HU230365B1 - Simian adenovírus nukleisav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására - Google Patents

Simian adenovírus nukleisav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására Download PDF

Info

Publication number
HU230365B1
HU230365B1 HU1300578A HUP1300578A HU230365B1 HU 230365 B1 HU230365 B1 HU 230365B1 HU 1300578 A HU1300578 A HU 1300578A HU P1300578 A HUP1300578 A HU P1300578A HU 230365 B1 HU230365 B1 HU 230365B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
adenovirus
sequences
sequence
virus
cells
Prior art date
Application number
HU1300578A
Other languages
English (en)
Inventor
James M Wilson
Guangping Gao
Soumitra Roy
Original Assignee
The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2002/003364 external-priority patent/WO2002063806A2/en
Application filed by The Trustees Of The University Of Pennsylvania filed Critical The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Publication of HU230365B1 publication Critical patent/HU230365B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/235—Adenoviridae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/17011—Spumavirus, e.g. chimpanzee foamy virus
    • C12N2740/17022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria

Description

A takihntiny tárgyát képezi rekombinsns adetiovims, amelynek a kővetkezőkéi tartahmzo kapszidja 5 vas: AdFimó-bexosfefeőrie, amelynek ammosav-szekveneiáia a SEQ ÍD NO, 7 szerintii szekvencia, riherprotein. és peslósproteiu, ahol a üher- és peatostproteíuek egyesként emberi vagy simínn eredetűek, továbbá aisely adenovins* tartalmaz olyan adenov irus-szekveseiákat, smelyekböí az Ela- és/vagy Elb-gének fbakeionálmn deletálva vannak, 3' és 3' aáenovíms eisz-elémefeet, amelyek implikációhoz és kapszúdba esömagolódáshoz szükségesek, valamim az adenovírua szempontiából beterelóg transzgéut a gén gazdasejt!() ben tőríénö expressziéi;» irányító szekvenciákhoz kapcsoltan.
Az adenovüusok kettősszálú. LöriiSbelüi 36 kilobázís (kh) körülbelül gettotnot tartaEnsző ÜNSvirusok. amelyeket széles körben használnak géntram-zferre a vírus azon képességeit kihasználva, begy nagy hatékonysággal juttat géneket különböző célszövetekbe, es tmtszgmbefogadö kapacitása nagy. Általában úgy járnak el, hogy az adenovirusok Fl-génjét eltávolítják. es a választott promótert, & kérdéses génnek meg15 telelő cDNS-szekvencíát és poiladeslíezési helyet magában foglaló unstszgén kazettával helyettesítik, íepiikáció'deócíe-i.s rekornbisáss \ mist ho/vj leire z\z adenovirusok jellemző mort61ugia>uak, bárom jelentősebb proteint, bexont (11), pentonijúzist fíll) és götabdoménben végződő fíbensrvtmmet b.knohbed íiber), valstsiss több kisebb jelentőségű pívseiat ~ VI, V11L IX, lila és LVa2 - tartalmazó Ao/aecteres kapsxiddal [W-C- .fessek 7, Gén. Vtról. hl, 2573 (2ÖÖÖ,
21) novemberjl. A vírusgénem lineáris. kettóss/alu 1 )NS, amelynek Süvegéhez kovalens módon protein kapcsolódik, és amely invertált rermináiis ismvtíocő egységeket .{„wWmrmútöi repests9’, 1TR) tmtahnas. Á virus~KN5 szorosan kapcsolódik ,iz tsvn ba/tkus VILproteinnel es egy kisebb, m« elnevezésű proteinnel. Egy további protem. az V. a fenti DNS-proteisi komplexbe vas csomagolva, és a VL proteinen, keresztül strukturális kapcsolatot létesít a kapsziddal. ,3 vírus a víms almi kódolt proteázt is tartalmaz, amely a több strukturális protont átalakításához, ezáltal éreti, fertőző vírusok keletkezéséhez sz.ükséges.
Rékómbisáns adenovírusok alkalmazását már leírlak molekulák bejuttatására gazdasejtekbe. Lásd a
083 716 számi amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, ttmelyben két csimpánz admovtmavektor leírását találjuk, \ >t, 'un »a a -o --/00,0, Y -ckonv abb sektoroku vas szükség, amelyek éllen a populációban eredetről) lég íícís muutható ki immunválasz különböző adCíiovírus-szerotípnsokk.al történő korábbi találkozás álfal mdakáh immunválasz következtében, és/vagy ki vám esethet* alkalmasak ismételt beadásra és tnásodik vakcmázással titeremelkedést célzó megerősítő oltásra.
.Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldás lényegét..
A taláhmhty tárgyát hat rimian adenovirtisbői s/ámmzo izolált nnklerüiá-szekvsnciák: és amísosav3.5 xze.kvéneiák, a szekvenciákat tartalmazó vektorok, és sírnia» adcoovárusgéseket expresszalő sejtvoualak képezik.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezik eljárások, a találmány szerinti vektorok és sejtek alkalmazására.
A találmány szerinti eljárásban egy vagy több beterolőg géni juttatunk emlős betegbe a találmány szeli 5462-6152 SG
Pl 31)()578 •7 rintí vektor beadásával Mivel a különböző vekíorkönstorkotók bumás adenovímsirk helyett majom (sinrián) adenovírnsijkhól szásuaznsk, a nem majom humán vagy aüatí gazdaszervezet korábbi találkozás hiányában sem reagál azomiah immunválasszal az ideges atitigénkéin prezentálódó vektorra. A találmány szenno, készítményük alkalmazása tehát aera malom betegnek beadva a kiválasztott transzgét: sokkal stabilabb expressztóját feszi lehetővé. A találmány szerinti készítmények alkalmazása vakcinaként lehetővé teszi a ki választóit antigén prezentálását ezáltal ptoiektív inmumválasz kiváltását. Anélkül, hogy igényünké?, bármilyen elméletre korlátoznánk, a találmány szerint: áíiesovimsok humán dendrírikus sejteket transzdukáló képessége felelős legalább részben szérű hogy a találmány szerlms rekotnbtndns konstrukciók úninutsYása».;t váltanak ki. A találmány szerinti rekomblnáns síimen adenovírusok heterológ géntermékek i/ι elóállitaSri sara is alkalmazhatok. Ilyen géntermékek maguk is alkalmazhatok különböző célokra az alább ismertetettek szerint.
Λ találmány fenti es egy eb előny Λ nem modgnt az il,jbb«ób<m rea/íetes-ehbe.t ·» omertepúk.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a Ishásbo; csatol· ábrását
Az 1. ábrán a C l csimpáriá: adenovhus [13. azonosítószámú szekvencia], C68 csimpánz adettovírn.s (Pan-9) [14, azonósitöszámú szekvencia], és a találmány szerinti új Fan5 [15. azonosítószámú szekvencia].
Pattó fio, azonosítószámú szekvencia], es Fan? [17. azonosítószámú szekvencia] csimpánz adesevírusok hexcii-kapszidproteiujel kl-hnrckrégíójának ajmhiosav-,szekvenciáját és az 1.2-hurok egy részének amínosavszekveseiáját. rendeztük páronkénfi szekvencia-ossitorerídezéssel egymás mellé. A közbeiktatott konzervált régió a kulösböZö adsnovírus-szerötipusok föseféixis konzervál:, alapáraién egy része.
A 2. ábrán a CÖ8 cstsunánz adenovírus iPan-9) (18.. azonosítószámú szekvencia;, Pan-6 [19. azonosítószámú szekveneta], a Pati-7 [,?.(?. azonosítószámú szekvencia], a Pan-5 [21. azonositoszámu szekvencia] és a humán.adenovirus; 2, szerodpus [22. azonosítószámú szekvencia] és 5. üzemtípus [23. azonosítószámú szekvencia]: filxíi-göuílxtoméHjai ammosüv-szekvencíájának szekvenela-összeiendezését mutatjuk be.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldás lényegét.
\ Vn.:lm.m’v imaest az VdParS 1-Ά'Ά^2ί az,mosnov :mu-,/eks enuak , Atí Pan-ó [?-$ lé c- ’ú azöttoshószánm szekvenciák] és Ad Fan? [9-12., 17, és 20. azonosítószámú szekvenciák] szerottpusokbói származó új nukleínsav- és amtíxístiv-szekvenciák képezik, amelyek eredetileg csimpánz nyirokcsomói»! lettek izolálva. A leírás további részében ezeket az adenovimsokáí esetenként C5. Có és € adenovlmsoktiak nevezzük. Szintén a ialálmány tárgyát képezik az eredetileg -teotnolgns η,νοη: tcx\ntA-\>l /‘dalt S\ t39 adenovírusbő! származó: szekvenciák [24-28, szösösltószásnú szekvenciák]. Ugyancsak a találmány vátgyái képezik az eredetileg: rhesusmajom vesesejt^ból izolált SV-25-adenovinisbol származó szekvenciák [29-53. azonosítószámú szekvenciák] és SV^áÚ-adenethtisből származó szekvenciák [34-37. azonosítószámú szekvenciák;.
A találmány tárgyát képezik tu adeuevirusvektorok, valamint becsomagoló sejttonaktk s vektorok előállítására, amelyek alkalmasak rekomblnáns proteinek vagy fragmentumok vagy ínás reagensek ή: v.ore> termelésére. Ezen télül, a ialálmány tárgy át képezik készítmények heterológ molekulák bejuttatását^, terápiás vagy vakemázázi célzattal. Az ilyen terápiás vagy vakemakészitmérsyek mszertált heterológ molekulát tartalmazó adenovirusvektori tartalmaznak. A ialálmány szerinti új szekvenciák a rekoxabináns adenovirusasszociált vifusvtíkiorok (AAV1 termeiödése szempontjából kulcsfontosságú helper tsegitó) funkciókat is cila ' k ? r iluumv ·. ;g\ : x<.ne>n tontt a »,> r η ίο»: ,4 tet ο I >Ίρν-konumke ,. x J: t a-A
113462-6132/SÖ
P1300575
- ο « és sejtvonalak.
Akkor mondjuk, hogy mikleinsav-szekveneiák vagy azok .fragmentumai “lényegében homológok” vagy lényegében hasonlók') ha optimális páronként! szeks-eneia-ősszetenőezz-s esetén - megfelelő önkiéinsav-inszerctók és -deléclók közbeiktatásával · legalább körülbelül 95-99% azonosság mutatható ki az óssze5 rendezett rmkieiosav-szekvenciak (vagy kontptemeráer szálaik) közt.
Akkor mondjuk, hogy amfeosav-szskvenciák vagy azok fragmentuma; “lényegében homológok” vagy “lényegében hasonlók’) ha optimális páronként!. szekvescia-összeremlssés esetén - megfelelő aminosavmszereiok és -deleciök közbeiktatásával - legalább körülbelül 95-99% azonosság mutatható ki az összerende zek jmmmsav-szekvenciák közt lő Előnyösen, a homológia a mhes. szekvencia. vagy általa kódolt protein mentén kumnatható. vagy japák legalább 8 amlnosaybél álló fragmentuma mentén, előnyösebben 15 amtnosavbó; álló fragmentuma, memén kimutatható. Távén fragmentumokat ismertetünk az alábbiakban.
Mukleinsav-szekvencíák vonatkozásában százalékban kifejezetett szekvencia-azonosságon'' vagy “azonosságon a szekvenciák optimális páronként! Összerendezése mellett a két szekvenciában megegyező .oukleotidokai értünk. .Á szeks'encia-asonssságot vizsgálhatjuk a genom teljes hossza xueutén (például körülbelül 36 kbp mentén), egy gén, protein, alegység vagy enzim teljes nyitott olvasási kerete mentén [lásd például az aöenovtrtis kódoló régiókat ismertető táblázatokat], vagy kívánt esethe-Uj annak legalább 50(1-5(100 nukleotid hosszúságú fragmentuma mentén.
Az azonosságot megállapiíhaíjak azonban kisebb fragateshnnok, például legalább 9 mrkleoíiá, ílplku2ő san legalább 20-24 rtukleobd, legalább körülbelül 28-32 nukleonét, és legalább körülbelül 36 vagy több pnkfrotirl mentén. Λ hasonlóságot, '‘százalékban megadott azonösságot” aminosav-szekveociakra is egyszerűen megadhatjuk a teljes protein hossza vagy annak fragmentuma mentén. A fragmentum legalább 8 aminesav hosszúságú, de lehat akár körülbelül 7ÖŐ aminosav hosszúságú is. Ilyen fragmentumokat az alábbiakban ismertetünk.
-Az azonosság tokát algoritmusok és számítógépes programok alkalmazásával batifrozhatjuk meg egyszerűen, alapértelmezett paraméterem tnelteít. Előnyösen, az azonosság;a protein, enzim, alegység vagy legalább 8 aannosav hosszúságú fragmentum teljes hosszára vonatkozik. Az azonosságot azonban az: azonosságöt mutató gétttemék felhasználásának megfelelően rövidehb régiókra is megadhatjuk.
Kívánt esetben, az összerendezést végezhetjük térítés ftéíkal vagy kereskedelemben bozzúferhetö '‘Multiple Sequenee Aíigmcnt Program, .például a “Clustal W” alkalmazásával, amefr hozzáférhető a Web szervereken kérésziül az internetes. Aikslmszhstjok a vector ΝΤΓ alkalmazásokat is. A technika állása szerint számos algoritmus ismert, amely alkalmas a atikfeoödszekvenoia-aKOn.ossúg meghatározására, például a fenti programok álfel tartalmazott algoritmusok, Polhínkleotid-szekveoeiák összehasomthaiók még a Fasta. ο „('(. v \ ersson 6 I' ,<.‘s<ct kepc.re program a&a'.mtzasrtfe \ 1 as,a a. e\vchus< múlandó es 3d.üb<v5sóán szereplő szekvenciák legoptimálisabb összerendezése mentén végzi el az átfedő régiókban a pérofikéntt őszszeresdezési, és határozza meg a százalékos szekvenela-azonosságet. Például, nukleinsav-szekvencták százalékban megadott szekveseia-azönosságáí meghatározhatjok a Fasia segítségével. a „GC<3 Version 6.1” alapértelmezett paraméterei mellett iszóhosszúság~6; a pontozásos mátrixra NOPAM-foktor.;, amely teljes terjedelmében a kitamíás részét képezi. Hasonló programok állnak rendelkezésre araínosav-szekvenciák őssze40 rendezésére, ÁhaláHOSságbao, ezeket a programokat alapértelmezett paraméterek mellet; alkalmazzak, bár a
113462-6132/SG ísl 3ŐŐS78 beállításokat szakember igény szerint megváltoztathatja. Szakember -alkalmazhat más algoritmusokat vagy számítógépes programokat Is, amelyek a referencia algorilmuasal vagy programmal megállapított azonosság! szinttel legalább megegyező fotói azonosságot képesek megkeresni.
A leírásban és a csatolt igénypontokban „tartalmaz” kifejezés és annak változatai („eomprises”, „comprismg”) ittás komponensek, elemek, integerek, lépések és hasonlók jelenlétére Is vonatkozik, A „valamibői áll” .„valamiből felépül k-fetezes kizárj.} egyéb komponensek, elemek. integerek, lépesek ás hasonlók jelenlétét, .LSitnka.sfe«yjaoatei£ia
A találmány tárgyát a természetben elótbrduló környezetükből, szókkal asszociált -más v írásoktól izo?0 , Iáit Patrik Panb, Part?. SVl. SV?5 és SV39 nukleinsav-szekvenciak és ammosav-szekvencták képezik, A^.kfofens<kY-szek\göc iák
A találmány szerinti PanS mtkleisssv--sze.feene.ja az I. azoaosliószArná szekvencia 1-36 462. mtkleotidjait tartalmazza. A találmány szerion Fanó nnkfensav-szekvencia az 5. azonostlószfem szekveaom 1-36 604 nukieoiidjaít tartalmazza. A találmány szerinti Fan? nuklem.sav-szefeencja: a 9. azonosítószámú szckwncta I 5o W nakleetKíjatt mríalnuzza Λ íifemart', -/euno I nuuto-ní-ev-^ekvenua a 24 azonosítószámú szekvencia I-54 264 nukleotldjstt foglalja magában. A találmány szerinti SV25 nnklel-issv·szekveticia a 29, azonosítószámú szekvencia I -31 044 nnkleotidjait lóglalja magában, A találmány szerinti SV39 nttkleimv-szekvencia a 34. azonosítószámú szekvencia 1-34 115 nnkleotidjaitfoglalja magában,, lásd a szefcvenciálistát. amely teljes terjedelmében a kitanitás részét képezi.
A találmány szerinti nukíelnsav-szekveixia kifejezés vonatkozik az 5./9., 24., 29. és .34. azonosítószámú szokveKdákkiú komplementer szálakra, a szekvenciáknak megfelelő RNS- és eDNS-székvendátep és szókkal komplementer szálakra. Színién a találmány tárgyát képezik a szekvesclallstábas szereplő szekvenciákkal 9595%-nál nagyobb mértékben, előnyösen körülbelül 99-99,9%-ban homológ vagy azonos nukfensavszekvenciák. Ugyancsak a. találmány tárgyát képezik az 5.. 9., 24., 29. és 34, szonosltoszámú szekvenciák te25 mészetes variánsai, es komplementer szálai. Ilyen módosulások lehetnek például a technika állása szerint ismert jelölések, nretllálás, és egy vagy több természetben előforduló rmkleotid szubsrifetoióia degeneráh snkfeedádal.
\ taltómútív tar-..:',,a kesx/ik to-mbba a F,m>, Ferto, Pm7, SV3, SV25 és SV^ vz.kscr.cíuk ftagmenttmiat. azok komplementer szálai, és azoknak megfelelő cffeS ás RNS-sznkveneiák. A fragmentumok előnyösen legalább 15 nukleotid hosszúságúak, és azok lob. ú A feakcfeiális Iragmentumok, azaz biológiai szempontból érdekes fragmentumok. Ilyen funkcionális. fragmentum expresszálhaf például kívánt adenovirus-tennéket, vagy alkalmazható lehet tekombináns vírusvoklorok előállítására. Ilyen. íragtnéntumók például az alábbi táblázatokban felsorolt génszekvcnciák és fragmentumok.
Az alábbi táblázatokban a találmány szerinti s-mian aáMovtnrs szekvenciák átírt régióit és nyitóit olvasási kereteit adjak meg. Egyes gének esetében a tmnszkrípmmok és nv tott tóv.ivrsí keretek (ORD >r 5.,
9., 24., 29. és 34. azonosttőszámó szekvenciákkal komplementer szálon találhatók. 'Lásd például, Ffe E4 és
E2a. A kódolt proteinek számított molekulatömegét is megadtuk. Felhívtok a figyelmet in,-> bogv u Fan5 lila nyitott olvasást kerete [az 1. azonosítószámú szekvencia 576-1436, sokiertódjaíl, a Fafe hla nyitott •Olvasási kerete fáz 5. azonosítószámú szekvencia >76-1437. m-kleotidjaíj, és a Pun? £la ny-fott olvasási kerete (a 9. azonóshószáínó szekvencia 576-1437, nakleottdjalj belső hasítási helyeket tariátótááinak. Ezeket
4Ó a hasítási helyeket a táblázatokban jelöltük.
113462-6132/96
P13Ö0S78
XXXXXXXsXXXsXw.
Ad Fan-5 [1. a,sz.sz.j £
\xxx
I
Régiók j g|a j Fw^iX«r·
Kezdet Vég iímklectiá) í Ί í ««ΜΜΜ^ΦΜ'ίΜ'Μ'βββ'Η'ΡΜΰβ'ΜββΟΜΜ
Mö&S&ökn^fcg O\íl 3 .<*W $ $ i ^\%ΧΧΧΧ\ΧΧ\\\ν\\νΛ.»·^Χν·ί««···»<·Μ«,.\·Λ»,··»·Λ·«ΜΛ·Λ«.%.ν».ν>ν>:«,·,·.^&·'!
.·.*» .»S ,·.χ.
“ 1
Ά? Μ
: 14dói
i:s 57MÖ4<\ 1233» ( 29W HM j
98 .... ....... . ..... HÓMMJ23M MM VÁC
i f-uvizkílptuíü I ? i5íé'
Elb Ϊ Tmsirtópwtos 1552 ' ·
Ku.,: T Ϊ $W H71 22JP
Nagy Γ 1W4 ?4'ü ÁM95 j
IX 3492 m:o /9927 1
TremknpaaK ·: Λ(. :
E2b ••TmsszknpiöBSí RVM9 | •
FTP _ Pofonéra* MWj .^Si, ΜΓίΠ M'g’F M9M ϊ '2 ·> *í
4r·? 61 '1 A
FI 300578
- b
Γ ' · Ad Pan-5 (folytatás) | L a.sz.sz,]
η Ré«í6k Kezdet Vég Molekulát Enej
i f-uk lem 141 í tkskoni
B2s l'öro/khptuí» 26792 * .
DBF 23336 21845 37556
J 21788
Ö rfWzknptiífB 33406 .. : ..d
. :md 33412 2 5305 68775 1
í* :· 53 kö kwofotf 25325 24356 3955$
1 vin 26423 271111 2-476$
'fratü.zk'ws.!»·» ' -27421 *
ll Frans/knoturri 26783
OH#1 27113 27432 22996
Örf4'2 27586 23912 25690
0H95 2'm 28527 /9525
OrfH 23357 29136 22567
Oií#5 29169 29783 i 277/0
Öd'4Ö 29798 39673 5/458
OH#? hW 3G036 /097?
OH #8 32962 31396 /6525 1
OH 69 3Ϊ389 31796 [.. /5256 1
T eaí®fckr?pui£ft: 1 * ................ 31837 »·
L5 'üvnszknptiííJi 32932 Λ
Hbn 57955 33372 -Hőd)
Ttaíjssíácnpi’sat 33443
ί 24 I fjíUZkfSpUSf: 36135
OH? 33710 1)4-62 9/0/
OHő 3*as1S 33719 55995
OH 4 34886 54321 /5678
j OH 3 55249 i 34896 /549/
OH2 55635 5 35246 /9569
^Onl 36959 15676 /5272'
i ϊ 53437 ,> 7
ITR 36343 i 16442
113462-6132/SÖ
F136Ö575
AdPa«-0 [5. s..sz..sz.i
Régiók Kezdet Vég Íítnkieoíld) Mufcteííatömeg iWtoíé 5
Π72. í í 121 i
Ha > s r-xmvkftytiK’s 47$ | - i
13$ $764 M3 1437 1029- m |
12$ 4764954, 1229- 1437 2403
ΐ ' -9$, >?§ ó4\ 044 1Ό7 IŰ/&1 ..............................J
j-i»·.’kuoau í ...........= 1510 • 1
Elb í'iSLíWZkfiptiííf·. '4553 ;
K.!$ ' 1690 3172 005/5 ί
i Nagy 7 144 3413
IX 1493 $920
P-an •fkoptum 5765 - ;
£2h I «iflítökn pttttTi kc4? i
P7P 0440 $451 725 70 í
ífefener&f. $445 >0$9 070007
IVaZ SOR) 34S6 50452
‘ÍTaiftítópuira .)060 -
Ü TYSíHSítepmví ..........’.. .<...... 414 .............. ' 1
$275$ kD B)$40 4912 07.375 j
5 w 13799 05*6ö [
! SVoZ.! ptíBSS ΐ mn - i
zUka 5161 5905 05012
Asswr«ein 7870 5Z00 25 55 0
U Trass/knpns» 4§70 i ·: :
P?sw 13 $78 15407 5R7/7
\n 4471 , 14)55 0/500
í V 10100 17137 j&m'
Mu Fm>p .-kopásit ......... í 17160 17393 AWV. Λ1. „»»..»»»«,.γνΑ-Λ 17415 2593 yAWA-vi-MSvVAY,', ,,χ,,μ,
ί In» .'koptam 1 17406 Pn ......... pTmT ....... — ~~ 05500
V i 444 omo 100/53
j ' RHóprotdase 1 OlUz 0175,4 03777
1 s '1 si»iíKkdpnifö 1 01004
1 kés l'iXawAnptí.»» | 00780
'6 DBF | 'tv'5 21037 ......... ':'·094'
$ i Γΐ'Λ«&ίληρ5·αιη ; 21734
ί 13462-6132/SG
F UW57 8
Ad Pan-6 (folytatás) (5. a.sz.szj
Régiók Kezder Vég Y^itehs^tesg (Dal· (fníkícciídl toí7
U rransmwwn 23302 .<
HHÍÖ 23404 MP?
33 kD homofog 25323 2035/ 246ÖÖ
VÜI 26426 27109 24749
Tr smkoptian 22419 .V
; h i ΐ rjíss'íknpUOT; 267SÖ
27114 27430 /2929 i
OrK? 27354 23O07 3AW
Ki 9? 2~í>46 24519 ' /0440
Orí#4 34553 20256 23435
1 OrfOS 22249 ; 29360 22550
006 74-41 5/0
Orf#7 i 30749 t WP
OrKS 1 mso . 31404 /3540
K'K9 1 3M57) 3ISM 7.5254
Tra«szknptK>a ( | 31907 *« :
L.S 7 *ír3a$2k-npta») | )
Nber i 3462 33493 4/564
rnmsifnwiujn 1 t 35524 ·.
154 Tra.wkttjínrai | 30276 ( : »: ί
Od? 3 534! n$ő3 9/77
OrH 1 347W 5334 H kW
,Ötf4 ; 55OP; 34652 ( /5957 i
Itr KM 5 * 35530 35027 | 1 Úrí 2 , 35766 553?K /470 1 lOrfl , '>$0\ K’'* | '5 íiiKsrtepWí?! | s 53550 1 - i | —η—J—^
Π462-6132/SG
P1500578
Régiók A4 Pan-7|9. a.sz.sz-1 ~~~~~~~~
Kezdet bükk Vég ;otid) „ MoSefcaiaíÖjaegiPalteK)
η r I 132 •A- . .1
Bla • funskkópnsat 47S
13S 5?§ - i 1229-)4)- 262/6 j
ί : V»’A\SSS\V»W»W.V»V.WAWA\\‘.Sy*'«XA .>· -x<\? $76 ~R>5lk 1W- 1437 s 2456/j
; 1 57$ - 443, ~~~~ FTT/vTi i |
í 1226 ~ M27 ...........,--,-,..........,.',',..J
J Tíunszknpúím .1 §W í ~ 3
| B.lb tísnsífcj?pí«ö· : $53 mwWNWWWAMNWMWSW^^
Ki::T 1600 ΆίΑ>^ ώ·λ /« .32559
Nagy T 1903 3414 55626
<Vp2 -............. 7442 5516 * >' V
Tiaasztópíma 5471 -»
kb l\un$ztept«;n !0?4Í A· i
rr? 10340 §457 73297
í\- -isseriz 3451 5045 /3ó39?
ÍX 3504 3932 7447/
! ;_ í rdiwzkfipurea: 3472 A- j
282 RD 5167 5441 26026 :
AgmtptWb 7876 3586 2.5424
i n S Tansíters púim í'b54
í 52/55 kD (0836 non -44502
í Bb 1265$ 13745 £5559
$ TsssszknpiUfts J
í 1.2 THKWzfcnptöffi □$?Ö - 5
1 iWod i 3874 15-169 554.H
vn 15473 16087 27552
V Τ'- 15102 i 7139 594/6
Met 1716? 17400 5506
Tís».szknp?u«5 171241 · í
1.3 : TsassAngísssa : d- ' :
Ví rro 13198 26/65
Hexdts 108 21006 /ÜTó3
1 KiiíkípTOtóí. :nrö 21732 25620
TlUSSZteípíUBi 21781 í
b\b 'transzkttpíüií;. 3-> >- i
1 DBF 27 753 21013 57799
íi 'U-anszfc'.gíasn 21755 1
Π 7462-6132'SG
Η390578
UÖ-
Ad Psn~7 (folytatás) (9. a.s'z.sz,] ___________________________ _ W&ufcaÖmcg J
I Régiók ínukkotíd) {Ösifoö)·
14 TíUfSi-í.kOfSVtti 23370 ··<*' <
lOÖkD 23376 257Í1 i
BkD homofog 35419 MBS 35355
vili 1 264101 27093 24749
Traaszknpfcsn} 1 27405 ...................................................d
B3 Tjxnszknpíyfs; j ΆΟ/^Ο | J
Orf 41 ) 27<« j 200 53656)
orm . AH 2 VM 22600
Of 63 27970 23500 ' 1
Obi 24530 29150 27« 1
OÍB 1 29ΊΒ 29777 522.37 j
OrfAfo 29792 30679 J2255 ?
Orf 47 306S7 30942 0B
OrtfoS 3096S 31399 /OUOd
CrO9 31592 3Π99 55205
TswsstesKajn 1 31S42
b hsnsxíiRpuaf: | 0091 W :
Ftber 32694 33425
3351?
1:4 rmszfcnpfyjfi 36204
Orf? 337S4 33536 9292
(M 6 34689 35734 060.0
Orf 4 54960 34595 0979
Orf 3 05523 54976 :5009/
Of 2 52700 35320 1 59«
Orf I 30125 35749) 30$
rtidnükfipuat· 33501 1
rtb 30404· 30535 I
I15462-6B2/SG
PBÖ0S7&
Ad SVA (24 a.,«z.»2.j ——> Ad SV-25 [29 a.sz.sz.j AdSV-30 [34 a.sz,sz,|
Kezdet \'íí· Kezdet Vés í\ííZ<i ííí Vsa
FFR = 06 1 m 1 ISO
Bb 352 1WO - - 404 lOÖÍ
Étfe 1301 2891 359 2270 15 IS 3877
föl 9257 2$S2 W 2754 10143 3308
B2ü 244 = 5 24054 20OSO 23381 21228
24974 ··· 27W 247J 25792 25790 '39235
U 334% K.Aht 50090 28163 33894 .3.1157
ITR JiJ 54204 < 30912 L- 31044 33960 3411$
wsy-i Ρ«λ sz.sz.j Ad SV-2S JA”J.......................... Ad SV-39 [34 ts.ss.szj
Réssé Kezdet w Keziks Vég Kezdet Vés
O'R 1 100 1 ................. .1 = 50
Ϊ..1 ...... 9313 ;23A 9343 10410 ·; Π383
L2 12453 13853 12283 150% 13444 = 6877
12 15910 .12773 1574» 20080 17783 21192
14 21715 2 5583 21520 25420 22659 20-427
15 28059 30589 25320 28172 29513 3Π70
rrk 34145 30912 34115
113462-6132/80
H39Ö57S το
ΐ fehérje :.' AdSV- L..... . .....ί...........___________... .1__________________________ 1, 24. a.s2.sz. .MJefcsiS.v Vég: wsRCji
h ; kezdet
ϊπ> .--....^ h _____________________te ......... 103 -
Us ;3S 439 433 26359
J5
ΪΖΪ • 2? Kis ΐ
Nagy T j W w 422Z?
IX : 2391 2 355 «
' 020 1342 143Μ .k.s...s..w.v.—.ssssssss..s.«sssssssss<Lss....s.>s>ss.s..ss.s..Í 2324 54>?
pohnseraz j 9?2Ö 432? 252363
fel? 423? 74? j XJ/5
Agru-fehege 3530 ?45S 23564
AJ 5 A 53 J3 35 15 : . X®42 42625
Illa j 19« A572 456566
L2 Feasss 1 12 kJ 13965 56755
VB: ' Ι5Ά5 AJA 2655?
V í 14383 15525 53554
Ma 1 fejte 15557 ί X5A4
L3 V! : Sfeíil
Htssos 1 WS41 19636 504454
Endoproieáz < 1^5 20262 5343?
2a *IRp 2 ? '20512 55/0?
u 1:33X0 j .JJJ 2-040 ' XfeW
VM ; 245'fi 25232 } 25230 •™ ................
ί LM62-6Í32/SÖ
PJ300578·
-U-
fehérje Ad SV> 1 (folytatás) 24. &.8Z.8Z.
KMíie. Ό tóm<í£'
133 Grffi .............................................. 23292 23609 //.950
p Orf^ 2S5Ó3 26081 7MW
Ort'#3 26684 26893 50453
004 2Ő0O8 27180 /0253
005 27177 ................. 17512 /307
í L................. 006 27503 27873, /JW
115 .. O #2 z&05$ ........................ 29130 3.7473
PsO 81 29Í85 6//26
E4 w 31098 ........ 30892 703?
oo 31982 3h22 5592/
32277 3)915 /4528
i Orf 3 32623 \>279 /5580
oo 33018 32626 /4255
Őrt 1 3?cs 3 3Ö-13 /450/
1FR L 34145 ............. í í^,x.................
113462-6122/80
01300578
fehérje Ad S V- -25,29. a.S2.s;;. fdölekte- j Vág íőíüég . . . ^Ί Ad SV-39, 34. s.sz.sz, McO&aSs·· .. Kíízdrt Vég teaeg
tetet
ITÍ? 1 EB - i ISO -
YU 53S 402 KÍS5 28585
12S 492 | 1355 25603
BÍb K:S · 478 1030 26274 i 1518 2675 2/652
¥ 829 2244 57306 1823 33-10 555.1·?
IX . 2305 3716 155854 ~ ; 3434 3844 /4675
B3b i%.G -?2-B > s χ,-,'5 30U hHi 46/64
1 PiítuKcOffi 16581 ; -i 3858 /02633 77;; 3 5933 /03585
FIT* ói??.? 7.70? i '/326 ; 10M3 8555 e'-'2~4
Ϊ Á?a> proteb 0681 ΐ ?i3§ ;S625 í -
:u 52.-55 \P 'tart Hö4í2 .................... l........... 4/765 írni s Π608 472.32
«u ;?K3 i 12202 . ?i.................. 65396 11574 1 3364 666 :'8
u fcm | U2§4 Ϊ 15801 56.646 13448 14050 56202
VÍr ’i 11806 I M369 ;..........................L.................i........ 26565 OKOO j:';317 36574
1 V ; 144¼ 1 13463 56280 15567 15628 566--6
Mu ΐ 1S483 ; 5695 7568 16650 16871 746?
; : : e-í : '•'•'í i VI 5 576 | ·6$91 < 1 -?4’ 10025 rws 3-36 *5 7
RexM l6e$l 19445 /64655 17755 26558 /62570 1
Eude-proteáz - VK.-.S '.í ' te,·? 20373 31181 327/6 8 2 1
2s DB? 21311 20123 52/86 ?.2O31 212.31 5S/60
y I \W 21533 7.3829 55676 A>«> 's\'< ' <5 <
Vili Atá08 73100 2554? 75410 I loSöS s28374
U34Ő2-ŐB2/SG
Pl 300578 ,15-
1 bekérje .Ad SV-35 (folytatás). 29, a.sz.sz. Ad kV 39 rtoiviatasí, 34. a.sz.sz.
1 Start Bnd ,;W. Ei Surt j Búd
E3 ÖrfH 2$ 109 p$426 h\W 20325 2?4H 4?257
Űrt 92 2.'5$Ö 2OS? 56755
OrW ’ 2S:3?6 2SM5 /65/4
OtíM 2ÖB 29233 /S535
Orf#S
űrt 7b j
Ló RberA> ) zHhö
bibéé M 2ó4S? 2313b ddd? 29515 3líib
E4 Orí? 3140 31 lök Ű555 ........... :
Űri 6 26255 23365 551-55 32292 3143B | 55/5?
űri 4 26550 29133 0069 32537 32225 /59.97
űri 3 29662 29352 ÍÁHd j 32954 32Ó87 /5355 ' ;
Orí 2 3b29l 29396 A/eóó 5334S 32656 ./« j
Orí 1 363 ló 3ÖÓ9Ó /936/ 53954 0175 /4255
(ÍR __ 36912 31644 333Ó6 14115
A Pas5, Panó, Pa«7, SVL SV25 -és SV39 aáeuovíms mtkieinsav-szekvenoiák slkalmaz.hatók. teápi» ás ágensekként és külSaPözó vestonw.ífezerek és gazdasejtek előállítására. A leírás szerinti; értefemben, vektoron, ériünk bármely tlvca fonkeió betöltésére képes nukleinsavmmlskoíát, ezen beiül csupasz DNS~ts plszrmdot, wcsd, közreadni r agy episzomát. Ezek a szekvenciák és íconckek alkalmazhatók egytagúkban; \3g> nas adenovirus wgy nem adenovtms szcto en. iákkal vagy &agia«ni«mokk:al kombinálva; vagy más: aáetnnirus vagy nem adenovím. szekvenciák elemeivel kombinálva, A találmány szerinti aderioOreSszekvenc-ák annszensz szálltán etetőkként, génterápiás vektorokként vagy vakcina vekiníkkónt is alksl18 máznátok. Szintén a találmány tárgyát képezik tehát a találmány szerinti aderiovis-us-szekveucsákat tartalmazó rinkleinsav-molekulák. génszáilho vektorok, és gazdasejiek,
A iahdmany tárgyát kepezik például a találmány szerinti simán Ad ÍÍR-szekveneiákat tartalmazó nukleinsav-moiektílák. Ezen télül, a találmány tárgyát képezik kávást Ad-génierméket kódoló majom Adszekvenciákat tartalmazó nukleittsav-mofoknlák, A találmány szerinti szekvenciák alkalmazásával dőálllthaí5 ló egyéb nukleinssv-mok-kulák a lenás ahtgjás szakember számára nyilvánvalóak.
A találmány egy további előnyös megvalóshási módja szerint, az áltahmk azonosított majom Aá.genegwk alkalmazhatok különböző vektorokban, heiétoióg molekulák ehuitataram a .sédekhez. Vektorokat eku Unhatunk példás 1 adenov trus kapszídproieits (vagy annak S'mgmentamo) expre^altata^ua, Pe< somagofo gazdas.edckhen alkalmazható vírnsvektorok létrehozására, flven. vektorokat meetetve/hentnk out hogy azok a műt teonéket tewsz. módon expresszálják, ilyen vektorokat Ktegtervezhemsk ug\ itt, hogy kivont
1534Ő2-6132/SG
PI3ÖÓ593
-lő-denovittm Funkvtokst például az i la, Llb, a temnaahs ismétlődő szeks enci.)kat, az ti'a, 1 ?h 1 l é. vagy E4ÖRFŐ régiókat - expresszáló szekvenciákat stabil isjódoa.tartalmazó sejSvonalat kapjunk.
Az adenovírus génszekvencíák és azok íragmentomsi alkalmazhatók továbbá helperftmkckAíÜggő vírusok (például esszenciális funkciókat ellátó régiókban deisták atieuoyírns-vektotok vagy adeno-asszooiák vírusok, AVVt eloaihüsshe.’' s/nxtozcs őebet- (segítő' tünké ok dlatinán lóén vírusok eícaiktasaru. a ialáííttány szériád sírnia» aslenovírns-szekvestctákat hantáit Ad-szckveuciákhoz hasonló tnddotr alkal-nazthatjak. A majom és husnán Ad-szekveneiák és a találmány szerinti majom adenovíms-szekvenciák eltéréseinek következtében azonban a találmány szerinti szekvenciák alkalmazása lényegében kiküszöbölt a homológ rekombináció lehetőségét humán AdEl-iúnkeiőt hordozó gazdasejtek, például 293-sejtek helperiunkcíóíval, and esetleg fertőző ítdensívíras-komaíuinánsok keletkezéséhez vezetne rAAV-vírasok előállítása során.
Ilyen rAA V-vírasok. adenovirus heipertúnkciók segítségével történő előállítására alkalmazható eljárások - humán atteníivirus-szerodpusok alkaknszásávsl - leírása a szakirodalomban bőségese» hozzáférhetők. Lásd például a 6 258 595 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást és abban idézett hivatkozásokat, Lásd még az 5 871 W2 számé amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást; és a WO 99714354,
WÖ 99/15 685, Wö 99/4? 691 számú nemzetközi közzétételi iratokat, tizek az eljárások nem-banian AAVszeroítpnsok, például nem-hamun főemlős .AÁV-szerotípusok előállítására is alkalmazhatók. A szükséges helperúmkciők ellátására képes találmány szerinti sírnia» sdeneo tru\ genszekvenciák (például Lla, JSSb, E2a és/vagy .E4ORF6). alkalmazása különösen előnyös lehet a szükséges adenovirtts-fúukeiók komplementálására a tipikusan humán eredetű ttAAV becsomagoló sejtekben jelenlévő egyéb gdenöviresokkal történő rekombináció lehetőségének mmfmaltzáiásá vagy kiküszöbölése miatt, A találmány szerinti adenovirus-szekveneiák kiválasztott génjei vagy nyitod olvasási keretei aikahnazlatíók az ilves. rAAV-íermdő eljárásokba».
További lehetőség szerint, a találmány szerinti rekotnhináns sírnia» adeno vírus-vektorok alkalmazhatók az ilyen eljárásokban. Ilyen rekembináns sírnia» adenovhus-vektorok lehetnek például hibrid csimpánz
Ad/AAV-vektorok, amelyekben a csintgánx Ad-szekvencíák fogják közre például az AAV3' és/vagy 5' 1TRrégiőkat és annak expresszióját szabályozó szekvenciák ellenőrzése alatt álló rr&oszgéxrt magukba foglaló rAAV expresszíós kazettát. Szakember szátnára nytlvársvalé, hogy más találmány szerint: sintiaa adenovirusvektorek és/vagy génterntékek is alkalmazhatók rAAV vagy egyéb, adenovüus heiperfunkriőtól függő vírusok előállítására.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, nukíeínsav-ntoiekulákat kívánt adenovírus gétúermékek givzáasejíekbe történő szállítására, és azok expresszáltatására tervezőnk., hogy ezáltal kívánt élettani hatást érjünk el. Például, a találmány szerinti, adenovírus E la-proteint kódoló szekvenciákat tartalmazó nnkiemsav-mofekulákat. egyénekbe juttathatunk tutnorterápiás célból. .Adott, esetlaen. Ilye» tuolekulak.n lipidházisu hordozóanyagban fbromlázunk, és axofcat célzónán ttmrorsejtekhez juttatjuk el. Ilye» készítinénysket más timtöricrápíás szereklsri ípe'dáui etsplaiinrtal, taxollal vagy hasonlókkal) kombinálhatunk. A taláhnány szerinti adeaovjm-szek'« csak további alkalmazási lehetőségei szakember számára világosak.
tizet: telük szake»:ber számára az is nyitvánvalö, hogy a találmány szerinti Ad-szekvéneiák könnye·: íídapsálhatók különböző vitális ás nem-vitális vektotvendszerekhez terápiás és únmtmogén molekulák út
4ő víP'ö, ex vívó vagy úí rit-o szállítására. A találmány szerinti Pa»5, bánd. Fart?, SVl, SV25 -és/vagy SV39
113462-6132 SG
Pl 3(8)578 sumun Ad-genontok alkalmazhatok pcldaui kúíönbozó tAd- és rtcm-r.AdoekmrrenOszerekben ilyen vcku'trex;dsze.oak. lehetnék többek között píazimdek, lenúvírus, reteovírus, poxwusok, vaeciniaviras és adenoasszociált vfrusrenászcmk. A találmány szériái! megoldás netn korlátozódik valamely meghatározott vektorreudszerre.
Ugyancsak a t&lúteúay lárgyáí képezik a találmány szerinti majom és ntajomeredétű profoinek ölőáilííására alkalmas molekulák, ilyen molekulák, amelyek a smxiaa Ad DNS~s»ekve»ciák»t tartalmazó pedi«ukleoíidokat hordoznak, fohstoek csupasz DNS, plazmád, vírus vagy bármely más genetikai elém formájában.
lö . S/m-én a JalÁhnánv urgyát képezik a fenti adeuovűusok géntcsraekei. pékiául a találmány szerinti adeno? trtts-wkletnsavafe által ködök protenvk, enzimek es azok: fragmentumai. .A találmány tárgyai kenezik továbbá a találmány szerinti nukleinxat -s-zekeendák által kódéit eminosav-szekveneiájú. de más <.1μη< ss ti előállított Fan?, Pattá, Pan7, SVI, 5A33 cs.sapy SV39 proteinek, enzimek és azok fragmentumai. Ilyen proteinek például az I. és 2. ábrán bemutatott nvitott olvasást keretek által kódolt proteinek és azok Imgmesíu15 mai.
A találmány egy szempontja szériát, a találmány tárgyid képezik Izolált simám adesovirasprotensek, anteivek lényegében tiszták, azaz más vírus és pfotemszerií komponensektől mentesek. Előnyösen:, ezek a pr<'leinek legalább 10%-ban homogének, előnyösebbért 60%-bas homogének, és legelőnyösebben 95%-bas homogének.
A találmány egy előnyös megvalósítást módja szerint, a találmány tárgyát képezik izolált majomeredetű adenovinas-kapszidproteinek. A leírás szerinti értelemben, msponteredefo adenovte-kapszlt^roseinen..a F&n5, Panó, Part?, SVI. SV25 és/vagy SV39 kapszidpretcinek bármelyikét vagy atmak fragmentumát tarts!mázó adenovirus-lcapszidproteiní értünk, például, de anélkül, hogy jgénuínket a felsoroltakra- koriátozmuík, kitnéra kápszldprőfoineket, lüzlós proteineket, mesterséges utón előállított kapsaadprotelttekef, szintetikus kepszsdprötöneket és rexombtnáns kapsziáproteineket, tckmkrt nélkül a proteinek előállításának módjára.
Ennek nacuteleloen. ezek a majomeredetú kapszidproteinek egy vagy több Far,?. Fanb, Ean7, SVI,
SV2S és/vagy SV'<> jvmót vagy fragmentumot (például hexont, pontont, lábért vagy azok fragmentumát) tartalmaznak egy eb adcnovírus-szeroűpusoklx/l származó kupszidregsókk.sl vagy íragtssutetnokkal, vagy modositoh suruuu adonnvirus eredetű kapszldproteinekkel vagy fragmentumokkal kombinálva. A leírás: szedő nntt er-elentben ,,a kapszidpretein megváltozott tropixuiussal asszociált módosításán” módosított kapszidprotein (például penfon-. bexon- vagy Sherproíein-régió vagy Ilyen (ragmentnai, például Shérregiögömbdomén, vagy a felsoroltakat kódoló pohnuklcotid) létrehozását érijük, amelynek, specsfitásn a módosítás következtében megváltozott. A majomeredetú kapszidot előállt-hatjuk egy vagy több találmány szerint; suttí&ij-Ad vagy ?r;ás, humán vagy nem humán eredetű A.d.SWót^}ns^k..alka'lHi8Zásával, ilyen Ad különböző forrásokból szerezhető be, például az A'i'CC gyűjteményéből, kereskedelmi forrásból vagy kutatási iraózményekbi'l vagy az Ad-s/ekvoncia hozzáférhető & GenBank adatbázisából vagy más forrásból, \ tJ&lmú n szenna suruan adenovtras pepfonprotelnek amríjosav-ssckveneíáit csatoltuk. Az AdP3«5penloPproteh? őzukvetsclájáí a 2, azonosítószámú szekvencia tartalmazza. Az AdPaít?-penton szekvenciáját a ö, azonositoszamo szcsvenesan adtuk ateg. Az AdPastá-penion a 10. azonosítószámú szekvenciáié. Az SY14ö pctt.ton szekvenciája a 25. azonmitószámá szekvencia. Az- SV25-peatonproteiu szekvenciáját a 30. azonosító1134Ó2-ÓÍ32/EG
Pl 300578
18számú szekvencia «jutatja. Az SV39-penton a 35. azonosítószámú szekvene-ájú. A. fend pentonproinek bármelyike vagy azok fragmentuma különböző célokra alkalmazható. Alkalmazhatjuk például; a fentiekben és a 2., 6,, 25., 30, és 35. azonosítószámú szekvenciákon alkalmazott aímnosavszámozáa szerint a pentos Nterminális és/vagy C-tentónalri vegéről körülbelül 58, l ÖÖ, 150 vagy 200 aminösav deiéciöt tartalmazó csoa•5 kitolt fragmentumokat. Alkalmazhatunk továbbá rövidebb belső,. C-termínális vagy bl-termhsális Sagmeattó «rókát. Ezen felöl, 3 pentonprofelní szakember szántára ismert módon; különböző célból módosíthatlakUgyancsak a találmány tárgyát képezi a FanS hexotsprotetó [3. aaouosltószámi szekvencia], Psső hexooprotem [7. azonosítószámú szekvencia], Fan? bexonprotein (11, azonosítószámú szekvetiela], SV1hexerpíotem pő a/onosuo-zatm. szekvencia], S'v 25-hexonpn te j, e7| azonosa, ss ama > ek\om sa] os ,ag\
SV39-hexonproteíti pő azonosítószámú szefo-mveía] aminosav-sitekvencíája, A fenti hesonpioícinek bármelyiké vagy azok iztótót fragmentuma különböző célokra alkalmazható. Aíkabnazbatjnk például a fentiekben ós a 3,, 1!2ő,, 31, és 36·, azonosItószámá azekvettoiákon alkalmazott nminosavszáinozás szerint a bexoa
N-tenmnális-és/vagy C-tórminális végéről körülbelül 50, 100, 150,200,308,400 vagy 500 amínosaV deléciót tartalmazó csonkított fragmentumokat. Alkslmazkatónk továbbá rövidebb belső, C-tertnináíis vagy A1.5 terminált hagmenmmokat. Alkalmazhatjuk: például a hexonprntém bmokrógíőjának ídoménjámk} Ö£l és FG1 elnevezésű fragmentumát, .vagy atmak hipervnriábilis régióját. Ilyen régiók például a majomeredetd Itexonprotein - a 3·., 11-, 26., 30. és 36. azonosítószámú szekveóclákbun alkalmazott Számozás szerint 'körülbelül 125-443,, körülbelül 138-441. mmosawlí átfedő fesgmeöíumok. vágy kisebb fragmentumok, ped.u a l5Mö> amnovavakat kömmel tó j Ι'Ό-Ι'Ά .uidnosttvakat: kotülbeíül a195-203. aminosavakat;
kőrüíbelbl a 233-264. ammosavakat; körülbelül 253-264. am'iaosavalmg körülbelül a 287-297. aimarssavakat, ék kőrülheíüs 484-4311, smisosávakat átfedő fragmentumok. Más alkalmas fragmentnm&k azonosítása szakember számára ismert. A bex<mproteio szakember számára Ismert liülönbőzó alkalmazási céloknak megfeleíőco módosítható. Mivel « bexorsproíem határozza meg az aáenovlms szerodpusát, ilyen mesterséges .hexonprötetflék beépítése természetben elő » forduló mesterséges szerotípusú adenovirasokat erebmé25 ny-ezne. Más mesterséges fomszldproteineket is előállíthatunk a 'csimpánz Ád-pentonszekvenciák és/vagy á találmány szerinti vagy azok ihtgmeammaisak alkalmazásával,
A találmány egv előnyös megvalósítási módja szerint, módosított hexonproteint tartalmazó adenovfrust állínmk elő a: találmány szerinti .hexmtprotein-saekvencfek alkalmazásával. Hexonproteinek módosítására alkalmazható eljárás ismertetései: találjuk például az 5 922.315 számú amenkai egyesült álla3Ő mokbeli szabadalmi leírásban, amely teljes terjedelmében a kltauüás részéi képezi, libben az eljárásban az •aáenovlrus hexoo legalább egy -burokrégióját másik adenovfrus-szerotipus legalább egy hurokrégiójáv&l helyettesítsük .V ilvejt modemen ader.os rms bestmpro-emtenek legaiabb egy hutokregnna tehat a takdirasty srerjuti, majomeredetü Ad-hexon-bifrokrégió (például Pat;7). A találmány egy előnyös megvalósítási utódja szerűn, a FasT-bexosiproíeio burokrégióját helyettesítjük más adenovirus-szsrotiptts megfelelő hurokrégiőjá35 vak A találmány egy további előnyős megvalósítási módja szerint, más adenovlrus-szeroitpus megfelelő hurokrégióját helyettesítjük a Pan7-hexoa hsrokrégtöjával. Megfelelő adettoviras-szerotipusok választhatók humán vagy nem humán szerodpussik közül,például: az ismertettek közül. A Pan?-hex«m csuk a szemléltetés kedvéért váistsztoífetk; a találmány szerinti egyéb simíán Ad-hexonproteínek hasonló módon módosíthatók, vagy alkalmazhatók más: Ad-ítexon módosítására, A btiálmány szeri mi megoldásnál a megfelelő szerotlpus kiválasztása nem korlátozó -tényező. A találmány szerinti hexonprotein-szekvenciák további alkalmazási
113462-6132/5(3
Fi 388578
19..
tehetőségei szakember számára nyilván valóak.
Szinten a t&iálmány tárgyát képezik a mláitnáuy szerinti símlan adenovirusok bberproteföjei. Az. ÁáPanő isberpröteteje a 4·,. azonosítószámú mímsav-mkvencíájü. Az AdPanő frberprotemjének amtnosavszekvene Iáját a 8. azonosítószámú szekvencián mutatjuk be. Az AdPan7 fiberproieírt antir-osav-szekvenclája a 12. azonostföszámú szekvencián látható. Az SV-1 két ftbe-proteiní tartalmaz; a fiber~2 atninosavszekvenciáját a 27. azönesitószámú szekvencia., a Sber-1 ammesav-szekvenciáját a 28, azonosítószámú szekvencia mutatja. Az SV-25 szántén két llberprotemnei rendelkezik; a fiber-2 a 32. azo«osité?száiuá anunosavszekvenciájó, a hber-1 a 33. azonosítószámú áttunosav-szekveneiájú. Az SV-39 fiberproteínjének. amhmsavszekvenciáját a 37. azonosítószámú szekvencia ·ηη1ηί;η.
A íiberproteín vagy annak izolált fragtnentutun különböző célokra alkalmazható. .Alkalmazhatjuk például a íibergöttthőoméai, amely a 4,, 8., 12.. 28.. 32., 33. és 37. azonosítószámú szekvenciák, körülbelül 247- 425. anünos&vaáí fediát, lásd 2,-ábra. Alkalmazhatjuk például a fentiekben és a 4., 3 12 ’s , V >1 és 37, azonosítószátnü szekvenciákon alkalmazott aminosav számozás szerint a úheeprofo;o \ ferwuli'· e·» v agy Cfermínális végéről körülbelül 50, 100, 150 vagy' 200 aminosav áeléeiöt tartalmazó csonkított frstgmenútmo15 kát, Alktüsnazhatenk továbbá belső fragmentumokat Ezen fölül;, a flberprotemí szakember számára ismert módon módosithafluk.
Szintén a fJabuty út mai kcpeztk a találmány szerinti proteinek legalább 8 anúnesav hosszúságú izolált fegmenmnun knánt ebeiben a!k.dm.;?lramsvk azonban más hosszúságú fragmentumokat is. Az említetteken telni, a tatóhnáriy tárgyul Sereik a PanS. Parte, Pun?, SV1, SV25 és vagy SV39 géniertnékek eloál2Ö htásának hatásfokát növelő es v agy exprcssztoiát fokozó módosítások, például fúziós molekulák előállítása, amelyekben a Pan5, Panő. Pan, SV1, SY25 es.·'vagy SV.39 géntennék egésze vagy fragmentuma . (közvetítettül vagy hnkeren keresztül) a hatásfoké· vagy expressziét fokozó fúziós partnerrel fuzionált. További előnyös módosítások példánk de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a kódoló régió (például protein vagy enzim) csc-nkiíúsa, hogy a pre- vagy pro-proteis hasításának szükségességét kiküssóbí. bek, es érett protein vagy enzúö keletkezését biztosítsuk: vagy a kódoló régió mutációja, hogy székretálőds gvmertnékei kapjunk. További módosítások szakember számára sstnertek. a találmány tárgyát képezik továbbá a. P;m5, Paaé, Patt?, SVl, SY25 sagv SY39 proteinekkel legalább körülbelül 95-99%-ban azonos proteinek.
A már ismertetettek szénát, a találmány szerinti sdenovirus-kapszidproteineket tartsáuiaző vektorok alkalmazása különösen előnyös olyan esetekben, amikor netitrallzóló ellenanyagok más Ad-szeroilpusok vagy más vírusvektorek alkaüna/asan alapuló vektorok hatását semlegesítenék, A találmány szerinti rAdvektorok kfrlöoösan előnyösen aikaln.n’haíők ismételt beadásra génterápiás alkalmazásra, vagy Itntntmváiasz megerősítésére (vakcinattter etreles<rfo.
Bizonyos körülmények mellűt, előnyös lehet a Pattá, Parte. Pan?, SVt, SV25 és/vagy SV39 gémerafök (például kapszldprotein vagy annak fmgmenmmai alkalmazása ellenanyagok termelódásének kivúhásá35 m. A. leírás szerinti értelemben „ellenanyagon valamely epüöphoz specifikus módon kőfödni képes immunglebukö-molekulát értünk. A találmány szerinti ellenanyagok tehát Pao5. Panó, Part?. SVi. SV25 és/vagy SV39 epitópokhöz kötődnek, előnyösen specifikus módon és heresztmakftvifás nélkül. A találmány szerint) ellenanyagok 'különböző formában létezhetnek, például, de anélkül, hogy Igényűnket a felsorcdfaktu korlátoznánk, nagy a&ntltású pobklonális dlenanyaeekkent, tnottoklonális ellenanyagokként, szintetikus ellen·
411 anyagokként, klméra ellenanyagokként, xekoohtnans ellenanyagokként vagy humanizált ellenanyagokként.
1134Ő2-ŐI32/8Ö: P1300578
-20Az ellenanyagok származhatnak IgG. IgM, IgA, JgDvagy IgE immumöobnim-oszraiyokbóí.
Ilyen ellenanyagokat a technika állása szerint ismert módon állíthatunk elő. ellenanyagokat elöállitha* tóik jól ismert hagyományos töchöítlógiákkat, például Kohlé? és Mtlsíetn által leírtak szerint, és az általuk ismertetett eljárás számos módosítót! változatának bármelyikével.
Hasonlóképp, magas titerü ellenanyag állítható elő az antigénekkel szentben kapott monokíonáífe vagv pobktondhv el lenen sagok .napntn ismert rekombtn.:ns technelegmh alkalmazásával (lásd példát?, a PCT/GBÍ85/Ö0392 szárad PCT közzétételi rratot: a GB2I88638A számú Angol szabadalmi bejelentést; Amit és mtsai.: Soion.ee 233, 747 (1986); Queen és mtsaí,: Proc. Natl. Acad. S;:í. (VSA) 86. 10 029 <1989); a PCT/WO9Q07S'51 ssármt PCT közzétételi iratot: Ríeehnxaan és tátsas.: Natúré 332, 323 (1988); Huse: és lö mis®.;: Science 24Óe 1275 (Í988a)j, További lehetőség szerint, az. ellenanyagokat előállíthatjuk a találmány szerinti antigén elleni állati vagy humán ellenanyagok komplementaritást meghatározó régióinak.(módosításával.· Lásd Mark és Padiin· „Humaiuzatión of Monoé lónál Anúbodies”. 4. fejezet, „The Elandbeok of Expertósentíd Pharmacology 113. The Phannacology of Monodonal Antibodtes, Springer-Veriag (1994); .Harfow és mtsaL; „(Jsing Anttbodies: Λ Lahoratory Manual·’, Coki Spriag I-larhor lahoratóry Press, NY (1940), Haríev. es mtsas. „A mtwdtes. Λ 1 aboratorv M,o«al( old Sprmg Harhor I aborstorv Press,
York (1989.8 Houston és ártsál.: Proc. Natl. Acad, Sci. fCSAí 85, 5879 (1988); valamint Búd és mtsai.: Science 242, 42? (;988). A találmány tárgyát képezik továbbá aatí-iörotípus ellenanyagok -CAbS) és anti-antisdiodpüs ellenanyagok (Ah3j:, Lásd például Wriendortf M. és misak: „Modubtioa of trati-írmiör immrmity by anti-ídiotypk aattbodsetT, „idioíypie NetWork and Diseases, szeri:.: Cerny J. és Hiemaux í...3, Am,.Sec.
Mí.crőbrol., Washington DC 203 {1990). Ezeket az anti-Mliotipus ellenarvapókat és auti-suti-idioíípus ellea.aayagokat: szakember szánjára istnerí eljárásokkal áhitiraíjuk elő. Az ellenanyagok kblSnböző célra alksb mazhsíoafc, például diagnosztikus és klinikai eljárásokban és készletekben.
Bizonyos körülmények ínelleti előttyös lehet, ha kimutatható jelölést vagy címkét adunk a l-’arri, Parté, Píts7, :SV1, SV2S ös/vsgy SV39 génlertnékhez, ellenanyaghoz vagy más tslábnáay szerinti konstrukcióhoz.
A leírás szerinti értelemben .kimutatható jelölésen olyast molekulái értünk, amely egymagában vagy másik molekulával kölcsön hatásba lépve képes kimutatható szignált generálni. Legelőnyösebben, a jelölés vizuábssn detekiálhaió, például fluoreszcencia alapján, például itranuniüsztokémiai analízisekben vagy immunlloaraszcföns mtkroszkópizáiáml. jelölésként alkalmazható például fluotesznela-izotioctanát (FíTC) pmAnna tPl 1 al'ophvc.xtunm ( \Pt) -onphoxphο P ív Fit) \,tgv ,tx v t>'\Uw\ -címűn-5 .30 vagy Tesas-Red (ECD). Az említeti fluoreszcens festékek a kereskedelemben hozzáférhetőek, és alkalmazásuk'a technika állása szerint Ismert. További jelölések például koiloidáhs arany. jelölésként: alkalraazhattihk még radioaktív vegyületeket vagy elemeket. Jelölésként alkalmazhatunk különböző enzlmswdszereket, amelyek koiorimetriás úton detektálható szignál keletkezéséhez vezetnek a vizsgálatban; a glükóz oxidáz például iíítsdy glukózként szwbsztrátót használ) termékként pervöidot szabadít fel, amely pernsidaz és hidrogéndo35 nor, péidávd terrníjíetil-hcn. tón ( MB j?ettetóbv' kék sztru o\.d«x 1 1\W <, ctkc/.-ehcz ,vzot ható továbbá tormaperojvidáz (HRP) vagy alkalikus íösztóáx (AB), és hexokináx glukéz-é-foszfáí dehíörogeaázzai együtt, amely ATP-vel, glükózzal és NAD*-d&l lép reakcióba, más termékek melled 340 nm hullámhosszon mért abszorbascla-emelkedés alapján kimotótható NADí'í keletkezéséhez vezetve,.
A íslálíaásy szerinti eliárlsokbtó alkalmazható további jelölőrendszsrek más módon detektálható,.
aTxaisrazhatuak példáid színes látéx mikrorészecskéket (öattgs Laboratories, Indiánál, amelyben enzimek
P130ÓS78
113402-0132 Sti ,21.
helyett beépített festéket alkalmazunk, hogy a eeiszekvenciákkal konjugáttmtof képezve, megfelelő tesztrendsserekben a komplex jelenlétére utaló, vizuális úton .detektálható szignált kapjunk.
Á jelölöaoy ag kí vánt molekulához történő kapcsolására vagy azzíti történő asszoc tálasára alkalmazható eljárások szakember szántára ismertek. Jekllöanyagot hozzákapcsolhatunk az alább Rnieneteti eijátások$ ísal „llnndboc-k ot‘ Flaoresceot probes and Research Chemicals”, 6. kiadás, szork.: Hanugland R.P.M., 1M<4« n «· Probcs, Inc . Lugene, OR! 1996); Píeree Catalog and Hasdbook, Life Science and Analyiical Research Products, Pierce Chemical Company, Rockford, II. (1994/1995), A. jelölöanygg kiválasztása és az összekapcsoló eljárás a találmány szerinti megoldás szempontjából netn koflátbzö tényező.
A találmány szerimi szekvenciák, proteinek és azok fragmentumai bármely alkalmas eljárással előállt) kihatok, -például rekombináns technológiákkal, kémia; sziutézis-teehnöíógiákkal, vagy más szintetikus eljárással. Megfelelő eljárások -szakember szamára jól Ismertek. Lásd például Sambrook és mtsai.: „Molecular Cloning; A Laboratory Mámul, Cold Spríng Harbor Press (Cold Spríng Jtefeor, NY). Peptktekei szintetizálhatetk szilárd fázisú szimézisseclmolőgiákkal [lásd például MemSekfc X A®. Chem. Soc, S5., 2M9 (1962); Stew&rt és Young: Solid Phuse Pepiidé Sythesís (freetnan, San Francisco) 27-62, oldat, (1969)).
IS Ezek, és egyéb hasonló eljárások szakember számára ismertek, és s találmány szerinti megoldás szempontjából nem kotlátozóak.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti Ad-szekvenóták könnyen adaptálhatok különböző Vitális és nem-vjtáhs vektorrendszerekhez terápiás és mnnonogeo molekulák bt vuro, ex vivő vagy i.u v?w szállítására. Például, a találmány egy előnyös megvaloxnás- módja szerint, a sióban Ad20 kapszidpröteint'kei és a leírásban ismer-etetí egyen simian adenovirns proteinokét: nem-vírálís protein alapú szállsíörend.szerekben alkalmazzak gének, proteinek és más diagnosztikus, terápiás és itrnmaog&i molekulák szállítására. A találmány egy előnyös tnegvslosi-ásl módja szerint, a taláimány szerinti proteint közvetlenöl vagy közvetett módon, a urast adenovlrus-receptort hordozó sejtekhez irányító molekulákhoz; kapcsoljuk..
Előnyösen, a- célhajuítató snoiekulaként sejtfelszíni receptor szántásra liganduíaot tartalmazó kapszidproteiat, például hexont, pemont, fíbert vagy azok fragmentumát választunk, .Azokat előnyösen a fenti ismertetett terápiás molekulák és azok géasennékehsek szállítására .alkalmazzuk, Kapcsoló régióként (Bakerként) lipideket, polyl.ys-li.kert és hasonlókat alkalmazhatunk, Ilyen célra aikatew&atjuk például a \un< u pe'ionosotent 4' műdet he. a ma «'meredem pe η\'»>ekve k>u d\0 naza-asu \led »<
K es munkatársat almi i&niertctettek s/esnt frtzsés proteint adnunk eső |Me<.hru kn-soc 1 k c\ merni
3ő tícne l'her KGO), ‘to UnO:); Medina K,mae I K, é» ursa·,, Genc liter. kiló). l~5? i,2(Xsi t\ λ ektorekat célzottan sejtfelszíni receptorokhoz irányiílnttustk a sirninn Ad íX-prntem amisúsav-szskvenelájának alkalmazásával is. a 2001 0047081 szántú amerikai egyesült álkíntokbcü szabadsbní leírásban ismertetettek szerint. A liganöum szerepét betöltheti f..'D4ö-antigóú, egy RGD- vagy polilizm-tsrtalmú szekvencia, és hasonlók, liyestt ős hastsíílő célokra alkaksaxhatattk egyéb skálán Ad-proteineket is, például hexottptúteiaí ósávagy
35- fífesáprotéiat.
A találmány szerinti egyéb adenovírus-protóaek: is alka-lnmhatők egymagában vagy más adenovírus-proteínekkel kombinálva szakember számára ismert kitlö&bözö célokra. A találmány szerinti adenovírus-ptoteíaek további alkalmazási lehetőségei szakember számára nyüvánvai ónk.
A találmány szerinti készítmények lehetnek például vektorok, amelyek képesek betérőkig molekulák
11)462-6132/SG
Pl 9)057 8 '77 cljuttatásáta .sejtekhez terápiás \agy vakemazási célból. Λ letrás szerinti értelemben vektoron genetikai elemet énünk, például., de anélkül, hogy igényünket a ieísoroítakra korlátoznánk, csupasz· DMS-t, fügét, rauszpozont, kozmidoí. ep-szomát, plazmidot vagy vírust. Ilyen vektorok Pan5, Panő. Pan7, SV1. SV25 és/vagy 5V30 simian adenovirasDNS-t és nőmgésí:wtalmazaak. A leírás szerintiértélemben„mintgénen&
választott betctolog ger. c» a gémeméi, ga/dasejrckcén történő tt.Í-!vf..f!O'a.ö trtm^/knpciófá’uk es sauv exprosszíójának: irásyiíásához szükséges irtás szabályozó elemek kombinációját értjük
Tipikusan, a találmány szerinti adenovírusvektort úgy tervezzük meg. hogy a minigóa a választott sdenovirusgén vöftaiko'zásábaő natív régióban egyéb adenovirus-szekveoctákat is tartalmazó nuktebsnvmolekulában legyen jeletr. Kívánt esetben, a minigént ioszertálhaijnk egy már létező génregioba úgy, hogy az
W: - adott régió működését megszakítjuk. Más-eljárás szerint, a minigént részlegesen vagy teljesen deistáit adfemtitu'.zet he vete'tts/crt.-bt k Xt'ni'.n >b -.vezeti e.e .lehet nulvt m.T-aréeletilt hl 'agy mAten, lisaa deletált E3 helyén. Λ leírás szerimi értelemben „funkcionálisan deletálf' kifejezésen azt értjük, hogy a géíifégíő elegendő mennyiségét távolltottuk el vagy károsítottuk más módon - például mutációval vagy módosítással - ahhoz, hogy az többé ne legyen képes a génexpresszió funkcionális termékeit eióáilítam. Kívánt esethet?, a teljes géstrégiót eltávolíthatjuk. Génmegszakt-ásra vagy deleíáiásra alkalmas helyeket a leírás már részeiben tárgyalunk.
R„\omom„ns \!ru->ok c„ul ita-uíd alku hús \eh.<' t etmho/*'d.u'k petóuu --rs, hoys a st'mg<. ?t az adenovírus genom S’-végére, 5’-végre, vagy annak tnind az 5’-. mind 3’:-végére tnszertáíjuk. Az adenovírus genom 5’-vége a hecsomágolödá.shoz es replíkáeióhoz szükséges 5“-cisz elemeket tartalmaz; azaz az .5’ in20- vertéit ismétlődő: egység (1TR) szekvenciákat (amelyek replikéciós origóként funkcionálnak), & natív 5’ becsomagoló donténí (amely a lineáris Ad-genom kapszidba történő csomagoiódásához Aktilözheísííes szekvenciákat és az El-promÓter enhanszer elemei? tartalmazza). Az adenovrrus genom 3‘-vége a beesotnagoióáashoz és: kapszidáal: történő kombinálódáshoz szükséges ?'-eisz elemeket tartalmaz (ezen belül az ITk.ekeí). Előnyösen, a rekombináns adenovírus 5’- és 3’ adenovírus cisz-elemeket, és az 5'- és .3' aderiovírus25 szekvenciák közt mírtigénr tartalmaz. A találmány szerinti adenovintsvektor további adenovírnsszekvenciákat is totalmazhat.
iElőayösen, a találmány szerinti adettovirusvektor egy vagy több, a találmány szerinti adenovírus génemből származó adenovírus elemet tartalmaz. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szeriül;, a vektorok Pau5, Fanő,.Faa7, SV1, SV25 vagy SV?9 adenovimsokbói származó ITR-szekvencíákat és ugyanazon adenovims-szerotípusből származó egyéb adenovims-szckvenciákat tartalmaznak. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a vektorok, az TfR-szekveaeiákai szolgáltató adenovírus-szerotípuslöl eltérd adenovii’us-szero-íp'.isból származó adenovírus-^zekvenciáka? tartalmaznák. Adsooviruspszeudotípasnak olyan adenovírust nevezünk, amely más adenovirns-szerotipusből származó kapszidproteint indaímaz, miaí attólyeus\.r<.l \»\το u CR vek-stxt^u \λγπ .tv u\ VHRivt te.-'t» s/viett'U\ kt\ t ts * i\.t v- a '.οΆηχ» tiu Intő ,?',ct> „ka·.un·- ,k s^esotsoixí tihln»' - ennts nicgeldiszempontjából nem korlátozó Az ATÜC {„American Type Culture Collection, Vitgitóa) gyűjteményében számos ademovirtsstörzs hozzáférhető, vagy ilyenek beszerezhetők kereskedelemből vagy tudonusiyos kutatást végző iníézetekböl. Ezen leiül, számos Ilyen törzs szekvenciája hozzáférhető különböző adatbázisokból, például á EuhMed és GenBank adatbázisából. Más majom vagy humán adenovintsokbói előállított homológ adenevírus-vektoj-ok leírása megtalálható a szakirodakunbaa [lásd például az; 5 240 846 számú amerikai
113462-6132/SG
Rí 300578 egyesült államokbeli szabadalmi leirástj. Számos adcnovirustipm. DNS-szekvenciája hozzáférhető a Genöank adatbázisáből, ilyenek például az A45 íGeítBanh nyilvántartási szám: No. M732601. Az adenovírusok-szekvenelák szátmazhatnak hámtely ismeri, szerosipusböl. például a 2., 3., 4., 7., 12. és 40. szerotipusokból, vagy bármely újabban nzíumsitott humán szerotipusból. A találmány szerinti vektor5 kónstreké sókban alkalmazhatunk nem humán állatok»} (például majmokat) fertőző adeoovirasokat is. Lásd például a 6 033 716 S2ámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást:, k a’i utam szc? ti sek <. tok elő dotawa lehn-ztdí ka .vxset utakat κοροι u ososa ,en, rs uyibeo azokra szükség van -, rekosnbináns vimsrészecskéket, és a konstrokciókbtta alkalmazott egyéb vektorkoriipoite.tt.seke; és .szekvenciákat a fetrásbau ismertetjük, és azokat a fentiekben leírtak szerint kaphatjuk
1Ő meg. A találmány szerinti Pan5. Pmtfe Pun”/ SVl, 8V25 és/vágy SV30 sírnia®. sdenovíms-szekveneiák DNSszokvetteiáiát alkalmazhatjuk sbcn svkterrendszerekben alkalmazható vektorok és sejívonaiak előállítására.
\ találmány s/u-nu %ekk-rokban alkalmazott ®uktemsuv-szekteneíaki>£tu módosításokat, például .szekvettcia-íieléciókííj., -inszerviókat és más mutációkat ismert molekuláris biológiai technológiákkal: hozhatunk leire, és azok szinten a találmány tárgykörébe tartoznak.
RK^dhitrigén’'
A transzgén kiválasztására, a ..mmlgén'' klónozására és · előállítására, valamint annak a vírus vektorba történő Inszeríálására alkalmazott eljárások a hihmltás alapján szakember számára ismertek.
.L'-Aííanszgén
A Unnszgén az azt határoló vektorszekvenetákboz képest betérőiéig, a kívánt pokpepíitfet, proteint, 21) vagy más terméket kódoló ntikieinsav-szetevaeíu. A aukleinsav kódoló szekvenciát funkoionális módon szabályozó elemekkel kapcsoljuk össze ágy, hogy azok lehetővé tegyék a transzgén áíírödásáí, transz lalódásáí és/vagy sxpresszálódását a gazdttsejíekbert.
A iranszgén-szekvencia összetétele ahol tagg. hogy a kapott vektort milyen célra kívánjuk: felhasználni. Transzgén-szekvencta lehet például riporterszekvencia, amelynek expressziója detektálható .szignál seiet25 kezeséhez vezet. Ilyen riporternek veneidk például, de anélkül, hogy idényünket a tel soroltakra korlátoznánk, a kővetkezők: β-laktamáz, β-galakiozidáz (LaeZ), atolikns foszlátáz, timidin kináz. zöld tluoressceas protein íGrP). ii varnu!-M. 5 aeud ai-ví. \P> hunéra' i'^mbjaaboz u'too prme uek pdui! í D'*
CD4, CDS, az influenza baemaggluumn protein:; és a íeehnika állása szerint ismert egyéb gének, .amelyekkel .szemben nagy affinitássá ellenanyagok állnak rendelkezésünkre vagy állíthatók elő szokásos eljikasokk.d;
3b vaiamiat membránhoz kötött proteineket anbgéncimke dotnénhoz, például bueutagglutisdnbdl vagy Mye-ből. származó ilyen dotnénhoz fezionáltau tartalmasé fúziós proteinek. Ezek a kodoló szekvenciák, expressztójukat irányító szabályozó elemekkel kapcsoltan, szokásos módon, például euzimatikus, radoiográfiás, kolortmetriás, fluoreszcens vagy más spektográflás eljárással; ftuoreszeess aktivált spjtosztályozóval, immunológiai djárúsokkal például enzimes itnmiinoszorijess vizsgálattal íriUSA), radioitntwr vizsgálattal: (RIA) vagy tmmuuhisziokémiat eljárásokkal detektálható szignálok keletkezéséhez vezetnek. Amennyiben például nwkerszekveaclaként i.aeZ-géat alkalmazunk, a szignált generálé vektor jelenlétét a béta-gakiktozidáz aktivitás alapiá®. ntötatlzafjak ki. Amennyiben a transzáén öFP vagy It-ciföráz, a szigttái keletkezéséhez vezető szekvenciát hordozó vektort vizuális úton, szloreakcíö, vagy fenyjeiet-ség alapján., luminométerrel ísamthstjtik ki,
4ó A ímttszgéo azonban előnyösért nem utazfcer szekvencia, utsiely biológiai vagy orvost jelentőségű ter113462-0132/80
1*1300578 méket, például proteineket, peptideket, RNS-t, enzimeket vagy katalitíte RNS-ekfct kódöl Előnyösen, az. RNS-moleknia tRNS, dsRNS, riboszomális RNS, katalitikus RNS vagy ssriszeasz RNS. A -találmány egy előnyős megvalósítási módja szerűit, az RNS-szekvencia a kezeit állatban egy célzott nukleiusav-szekveticta expresszsójáí kioltó szekvencia.
A transzgést alkalmazhatjuk leréptás célra, például genetikai deficíeneíáfc kezelésére, ípmorterápiára vagy tumor elleni, vakoiriíkásrí:, immunválasz ktváltására, és·'vagy profilaktikus vakcisázáara. A leírás szerinti értelemben iínntnővábsz kiváltásán a molekula (például genterraek) azon ftdajdnaságái érijük, hogy képes az adott molekulával szemben T-sejtes és/vagy humoréit?· tmmun\ul,u.,:í kiv.dkmi. Szintén a találmány tárgyát képezi több transzgén alkalmazása, például több alegtsvgoc’l fekpulo proteinnel kapcsolatos rendelkt10 ncsseg he!vreíli'tas.»a vae/mnmte.'.tre Bt/vrsv» kortsltnensek mellet·. különóőző trttnszganeket aíkulmaz hatunk, a ptoíein egyes alegységeinek vagy peptidjeinek l-ouolasarn. F-'kkot előnyős, ha a pröteinaiegységet kódoló DNS mérete nagy, például í tnmang lobul ínok, vétlemezke eredetű növekedést faktor, vagy dísztrofta protein-esetében. Ahhoz. hogy a sej? termelje a több alegységből álló proteint, azt a különböző alegységeket kódoló tekotnbtnáns vírussal fertőzzük. Más lehetőség szerint, a protein különböző alegységeit azonos íraxtszgért kódolhatja. Ebben az esetben, egyetlen transzgén hordozza az egyes alegységeket kódoló DN'Seket, és azok belső riboztm felismerő helyek Limát/ tyróom-me vn/ty s/W; IRES) által vannak elválasztva. Bz a megotdás előnyős, ha az egyes alegységeket kódoló DNS mérete kicsi, például az alegységet és ÍRES-1 kódoló DNS mérete összesen kisebb mint 5 kilobáris. íRES-szekvenciák helyet!, a DHS-eket 2Apeptklet kódoló szekvenciákkal is elválaszthatjuk egymástól, amely a transzlációt követően önmagát hasítja.
Lásd például Donnellv M.L. és mtsat.: .1. Qec Vhol. 78( 1). 13 (1997}-. FurlerS. és mtsai.: Geae-Ther. 8(111 8ö4 (200 1); Kiump H. és mtsat.: üetie Tber. S.tl 1). 811 <2001). Ez a zA-pepod lényegesen kisebb, mint az: IBl'S, amely aikalmazaxát különösen dotisöv.? teszi akkor, hu a tendeikezesre <dh> hely korlátozó leró ező
A választóit tr&oszgén bármely biológjadag aktív termékét vagy más terméket is kódolhat, például olyas terméket, amelynek tulajdonságait tanulmányozni kíyásjtjk.
Megfelelő trasszgenev kiválasztása szakember számára nem jelest gondot. A transzgés kiválasztása a találmány szerinti megclcxs 'erapotiíjáböl nem korlátozó faktor.
A mtnigén fent ismertetett fő komponensein félül, a vektor a trarsszgénuel funkcionálisan kapcsoltan szokásos szabályozó elemeket is tartalmaz, amelyek -jelenléte lehetővé teszi a irauszszén Wiszkripeiójáf,
3Ő transzlációját és/vagy «spresszióját a találmány szerinti oiazrttidvekíerral tmaszfcktáii vagy vírussal fertőzött sejtekben. Akkor mondjuk, hogy szekvenciák „fm-ikcionálisan kapcsoltak’''., ha'az·: expressziét szabályozó szekvenciák az adott génnel folyamatosak, vagy hatásukat transz. módos kifejtve, vagy bizonyos távolságból irányítják a kívánt gén espresszióját.
Expressziét szabályozó szekvenciák például megfelelő trauszkripelós kezdöszekvcocták, tertsűtáclös lalwk ,s >n, rA ,nh nvurvekOkiai η<Λ<.>ο lAs^si <,tk't k pc d u ov-z-a toda*-» és políadenileződési IpolyA) szignálok; a citoplazma RNS-t stabilizáló szignálok; transzláció hatékonyságát növelő szignálok (azaz Kozák konszenzus szekvenciák); a protein stabilitását fekozó szekvenciák; .valamint.Idváat esetben - a kódolt termék -ssékretálódásat· fokozó szignálok, Evprcssziól: szabályozó szekvenciák a technika állása szeritű nagy szán-tban Ismertek, például natív, koasiiiutiv, indukálható és/vagy sKővetspecifikös promőterek, és azok bármelyikét aikalmszhaijnk.
; i?.4í<.ísi?d sí;
P130Ö578
Ismeri konstitutív prumóterek pékiául, de anélkül, hogy igényünket a felsorol!tikra korlátoznánk, a zetrovíras eredetű Rous-»za£kpm vírus <RSY> LTR-promóter (adott esteiben KNS-enharíSzcrrel együtt), a citomegalövirus (C\l\) prctmőíer (adott esetben a CMV-enhanszerrd együtt) [lásd például Boshart és mtsal: Céh 41, 521 (1^85)), az SVAO-promőisr, a dihidrololát redukíáz prontóter, a 3-aktm promöter, a fosz&gheerel Idaáz < PGR1 promöter, és az EF 1 «-promöter Pnvítrogersj.
Indukálható promóterek alkalmazása lehetővé teszi a génexpressziö szabályozását exogén ütőn hozzáadott komponensek hozzáadásával; környezed faktorok, például hőmérséklet módosításával vagy sneghatározott fiziológiai sllapoiharg például akut fázis; a .sejt adott dilfötestet&lődásí Szisában; vagy csak teplikálődő sejtekben, indukálható promóterek és indukálható rendszerek a kereskedelemben különböző forrásokból fő hözzáferhétőek, például, de anélkül hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, az laviírogen, Clontech, és Ariad cégektől. Számos egyéb rendszer ismert, és alkalmazható szakember számára Isméd módon. Indukálható promóiereié péidási a cink által indukált hírka tuetaltóddoníne (híT) promöter és a dexamethason (Dex) által indukált egér emlőíamor vírus (MMTV) promoter. További indukálható rendszerek a Ϊ7 poliroeráz promóter rendszer (Lásd WO W18 088 száma nemzetközi közzétételi trat’j, az eedysoae rcvargrotrtoíer (No és anj Proc. Null Acad, Sci. (USA) 93, 3246 (1996); a tetraelklmnel represszáiható tends/vt [Gesv,'»es. mfeut. Ihoc. Aad, Vad Se- íl bA) Hí. *547 (1492), a R{rav’-kltnoel indukálható sendszer (Gossers: Science 2pl, 17ól (1995)1; valamint liarvey és mtsuí.: Cte. Opln. Cheot. Bioi. 2, 512 (199811 További ilyen rendszerek az kKSÖó-dúner, VP16 vagy pó5. amely castrodiol, dl. diphemd-murislerone alkalmazásán alapul, az Rüddö-índukálható rendszer [Warp és mísak; Ólat. Bíoteeh. fo. 239 (1997); valamint
Wsag és mísal: Gene The?. 4, 432 (1997)), és a rapamyem-mdukáílmtó rendszer [Magari és tntssk: .1, Cím, invsst, jTO, 2865 (1997)). Egyes indukálható promóterek hatékonysága az idő függvényében nő. Ilyen esetekben, a rendszer hatékonyságát fokozhatjuk, ha több represszori inszertálunk tandem elrendezésben, poklául TetR-szekvenciát IRkS-en keresztül TefR-szckveoeiához kapcsolva. További lehetőség szerint, legalább 3 napot várunk a kívánt funkció tesztelését megelőzően. A kívánt protein pxpresszíöját ismeri eljárásokkal fokozhatjuk a rendszer hatékonyságának növelésével például a Wnodehnek Hepatitis Virus poszttranszkripciós szabályozó elem (WRE) alkabnazásával
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a transzgén natív promóterét alkalmazzuk, A natív proraóte? alkalmazása előnyös, ha a transzgén expresszlőlának utánoznia kel! a natív gén evpresszióisí. A natív promótert alkalmazzuk, amennyiben a tmnszgét· expresszióját időbér; korlátozottan, foilödésí szakasszal összefüggésben, szövetspeelfíkas módon:,, vágy specifikus, transzkripciót Indukáló stimnlussai szabályozni kívánjuk. A találmány egy további előnyös megvalósítási utódja szerint, más natív expressziós szabályozó elemekei, például enhanszer elemeket, poüadenileződési szignálokat, vagy Kozák knrtszettzus szék véne iákat alkateazhateuk a natív expresszíó utánzására.
A találmány •egy előnyös: megvalósítási módja szerint, a temszgénf funkcionálisan szövetspecifikus promóterhez kapcsoljuk. Amennyiben: például a trsnszgém: vázizommm kívánjuk expresszákafns. izomban, akttv promotert alkalmazunk. Ilyen promóter például a várizom β-aktln, rninzm kőnnyölánc 2A, áistrophyB, v.otn krettim k utaz gének protuóterei, valamint a festészetben előforduló promótereknél nagyobb aktivitású •¥>ηη<.0\»ν >n. motort, k ,η,,ί 1 s ex 'm- t \.í Kfo,t.A >] íMo mccdíkus mm; όο, tsnrorsek peldutd mfeb.in sértette ..'\gro\/.t!;ci.u;r.5 btlhumm. Vusatakc cs umas 5 kitol jl 5 ; .M · t «om,
4ö bfepabbs B vírus ,gore” promőtep Sandig és misal.: Gene Tber,, 3, ΙΘ02 (I99ő); alfa fotoproteia ÍÁEP), t 13462-6132030
P1300573
26.
Ártmfhnot és nas&j.:: Hu®,.Geae Ther. 7, 1583 11996); csont oszseokalcm, Síéin és in-sas.: Mól. Bioi. Rep, 24, 1.85 (Í997£ csont szrsloka-lcin, Chett és sásai.: .1. Boné Miner Rés. PL 654 (I 996)]; limfocitáfcban történő exprcsszáltaíásra [CD2, Hassal és n-isai.: ,1. Immunoi. 161. 1063 (1998); immunglobulin uehésdáse; T-sejt ícv, rto nój tKun.no\ba’ le teno e\>ressz, katedra. oeídnal neu.ot-spe.jllku·? cnoltz A‘-ΊΑ otervur {Atídérses és mtsai.: Coll Mos. Nearobtol, Π- 5Ö3 (1993)]; neuroblamentum könttyóláue gén (Ficcioi; és mtsai.: Proc. NaÜ. Acad. Seb (USA.) §§, 5611 (1991)]; és a neuronspectSkus vgf-gén premótere (Piectoli és ini.s&i,: Neuron 15, 373 (19951).
Adott esetben, terápiás <élm alkalmazható vagy ámmmogén terméket kódoló tmaszgéat hordozó vektorok szelekiáilsztő marfeereket vagy riportergénekef is tartaímazteask, amelyek genetiein-, hygromieinlő - vagy purirnycin-rezisanenciát kódolírszekvenesákat foglalhatnak magukba». Ezek a szelektálható- rlportergénck\t>? mM unk (j exdeoxv',..·' - s oses.essxebc .-o ucohtes , x„cik>r o*t v 'ul nvt.
kőinek el', például .tr.tpxtli n-te.’ss/xoeta uiap-an jele/hcuk pia mm! icíenlotcf λ bal terű » sejtekben 3 vektor egyéb komponensként repükáclós origót tartalmazhat ilyen és -egyéb promőterek ás vektorelemek kiválasztása szakember azáinára nem jelent nehézséget, és ilyen szekvenciák rendelkezésre álbak Hasd pél15 -dául S&mbrook és rntsaí·. és abban idézeíí hivatkozások].
Ezeket a vektorokat a találmány szerinti eljárások és szekvenciák és .szakember számára ismert eljárások kombinációjának alkalmazásával állítjuk elő. Ilyen technológiák például a szokásos cDNS-klónozási eljárások, példán 1 Sambrook és rntsaí. kézikönyvében Ismertetett eljárások {„MoleenW Oomag,. A Laboratory Manual, t óid Spring Haj-bor Press, Coki SpHng Harbor, NY], az aóeoevírus genotnok átfedő
-oiigonnkleotid-szekveneiáinak alkalmazása. poltmetáz-láticreakoló, vagy bármely alkalmas eljárás, amely a kívánt nukleoúá-szekveneiát eredméityez.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a sámán adenovirus szekvenciákat tartalmazó plazraidot (vagy más vektort) alkalmazunk rskombmaji» adenovírss-részeeskék előállítására. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a reNomhtnans idenovb-asokból az: Bía- vagy Elb-génekeí funkcionál isan deletáhuk. adott esetben. azokKto muunokaí, példád hőmérséklet-szenzitív mutációkat vagy deléciókat is létrehozunk. Λ találrvm eg> Jovahtx e-nnvds megvalósítási módja szerint, az Eta és/vagv bih-j úrnők megtartása előnyős lehet: .a rekernbináns adcnevirusokhsn. Intakt .El -régió jelen lehet: annak eredem ijolvert az adenovíras geuombaa, vagy azt áthelyezhetjük a natív adcnovjrns genom, deistáit régiójába t például untuk hd-régiójába).
Gének humán (vagy más emlős) sejtekhez történő eljuttatására alkalmas simian adenovirus vektorok létrehozása során adenovírns nuklemsav-szekvenciák széles skáláját rdkalntazhatjuk & vektorokban. Például, az E3 elnevezésű adenovirus késleltetett korai gén egészét vagy részét delethlhasjuk a rekoHjbmáns vírus részét képező shniun aifenovirus-szekvenetábók A majomeredefü Ed-gétt a rokofiihroáus vlrnsrőszecske funkssóképessége és termelődése szempontjából lényegtelen, A stóart adenovirus vektorokat előállíthatunk ügyf is, hogy sz BA-géo. legalább ÖRFő-réglöjái delegáljuk, és eióoyösebbeu, s fésűi régió funkciójának reáusdurtcíájs miatt, a teljes Ed-régíőt deíetáljuk. A tsiálmány szerinti további vektor az £2a késleltetett korai génben hordoz deleuot (Mléciókaí a sisnisst sdeoovóus genom 1..1-1,5 késői génjeinek bármelyikében is létrehozhatunk. Hasonlóképp, a IX és ÍVa2 ístermodier géneket is deletálhaijuk hasonló célból. További deléciókat hozhatunk léire egyéb sts-nkturálss vagy sem strukturális adenovlntíigénekbe». A fenti deléciókat
113462-6I32/SG
P1300576 .alkalmazhatjuk kulön-külöu, ahol a találmány szerinti adeaovöus-S2«kvnacfe csak. egyetlen régióban tartalmaz detéeíőt, További lehetőség szerint, felles géneket deletálunk, vagy stzoksak a biológiát aktivitás ntsgszímtetésébez elegendő részeit doleíáljnk valamilyen kotsbiaációbart. A vektorban az arienovrins-szekvencta «felédét hordozhat például az E l-génekben, és az Ed-géttbéts; vagy az El*, E2a~ és Eö- génekben; vagy az
11- es l· - értékben, vtgv -m H-. L2a- es t4- periekben., az Ά ven deléctopu ü kmnbtnaUa \agv «.nélkül stb. A fentiekben már említettek szerint, ilyen deléeíók más mutációkkal, például hőntérséklet-szenzhív mutációkkal kombinálva is alkalmazhatók a kívánt eredmény elérésére.
Az esszenciális ítdettovirtis-szekvenoiákban (például Ela, Elb, E2a, E2b, E4 ORFő, 1,1, L2,13,Í..4 és 1,5) deiefctív adenoviriisvékt;>rok a vírus irdéktsvhásshcz és az üdenovtrus-részecskék szaporodásához szűkló séges hiányzó adenovírus-génmnnékek jelenlétében tenyészthetők. Ezeket a segítő (helper) funkciókai úgy ' sZölgáitátfaatjuk, hogy az adenovtnisvőklon egy vagy több helper konstrukció {például plaztmd vagy vírus) lelenié’v-beo ’vove'.zyuk, \ayy ,t -oka- s okokat Itatta a becsomagoló scjtsonal 1 a»d például ,t )6 13 5U~ .számú nemzetközi közzétételt iratban ismertetett, „mmisnális humán Ad-vektor ek<aihtására nlkalntazoít eljárásokat (közzététel napja; 1996, május 9.; amely teljes tcrjedelmélreoa kstanítas részét képezi).
Ϊ, Helper vírusok
Á mtnigént hordozó virusvektotok majom adwovtmsgéo-Jartahnátói függően, helper adenovírnsra vagy nem replikálóde vinisfragmentumra lehet szükség ahhoz, hogy elegendő majom adenovtrns génszekvencia legyen jelen a mhrigént tartalmazó snhíkbv- rekombmans virusrészecskék termelődéséhez, A helpoivhusok az adenc-rims-vektorkonsímkcióból hiányzó és-'vagy a vektorral mmszfökiált becsomagoló
21): sejtvonal által nem expresszált adenovirus-génszekveneíákaE tartalmaznak. A találmány egy előnyős megvaíosras nndju -,/οπκί. ,t reberv-rm tep,tk,scm~defk ers, ¢.-, a tetu. s/ckven<. uson Mm kalonbozo adcoovírusgéneket tartalmaz. Ilyen helperv húsokat előnyösen E4 cvpxesszahi ssejtvoualakkal kombinációban alkalmazunk,
Heípervírusok poli-kationos konjugátt-mohkeot is előállt-hatók például Wu és mtsas. által ismertetet25 tok ocíiw μ öol Öten 2o4, > io-m-r k) o Wtlson J M Emeltem I 2M 4óíl9«4)] A heipervhms adott esetben egy mástxbk riporter mimgéot is tartalmaz, A technika állása szerint szúmos ilyen riportergán ismert. A az adenovims vektoron jelenlévő transzgésttől eltérő riporterién jelenléte a helpervirnsbart lehetővé teszi, hogy az Ad-vektor és a heipervirus jelenlétét egymástól függetlenül kövessük:, A második riportérgént lehetővé teszi a rekosubütárts vírus és a heipervtrus elkülönítését a tisztítás során,
A fenti gének bármelyikében deíetáít rekombínáns sirnian adenovirusokok (Adj elöáihiáxÁra a áeletált géntógió funkcióját - amennyiben az a vírus rspiikációjához vagy rsíékttvitásához esszenciális - feelpervírus vagy sejtvorta! alkalmazásával, azaz kotnplen-erttálással vagy beesomágolö sejtvonal alkalmazásával a nskotnbishins vírus számára pótolnunk kell. Az esetek többségében, a kutasa El-proteiní expresszáló sejtw35 nakít alkahnazhaUmh eskn-pánz Ad-vektor írartszkoinplemeníáiására. Ez különösen előnyös, mivel - ügyelesnbe véve a találmány szerinti csimpánz Ad-szekveneiák és jelenleg rendelkezésre álló becsomagoló seltvonalakban alkalmazott humán Ad El-szekvenciák közti eltéréseket - a gyakorlatban elterjedt humán Eltartahnu --epe·, a.kJniu/avi .nép„k..dJ>ózza teohkn vkon-peAns adenot n J'-j'k kekNOxese; ,t tep.'kacto ¢-. vífusíerhtelödés során. Bizonyos esetekben azonban előnyős lehet az El-géntertnékeí expresszáló sejtwaal
4ö alkalmazása, példáid F1 -.Métáit sírnia» adettovtmsok előállítására. Ilyen sejívonaiak leírását találjak például
113462-6132/30
Pl 360573 a 6 983 715 szúrná amerikai egyesült állataokbeb gzabadater leírásban.
Kívánt esetben, a találmány szedeti szekvenciák alkalmazásával minimálisai: a Ea«5, Parsó, Pun?, SVI, SV'25 vagy SV39 adeaovkus El-néot adott szülői sejtvonalban futtkctonálís promóter szabályozása alatt expresszálö becsomagoló sejteket vagy sejt vonalakat állíthatunk elő. Erre a célra sudukálható vagy konstitutív $ promóteréket alkalmazhatunk, Ilyen nrootótemk részletes ismertetését találjuk a leírás más részesben·. Szülői sejtvoaslat választtmk a kívánt AdPartS, Paa6,?an7. SVI, SV25 vagy SV39 gént eapresszaló új sajtvosal előállítására, Például de anelkut, hoct tger.\ ónkét a felsoroltakra korlátoznánk, szülői sejtekk&n aikalnmzhaíunk Hol a . -UY(' turiumturUxt ft/an. No CO 2], A549 (A ICC nvtlvanuriáss szám. CCl 18ή\ ΠΓΚ2'0, KB (CCL 1 7j, Dcnou [példáid Detrmt 5ló, (VI Vi, és WI-38 [CCL 75] sejteket. Ezek a sejtvonaíak hozzáierhe19 tök az ATCC gyűjteményéből {America» Type Cukoré Collecaon, 10891 Usiversity Bonlevard, Msmassas, ' Virginia 20119-2209). Más alkalmas szülőt sekvonalak egyéb forrásokból szerezhetők be, ilyen, E1 -expresszálö sejtvonalak alkalmazhatók rekombhtáss, El -deleteiálí slntian anertoviíusvektorok előállításúm. Szintén a találmány tárgyát képezi egy vagy több sírnia» aíleuovúus géníertnéket, például Bla, EIb. E2a es.·· vagy JprtjRfő~gen;ermeket expresszáló sejtvonal, amely lényegében a rékombináns, siurian vdrus15 vektor esetébe» ismertetettek szerint állítható elő. Ilyen sejfvonalnk alkalmasak a lent: géntermékeket kódoló esszenciális génekben deieíáit ademOíusvektorok trauszkomplemestálására, vagy heíper-dependens vírusok (például aáeao-asszocíált. vírusok) becsomagolásához szükséges heiper funkciók szolgáltatására. A találmány szerint: gazdasejt előállítására például BNS-szekvenciák összeállítására alkalmas eljárásokat alkalmazunk. A szekvenciák összeállítását szokásos eljárásokkal végezhetjük. ilyen eljárások például a cDNS és genom:
29· DNS klónozása, amely technológia jól ismeri, és .melynek leírása megtalálható például Sambtóok és tntsai kézikönyvében t lásd feni); az adenovírtts genom átfedő oligomikteotíd-szekveneiájnak alkalmazása poiuneraz-lánereakciőval kombinálva; szimézrsteelmológiák; és bármely más, a kívánt nukleofld-szekvénciáí eredményező eljárás.
További lehetőség szerint, az esszenciális adenovirus-góutermékeí ín írons szolgáltatjuk adenovirusvektor vagy helpetvírns állal. Ebben az esetben, megfelelő gazdasejtet választhatunk bármely biológiai organizmusból, például prokarioia· (például bakteriális) sejteket, euknrioía sejteket, például rovat-sejteket, élesztösejteket vagy emlős sejteket. Gazdasejtekként különösért előnyösen emlős sejteket alkalmazunk például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, A549-, WEHÍ-, 3T3~, 1ŐT1 2-. BEK 2Ö3sejteket vagy PLRv o-sejteket (ameh usöbbiak funkcionális adertovlAts El-génterméket expussz álnak) (Fallaux FJ, és mx« Ham, Gene liter. 9, 1909 (1908)]; Saos-, C2C12-, E-sejteket, ΗΤΠ980-, HepG2~ es primer fíbrobiaszt so.rakat, vagy emlősökből például emberből majomból, egérből patkányból nyóiból vagy hörcsögből \, art:,vő bepatomta vagy myoblast sejteket.. A sejtek forrásául szolgáld emlős faj, vagy emlős cprk npt-sa púdéul khmbfesz; hepetov :t«. tu »'tx í \to r ialatnrmy szériát: megoldás szempontjából nem korlátozó.
feA'irusrészecs^^
Aimlánossaghan, n nbnigént tartalmazó vektor tmnsziékelévai történő bejuttatásakor a vektort körülbelül 5 p.g - 1ÖÖ pg DNS mennyiségben, eiöayősen körülbelül 1.9-59 ug 1>HS mennyiségben, adjuk körülbelül ixlO4 sejthez, körülbelül Is ÍÖ!í véghez, és eloraosebbers |;05 sejtta. A vektor-BNS és gazdasejt aránya azonban változtatható a választott vektor, a nukietnw be u'ta£a->,n: alkalmazott eljárás és a gazdasejt llgve49 lembe vételé \ e 1
1134Ő2-Ö 132/SÖ
F1590578
A vektor a technika állása szériát ismert, vagy a fentiekbes említett 'bármely -vektor lehet, ezen belül csupasz DfeS, ptazmid, fág, frauszpozon, kozmád, episzenta, vírus, stb, A vektort a gazdasejtekbe juttathatjuk bármely, a technika állása szormt ismert, vagy fentiekben említeti eljárással- például feanszfekctóvai, vagy fertőzéssel, Egy vagy több adenovíntsgéM stabil módon a gazdasejt genotnjaba építhetünk, stabil módon epíszotnakéni exprssszáitathaltmk, vagy tranziens módon expresszátiaíhsmnk Valtasentsyi géntetméket. tranziens módos sxpresszállaíhatjuk episzómáről, vagy stabilan íntegrálhaijtA; vagy eljárhatunk úgy, hogy a géntermékek egy részét stabil módon cspíesszáhatjuk, míg tnas részét tranziens módon e\í'rcssza.tatjak. Az egyes aáenovímsgéaek promóterebíént - egymástól függetlenül - választhatunk köosutuus psonxnerekei. Indukálható prejnoterekeí, vagy natív adenovirns proutótcrf. .A promdtett szabályozhatja az: organizmus vagy
10- sejt-meghatározott fiziológiás állapota (például differenciálódási lázss, vagy replikáeiŐ, vagy a. sejtek osztódása), vagy exogén forrásból származó faktor,
A molekulákat (például plazmidokat vagy vírusokat) szakember számára ismert módon, & leírásban ismertetettek 'szerint jiíttáthatjtik gazáasejtekhe. A találmány egy előnyös megvalósítási média szerint, szokásos íraasziekciős eljárásokat, például CaPO^tránszfekciót vagy efektroporádó; alkalmazunk.
A választott adenovirns DNS-szekvensiák, valamint a transzgén és egyéb vektorelemek összeállítását különböző köztes plaztnidokká, valamid a pkizmidok és vektorok összeépítését rekotnbináns vioasrészecskékké szokásos eljárásokkal végezzük. Ilyen eljárások példást szokásosan alkalmazón cDNS-kiónozó eljárások, például Satnbrook kézikönyvében ismertetetlek (lásd fent), az adenovtros genorttók átfedő oligonukk'Olid-szekveneiátnak alkalmazása. pohmcráz-iúncreakcio, és bármely egyeb, a kívánt nukkottű.20 szekvenciát eredményező eljárás, ismert transzfekctés es kotranszfelíí tos el; írásokat alkalmazhatunk, például CaPG<.-precápitáeiós teelMioiógíákat. További szokásosan alkalmazott cljátások például a virásgenomok homológ rekombinációján, agarlemezre östtött kigyagarSoan vírusplakkok ke-p;odésén. vagy szignálók keletkezésének mérésén, és hasonlókon alapulnak,
Például, a lovam mmtgenfurialmn \trmcku»· öiK/eJlíüi.-m kosetoer a sektomal η, iun; oeví-omagoló sej {vonalat transxtektólnsk a belperviras jelenlétében. A helper- és adenovirus-szekvencták közt homológ rekombináció megy végbe, ami lehetővé teszik, hogy a vektorba épített adenovtrus transzgén szekvenciák mplíkálódjanak, és vinoitkapszidokba escmagolódjansk. rokombináns vírusrészecskék kelctktwtét eredményezve. Ilyen vírusrészecskék előállítására transztéscíón alapuló eljárást aikalnniztunk. A takdtsnrty szerinti megoldás azonban-nem korlátozódik ilyen eljárások alkalmazására
3Ö A fenti módon kapott rekotnbináns. staiian adenovlrusok alkalmasak a választott tramssgért választott sejtekbe történő bejuttatására. A becsomagoló sejtekben szaporítod rekombináns vírusok alkáltnazásávsl végzett /η idvo kísérletekben, a találmány szerinti El-deistáit, rckombítuxK. sinnan adsnovirnsvektorok ab kahoasnak bizonyultak transzgéa nem-majom, előnyösen humán sejtekbe történő bejuttatására.
A találmány szerinti n kombináns, sinnan adenos írusveksorok alkalmasak m vitrö, <?.v vivő vagy ?« vivő géstranszierre humán betegekbe vagy nem hűmére beteg állatokba. Az -ismertetett rekombmáns adewvtrusvektotvk expressziős vektorokként is alkalmazhatóak a bcterolőg gén állal kódólt. fennek. i« vöm előállítására. Például, az El-dsiéció helyére inszeriált gént tartalmazó rckomhmáns adenovlrusok a fentiekben leírtak szerint 1.1 í-expresszálc .sejtvooalba tramszfektálhatók. Más eljárás szerint, repljkáeic-kompetens adeoovirttsokat alkalmazhatunk egyéb sejsvonalakban, .Ezután, a transzfektált sejteket szokásos módon te113462-6132/SG
Pl 39057$ ,3ö...
lehetove xxe. tx-gs a xtenbnáns adenovnusek - promotesro; oxptesvabak a ge»tern<.k<.í Lzs követően, a gérttennéktn 3 tenyésztő tápközegbői proteinizolálásra és tenyészetből történő izolálásra alkalmas ismert eljárásokkal ktnyetjak
A találotán\ szerinti bánó, Portó, Pari?, SVi, SV25 és/vagy SV39 eredetű retenbutáns, stmiaa 5 adenovkusvektorofc bafékonyan alkalmazhatók génífanssíerra, azaz kívánt tenszgéat hAtéko-nyart képesek ts vívó vagy ez vivő a választott g&záasejtekbe jtetó stég abban az esetben is, ha az organizmus neatraltzálá ellenanyagokattartalmaz egy vagy több AAV-szerottpas ellen. A találmány egs etosv.ős megvalósítási módja szerint, az- rAAV-részeeskékei és a- sejteket ex vivő ériütké£tóijek;: a fertőzött sejteket szokásos, módos tenyésztjük; és a transzáukált sejteket viwa-tobnááijtik a betegbe, ilyen kószítrsésyek különösen alkalmasak . 1-0- terápiás célra és immunizálásra, például prolektiv immunválasz kiváltására.
Tipikusabbmt, a kertetekben már ismertetettek szerint, a találmány szerinti Pan.5, bánó, Fen, SV1, SV35 és/vagy SV39 rekotubhiáas adenovinssvelttorotot terápiás vagy unmunogén molekulák bejuttatására stlkalntazzuk. Mindkét alkalmazás őseién nyíivimvslő. hogy a találmány szerinti rekombínáas aóenowra.S'vektorok alkalmazása ikttlőnőssn előnyős olyan beadási rendeknél, altot a rekombináns adenovírusveterek ismételt beadására van szükség. Ilyen beadási rendeknél tipikusait úgy jártaik el, hogy sorozatban több. megvaixvtatotí tiruskapszidot tertairoazó tirasvektori adunk be Λ <. jruskapszídot mmdegy;k beadás Jkalrax.ti. vagy bizonyos szeroíipusü kspszid tneghatározotl. száma (például egy. kőt, károm, négy vagy több ad.nio.nmsl végzett) beadását kővetően tnegváltöztafhatjnk. \ beadást rend szerint eljárbatek úgy, hogy egy élte) ntajoriteredeíri kapsztáof. hordozó r.Ad-t attak be. majd egy második ntajeméredefü kapszidot hordozó rAd-t adunk be. végül egy harmadik tnajotneredetö kapszídot hordozó rAd-t adunk be. MM beadási rendek, amelyekbe» a találmány szerinti Ad-kapszidokat alkalmazzuk egy inagukban, egymással.kombinálva, vagy órás szerotípusó kapssldokkal kombinálva, szakember számára «yüváövailőak, .Adott esetheti, a beadást rend szerint más nem humán ióentlös adenovlrasáhól, harnáo adenov&ushók vagy mesterséges Ad-szerodpusból származó kapszidoi hordozó rAD-t adunk be a már istnerteteílek szerint. A beadást rend minden egyes szaka25 sasban egyetlen Ad-szerotípus-kapszidot adunk be több injekcióval ívagy más beadási őt alkalmazásával), majd további sorozatot adunk' be egy snásik Ad-szerotípus alkalmazásával. A találmány egy további előnyös rnegvuiősttási módja szeriül, a találmány szerinti, rekombírtens Ad-vektorokat más, nem adenoviros által közvetíted szálhtórendszsrek, például más viráiis vektorrendszerek, nem víráíis szállítórendszerek, proteiítek, peptidsk vagy más biológiailag aktív motekidák alkalmazásán alapuló beadási rendben alkalmazzuk. A kő30 vetkező fejezetben a találmány szériád adenovírtísvektorok alkalmazásával bejuttatható molekulák ismertetésére összpontosítunk,
A.fetúgsmsnx^^
A találmány egy előnyős megvalósítási utódja szerint, a találmány szerinti: rekombináns vektorokat a szakirodalomból ismert géuterápiás eljárásúkkal adjuk be embernek. A transzgónt hordozó majom virusvek35 tori betegnek adjuk be, előnyösen biológiailag kompatibilis oldatban vagy gyógyászaiUag elfegadhatö hordozóanyagban szaszpendáíva. Hordozóanyagként alkalmazhatunk például steril fiziológiás sóoldatot. Erre a célra alkalmazhatunk szakember számára gyógyászatílag elfogadható hordozóanyagokként jól ismert egyéb vizes és nem vizes ízotóniás, steril injekciós oldatokat; vagy vizes és nem vizes, steril szusxpenziókai.
A találmány szerinti sitten. adenovímsvektorokat elegendő memtyiségben adjuk be ahhoz, hogy a
41) eélzott sejteket transzdnkáhák, és 3 kívánt terápiás hatás eléréshez megfelelő színtű: géníransziert és
1154ő2 -6 B2-SG
Pritevs sénexpresszlöt idézzenek dö kádas vagy gyógyászaidat elfogadbatötláa fiziológiás meliékhátások nélkül; az ilyen dózisok szakember számára ismert okidon meghatározhatók. Szokásos, gyógyászaíilag elfogadható beadási utak például, de anélkül, hegy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, $ következők; a készítmény közvetlenül a szivárványbártyárs történő juttatása és η,Ε mü'aekm.m'S Ntadast umk a kosz tmonv '«». nct er bejuttatása a májba; inhalálás; iotmnázáiás, intravénás, hrtamuszkniáris, úíirstheoAhs. sznbkntán, mtradermáiis, rectális, orális és más psretrtefells beadási utak, A különböző beadási utak kívánt esetben egymással kombinálhatok vagy mődösitfedők a irttnszgéonek vágy a körülményeknek tnegfelelöén. A beadás árja elsődlegese» & kezelendő állapottól függ,
A vfrusvektor beadandó mennyisége elsősorban a kezelendő állapottól, a beteg életkorától. testsúlyául tói és egészségi állapotától függ, és ennek megfelelően betegenként ehető lehet Peküaí. a vtnnvektot terápiásán hatásos dózisa humán vagy állatorvos} alkalmazásra tipikusan köriílbetm 1 a 10*'-1 \ R,!' virusrészeeske; körülbelül lxlöil-lx.l(íi:! vírasrészecske; vagy körülbelül Ixlö'vlxlö' vtrusrészeeske. A dózis függ az álhtóember mérőiétől, és. á beadás óljától. Például, imramuszkuláris úton történő beadás esetén, humán vagy állatorvosi alkalmazásra (körülbelül 80 kg testtömege állatnak/emhomok) előnyösen körülbelül IxKf’-SxlV^ virusreszecskét adunk be egy milliliter térfogatban, egyetlen helyte. Adott esetben, a készítményt több különböző helyre adjuk be. A találmány egy további előnyős megvalósítási módja szervit, oráhs úton történő beadás esetén, humán vagy állatorvosi alkalmazásra körülbelül IxlO^-ixíO'·’ virusrószecskét adunk be. Szakember a festi dózisokat módosíthatja a beadás útjának, és a rekombináns vektor terápsás vagy vakelnázáss célú alkalmazásának, megfelelőm. A trnirszgén expressziója - vagy imtnunogének esetében - a keringő ellenanyagök szintje követhető, és ennek alapján a beadások gyakorisága megállapítható;: A. beadás időzítésének és gyakoriságának meghatározása más módszerekkel szakember számára ismer·.
Előnyősén, a virnsvektomal együtt vagy annak beadását megelőzően vagy azt követően rövid hatású immumnodulátort is beadunk megfelelő mennyiségben. Itnmuttmodulaíorort olyat! szert értünk, amely képes a találmány szerintii rekombináns.vektor ellent nemrtdizáló ellenanyagok képződését gátolni, vagy a vektort
2S eiimináló cítolklkus T-kntibcbák (GTE) hatását gátolni. Az immuomoduláfor megakadályozhatja a T-heíper szühpopüláeiők (Tm vagy ϊ/ο) és Ö-sejtek közti kölcsönhatást, és ezáltal gátolhatja a nenfralizálő ellenanyagok képződését. .Más lehetőség szerint, az tmtmmmodulámr gátolhatja a Tus-sejtek és CTL-ek közu kölcsönhatást,.és ezzel gátolhatja & vektor GTE általi elintntái-loját. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható különböző immunmodulátorok és azok adagolásának leírása megtalálható például a kővetkező szakim3ö dalmi helyeken; Yaag és mtsai.: .1. Vitel. 2S1$)· (IV9őr, WO $6.12 406 számú nemzetközi közzétctca rml tkoz/óícü'l r.tp;s íyvf, tnap-s ? g ;>(. f US$0 030ts .»Zamú PCI kózzetotch jxat: amelyek telte». í-redelműkben a kitaaitás részét képezik,
A trsnszgén által kődoh terápiás termékek, lehetnek például hormonok, növekedési és dífeerenciálódá35 si faktorok, például, de anélkül, hogy igényűnket a felsoroltakra korlátoznánk, inzulin, gfekagön, uövekedósi iakíor <GH). paiathyroíd hormon (ΡΉ0, növekedési hormon releasing faktor (GRF), follíkulus stimuláló honnon (fSH). iuseinizáló hormon (LHí, humán choriögonadoíropm fh€G), vas/kukut» endothd növekedési faktor (VGEfh angiopoetinek, angsosztaün, gmaulocitó kolóniasthnuláló fekior (GCSF), eritropoetin (EPO), kötőszövet; növekedési faktor ICTGR. bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bf'GP), savas írbrohlasst nö40 vekedési faktor (aPGE). epidertnalis növekedési fater (EGE), transzfermálö növekedési faktor íTGE),
I 15462-6152/ÖG
Pl300578 vériemezke eredetű növekedési faktor (PDGFj, inzulin növekedési faktor 1 és fi {KII--1 és IGF-U); & transzformáló növekedési faktor föcsalád bármely tagja, például TCP, áktlvlBek, inhibinek; vagy a csont nsorfogé» proteinek (BMP) bármelyite, például BMP-1-15; a növekedési faktorok bereglauvncregluit· ARlAóiea differenciálódást faktor <NBF> családjának bármely tágját idegnövekedési faktor (NGFk az agyi eredetű neuroör-ph laklor (BDNF), a NTG és Kf-4'5 oeurotriphinek; a ciliáris neurotroph faktor (CNTF), gliasejlvonal eredetű neurotrcph faktor (GDNP); neurturin, agrin; a semaphorinok/collapsindt családjának bármely tagja, netrin-t, aeuitt-2, hepatpeba növekedési faktor (B.GF), ephrlnek, noggxn, “scmfe éedgoéog” (az agy fnptfogenezisét szabályozó protein) és timin hídroxiláz).
A transzgén termékei lehetnek továbbá az Immunrendszert szabályozó proteinek, például, de anélkül,
Ki hogy' igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, cbokinek és liatfekinek, például trombopoeiin (FPÖ), mtecícutunck ili 1. 11 -1-11-25 (például 11-2, II -4 1L 12 \.tg\ íl -Bt), meo»Cita kcín,>,ít:raMans ptotesrek. leukémia. inhibitor faktor, granulocita-makxcfág stimuláló faktor, Fas-ligaíídutn, íutapr nckrózis faktorok, ínterietepok, o?>cp fektetők, fk·? fet.hv„iTídnm A találmány szerinti eljárásban az immunrendszer által termeit géntermékeket is alkalmazhatunk. Ilyenek például, de anélkül, begy igényünket a felsorolt&kra. kotláid toznánk, a következők: IgG, IgM, IgA, l.gö és IgE, lóméra Ísnínunglobulinok, humanizált ehettanyagök, egvláneá. ellenanyagok, T-sejt-recepferak, .1, és II osztályú MHC-mofeksiák, géntechnológiai dton módosított. immunglobulinok és M HC-motekulsk. Géniennékekként exprosszáltafkatutsk kotupieteentszabályozó proteineket, például membrán kofafóor proteint (MFC),, <fccay .a<wfere»őtg’’ faktort (a Ό-feonvettóz alegységekre történő bontását gyorsító faktort) (iÖAF), CRl Cl ? vagy CD59 Faktort.
A u-anazgén által evpresszaít géntenuékek fehetnek továbbá a férni hormonok, növekedési faktorok, chokinek, iimfokinek, szabályozó proíeiuek és immsnrendszeri proteinek receptorai. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, Ilyen receptorok tehernek például koleszterin szabályozó proteinek receptorai, pékiául alacsony denzrtásu lipoprofeja(Lök) receptor, magas deazítású lipoproteír· (Bök.) receptor, nagyon alacsony denzrtású Hpoprotest (Vl.Dk) receptor, és a „scaveuger” receptor. A fraoxzgén géntermékei lehetnek a szteroiéS-hormon receptor íócsalád tagjai, például ginkokoriikoíd receptorok és ösztrogénreeeptorok. D-vitamin-receptorok és más rnagreeepttwk, Ezen felül, a génfermék lehetnek transzkripciós faktorok, például /h«. /»,$·. mar, woJ, vett m n'spuwe faktor (S'RS), AP-l, AF-2, nnfe, MyoD és rnyogeoio, ÉTS-box-tanalmú proteinek, TI 1-5, 1 21, VI1 „ M'F2, ÁTF3, ATF4, ZFS, NFAT. CRBB. ΗΝΓ-4. C EBP. SPI, CCAAT-bos kötdproteinek, interibron szabályozó faktor (1RF-1), Wüsts tumor protein, £TS-kötö30 protem, STAT, GATA-box kötoproícin, például GATA-3, és a szárnyas hélix proteinek villás uyii („feráóoife”} családja,
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a trasszegéa génterméke lehet k&rbatneil szintetáz 1, otmíin traaszkurfeamiláz,. arginosznkemát szintetáz, arginoszukeinát ház, argisáz, femarilaeeí&eetát bidfeláz, femfelánfe hidroláz- aife-1 antitripszín, glukóz-ó-feszfeláz, porfobillnogés dezatainás,
Vili. feksor, IX, faktor, cisztádon héta-szinteíáz, elágazó láncú ketoósav dekarhoxiláz, tübanils, ízovaretilCoA dehidrogenáz, propiouil-GoA karhoxiláz, rneftl-malonll-CoA rnutáz, glutaríf-CoA dehidrogsnáz, inzulin, béta-glnkuroaidáz, piruvát karboxiláí, bspatlkus foszlbriláz, Ibsztbriiáz kináz, glicits dskarboxiláz. Hprotein, T-protern, cfezíiktís fibrozis transzniembrán szabályozó (CFTR) szekvencia, és áisztrotm-cDNSszekvencia,
A már említetteket! felül, a gentermékek lehetnek természetben elő nem forduló polipepiídek, példátíl
113462-6132 SG
P1300578 termeszeiben elő nem tordnió amínosav-szekvenciájú, például inszcrciókat. deléciókat vagy amtnosavszubsztísúeiókat hordozó Rbncta vagy hibrid polipeptidek. Egyes nntnünkontprontittátt betegekben előnyős tehet például egyiáneú. géntechnológiai utón módosított immunglobulinok alkalmazása Ilyen,, tennészetben elő nem forduló génszokveneiák például vahoeh «.élmolekula túlzott mértékű ex.presszlójának visszaszoritá5 Sára alkalmazható antíszensz molekulákéi? katalitikus sokfeinssvsk, például ribozimok.
Valamely gén expresszlo-jának csökkentése és/vagy szabályozása különösen előnyős túlzód mértékben proltíeráiódö sejtek jelenlétével jellemzett, hlperprohteraiív állapotok, például pszoriázis kezelésére, A célzott polipeptidek kizárólag a oiperprolilémtsv sejtekben termelődő, vagy az Ilyen sejtekben a normális sejteknél nagyobb mennyiségbett termelődő polipeptidek lehetnek, A célzott antigének lehetnek onkogéttek, példáid ul« »nh. >«?<, h*«,. a..fcr/afá tramssokáciős gén, «s, sw, P5.3, ?m«, ok vagy F6FR által kódolt polipeptidek.
OokogemA áltál kódolt célzott antigéneken telni, anti-tumor terápia kags-tumorproíekuv kezdési rend célzott mutgénjei lehetnek B-sejtes lőnkámák által termett ellenanyagok varubün régiót Γ-sejtes limfömák Tsejt-reeeptorasaak variábilis régiói, amelyek - a találmány egyes előnyős fnegvalósitásl módjai szerint --autoimmun betegségek céiantigenjeikéot is szerepelhetnek.. A célzott polipeptidek egyéb tenoíusszociált
IS pobpeptidek is lehetnek, például tumorsejtekhen nagyobb mennyiségben előforduló polipeptidek, pékiául a
17-1A jelzésit morsoklonális ellenanyag által felismert poiipepbd, és folátkőtő polipeptidek.
Terápiás pohpeptídekként és proteinekként alkalmazhatunk autoimmun betegségekben szenvedő betegek és rendellenességek kezelésére alkalmazható polipeptideket, széleskörű protékHv itnnmnvu íozt indukálva az autoimmunitást előidéző célmolokniákkal, például sej-treeeptorókkal és: saját antigének ellen Irányuló ellenanyagokat termelő sejtekkel szemben, T-sejtek által közvetített autoimmun betegségek például rheumatoid artleuts«KA), solerozis tnukipiez IMS):, Sjogten szindróma, sarcoidösis, inzttlindependens d-sbeíes mellhús 0DPM), autoimmun thyrosdiűs, reaktív arthritis, spondylosis ankylopoetiea, seterodesrna, pölymiositis, dunttátotnyoshís, psoriasis, vaseulitísx Wegenor graaulöíúatosis, <bolm betegség és celitis uloerosa, A lenti betegségek mindegyikét az: autoimmun betegséggel kapcsolatos gyulladásos láncreakció kiváltásáért felelős, endogén antigénekhez kötődő T-sejt-receptorok (TÜR-ek) jelenléte jellemzi.
A táláknány szerinti sísáaa adenovkusvekforok tötönósea alkalmasak olyan terápiás eljárásokban történő alkalmazásra, ahol: transagénéket több alkalommal kivártunk bejuttatni adenovirnsvekíorok által, például ugyanazt a transzgént kívánjak bejuítátrá ismételten, vagy a itanszgém más transzgénnel együtt kívánjuk beadni kombinációban, Ilyen -beadási rendekben Imiuttatiratnnk P.m5, Faun, Ean7, SVI. SV25 vagy .10 SV39 símian adenovirnsvektori, majd issnételten, azonos szerotipnsö adenoutusvekíort Különösen eíönyősen, a találmány szerinti Pan5, Panő, Bán?, SVI, 8V25 vagy SV39 simiári aáénovlmsvektort adunk be, ahol az első alkalommal beadott: virusvekíor szsrotlpusa eltér az egy vagy több további alkalommal beadott virnsvektorárol. Előnyösen, a terápiás rend szerint beadhatunk például Fan5, Fané, Pat?7, SVI, SV2S vagy SV39 vektort, majd egy vagy több azonos vagy ekérő szerotipusú adenövintsvektort, A találmány egy tovább?.
ekm\ os megvalósítási módja szeréit, adenovirusvektort adunk he, majd az ismételt beadás során a találmány szerinti, az első alkalommal beadott adenovirusvektorétól eltérő szeroupasű P;u?S, iráoő, Fan?, SVs, SV25 vagy SV.39 vektort adunk be, és adott esetben, további beadásokat végzünk az előzőleg alkalmazottadenovirusvekiorral megegyezd, vagy előnyösen, jattól eltérő szerottpuső adenovlrusvekton d Λ beadás u-nd nem. korlátozódik a találmány szerinti írért/?, Fané, Fan7, SVI, SV25 és/vagy SV39 svmun adenosmus szerotipasok alkalmazásával létrehozott arieuevirusvektorok bejuttatására. A beadási rendekben aikalmazha113462-6132/SG
Pl 31)0578 ~34~ íoiik más adenovíros szerótipasok alkalmazssásul létrehozott vefetw^al is, példánk de anélkül, hegy igényünket a feisorohakm korlátoznánk, alkalmiatok más simian storó szerotipusokat (például Fan9, vagy C68, Cl. stb,}, más nem-humán főemlős adenovirus szerotipusokat vagy humán adenovíms: szerotipusokat a találmány szerinti P&nS, Paták Pan7, SVI, SV25 és/vagy .SV39 vektorok egyikével vagy azok közül tohbal komfetótva. Ilyea, majom, más nem komán főemlős vagy humán adenovirus szerotipusokat a leírás más fejezeteiben ismertetünk. A. lenti terápiás beadási rendekben, a találmány szerinti Pan5, Panb, Pan7, SV I, SV25 és/vagy SV39 adenovirusvektorokaf beadhatjuk más nem adenovírosok vektorokkal, nem vitális vektorokkal es/vagy különböző terápiás szerekkel vagy molekulákkal együtt; vagy azok beadását végezhetjük egymást követben (szekvenciálisán). A találmány szerinti megoldás nem korlátozódik a
- 1Ö: lenti terápiás beadási rendekre, hanem szakember számára más beadási rendoktis nyifeánvalöak.
A rekombináns, simian adsnevírusok immunogén készítményekben is alkaintazhaíők. A leírás szerinti értelemben, immtmogést készttoéayen emlősnek, előnyösen főemlősnek a transzgénnel bejuttatott terméket ériünk, amely immorális (például ellenanyag) választ vagy eelhrláris (például dtotoxikos T-sejtes) választ vált ki, A találmány tárgyát képezi rekonásmáns, símim; Ad, amely az adenovirus-szekvencia valamely részében létrehozott deléeió helyén a kívánt issmunogént kódoló gént tartalmaz, A simian adenovirus élő, rekombtnáns vlrttsvakcísakérsk más állatfajban történd alkalmazásra alkalmasabb, mint a barnáit eredetit ndertovtrnsok, de a találmány szerinti megoldás nem korlátozódik azok más fajban történd alkalmazására. A rekombtnáns adenovírusok alkalmazhatók profdakíikus vagy terápiás vakeisísként bármely patogénael szem26 ben, amelynek az Immunválasz kiváltása szempontjából kulcsfontosságú antigénjét (antigénjeit) azonosították, tmtelyiek) ellen irányuló immnttválasz; képes a pafogén terjedésének gátlására, és ameiynek/amelyuknek megfelelő eDNS rendelkezésre áll,
A vakcina (vagy immuBögén) készifafenyekei a fent ismertetett megfelelő hordozóanyagokban fórmulázzák, Általánosságban, az immursogén készítmény dózisa a fentiekben, a terápiás készítményekre megadott tartományban van, A választott gén mmmnogsmtáss követhető az esetleges megerősítő oltások szakságességeaefe magáilapításársi. Miután az ellsnmiyagtitert a szérumban megállapítottuk, kívánt esetben megerősítő immunizálást végezhetünk.
Adott esetben, a találmány szerinti vaks.iuakészhméayt más komponensekkel együtt ss fonstutózhatjuk, például adjuvánsokkah stabílizálöszerekkel, pH-beálittó szerekkel, tartósítószerekkel vagy hasonlókkal.
Ilyet; komponensek vakemszáxbaa jártas szakember számára jól Ismertek. Adjuvánskéní alkalmazhatók például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra koriátozstánk, liposzömák, alma, nsonofoszferii-tiptd-Á, biológiailag aktív faktorok, például cttokí®, ItUerieukiu, kemokln, ligstufumok, és adott esetben, azok kombinációi. A fenti, biológiailag aktív faktorok közül egyesek expresszálíaíhatók fe v/w, például pisznüdról vágy vlrttsvektorról. Ilyen adjuváns beadható például az efeö Immunizálás alkalmával, az antigént kódoló DNS35 vakcinával annak érdekében, hogy erősebb aníigénspeeihkus Immunválaszt váltsunk ki, mintha csak az; antigént kódoló DNS-vakcinát adtuk volna be egymagában.
A rekosubináns adesovlrusokal „Immaaogén mennyiségben adjuk he, azaz olyan mennyiségben, amely az alkalmazott beadási út mellett a kívánt sejtek hatékony' transzfekelóját és a választott génnek az immunválasz kiváltásához megfelelő szinti· expressziójáf biztosítja. Amennyiben ptotekttv immunválaszt
4Ö kívánunk. kiváltani, a rekomblnáns adenovhusok.at a fertőzést és/vagy rekttrrens betegséget megelőzni kepes
113462-6132/SG
Pl 3005 vakeraakoraponcnse leként slkalruazbatjok.
Ezen felül, vagy más megoldás szerint a találmány szerinti vektorok tanaímazhataak a választott ímmtmogénnei szemben immunválaszt kiváltó pepiidet pohpeptídct vagy proteint kódoló trsnszgéuí, Á találmány szerinti tekombináns adenovimsek várhatóan nagyon hatékonyak az raszertáh, a vektor által expresszi!t heterológ antigén protein elleni ctiolítlksís T-sejtek iadnkálasában és eíienanyag-tetmelődés kiváltásában.
Az trararatogén származhat például különböző viruscsaládokból. bíuuunvábsst ^válthatóak például a pícomavírus családba Wfoxó vírusok ellen, például a közönséges- nátha körülbelül 50%-árt felelés rhinovlntsok elten; enforovirusok, például polfovlrusok, coxackie- vírusok, echovirusok. és humán enterovtrusek-ellen, például a hepatitis A. vírus ellen;: aphíovárusofocilcn. ahtciyuk száj és körömfájást: okoznak elsősorban nem humán otgaaízmssefcb» A pfoomavfozs «saladba tartozó vírusok eétaatigénje lehet például a VPI. VP2,. VP3, VR- §§ VPG. További víruscsalád a eaheivirusok család, amely magúban foglalja a úinusnus gaslroenteriílsek kiváltásában betöltött szerepe rakat nagy jelentőségű Norwaik vírusokra. Hőmön vs nem humán. otganizrausokban mtmnovúiaszt kiválté celantígánek forrásául szolgálhat továbbá a
1:5 togsvirus csatád, amelybe az alghavfoasokra, essen beiül a Siudbis vírust, Ross Kiver vírust és· venezuelai keleti és nyugati lóencephatitis vírust soroljuk; a rubivirust ezen beiül rubeola vírust. A flsviviridae családba tartozik .a dengue vírus, sárgaláz város, japán escepfotiíds vírus, St. Lonís eneephálitis és kuilancsencephahtis vírus. Célaotigém előáll ‘Ihatunk továbbá Hepatitis C vírusból vagy a eoronavllros családba tartozó vírusokból, amely utóbbi szántó» nem humán vírust foglal magában. például a (baromnak) fertőző légesöhurut vírusát a sertések fertőző gastroenteritis vírusát (amely malacokban okoz betegséget), a sertések heroaggtótótá-iö coronavirus okozta agy- és geríncveíö-gyatisdását okozó yíru.st {msely -mabcekba® okoz betegséget), a macskák fertőző peritenltlsét okozó vírust (amely macskákat betegít meg), a macskák belgyuíladását okozó eoronavfrus (amely értelemszerűen szintén macskákat betegít meg)»· a kutyák eoronavírusút (amely kutyák megbetegedését okozza}, és a humán respirstorikus coronavirusoku’ (amelyek közönséges náthát és/vagy pon-A rson-B, son-c hepatitist okoznak), A eorouavirus csalásion bohd a. eéíantígén lehet az: B! (más néven M- vagy mátrixprotein), E2 (más néven S· vagy „Spxke” protein), B3 (más néven HE vagy hemagghiiinindterose) glikoproíein (amely uracs jelen minden coronavirusbani, vagy N ínukleokapszid). Az anrigéu származhat a rhííbdovirns estdádbói, amely magában foglalja, például & Vesicutovírusokat (például hólyagos szájgyulladás vírust} és a Lyssa vírusokat (ezen betűi a veszeuségvánst), A rhabóovírus család esetében, az aatl36 gén származitat például a G-proteínhől vagy bt-proíeínból. Az antigén forrása lehet a Lloviridae család, amely tartalmazza a haontorrhagias láz vírusokat, ezen beiül a Marbutg és Eboia vírusokat. A paramyxovíros családba soroljak. az 1. típu»u oantiufínenza vírust, 3. típusú paraísiluenza vírust, a szarvasmarha parainfím-nro -3 v Irusti a rubuíav-ru»í {mumpsz vírust), 2, típusú paraűtiíusnza vírust, 4, típusú parainfiuertza vírust, íSówesstto-betegsóg (barontizperaís) vírust, a keleti niaritsvéaz· („rindejposf) vírusát, a raorbtilivirusokat, amely kanyaró és kutyákra megbetegíto szopornyica vírust foglalja magában, valamint a pneumo vírust, amelyhez tartózik a respiratorikus színeié íutnkéözö vírus. Az in finenzavírást az ortitoírty.sóvír»sok csaladjába soroljuk, és az is antigének forrása lehet (például a K A-proíein, az NI -protein). A bunyávirtis család foglalja -magába a bunyavíras nemzetséget (kaliforniai eneephálitis, La Crosse), phlebovirus nemzetséget (Biti-völgyi láz), Hantavhss nemzetséget {a pnromalía egy hemahagút lázat okozó vírus), naiíOvtius nemzetséget (a juhok Nairobi betegségét okozó vírust), és különböző, külön elnevezés113462-Ó132/SÖ ? 130ÓÓ3Ü
..36-.
nélküli btmyavírusokat. Áz areuavíras: nemzetség -esetében antigén forrása lehet az 1.CM' és 'taása-láz vírus. .A reovínrsók csalánjába sorolják: a reov&w, rotavirus xienxzetségeket (amely utóbbiak gyermekek akut gastroeutexidsct okozzak}, o-rfeivírusokak. és ealtivirüsokat [kolerádéi fcutteesláz. Leborirbo (embereknél), tő escephalosis, „kék nyelv” betegség).
A refrovlrus családba sorok vírusok az oncovtnnae afcsaláá tagjai, amelybe humán és állatorvosi jelentőségű betegségek kórokozóit sorolják, például a macska tekétte vírust, HTLVÍ és HTLVíf vírust; a lésüívirus alesaiádct (amely tartalmazza a humán sntsuuáeScieueia vírust (HÍV), majom ntwenáeScieneia vírust (S1V), macska immundelkíencia vitte (FtV), a lovak fertőző kevésvérilségét okozó vírust); és a spumavirláae alcsaiádot..
Számos előnyösen alkalmazható íoiUivirusanügér^ismert és választható, ilyen HÍV™ és SíV-antigések például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a <«g, po/, 1-7,6 ip,r, 1759, tev, te, Ak/ós Aev-proteinck. valamint azok különböző fragmentumai. Az Env-proteln fragmentumaikén!.-alkalmazhatjuk, annak alegységeit például a gp 120, go 160. gp4 l-ategységeket vagy azok kisebb fragmentumait, például azok legalább körülbelül 8 ammos&v hosszúságú fragmentumai!. Hasonlóképp. válászfrtaíjnk s te-protein frag15 mentumsit (lásd például ez .5 591 994 vagy 6 19.3 98! szárnú amerikai egyesüli államokbeli szabadalmi leúásuka;' 1 a-o 15vg λ Ilik proteineket iBuroueh 1> H e» m;s<u 1 Ysrol tek 2462 (79u|)(, Amara
R.R. Sciextce 292. 69 (2001)), A -talátóny egy előnyös megvalósítási módja szerint, a HÍV és/vagy S1V í msnnnogén proteineket vagy pepttdekeí más temugogen proteinekkel alkotod fúziós proteinekként alkalmazzuk. Lásd például a \¥Q<H 547Í« teraú (közzététel napja: 200Ö1, augusztus 2.)· valamim a
WO 99.· ló 884 számú (közzététel napja: 1999, április 8.) nemzeiközi közzétételi iratokban ismertetett HÍV-1 7uí és/vagy A;,/ fúziós proteixtekét és immsasizálási rendeket. Λ találmány szerinti megoldás ama korlátozódik az. itt leírt HÍV és/vagy 'SÍV imm-mogen proteinek vagy peptidek alkalmazására. Szakember számára a. fenti proteinek számos lehetséges módosítása, ismert elvégezhető. Lásd például az 5 972 596 számúamerikai egyesült -államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módosított gag-proteint. Ezen. felük bármely kívánt.
H.ÍV és/vagy SIV immeaogéa bejuttteaío egymagában vagy kombinációbap,. Πνοή kombináció exprésszálteiha.tó egyelte, vektorról vagy több vektorról. Adott esetben, a kombisádiöba» egy vagy több expresszáitaiott húöünogént adunk be, ahol egy vagy több ünmnnogént protein formájában adunk be. Ilyen kombinációkat az alábbiakban részletesen ismertetünk..
A papova vírus családba soroljak a polyomavírus alcsaiádot tBKLl és JCU vírusokatí és a
-papi llonta vírus alcsaiádot (amelynek tagjai tumoros elváltozásokkal és p&pillöma malignus elfajulásával kapcsolatosak). Az adenendrusok családjába légúti betegségeket és/vagy enteritist okozó vírusokat sőrétek (EX, AD7, ARI), O.Bj. A parvovírus családba tartozó vírusok közűi megemlítjük a macska parvovímst (macska emeritlst okozó vírust), macska panleukopenia vírust, kutya parvovirust és sertés parviterusí. A hvpeyu'«x'k csabduiba tast-vn, az .dphabvo'o^suvtae atea.aú - ametvbe a l\rpc\ stm.'iev. vras t lísYI.
BSVíi) és varicella vírus tpseudorabxts·, s. ur, ellő costef) nemzetségeket soroljuk a betáfeerpesv&iaae atesalád - amelybe a cytomegslo vírus tl-lCMY, muromegalovírus} nemzetséget soroljuk -és & .gammahetpesvtrinae alcaalád -- amelybe a ílmpboemptovlrus és EB-V nemzetségeket (öurkítf Bmphema) tetőző rftinotrachettts vírust, a Marek-bvteg-wg vírusát, és .rbadisovfrnst soroljuk. A poxvírussok családjába tartozik a chordoposvírinae tested, amely sz otüropoxviros nemzetséget (varioia (feketehtmlö) veedhiá (tehénhimlő)!, paraposvints, avipoxvtrus, eaprlposvirns, leportpoxvíras, saipokvirus nemzetségeket, ős az
113462-6132/Sö
Pl390578 entortKspoxvirus afesaládot fegfaJja magában. A hspadnavirus család tartalmazza a Hepatitis B vírust. Egy még osztályozatlan, aatigénfört-ásként nikntoiazkatő vírus a hepatitis delta vírus. Az antigén szárnrazbat további virusokhók például a madár fertőző hurznbctcgség vírusból és a sertések légzőszerv! és repróduktiv szindróma vírusból. Az alphavirus csttiádha soroljuk: a lő arteriíts vírust és a különböze ébcephahits vírusé5 kát.
Szintén a találmány árgytif képetek humán vagy nem humán organizmusok humán és nem humán gerinceseket megfertőző patogéoek, például baktériumok, gombák, parazita mikroorganizmusok vagy más többsejtű paraziták elleni immunizálására alkalmazható, vagy rákos sejtekből vagy tumorsejtekbót származó isttínttítogének. ilyen bakteriális patogének például pttíegén Gmm-pozhtv ooccusok. például
IÖ pneutnoeoccnsok, staphyiococcusok és -streptocoecusok. Fa-egén Grain-negativ eoeem-ok például a tnenhigococcusok és gcnococcasok:· Fafogén ötara-negatív bactHúsok például az eatérobacleriaceae család tagjuk a psetuksu-ofínsok/aeinetobacter, erkeneila; a tnelioidosis kórokozója HA psearfofíífofo;), salnn nelluk, shígéllák, haernophtlusoL moraxdlák, «'. ducm- (a iágyiékéiy kórokozója), hrueeíhi, FrunntWE; udm, utis fa iularentia okozója), yersinia (pasmerellak Sw/yöbrt«Y/«s «ΚΜ/δ/ο» és spírilhtroek; Orats-pozlftv bac'illusok például a kővetkezők: Aáwrm mo«rxtwoge«e$, £n:«/?e7<«'Arir ráusío/wáKM», Cbfyseóímíwhw (dtphseria). 3 kokra kórokozója tt ti. «wáreeis (antrax), a donovanosis (granuloma inguinaie) kórokozója, és a btutonellosis kórokozója (BmoneHa sp.}, Eatogén anaerob baktériumok által okozott betegségek például a kővetkezők: fetauusz, boiutizntös, egyéb ctosíndiutnok attal okozott betegségek, fuöerculozts, lepra, más ntycobacierium által okozett betegségek, Fafogén spirochcrák rlfttl okezotr betegsé20 gek például a szifilisz, írepttsematozisek, ihnnboesia, pinta endémiás szifilisz és lepíoepue/t» Magasabb rendit patogén baktériumok t úgy patogeo gombák okozta egyéb fertőzések például az íunnomycosis, nocardiosis, eryptuceceos-is, blastoniveosis, histopiasmosis és coccidíomycosis, candidiasis, aspergillosis, ríucooorycosis, spcroiríehesto paraeoccidiomycosis, petrielididosis, torulopsis, myoetorna, ehromomyeosis es áermatöphytosts. iéiekettssa fertőzések például a tífusz, szikláshegységi foltos láz, Q-íóz, F ickeiisúthhniő.
Mycepkísruu es Chluntytici fertőzések például a „Vnopfosma p%ww>k«íc pnuumonu. a hropbocowntlonta vsueretnn, psütacoMS, es j permatáfo Jtiamydia-tmuVen'k. Palogén eukarioták például patogéo egysejtűek és férgek, és azok fond okozott fertőzések például az .tmobiasis, ttiaiárla, leishmaníssis, irypattesnmmiasis, toxoplasmoms,. .hwwusiÍ uró#. 1 néhány 1 oxoplasma. gondií, babestosis, giardissts, irichhiosis, fíiiariasls, schistoaonoatsb, fonalféreg fertőzések, métely fertőzések, horogférgesség; ss: gafendíéíeg (sxalag30 féreg t okozta fertőzések,
A .Centes Ιό- Djx-aáe Controi ÍCDC; „Depanrancnt of Health and Humán Services”, ÖSA) szerint, a fenti orgmn. πκι·»η m \ agy általuk termelt íoxinok közül több potenciális biológiai iégyverkéxtt is számításba jön. Ilyen luotogen ágensek például a következők: Sí«:7/;us nntiirí.'ois (antrax), Cfortfedíw őoífoőuíut és foxinja (boiúlizmuá), ffotviítfo pesti,·? (pestis), «mfo/u mo/or {feketehimő), F«}«cj$c//ő to/owit (toí&rerata)
35· és vírusos haemörtbagiás lázak jítlovirusok (például Eboia, Matburg), arenavirusok (például Hassa, Macbnpo)}, amelyek „A veszélyességi kategóriába sorolt organizmusok; Co.rfeő'n őuzziivfo íQ-láz}: .Brucella species (brucellózis!., #«r£áo/«fem? ntuö’ei (takonykor), Auz&áökfertu p.ruHdoraűífer (ínolíoidosi»), 3?fe«ms «unmuítfe és toxinia {ricta ioxta). C/oatiidóím per/Főígéms és toxinja (^saöon-toxis), Staphyfocíxtcns sp. és foxfojai (ettferotoxia S). OtfesWm psttiac; (ntadárittfittéttgá); a vízhlAonságot veszélyeztető ágensek (péi40 dán! itiö.dő fomővuv, Cnyítoporizfem jMrew), tíftiszos láz iAóAvtffoű rntwasfö), vírnseitcephalitisek
113462-6132/SG
FI 300578
-38j don< v nt'i'k njo nd „ K u<. i uü\ ktk ΐ < e Λνρ tó üss r-ag, ukctbAoh,·, t s meL.k}deufeg „B” veszélyességi kategóriába sorolt mikroorganizmusok; továbbá a Nippan. vírus és baniavirusofo amelyek· jelenleg ,,C' veszélyességi kategóriába -vvok ágensek. A jövőt» azonban további míkroofgmízmösofeat- azonosíthatnak és/vagy sorolhatnák a fenti kategóriákba, vagy tnár osztályozott mikroorganizmusokat sorolhatok más kategóriába. Nyilvánvaló, hogy a test ismertetett vhasvektorokat és más konstrukciókat alWmazh&tjuk a fenti mikroorganiwosoldtéi, vírusokból toxinjalkból és egyéb melléktermékeikből származó antigének bejuttatására abból a eálhől, hogy a festi biológiai ágensek okozta fertőzéseket vagy más káros reakciókat tnegelözzük és/yagy kezeljük,
T~sejtek variábilis régiói elleni íimmasgósek bejuttatása a ;alálnub<y szerinti vektorok alkalmazásával
CTL-sejtek közreműködésén alapuló itntrionválaszt vált ki, és elimlnáíja a fenti Ί -sejteket, RA-ban, a TCRek több specifikus, a betegség létrehozásában szerepei játszó variábilis régióját’ azonosították. Ilyen TCRrégiök például a V-3, Y-14. V-l? é\ Va~(7. A fenti pobpeptidek legalább egyikét kódoló nukteins&vszekvencia Muttat.?s.i tetut ceDettm, az RÁ kialakulásában szerepet játszó T-sojfek ellett irányuló iutmuttxáLmszí vau ki MS-ben, szinten a i'CR-ek főbb specifikus, a betegség iétehosásábea szerepet játszó variábi15 lis régióját sikerűit azonosítani, bzék: a TCR-régiők a V7 és Va-lÖ. A. fenn pfoipspddek legalább egyikét kódoló «ukfofosav-szekveneki bejuttatása tehát célzottan, az MS kialakulásában szerepet játszó I M?jk k ellen irányuló immunválaszt vált ki , Sclerodetmában, a TCR-ek több specifikus, a betegség létrehozdsshjn szerepe; játszó variábilis régióját azonosítottak. Ezek a ICR-ek a V-6. V-8. V-14 és Yo-16, Vtt-.IC, Vet··?. Va-ÍA, Vo-IS, Vos-lö, Vo-28 és V«-I2. A fenti polipeptidek legalább egyikét kódoló rekombináns simian adenovfeus bejuttatása tehát célzottan, sclercxlemia kialakulásában szerepet játszó T-sejtek ellen irányuló immunválaszt vált ki.
A választott gén terápiás színije, immfíoegemtáí'r'j*. < intje követhető annak megállapítására, hogy szükség -vau-e megerősítő oltásra. A CDS-e T-séjtes válasz, vágy adott esetben a szérum eliesattyagíiíer toeg~ határozását követően, megerősítő immunizálásra lehet szükség. A találmány szerinti rekombbaáns sírnia» sdeaovírusvekfort adott esetben beadhatjuk egyetlen adagolással, vagy különböző, kombinációs beadást rendek szerint, például más aktív hatóanyagok beadását is magában foglaló beadási vagy kezelési rend szerint, vagy első ímmtuózálásf és tnegerösiíö imnvamzáiásokat magában foglaló beadási rend szerint. A technika állása szerint számos ilyen beadási ti o w téri és slkalrnaz.hatő,
-Például, egy első inmtunizábs. e» megerősítő immunizálásokat magában foglaló beadási read szerint, először O'NS alapú vektort (például plazmldot) adunk be, hogy az immunrendszert indukáljuk, majd második, megerősítő ítmnnntzáiást végzünk szokásos antigénnél, például proteinnel vagy Ilyen antigént kódoló szekvenciát hordozó mkOKibiuáns vírussal. Lásd például a Wö 09 11149 számú nemzetközi közzétételt iratot; közzététel napja: 2099, március 2.; amely teljes iericdehnéhen a foLnuUs részét képezi. Az immunizálást végezhetjük ügy is, hogy a találmány szerinti rekonfotnáns, sitnlat? udenoususvektort adunk be, .hogy az antigén; hordozó vektormi (vírus vagy DNS alapú vektorral) szesnhen az innaunrondszer reakcióját megerősítsük, vagy protemt adunk be. .Bljáriiatank ügy is, hegy proteint, adunk be, maid az: antigént hordozó vektorral végzünk megerősítő immunizálást
A találmány egy előnyös megvalósítást média szerint, a találmány tárgyát képezi első irnmuutzáiást és megerősítő immunizálást magában foglaló beadási rend kiválasztott antigénnel szemben, melyben az autií 13462-Ö132/SG
P139Ö578
-39géot hordozó piazmid DNS-vckíort adunk be, majd megerősítő immunizálást végzünk a találmány szerinti rekombinsns, aimiástt- adenovírusvekzorral. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az első és taegerósM ímmanízálást magában foglaló beadási rrttd szerint rnukiproteínt expresszáltatunk az első és/vagy megerősítő isnmuolzslásra .ftkahnazort vektortól [lásd például Amám R.R.: Science 292. 69 (2001, április),
S ..tne.vben ruk-pvte.·} beadót tenort ηύertotok pÍöurA'gw^k e\ptss\i tat.rsu.a, „/u'tal HP· c-, hit ellepi immunválasz kiváltására, Az immunválasz índukátasára elsőként alkalmazott DNS-sel bejuttathatunk például öag. Föl. Yif. VPX. Ypr. (λ. Tat és/vagy Rév proteineket „egyetlen tríniszkriptumról. További lehetőség szerint, a SIV Gag, Fok és HÍV- Env-ssekvencíákns juttatjuk: be a íaláfaúmy szerinti rekomfeináns adextövtms-konstrokcioval. További ilyen beadás; rendek ismertetését találjuk például a Wö 99/16884 és \Yö 01 54 H ván'iU'uen:zcikoz· közzétételi iratokban
Az első és megerósitó immunizálást magában foglaló beadási rend alkalmazása nem korlátozódik HÍV ettem immunizálásra. vagy ilyen antigének bejuttatására. Az immunválaszt először indukálhatjuk például egy, a találmány szerinti első csimpánz vektorral, majd megerősítő immuaízálást végezhetőnk egy második csimpánz vektorra'·, vagy az antigént protein formájában tartalmazó készítménnyel. Az első és megerősítő
1.5 immunizálása magában foglaló beadási rend aikaimazásával projektív immunitást hozhatok létre az- antigén forrásául szolgáló vírusok, baktériumok vagy más organizmusok elleti. A. íaiáhsány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, az első és megerősítő Immunizálást magában foglaló beadási rend elkalmazása a kezelendő állapot kimutatására alkalmas szokásos eljárásokkal mérhető terápiás hatást hoz létre.
Az első immunizálásra alkalmazod készítményt különböző helyekre adhatjuk be dőzísfítggő módon;
az adott dózis ífcgg az antigéntől, amellyel szemben immunválaszt kívánunk kiváltani·. A találmány szerinti megoldás sem korlátozódik meghatározott dózisok, injektálási helyek vagy gyógyászatdag elfogaőhatö bordozőaayagfök s alkalmazására. Az eljárás első és/vagy megerősítő immunizálást foglal magában, amely lépesek állhatnak egyetlen dózis beadásából, vagy több dózis ótokéra, naponként, hetesként, havonként vagy évenként történő beadásából. Az emlősnek beadhatunk például egy vagy több, 10-50 dg plszmiidot hordozé25 anyagban tartalmazó dózist \ DNS-készitmérsy «lönyösen- 1-iö öOOyg: DNS-vekíori tartalmaz. .A DNS dózisa l testtömeg-kg-ra >?amitva tipikusan I ug és 1Ö0O pg közti, tartományba esik. A beadás helyét az emlős faja és állapota szerint választjuk meg.
Az antigénnek emlősbe történő beadására alkalmazott vektor dózisát az alábbiakban ismertetjük. A vektort úgy alakítjuk beadásra alkalmas formává. hogy gyógyászat;tag vagy fiziológiásán elfogadható hordozóanyagban, például izo-ó-úás. fiziológiás .sóoldatban szuszpendáljuk vagy oldjuk; izotóniás sóoldatok vágymás formulák szakember számára ismerték. A választandó hordozóanyag: szakember számára nyilvánvaló, és nagyrészt a beadás ódától ftigg, A találmány szerint! készítményeket beadhatjuk a fent ismertetett beadási utakon, a hatóanyag elnyújtott. félszabudvdását biztosító készítményben, biológiailag lebomlő, biekompatibriis polimerben, vagy azokat a célzott helyre juttathatjuk miceilák, gélek vagy hposzómák alknl' szánts el Votüvtbsn ;z 'Re n m r ,ahst vege./ k t >zy ne.rilck m. uv \<$.í ídjisu» or tó a leírásban említett adjuváast is adunk a készítményhez.
Llőnyősem a megerősítő immunizálásra alkalmazott készítményt körülbelül 2-27 héttel az első immuno· .dúst kővetően adjuk be az emlősnek. A megerősítő készítmény az első immunizálásra alkalmazott DNS40 vakcinával svjuttatott: antigént tartalmazza vagy képes bejuttatni hatékony mennyiségben, .A megerősítő
1134Ö2-6132/SÖ
P13ÖÖ528
-40 készütaérty tartalmazhat azonos vírusból száram© rekombináns vírusvektort {például a talátoásy szerinti adcísovíms-szekvencíákatk vagy más forrásból származó virusvektort. Tovább', lehetőség szerint, a „megerősítő készítmény” tartalmazhat a gazdaszervezetben immunválaszt indukáló első immunizálásra alkalmazón DNS-vákema álfái kódolt antigénnek megegyező antigént de protein vagy pepiid formájában. A találmány egy további előnyős megvalósítási mftdja szerint, a megerósnö készítmény antigént kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz armsk expresszióját emlős seitekben hnmíto szabályozó szekvenciák irányítása alatt, például jól ismert bakteriális vagy virasvekiorokat tartalmaz. Λ megemsitő készítménnyel szemben az elsődleges elvárás az, hogy &z alsó Immunizálást» alkalmazni! készítmény által kódolt, antigénnel megegyező, vagy azzal keresztróagáki amigént tartalmazzon,
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerint t simian adenoviruscektorokat k'th>no,i/{i mmnns/.,hi 'et.ipia, eiizrasokbah alkalmazzuk k lem; e'-arasckhan :t ttlahnonv szerinti smuaxt adenovirusvektorokat eltérő'szeretipusú kapszídot hordozó Ád-vektorokkal együtt, vagy azokhoz képest szekvenciálisán adjuk be; a találmány szerinti adeaoylnm&ktorofc&i osm-Ad-vekfórokkal együtt vagy azokhoz képest szekvenciálisán adjuk he; a találmány szerinti adeaovírusvektorokat proteinek15 kel, peptidekkel és/vagy más biológiailag előnyős terápiás vagy immunogéu készítményekkel együtt, vagy azokhoz képest szekvenciálisán adjuk be. Ilyen beadási rendek szakember számára nyilvánvalóak.
A csatol} példákban simian adenovirasok klónozását és a találmány szerinti rekombináns adenovínss-whtorok előállítás,!· i/emleitetpik. A csatok példák csupán u tJáhnany szerinti megoldás szemléltetését' ‘ < lg dnk anélkül ao inban logv 'gémünkét az Ismertetettekre korlátoznánk.
I. példa
ViwisStŐpSn.tóá
A PanS (ATCC nyilvántartási szára: YR-591], Pauó 1ATCC nyilvántartási szám:: VR-592j. Pasa? [AICC ntíhao'artast vüut YR-503] vucioku -vneRek ctedeükg vrnnpmtzvk nyirokcsomóból R-rtA izolálva 293-vejtekben |ATCC nyilvántartási szám: CRLIS731 szaporítottak. Tipikusan, a sejteket 10% fötáiis boíjúszérntnmai (FCS: Sígmaj es 1% pemcilimneVstreptoínycinxtel (Sígma) kicgcs/itett Dtábecco-féle módosított Fagle-tápközegben szaporítottuk (DMEM; Sigtna, St. Louts, MOj. A 243-veiteket 2% ECS-sel kiegészíted DM PM-tápközegben fertőztük az első 24 órán ár, majd FCS-t adtunk hozzájuk 10% végkoncentrációig. A fertőzőit sejteket akkor gyűjtöttük össze, amikor a vírus ált,·.' mdokák eüopátiás hatás (,zyí<?pö,duc p/nzr'; CPU) a sejtek 100%í-ábast megfigyelhető volt; ekkor, az összegyűjtött sejteket cemrifagálássa! kon30 centfáltuk. Az üícphcö sejteket 10 mmol/l Tris-py Sörben (ρΗ-Ά,Ο) szu^zpendáitak, és három fagyasztásolvasztás' ciklussal llzáltaftuk. A vsruskészihnéuyt eéztum-kiorid söriiséggradteasea. kert lépésben altraeentriíogálmk, raajö a víruskonesndátumot 10 mmol/l TrivlÖÖ ramol/lőO mmol/l NaCl/50% glicerin összetételű pyffer&ett l-5xfő!'rószecske/ml deszkásig hígítottuk, majd~?őaC-©n tároltuk,·
Egyéb netn-humán adenovlnis-szemüposek mporodásám vonatkozó issnemtomk alapján, a 29335 sejtekben a várakozást felülmúló ndénovúua- hozamot értünk el.
Vírus Hozam S virusrészeexkeTz t0'
PanS 8.8x10='
Patté i,6xlÓ:'!
Pan? ............yj-yy:
1134Ő2-Ő132/SG
Pl 300573
2. Példa
Az I. példában ívtosrtetéttek szerint kapott tisztított viruskésztaényhöi getsomi DN-S-i ízöláldrttk, ás azt Hindii! vagy Basafil restrikciós ertzitnekkel ettrésztetfük a gyártó utasításai szerint eljárva. Eredményeink szerint (amelyeket itt nem tüntettük fel) a találmány szerinti PartS-, Parté* es Part?-genom és a szaldrodalotnból ismert PanÓ-genom (C6S) eltérő restrikciós httsitási mintázatot ad. tehát ne® egyezitek meg egymással
Meghatároztuk a Pan5-, Pané- A AtM-geocm sgkieotíd-szekveacíájál. A Pan5 DNS felső szálának úttkleotíd-szekvertciájáí az 1. azosostlós/útot. vck\esei& adtuk meg, A Pátié DNS felső szálának nukleotidszekvenciáját az 5. azonositósz&nő szeksertctán adták meg. A Part? DNS felső szálának uukleotldlö ..^szekvenciáját a 9. azonosítószámú szekvencián adtuk meg.
\ ’.t’tis D\S f/ckventtak szabályzó é-s x-vlolé rcgnűt ismert adcnostrus-szck'. Vicákul -nutttott hontotógíajuk alapján azonosítottuk a fent ismertetett „Clustal kV” program alkalmazásával, szokásos: beállítások mellett. Az aáetxtvinis-szek-veneiákat lásd a lenti láblázatokbatt, A jtyitotí olvasási kereteket transzláltuk. és a következtetett amittosav-szekvettciákar kotábbaa leírt adeuovirus proteitt-szekvetsosákkal 15 Ad4, Ad5, Ad7, Ad 12 és Ad4Ö - hasonlítottuk össze.
A szekvenciák anab/tseseí a genom szerveződéséi humán adenovirusok szerveződéséhez hasonlónak találtuk, a legnagyobb foka ha\onlv»agot az Ad4 esetében mutattuk ki. A csimpánz adenovirusok és más ismert ttdertoArttxok. ezen belül az AáH«4 totem hipervariábihs régiói azonban jelentős eltéréseket ítmíabak. Bzéket az eltéréseket tükrözik a meg ügyelt szerológiai keresztreakciók is {lásd :rz alábbiakban.!,
2Ő A hexon-szekv ette iák egy részének ptuonkénti összerendezését mutatja az I. ábra. ,A bemutatott részlet totón kifelé megjelenített, a vírusból projetólódó O£l·· és Eö t-hurok?cgiő|ából származik, amelyek a legnagyobb fokú variabilitást mutatják a különböző s/erotipusok közt. Megfigyelhető egy, a hexon bázisának felépítéséhez hozzájáruló, a különböző szerottposok közt nagymértékben konzervált közbeiktatott rész is (az AiDCóS 308- nuk lese fiijainak megfelelő szekvencia; lásd <6083 716 számú amerikai egyesült államokbeli
2.5 szabadalmi lesre»!! Az atábfei táblázatban a hexonprotetnek ammosav-szekvenciáhmak náronkéoti szelvénőia-ósszereádezcsev ei Ag >ott adatainkat foglaltuk össze.
összehasonlított szekvenciák Hexonprotetnek aminosav-szckvenclajának hasonlósága (%)
71 O
AdC5 AdC7 99,0
AdC5 AdCőS 98,2
A.ÓC5 Ad€6 58 0
AdCS Add 84,9
AdCó Ad€7 87.7
AdCo AdC68 87,5
AdCó AdCl 84.9
AdC7 Adf.'óS 97,5
AdC7 AdCl 84,8
AdC68 AdCl 84,9
113462-6132/SG
Pl300578
A csimpánz adenoyírusok 'fibetgtoMótncnjanak {amely a reeepíerhoz történő kötődéséi felelős} struktúrája összességében hasonló-(2. ábra}. A huA»!5 es CoS F f-ptvtmütjének szekvencia-hasonlósága (lásd az alábbi táblázatokban) nagyjából megfelel & huAdő és PanS, Fsmó, Fait? szekvenciák közti hasonlóságnak.
< X^ehtiv. rlwrtt <- \\\ ικ uk 1 htíh) aminosas-s.tebcíiciák azonossága (%ϊ
ál 72
Ad,Ku5 AdC5 36,6
AdHu5 AdC6 28,5
AdHu5 AdC? 34,9
AdlltíS AsCO 35,6
AdKu5 . AdC! 35,6
eh AdC6 68,3
AáC5 AdC? 96,9
AdC5 AáO8 80,4
AdC5 AdCl 51,3
AdCő AdC? 69,3
AdCb AdC68 59,4
AdCó AdC 1 37.7
AdC7 AÖC6S 81,5
A«C7 Add 51,0
ArtCők Add 54,9
Szekvencia-azonosság humát τι AdS-szekvenexaval
Fib kis í -protein Elb nagy f-protein
C68 47.4% 55.3%
Pan5 n ->% 54,530
PattP 54 5%
Fan? fe 1 , 53,8%
Az AdC5, AdCő és AdC? .mpiikáciőttoflciens· változatait állítottak elő molekuláris klónozó eljárásokkal. az alábbi példákban ismertetettek szerint úgy, hogy mimgénkazettákat bíszertáhusk az Elé- és Elegének helyére. A mkomfemáns vírusok klánjait izoláltuk, és CsCl szedmsesrtáeíós ellátással 2.93-sejtekben lő szaporítottuk nagy mennyiségben történő tisztításra [Fiscíter K. és· mtsai.: I. Vlrol, 7ö, 520 (1996)]. .A. vektor hozamot 50 lemez alapján határoztuk meg (150-mm átmérőjű lemezek), amelyeken körülbelül 1 xlfE 293scitet fertőztünk, a megfelelő vírussal. A hozamot ágy határoztok meg, hogy spektrofotometriás- úton mértük a virttsréséeeské-konceaháetot Mattá» E l -deisták vektorokat hoztunk létre, megáílspítotttik, hogy BEK 293sejtefc (humán. adenevirus-S El-géut expresszáíö sejtek) hansz-kott^lementálj^ az új virusvektorok fel15 deléeiőit, és azokban magas tíísrü vtotskésztetény állítható elő. Néhány rekembináns vírus esetében kapott vízhozamokat: adtunk: meg az alábbi táblázatban.
A vektorok öausxgéstképt β-gaiaktozídáz (LazZ), zöld. fluoreszcens protein (GFF), .alfM-anttiripsztn (ÁÍAT), ebola gllköproteut (ebo), a ttawmerabrás eitopiazma doménf nem tartalmazó szolúhilis ebela gkkopröteín variáns (skbo) gént vagy az eboia. glfeprthem delécíós mutánsainak tEhc..V, kbo.-.V és EboM)
FI 3462-6132/SG F13ŐŐ57S ~
re-tek c gyeket iwess/jük . et (tcza i„\ <CMV or^nxer t.anv Cs,t atert V \öuikc/O uhu H bán „ND” jelentése az, hogy az adott vizsgálatot még: nem végeztük el
Tmwgén Vírasváz/vektorhozam (Virwészeeske sl,0ÍJ/
AdlluS AdC7 AdC68 AdC6
CMYtacZ u ............... 1.4.................. 3.3 6.1
CMVGFP 2,5 3.6 8 10
cmvaiat 3,7 6 lö ND
CMVEbo u 4,3 NI) ND
CMVsEbo 4,9 5,4 NI) NI)
CMV Fbo \2 1 9,3 NA ND
CMV EboA3 • OA 9.5 ND ...............
CMV EboA4 ' M 6,2 NI) NI)
A humán adenovirus-El-gén El-deletek csimpánz víntsokaí trausz-knu-rplenierttálö képessége elő· nyös, mivel lehetővé teszi a találmány szerinti E l-deletált esimpáöz adenovhasvektoriA. termeléséi, emelteit, a humán Ad és a találmány szerinti csimpánz adenpvlnís-sz^weneiák közti eltérések miatt. csökkenti vagy kiküszöböli a homológ rekombináció esélyét.
3. példa bzefoió&kn Gzs^L^
A bevon biperv&riabifis régiókban megfigyelhető eltérések mtak azt vártuk, hogy a C.5·, C6- és C7~ vírusok szerológiadag eltérnek, a htanan adenovirusoktol. ezen belül az AdMu~4-viiwól.
Vad-típusó vírusokkal mutatott eitenanyag-kereszireaktivítás meghatározására vizsgáltuk az ellenanyagok replikáoíé-korupeteas vírusok citopátlás hálását (C?B) gáttő képességéi Röviden, a vizsgálathoz
IS $xlQu résxeeske/tnl koneeotráci.óban tárolt adenovxrus-készianéayekot (AdhúS, PaaS, Panó, Patt? és AdCöS) áígitratuok 5 nőn aranyban Ve»: \alns.'k<ftuk ezt ,i kötKentractoi mén azt talalmk. rogy neutralvacm Ina nyában 43 órán beiül 100%-os citopátiás hálást eredményez. Mielőtt a vírusokat a 293-sejtekte. adtuk-volna i-A. 10* sej ο lyuk, vó-tynké lemezeken}, azokhoz 1:20 arányban hígított -széntmoi adtunk. A vizsgálatba» a CP1 kialakulását vagy annak hiányai értékeltük; teljes rteuiralizáeió esetén citopátiás hatás nem. abkuh ki.
2í) Eredményeinket az alábbi táblázatban összegeztük, Az a megfigyelés, hogy a 36 hantán szérumból 9 sétáralizálta az Adhu5 által Indukált CPE-t, összhangban van a fteutralizáló ellensmysgok előfordulásának, beesőit arányával a barnán populációban. A számok a neutrafizációt mutató egyének számát jelentik (számlálói az összes szűri egyen számává! szemben (nevezői, NI) jelentése: nem vizsgáltuk.
Neutrafizáciö V2Ö arányban hígított szérumokkal
Humán Rbesus Csimpánz:
(N-36) (N-52) .................i (34-20)
AdhuS 9 36 NT) NI)
Ad€Y>8 :36 0/52 :2.-20
Pan5 0 36 0/52 :0720
Panó .................0/3:6 “ 0 52 o ;<o
Pari 0(36 052 '2 20
1134Ó2-61.32/SG
01300578
-44A szűrt humán szérumok közöl 3Ó-feél .35 nt nestralizáltt; az Ad€6$ itatását, és· 36-ból egs setn ncortalízOta a FaaS, Paaó és Paaó eitopátiás hatását. Az 52. vizsgáit rhesss szérumból egy -sem scunaluúlta a csimpánz adesofemsokatt a rhesus majmot előszeretettel alkalmazzák pse-kMkai tntxíellkéttt HlV-vakutük. tesztelésére. A 20 csimpánzból 9-12 széruma mutatod jelentős- mértékű 'neaíralizátó hatást egy vagy több csimpánz adeöövlrussal szemben, annak megfelelőén, hogy azok valóim endémiás osímpW'.peviítktts patotenek. Érdekes módon, néhány csimpánz széruma csak a PartS, Psnb vagy AdCéS vírusok elleti tártálmázott rteutr&hzáló ellenanyagokat, alátámasztva azt ;t feltevést, hogy ezek a csimpánz adsaovírusvektorok nem: keteszíueutraHzáljak egy mást, és különböző szerodpttsokat képviselnek,
Ugyanezt a vizsgálatot végeztük el 2ö csimpánz széruxnmint&v&l A minták fele (5ö%-a) reagált szero' lö- lögiatlag. bár különböző mértékben, a PaRO-vírnsokktti, 4Ö%-a a Fané, 55%-a a Pan7, és 6ö*á-a a CoSvirusokkal. A pozitív szénumnínták közöl egy tartalmazóit erősen neotralizáló hatású ellenanyagokat mind: a négy csimpánz vírussal szemben.
Λ különböző szerotípusok közti kere^zt-neutraltzáció pontosabb meghatározásúra magas tíssrít 15 poliklonáhs ellenanyag-készítmény eket állítottunk elő a sttnian adenov&wk. elles. Azok elöállításérs nyálakat immunizáltunk intmmuszkuiártsan. a Cftk csimpánz adenovirtisokkál végzett korábbi kísérletek alapján ádjuvánském GFP-t hordozó tekomhináns vírusokkal. A szérumok neotralfeálö aktivitását teszteltük a három, találmány szerinti csimpánz adenovirussal - AdCS. AdC6 és AdC7 - szemben. A nyulakal testtötnegki íogrsnnnonként ífeiO1* C68CMVGFP virusrészecskével injektáltuk tnlramuszkulánsan, maid 5 hét múlva,
2ö azonos dózis alkalmazásával megerősítő Immunizálásban részesítettük. A kilétté héttel később levett vér vizsgálata azt mutatta, az igen hatékony tteutraltzáló aktivitású C68-, yalamiatPáa-5- és Pss-7-vírusók ellen, de nem nentraiizáló Pau-ó-virussas szemben (lásd az alábbi táblázatöt}, apu arra. utal, hogy egy €68 (vagy Pan5 vagy Pan-7; alapú vakcina hatékony immunizálást biztosíthat fem-ő alapú vektort alkalmazva megerősítő immunizálásra. Megfigyeltük azonban, hogy a vírusok közti fenti mértékű hasonlóság nem szükségsze25 Afen akadályozza .* mt, x 5 be tda <«h n ^ovníc okvtt uc> ke u \ tnt -e -^e-, e cnatv.ct tes xn<hn> magas, mint a festi Idsérleíben a nyuíakban kiváltott ellenanvagszint. Az alábbi táblázatban v jelentése 55% CPE, v-v jelentése 66% CPE; és ---4- jelentése 100% CPE.
113462-6132/SG
01300578 .45-
293 sejtek R'rto?ece \ trassal: j
iOaO PsnAC-eS) i C-:tó 1 .. , 1 1 bzenwn- GFP 1 hígítás ....... . ~........
- /-:-4 i j : S j 'ü- j 1
V'
- - - j 1/60
- <r- 1/160 .........j
i- - 1/320 |
f-'íí* - , 1/640 j X ........................... §
» Λ'··“· XV 1/1,250
*· - , 02360
A V 25220
•:fv ^-Λγ.χ<.: V. 1/01,240
4- Ϊ < < > A “ 40- --: * : 1/20280 ........
Ή- vteO.te í y “ ....... WW3
'„>6 : ϊ *y τ 4 :·'Γ 281,020
.¾ , ,t. . * 4'-^?j4*' 4-6 12 03,840
Λ.-ter. .> -¾ ; 4-(-4- 2327389 ’
y rT — ·4-4·$χ 1/605,300
100 • - f - H-4 444 bl 3KV2Ö 1
:000 6 ❖ ' * v \ te—. 4-64- 444 5 leCLOO i
fi 3462-6132/8G
R3ÜÖS78 „46
Az eredményeket neutraíizáló ellenanyagok kán-utalására szolgáié kvantitatív vizsgálatul' erősítettük meg, amely GEF-vekfor íiuoszdukclőíán alapult, Rövides, €57BL/ó-egereksi immuaizáitunk intranruszkalúfisa» vagy intravénása®. $,őkiöl!' részoeske/mi Bánd, Fané, Pás? vagy C68 készítménnyel. Huszonnyolc (2S) nappal később levett szérumokat kuresztneutrabzáló aktivitásra teszteltünk CnkCMVÉGbF-vírussal szemben 1/20 és 1 ''80 hígításban. Összefoglalva, amikor gyógyászati célra előállított humán immunglobulin készítmóoyt teszteltünk Fanő. Parté, Pan7 vagy C68 vírussal szemben mutatott szerológiai reakcióssá. alacsony szintű neumíizáló aktivitást tapasztaltunk a. Fan? és C68 vírusok esetében. Ugyanebben a vizsgálatban 36 humán szérumot is teszieítünk, A szérumm imákat 1/20 hlghásfean vizsgáltuk. Eredményeink szerint, csak egy egsen szerűm* tanalmazotf nytham uióau ncutrrbzúlo ukítvu *\u cllenant acekaf <ek-vírussal szemhon \crn mutat un». bt uomr ibzelo a»tn, s W a Fa t* . F,*no \ ay - Fan , t usokl ,ei vonnher
Vizsgáltuk ,t Fan.5. Fanm Patt? és C68 simjan adenovírusokkal szemben etóuihíott, magas túorű pöhklonáiis ellenanyagok sírnia» adenovmusokát keresztneutráiizálé hatását,
Nyuíakat immunizáltunk 10’?' csimpánz adenovíntsrészecske iniranntszkuláns beadásával, és megerősítő immunizálást végeztünk 41) nappal később, azonos dóz;$ alkalmazásával, insompíett Ereuno-adpivánssal. A szérumokat neutrahzáió ellenanyagok jelenlétére analizáltuk oly módon, hogy azokból telező sorozathígítást készítettünk, és a megfeleld, öFP-t espresszáló csimpánz aáenovirus vektort líF genom kópiában tartalmazó szuszpettziőval fertőzött 293-sejtekes GPP-expmssziőt sznpresszálé hatásra teszteltük, Á GPF20 express/tot 6t>%.ban gadó hatású szénumíucífás? tekintetűik az adott rítust netttrah/áió ellenünyagtnernek,
Eret&nényeinkei az .rabbi táblázatban adtuk meg. Adataink jő e^vemst mutatnak a hes.on amáiösavszekvenciák széksor >u műi zise alapján várt eredményekkel, mely - sntt az Ad Fan-6 a szerológiaiiag várhatóan leginkább eiíerő a többi csimpánz sdenovírustól.
293-sejtek fertőzése 10' gettomkópiával
λ\ uuxh nysfA 1 Ad Fádvb Ad főtö-4 AdFun-7 Aő ök$
szérum immu•ife.álva a kő- §
vetkezőkkel: 1
Ad Pvofe 1 10120 <V20 02500 1/2500
Ad Faa-ét ] \c ót ilizáctó 1 rv'kul 1/20,« <1/20 <1/80
ifem? lasóo i > 1 öv^S4'U 1/256Ö
C68 5 1 Neutralízái ctó nélkül <1/20 1/3120
Aniták maghateíOzására, hogy a sírnia® adeno vírusokkal keresztreagáló ellenanyagok pívvaiendája várhatóan alacsony-e a humán populációban, az SVÍ, SV39 és SV2.5 sírnia® adenovintsokai arra nézve teszi 13 h'2 -í'i '2 SG
FI 390578
-47íelíítk, hogy kereskedelemben hozzáférhető kevert Immáo IstnMiagiöbu&nal (lg) isknbáiva képesek-e a neutrailzáló hatásnak ellenállni Ugyanezt a vizsgálatot: elvégeztük az· Adhttő vírussal és a FasrS, Fané és Fati7, valamim CŐ8 csimpánz sdeoovirusokkal. Egy további kísérletben, a C5, €Ö, C? és; C68 csimpánz adenoviFíssokkaí immunizált egerek szérumát teszteltük az SV-15, SV-23, SA-1? és Saboo»· majom adeaovfrasokat seresztsetrírabzálő képességre, Egyik esetben sem tapasztaltunk keresztÍteutraitzáeíóf.
Móiiosuott p\ pl r/midot állítottunk elő úgy, hogy a pX (Clontech} báz-génrégmiábatr helyspeciftkas mutagenezissei megszüntettük az Fspl-helyet. Az így kapod módosítóit plaztníd, pX', 3900: bp cirkuláris
1.9 -· plazmád,'átufefy fi replikúeiós ongót (őri) és ítíupicillin-rezísztenciagént tartalmaz t AmpR-cds).
A. A Fartő adenovír·,tsplszmid előállításit ., y A pX'-plazrrndban pociinkért hoztunk létre a Fartő DNS-fragmeatutn szekvenciális klónozására. .A poiilínkerrel a már meglevő pX'-poHlinkert beiyeítesitcttük a plaznnd Λ/ΖηΛ és EcojRf-enzitnekkei történő emésztését követően, A FanS [tompa vég - Z-áe/j fragmentumát a poldinkcr Sw«/- és ftcí-helyei közé inszertáimk. Fz a fragmentum az ade no vírusgénem 5'-végét -artaltnazta (az 1. azonosítószámú szekvencia szermti 1-3606- bázispárokat). A Pa«5 ,S'ao.ö'í-Fsp/· fragmenmniát iaz 1, azonosítószámú szekvencia szerinti 455-3484, bázisokat) a pShníde (Cloatech) egy rövid, és /X-ó'ce-helyek által határolt szekvenciájával helyedesitettük, bogy az adeuovírusgenom Fl-régioját elimináguk. Λ P&o5 [Xcn/fé - tompa végű] írágnúmtimtáí (az 1, azonosítószámú szekvencia szerinti 28 658-36 462. bázlspárokat) a poldútker XcoX/-£coXía helyei közé inszertálmk íltogy az. adeaovirusgeoom 3’-végéi: a konstrukcióhoz adjuk); az /Χο/-Λ?7«/fragmentumot (az 1, azonosítószámú ssekvenciu szermti 3696-15135. házaspárokat) a potilinkeíbe iííszertáimk, és az á/ím\keoXAfragmentutnot (az t azonosítószámú szekvencia szermti 15 I 35-28 658, búzispárokat) szintén a poblmkerbe inszertálmk. .Adott esetben, kívánt trasszgént inszettálnuk az újonnan léttéhözott-pX’PatúABl-vekhM· /-·€>«£ és FX&ei-helyeíre.
A kiindulási pX plazmidoí a p.AdX-adenovírüs-píaztnidból (Cíomeeh) állitotíuk elő a fent ismertetettek szerint. Ezután, a pX' F;mre-Ako/-réglóját delenbuk, és a tompa végűvé alak íseb Fanö-poiilinksrí a é'spé-belyre m>.zermlíuk. így kaptuk a pXTl.hiK-pht/núdot t29ö4 bp) a. Fartő S -vég-FsoJ-régióját (az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-3607. bázispátokari a pX'LNK ómmfeXrrd-helysire tnszertálltik, így kaptuk a p.X’Fanő-5’.ptaztnióot (659; bp) A pXFae.5-5' SnaBi-AricZ-régiójáí kivágtuk, és a pRCSu'.ornőtől Ft R vp s\d (.<,<\v ktcutt,, Kiset es renuk j‘.Ή'Rúdon Lpu· p\P t· * ti píaznúdot (4374 bp). Röviden, az AÓéué és ./X-Öée/ ritka hasítási helyeket tartalmazó szekvenciát FCRtechaológiával muplifikálfetk a pRSC-plaznúdról (5113 hp). A 3’ FCR-láneinditó Ndel-heiy hozzáadását eredményezte & PCR-imtékhez.
A pX'Paoő-ő'Ahl -plaztaidhan (4374 bp) a Pdnó-D.NS-i ágy hosszabbítottuk meg, hogy almoz a Fanő
Fkg/-Aóá,'/-régló|ár (az 1. itzonosúőszénná szekvencia szerinti 3697-13 135. bázispárokat) adtuk, bogy tuegkaoíu-sapX ián'' ' \bu-pkvmtdot tlő‘Wbp! A fenő-s/,^servta re-nomnado ','ίαί V-veget <,uí 1 azonosítószámú. szekvencia szerinti 15 155-36 462, bázíspárokat) a vektor polilmker M«A£cöRF~he!yei közé inszeríáítuk; így kaptuk á pXTanSAFl-plazmidot. amely az El-régióban deieíáit, teljes hosszúságú Psoő49 szekvenciát tartalmaz.
113462-6I32/SG
81309378
-48A pX’PanSAEl-plazÍUÍóből rékomOínáns ádénovírasókát' ágy álíítöttnok elő, hogy a phzrrúdet Elpoli'peptsdet cxpresszátó helperrel együtt ho-hamzfektáltuk, vagy El-exprssszáié becsomagoló sej romaiba, például 293-sejtekbe, vagy a 'leírásban ismertetettek szerint előállító» ssyt vonalba Irauszfeklákuk. Az: El es-presszlója a becsomagoló sejtvoaaiban lehetővé teszi a ParsóAEl «pltáctóját és vlrtótteapsztóba csomag»iéítósár, A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a pXTsuSAEl-transzfektóh csomagoló síteket a fent ismertetett, temszgéxst hordozó adesovfasvektörrál trsmszfetóljak, A helpervirus és plazmíd közt' homológ rekomhmámó jön létté, arat lehetővé teszi, hogy a vektorban található ádetiovírús-transzgén székvencia-repíikálődjon, virionkapsztdba esoniagolódjoo, és ily módon rckombmáns adenovlrusok jöjjenek létre.
A transztékciét követően lagvagart retegezitek agarlemezere, 2 hétig állni hagyjak vlntspíakkokat gyűjtünk, a vírusokat feíszaporirjuk, és a tnmszgéo expressztöjára szűrjük. Ezután, a piahktisztításí többszőr j savié ul , uustotn·, e*Ai! tvivifi k \<gt a e^zcgvu 1 urusvXtn \ ^vot K-a tűnk,. és a kívánt transzgént tartalmazó rekombteáns, csimpánz adcnovirust CsCbgradíetssben végzett süröséggradiens tdlracentrífegálással tisztítjuk, \asy szakember számat,t ismeri más módon tisztítjuk,
5. példa
RekSKtómfeEMdgO
A. Panó-viAist prcnái! és profelnáz-X-kezeléssnl, majd fenolcxtrakciévai protemmentesitettük. A vírus28 ÖNS-héz szintetikus 12 hp ZWÁlinkereket ligáiíank Berliner és Sharp által leírtak szerint (Nucieie Actds Research 11,6003 -1985)]. Ezután, a virus-DNS-t Xbal-cnzímmei emésztettük, hogy abból 5'-fragmentumot izoláljunk (6043 bp}. Az Adó Xbal S'-fragmsntnmot pX-píazmídba Ügáltuk a 5'/w.</-2.'bö/ helyek közé, így kaptuk a pX-AdEau6-8-18.5-plazmídot. A /WZ-lifikereksel eilá-ost yuus-DNS-í Poci-enzimmel emésztettük, hogy abból a 6475 bp 3'4ennínálís fragmentumot ízoií'lljuli, és a p\ i-INK Pacl-Smal-hplyeire klónoz25 zuk; a festi módon kaptok' a pX-AdPaoó-82-1 öü-plazmsdot.
,-Xz El-régió ddeíálésára (ns.u. 1,3-9} a pX~AdPanb~82-108-plazoriá £á?'MXYW4ragwnte«rát a in.u.9-l,7-tragmestumut átfedő, &w8'.»- es AW-enzmekkel kezeit PCR-fmgmentammttl helyettesítettük. így kaptuk a pX-Ad-Panő te.ü.8-l,9~}ó.5-plazt!«dv-t.
3:..5ő.éslEfthgmgtttínuók.elóáihtám,Js.aMgépáé jBttóllEhagtnammujnsgcr;á|ására.aíkaiínasA;jpElőször, a pX-Ad-Pattó m.o.ö-í-9-ló 5 5A-klóm bosszabbitottuk meg- égy, hogy a Partó-geaom 2, 3'őo/'--iragm:etííusuát (4350 bp, 16,5-28} a pX-Ad-Panó uí.u.0--Í,Q--i6,5.A7?cd'--:heiyére :inszeríálíuk. Ezt a konstrukciót pX-Ad-Panó mii.ö-l,9-28-p;azm>d«ak uevez-uk.
Másodszor, a .V-klóot ís meghosszabbítottuk oly «tódon, hogy a Panó-geoo® í«.u,4í-82szekvenciáját átfedő 15 826 bp ..VóíéPöcZ-lragtRentamot. a pXAdPaitó-82-108 .;W‘fe/?2k;íAbetyére mszerláituk.
um a s ->p Púm tt mmí/n u /daluk a pX-Ad-Panő smu.ö-1,9-28plazmtdból, és a pXAdPanó~41-IGÖ-piazttúdba inszertál tűk a KimOH és tosnpa végűvé alakítóit AívrZ-helyek
Κολ Irt .r 5' t s 'cS\cn, i,ik,u ogs itaoí hutáim,s/o tu.oos którí :A VtPano o !,- 1° 5 o4-tv'4 ktornak
V134Ó2-6132/SG
Pl300578
..42 aeveztük.
z\ Pan6 ϊ§ 335 bp Hindííí-fragtseKtexái (tn,u, 19.5-64) pXMEaski-O-l ,9-19,5,64-190 Hindííl-helyém íaszertáltok, így kaptuk a oXAdFanő-ö-IT-lOO-plazmidoi,
A.RKGFEszgieMíyjjigrkerbeil^ rekosnbínrias tmnszíontoínsok zöld/íehér snegielenés ősapján történő szelektálására
A OFF-gént te-promóier irányítása alatt expresszúió, ritka, mtzonkódoíó restrikciós enztöt hasítási helyekkel -- Pí-Scel és 1-Cen 1 - teteit torigénkazeisát ízoláhönk -a pSíaiöíe-pkGFP-píaxtoídfeói (ötszöri néiküb) ŐtoZ- és öraZff-emésztéssek majd a ragadós végek feltóhésével. A pShíitíle-pkGFP-plazmíd íinszert
-- tö ' nélküli) 4129 bp hosszúságú, és <o/E7»O« replikáesós origót, kanaínyein-rezssz-enciagént, pto, LacZpronjóteí-GFPmoö-leds szekvenciái (Cíonteeh), valamim GFPnmG-lcds (Ciomeeh) szekvenciát tariulmaz. Ezt a kazettát Óri?-enzimmel emésztett, tompa végűvé alakított. pXAdPanő-Ö- l,9-l(|9-p);rzmidba szöbkiósozíuk. Ezt a végső,kööStníkdót ρΧ-Panó-pkGFTinu.O- I ,9· 1 Oü-plzzsmbn&k neveztük, és az alkalmas a kívánt géneket hordozó, rekombmáns, £1 -deíetált P&oő molekuláris klóitok előállítására oly módon, hogy ,ihb.i a gont G·, seikmíu hgaljak, maid a kií-V kiinc?.ai <:z eredet; pSh-öde-pkCiFF· vetoero^a; to>rd>v<x kló nőktől zöld/fehér megjelenésük alapján szelektáljuk.
B.Ahc®ai!y eljárás Ftoó^hazmjd eipálbtására
XJid£§gÍ&3gmiÖJfíMá^ÖB^ .A Psnő-virast pronáz és prötehíáz-lGkezeléssel, majd tenolextoskeióval a lent leírtak szerint proíein20 mentesstettSk, ':majá a viríts-DNS-hoz szitotikas 12 bp A?íe/-lhskereket ligáitok. Az AdóXhsdő’fogmentuntot izoláltuk, és· pX-plaztatdha HgaítuL tgv kaptuk az A-pontban «.menetet? pX-.AdPtm6-9-le.8· plazondoí Í9922 bp).
Az bl-gén un.u, 1.2-9) áeleiálásúhoz a pX-AdPanő-ö-ló.5-p)azmidot ótoT/- és AktoZ-eozlsttekkeS 25 emésztettük, ezáltal az £!a- és Elh-preíeiríeket kodoló régiókat (3442-6310. bp) ehávclitottok. Ezután, a kapott vektort BsiWI-enzimmei emésztettük, hogy a szelektív markért hordozó mmigén. kazettával kompatibilis tompa végeket kaptok.
A GFT-gést to-protoíer irányhúsa akut éxprcsszáió, ritka, inh'enködoló restrikciós etíziro hasítási helyekkel ··· Pl-Xeel és í-Ceu I - határok mkrigén kazettát Izoláhurtk. a pSiítíttle-pkGFP-plazmidból a fent leírtak szerint. Bzatán, a 22rö2íAÓpf>Ómagmönítimot az etnőszteh pX-AdTanó-O-ló.S-pfezmiddai ligáitok, hogy megkapják a pX-AdE:mőMU9-;ó.5AEI í?749 bp) plaznúdot, ;L.ri±an;éjuksiiv^
A pX-AdkarsóXll.lO-iió.SriEl-piazmidot .rióol-eítzimmei emésztettük. 'hogy abba egy ,VW-to7/35 linkért ligáljtmk. Az AdPanb-genombol Xbal Rsríl-fragrnentsmot izoláltok (n;n?.d-lC!í). 26240 bp), és azt az .fóúyókstrfZ-emésztett pX-AdPa.nó.MUÖ-ló,5Ari1.-plazjrddba ligáitok; a iéöti módon kapruk a pXA<PaöőMG0-Í,9-lő.5,28-190-plazmidet, A. Paöó-genotphól izolált második Xbai-íxagm««mmoí ímu 16.528; 4350 bp) ligáitok a lenti piazmidba, hogy megkaptok apX-AdPanŐMü-Ö-FF-WO-pIazmidot í385 $ | g-o.
\h Ό/ 1 e > ,</ \ es B pontokban 'esttel· < nm e o,-, utót' t I , tok Sí P w tom d, > , .vrmmars
113462-6132/SÖ
ΡΊ3Ο9578 adenovirusokokat állítsunk elő, a plsznüdot Et-pohpepödet expresszié helperrel együtt ko-ttmszfetóhsifc, vagy El-exittusszálo becsomagoló sejtvonaíM például 2ö3-sejtekhe, vagy a leírásban ismertetettek .szériát előállított sejtvonaiba traaszfektáltuk. Az El expressziója a becsomagoló sejrifonalbaa lehetővé teszi a PattőpköEFfes.O-loblOttrepliáeiöját és víriordcapsriáha csomagolődását. A találmány egy előnyös megvalósítási módja .szériát, a pX“Paaó-pkGFPma.ö-ís§’l.öö-tKS!tó'ektó.lt csomagoló: sejteket a fest ismerteteti, másik traoszgéat hordozó adenovírnsvektorral trattszfekiáljuk.
Ax^Z^fe.4xo.?áöL.döál.lkása li) .. A Pací-Smaí-Fscí-Mlül-EcoRV-Pacl restrikciós helyeket tartalmazó szhttehkus linkért klónoztunk EeoRE és Ndei- enzimekkel hasított pBR322-plaznndba. Az AdFan? bal végét (1-3618. házsspárokat) a Imkerbe klónoztak a Őmctt- és /Afe-lselyek közé. Ezután, az adeaovirus EI -régióját a klónozott végből S««8Jé.s A^W-etszimekkeí kivágtuk, majd helyére s pSbuttle ÍClonieeh) vektotból származó I-C’eui-GFP-Pl-Scslkazettái inszertóttunk. A kapott piaztnidot í'se.1- és Mlul-eazsmekkel nasltnttuk. és erre a helyre, a bal vég meghosszabbítására az AdPaoT-vírusból származó .Esc/ (3618, bp) - Αίία/ Π.5Η4. bps fragmentumot inszertáittiok. A konstrukció (pPass?pGFP) végső kialakítására a fenti plazmid Mbtf~ és EkoXl--helyei közé az AdParfe-genom 21 421 bp jobb oldali fragmentumai inszertáltuk a Miul-heiiyeí (15 114. bp) kezdődően: a fenti -módon El-deleiált Fao7- adenovfras komplett molekuláris klósját kaptuk, amely alkalmas rekonshhsám adenovirusok előállítására. .Adott esetben, az újonnan létrehozott pF&nV-vektorplaznndba, az t-Cenl és Pl20 Scel-beiyekre kívánt transzgént tRszertólharimk.
A pPan?AEl-plazmídhól rekombínáns adenor írásokat ügy áíittotttink elő. begy a piazmsdot Elpoiipepiidet expresszáló belperrel együtt bo-íransafekiáiínk, vagy El-expresszáló becsomagoló sejtvonalba, például 203-seRekbe, vagy a leírásban ismertetettek szerint előállított sejtvonalba transzléktáknk. Az El expressziőla a becsomagoló sejívoosiban lehetővé teszi a Pan?AEl repltáeiéjái es vinonkápszidba csomagoíódását. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szériát, a pX’EanTAElttránszfekíáR csomagoló sejteket a fent ismertetett, msxtszgéxii hordozó adenovirusvektorröl transzlekkiliuk. A helpervlru* es piarnnd közt homológ rekombináció jön létre, ami lehetővé teszi, hogy a vektorban található adetsovirus-tr&nszgvsi szekvencia replikálödjoa, vsrionkupszidha csonsaaoiódjon, és ily «sódon rekombínáns adenovirusok jöjjenek létre.
A transzfékeió és tisztítás menetét a Iénttekhea ismertettük.
A PanSEl -régiónak megfelelő gént expresszáló plazmídvektorokat állltommk elő, és azok alkabnazásítvíd. '.h s t ,-protes sexet stfed módón iVWjÓ vite> uLkn , ott. ró ere
A Paa5 EI-régióját pX’-pkízmidba klónoztuk, lényegében a 4. példában ismertetetlek szerint, mielőtt a lenti festőt a pSlmttle (Clontech) vektor bagrneni-unávai helyettesítettük. .Az expresszíős plazmid a Pan5genotn legalább 1-39Ő9, ntikleotidjait átfedő Pan5-aőenovimsger:OÍH-s;<ekvenciᣠtartalmaz. Az- expmssziós p'u Síid !(. i,i az \dksik cxinp-íjv kkncvsm- 1 fe- ?s I P-> v-oíeurui k.xk'o 'körtei ik.tt tmtalruz beteroíóg pronróter irányítása alatt. Hasonló expmssziós píazmidokat előálíiíhahmk a fenti táblázatokban
4Θ szereplő AdPanó és AdPan7 E l-régiók alkahssazásaval.
1134Ő2-6132/SG
F1300578 .
8. példa
Vírus FI-proteineket expresszálő sejfeonalakaí hoztunk' léte ügy, hogy Béta- (ATCC nyilvántartási szám: CLL2) sejteket: traasztormáltursk a 6. példában- ismertetettek -szerint előállított plazmáddal Az így
S kapott' sejtvonabk alkalmasak El-deletált rekombluáns cslnspánz adenosánusok tertnélt-'»’'? oIv iítödost, hogy szokat- gesom! vhaa-DNS-se.l és a fent leírtak szerint előállítóit expressziéi; ptem-ídokUl ko- tmstszléktáljuk, A sejtvon&lak tmrtszfektáiását és a sekcmbináns csimpánz .adenowwk tisztftását a sejtekből más adenovírusttk, például humán adenovtrusok esetében szokásosan alkalmazott eljárásokkal végezzük (lásd példán! ílorvrite: lásd fent és egyéb szakirodalmi hivatkozásokban).
lö .<- .· ,,
Tíz (lő) em átmérőjű tenyésztőedényekhe kiöhotfíiefea-sej^et transzMőáíümk: 10 pg pXrPan5lEl-DNfAsel a Céílpbeet™“reúg«nskészlet alkalmazásává! (Ehatmaeis, Uppsala, Svédország), a gyártó utasításai szerint eljárva, A íranazfekeiőt követően 22 órával a sejteket három percig giicerinsokknak tettük ki (15¾ glicerin Eíepes-puí&rbeu; p:H-;7,5), li;% totális böíjüszezunmtal és 1% Pert-Strep antibiotikumokkal
1.5 kiegészített DMEM- (IfeLaj vagy F12X- (A549; Life Science Technologies, Inc,» örand ísland, NY) tápközeggeí egyszer mostuk»- «&jd hat órán át, 37°C-on a festi tápkőzegben mkübáltuk, Ezután, a transziektálí Sejteket rkiplíkáonnokban 15 ma átmérőjű tenyésztöedényekbe- oltottuk L29, 1:40, 1:80, 1:160 ős 1::320 arányban hígítva. Mintán azokat egy éjszakán át, 37°C-on ínkubálíuk, a tápfeőzeget G41k-aníibíöüfenrmtai egészítettük fcr (.Lite Techuoiog-es, íné,) 1 ggítol ktmeentráe tóban. A lápközegeí 5 naponként kicseréltük, és a transzfekciót kővető 20. napon klónokat izoláltunk.
Kela El-klónokat izoláltunk, és azokat aáeno-asszoclált vírus (AAV) fertőzést támogató képességre és mkornbíoáns IncZ-pto-cin-exprossziéra teszteltük az alább ismertetettek szerint BA3Ay~feriozésLe!ósemtöAu!;ydonságyiz8gálaU
Az AAV adcíiovhus által kódolt proteinek jelenlétét igényű- teljes-éfetcittisáaak beteljesítéséhez. Az
AAV-fertözés elősegítéséhez az adenovírus El-praleín és az E4-rőgló által kódolt ÖREő-p:roteíu jelenléte egyaránt szükséges. Az el-expresszié kímntaiősára AAV-fertözés elősegítésen, alapuló eljárást alkalmaztunk. Röviden, adenovírus El-profebn expresszié sejteket úgy izoláltunk, hogy feltételezetten, adeuovírns Elexpresszáló sejteket ős atfenovíros-szekveudákaí nem tartalmazó sejteket: tartalmazó sejtfenyészeteket fertőztünk megfelelő ideig rsatfegérst expresszsló ade&o-asszociálí vírussal (AAV) és humán udenovtrus E4-gén
3ö által kódolt ORFő-proteiaé expresszáló AAV-sal. Mérjük a nartkergén-üktivitást a keletkező sejtekbe»,, és a kontroli sejtekhez, képest jelentősen ntegnővekedelí m-arkeraktiviíásö sejteket szelektálunk El-expresszáló sejtekként. A következő kísérletijén, markergéttk ént a LaeZ-gém-alkahaazt'uk, és a markeraktmlwt kék szín megjelenése jelezte.
Például, a fend sejtvönalskat és nem transzfekíáií kontroll (Héla) sejlvottalakat fertőztünk sejtenként
100 gettóm menny?segített marfecrgént hordozó AAV-vektor genomrnaí, például ÁV.LacZ-genommal [Flsher
K., és mlsal.: J. Vlrol. 71), 520 (1996)1, és busrtárs sdenovjtus-S ORFő-réglóját expresszáló AAV-vektorraí lAV.otTőj. A plazmíd DNS· szekvenciája áj. a LacZ-tr&nszgéat és az Ad F4 üRPft-régiót - amely nystott olvasás! keret expresszibe terméke az iAAV-geríontnak megfelelő e§>száki (ss) DNS keítősszáh't ids) DNSse történő átalakulásai segíti elő - hordozó rekombináns adeno-asszoeiálí vírusok (rAAV) keletkezései ered4Ö ményeri. Ezeket a vektorokat 2% FCS-t és 1 % Pen-Strep elegye! tmfateazó: tápkőzegbea htkahsljuk ,37’C113462-6132(8(3
Pl 30057$ οη, 4 órán át, amikor is azonos rnettttyíség^ iö?» FCS-t íartaimaző tápkozeget adunk hozzájuk. Szakember szántára nyilvánvaló, hogy az első AAV-vekíoj'ban bármely ntarkergén (vagy riporterién) allalmazbatő a vizsgálatban, például alkalíkus foszfatáz, lucriéráz, stb. Amennyiben a markor valamilyen antigént expresszál. ellenanyagok alkalmazásán alapuló enzimes vizsgálati ehurass alkalmazhatunk az antigén kvantitatív meghatározására. Az eljárás nem korlátozódik a markergért azonos íteriára. .A fertőzést: kővetően búszbuszonnégy órával a sejteket l.acZ-aktívísásra festjük ismert: módon. Négy (4) óra múlva a sejteket mikroszkóp alatt vizsgáljuk, és a: kontroll A459- vagy Hela-sejfeknél szignifikáns mértékben több kök sejtet tartalmazó sejt vonalakat pózait viták tekintjük.
A 4., 5. vagy 6. példában isitíerteteítek''szerint: előállított. rekombinúas«csimpánz adenovirusokkaí írtusszgérst juttatónk emlős, előnyösen humán sejtekbe. Eljárhatunk például úgy, hogy a rekombtnáns vírust tisztítjuk, majd azokkal 293 jelzésű htsmán embrionális véséseiteket fertőzőnk 50: ΜΟΪ. részeeskefeeji koneeiítfúóítihan. A GFF-expressxiot a fertőzést kővetően 24 órával jegyeztük fel..
A:.Géntrapszfer.
A rekonzbiuáos -csimpánz adenovírt?sok génttanszfeít előidéző hatékonyságát és toxikológiai profilját egérmájba Irányított géntranszfer, egérlüdöbe irányított géntrtinszfer és egérizomba irányított géníranszfer hatékonyságának vizsgálatával hasonlítottuk össze.
A LacZ-gérst CMV-promórer irányítása alatt tartalmazó El-deleláit aáenövirusvektorokat állítottunk el» a fent Ismertetett eljárással humán Adó, csimpánz Fanó, csimpánz Fan? és csimpánz Pan9 (C6S) vtrusokbői, A vektorokat immundefieiens NCR snde-egerekbe .juttattok (80 egér/klsérlet) a következőkben leírtak szerint. A májttansziukdős kísérlethez 100 pl szuszpenziót (1.x 10’: részecskét) injektállunk: a farokvénába, A tűdőírasszfekciőkoz 50 ni szuszpenzió· (5χΙ0’χ> részecskét) adtunk: be imraíracheálisan. Az izomtíunsztekcióhoz 25 pl sruszpenziót <5χΧ0*ν részecskét) ittjektdkuuk a riőmrivímíívvbr Izomba. Az egereket a vektor injektálását kővető 3,, ?., 14, és .28. napon öltük le {ídopoaionköní 5-5 egeret). A boncolássá! múi~, tüdő- vagy izcstszövetef távolítottnak el fagyasztásra és paraffinba ágyazásra. A fagyasztott blokkokból metszeteket késsittettlink X-gal festésre, es a paralTmba ágyazott szövetből készült metszeteket hsmaéoxiliüeozisi-festettük kórszövettani analízisre. Mindegyik időpontban vért vettünk. A szérummimákböl májfnnkeiös teszteket végeztünk.
A lenti kísérletet megfigyeltük,. hogy a Fan-6 .Fan·? és Fan-9 csimpánz ttdenovítusok kevésbé hatékonyan idéztek elő géníraszfert a májban és tüdőben, mini a ImAdő-virus. Ez azonban előnyős is lehet bizonyos körülmények mellett, mivel csökkenhet a huAdó esetében megfigyelt májtoxieitás. Az. Izomba történő gemrnnszfer kisebb eltéréseket mutatott áz egyes szerolípusok közt.
vsJiandkóekiorok közti s/eroílpn» .diával
Egereknek iCŐr.dáln; dfesopo-t) AtSfnS, Fan-ó-. Pan-7 és lkm~9 alapú Lsczbvektort (H5,O40€MVEacZ, EanőAídOCMVEaeZ, EmrT.őÖÖCMVLacZ, Fas9,000CAlVf..acZ: W:!1 részeeske/ínjektáiás) adtunk be-a farokvénán keresztül. Harminc nappal később az egereknek ismét, o I -nntirripsxmt expresszálő adenovirnsvektort adtunk hé i li5.ö4í)CMVh.A 1 AT, Pan&.0(!ÖCMVIrAl AT,
Faít?.O00CMVhAÍAT·, PanP.OOOEMVhAlAT; 10!! részecskcvinjektálásf. Az ismételten beadott vektor
II3462-6! 32/Sö
P1300574 transzdakeiójáaak sikerességei & szérum a-autltripszia-koueentráfiló ruegbmározása alapján állapítottak meg a vektor ismétek beadása; köve-e 3. es. 7, napos.
Az AdffttS, Pan-6, Fan-? és Pan-P-virtisoköu alapuló auenovtöasvekiötok egérmájat transzdukáló képessegét a többi szerotipussal szemben termelődött ueutrakzáló ebenanvagek. jelenlétében is vizsgálatuk. Ereó-nérivernket az. alábbi táblázatban összegeztük.
1134Ó2-6132/SG
Pl300576
Vektorok egérmájat; transzdukáló képessége más szerotípnsokkal szemben termelődött neutrálizálő ellemtHyagok jelenlétében.
A huAdS-v&ttSSal' végzett hmmusizáció nem akadályozta s Paa-6, Fsn-7 vagy Fatt-9 (C6k) csimpánz adsaovírasok ismétek beadását. A fenti kísérlet alapján az is megállapítható, hogy a Fan-7 a Pan-6 és Pan-9 közt helyezkedik el antigénrokcnság tekintetében, és mindkettővel kereszfreagál; a Psn-ö és Paa-9 azonban nem neuimlízáha egymást. Ez meglepő a két vírus közti homológiavizsgábtok alapján, melyek szedni, a Faa6 igen jelentősen eltér a Pan-7- és Pas-9-vímsokíók A Pan-9 ellett termelt artísszémm nem keresztnsntralxzálta a Pan-ó-virusokat, de bizonyos ménekig neutralizálta a P;m~7-vitusok;d, ami arra utal, hogy a.
ló Pan-6 eltér a másik két vírustól.
16. példa Rekomhmte^^
A teljes SV-25-genotnot·- kivéve a géntechnológiai eljárásokkal létrehozott El-deléciót - tartalmazó pl&zmidot áHitoíttnfk elő, Az El-deiéeió helyére beiktatott i-Ceui és Pl-Seei restrikciós enzim felístnerő helyek- sebeiévé teszik transzgán Inszertálssáí mgázó plazmidokbói ógy, hogy oda a fenti restrikciós felismerő helyek által határolt transzgén expressziós kazettái Inszeriáktnk.
A Sytof-SttaBi-Spei-AíUi-EcoEV-Swí restrikciós helyeket tartalmazó szhdetikus linkért klónoztunk IwRl-o.\F (.n/jnekkt !,„\t ott ptt? *' ’ p a m<h 1 két-omts-ttkus oltoomxít ΆΝ to W ΤΓΛ AAT AGG TAG CGC ACT AGT CGC GCT AAG CGG GGA TAT GAT TTA AA-3’; 28. azpnosito2ö >zá«)ú szekvencia) es, az SY25S (5'-TAT ’ΠΆ AAT GAT ATC CGG GCT TAA GCG CG A CTA GTG CCC TaC GTA ITT A-3’; 39, azonosítószámú szekvencia) - hibridizáltetfu.uk, és mszertálíunk az EcoRÍ- és Hőéi- enzimekkel hasított pBR322-plázmidba. Az AdSVg'S bal végét {1-1057. hp; 29, azonosítószámú szekvencia) a fenti linkerbe klónoztok a Sn&Bl és Spel-helyek közé. Az AÓSV25 jobb végét i28 0Ő9-J1 042. bp;
29. azonosítószámú szckverseia) a imkerbe klónoztuk az Alii!- és EeoRY-helyek közé. Az adeaovirus El25 gént a klónozott bal fragmentumbók az EcoRl-helytői (547. bp) az Xhol-belyjg 12031. bp) a következőkben ismertetettek szermi kivágtuk. A pShuttle-vektorről (C'lontech) PCR-eijárássat előállított I-Ceu-Pí-Sceíkazettát mszeríáitonk az EeoB.1- és Spel-helyek közé. Ezután, az AdSV25 10 154 bp Ahol · fragmentumát (21)31-12 185. bp, 29. azostositőszámú szekvencia) inszertáltnk az Spel-belyre. A kapod pk-zmldot flmdíllen/nntne: emeltettük es a veg*okonsvruke\4 <pW25) a IS '-t-· bp Ad>»\ -?* Ibudlll-lmguientum ; 11 ‘tS43Ö 39 528 bp, 29. azonosítószámú szekvencia.! mszertálásávai hoztok létre; a fenti módon El -deleiéit SV25113462-6 1 32/SG P1300578
- 55 10 adertovínts. komplett molekuláris klőujáf kaplak, amely alkalmas rekombináns adenoviru-sokok előállítására. Adott esetben, az ájoonsn létrehozott pSV25-vekioíplazroidba, az Í-C'eul és Fí-Scel-hclyekrc kívánt transzgént ksszersálhatok,
Markergér.í hordozó AdSV25~vektort ügy áilitotíunk elő, hogy előzőleg a pShtttlle-plaztnidba (Clontech) klónozott zöld Ouoreszcc tss proíenst tGFP) expresszáló kazettái 1-Cetd és Pl-Scd restrikciós enzimekkel kivágtuk, és ugyanezekkel az enzimekkel emésztett pSV25-plazt»idfea (vagy a leírásban ismertetett, más csimpánz Ad-plazmidba} ligáiruk. A kapott piazmidot ipSV2.50.FPi Sual-ertzámmel emésztettük, hogy a kazettát ,a bakteriális piaznsidváztól szétválasszuk, és HER293 jelzésű El-komplctttctttálö xejtvoualba transzlektáltuk, Körülbelül lö nappal később, a repíikákkió vírusok jelenlétére utaló eitopátiás hatást megSgyeltük. A GFF-expresszáió AdSV25 -alapú atiettovirnsvektor előállításának sikerességét úgy igazoltuk. hogy a transzíeklált terpeszei felülászöját (r;ss sej,tényeszesre vittük át. Λ másodlagosan fertőzött sejtek jelenlétét a sejtpopulációban megfigyelhető zöld fh;oreszcene>a alapját! mutattuk ki.
SÍ. példa hlVóeíeiált Pam5?.-..P^
Az adetiovirusvektorok klónozó kapacitásának növelésére az E3-régíó deletálhsíó, mivel ez a régió á vírus tenyészetben történő szaporítása szempontjából sem esszenciális géneket tartalmaz..-Ehhez, :a. Paxt-5-, Pan-ő--, Fan-';- és C68-vektorok £3-deletált változatait hoztuk létté (az E31-9-szekvenciái tartalmazó 3,5 kb blru--?k\ttO-fragmetttnmot deletáltuk).
Az El-deieták pPaaő-pkGFP-plazaridol Avtlí-endonukleiz-zttl kezeltük, hogy az F3~regíóí tartalmazó 5,8 kb íragmeantmot izoláljunk, és az Avrll-deléciót tartalmazó pPattS-pkGFP-pl&zmiriöf álból cirkulárissá .ttakitottuk: igy kaptuk a pPanSpkGFP-H-Avrll-plaznndol. Ezután, az 5,8 kb Avril-fragmerUumot pSLFajxS-EJ-Avrn-plazrnxdha sznbklónoztuk, hogy az £3-régiőbas Nroí-emésztéssel további deléciót hozzunk létre. A fenti módon kaptuk a pSLd'ari5-E3 delée-ós konstrukciót A végső pPátt5-E3-pkGPP-ko8Strakcióí ágy kaptuk, hogy a pSL-Pan5-E3 deiériós konstrukcióból eltávolítottunk egy 4,3 kb Avrih'Spelfragmentumot, és azt a pPats5-pkGFP-E3-AvrU-plaznüdba htazérlálíök az Avrli-helyre. A kapott: konrimkcióban 3.1 kb deléciót hoztunk lene az E3-régiőb&o.
Az Eí-deletált pPnnó-pkGPP molekulám kiónt Sb:tl- es Notl-enzímekkel emésztettük, hogy abból zés kb'TAgrv mimet /o .'hmm e-az mbol ,r őbíi-hoote . ea. u-, V k tpe f xons,t ukcm. pPanoSbfi-E3 - Eco4?HI- és Swal-enzimekkei emésztettük. így kaptuk: a pEa?tó-E3~klősri, Végül, a Sbíl-emésztett pPanó-pkGEP-plaznudből egy 21 kh Shff-frtsgtnentumof a pPsnő-E3^piaz5nid.ba szubklónozlunk, hogy megkapjuk a píton~E3-pkGFP-klönt, amely a kb deléciót hordozott az E3-régióbaa
CJide)^
Ugyanezt a stratégiát kővettük mindkét vektor esetében -az E3~delémó létrehozására. Először, egy, az £3-régiót átfedő 5,8 kh Avrll-fragsuctttumot szubkiönozmnk pSE-í180-pkczmidbs, majd az F3-régiót Nrulemésztéssel deletáhnk, A kapott plazmidokaí Spel- és AvrU-enzímekket -emésztettük, hogy egy 4.4 kb fragmentumot kapjunk, amelyet. pPaa7-pkGf P- és pPanö-pkGEP^bzruidek Avrll-belyére Ittónoztunk az eredeti E3-rós;iói tattalmazó Aetíl-fragmsnmmek helyére. A píhsn7-B3-pkGEP- ék pPan9-E3-pkGFP-kottstmke:iök 3-,5 kb deléciót hordoztak az Eó-régtóban.
13462-6132/SG
P1.3ÖÖ.578
.. 50
12. példa
Bar a/ .«.lenes ur.ssk 1 1 -c uo'abd» leueho/ott cdec.o <,etie generációs .'.denoMrisvckterokj a síokokat replikádéra képtelenné teszi, az adenuvirusvektor gének expressziója nem szűnik meg teljesen. Az E45 régió deléeiója ez; a maradvány génerpressziól jelentősen gyengíti, és előnyösen, a vektorok alkalmazását biztonságosabbá teheti. Ezért, 2.5 kb deledéi hordozó E4-ddctált Paa-7-vektort hoztunk létre (amelyből az. E4ORF1-OR1 7-szekveaeiakn.tk rmgtefe-lö Pvan-Agel-fragmentumot deletálínk). Magas titeni virustotvészelét állítottunk elő HEH 29? alapú sejts enalbau, amely ti 1 -proteinen felül egy esszenciális E4-géni (eríó) is ex presszóit.
iü - - k,gá.^§lásiá^gte^AEtó-a^á^^ös^
Egy 19 kb Xbal-tí igmeotmnoí deleiákunk a pE3n7-pköFP-plaz!nidbök hogy megkapjak a pPan7Xal-konstrtíkciöt. amelyből Agel- és pvulí-enzimekkel végzett részleges emésztéssel egy 2,5 kb 134fragmentumot deletáltunk, így kaptuk ís pPan7’XbaIrE4kosstntkeiót. A pEgíi7-E4-pkGEE-plazmidot: a pPM7-Xbal-E4’plazmidböl állítottuk elő két szekvenciális klónozási lépéssel, a pP&nJ-pköFP15 konstrukcióból szármázó 19 kb Xbal- és 15 kb t 'eut Mlut-tragmentamok hozzáadásával.
Az .E4~régiót tartalmazó i 1 kb pl&zrsidot - pPanŰ-EeoRl - hoztunk létre oly módon, hogy a pPááSpkGFP-plazrmdot EeoRl-en2Ímuss< etnsézíettiik, abból egy 11 kb BcoRl-fiugmeammot visszanyertünk, és önmagával ligálítmk. A fenti konstrukcióból az E4-régiét Agei-einésstéssel (majd a ragadós vég fel töltésével> és Pvulí részleges emésztéssel deletáltuk, és a fragmentumot önmagával ligáimk; így kaptuk a pPan9-EcoRl-E4-klónt. A pPan^-pkOFP-plazraídhál 23 kb EcoRtdragmentumot .izoláltunk, és azt pPasSEcoRl-E4-plazx»ld EeoRl-heRere inszeriáltuk. Ezután, a konstrukcióhoz a pRarfe-pkGEP-plszíntából -származó 5,8 kb AvxII-fragmeniuinoí .uhunk, hogy a. pPa»9-E3-E4-pköFP elnevezésű végső konsímkdöt megkapjuk. Figyelembe véve a \ .íd-unuAí PanS geaons méretét, az El-E3-E4-dofelált vektor 8 kb tianszgéní ,\cpes betcgadni ^1\ά&.&έη^ρ.$|ΰύηΙηροηε^^^^ .dáLhördozó.^^
Nagy hatékonyságéi direkt klónozó eljárást és zölddehér íeuotlpus alapján történő szelekciót alkal-maztunk rekombínáns virasok molekuláris klónjaioafc előállítására. Röviden, a kívánt géneket pShurt-epkGFP-vektofba klonozjuk ágy, hogy fehér rekombinánsoksí szelektáltunk, Ezután, a mhkgén kazettát különböző <>dée lókat hordozó pRtnX-pkGFF csimpánz adenovírns ptemldvlzba Ittszertálhikügy, hogy azt a pköF P-kazetta által eiíbgsalí I-Ceul- és Rl-Scel-helyre klónoztuk, és s helyesen mszertáiódott: fe&gnrenu vo\a, tan.? maró noham te-sen bmansnuk inge elő ti r., 1 clor mka’ szelektál -. nk áverése,, és Afermzikszapsrrtása
EI -Eo-öeleták csimpánz aáenovjrasvektorok:molekuláris klánjait ágy kaptuk,·hogy a klónokat megfelelő tcsirikcios enzunekke, Isnearizaltuk. es s/okasv»an .tifeiluuzott. dój-senekbe transztestaituk. Mtatan a 'm's. (.kav-epésben a c top η a hUa ti pcseTt k alak, t r ve s I m^mot r vágom n> c\ '4' s, pj-dvo p.n léptékű íernwshez felszaporitottiínk. A vírusokat CsCI sz.cdintentiidós eljárással tisztítottuk.
E1--E4 és Ei-E3-E4-deletáli Pan-vektoroka? IŐ-3-sejrak - 205 alapú El-E4-korstpiemcnthi sejtvonat 113462-6132/80
P130Ö578 alkalmazásával kaptunk, és: a vektorokat abba» szaporitottnk. B4 Ol-ötó-géítexpressziót a ; 0~3-sejiekhtm úgy mdukáttiusfe, hogy a tósyésztó tápközeghez 159 ptaoG ZnSO< -t adústk.
13, példa
Bbola burok ksméráksd expresszié AdfesS- vagy ÁdC 7-vektorokat .állifettimk elő C57BL/'ó-egerekben végzett tű vívó humuntzádös kísérletekhez. fetilönbözo vtrosvázat tsrialtttazó rskotnbhtfes vírusokat hoztok létre molekuláris klónozó eljárásokkal úgy, hogy tntnigén kazettákat. tnszerláltunk az El-deléeió helyére. Valamennyi rekonthináns virusklóut kinyertük, és nagy mennyiségben, CsCl-szedtuteuláciös eljárással tótiéstő tisztításra 293-sejtekben szaporítottuk. Öt, az AdBuS vagy AdPas? (C?) által kódolt EboZ va-arst szelek lf>- tájiunk, és azokat relatív Immunogenitásnlí hmnmusskolárlx Ad-injektálásal történő összehasonlítására szaporítottuk. A kezdeti vakeinázási kísértetekben a következő variánsokat hasonlítottuk össze: vad-típusú Ebo. szolubilis Ebo-variáns, Ebe,Al, EboA2. EboAl. Ebe Ad, EboAóS, EfcoAóS. E.boA7Sl és bboASS. Az alábbi ttbl t \n í <.íto ott N. -.ί,ροκΚ,η tj nJodotl \ sj'.tcs-'eí.ske *-'in'Ct al tk ' tf.<v 'nJi )t-n ti<p uÖsszes mennyiségre vonatkoztatva) spektrotótometriás úton történő meghatározás alapján.
1A EboZ^yariánsokat kódoló ÁdhnLk3£vJ\dC2aden£^^
Gén HttÁdS AdC7
fiiéi’ (VP>: nPv'tóh Teljes hozom (VFx Ttw >VP\ !0<2Zmi) Teljes hozom (VP λ
bitó vri 3.,5 B 4,3 43
BboS 4,6 49 4,6
XI 6 5.3 65
HboAs Í.7 g 53 95
EbdM 3 $··*:: Ti- 4,1 63
A vektort rníramuszkulárisatt adtuk be fi0'! genonu kóptateejt) C5?BI..'ó-egeretenek, és meghatároztuk a v-tvianenírsiizáki eítarnyagtitert („VNÁ-titef’) tVNAÖ: 28 nappal később tneghatározott aeutrallzátó eilsnanyagtiter, az Ebola burok glíkoproteinnel szemben indukálódott inununvalasz első indikátoraként). A
2Ö feíríts szerűid érietentben VNA kifejezésen HeLa-sejtvk vad-típusú Ebola burok-glikoprotcjneket. hordozó IHV alapú vektor („pszeudodpus) általi transzdukálóját gátló szénán ellenanyagokat értünk.
Az EboZ-pszendotípussal szentben kimutatható VNA AdPan? (C7) vektot esetében magasabb túeritoek bizonyult, mint az AdHu.i esetében. A célzott transzgén vonatkozásában az EboZÁÓ váltotta ki a legmagasabb ti térit VNA-t. Az alábbi táblázatiam a HlV-EboA-GEE--pszeudotipusokknl szemben kúnniatható nonuahzaio eltenanvuztnereket tómk meg »t ingu n- -.otp;okosad (N 5 állat csípett) i kfeö2-riiá2/sö
P13ÖO57S
Lgermsés leteket kezdtünk az Fbola-bnmskproteinekeí: és az Hbola nukleáris antigént cxpresszálö ton7-vektorok jellemzéséire. Vizsgátok. négy (4) különböze Ehote i?mí-konstmkeiőt expresszié AhtoS- vagy Pan-7-yektorokka! toramasz&ulárisaa,. (1.64.) injektált G57Bl/ő~egetekben kialakult neunalizáló állesrrínyágtitoreköt,
A. ÜTL-vábsz meghatározása Ebola knv-konstrakcrókat expívsszáló AöbaS- vágy Fart-?-vektorokkal tosírarmozka kri sün ini ektál t C57B1 ''ő-eeorekhetr
I renozeses kísér toggertotoíra, «’tokbtofeltoíSSááysd .Az Fboia-btrrokkal szemben miamit sotoslizálő ehenanyagvábszt <>xse«íra/&íHg ősu&ödy'' NAB) vizsgátok az Fboia-batok-glskopreteineket hordozó lentivírus (HÍV) vektor pszendotipusokkal (ekbo, ΝΤΌ2, NTD3,. NTÍ54) tonntnizáU egerek szérumainak alkalmazásával. C57BI2Ő- vagy BÁLB/c-egereket
IS injektáltunk egyedim alkalommal, intontoszkuiáris&n, egerenként Sxld:l! BboIa-barökvadánsS kódoló C (Adton-?) virasrészecskével, A neutralizáló ellenanysgtltert a vakclnázást követben 30 nappal később határoztok meg. Röviden, p-gsi&ktezidási kódoló Ebola-Zaire pszeudotlpos HIV~vekíorí (EboZ-HÍV-LacZ) inkubáltunk 2 órán át, 37cC~on, a bővel iuaktiváli egérszérumok különböző hígításainak, jelenlétében. A szárurnnto történő mkubáklst követően, az FonZ-HlV-Laek-víntssai Beto-sejteket . fertőzitek 37°C-oa íö órán ál. A íertőzeképessöget transzdukáit Heta-sejíek X-gal festésével igazótok, ahol azok β-gslaktozidáz pozitív festödést mutatnak. A neutrahzáiö liter azon: szértanhigitás reeiproka, amely a β-gaíaktozidáz: pozitív; kék festödésá sejtek szántat zó'· -kai csökkenti. Szérnmsníníákat az irmnunizánto: kővetően 3Ö nappal gyujtötnotk, az immunizálást zxoz részeeske/álbt büramuszkuláns (Fiük) beadásával végeztük; Valameenyi csoportban kimutattunk Fbola-buroktoufciaetoFtordozö HÍV (pszeudotlpus) elleni aeutolizál© ellenanyago25 kút, az dlenanyagtíter Ád-FboZ (Eboő-espre-sszálö Ádfe«5), Ad-NT133 (szólúbilis NTIAF-ex.presszídö AdtoS) es <?--sEb»> (FboZ-cxpresszálé Adton-?) esetében 20, a C7-NTÖ3 (szólúbilis NTÖa-eKpresszálö AdPao~7; esetében ΠΒ vök, A fentivel azonos írntnunlzáclőx stratégia BALB/c-pgerekbeu alacsonyabb seuítoizsln eílenanyagtiterekei eredményezek az Ad- és G7-NTB2 és KTD4 esetében.
Ik.Ce.Utoiris.xm
3ö Az Ebola-burok elleni cdialáris immunvákíszt C57SI26-egerekben vizsgáltok S nappal állatonként
SxliF’' C7-l..acZ -,agy C7-Fbola burokvariáas virusrészecske inizautaszkuláris beadását követően, Egereket l.M, vakcmáziutoi 5xlO!'*C7-LacZ'vagy C7-Bbolabarokvariánst kódoló vlrusrészeeskévei. Nyolc 18) nappal az immunizálás «tor, az immunizált egerekből lép liintőt:ítákat izoláltunk, és azokat /« r«ro tápláló sejtekkel (vad-típusú kbola burokproteint kódold, sugárkezeit humán adenovirus-5 szerotipussal fertőzött, kezeletlen cae;e\bol s/urrna-o \p lurílocílaskab st.nrtr.utok A t II \i/sgtotor szokásos rrvoan, s m.n ,.t rece/tuk l'Íso/-e\pressz.,,o svktorr.it toms/fekx.lt,' <'r--elob s/rn-vn t 5-seiiek alkuitmízasavak
Pozitív NIFíC-korlátozott elíotoxikus T-liu-ítoitu (CTL) választ tapasztaltunk valamennyi Imoláit 3462-6132/SG
PI30Ö578
-59batokvariánsí kódoló AdBaa-7-klőit esetében, erősebb válasz volt megfigyelhető az. NTD2-, NTD.3- és NTD4ánmonízá.U· egerekben. Az Ebola-barokpröteint kódoló CT-virussaí tenarazák egerekből származó efféktorsejtök felismerték az. EböZ-transzfektáfí célsejteket, és CTL-válasszal reagálóik akár 30% specifikus Itzisf eredményezve. Naiv vagy LacZ-imumizak koairöil egerekből szármázó eí&klorsejtefc alkainutzásakör
5%-nál álacsonyabfe- arányit lízis volt tnegfígyelhetö, arai art igazolja, hegy a kzis specifikus volt az. fibeia hnrekantigenre.
Az EboZ-variánsokat kódoló C? (AdPan-7j sikeres vakcinaként történő alkalmazhatóságának értékelésére, az imtnurnzálássai létrehozott védettséget vizsgáltuk egerekben, egerekhez adaptált Eboia-Zstre virus10 sttl történő íetálss fertőzés által előidézett testsúly veszteséggel és pusztulással szemben. B/\LB/e-egereket Immunizáltunk a korábbiakban ismertetettek szerint, egyetlen alkalommal, állatonként Sxlöí& részecske beasknaval, es 21 η.φρ.51 kesébb a v/íkmui/ott altatókat 2v0 Ií\, egebez adaptak Ϊ boiu-Zaue v tréseit fertőztek \ ««iw kontroll euer ihorrtezoanvg é-' t-l,.eZí e’pus.tttk a mttozest kővető s 4 m-p kozof t zzel szemben, egs kivételévé! te V'-sLbo-csOperthől) v.;lamcnn>· vakén úszott ege- eleiben nyarad! az ibo15 la-Zaire vírussal történt. fertőzést kővetően.
Mértük a C7-áEbo-vakcinázott egerek testsúlyveszteségét a 4-7. nap közötti időszakban. A betegség tünetei, például borzolt szőrzet, enyhe fokútól súlyos fokúig terjedő levertség megfigyelhető volt a CT-sEbo, NID2-, és NTDS-vafcstnázort csoportban a 4-7. napok között. A C7-EboZ- és C7-NTI)4-hntnunizáb egetekben betegségié utaló tünetek nem jelentkeztek. Összességében, egyetlen dózis C7-EboZ vagy C7-NTD4 .20 teljes védettséget nyújtott az immunizált egereknél a betegséggel és a fertőzés okozta pusztulással szemben, feltehetően jelentős mértékű T-sejtes immunitáson keresztül,
A leírásban idézett valamennyi szakirodáim! hivatkozás teljes terjedelmében a kitanttás részét képezi. A taláíiöány szerinti megoldásnak számos tnódosüása és variációja lehetséges, amelyek szakember számára nvrtvangolnak, es ezek vonton a ’akilnkm bugyit kepez-k t ta..ifot,nv szundi kesz-tmenvek és zljamxk von , ooosu-c es vátkuo V <. úti t kü'Onóo n v-g- v-\tóteozj»vk v.gv menüt rtodulu o dózisok megvá-lassdástt ugyancsak a találmány tárgykörébe tartozik.
SZfKVbNCIALlS'i'A
A s/ekv enuzhstnhnn szereplő kötetlen szövegrészek (223-aa kód) fordításé;
<2 IÖ> 1
% l ? i\n:vn
1 1 1 lovon
<223> t 5 1 Kr
<2IO> 5
<223-- 1 2 Ponton
<223> 1 3 He-<vn
<223>- 1.5 fíber
<210> 9
113462-6132/SÖ
F1309578 ·<223·> L2 Festőn «223» 13 Hexán «223» LSPiher «210» 24 «223» 12 Pesten «223» LS Hexos <223» LSFiberS'2 «223» 15 Fíber #1 <2I0» 29
K) «223» Fenton «.223» Flexon «223» Fíber#2 «223» Fiberrii «210» 34 «223» 12 Festőn <223> 13 Hexos «223» LSFsfeer#!
«210» 38 «223» öligömer SV25T «210» 39 «223» oligomer S V25B

Claims (11)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    25 1 Rekomfeiaáas adenovlrns, amelynek a következőket tartalmazó kapszidja van: ÁdFanőbexosproteia, amelynek sram<mv-szekw»ááfs a SEQ ID NO, 7 szennti szekvencia, Itberprotein és pmonprotdm továbbá amely adetfovim isrtsins&z olyan atoowm-wékwacWsg, amelyekből az Etaés/vagy Fíb-gcnek Emkctostálisas deleíálva vasnak, 5’ és 3’ adesoviras dsz-dsmekek amelyek replikádéhoz és kajszidba esomagolőóáshoz .szükségesek, amely mez-elemek ndesaovírus 5’ invertált termi
    30 náKs ismétlő egységet és adenovfetts 3’ terromális ismétlő egységet tartalmaznak, valamint az aáenovkas szetnponljából beteroiég transzgént a geo gazdasejtbe» torténő expresszióját Irányító szekvenciákhoz kapcsortan.
  2. 2. Ás I... igénypont szerinti rekomhináss adcxmvirus, and & Sberprotem a SBQ' ID NO.. 19 szerinti Adlhttrő-fibe^rötein-íragamstona,
    35
  3. 3. Az l, igénypont szénáé rekonthináns aóenovlrus, ahol a Sberprddn a SBQ ID Nö. 8 szerinti
    AdPaoS-riberpro tein,
  4. 4.. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adesoviros, ahol a psotonproieks ÁtiPánópentosprotdn,
  5. 5. Az 1-4, igénypontok bármelyike szerint· rckombmmts adenovírns, amely pszeaóoiíptistr adenovírax,
    40 és tartalmaz replikádéhoz és kapsridha esomagelőáásáhez szükséges 5’ és23’ sdeocvirny cisz elemeket
    113462-6132/SG
    F1300578
    -ői amely eisz-eletnek adsnevtesből származó adenovims 5’ invertált terminális ismétlő egységet és adenoviras 3’ terminális ismétlő egységet tartalmazíiak, amely adeaovíms eltér a hexonfehérjét biztosító adenoriroxtől, ó< Rekombináns adenovlrus, amelynek a következőket tartalmazó kapszídja van: AdFanÓhexonproteís fmgmenmmát tartalmazó hexon, Sbersroteht és pentoaproteia, továbbá amely adenovlras tsz5 talmaz olyan adenovdrtis-szekveneiákaí, amelyekből az Fia- és/vagy Elb-gének fonkeionáhsan deletálva vásnak, 5’ és 3’ adesövírss. asz-efe-mekek amelyek replikációboz és kspazidba esomagolódáíkoz szükségesek, amely clsz-elésnek adenovlrus 5' invertált terminális ismétlő egységet és adenovlrus 3’ temináiís ismétlő egységet 'tartalmaznak,, és az AdPanó-íal hetefológ: nukleinsav-szekveaeiáp ahol. az.
  6. AdPanő-hexenprotrin fragmense a SEQ 83 NO.
  7. 7 szerinti AdFanö-hexonpRjiöia-szekv'etteia mintegy 59 aminos&v hosszúságú. ΜΙ 0 terminális vagy C-larsr sális: delemét tartalmazó, esonkolt változata.
    Ί, Az: 1-4. vagyő, igénypontok bármelyike szerinti, rekombmáns adenovlrus, aholazadenovirnaefezefemei tartalmaznak .5’ invertált terminális ismétlődő (1TE) szekvenciákat, és a .SEQ © NO, 5 szerinti FanS ólTS-jég vagy olyan szekvenciát, amely ezek bánnelyikével kompkmumíett
  8. 8, A ő, igénypont szerinti adpnoyíras, amely legalább egy, a következők kézül választott skálán
    IS kapsztdprotenrt tartalmaz;
    a Fanó SEQ JD biö. ő szerinti pentonprehrin; és: a FasÓ SBQiDNÖ. S szerinti flberprotejn.
  9. 9, feoláíl gazdasejk amely 1-8. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenévforst tartahnaz.
    l ö.
  10. Készítmény, amely 1-8. Igénypontok bármelyike szerinti reketöbtnáns adenövirust és gyógyássatí29 feg elfogadható hordozót tartalmaz..
  11. 11. Az 1-8. igénypontok: bármelyike szerinti rekombináns adenovfors alkalmazása emlősgazdaszervezelben fertőző ágens ellent immunválasz kiváltására szolgáló gyógyszer előállítására, ahol a íranszgén vagy bsterolőg gén a fertőző ágens antigénjét kődoiis.
HU1300578A 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleisav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására HU230365B1 (hu)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33195101P 2001-11-21 2001-11-21
US60/331,951 2001-11-21
PCT/US2002/003364 WO2002063806A2 (en) 2001-02-07 2002-02-07 System, method, and computer program product for sharing bandwidth in a wireless personal area network or a wireless local area network
US36679802P 2002-03-22 2002-03-22
US60/366,798 2002-03-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU230365B1 true HU230365B1 (hu) 2016-03-29

Family

ID=26987985

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1400619A HU230488B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
HU1300578A HU230365B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleisav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
HU0500987A HU230364B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1400619A HU230488B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0500987A HU230364B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására

Country Status (19)

Country Link
US (5) US7247472B2 (hu)
EP (4) EP1453543B1 (hu)
JP (9) JP2005511035A (hu)
KR (1) KR100987360B1 (hu)
CN (1) CN1578678B (hu)
AU (1) AU2002365366B2 (hu)
BR (1) BR0214350A (hu)
CA (3) CA2990322A1 (hu)
CO (1) CO5590973A2 (hu)
HU (3) HU230488B1 (hu)
IL (5) IL161584A0 (hu)
MX (2) MXPA04004876A (hu)
NO (3) NO332692B1 (hu)
NZ (3) NZ532383A (hu)
PH (1) PH12016500338A1 (hu)
PL (1) PL209133B1 (hu)
SG (2) SG2013034475A (hu)
WO (1) WO2003046124A2 (hu)
ZA (1) ZA200403117B (hu)

Families Citing this family (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2375557T3 (es) 2001-06-22 2012-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus recombinantes que comprenden prote�?nas de adenovirus de simios y usos de los mismos.
US20040136963A1 (en) * 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
SG2013034475A (en) * 2001-11-21 2016-10-28 Univ Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
PL376792A1 (pl) 2002-10-23 2006-01-09 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Sposoby szczepienia przeciwko malarii
US7291498B2 (en) 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
US7491508B2 (en) * 2003-06-20 2009-02-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
CA2553541C (en) * 2004-01-23 2015-04-21 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Chimpanzee adenovirus vaccine carriers
ES2361000T3 (es) * 2004-04-28 2011-06-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Suministro secuencial de moléculas inmunogénicas mediante administraciones de un adenovirus y de un virus adeno-asociado.
EP1742657B1 (en) * 2004-04-28 2013-11-06 The Trustees of The University of Pennsylvania Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost
US7964196B2 (en) * 2004-05-25 2011-06-21 Chimeros, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
GB0417494D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
SG159554A1 (en) 2004-11-16 2010-03-30 Crucell Holland Bv Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors
EP1863520B1 (en) * 2005-03-08 2014-12-31 Aptose Biosciences Inc. Use of interleukin 17e for the treatment of cancer
GB0513421D0 (en) 2005-06-30 2005-08-03 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccines
CA2648581A1 (en) * 2006-04-07 2008-09-12 Chimeros, Inc. Compositions and methods for treating b- cell malignancies
JP5889514B2 (ja) * 2006-04-28 2016-03-22 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 改変アデノウイルスヘキソンタンパク質およびその用途
WO2008027394A2 (en) 2006-08-28 2008-03-06 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Constructs for enhancing immune responses
EP2137210B1 (en) 2007-03-02 2016-10-19 GlaxoSmithKline Biologicals SA Novel method and compositions
US20090226525A1 (en) * 2007-04-09 2009-09-10 Chimeros Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
MX347246B (es) * 2007-11-28 2017-04-19 Univ Pennsylvania Adenovirus e simianos sadv-39, sadv-25.2, sadv-26, sadv-30, sadv-37 y sadv-38.
WO2009105084A2 (en) * 2007-11-28 2009-08-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian subfamily c adenoviruses sadv-40, -31, and-34 and uses thereof
BRPI0822651A2 (pt) 2007-11-28 2014-10-14 Univ Pennsylvania Subfamília b de adenovírus sadv-28, -27, 29, -32, -33 e -35 de símio e seus usos
AU2014203073B2 (en) * 2007-11-28 2016-07-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian E adenovirus SAdV-30
US8470310B2 (en) * 2008-03-04 2013-06-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses SAdV-36, -42.1, -42.2, and -44 and uses thereof
US9217155B2 (en) * 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
US8940290B2 (en) * 2008-10-31 2015-01-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses SAdV-43, -45, -46, -47, -48, -49, and -50 and uses thereof
WO2010085984A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Okairos Ag Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
HUE039908T2 (hu) * 2009-02-02 2019-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Majom adenovírusból származó nukleinsav- és aminosav-szekvenciák, azt tartalmazó vektorok és alkalmazásuk
JP5882741B2 (ja) 2009-02-02 2016-03-09 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム サルアデノウイルスの核酸配列及びアミノ酸配列、それを含有するベクター、並びにその使用
EA021100B1 (ru) 2009-03-17 2015-04-30 МДхХЭЛС СА Усовершенствованное определение экспрессии генов
WO2010120874A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
CN102575232B (zh) * 2009-05-29 2015-07-22 宾夕法尼亚大学托管会 猿腺病毒41及其应用
WO2011057248A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 Genvec, Inc. Simian adenovirus and methods of use
WO2011057254A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
KR101458367B1 (ko) * 2010-04-14 2014-11-05 재단법인 목암생명공학연구소 원숭이 아데노바이러스 혈청형 19로부터 분리된 헥손, 그의 초가변 영역 및 그를 이용한 키메라 아데노바이러스
DK2826860T3 (en) 2010-04-23 2018-12-03 Univ Massachusetts CNS targeting AAV vectors and methods for their use
WO2011133901A2 (en) 2010-04-23 2011-10-27 University Of Massachusetts Aav-based treatment of cholesterol-related disorders
WO2011133874A1 (en) 2010-04-23 2011-10-27 University Of Massachusetts Multicistronic expression constructs
LT3333265T (lt) * 2010-05-14 2020-05-25 Oregon Health & Science University Rekombinantiniai žcmv ir rhcmv vektoriai, koduojantys heterologinį antigeną, išskirtą iš hepatito b viruso, ir jų panaudojimas
WO2012021730A2 (en) 2010-08-11 2012-02-16 Genvec, Inc. Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
WO2012038367A1 (en) 2010-09-20 2012-03-29 Crucell Holland B.V. Therapeutic vaccination against active tuberculosis
AU2011332025B2 (en) 2010-11-23 2015-06-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily E simian adenoviruses A1321, A1325, A1295, A1309 and A1322 and uses thereof
US9266939B2 (en) 2010-12-27 2016-02-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
WO2012089231A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Okairòs Ag Paramyxovirus vaccines
US9267112B2 (en) 2011-05-10 2016-02-23 The Regents Of The University Of California Adenovirus isolated from Titi Monkeys
US10221218B2 (en) 2011-05-10 2019-03-05 The Regents Of The University Of California Adenovirus isolated from titi monkeys
GB201108879D0 (en) * 2011-05-25 2011-07-06 Isis Innovation Vector
TWI623618B (zh) 2011-07-12 2018-05-11 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
US8865188B2 (en) 2011-09-09 2014-10-21 Biomed Realty, L.P. Methods and compositions for controlling assembly of viral proteins
US20140348791A1 (en) * 2011-09-09 2014-11-27 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Modified adenoviral vectors and methods of treatment using same
TW201321016A (zh) 2011-09-29 2013-06-01 Transgene Sa 免疫療法組成物及用於治療ｃ型肝炎病毒感染之療程（二）
WO2013045658A1 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
CN107937440A (zh) * 2011-10-05 2018-04-20 金维克有限公司 猴腺病毒(大猩猩)或腺病毒载体及其使用方法
WO2013058833A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 Enobia Canada Limited Partnership Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
US9226936B2 (en) 2011-10-28 2016-01-05 The Wistar of Anatomy and Biology Methods and compositions for enhancing the therapeutic effect of anti-tumor T cells
US10238755B2 (en) 2011-11-30 2019-03-26 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for regulation of cell aging, carcinogenesis and reprogramming
KR20150014505A (ko) 2012-05-18 2015-02-06 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 아과 e 원숭이 아데노바이러스 a1302, a1320, a1331 및 a1337 및 이것들의 사용
US9861693B2 (en) 2012-09-07 2018-01-09 Emory University HIV immune stimulating compositions comprising recombinantly expressed pili on bacteria and methods related thereto
US9683268B2 (en) * 2012-09-19 2017-06-20 Beth Israel Deaconess Viruses associated with immunodeficiency and enteropathy and methods using same
CA3200425A1 (en) * 2012-11-16 2014-05-22 Peter ABBINK Recombinant adenoviruses and use thereof
JP2016505267A (ja) * 2013-01-15 2016-02-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア アデノウイルスおよびその使用
US9624510B2 (en) 2013-03-01 2017-04-18 The Wistar Institute Adenoviral vectors comprising partial deletions of E3
US9402888B2 (en) 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
KR102089121B1 (ko) 2013-03-14 2020-03-13 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 종양살상형 아데노바이러스 조성물
PL3062815T3 (pl) * 2013-11-01 2019-07-31 Pfizer Inc. Wektory do ekspresji antygenów związanych z gruczołem krokowym
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
PL3200815T3 (pl) 2014-10-02 2021-10-18 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Sposoby i kompozycje do leczenia nowotworu
CA2963293A1 (en) 2014-10-06 2016-04-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for isolation of circulating tumor cells (ctc)
CN107073051B (zh) 2014-10-21 2021-08-24 马萨诸塞大学 重组aav变体及其用途
MX2017005834A (es) 2014-11-05 2017-11-17 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos aad para el tratamiento de la enfermedad de parkinson.
AU2015346162B2 (en) 2014-11-14 2022-02-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
CN112375760A (zh) 2014-11-14 2021-02-19 沃雅戈治疗公司 调节性多核苷酸
WO2016094783A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
MX2017016105A (es) * 2015-06-12 2018-05-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Polinucleotidos y polipeptidos de adenovirus.
CA3006569A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Voyager Therapeutics, Inc. Assays for the detection of aav neutralizing antibodies
US11208468B2 (en) 2016-02-18 2021-12-28 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating melanoma
CA3013637A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
CN108699566B (zh) 2016-02-23 2023-06-30 萨克生物研究学院 对病毒动力学影响最小的治疗性腺病毒中的外源基因表达
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
CA3023022A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
SG11201809699XA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
RU2764587C2 (ru) 2016-05-18 2022-01-18 Вояджер Терапьютикс, Инк. Способы и композиции для лечения хореи гентингтона
AU2017305176B2 (en) * 2016-08-01 2021-05-27 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Compositions and methods of replication deficient adenoviral vectors for vaccine applications
US11298041B2 (en) 2016-08-30 2022-04-12 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
US20190328869A1 (en) 2016-10-10 2019-10-31 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
US11578340B2 (en) 2016-10-13 2023-02-14 University Of Massachusetts AAV capsid designs
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
SG11201909868YA (en) 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
JP2020518258A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）治療組成物および方法
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
CN111132626B (zh) 2017-07-17 2024-01-30 沃雅戈治疗公司 轨迹阵列引导系统
KR20200044793A (ko) 2017-08-03 2020-04-29 보이저 테라퓨틱스, 인크. Aav의 전달을 위한 조성물 및 방법
JP2021502060A (ja) 2017-10-16 2021-01-28 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
WO2019118480A1 (en) 2017-12-11 2019-06-20 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Recombinant adenoviruses and uses thereof
EP3807404A1 (en) 2018-06-13 2021-04-21 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered 5' untranslated regions (5' utr) for aav production
US20210355454A1 (en) 2018-07-24 2021-11-18 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing gene therapy formulations
US20210348242A1 (en) 2018-10-04 2021-11-11 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
TW202028458A (zh) 2018-10-05 2020-08-01 美商航海家醫療公司 編碼腺相關病毒(aav)生產蛋白之經基因工程化核酸構築體
EP3867389A1 (en) 2018-10-15 2021-08-25 Voyager Therapeutics, Inc. Expression vectors for large-scale production of raav in the baculovirus/sf9 system
KR20210130158A (ko) 2019-01-31 2021-10-29 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 Aav 캡시드의 전사 의존적 유도 진화를 사용하는 방법
CN114269363A (zh) * 2019-04-17 2022-04-01 威斯达研究所 用于hiv疫苗应用的复制缺陷型腺病毒载体
KR20230038496A (ko) 2020-07-13 2023-03-20 트랜스진 면역 억제의 치료
US20240091380A1 (en) 2021-02-01 2024-03-21 Regenxbio Inc. Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
CN112831524B (zh) * 2021-02-20 2023-06-13 苏州相奕生物技术有限公司 人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用
CA3213066A1 (en) 2021-03-29 2022-10-06 Soo-Ok Kim Recombinant chimeric adenoviral vector substituted by knob gene of chimpanzee adenovirus serotype 6, and application thereof
WO2022218997A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Novel universal vaccine presenting system
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5240846A (en) 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
US6174666B1 (en) 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
WO1996012406A1 (en) 1994-10-19 1996-05-02 Genetic Therapy, Inc. Gene therapy involving concurrent and repeated administration of adenoviruses and immunosuppressive agents
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
DE69534166T2 (de) 1994-10-28 2006-03-09 Trustees Of The University Of Pennsylvania Rekombinanter adenovirus und methoden zu dessen verwendung
US5770442A (en) * 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
US6127525A (en) 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
US5698202A (en) 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
AU6261696A (en) 1995-06-05 1996-12-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The A replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
US6083716A (en) 1996-09-06 2000-07-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
WO1998010088A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
US5922315A (en) 1997-01-24 1999-07-13 Genetic Therapy, Inc. Adenoviruses having altered hexon proteins
US5891994A (en) 1997-07-11 1999-04-06 Thymon L.L.C. Methods and compositions for impairing multiplication of HIV-1
EP1015619A1 (en) 1997-09-19 2000-07-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
CA2303768C (en) 1997-09-19 2009-11-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
GB9720585D0 (en) 1997-09-26 1997-11-26 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ES2235470T3 (es) 1998-03-20 2005-07-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Composiciones y metodos para la produccion libre de cooperadores de virus adnoasociados recombinantes.
US20030017138A1 (en) * 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US6210663B1 (en) 1998-08-20 2001-04-03 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
CA2378539A1 (en) 1999-07-06 2001-01-11 Merck & Co., Inc. Adenovirus carrying gag gene hiv vaccine
CN1326873C (zh) 2000-01-31 2007-07-18 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 用于hiv预防或治疗性免疫的疫苗
US6740525B2 (en) 2000-02-09 2004-05-25 Genvec, Inc. Adenoviral capsid containing chimeric protein IX
US20040241181A1 (en) 2001-06-22 2004-12-02 Ertl Hildeghund C. J. Methods of inducing a cytotoxic immune response and recormbinant simian adenovirus compositions useful therein
US20040136963A1 (en) 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
ES2375557T3 (es) * 2001-06-22 2012-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus recombinantes que comprenden prote�?nas de adenovirus de simios y usos de los mismos.
SG2013034475A (en) * 2001-11-21 2016-10-28 Univ Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
PL376792A1 (pl) 2002-10-23 2006-01-09 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Sposoby szczepienia przeciwko malarii
US7491508B2 (en) 2003-06-20 2009-02-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
US7291498B2 (en) 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
EP1742657B1 (en) 2004-04-28 2013-11-06 The Trustees of The University of Pennsylvania Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost
EP1743028A2 (en) 2004-04-28 2007-01-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Polyvalent viral vectors and a system for production thereof
ES2361000T3 (es) 2004-04-28 2011-06-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Suministro secuencial de moléculas inmunogénicas mediante administraciones de un adenovirus y de un virus adeno-asociado.
MX2007014038A (es) 2005-05-12 2008-02-11 Glaxo Group Ltd Composicion de vacuna.
JP5889514B2 (ja) * 2006-04-28 2016-03-22 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 改変アデノウイルスヘキソンタンパク質およびその用途
AU2007276219B2 (en) 2006-07-18 2013-10-03 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccines for malaria
EP2137210B1 (en) 2007-03-02 2016-10-19 GlaxoSmithKline Biologicals SA Novel method and compositions
EP2777185B1 (en) 2011-10-13 2016-08-24 Telefonaktiebolaget LM Ericsson (publ) Method and node related to channel estimation

Also Published As

Publication number Publication date
HU230488B1 (hu) 2016-08-29
CN1578678A (zh) 2005-02-09
NZ550416A (en) 2008-06-30
NO334512B1 (no) 2014-03-24
HUP1400619A2 (en) 2006-01-30
CA2852277A1 (en) 2003-06-05
JP2011055835A (ja) 2011-03-24
IL230292A (en) 2016-08-31
KR20040054796A (ko) 2004-06-25
US20150352203A1 (en) 2015-12-10
JP2015057051A (ja) 2015-03-26
EP2286841A1 (en) 2011-02-23
PL209133B1 (pl) 2011-07-29
WO2003046124A3 (en) 2003-11-20
CO5590973A2 (es) 2005-12-30
CA2990322A1 (en) 2003-06-05
US8603459B2 (en) 2013-12-10
CA2852277C (en) 2018-02-20
PH12016500338A1 (en) 2018-03-26
US20050069866A1 (en) 2005-03-31
JP2017035110A (ja) 2017-02-16
NZ564586A (en) 2009-09-25
PL373602A1 (en) 2005-09-05
US20120093778A1 (en) 2012-04-19
JP2005511035A (ja) 2005-04-28
EP3108899A1 (en) 2016-12-28
ZA200403117B (en) 2005-03-30
IL223344A (en) 2015-04-30
US20080090281A1 (en) 2008-04-17
CA2466431C (en) 2014-08-05
US9133483B2 (en) 2015-09-15
SG165153A1 (en) 2010-10-28
KR100987360B1 (ko) 2010-10-12
NZ532383A (en) 2007-03-30
US20140065105A1 (en) 2014-03-06
NO20120337L (no) 2004-05-26
BR0214350A (pt) 2005-05-10
MX351516B (es) 2017-10-17
AU2002365366B2 (en) 2007-05-10
JP2017035111A (ja) 2017-02-16
US8105574B2 (en) 2012-01-31
HU230364B1 (hu) 2016-03-29
US7247472B2 (en) 2007-07-24
WO2003046124A2 (en) 2003-06-05
JP2017070292A (ja) 2017-04-13
EP1453543A4 (en) 2006-12-06
IL231502A (en) 2017-04-30
AU2002365366A1 (en) 2003-06-10
NO20130590L (no) 2004-05-26
IL223344A0 (en) 2013-02-03
IL161584A0 (en) 2004-09-27
NO20042191L (no) 2004-05-26
EP1453543B1 (en) 2017-08-30
CA2466431A1 (en) 2003-06-05
US20170119873A9 (en) 2017-05-04
JP2009136296A (ja) 2009-06-25
EP2301582A1 (en) 2011-03-30
EP2301582B1 (en) 2017-07-12
MXPA04004876A (es) 2004-07-30
SG2013034475A (en) 2016-10-28
HUP0500987A2 (en) 2006-01-30
JP2015057052A (ja) 2015-03-26
JP5715749B2 (ja) 2015-05-13
CN1578678B (zh) 2010-05-26
EP1453543A2 (en) 2004-09-08
IL161584A (en) 2015-05-31
HUP0500987A3 (en) 2008-05-28
IL231502A0 (en) 2014-04-30
NO332692B1 (no) 2012-12-10
JP2013252144A (ja) 2013-12-19
NO335438B1 (no) 2014-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230365B1 (hu) Simian adenovírus nukleisav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
ES2883354T3 (es) Vector adenoviral
CN103930551B (zh) 猴腺病毒和杂合腺病毒载体
US7429481B2 (en) Targeting viruses using a modified sindbis glycoprotein
ES2404689T3 (es) Vacunas quiméricas que comprenden el dominio lumenal de LAMP-1 o LAMP-2
JPH05505306A (ja) 組換えアデノウイルス
BG98718A (bg) Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки
KR20190138311A (ko) 종양용해성 바이러스요법 및 면역요법
HU230406B1 (hu) Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására
CN112972668A (zh) 重组修饰的痘苗病毒安卡拉(mva)丝状病毒疫苗
CN109803677A (zh) 用于α病毒疫苗接种的组合物和方法
EA007811B1 (ru) Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)
HU228327B1 (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
HU229051B1 (en) Porcine circovirus vaccine in reconbinant poxvirus
EA012037B1 (ru) Поливалентные вакцины, содержащие рекомбинантные вирусные векторы
JP2005537802A (ja) ラブドウイルスの組み換え型変異体及びその使用方法
US20020192824A1 (en) Viral vectors having chimeric envelope proteins containing the IgG-binding domain of protein A
PT1497438E (pt) Meios e métodos para a produção de vectores de adenovírus
EA023888B1 (ru) Репликационно-дефектные вакцины и вакцинные векторы против флавивирусов
JP2012504944A (ja) 腫瘍の療法のためのｌｃｍｖ−ｇｐシュードタイプ化ｖｓｖベクターおよび腫瘍浸潤性ウイルス産生細胞
EA015013B1 (ru) Рекомбинантный вирус сендай с ослабленной способностью к репликации, предназначенный для использования в качестве вакцин
KR20220016137A (ko) 변형된 아데노바이러스
CN107530383A (zh) 用于埃博拉病毒疫苗接种的方法和组合物
CN115916986A (zh) 修饰的腺相关病毒5衣壳及其用途
WO2005113584A1 (en) Methods and compositions comprising protein l immunoglobulin binding domains for cell-specific targeting

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees