A beadás útja elsődlegesen a kezdendő állapottól fligg.
A virosvektör beadandó mennyisége elsősorban a kezelendő álíapobsk a beteg: életkorától, testsúlyától és egészségi állapotától függ, és ennek megfelelően betegenként eltérő lehet. Például, a vlrusvdrtor terápiásán hatásos dózisa humán vagy állatorvosi alkalmazásra tipikusan körülbelül IxlfiMxlO’5 vkúsrészeesks; körülbelül tzl0!:-ixl0i! vímsrésxeeske; vagy körülbelül ixlö''~ixld: vrmsrészecske. A dózis filgg az áüavember méretétől, és a beadás útjától. Például, itáramaszknláris ötön történő beadás esetés, humán vagy állatorvosi aikabnazásra (körülbelül SO kg tesítömegü állatnak/embernek) előnyöset! körülbelül IxlőMsdít*2 virosrészeeskét adunk be egy milliliter térfogatban, egyetlen helyre. Adott esetben, a készitméoyt több különböző helyre adjuk be. A találmány egy további előnyös megvalósítást módja szerint, orális ütőn: történő beadás eseten, hamun \,tgv .fiiul·, ή aikítbtjaxds’a kendődéi i\IGl'-'\íó ensiószeesket udt.uk tv. Szakember a 'eou dózisokat módosíthatja a beadás útjának, és a rekoutbínáns vektor íoráulüs vagy vakchtázási célú alkalmazásának megfelelően A transzgén expresszíója - vagy loumtuegének esetében ~ a keringő ellenanyagok szintje követhető, és ennek mupitm a beadások gyakörisága megáfiapiíhatő.. A-beás js <? ek és gyakoriságának meghatározása más módszerekkel szakember számára ismert.
lény o\en, a virttsvektotral együtt vagy annak beadását megelőzően vagy azt. követően rövid hatású hnmumnodubtort h beadunk megfelelő mennyiségben:, íntmuamodulátoreu olyan szert értünk, amely képes a
100445-6 i.U'SG találmány szerinti rekombisáns vektor ellent nentrulizátó ellenanyagok képződését gátolni, vagy a vektort elltmnaío cuotetncu? F-límtoceak tC 'Π) hoüe-.-t gátolni, Az tmmunntodmator megakadt'.!)ózhatja a I-helpcr xzubpopulációk (Tft! vagy T{J,} és S-sejtek közti kölcsönhatást, és egállal gátolhatja a ncatralizáló ellenanyagok képződését. Más lehetőség szerint, az immuntnodulátór gátolhatja a Τ®-8φ«&. és CTL-ek közti feölesönhaíást, és ezzel gátolhatja a vektor CTl. általi eliminációját. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható különböző immunmodolátorok és azok adagolásának leírása megtalálható példán! a következő szakirodalmi helyeken: Ysag és Éatsáí: I, Vitel 70(9), (1996); WO 96/12 406 számú nemzetközi közzétételi itat (közzététel napja;. 1996, május 2.); FCI7lJS96á)3035 számú PCI közzétételi irat;: amelyek teljes téjjedeknökbes a kikiáltás részét képezik,
Lláí3piás .transznének
A u&oszgén által kódolt terápiás termékek lehelnek például hormönok, növekedési és öiffeenűiálödási faktorok, például de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, inzolm, glökagon, növekedési faktor (üli), parathyroid hormon J’l 11), növekedési barmon releaslng faktor (öKFj, fellikötas stimuláló hormon (l-'Slls. Itnemizáló hormon d Hl Imnem choóogonadotropm ItiCG), vaszkuláris endo-hel növekedési faktor (VGEF), anglopoennek. aagios/Mir, gf-mnlocita. k<?lőnisshm«tálő faktor (GCSF), erííropoetin (EPO), kötőszóveti növekedést faktor (CTGF.>, bázíkox SWebfeszt növekedési faktor (bPGP), savas flhtoblaszt aöwkeáési faktor (aFGF), epidermális növekedési faktor fküF}, tmnszfermáfó növekedési faktor tTGF), vérlemczks eredetű növekedési faktor (FOGÉ), Inzulin aővek:\<.·» oklor 1 és II (ÍGF-1 és IGF-ll); a transzformáló növekedési faktor fócsalád bármely tagja, például Ki!'·', aktivetek, mhibmek; vagy a csont morfogén proteinek (ÖlMPj bármelyike, például ÖMF-1-15; a növekedési faktorok hereglniWnereglnwARWpea differenciálódási isitor (NDF) családjának bármely tagja; megnövekedés! faktor (NGF). az agyi eredéin neurotroph faktor (SöblFj, a. NT-j és NT-4/5 neurotriphinek; a ciliáris nenrosroph faktor (CNTF), glrasejtvonal eredetű neurotropb faktor (GDNF); neunurin. agrin; a seinuípkóríaol/eollapstóok családjának bármely tagja, nctrís-1, setrin-2, Irepatoeita növekedési faktor i.KGF), ephrinek, aeggin, “.wto óc</gz7?og (az .agy ntoribgeossisél -szabályozó protein) és firozin hidrosikiz),
A ttanszgen termékei tehetnek továbbá -az irtarmarendszert szabályozó proteinek, például, de anélkül, hogy igényűnket a felsoroltakra: korlátoznánk, citoteinete és limfelmek, például ftomöopoetin (TFÖ), imerfeukinek (II.), 1L-I~ff,-2S ipáiddal ff,-!, IL-4,lte-12 vagy IL-1S), monoclta ksmoaíü-aktáas proteinek, lenláxnia inhibitor fflfoí, granolociteonskrolag: sütuoiálő faktor, Fas-ligasáutn, tantor nekoázis faktorok, interferonok, Őssejt faktorok, llk-Mt3-ligandimt. A találmány szerinti eljárásban az immmwtászer által termelt géstermékeket Is alkslmazhatotik. Ilyenek például de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a következők: IgG, IgM, IgA, IsD és ígE, kíméra Ijnuaraglebnlínok, humanizált ellenanyagok, egyláseú ellenanyagok, T-sejf-rscepterol, 1 és lí. osztályú MHC- tnoletetrfáte, géntechnológiai étem módosított ímmunglobolittok ős MHC-inolek-nldk, Géntermékeskérii. uvpresszálfathatunk komplessestszabályozö proteineket, például membrán koláktor proteint (MPC), „tfeesy rmctóresítóíf’ faktort (a €3~komreriáz alegységekre történő bontását gyorsító faktort) (DAF), CR.I, GF2 vagy CD59 faktort,
A i-mnssgé» által sspresszált: gértlertSiékel lehetnek továbbá a fenti hormonok, növekedési faktorok, dtoidnete, limfekinek, szabályozó proteinek és immunrendszert proteinek receptorai. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, ilyen, receptorok tehetnek például koleszterin szabályozó proteinek receptorai, például alacsony donzitásá llpoprotein (I1M,) receptor, magas denz^asu lipoproíem (Hfek) receptor, nagyon
100445-O132 Sv
3Ő alacsony deazítású lípopretem (VLDU receptor, és a „scavenger receptort. A transzgén gáztermékei lehetnek a sxtoroid-hormon receptor tocsalád tagjai, például glakokortikoid receptoréit és öszdogén-receptorok, D~ vitamin-receptorok és más tuagrecep-orek. Ezen felöl, a. .géntermék leshetnek trsnszkripclös íaktosvtk, például fen, .te. ?»«u\ «ed, szérum ?«xp><we faktor (SRS>, AF-i, AP-2., «$, AfysD és myogenm, £Tb-böx~taríaimú proteinek TEE3, E2f, AIΗ. Λ112, ATF3. ATF4. ZF5, NFAT, CREB, HNF-4. C'FBP, SPI. CCAAT-bos kötőproteinek, interferon szabályozd fektort&P-íj, Wlhns tumor protein, ETS-kötÖ-proteb, ISTÁT, GATAbox kötdprereir». például OATA- 3, és a szárnyas háüx proteinek villás ovii csalásba.
A találmány egy előnyős megvalósítást módja szerint, a trsnszegén gésfertnéke lehet karámod sztuteiáz I, orrdtín franszfeírbímtiláz,, argsnoszökciaát szinteráz, argincszakcinát Ház, atgiíte, teoarikieetseetái hldmiáz, fentíalanin hidroláz, alfe-1 antráipszto, glukóz-ó-fessfetáz, posfebd&iogért desaraináz, Vili. faktor, IX. faktor, «sztorién héta-szírstefez, elágazó láncú keteotsav áeksrboxüáz, atomi»,, izovarébl-Ce A dv-ndrvyenús, propfeníi-CöÁ karboxiláz. msrii-toaloidbCoA utösáz, glntaril-CcA debidrogcuáz, Aszúim, bem ghikormnuaz, píruvát. karboxslát, heparikos fosszferdáz,. feszíbnláz kináz, glicín dekarboxiláz, H-protei n. f pn kon, cu ··< A ts fthrfeits tramzmembrán szabályozó tCETR) szekvencia, és ássztrohtoeSNS-szekvenöia,
A már emkiadeken fellil, a geatertnékek lehetnek természetbe» elé nem forduld polipeptidek, például lenttoszelben elő nem ferritdő .smimsav-szKkvencrájú:, tfeldául tozeriáőkat, -deléciókat vagy amtos&vszubszdtáctókat hordozó kimére vagy hibrid polipspbdek. Egyes immunkom.promitrált betegekben előnyös lehet például egy láncú, géntoelatológsaí ötou módosáéit ítststtoglöbullsok aikataazása. ilyen, természetben elő nem fotdaió genszskvenciák például valamely eélmolskula túlzott mértékű expressziéiánsk visszaszorítására alkalmazható antlszensz molekulák és kaíallbfeas askfeissaxak, például riboximek.
Valamely gén expressziojánsk csökkentése és/vagy szabályozása különösen előnyös Intett mértekben probferálódó sejtek jelenlétével, jellemzett, hipaíprobferativ állapotok, például pszeriázis kezelésére, A célzott polipeptidek kizárólag a hiperpröliítetsv sejtekben termelődd, vagy az ilyen sejtekben a normális sejteknél nagyobb mennyiségben tstmelbdS polipeptidek lebsíssk. A célzód antigének letettek onhögének, példáid a »te, ríme, te, a tete/ri írónszldkácfes gén, .?«s, P53, «ea, tok vagy EGfR által kódúit polipeptidek.
Oakogének által kódolt célzott antigéneken felül, ami-ttmtor terápia vagy tenorprotéksiv kezelési rend célzott antigénnel lehetnek B-sejtss llrnfómák: állal termelt «faanyagok. variábilis régiói, T-sejíes limfemúk Γ-sejtreceptoraínak variábilis régiói, amelyek - a. találmány egyes előnyös megválösibási módjai szerint. - autoíxmmm betegségek cetetigénjeikéttí is wrepe&tssk, A célzott polipeptidek egyéb íaroorasszöeiáh. polipeptidek is iebetnek, például umorsejiékbett nagyobb mennyiségben elóíőrdale polipeptidek. például a 17-1A jelzésé monoklonális ellenanyag által felismert poilpepűd, és íslátköto pollpeptíriek.
Terápiás poilpeptidékkénl; és proteinekként alkahsuzbátoök aotómsnitn betegségekben szenvedő betegek és rendel lenességek kezelésére alkalmazható peiipeprideket, széleskörű projektív immunválasz- indukálva az autoímmnuítástelőúiéző eolroolekulákkat például sepreeeptorokkal és saját antigének ellen irányuló ellenanyagokat termelő sejtekkel szemben. T-sejtek által közvetített: aatolstoms betegségek például rheumatoid arthritis! (RÁ), sclerozís multiplex <M$j,: Sjögren szistőrőtna, sareoidosA, inzulindependens dssheies mellhús. UDDMl, antomiröus fbyroidíhs, rtok-iv arthriris, sponoylosás ankylopcetica, scleroderma, pclymloritis. dermatosjyosiíis, psoriasis, vasculúis, Wegener gzanulomatosis, Crohn betegség és colios aleerosa. .A fenti be-egsegek jnindegyskét az: autolútoum betegséggel 'kapcsolatos gyulladásos láncreakció kiváltásáért felelős, endogén antigénekhez kötődő T-sej t-röceplorok (TCR-ekj jelenléte jellemzi
100445-6 H2 SG
X *
A találmány szerinti sktaan adetKstfu vektorok. különösen alkalmasak olyan terápiás eljárásokban törtér«« éhalma/tűt a, ahol transzgcmekeá több } ka lommal kívánunk hejpttaá5Í aílettotdrasveklorok: által, például ttgt anazt a traaszgém kivárunk bejurtater ismétekén, vagy a íranszgént más: trsnszgsnne) együtt kívánjuk beadni kembinácicbar. Ilyen beadási rendekben bejuttathatunk Pan5, Paaő, Pan7, SV1, SV25 vagy $V3§ sutban .Kko<‘\oassektöft. majd ismételten, azonos szerotíposü adenovlrnsvektom. Különösen előnyöseit, a találmány »zer,nt' Puné, Pattő, Fan?, SVl, SV.25 vagy SV3P sívnían tídenovÉrasvektort sdunk be, ahol az első alkalommal beadott t tmvsektor szetoíipusa eltér az egy vagy több további alkalommal beadott vírus vektorétól. Előnyösen. & terápiás rend szerint beadhatunk például PeaS, Paaö, Fan?, SV1, S V25 vagy SV>’- \ htod, majd egy vagy több azonos vagy eltérő szerotlpusú adenovirusvekíört. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, adenovírusvektort sdunk be, majd az ismételt beadás során a találmány szennts az első alkaiommo; beadott sdetmviíusvektörétől eltérő szeretípusú Pasrö, Psnö, Fas7, 5V1, SV25 vagy SY'39 vektort adunk be, és adott esetben, további beadásokat végzünk az előzőleg alkaitnazoít adenovirusvektorral megegyező, vagy előnyösen, attól eltérő szerötipnsu adenovlrtisvektörral. A beadási rend nem korlátozódik a találmány szerinti Pan5, Pnnó. Pan7, $ VI, SV25 és/vagy S¥39 sómon adenovlrus szerotipusok nlfesbnazásával létrehozod ade.no virosvektorok bejuttatására, A beadást rendekben alkalmazhatujik más adenovlrus szerodpusok alkslmazásávaí létrehozott vektorokat is, például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra kodátoznáttk, alkalmazhatunk más simían adenovlrus szeroítpasokat (például Pau9, vagy CéR. Cl. stb,), más nem-humán töendos sáenovtrus szerotlposokaí vagy humán adesoviras szerotípusokat a találmány szerinti FauS, Eanő, Pas7. SV1, SV25 ésA'&gy SV3§ vektorok egyik évei vagy azok közül többel kombinálva. Ilyen, majom, más nem .barnán Iberaiöx vagy humán adenovírsrs szerotipusokat a leírás más fejezeteiben Ismertetőnk. A fenti terápiás beadási rendekheti, a találmány szerinti PanS. Fané, Pao7, SVI, :SV2S ésívagy S¥39 tfeepavirusvéktdrökaí beadhatják irtás nem adenovirusok vektorokkal, nem virális vektorokkal és/vagy küiöttbözÖ terápiás szerekkel vágy molekulákká! együtt; vagy azok beadását végezhetjük egymás kőt érőén (szekvenciálisán). A találmány szerinti megoldás nem. korlátozódik a fenti: terápiás beadást tetsáekre, femem szakember számára más beadási rntrdek is nyilvánvalóak.
A rekombisáns, simít® adenovirusok: itumuaogén keszlmfenyökben is alkalmazhatok. A leírás szerinti értelemben, hunrunogén készítményen emlősnek, előnyösen íöemlösoek a tranvgérmel bejttt ttod terméket ériünk, amely humíuáiis (például, ellenanyag) választ vagy· celhdsris (például cíloíoxikes Γ »oaes; választ vált ki. A találmány tárgyát képezi rekombináns, simdan Ad, amely az ademovirus-szekyeneí.i vubmely részében létrehozott deledé helyén a kívánt immoaogéat kódold géut tartalmaz. A slröiau adéttov uus elő, rekombináns virusvakcinakést, más állatfajban történő alkalmazásra alkalmasabb, rnfeí a humán eredetű adenov trusok, de a találmány szerinti megoldás sem korlátozódik: azok más. i'ajbds történő alksumazasám. A rekombináns adenovírusök: alkalmazhatok proídakuktís vagy terápiás vakcinaként bármely patogénne! szemben, amelynek az immunválasz kiváltása szempontjából kulcsfontosságú antigénjét tanti gór· jelt) azonosították, méiy(ek) ellen irányuló immunválasz képes a paiogén terjedésének gátlására, és amelynek amelyeknek megfelelő cDNS rendelkezésíe áík
A vakolna {vagy immnnogefe készítményeket a lent ismertetett megfelelő hordozóanyagokban fommlázzák. Általánosságban, az immtmoeen készítmény őwi a fentiekben, a terápiás készítményekre megadat tartomáo.ybau van, λ ' is o t gén mtmunogetntusa kötethető az esetleges tnegerösitő oltások szükségessé g<
ÍPÖU45.6Í32/SÖ \ ·γ nek magállapáására. Miután az: ellenznyagíherí a szérumban megállapítottak, kívánt esetben megerősítő ímman-záiást végezhetünk.
Adón estetheti, a taláítaSny szerint; vakcinakészdményt más ksnnposertsökkel 'együtt is femuíázhaijük, peldnol adun árasokká i, xrabfizHeszerekkcí pd-hea ,-to xzereskek ;urtosslv»zerekkel '-.agy hasonlókkal Jbcn komponensek vakcisázáShsm: jártas: szakember szs iiua jel ismertek. Adjuvánském alkalmazhatók például, de andku' hogy tgcm-unket ; fel-otolukta ^oriateznank, l.poOomak a'u-r.. .Oonotos.zrts>nl hp,d \, b'olocta.kíg aktss faktorok, pcidnul x sokra, jnterteukir. keraekm. heandunivk. és cetben, ások kontbinactOi. A fenti, biológiáikig aktív faktorok kózííl egyesek expmsszáfePhaEÓk ;?? v?vö, például plazmádról vagy vírus.vektorról. Ilyen adjuváns beadható példáal az első mrtmmizálás alkalmával, az aratígént kódoló DNS-vakcinával annak érdekében, hogy erősebb anttgénspecítikus immunválasrt váltsunk ki, mintha csak az antigént kódoló lAMSvakclnát: adtak: volna be egymagában.
A rekemfeítiáns sáeuovlrusokat Jnaourtogén mennyiségben adjuk W, azaz okán mennyiségben, amely az alkalmazod beadási út mellett a kívánt sejtek hatékony traoszfckciojat, c* a \áhított gemtest az miniunvátez kiváltásához megfelelő szintű expressziójái biztosítja. Amennyiben protektít' immunválaszt, kívánunk kisállam, a rekombisáus adenovlrusokaí a fertőzési és/vagy rekurrens betegséget megelőzni képes vakcinakomponensskkérti aíkalmazhaijak.
Esen leiül, vagy más megoldás szerint, a. találmány szerűm vektorok tsmfeaazhataak a választott imraunogénnel szemben immunválaszt: kiváltó pepiidet, polípep-idet vagy proteint kódoló transzként Á találmány szerinti rakombíraaas adenovírusok várhatóan nagyon hatékonyak az ntesertaR, a vektor úttal cxpresszált heterológ antigén protein elleni eitoliiíkus T-sejfek Indokálásában és ellennnyag-tennelődés kts Jusuhzn,
Az mwtmogén származhat például különböző vírüscsatádókbói, immunválaszt kiválthatunk például a píeormtvirus családba tartozó vírusok ellet!, poklául a közönséges nátha körülbelül 50%-árt felelős rhlsovírttsok ellen; enterovirusok, például pohovírasok, coxackie vírusok, ecbovlmsok és htrtnán étt\-u«\ ru&ok e'kp, például a hepatitis Á. vírus ellen;: aphtsvsmsok ellett, amelyek száj és körömfájást okoznak elsősorban m Inasán organizmusokba®. A pieentavíms családba tartozó vírusok eéhsntígértje lehet például s VPl, VP2, 'VP3, VP4 es VFö. További víruscsalád a caliclvlrusok család, amely magában foglalja a járványos gasíroenteritisek kiváltásában betöltött szerepe miatt: nagy jekmíóségű Normáik vírusokat. Humán és netn humán orgamztuusekhan iumuísválsszt kiváltó célastígések fotrásání szolgálhat továbbá a togavims csalod, .vuelvbe az alpkavirusokat, ezen belül: a Sindbis vírust, Ross kiver vírust és venezuelai keleti és nyugati bercvphabttx virusl soroljuk; a. smbsvírusí ezen belül rubeola vírust. A flavivhidae családba tartozik a cíengue vírus, sárgaláz vírus, japán ertcephaíitis vírus, :St. Louss encephalitisés ksdlancseneephahtis vírus. Célanügéo; elóállíihatuttk továbbá Hepatitis C vírusból vagy a eoromívúns családba tartozó vírusokból. amely utóbbi számos nem Irónián vírust taglal magában, például a (baröraliak) fertőző iégesöhurut vírusát a sertések fertőző gastroenferttis vírusát (amely ínabtcökban okoz betegséget), a sertések hémagglutináló coronavirus okozta agy· és genncveio-gyallsdásál: okozó vírust (ómért muktcokbm okoz betegséget), n macskák fertőző peritonsiisét okoz.o vtrnd {amely maeskák't oeteztí rv' ’ n ^>í,zk lx«r,u', la-, ·λ» ror w η χ ur\.N értele -özet „eu -/mtC' n Kc»,t»ut K teást meg), a súlyúk eöröKuvsrussi: (amely kutyák megbetegedését okozza), és & humán respitíttortkus coronov tmsokat (amelyek közönséges náthát és/vagy non-A soa-B, aos-ü kepntiíist okoznak), A coronavirus csatádon belül, a céktnsger lettet az El (m;is néven M- vagy máirlxproleisk £2 (más néven S vagy „Spike protetn). E3 (ínás: tc^et Ok vagy hemagghititdu-elterose) ghkoprotcín (amely nincs jelen minden.
W445-6132/SG mvjoíuv ra-tMi; sag' K {xukko^P'. x> \z antigén v«j r-nhu rísabdoviros családból, amely -magában foglalja például a Vesiéulovírasnkat (például hólyagos szájgyulladás vís-issa) és a Lyssa vítusofeal. («zen: belül a veszettségvíntáll. A rhabdovirus család esetében, az antigén származhat például a G-proteinból vagy 1Nproteinből. Az antigén fotnsa lehel a frfovlridae család, amely tartalmazza a haetnorrhagiss láz: vírusokat, ezen belül a Martaiig és F hol a vírusokat. A parasnysovirus családba sorolják az: 1, 'típusú pammlluenza vírust, 3, ílpusú paramHuenza vínsst, a tp^mmnarfea pansinütsctsza-S vírust, a rubu&vírasí (mumpsz vírust), 2, típusú paramflucnza vírust, 4. típusú parmAtenza vírust, Newcastte-betegség (hsromfipestis) vírust, a keleti nsarbavész forbiderpesf’) virosúí, a nmfoílkv kosokat, amely kanyaró és kutyákat meabetegífo szopornyica vírust foglalja magáim», valamint a pneusnovkust, amelyhez tartozik a respiraíorikus szmcíckjsnképző vírus. Az.iriiluetszaviruss az örthemyxevfrusek: családjába soroljak, és: az: Is antigének forrása lehet (például a HA-protem, az Nlprotem.i, A banyavinjs család foglalja ssagáha a busjyaforus: nemzetséget (kaliforniai estcephalitis. La Crosse), phlebovfoas nemzetségei (Rril-völgyí láz), riantasdrus: nemzetséget (a pursmaliu egy hestahagi» lázat okozó v írás), stairos srus nemzetséget (a juhok Nairobi betegségéi: okozó vírust), és; különböző, külön elnevezés nélküli bunyaunixoket. zkz arenavlrus nemzetség esetében .antigén, forrása lehet az I..CM és Lassa-láz vírus. A ree\lru*vk családjába sorollsk: s reovlras, röiavlrus nemzetségeket (amely utóbbiak gyermekek akut «asíroenienuseí okorraxi foívímsokal, és cislíivfeusswl íkolőrádői ksilatsEsdáz, Létembe (embereknél), ló eaeephakws, Jfox lyc’v” betegség).
A tetroforus családba sorolt vírosssk az oseovirinae aícsaláé tagjai, amelybe humán :és állatorvosi jéleotőscgü betegségek kórokozöií sorolták, például a.maeska 'leukémia vírust, HTLV1 és HTLVil vírusé, a lesstívírus .alcsaládot (amely íartáiutuzzn a humán tmmunáslíoiescia vírust (HÍV), majom immaodéfeSetóa vírust (SíV), macska Immonáéíícfonsla vírust: (FiV), a fovak fortözó kevésvérüségét okozó vírust); és a sposnsvírioae alcsáládot.
bzásneo előnyösen alkalmazható leutívífusasmgén ismert és választható. Ilyen HÍV- és SlV-anfrgénex például, de anélkül, .hagy jgóítyfotket a fitísosollakta korfutoznáaL a gag, p<d, kfo kpr, IW, &<»-, íat, W és /for-proteinek, valamint azok különböző fragmentumai, Az Env-protels ífogmeatumaském: alkalmazhatjuk annak alegységeik például a gpl2ó, gplóö, gp41-alegységeket vagy msek: kisebb fragmessumíilt, például azok legalább körülbelül 8 ammenav hosszúságú fragmentumait Hasonlóképp, választhatjuk a w-pmteín fragmentumait [lásd például az 5 891 994 vagy ö 193 9S1 számú amerikai egyesült áLlamokheíi szabadalmi leírásokat]. Lásd ntég a HÍV- és SlV-proteíoeket (Baroueh fr.H. és sntsai.: í. Vita. .75(5):, 2463 (2091)]; Ámara R.R. Science 292., 69 (20öí)]. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a HÍV és/vagy SÍV hmounegén proteineket vagy peptidéket más immsmngén proteinekkel alkoioh fúziós |»ntóneldcés|: álknlntazzufe. Lásd például a ftO t'4 s-7'ο vv.mu foozratenv sápra ^'ssfr í sugi-,ztu\ 2 3 m.anmt a At5<X: '»k84 <>','« tkozzeturi smpja; 1999, április 8.) nemzetközi közzétételihatokban ismerteiettHIV-l 7fr? és/vagy Ab) háziós proteineket és isnrtsusizáiási rendeket. A találmány szerinti megoldás .nem. korlátozódik az Irt leírt HÍV ésAagy SÍV immmsögéa proteinek vagy peptldck alkalmazására. Szakember számára a fond proteinek számos lehetséges módosítása ismert elvégezhető.. Lásd például az 5 972 596 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi lohákhuts íssncrteteíi módosítottgríg-protemt. Ezen telük bármely kívánt HI\ cwagv S.1Y misnussvgvO beputathatö egymagában vagy koatblnáelöban, Ilyen kombináció cspresszáltetható egyetlen vektorról vagy több vektorról. Adott esetbesr, a kömbissációfessi egy vagy több expresszálratott immuoogent adunk be, ahol egy vagy több immsnögénl' protein lorsnájáhan adunk be. ilyen kombinációkat az alsíbbiakban részletesen isasertetímk.
1004-fo-ol Ώ Sra )4
A. pttpovavirus családba sas sípA a pvly ómat írás alcsafádot (BKU és .1CU vírusokat) és a papillomavsrixs alessládoí (amelynek taglal mv; elvuhoz-asokkal és papítersa malxgsus etfejolásával kaptsotosskjb Az adenovirusok: családjába kigáti betegscgeket (> \aey eatóítsí Okozó vímokaf sorolunk (EX, AD7, ÁSD, O.B.). A. parvovínts családba tmo/o utasok közút megemlítjük a macska parvovirust (macska.entetvM oteze vírust), macska panleukopenta vtrast, kutya parvovímst és sertés parvovírnsí. A hestgesvírusek családjába tartozik az alpbahexpesvirinac Mcsalíid - amelybe a herpes símpfes vúxts (HSVÍ, HSYíí> és variceíla vírus (pseudorafeies, varieella zoster) asmzetségekcr soroljak a beiabetpesvirstiae alcsalád - amelybe a cyáomegalovirus fHCMV, muTOmegafovirvs} nemzetséget soroljuk és a gatttuxaberpesvirisae alcsalád: amelybe a Rmphoctypíovlnts és E8V nemzetségeket (Burkitt limphoma) fertőzd rlfemíraeheids vírust, a Marékbetegség vírusát, és rhadinovtrtjxt soroljuk.. A poxvírasok családjába tartozik a elmrriop>xviri.nae alcsalád, amely az orthopox vírus nemzetséget {varkrta (íekelebímlő) vaceinla (lebénbimíöij, parapoxv Ints, avtpoxvírus, capripoxvin.ES, feporipoxvirus, sutpoxvirus nemzetségeket és az, entotnopoxvöus alesaiádot foglalja magában. A hepadnavlnts család tartalmazza a Hepatitis 8 vírust, Egy még osztályozadan, sutigénfbrráském nikabnaxható vírus a hepatitis delta vírus. Az antigén származhat további vírusokból, például a madár fertőző burzabdegség vírusból és: a. sertések légzőszerv! és reproduktív szindróma vírusból, Az alphavtrus családba soroljuk a ló artoríiís \irust és a kíílőntxtzri encephalítls vírusokat,
Szhitéu a talíiiíriány tárgyát képezik humán vagy nem humán organizmusok humán és nem humán gerincesekéi megfertőző patogének, például baktériumok, gombák,, parazita rnilsroorgsttlzínusek vagy más többsejtű para/Cak elleni immunizálására slksdmazkatá, vagy rákos ssdíekhől vagy tunrorsejfekbőí száon&zó mitnenogctiek, Ilyen bakteriális pamgének példán! pálosén Grars-pozltlv eoeensok,, például paeumococcusok, síaphylecooeusok és síreptocoeeusoL Patogen Gram-negativ eoceusok például a meniírgococcusok és gonococcusok, Batogén Gram-negativ baeilfesok például az enterofeacíeriaeeae csatád tagjak a pseudemonasek, aeiaeíobaeíer, eíkeneíla; a írtdioidos;.s kémkozőísr (F. pseKtfomuriíM, salmontdíak, shigellák, baemopbíiusök, ntortsxe.llák, Η. (a lágylűkély kómkazöják hmcellai,.Fzí;KO.WMjHáí.m??ris fa íularemía okozója), yersittia ípastucrelia), Sfrt^oőítc/7/ífó· mmt/ó'/roruri és söirillntnok; Gram-pozibv baedíítsok például a következők' óirterin ???onc<v?i'./oeutvt, ΕηνίίηηΙοίΑίΆ Hno«:wfeine, CPívnebocteriízm Ugdtrorine (dipfeteris), a kolera korokozója a S. anthracis (antrax). a dönevaoöris (granulonta ingtánaie) károkozója, és a hartonehosts kórokozója (Bartonelfe sp.). Patpgén anaerob baktériumok által okozott betegségek például a következők: tetanusz, botulizmus,. egyéb elostridimsok által okozttö betegségek, feöeroulozís, lepra, más mycobaeíeritmr állal okozott betegségek Patogén spirochetúk által okozott betegségek például a szifilisz, trcyronematozísok. irántboesia. pint a endémiás szifilisz és leptospírozís. Magasabb rendű paíogen baktériumok vagy patogén gombák okozta egyéb fétáözések például az actinotnyeosis, tmeardiosis, eryptoeoecosis, bfestonyeosis, (tistoplasroosís és coceídíomycosís, carafldlaris, áspergillosis, tnoconnyeosís:, sporotrichosis, paracoceidórtnycesis, poúislididosis, iorsfeoris, mvcetosoa, ehrontotnyeosis és dsrrosfophyíosis. Siekeösía fertőzések például a tífusz, sztklásbegységi foltos láz, Q-láz, feiekettsíabhnló. Mycsplssms és Cblamydia fertőzések például a Afecop/rowí pmm.VKKiVíe pnstmxtma, a lyruphogranaloHta vcxterenm, psittacosis, és a periitaráiís chlatrsydia-fertőzésék. Fafogéxt esharioíák például pátogén egysejtűek és férgek, és azok által okozott fertőzések például az atnohiasis:, malária, íeisbmamasis, írypttaosmomiasis, toxoplssumsis, ?«e«woc vttris curiari, Triehans, Toxopfestm gosdií, babesiesis, glardiusis, trsshioosss, flliaríasis, schístoserniaisis, fonalféreg fertőzések, métely fertőzések, horogférgesség; és gahmdfereg(sa;dág:feregl okozta fertőzések.
HjO445-6B2.'SG \ CYn.er tor P teste Ί Λϊ>' 1 kper sí te sí el tma th a'te 1 'u na.' Ko < 1 V \ inn a fesd OTgsmznmsok és/vagy általuk teretek toxinck közöl több potenciális bioiógssi fegyverként is szásnltásba jön, ilyen biológiai ágensek például s kővetkezők: Síidiías umártteis (anfc&O, Ckm/dkOK ótriísámHaj és toxíoja
basw»ritagiós- lázak [filovtrusok fpéldátd Ebola. Matbatg). arenavtresok (például Lasss, Msclsnpo)], amelyek „A” veszélyességi kategóriába sorolt organizmusok; tox/ré/at ómvm/ri (Q-láz); Bincella species (femceltosís), Amkóöáferiö »m//e; pakonykőr), í/y;iMfefo pseüdamattei (xuelloidosis), Ő'icms etwwris és ioxluja (risia toxiiri, é7ős.o-á/«i.te /íer/mgOAU és roxinja (epszilon-toxínk Staphyiocoeeus sp, és toxinjm (eníefoíoxin Bf, CáfernyAm ps/ííöt / ftsadárijAenza); g vizbiztonságot veszélyeztető ágensek (például ®rá etow», Cn-pföspor/í/ia#» pő/ve/e). tífuszos biz · ΚΙίόζν.Άζ; prwjvo’eáö'í, vifuseocepbalítisek (alphavír-rsök, példám venezuelai löencephalüis, keleti lóeucvphaUtís, nyugati lóeaceph&liüs). amelyek jelenleg ,JB” veszélyesség? kategóriába sorolt mikroorganizmusok; továbbá a Ntppaa vírus és hautavhusok, amelyek jelenleg „£A veszélyességi kategóriába sorok ágensek. A jövőben azonban további tntkrtx?rganizmu$ute azonosíthatnak és/vagy sorolhatnak. 3 fents kategóriákba, vagy már osztályozott mikroorganizmusokat sorölbatsak más kategóriába. Nyíl.vártvaló, hogy a fent rtmertetett vúusvektorokat és más konstrukciókat alkalmazhatjuk a fenti míkroorgímizítmsokbők vírusokból toxinjsíkból és egyéb melléktermékeikből származó antigének bejuttatására abból a célból, hogy a fenti biológiai ágensek vko/ta fertőzéseket vagy más káros reakciókat .megelőzzek. és/vagy kezeljük.
T-sej'tek. vartabtltv régiót dkni irmnungések.bejuttatása a találmány szerinti vektorok alkalmazásával CTL-sejtefe Wm.ntukoövxen alapuló immm?vá!aszí vált ki, és elsraináljá a fenti T-s^fetó. RÁ-fcaa, a T€fe-ek ohx'wiáu1' x <.< sí. ’ k tEt.b<' ,cí \t' tested s: \zo tete- ! 'íIh .cg o u azé \ i* >A lut: ri A regiem példán! a V-3, Y-l-1. Y- }7 és W-í 7. A fetó polxpepbdéklegalább egyikét kódoló sukfeíssav-szekvenckí bejuttatása tékát célzottam sz BA kialakulásában szerepet játszó T-seiíek ellen irányuló immunválaszt vált ki. MSben, szintén s TCfe-ek több specifikus, a betegség létrehozásában szerepet játszó variábilis régióját sikerült azonosítani, Ezek a TCR-régtók a V7-é\ Υα-iO \ fenő p<'hpepnsfek legalább egyikót kódoló nukleuisav'uek'.encío bctatia’asa tettát célzottan, az MS tuaiakuUtexhan wtepe· átsző T-sejtek ellett trányalő immusvákiszt \ alt kt Seterodes'snában, a TCR-ek több speetf kos « betegség iétrshozásáőan szerepet játszó: variábilis régióját azonosították. Ezek a TCR-ek a V ó, \ b, V-U es Yo-ló, V«-3C, Yct-7, Vct-14, Va-íő, Vat-.l6, Verek és Vü-12. A fent; pollpeptiáek legalább egeikét xtetofe sekomhmáns sxmiaís adenovirus bejuttatása tehát célzottat!, seleroderma kialakulásában szetepet ja’s/c Γ-sejtek ellet: .ranyuló immunválaszt vált ki,
Á választóit gén terápiás szintje, immnstogesiíásáuak szimjs követhető a-msk megállapítására, hogy szükség vas-e megerősítő ollósra, A CDS* T-sejtes válasz, vagy adott esetben a szérum eUemmyagíiter meghatározóéi követőem megerősítő mmnarizáiásm lehet szükség. A találmány szerimi rekorebináns sírnia·: aáéí?o\ : is\eltört adott esetbe» beadhatjuk egyetlen adagolással, vagy különböző kombinációs beadási rendek szeoní például más aktív hatóanyagok beadását Is magában foglaló beadást vagy kezelést rend szerint, vagy első immunizálást és megerősítő immunizálásokat magábaa foglaló beadási rend szerint. A teelmika állása szerint számos ilyen beadási rc-x; ismert és alkalmazható.
Például, egy eisó immunizáfást és megerősítő hmnunizálásökat magában foglaló beadási rend szerint, először DNS alapú vektort (például plazmidot) adunk be. bogy az immunrendszert indukáljuk, majd második, megerősítő immtmizóíásr végzünk szokásos antigénnel, például proteinnel vagy Ilyen antigént kódoló szekveaI 06445-61A2/SG ólát hordozó rekínnbinánx vírussal. Lásd például 3 WO 00/11140 .Számú nemzetközi közzétételt iratéi, kvz/olétel napja: 2(100, rsámms 2.; amely teljes tép epeimében a kítanhás részét képezi. Az imtnoro/Ja.-.; végezhettük ágy iá. hogy a találmány szerinti rekomblnáns, slmíau sdenovlrssvekfori adunk be, hogy az antigént hordo/e vektorral (vírus vagy DNS alapú vektorral) szembea az; iroronnrendszer reakcióját megerősítsük, vagy proteint adunk be. Eljárhatunk úgy is, hogy proteirtt: adunk W, majd az antigént hordozó vektorral végzünk megerősítő iörmmtízáíási.
A találmány egy előnyős megvalósítás; utódja szerint, a találmány tárgyát képezi első immunizálást és: megerősítő immunizálási magában foglaló beadási rend kiválasztott antigénnel szemben, smelyhen sz antigént hordozó plazsníd ÖNS-vektort adunk be, majd megerősítő immunizálást végzünk a találmány szerinti: rekombíRÚns, simiart aóenovirasvektötral. A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint, az első ős megerősítő immorn/mast magákat- foglaló beadási rend szerint mtilriproletfo espresszáltatank az első és/vagy megerősítő imnumtzabsta alkalmazott vektortól [lásd például Amara R.R.: Science 292, 69 (2001, április), amelyben mult»pr»'«em hesosst rendéi ismertetnél·;: protelnalegységek emzresszálíatésára, ezáltal 1-ílV és :S1V elleni immunváiasí kivaimforu. Az ítnmunválasz redukálására elsőként alkalmazott DNS-sel bejuttathatunk például Gag, Poi. V 3f VPX, Vpr, .Env, Tat és/vagy Rév proteineket egyetlen tosszkriptemról.. További lehetőség szerint, a. SlVGag,Edl- és HÍV-Esiv-szekvescíákat juttatjuk be a találmány szerinti rekorohiastts ttutesi v- ^on- ruk. »o\ 1 le«>b't \< „ao r teA «'„Resa ,« ahux pvlisk' 3 WO 99/1ŐŐE4: és: WO 01/54 719 számú -nemzetközi közzéte-eii iratokban.
Az első és megerősítő immunizálást magában foglaló beadási rendalkalmazásanem korlátozódik: HÍV elleni immunizálásra, vagy ilyen antigének bej altatására. Az .Immunválaszt először mdukálhaíjok például egy, a találmány szerinti első csimpánz vektorral, majd megerősítő Immunizálást végezhetőnk egy -második csimpánz: vektorral, vagy az antigént protein fonnáíá'san tnrtaltsazó készítménnyel. Az első.és megerősítő immunizálást: magában, fogfotó beadási rend alkalmazásával protekíiv mmsurótást hozhatunk létre az antigén .forrásául: szolgáló vírusok, bakiérlnntok vagy más organizmusok ellen. A .találmány egy további előnyős megvalósítási módja szerint, az eko és megerősítő immunizálást magában foglaló beadás; rend alkalmazása a kezelendő állapot ktmutatására alkalmas szokásos eljárásokkal mérhető terápiás hálást hoz létre.
Az etso murumzaíásra alkalmazott készítményt különböző helyekre -adhatjuk be dózisfoggö módon-; az adott dózis függ az antigéntől, amellyel szemben immunválaszt kívánunk kiváltani;, A találmány szerinti megoldás nem. koriáfozóáik meghatározott dózisok, fojektáil^t helyek vagy győgyászablag elfogadható hordozóanyagjők) alkalmazására, As eljárás első és/vagy megerősítő humanizálást foglal inasában, amely lépesek állhatnák egyetlen dózis beadásából, vagy sőbb dózis órásként, naponként, hetenként, havonként vagy évenként történő beadásából. Az emlősnek beadhatunk példád! em több. 10-50 pg pkusudot hordozóanyagban tartalmazó: dózist. A DNS-készítmény előnyösen. ί-lOdúő gg üNő-vektort tarrslmaz. A DNS dózisa 1 íestíSíKeg-kg-ra számítva íigikssarr 1 pg ős IW pg közti tartományba esik. A beadás helyet: az em lős faja és all apó; a szerint vála.xzpak meg.
Az antigénnek emlősbe történő beadására alkalmazott vektor dózisát sz alábbiakban ismertetjük, A. vektort ágy alakítjuk beadásra alkalmas .foramva, hogy gyögyászaril&g vagy fiziológiásán elfogadható hordozöanyagbaa, például Izotőmás^ fiziológiás sóoldallm szuszpendáljnk vagy oldjuk; izofóniás sőoldaíok vagy más fonm-lák szakember számára. ismertek. A. választandó irordozöanyag: szakember számára nyilvánvaló, és nagyrészt ..a beadás útjótól fogg, A találmány szerinti készítményeket beadhatjuk a lén;, ismertetet; beadási «lakon, a
00445-6132 SG hatóanyag elnyújtott fetszalradulását biatesitó készítménybe®, biológiailag lebomlő, biokotnpaíibiils polimerben, vagy g^ökaí a oétett helyre juttatbsbuk «ticeUák, gélek vagy líposzőmák alkalmazásával. Adott erőben, ez első immunizálást ágy végezzek, hagy megfelelő meftnytségű sdjwMfe például a leírásban említett adiüvánst is adatik a készítményhez.
ioiop-en, a megerősítő Immunizálásra alkalmazó# készítmény! körülbelül 2-27 héttel az első nomui»zálásf kóieteví? adjuk be az emlősnek, A megerősítő készítmény az első immunizálásra alkalmazott DNSvakcinával bejuttatott antigént tartalmazza vagy képes bejuttató hatékony mennyiségben. A megerősítő készítmény tartalmazhat azonos vírusból származó rekombináns virusvefciort (például a találmány szerinti adenovímsszekveneláka!:), vagy más· forrásból származó vfrusvektott, További lehetőség szertat, a „megerősítő készítmény tartalmazhat a gazdaszervezetben kmuuuválaszt indukáló első immunizálásra alkalmazón. DNS-vakema. áltál kódolt antigénnek megegyező antigént de protein vagy pepiid dumájában. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a megerősítő készítmény antigént kódoló DNS-szekverteiáí tartalmaz annak: expresszíóját emlős sejtekben Irányító szabályozó szekvenciák irányítása alatt, például jól Ismert hskteríáits vagy vinjsvektorokar tartalmaz. A megerősítő készítménnyel szemben az elsődleges elvárás az, hogy az első Immunizálásra alkalmazott készítmény által kodéit antigénnel megegyező, vagy azzal kemszíreagálő antigént Unainsazzon.
\ ’ulaínutrv egy tovább’ eloryo- mcgwte?ttásí modm szerm·. a mldmarn -zurn-í -imun <:d<no\nusvektorokat különböző immunizáló és terápiás eljárásokban alkalmazzuk. A térni eljárásokban, a találmány szerinti ssrniart adesovirusvcktorokat eltérő szerotipusú kapszidot hordozó- Ad-vekterokkíd együtt, vagy azokhoz, képest szekvenciálisán adjuk be; a találmány szerinti adesovlrusvektorokat oejn-Aá-vekforokkal együtt, vagy azokhoz képest szeferertelálisan adjuk he; a találmány szeriíitl adenovuusvekioröket proteinekkel, peptldekkel és/vagy más biológiailag előnyös terápiás vagy inuounogén késziünényekkel együtt, vagy·’ azokhoz képest: szekvenciálisán adjuk be. Ilyen beadási rendek szakember számára nyilvánvalóak.
A csatol! példákban simian sdenovhusok klónozását és a találmány szerinti rekorsbínáns adénsvlrusvektorok elöáliitását szemléltetjük. A csatok példák csupán a találmány szerinti megoldás szemléltetését szolgálják, anélkül azonban, hogy igényünket sz ismertetettekre .korkkoznánk.
iifettaAT<yttás
A P,ms Λ1 CC nvhamariíssa szám \ R-5°I j, fano í AfCC nvth miUUm s/^m, k K-ó02k Fan'' [AÍCC nyilvántartási szám: VR-5Ü31 \ioasoka; - amelyek eredetileg csimpánzok nylrokcsomölbói lettek: izolálva 293-sejtekhen LATCC nyilvántartásiszám: CRI.1573j szeporimítök. Tipikusan, a sejteket 10% totális boijászérummal (FCS; Sígrus) és l.% |nínicíllinTsel/streptomyciíme.l (Sigraaj kiegészített Dnlbeeco-íele módosított bagle- · ép közegben szaporítottuk (DMEM; Sigma, St. Louis, Mö)> A 293-sejíefcet 2% ECS-sel kiegészített DháEhííápkőzegbea fertőztük az első 24 órán át majd FCS-t adtunk hozzájuk ICÁT végkoneeírtráelőlg. A fertőzött sejteket akkor gyűjtöttük össze, amikor a vírus által indukált eítopáií&s hatás igyíopmáíí «nVcf. CPtA a «ejtek lüŐTö-ában íuegfigyelhetö vek; ekkor, az összegyűjtött sejteket: cenírilagálássel koncenmhuk V ülepíted sejteket 19 mmei/Ί Trls-pufferben (pll~k,Sj szuszpendaltuk. és három fegyaszrás-olvaszks mklu««al hrákattuk A viniskészitményt eézium-kiorid snriiséggratlíensen két lépesben ultracentrifugáitok, ma,d vu-ashoncvuttuíutnot lő mmeí/l Tris/fŐö mmel/lőO mrool/l NsCl/őOőá glicerin összetételű, puf&rben l-SxTQ!/· fes/ee-Ae nd deozitásig higitöttuk, majd -TtriC-on tároltuk.
.9''4+*-6Ι tg Sít
Egyéb .«gm-humárt »deöövkas-í.zerotípus<’k· ssapcrodására vonatkozó ismeretetek alapján, a 293sejtekben a várakozást feiülmólő adeno n is hozamot értünk el,
Vírus Hozam iyirusrészeeskeNxIif ,sejt) i
IfenS 'M......... |
Fané ..............................................j
fan? 8Axlö:T 1 ,. ......................................J
2, nélda
Y η usgy tk-Ki DN$ iélíemzése
V 1 pekbbnn ismertetettek szerint kapott tisztított: vímskészionénybölgenosni DNS * '.'ntáhunk és azt llmdííl vagy Bandii restrikciós enzimekkel eafeszieníik. a gyártó utasításai. szerint eljárva. Erédméáyeisk szerint (amelyekét iíraem. ttesíettük fel) a találmány szerinti FasS-, Partb- és Fan7-gsnom és a á^ákkodalomból ismert Fan9-genom (CŐ8) eltérő resiriketős: basttásí mintázatot ad, tehát m egyeznek meg egymással.
Meghatároztok a: ftmS--, Fané- és: Fah?-geaom nukleöbd-szskvöncíáiáí. A fan? DNS felső szálának ntskleobd-szekvendájáí az f. azeaesítószármt szekvencián adtuk meg, A Panó DNS felső szálának nokleoridszekveoelőját az á. azonoslfeszárml szekvencián adtuk meg. A fan7 DNS te m> ->,'dttak ttAeAis/ek<. eoccy.tt a o azonos üószásnu szelő encián adtuk meg.
A virus-DHb-szekveítclák szabályozó és kódoló régiéit ismeri sdenovims-székvettclákkal mutatott hymoiógiáíufc alapján azonosítottuk. a fent ismertetett Xtostal W” program alkalmazásával, szokásos beállítások mellett. Az adenovíms-szekvenciákat lásd a fenti táblázatokban, A nyitott olvasási kereteket transzláltuk. és a következtetett amiaosav-szekveneiákat korábban leírt sdsnovlrus protem-szekvenciákkal -- Adó, AdS, Ad'?. Ad12 és Ad4Ö - hasonlítottak össze.
A. szekvenciák analízisével a genom szerveződését barnán adenovírssok szerveződéséhez: hasonlónak találtuk, a legnagyobb fokú hasonlóságot az AtH esetéhen matattok ki. .A csimpánz adénovámsok és más xmort ade.oovlru.sok, ezen belől az AáHud bevon bípervariábílis. régiói azonban jelentős eltéréseket tnöfattak Fx-ket az eltéréseket tükrözik a megfigyeli: szexológiai kereszsreakoiók is (lásd az alábbiakban),
A iievoittszekvsíKííáfcegy részének páronkenti összerendezését matatja az 1 ábra. A bemutatott részlet: bevon kifele tuegjefenitetí, a vírusból profekíáiodő DEl- és EGi-lturokrégiőjából származik. amelyek a legaagsobb felni variabilitást matatják a különböző szerotlpusok közi. Megfigyelhető egy, a hesou bázisának felépítéséhez hozzájáruló:, a különböző szeoatípasdk közt ttagyntértékbsn konzervált közbeiktatott rész is (az ADC68 3Ő8-368. ttukleotidjaíffisk megfelelő szekvencia; lásd 6 083 7íő szánni amerikai egyesült llUotckbeü szsbadalnd lcira.-í! Az aínbbs í;fe:&.'.ub.m a ttexonproteuuk am-n^sar -s/ehvwe ímanak porookentt s.:-ekven<iaőssserendezésével. kapott adatainkat foglaltuk össze.
Összehasonlított szekvenciák Hexonuroteinek arttmosav-szekvene iájának hasonlósága (%)
:AÍ #2
| Adó. 5 AdC? 99,0
| AdCS AdCéS 98.3
AdC5 AdC6 88.0
100945-6132. SG
AdC5 AdCl 84,9
AdC6 A<sC7 87.7
AdC6 AdC68 87,3
AdCő AdCl MA
AdC7 AdC68 97.5
AdC7 AdCl 80
AdCóS AdCl 84,9
A csimpánz adenovirusok tibergóöibdortónjáoak (amely a receptorhoz történő kötődését fétetSs) strííkíárája összességében hasonló 62. ábra). A h&Ad5 es. Có$ E1 -proteinjének szekvencia-kasenlósága fíásd az alábbi táblázatokban) nagyjából megfelel a huAdS és kané, Panó, Paa7 szekvenciák közti httsonlóságsstk..
Ósszehax'nhm saA> cn.uk El» (13S) agwesav-szekvanclák azonossága (%).
#1 #2
Ad Hu 5 AdC5 36,6
Adllu? AdCó 28.5
AffittS AdC? 34,9
AáHuő AdCóS 35.6
Adltuö AdCl 55 Á
AdC5 AdCó 68,3
AdC5 AdC 96,9
AdC5 AdC68 80.4
AdC5 AdCl 51,3
AdCó AdC 7 69.3
AdCö ÁdCóS 59,4
AdCó AdCl 37,7
AdC7 AdCóS 31,5
AdCv AdCl 51,6
AdCó8 AdCl 54.9
Szekvencia-azonosság mintás AdS-szekvenesával
Elb kis I -protein Eth nagy Tetetem
COS 4Ά3·-χ 55,839
Panő 43 2% 54,549
Panő 45,3% 54.5%
Part? 4» 4% 53,8%
•V \dt 5 AdÖS és AdC7 replikáetódefkiens változatait állilottak elő molekuláris klónozó:.eljárásokkal, az jteb'n pctóavtn» ismertetettek szerint, ügy. hogy nteheénkazeífáítet mszertáiiunk az Pia- és Eíb-gének hehére Λ mkombrrsáns vírusok Honjai! izoláltuk, és CsCl szeduneniácios eljárással 293-sejtekben szaporít»;·· Iák hagy hiéRöyíségbéá -órténó fis/titásra (Fnehcr X. és tntsai.;: 1 Viták 76, 52Θ {19901). A vektor hozamot 50
100445-61.32/SG lemez alapján határoztak meg {150 mm átmérőjű lemezek), amelyeken körülbelül 1 x lö'5 203-sejtet fertőztünk a megfelelő vírussal, A hozamot ágy határossal meg, hogy spebrolötömefrlás ötön mértük a vlrnsrészeeskekosceutráciőt Miután El-deistáit vektorokat hoztuok létre, megallapílfóhök, hogy KEK 293-sejiek íhümtm adenovirus-ó El-gént evpresszáló sejtek) transz-kompiementahák a? tg vjtus'.ektorek 1 l-áek-oon, es azokban magas titerü vimskészitmény áliithatö elé. Néhány rekembmáss viríts esetében kapott virusboxaraokat adtunk meg az alábbi táblázatban,
A vektorok transzgenxest fl-ualaktozídáz (LszZ). zöld öuoreszcens protein (GÉP), alfá-l-amitrípszm (AlAT), efeóla glikoptotein (ebe), a transzmembrán eiíopbzma döntést sem tartalmazó szohíbiiis sbola gk képről»;» variáns: (sEbo) gént vagy az efeokt gltkoprotets deléeiós mstáasaiaak ÍEboA2, EööAő és EhoA4) megfelelő géneket expresszáltak a eíramegstetrus (CMVt prométer irányítása alatt, A következő táblázatban „ND” jelentése az, hogy az .«doh vizsgálatot még nem végeztük el.
Tterts/gen Vírusra/ vektorhozam (Ylrasrészevske s.l0:“)
ArfHtö AdC? AdCöá AdCÓ
CMVLacZ 1.5 ...................1,4................... 3,3 6,1
CMVGFP 2,5 3.6 8 10
CMVA1AT 3 6 lö ND
C'MVFibo 1,1 4,3 ND ND
CMVsEbo 4,9 ...................3,4.................. ND ND
CMV EboA2 I 9.3 ND ND
: CMV EboA3 0,8 9.3 ND ND
CMV EboA4 1,4 6.2 ND ND
Á humán sdenovirus-El-gén El-deleták csimpánz vírusokat Izansz-komplementálö képessége előnyös, mivel lehetővé teszi a találmány szerísti El-deisták csimpánz adenosárusvektorök termelését, emellett, a humán Ad és a: találmány szerinti csimpánz adenövirtís-szekvesoiák közti eltérések süaft csökkenti vagy kiküszöböli a homológ rekombináció esélyét.
AJAlík
A hoxon hípervaríahilts somok part megtlgyclhetö eltérések miatt azt vártuk, hogy a €5-, Cő- és C7vírusok szetOÍögíailag eltérnek a tette adenevirasekiól, ezen bélül sz Affia-d-vírustöL
Vad-tipnsű vírusokkal mutatott eliesartyag-kemsAreaköGláa meghatározására vizsgáltuk az elleaasyagok feglikáeíó-korapetess vírusok eitopátiás hatását (EPE) gátló képességét Rövidet!, a vizsgálathoz 5slOn részeeske/ml koncentrációban tárolt abesovirns-készhményekei (Adhu5. PanS. Panö, Part? és AdC68) hígítottunk l/őöö .aránybes. Azért választottuk ezt a koncentrációt, mert azt találtuk, hogy neutodízácló hiányában 48 őrás beiül 1ÖÖ%-os eitopátiás hálást eredmény ez. Mielőtt & vírusokat a 2A? -mséhez adtuk volna (4x40* se t kuk, 96-lyukú lemezeken), azokhoz 1-,20 arányban hígított szérumot adtunk, A vizsgálatba» a CPE kialakulását vagy stnítak hiárnái értékeltük; Seijes neütraltzáeiö esetén eitopásiáft hatás nem alakult ki. Eredményeinket: az alábbi táblázatban szegeztük, Az a megl'igyesés, hogy a 3 b humán szérmobót 9 neuírallzálta az AdhuS által indukált CPE-t. összhangban van a ncutralizálő ellenanyagok előfordulásának becsűit arányával a humán pepuIÖt)44S-6B2ISG ládőbss, A számok a oeoítaisációt -matató egyének számát jelentik (számláié) az összes szart egyw számával szemben (nevező). 30 jelentése: nem vizsgáltak.
Neatralizádé V2Ö arányban hígított szérumokkal
Hümár· (N--36) Rhesus (N~52) Csimpánz (3 30/
I AöhaS 936 NI) ND
AdCóS 1.36 0/52 12/20
• Pata 0/36 0/52 1030
Pata 03ö 0/52 930
Pata 036 0:52 1220
A szűrt humán szérumok közül 3ö-bot 35 oetn semralizáta az AdCő8 hatását, és 36-boí egy sem neatralizálía a Fan5, Paaő· és Pata dtopátlás hatását Az 52 vizsgált rbesus szérűmből egy sem neülralizáha a csimpánz adenövírtisokab a rbesns malmöi eloszsréfetíei alkalmazzák pís-klohkal modellként HiV-vakoinák tesztelésére. A 20 csúnpánzbésl 9--12 szérumé .matatott ielettes mértékű neahalizálé íratást egy vagy több csimpánz aáenovírussal szemben, annak megfelelően, hegy azok valóba» endémiás esimpánzspedfikus patogének. Ptóc.fees ísódcm, néhány csimpánz széruma csak a tanS, Pata vagy AdCőh utasok d)es tanaimazoti aeuirtazafe ellenanyagokat, alátámasztva azt a feltevést, hogy ezek a csimpánz sdeso vírus vektorok nem kereszt•sststralizálják egymást és különböző szerotlgosokal: képviselnek.
Ugyanezt a vizsgálatot végeztük el 2Ö csimpánz szérumsnntávnl, A. ntmiák fele {50%-íí} reagált szerolögíaítag. bár különböző mértékben a Pauí-vínjsnkkai, 4Ö%-& a. Pata, 55%-a a Ptte?, es őöSfea a GÓ^-vúusokkal. A pozitív szénirominták közül egy íartolmazetl erősen sestraltzáló tatásé elfemtnyagokal minő a négy csimpánz vúussíü szemben.
Λ különböző szerotipusök közli kcreszt-neutrallzáckr prabossöh meghatározására magas Isleré poliklooális ellenanyag-készítményeket álltatok elő a síroíau sdettsvtasök eto; Azok előállítására syul&kat immunizáltunk iRtramuszkuiansaa, a CS8 csimpánz: sácimvlrnsokkal végzett korábbi kísérletek alapján adsuvcntacnt GHM herd>V'> rea'Vrbsmms \noso\k.d \ >.'ensmek seatreb/aio jtaitbil tvs/íebuk .. barom, takilmcmv szerínn csimpánz adcnos unssai - AdCS, AdCő és AdC? -· szemben \ n\ okikat. testtömegkiiogrmnmonkétít fedő* C68(M\GIP virosrészeeskével injektábta httamus/takiiiSsHt, autó 5 hét múlva, azonos dózis altaintartaar al megerősítő immunizálásban részesítettük. A ki lenc hetid később levett vér vizsgálata azt: nmtatiu, az igen tetékooy seuírdizáió aktivitású C6S-, vaiaormt Pan-5~ és Pas-7-virusok ellen, de nem áéttíralizalő Psn-6-vírussal szethbeo (lásd az alábbi táblázatot), ami arra atal, hogy egy C68 (vagy Pata vagy Pau-7) alapú vakcina isatokony nnsnonizálást biztosi that Pan-6 alapú vektort alkalmazva megerősítő untrtsnszáiásra, Megfigyeltük azonban, hogy a vírusok közli fenti mértékű hasonlóság nem szükségszerűen akadd} ózza az ismételt beadást olyas sziíuádőkban, amikor a vtasdlones eilenanyagtiícr nem olyas magas, mint a fenti kísérletben a nyírtakban kiváltott: eltcnanyagszint, Az· alábbi táblázatban * jelentése 55% CP£, Ή- jelentése 6ő% 03; és t-íd jelentése 10(1% CPE.
100445-6132753
293 sejtek fertőzése vimssuk:
Pané Partó Fan? Fan9lC68i C68 GFF Szcrunsíuglíás
y ÓH·” - - 1720
ü;-é - :-..................................1 :- 9/90..........................
:-· - - - 1780
- ----- 4 - 1/160
:- --m- y - - :1/329
:- :- - :-- 1/648
:- : •í-h- :- - :-..................... 11.280
B-B : 1- - 1/2,560
:- ----- :~ - :- 175429
:’T - - - in 0.240
H- l-W-H ττ :- 1/20,480
:« -H~r i 4-4·^ - 9 1740,969
•i-b ' +-B- Í4· -4 1781,920
+++ h-b- ' 4-4- .............' : 44 17103,840
' V V V -B-i- -i-B- H-Í--Í- B-B- 1/327.680
-i-t-S- -i-A- H-B- :-!-!-+ 1766 5 3 60
-r-h-r ΗΒΗ H-B- 01310,729
feti •r-hB -Í-Í-+- -fB- ,,n. : 1 5 ? 1 2,021.440
Az, eredményeket neatrahzáló ellenanyagok lato.uvmtc -ovl.m,o vra^ttt v ws’rtrt a viiw euk meg, amely GFP-vektor tra»s.zdukesóján alapúit Röviden, C5?BL76-egcreket iamuisizáiteak útttamuszkulári.suti vagy intravénásait 5,0.xí0’f rcsrecske/'mi ?aa$, Paaő, Paa? vagy C68 kcszjhxnénsyef. Huszonnyolc (28) nappal később levett: szérumokat keiesztaeíitnrtizálő akfivMsra: íeszteÖSrik: CőOGMVbGPF-vííossal szemben 1/29 és 1/89 hígításban, Összeibgialva, araikor gyógyászati célra előállított barnán immunglobulin készítményt •exz-eltitek Psnö, Partó, Fan? vagy C68 vírussal: szemben mutatott: szerelőaiai reakciókra, alacsony szintű neulralszáló aktivitást tapasztaltunk a Fan? és Cö§ vfeusofc esetében, Ugyanebben a vlasgklatban 36 'humán szérumot is íssztekűnk, A szérammisiskaí 1729 hígításba» vizsgáltuk. Bre^a&iyelnfe szerint csak egy egyén széruma tartalmazott nyilvánvalóan nsutraíizálő aktivitású eílenairyagöten C68--virnssal szemben, Nem mntatiísak ki neutelizáló aktivitást a Pfméfe Partő- vagy Paafevirusökkal szentben.
Vizsgáltuk a FasS, Fané, Part? és C§8 smrtaa adeuov busókkal szentben elbállboit, magas titeru: pobkionábs ellenanyagok sírnia» sdeno vírusokat keresztneutrahzáiő íratását.
Nyníaknt imniunlxákank 10:'’ esimnánz aáenovitusrészecske msra»mszku;á.ris beadásával, és megerősítő inmmmzáiásí végeztünk 40 nappal később, azonos dózis aikaímazásávai, Inkomplett Freund-adjuvánsssl, A szérumokat neutralizaió elkmanyágok jelenlétére analizáltuk oly módon, hogy azokból felező sorozaílngitást készítettünk, és a megfelelő, GFP~t expresszásó csimpánz adenovíxusvetart lö-> genom kópiába® tartalmazó szasspenzlóvai fertőzőit 293-sejteken GFP-expressziét szuprestolő hatásra teszteltük, A GFF-exptcsssiöt 5Q®oÍ89445-Ó132/SG has gátló: hatású szénunhigdást tekintettük az adott vfrnst tteunnkzálő ellenanyagtrsernek.
Erednréjiyeínket az alábbi táblázatban adtok mjg Adatotok jő egyezést mntotnak a hexon aminosav«.tekvrtKták ^zekvenmu-analiziízt alapján várt «festményekkel, mely szerint az. Ad Ran-6 a szerolúgiaílag várhatóan .egsttkúbb díero a többi csimpánz ndertovírsstdl.
203-sejtek fertőzése lo’geomkópiával
Szérum az alábbival immunizált nyűiből Ad Fan-5 Ad Pas-6 Ad Pan-7 Ad € 68
Ad Pas-5 1/5120 <1/20 I 2560 1/2560
Ad Part-ó Wtotsdssácto nélkül t (20,480 U/20 <1(20
Ad Fon-7 1.(2560: 1(160 h IÓ3A40 1(2560
Ad C68 öíeníralizáeio nélkül <1 20 <020 1(5 í 20
Annak maghatározására. hogy a ssmtoö adenovírssokkal ksresztreagáíó ellenanyagok prevateneí&j t várhatóan alacsony-e a humán populációban, az SV1, SV32· és SV25 srnhan adeaovírusokat antu nézve tesztekül, hogy kereskedelemheti hozzáférhető kevert homán immunglobulinnal (lg) hrk.ubáíva képesek-e a úeutralizáió hatásnak ellenállni. Ugyanezt a vizsgálatot elvégeztük az AdhsS vírussal és a ktm5, Pasó és (Fan?., valamint 038 csimpánz adenovírusokkal, Egy további kísérletben, a €5, Cd, C7 és C68 csimpánz adenovirusokkai ínimanizáh egerek szérumát teszteltük az SV-15, SV-23, SA-1.7 és Baboon majom adenoviftisokaí: fceresztneutrslizáló képességre. Egyik esetben sem tapasztaltunk kemztoeníralizációi.
4. példa
Mixfostom ρλ pto/mídot aduoitunk elé ügy, hogy a pX (Clontech) Í?áí-gémégiö)ában heíyspeciíikus nrnmgt'nezix'.d rocgs/üntvKük az FspEhelyet. Az tgy kapott módosított plazmíd, pX’, 30ööhp cirkuláris plaztntd, amely fi rephkactóu origót (oríj és ampicillm-toaiszíeociagőnt tartalmaz (AmpR-eds).
A. A Pan5 sdeoovímsplazmid előállítása
A pX’-phzsmdban poiilinker· hoztunk létre a Pan5 DMS-fí-agsamtotn szekvenciális klónozására, A polilmkerret a mar meglévő pX’-poHlinkert helyettesítettük a plazmád áí/uí- és £ceX/-enzimekkel történő emésztését követően. A Paa5 |tompa vég. - ése/j frngnicntumáí a poíiíinker Ssö/- és .őkitMsdyei közé mszertáltuk. Ez a fragmentum az adettovírnsgenom 5-végét tartalmazta (az 1 azonosítószámú szekvencia szerinti 1-36ÖŐ. házaspárokat). A Psn5 S«uŐÍ-rsp/-frs^t^mtmn»t (az 1. azottoshószámú szekvencia szerinti 4553484. bázisokat) a pShuttle (öomechí egy rövid, Aí/éa- és £/-Sce-helyek által határolt szekvenciájával helyettesítettük, ttetgy az adtmotK sgenottt El-régióját ehmittoljuk. A.kanS |£«d£t - tompa végű] fragmentumát (az I. azo.oosítőszámú szekvenert szerinti 28 658-50 462. bázispárokat} a pöhlirrker be sós teve ipszertúltak (hogy az adestoyimsgemmt 3'-végét a konstrokeiohos adjuk): az /XeódfátAEag’neríhintot (az 1. azomteköszámú szekvencia szerinti 3őOó-Í.5 135, házaspárokat) a poítbaferbe mszertáltak, és az ΜΛ<Ζ-£ροΛΖfeígmontumot (az 1. azortositószáinű szekvencia szerinti 15 135-38 088 feázispárokaf) szintén a polihnksrbe inszertáltuk, Adott esetfeed, kívánt ftonszgéht íhszertálunk. az: újonnan létrehozott pX'Pan5AEl-vektor.A(?eiíé- és íV-„%-t7- helyesre.
A kiindulási pX-plazmidet a pAfoX-aáenovírus-pfeznodbói í Ctooíech) állítottuk elő a fent ismertetettek
30445-6132,'SG szerint. Ezután, a pX /AmeA.Y/;o./~róg lóját deletálíuk, és a tompa végűvé alakított Psrő-polüőtkert a EspAhelyre mszertáltuk, így kaptuk. a pX' PLNK-plazmidot (2994 bp}:. A P;ut5 S’-vég-zfeizí-regíóját (pz L azonosítószámú szekvencia szériáit 1 -3607. básíspáro&at) a pX'LNK S«íri-Xsabfeelyctre inszertáhuk, így kaptak apX’Ea«5-5’plaztnídoí (§391 bp). -A pX'Pat-5-5' SnaBí-Aífeterégióját kivágtuk, és a pRClS-piaztnidról PCR-amplInkáít
G?tv2fea-k&zedávai feslycttesitefrük, a fenő módon kaptuk a ρΧ'Ιόηνό-ό'ΑΕΙ-ρΕί/ηΰή.η ι B7 + í«pj Röviden, az /-iámé és FASkéö ritka hasítási ijelyekst ismlnmsó szekvenciát IXlR-technoiogno el ausphrtkáltuk a pESGHa/tnídrol <3112 bpí Λ ?' I\ R-ianctndít·' \'del heh hozzáadását eredményezte a FCR-tcnnékbez.
,6 pX'FaaS-5’A£í-pla23»idba« (4374 bp) a PanS-DNS-t ágy bosszabbkettuk meg, -hogy abhoz a Ran5 Fsaí-34á</-régíőját (az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti 3607-15 535. bárispárokaí) adtok, hogy megkapjuk a pX'Pao5-S’Mfe“pbzmiooí (159(10 bp). A PauS-szokveítcia fennmaradó 37á/A3’-végét (az 1, azonostfószánra szekvencia szerinti: 15 135-3a 462. oárispátokaí) a vektor poldtnker A/W-£?o#r-hi'íyei köze («szériáitok; így kaptok a pX/PahSAEl-piázirítdot, amely az El-régióban áeletalt, teljes hosszúsága Ean5szekveociát iartahnaz.
A pX’EanSABI-plszmidból fsMwte adesovirusokat úgy állítottunk ele, hogy a píamidöí Elpobpeptiáct exprcssxáió helpetreí együtt ko-traaszíéktáltuk, vagy EI -expresszálb becsomagoló sejtvonalba, például 293-sejíekbe, vagy a léHriM· ismertetettek: szermi előállított sejtvonalba irsnszfektáhuk. Az El expressriója a becsomagoló sejtvom \m iebetövé teszi a PanóAEi repiiáeióját és virjoakapsztába csomagolódúsát. .A feuálmáay egy előnyös megvalósítás! módja szerint, a pX'PausAEl-trassz&ktúitcsomagoló sejteket a fent ismertetett traaszgént: hordozó aáejxtviraxvektorrai mmszfektáljuk. A helpervfeus és plazmái. közt homológ rekombináció jön. létre, ami: lehetővé feszi, hogy a vektorban található adeoe-vlras-trímszgén szekvencia replikálődjoa, viritaskapszidha esomagolódjon, és ily módon rekombisúas adenovírusok jöjjenek létre.
A trasszíékciőt követően lágya,gart rétegezőnk agariemezere, 2 hétig állni hagyjuk, vírusplakkokaí gyűjtünk» a vírusokat, felszaporiljók, és a transzgón expresszíőjára szűrjük. Ezután, a plakktisztitást többször ismételjük, és a. vhusteoyesiteteket felszaporitjuk. Végül, a sejteket összegyűjtjük, vírusesfraktmnot készítünk, és a idváof tmnszgéní tartalmazó rekombinátts, csimpánz adenovírust CsCÍ-gradiensben végzett sürüséggradiens oltracenúáfeg&lással tisztítjuk, vagy szakember számára ismert más módon tisztítjuk.
áiaátte El - deistáit Panó-vektor előállítása ,LI§rtónábsj^
A Psmő-\ cro.'.t pronáz és promináz-K-kezeléssel, majd fénolextrakeiőval protei-mresne.siteííök. A víras©XS-bes sziotehknx l ? bp Ehod-liakereket 1 lgálásnk Serkner és Sharp áltat leírtak szerint ÍNueteíc Aeids- Research I i. 600? í |9g?)l. Ezu-áu, o rirus-DNS-í Xhoí-enzímmel emésztettük, hogy abból 5'-fragmentumot izoláljunk <6043 bp}, Az Adó Xbalriá'-fragmentumot pX-plaxmidba bgáihtk a SmíriAEW helyek közé, így kaptuk a pX-Ad?ami-0-16.5-plaz:ínidot; A Fa; ¢7-link erekkel ellátott vtros-DXS-t riacfeeuzhruííel emésztettük, hogy óbból a «47$ bp l’-tenoiaális fragmenaonot izoláljuk, és a pX-LIKR. Faeí-SméJ-Wyeire klónozzuk; a lenti módon kaptuk a pX-AdPat!Ó-S2-100-pia2:tnidot,
2*A2XljÍgisJe^al^OAáJdó^
Az Ή-régió deletálásúra (műt. 1,2-9? a pX-AdPan(s-á2-lÖ0-piazmiá RóIRsáTmAfragntetttptnát $ nt.«.9;fO44*-.s32 fe,i
1X-őagmeotum ot aí teou, fenőés JW-euzmekkel kezelt ECR-Sagmentornntal Ixílyettesitottük; így kaptak a gX-Ád-Panó m.u.v-11t’.f-plazuúdoí.
Először, a pX-Ad-kaué nr,u,ö-l,9-16.5 S’-klónt. hosszabbiíotoik meg ügy, hogy a kanő-genom 2, Aőo/ó-aztaentosná; (4350 bp. 10,5-28) a pX-A<t?an6 ttvn.O-1,9-16.5 Aítelxftyére inszenáltuk. fezt a konstrukciót pX- Aö-Panó trsu.;')- 1,9-28-phzmiának neveztük.
Másodszor, a X-kiónt is meghosszabbítottuk oly módón, hogy a Paöó-geuots ,m,u,41-gSkszefcwtciájáfc átfedő 1:5 026: bp Mf»//P«eZ-&agtnenr itnot a pXAdPanó-62-löO íVZuZ/PocZ-belyáre iuszeriá&tk.
Ezután, a 8fő?bp ,07ndZ<ő'XceA~// Panő-fragntenöanol izoláljuk g pX-Ad-Panő ηκι,ό-1,9-28plaznxidbőX, és a pXAdFaoő-dl-lÖO-piazmidba ioszertáltok a ffísidtff és tompa végűvé alakított A)W-helyek: közé. Ezt, az 5'- és: 3'-szekvenciákat egyaránt tartalmazó fúziós kiónt pXAdEan6~b-I!9-19,5dí4-iö0--kiótu3ak: neveztük.
&AweBÍ^^Í^Mte^M4Hl>^.á..?S?á^ÜÉQl5a
A Puttó 16335 bp ihnüiil-Aaemsníutnát íin.u. 19.5-64) pXAdhaH6-(í:-i,9-19.5X4-iÖd Biodilí-helyé úíszíírlátok, így kaptuk a pX AáPaaó-0-1X-1 OO-plazstuifct.
2_ΡΚΛ?5_1λ 'k\u msrx. e u^^jmegsp km tktati kn vetem ktonoovara o.i rékombináns írartsziőtznánsokzöid fehér megjelenés alapján történő szelektálására
A GEE-gént te-promótet ufegtea .dal» evpresszálő, ritka, imronködotó restrikciós· enzim hasítási helyekkel - Fl-Sceí és .i-Cen 1 - halmok ntsregejtkazeríat izoláltunk a pShuníe-pkGEP-plazntidbésl fiuszert nélküli) Síit?/- és /Aö/ZAenjésztéssei, majd a ragadós végek iéltöhésével. A pShuttle-pkGfP-plaztuiő (túszért nélküli) 4f2Őhp hosszúságii, és Co&V-Ori rsphkációs origót. kanaEnycin-rezisztenciagést, píoe, LaeXyproruóterGFEtouM-lcds szekvenciát (ÖoPfech), valamin; GfePtnutS- 1 ods (Clorttech) szekvenciát tartahuaz, Ezt: a. kazettát 6?y?-onzímmel emésztett, tompa 'Zg.t'-e a Kilőtt pXAdPanőfe-l,9-iöO-píazmidfea szutjklóuoztok. Ezt a végső konstrukciót gX-Pauö-pkQEPhanÖ' 1,9- lOO-plazmidnak nevezőik, és az alkaltnas a kívánt géneket, hordozó, rekombiná&s, El-deistáit Parsó molekuláris kiónok előállítására oly toódoo, hogy áhhu a gént közvetlenül Egáljuk, majd a kapott klöuokaí az eredet; pShuüle-pköFF-vektorokat hordozó Másoktól zoldÁéher megjelenésük alapján szelektáljuk.
i«Bttgggaj .LJGvégiEtagsteEhapak.Mpupzásg
A Panő-virust pronáz. és proteináztekezeiéssel, majd feaolezítuke:,nul a test: leírtak szerint proteisiVfantesitstiúk, majd a tets-DNS-hez szintetikus 12 bp ErtaX-Ivukereket ligáltunk. Az AdáXhalő’íMigmeteuruoí izoláltuk, és pX~p;sz;mdba ligáitok, igy kaptok az A-pontősu ismertetett pX-AdP'ajfe-ö~iő.5pktznhdot pM22 hpj.
Az E1-gén (tn.u. 1.2-9> ddetálásáitv' .. p\- \dP.t ;6-0-i6,5-plazmídoi 5'mSA és: AbaAenzimekksl emészteltuk. évadai .v E’a- es Elh-grotevke: -<. xrio t, tokai t3442-ó3ld pp) cteo!óvtuk E/t.íen a kapott vektort Bsnvt-eítzimsnel emésztettük, hogy „ s..zUkti, markért hordozó múEgés kazettával kompatibilis tompa végeket kapjunk.
3;..5zeiektivynugrker beiktatása )i)Ő44S-ŐÍ32/SG
4ο
A Gf P-gént kíc-premóter irányítása alatt expresszáió. ritka, iaírcnkódoló restrikciós enzist hasítási helyetek®! ~ Fi-Xcel és 1-Ceu 1 - határok reimgén kazettát Izoláltunk. a pShutíle-pkGt P-plaznridból a lent leírtak szériát Ezután, a Z??z!fró-&pAfrsgs?sntnu?ót az emésztett pX-AdPaaő-ö-lő.S-plazmiddul ligáitok, hogy megkapjak a pX-AáPan6MUÖ-16.5AEl (7749 hp) ötezreidet.
A $X-Adf aaóMUö-ló.SÁEl-piaaruidof .Yföri-enzimreel emésztettük, begy abba egy JlmAfe&dirskerí ligáljnak. Az AdPanő-genornból XbakKsíH-fragmeraíUHUít ízekdtunk (mnzb-löő, 26241? bpk és tó az: xt7'o/2?s?'j7-cmcsztet! pX-AdPanőMEÖ-l.ő.5ÁEl-plaamídha ligáitok;: a festi módos kaptuk s pX-ÁdkauőMOÖl,<!-lo 5.2k~lv0~pktzmidot A Főmó-genombél Izolált második XhákfragiHemumoi (mu 16.5-2$; 4351) bp) hgahunk λ fend plazmáiba, bógy megkapjuk a pX-AdPan6MXJ0-1,9-1 OÖ-plazmkiot (38551 bp), t .Rekymbreág ®
Ahhoz, hogy sz A és ö pontokba?? leírtak szerint előállított E1-deletek Panó-plazreldből reksmbioáos adermv-Irosokokaí aluísauk elő, a plazmídoí Ei-poiipepüdet expresszálö helperrei együtt ko-trasszfekteltuk, vagy Ei-expresszáló: becsomagoló sejtvonslha, például 293-seítekbe, vagy a iebasban ismerteíebek szerint előállítóit sejívooalhs transz.föktátek. Az El «vpresszióia a becsomagoló sepvenalban lehetővé teszi a íbmópkGEPmu.6-E9-160 reglíáciőjáí és vfriottkapszidba csomagoiödását. A találmány egy előnyös megvalósftesi módin szerint, a pX-kaííó-pköEPma.ö-EÜ-lÖö^tfsrísziektak csomagoló sejteket a íéi?t isiuoríeteír, másik transz·· géní hordozó adeuovbrtsvsktorrai transzfekíáij :uk.
.&kombmán^
A.,£ktű.-.plíWÁdi>k<
A Pael-Sntat-fset-Miul-kvoSV-Pael restrikciós 1ζ.>ο'ό· mrtálmszó szintetikus linkért klónoztunk: BeoEÍ- és Ndeí- enzimekkel hasított phR322~plszímdha. As AdEan? bal véget (1-361$. bázispsmksl) a lískerbe klónoztuk a ÓwA és ókeAfeslyek közé. Ezután, az adenovínw E1 -régióját a k (ónozott végből ónaPA és Vf,;<'/-vn.zim«lAel kivágtok, majd helyére a pShntífe (Cloateeh! vektorból származó l-Geul-CdP-PI-Seei-katreífát mszerteltartk. A kapott plaznridot Esel- és Mini-enzimekkel hasítottuk, es erre a helyre, a bal vég meghosszabbítására az AdPanT-vírusből származóEsc/'(361$. bp)· ΑΑκ/ (15114, bp) fragmentumot inszertáltítuk, A konstrukció (pkanEpGFk) végső: kialakítására a festet phtzmiri Mád- és Ei'ofré'-helyei közé az íXdPauv-genom 21: 421 bp jobb oldali fragmentuínát ínszertelínk a MW-hetlyel (15 114. bp) kezdődően; a fenti módon El deletáii: Fanr-adösovifus komplett molekuláris kiónját kaptuk, amely alkalmas rekombreásts adenovirusok előállítására. Adott: esetben, az ój-enna» létrehozott pPanT-vektorplazmíklh;·, sz i-Csui és Pí-Scel-helyekre kívánt transzgónt iísszertálhtesttk.
A pEas7AEi-p:ia2!nídhóí rekontblnáns adesrevirusökat úgy állítottunk elő, hogy a plszmidot Eípolípeptiáet exptesszálö helperrel együtt ke-írunszfékiálmk, vagy El-enpresszáló becsomagoló sejtvonalba, például 293-seitekbe, vagy a leírásban Ismertetettek szerint előállított sejjvoo&lbs transz fökíákitk, Az El expresszlőja a becsomagoló Séjtvonalban iehetóvé teszi a PaaTAEl repiiádőíát és: virionkapszidhs csomagolódúsát A- isláhuáuy egy előnyös: megvalósítási módja szerint. a pXTao7óEi-uasszfekiáií csomagoló sejteket a fent ismerteteti, banszgéní hordozó adenovimsvektö:rrai trsnszfekteljuk. A helpcrvírus és plazmid közi: homológ rekombináció jen léire, ami lehetővé teszi, hogy a vektorban található adenövlrus-temszgén szekvencia
166445-6132)80 replikálötljoss, viriotskapszsdbu csomagolódjosr, ás ily módon rekoníbiaáss adenovirnsok jöjjenek létre. A transzfekció -és üszötas menetét a festícfeben issnertettuk.
Λ Pan5El-régiónak megfelelő gént expresszáló piazntídvck-orokat állítottunk eső, és szók alkaitnazasá'.al a vírus Et-proteineket stabil módon esprcsszátó sejtvotsalakat Hozn-nk létre.
A Pun? Pl íc;Sío,.íí pX* pli/mJE; kíonozU-k. envegébeo a 4 példában 'SítserctettcK szerint, m-eleti a -férni régiót a pSbustle (Clostech) vektor iraguvensutnával helyettesítettük. Áz exprcssziös plazmád a Pan5genom legalább 1-3959. nukleotiskait átfedő Panő-adesovtrusgeöo-n-szekveneiáí tartalmaz. .Az expressziós plazntid tehát sz. AdPanő ©sbnpsnz adenovürus El a- és Eíb-proteíníeit kódoló szekvessc Iákat inrüdssnsx heterolőg protnóter irányítása alatt. Hasonló η „-azIós plazmidokat előállíthatunk a fenti iáblázaiökbatt szereplő AdPanő és AdPan? E i-régiók-alkalmazasava;.
8, példa kÁwMzji<fe£»3;te^
Vírus EL-proiesneket expres»S2áió seítvonal&kat hoztunk létre úgy, hogy Helzs- (ÁTCC nyilyántartáoi -Ma v i. L2'i leket ítaiszl >í ö X o víw '.bcigcusa rí Joí h <9 p' o> uuA.t \ tgs moh sejtvoaalafc: alkalmasak Eí-deletált rekomblnáns csimpánz adenovímsok termelésére oly módon,, hogy azokat: geoomi vírus-DNS-sel ás a feni leintik szerint előáll írott espressziós plazmidokkal ko-transzfektáijnk, A sejlvoaalsk transzfektáláí-áí és a rekosnbináns csimpánz adenovlrusok tisztítását a sejtekből más adssovirusok, például humán adenovimsok esetében szokásosan alkalmazod eljárásokká; végezzük ífesd például Horni-z: lásd feni és cgveb szakirodalmi hivíukozáseltbaxs].
Tfe (10) cm ádbéröjtí tenyesztőedényekbe kiotett tfeLo-sejtekeí transzfelöSIfeíÁ 10 gg g^dWSl-B l DfíS-ael a Ceüpheeí™: resgenskészlet aikalrnazásávs): (Pharmacia, Cppsala, Svédország). a gyártó utasításai szerint eljárva. A. tenszfekcirií kővetően .22 órával a sejtekét három percig gfeerínsokknak tettük ki {15Ö·» glleérts Hepes-puöerbea; p&::7,5), 1-0% íoíálss borjbszérummai és 1% Pes-Strep antibiotikumokkal kiegészített ÖVIEM- íHeLit) vagy EI 2K- (A549; Life Ssfeueu Teehnologies, lixe,. Oraod ísinad, NYí uipkezeggel egyszer mostuk. majd hat órán át, Sv-C-on & te m tápközegben nrkabákuk. Eztbáu, a transzfekfah: sejteket ánpllkáíuníokban 15 cm átmérőjű rém észioede oc\~e oltottuk 1:26, 1::40.,. 1:86, 1;4 ŐO és: 1:32Ü arányban .hígítva,. .Miután szokat egy éjszakán, át, 3?’Χ1'-οπ üiköbáituk, a táp-közegét G41 S-astibiötikámmal egészítettük ki (Lite Téehao-íogíes, lse.) 1 pg/ml koneeíkráciőban. A tápközeget 5 naponként kicseréllek, és a iranszfekeíöt kővető: 26, napos klósokst feol&ltosk.
KeLaBt-kíönofcat izoláltunk, és azokat adene-asszooíák vírus (AÁV)· fertőzést támogató képességre és mkombináns .LacZ-preíeia-expressziára feszteítük az: alább: ismertetitek szénén.
jl.AAyyfertófestcjösegitö tulajdonság vizsgálata Eí-exptxsszáfe seitvouaktk Izolálására
Az AAV' adeoovires által kódok proteinek jelenlétét igényli teljes életciklusának beteljesítéséhez. Az AAV-fertőzes elősegifesébez az .sdenosirus El-protein és az E4-réglő által kódolt ÖR.Fó-protein jelenléte egyaránt szükséges. Az e l-expressz -» k nuvussára A AV-fertőzés elősegítésén alapuló eljárást alkalmaztunk. Rövidest, adetrovirus Eb-proteint exprcssz.átó sejteket ágy izoláltunk, hogy feltételezetten adenovirus E i-exprvssznló sejteket és adMtyv-fe^^>z«fcswci^íat nem tartalmazó sejteket tartalmazó sejtteayészeteket fertőztünk megfelelő íeö445~őn2ISG ideig markergént exprs.?b/a.o adeno-asszociai! , kussaI t \A\> es hutná» adenovírua E4-sén úlias Ködök ORíoproteint expresszáló AAV-sal \Rr;ife λ nM’&ergen-uKín nőst a ketdkezó sejtekben. es a kontroli sejtekhez képest jelentősen mcgnovckeskn m.a\erakts\;íasú sejteket szelektálunk l l-evoresszslc sejtekként. A következő kísérletben, markergeukem LaeZ-geot atkaimazíuk. es a meAet aktomért kék sztn megjelenése jelezte
Például, 3 íér.t; sepv,mak\3t es aem tots/fekuit koahull t,líel.uí sejtvonaiakul fertőztünk sejtenként íOt gettó n rte-msjss-gbet’ tnatketgen; h<'\kve AAV-\ekter genom-rtal, pelcaul AV Loc/'-goomn-rtal F-sttcr k és tntsat.t j. Vlrol ő, 520 «Jquö,'i, &» hutrtón adenota.tó-5 ORFo-régíóját expresszálö AAkkvekiorral (AV.orfo). A plazmid DNS-szeksenciaia aj, a LacZ-transzgént és az ?\d E4 0R.E6 régiót - amely nyitott olvasási ketet expresszit» terméke az tAAV-geaamnak megfelelő egyszáiú (ss) DNS kettősszáld (ds) DNS-sé történd átalakulását .segíti elő - hordozó rekornbtnsss sdeno-ttsszociált vírusok (rAAV) keletkezését eredményezi. Ezeket a vektorokat 2% Κ'8-ί es 1% ífen-Strep degyer tartalmazó íápközegben mkubáljuk ST’C-os, 4 órát! át, amikor is azonos mennyiségű, 19¾ FCS-; tartalmazó tápköaeget adunk hc-zzájtik. Szakember számára sydvánvnlő, hogy az első ÁAV-vskteban bármely snarkergéri svagy riportergént alkalmazható a vizsgálatban, például alkaökss íbszíatáz, krctferáz,stb. Amennyibe® a marker valamilyen antigént expresazál, ellenanyagok alkalmazásán alapuló eazüass vizsgálati eljárást aikalmazhntnrsk?.az antigén kvantitatív meghatározására. Az eljárás nem korlátozódik a markergéa azonesitásártí. A fertőzést követően hűsz-huszonnégy irtával a sejteket LacZaktivításra festjük ismert utódon. Négy (4) őrs múlva a -c-tói-et mikroszkóp alatt vizsgáljuk, és a kontroli A459vsgy ReLa-sejteköál szignifikáns mértékben több kék sejtet tartalmazó sejívonaiakat pozitívnak tokmijük.
9. példa jBAá«yRÓjLbejurt3tasa..gazdas<.j.teKhe
A 4., 5,. vagy 6. példában ismertetettek szerint eloáiiiiotf rekonrbtoáBS csltnpánz adenovlmsokkal transz-? gént juttatok emlős, eíósyősen barnás sejtekbe. Eljárhatunk például úgy, hogy a rskombnuns vírust tisztítjuk, majd azokkal 293 jelzésű humán embrionális vesesejteket fertózbuk 59 MÖ1 részeeskcAejt koncentrációban. A GFF-expressztót a fertőzést kővetően 24 órával jegyeztük fel.
Á_Oénrtrtuszfer.;?géru;odellbe a. FattóÍA Fan-' és
A rekoröhináns esimpáríZ adsnovirusok gétrtmttszfért előidéző batékoöytógáf és toxikológiai profilját egérmaíba irányított géníranszfer, egértüdőbe irányhott géntranszfer és mvt ✓<. nba huny ított géntranszfer hatékonyságának vizsgálatával httsoblkoímk össze.
Á LttóZ-gátit CMV-pfomóter irányítása alatt tartalmazó fcl-deleiéit adenevmusvektorokat áiiifotiimk elő a fent ismorteteft: eljárással humán Adó, csimpánz Fanó, csimpánz Fan? és csimpánz Fan9 (C68 í vírusokból. A vektorokat inimitadeficiens NCR mufe-egerekhe juttattak (89 egerAisérfe·) a következőkben leírtak szerint. .A tótóoznszíeA. o- körlethez 1 tó pl síavpctt/tót edl1 tv, eo^vA injvWtn 5\ a ía o-vsertába A tüdőírasrszfekciekoz ŐS pl szuszpenziöi (5xi9R> részecskét) adtunk be hrtratraebeálíssn. Az izomíranszfekelőMz 25 pl szusztpenzsót (SxtS*®- részecskét) injektáltak a ftótóSs outalm- izomba. Az égerekéi a vektor injektálását követő 3., 14. és 28. napon okúk le időpontonként 5-5 egereil A boncolásnál máj-, tüdő- vagy izomszövetei távolítottunk el fagyasztásra és paraínnbt hivatásra. A fagyasztott blokkokból metszeteket készíttettünk X-gal festésre, és a paraffinba ágyazott szövetből készült metszeteket hetsatoxIKn-cozIn-fesietrük kórszövettani analízisre. Mindegy A időpontban vért vettünk, A szérmnmmíákbőí májfunkolós teszteket végeztünk,
A fenti kísérletben üteg figyeltük, hogy a Pan-ö Pan-7 és Pan-9 csimpánz adenovirusok kevésbé hatékonyait idéztek elő géntraszfert a májba» és tüdőben, mint a huÁdS-vtrus. Ez azonban előnyös is lehet bizonyos
1ÖÖ44S-ÓB2/SG ko-nlnonvek nx-’.ott, ijpc. >» s korév! λ be\d5 excteK-n mezőg^el’ nape\ cnas A/ romba tortero ucntranszfer kisebb eltéréseket mutatott az egyes szerotípnsok közt
Ö,.sMÍ«tóinntóy£ktoroLlssétók_
,.8§8?χΕ^η*Λϊ&^εδ»ώ^δ^.Ι.^
EiaiáikgkteLkáSÜ^^ieuáváltáásal
Egeteknek t'C5?/B} 6; 4/esopo«) AdílnS, Pss~6, Fsa-? és Paa-9 alapú: LaoZ-vektott <H5:.04ÖCMVlasZ, VuóoCoCMV ' u. 7 ΡοηΓ <\ X?\I\ <<k/ b r 9 CbtA MN 1 kZ '(? tymnfesi <Ληη\ be a íarokvénáö keresztül. Harminc nappal később M egereknek ismét, ο,Ι-aptitnpsziní expresszáló ademvims-.
vektort adtunk be (HS-feiSCMVhÁÍAT, Panö.SOÜCMVkAlAT, M.ÖKCMVhAÍ AT, PaaOSöOÍVbÁUT; 10! 4 részeeskeimfektálás). Az ismételten feeattstí vektor üattszdnketó játsak sikerességét a szerűm «.-;ua:irépszinkoBcsoPráeiö ntegfeatározáss alapján áilapíioííuk meg: a. vektor Ismételt beadását tehető 3. es 7, napon,.
AdfíttS. PííK-ö, Fan*·? és Pan-P-vlrustifen alapuló atfcnovtrusvektorok egérmápo transzdukáló képességét a többi szeroiíposssí szemben termelődöd neutraíizálő alfeosnyagek téleak-téhen is Vizsgálatuk. Eredtnényűinket az alábbi táblázatba® összegeztük.
1, imektákis 2, injektálás teereszöietitrahzáeió
AdkuS AdiutS Pati-6 Pas-7 Pan-9 (Cö8) igen (pozitív kontroli) Nem Nem Nem
Fan-ó Adbtiá Pas~6 Nem Igya; (pozitív .kontroli)
Pao-7 ige®
Pan-9 (C68) Nem
Pan-7 Adb.ti.5 Pan-6 Pan-7 Pait-9 (CÓk) Ném Ige® Igen (pozitív kontroll) Igen.
Patí-O (CóR) AdhuS Pan-6 Pan-7 Pan-9 (Cák) Nem Nem Igen Igen (pozitív kontrol!)
Vektorok egénaájat transzdukáló képessége más szerotipusgkkn! szemben termelődött sentrallzálö eileu~ im azok jelentemben \ üuAd5-vírussal végzett ítömuttízaciő neut akadályozta a Pan-b, Faa-7 vagy Psíí-9 (Cö8) csimpánz .tdonos uu^-A swnvtdt beadását. A fenti kísérlet alapján az is megállapítható, hogy a Pán-7 a Fsn-6 és Pan-P közt helyezkedik el anogénrokonság tekíatetebcn, és mindkettővel kemszteeaaál; a Pua-ő és Pan-9 azonban w neumh/al|«i egymást Ez meglopó a két vírus közti homológlavízsgálatok alapján, melyek szerint a Pán-b igen mte-utösen ebét a Fan 7 és Pan-9-virusekíöl. A ?an-9 elleti termelt anliszérmn nem kerosztsontralízálta a Pan-óv a-esokat, de b«onyo« mértékig nctíímltzálta a Pan-?--v!rnsckttí, ami. arra utal, hogy a Pan-6 eltér ő másik két vírustól.
100445-6137 M3 tő. példa
A teljes S¥-2S-geaoa®t - kivéve a géntechnológiai: eljárásokkal Lírehozon Fi-delmot - ísrtalmazó plazmtdot állítottak elő. Az Ei-deléeiő helyére beiktatott I-Ceul és ΡΙ-Seel rert- Ac'-os enz'ta felismerő helyek lehetővé teszik transzgén jnszertálás,át mgázó plazroklokböl úgy, hogy oda a lenti rt'stnkcfes felismerő hebek kitel határolt trtmszgén expresszíós kazettát iuszertáiuuk.
A Swaf-Sa^BT-Spd-AílK-EeoRV-Sw&l restrikciós helyeket tartalmazó szintetikus linkért klónoztunk EcoRl·· iís. Ndel- eszintekkd hasított pöR322-plazmtdb&. Ezt két szintetikus ollgorsert - SV25T (S’-AÁT TTA AAT AGG TAG CGC ACI AÖT CGC GC'T AAG CGC GGA 1 \1 CATTTA AA-T; 38. szímosítoszámú szekvencia) és az SV258 (5'-TAT TTA AAT GAT ATC CGC <K 1 t \A CCG CGA CTA CTG CGC TAG GTA TIT A~3 k 39- azonos! tószámü szekvencia) - htbrtdizáltatnmk, és iaszertáiiottk :as EsoRí- és: bittel- esziműkkel hasított pBR322.-pkízrmdba. Az AáSV25 hal végét (1-1057. bp; '29, azianosiíoszáste szekvencia) a fenti liíterhe klónoztuk a SnaBl és Spsl-helyek közé. Az ÁdSV2 5 jobb végét (28 059-31 042, bp; 29, azonosítószámú szekvencia) a iinkerbe klónoztuk az AfíH- és EcoRV-helyek közé. Az adenovlrus El-gést a klónozott bal ífágmetatnből, az EcoRI-helytől (547. bp) az Xhoí-heiylg (2031, bp) a következőkben ismertetettek szerint kivágtuk. A nSbuttle-vektorrói (Clontech) PCR-eljárássa; előállítót·· l-Ceu-H-Scel-kazettáí inszertáltenk az EeoíU- és Spei-helyek közé. Ezután, az AdSV25 10 154 bp Xhol-íragssesfurnát (2031-12 185, bp. 29, azortositőíszátnú szekvencia) inszertáltuk az Spel-hclym. A kapott plaxthtdoi Hírtdslíí-enzímmsl emésztettük, és a végső konstrukció; (p$V25> a 18 344 bp AdS V-25 HüídHI-ftagmemum (11 9H-3Ö 328 bp, 29, azonosítószámú szekvencia) mszertálásávai hoztuk létre; a térni tur-don El-deisták SV25-adenovánts komplett molekuláris klórját kaptok, amely alkalmas rekombináns adenovü-jsokok előállítására. Adott esetben, az hjonunn íétrehozott pSV25-vektotplazmidha. az i-Ceal és Pl-5ceí-he Ivekre kivárd, transzgént tnszertálhatusk.
Markergúnt hordozó AdSV25-vek;ort ügy áililottuak elő. hogy előzőleg a pShnta-ptezuddóa (Clontech) klónozott zöld fluoreszcens potenst (GPP) expresszálő kazettát í-Cetd és Pl-Seel restrikciós enzimekkel kivágtak, és ugyanezekkel az enzimekkel emésztett pSV25-plazmid»a (vagy a fekásbas ismertetett: más esisupász Ad.-plazsmdbal hgáltuk. A kapott plazmídot (pSV25GFE) Swal-enzimmel emésztettük, hogy a kazettáta bakteriális ptemtdváztöl szétválasszak, és HEK 293 jelzésű E l-kompiemenúhó sejtwna&a üanssfektáhuk. Kőrülbetúl 10 nappal később, a replikálodó vírusok jelenlétére utaló cítopátiás hatást megbgyehnk, A GFP-expresszáíó AdSV25 alapú adetsovirttsvektor előállításának sikerességé? ügy igazoltok, hogy a transzfekták tenyészet felülúszóját itass sejttesyészetre vittük át. A másodlagosán fertőzött sejtek jelenlétéi a sejitpopuíácíöbnn megfígyellsetó zöld lluoreszcencía alapján mutattuk ki.
Az atlejjovirnsvekíorok klónozó kspaeutoanA k«' . tesere ar E3-regiŐ deieíálhstó, mivé! ez a régió a vírus tenyészetben történő szaporítása »zemportja.«l nem essx.encjJ.ts géneket, tartalmaz. Élthez, a Fsn-S-, Pata-, Psrt-7- és Cöb-vektorcík E3-d«leteÍí változatait hoztak létre (az E31-9-szekvene:iát:tertaimazó 3,5 kb Nns-AYTÍÍiragímmtumot deistáitok).
Az E l -deteíált pPsteS-pköPR-plazitridot. Avril-esdonukleázzai kezeltük, hogy az E3-régiőí tartalsuazó 5,8 kb feagumötemot izoláljunk, és az AvrE-deléeíöt tertaltazó pRasö-pkGFP-ptem-dot újból cirkuláössá ; 00445-6132. SG alakítotok; így kaptuk a pfans-pkGFF-ES-Avrö-plazsxldot.. Ezután, az. 5,8 kb ΑντϊΙ-lragmestemot pSL-fanSE3-'Ám/Ö-pbzííddha szubklöttostok, hogy az E3-rágiőban Nral-emószteasel további dőlésiét hozzunk léire, A fesd módos kapáik a pSI-PasS-BS- áeléeíös konstrukciói. A végső pPwS-E3’pkGFP46ö8SíFBkcíót ágy kapták, hogy a pEL.-Pan5-E3 éeléniós korfötokcldból eltávolítottunk egy 4,3 kb AvrlESpebíhígntotoanto, és azt a pFmS-xásGFr-B'S-zkvrü-piaraaidha. fczertáltuk az ΆντΠ-helyre. A kapu t k< t\t»a\e otom 3,1 kb deléeiót hoztunk létre az E3-réglóhaa.
Az El-deteíált pEanó-pkGFP molekuláris klósí Sbtí- és Nóií-eitztoekkel emésztettük, hogy abból egy t ό hato' ο» nmet p > ili„s'h, e\ sx jlxl η ^>7 x \ . χιΑ λ ,gx i> to jo tA v>í pEmc vhri I t Eco47íll- és Ssval-enzösekkei enxwíeihik, r.:y kaptuk a pPanb-EJ-klónt. Végül, a Sfefl-essessztett pPanfx pköFF-plazmidból egy 21 kb SbÜ-lrágmeniutnot :a pPanb-Eu-pkumldba szubklénoztorsk;, hogy megkapják a pPanó-Ed -pkGFF-klónh amely 4 kb delec ,ot hordozott. az. Ed-réglóban
C..D.:.dek'tájLEéa7z. es.Faj-D-Yeku?rpk
Ugyanezt a stratégiát követtük mindkét vektor esetiben „/ t t Ariét )o w Avw s Elos/nr, eg\ az 13régiót: .átfedő 5,8 kb Avrll -fetgroeatuntoÍ szubklóno/tot k p$~~5 .SO-pla/rmdbj mád az Fd-regtot \nriemósztéssei deietáitok. A kapott plazttsdokat Speí- és AsUbeoztmehkel emeszretok, hogy egy 4 4 kb í agtucrtSomot kapjunk, amelyet pPan7-pkGFP- és pPanü-pkGEP-ptexndok Αν ri!-hely éré klónoztunk az eredeti F3réglót tartalmazd Avrkl-feupHemnrxA lx.be-e \ pPar~-F3.pk<,fp es pPnm» F3 pkUEP k.m-toü, ó',>, V ke deléelót hordoztak az E3-régiöbsn.
Etár az adesiovin.ss.ok El -régiójában létrehozott deléeló tei»ö generációs adettov irussektorok) a vírusokat replikáé tóra képtelenné teszi, az: aáenovlrusvektor gének expressziója nem szűnik meg teljesen. Az E4-régió deltoidja ezt a maradvány gésespresszlót jelentésen gyengíti, és előnyösen, a vektorok alkalmazását biztonságosabbá teheti. Ezért, 2,5 kb dekádét hordozó E4-de!e;álí Pan-7-vektort hoztunk léire (amelyből az E-IORFEÖRFAszekveadáknak n egté'eló Fvuíl-Agel-fragtnentumot. deletáltuk). Magás íheríl vtfiistsáyészeiet álltiat·vrk e o Dl M AU a apu -e,Tso*iaKn aa\A Í 1 nmemen «. ü <>-,,<.< > tu \ t i m kuíö> x erg^-szau
Egy Í9kh Xbaí»fctgn-e«tnní»t delemtoAa pFsnü-pkGFP-pliízmidbői, hogy inegkapyuka pFan7-Xalkonsítokciét, amelyből Agel- és Pvu 11 -enzimekkel végzett részleges emésztéssel egy 2,5 kb Eó-hagaientíanot deletáltunk, igy kaptuk a pPan7-Xbal-E4~konstruk.eiób A pP&nT-Eó-pxöFPsplaztnidöt. a pPaa?-Xba!-E4plazmioból állítottuk elő két szekvenciális kíónozási lépessel. a pPan7-pkGEP-konstrukesobn! származó 19 kb Ahol ,A kbAeui X’tx. bíígnxntnnvsl'-v’áadasíirtd
2t.£3vösE4r^
Az E4-régiói tartalmazó 11 kb plazmidoi - pPaa9-EcoRI - hozóink leire oly módon, hogy a pPart9piíGFp,plgzinldot EvoRJ-enzimmel emsözíottük. abból egy II kb K'oRl-íragtnentutnot visszanyertünk, és önmagával ligálnmk. ,3 lenti konstrukcióból az E4-régtö: Agel-emés/iéssci ímmd a ragadós vég feltörésé·· \el; és Pvuií részleges emésztéssel deletáltuk, és a Íraginemuínoí ő&magmal ugattok; így kaptok a pFas9~ EcoS.i~E4--klónt. A pPan9-pkGFP-piaxnudból 23 kb EeoKl-iragmeotumot jzol&ltusk, és azt p:Pan9~EeóRÍ-E4~ pkizmld EcoRl-belyére mszertáltofe, Ezután, a konstrukelátoz a pEas9-pkö;EE-plazmidból származó 5,8 kb
10Ö445-Ó EkSSG
A vrll-fragmentumot adtunk, hogy a pPan9-E3-E4-pkGFP elnevezésit végső konstruketót megkapjak, Figyelembe véve a vadAipssu. Pata gemm tereiéi, az El -E5-E4-deleták vektor 8 kb íranszgérd képes b< cgadw terdotamtagMkassOs bgotájtása a.Ta.n-vektoiok molekuláris kióojalha
Nagy hatékonyságú Üirekt klónozó eljárást és zöld-fehér fenotfpus alapján történő szelekciót alkalmaztunk rekombináns vírusok molekuláris klonjainak előáíÜtására, Röviden, a kívánt géneket pShuttlepkGl'Pvekiorba klónoztuk ug>, h>->gs fehér rekotnbinánsokat szelektáltunk. Ezután, a minigén kazettát különböző őelee-okni bordozo pPanX-pkGÍP cs;mpánz adspovirus piaztniávázba inszertáltuk ügy, hogy azt a pkGFPkazeua allal elfoglalt feCeui- es PI-S,es-heiyte klőooztuk, és a helyesen toszertálődoit írageienteotökat tartalmazó néhány retomésnaomak meGele'u tehes ko oniuk.it s/clAtáúnnk
El-Ed-őefeiáh csimpánz adeaovteivektorok molekulám klánjait úgy kaptuk, hogy a kiöaokat megfelelő restrikciós enzimekkel imearizálíufc, és szokásosan alkalmazón 293-sejtekbe trar,·»’tektalttd, Musr a Uanszléktált sejtekben a enopádás hatás teljesen kialakult, nyers iizáíumot gyűjtöttünk, e- 293-^u, .„oet 'pari léptékű fertőzéshez felszapursrottunk. A vírusokat CsCi szedsmentációs eljárással tisztítottuk.
EÍ-E4 es fel-E3~E4-deietált Fan-vektorokat 10-3-sejiek -293 alapú El-E4-koraplexnentió sejtvonal - slkalma/avr, ai kaptunk, és a vektorokat abban szaporítottuk. E4 ORFó-génexpresszjőt a IÜ-3-sejfekbe® úgy indukáltunk, hogy & tenyésztő tapközegbez 150 μχηοΐ/! ZtiSCh -t adtunk.
Ebola burok kimérákat expresszátó AdlruS- vagy AdC7-vektorokat állhottunk elő C5?SL/6-egérékben végzek ín vevő iínnmmzáetös ikísétílétekbsz. Különböző vírusvázaí tartalmazó tekombihfe vírusokat testünk létre molekuláris- klóaoző ©látásokkal úgy, hogy mkhge& kazettákat mszertálíauk az E l utáltaié helyére; Válasnsiuiyi. rekomibináns váruskkmt kinyerték, ®s nagy memsyíségheu, üsCl-sszedsmesíácios eljárással történő tiszthásra 293~sefrekhea szaporítottak. Öt, az AdRaő vagy AdPasi? (G7) áltál kódolt EboZ-vaxánst szeiektáihösk. és azokat relatív mmimmgenításnk intramuszkuláris Ád-injektálásaí történő összeírásost kására szaporítottak. A kezdeti vsksínázásí kísérletekben a kővetkező variánsokat hasonlítottak összei vadrtlpnsú Eb©> szolúbilts Eho-i ariár-s. EheAl, Eboú2, Ebo\3. EboA-l, Fbo.\5S. EboóóS, FboVÖSI és EboASS. Az alábbi táblázatban-a fertőzött 293-sejtekben termelődött vfeasrészeesks-számot adtuk meg (egy milliliteré vagy az: összes mennyiségre vonatkoztatva) spektrototometríás ütőn történő meghatározás alapján.
Gén RuAd5 AdC7
Titár {VFx lő’vmii Teljstá hozam (V? v lö!J) Titár ÍVPxlO’-’/ml) Teljes hozam (VP v life)
Ebo wt 2,6 Ö 4,3 43
EboS 4,9 40 4.6 55
Eboő2 2-1 9 5.8 93
EböA3 .......................ö...................... ........................&........................ 5 t ..............95
EboA4 3 12 4,1 62
I Ö844S^> 132/8(}
A vektort hhramusxkulárj.ssn adtuk be (Kd1 geuonsi köpiaisejt) CSRBL/O-egerekaek, és meghatároztuk a yírtisseati'altzáíő eílenany&gtttort {„VNA-ttfer) {VHAŐ: 28 nappal később meghstfárezoh ueutrallzáíó elletiányógtber, az Bbola burok gliköproteinnei sze-nbest Indukálódott Imtnunváhtsz első indikátoraként. A •leifás szerinti éfleieíúbeh VNA kifejezésen HeLa-sejfek vad-típusú E-bola bunÁ-glíkoproteiheket hordozó BíV alapú vektor í,.pxzeudoíip-i.s’'} általi trsaszdukcíöjáí gátló szertan ellenanyagokat értünk.
Az EboZ-pszeudotípussaí szemben kiroatathatoi VNA AdPan? (C?) vektor esetében magasabb: titerunek bizonyult, matt az AdHuS esetében, A célzott transzáén vonatkozásában. az- EboZAo váltotta ki a: legmagasabb átérti VHá-í. Az alábbi táblázatban a HiV-EboZ-öbP-pszeudotípusokkal szemben klututsihato neutolizáíé eileaanyagtstereket adtok meg (a hígítás reetprofcáva!} ÍN'-~ 5 álktbesopon |,
VNA-merek
EboZ v.id-ttpiiisó RboZs EboZAJ
Adl-feS 12 ló 12
AdC7 44 1.2: '140
14. példa bgórkásérfeteket kezdtünk az hbokr-feroktuetehsekst és az Ebbla nukleáris antigént exprésssálo Rsn--7vekíorök jellemzésére.. Vizsgáltuk négy (4) különböző Ebob env-köastrukciöí expresszáíő AdhuS- vagy Pzn-7~ vektorokkal istraruaszkoiárisan (Ι.Μ.) injektált G37Bí/ó-egerekbes kialakult, neatralízáló ellenanyaglitereket.
A. CTI.-válasz meghatározása Eheia Ettv-konstrukelókar expresszálo AdhnS- vagy Ban-T-vökíorokiod hrtiamaszkalárisan injektált C57B1 /6-egerekheo
Az Bboíu-borokkal szentben kialakult senírtdizáié ebeoatryagválaszí („negiWfeútg íteööífe”; HAB) vizsgáltuk, az Ebola-bnroE-gEkeprotemeket hordozó lenti vírus (HÍV) vektor pszeudodpusokkal (eEho, HTD2, HTD3, ΝΊΊ34) bnmaaixáh egerak sztanainak aifaslísazásávat. CS7BLM- vagy BALBA-egereket fejekiálíúnk egyetlen alkalommal, Hitrairnisztelárisan, egerenként SxítE'' bbola-kurokvííriánsí kódoló ü? fAdBan-?) vrrusrészecsfcével. A. neoítulizáló ellenanyagjáért: a vakeinázást követöett 3Ö nappal később határoztuk: meg. Röviden, Ó-galaktezidázt kódoló Eboía-Eaíre pszeudotipus BíV-vektort (EhoR-HlV-teZ) inkabátefk 2 órán át, 3?°C©n, a hővel inokíiválí egérszértunok különböző hígításainak jeleulétébea, A szérummal történő inkubsiást kővetőéit, az BixtA-ffiV-LaeX- vntísssi HeLa-sejtekei leriőztuak ól^C-öri, lő óráit át. A feriőzőképésségét tíátiSzdnkált Heteseitek X-gaí festésével igazoltuk, sholnzoklp-galakíozsáűz pozitív les tódé st mutatnak. A neutralizáió uter azon szért-mhigísás re<. pjoka, mnelv a β-gsíaktozídáz pozitív, kék lestődésii sejtek számát 50%-kai csökkenti. Széruntíróntákat az sntntutttzáetöt követően 30 nappal gyűjtöttünk, az immunizálást 5χ10!<ϊ részecske/állat iníraítiuszkuláris ti.M. i beadásával végeztük. Valamennyi csoportban kimutattunk Ebola-bur<?kpre-eineke! hordozó HÍV ípszeudotipus) ellent neutra'üzáló dienanyagokaL az ellenem, .igaíer Ad-EboZ (EbeZ-expresszálő .Adhu?), Ad-XFD? teombdis HTDd-expresszálő AbhtS): és €7-sBbe íEheZ-expressz&lo AdPan-7) esetében .20, a C? M'te f\.ofebibs NTD3-exp:resszáiő AdPan-7} esetében léd volt, A fentivel azonos irnrnunlzáciős síraíégu BALÉ c-egerekbvu alacsonyabb r-eutrallzáíó elfennnyagtíterekei eredményezett az Ad-és C7-HTÖ2 és HÍD4 esetében.
1ÖÓ4 4 5 -ói 3 2. SC
Az Ebola-burok elleni cellftláris itmuttaválaszí e57Bt/ő-egerekbea: vizsgáitok .8 nappal állatosrkétit Sxlöi8 C?-LaeZ v agy C?-Eboia burokvariáns vírKsfeszeoske líttramííszktrláris beadását .kővetően. Egereket l.M, vsketoáztusk όχΙΑ’ t'?-LacZ vagy C7-Ebola batokvanstsst kódoló vltwészeeskövel. Nyolc (8) nappal az invnunisálás után, az immunizált egerekből lép limfbeltákat izoláltunk, és azokat w vkw tápláló sejtekkel (vssdttpusn i bvbs onm Apumon: kvöoto, sug.n kezek hunra r attettovittt4·-? szeutupu^ai térten ott. femlettou egetek:»* származó lép limfocitákkal) stimuláltuk, A Őffk-vizsgákttot szokásos siódon, 5 órán át végeztük EboZexpresszáló vektorral transzfektált, $:Cr-jelölt szingón€57-sejtok alkalmazásával,
Pozitív MHC· korlátozott eitotoxikus í-llmfóerta (CTt) választ topítsAaltonk valamesitvi Ekolabinnkvariánst kódoló AdPas-7-klős esetében, erősebb válasz volt megfigyelhető az:NTD2-, ΝΊ1Χ5- és NTD4itnsttndzálf egerekben. Az Eboia-bumkprtoemt kódoló C?-vk«sstd immumzálf egerekből származó· eífektorsejtok felismertek sz fiboZ-trsnszfektálí célsejteket, és CTL-váhtsszal reagáltak Akár 36% specifikus lízist eredményezve, Naiv vagy kacR-rmmuoizáh: kotorod egerekből származó effektorsejtok alkaitoazásakor 5%-náí alacsonyabb arányú lizis volt ntegfigyelhető, arab azt igazolja, hogy a lizis specifikus volt az Eboia buroteorfigónre,
í. Vcde.'v.gt s , -£u’,.tok
Az EboZ-varíúnsiofcat kódoló C7 (AdPan-7) sikeres vak< t nt^e Ί történő alkalmazna <. -avasak értékelésére, az: immunizál ássál létrehozott védettségei vizsgáltok egereklxn egerekhez adapsáh 1 Nú t-Zaire vírussal történő totális fertőzés által etotoe/ett testsúly ’ms/teseggei es pusztulássá! szemben..BAIB < egereket hasasadsálhark a korábbiakban ismertetettek szerint, egyetlen alkalommal, állatonként 5xiö!ö részecske beadásával, és 21 nappal később a vakemazott altotokat 20« i.I);e egérhez adaptált Ebekt-Aalre vírussal fertőztük. Vataésnyl kontroll egér (hordozóanyag és vA-Laed) Apasztok a fertőzést kővető 5-9. nap között, Ezzel szemben, egy kivételével (a C7~sEbo-esoporthől) valamennyi vsfeeinázott eg:ér életben maradt az Ebola-Zaire vírussal tőrtésí: fertőzést követően,
Mértük a C7-sEho-vakcixtázoít egerek testsúly vesz tőséget a 4-7. nap közötti időszakban. A betegség tünetei, például borzolt szőrzet, enyhe- fokától súlyos: fokúig íe<jvdő levertség ntegflgyelltető vek a C7-sE:bo~, NTD2-, és NI DŐ-vakemázoií csoportban & 4-7. napok között. A Ü7-EboZ- és C7-NTO4-inmmmzálí egerekben betegségre utaló tünetek nem jelentkeztek. Összességében, egyeben dózis C7-EboZ, vagy C7-NW4 teljes védettséget nyújtott az imjpttntzáit egereknél a betegséggel és a fertőzés okozta pyxztofeul szembera, feltehetően jelentős mértékű T-sejtes iraustuniíáson keresztül,
A leírásban idézett vateaessyi szakirodalmi hivatkozás teljes terjedsbsébett & kítsnitás részét képezi:. A találmány szédüli: ategoldssnak számos módosítása és vadáeióia lehetséges, amelyek szakember számára rryilvártv&lősk, és ezek színién a találmány tárgyát képezik,, a találmány szerinti készítmények: és eljárások ilyen módositásm: és variáetöl, példáid a különböző minlgének vagy yektordözlsok vagy kmnusmodúlstor dózisok tncgválaszfása ugyancsak a találmány tárgykörébe tartozik.
SZESVENHtALISTA
A szekveneisüsiábaa szereplő kötetlen: szövegrészek (223-as ködj fórdltása; <21Ó> 1 lŐB44S-n$'B2/SG <223> L2 Pontos 13 Hexoa <223 > L.5 Hber <210 5 <220 L2 Festőn <223> 1.3Hexen <223> L5 P&er <21Ö> § <223> 1.2 Peaton <223> 1,3 Hsxoa <220 1.5 Fibor <2W> 24 <223> 1,2 Pontos <323> 1,3 Ploxon <223> 15FjW#2 <2.23> 15 Psbor Pl <210 29 <220 Pontos <2'23> Hoxon <223> FtbotPS <223> Flbor Pl <2lO> 34 <223> 1,2 Pon-es.
<23> 1,3 Hoxsn <i25> 15 Fitos-oi <210 38 <223> oligonjor SV25T <210-··- 39 <223> foígosser SV2SB

Claims (10)

  1. SZAB AÖÁLMÍ IGÉNYPONTOK
    L Rekömbináns sáenovíras, amelynek a következőket tartalmazó \a-i AdPar:'’-bex<ra^áife^, amdysfiJt amlsosav-szekvencbíja & SEQ:.© NO, ti szerinti szekvencia, ftberpTo-em «és. peutonproiem, továbbá amely adenevims tartalmaz olyan adenovírtis-szekvenciákat, amelyekbő. az El a- ésAagv Llb gét.ek Innkcioná* lissn deistáivá vasműt, 5’ és 3’ adenovh-ss cisz-eiemokeí, amelyek repbkápiőboz ás kapszkíba csoínagolődáshoz szükségesek, és a cisz-demek adesovirtís 5’ invertált terminális ismétlődé egységet ős adenov&ns 3’ invitált terminális ismétlődő egységet tarintasznak, valamiéi az adenovtms szempontjából fcíerolőg: transzgsat a. gén gazdasejtben történő expresszíóját irányító szekvenciákhoz kapcsoltán.
  2. 2. Az I, igénypont szerinti rekominsáas adenovírus, ahol a ílberprotein a SEQ lö NÖ. 2ö szerinti .AdPané-fíberprotsfe-fragmentnm.
  3. 3. Az. 1. igénypont szerinti rekombínáns adenovűns, ahol s riberproteín a SEQ ID NO. 12 szerinti AdirimT-iiberproteín.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bártneh>ák:e szerinti rekombisáns adestovirus, ahol a pentonptoíeis SEQ ID Nö, lö szerinti ÁdFanT-pentonproíesn.
  5. 5. .Az 1-4. igénypontok:bármelyike szerinti rekomhlnáns adenovíras, amely nszetjdotlpnsó adéhevnus, és latofew implikációhoz és kapszádfea esomagofedásaboz szükséges 3 ' és 3' ádenovítnx cisz elemeket, amely cisz- eleinek sdenovhushél származó, hexooproteintői különböző, adesovírns S:‘ invertált terminális Ismétlő egységet és adeitoviriíS 3’ terminális ismétlő egysége? tartalmaznak.
  6. 6. Rekontbináas adesevirns, amelynek a következőket tartalmazó van: AdPan
  7. 7-hexontéhérje iragmestítmát: tartatesíző hexost, fíberproíetn és pentonprotein, továbbá amely atetosiiw, tartalmaz olyan {iden&itírtiZ-xsekssKcíákai, amelyekből az Ela- és/vagy Elb-gének fmtkeionáílsan deletálva vannak, 5’ és 3' adssovlrus cisz-elerneket, amelyek replíkáclónoz és kapsztába csomagoiodásltoz szükségesefeás amely clszeisstok adenovlrss $’ invertált terminális ismétlődő egységet és adesovirus 3’ invertált terminális Ismétlődő egységet tarlalntssnak, és az, ÁdPao?-iel beterológ nnkleinsav-szekvenciáí, ahol az; Adban7-bexoniébérte Éngmense a SEQ II) NO, 11 szerűm AdPanYriíexrtsfebérjé-szekvcnelSí mintegy 59 amsnesav hosszúsági Nterminalis vagy C-iermmálts deléciót tartalmazó,. csonkolt változata.
    ?. Az 1-4. vagy ő, igénypontok bármelyike szerinti, rekotnbaaáas adenovlrus, altot az sdenovkos ciszólemes tartakmumsk S* invertált terminális ismétlődő (i'l'R) szekvenciákat, és a SRQ 1D NO, 9 szerinti Fan? 3dTR.-jét, vagy olyan szekvenciát, amely ezek bármelyikével komplernenter.
  8. 8. A 6, igénypont szerinti adenovlrux, amely legalább egy, a következők közöl választott sióban kapszidproieint tartalmaz:
    a Fan? SEQΓΟΝΟ. 19 szerinti pentonpröteia; és: a íW SEQIDNO, U szerinti fiherprotem..
  9. 9. Izolált gazáasejt, amely 1 -8. igénypontok: bármelyike szerinti rekombteáes adssKívinrit tartalmaz.
    19. Készítmény, amely l-§. Igénypontok bármelyike szerinti rekornhináns adenovirast és győgyászatílag elfegadiratő hordozót tartalmaz.
  10. 11, Az 1-8, igénypontok bármelyike szerinti rskombináns· adeno vírus alkalmazása emlős-gazdaszervezetben fertőző ágens elleni immunválasz kiváltására szolgáló gyógyszer előállítására, ahol a trimszgéa vagy beterolog gén a fertőző ágens antigénjét kódolja.
HU0500987A 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására HU230364B1 (hu)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33195101P 2001-11-21 2001-11-21
US60/331,951 2001-11-21
US36679802P 2002-03-22 2002-03-22
US60/366,798 2002-03-22
PCT/US2002/033645 WO2003046124A2 (en) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0500987A2 HUP0500987A2 (en) 2006-01-30
HUP0500987A3 HUP0500987A3 (en) 2008-05-28
HU230364B1 true HU230364B1 (hu) 2016-03-29

Family

ID=26987985

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1400619A HU230488B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
HU1300578A HU230365B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleisav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
HU0500987A HU230364B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1400619A HU230488B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
HU1300578A HU230365B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleisav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására

Country Status (19)

Country Link
US (5) US7247472B2 (hu)
EP (4) EP3108899A1 (hu)
JP (9) JP2005511035A (hu)
KR (1) KR100987360B1 (hu)
CN (1) CN1578678B (hu)
AU (1) AU2002365366B2 (hu)
BR (1) BR0214350A (hu)
CA (3) CA2466431C (hu)
CO (1) CO5590973A2 (hu)
HU (3) HU230488B1 (hu)
IL (5) IL161584A0 (hu)
MX (2) MX351516B (hu)
NO (3) NO332692B1 (hu)
NZ (3) NZ564586A (hu)
PH (1) PH12016500338A1 (hu)
PL (1) PL209133B1 (hu)
SG (2) SG165153A1 (hu)
WO (1) WO2003046124A2 (hu)
ZA (1) ZA200403117B (hu)

Families Citing this family (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2450470C (en) 2001-06-22 2012-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for rapid screening of bacterial transformants and novel simian adenovirus proteins
US20040136963A1 (en) * 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
KR100987360B1 (ko) 2001-11-21 2010-10-12 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 원숭이 아데노바이러스 핵산과 아미노산 서열, 이를함유하는 벡터 및 사용방법
NZ539509A (en) 2002-10-23 2008-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Priming vaccine comprising a polynucleotide encoding at least one first malarial antigen and a boosting vaccine comprising at least one polypeptide comprising at least one second malarial antigen having at least one epitope in common with the first malarial antigen of the priming vaccine
ES2478625T3 (es) * 2003-06-20 2014-07-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Método de generación de adenovirus quiméricos y usos de tales adenovirus quiméricos
US7291498B2 (en) 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
PL1711518T3 (pl) 2004-01-23 2010-06-30 St Di Richerche Di Biologia Molecolare P Angeletti S P A Nośniki szczepionek pochodzące od szympansich adenowirusów
CA2563500C (en) * 2004-04-28 2016-06-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost
ES2361000T3 (es) * 2004-04-28 2011-06-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Suministro secuencial de moléculas inmunogénicas mediante administraciones de un adenovirus y de un virus adeno-asociado.
US7964196B2 (en) * 2004-05-25 2011-06-21 Chimeros, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
GB0417494D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
CN101090974B (zh) 2004-11-16 2011-05-11 克鲁塞尔荷兰公司 包含重组病毒载体的多价疫苗
EP1863520B1 (en) * 2005-03-08 2014-12-31 Aptose Biosciences Inc. Use of interleukin 17e for the treatment of cancer
GB0513421D0 (en) 2005-06-30 2005-08-03 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccines
EP2018156B1 (en) * 2006-04-07 2010-03-17 Chimeros, Inc. Compositions and methods for treating b- cell malignancies
ES2341501T3 (es) * 2006-04-28 2010-06-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Proteina hexon de adenovirus modificado y usos de la misma.
WO2008027394A2 (en) 2006-08-28 2008-03-06 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Constructs for enhancing immune responses
MX2009009342A (es) 2007-03-02 2009-09-11 Glaxosmithkline Biolog Sa Metodo novedoso y composiciones.
US20090226525A1 (en) * 2007-04-09 2009-09-10 Chimeros Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
EP2220217A2 (en) * 2007-11-28 2010-08-25 The Trustees of the University of Pennsylvania Simian subfamily c adenoviruses sadv-40, -31, and-34 and uses thereof
LT2220242T (lt) 2007-11-28 2017-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian pošeimio b adenovirusai sadv-28,27,-29,-32,-33 ir -35 ir jų panaudojimas
AU2014203073B2 (en) * 2007-11-28 2016-07-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian E adenovirus SAdV-30
CA2706258C (en) * 2007-11-28 2017-06-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian subfamily e adenoviruses sadv-39, -25.2, -26, -30, -37, and -38 and uses thereof
WO2009136977A2 (en) 2008-03-04 2009-11-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses sadv-36,-42.1, -42.2, and -44 and uses thereof
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
EP2774985B1 (en) 2008-10-31 2016-12-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus SAdV-43 and uses thereof
WO2010085984A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Okairos Ag Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
AU2010209938A1 (en) 2009-02-02 2011-08-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
PT2391638T (pt) * 2009-02-02 2018-10-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos de adenovírus símio, vetores contendo as mesmas, e as suas utilizações
BRPI1009873A2 (pt) 2009-03-17 2016-03-08 Glaxosmithkline Biolog Sa detecção aperfeiçoada de expressão gênica
WO2010120874A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
WO2010138263A2 (en) 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
US8846031B2 (en) 2009-05-29 2014-09-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus 41 and uses thereof
BR112012010824A2 (pt) * 2009-11-09 2018-03-06 Genvec Inc adenovirus simios e métodos de uso
WO2011057254A2 (en) 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
CN102844329B (zh) 2010-04-14 2016-01-20 财团法人牧岩生命工学研究所 分离自猿腺病毒血清型19的六邻体、其高变区和使用其的嵌合型腺病毒
DK2561073T3 (en) 2010-04-23 2016-12-12 Univ Massachusetts Aav vectors targeted to central nervous system and methods of use thereof
WO2011133901A2 (en) 2010-04-23 2011-10-27 University Of Massachusetts Aav-based treatment of cholesterol-related disorders
WO2011133874A1 (en) 2010-04-23 2011-10-27 University Of Massachusetts Multicistronic expression constructs
EP3333265B1 (en) * 2010-05-14 2020-02-05 Oregon Health & Science University Recombinant hcmv and rhcmv vectors encoding a heterologous antigen isolated from hepatitis b virus and uses thereof
WO2012021730A2 (en) * 2010-08-11 2012-02-16 Genvec, Inc. Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
CA2808556A1 (en) 2010-09-20 2012-03-29 Crucell Holland B.V. Therapeutic vaccination against active tuberculosis
EP3075860A1 (en) 2010-11-23 2016-10-05 The Trustees of the University of Pennsylvania Subfamily e simian adenovirus a1295 and uses thereof
CA2823066A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Alexion Pharma International Sarl Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
WO2012089231A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Okairòs Ag Paramyxovirus vaccines
WO2012154994A2 (en) * 2011-05-10 2012-11-15 The Regents Of The University Of Californa A novel adenovirus isolated from titi monkeys
US10221218B2 (en) 2011-05-10 2019-03-05 The Regents Of The University Of California Adenovirus isolated from titi monkeys
GB201108879D0 (en) * 2011-05-25 2011-07-06 Isis Innovation Vector
TWI575070B (zh) 2011-07-12 2017-03-21 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
WO2013036791A2 (en) * 2011-09-09 2013-03-14 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Modified adenoviral vectors and methods of treatment using same
WO2013036973A2 (en) 2011-09-09 2013-03-14 Biomed Realty, L.P. Methods and compositions for controlling assembly of viral proteins
TW201318637A (zh) 2011-09-29 2013-05-16 Transgene Sa 免疫療法組成物及用於治療ｃ型肝炎病毒感染之療程（一）
TW201321016A (zh) 2011-09-29 2013-06-01 Transgene Sa 免疫療法組成物及用於治療ｃ型肝炎病毒感染之療程（二）
WO2013052811A2 (en) * 2011-10-05 2013-04-11 Genvec, Inc. Adenoviral vectors and methods of use
SG11201401605QA (en) 2011-10-19 2014-09-26 Alexion Pharma Holding Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
WO2013063019A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for enhancing the therapeutic effect of anti-tumor t cells
US10238755B2 (en) 2011-11-30 2019-03-26 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for regulation of cell aging, carcinogenesis and reprogramming
CN105473723A (zh) 2012-05-18 2016-04-06 宾夕法尼亚大学托管会 亚家族e猿腺病毒a1302、a1320、a1331和a1337及其用途
US9861693B2 (en) 2012-09-07 2018-01-09 Emory University HIV immune stimulating compositions comprising recombinantly expressed pili on bacteria and methods related thereto
US9683268B2 (en) * 2012-09-19 2017-06-20 Beth Israel Deaconess Viruses associated with immunodeficiency and enteropathy and methods using same
DK2920313T3 (da) 2012-11-16 2019-09-02 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Rekombinante adenovira og anvendelse deraf
JP2016505267A (ja) * 2013-01-15 2016-02-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア アデノウイルスおよびその使用
US9624510B2 (en) 2013-03-01 2017-04-18 The Wistar Institute Adenoviral vectors comprising partial deletions of E3
SG11201507393TA (en) 2013-03-14 2015-10-29 Salk Inst For Biological Studi Oncolytic adenovirus compositions
US9402888B2 (en) 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
KR102196884B1 (ko) * 2013-11-01 2020-12-30 화이자 인코포레이티드 전립선-연관 항원의 발현을 위한 벡터
EP3151866B1 (en) 2014-06-09 2023-03-08 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
CN106999552B (zh) 2014-10-02 2021-12-28 威斯塔解剖学和生物学研究所 治疗癌症的方法和组合物
US10941452B2 (en) 2014-10-06 2021-03-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for isolation of circulating tumor cells (CTC)
RU2020140209A (ru) 2014-10-21 2021-01-25 Юниверсити Оф Массачусетс Варианты рекомбинантных aav и их применения
RU2020109343A (ru) 2014-11-05 2020-03-17 Вояджер Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды aadc для лечения болезни паркинсона
ES2878451T3 (es) 2014-11-14 2021-11-18 Voyager Therapeutics Inc Polinucleótidos moduladores
CN107109407A (zh) 2014-11-14 2017-08-29 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
EP3230441A4 (en) 2014-12-12 2018-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
EA038402B9 (ru) * 2015-06-12 2021-09-22 Глаксосмитклайн Байолоджикалс Са Аденовирусные полинуклеотиды и полипептиды
AU2016362477A1 (en) 2015-12-02 2018-06-14 Voyager Therapeutics, Inc. Assays for the detection of AAV neutralizing antibodies
WO2017142988A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating melanoma
CN117384961A (zh) 2016-02-23 2024-01-12 萨克生物研究学院 对病毒动力学影响最小的治疗性腺病毒中的外源基因表达
CA3013637A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
WO2017191147A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
SG11201809699XA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
KR20220108216A (ko) 2016-05-18 2022-08-02 보이저 테라퓨틱스, 인크. 헌팅톤 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
SG11201900808SA (en) * 2016-08-01 2019-02-27 Wistar Inst Compositions and methods of replication deficient adenoviral vectors for vaccine applications
CA3034089A1 (en) 2016-08-18 2018-02-22 The Regents Of The University Of California Crispr-cas genome engineering via a modular aav delivery system
US11298041B2 (en) 2016-08-30 2022-04-12 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
US20190328869A1 (en) 2016-10-10 2019-10-31 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
CN110506119A (zh) 2016-10-13 2019-11-26 马萨诸塞大学 Aav衣壳设计
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
JP2020518259A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ハンチントン病治療組成物および方法
EP3618839A4 (en) 2017-05-05 2021-06-09 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND TREATMENT METHODS FOR AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
AU2018302016A1 (en) 2017-07-17 2020-02-06 The Regents Of The University Of California Trajectory array guide system
CA3071978A1 (en) 2017-08-03 2019-02-07 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
JP7502991B2 (ja) 2017-10-16 2024-06-19 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2019118480A1 (en) * 2017-12-11 2019-06-20 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Recombinant adenoviruses and uses thereof
WO2019241486A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered 5' untranslated regions (5' utr) for aav production
SG11202100139VA (en) 2018-07-17 2021-02-25 Neuromyon Inc Treatment of neuropathy with dna constructs expressing igf-1 isoforms
JP2021530548A (ja) 2018-07-24 2021-11-11 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics, Inc. 遺伝子治療製剤を生産するための系および方法
EP3861113A1 (en) 2018-10-04 2021-08-11 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
WO2020072844A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acid constructs encoding aav production proteins
AU2019360937A1 (en) 2018-10-15 2021-05-20 Voyager Therapeutics, Inc. Expression vectors for large-scale production of rAAV in the baculovirus/Sf9 system
CN113924115A (zh) 2019-01-31 2022-01-11 俄勒冈健康与科学大学 用于aav衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法
US20220211835A1 (en) * 2019-04-17 2022-07-07 The Wistar Institute Replication Deficient Adenoviral Vectors for HIV Vaccine Applications
JP2023533584A (ja) 2020-07-13 2023-08-03 トランジェーヌ 免疫低下の処置
WO2022165313A1 (en) 2021-02-01 2022-08-04 Regenxbio Inc. Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
CN112831524B (zh) * 2021-02-20 2023-06-13 苏州相奕生物技术有限公司 人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用
CA3213066A1 (en) 2021-03-29 2022-10-06 Soo-Ok Kim Recombinant chimeric adenoviral vector substituted by knob gene of chimpanzee adenovirus serotype 6, and application thereof
WO2022218997A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Novel universal vaccine presenting system
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5240846A (en) 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
US6174666B1 (en) 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
WO1996012406A1 (en) 1994-10-19 1996-05-02 Genetic Therapy, Inc. Gene therapy involving concurrent and repeated administration of adenoviruses and immunosuppressive agents
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
EP0787200B1 (en) 1994-10-28 2005-04-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Improved adenovirus and methods of use thereof
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
US5770442A (en) * 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
US5698202A (en) 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
US6019978A (en) 1995-06-05 2000-02-01 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
IL128780A0 (en) 1996-09-06 2000-01-31 Univ Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing T7 polymerase
US6083716A (en) 1996-09-06 2000-07-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
US5922315A (en) 1997-01-24 1999-07-13 Genetic Therapy, Inc. Adenoviruses having altered hexon proteins
US5891994A (en) 1997-07-11 1999-04-06 Thymon L.L.C. Methods and compositions for impairing multiplication of HIV-1
AU9397098A (en) 1997-09-19 1999-04-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
CA2303768C (en) 1997-09-19 2009-11-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
GB9720585D0 (en) 1997-09-26 1997-11-26 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
PT1064393E (pt) 1998-03-20 2005-04-29 Univ Pennsylvania Composicoes e metodos para a producao de virus adeno-associados recombinantes sem auxiliar
US20030017138A1 (en) * 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
AU5677399A (en) 1998-08-20 2000-03-14 Wistar Institute Of Anatomy And Biology, The Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
EP1200622A4 (en) 1999-07-06 2004-12-22 Merck & Co Inc HIV VACCINE COMPRISING A GAG GENE VEHICLE ADENOVIRUS
DZ3286A1 (fr) 2000-01-31 2001-08-02 Smithkline Beecham Biologicals Nouvelle utilisation
WO2001058940A2 (en) 2000-02-09 2001-08-16 Genvec, Inc. Adenoviral capsid containing chimeric protein ix
ATE422365T1 (de) 2001-06-22 2009-02-15 Wistar Inst Verfahren zur auslösung einer zytotoxischen immunantwort und dafür nützliche rekombinante affen-adenovirus-zusammensetzungen
CA2450470C (en) * 2001-06-22 2012-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for rapid screening of bacterial transformants and novel simian adenovirus proteins
US20040136963A1 (en) 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
KR100987360B1 (ko) * 2001-11-21 2010-10-12 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 원숭이 아데노바이러스 핵산과 아미노산 서열, 이를함유하는 벡터 및 사용방법
NZ539509A (en) 2002-10-23 2008-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Priming vaccine comprising a polynucleotide encoding at least one first malarial antigen and a boosting vaccine comprising at least one polypeptide comprising at least one second malarial antigen having at least one epitope in common with the first malarial antigen of the priming vaccine
ES2478625T3 (es) 2003-06-20 2014-07-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Método de generación de adenovirus quiméricos y usos de tales adenovirus quiméricos
US7291498B2 (en) 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
CA2563500C (en) 2004-04-28 2016-06-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost
JP5690038B2 (ja) 2004-04-28 2015-03-25 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 多価ウイルスベクターおよびその作製のためのシステム
ES2361000T3 (es) 2004-04-28 2011-06-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Suministro secuencial de moléculas inmunogénicas mediante administraciones de un adenovirus y de un virus adeno-asociado.
KR101451620B1 (ko) 2005-05-12 2014-10-21 글락소 그룹 리미티드 백신 조성물
ES2341501T3 (es) * 2006-04-28 2010-06-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Proteina hexon de adenovirus modificado y usos de la misma.
CA2657279A1 (en) 2006-07-18 2008-01-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccines for malaria
MX2009009342A (es) 2007-03-02 2009-09-11 Glaxosmithkline Biolog Sa Metodo novedoso y composiciones.
EP2777185B1 (en) 2011-10-13 2016-08-24 Telefonaktiebolaget LM Ericsson (publ) Method and node related to channel estimation

Also Published As

Publication number Publication date
NZ564586A (en) 2009-09-25
US20120093778A1 (en) 2012-04-19
US7247472B2 (en) 2007-07-24
CA2466431C (en) 2014-08-05
IL223344A0 (en) 2013-02-03
BR0214350A (pt) 2005-05-10
CA2990322A1 (en) 2003-06-05
JP2017035110A (ja) 2017-02-16
CA2466431A1 (en) 2003-06-05
IL230292A (en) 2016-08-31
JP2017035111A (ja) 2017-02-16
PH12016500338A1 (en) 2018-03-26
US20050069866A1 (en) 2005-03-31
MXPA04004876A (es) 2004-07-30
NZ550416A (en) 2008-06-30
SG2013034475A (en) 2016-10-28
JP2005511035A (ja) 2005-04-28
PL209133B1 (pl) 2011-07-29
EP1453543B1 (en) 2017-08-30
US20080090281A1 (en) 2008-04-17
IL161584A (en) 2015-05-31
US8603459B2 (en) 2013-12-10
NO335438B1 (no) 2014-12-15
HUP0500987A3 (en) 2008-05-28
JP2015057051A (ja) 2015-03-26
WO2003046124A2 (en) 2003-06-05
US20140065105A1 (en) 2014-03-06
KR20040054796A (ko) 2004-06-25
EP2301582B1 (en) 2017-07-12
WO2003046124A3 (en) 2003-11-20
ZA200403117B (en) 2005-03-30
JP2017070292A (ja) 2017-04-13
CN1578678B (zh) 2010-05-26
NO334512B1 (no) 2014-03-24
HU230365B1 (hu) 2016-03-29
CN1578678A (zh) 2005-02-09
EP2286841A1 (en) 2011-02-23
AU2002365366A1 (en) 2003-06-10
HU230488B1 (hu) 2016-08-29
IL223344A (en) 2015-04-30
NO20130590L (no) 2004-05-26
HUP1400619A2 (en) 2006-01-30
IL231502A0 (en) 2014-04-30
NO20120337L (no) 2004-05-26
US8105574B2 (en) 2012-01-31
US20170119873A9 (en) 2017-05-04
JP5715749B2 (ja) 2015-05-13
PL373602A1 (en) 2005-09-05
CA2852277C (en) 2018-02-20
EP2301582A1 (en) 2011-03-30
AU2002365366B2 (en) 2007-05-10
CO5590973A2 (es) 2005-12-30
CA2852277A1 (en) 2003-06-05
NO332692B1 (no) 2012-12-10
JP2011055835A (ja) 2011-03-24
IL161584A0 (en) 2004-09-27
SG165153A1 (en) 2010-10-28
NO20042191L (no) 2004-05-26
IL231502A (en) 2017-04-30
EP3108899A1 (en) 2016-12-28
US20150352203A1 (en) 2015-12-10
US9133483B2 (en) 2015-09-15
EP1453543A2 (en) 2004-09-08
MX351516B (es) 2017-10-17
KR100987360B1 (ko) 2010-10-12
JP2013252144A (ja) 2013-12-19
NZ532383A (en) 2007-03-30
JP2009136296A (ja) 2009-06-25
JP2015057052A (ja) 2015-03-26
HUP0500987A2 (en) 2006-01-30
EP1453543A4 (en) 2006-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230364B1 (hu) Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
BG98718A (bg) Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки
CN106999565A (zh) 重组修饰的痘苗病毒安卡拉(mva)丝状病毒疫苗
CN113666990B (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
JPH05505306A (ja) 組換えアデノウイルス
CN106471125A (zh) 包括白蛋白结合部分的腺病毒
JP2002512501A (ja) 外来性ｄｎａを含む組換えイヌアデノウィルス（ｃａｖ）
JP2001515348A (ja) 骨髄における異種性遺伝子の生体内デリバリーと発現のための方法
HU228121B1 (en) Corona-virus-like particles comprising functionally deleted genomes
TW200530402A (en) Recombinant baculovirus and virus-like particle
TW202146427A (zh) 用於預防冠狀病毒疾病的疫苗組合物
EA011557B1 (ru) Конструкции нуклеиновых кислот
JP2001514871A (ja) 組換えブタ・アデノウイルス・ベクター
CN107530383A (zh) 用于埃博拉病毒疫苗接种的方法和组合物
WO2022071513A1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する改良型ＤＮＡワクチン
CN107787364A (zh) 用于治疗癌症的治疗组合物及使用方法
WO2023023940A1 (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
JP2021501761A (ja) ネコ白血病ウイルスワクチン
US20070275873A1 (en) Methods and Compositions Comprising Protein L Immunoglobulin Binding Domains for Cell-Specific Targeting
JPH10500128A (ja) マイコバクテリア感染症に対するワクチン
CN110157676A (zh) 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用
US20130058971A1 (en) Innoculation of recombinant viral vectors for rapid pre-exposure prevention and post-exposure protection against alphavirus-induced encephalitides
JPH10512243A (ja) 遺伝子送達ビヒクルの非外傷性投与
JPH04500312A (ja) 自己アセンブルド欠損非自己増殖性ウイルス粒子
CN110157677A (zh) 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees