CN112972668A - 重组修饰的痘苗病毒安卡拉(mva)丝状病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含针对丝状病毒感染的基于重组修饰的痘苗病毒安卡拉(基于MVA)的疫苗的改进的丝状病毒疫苗并且涉及相关产品、方法和用途。具体地说，本发明涉及遗传工程化的(重组)MVA和FPV载体，所述MVA和FPV载体包含编码马尔堡病毒(MARV)或埃博拉病毒糖蛋白的抗原决定簇的至少一个异源核苷酸序列。具体地说，本发明涉及重组MVA，其包含埃博拉病毒糖蛋白和病毒粒子蛋白40。本发明还涉及例如适合于在受试者中诱导保护性免疫应答的其产品、方法和用途以及MVA和遗传工程化的(重组)FPV的初免/加强方案。

Description

重组修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)丝状病毒疫苗
本申请是申请号为2015800473281，申请日为2015年9月3日，发明名称为“重组修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)丝状病毒疫苗”的分案申请。
发明领域
本发明涉及包含针对丝状病毒疾病的基于重组修饰的痘苗病毒安卡拉(基于MVA)的疫苗的改进的丝状病毒疫苗并且涉及相关产品、方法和用途。具体地说，本发明涉及遗传工程化的(重组)MVA载体，其包含编码丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。本发明还涉及疫苗接种方法，具体地说采用两种病毒载体组合物的同源和异源初免-加强疫苗接种方案。更具体地说，本发明涉及用于同源初免-加强疫苗接种方案中的重组MVA和/或用于异源初免-加强疫苗接种方案中的重组MVA和重组禽痘病毒(FPV)。本发明还涉及例如适合于在受试者中诱导保护性免疫应答的其产品、方法和用途。
发明背景
丝状病毒是病毒科丝状病毒科(Filoviridae)的包膜、非节段性负链RNA病毒。迄今已鉴别了所述病毒科的两个成员：马尔堡病毒(Marburg virus；MARV)和埃博拉病毒(Ebola virus；EBOV)。丝状病毒是极其毒性的，可容易地在人与人之间传播，并且是极其致命的，从而在人和非人灵长类动物中引起严重出血热。丝状病毒感染在人中具有23％至高达90％范围内的致死率。然而，尽管它们具有传播性和致死性，但是没有批准的疗法或预防性疫苗可供使用。
在爆发期间，隔离患者以及使用防护服和消毒程序(一起称为病毒性出血热(VHF)隔离预防措施或屏障护理)已足以中断马尔堡病毒或埃博拉病毒的进一步传播，并且因此控制且终止爆发。因为不存在用于由丝状病毒引起的出血热的已知有效治疗，通过应用VHF隔离预防措施的传播预防是目前用于控制丝状病毒爆发的唯一可用手段。
在1967年处理来自非洲绿猴的组织的德国和南斯拉夫的一些实验室工作人员发展严重出血热后，认识到第一种丝状病毒。总计31个病例和7例死亡与这些爆发有关。所述病毒以德国马尔堡(所述爆发之一的地点)被命名为马尔堡病毒(MARV)。在初次爆发之后，所述病毒消失并且直到1975年才重新出现，当时最有可能在津巴布韦暴露的旅行者在南非约翰内斯堡生病；所述旅行者的旅伴和护士也被感染。自那时以来已鉴别了马尔堡出血热(MHF)的一些散发病例，但所述疾病仍然相对罕见。
第二种丝状病毒埃博拉病毒(EBOV)在1976年首次鉴别，当时在扎伊尔北部(现在是刚果民主共和国)和苏丹南部发生了埃博拉出血热(EHF)的两次爆发。所述爆发涉及病毒，所述病毒最终被证明是两种不同种类的埃博拉病毒，所述病毒以发现它们的国家命名。两种病毒均被证明是高度致命的，其中在扎伊尔的90％的病例和在苏丹的50％的病例导致死亡。自1976年以来，埃博拉病毒在非洲偶发性地出现，其中在1976年与1979年之间证实了一些小型至中型爆发，并且在1994年与1996年之间在加蓬再次发生。埃博拉HF的较大流行在1995年在扎伊尔基奎特发生并且在2000年在乌干达古卢发生。
似乎丝状病毒在一种或多种非人动物中从正在进行的生命周期传播至人。尽管许多尝试定位埃博拉病毒和马尔堡病毒的一个或多个天然储库，但它们的起源仍然是神秘的。因此，尚不清楚病毒如何从其天然储库传播至人。然而，一旦人已被感染，进一步感染就通过人至人传播而发生。具体地说，传播涉及受感染个体或其体液与另一个人之间的密切个人接触。在由丝状病毒感染引起的出血热的记录爆发期间，照顾(即喂食、洗涤、加药)受感染的个体或与受感染的个体非常密切地工作的人尤其处于被感染的风险。通过与感染的体液接触(即，通过再使用未灭菌的注射器、针或被这些流体污染的其他医疗设备)的医院(医院)传播也一直是疾病传播的重要因素。最小化未感染患者与感染患者之间的紧密接触通常减少爆发期间人中新的丝状病毒感染的数量。虽然丝状病毒已在实验室中展示通过小颗粒气溶胶感染的一些能力，但尚未清楚地证明人中的空气传播。
迄今已鉴别了5种埃博拉病毒株，并且以其首次出现的地点命名：本迪布焦(Bundibugyo)(BEBOV)、象牙海岸(EBOV-CdI，也称为Tai森林病毒或TAFV)、雷斯顿(Reston)(EBOV-雷斯顿)、苏丹(SEBOV)和扎伊尔(ZEBOV)；扎伊尔、苏丹和本迪布焦病毒株通常参与人的发病和死亡。埃博拉-雷斯顿是不会在人中引起严重疾病的唯一已知的丝状病毒，但是它在猴子中可能是致命的。迄今已鉴别了几种马尔堡病毒株，其中穆索科(Musoke)病毒株具有最高的致死率。参见图1。
在结构上，丝状病毒病毒粒子可以几种形状出现，包括长的、有时分枝的细丝，以及形状像“6”、字母“U”或圆形的较短细丝。病毒丝可在长度上测量达14微米(μm)，具有80纳米(nm)的均匀直径，并且被包封在脂质膜中。每个病毒粒子包含长度大约19千碱基对(kb)的一个单链负义RNA分子，其含有处于以下顺序的七个顺序排列的基因：核蛋白(NP)、病毒粒子蛋白35(VP35)、病毒粒子蛋白40(VP40)、包膜糖蛋白(GP)、病毒粒子蛋白30(VP30)、病毒粒子蛋白24(VP24)和RNA引导的RNA聚合酶蛋白(L)。在进入宿主细胞细胞质时，RNA被转录以产生编码蛋白质的聚腺苷酸化的亚基因组mRNA物质。转录和翻译导致七种结构多肽的合成，假定每种不同的丝状病毒具有相同的功能。四种蛋白质(NP、VP30、VP35和L)与核衣壳复合物中的病毒基因组RNA相关。三种其余的结构蛋白是膜相关的；GP是I型跨膜蛋白，而VP24和VP40可能位于膜的内侧上。包膜糖蛋白(GP)作为包含三个异源二聚体拷贝的同源三聚体(也称为“病毒包膜粒(peplomer)”)出现在病毒包膜中。异源二聚体包含通过弗林蛋白酶裂解产生的称为“GP1”和“GP2”的全长GP前体(称为“GP0”)的两个片段。GP1和GP2通过二硫键连接。非结构分泌型糖蛋白(sGP)由EBOV而不是MARV表达(H.Feldmann和M.P.Kiley,Curr.Top.Microbiol.Immunol.235:1-21(1999))。新的病毒颗粒通过从宿主细胞表面出芽而产生(见下文)。
丝状病毒生命周期开始于病毒粒子附着至特异性细胞表面受体，接着病毒粒子包膜与细胞膜融合和病毒核衣壳释放到细胞质中。病毒RNA引导的RNA聚合酶(RNAP，也称为“L”蛋白)部分地脱去核衣壳并且将基因转录成正链mRNA，其然后被翻译成结构和非结构蛋白。参见图2。RNAP结合至位于基因组的3’端的单个启动子。转录在基因后终止或继续至下游的下一个基因，从而意味着接近基因组的3’端的基因以最大丰度转录，而朝向基因组的5’端的那些基因最不可能被转录。基因顺序因此是一种简单但有效的转录调控形式。所产生的最丰富的蛋白质是核蛋白(NP)，其细胞浓度决定RNAP何时从基因转录转换至基因组复制。复制产生全长正链反基因组，所述反基因组进而转录成负链病毒后代基因组拷贝。新合成的结构蛋白和基因组自组装并且积聚在细胞膜内部附近。当病毒颗粒从受感染的宿主细胞出芽时，所述病毒颗粒被包封，从而产生成熟的感染性病毒粒子。
先前疫苗开发
已经在尝试开发能够诱导针对被一种或多种丝状病毒物种感染的保护性免疫的安全的免疫原性疫苗的尝试中评价了许多策略，具有明确的混合结果。综述总结于Marzi和Feldmann中(A.Marzi和H.Feldmann Expert Rev.Vaccines 13(4):521-531(2014))。例如，虽然包含三种DNA质粒(一种表达来自ZEBOV的包膜糖蛋白，第二种表达来自SEBOV的包膜糖蛋白，并且第三种表达来自ZEBOV的核蛋白)的混合物的三价DNA疫苗是安全的、免疫原性的并且能够诱导针对人中的三种抗原中的至少一种的抗体应答。在少于1/3的疫苗接种的群体中检测到CD8+T细胞应答(J.E.Martin等人,Clin.Vaccine Immunol.13(11):1267-1277(2006))。类似地，包含表达来自ZEBOV、SEBOV、马尔堡-Ci67(病毒株Ratayczak)、马尔堡-穆索科(Marburg-Musoke)和马尔堡-Ravn的包膜糖蛋白以及来自ZEBOV和马尔堡-穆索科的核蛋白的四种不同重组腺病毒的混合物的基于复合五价腺病毒的“泛-丝状病毒”保护非人灵长类动物免受ZEBOV或MARV攻击并诱导针对两种类型的病毒的抗体应答，但是尚不清楚疫苗是否诱导任何CD8+T细胞应答(D.L.Swenson等人,Clin.Vaccine Immunol.15(3):460-467(2008))。
鼻内施用重组副粘病毒-表达来自ZEBOV的包膜糖蛋白或包膜糖蛋白和核蛋白两者的人副流感病毒血清型3(HPIV3)保护豚鼠免于随后的EBOV攻击。啮齿动物模型通常很少预测灵长类动物中的结果，其中在啮齿动物中有效的许多先前EBOV疫苗候选物在非人灵长类动物中完全失效(A.Bukreyev等人,J.Virol.80(5):2267-2279(2006))。鼻内施用表达来自猕猴中的ZEBOV的包膜糖蛋白或包膜糖蛋白和核蛋白二者的重组HPIV3显示，表达所述包膜糖蛋白的任何构建体是适度免疫原性的并且在用ZEBOV疫苗接种后攻击之后保护多于80％的动物免受疾病(A.Bukreyev等人,J.Virol.81(12):6379-6388(2007))。最后，其中VSV糖蛋白被ZEBOV包膜糖蛋白替代的重组水泡性口炎病毒(VSV)在另外一致的致死感染后迟至24小时处理之后保护50％的豚鼠、100％的小鼠。八只恒河猴中的四只(50％)在暴露后20至30分钟处理时收到保护，从而为埃博拉病毒感染提供暴露后治疗选择(H.Feldmann,PLoS Pathogens 3(1):54-61(2007))。
Geisbert等人评价了已保护小鼠或豚鼠免受非人灵长类动物中的致命EBOV感染的疫苗策略的作用。他们使用来源于表达EBOV糖蛋白和核蛋白的委内瑞拉马科病毒(VEEV)、表达EBOV糖蛋白的重组痘苗病毒(VACV)的减毒株的RNA复制子颗粒、含有脂质A和灭活的EBOV的脂质体以及浓缩的灭活的全病毒粒子制剂。他们发现这些策略都没有成功地保护非人灵长类动物免受EBOV的强烈攻击(T.H Geisbert等人,Emerging InfectiousDiseases 8(3):503-507(2002))。
其他人已经使用在哺乳动物、细菌、植物或昆虫细胞中表达的病毒样颗粒(VLP)作为非复制亚单位疫苗(D.L.Swenson等人,Vaccine23:3033-3042(2005)；K.L.Warfield等人,JID 196(2):430-437(2007)；N.Kushnir等人,Vaccine 31(1):58-83(2012)；K.L.Warfield等人,PLOS ONE 10(3):e0118881(2015)；K.L.Warfield和M.J.Aman JID204:1053-1059(2011)；V.M.Wahl-Jensen等人,J Virol.79(16):10442-10450(2005)；WO 2003/039477；WO 2006/046963；WO2006/073422；WO 2004/042001；US 8,900,595；US 7,211,378)来诱导抗体应答。然而，丝状病毒VLP需要成本密集的和挑战性的生产过程，并且需要随时间推移在环境温度下储存。
因此，在花费相当多的时间和努力之后，在临床前阶段出现了一些有希望的疫苗候选物，但是目前没有批准的预防性疫苗可供使用。鉴于丝状病毒感染的传播性和致死性，迫切需要有效的疫苗。
发明概述
在本发明中发现，复制缺陷型载体和不可复制型载体的各种初免-加强组合产生针对丝状病毒感染的有效免疫保护。
因此，本发明的一个总体方面涉及一种组合疫苗，其包含：
a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体(vector)，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体(carrier)；以及
b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体，所述禽痘载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
在另一方面，本发明涉及一种组合疫苗，其包含：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
在另一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体，所述禽痘载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
在另一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗和/或预防丝状病毒引起的疾病的重组修饰的痘苗病毒(MVA)载体，所述载体包含编码丝状病毒蛋白的两个或更多个抗原决定簇的核苷酸序列。在另一方面，本发明涉及一种用于治疗和/或预防丝状病毒引起的疾病的重组MVA载体，所述载体包含编码丝状病毒糖蛋白的抗原蛋白且编码丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及一种包含选自由以下组成的组的核苷酸序列的重组MVA载体：a)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:30，b)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30，以及c)SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:33。在某一方面，本发明涉及包含所述重组MVA载体的组合物，包含所述重组MVA载体的疫苗，包含所述重组MVA载体和药物载体、稀释剂和/或添加剂的药物，以及包含所述重组MVA载体的细胞。在某一方面，本发明涉及所述重组MVA载体用作用于治疗和/或预防受试者的丝状病毒引起的疾病的药剂或疫苗，以及影响受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用所述重组MVA载体。在另一方面，本发明涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括在第一小瓶或容器中用于第一次施用(初免)和在第二小瓶或容器中用于第二次施用(加强)的所述重组MVA载体。
本发明还涉及一种重组FPV载体，其包含在具有SEQ ID NO:26的FPV-40K启动子控制下编码丝状病毒蛋白(例如，如上文或下文提及的任何丝状病毒蛋白，优选丝状病毒包膜糖蛋白)的至少一个抗原决定簇的核苷酸序列。在另一方面，本发明涉及一种用于治疗和/或预防丝状病毒引起的疾病的重组禽痘病毒(FPV)载体，所述载体包含编码丝状病毒蛋白的一个、两个或更多个抗原决定簇的核苷酸序列。在某一方面，本发明涉及包含所述重组FPV载体的组合物，包含所述重组FPV载体的疫苗，包含所述重组FPV载体和药物载体、稀释剂和/或添加剂的药物，以及包含所述重组FPV载体的细胞。在某一方面，本发明涉及所述重组FPV载体用作用于治疗和/或预防受试者的丝状病毒引起的疾病的药剂或疫苗，以及影响受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用所述重组FPV载体。
在另一方面，本发明涉及一种组合疫苗，其包含：
(a)免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)免疫有效量的禽痘载体，所述禽痘载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述载体中的一种是初免疫苗并且另一种载体是加强疫苗。
在另一方面，本发明涉及一种组合疫苗，其包含：
(a)免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)免疫有效量的一种或多种另外的MVA载体，所述一种或多种另外的MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述MVA载体中的一种是初免疫苗并且另一种MVA载体是加强疫苗。
在另一方面，本发明涉及一种组合疫苗，其包含：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的核酸；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的核酸；
或
(c)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的核酸；以及
(d)第二组合物，其包含免疫有效量的FPV载体，所述FPV载体包含编码丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的核酸；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
在另一方面，本发明涉及一种在受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体，所述禽痘载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
在另一方面，本发明涉及一种在受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
本发明还涉及一种产生用于治疗和/或预防丝状病毒引起的疾病的重组MVA载体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用MVA病毒感染宿主细胞，
(b)用包含至少一个核苷酸序列的重组载体转染所述感染的细胞，所述核苷酸序列编码本发明的任何实施方案的任何丝状病毒蛋白的抗原决定簇，所述核酸序列还包含能够引导所述至少一个核苷酸序列整合至MVA病毒基因组中的基因组MVA病毒序列，以及
(c)鉴别、分离且任选地纯化所述产生的重组MVA病毒。
在另一个实施方案中，产生以上实施方案中的任一个的重组MVA载体的方法的步骤a)和b)可改变以使得步骤b)是第一步骤并且步骤a)是第二步骤。
本发明还涉及一种产生用于治疗和/或预防丝状病毒引起的疾病的重组FPV载体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用FPV病毒感染宿主细胞，
(b)用包含至少一个核苷酸序列的重组载体转染所述感染的细胞，所述核苷酸序列编码本发明的任何实施方案的任何丝状病毒蛋白的抗原决定簇，所述核酸序列还包含能够引导所述至少一个核苷酸序列整合至FPV病毒基因组中的基因组FPV病毒序列，以及
(c)鉴别、分离且任选地纯化所述产生的重组FPV病毒。
在另一个实施方案中，产生以上实施方案中的任一个的重组FPV载体的方法的步骤a)和b)可改变以使得步骤b)是第一步骤并且步骤a)是第二步骤。
在另一方面，本发明涉及一种在受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的核酸；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的核酸；
或
(c)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的核酸；以及
(d)第二组合物，其包含免疫有效量的FPV载体，所述FPV载体包含编码丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的核酸
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
在另一方面，本发明涉及一种在受试者中提供保护性免疫或保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体，所述禽痘载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
在另一方面，本发明涉及一种在受试者中提供保护性免疫或保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
在另一方面，本发明涉及一种用于在受试者中产生丝状病毒样颗粒的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒糖蛋白的抗原蛋白和丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)免疫有效量的禽痘载体或MVA载体，所述禽痘载体或MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述载体中的一种是初免疫苗并且另一种载体是加强疫苗。
在另一方面，本发明涉及一种用于在受试者中产生丝状病毒样颗粒的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒糖蛋白的抗原蛋白和丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体或MVA载体，所述禽痘载体或MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
在另一方面，本发明涉及一种在受试者中诱导针对丝状病毒的增强的免疫应答的方法，所述方法包括通过向所述受试者施用以下各项来在所述受试者中产生丝状病毒样颗粒：
(a)免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒糖蛋白的抗原蛋白和丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)免疫有效量的禽痘载体或MVA载体，所述禽痘载体或MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述载体中的一种是初免疫苗并且另一种载体是加强疫苗。
在另一方面，本发明涉及一种在受试者中诱导针对丝状病毒的增强的免疫应答的方法，所述方法包括通过向所述受试者施用以下各项来在所述受试者中产生丝状病毒样颗粒：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒糖蛋白的抗原蛋白和丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体或MVA载体，所述禽痘载体或MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
附图简述
并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图说明本发明的若干实施方案，并且与描述一起用于解释本发明的原理。
图1示出描绘各种鉴别的丝状病毒株之间的关系的系统发生树。使用包膜糖蛋白(GP)基因的编码区和最大简约法构建所述树。马尔堡病毒的Ravn病毒株和Ratayczak病毒株具有23％致死率，而穆索科病毒株和安哥拉(Angola)病毒株具有50％至88％范围内的致死率。苏丹株具有41％-65％致死率，并且扎伊尔病毒株具有57％-90％致死率。科特迪瓦(Cote d'lvoire)病毒株和雷斯顿病毒株尚未在人中引起疾病，但雷斯顿已在猪中引起疾病。
图2示出丝状病毒基因组的结构和遗传组构。
图3A示出MVA-mBN252B的结构和遗传组构。图3B示出MVA-mBN226B的结构和遗传组构。图3C示出包含选择标记的MVA-mBN254A的结构和遗传组构。图3D示出包含选择标记的MVA-mBN368A的结构和遗传组构。
图4A示出质粒pBNX186的结构和遗传组构。侧翼1(F1 IGR88/89)和侧翼2(F2 IGR88/89)是围绕IGR 88/89的MVA-BN的序列。F1 IGR 88/89和F2 IGR 88/89用于在同源重组事件中将表达盒和选择盒(NPT II和eGFP)插入到MVA-BN中。将大肠杆菌药物选择基因新霉素磷酸转移酶(NPT II)和增强的绿色荧光蛋白(eGFP)通过内部核糖体进入位点(IRES)连接并且在强合成痘病毒启动子(PrS)控制下插入以便允许选择重组病毒。IGR 88/89的F2和F2重复序列侧接选择盒，从而能够在选择性压力不存在下通过同源重组除去选择盒。
图4B示出质粒pBNX197的结构和遗传组构。侧翼1(F1 IGR148/149)和侧翼2(F2IGR 148/149)是围绕IGR 148/149的MVA-BN的序列。F1 IGR 148/149和F2 IGR 148/149用于在同源重组事件中将表达盒和选择盒(GPT和RFP)插入到MVA-BN中。将大肠杆菌鸟嘌呤-黄嘌呤-磷酸核糖基-转移酶药物选择基因(GPT)和红色荧光蛋白基因(RFP)在强合成痘病毒启动子(PrS)控制下作为融合基因插入以便允许选择重组病毒。LoxP序列侧接选择盒，从而实现所述选择盒的Cre重组酶介导的除去。图4C示出质粒pBN274的结构和遗传组构，所述质粒pBN274表达Cre重组酶。图4D示出质粒pBNX221的结构和遗传组构。侧翼1(F1 IGRBamHI J禽痘)和侧翼2(F2 IGR BamHIJ禽痘)是围绕插入位点BamHI J的FPV的序列。F1 IGRBamHI J禽痘和F2 IGR BamHI J禽痘用于在同源重组事件中将表达盒和选择盒(GPT和RFP)插入到FPV中。将大肠杆菌鸟嘌呤-黄嘌呤-磷酸核糖基-转移酶药物选择基因(GPT)和红色荧光蛋白基因(RFP)在强合成痘病毒启动子(PrS)控制下作为融合基因插入以便允许选择重组病毒。LoxP序列侧接选择盒，从而实现所述选择盒的Cre重组酶介导的除去。图4E示出质粒pBNX214的结构和遗传组构。侧翼1(F1 IGR 148/149)和侧翼2(F2 IGR 148/149)是围绕IGR 148/149的MVA-BN的序列。F1 IGR 148/149和F2 IGR 148/149用于在同源重组事件中将表达盒和选择盒(GPT和RFP)插入到MVA-BN中。pBNX214已经包括PrS5E启动子以用于表达转基因。将大肠杆菌鸟嘌呤-黄嘌呤-磷酸核糖基-转移酶药物选择基因(GPT)和红色荧光蛋白基因(RFP)在强合成痘病毒启动子(PrS)控制下作为融合基因插入以便允许选择重组病毒。LoxP序列侧接选择盒，从而实现所述选择盒的Cre重组酶介导的除去。
图5A示出质粒pBN433的结构和遗传组构。将GP-MARV-穆索科在启动子PrS控制下插入到pBNX197的BspEI/NheI位点中。此外，所述质粒还包含侧接MVA-BN基因组的IGR 148/149的MVA-BN DNA序列和loxP侧接的选择盒。所述loxP位点允许通过Cre重组酶介导的重组随后消除选择盒。图5B示出质粒pBN384的结构和遗传组构。将埃博拉病毒扎伊尔-梅菱噶(Ebola virus Zaire-Mayinga)的糖蛋白基因(GP-ZEBOV-梅菱噶)和马尔堡病毒穆索科(Marburg virus Musoke)的糖蛋白基因(GP-MARV-穆索科)在启动子Pr7.5和PrS控制下插入到pBNX197的MluI/NheI位点中。此外，所述质粒还包含侧接MVA-BN基因组的IGR 148/149的MVA-BN DNA序列和loxP侧接的选择盒。所述loxP位点允许通过CRE重组酶介导的重组随后消除选择盒。图5C示出质粒pBN385的结构和遗传组构。将埃博拉病毒苏丹的糖蛋白基因(GP-SEBOV)和埃博拉病毒象牙海岸的核蛋白(NP-EBOV-CdI)在合成启动子PrS和PrLE1控制下插入到pBNX186的MluI/NheI位点中。此外，所述质粒还包含侧接MVA-BN基因组的IGR148/149的MVA-BN DNA序列和由F2和F2rpt侧接的选择盒以便允许在选择性压力不存在下通过同源重组随后消除选择盒。图5D示出质粒pBN436的结构和遗传组构。将埃博拉病毒扎伊尔-梅菱噶的糖蛋白基因(GP-ZEBOV-梅菱噶)在PrS5E启动子控制下插入到pBNX214的BspEI/NotI位点中。此外，所述质粒还包含侧接MVA-BN基因组的IGR 148/149的MVA-BN DNA序列和loxP侧接的选择盒。所述loxP位点允许通过Cre重组酶介导的重组随后消除选择盒。图5E示出质粒pBN555的结构和遗传组构。将埃博拉病毒扎伊尔-梅菱噶的糖蛋白基因(GP-ZEBOV-梅菱噶)在FPV-40K启动子控制下插入到pBNX221的MluI/NotI位点中。此外，所述质粒还包含侧接FPV基因组的插入位点BamHI J的FPV DNA序列和loxP侧接的选择盒。所述loxP位点允许通过Cre重组酶介导的重组随后消除选择盒。
图6示出在用MVA-BN-Filo(MVA-mBN226B)疫苗接种后，食蟹猴中针对GP的抗体的水平，如通过ELISA所测量。将动物用MVA-BN-Filo相隔四周疫苗接种两次(在第-42天和第-14天)，并且在时间间隔处抽取血液以用于通过ELISA分析：在疫苗接种之前(第-42天，红色曲线(1))，在第一次疫苗接种之后但在第二次疫苗接种之前(第-14天，绿色曲线(2))，以及在第二次疫苗接种之后(第-5天，橙色曲线(3))。左侧的曲线图示出血清中的马尔堡GP特异性抗体，中间的曲线图示出血清中的埃博拉扎伊尔GP特异性抗体，并且右侧的曲线图示出血清中的埃博拉苏丹GP特异性抗体。来自用马尔堡安哥拉GP(左图)、埃博拉扎伊尔GP(中间图)或埃博拉苏丹GP(右图)免疫的食蟹猴的超免疫血清在每一ELISA中用作阳性对照。
图7示出在用MARV-穆索科攻击后，用MVA-BN-Filo(MVA-mBN226B)疫苗接种的结果。图7A示出用MVA-BN-Filo疫苗接种保护100％的动物免于MARV-穆索科攻击。图7B示出攻击后临床得分；用MARV-穆索科攻击的疫苗接种的动物未显示与出血热相关的症状或组织学变化，并且在肝、脾、肾上腺、淋巴结或肺中没有病毒。
图8示出在异源MVA/FPV免疫之后的抗体和CD8 T细胞应答。将H-2Kk+B6CBA F1小鼠在第0天和第21天用5×107TCID50MVA-ZEBOV-GP(MVA；MVA-mBN354A，参见图3C)或FPV-ZEBOV-GP(FPV；FPVmBN368A，参见图3D)皮下免疫。A)在第21天和第41天将小鼠放血以用于抗体分析。示出ZEBOV-GP特异性抗体的平均浓度+/-SEM。B)在第41天，将小鼠杀死并且在用GP577-584肽再刺激之后通过流式细胞术对脾进行分析。示出CD107a+、IFN-γ+和TNF-α+CD8 T细胞的绝对数目/脾×104+/-SEM。rMVA＝重组MVA-ZEBOV-GP(MVA-mBN254)；rFPV＝重组FPV-ZEBOV-GP(FPV-mBN368)。
图9示出在用MVA/FPV免疫(皮下)小鼠之后的ZEBOV-GP特异性CD8 T细胞应答。示出CD107a+、IFN-γ+和TNF-α+CD8 T细胞的绝对数目/脾×104+/-SEM。1：MVA-mBN254/FPV-mBN368；2：MVA-mBN226/FPV-mBN368；3：MVA-mBN255/FPV-mBN368。
图10示出食蟹猴的ZEBOV-GP特异性抗体，所述食蟹猴根据实施例6在研究第0天和第28天接受用5×108TCID50(n＝3)剂量下的MVA-BN-ZEBOV/GP(MVA-mBN254)、用5×108TCID50(n＝3)剂量下的MVA-BN-ZEBOV/GP-VP40(MVA-mBN255)初免-加强疫苗接种。结果被呈现为几何平均浓度(ng/ml)连同平均值的标准误差(SEM)。
图11示出食蟹猴的中和抗体应答，所述食蟹猴在研究第0天、第28天和接受用5×108TCID50(n＝2)剂量的MVA-BN-ZEBOV/GP或用MVA-BN-ZEBOV/GP-VP40(5×108TCID50，n＝2)的三次疫苗接种。另外的动物(n＝2)在研究第0天和第56天接受TBS作为阴性对照。通过ZEBOV-GP特异性假病毒粒子中和测定对血清进行分析。结果被呈现为中和80％的表达ZEBOV-GP的VSV的个体抗体滴度。
图12:A和B)示出用MVA-BN-ZEBOV/GP-VP40(MVA-mBN255)感染的HeLa细胞中丝状病毒样颗粒的形成。A，B)MVA-BN-ZEB OV/GP-VP40(VLP)和MVA wt感染的HeLa细胞的透射电子显微术(TEM)分析。将HeLa细胞用MVA-BN-ZEBOV/GP-VP40(A)或BAC来源的MVA-wt(B)以10的MOI感染，并且产生薄切片且进行加工以用于TEM。箭头：通过MVA-BN-ZEBOV/GP-VP40产生的VLP的横切面。C)示出Hela细胞中GP和VP40的(共)表达的免疫印迹分析。D)示出来自用MVA-BN-ZEBOV/GP-VP40以10的MOI感染2天的H eLa细胞的上清液(如在C中所示的相同上清液的等分部分)的免疫沉淀物的免疫印迹。VP40和GP仅能够在完整VLP中共沉淀(如果存在)，但在用Triton-X-100(1％)破坏VLP之后不能。166：MVA-mB N166，254：MVA-mBN254，255：MVA-mBN255。
图13示出某些重组MVA/FPV构建体的结构。
发明详述
本发明人已经发现包含重组修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)的疫苗提供能够诱导足以赋予对马尔堡病毒以及对天花的保护性免疫的细胞应答和体液应答两者的丝状病毒疫苗，所述重组修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)包含编码马尔堡病毒(MARV)糖蛋白(GP)的抗原决定簇的异源核苷酸序列。将编码埃博拉病毒扎伊尔(ZEBOV)糖蛋白(GP)、埃博拉病毒苏丹(SEBOV)糖蛋白(GP)和/或EBOV核蛋白(NP)的抗原决定簇的另外异源核苷酸序列插入重组MVA中产生能够诱导针对MARV和EBOV二者、且甚至针对MARV和/或EBOV的多种病毒株的免疫应答的多价疫苗，所述多种病毒株例如像苏丹埃博拉病毒(SEBOV)和扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)，其为与致死形式的埃博拉出血热相关的两种类型。因此，包含编码EBOV GP的抗原决定簇的核苷酸序列的重组MVA载体揭示针对埃博拉病毒株的非常好的免疫应答。此外，MVA及其衍生物(例如，MVA-BN)的优异安全性概况以及其适应多种异源核苷酸序列的能力使得能够产生安全的单组分多价泛丝状病毒疫苗，这与处于早期开发阶段的许多多组分疫苗(参见下文)形成对照。
鉴于产生针对丝状病毒、特别是在非人灵长类动物中产生针对MARV和EBOV的免疫应答的现有技术尝试失败的事实，本发明出人意料。从现有技术中所教导和所实现的无法预期基于MVA的疫苗将产生免疫应答，所述免疫应答在非人灵长类动物中赋予针对丝状病毒感染、特别是针对MARV的保护。当然，从本发明人及其观察结果产生的数据来看，得出基于MVA的疫苗也将在人中诱导免疫应答的结论是非常合理和似乎可信的。的确，FDA接受非人灵长类动物模型作为在这些非人灵长类动物中赋予保护的疫苗同样适合于人的证据。
本发明人还发现包含重组修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)与重组修饰的FPV的组合的疫苗接种方案提供能够诱导足以赋予保护性免疫的细胞应答和体液应答两者的丝状病毒疫苗，所述重组修饰的痘苗病毒安卡拉包含编码EBOV(例如像苏丹埃博拉病毒(SEBOV)和/或扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV))的抗原决定簇的异源核苷酸序列，所述重组修饰的FPV包含编码EBOV(例如苏丹埃博拉病毒(SEBOV)和/或扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV))的抗原决定簇的异源核苷酸序列。
在为本发明的基础的研究中，还发现使用包含编码至少一种丝状病毒亚型的抗原蛋白、特别是丝状病毒糖蛋白的核酸的MVA载体以及包含至少一种编码第一禽痘病毒糖蛋白的抗原蛋白的核酸的禽痘载体作为异源初免和加强通过诱导高水平的抗体应答和达5倍更高的细胞毒性CD8 T细胞应答而产生针对丝状病毒免疫原的保护性免疫应答，特别是其中MVA载体用作至少一种初免组合物且禽痘用作增强组合物。
重组MVA和/或FPV可以是单价的，即仅包含一个编码EBOV的抗原决定簇的异源序列；或多价的，即包含至少两个编码EBOV的抗原决定簇的异源序列。
因此，本发明提供用于产生赋予针对至少两种丝状病毒亚型、特别是马尔堡病毒亚型和/或埃博拉病毒亚型的感染的双重保护或交叉保护的免疫应答的疫苗或疫苗组合，以及可用于制造针对至少两种丝状病毒亚型、特别是马尔堡病毒亚型和/或埃博拉病毒亚型的疫苗的疫苗或疫苗组合。因此，可提供针对诸如埃博拉扎伊尔-梅菱噶和扎伊尔-基奎特(Zaire-Kikwit)和/或马尔堡-穆索科和马尔堡-安哥拉的丝状病毒的交叉保护的疫苗。现在还首次发现，用表达某些抗原(诸如ZEBOV的VP40蛋白)的MVA载体连同编码丝状病毒、特别是ZEBOV的至少一种表面糖蛋白的其他异源核苷酸序列免疫可产生丝状病毒样颗粒，例如在其表面上含有丝状病毒糖蛋白的埃博拉病毒样颗粒。这是出人意料的，因为据报道丝状病毒GP转运至细胞表面在很大程度上被MVA抑制(
Figure BDA0002961398000000211
等人J.Virol.Meth.81,29-35(2001))。然而，因为丝状病毒颗粒出芽发生在细胞表面(Noda等人,PLoS Pathog.2(9):e99(2006))，所以有效GP表面转运是形成含GP的丝状病毒-VLP所需要的。在为本发明的基础的研究中，表达丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)和糖蛋白(例如能够产生VLP的GP-ZEBOV-梅菱噶)的重组MVA，用各种初免-加强组合诱导增强的免疫应答并且保护非人灵长类动物免于丝状病毒感染。所进行的研究还可表明，仅基于表达丝状病毒糖蛋白和丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)蛋白质的重组MVA的同源初免-加强在非人灵长类动物中保护免受丝状病毒感染。
已进一步发现，使用包含编码至少一种丝状病毒亚型的抗原糖蛋白、特别是马尔堡病毒和/或埃博拉病毒的糖蛋白的核酸以及编码病毒粒子蛋白40(VP40)的抗原蛋白的核酸的MVA载体与包含编码第一丝状病毒糖蛋白的抗原蛋白的至少一种核酸的禽痘载体作为异源初免加强产生增强的CD8 T细胞应答。进一步发现，使用包含编码至少一种丝状病毒亚型的抗原糖蛋白、特别是埃博拉病毒的糖蛋白的核酸和编码病毒粒子蛋白40(VP40)的抗原蛋白的核酸的MVA载体在非人灵长类动物中(例如已经在初免后)诱导更高的中和抗体应答(其在加强后进一步提高)并且因此产生针对一种或多种丝状病毒感染、特别是扎伊尔-梅菱噶和扎伊尔-基奎特的免疫应答。还已经表明，用表达某些抗原(诸如丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40))连同丝状病毒糖蛋白的MVA载体免疫可产生表达丝状病毒包膜糖蛋白的VPL，所述丝状病毒包膜糖蛋白内衬类似完整丝状病毒病毒粒子的VLP的整个表面。以这种方式，将编码丝状病毒VP40蛋白的核酸并入MVA载体中显示增强表达一种或多种抗原蛋白的病毒载体、特别是MVA载体的免疫应答。
现在将详细参考本发明的示例性实施方案，所述示例性实施方案的实例在附图中示出。
重组MVA病毒
一方面，本发明提供一种重组修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)，其包含编码丝状病毒糖蛋白(GP)、特别是包膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。另一方面，本发明提供一种重组MVA载体，其包含编码丝状病毒糖蛋白、特别是包膜糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列和编码另一种丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。已经通过在真皮痘苗病毒株安卡拉(绒毛膜尿囊痘苗病毒安卡拉病毒，CVA；关于综述，参见Mayr等人(1975),Infection 3:6-14)的鸡胚胎成纤维细胞上的超过570次连续传代产生了MVA，所述MVA维持在土耳其安卡拉的疫苗接种研究所多年并用作人疫苗接种的基础。然而，由于通常发生与痘苗病毒相关的严重疫苗接种后并发症，曾经多次试图产生更加减毒、更安全的天花疫苗。
在1960至1974年期间，Anton Mayr教授通过在CEF细胞中的超过570次连续传代而成功地将CVA减毒(Mayr等人(1975))。在各种动物模型中显示所得MVA是无毒性的(Mayr,A.和Danner,K.(1978),Dev.Biol.Stand.41:225-234)。作为作为预天花疫苗的MVA的早期开发的一部分，在处于来自痘苗的不良反应的风险下的受试者中，存在使用MVA-517与ListerElstree(Stickl(1974),Prev.Med.3:97-101；Stickl和Hochstein-Mintzel(1971),Munch.Med.Wochenschr.113:1149-1153)的组合的临床试验。在1976年，在德国，来源于MVA-571种子储备(对应于第571次传代)的MVA作为两阶段胃肠外天花疫苗接种程序中的初免疫苗(primer vaccine)加以注册。随后，MVA-572在大约120,000名高加索人个体中使用，大部分儿童在1与3岁之间，并且未报道严重副作用，虽然许多受试者处于具有与痘苗相关的并发症高风险的群体之中(Mayr等人(1978),Zentralbl.Bacteriol.(B)167:375-390)。MVA-572作为ECACC V94012707寄存于欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection ofAnimal Cell Cultures)。
由于传代用于将MVA减毒，所以取决于在CEF细胞中进行的传代数目，存在许多不同病毒株或分离物。例如，MVA-572在天花根除程序期间在德国作为预疫苗(pre-vaccine)以较小剂量使用，并且MVA-575广泛用作兽医疫苗。与祖CVA病毒相比，MVA以及MVA-BN缺少大约13％(来自六个区的26.6kb)的基因组。所述缺失影响许多毒力和宿主范围基因，以及A型包涵体的基因。MVA-575于2000年12月7日在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)以登录号V00120707寄存。通过CVA在原代鸡胚胎成纤维细胞上的连续繁殖(超过570次传代)，获得减毒的CVA-病毒MVA(修饰的痘苗病毒安卡拉)。
虽然Mayr等人证明在20世纪70年代期间，MVA在人和哺乳动物中是高度减毒和无毒性的，但是某些研究者已经报道MVA在哺乳动物和人细胞系中未完全减毒，因为残余复制可能在这些细胞中发生(Blanchard等人(1998),J.Gen.Virol.79:1159-1167；Carroll和Moss(1997),Virology 238:198-211；美国专利号5,185,146；Ambrosini等人(1999),J.Neurosci.Res.55:569)。假定在这些出版物中报道的结果已用各种已知的MVA病毒株获得，因为所使用的病毒在它们的性质、特别是在它们在各种细胞系中的生长行为方面基本上不同。出于各种原因，包括与用于人相关的安全性考虑，这种残余复制是不期望的。
具有用于开发更安全产品(诸如疫苗或药物)的增强的安全性概况的MVA病毒株已经由Bavarian Nordic开发：MVA由Bavarian Nordic进一步传代并且被称为MVA-BN。MVA-BN的代表性和优选样品在2000年8月30日在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)以登录号V00083008寄存。MVA-BN在WO 02/42480(US 2003/0206926)和WO03/048184(US 2006/0159699)中进行了进一步描述，所述专利两者以引用的方式并入本文。
MVA-BN可连接并且进入人细胞，其中病毒编码的基因非常有效地表达。MVA-BN强烈适于原代鸡胚胎成纤维细胞(CEF)，并且不在人细胞中复制。在人细胞中，表达病毒基因，并且不产生感染性病毒。根据美国疾病控制和预防中心，MVA-BN被分类为生物安全1级生物体。MVA-BN和衍生物的制剂已被施用至许多类型的动物，和超过2000名人受试者，包括免疫缺陷个体。所有疫苗接种已经证明总体上安全并良好耐受。尽管它的高度减毒和减少的毒力，但在临床前研究中，MVA-BN已被证明引起对痘苗和对由克隆至MVA基因组中的基因编码的异源基因产物的体液和细胞免疫应答(E.Harrer等人(2005),Antivir.Ther.10(2):285-300；A.Cosma等人(2003),Vaccine 22(1):21-9；M.Di Nicola等人(2003),Hum.GeneTher.14(14):1347-1360；M.Di Nicola等人(2004),Clin.Cancer Res.,10(16):5381-5390)。
MVA的“衍生物”或“变体”是指表现出与如本文所述的MVA基本上相同的复制特征、但在其基因组的一个或多个部分中表现出差异的病毒。MVA-BN以及MVA-BN的衍生物或变体在人和小鼠中(即使在严重免疫抑制的小鼠中也)未能体内繁殖性复制。更具体地说，MVA-BN或MVA-BN的衍生物或变体还优选具有在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)中繁殖性复制的能力，但不具有在人角质形成细胞细胞系HaCaT(Boukamp等人(1988),J.Cell Biol.106:761-771)、人骨骨肉瘤细胞系143B(ECACC寄存编号91112502)、人胚肾细胞系293(ECACC寄存编号85120602)和人子宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC寄存编号CCL-2)中繁殖性复制的能力。另外，MVA-BN的衍生物或变体在Hela细胞和HaCaT细胞系中具有比MVA-575小至少2倍、更优选小3倍的病毒扩增率。用于MVA变体的这些性质的测试和测定描述于WO02/42480(US 2003/0206926)和WO03/048184(US2006/0159699)中。
术语“不能繁殖性复制”或“无繁殖性复制能力”例如描述于WO 02/42480中，其还教导如何获得具有如上所述的所需性质的MVA。所述术语适用于使用WO 02/42480或美国专利号6,761,893中所描述的测定在感染之后4天具有小于1的病毒扩增率的病毒。
术语“未能繁殖性复制”是指在感染后4天具有小于1的病毒扩增率的病毒。在WO02/42480或美国专利号6,761,893中描述的测定适用于测定病毒扩增率。
病毒的扩增或复制通常被表述为从感染细胞产生的病毒(输出)与最初用于首先感染细胞的量(输入)的比率，其被称为“扩增率”。“1”的扩增率定义其中从感染细胞产生的病毒的量与最初用于感染细胞的量相同的扩增状态，从而意味着所述感染细胞容许病毒感染和繁殖。相比之下，小于1的扩增率(即与输入水平相比输出减少)表明缺乏繁殖性复制，且因此所述病毒减毒。
基于MVA的疫苗的优点包括它们的安全性概况以及大规模疫苗生产的可用性。临床前测试已揭示，与其他MVA病毒株相比，MVA-BN展示极好的减毒和功效(WO 02/42480)。MVA-BN毒株的另外性质是在与DNA初免/痘苗病毒加强方案相比时，在痘苗病毒初免/痘苗病毒加强方案中诱导基本上相同水平的免疫力。
重组MVA-BN病毒(本文最优选的实施方案)由于它们在哺乳动物细胞中的不同复制缺陷及其良好建立的无毒性而被认为是安全的。此外，除了其功效之外，工业规模制造的可行性可以是有益的。此外，基于MVA的疫苗可递送多种异源抗原，并允许同时诱导体液和细胞免疫。
在一个优选的实施方案中，用于产生重组病毒的任何实施方案的重组MVA载体是MVA-BN病毒或衍生物，所述衍生物在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)细胞中具有体外繁殖性复制能力，但是没有在人角质形成细胞细胞系HaCat、人骨骨肉瘤细胞系143B、人胚肾细胞系293和人子宫颈腺癌细胞系HeLa中的繁殖性复制能力。
在另一个实施方案中，用于产生重组病毒的任何实施方案的重组MVA载体是如在欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)以登录号V00083008寄存的MVA-BN。
用于本发明的MVA载体可使用本领域中已知的方法来制备，诸如在WO02/042480和WO02/24224中描述的那些方法，所述专利两者以引用的方式并入本文。
另一方面，适于产生重组病毒的MVA病毒株可以是病毒株MVA-572、MVA-575或任何类似的减毒MVA病毒株。还合适的可以是突变型MVA，诸如缺失的绒毛膜尿囊痘苗病毒安卡拉(dCVA)。dCVA包含MVA基因组的del I、del II、del III、del IV、del V和del VI缺失位点。所述位点特别适用于插入多个异源序列。dCVA可在人细胞系(诸如人293、143B和MRC-5细胞系)中繁殖性复制(具有大于10的扩增率)，其然后能够通过进一步突变进行优化，所述突变适用于基于病毒的疫苗接种策略(参见WO2011/092029)。
重组FPV
一方面，本发明提供一种重组FPV，其包含编码丝状病毒糖蛋白(GP)、特别是包膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。另一方面，本发明提供一种重组FPV，其包含编码丝状病毒糖蛋白、特别是包膜糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列和编码另一种丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。
根据本发明的FPV是禽痘病毒属内的原型物种。描述了多种FPV病毒株并且可例如从CEVA Laboratories、Cynamid Webster、Fort Dodge、Intercontinental Laboratories、Intervet(NOBILIS VARIOLE)、Merial(DIFTOSEC CT病毒株)、Schering-Plough、SelectLaboratories、Solvay、Syntro-Zeon和Vineland Laboratories获得。FP1是经修饰以用作一日龄鸡中的疫苗的Duvette病毒株。所述病毒株是1980年10月指定为0DCEP 25/CEP67/2309的商业禽痘病毒疫苗株且可从Institute Merieux,Inc获得。FP5是可从美国威斯康星州麦迪逊的美国科学实验室(American Scientific Laboratories)(Schering公司的部分)获得的鸡胚胎起源的商业禽痘病毒疫苗株，兽医执照编号165，序列号30321。禽痘病毒的各种减毒病毒株是已知的，诸如可从澳大利亚Cyanamid Websters PtY,Ltd获得的FPV M(温和疫苗株)和FPV S(标准疫苗株)。美国农业部(USDA)攻击病毒株已由C.L.Afonso等人,J.Virol.74(8):3815-3831(2000),74(8):3815-3831(2000)进一步描述。FP9是在20世纪80年代晚期由Tomeley、Binns、Boursnell和Brown在IAH Houghton Laboratories(St Ives,UK)获得的用于疫苗目的的禽痘病毒株。其来源于已在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)培养物中从HP1传代438次的病毒的噬斑纯化(A.Mayr和K.Malicki(1966),Zentralbl Veterinarmed(B)13:1–13,Skinner等人(2005),Expert Res.Vaccines4(1):63-76)。其他减毒病毒株是POXVAC-TC，如描述于S.Jenkins等人(1991),Aids Research and Human Retroviruses 7(12):991:998中。寄存的病毒株涵盖例如禽痘病毒
Figure BDA0002961398000000281
VR-229(在1928年之前在新泽西州来自鸡的鸡冠的典型禽痘痂)和禽痘病毒
Figure BDA0002961398000000282
VR-250(鸡，肯塔基州，1950)。
另一方面，适于产生重组病毒的FPV病毒株可以是上文提及的任何病毒株或任何类似的FPV病毒株。另一方面，所述FPV选自以下的组：FP1、FP5、FP9、FPV M、FPV S、
Figure BDA0002961398000000283
VR-229、
Figure BDA0002961398000000284
VR-250、USDA病毒株和POXVAC-TC。在另一实施方案中，任何实施方案的FPV是减毒FPV。
FPV的优点是病毒仅仅在禽类物种中引起疾病，但是能够进入哺乳动物细胞且在哺乳动物细胞中表达转基因，同时与痘苗病毒在免疫学上不交叉反应，并且因此能够逃避在经历天花的人中预先存在的免疫性。
适于产生重组FPV的重组FPV载体可通过公认的方法来构建。活减毒禽痘病毒可通过病毒在禽类细胞中的多次传代来产生。FPV载体的制备描述于例如Michael J.P.Lawman和Patricia D.Lawman(编)Cancer Vaccines:Method and Protocols,Methods inMolecular Biology,第1139卷,第32章Paul M.Howley,Kerrilyn R.Diener和JohnD.Hayball第407-427页中。用于基于病毒的疫苗接种策略的重组FPV的产生还描述于EP0284416B1、WO 88/02022、WO 89/03429、WO89/03879、WO89/07644、WO 89/12684、WO 90/02191、WO 91/02072、WO 89/03879和WO 94/019014中。基因组序列和基因组组构已由Afonso等人以及Laidlaw和Skinner(C.L.Afonso等人(2000),J.Virol.74(8):3815-3831；S.M.Laidlaw和M.A.Skinner(2004),Journal of General Virology 85:305-322)进行了描述。FPV的示例性基因组序列可在GenBank登录号AF198100.1中找到。
抗原决定簇
术语“抗原决定簇”是指刺激宿主免疫系统以产生抗原特异性免疫应答(无论是细胞应答还是体液抗体应答)的任何分子。抗原决定簇可包括仍然在宿主中引起免疫应答并形成抗原的一部分的蛋白质、多肽、抗原蛋白片段、抗原和表位，蛋白质、多肽和抗原蛋白片段、抗原以及表位的同源物或变体，例如糖基化蛋白、多肽、抗原蛋白片段、抗原和表位以及编码此类分子的核苷酸序列。因此，蛋白质、多肽、抗原蛋白片段、抗原和表位不限于特定的天然核苷酸或氨基酸序列，而是涵盖与天然序列相同的序列以及对天然序列的修饰，诸如缺失、添加、插入和取代。
术语“表位”是指抗原上的针对其B细胞和/或T细胞单独地或与另一种蛋白质例如像主要组织相容性复合体(“MHC”)蛋白质或T细胞受体结合而应答的位点。表位可从通过蛋白质的二级和/或三级折叠并置的连续氨基酸或不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常在独特空间构象中包括至少5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸-但通常少于20个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和2维核磁共振。参见例如，“Epitope Mapping Protocols”in Methods in Molecular Biology,第66卷,GlennE.Morris,Ed(1996)。
优选地，同源物或变体在核苷酸或氨基酸序列水平上与参考蛋白质、多肽、抗原蛋白片段、抗原和表位具有至少约50％、至少约60％或65％、至少约70％或75％、至少约80％、81％、82％、83％、84％，85％、86％、87％、88％或89％，更通常至少约90％、91％、92％、93％或94％，且甚至更通常至少约95％、96％、97％、98％或99％，最通常至少约99％同一性。
用于确定核酸和氨基酸之间的序列同一性的技术是本领域已知的。两个或更多个序列可通过确定它们的“同一性百分比”进行比较。两个序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配的数目除以较短序列的长度且乘以100。
关于本文所述的蛋白质、多肽、抗原蛋白片段、抗原和表位的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并且在必要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考序列(即，其所来源于的蛋白质、多肽、抗原蛋白片段、抗原或表位)中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的所进行的比对可以本领域技术范围内的各种方式获得，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上获得最大比对所需的任何算法。
加以必要的变更，同样适用于“核苷酸序列同一性百分比(％)”。
例如，用于核酸序列的适当比对由Smith和Waterman,(1981),Advances inApplied Mathematics 2:482-489的局部同源性算法提供。通过使用由Dayhoff,Atlas ofProtein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff编,5增刊.3:353-358,NationalBiomedical Research Fou ndation,Washington,D.C.,USA开发且由Gribskov(1986),Nucl.Ac ids Res.14(6):6745-6763加以标准化的计分矩阵，此算法可应用于氨基酸序列。用以确定序列同一性百分比的这个算法的示例性执行程序由Genetics Computer Group(Madison,Wis.)在“BestFit”实用程序中提供。用于这种方法的默认参数描述于威斯康星序列分析程序包手册(Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual)，第8版(1995)(可从Genetics Computer Group,Madison,Wis.获得)中。在本发明的背景下建立同一性百分比的优选方法是使用由爱丁堡大学(Univ ersity of Edinburgh)版权保护、由John F.Collins和Shane S.Sturro k开发且由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,California)分售的M PSRCH软件包。从这组软件包，可采用Smith-Waterman算法，其中默认参数用于评分表(例如，空位开放罚分为12，空位延伸罚分为1，空位为6)。从所产生的数据，“匹配”值反映“序列同一性”。用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的其他合适程序通常是本领域中已知的，例如另一比对程序是使用默认参数的BLAST。例如，BLAST N和BLASTP可使用以下默认参数来加以使用：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两者；截断＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序依据＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DD BJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详情可在下列网址找到：http://wvw.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
在一些实施方案中，异源核酸编码抗原结构域或抗原蛋白片段，而不是完整抗原蛋白。这些片段可具有足以为抗原性或免疫原性的任何长度。片段可以是至少8个氨基酸长，优选10-20个氨基酸，但可以更长，例如像至少50、100、200、500、600、800、1000、1200、1600、2000个氨基酸长，或者之间的任何长度。
在一些实施方案中，将编码抗原蛋白片段或其免疫原性多肽的至少一个核酸片段插入本发明的病毒载体中。在另一个实施方案中，将编码不同抗原蛋白的约2-6种不同核酸插入一种或多种病毒载体中。在一些实施方案中，可使用各种蛋白质的多个免疫原性片段或亚基。例如，可从载体表达来自单一蛋白质的不同位点或来自相同病毒株的不同蛋白质或来自不同病毒株的蛋白质直向同源物的若干不同表位。
定义
必须注意的是，除非上下文明确指明，否则如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“抗原决定簇”包括一个或多个抗原决定簇，并且提及“所述方法”包括提及本领域的普通技术人员已知的等效步骤和方法，其可修改或替代本文所述的方法。
除非另外指出，否则在一系列要素之前的术语“至少”应被理解为是指所述系列中的每一种要素。本领域普通技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等效方案。所述等效物意图由本发明涵盖。
贯穿本说明书和以下的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”和诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变化形式应理解为暗示包括所陈述的整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。当在本文使用时，术语“包含(comprising)”可被术语“含有(containing)”或“包括(including)”替代，或有时当在本文使用时被术语“具有(having)”替代。任何前述术语(包含、含有、包括、具有)，在本发明的方面或实施方案的背景下无论何时在本文使用都可被术语“由…组成”，但是不太优选。
当在本文使用时，“由…组成”排除了在权利要求要素中未规定的任何要素、步骤或成分。当在本文使用时，“基本上由…组成”不排除不实质性地影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。
如本文所用，多个所叙述要素之间的连接词“和/或”被理解为包括单独选项和组合选项。例如，当两个要素通过“和/或”连接时，第一选项是指在无第二要素的情况下第一要素的适用性。第二选项是指在无第一要素的情况下第二个要素的适用性。第三选项是指第一要素和第二要素一起的适用性。这些选项中的任一个被理解为落入所述含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一个选项的并发适用性也被理解为落入所述含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
本说明书的正文中引用了多个文献。无论在上文还是下文，本文引用的文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的规范、说明书等)中的每一个特此以引用的方式整体并入。在以引用的方式并入的材料与本说明书相矛盾或不一致的程度上，本说明书将优先于任何这种材料。本文中的任何内容均不应被理解为承认由于先前发明而使本发明无权享有这种公开内容的优先权。
在本发明的丝状病毒抗原蛋白的背景下，术语“基本上相似”指示多肽在10-20个氨基酸的比较窗内包含与参考序列的至少90％、优选至少95％同一性的序列。序列同一性百分比通过在比较窗上比较两个最优比对的序列来确定，其中比较窗中的多核苷酸序列的部分可相较于参考序列(其不包含添加或缺失)包含添加或缺失(即空位)以用于两个序列的最优比对。通过如下方法计算所述百分比：确定两个序列中的相同核酸碱基或氨基酸残基所在的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗中的总位置数并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。
本文中的术语“亚型”可用“物种”替代。它包括任何丝状病毒如马尔堡病毒或埃博拉病毒的病毒株、分离物、分化枝或变体。术语“病毒株”、“分化枝”或“分离物”是从业人员所熟知的技术术语，是指微生物的分类学。分类系统将所有迄今为止表征的微生物分类为科、属、种、病毒株的分级顺序(Fields Virology,由Fields B.N.,Lippincott-RavenPublishers编著,第4版2001)。科的成员的标准是它们的系统发生关系，属包括所有具有共同特征的成员，并且种被定义为构成复制谱系并占据特定生态位的多原则分类。术语“病毒株”或“分化枝”描述微生物(即病毒)，其具有共同特征，如基本形态学或基因组结构和组构，但是在生物学性质如宿主范围、组织向性、地理分布、减毒或致病性方面变化。例如，已知存在五种埃博拉病毒亚型，即扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒、雷斯顿埃博拉病毒、本迪布焦埃博拉病毒和象牙海岸埃博拉病毒。扎伊尔埃博拉病毒株是例如扎伊尔-梅菱噶、扎伊尔-基奎特、扎伊尔-加蓬(Zaire-Gabon)(1994)、扎伊尔-加蓬(1996年2月)、扎伊尔-加蓬(1996年10月)。目前已知仅存在一种马尔堡病毒亚型或物种，即维多利亚湖马尔堡病毒，其中所述病毒株包括马尔堡-穆索科和马尔堡-安哥拉。对于其他病毒株或分离物，还参见图1。
术语“TCID50”是“组织培养感染剂量”的缩写，所述剂量为在50％的接种细胞培养物中将产生病理学变化的致病因子的量，表示为TCID50/ml。用于确定TCID50的方法是本领域的技术人员熟知的。其例如描述于例如WO 03/053463的实施例2中。
如本文所用的术语“受试者”是活的多细胞脊椎动物生物体，包括例如人、非人哺乳动物和(非人)灵长类动物。术语“受试者”可与本文的术语“动物”互换使用。
在任何实施方案中提及的术语“丝状病毒引起的疾病”可以是由如本文提及的任何丝状病毒株、分离物或其变体的感染或任何丝状病毒株、分离物或变体的任何组合(如在上文或下文的任何地方和/或在上文或下文的任何实施方案中所提及)引起的任何疾病。
如本文所用，当关于针对丝状病毒的免疫应答诸如抗体应答(例如，中和抗原特异性抗体应答或ZEBOV-GP特异性抗体应答)、细胞因子应答或CD8 T细胞应答(例如，免疫显性CD8 T细胞应答)使用时术语“增强的”是指相对于从施用MVA载体的同源初免-加强组合疫苗的动物观察到的相应免疫应答，施用MVA的同源初免-加强组合疫苗的动物中的免疫应答的增加，其中所述MVA载体不表达任何丝状病毒病毒粒子蛋白40，或者是指相对于从施用根据本发明的MVA载体和FPV载体的异源初免-加强组合疫苗的动物观察到的相应免疫应答，施用根据本发明的MVA载体和FPV载体的异源初免-加强组合疫苗的动物中的免疫应答的增加，其中所述MVA载体不表达任何丝状病毒病毒粒子蛋白40。优选地，当关于免疫应答诸如抗体应答(例如，中和抗体应答、细胞因子应答或CD8 T细胞应答)使用时，“增强的”是指相对于从施用反向初免-加强组合的动物观察到的相应免疫应答，施用根据本发明的作为初免的MVA的异源初免-加强组合疫苗和作为加强的FPV载体的动物中的免疫应答的增加，其中所述FPV载体被提供作为初免，并且所述MVA载体被提供来增强免疫应答，使用相同初免-加强间隔。
在本发明的背景下，“免疫显性CD8 T细胞应答”意指宿主针对由MVA和/或FPV载体编码的重组抗原的主要CD8 T细胞应答。因此，可产生针对由重组MVA的同源初免-加强或重组MVA和FPV的异源初免-加强编码的重组抗原的免疫显性CD8 T细胞应答，其大于针对重组MVA或FPV的任何重组抗原的CD8 T细胞应答，其中所述MVA载体不表达任何丝状病毒病毒粒子蛋白40。
CD8 T细胞应答的水平可通过本领域中熟知的方法来测定，如但不限于ELISPOT测定(例如，干扰素γ(IFN-γ)ELISPOT。方案例如描述于Current Protocols in Immunology(John Wiley和Son,Inc.(1994)(参见例如，第6章,第19节:ELISPOPT Assay to DetectCytokine-secreting Murine and Human Cells,增刊10)或Schneider,等人,Nat.Med.4:397–402(1998))中，并且例如由实施例中针对本发明的特定病毒列出的技术描述。其他合适的测定包括ICS测定，其分析CD8 T细胞活性的细胞内细胞因子水平。例如，CD8 T细胞应答可包含多于动物受试者中的总抗原特异性T细胞应答的50％，诸如51％、60％、70％、80％、90％或100％的抗原特异性CD8 T细胞应答。优选地，CD8 T细胞应答还代表动物受试者中的总细胞因子应答的0.1％或更多，诸如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或更多。在一些实施方案中，在第二次或第三次加强后，根据本发明的重组病毒载体在宿主中诱导针对编码抗原的CD8 T细胞应答，其为总CD8 T细胞区室的至少0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％或30％。
抗体应答的水平可通过本领域中已知的方法来测定。任何合适的噬斑减少中和滴度(PRNT)测定可用于确定多肽(或表达这种多肽的多核苷酸)是否诱导针对一种或多种丝状病毒亚型的一种或多种丝状病毒抗原的一种或多种中和抗体。在实施例中描述了针对丝状病毒的示例性噬斑减少中和滴度测定。其他PRNT方法和形式是本领域的普通技术人员熟知的。
丝状病毒蛋白
如本文可互换使用的，术语“糖蛋白基因”或“GP基因”是指在任何丝状病毒株或分离物中编码糖蛋白、特别是跨膜包膜糖蛋白的基因或所述基因的同源物或变体，但是糖蛋白基因的精确序列和/或基因组位置可能在病毒株或分离物之间不同。例如，在SEBOV的马莱奥(Maleo)株(SEBOV-马莱奥)中，糖蛋白基因(GP-SEBOV-马莱奥基因)包含如在GenBank登录号U23069.1中编号的核苷酸120-1004和1004-2149(包括端点)。EBOV转录物在转录期间经历编辑，以使得一些核苷酸被读取两次。GP-SEBOV-马莱奥基因还包含编码开放阅读框(ORF)的蛋白质，其跨越如在GenBank登录号U23069.1中编号的核苷酸120-1004和1004-2149(包括端点)。GP-SEBOV-马莱奥基因的核苷酸序列在SEQ ID NO:1(GenBank登录号U23069.1)中列出。
如本文所用，“同源物”或“变体”优选地与参考基因、蛋白质、多肽、抗原蛋白片段、抗原和表位具有至少约50％、至少约60％或65％、至少约70％或75％、至少约80％、81％、82％、83％、84％，85％、86％、87％、88％或89％，更通常至少约90％、91％、92％、93％或94％，且甚至更通常至少约95％、96％、97％、98％或99％，最通常至少约99％核苷酸序列同一性。术语“同源物”或“变体”还分别涵盖基因和蛋白质的缺失、截短或以另外的方式突变的型式。作为举例，涵盖例如缺乏全长GP-EBOV或GP-MARV蛋白质的信号肽以及跨膜和/或细胞质结构域的GP-EBOV或GP-MARV蛋白质的可溶形式。
如本文可互换使用的，术语“糖蛋白”或“GP”是指糖蛋白，特别是跨膜包膜糖蛋白，或是指糖蛋白的同源物或变体。
GP-EBOV-马莱奥的氨基酸序列在SEQ ID NO:2(GenBank登录号U23069.1的氨基酸序列)中列出。GP-SEBOV-马莱奥蛋白质包含信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域(参见例如，UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q66798)。GP-SEBOV-马莱奥蛋白质的信号肽由SEQ ID NO:2的氨基酸1-32组成；GP-SEBOV-马莱奥蛋白质的细胞外结构域由SEQ ID NO:2的氨基酸33-650或SEQ ID NO:2的氨基酸1-650组成；GP-SEBOV-马莱奥蛋白质的跨膜结构域由SEQ ID NO:2的氨基酸651-671组成；并且GP-SEBOV-马莱奥蛋白质的细胞质结构域由SEQ ID NO:2的氨基酸672-676组成。
编码GP-ZEBOV-梅菱噶的氨基酸序列的核酸在SEQ ID NO:19中列出。GP-ZEBOV-梅菱噶包含如在SEQ ID NO:20(GenBank登录号ABX75367.1)中列出的蛋白质。
同样，如本文可互换使用的，术语“核蛋白基因”或“NP基因”也是指在任何丝状病毒株或分离物中编码核蛋白的基因或所述基因的同源物或变体，但是核蛋白基因的精确序列和/或基因组位置也可能在病毒株或分离物之间不同。例如，在SEBOV的博尼费斯(Boniface)株(SEBOV-博尼费斯)中，核蛋白基因(NP-SEBOV-博尼费斯基因)包含如在GenBank登录号AF173836.1中编号的核苷酸383-2599(包括端点)。NP-SEBOV-博尼费斯基因还包含编码开放阅读框(ORF)的蛋白质，其跨越如在GenBank登录号AF173836.1中编号的核苷酸383-2599(包括端点)。NP-SEBOV-博尼费斯基因的核苷酸序列在SEQ ID NO:3(GenBank登录号AF173836.1)中列出。
NP-EBOV-博尼费斯的氨基酸序列在SEQ ID NO:4(GenBank登录号AF173836.1的氨基酸序列)中列出。NP-SEBOV-博尼费斯蛋白质包含卷曲螺旋结构域(参见例如，UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9QP77)。NP-SEBOV-博尼费斯蛋白质的卷曲螺旋结构域由SEQ ID NO:4的氨基酸334-363组成。
在某些实施方案中，编码抗原决定簇、优选抗原蛋白、更优选如上文或下文提及的任何蛋白质的核酸是全长蛋白。
重组MVA和FPV
本文提供包含并入痘病毒(例如，MVA或MVA-BN或FPV)基因组中的多个插入位点中的来源于EBOV和/或MARV的异源或外来核酸序列的重组痘病毒(例如，MVA或MVA-BN或FPV)。所述异源核酸可编码一种或多种外来蛋白质和/或外来抗原，包括例如病毒抗原。
一般来说，如本文所述的“重组”MVA或FPV是指通过标准遗传工程化方法产生的MVA/FPV，即本发明的MVA/FPV因此是遗传工程化的或遗传修饰的MVA/FPC。因此，术语“重组MVA或FPV”包括在其基因组中具有稳定整合的重组核酸(优选呈转录单位形式)的MVA/FPV。转录单位可包括启动子、增强子、终止子和/或沉默子。本发明的重组MVA/FPV可在调控元件诱导后表达异源抗原决定簇、多肽或蛋白质(抗原)。在本发明的任何实施方案的背景下，术语“MVA/FPV”涵盖MVA、FPV或MVA和FPV的单独选项和组合选项两者。
如本文所用，“异源”基因、核酸、抗原或蛋白质应理解为不存在于野生型痘病毒基因组(例如，MVA或MVA-BN或FPV)中的核酸或氨基酸序列。本领域的技术人员了解，当存在于痘病毒如MVA或MVA-BN或FPV中时，“异源基因”以这样的方式并入痘病毒基因组中：即在将重组痘病毒施用至宿主细胞后，它被表达为相应的异源基因产物，即作为“异源抗原”和/或“异源蛋白”。表达通常通过将异源基因可操作地连接至允许在痘病毒感染的细胞中表达的调控元件来实现。优选地，调控元件包括天然或合成的痘病毒启动子。
一方面，根据本发明的重组MVA/FPV载体包含编码选自埃博拉病毒(EBOV)和/或马尔堡病毒(MARV)的丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。在另一个实施方案中，根据本发明的重组MVA/FPV载体包含编码丝状病毒蛋白(例如，EBOV蛋白)的一个或多个抗原决定簇的抗原决定簇的异源核苷酸序列，所述丝状病毒蛋白选自一种或多种EBOV亚型，所述EBOV亚型选自由以下组成的组：扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)、苏丹埃博拉病毒(SEBOV)、科特迪瓦埃博拉病毒(EBOV-CdI，也称为Tai森林病毒或TAFV)、雷斯顿埃博拉病毒(REBOV)以及本迪布焦埃博拉病毒(BEBOV)。
根据另一个实施方案，根据本发明的重组MVA/FPV载体包含选自以下的组的丝状病毒蛋白(优选EBOV蛋白、MARV蛋白或其全长蛋白)的一个或多个抗原决定簇：扎伊尔-梅菱噶、扎伊尔-基奎特、扎伊尔-加蓬、科特迪瓦埃博拉病毒、苏丹-博尼费斯、苏丹-马莱奥、苏丹-古卢(Sudan-Gulu)、马尔堡-Ravn、马尔堡-奥佐林(Marburg-Ozolin)、马尔堡-Ratayczak、马尔堡-穆索科、马尔堡-安哥拉。
优选地，所述丝状病毒蛋白(例如，选自以下的组：扎伊尔-梅菱噶、扎伊尔-基奎特、扎伊尔-加蓬、科特迪瓦埃博拉病毒、苏丹-博尼费斯、苏丹-马莱奥、苏丹-古卢、马尔堡-Ravn、马尔堡-奥佐林、马尔堡-Ratayczak、马尔堡-穆索科、马尔堡-安哥拉)的抗原决定簇选自由以下组成的组：包膜糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、病毒粒子蛋白35(VP35)、病毒粒子蛋白40(VP40)、病毒粒子蛋白30(VP30)、病毒粒子蛋白24(VP24)以及RNA引导的RNA聚合酶蛋白(L)。
在另一个实施方案中，所述丝状病毒蛋白的抗原决定簇是包膜糖蛋白(GP)，优选至少包膜糖蛋白(GP)和病毒粒子蛋白40(VP40)。
在另一个实施方案中，所述丝状病毒蛋白的抗原决定簇是选自ZEVOV和SEBOV的组的包膜糖蛋白(GP)，优选至少包膜糖蛋白(GP)和病毒粒子蛋白40(VP40)，其中GP和VP40来源于相同病毒株，优选其中所述相同病毒株选自ZEBOV和SEBOV的组。
在另一个实施方案中，所述丝状病毒蛋白的抗原决定簇是至少包膜糖蛋白(GP)和病毒粒子蛋白40(VP40)，其中所述GP和VP40来源于不同的分离物或相同的分离物，优选其中所述不同的或相同的分离物选自以下的组：扎伊尔-梅菱噶、扎伊尔-基奎特、扎伊尔-加蓬、科特迪瓦埃博拉病毒、苏丹-博尼费斯、苏丹-马莱奥、苏丹-古卢、马尔堡-Ravn、马尔堡-奥佐林、马尔堡-Ratayczak、马尔堡-穆索科以及马尔堡-安哥拉，优选其中所述分离物选自以下的组：扎伊尔-梅菱噶、苏丹-古卢、马尔堡-穆索科和马尔堡-安哥拉，最优选其中所述分离物选自扎伊尔-梅菱噶、苏丹-古卢和马尔堡-穆索科。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的重组MVA/FPV载体包含编码两种、三种、四种或更多种埃博拉和/或马尔堡亚型的抗原决定簇的核苷酸序列。
另一个优选的实施方案涵盖根据本发明的任何实施方案的重组MVA/FPV载体，所述重组MVA/FPV载体包含选自由以下组成的组的两种、三种、四种或更多种丝状病毒蛋白的抗原决定簇：包膜糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、病毒粒子蛋白35(VP35)、病毒粒子蛋白40(VP40)、病毒粒子蛋白30(VP30)、病毒粒子蛋白24(VP24)和RNA引导的RNA聚合酶蛋白(L)。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的任何实施方案的重组MVA/FPV载体包含选自由以下组成的组的一种、两种、三种、四种或更多种丝状病毒蛋白的抗原决定簇：SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:34和SEQ ID NO:37。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的任何实施方案的重组MVA/FPV载体包含选自由以下组成的组的丝状病毒蛋白的抗原决定簇：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
在另一个实施方案中，根据本发明的任何实施方案的重组MVA/FPV载体包含由SEQID NO:20组成的丝状病毒蛋白的抗原决定簇。
在另一个实施方案中，根据本发明的任何实施方案的重组MVA/FPV载体包含选自由SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:34组成的组的丝状病毒蛋白的抗原决定簇。
在另一个实施方案中，根据本发明的任何实施方案的重组MVA/FPV载体包含选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34组成的组的丝状病毒蛋白的抗原决定簇。
在另一个实施方案中，根据本发明的任何实施方案的重组MVA/FPV载体包含选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34组成的组的丝状病毒蛋白的抗原决定簇。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的任何实施方案的重组MVA/FPV载体包含选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ IDNO:37组成的组的丝状病毒蛋白的抗原决定簇。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的任何实施方案的MVA载体包含编码丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列，所述丝状病毒蛋白由SEQ ID NO:29和/或SEQID NO:6、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:31组成。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的任何实施方案的MVA载体包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:28和/或SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:30。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的任何实施方案的MVA载体包含编码包含SEQ ID NO:33的丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)的抗原蛋白的核苷酸序列或编码包含SEQID NO:34的蛋白质序列的核苷酸序列。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的任何实施方案的重组MVA载体包含选自以下的组的核苷酸序列：a)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:30，b)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30，以及c)SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:33。
另一方面，本发明包括一种重组MVA载体或FPV载体，其包含编码丝状病毒糖蛋白、特别是丝状病毒包膜糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。
丝状病毒糖蛋白可编码GP-MARV或GP-EBOV。
对于如本文所述的实施方案，MARV的糖蛋白可来源于MARV-穆索科，优选全长MARV-穆索科，其进而可来源于MARV-穆索科的维多利亚湖病毒株或分离物。GP-MARV也可来源于MARV-Ravn MARV-奥佐林、MARV-Ratayczak或MARV-安哥拉。编码全长GP-MARV-穆索科的核苷酸序列在编码SEQ ID NO:6的氨基酸1至681或19至681的SEQ ID NO:5中示出。在一个优选实施方案中，GP-MARV-穆索科包含优选编码SEQ ID NO:6的蛋白质的SEQ ID NO:5的核苷酸序列。在某些实施方案中，GP-MARV-穆索科被截短，其中截短的GP-MARV-穆索科可仅包含包膜糖蛋白的细胞外结构域，其包含SEQ ID NO:6(GenBank登录号ABA87127.1)的氨基酸1至648或氨基酸19至648。在如本文所述的其他实施方案中，MARV的糖蛋白可来源于MARV-安哥拉，优选全长GP-MARV-安哥拉。在一个优选实施方案中，GP-MARV-安哥拉包含编码SEQ ID NO:37的氨基酸的SEQ ID NO:36的核苷酸序列。
EBOV的糖蛋白可以是GP-SEBOV或可来源于GP-ZEBOV，特别是来源于GP-ZEBOV的梅菱噶病毒株(GP-ZEBOV-梅菱噶)。全长GP-ZEBOV-梅菱噶包含编码SEQ ID NO:20的氨基酸序列的SEQ ID NO:19的核苷酸序列。在一个优选实施方案中，GP-ZEBOV-梅菱噶包含优选编码SEQ ID NO:20的蛋白质的SEQ ID NO:19的核苷酸序列。GP-EBOV还可以是GP-BEBOV、GP-EBOV-CdI或GP-EBOV-雷斯顿。GP-ZEBOV可以是截短的，并且可包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:19被修饰以编码SEQ ID NO:20的氨基酸1-636或被修饰以缺失跨越SEQ ID NO:20的氨基酸314至464的粘蛋白结构域。
GP-SEBOV可来源于GP-SEBOV的古卢病毒株(GP-SEBOV-古卢)。在某些实施方案中，GP-SEBOV包含优选编码SEQ ID NO:31的氨基酸序列的SEQ ID NO:30的核苷酸序列。
根据本发明的重组MVA/FPV还可进一步包含破伤风类毒素片段C序列。在一个优选的实施方案中，GP-MARV-穆索科，特别是全长MARV-穆索科GP还包含破伤风类毒素片段C。破伤风类毒素片段C可包含编码SEQ ID NO:8的氨基酸序列的SEQ ID NO:7的核苷酸序列。在某些实施方案中，截短的GP-MARV-穆索科还包含破伤风类毒素片段C(TTC)，其可包含编码SEQ ID NO:8的氨基酸序列的氨基酸760-1213的SEQ ID NO:7的核苷酸序列的核苷酸2281-3642。
根据本发明的重组MVA/FPV载体可另外包含免疫刺激或共刺激分子。在一个优选的实施方案中，编码GP-MARV-穆索科的抗原决定簇的异源核苷酸序列还包含一个或多个免疫刺激分子。在某些实施方案中，所述一个或多个免疫刺激分子是人CD40配体(hCD40L)，其可包含编码SEQ ID NO:10的氨基酸序列的SEQ ID NO:9。在某些实施方案中，所述一个或多个免疫刺激分子是包含人白介素-15受体(hIL15R-Sushi)的sushi结构域的融合蛋白，其可包含编码SEQ ID NO:12的氨基酸序列的SEQ ID NO:11。
所述一个或多个免疫刺激分子还可以是淋巴细胞功能相关抗原3(LFA-3，或CD58)、细胞间粘附分子1(ICAM-1，或CD54)和B7.1(CD80)，统称为共刺激分子的三联体(即，“TRICOM”)。如本文所用的“TRICOM”是由B7-1(还称为CD80)、细胞内粘附分子-1(ICAM-1。还称为CD54)和淋巴细胞功能抗原-3(LFA-3，还称为CD58)组成的共刺激分子的三联体的缩写，其包含于表达特异性抗原以便增加抗原特异性免疫应答的重组病毒载体(例如，痘病毒载体)中。TRICOM的单独组分可在相同或不同启动子的控制下，并且可被提供在具有特异性抗原的相同载体上或提供在单独的载体上。示例性载体公开于例如Hodge等人,“A Triadof Costimulatory Molecules Synergize to Amplify T-Cell Activation,”CancerRes.59:5800-5807(1999)和美国专利号7,211,432B2中，其两者以引用的方式并入本文。LFA-3可包含编码SEQ ID NO:14的氨基酸序列的SEQ ID NO:13的核苷酸序列，ICAM-1可包含编码SEQ ID NO:16的氨基酸序列的SEQ ID NO:15的核苷酸序列，并且B7.1可包含编码SEQ ID NO:18的氨基酸序列的SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
根据本发明的重组MVA/FPV还可另外包含膜锚定序列，诸如包含编码SEQ ID NO:22的氨基酸序列的SEQ ID NO:21的核苷酸序列的痘苗病毒基因B5m。具体地说，如本文所述的抗原决定子可优选地可操作地连接至膜锚诸如B5m。因此，当在本文使用时，重组MVA/FPV包含膜锚定序列，其意味着由所述重组MVA/FPV包含的抗原决定簇优选可操作地连接至膜锚。膜锚是指能够将异源多肽锚定至细胞膜的外部面的任何多肽。优选地，所述膜锚包含痘苗病毒B5R蛋白的细胞质和跨膜结构域，其在本文称为“B5R锚”或“B5m”。如所定义，B5R锚是指来自任何类型的痘苗病毒，例如WR病毒株(Katz等人J Virol.71(4):3178-87(1997))或更优选地MVA的B5R蛋白的42个氨基酸的C末端区段。此外，相对于参考B5R锚定序列具有至少80％，诸如至少85％，例如至少90％或至少95％，诸如至少98％序列同一性的B5R锚变体也包括于本发明中。优选的锚定序列在SEQ ID NO:21中示出，其翻译产物也在SEQ ID NO:22中示出。
在一个优选实施方案中，全长和/或截短GP-ZEBOV还包含痘苗病毒基因B5m。
另一方面，本发明包括一种重组MVA/FPV载体，其包含编码如上所述的丝状病毒糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列，并且还包含编码形成病毒样颗粒(VLP)所需的另外丝状病毒蛋白的异源核苷酸序列。在一个实施方案中，编码形成VLP所需的丝状病毒蛋白的另外异源核苷酸序列可以是VP40。在某些实施方案中，形成病毒样颗粒或增强VLP形成所需的另外丝状病毒蛋白是NP-EBOV和VP40-EBOV，其中这些蛋白质可来源于如上所示的病毒株。优选地，所述丝状病毒核蛋白(例如，NP-EBOV)和丝状病毒病毒粒子蛋白40(例如，VP40-EBOV)来源于相同丝状病毒株。通过用表达GP和VP40(除此之外或不表达NP)并且能够从感染细胞产生含GP的EBOV-VLP的重组MVA疫苗接种非人灵长类动物，本发明人能够在非人灵长类动物中实现针对丝状病毒攻击的保护。在被疫苗接种的动物中产生病毒样颗粒产生另外的疫苗模式，其密切模拟存在于真实丝状病毒感染中的病毒颗粒。这种重组MVA filoVLP疫苗接种刺激体液和细胞免疫应答，并且因此保护免受丝状病毒攻击。用提供丝状病毒VLP的减毒MVA疫苗接种的另一个优点是避免对纯化用于接种的病毒样颗粒和另外MVA介导的免疫刺激的需要。来源于相同病毒株的丝状病毒核蛋白(例如，NP-EBOV)和丝状病毒病毒粒子蛋白40(例如，VP40-EBOV)的使用对于增强VLP的形成，优选用于产生具有均匀直径的均匀GP刺突修饰的VLP以用于密切模拟病毒颗粒且改善针对丝状病毒感染的保护是有利的。
本发明还涉及一种重组MVA/FPV载体，其包含编码丝状病毒糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列和编码另一种丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。编码另一种丝状病毒蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列可编码一种或多种选自由以下组成的组的丝状病毒蛋白：核蛋白(NP)、病毒粒子蛋白35(VP35)、病毒粒子蛋白40(VP40)、病毒粒子蛋白30(VP30)、病毒粒子蛋白24(VP24)和RNA引导的RNA聚合酶蛋白(L)。所述基因和蛋白质分别可来源于上述一种或多种丝状病毒株。某些实施方案的NP-EBOV-CdI包含编码SEQ ID NO:29的氨基酸序列的SEQ ID NO:28的核苷酸序列。
在某些实施方案中，VP40选自MARV或EBOV，优选VP40选自一种或多种EBOV亚型，所述EBOV亚型选自由以下组成的组：扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)、苏丹埃博拉病毒(SEBOV)、科特迪瓦埃博拉病毒(EBOV-CdI，也称为Tai森林病毒或TAFV)、雷斯顿埃博拉病毒(EBOV-雷斯顿)以及本迪布焦埃博拉病毒(BEBOV)。在一个优选实施方案中，VP40选自ZEBOV、SEBOV和MARV中的一种或多种。在某些实施方案中，所述丝状病毒糖蛋白和丝状病毒VP40选自相同丝状病毒株。在另一个优选实施方案中，VP40和/或丝状病毒糖蛋白选自以下中的一种或多种：扎伊尔-梅菱噶、扎伊尔-基奎特、扎伊尔-加蓬、科特迪瓦埃博拉病毒、苏丹-博尼费斯、苏丹-马莱奥、苏丹-古卢、马尔堡-Ravn、马尔堡-奥佐林、马尔堡-Ratayczak、马尔堡-穆索科以及马尔堡-安哥拉，更优选选自扎伊尔-梅菱噶(VP40-ZEBOV-梅菱噶)、苏丹-古卢(VP40-SEBOV-古卢)、马尔堡-穆索科(VP40-MARV-穆索科)以及马尔堡-安哥拉(VP40-MARV-安哥拉)中的一种或多种。在另一实施方案中，任何实施方案的MVA载体还包含丝状病毒核蛋白(NP)，优选其中所述丝状病毒核蛋白和丝状病毒VP40来源于相同丝状病毒株。在另一实施方案中，VP40包含编码VP40-ZEBOV-梅菱噶或VP40-MARV-穆索科的核酸序列。在其他实施方案中，丝状病毒VP40包含SEQ ID NO:33的核苷酸序列。在另一实施方案中，VP40包含编码SEQ ID NO:34的蛋白质序列的核酸。在另一优选实施方案中，VP40包含编码SEQ ID NO:34的氨基酸序列的SEQ ID NO:33的核苷酸序列。
在另一优选实施方案中，重组MVA/FPV载体包含编码丝状病毒包膜糖蛋白的抗原决定簇的两个异源核苷酸序列和编码另一种丝状病毒蛋白的抗原决定簇的至少一个异源核苷酸序列。在某些实施方案中，编码丝状病毒包膜糖蛋白的抗原决定簇的第一异源核苷酸序列编码GP-MARV，并且编码丝状病毒包膜糖蛋白的抗原决定簇的第二异源核苷酸序列编码GP-EBOV。根据本发明的另一优选实施方案，重组MVA/FPV载体包含编码丝状病毒包膜糖蛋白的抗原决定簇的三个异源核苷酸序列和编码另一种丝状病毒蛋白的抗原决定簇的至少一个异源核苷酸序列。优选地，编码丝状病毒包膜糖蛋白的抗原决定簇的第一异源核苷酸序列编码GP-MARV，编码丝状病毒包膜糖蛋白的抗原决定簇的第二异源核苷酸序列编码GP-EBOV，并且编码丝状病毒包膜糖蛋白的抗原决定簇的第三异源核苷酸序列编码来源于与由第二异源核苷酸序列编码的GP-EBOV不同的EBOV病毒株或分离物的GP-EBOV。因此，编码丝状病毒包膜糖蛋白的抗原决定簇的一个异源核苷酸序列可编码GP-SEBOV-古卢和另一个GP-ZEBOV-梅菱噶。
在另一个实施方案中，重组MVA/FPV载体包含编码来自EBOV病毒株或分离物的GP-EBOV的抗原决定簇的两个异源核苷酸序列和编码来自MARV病毒株或分离物的GP-MARV的抗原决定簇的两个异源核苷酸序列，优选MARV病毒株是MARV-安哥拉和MARV-穆索科，并且EBOV病毒株是ZEBOV和/或SEBOV，优选ZEBOV-梅菱噶和SEBOV-古卢。当然，编码另一种纤维病毒蛋白的抗原决定簇的另一核苷酸序列还可编码选自由以下组成的组的丝状病毒蛋白：核蛋白(NP)、病毒粒子蛋白35(VP35)、病毒粒子蛋白40(VP40)、病毒粒子蛋白30(VP30)、病毒粒子蛋白24(VP24)和RNA引导的RNA聚合酶蛋白(L)，如已经在上文所提及，其也可来源于如已经在上文所示的不同病毒株。
根据本发明的另一优选实施方案的重组MVA/FPV载体包含编码GP-MARV和GP-EBOV的丝状病毒包膜糖蛋白的抗原决定簇的两个异源核苷酸序列和编码VP40的抗原决定簇的第三异源核苷酸序列。这种VP40可以是如上文或下文所述的VP40中的任一种。因此，编码丝状病毒包膜糖蛋白的抗原决定簇的一个异源核苷酸序列可编码GP-SEBOV-古卢，另一个异源核苷酸序列可编码GP-ZEBOV-梅菱噶，并且第三异源核苷酸序列可编码丝状病毒蛋白VP40-ZEBOV、VP40-SEBOV或VP40-MARV，优选VP40-ZEBOV-梅菱噶或VP40-MARV-穆索科的抗原决定簇。
在另一优选实施方案中，重组MVA/FPV载体包含两个异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码丝状病毒包膜糖蛋白GP-EBOV、优选GP-ZEBOV和/或GP-SEBOV、更优选GP-ZEBOV-梅菱噶和GP-SEBOV-古卢，GP-MARV、优选GP-MARV-穆索科或GP-MARV-安哥拉的一种丝状病毒包膜糖蛋白，和优选选自NP-EBOV-CdI、NP-ZEBOV和NP-MARV、优选NP-MARV-穆索科或NP-MARV-安哥拉的至少一种丝状病毒核蛋白的抗原决定簇。
进入MVA/FPV的整合位点
可将编码丝状病毒糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列(任选地还包含编码另一种丝状病毒蛋白的至少一个异源核苷酸序列)插入MVA的一个或多个基因间区(IGR)中。在某些实施方案中，IGR选自IGR07/08、IGR 44/45、IGR 64/65、IGR 88/89、IGR 136/137和IGR148/149。在某些实施方案中，重组MVA的少于5、4、3或2个IGR包含编码丝状病毒包膜糖蛋白和/或另一种丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。异源核苷酸序列可另外或可替代地插入一个或多个天然存在的缺失位点中，特别是插入MVA基因组的主缺失位点I、II、III、IV、V或VI中。在某些实施方案中，重组MVA的少于5、4、3或2个天然存在的缺失位点包含编码丝状病毒包膜糖蛋白和/或另一种丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。
包含编码丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列的MVA的插入位点的数目可以是1、2、3、4、5、6、7个或更多个。在某些实施方案中，异源核苷酸序列被插入到4、3、2个或更少插入位点中。优选地，使用两个插入位点。在某些实施方案中，使用三个插入位点。优选地，重组MVA包含插入到2或3个插入位点中的至少2、3、4、5、6或7个基因。
可将编码丝状病毒糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列(任选地还包括编码另一种丝状病毒蛋白的至少一个异源核苷酸序列)插入FPV的一个或多个基因间区(IGR)中。在一个优选实施方案中，IGR位于基因组的1.3-kbp HindIII片段的ORF 7与9之间(参见Drillien等人,Virology 160:203-209(1987)(US 5,180,675)和Spehner等人,J.Virol.64:527-533(1990))。在某些实施方案中，异源核苷酸序列可插入禽痘插入位点中，如在此以引用的方式并入的EP0538496A1和WO05/048957中所描述。本发明的还优选的禽痘插入位点是LUS插入位点、FP14插入位点和43K插入位点。这些位点有时还被称为FPN006/FPN007(LUS插入位点)、FPN254/FPN255(LUS插入位点)、FPV060/FPV061(FP14插入位点)以及FPV107/FPV108(43K插入位点)。
在一个优选的实施方案中，禽痘中的插入位点是LUS插入位点。在禽痘病毒基因组(Genbank登录号：AF 198100.1)的每个末端处存在两个长独特序列(LUS)，且因此在每个基因组中存在两个LUS插入位点。在基因组左端处的LUS插入位点位于FPV006的3'和FPV007125L的5'，优选介于如在GenBank登录号AF198100.1中注释的禽痘基因组序列中的位置7470与7475之间。在基因组右端处的LUS插入位点位于FPV254的3'和FPV255的5'，优选介于例如GenBank登录号AF198100.1的禽痘基因组序列中的位置281065与281070之间。在一个实施方案中，异源核苷酸序列可插入核苷酸位置281065和281070内的任何位置处。
在另一个优选的实施方案中，禽痘中的插入位点是FP14插入位点。所述位点位于禽痘基因组序列中FPV060的3'和FPV061的5'，优选介于例如GenBank登录号AF198100.1的禽痘基因组的位置67080与67097之间。在一个实施方案中，DNA序列的位置67080与67097之间的核苷酸在重组病毒中缺失，并且用表示目标序列的限定插入片段置换。在一个实施方案中，FP14插入位点位于例如AF198100.1的FPV060基因的直向同源物与FPV061的直向同源物之间。术语“FPV060、FPV061、FPV254”等是指如在GenBank登录号AF198100.1中所注释的从5'至3'编号的相应基因的对应编码序列(即，CDS)的位置。在一个优选的实施方案中，FP14插入位点位于禽痘基因组序列的位置67091与67092之间(也称为IGR60/61插入位点，如在GenBank登录号AF198100.1中所注释)。
在另一个优选的实施方案中，禽痘中的插入位点被指定为43K插入位点。所述位点位于禽痘基因组序列的FPV107的3'和FPV108的5'，优选在位置128178处，如在GenBank登录号AF198100.1中所注释。
在一个优选的实施方案中，整合位点是FP14(IGR60/61)和/或BamHI J区。BamH1 J区在S.Jenkins等人(1991),Aids Research and Human Retroviruses 7(12):991:998中进一步描述，其在此以引用的方式并入。
在某一实施方案中，IGR是IGR BamHI J FPV。
包含编码丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列的FPV的插入位点的数目可以是一个或两个。优选地，使用两个插入位点。在另一个优选的实施方案中，重组FPV包含插入到一个或两个插入位点中的至少1、2、3、4或5个基因。
本文提供的重组MVA/FPV病毒可通过本领域中已知的常规方法来产生。获得重组痘病毒或将外源编码序列插入痘病毒基因组中的方法是本领域的技术人员熟知的。例如，用于标准分子生物学技术如DNA的克隆、DNA和RNA分离、蛋白质印迹分析、RT-PCR和PCR扩增技术的方法描述于Molecular Cloning,A laboratory Manual(第2版)(J.Sambrook等人,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，并且用于处理和操纵病毒的技术描述于Virology Methods Manual(B.W.J.Mahy等人(编),Academic Press(1996))中。类似地，用于MVA的处理、操纵和遗传工程化的技术和专门技能描述于Molecular Virology:APractical Approach(A.J.Davison和R.M.Elliott(编),The Practical ApproachSeries,IRL Press at Oxford University Press,Oxford,UK(1993)(参见例如第9章：Expression of genes by Vaccinia virus vectors))和Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley和Son,Inc.(1998)(参见例如，第16章，第IV节：Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector))。
为了产生本文公开的各种重组MVA/FPV，可应用不同的方法。可将待插入病毒中的DNA序列置于大肠杆菌质粒构建体中，所述构建体中已插入了与MVA/FPV的DNA区段同源的DNA。单独地，待插入的DNA序列可连接至启动子。启动子-基因键联可位于质粒构建体中，以使得启动子-基因键联在两端由与侧接含有非必需基因座的MVA/FPV DNA的区域的DNA序列同源的DNA侧接。所得质粒构建体可通过在大肠杆菌细菌中繁殖进行扩增并分离。可将含有待插入的DNA基因序列的分离质粒转染到例如鸡胚胎成纤维细胞(CEF)的细胞培养物中，同时用MVA感染培养物。在所述质粒中的同源MVA DNA与病毒基因组之间重组可分别产生通过外来DNA序列的存在修饰的MVA。
根据一个优选的实施方案，可用痘病毒感染合适的细胞培养物的细胞，例如CEF细胞。随后可优选在痘病毒表达控制元件的转录控制下用包含一种或多种外来或异源基因的第一质粒载体转染感染的细胞。如上所述，质粒载体还包含能够引导外源序列插入痘病毒基因组的选定部分中的序列。任选地，质粒载体还含有包含可操作地连接至痘病毒启动子的标记和/或选择基因的盒。合适的标记或选择基因是例如编码绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、新霉素-磷酸核糖基转移酶或其他标记的基因。使用选择或标记盒简化所产生的重组痘病毒的鉴别和分离。然而，重组痘病毒也可通过PCR技术来鉴别。随后，可用如上所述获得的重组痘病毒感染另一细胞，并且用包含一种或多种第二外来或异源基因的第二载体转染。在所述基因将被引入痘病毒基因组的不同插入位点中的情况下，第二载体还在引导一种或多种第二外来基因整合至痘病毒的基因组中的痘病毒同源序列方面不同。在发生同源重组后，可分离包含两种或更多种外来或异源基因的重组病毒。为了将另外的外来基因引入重组病毒中，可通过使用在先前步骤中分离的重组病毒用于感染并且使用包含另外一种或多种外来基因的另一载体用于转染来重复感染和转染的步骤。
或者，如上所述的感染和转染步骤是可互换的，即合适的细胞可首先通过包含外来基因的质粒载体转染，且然后用痘病毒感染。作为另一种选择，还有可能将每种外来基因引入不同的病毒中，用所有获得的重组病毒共感染细胞并且筛选包含所有外来基因的重组体。第三种选择是在体外连接DNA基因组和外来序列，并且使用辅助病毒重构重组的痘苗病毒DNA基因组。第四种选择是在大肠杆菌或另一种细菌物种中在作为细菌人工染色体(BAC)克隆的痘苗病毒基因组与侧接有与位于痘苗病毒基因组中的所需整合位点侧翼的序列同源的DNA序列的线性外来序列之间同源重组。
异源丝状病毒基因的表达
编码丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列可表达为单个转录单位。例如，编码丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列可以可操作地连接至痘病毒，例如痘苗病毒启动子和/或连接至痘病毒，例如痘苗病毒转录终止子。
在某些实施方案中，“转录单位”自身插入MVA/FPV基因组中的插入位点中。在某些实施方案中，“转录单位”与其他转录单位一起插入MVA/FPV基因组中的插入位点中。“转录单位”在MVA/FPV基因组中不是天然存在的(即，它是异源的、外源的或外来的)，并且能够在感染的细胞中转录。
优选地，重组MVA/FPV包含插入到MVA/FPV基因组中的1、2、3、4、5个或更多个转录单位。在某些实施方案中，重组MVA/FPV稳定地表达编码由1、2、3、4、5个或更多个转录单位编码的丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。在某些实施方案中，重组MVA/FPV包含在MVA/FPV基因组中的1、2、3个或更多个插入位点处插入到MVA/FPV基因组中的2、3、4、5个或更多个转录单位。
在某些实施方案中，编码丝状病毒蛋白的抗原决定簇的一个、多个或所有异源核苷酸序列的表达处于一个或多个痘病毒启动子的控制下。在某些实施方案中，痘病毒启动子是Pr7.5启动子、杂合早期/晚期启动子、PrS启动子、PrS5E启动子、合成或天然早期或晚期启动子或牛痘病毒ATI启动子。合适的启动子在在此以引用的方式完全并入的WO 2010/060632、WO 2010/102822、WO 2013/189611和WO2014/063832中进一步描述。在某些实施方案中，痘病毒启动子选自由以下组成的组：PrS启动子(SEQ ID NO:23)、PrS5E启动子(SEQID NO:24)、Pr7.5(SEQ ID NO:25)、PrLE1启动子(SEQ ID NO:27)、Pr13.5长启动子(SEQ IDNO:35)和FPV-40K启动子(SEQ ID NO:26)，更优选选自由以下组成的组：PrS启动子(SEQ IDNO:23)、PrS5E启动子(SEQ ID NO:24)、Pr7.5(SEQ ID NO:25)和PrLE1启动子(SEQ ID NO:27)。
在某些实施方案中，编码丝状病毒蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列处于选自由PrS、PrLE1和Pr7.5组成的组的启动子的控制下，所述丝状病毒蛋白优选ZEBOV、SEBOV、EBOV-CdI、MARV和NP-ZEBOV蛋白，更优选GP-ZEBOV-梅菱噶、GP-SEBOV-古卢、GP-MARV和NP-ZEBOV，最优选GP-MARV-穆索科或GP-MARV-安哥拉。在一个优选的实施方案中，编码丝状病毒蛋白GP-SEBOV和GP-MARV-穆索科的抗原决定簇的核苷酸序列在PrS启动子(例如，SEQ IDNO:23)的控制下表达，NP-EBOV-CdI在PrLE1或修饰的PrLE1启动子(例如，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:32)的控制下表达，并且GP-ZEBOV-梅菱噶在Pr7.5启动子(例如，SEQ ID NO:25)的控制下表达。
在另一个优选的实施方案中，编码任何实施方案的FPV的丝状病毒蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列处于启动子的控制下，所述启动子优选包含或具有SEQ ID NO:26。
丝状病毒疫苗和药物组合物
由于本文所述的重组MVA病毒是高度复制限制性的并且因此是高度减毒的，它们是用于治疗广泛范围的哺乳动物(包括人和甚至免疫受损的人)的理想候选物。因此，本文提供用于在活动物体(包括人)中诱导免疫应答的药物组合物和疫苗。另外提供一种用于治疗和/或预防丝状病毒引起的疾病的重组MVA载体，其包含编码丝状病毒糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。
所述疫苗优选地包含以104至109TCID50/ml、105至5×108TCID50/ml、106至108TCID50/ml或107至108TCID50/ml的浓度范围在溶液中配制的本文所述的重组MVA病毒中的任一种。用于人的优选疫苗接种剂量包含介于106至109TCID50之间，包括106TCID50、107TCID50或108TCID50的剂量。
本文提供的药物组合物通常可包含一种或多种药学上可接受的和/或批准的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。此类辅助物质可以是水、盐水、甘油、乙醇、润湿或乳化剂、pH缓冲物质等。合适的载体通常是大的、缓慢代谢的分子，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。
为了制备疫苗，本文提供的重组MVA病毒可被转化成生理上可接受的形式。这可基于制备用于针对天花进行疫苗接种的痘病毒疫苗的经验来完成，如由H.Stickl等人,Dtsch.med.Wschr.99:2386-2392(1974)所描述。
例如，纯化的病毒可在-80℃下以约10mM Tris、140mM NaCl(pH 7.4)中配制的5×108TCID50/ml的滴度储存。为了制备疫苗注射剂，例如，102-108或102-109个病毒粒子可在安瓿(优选玻璃安瓿)中在2％蛋白胨和1％人白蛋白存在下，在100ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冻干。或者，疫苗注射剂可通过将制剂中的病毒逐步地冷冻干燥来产生。此制剂可含有另外添加剂，诸如甘露糖醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或适合于体内施用的其他助剂诸如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白质(例如，人血清白蛋白)。然后，将玻璃安瓿密封并且可储存在4℃与室温之间几个月。然而，只要不存在需求，则安瓿优选地储存在低于-20℃的温度下。
为了疫苗接种或治疗，冻干物可溶解于水溶液，优选地生理盐水或Tris缓冲液中，并且全身或局部，即肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、鼻内或熟练的从业者已知的任何其他施用途径来施用。施用模式、施用剂量和数量可由本领域技术人员以已知方式来优化。然而，最通常在第一次疫苗接种注射之后约一个月至六周，通过第二次注射来对患者进行疫苗接种。
使用同源/异源初免-加强方案的组合疫苗
本文所述的组合疫苗和方法还可用作同源初免-加强方案的一部分。在同源初免-加强中，给予第一初免接种，然后进行一次或多次后续加强疫苗接种。加强疫苗接种被配置为通过施用与在第一次疫苗接种中使用的相同重组痘病毒来加强在第一次疫苗接种中产生的免疫应答。
在一个示例性实施方案中，可使用同源初免-加强方案，其中如本文定义的MVA病毒载体以第一剂量施用。可给予如本文定义的MVA病毒载体的一次或多次后续施用以加强在第一次施用中提供的免疫应答。优选地，一个或多个抗原决定簇与第一次施用的抗原决定簇相同或相似。
根据本发明的MVA和FPV重组病毒载体也可用于异源初免-加强方案中，其中用如本文定义的MVA或FPV载体进行一个或多个初始初免疫苗接种，并且用未在初免疫苗接种中使用的痘病毒载体进行一个或多个后续加强疫苗接种，例如，如果本文定义的MVA载体在初免加强中给予，则后续加强疫苗接种将是FPV载体，反之亦然。
在一个优选的实施方案中，用MVA载体进行初免疫苗接种，并且用FPV进行加强疫苗接种。因此，本发明的一个方面涉及一种组合疫苗，其包含：
a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体，所述禽痘载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述第一组合物是初免组合物，并且所述第二组合物是加强组合物，优选其中所述加强组合物包含两个或更多个剂量的所述加强组合物的载体。
包含重组MVA和FPV病毒的疫苗和试剂盒
本文还提供包括本文所述的任何一种或多种重组FPV和/或MVA的疫苗和试剂盒。所述试剂盒可包括重组MVA或FPV的一个或多个容器或小瓶，以及用于向处于丝状病毒感染风险的受试者施用重组MVA和FPV的说明书。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，说明书指示重组MVA以单个剂量或多个(即2、3、4等)剂量施用至受试者。在某些实施方案中，说明书指示重组MVA或FPV病毒在第一次(初免)和第二次(加强)施用中施用至初次治疗的受试者或非初次治疗的受试者。优选地，试剂盒包括用于初免/加强免疫的至少两个小瓶，其包括在第一小瓶/容器中用于第一次接种(“初免接种”)以及在第二和/或另一小瓶/容器中用于至少第二次和/或第三次和/进一步接种(“加强接种”)的如本文所述的重组MVA。
在一个优选的实施方案中，本文提供的疫苗和试剂盒包括第一组合物，所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第二丝状病毒亚型、第三丝状病毒亚型或至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
在一个优选的实施方案中，本文提供的疫苗和试剂盒包括在所述第一组合物中的MVA载体，所述MVA载体包含编码选自由以下组成的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQID NO:37。
在另一实施方案中，本文提供的疫苗和试剂盒包括在所述第一组合物中的MVA载体，所述MVA载体包含编码选自具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31的组的抗原蛋白的核酸，优选包含编码选自具有SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31的组的抗原蛋白的核酸。
在另一实施方案中，本文提供的疫苗和试剂盒包括第一组合物，所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，优选其中所述四种不同的丝状病毒亚型选自具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37的组。
在另一优选的实施方案中，本文提供的疫苗和试剂盒用于产生针对至少一种丝状病毒亚型的保护性免疫应答，其中第一组合物用于引发所述免疫应答，并且第二组合物用于加强所述免疫应答；或用于产生针对至少一种丝状病毒亚型的保护性免疫应答，其中所述第二组合物用于引发所述免疫应答，并且所述第一组合物用于加强所述免疫应答。在本文提供的任何疫苗和试剂盒中，加强组合物可包含两个或更多个剂量的加强组合物的载体。
如上文先前所论述，本发明还涉及使用两种不同的非复制性病毒载体的异源疫苗接种方案。
对于异源疫苗程序，本发明提供一种组合疫苗和/或疫苗接种试剂盒，其包括：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体，所述禽痘载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
本发明还提供一种组合疫苗和/或疫苗接种试剂盒，其包括：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
在此实施方案中，所述组合疫苗和/或试剂盒包括用于初免/加强免疫的至少两个小瓶，其包括在第一小瓶/容器中用于第一次接种(“初免接种”)以及在第二和/或另一小瓶/容器中用于至少第二次和/或第三次和/进一步接种(“加强接种”)的如本文所述的重组MVA/FPV。
所述组合疫苗和/或试剂盒可包括重组MVA/FPV的多个容器或小瓶，以及用于向处于丝状病毒感染风险的受试者施用重组MVA/FPV的说明书。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，说明书指示重组MVA/FPV以单个剂量或多个(即2、3、4等)剂量施用至受试者。在某些实施方案中，说明书指示重组MVA/FPV病毒在第一次(初免)和第二次(加强)施用中施用至初次治疗的受试者或非初次治疗的受试者。
本发明的任何组合疫苗、疫苗接种试剂盒和/或任何异源疫苗程序的第一和/或第二组合物或MVA和/或FPV可包含本文所述的或如“重组MVA和FPV”下进一步定义的任何MVA和/或FPV载体及其任何组合。
在一个优选的实施方案中，如本文提供的组合疫苗包含第一组合物，所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第二丝状病毒亚型的抗原蛋白、第三丝状病毒亚型的抗原决定簇、四种丝状病毒亚型的抗原决定簇或至少四种丝状病毒亚型的抗原决定簇的核酸。
在另一个实施方案中，如本文提供的组合疫苗包含选自埃博拉病毒(EBOV)或马尔堡病毒(MARV)的丝状病毒亚型。
在另一个实施方案中，如本文提供的组合疫苗包含来自一种或多种EBOV亚型的抗原决定簇，所述EBOV亚型选自由以下组成的组：扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)、苏丹埃博拉病毒(SEBOV)、科特迪瓦埃博拉病毒(EBOV-CdI)、雷斯顿埃博拉病毒(EBOV-雷斯顿)以及本迪布焦埃博拉病毒(BEBOV)。
在另一个实施方案中，如本文提供的组合疫苗包含丝状病毒蛋白的抗原决定簇，所述丝状病毒蛋白选自由以下组成的组：包膜糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、病毒粒子蛋白35(VP35)、病毒粒子蛋白40(VP40)、病毒粒子蛋白30(VP30)、病毒粒子蛋白24(VP24)和RNA引导的RNA聚合酶蛋白(L)。
在另一优选的实施方案中，如本文提供的组合疫苗包含在所述第一组合物中的MVA载体，所述MVA载体包含编码选自由以下组成的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQID NO:37。
在另一实施方案中，本文提供的组合疫苗包含第一组合物，所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，优选其中所述四种不同的丝状病毒亚型选自具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37的组。
在另一优选的实施方案中，本文提供的组合疫苗包含第一组合物，所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码来自四种不同的丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，所述丝状病毒亚型选自具有以下的组：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29和SEQID NO:31。
在另一个实施方案中，本文提供的组合疫苗用于产生针对至少一种丝状病毒亚型，优选至少两种、更优选至少四种丝状病毒亚型的保护性免疫应答。
在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及任何实施方案的组合疫苗或重组MVA，其用作用于产生针对至少一种丝状病毒亚型、至少两种丝状病毒亚型、至少三种或至少四种丝状病毒亚型的保护性免疫应答或用于诱导针对至少一种丝状病毒亚型、至少两种丝状病毒亚型、至少三种或至少四种丝状病毒亚型的增强的免疫应答的药剂或疫苗，其中所述MVA能够在待治疗的受试者中产生丝状病毒样颗粒，优选其中所述MVA在待治疗的受试者中产生丝状病毒样颗粒。
重组MVA/FPV病毒的方法和用途
本文还提供用于在对受试者动物免疫或影响受试者的免疫应答的方法中使用的如本文所述的方法和/或任何重组MVA/FPV。还涵盖本文所述的重组MVA/FPV用于制备用以免疫受试者动物的药剂或药物，特别是用于制备用以治疗和/或预防受试者中丝状病毒引起的疾病的药剂或疫苗的用途。还提供根据本文任何实施方案的重组MVA/FPV，其用于引发或加强针对丝状病毒的免疫应答，优选其中施用一次、两次、三次或四次所述重组MVA和/或重组FPV。
本文进一步涵盖任何实施方案的疫苗组合或重组MVA，其用作用于诱导针对丝状病毒感染的增强的免疫应答的药剂或疫苗，其中所述MVA能够在待治疗的受试者中产生丝状病毒样颗粒，优选其中所述MVA在待治疗的受试者中产生丝状病毒样颗粒。还涵盖任何实施方案的疫苗组合或重组MVA，其用作用于治疗和/或预防丝状病毒疾病的药剂或疫苗，其中所述MVA能够在待治疗的受试者中产生丝状病毒样颗粒，优选其中所述MVA在待治疗的受试者中产生丝状病毒样颗粒。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种在受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体，所述禽痘载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供一种在受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且另一种组合物是加强组合物。
在另一个实施方案中，所述诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，本文所述的重组MVA/FPV用于制备用以免疫受试者动物的药剂、特别是用于制备用以治疗和/或预防受试者中丝状病毒引起的疾病的药剂或疫苗的用途，或如本文提供的用于提供针对丝状病毒感染的保护性免疫应答的任何实施方案的组合疫苗包括第一组合物，所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第二丝状病毒亚型、第三丝状病毒亚型或至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
在另一个实施方案中，所述诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，本文所述的重组MVA/FPV用于制备用以免疫受试者动物的药剂、特别是用于制备用以治疗和/或预防受试者中丝状病毒引起的疾病的药剂或疫苗的用途，或如本文提供的用于提供针对丝状病毒感染的保护性免疫应答的任何实施方案的组合疫苗包括在所述第一组合物中的MVA载体，所述MVA载体包含编码选自由以下组成的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
在另一实施方案中，所述诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，本文所述的重组MVA/FPV用于制备用以免疫受试者动物的药剂、特别是用于制备用以治疗和/或预防受试者中丝状病毒引起的疾病的药剂或疫苗的用途，或如本文提供的用于提供针对丝状病毒感染的保护性免疫应答的任何实施方案的组合疫苗包括第一组合物，所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，优选其中所述四种不同的丝状病毒亚型选自具有以下的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
在另一个实施方案中，本发明提供一种在受试者中提供针对丝状病毒感染的保护性免疫和/或保护性免疫应答的方法。在另一个实施方案中，本发明提供一种在受试者中提供针对丝状病毒感染的保护性免疫和/或保护性免疫应答的方法：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型、优选至少三种或至少四种不同的丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的FPV载体，所述FPV载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物，并且另一种组合物是加强组合物，优选其中所述第二组合物是加强组合物，优选将施用一次、两次、三次或四次。
在另一个实施方案中，任何实施方案的提供针对丝状病毒感染的保护性免疫和/或保护性免疫应答的方法包括在所述第一组合物中的MVA载体，所述MVA载体包含编码选自由以下组成的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
在另一个实施方案中，任何实施方案的提供针对丝状病毒感染的保护性免疫和/或保护性免疫应答的方法包括在所述第一组合物中的MVA载体，所述MVA载体包含编码来自四种不同的丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，所述抗原蛋白具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于产生丝状病毒样颗粒的方法或一种在受试者中诱导针对丝状病毒的增强的免疫应答的方法，所述方法包括在所述受试者中产生任何实施方案的丝状病毒样颗粒，其中丝状病毒VP40选自由以下组成的组：扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)、苏丹埃博拉病毒(SEBOV)、科特迪瓦埃博拉病毒(EBOV-CdI)、雷斯顿埃博拉病毒(EBOV-雷斯顿)以及本迪布焦埃博拉病毒(BEBOV)，优选其中所述丝状病毒VP40选自一种或多种ZEBOV、SEBOV和MARV。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于产生丝状病毒样颗粒的方法或一种在受试者中诱导针对丝状病毒的增强的免疫应答的方法，所述方法包括在所述受试者中产生任何实施方案的丝状病毒样颗粒，其中所述丝状病毒糖蛋白和所述丝状病毒VP40选自相同丝状病毒株。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于产生丝状病毒样颗粒的方法或一种在受试者中诱导针对丝状病毒的增强的免疫应答的方法，所述方法包括在所述受试者中产生任何实施方案的丝状病毒样颗粒，其中所述MVA载体还包含编码丝状病毒核蛋白(NP)的核酸，优选其中所述丝状病毒核蛋白和所述丝状病毒VP40来源于相同丝状病毒株。
在另一个实施方案中，任何上述方法的丝状病毒株选自以下的组：扎伊尔-梅菱噶、扎伊尔-基奎特、扎伊尔-加蓬、科特迪瓦埃博拉病毒、苏丹-博尼费斯、苏丹-马莱奥、苏丹-古卢、马尔堡-Ravn、马尔堡-奥佐林、马尔堡-Ratayczak、马尔堡-穆索科、马尔堡-安哥拉，优选扎伊尔-梅菱噶或科特迪瓦埃博拉病毒，优选其中所述丝状病毒VP40选自扎伊尔-梅菱噶或马尔堡-穆索科的组，更优选其中所述丝状病毒VP40包含编码SEQ ID NO:34的蛋白质序列的核酸，或其中所述编码丝状病毒VP40的抗原蛋白的核酸包含SEQ ID NO:33。
如本文所用，术语“保护性免疫”或“保护性免疫应答”意指疫苗接种的受试者能够控制针对其进行疫苗接种的致病因子的感染。通常，已经发展“保护性免疫应答”的受试者仅发展轻度至中度临床症状或根本没有症状。通常，针对某种致病因子具有“保护性免疫应答”或“保护性免疫”的受试者将不会因为感染所述致病因子而死亡。在某些实施方案中，受试者动物是哺乳动物。所哺乳动物可以是成年牛、小牛(特别是幼年小牛)、大鼠、兔、猪、小鼠，但优选人，并且所述方法包括将一定剂量的本文提供的任何一种或多种重组MVA/FPV施用至所述受试者。
在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，受试者是成人。在某些实施方案中，所述成人是免疫受损的。在某些实施方案中，所述成人的年龄超过10、15、20、25、30、25、40、45、50、55、60、65、70、75、80或85岁。在某些实施方案中，受试者的年龄小于5岁、小于3岁、小于2岁、小于15个月、小于12个月、小于9个月、小于6个月或小于3个月。在某些实施方案中，受试者的年龄为0-3个月、3-6个月、6-9个月、9-12个月、1-2岁或2-5岁。
本文提供的任何重组MVA/FPV可以以106至1010TCID50，优选106至109TCID50的剂量，例如以106至109TCID50、106至5×108TCID50、107至108TCID50、5×107TCID50至5×108TCID50、107TCID50或108TCID50的剂量施用至受试者。在某一实施方案中，所述重组MVA/FPV载体以1×108TCID50至1×1010TCID50的量施用。在另一个实施方案中，所述重组MVA/FPV以1×108TCID50至5×109的量，优选以5×108TCID50至6×109的量施用。在某些实施方案中，本文提供的任何重组MVA以107TCID50或108TCID50或5×108TCID50的剂量施用至人受试者。在某些实施方案中，本文提供的任何重组FPV以5×108、6.3×108或1×109TCID50的剂量施用至人受试者。
在另一个实施方案中，本文提供的重组MVA以低于重组FPV的剂量施用至人受试者。在某些实施方案中，本文提供的任何重组MVA/FPV在丝状病毒暴露之前，例如在丝状病毒暴露之前1周、2周、3周或4周或1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月以本文提供的任何剂量施用至受试者。在某些实施方案中，本文提供的任何重组MVA/FPV在丝状病毒暴露之后，例如在丝状病毒暴露之后1、2、3、4、5、6、7、8、9.10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时或1、2、3、4、5、6或7天以本文提供的任何剂量施用至受试者。
在某些实施方案中，本文提供的重组MVA/FPV以单个剂量或多个(即2、3、4等)剂量施用至受试者。在某些实施方案中，本文提供的重组MVA/FPV在第一(初免)和第二(加强)施用中施用。第一剂量可包含107至108TCID50的重组MVA/FPV病毒，并且第二剂量可包含107至108TCID50的重组MVA/FPV病毒。
增强组合物通常在施用所述初免组合物之后数周或数月，例如约1或2周或3周、或4周、或6周、或8周、或16周、或20周、或24周、或28周、或32周或一至两年施用一次或多次。
优选地，在初免之后1-12周或2-12周，更优选在初免之后1、2、4或8周施用初始加强接种。在一个优选的实施方案中，初始加强接种在初免之后4或8周施用。在另一优选的实施方案中，初始加强在初免之后至少2周或至少4周进行。在另一个优选的实施方案中，初始加强在初免之后4-12或4-8周进行。
本文提供的重组MVA/FPV可全身或局部施用。在某些实施方案中，胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内或鼻内，特别是皮下地施用所述重组MVA/FPV。优选地，鼻内施用所述重组MVA/FPV。在其他实施方案中，通过熟练的从业者已知的任何其他施用途径施用所述重组MVA/FPV。在另一优选的实施方案中，肌肉内施用所述重组MVA/FPV，优选地以介于约100μl至约10ml之间范围内的体积、优选含有例如约104至1010个病毒颗粒/ml的浓度肌肉内施用所述重组MVA/FPV。优选地，以介于0.25与1.0ml之间范围内的体积施用所述重组MVA/FPV载体。更优选地，以约0.5ml的体积施用所述重组MVA/FPV载体。
用于产生重组MVA/FPV载体的方法
其他实施方案包括一种用于产生本发明的任何实施方案的重组MVA载体或从所述重组MVA载体的基因组表达的抗原决定簇的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用任何实施方案的重组MVA病毒感染宿主细胞或用任何实施方案的重组MVA病毒的重组DNA转染所述细胞，优选添加用于产生MVA病毒颗粒的辅助病毒，
(b)培养所述感染的或转染的细胞，以及
(c)从所述细胞分离所述MVA病毒和/或所述抗原决定簇。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种从用于产生重组载体的方法获得的重组MVA病毒和/或抗原决定簇。
其他实施方案包括一种用于产生本发明的任何实施方案的重组FPV载体或从所述重组FPV载体的基因组表达的抗原决定簇的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用任何实施方案的重组FPV病毒感染宿主细胞或用任何实施方案的重组FPV病毒的重组DNA转染所述细胞，优选添加用于产生FPV病毒颗粒的辅助病毒，
(b)培养所述感染的或转染的细胞，以及
(c)从所述细胞分离所述FPV病毒和/或所述抗原决定簇。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种从用于产生重组载体的方法获得的重组FPV病毒和/或抗原决定簇。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种产生重组MVA载体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用MVA病毒感染宿主细胞，
(b)用包含编码任何蛋白质的抗原决定簇的至少一个核苷酸序列的重组载体转染所述感染的细胞，所述核酸序列还包含能够引导所述至少一个核苷酸序列整合至所述MVA病毒基因组中的基因组MVA病毒序列，以及
(c)鉴别、分离且任选地纯化所述产生的重组MVA病毒。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种产生重组FPV载体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用FPV病毒感染宿主细胞，
(b)用包含编码任何蛋白质的抗原决定簇的至少一个核苷酸序列的重组载体转染所述感染的细胞，所述核酸序列还包含能够引导所述至少一个核苷酸序列整合至所述FPV病毒基因组中的基因组FPV病毒序列，以及
(c)鉴别、分离且任选地纯化所述产生的重组FPV病毒。
从本文公开的本发明的说明书和实践考虑，本发明的其他实施方案对于本领域技术人员来说将是显而易见的。意图本说明书和实施例仅被认为是示例性的，并且本发明的真实范围和精神由所附权利要求书指示。
以下编号的项提供了本文所述的实施方案。
项1.一种疫苗组合，其包含
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体，所述禽痘载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且所述另一种组合物是加强组合物。
项2.一种疫苗组合，其包含
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且所述另一种组合物是加强组合物。
项3.根据项1所述的疫苗组合，其中所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第二丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
项4.根据项2-3所述的疫苗组合，其中所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第三丝状病毒亚型或第四丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
项5.如项1-4所述的疫苗组合，其中所述丝状病毒亚型选自埃博拉病毒(EBOV)或马尔堡病毒(MARV)。
项6.根据项1-5所述的疫苗组合，其中所述EBOV蛋白的所述抗原决定簇来自一种或多种EBOV亚型，所述EBOV亚型选自由以下组成的组：扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)、苏丹埃博拉病毒(SEBOV)、科特迪瓦埃博拉病毒(EBOV-CdI)、雷斯顿埃博拉病毒(EBOV-雷斯顿)以及本迪布焦埃博拉病毒(BEBOV)。
项7.根据项1-6所述的疫苗组合，其中所述丝状病毒蛋白的所述抗原决定簇选自由以下组成的组：包膜糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、病毒粒子蛋白35(VP35)、病毒粒子蛋白40(VP40)、病毒粒子蛋白30(VP30)、病毒粒子蛋白24(VP24)和RNA引导的RNA聚合酶蛋白(L)。
项8.根据项1-7所述的疫苗组合，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码选自由以下组成的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
项9.根据项1-8所述的疫苗组合，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码来自四种不同的丝状病毒亚型的选自具有以下的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31。
项10.根据项1-9所述的疫苗组合，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码来自四种不同的丝状病毒亚型的选自具有以下的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31。
项11.根据项1-10所述的疫苗组合，其用于产生针对至少一种丝状病毒亚型的保护性免疫应答，其中所述第一组合物用于引发所述免疫应答，并且所述第二组合物用于加强所述免疫应答。
项12.根据项1-10所述的疫苗组合，其用于产生针对至少一种丝状病毒亚型的保护性免疫应答，其中所述第二组合物用于引发所述免疫应答，并且所述第一组合物用于加强所述免疫应答。
项13.如项1-12所述的疫苗组合，其中所述加强组合物包含两个或更多个剂量的所述加强组合物的所述载体。
项14.一种试剂盒，其包括：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体，所述禽痘载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且所述另一种组合物是加强组合物。
项15.一种试剂盒，其包括：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且所述另一种组合物是加强组合物。
项16.根据项14-15所述的试剂盒，其中所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第二丝状病毒亚型、第三丝状病毒亚型或至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
项17.根据项14-16所述的试剂盒，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码选自由以下组成的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
项18.根据项14-16所述的试剂盒，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码选自具有以下的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31。
项19.根据项14-16所述的试剂盒，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码选自具有以下的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29和SEQID NO:31。
项20.根据项14-19所述的试剂盒，其用于产生针对至少一种丝状病毒亚型的保护性免疫应答，其中所述第一组合物用于引发所述免疫应答，并且所述第二组合物用于加强所述免疫应答。
项21.根据项14-19所述的试剂盒，其用于产生针对至少一种丝状病毒亚型的保护性免疫应答，其中所述第二组合物用于引发所述免疫应答，并且所述第一组合物用于加强所述免疫应答。
项22.根据项14-21所述的试剂盒，其中所述加强组合物包含两个或更多个剂量的所述加强组合物的所述载体。
项23.一种用于治疗和/或预防丝状病毒引起的疾病的重组修饰的痘苗病毒(MVA)载体，其包含编码丝状病毒蛋白的两个或更多个抗原决定簇的核苷酸序列。
项24.用于根据项23所述的用途的重组MVA载体，其中所述丝状病毒选自埃博拉病毒(EBOV)或马尔堡病毒(MARV)。
项25.用于根据项23或24所述的用途的重组MVA载体，其中所述EBOV蛋白的所述抗原决定簇来自一种或多种EBOV亚型，所述EBOV亚型选自由以下组成的组：扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)、苏丹埃博拉病毒(SEBOV)、科特迪瓦埃博拉病毒(EBOV-CdI)、雷斯顿埃博拉病毒(EBOV-雷斯顿)以及本迪布焦埃博拉病毒(BEBOV)。
项26.用于根据项23-25所述的用途的重组MVA载体，其中所述丝状病毒蛋白的所述抗原决定簇是包膜糖蛋白(GP)。
项27.用于根据项23-26所述的用途的重组MVA载体，其包含编码两种或更多种埃博拉亚型的抗原决定簇的核苷酸序列。
项28.用于根据项23-27所述的用途的重组MVA载体，其中所述丝状病毒蛋白的所述抗原决定簇选自由以下组成的组：包膜糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、病毒粒子蛋白35(VP35)、病毒粒子蛋白40(VP40)、病毒粒子蛋白30(VP30)、病毒粒子蛋白24(VP24)和RNA引导的RNA聚合酶蛋白(L)。
项29.用于根据项23-28所述的用途的重组MVA载体，其中所述丝状病毒蛋白的所述抗原决定簇选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
项30.用于根据项23-28所述的用途的重组MVA载体，其中所述丝状病毒蛋白的所述抗原决定簇包含SEQ ID NO:29和/或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:31。
项31.用于根据项23-28所述的用途的重组MVA载体，其中编码所述抗原决定簇的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:28和/或SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:30。
项32.一种用于治疗和/或预防丝状病毒引起的疾病的重组MVA载体，所述重组MVA载体包含编码丝状病毒糖蛋白的抗原蛋白且编码丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)的核苷酸序列。
项33.用于如项32所述的用途的重组MVA载体，其中编码所述丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)的抗原蛋白的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:33。
项34.一种重组MVA载体，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：a)SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:30，b)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28和SEQID NO:30，以及c)SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:33。
项35.根据项1-13所述的疫苗组合、用于根据项23-33所述的用途的重组MVA载体或如项34所述的重组MVA载体，其中用于产生所述重组病毒的所述MVA是MVA-BN病毒或衍生物，所述衍生物在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)细胞中具有体外繁殖性复制能力，但是没有在人角质形成细胞细胞系HaCat、人骨骨肉瘤细胞系143B、人胚肾细胞系293和人子宫颈腺癌细胞系HeLa中的繁殖性复制能力。
项36.根据项1-13所述的疫苗组合、用于根据项23-33所述的用途的重组MVA载体或如项34所述的重组MVA载体，其中用于产生所述重组病毒的所述MVA是如在欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)以登录号V00083008寄存的MVA-BN。
项37.用于根据项23-33、35或36所述的用途的重组MVA载体，其包含编码共刺激分子的核酸。
项38.根据项23-37所述的重组MVA载体，其用于影响受试者的免疫应答。
项39.根据项23-37所述的重组MVA载体，其用作药剂或疫苗。
项40.一种疫苗、组合物或细胞，其包含根据项23-37所述的重组MVA载体。
项41.用于根据项23-33或35-39所述的用途的重组MVA，其中所述重组MVA载体将施用一次、两次、三次或四次。
项42.如项32-33所述的重组MVA，其用作用于诱导针对丝状病毒感染的增强的免疫应答的药剂或疫苗，其中所述MVA能够在待治疗的受试者中产生丝状病毒样颗粒。
项43.一种试剂盒，其包括在第一小瓶或容器中用于第一次施用(初免)和在第二小瓶或容器中用于第二次施用(加强)的根据项23-33或35-39所述的重组MVA载体。
项44.根据项43所述的试剂盒，其包括在第三、第四或另一小瓶或容器中用于第三次、第四次或进一步施用的所述重组MVA载体。
项45.如项1-11所述的疫苗组合的用途或如项23-26所述的重组MVA载体，其用于制造用以治疗和/或预防丝状病毒引起的疾病的药物。
项46.一种药物组合物，其包含如项23-36中任一项所述的MVA载体和药学上可接受的载体、稀释剂和/或添加剂。
项47.一种重组FPV载体，其包含在具有SEQ ID NO:26的FPV-40K启动子控制下编码丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的核苷酸序列。
项48.如项47所述的重组FPV载体，其中所述丝状病毒选自埃博拉病毒(EBOV)或马尔堡病毒(MARV)。
项49.根据项48所述的重组FPV载体，其中所述EBOV蛋白的所述抗原决定簇来自一种或多种EBOV亚型，所述EBOV亚型选自由以下组成的组：扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)、苏丹埃博拉病毒(SEBOV)、科特迪瓦埃博拉病毒(EBOV-CdI)、雷斯顿埃博拉病毒(EBOV-雷斯顿)以及本迪布焦埃博拉病毒(BEBOV)。
项50.根据项47-49所述的重组FPV，其中所述丝状病毒蛋白的所述抗原决定簇选自由以下组成的组：包膜糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、病毒粒子蛋白35(VP35)、病毒粒子蛋白40(VP40)、病毒粒子蛋白30(VP30)、病毒粒子蛋白24(VP24)和RNA引导的RNA聚合酶蛋白(L)。
项51.根据项50所述的重组FPV载体，其中所述丝状病毒蛋白的所述抗原决定簇编码选自以下的组的抗原蛋白：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
项52.根据项47-51所述的重组FPV，其用于治疗和/或预防丝状病毒引起的疾病。
项53.根据项47-51所述的重组FPV，其用于引发或加强针对丝状病毒的免疫应答。
项54.用于根据项52或53所述的用途的重组FPV，其中所述重组FPV载体将施用一次、两次、三次或四次。
项55.如项47-51所述的重组FPV的用途，其用于制造用以治疗和/或预防丝状病毒引起的疾病的药剂或疫苗。
项56.一种在受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体，所述禽痘载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且所述另一种组合物是加强组合物。
项57.一种在受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且所述另一种组合物是加强组合物。
项58.根据项56所述的方法，其中所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第二丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
项59.根据项58所述的方法，其中所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第三丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
项60.根据项56-59所述的方法，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码选自由以下组成的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
项61.根据项56-59所述的方法，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
项62.根据项56-61所述的方法，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码来自四种不同的丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，所述抗原蛋白具有SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ IDNO:37。
项63.根据项56-62所述的方法，其中所述加强组合物在施用所述初免组合物之后2-12周施用。
项64.根据项56-63所述的方法，其中所述加强组合物两次或更多次施用至所述受试者。
项65.一种影响受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据项23-39所述的重组MVA载体
项66.一种产生用于治疗和/或预防丝状病毒引起的疾病的重组MVA载体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用MVA病毒感染宿主细胞，
(b)用项23-37中包含编码任何所述丝状病毒蛋白的抗原决定簇的至少一个核苷酸序列的重组载体转染所述感染的细胞，所述核酸序列还包含能够引导所述至少一个核苷酸序列整合至所述MVA病毒基因组中的基因组MVA病毒序列，以及
(c)鉴别、分离且任选地纯化所述产生的重组MVA病毒，
优选其中步骤a)和b)的顺序可改变以使得步骤b)是第一步骤并且步骤a)是第二步骤。
项67.一种产生用于治疗和/或预防丝状病毒引起的疾病的重组FPV载体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用FPV病毒感染宿主细胞，
(b)用项47-51中包含编码任何所述丝状病毒蛋白的抗原决定簇的至少一个核苷酸序列的重组载体转染所述感染的细胞，所述核酸序列还包含能够引导所述至少一个核苷酸序列整合至所述FPV病毒基因组中的基因组FPV病毒序列，以及
(c)鉴别、分离且任选地纯化所述产生的重组FPV病毒，优选其中步骤a)和b)的顺序可改变以使得步骤b)是第一步骤并且步骤a)是第二步骤。
项68.一种在受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的核酸；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的核酸；
或
(c)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的核酸；以及
(d)第二组合物，其包含免疫有效量的FPV载体，所述FPV载体包含编码丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的核酸
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且所述另一种组合物是加强组合物。
项69.如项68所述的方法，其中所述抗原决定簇是EBOV糖蛋白，优选选自由以下组成的组的EBOV糖蛋白：扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)、苏丹埃博拉病毒(SEBOV)、科特迪瓦埃博拉病毒(EBOV-CdI)、雷斯顿埃博拉病毒(EBOV-雷斯顿)以及本迪布焦埃博拉病毒(BEBOV)。
项70.如项68所述的方法，其中所述丝状病毒蛋白的所述抗原决定簇选自由以下组成的组：包膜糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、病毒粒子蛋白35(VP35)、病毒粒子蛋白40(VP40)、病毒粒子蛋白30(VP30)、病毒粒子蛋白24(VP24)和RNA引导的RNA聚合酶蛋白(L)。
项71.根据项70所述的方法，其中所述丝状病毒蛋白的所述抗原决定簇选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
项72.一种在受试者中提供保护性免疫或保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体，所述禽痘载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且所述另一种组合物是加强组合物。
项73.一种在受试者中提供保护性免疫或保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且所述另一种组合物是加强组合物。
项74.根据项72所述的方法，其中所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第二丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
项75.根据项74所述的方法，其中所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第三丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
项76.根据项72-75所述的方法，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码选自由以下组成的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
项77.根据项72-75所述的方法，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
项78.根据项72-77所述的方法，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码来自四种不同的丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，所述抗原蛋白具有SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ IDNO:37。
项79.根据项72-78所述的方法，其中所述加强组合物在施用所述初免组合物之后2-12周施用。
项80.根据项72-79所述的方法，其中所述加强组合物两次或更多次施用至所述受试者。
项81.根据项72所述的方法，其中所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第二丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
项82.根据项72或73所述的方法，其中所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第三丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
项83.根据项72-82所述的方法，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码选自由以下组成的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
项84.根据项72-82所述的方法，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
项85.根据项72-84所述的方法，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码来自四种不同的丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，所述抗原蛋白具有SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ IDNO:37。
项86.根据项84-85所述的方法，其中所述加强组合物在施用所述初免组合物之后2-12周施用。
项87.根据项72-86所述的方法，其中所述加强组合物两次或更多次施用至所述受试者。
项88.一种用于在受试者中产生丝状病毒样颗粒的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒糖蛋白的抗原蛋白和丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)免疫有效量的禽痘载体或MVA载体，所述禽痘载体或MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述载体中的一种是初免疫苗并且另一种载体是加强疫苗。
项89.一种用于在受试者中产生丝状病毒样颗粒的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒糖蛋白的抗原蛋白和丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体或MVA载体，所述禽痘载体或MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且所述另一种组合物是加强组合物。
项90.一种在受试者中诱导针对丝状病毒的增强的免疫应答的方法，所述方法包括通过向所述受试者施用以下各项来在所述受试者中产生丝状病毒样颗粒：
(a)免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒糖蛋白的抗原蛋白和丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)免疫有效量的禽痘载体或MVA载体，所述禽痘载体或MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述载体中的一种是初免疫苗并且另一种载体是加强疫苗。
项91.一种在受试者中诱导针对丝状病毒的增强的免疫应答的方法，所述方法包括通过向所述受试者施用以下各项来在所述受试者中产生丝状病毒样颗粒：
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒糖蛋白的抗原蛋白和丝状病毒病毒粒子蛋白40(VP40)的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体或MVA载体，所述禽痘载体或MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且所述另一种组合物是加强组合物。
项92.根据项88至91所述的方法，其中所述丝状病毒VP40选自由以下组成的组：扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)、苏丹埃博拉病毒(SEBOV)、科特迪瓦埃博拉病毒(EBOV-CdI)、雷斯顿埃博拉病毒(EBOV-雷斯顿)以及本迪布焦埃博拉病毒(BEBOV)。
项93.根据项88至91所述的方法，其中所述丝状病毒VP40选自一种或多种ZEBOV、SEBOV和MARV。
项94.根据项88至91所述的方法，其中所述丝状病毒VP40选自扎伊尔-梅菱噶或马尔堡-穆索科的组。
项95.根据项88至91所述的方法，其中所述丝状病毒糖蛋白和所述丝状病毒VP40选自相同丝状病毒株。
项96.根据项88至91所述的方法，其中所述MVA载体还包含编码丝状病毒核蛋白(NP)的核酸，优选其中所述丝状病毒核蛋白和所述丝状病毒VP40来源于相同丝状病毒株。
项97.根据项96所述的方法，其中所述丝状病毒株选自以下的组：扎伊尔-梅菱噶、扎伊尔-基奎特、扎伊尔-加蓬、科特迪瓦埃博拉病毒、苏丹-博尼费斯、苏丹-马莱奥、苏丹-古卢、马尔堡-Ravn、马尔堡-奥佐林、马尔堡-Ratayczak、马尔堡-穆索科、马尔堡-安哥拉，优选扎伊尔-梅菱噶或科特迪瓦埃博拉病毒。
项98.根据项88至96所述的方法，其中所述丝状病毒VP40包含编码SEQ ID NO:34的蛋白质序列的核酸。
项99.根据项88至96所述的方法，其中编码所述丝状病毒VP40的所述抗原蛋白的所述核酸包含SEQ ID NO:33。
项100.根据项88至99所述的方法，其中所述重组禽痘载体将施用一次、两次、三次或四次。
实施例
以下的详细实施例意图有助于更好地理解本发明。然而，本发明不受所述实施例限制。从本文公开的本发明的说明书和实践考虑，本发明的其他实施方案对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
实施例1：重组MVA的构建
以下部分描述包含表达丝状病毒包膜糖蛋白和/或另一种丝状病毒蛋白的抗原决定簇的一种或多种异源核酸的重组MVA的构建。本文所述的所有其他构建体都使用类似的方法制备。
MVA-mBN252B(PrS-GP-MARV-穆索科)的构建
天然存在的GP-MARV-穆索科基因(维多利亚湖分离物)的全长DNA序列用作构建MARV疫苗候选物MVA-mBN252B的参考序列。编码全长GP-MARV-穆索科的核苷酸序列由Geneart AG(Regensburg,德国)合成，其具有针对在人中表达且最小化或防止内部同源重组事件而优化的密码子使用。尽管密码子优化改变了野生型DNA序列，但密码子优化的序列编码与野生型GP-MARV-穆索科(SEQ ID NO:6；NCBI登录号ABA87127.1)同一的氨基酸序列。GP-MARV-穆索科的表达由启动子PrS驱动，所述启动子PrS是从痘苗病毒启动子的早期和晚期元件设计的合成启动子(SEQ ID NO:23；还参见S.Chakrabarti等人,“Compact,Synthetic Vaccinia Virus Early/Late Promoter for Protein Expression”,BioTechniques 23(6):1094-1097(1997))。使用若干定制的重组质粒中的一种通过标准方法(参见下文)将密码子优化的GP-MARV-穆索科基因插入MVA-BN基因组中，所述质粒靶向MVA-BN基因组的不同特异区，包括缺失位点或基因间(非编码)区(IGR)。
为了将密码子优化的GP-MARV-穆索科基因插入MVA-BN基因组，用MVA-BN感染鸡胚胎成纤维细胞(CEF细胞)，且随后用重组质粒pBN433(图5A)转染。pBN433含有在经由BspEI/NheI限制性插入到质粒pBNX197(图4B)中的合成PrS启动子控制下的密码子优化的GP-MARV-穆索科(编码SEQ ID NO:6(氨基酸)的SEQ ID NO:5(DNA))。质粒pBN433还含有侧接MVA-BN基因组中的IGR 148/149的MVA-BN DNA序列以及由loxP位点侧接的选择盒，这允许通过Cre重组酶介导的重组随后消除所述选择盒。在所述质粒中的侧翼序列与MVA-BN基因组中的所需插入位点处的同源序列之间(即，IGR148/149)的同源重组之后，将所述质粒的编码部分插入MVA-BN基因组中的所需位点中。
在选择性条件(霉酚酸/黄嘌呤和次黄嘌呤)下扩增和噬斑纯化(9次传代；其中3次包括噬斑纯化)后，获得含有GP-MARV-穆索科的基因的重组MVA-BN产物，其被指定为MVA-mBN252A(PreMaster A)。针对MVA-BN(亲代病毒；数据未示出)的消除、针对所插入基因以及插入侧翼区的正确序列(通过基因特异性PCR，使用对MVA-BN基因组序列具有特异性的引物，外来基因插入所述MVA-BN基因组序列中；数据未示出)、针对微生物的不存在(无菌性测试；数据未示出)以及针对插入物的存在和正确大小(通过测序；数据未示出)来对重组MVA-mBN252A PreMaster病毒原液进行检查。还测定了MVA-mBN252A PreMaster病毒原液的滴度。
在插入序列中存在选择盒允许培养物中的重组MVA-BN病毒的阳性选择。为了产生最终重组MVA-mBN252B，使用Cre/loxP系统从MVA-mBN252A PreMaster病毒原液中除去选择盒。为了除去选择盒，将用含有质粒pBN433(即，在PrS启动子控制下的GP-MARV-穆索科，加上由loxP位点侧接的选择盒)的插入物的重组MVA-BN感染的CEF细胞用pBN274进一步转染，所述pBN274是编码CRE重组酶的表达质粒(图4C)。位点特异性Cre重组酶催化由靶loxP序列侧接的选择盒DNA序列的精确切除，从而完全除去选择盒。将所得到的病毒在非选择性条件下进行噬斑纯化(二十七代；其中九代包括噬斑纯化)，并且分离缺失选择盒的重组病毒MVA-mBN252B。通过巢式PCR证实了选择盒的完全消除(数据未示出)。最后，通过逆转录酶PCR(RT-PCR；数据未示出)证实了通过重组MVA-mBN252B进行的GP-MARV-穆索科的表达。
MVA-mBN226B(多抗原MVA-Filo)的构建
对于从MVA-mBN226B表达的所有转基因，天然存在的基因的全长DNA序列用作参考序列。那些由Geneart AG(Regensburg,Germany)合成，其具有针对在人中表达且最小化或防止内部同源重组事件而优化的密码子使用。密码子优化改变了野生型DNA序列，而不改变氨基酸序列。MVA-mBN226B包含以下丝状病毒基因：GP-SEBOV(SEQ ID NO:30)；NP-EBOV-CdI(SEQ ID NO:28)；GP-ZEBOV，梅菱噶病毒株(GP-ZEBOV-梅菱噶，SEQ ID NO:19)和GP-MARV-穆索科(SEQ ID NO:5)。GP-SEBOV和GP-MARV-穆索科在PrS启动子(SEQ ID NO:23)的控制下表达，NP-EBOV-CdI在PrLE1或修饰的PrLE1启动子(SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:32)的控制下表达，并且GP-ZEBOV-梅菱噶在Pr7.5启动子(SEQ ID NO:25)的控制下表达。
PrS启动子是从痘苗病毒启动子的早期和晚期元件设计的合成启动子，其确保在基因表达的早期和晚期阶段期间的转基因表达。类似地，来自痘苗病毒7.5kDa基因的Pr7.5启动子是强早期和晚期启动子，从而意味着在其控制下的转基因也将在基因表达的早期和晚期阶段期间表达(SEQ ID NO:25；还参见M.A.Cochran等人,“In vitro mutagenesis ofthe promoter region for a vaccinia virus gene:evidence for tandem early andlate regulatory signals”,J.Virol.54(1):30-37(1985))。启动子PrLE1是由牛痘病毒(ATI)的A型包涵体启动子组成的合成启动子，其融合至来源于Pr7.5的五个优化的早期元件(SEQ ID NO:27；还参见K.Baur等人,“Immediate-Early Expression of a RecombinantAntigen by Modified Vaccinia Virus Ankara Breaks the Immunodominance ofStrong Vector-Specific B8R Antigen in Acute and Memory CD8 T-Cell Responses”,J.Virol.84(17):8743-8752(2010))。因此，NP-EBOV-CdI将在在表达的早期和晚期阶段期间表达。此外，PrLE1显示诱导特别强的细胞介导的免疫应答。在MVA-mBN226B传代期间，来源于Pr7.5的五个早期元件中的一个可能通过同源重组丢失；分析显示NP-EBOV-CdI的足够表达水平，然而(数据未示出)，因此使用修饰的构建体而不置换修饰的PrLE1启动子。
为了将外来基因插入MVA-BN基因组中，产生了靶向MVA-BN基因组的不同缺失和基因间区(IGR)的若干重组质粒。为了产生重组MVA-BN产物，可使用通常可获得的限制酶和常规分子生物学技术将目标外来序列插入这些基础载体中的任一个中，例如靶向IGR 88/89的pBNX186(参见图4A)或靶向IGR 148/149的pBNX197(参见图4B)。为了产生表达所需转基因的重组MVA-BN分离物，然后用MVA-BN感染CEF细胞，且随后用一种或多种表达一种或多种所需转基因并且包含能够进行重组病毒的阳性选择的选择盒的重组质粒来转染。在同源重组过程中，质粒侧翼序列与MVA-BN病毒基因组中的插入位点的同源序列重组。这将质粒序列插入由在MVA-BN基因组中用作起始材料的基础载体靶向的位点(例如，IGR 148/149、IGR88/89等)中。pBNX197靶向IGR 148/149(图4B)并用作构建最终重组质粒pBN384(图5B)的起始质粒。质粒pBN384表达GP-ZEBOV-梅菱噶和GP-MARV-穆索科。pBNX 186靶向IGR 88/89(图4A)并用作构建最终重组质粒pBN385(图5C)的起始质粒。质粒pBN385表达GP-SEBOV和NP-EBOV-CdI。
为了将GP-SEBOV、NP-EBOV-CdI、GP-ZEBOV-梅菱噶和GP-MARV-穆索科转基因插入MVA-BN中，用MVA-BN感染CEF细胞，且随后用重组质粒pBN384和pBN385转染。在双重选择性条件(霉酚酸/黄嘌呤和次黄嘌呤以及遗传霉素)下扩增和噬斑纯化(10次传代；3次包括噬斑纯化)后，获得含有三种糖蛋白、一种核蛋白和两个选择盒的基因的重组MVA-BN产物，其被指定为MVA-mBN226A(Interim Premaster)。针对MVA-BN(亲代病毒；数据未示出)的消除、针对所插入基因以及插入侧翼区的正确序列(通过基因特异性PCR，使用对MVA-BN基因组序列具有特异性的引物，外来基因插入所述MVA-BN基因组序列中；数据未示出)、针对微生物的不存在(无菌性测试；数据未示出)以及针对插入物的存在和正确大小(通过测序；数据未示出)来对重组MVA-mBN226A PreMaster病毒储备液进行检查。还测定了MVA-mBN252APreMaster病毒原液的滴度。
在进一步扩增后，在非选择性条件下进行选择盒的除去和噬斑纯化(二十次传代；六次包括噬斑纯化)，分离缺失选择盒的重组病毒MVA-mBN226B。通过巢式PCR证实了选择盒的完全消除(数据未示出)。最后，通过逆转录酶PCR(RT-PCR；数据未示出)证实了通过重组MVA-mBN226B进行的转基因表达。
MVA-mBN254A(MVA-GP-ZEBOV)的构建
对于从MVA-mBN254A表达的GP-ZEBOV转基因，天然存在的基因的全长DNA序列用作参考序列。GP-ZEBOV基因由Geneart AG(Regensburg,Germany)合成，其具有针对在人中表达且最小化或防止内部同源重组事件而优化的密码子使用，如上文在“MVA-mBN226B的构建”中所描述。密码子优化改变了野生型DNA序列，而不改变氨基酸序列。GP-ZEBOV-梅菱噶在PrS5E启动子(SEQ ID NO:24)的控制下表达。
PrS5E(SEQ ID NO:24)是从合成早期和晚期启动子设计的合成强早期和晚期启动子(Chakrabarti等人,1997)，其后是来自痘苗病毒7.5kDa基因的Pr7.5启动子的5个早期元件(SEQ ID NO:25；还参见M.A.Cochran等人,“In vitro mutagenesis of the promoterregion for a vaccinia virus gene:evidence for tandem early and lateregulatory signals”,J.Virol.54(1):30-37(1985))。PrS5E启动子在专利申请WO 2013/189611A1中更详细地描述。
为了将外来基因插入MVA-BN基因组中，构建了靶向MVA-BN基因组的不同缺失和基因间区(IGR)的若干重组质粒。为了产生重组MVA-BN产物，可使用通常可获得的限制酶和常规分子生物学技术将目标外来序列插入这些基础载体中的任一个中，例如靶向IGR148/149的pBNX197(参见图4B)。为了产生表达所需转基因的重组MVA-BN分离物，然后用MVA-BN感染CEF细胞，且随后用一种或多种表达一种或多种所需转基因并且包含能够进行重组病毒的阳性选择的选择盒的重组质粒来转染。在同源重组过程中，质粒侧翼序列与MVA-BN病毒基因组中的插入位点的同源序列重组。这将靶序列插入由在MVA-BN基因组中用作起始材料的基础载体靶向的位点(例如，IGR 148/149)中。pBNX197靶向IGR 148/149(图4B)并用作构建最终重组质粒pBN436(图5D)的起始质粒。质粒pBN436含有GP-ZEBOV-梅菱噶。
为了将GP-ZEBOV-梅菱噶转基因插入MVA-BN中，用MVA-BN感染CEF细胞，且随后用重组质粒pBN436(图5D)转染。在选择性条件(霉酚酸/黄嘌呤和次黄嘌呤)下扩增和噬斑纯化(9次传代；包括3次噬斑纯化)后，获得含有GP-ZEBOV-梅菱噶的基因和选择标记GPT-RFP融合基因的重组MVA-BN产物，其被指定为MVA-mBN254A(Premaster)(图3C)。针对MVA-BN(亲代病毒；数据未示出)的消除、针对所插入基因以及插入侧翼区的正确序列(通过基因特异性PCR，使用对MVA-BN基因组序列具有特异性的引物，外来基因插入所述MVA-BN基因组序列中；数据未示出)、针对微生物的不存在(无菌性测试；数据未示出)以及针对插入物的存在和正确大小(通过测序；数据未示出)来对重组MVA-mBN254A PreMaster病毒储备液进行检查。还测定了MVA-mBN254A PreMaster病毒原液的滴度。最后，通过逆转录酶PCR(RT-PCR；数据未示出)证实了通过重组MVA-mBN254A进行的转基因表达。
因此产生了其他构建体。具体地说，MVA-mBN255表达了在PrS启动子控制下整合至IGR 88/99中的NP-EBOV-CdI(SEQ ID NO:28)，在PrS启动子控制下整合至IGR 136/137中的VP40 ZEBOV(SEQ ID NO:33)，以及在PrS5E启动子控制下整合至IGR 148/149中的GP-ZEBOV(SEQ ID NO:19)(图13)。
FPV-mBN368A(FPV-GP-ZEBOV)和FPV-mBN391(FPV-多-filo)的构建
对于从FPV-mBN368A表达的GP-ZEBOV转基因，天然存在的基因的全长DNA序列用作参考序列。GP-ZEBOV基因由Geneart AG(Regensburg,Germany)合成，其具有针对在人中表达而优化的密码子使用，如在“MVA-mBN226B的构建”中所描述。密码子优化改变了野生型DNA序列，而不改变氨基酸序列。GP-ZEBOV-梅菱噶在FPV-40K启动子(SEQ ID NO:26)的控制下表达。FPV-40K启动子是FPV中的40K蛋白编码序列的FPV启动子序列。
为了将外来基因插入FPV基因组中，构建了靶向FPV基因组中的不同整合位点的若干重组质粒。为了产生重组FPV产物，可使用通常可获得的限制酶和常规分子生物学技术将目标外来序列插入这些基础载体中的任一个中，例如靶向插入位点BamHI J的pBNX221(参见图4D)。为了产生表达所需转基因的重组FPV分离物，然后用FPV感染CEF细胞，且随后用一种或多种表达一种或多种所需转基因并且包含能够进行重组病毒的阳性选择的选择盒的重组质粒来转染。在同源重组过程中，质粒侧翼序列与FPV病毒基因组中的插入位点的同源序列重组。这将靶序列插入由在FPV基因组中用作起始材料的基础载体靶向的位点(例如，插入位点BamHI J)中。pBNX221靶向插入位点BamHI J(图4D)并用作构建最终重组质粒pBN555(图5E)的起始质粒。质粒pBN555含有在FPV-40K启动子控制下的GP-ZEBOV-梅菱噶。
为了将GP-ZEBOV-梅菱噶转基因插入FPV中，用FPV感染CEF细胞，且随后用重组质粒pBN555(图5E)转染。在选择性条件(霉酚酸/黄嘌呤和次黄嘌呤)下扩增和噬斑纯化(13次传代；包括4次噬斑纯化)后，获得含有GP-ZEBOV-梅菱噶的基因和选择标记GPT-RFP融合基因的重组MVA-BN产物，其被指定为FPV-mBN368A(Premaster)(图3D)。针对FPV(亲代病毒；数据未示出)的消除、针对所插入基因以及插入侧翼区的正确序列(通过基因特异性PCR，使用对FPV基因组侧翼序列具有特异性的引物，外来基因插入所述FPV基因组侧翼序列中；数据未示出)、针对微生物的不存在(无菌性测试；数据未示出)以及针对插入物的存在和正确大小(通过测序；数据未示出)来对重组FPV-mBN368A PreMaster病毒储备液进行检查。还测定了FPV-mBN368A PreMaster病毒原液的滴度。最后，通过逆转录酶PCR(RT-PCR；数据未示出)证实了通过重组FPV-mBN368A进行的转基因表达。
根据如上所述的方法使用FP14(IGR 60/61)和用于整合的BamHI J区产生了其他禽痘构建体。FPV-mBN391表达了在FPV-40K启动子(SEQ ID NO：26)控制下的GP-ZEBOV(SEQID NO：19和20)，在FP14位点处在PrS启动子(SEQ ID NO：23)控制下的GP-MARV-穆索科(SEQID NO：5和6)和在Pr13.5长启动子(SEQ ID NO：35)控制下的GP-MARV-安哥拉(SEQ ID NO：36和37)，在FPV-40K启动子控制下的GP-SEBOV(SEQ ID NO：30和31)，以及在PrLE1启动子(SEQ ID NO：27)控制下的NP-EBOV-CdI(SEQ ID NO：28和29)，所有三个均以所提及的顺序插入在BamHI J区处。
实施例2：非人灵长类动物中的MVA-BN-Filo(MVA-mBN226B)
在食蟹猕猴的埃博拉和马尔堡攻击模型中对MVA-BN-Filo(MVA-mBN226B)的免疫原性和保护功效进行了分析。猴子根据研究动物的护理和喂养的适当机构准则来圈养和喂养。
实验设计在以下表1中列出。
表1：用于食蟹猴中的MVA-BN-Filo的疫苗接种方案。
Figure BDA0002961398000000931
用EBOV扎伊尔病毒株或MARV穆索科病毒株肌肉内攻击(1,000pfu)；将存活动物在第63天安乐死
媒介物对照和疫苗接种组两者的剂量体积均为0.5mL；所有疫苗接种通过皮下注射递送。第一次疫苗接种日被指定为第0天。所有动物在第42天通过肌肉内注射接受1,000pfu的ZEBOV(组1和3)或MARV-穆索科(组2和4)的攻击剂量。将所有存活动物在第63天安乐死。
通过ELISA测量GP特异性抗体。如所预期，用MARV-穆索科攻击的未疫苗接种的对照动物在攻击前的任何时间(即，在第0天、第28天和第36天(数据未示出))没有可检测的GP-MARV特异性抗体并且死于疾病。相比之下，用MVA-BN-Filo疫苗接种的三只动物中的两只(动物编号30766和30768)在第一次疫苗接种之后(第一次疫苗接种后；还参见图6)28天具有低GP-MARV抗体滴度，并且所有三只疫苗接种的动物显示在第二次疫苗接种之后(加强疫苗接种后；参见图6)8天的明显加强应答。所有三只动物在另外用MARV-穆索科致死性肌肉内攻击后存活。
类似地，在所有测试的时间点，用ZEBOV攻击的未疫苗接种的对照动物对GP-ZEBOV特异性抗体是阴性的(数据未示出)。对照动物以及所有疫苗接种的动物在通过肌肉内注射用ZEBOV攻击后死于感染。出人意料地，所有三只疫苗接种的动物在攻击前产生GP-ZEBOV特异性抗体，在水平上量值大于通过用ZEBOV-GP疫苗接种在非人灵长类动物中产生的超免疫血清中测量的水平。对在死亡时收集在10％中性缓冲福尔马林中的组织进行完全尸检。通过常规方法处理组织切片，切成5μm，并用苏木精和伊红染色以用于组织学评价。结果总结在以下表2中。
表2：疫苗接种的动物和对照动物的组织学评价。
Figure BDA0002961398000000951
*动物30766和30768中的血管炎似乎是预先存在的病状。E-安乐死；SD-自发性死亡
分析证实了在MARV-穆索科攻击的未疫苗接种的对照动物以及所有ZEBOV攻击的动物中的出血热的典型症状，而用MARV-穆索科攻击的疫苗接种的动物显示很少组织学变化，除了与攻击后免疫应答一致的脾增生和B细胞增生。
实验结果总结在图7中。图7A示出用MVA-BN-Filo疫苗接种保护100％的动物免于MARV-穆索科攻击。图7B示出攻击后临床得分；用MARV-穆索科攻击的疫苗接种的动物未显示与出血热相关的症状或组织学变化，并且在肝、脾、肾上腺、淋巴结或肺中没有病毒。
实施例3：非人灵长类动物中的MVA-BN-Filo
此实验在如实施例2中描述的类似研究方案下在非人灵长类动物中测试MVA-BN-Filo，但用另一种马尔堡病毒株(即马尔堡安哥拉)代替实施例2中的马尔堡穆索科攻击。
表3：非人灵长类动物中MVA-BN-Filo的研究设计和结果
Figure BDA0002961398000000961
用MARV安哥拉病毒株肌肉内攻击(1,000pfu)；将存活动物在第70天安乐死。
表3显示MVA-BN-Filo完全保护非人灵长类动物免于马尔堡病毒的安哥拉病毒株。相反，第5组中未疫苗接种的动物死于感染。还显示保护功效是剂量依赖性的，因为使用也编码马尔堡病毒的GP的MVA-BN-MARV的5倍更低剂量仅是部分保护性的，除非其共表达CD40L作为共刺激分子。所有疫苗候选物产生对MVA载体(痘苗特异性抗体)具有特异性的抗体，以及对MARV GP插入物具有特异性的抗体，如表4中所概述。
表4：非人灵长类动物中由MVA-BN-Filo诱导的抗体
Figure BDA0002961398000000971
实施例4：异源初免/加强
此实验在初免/加强免疫中测试重组MVA和重组禽痘FPV的组合。
将H-2Kk+B6CBA F1小鼠(Janvier Labs,France)用5×107TCID50MVA-ZEBOV-GP(MVA；MVA-mBN254A，图3C)或FPV-ZEBOV-GP(FPV；FPVmBN368A，图3D)皮下(s.c.)免疫。将病毒剂量以100μl/胁腹的总体积注射在两侧胁腹处。
为了检测ZEBOV-GP特异性IgG，在4℃下用ZEBOV GP抗原(IBT Bioservices,MD,USA)涂覆96孔板(Corning,MA,USA)过夜。将一式两份的两倍血清稀释液添加到洗涤且封闭的板上，并且使用绵羊抗小鼠IgG-HRP(AbD Serotec,UK)作为检测抗体。在室温下添加TMB底物30分钟，且通过添加1M H2SO4终止反应。在450nm下测量吸光度。鼠单克隆抗体13F6用作标准物，以计算ZEBOV-GP IgG的血清浓度。
通过轻轻研磨并迫使组织通过70μm细胞过滤器(BD Bioscience,CA,USA)来从脾中新鲜分离小鼠淋巴细胞。在溶解后，在10μg/ml布雷菲尔德菌素A和CD107a-FITC存在下，在37℃将细胞与5μg/ml ZEBOV-GP577-584肽(TELRTFSI)(GenScript,NJ,USA)在完全RPMI中孵育6小时。对于活/死区分，使用Zombie AquaTM可固定活力试剂盒(BioLegend,CA,USA)对细胞染色。在用CD4-BV605、CD8α-BV421(BioLegend,CA,USA)和CD44-APC-eFluor780(eBisocience,CA,USA)表面染色且根据制造商的说明书(BD Cytofix/Cytoperm,BDBiosciences)固定/透化后进行IFN-γ和TNF-α的细胞内染色。使用数字流式细胞仪(LSRII,BD Biosciences,CA,USA)获得所有细胞，并用FlowJo软件(FlowJo,OR,USA)分析数据。
在H-2Kk+CBAB6 F1小鼠中测试了重组MVA和FPV初免/加强免疫的四种可能的组合，因为来自扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)糖蛋白(GP)的强CD8 T细胞表位被描述用于这种MHC I类单倍型，即GP577-584(TELRTFSI)(Rao等人,Vaccine 17(23-24):2991-8(1999))。在第0天和第21天皮下免疫之后第21天和第41天分析ZEBOV-GP特异性IgG的血清浓度。而在第21天，所有MVA免疫的小鼠具有稳健IgG滴度，仅20％的FPV免疫的小鼠具有血清转化。在第二次免疫后，所有动物对ZEBOV-GP特异性IgG呈血清阳性。在用FPV同源免疫后观察到最低滴度。在第41天未能检测到在用MVA免疫两次的动物与用FPV初免且用MVA加强的动物之间在GP特异性IgG浓度方面的差异。然而，在第41天用MVA初免并用FPV加强的小鼠的滴度略高于所有其他组(图8A)。
令人感兴趣的，产生最强抗体应答的相同组合也诱导最强CD8 T细胞应答。再次，用FPV同源免疫产生最弱的CTL应答，然后是MVA-MVA和FPV-MVA免疫。用MVA初免、然后用FPV加强诱导比2×MVA的同源组合多约5倍的细胞毒性CD8 T细胞(图8B)。
总之，这些数据意味着用MVA第一和FPV第二异源免疫诱导最强ZEBOV-GP特异性抗体应答并且还诱导最强CTL应答，如高度功能性CD8 T细胞的存在所示。
实施例5：增强的ZEBOV-GP特异性CD8 T细胞应答
将H-2Kk+CBA小鼠在第0天和第21天用5×107TCID50 MVA或FPV皮下免疫。将小鼠(5只/组)在第42天杀死以用于通过脾细胞的细胞内细胞因子染色进行T细胞分析。使用以下初免/加强方案：1：MVA-ZEBOV-GP(mBN254)/FPV-ZEBOV-GP(mBN368)，2：MVA-多-filo(MVA-mBN226)/FPV-ZEBOV-GP(mBN368)，3：MVA-ZEBOV-GP-VP40(mBN255)/FPV-ZEBOV-GP(mBN368)。数据总结在图9中。
在第42天在10μg/ml布雷菲尔德菌素A和抗CD107a-FITC存在下用5μg/ml ZEBOV-GP577-584肽(TELRTFSI)标准6小时体外在刺激之后对脾CD8 T细胞应答进行分析。将细胞用CD4-BV605、抗CD8-BV421、CD44-APC-eFluor780表面染色并且用抗IFN-γ-PECy7和抗TNF-α-PerCP-eFluor710细胞内染色。通过
Figure BDA0002961398000000991
可固定Aqua死细胞染色试剂盒根据制造商的说明书(Life Technologies)进行活/死区分。条形图示出CD107a+、IFN-γ+和TNF-α+CD8 T细胞的总数目。所示的是来自5只小鼠/组的平均值±SEM。相较于MVA-ZEBOV-GP(mBN254)或MVA-多-filo(MVA-mBN226)作为初免构建体，当MVA-BN-ZEBOV/GP-VP40用作MVA-FPV异源初免-加强方案中的初免构建体时，针对ZEBOV-GP-来源的肽TELFRTSI的CD8 T细胞应答增强大约2倍(图9)。
实施例6：在用MVA-GP-VP40疫苗接种后针对ZEBOV的增强的保护
将食蟹猴(Cynomolgus macaques/Macaca fascicularis)用MVA-BN-ZEBOV/GP(n＝3)、MVA-BN-ZEBOV/GP-VP40(n＝3)以5×108TCID50的剂量皮下疫苗接种两次(第0天和第28天)，或接受Tris-缓冲盐水(TBS)作为阴性对照(安慰剂组，n＝2)。在免疫之前且在攻击之前每周(第7天、第14天、第21天、第28天、第35天和第40天)，收集血清以用于通过埃博拉病毒扎伊尔糖蛋白(GP)特异性和MVA-主链特异性ELISA进行分析。在加强疫苗接种后四周，将动物通过肌肉内施用大约1000pfu用埃博拉病毒扎伊尔(基奎特病毒株)攻击。
表5：研究设计：
Figure BDA0002961398000001001
扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)特异性ELISA
进行ELISA，从而测定通过重组ZEBOV/GP固定的ZEBOV/GP特异性抗体，并且通过针对NHP IgG的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体检测。在底物反应后作为在450nm下的光密度(OD)值读取结合的HRP标记的抗体的量。根据四参数回归分析且基于使用单克隆小鼠抗体的标准曲线来计算抗体浓度。
ELISA结果在图10中示出。用MVA-BN-ZEBOV/GP或MVA-BN-ZEBOV/GP-VP40构建体疫苗接种的所有动物在初免疫苗接种后已经具有可检测的主链和ZEBOV特异性抗体，并且通过第二次疫苗接种加强抗体应答。
在第二研究中，将食蟹猴(Cynomolgus macaques/Macaca fascicularis)用5×108TCID50剂量的MVA-BN-多-filo(MVA-mBN226，n＝2)、MVA-BN-ZEBOV/GP-VP40(MVA-mBN255，n＝2)皮下疫苗接种三次(第0天、第28天和第56天)，或接受Tris-缓冲盐水(TBS)作为阴性对照(安慰剂组，n＝2)。在免疫之前且在攻击之前每周(第0天、第27天、第41天、第55天、第35天和第67天)，收集血清以用于通过埃博拉病毒扎伊尔糖蛋白(GP)特异性中和测定进行分析(图11)。在最后一次疫苗接种后四周，将动物通过肌肉内施用大约100pfu用埃博拉病毒扎伊尔(基奎特病毒株)攻击。
表6：研究设计：
Figure BDA0002961398000001011
用MVA-BN-ZEBOV/GP-VP40疫苗接种在初免疫苗接种后已经产生可检测到的中和抗体，而MVA-BN-多-filo未在第27天初免后诱导可检测水平的中和抗体(图11)。在所有分析时间点，用MVA-BN-ZEBOV/GP-VP40疫苗接种的动物具有比MVA-BN-多-filo疫苗接种的动物更高的中和抗体滴度。在ZEBOV攻击后，MVA-BN-多-filo在攻击后第7天死亡，而MVA-BN-ZEBOV/GP-VP40疫苗接种的动物存活，无症状或伴随短暂发热发作。
实施例7：VLP形成以及GP和VP40的蛋白质表达
将HeLa细胞以10的MOI用所指示的病毒感染。在感染2天后，收获上清液并且然后将澄清上清液(SN)中的VLP通过超速离心(UC-SN)穿过20％蔗糖垫沉淀。通过在1x Laemmli缓冲液中直接裂解细胞来制备细胞溶解产物。将细胞溶解产物1:5稀释，之后通过SDS-PAGE分离以用于免疫印迹分析。在SDS-PAGE之前不稀释UC-SN。使用来自USAMRIID的单克隆小鼠抗体(克隆6D8)检测到ZEBOV-GP，并且使用来自IBT Bioservices的纯化兔多克隆抗体检测到ZEBOV-VP40。
通过免疫印迹在新鲜制剂中证实GP和VP40的表达。两种蛋白质均存在于细胞溶解产物中，并且也富含UC-SN(图12C)。基质蛋白VP40的表达已知足以形成VLP，并且未报道VP40和GP蛋白的直接相互作用。为了显示GP确实与VP40一起并入VLP中，从感染细胞的SN中免疫沉淀GP。为此，用MVA-ZEBOV/GP-VP40以及具有MVA-ZEBOV/GP和BAC来源的MVA wt的对照细胞感染HeLa细胞。BAC来源的MVA wt已先前在Meisinger-Henschel等人(Meisinger-Henschel等人(2010),J Virol.84(19):9907-9919)中进行了描述。使用抗GP特异性抗体使来自感染细胞的SN经受免疫沉淀(IP)。在免疫沉淀之前，用1％Triton X-100(TX-100)处理SN的等分试样30分钟，所述Triton X-100先前显示破坏鼠白血病病毒的大多数成熟包膜VLP(Davidoff等人(2012),Virology433(2):401-409)。
然后针对GP和共沉淀的VP40的存在通过免疫印迹分析IP-复合物。对于免疫沉淀(IP)，将澄清的SN与抗ZEBOV-GP(克隆6D8，USAMRIID)抗体连同蛋白G-琼脂糖(10μl)在4℃下孵育过夜。然后将免疫沉淀物的免疫印迹与针对ZEBOV-GP(单克隆抗体6D8)和ZEBOV-VP40(来自IBT)的抗体一起孵育。GP蛋白从仅表达GP的细胞的SN中有效地免疫沉淀(图12D，上图)，其与VP40的存在无关。重要的是，仅在不存在TX-100的情况下，VP40与来自MVA-ZEBOV/GP-VP40感染细胞的上清液的GP共免疫沉淀(图12D，下图，泳道2)，从而表明GP确实已并入VLP中。由于TX-100应该破坏VLP，并且由于不存在直接GP-VP40相互作用，因此在TX-100处理的样品中没有VP40能够共沉淀(图12D，下图，泳道4)。因此，显示确实在用重组MVA感染时产生呈递VLP的GP。
实施例8：293T/17中的VLP形成
为了可能在感染细胞后获得更高的VLP浓度，293T/17细胞用于制备新鲜VLP。通过蛋白质印迹针对GP和VP40分析制剂的蛋白质含量。
将T175培养皿中的293T/17细胞以10的MOI用所指示的病毒感染。在感染后第24小时收集上清液，并且直接与3x负载缓冲液(粗SN)混合或在20％蔗糖垫(UZ-prep)上浓缩。在1x负载缓冲液中制备细胞溶解产物(CL)。通过变性SDS-PAGE根据大小分离蛋白质。将免疫印迹与抗GP抗体(克隆6D8，1:2500，USAMRIID)或抗VP40抗体(多克隆，1:1000，IBT)一起孵育，并且使用化学发光底物显色。
在来自感染细胞的细胞溶解产物(CL)和上清液(SN)两者中，在感染MVA-filo-VLP之后用MVA-ZEBOV/GP和MVA-ZEBOV/GP-VP40(MVA-filo-VLP)、VP40感染细胞之后可容易地检测EBOV糖蛋白(GP)的表达。出人意料地，与感染MVA-filo-VLP的细胞相比时，MVA-ZEBOV/GP感染的细胞似乎表达更多的GP，而在MVA-filo-VLP感染的细胞的情况下，在SN中发现更多的GP。这可能反映了以下事实：使用MVA-filo-VLP，GP和VP40的共表达增强来自感染细胞的GP释放(以VLP的形式)。GP和VP40蛋白两者均存在于UZ-制剂中，从而表明GP和VP40通过UZ收集。在UZ后一些GP以及还有VP40仍然存在于SN中，但是与粗SN相比更少，对于VP40尤其如此。因此，主要以VLP形式存在的VP40与GP一起在很大程度上从SN中耗竭，而GP库(可能呈多形颗粒的形式)的一部分在UZ后保留在SN中。
来自293T/17细胞的VLP的透射电子显微术(TEM)和免疫电子显微术分析显示由相应MVA重组体产生的MVA-filo-VLP是用GP密集修饰的，GP刺突内衬filo-VLP的整个表面。另外，通过免疫-EM对来自用MVA-wt或MVA-ZEBOV/GP感染的细胞的制剂进行分析；在这些样品中没有检测到VLP。
实施例9：NHP中异源初免-增强免疫的免疫原性
在第0天和第28天对4只食蟹猴进行(皮下)疫苗接种。两只动物在第0天接受5×108TCID50 MVA-mBN226作为初免并且在第28天接受1×109TCID50FPV-mBN368作为加强。一只动物在第0天接受1×109TCID50 FPV-mBN368作为初免并且接受5×108TCID50 MVA-mBN226作为加强。一只对照动物仅接受TBS。在第0天、第7天、第28天、第35天和第49天分离PBMC。在第0天、第28天和第49天收集血液以用于血液学、临床化学、凝血参数，分离PBMC或血清以分别用于分析T细胞应答和抗体应答，以及用于病毒载量分析。通过ELISA和FRNT分析血清样品的埃博拉特异性体液应答。通过用具有痘苗Wyeth的ZEBOV/GP肽文库体外再刺激PBMC分析GP和痘苗特异性T细胞，随后通过ELISPOT检测IFN-γ分泌细胞。所有动物在第56天接受EBOV基奎特-9510621的肌肉内(i.m.)攻击(100pfu)。接受用MVA和FPV异源初免加强的所有三只动物均存活。在通过加强进一步改善初免之后，已经获得完全血清转化。
序列表的描述
SEQ ID NO:1[编码GP-SEBOV-马莱奥(GenBank登录号U23069.1)的DNA序列]
SEQ ID NO:2[GP-SEBOV-马莱奥(GenBank登录号U23069.1)的氨基酸序列]
SEQ ID NO:3[编码NP-SEBOV-博尼费斯(GenBank登录号AF173836.1)的DNA序列]
SEQ ID NO:4[NP-SEBOV-博尼费斯(GenBank登录号AF173836)的氨基酸序列]
SEQ ID NO:5[编码GP-MARV-穆索科(用于蛋白质序列的GenBank登录号ABA87127.1)的密码子优化的DNA序列]
SEQ ID NO:6[GP-MARV-穆索科(GenBank登录号ABA87127.1)的氨基酸序列]
SEQ ID NO:7[编码TTC的DNA序列]
SEQ ID NO:8[TTC的氨基酸序列]
SEQ ID NO:9[编码hCD40L的DNA序列]
SEQ ID NO:10[hCD40L的氨基酸序列]
SEQ ID NO:11[编码hIL15R-Sushi的DNA序列]
SEQ ID NO:12[hIL15R-Sushi的氨基酸序列]
SEQ ID NO:13[编码人LFA-3/CD58(EMBL-CDS登录号CAA75083.1)的DNA序列]
SEQ ID NO:14[人LFA-3/CD58(UniProtKB/SwissProt登录号P19256)的氨基酸序列]
SEQ ID NO:15[编码人ICAM-1/CD54(GenBank登录号BT006854)的DNA序列]
SEQ ID NO:16[人ICAM-1/CD54(UniProtKB/SwissProt登录号P05362)的氨基酸序列]
SEQ ID NO:17[编码人B7.1/CD80(EMBL-CDS登录号AAA58390.1)的DNA序列]
SEQ ID NO:18[人B7.1/CD80(UniProtKB/SwissProt登录号P33681)的氨基酸序列]
SEQ ID NO:19[编码GP-ZEBOV-梅菱噶(GenBank登录号ABX75367.1)的密码子优化的DNA]
SEQ ID NO:20[GP-ZEBOV-梅菱噶(GenBank登录号ABX75367.1)的氨基酸序列]
SEQ ID NO:21[编码VV B5R锚的DNA序列]
SEQ ID NO:22[VV B5R锚的氨基酸序列]
SEQ ID NO:23[PrS启动子的DNA序列]
SEQ ID NO:24[PrS5E启动子的DNA序列：1x(PrS)+5x(Pr7.5e)]
SEQ ID NO:25[Pr7.5启动子的DNA序列]
SEQ ID NO:26[FPV的FPV-40K启动子的DNA序列
SEQ ID NO:27[PrLE1启动子的DNA序列–1x(ATI)+5x(Pr7.5e)]
SEQ ID NO:28[编码NP-EBOV-CdI(GenBank登录号ACI28629.1)的密码子优化的DNA序列]
SEQ ID NO:29[NP-EBOV-CdI(GenBank登录号ACI28629.1)的氨基酸序列]
SEQ ID NO:30[编码GP-SEBOV-古卢(GenBank登录号AAU43887.1)的密码子优化的DNA序列]
SEQ ID NO:31[GP-SEBOV-古卢(GenBank登录号AAU43887.1)的氨基酸序列]
SEQ ID NO:32[PrLE1启动子的DNA序列–1x(ATI)+4x(Pr7.5e)]
SEQ ID NO:33[编码VP40-ZEBOV-梅菱噶序列的密码子优化的DNA序列]
SEQ ID NO:34[VP40-ZEBOV-梅菱噶序列的氨基酸序列]
SEQ ID NO:35[Pr13.5启动子序列]
SEQ ID NO:36[编码GP-MARV-安哥拉的密码子优化的DNA序列DNA序列]
SEQ ID NO:37[GP-MARV-安哥拉的氨基酸序列]
序列表
<110> 巴法里安诺迪克有限公司(Bavarian Nordic A/S)
<120> 重组修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)丝状病毒疫苗
<130> BN89PCT
<150> US 62/045,538
<151> 2014-09-03
<150> US 62/055,154
<151> 2014-09-25
<160> 37
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 2362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码GP-SEBOV-马莱奥 (GenBank登录号
U23069.1)的DNA序列
<400> 1
atttgatgaa gattaagcct gattaaggcc caaccttcat ctttttacca taatcttgtt 60
ctcaatacca tttaataggg gtatacttgc caaagcgccc ccatcttcag gatctcgcaa 120
tggagggtct tagcctactc caattgccca gagataaatt tcgaaaaagc tctttctttg 180
tttgggtcat catcttattt caaaaggcct tttccatgcc tttgggtgtt gtgaccaaca 240
gcactttaga agtaacagag attgaccagc tagtctgcaa ggatcatctt gcatcaactg 300
accagctgaa atcagttggt ctcaacctcg aggggagcgg agtatctact gatatcccat 360
ctgcgacaaa gcgttggggc ttcagatctg gtgtgcctcc ccaagtggtc agctatgaag 420
caggagaatg ggctgaaaat tgctacaatc ttgaaataaa gaaaccggac gggagcgaat 480
gcttaccccc accgccggat ggtgtcagag gctttccaag gtgccgctat gttcacaaag 540
cccaaggaac cgggccctgc ccgggtgact atgcctttca caaggatgga gctttcttcc 600
tctatgacag gctggcttca actgtaattt acagaggagt caattttgct gagggggtaa 660
tcgcattctt gatattggct aaaccaaagg aaacgttcct tcaatcaccc cccattcgag 720
aggcagcaaa ctacactgaa aatacatcaa gttactatgc cacatcctac ttggagtacg 780
aaatcgaaaa ttttggtgct caacactcca cgaccctttt caaaattaac aataatactt 840
ttgttcttct ggacaggccc cacacgcctc agttcctttt ccagctgaat gataccattc 900
aacttcacca acagttgagc aacacaactg ggaaactaat ttggacacta gatgctaata 960
tcaatgctga tattggtgaa tgggcttttt gggaaaataa aaaaatctct ccgaacaact 1020
acgtggagaa gagctgtctt tcgaaacttt atcgctcaac gagacagaag acgatgatgc 1080
gacatcgtcg agaactacaa agggaagaat ctccgaccgg gccaccagga agtattcgga 1140
cctggttcca aaggattccc ctgggatggt ttcattgcac gtaccagaag gggaaacaac 1200
attgccgtct cagaattcga cagaaggtcg aagagtagat gtgaatactc aggaaactat 1260
cacagagaca actgcaacaa tcataggcac taacggtaac aacatgcaga tctccaccat 1320
cgggacagga ctgagctcca gccaaatcct gagttcctca ccgaccatgg caccaagccc 1380
tgagactcag acctccacaa cctacacacc aaaactacca gtgatgacca ccgaggaacc 1440
aacaacacca ccgagaaact ctcctggctc aacaacagaa gcacccactc tcaccacccc 1500
agagaatata acaacagcgg ttaaaactgt ttgggcacaa gagtccacaa gcaacggtct 1560
aataacttca acagtaacag gtattcttgg gagccttgga cttcgaaaac gcagcagaag 1620
acaagttaac accagggcca cgggtaaatg caatcccaac ttacactact ggactgcaca 1680
agaacaacat aatgctgctg ggattgcctg gatcccgtac tttggaccgg gtgcagaagg 1740
catatacact gaaggcctta tgcacaacca aaatgcctta gtctgtggac tcagacaact 1800
tgcaaatgaa acaactcaag ctctgcagct tttcttaagg gccacgacgg agctgcggac 1860
atataccata ctcaatagga aggccataga tttccttctg cgacgatggg gcgggacatg 1920
taggatcctg ggaccagatt gttgcattga gccacatgat tggaccaaaa acatcactga 1980
taaaatcaac caaatcatcc atgatttcat cgacaaccct ttacccaatc aggataatga 2040
tgataattgg tggacgggct ggagacagtg gatccctgca ggaataggca ttactggaat 2100
tattattgca atcattgctc ttctttgcgt ctgcaagctg ctttgttgaa tatcaacttg 2160
aatcattaat ttaaagttga tacatttcta acattataaa ttataatctg atattaatac 2220
ttgaaaataa ggctaatgcc aaattctgtg ccaaacttga aagtaggttt accaaaatcc 2280
tttgaactgg aatgctttaa tgctctttct caatactata taagttcctt cccaaaataa 2340
tattgatgaa gattaagaaa aa 2362
<210> 2
<211> 676
<212> PRT
<213> SEBOV-马莱奥
<400> 2
Met Glu Gly Leu Ser Leu Leu Gln Leu Pro Arg Asp Lys Phe Arg Lys
1 5 10 15
Ser Ser Phe Phe Val Trp Val Ile Ile Leu Phe Gln Lys Ala Phe Ser
20 25 30
Met Pro Leu Gly Val Val Thr Asn Ser Thr Leu Glu Val Thr Glu Ile
35 40 45
Asp Gln Leu Val Cys Lys Asp His Leu Ala Ser Thr Asp Gln Leu Lys
50 55 60
Ser Val Gly Leu Asn Leu Glu Gly Ser Gly Val Ser Thr Asp Ile Pro
65 70 75 80
Ser Ala Thr Lys Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Gln Val
85 90 95
Val Ser Tyr Glu Ala Gly Glu Trp Ala Glu Asn Cys Tyr Asn Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro Pro Pro Pro Asp Gly
115 120 125
Val Arg Gly Phe Pro Arg Cys Arg Tyr Val His Lys Ala Gln Gly Thr
130 135 140
Gly Pro Cys Pro Gly Asp Tyr Ala Phe His Lys Asp Gly Ala Phe Phe
145 150 155 160
Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr Arg Gly Val Asn Phe
165 170 175
Ala Glu Gly Val Ile Ala Phe Leu Ile Leu Ala Lys Pro Lys Glu Thr
180 185 190
Phe Leu Gln Ser Pro Pro Ile Arg Glu Ala Ala Asn Tyr Thr Glu Asn
195 200 205
Thr Ser Ser Tyr Tyr Ala Thr Ser Tyr Leu Glu Tyr Glu Ile Glu Asn
210 215 220
Phe Gly Ala Gln His Ser Thr Thr Leu Phe Lys Ile Asn Asn Asn Thr
225 230 235 240
Phe Val Leu Leu Asp Arg Pro His Thr Pro Gln Phe Leu Phe Gln Leu
245 250 255
Asn Asp Thr Ile Gln Leu His Gln Gln Leu Ser Asn Thr Thr Gly Lys
260 265 270
Leu Ile Trp Thr Leu Asp Ala Asn Ile Asn Ala Asp Ile Gly Glu Trp
275 280 285
Ala Phe Trp Glu Asn Lys Lys Asn Leu Ser Glu Gln Leu Arg Gly Glu
290 295 300
Glu Leu Ser Phe Glu Thr Leu Ser Leu Asn Glu Thr Glu Asp Asp Asp
305 310 315 320
Ala Thr Ser Ser Arg Thr Thr Lys Gly Arg Ile Ser Asp Arg Ala Thr
325 330 335
Arg Lys Tyr Ser Asp Leu Val Pro Lys Asp Ser Pro Gly Met Val Ser
340 345 350
Leu His Val Pro Glu Gly Glu Thr Thr Leu Pro Ser Gln Asn Ser Thr
355 360 365
Glu Gly Arg Arg Val Asp Val Asn Thr Gln Glu Thr Ile Thr Glu Thr
370 375 380
Thr Ala Thr Ile Ile Gly Thr Asn Gly Asn Asn Met Gln Ile Ser Thr
385 390 395 400
Ile Gly Thr Gly Leu Ser Ser Ser Gln Ile Leu Ser Ser Ser Pro Thr
405 410 415
Met Ala Pro Ser Pro Glu Thr Gln Thr Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Lys
420 425 430
Leu Pro Val Met Thr Thr Glu Glu Pro Thr Thr Pro Pro Arg Asn Ser
435 440 445
Pro Gly Ser Thr Thr Glu Ala Pro Thr Leu Thr Thr Pro Glu Asn Ile
450 455 460
Thr Thr Ala Val Lys Thr Val Trp Ala Gln Glu Ser Thr Ser Asn Gly
465 470 475 480
Leu Ile Thr Ser Thr Val Thr Gly Ile Leu Gly Ser Leu Gly Leu Arg
485 490 495
Lys Arg Ser Arg Arg Gln Val Asn Thr Arg Ala Thr Gly Lys Cys Asn
500 505 510
Pro Asn Leu His Tyr Trp Thr Ala Gln Glu Gln His Asn Ala Ala Gly
515 520 525
Ile Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Gly Ala Glu Gly Ile Tyr Thr
530 535 540
Glu Gly Leu Met His Asn Gln Asn Ala Leu Val Cys Gly Leu Arg Gln
545 550 555 560
Leu Ala Asn Glu Thr Thr Gln Ala Leu Gln Leu Phe Leu Arg Ala Thr
565 570 575
Thr Glu Leu Arg Thr Tyr Thr Ile Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp Phe
580 585 590
Leu Leu Arg Arg Trp Gly Gly Thr Cys Arg Ile Leu Gly Pro Asp Cys
595 600 605
Cys Ile Glu Pro His Asp Trp Thr Lys Asn Ile Thr Asp Lys Ile Asn
610 615 620
Gln Ile Ile His Asp Phe Ile Asp Asn Pro Leu Pro Asn Gln Asp Asn
625 630 635 640
Asp Asp Asn Trp Trp Thr Gly Trp Arg Gln Trp Ile Pro Ala Gly Ile
645 650 655
Gly Ile Thr Gly Ile Ile Ile Ala Ile Ile Ala Leu Leu Cys Val Cys
660 665 670
Lys Leu Leu Cys
675
<210> 3
<211> 2926
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码NP-SEBOV-博尼费斯 (GenBank登录号
AF173836.1)的DNA序列
<400> 3
ctcaaactca aactaatatt gacattgaga ttgatctcat catttaccaa ttggagacaa 60
tttaactagt taatccccca tttgggggca ttcctaaagt gttgcgaagg tatgtgggtc 120
gtattgcttg gccttttcct aacctggctc ctcctacaat tctaaccttc ttgataagtg 180
tggttaccag agtaatagac taaatttgtc ctggtagtta gcattttcta gtaagaccga 240
tactatccca agtctcaaga gagggtgaga ggagggcccc gaggtatccc tttagtccac 300
aaaatctagc caattttagc taagtggact gattaccttc atcacacgct atctactaag 360
ggtttacctg agagcctaca acatggataa acgggtgaga ggttcatggg ccctgggagg 420
acaatctgag gttgatcttg actaccacaa gatattaaca gccgggcttt cagtccaaca 480
ggggattgtg cgacagagag tcatcccggt atatgtcgtg aatgatcttg agggtatttg 540
tcaacatatc attcaggctt ttgaagcagg tgtagatttc caggataatg ctgatagctt 600
ccttttactt ttatgtttac atcatgccta ccaaggagat cataggctct tcctcaaaag 660
tgatgcagtt caatatttag agggccatgg cttcaggttt gaggtccgag aaaaggagaa 720
tgtgcaccgt ctggatgaat tgttgcccaa tgttaccggt ggaaaaaatc tcaggagaac 780
attggctgct atgcccgaag aggagacaac ggaagctaat gctggtcagt ttctatcctt 840
tgccagtttg tttctaccca aacttgtcgt tggggagaaa gcgtgcctgg aaaaagtaca 900
aaggcaaatt caggtccatg cagaacaagg gctcattcaa tatccaactt cctggcaatc 960
agttggacac atgatggtga tcttccgttt gatgaggaca aactttttaa tcaagtttct 1020
actaatacat caagggatgc acatggttgc aggtcatgat gcgaatgaca cagtaatatc 1080
taattctgtt gcccaggcaa ggttctctgg tcttctgatt gtaaagactg ttctggatca 1140
catcctacaa aaaacagatc tcggagtacg acttcatcca ctggccagga cagcaaaagt 1200
gaagaatgag gtcagttcat tcaaggcggc tcttggttca cttgccaagc atggagaata 1260
tgctccgttt gcacgtctcc ttaatctttc tggagtcaac aacttggaac atgggcttta 1320
tccacaactt tcagccatcg ctttgggtgt tgcaactgcc cacgggagta cgcttgctgg 1380
tgtgaatgta ggggagcaat atcagcaact gcgtgaggct gctactgagg ctgaaaagca 1440
actccaacaa tatgctgaaa cacgtgagtt ggataacctt gggcttgatg aacaggagaa 1500
gaagattctc atgagcttcc accagaagaa gaatgagatc agcttccagc agactaatgc 1560
aatggtaacc ttaaggaaag aacggctggc taaattgacc gaagccatca cgactgcatc 1620
gaagatcaag gttggagacc gttatcctga tgacaatgat attccatttc ccgggccgat 1680
ctatgatgac actcacccca atccctctga tgacaatcct gatgattcac gtgatacaac 1740
tattccaggt ggtgttgttg acccgtatga tgatgagagt aataattatc ctgactacga 1800
ggattcggct gaaggcacca caggagatct tgatctcttc aatttggacg acgacgatga 1860
tgacagccga ccaggaccac cagacagggg gcagaacaag gagagggcgg cccggacata 1920
tggcctccaa gatccgacct tggacggagc gaaaaaggtg ccggagttga ccccaggttc 1980
ccatcaacca ggcaacctcc acatcaccaa gtcgggttca aacaccaacc aaccacaagg 2040
caatatgtca tctactctcc atagtatgac ccctatacag gaagaatcag agcccgatga 2100
tcaaaaagat aatgatgacg agagtctcac atcccttgac tctgaaggtg acgaagatgg 2160
tgagagcatc tctgaggaga acaccccaac tgtagctcca ccagcaccag tctacaaaga 2220
cactggagta gacactaatc agcagaatgg accaagcagt actgtagata gtcaaggttc 2280
tgaaagtgaa gctctcccaa tcaactctaa aaagagttcc gcactagaag aaacatatta 2340
tcatctccta aaaacacagg gtccatttga ggcaatcaat tattatcacc taatgagtga 2400
tgaacccatt gcttttagca ctgaaagtgg caaggaatat atctttccag actcccttga 2460
agaagcctac ccgccgtggt tgagtgagaa ggaggcctta gagaaggaaa atcgttatct 2520
ggtcattgat ggccagcaat tcctctggcc ggtaatgagc ctacgggaca agttccttgc 2580
cgttcttcaa catgactgag gacctatgat tggtggatct tgtttattcc gagcctgatt 2640
ataattgttc tgataattca agtataagca cctaccccga aatataaacc ctatcttagt 2700
tataaggaaa ttaaataaat aacctgtaag ttataggact acgaagagct gcttgtgtca 2760
atttatcatg ggttgatacc cgtaccgcaa gaatcattat ttagtagttt tggtcagctt 2820
ctgatatgta ccaataagaa aacattatag cattaaaaca taaggtatct ttcaatgagc 2880
ttaggaggat aatatcctga taaattctat agaacttaag attaag 2926
<210> 4
<211> 738
<212> PRT
<213> SEBOV-博尼费斯
<400> 4
Met Asp Lys Arg Val Arg Gly Ser Trp Ala Leu Gly Gly Gln Ser Glu
1 5 10 15
Val Asp Leu Asp Tyr His Lys Ile Leu Thr Ala Gly Leu Ser Val Gln
20 25 30
Gln Gly Ile Val Arg Gln Arg Val Ile Pro Val Tyr Val Val Asn Asp
35 40 45
Leu Glu Gly Ile Cys Gln His Ile Ile Gln Ala Phe Glu Ala Gly Val
50 55 60
Asp Phe Gln Asp Asn Ala Asp Ser Phe Leu Leu Leu Leu Cys Leu His
65 70 75 80
His Ala Tyr Gln Gly Asp His Arg Leu Phe Leu Lys Ser Asp Ala Val
85 90 95
Gln Tyr Leu Glu Gly His Gly Phe Arg Phe Glu Val Arg Glu Lys Glu
100 105 110
Asn Val His Arg Leu Asp Glu Leu Leu Pro Asn Val Thr Gly Gly Lys
115 120 125
Asn Leu Arg Arg Thr Leu Ala Ala Met Pro Glu Glu Glu Thr Thr Glu
130 135 140
Ala Asn Ala Gly Gln Phe Leu Ser Phe Ala Ser Leu Phe Leu Pro Lys
145 150 155 160
Leu Val Val Gly Glu Lys Ala Cys Leu Glu Lys Val Gln Arg Gln Ile
165 170 175
Gln Val His Ala Glu Gln Gly Leu Ile Gln Tyr Pro Thr Ser Trp Gln
180 185 190
Ser Val Gly His Met Met Val Ile Phe Arg Leu Met Arg Thr Asn Phe
195 200 205
Leu Ile Lys Phe Leu Leu Ile His Gln Gly Met His Met Val Ala Gly
210 215 220
His Asp Ala Asn Asp Thr Val Ile Ser Asn Ser Val Ala Gln Ala Arg
225 230 235 240
Phe Ser Gly Leu Leu Ile Val Lys Thr Val Leu Asp His Ile Leu Gln
245 250 255
Lys Thr Asp Leu Gly Val Arg Leu His Pro Leu Ala Arg Thr Ala Lys
260 265 270
Val Lys Asn Glu Val Ser Ser Phe Lys Ala Ala Leu Gly Ser Leu Ala
275 280 285
Lys His Gly Glu Tyr Ala Pro Phe Ala Arg Leu Leu Asn Leu Ser Gly
290 295 300
Val Asn Asn Leu Glu His Gly Leu Tyr Pro Gln Leu Ser Ala Ile Ala
305 310 315 320
Leu Gly Val Ala Thr Ala His Gly Ser Thr Leu Ala Gly Val Asn Val
325 330 335
Gly Glu Gln Tyr Gln Gln Leu Arg Glu Ala Ala Thr Glu Ala Glu Lys
340 345 350
Gln Leu Gln Gln Tyr Ala Glu Thr Arg Glu Leu Asp Asn Leu Gly Leu
355 360 365
Asp Glu Gln Glu Lys Lys Ile Leu Met Ser Phe His Gln Lys Lys Asn
370 375 380
Glu Ile Ser Phe Gln Gln Thr Asn Ala Met Val Thr Leu Arg Lys Glu
385 390 395 400
Arg Leu Ala Lys Leu Thr Glu Ala Ile Thr Thr Ala Ser Lys Ile Lys
405 410 415
Val Gly Asp Arg Tyr Pro Asp Asp Asn Asp Ile Pro Phe Pro Gly Pro
420 425 430
Ile Tyr Asp Asp Thr His Pro Asn Pro Ser Asp Asp Asn Pro Asp Asp
435 440 445
Ser Arg Asp Thr Thr Ile Pro Gly Gly Val Val Asp Pro Tyr Asp Asp
450 455 460
Glu Ser Asn Asn Tyr Pro Asp Tyr Glu Asp Ser Ala Glu Gly Thr Thr
465 470 475 480
Gly Asp Leu Asp Leu Phe Asn Leu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Arg
485 490 495
Pro Gly Pro Pro Asp Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Ala Ala Arg Thr
500 505 510
Tyr Gly Leu Gln Asp Pro Thr Leu Asp Gly Ala Lys Lys Val Pro Glu
515 520 525
Leu Thr Pro Gly Ser His Gln Pro Gly Asn Leu His Ile Thr Lys Ser
530 535 540
Gly Ser Asn Thr Asn Gln Pro Gln Gly Asn Met Ser Ser Thr Leu His
545 550 555 560
Ser Met Thr Pro Ile Gln Glu Glu Ser Glu Pro Asp Asp Gln Lys Asp
565 570 575
Asn Asp Asp Glu Ser Leu Thr Ser Leu Asp Ser Glu Gly Asp Glu Asp
580 585 590
Gly Glu Ser Ile Ser Glu Glu Asn Thr Pro Thr Val Ala Pro Pro Ala
595 600 605
Pro Val Tyr Lys Asp Thr Gly Val Asp Thr Asn Gln Gln Asn Gly Pro
610 615 620
Ser Ser Thr Val Asp Ser Gln Gly Ser Glu Ser Glu Ala Leu Pro Ile
625 630 635 640
Asn Ser Lys Lys Ser Ser Ala Leu Glu Glu Thr Tyr Tyr His Leu Leu
645 650 655
Lys Thr Gln Gly Pro Phe Glu Ala Ile Asn Tyr Tyr His Leu Met Ser
660 665 670
Asp Glu Pro Ile Ala Phe Ser Thr Glu Ser Gly Lys Glu Tyr Ile Phe
675 680 685
Pro Asp Ser Leu Glu Glu Ala Tyr Pro Pro Trp Leu Ser Glu Lys Glu
690 695 700
Ala Leu Glu Lys Glu Asn Arg Tyr Leu Val Ile Asp Gly Gln Gln Phe
705 710 715 720
Leu Trp Pro Val Met Ser Leu Arg Asp Lys Phe Leu Ala Val Leu Gln
725 730 735
His Asp
<210> 5
<211> 2046
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码GP-MARV-穆索科 (用于蛋白质序列的GenBank
登录号ABA87127.1)的密码子优化的DNA序列
<400> 5
atgaaaacaa cctgcttcct gatcagcctg atcctgatcc agggcaccaa gaacctgccc 60
atcctggaaa tcgccagcaa caaccagccc cagaacgtgg atagcgtgtg cagcggcacc 120
ctgcagaaaa ccgaggacgt gcacctgatg ggcttcacac tgagcggcca gaaggtggcc 180
gatagccccc tggaagccag caagcgctgg gccttcagaa caggggtgcc acctaagaac 240
gtggagtaca cagagggcga ggaagccaag acctgctaca acatcagcgt gaccgacccc 300
agcggcaagt ccctgctgct ggacccccct accaacatca gagactaccc taagtgcaag 360
accatccacc acatccaggg ccagaatcct cacgctcagg gcattgctct gcacctgtgg 420
ggcgcattct tcctgtatga cagaatcgcc tccaccacca tgtaccgggg caaggtgttc 480
acagagggca atatcgccgc catgatcgtg aacaagaccg tgcacaagat gatcttcagc 540
agacagggcc agggctaccg gcacatgaac ctgaccagca ccaacaagta ctggaccagc 600
agcaacggca cccagaccaa cgacaccggc tgctttggcg ccctgcagga atacaacagc 660
accaagaatc agacctgcgc ccccagcaag atccctcctc ccctgcctac cgccagaccc 720
gagatcaagc tgacaagcac ccccaccgac gccaccaagc tgaacaccac cgacccctcc 780
agcgacgatg aggacctggc aactagtggt agcggcagcg gagagagaga gccccacacc 840
acctccgatg ccgtgaccaa gcagggcctg agcagcacaa tgccccctac ccccagccct 900
cagcctagca caccccagca gggcggcaat aacaccaacc actcccagga cgccgtgacc 960
gagctggaca agaacaatac caccgcccag cctagcatgc ccccccacaa cactactacc 1020
atctccacca acaataccag caagcacaac ttcagcaccc tgagcgcccc tctgcagaac 1080
accaccaacg acaacaccca gagcaccatc acagagaacg agcagaccag cgccccttcc 1140
atcaccaccc tgccccccac cggcaatcct accaccgcca agagcaccag ctccaagaag 1200
ggtcctgcaa ctaccgcccc caacacaacc aacgagcact tcaccagccc tcccccaacc 1260
cctagctcca cagcccagca cctggtgtac ttccggcgga agcggtccat cctgtggcgg 1320
gagggcgaca tgttcccctt tctggacggc ctgattaacg cccccatcga cttcgacccc 1380
gtgcccaata ccaagaccat cttcgacgag agtagttcat caggtgcatc agccgaagag 1440
gatcagcacg ccagccccaa catctccctg accctgagct acttccccaa catcaatgag 1500
aacaccgcct acagcggcga gaacgagaac gactgcgacg ccgagctgag aatttggagc 1560
gtgcaggaag atgacctggc cgctggcctg agttggatac cattcttcgg cccaggcatc 1620
gagggtctgt acaccgccgt gctgatcaag aaccagaaca acctcgtgtg cagactgcgg 1680
agactggcca accagaccgc caagtccctg gaactgctgc tgagagtgac caccgaagag 1740
agaaccttct ccctgatcaa ccggcacgcc attgattttc tgctgacccg ctggggcgga 1800
acatgcaagg tcctgggtcc agactgttgt atcggcatcg aggacctcag caagaacatc 1860
agcgaacaga ttgaccagat caagaaggac gagcagaaag agggcacagg ctggggcctg 1920
ggcggcaagt ggtggaccag cgactggggc gtgctgacaa acctgggcat cctgctgctg 1980
ctgtctatcg ctgtgctgat tgccctgagc tgcatctgtc ggatcttcac caagtacatc 2040
ggctga 2046
<210> 6
<211> 681
<212> PRT
<213> MARV-穆索科
<400> 6
Met Lys Thr Thr Cys Phe Leu Ile Ser Leu Ile Leu Ile Gln Gly Thr
1 5 10 15
Lys Asn Leu Pro Ile Leu Glu Ile Ala Ser Asn Asn Gln Pro Gln Asn
20 25 30
Val Asp Ser Val Cys Ser Gly Thr Leu Gln Lys Thr Glu Asp Val His
35 40 45
Leu Met Gly Phe Thr Leu Ser Gly Gln Lys Val Ala Asp Ser Pro Leu
50 55 60
Glu Ala Ser Lys Arg Trp Ala Phe Arg Thr Gly Val Pro Pro Lys Asn
65 70 75 80
Val Glu Tyr Thr Glu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Cys Tyr Asn Ile Ser
85 90 95
Val Thr Asp Pro Ser Gly Lys Ser Leu Leu Leu Asp Pro Pro Thr Asn
100 105 110
Ile Arg Asp Tyr Pro Lys Cys Lys Thr Ile His His Ile Gln Gly Gln
115 120 125
Asn Pro His Ala Gln Gly Ile Ala Leu His Leu Trp Gly Ala Phe Phe
130 135 140
Leu Tyr Asp Arg Ile Ala Ser Thr Thr Met Tyr Arg Gly Lys Val Phe
145 150 155 160
Thr Glu Gly Asn Ile Ala Ala Met Ile Val Asn Lys Thr Val His Lys
165 170 175
Met Ile Phe Ser Arg Gln Gly Gln Gly Tyr Arg His Met Asn Leu Thr
180 185 190
Ser Thr Asn Lys Tyr Trp Thr Ser Ser Asn Gly Thr Gln Thr Asn Asp
195 200 205
Thr Gly Cys Phe Gly Ala Leu Gln Glu Tyr Asn Ser Thr Lys Asn Gln
210 215 220
Thr Cys Ala Pro Ser Lys Ile Pro Pro Pro Leu Pro Thr Ala Arg Pro
225 230 235 240
Glu Ile Lys Leu Thr Ser Thr Pro Thr Asp Ala Thr Lys Leu Asn Thr
245 250 255
Thr Asp Pro Ser Ser Asp Asp Glu Asp Leu Ala Thr Ser Gly Ser Gly
260 265 270
Ser Gly Glu Arg Glu Pro His Thr Thr Ser Asp Ala Val Thr Lys Gln
275 280 285
Gly Leu Ser Ser Thr Met Pro Pro Thr Pro Ser Pro Gln Pro Ser Thr
290 295 300
Pro Gln Gln Gly Gly Asn Asn Thr Asn His Ser Gln Asp Ala Val Thr
305 310 315 320
Glu Leu Asp Lys Asn Asn Thr Thr Ala Gln Pro Ser Met Pro Pro His
325 330 335
Asn Thr Thr Thr Ile Ser Thr Asn Asn Thr Ser Lys His Asn Phe Ser
340 345 350
Thr Leu Ser Ala Pro Leu Gln Asn Thr Thr Asn Asp Asn Thr Gln Ser
355 360 365
Thr Ile Thr Glu Asn Glu Gln Thr Ser Ala Pro Ser Ile Thr Thr Leu
370 375 380
Pro Pro Thr Gly Asn Pro Thr Thr Ala Lys Ser Thr Ser Ser Lys Lys
385 390 395 400
Gly Pro Ala Thr Thr Ala Pro Asn Thr Thr Asn Glu His Phe Thr Ser
405 410 415
Pro Pro Pro Thr Pro Ser Ser Thr Ala Gln His Leu Val Tyr Phe Arg
420 425 430
Arg Lys Arg Ser Ile Leu Trp Arg Glu Gly Asp Met Phe Pro Phe Leu
435 440 445
Asp Gly Leu Ile Asn Ala Pro Ile Asp Phe Asp Pro Val Pro Asn Thr
450 455 460
Lys Thr Ile Phe Asp Glu Ser Ser Ser Ser Gly Ala Ser Ala Glu Glu
465 470 475 480
Asp Gln His Ala Ser Pro Asn Ile Ser Leu Thr Leu Ser Tyr Phe Pro
485 490 495
Asn Ile Asn Glu Asn Thr Ala Tyr Ser Gly Glu Asn Glu Asn Asp Cys
500 505 510
Asp Ala Glu Leu Arg Ile Trp Ser Val Gln Glu Asp Asp Leu Ala Ala
515 520 525
Gly Leu Ser Trp Ile Pro Phe Phe Gly Pro Gly Ile Glu Gly Leu Tyr
530 535 540
Thr Ala Val Leu Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Val Cys Arg Leu Arg
545 550 555 560
Arg Leu Ala Asn Gln Thr Ala Lys Ser Leu Glu Leu Leu Leu Arg Val
565 570 575
Thr Thr Glu Glu Arg Thr Phe Ser Leu Ile Asn Arg His Ala Ile Asp
580 585 590
Phe Leu Leu Thr Arg Trp Gly Gly Thr Cys Lys Val Leu Gly Pro Asp
595 600 605
Cys Cys Ile Gly Ile Glu Asp Leu Ser Lys Asn Ile Ser Glu Gln Ile
610 615 620
Asp Gln Ile Lys Lys Asp Glu Gln Lys Glu Gly Thr Gly Trp Gly Leu
625 630 635 640
Gly Gly Lys Trp Trp Thr Ser Asp Trp Gly Val Leu Thr Asn Leu Gly
645 650 655
Ile Leu Leu Leu Leu Ser Ile Ala Val Leu Ile Ala Leu Ser Cys Ile
660 665 670
Cys Arg Ile Phe Thr Lys Tyr Ile Gly
675 680
<210> 7
<211> 3642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码TTC的DNA序列
<400> 7
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtc ctgctcctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
gacgaagtga agcaggaaaa ccggctgctg aacgagagcg agagcagcag ccagggcctg 120
ctgggctact acttcagcga cctgaacttc caggccccca tggtggtgac cagcagcacc 180
accggcgacc tgagcatccc cagcagcgag ctggaaaaca tccccagcga gaaccagtac 240
ttccagagcg ccatttggag cggcttcatc aaagtgaaga agtccgacga gtacaccttc 300
gccacctccg ccgacaacca cgtgaccatg tgggtggacg accaggaagt gatcaacaag 360
gccagcaaca gcaacaagat ccggctggaa aagggccggc tgtaccagat caagatccag 420
taccagagag agaaccccac cgagaagggc ctggacttca agctgtactg gaccgacagc 480
cagaacaaga aagaagtgat cagcagcgac aacctgcagc tgcccgagct gaagcagaag 540
tccagcaact cccggaagaa gcggagcacc agcgccggac ccaccgtgcc cgaccgggac 600
aacgacggca tccccgacag cctggaagtg gagggctaca ccgtggacgt gaagaacaag 660
cggaccttcc tgagcccctg gatcagcaac atccacgaga agaaggggct gaccaagtac 720
aagagcagcc ccgagaagtg gagcaccgcc agcgacccct acagcgactt cgagaaagtg 780
accggccgga tcgacaagaa cgtgtccccc gaggccagac accctctggt ggccgcctac 840
cccatcgtgc acgtggacat ggaaaatatc atcctgagca agaacgagga ccagagcacc 900
cagaacaccg actcccagac ccggaccatc agcaagaaca ccagcaccag cagaacccac 960
acaagcgaag tgcacggcaa cgccgaagtg cacgccagct ttttcgacat cggagggagc 1020
gtgtccgccg gcttcagcaa ctccaacagc agcaccgtgg ccatcgacca cagcctgagc 1080
ctggccggcg agagaacctg ggccgagaca atgggcctga acaccgccga caccgccaga 1140
ctgaacgcca acatccgcta cgtgaacacc ggcaccgccc ccatctacaa cgtgctgccc 1200
accacctccc tggtgctggg caagaaccag accctggcca ccatcaaggc caaagagaac 1260
cagctgtccc agatcctggc ccccaacaac tactacccca gcaagaacct ggcccctatc 1320
gccctgaacg cccaggacga cttctcttct acccccatca ccatgaacta caaccagttt 1380
ctggaactgg aaaagaccaa gcagctgcgg ctggacaccg accaggtgta cggcaatatc 1440
gccacctaca acttcgagaa cggcagagtg cgcgtggaca ccggcagcaa ttggagcgag 1500
gtgctgcctc agatccagga aaccaccgcc cggatcatct tcaacggcaa ggacctgaac 1560
ctggtggagc ggcggatcgc cgccgtgaac ccctccgacc ccctggaaac caccaagccc 1620
gacatgaccc tgaaagaggc cctgaagatc gccttcggct tcaacgagcc caacggcaac 1680
ctgcagtacc agggcaagga catcaccgag ttcgacttca acttcgacca gcagacctcc 1740
cagaacatca agaatcagct ggccgaactg aacgtgacca acatctacac agtgctggac 1800
aagatcaagc tgaatgccaa gatgaacatc ctgatccggg acaagcggtt ccactacgac 1860
cggaacaata tcgccgtggg cgccgacgag agcgtggtga aagaagccca ccgggaagtc 1920
attaacagct ccaccgaggg gctgctgctg aacatcgaca aggacatccg caagatcctg 1980
agcggctaca tcgtggagat cgaggacacc gagggcctga aagaagtcat taacgaccgc 2040
tacgacatgc tgaatatcag cagcctgcgg caggacggca agaccttcat cgacttcaag 2100
aagtacaacg acaagctgcc cctgtacatc agcaacccca actacaaagt gaacgtgtac 2160
gccgtgacca aagagaatac catcatcaac cctagcgaga acggcgacac ctccaccaac 2220
ggcatcaaga agatcctgat cttcagcaag aagggctacg agatcggcgg acccggccct 2280
aagaacctgg actgctgggt ggacaacgaa gaggacatcg acgtgatcct gaagaagtct 2340
accatcctga atctggacat caacaacgac atcatcagcg acatctccgg cttcaacagc 2400
agcgtgatca cctaccccga cgcccagctg gtgcctggca tcaatggcaa ggccatccac 2460
ctggtgaaca acgagagcag cgaagtgatc gtgcacaagg ccatggacat cgagtacaac 2520
gatatgttca acaacttcac cgtgtccttt tggctgcggg tgcccaaggt gtccgccagc 2580
cacctggaac agtacggcac caacgagtac agcatcatca gcagcatgaa gaagcacagc 2640
ctgtccatcg gcagcgggtg gagcgtgtcc ctgaagggca acaacctgat ctggaccctg 2700
aaggactctg ccggcgaagt gcggcagatc accttccgcg acctgcccga caagttcaac 2760
gcctacctgg ccaataagtg ggtgttcatc accatcacca acgacagact gtccagcgcc 2820
aacctgtata tcaacggcgt gctgatgggc agcgccgaga tcacaggcct gggcgccatc 2880
cgggaggaca acaacatcac cctgaagctg gaccggtgca acaacaacaa ccagtacgtg 2940
tccatcgaca agttccgcat cttctgcaag gccctgaatc ccaaagagat cgagaagctg 3000
tacaccagct acctgtccat cacctttctg cgggatttct ggggcaaccc tctgagatac 3060
gacaccgagt actacctgat ccccgtggcc agcagctcca aggacgtgca gctgaagaac 3120
atcaccgact acatgtacct gaccaacgcc cccagctaca ccaatggcaa gctgaacatc 3180
tactaccggc ggctgtacaa cggcctgaag ttcatcatca agcggtacac ccccaacaat 3240
gagatcgaca gcttcgtgaa gtccggcgac ttcatcaagc tgtatgtgtc ctacaacaac 3300
aatgagcaca tcgtgggcta ccccaaggac gggaacgcct tcaacaacct ggaccggatc 3360
ctgagagtgg gctacaacgc ccctggcatc cccctgtaca agaaaatgga agccgtgaag 3420
ctgcgggacc tgaaaaccta ctctgtgcag ctgaaactgt acgacgacaa gaacgccagc 3480
ctgggcctgg tggggaccca caacggccag atcggcaacg accccaaccg ggatatcctg 3540
atcgccagca actggtactt caaccacctg aaggacaaga tcctgggctg cgattggtac 3600
ttcgtgccca ccgacgaggg ctggaccaac gacaagcttt ga 3642
<210> 8
<211> 1213
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Glu Val Lys Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu
20 25 30
Ser Glu Ser Ser Ser Gln Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu
35 40 45
Asn Phe Gln Ala Pro Met Val Val Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp Leu
50 55 60
Ser Ile Pro Ser Ser Glu Leu Glu Asn Ile Pro Ser Glu Asn Gln Tyr
65 70 75 80
Phe Gln Ser Ala Ile Trp Ser Gly Phe Ile Lys Val Lys Lys Ser Asp
85 90 95
Glu Tyr Thr Phe Ala Thr Ser Ala Asp Asn His Val Thr Met Trp Val
100 105 110
Asp Asp Gln Glu Val Ile Asn Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg
115 120 125
Leu Glu Lys Gly Arg Leu Tyr Gln Ile Lys Ile Gln Tyr Gln Arg Glu
130 135 140
Asn Pro Thr Glu Lys Gly Leu Asp Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser
145 150 155 160
Gln Asn Lys Lys Glu Val Ile Ser Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu
165 170 175
Leu Lys Gln Lys Ser Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala
180 185 190
Gly Pro Thr Val Pro Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp Ser Leu
195 200 205
Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp Val Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu
210 215 220
Ser Pro Trp Ile Ser Asn Ile His Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr
225 230 235 240
Lys Ser Ser Pro Glu Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp
245 250 255
Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val Ser Pro Glu Ala
260 265 270
Arg His Pro Leu Val Ala Ala Tyr Pro Ile Val His Val Asp Met Glu
275 280 285
Asn Ile Ile Leu Ser Lys Asn Glu Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp
290 295 300
Ser Gln Thr Arg Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His
305 310 315 320
Thr Ser Glu Val His Gly Asn Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp
325 330 335
Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr
340 345 350
Val Ala Ile Asp His Ser Leu Ser Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala
355 360 365
Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn
370 375 380
Ile Arg Tyr Val Asn Thr Gly Thr Ala Pro Ile Tyr Asn Val Leu Pro
385 390 395 400
Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly Lys Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys
405 410 415
Ala Lys Glu Asn Gln Leu Ser Gln Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr
420 425 430
Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Phe
435 440 445
Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met Asn Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu
450 455 460
Lys Thr Lys Gln Leu Arg Leu Asp Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile
465 470 475 480
Ala Thr Tyr Asn Phe Glu Asn Gly Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser
485 490 495
Asn Trp Ser Glu Val Leu Pro Gln Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile
500 505 510
Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala
515 520 525
Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu
530 535 540
Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn
545 550 555 560
Leu Gln Tyr Gln Gly Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp
565 570 575
Gln Gln Thr Ser Gln Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Val
580 585 590
Thr Asn Ile Tyr Thr Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met
595 600 605
Asn Ile Leu Ile Arg Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile
610 615 620
Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val
625 630 635 640
Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile
645 650 655
Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly
660 665 670
Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser
675 680 685
Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp
690 695 700
Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr
705 710 715 720
Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp
725 730 735
Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly
740 745 750
Tyr Glu Ile Gly Gly Pro Gly Pro Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp
755 760 765
Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn
770 775 780
Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser
785 790 795 800
Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly
805 810 815
Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His
820 825 830
Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val
835 840 845
Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln
850 855 860
Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser
865 870 875 880
Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu
885 890 895
Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe
900 905 910
Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val
915 920 925
Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile
930 935 940
Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile
945 950 955 960
Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn
965 970 975
Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu
980 985 990
Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr
995 1000 1005
Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu
1010 1015 1020
Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Asp Val Gln Leu
1025 1030 1035
Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn Ala Pro Ser Tyr
1040 1045 1050
Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu Tyr Asn Gly
1055 1060 1065
Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp
1070 1075 1080
Ser Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser Tyr
1085 1090 1095
Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala
1100 1105 1110
Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro
1115 1120 1125
Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp
1130 1135 1140
Leu Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn
1145 1150 1155
Ala Ser Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn
1160 1165 1170
Asp Pro Asn Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn
1175 1180 1185
His Leu Lys Asp Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro
1190 1195 1200
Thr Asp Glu Gly Trp Thr Asn Asp Lys Leu
1205 1210
<210> 9
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hCD40L的DNA序列
<400> 9
atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60
atgaaaattt tcatgtattt acttactgtc tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120
ctttttgctg tgtatcttca tagaaggttg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180
gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240
ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300
aacaaagagg agacgaagaa agaaaacagc tttgaaatgc aaaaaggtga tcagaatcct 360
caaattgcgg cacatgtcat aagtgaggcc agcagtaaaa caacatctgt gttacagtgg 420
gctgaaaaag gatactacac catgagcaac aacttggtaa ccctggaaaa tgggaaacag 480
ctgaccgtta aaagacaagg actctattat atctatgccc aagtcacctt ctgttccaat 540
cgggaagctt cgagtcaagc tccatttata gccagcctct gcctaaagtc tcccggtaga 600
ttcgagagaa tcttactcag agctgcaaat acccacagtt ccgccaaacc ttgcgggcaa 660
caatccattc acttgggagg agtatttgaa ttgcaaccag gtgcttcggt gtttgtcaat 720
gtgactgatc caagccaagt gagccatggc actggcttca cgtcctttgg cttactcaaa 780
ctctga 786
<210> 10
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 11
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hIL15R-Sushi的DNA序列
<400> 11
atggccccca gacgggccag aggctgtaga accctgggac tgcctgccct gctgctgctc 60
ctcctgctga ggcctcctgc cacccggggc atcacctgtc ccccacccat gagcgtggaa 120
cacgccgaca tctgggtcaa gagctacagc ctgtacagca gagagcggta catctgcaac 180
agcggcttca agcggaaggc cggcaccagc agcctgaccg agtgcgtgct gaacaaggcc 240
accaacgtgg cccactggac cacccccagc ctgaagtgca tcagggaccc cgccctggtg 300
catcagaggc ctgctcctcc aagcggcgga tctggcggcg gaggaagtgg cggaggatca 360
ggcggaggcg gcagcctgca gaactgggtc aacgtgatca gcgacctgaa gaagatcgag 420
gacctgatcc agagcatgca catcgacgcc accctgtaca ccgagagcga cgtgcacccc 480
agctgcaaag tgaccgccat gaagtgcttt ctgctggaac tgcaggtcat cagcctggaa 540
agcggcgacg ccagcatcca cgacaccgtg gaaaacctga tcatcctggc caacaacagc 600
ctgagcagca acggcaacgt gaccgagagc ggctgcaaag agtgcgagga actggaagag 660
aagaatatca aagagttcct gcagagcttc gtgcacatcg tgcagatgtt catcaacacc 720
agctga 726
<210> 12
<211> 241
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr
20 25 30
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
35 40 45
Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
65 70 75 80
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
85 90 95
Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln Asn
115 120 125
Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln
130 135 140
Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro
145 150 155 160
Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val
165 170 175
Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn
180 185 190
Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr
195 200 205
Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys
210 215 220
Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr
225 230 235 240
Ser
<210> 13
<211> 753
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
atggttgctg ggagcgacgc ggggcgggcc ctgggggtcc tcagcgtggt ctgcctgctg 60
cactgctttg gtttcatcag ctgtttttcc caacaaatat atggtgttgt gtatgggaat 120
gtaactttcc atgtaccaag caatgtgcct ttaaaagagg tcctatggaa aaaacaaaag 180
gataaagttg cagaactgga aaattctgaa ttcagagctt tctcatcttt taaaaatagg 240
gtttatttag acactgtgtc aggtagcctc actatctaca acttaacatc atcagatgaa 300
gatgagtatg aaatggaatc gccaaatatt actgatacca tgaagttctt tctttatgtg 360
cttgagtctc ttccatctcc cacactaact tgtgcattga ctaatggaag cattgaagtc 420
caatgcatga taccagagca ttacaacagc catcgaggac ttataatgta ctcatgggat 480
tgtcctatgg agcaatgtaa acgtaactca accagtatat attttaagat ggaaaatgat 540
cttccacaaa aaatacagtg tactcttagc aatccattat ttaatacaac atcatcaatc 600
attttgacaa cctgtatccc aagcagcggt cattcaagac acagatatgc acttataccc 660
ataccattag cagtaattac aacatgtatt gtgctgtata tgaatggtat tctgaaatgt 720
gacagaaaac cagacagaac caactccaat tga 753
<210> 14
<211> 250
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val
1 5 10 15
Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln
20 25 30
Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn
35 40 45
Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala
50 55 60
Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg
65 70 75 80
Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr
85 90 95
Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp
100 105 110
Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr
115 120 125
Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val Gln Cys Met Ile
130 135 140
Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met Tyr Ser Trp Asp
145 150 155 160
Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser Ile Tyr Phe Lys
165 170 175
Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr Leu Ser Asn Pro
180 185 190
Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr Cys Ile Pro Ser
195 200 205
Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala
210 215 220
Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly Ile Leu Lys Cys
225 230 235 240
Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn
245 250
<210> 15
<211> 1599
<212> DNA
<213> 智人
<400> 15
atggctccca gcagcccccg gcccgcgctg cccgcactcc tggtcctgct cggggctctg 60
ttcccaggac ctggcaatgc ccagacatct gtgtccccct caaaagtcat cctgccccgg 120
ggaggctccg tgctggtgac atgcagcacc tcctgtgacc agcccaagtt gttgggcata 180
gagaccccgt tgcctaaaaa ggagttgctc ctgcctggga acaaccggaa ggtgtatgaa 240
ctgagcaatg tgcaagaaga tagccaacca atgtgctatt caaactgccc tgatgggcag 300
tcaacagcta aaaccttcct caccgtgtac tggactccag aacgggtgga actggcaccc 360
ctcccctctt ggcagccagt gggcaagaac cttaccctac gctgccaggt ggagggtggg 420
gcaccccggg ccaacctcac cgtggtgctg ctccgtgggg agaaggagct gaaacgggag 480
ccagctgtgg gggagcccgc tgaggtcacg accacggtgc tggtgaggag agatcaccat 540
ggagccaatt tctcgtgccg cactgaactg gacctgcggc cccaagggct ggagctgttt 600
gagaacacct cggcccccta ccagctccag acctttgtcc tgccagcgac tcccccacaa 660
cttgtcagcc cccgggtcct agaggtggac acgcagggga ccgtggtctg ttccctggac 720
gggctgttcc cagtctcgga ggcccaggtc cacctggcac tgggggacca gaggttgaac 780
cccacagtca cctatggcaa cgactccttc tcggccaagg cctcagtcag tgtgaccgca 840
gaggacgagg gcacccagcg gctgacgtgt gcagtaatac tggggaacca gagccaggag 900
acactgcaga cagtgaccat ctacagcttt ccggcgccca acgtgattct gacgaagcca 960
gaggtctcag aagggaccga ggtgacagtg aagtgtgagg cccaccctag agccaaggtg 1020
acgctgaatg gggttccagc ccagccactg ggcccgaggg cccagctcct gctgaaggcc 1080
accccagagg acaacgggcg cagcttctcc tgctctgcaa ccctggaggt ggccggccag 1140
cttatacaca agaaccagac ccgggagctt cgtgtcctgt atggcccccg actggacgag 1200
agggattgtc cgggaaactg gacgtggcca gaaaattccc agcagactcc aatgtgccag 1260
gcttggggga acccattgcc cgagctcaag tgtctaaagg atggcacttt cccactgccc 1320
atcggggaat cagtgactgt cactcgagat cttgagggca cctacctctg tcgggccagg 1380
agcactcaag gggaggtcac ccgcaaggtg accgtgaatg tgctctcccc ccggtatgag 1440
attgtcatca tcactgtggt agcagccgca gtcataatgg gcactgcagg cctcagcacg 1500
tacctctata accgccagcg gaagatcaag aaatacagac tacaacaggc ccaaaaaggg 1560
acccccatga aaccgaacac acaagccacg cctccctag 1599
<210> 16
<211> 532
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Met Ala Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ala Leu Pro Ala Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Gly Ala Leu Phe Pro Gly Pro Gly Asn Ala Gln Thr Ser Val Ser
20 25 30
Pro Ser Lys Val Ile Leu Pro Arg Gly Gly Ser Val Leu Val Thr Cys
35 40 45
Ser Thr Ser Cys Asp Gln Pro Lys Leu Leu Gly Ile Glu Thr Pro Leu
50 55 60
Pro Lys Lys Glu Leu Leu Leu Pro Gly Asn Asn Arg Lys Val Tyr Glu
65 70 75 80
Leu Ser Asn Val Gln Glu Asp Ser Gln Pro Met Cys Tyr Ser Asn Cys
85 90 95
Pro Asp Gly Gln Ser Thr Ala Lys Thr Phe Leu Thr Val Tyr Trp Thr
100 105 110
Pro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Ser Trp Gln Pro Val Gly
115 120 125
Lys Asn Leu Thr Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly Gly Ala Pro Arg Ala
130 135 140
Asn Leu Thr Val Val Leu Leu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Lys Arg Glu
145 150 155 160
Pro Ala Val Gly Glu Pro Ala Glu Val Thr Thr Thr Val Leu Val Arg
165 170 175
Arg Asp His His Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg Thr Glu Leu Asp Leu
180 185 190
Arg Pro Gln Gly Leu Glu Leu Phe Glu Asn Thr Ser Ala Pro Tyr Gln
195 200 205
Leu Gln Thr Phe Val Leu Pro Ala Thr Pro Pro Gln Leu Val Ser Pro
210 215 220
Arg Val Leu Glu Val Asp Thr Gln Gly Thr Val Val Cys Ser Leu Asp
225 230 235 240
Gly Leu Phe Pro Val Ser Glu Ala Gln Val His Leu Ala Leu Gly Asp
245 250 255
Gln Arg Leu Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Asn Asp Ser Phe Ser Ala
260 265 270
Lys Ala Ser Val Ser Val Thr Ala Glu Asp Glu Gly Thr Gln Arg Leu
275 280 285
Thr Cys Ala Val Ile Leu Gly Asn Gln Ser Gln Glu Thr Leu Gln Thr
290 295 300
Val Thr Ile Tyr Ser Phe Pro Ala Pro Asn Val Ile Leu Thr Lys Pro
305 310 315 320
Glu Val Ser Glu Gly Thr Glu Val Thr Val Lys Cys Glu Ala His Pro
325 330 335
Arg Ala Lys Val Thr Leu Asn Gly Val Pro Ala Gln Pro Leu Gly Pro
340 345 350
Arg Ala Gln Leu Leu Leu Lys Ala Thr Pro Glu Asp Asn Gly Arg Ser
355 360 365
Phe Ser Cys Ser Ala Thr Leu Glu Val Ala Gly Gln Leu Ile His Lys
370 375 380
Asn Gln Thr Arg Glu Leu Arg Val Leu Tyr Gly Pro Arg Leu Asp Glu
385 390 395 400
Arg Asp Cys Pro Gly Asn Trp Thr Trp Pro Glu Asn Ser Gln Gln Thr
405 410 415
Pro Met Cys Gln Ala Trp Gly Asn Pro Leu Pro Glu Leu Lys Cys Leu
420 425 430
Lys Asp Gly Thr Phe Pro Leu Pro Ile Gly Glu Ser Val Thr Val Thr
435 440 445
Arg Asp Leu Glu Gly Thr Tyr Leu Cys Arg Ala Arg Ser Thr Gln Gly
450 455 460
Glu Val Thr Arg Lys Val Thr Val Asn Val Leu Ser Pro Arg Tyr Glu
465 470 475 480
Ile Val Ile Ile Thr Val Val Ala Ala Ala Val Ile Met Gly Thr Ala
485 490 495
Gly Leu Ser Thr Tyr Leu Tyr Asn Arg Gln Arg Lys Ile Lys Lys Tyr
500 505 510
Arg Leu Gln Gln Ala Gln Lys Gly Thr Pro Met Lys Pro Asn Thr Gln
515 520 525
Ala Thr Pro Pro
530
<210> 17
<211> 867
<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60
cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag 120
gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca 180
caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac 240
atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc 300
attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag 360
tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct 420
gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata 480
atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa 540
gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt 600
agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat 660
ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct 720
gataacctgc tcccatcctg ggccattacc ttaatctcag taaatggaat ttttgtgata 780
tgctgcctga cctactgctt tgccccaaga tgcagagaga gaaggaggaa tgagagattg 840
agaagggaaa gtgtacgccc tgtataa 867
<210> 18
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr
1 5 10 15
Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys
20 25 30
Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu
35 40 45
Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile
50 55 60
Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp
65 70 75 80
Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr
85 90 95
Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly
100 105 110
Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg
115 120 125
Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr
130 135 140
Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile
145 150 155 160
Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu
165 170 175
Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp
180 185 190
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met
195 200 205
Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg
210 215 220
Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro
225 230 235 240
Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly
245 250 255
Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg
260 265 270
Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val
275 280 285
<210> 19
<211> 2031
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码GP-ZEBOV-梅菱噶 (GenBank登录号ABX75367.1)的密码子优化的DNA
<400> 19
atgggcgtga caggcattct gcagctcccc agagacagat tcaagcggac ctcctttttc 60
ctctgggtca tcattctgtt tcagcggacc ttctccatcc ctctgggcgt gatccacaat 120
agcaccctcc aggtgtccga cgtggacaag ctcgtgtgcc gggacaagct gtcctccacc 180
aaccagctga gaagcgtggg gctgaatctc gagggcaatg gcgtggccac agacgtgccc 240
tccgccacaa agcgctgggg ctttcggagc ggcgtccctc ctaaagtcgt gaactacgag 300
gcaggggaat gggctgaaaa ttgttacaat ctcgagatca aaaaaccaga tggctctgag 360
tgcctgcctg ccgcaccaga cggcatcagg ggcttcccta gatgccgcta tgtgcacaag 420
gtgagtggta caggcccttg tgccggcgat tttgcctttc acaaagaggg ggctttcttt 480
ctgtacgaca ggctcgccag tacagtgata taccgaggta ctaccttcgc cgaaggcgtg 540
gtggcctttc tgattctgcc ccaggccaag aaggacttct tcagcagcca ccccctgaga 600
gaacccgtga acgccacaga ggaccccagc agcggctact acagcaccac aatcagatac 660
caggccacag gcttcggcac caatgagaca gagtacctgt tcgaggtgga caacctgacc 720
tacgtgcagc tggaaagccg gtttacccct cagttcctcc tgcagctcaa cgagacaatc 780
tacacctccg gcaagcggag caacacaaca ggcaagctca tctggaaagt gaaccccgag 840
atcgatacca ctatagggga gtgggctttc tgggaaacta agaagaacct cacccggaag 900
atcagatccg aggaactgtc cttcaccgtg gtgtccaacg gcgccaagaa catttcagga 960
cagagccccg ccagaacaag cagcgacccc ggcaccaaca ccacaaccga ggaccacaag 1020
atcatggcca gcgagaactc cagcgccatg gtgcaggtcc acagccaggg aagagaagcc 1080
gccgtgagcc acctgaccac actggccacc atcagcacca gcccccagag cctgaccacc 1140
aagcctggcc ccgacaacag cacacacaac acccccgtgt acaagctgga catcagcgag 1200
gccacccagg tggagcagca ccacagacgg accgacaacg acagcaccgc cagcgatacc 1260
ccttctgcca ccacagccgc cggaccccct aaggccgaga ataccaacac cagcaagagc 1320
accgactttc tggatccagc caccaccacc agtccacaga accacagcga aaccgccggc 1380
aacaacaata cccaccacca ggacaccggc gaggaaagcg ccagctctgg caagctgggc 1440
ctgattacca acacaatcgc cggcgtggcc ggactgatca ccggcggcag acggaccaga 1500
cgggaggcca tcgtgaacgc ccagcccaaa tgtaatccta atctccacta ttggaccaca 1560
caggacgagg gcgctgccat cggactggca tggattcctt acttcggacc agccgctgaa 1620
gggatctata tcgaggggct catgcataac caggatggtc tgatttgtgg tctccggcag 1680
ctggctaatg agacaacaca ggctctccag ctgtttctga gagccacaac agagctgaga 1740
accttcagca ttctcaaccg caaggctatt gacttcctgc tccaacgatg gggaggcaca 1800
tgccacatcc tggggcctga ttgttgtatc gaacctcacg attggacaaa gaacattaca 1860
gataagatcg atcagattat ccatgacttt gtggacaaga ccctgcccga tcagggcgac 1920
aacgataatt ggtggacagg gtggagacag tggattccag ccgggattgg cgtgaccggc 1980
gtgattatcg ccgtgatcgc cctgttctgc atctgcaagt tcgtgttctg a 2031
<210> 20
<211> 676
<212> PRT
<213> ZEBOV-梅菱噶
<400> 20
Met Gly Val Thr Gly Ile Leu Gln Leu Pro Arg Asp Arg Phe Lys Arg
1 5 10 15
Thr Ser Phe Phe Leu Trp Val Ile Ile Leu Phe Gln Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Ile Pro Leu Gly Val Ile His Asn Ser Thr Leu Gln Val Ser Asp Val
35 40 45
Asp Lys Leu Val Cys Arg Asp Lys Leu Ser Ser Thr Asn Gln Leu Arg
50 55 60
Ser Val Gly Leu Asn Leu Glu Gly Asn Gly Val Ala Thr Asp Val Pro
65 70 75 80
Ser Ala Thr Lys Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Lys Val
85 90 95
Val Asn Tyr Glu Ala Gly Glu Trp Ala Glu Asn Cys Tyr Asn Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro Ala Ala Pro Asp Gly
115 120 125
Ile Arg Gly Phe Pro Arg Cys Arg Tyr Val His Lys Val Ser Gly Thr
130 135 140
Gly Pro Cys Ala Gly Asp Phe Ala Phe His Lys Glu Gly Ala Phe Phe
145 150 155 160
Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr Arg Gly Thr Thr Phe
165 170 175
Ala Glu Gly Val Val Ala Phe Leu Ile Leu Pro Gln Ala Lys Lys Asp
180 185 190
Phe Phe Ser Ser His Pro Leu Arg Glu Pro Val Asn Ala Thr Glu Asp
195 200 205
Pro Ser Ser Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr Ile Arg Tyr Gln Ala Thr Gly
210 215 220
Phe Gly Thr Asn Glu Thr Glu Tyr Leu Phe Glu Val Asp Asn Leu Thr
225 230 235 240
Tyr Val Gln Leu Glu Ser Arg Phe Thr Pro Gln Phe Leu Leu Gln Leu
245 250 255
Asn Glu Thr Ile Tyr Thr Ser Gly Lys Arg Ser Asn Thr Thr Gly Lys
260 265 270
Leu Ile Trp Lys Val Asn Pro Glu Ile Asp Thr Thr Ile Gly Glu Trp
275 280 285
Ala Phe Trp Glu Thr Lys Lys Asn Leu Thr Arg Lys Ile Arg Ser Glu
290 295 300
Glu Leu Ser Phe Thr Val Val Ser Asn Gly Ala Lys Asn Ile Ser Gly
305 310 315 320
Gln Ser Pro Ala Arg Thr Ser Ser Asp Pro Gly Thr Asn Thr Thr Thr
325 330 335
Glu Asp His Lys Ile Met Ala Ser Glu Asn Ser Ser Ala Met Val Gln
340 345 350
Val His Ser Gln Gly Arg Glu Ala Ala Val Ser His Leu Thr Thr Leu
355 360 365
Ala Thr Ile Ser Thr Ser Pro Gln Ser Leu Thr Thr Lys Pro Gly Pro
370 375 380
Asp Asn Ser Thr His Asn Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser Glu
385 390 395 400
Ala Thr Gln Val Glu Gln His His Arg Arg Thr Asp Asn Asp Ser Thr
405 410 415
Ala Ser Asp Thr Pro Ser Ala Thr Thr Ala Ala Gly Pro Pro Lys Ala
420 425 430
Glu Asn Thr Asn Thr Ser Lys Ser Thr Asp Phe Leu Asp Pro Ala Thr
435 440 445
Thr Thr Ser Pro Gln Asn His Ser Glu Thr Ala Gly Asn Asn Asn Thr
450 455 460
His His Gln Asp Thr Gly Glu Glu Ser Ala Ser Ser Gly Lys Leu Gly
465 470 475 480
Leu Ile Thr Asn Thr Ile Ala Gly Val Ala Gly Leu Ile Thr Gly Gly
485 490 495
Arg Arg Thr Arg Arg Glu Ala Ile Val Asn Ala Gln Pro Lys Cys Asn
500 505 510
Pro Asn Leu His Tyr Trp Thr Thr Gln Asp Glu Gly Ala Ala Ile Gly
515 520 525
Leu Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala Glu Gly Ile Tyr Ile
530 535 540
Glu Gly Leu Met His Asn Gln Asp Gly Leu Ile Cys Gly Leu Arg Gln
545 550 555 560
Leu Ala Asn Glu Thr Thr Gln Ala Leu Gln Leu Phe Leu Arg Ala Thr
565 570 575
Thr Glu Leu Arg Thr Phe Ser Ile Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp Phe
580 585 590
Leu Leu Gln Arg Trp Gly Gly Thr Cys His Ile Leu Gly Pro Asp Cys
595 600 605
Cys Ile Glu Pro His Asp Trp Thr Lys Asn Ile Thr Asp Lys Ile Asp
610 615 620
Gln Ile Ile His Asp Phe Val Asp Lys Thr Leu Pro Asp Gln Gly Asp
625 630 635 640
Asn Asp Asn Trp Trp Thr Gly Trp Arg Gln Trp Ile Pro Ala Gly Ile
645 650 655
Gly Val Thr Gly Val Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu Phe Cys Ile Cys
660 665 670
Lys Phe Val Phe
675
<210> 21
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码VV B5R锚的DNA序列
<400> 21
cctaagcctt ctacacctcc tggcagcagc gccacctacc acatcatcat cgtggccctg 60
acaattatgg gcgtgatctt cctgatcagc gtgatcgtgc tcgtgtgcag ctgcgacaag 120
aacaacgacc agtacaagtt ccacaagctg ctgccctga 159
<210> 22
<211> 42
<212> PRT
<213> 痘苗病毒
<400> 22
Ala Thr Tyr His Ile Ile Ile Val Ala Leu Thr Ile Met Gly Val Ile
1 5 10 15
Phe Leu Ile Ser Val Ile Val Leu Val Cys Ser Cys Asp Lys Asn Asn
20 25 30
Asp Gln Tyr Lys Phe His Lys Leu Leu Pro
35 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 23
aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata 40
<210> 24
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 24
aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata aaaaattgaa aaactattct 60
aatttattgc acggtccggt aaaaattgaa aaactattct aatttattgc acggtccggt 120
aaaaattgaa aaactattct aatttattgc acggtccggt aaaaattgaa aaactattct 180
aatttattgc acggtccggt aaaaattgaa aaactattct aatttattgc acgg 234
<210> 25
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 25
tccaaaccca cccgcttttt atagtaagtt tttcacccat aaataataaa tacaataatt 60
aatttctcgt aaaagtagaa aatatattct aatttattgc acgg 104
<210> 26
<211> 119
<212> DNA
<213> 禽痘病毒
<400> 26
ttaatgtata gaactaattt ataataaaca tagtaaatat gggtaacttc ttaatagcca 60
taattaaaat tgaaaaaaaa atatcattat aaaacgtaaa cgaacaaaaa acattaatt 119
<210> 27
<211> 227
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 27
gttttgaaaa tttttttata ataaatatcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 60
tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt 120
gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 180
tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacgg 227
<210> 28
<211> 2220
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码NP-EBOV-CdI (GenBank
登录号ACI28629.1)的密码子优化的DNA序列
<400> 28
atggaaagca gggcccacaa ggcctggatg acacacaccg ccagcggctt cgagacagac 60
taccacaaga tcctgacagc cggcctgtct gtgcagcagg gcatcgtgcg gcagcgcgtg 120
atccaggtgc accaggtgac caacctggaa gagatctgcc agctgatcat ccaggccttc 180
gaggccggcg tggacttcca ggaaagcgcc gacagcttcc tgctgatgct gtgcctgcac 240
cacgcctacc agggcgacta caagcagttc ctggaaagca acgccgtgaa gtacctggaa 300
gggcacggct tcagattcga agtgcggaag aaagaaggcg tgaagcggct ggaagaactg 360
ctgcctgccg ccagctccgg caagagcatc agacgcaccc tggccgccat gcccgaggaa 420
gagacaaccg aggccaacgc tggccagttc ctgagcttcg ccagcctgtt cctgcctaag 480
ctggtggtgg gcgagaaggc ctgcctggaa aaggtgcagc ggcagattca ggtgcacagc 540
gagcagggcc tgatccagta ccctaccgcc tggcagagcg tgggccacat gatggtgatc 600
ttccggctga tgcggaccaa cttcctgatc aagtttctgc tgatccacca gggaatgcac 660
atggtggctg gccacgacgc caatgacgcc gtgatcgcca atagcgtggc ccaggccaga 720
ttcagcggcc tgctgatcgt gaaaacagtg ctggaccaca tcctgcagaa aaccgagcac 780
ggcgtgagac tgcaccctct ggcccggacc gccaaagtga agaacgaagt gaacagcttc 840
aaggccgccc tgtctagcct ggcccagcac ggcgagtacg cccctttcgc ccggctgctg 900
aacctgagcg gcgtgaacaa tctggaacac ggactgttcc cccagctgag cgccattgcc 960
ctgggagtgg ccacagccca cggctctaca ctggccggcg tgaacgtggg cgagcagtac 1020
cagcagctga gagaggccgc cacagaggcc gagaagcagc tgcagaagta cgccgagagc 1080
cgggagctgg atcacctggg cctggacgac caggaaaaga agatcctgaa ggacttccac 1140
cagaagaaga acgagatcag cttccagcag accaccgcca tggtgaccct gcggaaagag 1200
cggctggcca agctgaccga ggccatcacc tccaccagcc tgctgaaaac cggcaagcag 1260
tacgacgacg acaatgacat ccccttccct ggccccatca acgacaacga gaactccgag 1320
cagcaggacg atgaccccac cgatagccag gataccacca tccccgacat catcgtggac 1380
cccgacgacg gccggtacaa caactacggc gactacccca gcgagacagc caatgccccc 1440
gaggacctgg tgctgttcga cctggaagat ggcgacgagg acgaccacag acccagcagc 1500
tccagcgaga acaacaacaa gcacagcctg accggcaccg acagcaacaa gaccagcaac 1560
tggaaccgga accccaccaa catgcccaag aaggacagca cccagaacaa cgacaacccc 1620
gcccagagag cccaggaata cgcccgggac aacatccagg acacccctac ccctcacaga 1680
gccctgaccc ccatcagcga ggaaaccggc tccaacggcc acaacgagga cgatatcgac 1740
agcatccccc ccctggaatc cgacgaggaa aacaacaccg aaaccaccat caccaccaca 1800
aagaacacca ccgcccctcc cgcccctgtg taccggtcca acagcgagaa agagcccctg 1860
cctcaggaaa agagccagaa acagcccaat caggtgtccg gcagcgagaa taccgacaac 1920
aagccccaca gcgaacagag cgtggaggaa atgtaccggc acattctgca gacccagggc 1980
cccttcgacg ccatcctgta ctactacatg atgacagagg aacccatcgt gttcagcacc 2040
tccgacggca aagaatacgt gtaccccgac agcctggaag gcgagcaccc tccctggctg 2100
agcgaaaaag aggccctgaa cgaggacaac cggttcatca ccatggacga tcagcagttc 2160
tactggcccg tgatgaacca ccggaacaag ttcatggcca tcctgcagca ccacaagtga 2220
<210> 29
<211> 739
<212> PRT
<213> EBOV-CdI
<400> 29
Met Glu Ser Arg Ala His Lys Ala Trp Met Thr His Thr Ala Ser Gly
1 5 10 15
Phe Glu Thr Asp Tyr His Lys Ile Leu Thr Ala Gly Leu Ser Val Gln
20 25 30
Gln Gly Ile Val Arg Gln Arg Val Ile Gln Val His Gln Val Thr Asn
35 40 45
Leu Glu Glu Ile Cys Gln Leu Ile Ile Gln Ala Phe Glu Ala Gly Val
50 55 60
Asp Phe Gln Glu Ser Ala Asp Ser Phe Leu Leu Met Leu Cys Leu His
65 70 75 80
His Ala Tyr Gln Gly Asp Tyr Lys Gln Phe Leu Glu Ser Asn Ala Val
85 90 95
Lys Tyr Leu Glu Gly His Gly Phe Arg Phe Glu Val Arg Lys Lys Glu
100 105 110
Gly Val Lys Arg Leu Glu Glu Leu Leu Pro Ala Ala Ser Ser Gly Lys
115 120 125
Ser Ile Arg Arg Thr Leu Ala Ala Met Pro Glu Glu Glu Thr Thr Glu
130 135 140
Ala Asn Ala Gly Gln Phe Leu Ser Phe Ala Ser Leu Phe Leu Pro Lys
145 150 155 160
Leu Val Val Gly Glu Lys Ala Cys Leu Glu Lys Val Gln Arg Gln Ile
165 170 175
Gln Val His Ser Glu Gln Gly Leu Ile Gln Tyr Pro Thr Ala Trp Gln
180 185 190
Ser Val Gly His Met Met Val Ile Phe Arg Leu Met Arg Thr Asn Phe
195 200 205
Leu Ile Lys Phe Leu Leu Ile His Gln Gly Met His Met Val Ala Gly
210 215 220
His Asp Ala Asn Asp Ala Val Ile Ala Asn Ser Val Ala Gln Ala Arg
225 230 235 240
Phe Ser Gly Leu Leu Ile Val Lys Thr Val Leu Asp His Ile Leu Gln
245 250 255
Lys Thr Glu His Gly Val Arg Leu His Pro Leu Ala Arg Thr Ala Lys
260 265 270
Val Lys Asn Glu Val Asn Ser Phe Lys Ala Ala Leu Ser Ser Leu Ala
275 280 285
Gln His Gly Glu Tyr Ala Pro Phe Ala Arg Leu Leu Asn Leu Ser Gly
290 295 300
Val Asn Asn Leu Glu His Gly Leu Phe Pro Gln Leu Ser Ala Ile Ala
305 310 315 320
Leu Gly Val Ala Thr Ala His Gly Ser Thr Leu Ala Gly Val Asn Val
325 330 335
Gly Glu Gln Tyr Gln Gln Leu Arg Glu Ala Ala Thr Glu Ala Glu Lys
340 345 350
Gln Leu Gln Lys Tyr Ala Glu Ser Arg Glu Leu Asp His Leu Gly Leu
355 360 365
Asp Asp Gln Glu Lys Lys Ile Leu Lys Asp Phe His Gln Lys Lys Asn
370 375 380
Glu Ile Ser Phe Gln Gln Thr Thr Ala Met Val Thr Leu Arg Lys Glu
385 390 395 400
Arg Leu Ala Lys Leu Thr Glu Ala Ile Thr Ser Thr Ser Leu Leu Lys
405 410 415
Thr Gly Lys Gln Tyr Asp Asp Asp Asn Asp Ile Pro Phe Pro Gly Pro
420 425 430
Ile Asn Asp Asn Glu Asn Ser Glu Gln Gln Asp Asp Asp Pro Thr Asp
435 440 445
Ser Gln Asp Thr Thr Ile Pro Asp Ile Ile Val Asp Pro Asp Asp Gly
450 455 460
Arg Tyr Asn Asn Tyr Gly Asp Tyr Pro Ser Glu Thr Ala Asn Ala Pro
465 470 475 480
Glu Asp Leu Val Leu Phe Asp Leu Glu Asp Gly Asp Glu Asp Asp His
485 490 495
Arg Pro Ser Ser Ser Ser Glu Asn Asn Asn Lys His Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Thr Asp Ser Asn Lys Thr Ser Asn Trp Asn Arg Asn Pro Thr Asn Met
515 520 525
Pro Lys Lys Asp Ser Thr Gln Asn Asn Asp Asn Pro Ala Gln Arg Ala
530 535 540
Gln Glu Tyr Ala Arg Asp Asn Ile Gln Asp Thr Pro Thr Pro His Arg
545 550 555 560
Ala Leu Thr Pro Ile Ser Glu Glu Thr Gly Ser Asn Gly His Asn Glu
565 570 575
Asp Asp Ile Asp Ser Ile Pro Pro Leu Glu Ser Asp Glu Glu Asn Asn
580 585 590
Thr Glu Thr Thr Ile Thr Thr Thr Lys Asn Thr Thr Ala Pro Pro Ala
595 600 605
Pro Val Tyr Arg Ser Asn Ser Glu Lys Glu Pro Leu Pro Gln Glu Lys
610 615 620
Ser Gln Lys Gln Pro Asn Gln Val Ser Gly Ser Glu Asn Thr Asp Asn
625 630 635 640
Lys Pro His Ser Glu Gln Ser Val Glu Glu Met Tyr Arg His Ile Leu
645 650 655
Gln Thr Gln Gly Pro Phe Asp Ala Ile Leu Tyr Tyr Tyr Met Met Thr
660 665 670
Glu Glu Pro Ile Val Phe Ser Thr Ser Asp Gly Lys Glu Tyr Val Tyr
675 680 685
Pro Asp Ser Leu Glu Gly Glu His Pro Pro Trp Leu Ser Glu Lys Glu
690 695 700
Ala Leu Asn Glu Asp Asn Arg Phe Ile Thr Met Asp Asp Gln Gln Phe
705 710 715 720
Tyr Trp Pro Val Met Asn His Arg Asn Lys Phe Met Ala Ile Leu Gln
725 730 735
His His Lys
<210> 30
<211> 2031
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码GP-SEBOV-古卢(GenBank
登录号AAU43887.1)密码子优化的DNA序列
<400> 30
atgggcggcc tgagcctgct gcagctgccc cgggacaagt tccggaagtc cagcttcttc 60
gtgtgggtga tcatcctgtt ccagaaagcc ttcagcatgc ccctgggcgt ggtgaccaac 120
agcaccctgg aagtgaccga gatcgaccag ctggtgtgca aggaccacct ggccagcacc 180
gatcagctga agtccgtggg cctgaacctg gaaggcagcg gcgtgagcac cgacatcccc 240
agcgccacca agagatgggg cttcagatcc ggcgtgcccc ccaaggtggt gtcttatgag 300
gccggcgagt gggccgagaa ctgctacaac ctggaaatca agaagcccga cggcagcgag 360
tgtctgcctc cccctcccga tggcgtgaga ggcttccccc ggtgcagata cgtgcacaag 420
gcacaaggca ccggtccatg cccaggcgac tacgccttcc acaaggacgg cgcctttttc 480
ctgtacgacc ggctggcctc caccgtgatc taccggggcg tgaactttgc cgagggcgtg 540
atcgccttcc tgatcctggc caagcccaaa gagacattcc tgcagagccc ccccatccgg 600
gaggccgtga actacaccga gaacaccagc agctactacg ccacctccta cctggaatac 660
gagatcgaga acttcggcgc ccagcacagc accaccctgt tcaagatcga caacaacacc 720
ttcgtgcggc tggacagacc ccacaccccc cagtttctgt tccagctgaa cgacaccatc 780
catctgcatc agcagctgtc caacaccacc ggcagactga tctggaccct ggacgccaac 840
atcaacgccg acatcggtga atgggctttt tgggagaaca agaagaatct gagcgagcag 900
ctgcggggcg aagaactcag cttcgaggcc ctgagcctga acgagacaga ggacgacgac 960
gccgccagca gccggatcac caagggccgg atcagcgacc gggccaccag aaagtacagc 1020
gacctggtgc ccaagaacag ccccggcatg gtgcctctgc acatccccga gggcgagaca 1080
actctcccta gtcagaatag caccgagggc agacgggtgg gcgtgaacac ccaggaaacc 1140
atcaccgaga cagccgccac catcattggt actaacggca accacatgca gatcagcacc 1200
atcggcatcc ggcccagcag cagccagatc ccaagtagta gtcctaccac agcccctagc 1260
cctgaggccc agacccctac cacacacacc agcggcccta gcgtgatggc caccgaggaa 1320
cctaccaccc ctcctggcag cagcccaggt ccaactaccg aggcaccaac cctgaccacc 1380
cccgagaaca tcaccaccgc cgtgaaaacc gtgctgcccc aggaaagcac cagcaacggc 1440
ctgatcacca gcaccgtgac cggcatcctg ggcagcctgg gcctgcggaa gcggagcaga 1500
cggcagacca acaccaaggc caccggcaag tgcaacccca acctgcacta ctggaccgcc 1560
caggaacagc acaacgccgc tgggatcgcc tggatcccct actttggtcc tggtgctgag 1620
ggaatataca ccgagggcct gatgcacaac cagaacgccc tggtgtgcgg cctgagacag 1680
ctggccaacg aaaccactca ggcactgcag ctgttcctgc gggccaccac cgagctgcgg 1740
acctacacca tcctgaacag gaaggccatc gactttctgc tgcggagatg gggcggcacc 1800
tgtagaatcc tgggccccga ctgctgcatc gagccccacg actggaccaa gaatatcacc 1860
gacaagatca accagatcat ccacgacttc atcgacaacc ccctgcccaa ccaggacaac 1920
gacgacaact ggtggactgg ttggcgacag tggatccctg ccggcatcgg catcaccggc 1980
atcatcattg ccattatcgc tctcctctgc gtgtgcaagc tcctctgctg a 2031
<210> 31
<211> 676
<212> PRT
<213> SEBOV-古卢
<400> 31
Met Gly Gly Leu Ser Leu Leu Gln Leu Pro Arg Asp Lys Phe Arg Lys
1 5 10 15
Ser Ser Phe Phe Val Trp Val Ile Ile Leu Phe Gln Lys Ala Phe Ser
20 25 30
Met Pro Leu Gly Val Val Thr Asn Ser Thr Leu Glu Val Thr Glu Ile
35 40 45
Asp Gln Leu Val Cys Lys Asp His Leu Ala Ser Thr Asp Gln Leu Lys
50 55 60
Ser Val Gly Leu Asn Leu Glu Gly Ser Gly Val Ser Thr Asp Ile Pro
65 70 75 80
Ser Ala Thr Lys Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Lys Val
85 90 95
Val Ser Tyr Glu Ala Gly Glu Trp Ala Glu Asn Cys Tyr Asn Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro Pro Pro Pro Asp Gly
115 120 125
Val Arg Gly Phe Pro Arg Cys Arg Tyr Val His Lys Ala Gln Gly Thr
130 135 140
Gly Pro Cys Pro Gly Asp Tyr Ala Phe His Lys Asp Gly Ala Phe Phe
145 150 155 160
Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr Arg Gly Val Asn Phe
165 170 175
Ala Glu Gly Val Ile Ala Phe Leu Ile Leu Ala Lys Pro Lys Glu Thr
180 185 190
Phe Leu Gln Ser Pro Pro Ile Arg Glu Ala Val Asn Tyr Thr Glu Asn
195 200 205
Thr Ser Ser Tyr Tyr Ala Thr Ser Tyr Leu Glu Tyr Glu Ile Glu Asn
210 215 220
Phe Gly Ala Gln His Ser Thr Thr Leu Phe Lys Ile Asp Asn Asn Thr
225 230 235 240
Phe Val Arg Leu Asp Arg Pro His Thr Pro Gln Phe Leu Phe Gln Leu
245 250 255
Asn Asp Thr Ile His Leu His Gln Gln Leu Ser Asn Thr Thr Gly Arg
260 265 270
Leu Ile Trp Thr Leu Asp Ala Asn Ile Asn Ala Asp Ile Gly Glu Trp
275 280 285
Ala Phe Trp Glu Asn Lys Lys Asn Leu Ser Glu Gln Leu Arg Gly Glu
290 295 300
Glu Leu Ser Phe Glu Ala Leu Ser Leu Asn Glu Thr Glu Asp Asp Asp
305 310 315 320
Ala Ala Ser Ser Arg Ile Thr Lys Gly Arg Ile Ser Asp Arg Ala Thr
325 330 335
Arg Lys Tyr Ser Asp Leu Val Pro Lys Asn Ser Pro Gly Met Val Pro
340 345 350
Leu His Ile Pro Glu Gly Glu Thr Thr Leu Pro Ser Gln Asn Ser Thr
355 360 365
Glu Gly Arg Arg Val Gly Val Asn Thr Gln Glu Thr Ile Thr Glu Thr
370 375 380
Ala Ala Thr Ile Ile Gly Thr Asn Gly Asn His Met Gln Ile Ser Thr
385 390 395 400
Ile Gly Ile Arg Pro Ser Ser Ser Gln Ile Pro Ser Ser Ser Pro Thr
405 410 415
Thr Ala Pro Ser Pro Glu Ala Gln Thr Pro Thr Thr His Thr Ser Gly
420 425 430
Pro Ser Val Met Ala Thr Glu Glu Pro Thr Thr Pro Pro Gly Ser Ser
435 440 445
Pro Gly Pro Thr Thr Glu Ala Pro Thr Leu Thr Thr Pro Glu Asn Ile
450 455 460
Thr Thr Ala Val Lys Thr Val Leu Pro Gln Glu Ser Thr Ser Asn Gly
465 470 475 480
Leu Ile Thr Ser Thr Val Thr Gly Ile Leu Gly Ser Leu Gly Leu Arg
485 490 495
Lys Arg Ser Arg Arg Gln Thr Asn Thr Lys Ala Thr Gly Lys Cys Asn
500 505 510
Pro Asn Leu His Tyr Trp Thr Ala Gln Glu Gln His Asn Ala Ala Gly
515 520 525
Ile Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Gly Ala Glu Gly Ile Tyr Thr
530 535 540
Glu Gly Leu Met His Asn Gln Asn Ala Leu Val Cys Gly Leu Arg Gln
545 550 555 560
Leu Ala Asn Glu Thr Thr Gln Ala Leu Gln Leu Phe Leu Arg Ala Thr
565 570 575
Thr Glu Leu Arg Thr Tyr Thr Ile Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp Phe
580 585 590
Leu Leu Arg Arg Trp Gly Gly Thr Cys Arg Ile Leu Gly Pro Asp Cys
595 600 605
Cys Ile Glu Pro His Asp Trp Thr Lys Asn Ile Thr Asp Lys Ile Asn
610 615 620
Gln Ile Ile His Asp Phe Ile Asp Asn Pro Leu Pro Asn Gln Asp Asn
625 630 635 640
Asp Asp Asn Trp Trp Thr Gly Trp Arg Gln Trp Ile Pro Ala Gly Ile
645 650 655
Gly Ile Thr Gly Ile Ile Ile Ala Ile Ile Ala Leu Leu Cys Val Cys
660 665 670
Lys Leu Leu Cys
675
<210> 32
<211> 187
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 32
gttttgaaaa tttttttata ataaatatcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 60
tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt 120
gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 180
tgcacgg 187
<210> 33
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的VP40序列
<400> 33
atgcggcgcg tgatcctgcc caccgcccct ccagagtaca tggaagccat ctaccccgtg 60
cggagcaaca gcacaatcgc cagaggcggc aacagcaata ccggcttcct gacccccgag 120
agcgtgaacg gcgacacccc cagcaacccc ctgaggccta tcgccgacga caccatcgac 180
cacgccagcc acacccctgg cagcgtgtcc agcgccttca tcctggaagc catggtgaac 240
gtgatcagcg gccccaaggt gctgatgaag cagatcccca tctggctgcc cctgggcgtg 300
gccgaccaga aaacctacag cttcgacagc accaccgccg ccatcatgct ggccagctac 360
accatcaccc acttcggcaa ggccaccaac cccctggtgc gcgtgaacag actgggccct 420
ggcatccccg accaccccct gagactgctg cggatcggca accaggcctt cctgcaggaa 480
ttcgtgctgc cccccgtgca gctgccccag tacttcacct tcgacctgac cgccctgaag 540
ctgatcaccc agcctctgcc tgccgccacc tggaccgatg atacccccac aggcagcaac 600
ggcgccctga ggcccggcat cagcttccac cccaagctga ggcccatcct gctgcccaac 660
aagagcggca agaagggcaa cagcgccgac ctgacctccc ccgagaagat ccaggccatc 720
atgaccagcc tgcaggactt caagatcgtg cccatcgacc ccaccaagaa catcatgggc 780
atcgaggtgc ccgagacact ggtgcacaag ctgaccggca agaaagtgac cagcaagaac 840
ggccagccca tcatccctgt gctgctgcct aagtacatcg gcctggaccc cgtggcccct 900
ggcgacctga ccatggtgat cacacaggac tgcgatacct gccacagccc cgccagcctg 960
cccgccgtga ttgagaagta atag 984
<210> 34
<211> 326
<212> PRT
<213> ZEBOV-梅菱噶
<400> 34
Met Arg Arg Val Ile Leu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Tyr Met Glu Ala
1 5 10 15
Ile Tyr Pro Val Arg Ser Asn Ser Thr Ile Ala Arg Gly Gly Asn Ser
20 25 30
Asn Thr Gly Phe Leu Thr Pro Glu Ser Val Asn Gly Asp Thr Pro Ser
35 40 45
Asn Pro Leu Arg Pro Ile Ala Asp Asp Thr Ile Asp His Ala Ser His
50 55 60
Thr Pro Gly Ser Val Ser Ser Ala Phe Ile Leu Glu Ala Met Val Asn
65 70 75 80
Val Ile Ser Gly Pro Lys Val Leu Met Lys Gln Ile Pro Ile Trp Leu
85 90 95
Pro Leu Gly Val Ala Asp Gln Lys Thr Tyr Ser Phe Asp Ser Thr Thr
100 105 110
Ala Ala Ile Met Leu Ala Ser Tyr Thr Ile Thr His Phe Gly Lys Ala
115 120 125
Thr Asn Pro Leu Val Arg Val Asn Arg Leu Gly Pro Gly Ile Pro Asp
130 135 140
His Pro Leu Arg Leu Leu Arg Ile Gly Asn Gln Ala Phe Leu Gln Glu
145 150 155 160
Phe Val Leu Pro Pro Val Gln Leu Pro Gln Tyr Phe Thr Phe Asp Leu
165 170 175
Thr Ala Leu Lys Leu Ile Thr Gln Pro Leu Pro Ala Ala Thr Trp Thr
180 185 190
Asp Asp Thr Pro Thr Gly Ser Asn Gly Ala Leu Arg Pro Gly Ile Ser
195 200 205
Phe His Pro Lys Leu Arg Pro Ile Leu Leu Pro Asn Lys Ser Gly Lys
210 215 220
Lys Gly Asn Ser Ala Asp Leu Thr Ser Pro Glu Lys Ile Gln Ala Ile
225 230 235 240
Met Thr Ser Leu Gln Asp Phe Lys Ile Val Pro Ile Asp Pro Thr Lys
245 250 255
Asn Ile Met Gly Ile Glu Val Pro Glu Thr Leu Val His Lys Leu Thr
260 265 270
Gly Lys Lys Val Thr Ser Lys Asn Gly Gln Pro Ile Ile Pro Val Leu
275 280 285
Leu Pro Lys Tyr Ile Gly Leu Asp Pro Val Ala Pro Gly Asp Leu Thr
290 295 300
Met Val Ile Thr Gln Asp Cys Asp Thr Cys His Ser Pro Ala Ser Leu
305 310 315 320
Pro Ala Val Ile Glu Lys
325
<210> 35
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 35
taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt agtattgctc ttgtgactag 60
agactttagt taaggtactg taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt 120
agta 124
<210> 36
<211> 2046
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的DNA序列GP-MARV-安哥拉
<400> 36
atgaagacga cctgcctgct gatctcgctg attctgattc agggagtgaa aacccttccc 60
attctcgaga ttgcctctaa tatccagcca caaaatgtcg acagtgtgtg ttccggaacc 120
ctccagaaga cagaggatgt tcacctcatg ggattcactc tgtctggaca gaaagtcgca 180
gactctcctc tcgaggctag caaaagatgg gctttccggg caggtgtccc accaaaaaac 240
gtcgagtata ctgaaggcga agaagctaag acttgttata acatttccgt caccgatccc 300
agtggaaaat ccctccttct ggatccacca actaacatta gggattaccc gaaatgtaag 360
acaattcatc acattcaagg acagaaccct catgcccaag ggattgccct ccatctctgg 420
ggtgcattct ttctgtacga caggatcgca tctacaacaa tgtatagagg caaagtcttc 480
acggaaggga acatagctgc tatgatagtt aacaaaacag ttcacaaaat gattttcagt 540
cggcaagggc agggataccg ccatatgaat ttgacctcga ctaacaaata ctggacatcc 600
tcgaacggaa cccaaacaaa cgatactggc tgtttcggga cactccagga gtacaactct 660
acaaagaacc aaacgtgcgc tccctctaag aagccactgc ctcttcccac cgcccaccct 720
gaagtgaagc tcacatctac cagcacagat gccactaagc tcaacacgac agaccctaat 780
tctgatgacg aggatctcac cacatccggc tccgggagcg gcgagcaaga accctacacc 840
acatctgacg cagccacaaa gcaagggctg tccagcacta tgccacctac tcctagccca 900
caacccagta cacctcaaca gggagggaac aatacaaatc attctcaggg cgtggtcaca 960
gagcccggca agaccaacac aactgctcag ccttctatgc ctcctcacaa taccacaacg 1020
atttcgacga ataacacgag caaacacaat ctgagcacac ccagcgtgcc catccagaac 1080
gccacaaatt acaatacaca gtctacagct ccagagaatg aacagacatc cgctcccagc 1140
aagaccacgc tgctgcctac cgagaatcca acaaccgcta aatccaccaa tagcaccaag 1200
tctcccacca ccaccgtgcc taacaccaca aacaagtaca gcacctctcc cagccctaca 1260
cctaactcca ccgctcagca tctcgtgtat tttcgccgca agagaaacat cctctggaga 1320
gagggagata tgtttccatt tctcgacggg ctcattaatg cgcctatcga ttttgatccg 1380
gttccgaaca caaagacgat ctttgatgag tctagctcta gcggagcctc agcagaggaa 1440
gaccaacatg ctagtcctaa tatttccctc accctgtcct atttccctaa agtgaatgaa 1500
aataccgctc actctggaga aaacgaaaat gactgtgacg ctgaactccg gatttggtcc 1560
gttcaggagg atgatctcgc cgcaggactc tcttggattc ccttctttgg accagggatc 1620
gaaggactgt atacagctgg actcatcaaa aatcagaaca atctcgtgtg tcggctcagg 1680
cggctcgcta accaaactgc caaaagcctt gagctccttc tgcgggtcac cacagaggaa 1740
agaacatttt ctctgattaa tcgccacgct atagactttc ttctcgctcg gtggggtgga 1800
acctgcaaag tcctcggacc tgattgctgt atcggaattg aagatctgtc gcggaatatc 1860
tccgagcaaa tcgatcagat taagaaagat gagcaaaagg aaggtacagg gtggggattg 1920
ggtggaaaat ggtggacttc cgattggggt gtcctcacta atctcgggat cctcctcctg 1980
ctctccattg ccgtcctgat cgctctgtca tgtatttgca gaatctttac aaagtatatt 2040
gggtga 2046
<210> 37
<211> 681
<212> PRT
<213> MARV-安哥拉
<400> 37
Met Lys Thr Thr Cys Leu Leu Ile Ser Leu Ile Leu Ile Gln Gly Val
1 5 10 15
Lys Thr Leu Pro Ile Leu Glu Ile Ala Ser Asn Ile Gln Pro Gln Asn
20 25 30
Val Asp Ser Val Cys Ser Gly Thr Leu Gln Lys Thr Glu Asp Val His
35 40 45
Leu Met Gly Phe Thr Leu Ser Gly Gln Lys Val Ala Asp Ser Pro Leu
50 55 60
Glu Ala Ser Lys Arg Trp Ala Phe Arg Ala Gly Val Pro Pro Lys Asn
65 70 75 80
Val Glu Tyr Thr Glu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Cys Tyr Asn Ile Ser
85 90 95
Val Thr Asp Pro Ser Gly Lys Ser Leu Leu Leu Asp Pro Pro Thr Asn
100 105 110
Ile Arg Asp Tyr Pro Lys Cys Lys Thr Ile His His Ile Gln Gly Gln
115 120 125
Asn Pro His Ala Gln Gly Ile Ala Leu His Leu Trp Gly Ala Phe Phe
130 135 140
Leu Tyr Asp Arg Ile Ala Ser Thr Thr Met Tyr Arg Gly Lys Val Phe
145 150 155 160
Thr Glu Gly Asn Ile Ala Ala Met Ile Val Asn Lys Thr Val His Lys
165 170 175
Met Ile Phe Ser Arg Gln Gly Gln Gly Tyr Arg His Met Asn Leu Thr
180 185 190
Ser Thr Asn Lys Tyr Trp Thr Ser Ser Asn Gly Thr Gln Thr Asn Asp
195 200 205
Thr Gly Cys Phe Gly Thr Leu Gln Glu Tyr Asn Ser Thr Lys Asn Gln
210 215 220
Thr Cys Ala Pro Ser Lys Lys Pro Leu Pro Leu Pro Thr Ala His Pro
225 230 235 240
Glu Val Lys Leu Thr Ser Thr Ser Thr Asp Ala Thr Lys Leu Asn Thr
245 250 255
Thr Asp Pro Asn Ser Asp Asp Glu Asp Leu Thr Thr Ser Gly Ser Gly
260 265 270
Ser Gly Glu Gln Glu Pro Tyr Thr Thr Ser Asp Ala Ala Thr Lys Gln
275 280 285
Gly Leu Ser Ser Thr Met Pro Pro Thr Pro Ser Pro Gln Pro Ser Thr
290 295 300
Pro Gln Gln Gly Gly Asn Asn Thr Asn His Ser Gln Gly Val Val Thr
305 310 315 320
Glu Pro Gly Lys Thr Asn Thr Thr Ala Gln Pro Ser Met Pro Pro His
325 330 335
Asn Thr Thr Thr Ile Ser Thr Asn Asn Thr Ser Lys His Asn Leu Ser
340 345 350
Thr Pro Ser Val Pro Ile Gln Asn Ala Thr Asn Tyr Asn Thr Gln Ser
355 360 365
Thr Ala Pro Glu Asn Glu Gln Thr Ser Ala Pro Ser Lys Thr Thr Leu
370 375 380
Leu Pro Thr Glu Asn Pro Thr Thr Ala Lys Ser Thr Asn Ser Thr Lys
385 390 395 400
Ser Pro Thr Thr Thr Val Pro Asn Thr Thr Asn Lys Tyr Ser Thr Ser
405 410 415
Pro Ser Pro Thr Pro Asn Ser Thr Ala Gln His Leu Val Tyr Phe Arg
420 425 430
Arg Lys Arg Asn Ile Leu Trp Arg Glu Gly Asp Met Phe Pro Phe Leu
435 440 445
Asp Gly Leu Ile Asn Ala Pro Ile Asp Phe Asp Pro Val Pro Asn Thr
450 455 460
Lys Thr Ile Phe Asp Glu Ser Ser Ser Ser Gly Ala Ser Ala Glu Glu
465 470 475 480
Asp Gln His Ala Ser Pro Asn Ile Ser Leu Thr Leu Ser Tyr Phe Pro
485 490 495
Lys Val Asn Glu Asn Thr Ala His Ser Gly Glu Asn Glu Asn Asp Cys
500 505 510
Asp Ala Glu Leu Arg Ile Trp Ser Val Gln Glu Asp Asp Leu Ala Ala
515 520 525
Gly Leu Ser Trp Ile Pro Phe Phe Gly Pro Gly Ile Glu Gly Leu Tyr
530 535 540
Thr Ala Gly Leu Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Val Cys Arg Leu Arg
545 550 555 560
Arg Leu Ala Asn Gln Thr Ala Lys Ser Leu Glu Leu Leu Leu Arg Val
565 570 575
Thr Thr Glu Glu Arg Thr Phe Ser Leu Ile Asn Arg His Ala Ile Asp
580 585 590
Phe Leu Leu Ala Arg Trp Gly Gly Thr Cys Lys Val Leu Gly Pro Asp
595 600 605
Cys Cys Ile Gly Ile Glu Asp Leu Ser Arg Asn Ile Ser Glu Gln Ile
610 615 620
Asp Gln Ile Lys Lys Asp Glu Gln Lys Glu Gly Thr Gly Trp Gly Leu
625 630 635 640
Gly Gly Lys Trp Trp Thr Ser Asp Trp Gly Val Leu Thr Asn Leu Gly
645 650 655
Ile Leu Leu Leu Leu Ser Ile Ala Val Leu Ile Ala Leu Ser Cys Ile
660 665 670
Cys Arg Ile Phe Thr Lys Tyr Ile Gly
675 680

Claims (10)

1.一种疫苗组合，其包含
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少一种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的禽痘载体，所述禽痘载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且所述另一种组合物是加强组合物。
2.一种疫苗组合，其包含
(a)第一组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；以及
(b)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，连同药学上可接受的载体；
其中所述组合物中的一种是初免组合物并且所述另一种组合物是加强组合物。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合，其中所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第二丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
4.根据权利要求2-3所述的疫苗组合，其中所述第一组合物包含MVA载体，所述MVA载体包含编码第三丝状病毒亚型或第四丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
5.如权利要求1-4所述的疫苗组合，其中所述丝状病毒亚型选自埃博拉病毒(EBOV)或马尔堡病毒(MARV)。
6.根据权利要求1-5所述的疫苗组合，其中所述EBOV蛋白的所述抗原决定簇来自一种或多种EBOV亚型，所述EBOV亚型选自由以下组成的组：扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)、苏丹埃博拉病毒(SEBOV)、科特迪瓦埃博拉病毒(EBOV-CdI)、雷斯顿埃博拉病毒(EBOV-雷斯顿)以及本迪布焦埃博拉病毒(BEBOV)。
7.根据权利要求1-6所述的疫苗组合，其中所述丝状病毒蛋白的所述抗原决定簇选自由以下组成的组：包膜糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、病毒粒子蛋白35(VP35)、病毒粒子蛋白40(VP40)、病毒粒子蛋白30(VP30)、病毒粒子蛋白24(VP24)和RNA引导的RNA聚合酶蛋白(L)。
8.根据权利要求1-7所述的疫苗组合，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码选自由以下组成的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37。
9.根据权利要求1-8所述的疫苗组合，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码来自四种不同的丝状病毒亚型的选自具有以下的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31。
10.根据权利要求1-9所述的疫苗组合，其中所述第一组合物中的所述MVA载体包含编码来自四种不同的丝状病毒亚型的选自具有以下的组的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31。
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