ES2883354T3

ES2883354T3 - Vector adenoviral

Info

Publication number: ES2883354T3
Application number: ES17734440T
Authority: ES
Inventors: Sarah C Gilbert; Adrian Hill; Matthew Cottingham; Matthew Dicks; Susan Morris; Alexander Douglas
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 2016-06-23
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2037-06-23
Also published as: GB2549809C; US11306325B2; DK3475433T3; US11970709B2; JP7333857B2; GB2549809A; WO2017221031A1; US20220220507A1; EP3475433B9; CN109790548A; CN109790548B; JP2022159418A; JP2019519252A; SG11201811178UA; CA3027686A1; EP3475433B1; EP3475433A1; JP7187451B2; KR102205908B1; AU2017282102A1

Abstract

Vector adenoviral que comprende el genoma del adenovirus de chimpancé C68, en el que el genoma del adenovirus se ha modificado de tal manera que el vector carece del locus E4 nativo del adenovirus C68 y comprende las regiones codificantes E4Orf4, E40rf6 y E40rf6/7 heterólogas del AdHu5 en el locus E4 del adenovirus C68 y en el que el vector adenoviral comprende además las regiones codificantes E40rf1, E40rf2 y E40rf3 heterólogas del AdY25, en el que el vector adenoviral carece de un locus E1 funcional y en el que el vector adenoviral carece de un locus E3.

Description

DESCRIPCIÓN

Vector adenoviral

La presente invención se refiere a novedosos vectores adenovirales, a composiciones inmunogénicas de los mismos y a su uso en medicina.

Antecedentes

Tradicionalmente, las vacunas han estado basadas en patógenos completamente inactivados o atenuados. Sin embargo, para muchas enfermedades infecciosas, tales como la malaria, este enfoque no es práctico y se ha cambiado el centro de investigación al desarrollo de “vacunas de subunidades” que expresan únicamente aquellos antígenos derivados de patógenos que inducen correlatos inmunitarios de protección.

Las vacunas de subunidades presentan un antígeno al sistema inmunitario sin introducir ningún organismo completamente infeccioso. Uno de tales métodos implica la administración de una proteína aislada específica de un organismo infeccioso. Sin embargo, esta técnica suele inducir únicamente una respuesta inmunitaria débil y las proteínas aisladas pueden tener una estructura tridimensional diferente a la de la proteína en su contexto normal, lo que da como resultado la producción de anticuerpos que no pueden reconocer el organismo infeccioso.

Por tanto, se ha desarrollado un método alternativo que utiliza vectores virales para la administración de antígenos. Los virus son parásitos intracelulares estrictos que se replican transfectando su ADN en una célula huésped e induciendo a la célula huésped a expresar el genoma viral. Se ha aprovechado esta estrategia reproductiva para crear vacunas de vectores creando vectores virales recombinantes, no replicantes, que portan uno o más transgenes heterólogos. La transfección o transducción del genoma viral recombinante en la célula huésped da como resultado la expresión del transgén heterólogo en la célula huésped. Cuando el transgén heterólogo codifica para un antígeno, por ejemplo, la expresión del antígeno dentro de la célula huésped puede provocar una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica por parte del sistema inmunitario del huésped. Como tal, los vectores virales pueden funcionar como vacunas eficaces. Alternativamente, el transgén heterólogo puede codificar para un alelo funcional de un gen, cuya expresión puede usarse para contrarrestar los efectos de un alelo mutante perjudicial del gen, en un proceso conocido como terapia génica.

Los adenovirus son particularmente adecuados para su uso como vectores virales. Los adenovirus son virus sin envoltura, de aproximadamente 90-100 nm de diámetro, que comprenden una nucleocápside y un genoma de ADN bicatenario lineal. La nucleocápside viral comprende capsómeros de pentón y hexón. Con cada base de pentón se asocia una única fibra y ayuda en la unión del virus a la célula huésped a través del receptor del adenovirus de Coxsackie en la superficie de la célula huésped. Se han identificado cepas de adenovirus con más de 50 serotipos, de las cuales la mayoría provocan infecciones de las vías respiratorias, conjuntivitis y gastroenteritis en seres humanos. En lugar de integrarse en el genoma del huésped, los adenovirus se replican normalmente como elementos episómicos en el núcleo de la célula huésped. El genoma de los adenovirus comprende 4 unidades transcripcionales tempranas (E1, E2, E3 y E4), que principalmente tienen funciones reguladoras y preparan a la célula huésped para la replicación viral. El genoma también comprende 5 unidades transcripcionales tardías (L1, L2, L3, L4 y L5), que codifican para proteínas estructurales incluyendo el pentón (L2), el hexón (L3), la proteína de armazón (L4) y la proteína de fibra (L5), que se encuentran bajo el control de un único promotor. Cada miembro del genoma comprende una repetición terminal invertida (ITR) que es necesaria para la replicación viral.

Los adenovirus recombinantes se desarrollaron originalmente para la terapia génica, sin embargo las fuertes y sostenidas respuestas inmunitarias específicas del transgén provocadas por estos agentes de administración génica impulsaron su uso como portadores de vacunas. Además de ser altamente inmunogénicos, los adenovirus ofrecen otras muchas ventajas para el desarrollo clínico de vacunas. El genoma adenoviral es relativamente pequeño (entre 26 y 45 kpb), está bien caracterizado y es fácil de manipular. La deleción de una única unidad transcripcional, la E1, hace que el virus sea incompetente para la replicación, lo que aumenta su previsibilidad y reduce los efectos secundarios en aplicaciones clínicas. Los adenovirus recombinantes pueden alojar transgenes relativamente grandes, en algunos casos de hasta 8 kb, lo que permite flexibilidad en el diseño de subunidades, y tienen un tropismo relativamente amplio que facilita la administración del transgén a una amplia variedad de células y tejidos. De manera importante, para aplicaciones clínicas, hay métodos bien establecidos para aumentar la producción y la purificación de adenovirus recombinantes con alto título. Hasta la fecha, como vectores se han usado predominantemente los serotipos del subgrupo C, AdHu2 o AdHu5.

Sin embargo, la primera generación de vectores de vacunas basados en el adenovirus humano arquetípico AdHu5 mostraron poca eficacia en ensayos clínicos, a pesar de los alentadores datos preclínicos1. Posteriormente, se descubrió que una gran proporción de adultos humanos presentan títulos significativos de anticuerpos neutralizantes contra los serotipos humanos habituales, tales como AdHu2 y AdHu5, como resultado de una infección natural. Los anticuerpos neutralizantes podían reducir la potencia de las vacunas de vectores virales bloqueando la entrada viral a las células huésped y, por tanto, la administración del transgén diana.

La aparición de inmunidad contra los vectores preexistentes está abordándose mediante el desarrollo de nuevos vectores adenovirales basados en los serotipos a los que es menos probable que se haya expuesto la población humana, incluyendo los originarios del chimpancé23. Sin embargo, algunos de estos vectores adenovirales de chimpancé tienen una eficacia limitada debido a una inmunidad inexplicable en poblaciones humanas, niveles variables de reactividad cruzada con los adenovirus humanos y un crecimiento por debajo del óptimo en líneas celulares transformadas. Además, resulta ventajoso tener una gama de vectores adenovirales diferentes disponibles para su uso en la inmunización contra diferentes enfermedades, debido a que la inducción de anticuerpos neutralizantes contra un vector puede imposibilitar su readministración para otra indicación.

El documento WO2012/172277 describe un vector de adenovirus derivado del adenovirus de chimpancé AdY25, que aborda algunos de los problemas anteriormente descritos en la técnica. Este vector se denomina ChAdOxI. Roshorm et al. (2012) Eur. J. Immunol 42: 3243-55 describen la clonación del serotipo 68 de un adenovirus de chimpancé usando ingeniería de recombinación de cromosomas artificiales bacterianos, incorporando un epítopo del VIH en la región E1 del genoma del adenovirus. El vector viral se sometió a prueba en ratones y se halló que provocaba una memoria efectora protectora contra el epítopo del VIH.

Sin embargo, sigue existiendo la necesidad en la técnica de vectores adenovirales no humanos altamente inmunogénicos que administren eficazmente el transgén diana, minimicen el efecto de inmunidad preexistente contra los serotipos de adenovirus y se repliquen eficientemente en líneas celulares transformadas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un vector adenoviral tal como se define en las reivindicaciones y que comprende el genoma del adenovirus de chimpancé C68, en el que el genoma del adenovirus se ha modificado de tal manera que el vector carece del locus E4 nativo del adenovirus y comprende las regiones codificantes E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3 heterólogas del AdY25, en el que el vector adenoviral carece de un locus E1 funcional, en el que el vector adenoviral carece de un locus E3 y en el que el vector adenoviral comprende además las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 heterólogas del AdHu5 en el locus E4 del adenovirus.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende el vector de adenovirus según el primer aspecto de la invención y, opcionalmente, uno o más principios activos adicionales, un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Preferiblemente, el adyuvante es un adyuvante de aceite en agua. Por ejemplo, el adyuvante puede comprender escualeno. Preferiblemente, el adyuvante se selecciona de MF59®, AS03, ^aF03 o Addavax.

Un tercer aspecto proporciona el uso del vector adenoviral según el primer aspecto o la composición inmunogénica según el segundo aspecto en medicina. En particular, el vector adenoviral y las composiciones inmunogénicas se proporcionan para administrar un transgén a una célula huésped, provocar una respuesta inmunitaria en un animal, potenciar una respuesta inmunitaria en un animal, tratar o prevenir al menos una enfermedad, inducir una respuesta inmunitaria en un animal que romperá la tolerancia a un autoantígeno y terapia génica.

Un cuarto aspecto proporciona una secuencia de polinucleótido que codifica para el vector adenoviral según el primer aspecto de la presente invención.

Un quinto aspecto de la presente invención proporciona una célula huésped transducida con el vector viral según el primer aspecto de la presente invención.

Un sexto aspecto de la presente invención proporciona un método para producir el vector viral según el primer aspecto de la presente invención incorporando la secuencia de polinucleótido según el cuarto aspecto en un cromosoma artificial bacteriano (BAC).

Un séptimo aspecto de la presente invención proporciona un clon de cromosoma artificial bacteriano (BAC) que comprende la secuencia de polinucleótido según el cuarto aspecto de la presente invención.

Un octavo aspecto de la presente invención proporciona una línea celular de encapsidación que comprende y produce el vector viral según el primer aspecto de la presente invención.

Figuras

La presente invención se describe con referencia a las siguientes figuras:

Figura 1. Generación de un clon molecular de adenovirus de chimpancé 68 (ChAd68). a) Inserción de ADN genómico de ChAd68 en el “vector de rescate” pBAC mediante reparación de huecos. Las regiones flanqueantes izquierdas de E1 1 (LF1) y 2 (LF2) y la región lateral derecha (RF) terminal se amplifican a partir del ADN genómico de Chad68 y se clonan en pBACe3.6 para producir un clon de rescate de adenovirus de BAC. La recombinación tiene lugar entre la LF1 y la LF2 del genoma de ChAd68 aislado y el clon de rescate de BAC y la RF del genoma de ChAd68 y el clon de rescate de BAC. El producto resultante es un BAC que contiene el genoma de ChAd68 con E1 delecionada. b) Escisión de la región E3 de ChAd68 mediante ingeniería de recombinación. En primer lugar, el gen galactocinasa (GaIK) se amplifica a partir de pGalK usando cebadores que contienen secuencias homólogas a la región flanqueante de E3 (E3LF y E3RF). La región E3 se sustituye por el gen GalK usando recombinación de A red. Posteriormente, el gen GalK se sustituye por un producto de PCR que consiste en E3LF y E3RF, de nuevo usando recombinación de A red. El producto resultante es un BAC que contiene el genoma de ChAd68 con E1E3 delecionada. c) Inserción de un casete de antígenos en el locus E1. En primer lugar, el gen galactocinasa (GaIK) se amplifica a partir de pGalK usando cebadores que contienen secuencias homólogas a la región flanqueante de E1 (LF1 y LF2). La región E1 se sustituye por el gen GalK usando recombinación de A red. Posteriormente, el gen GalK se sustituye por un producto de pCr que consiste en LF1-casete de expresión de antígenos-LF2 usando recombinación de A red. El producto resultante es un BAC que contiene el genoma de ChAd68 con E1E3 delecionada con un casete de expresión de antígenos en el locus E1.

Figura 2. Inserción de un casete de expresión de antígenos en un vector de adenovirus usando sitios de recombinación att. Un casete universal que expresa un gen resistente a bacterias y el gen suicida ccdB flanqueado por las secuencias de recombinación específicas, attR1 y attR2, está ubicado en el locus E1 y/o el locus E3 del clon de genoma de adenovirus BAC. Los plásmidos lanzadera que contienen un casete de expresión de antígenos flanqueado por sitios de recombinación específicos emparejados con aquellos presentes en el genoma (attL1/L2) permiten la recombinación específica del sitio en presencia de una mezcla de enzimas que contiene la integrasa del bacteriófago A, el factor de integración del huésped y escisionasa.

Figura 3. Crecimiento de ChAdOx2 en comparación con ChAd68. Se infectaron células 293 de riñón embrionario humano que complementan a E1 con una multiplicidad de infección (MOI) de 1 vector viral por célula. Se tomaron muestras a las 48 y 96 horas tras la infección. La producción del virus se determinó titulando por triplicado células HEK293 y células positivas para GFP contadas 48 horas tras la infección. Los resultados se expresan como la media de Log10 unidades de fluorescencia (UF) por ml a partir de dos experimentos independientes, con la desviación estándar representada.

Figura 4. Inmunogenicidad de ChAdOx1-eGFP en comparación con ChAdOx2-eGFP. Se inyectaron por vía intramuscular 108 unidades infecciosas de vector a ratones BALB/c hembra (4 por grupo) y se recogieron los bazos 2 semanas después para medir la respuesta a GFP mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas de manchas con interferón-gamma (IFN-y-ELISPOT). Los resultados se expresan como unidades formadoras de manchas (SFU) por millón de esplenocitos. Se usó la prueba de Mann-Whitney para analizar estadísticamente los resultados, y se representa la media con EEM.

Figura 5. Grupos de estudio (tabla 1) y progreso actual de reclutamiento (tabla 2) de un ensayo clínico de fase I para determinar la seguridad y la inmunogenicidad de la vacuna experimental de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP), ChAdOx2 HAV, en voluntarios adultos sanos.

Figuras 6 a 11. Proporciones de voluntarios que presentan acontecimientos adversos (AA) en diferentes grupos de dosis en el ensayo clínico de fase I que investiga la vacuna experimental de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP), ChAdOx2 HAV, en voluntarios adultos sanos. Dosis de 5 x 109 pv para las figuras 6 y 7 y una dosis de 2,5 x 1010 pv para las figuras 8, 9, 10 y 11.

Figura 12. Mediana de la respuesta acumulada para todos los conjuntos de antígenos en la vacuna de HAV estratificada por dosis. * p=0,01 prueba de Kruskall-Wallis, con prueba de comparaciones múltiples de Dunn para el grupo con una dosis de 2,5x1010. Las líneas representan las medianas.

La figura 13 muestra las respuestas tabuladas para cada individuo el día 0, el día 28 y el día 56 en participantes inmunizados con diferentes dosificaciones de la vacuna de HAV.

La figura 14 muestra la estructura del vector de destino para la vacuna ChAdOx2-RabGP.

La figura 15 muestra el ANOVA de dos vías en los grupos de vacuna ChAdOx2-RabGP inmunizados con diferentes dosis con y sin Addavax.

La figura 16 muestra la alta inmunogenicidad del constructo de vacuna ChAdOx2-RabGP. p=0,005 comparando las respuestas de ELISA (medidas en unidades arbitrarias [UA] de anticuerpo) mediante la prueba de Mann-Whitney. La inmunogenicidad de ChAdOx2-RabGP se compara de manera favorable a la de AdC68. Se vacunaron por vía intramuscular ratones CD-1 no consanguíneos con 107 unidades infecciosas de glicoproteína de la rabia que expresa o bien ChAdOx2 o bien AdC68. Se recogió suero 4 semanas después de la vacunación. Se evaluaron las respuestas de anticuerpos mediante ELISA contra la glicoproteína de la rabia recombinante, y los resultados se muestran en el gráfico A y la tabla B.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a novedosos vectores adenovirales derivados del adenovirus de chimpancé C68, a composiciones inmunogénicas de los mismos y a su uso en medicina.

La invención proporciona un vector adenoviral, tal como se define en las reivindicaciones, que comprende el genoma del adenovirus de chimpancé C68, en el que el genoma del adenovirus se ha modificado de tal manera que el vector carece del locus E4 nativo del adenovirus y comprende las regiones codificantes E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3 heterólogas del AdY25, en el que el vector adenoviral carece de un locus E1 funcional, en el que el vector adenoviral carece de un locus E3 y en el que el vector adenoviral comprende además las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 heterólogas del AdHu5 en el locus E4 del adenovirus.

La región E4 del adenovirus comprende al menos seis marcos de lectura abiertos (ORF u Orf). Preferiblemente, el locus E4 nativo del adenovirus está delecionado.

El adenovirus es el adenovirus de chimpancé, C68 (también conocido como C9, Pan6 y sAd25). Se ha depositado el genoma completo del adenovirus de simio 25 (es decir, C68) y se le ha asignado el número de registro de GenBank AC_000011.

Según la invención, el genoma del adenovirus se ha modificado de tal manera que el vector carece del locus E4 nativo del adenovirus.

Además, según la invención, el genoma del adenovirus está modificado de tal manera que el vector comprende las regiones codificantes E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3 heterólogas del AdY25. El AdY25 es un adenovirus de chimpancé descrito con detalle en el documento WO2012/172277.

El vector adenoviral comprende además las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 heterólogas del AdHu5.

El AdHu5 es un adenovirus humano de serotipo 5.

Tal como sabrá un experto habitual, los vectores adenovirales basados en el adenovirus C68 se denominan en la técnica por sus diversos nombres, incluyendo AdCh68, AdC68, ChAd68 y sAdV25 (véase, por ejemplo, Abbink et al., J Virol. Febrero de 2015;89(3):15l2-22 (PubMed ID: 25410856) y Jeyanathan et al., Mucosal Immunol. Noviembre de 2015;8(6):1373-87 (PubMed ID: 25872483). Estos nombres también se usan de manera intercambiable en el presente documento.

El vector de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, comprende preferiblemente una cápside derivada del adenovirus de chimpancé C68. Preferiblemente, la cápside comprende las proteínas de la cápside de C68 nativas o de tipo natural, incluyendo las proteínas del pentón, proteínas del hexón, proteínas de fibra y/o proteínas de armazón. Sin embargo, resultará evidente fácilmente para un experto en la técnica que pueden realizarse pequeñas modificaciones a las proteínas de la cápside sin alterar de manera adversa el tropismo del vector.

El vector adenoviral de la presente divulgación puede comprender una de las proteínas del hexón, del pentón y de fibra tal como se describió anteriormente, cualquier combinación de dos de dichas proteínas o dichas tres proteínas.

El vector adenoviral de la invención se denomina en el presente documento ChAdOx2.

El experto en la técnica apreciará que existen homólogos, equivalentes y derivados de todas las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento. Por tanto, pueden contemplarse moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia sustancialmente idéntica a las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento en toda su longitud.

Un experto en la técnica apreciará que la presente divulgación también puede incluir variantes de esas moléculas de ácido nucleico particulares que se ejemplifican en el presente documento. Estas pueden producirse de manera natural, por ejemplo, debido a una variación de cepa. Por ejemplo, se incluyen adiciones, sustituciones y/o deleciones. Un experto en la técnica también apreciará que será posible una variación con respecto a las moléculas de ácido nucleico particulares ejemplificadas en el presente documento en vista de la degeneración del código genético. Preferiblemente, las variantes tienen una identidad sustancial con las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento en toda su longitud.

Tal como se usa en el presente documento, las secuencias de ácido nucleico que tienen “identidad sustancial” tienen preferiblemente al menos el 80%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 98,1%, el 98,2%, el 98,3%, el 98,4%, el 98,5%, el 98,6%, el 98,7%, el 98,8%, el 98,9%, el 99%, el 99,1%, el 99,2%, el 99,3%, el 99,4%, el 99,5%, el 99,6%, el 99,7%, el 99,8% o el 99,9% de identidad con dichas secuencias.

De manera deseable, el término “identidad sustancial” indica que dicha secuencia tiene un mayor grado de identidad con cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento que con las secuencias de ácido nucleico de la técnica anterior.

Cuando se comparan secuencias de ácido nucleico con el fin de determinar el grado de homología o identidad, pueden usarse programas tales como BESTFIT y GAP (ambos del paquete de software Wisconsin Genetics Computer Group (GCG)). BESTFIT, por ejemplo, compara dos secuencias y produce una alineación óptima de los segmentos más similares. GAP permite la alineación de secuencias a lo largo de toda su longitud y halla la alineación óptima insertando espacios en cualquier secuencia según sea apropiado. De manera adecuada, en el contexto de la presente invención, cuando se analiza la identidad de las secuencias de ácido nucleico, la comparación se realiza mediante la alineación de las secuencias a lo largo de toda su longitud. Lo anterior se aplica, haciendo los cambios necesarios, a todas las secuencias de ácido nucleico dadas a conocer en la presente solicitud.

Las referencias en el presente documento a “ácido nucleico” pueden ser a ADN, incluyendo ADNc, a ARN, incluyendo ARNm, o a PNA (ácido nucleico peptídico), o a una mezcla de los mismos.

Simplemente para la comodidad de los expertos en la técnica, se depositó una muestra de la cepa de E. coli Stellar, que contiene cromosomas artificiales bacterianos (BAC) que contienen ChAdOx2-GFP, por parte de Isis Innovation Limited el 13 de junio de 2016 en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), en las Colecciones de Cultivo de la Agencia de Protección de la Salud, Agencia de Protección de la Salud, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, Reino Unido bajo el Tratado de Budapest y designada con el n.° de registro provisional 16061301.

La E. coli que contiene el BAC es un organismo genéticamente modificado de clase I. El genotipo de la cepa de E. coli Stellar es: F-, endAI, supE44, thi-1, recAI, relAI, gyrA96, phoA, 08Od lacZA M15, A (lacZYA - argF) U169, A (mrr - hsdRMS - mcrBC), AmcrA, X-. El adenovirus de chimpancé ChAd68 se clasifica de manera provisional dentro de la especie adenovirus E humano basándose en la secuencia de nucleótidos de la ADN polimerasa viral.

El BAC se propaga dentro de las bacterias durante la replicación y puede mantenerse mediante selección con cloranfenicol. La cepa de E. coli Stellar, que contiene el BAC en el que se clona el genoma, puede propagarse en caldo Luria-Bertani o agar que contiene cloranfenicol 12,5 |ig/ml a 37°C.

La conversión de los clones de BAC de los genomas virales en virus (“rescate”) puede llevarse a cabo mediante las siguientes etapas. Se propaga el huésped E. coli y se purifica el ADN de BAC a partir de las bacterias según métodos convencionales. Se linealiza el ADN con la endonucleasa de restricción Pacl y se transfecta en células HEK293 (o una línea celular que complementa a E1 similar). Entonces puede propagarse el adenovirus resultante y purificarse para su uso como vacuna, por ejemplo. Todos estos reactivos y células están disponibles públicamente. Si se rescatara la deposición, el virus resultante sería un organismo genéticamente modificado de clase I.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “vector viral” se refiere a un virus recombinante, o a un derivado del mismo, que puede introducir material genético, incluyendo ADN recombinante, en una célula huésped o un organismo huésped por medio de transducción o infección no productiva. Por ejemplo, el vector de la presente invención puede ser un vector de administración génica, un vector de vacuna, un vector de administración antisentido o un vector de terapia génica.

Tal como se usa en el presente documento, “C68” se refiere al adenovirus de chimpancé 68, o a subunidades derivadas del mismo, y el término “ChAd68” se refiere a vectores derivados del mismo o basados en el mismo. Los términos abreviados se usan para indicar modificaciones realizadas al virus de tipo natural. Por ejemplo, “AE1” o “delE1” indica la deleción o deleción funcional del locus E1. La expresión “Ad5E4Orf6” indica que el vector viral comprende un marco de lectura abierto 6 de E4 heterólogo del virus Ad5.

Un experto en la técnica apreciará que la presente divulgación puede incluir variantes de esas secuencias de aminoácidos particulares que se ejemplifican en el presente documento. Son particularmente preferidas las variantes que tienen una secuencia de aminoácidos similar a la de la proteína original, en la que uno o más residuos de aminoácido se sustituyen, delecionan o añaden en cualquier combinación. Son especialmente preferidas las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades de la proteína de la presente divulgación. Diversos aminoácidos tienen propiedades similares y, a menudo, uno o más de tales aminoácidos de una sustancia pueden sustituirse por uno o más de otros de tales aminoácidos sin eliminar una actividad deseada de esa sustancia. Por tanto, los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina pueden sustituirse entre sí (aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas). De estas posibles sustituciones, se prefiere que la glicina y la alanina se usen para sustituirse entre sí (puesto que tienen cadenas laterales relativamente cortas) y que la valina, la leucina y la isoleucina se usen para sustituirse entre sí (puesto que tienen cadenas laterales alifáticas más grandes que son hidrófobas). Otros aminoácidos que a menudo pueden sustituirse entre sí incluyen: fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas); aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas); asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida); y cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre). Las variantes incluyen variantes que se producen de manera natural y artificiales. Las variantes artificiales pueden generarse usando técnicas de mutagénesis, incluyendo aquellas aplicadas a moléculas de ácido nucleico, a células o a organismos. Preferiblemente, las variantes tienen una identidad sustancial con las secuencias de aminoácidos ejemplificadas en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, las secuencias de aminoácidos que tienen “identidad sustancial” tienen preferiblemente al menos el 80%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 98,1%, el 98,2%, el 98,3%, el 98,4%, el 98,5%, el 98,6%, el 98,7%, el 98,8%, el 98,9%, el 99%, el 99,1%, el 99,2%, el 99,3%, el 99,4%, el 99,5%, el 99,6%, el 99,7%, el 99,8% o el 99,9% de identidad con dichas secuencias. De manera deseable, el término “identidad sustancial” indica que dicha secuencia tiene un mayor grado de identidad con cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento que con las secuencias de aminoácidos de la técnica anterior.

Puede usarse un programa, tal como el programa CLUSTAL, para comparar secuencias de aminoácidos. Este programa compara secuencias de aminoácidos y halla la alineación óptima insertando espacios en cualquier secuencia según sea apropiado. Es posible calcular la identidad o similitud de aminoácidos (identidad más conservación del tipo de aminoácidos) para una alineación óptima. Un programa como BLASTx alineará los tramos más largos de secuencias similares y les asignará un valor para el ajuste. Por tanto, es posible obtener una comparación en la que hay varias regiones de similitud que tienen, cada una, una puntuación diferente. Lo anterior se aplica, haciendo los cambios necesarios, a todas las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en la presente solicitud.

El vector de la presente invención también comprende preferiblemente una secuencia de nucleótidos exógena. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos exógena está ligada operativamente a secuencias de control de la expresión que dirigen la traducción, la transcripción y/o la expresión de la misma en una célula animal y a una secuencia señal de encapsidación adenoviral.

Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos exógena codifica para una molécula de interés. La molécula de interés puede ser una proteína, un polipéptido o una molécula de ácido nucleico de interés. La secuencia de nucleótidos exógena puede codificar para una o más, dos o más o tres o más moléculas de interés.

Las proteínas y los polipéptidos de interés incluyen antígenos, adyuvantes moleculares, proteínas inmunoestimuladoras y recombinasas.

Preferiblemente, el antígeno es un antígeno derivado de patógenos. Preferiblemente, el patógeno se selecciona del grupo que consiste en M. tuberculosis, Plasmodium sp, virus de la gripe, VIH, virus de la hepatitis C, citomegalovirus, virus del papiloma humano, virus de la rabia, virus del sarampión, parotiditis, rubéola, virus de Zika, parásitos de la leishmaniosis o cualquier especie micobacteriana. Preferiblemente, el antígeno se selecciona de TRAP, MSP-1, AMA-1 y CSP de Plasmodium, antígenos del virus de la gripe o los antígenos ESAT6, TB10.4 85A y 85B de Mycobacterium tuberculosis. Más preferiblemente, el antígeno puede ser Ag85A de Mycobacterium tuberculosis. El antígeno puede ser la nucleoproteína (NP) y/o la proteína 1 de matriz (M1) del virus de la gripe A.

Más preferiblemente, el antígeno es de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) o el antígeno es la glicoproteína del virus de la rabia.

Preferiblemente, la proteína o el polipéptido de interés es un antígeno. En una realización, el antígeno es un antígeno derivado de patógenos. Preferiblemente, el patógeno se selecciona del grupo que consiste en bacterias, virus, priones, hongos, protistas y helmintos. Preferiblemente, el antígeno se deriva del grupo que consiste en M. tuberculosis, Plasmodium sp, virus de la gripe, VIH, virus de la hepatitis C, citomegalovirus, virus del papiloma humano, virus de la rabia, virus del sarampión, parotiditis, rubéola, virus de Zika, parásitos de la malaria, parásitos de la leishmaniosis o cualquier especie micobacteriana. Los antígenos preferidos incluyen TRAP, MSP-1, AMA-1 y CSP de Plasmodium, antígenos del virus de la gripe y los antígenos ESAT6, TB10.485A y 85B de Mycobacterium tuberculosis. Los antígenos particularmente preferidos incluyen Ag85A de Mycobacterium tuberculosis y la nucleoproteína (NP) y la proteína 1 de matriz (M1) del virus de la gripe A, preferiblemente del virus de la gripe A.

En una realización preferida, la vacuna contiene antígenos de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) que es el agente causante de la enfermedad de Johne en ganado bovino y se ha relacionado con la enfermedad de Crohn en seres humanos.

En otra realización preferida, la secuencia de nucleótidos exógena codifica para la glicoproteína del virus de la rabia, preferiblemente la cepa ERA.

En una realización alternativa, el antígeno es un autoantígeno. Los autoantígenos adecuados incluyen antígenos expresados por células tumorales que permiten al sistema inmunitario diferenciar entre células tumorales y otros tipos de células. Los autoantígenos adecuados incluyen antígenos que o bien son inapropiados para el tipo de célula y/o su entorno, o bien sólo están presentes normalmente durante el desarrollo de los organismos (por ejemplo, antígenos fetales). Por ejemplo, GD2 sólo se expresa normalmente a un nivel significativo en las membranas de las superficies exteriores de células neuronales, en las que su exposición al sistema inmunitario está limitada por la barrera hematoencefálica. Sin embargo, GD2 se expresa en las superficies de una amplia gama de células tumorales, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, neuroblastoma, melanomas y osteosarcomas. Otros autoantígenos adecuados incluyen receptores de superficie celular que se hallan en células tumorales, pero rara vez o nunca se hallan en la superficie de células sanas. Tales receptores pueden ser los responsables de la activación de rutas de señalización celular que dan como resultado el crecimiento y la división desregulados de la célula tumoral. Por ejemplo, ErbB2 se produce a niveles anómalamente altos en la superficie de células tumorales de cáncer de mama. Preferiblemente, el autoantígeno comprende un antígeno asociado a tumor (AAT).

Tal como se usa en el presente documento, el término “antígeno” abarca uno o más epítopos de un antígeno e incluye el antígeno original y fragmentos y variantes del mismo. Estos fragmentos y estas variantes conservan esencialmente la misma actividad o función biológica que el antígeno original. Preferiblemente, conservan o mejoran la antigenicidad y/o la inmunogenicidad del antígeno original. Generalmente, se entiende que “antigénico” significa que la proteína o el polipéptido puede usarse para generar anticuerpos o células T o, de hecho, puede inducir la respuesta de un anticuerpo o de una célula T en un sujeto. Se entiende que “inmunogénico” significa que la proteína o el polipéptido puede provocar una respuesta inmunitaria potente y, preferiblemente, una protectora en un sujeto. Por tanto, en este último caso, la proteína o el polipéptido puede generar una respuesta de anticuerpos y una respuesta inmunitaria no basada en anticuerpos.

Preferiblemente, los fragmentos de los antígenos comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de la secuencia del antígeno original, en los que n es preferiblemente al menos, o más de, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 57, 58, 59, 60, 70, 80, 90 ó 100. Los fragmentos incluyen preferiblemente una o más regiones epitópicas del antígeno original. De hecho, el fragmento puede comprender o consistir en un epítopo del antígeno original. Alternativamente, el fragmento puede ser lo suficientemente similar a tales regiones como para conservar sus propiedades antigénicas/inmunogénicas.

Los antígenos para su uso en la presente invención incluyen variantes tales como derivados, análogos, homólogos o equivalentes funcionales del antígeno original. Son particularmente preferidos los derivados, análogos, homólogos o equivalentes funcionales que tienen una secuencia de aminoácidos similar a la del antígeno original, en los que uno o más residuos de aminoácido se sustituyen, delecionan o añaden en cualquier combinación. Preferiblemente, estas variantes conservan un epítopo o determinante antigénico en común con el antígeno original.

Preferiblemente, los derivados, análogos, homólogos y equivalentes funcionales tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos del antígeno original.

La secuencia de nucleótidos exógena puede codificar para más de un antígeno. El vector viral puede diseñarse para expresar el uno o más genes del antígeno como una serie de epítopos. Preferiblemente, los epítopos en una serie de múltiples epítopos están unidos sin secuencias que intervengan, de tal manera que se evita material de ácido nucleico y/o aminoácidos innecesario. La creación de la serie de epítopos se consigue preferiblemente usando un constructo de ADN recombinante que codifica para la secuencia de aminoácidos de la serie de epítopos, codificando el ADN para el uno o más epítopos en el mismo marco de lectura. Un antígeno a modo de ejemplo, TIPeGFP, comprende una serie de epítopos que incluye los siguientes epítopos: E6FP, SIV-gag, PyCD4 y Py3. Alternativamente, los antígenos pueden expresarse como polipéptidos independientes.

Uno o más de los antígenos o genes del antígeno pueden estar truncados en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal. Esto puede facilitar la clonación y la construcción de la vacuna de vector y/o potenciar la inmunogenicidad o antigenicidad del antígeno. Los expertos en la técnica conocerán los métodos para el truncamiento. Por ejemplo, pueden usarse diversas técnicas de modificación por ingeniería genética bien conocidas para delecionar selectivamente la secuencia de ácido nucleico codificante en cualquier extremo del gen del antígeno y luego insertar la secuencia codificante deseada en el vector viral. Por ejemplo, se crean truncamientos de la proteína candidata usando estrategias de exonucleasas 3' y/o 5' de manera selectiva para debilitar los extremos 3' y/o 5' del ácido nucleico codificante, respectivamente. Preferiblemente, la secuencia del gen de tipo natural se trunca de tal manera que el antígeno expresado se trunca por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos en relación con el antígeno original. Preferiblemente, el gen del antígeno se trunca por 10 - 20 aminoácidos en el extremo C-terminal en relación con el antígeno de tipo natural. Más preferiblemente, el gen del antígeno se trunca por 13 - 18 aminoácidos, lo más preferiblemente por 15 aminoácidos, en el extremo C-terminal en relación con el antígeno de tipo natural. Preferiblemente, el antígeno Ag85A se trunca en el extremo C-terminal de esta manera.

Uno o más de los genes del antígeno también pueden comprender una secuencia líder. La secuencia líder puede afectar al procesamiento del transcrito primario para formar ARNm, a la eficiencia de la traducción y a la estabilidad del ARNm, y puede potenciar la expresión y/o la inmunogenicidad del antígeno. Preferiblemente, la secuencia líder es del activador del plasminógeno tisular (tPA). Preferiblemente, la secuencia líder del tPA se posiciona N-terminal con respecto al uno o más antígenos.

La secuencia líder, tal como la secuencia líder del tPA, puede ligarse a la secuencia del antígeno mediante un ligador peptídico. En general, los ligadores peptídicos tienen una longitud de desde 2 hasta aproximadamente 50 aminoácidos y pueden tener cualquier secuencia, siempre que no forme una estructura secundaria que interfiera con el plegamiento de dominios de la proteína de fusión.

Uno o más de los genes del antígeno pueden comprender un marcador, tal como el marcador proteína fluorescente verde (GFP), para facilitar la detección del producto expresado de la secuencia génica insertada. Uno o más de los genes del antígeno pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido etiqueta que se liga covalentemente al antígeno tras la traducción. Preferiblemente, el polipéptido etiqueta se selecciona del grupo que consiste en una etiqueta PK, una etiqueta FLAG, una etiqueta MYC, una etiqueta de polihistidina o cualquier etiqueta que pueda detectarse por un anticuerpo monoclonal. La secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido etiqueta puede posicionarse de tal manera que, después de la traducción, la etiqueta esté ubicada en el extremo C-terminal o el extremo N-terminal del antígeno expresado o sea interna para el antígeno expresado. Preferiblemente, la etiqueta está ubicada en el extremo C-terminal del antígeno expresado. En una realización preferida, uno o más de los genes del antígeno codifican para una etiqueta PK. Una etiqueta de este tipo puede facilitar la detección de la expresión del antígeno y de clones que expresan el antígeno y/o potenciar la inmunogenicidad o la antigenicidad del antígeno.

51 se usa un polipéptido etiqueta, los nucleótidos que codifican para una secuencia ligadora se insertan preferiblemente entre el ácido nucleico que codifica para el polipéptido etiqueta y el ácido nucleico que codifica para el antígeno expresado. Un ligador a modo de ejemplo es IPNPLLGLD.

En una realización alternativa, la secuencia exógena de interés puede ser no codificante para proteínas. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos exógena puede ser un miARN o una secuencia de ARN inmunoestimuladora.

El vector adenoviral puede comprender una o más secuencias de nucleótidos exógenas, por ejemplo, 1, 2 ó 3 o más secuencias de nucleótidos exógenas. Preferiblemente, cada secuencia de nucleótidos exógena incorpora un transgén. La secuencia de nucleótidos exógena que incorpora el transgén puede ser un gen o una parte funcional del gen. El vector adenoviral puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica para una única molécula de interés. Alternativamente, el vector adenoviral puede comprender una secuencia de nucleótidos o más de una secuencia de nucleótidos que codifica para más de una molécula de interés.

Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos exógena está ubicada dentro del genoma del adenovirus, es decir, en una molécula de ácido nucleico que contiene otras secuencias adenovirales. La secuencia de nucleótidos exógena puede insertarse en el sitio de un gen parcial o completamente delecionado, por ejemplo, en el sitio de una deleción de E1 o una deleción de E3 dentro del genoma del adenovirus.

La secuencia de nucleótidos exógena puede insertarse en una región existente del gen C68 para alterar la función de esa región. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos exógena puede insertarse en una región del genoma sin alterar la función ni la secuencia de los genes circundantes.

Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos exógena o el transgén está ligado operativamente a secuencias reguladoras necesarias para dirigir la traducción, la transcripción y/o la expresión de la secuencia de nucleótidos exógena/transgén en una célula huésped, por ejemplo, una célula de mamífero. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “ligado operativamente” significa que las secuencias reguladoras son contiguas a las secuencias de ácido nucleico que regulan, o que dichas secuencias reguladoras actúan en trans, o a cierta distancia, para controlar la secuencia de ácido nucleico regulada. Tales secuencias reguladoras incluyen secuencias de control de la expresión apropiadas, tales como secuencias de iniciación de la transcripción, de terminación, potenciadoras y promotoras, señales de procesamiento de ARN eficientes, tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación, secuencias que potencian la eficiencia de la traducción y la estabilidad de las proteínas y secuencias que fomentan la secreción de proteínas. Además, pueden contener secuencias para la represión de la expresión del transgén, por ejemplo, durante la producción en la expresión de líneas celulares de un receptor transactivador. Se han identificado y se conocen en la técnica promotores y otras secuencias reguladoras que controlan la expresión de un ácido nucleico. Preferiblemente, el promotor se selecciona del grupo que consiste en promotores del CMV humano, promotores del CMV de simio, promotores del CMV murino, ubiquitina, el promotor EF1, el promotor EF1 de rana, actina y otros promotores de mamíferos. Los más preferidos son los promotores del CMV humano y, en particular, el promotor temprano inmediato principal del CMV humano.

La(s) secuencia(s) de nucleótidos exógena(s) de interés puede(n) introducirse en el vector viral como parte de un casete. Tal como se usa en el presente documento, el término “casete” se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que va a expresarse, junto con sus secuencias de control transcripcionales y traduccionales, para permitir la expresión de la(s) secuencia(s) de nucleótidos en una célula huésped y, opcionalmente, sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del casete. Debido a los sitios de endonucleasa de restricción, los casetes pueden insertarse, retirarse o sustituirse por otro casete fácilmente. El cambio del casete dará como resultado la expresión de secuencia(s) diferente(s) por el vector en el que se incorpora el casete. Alternativamente, puede usarse cualquier método conocido por un experto en la técnica para construir, modificar o derivar dicho casete, por ejemplo, mutagénesis por PCR, In-Fusion®, ingeniería de recombinación, clonación Gateway®, recombinación específica del sitio o clonación con topoisomerasas.

Las secuencias de control de la expresión incluyen preferiblemente los elementos del adenovirus necesarios para la replicación y la encapsidación de viriones. Preferiblemente, los elementos flanquean la secuencia de nucleótidos exógena. Preferiblemente, el vector ChAd68 comprende secuencias de repetición terminal invertida (ITR) en 5' de C68, que funcionan como orígenes de la replicación, y secuencias ITR en 3'.

La secuencia señal de encapsidación funciona para dirigir el ensamblaje del vector viral, y están bien caracterizadas y se entienden en la técnica.

Tal como apreciará un experto en la técnica, existen límites mínimos y máximos en cuanto a la longitud de la molécula de ácido nucleico que puede encapsidarse en el vector viral. Por tanto, si se requiere, la molécula de ácido nucleico también puede comprender “relleno” (stuffing), es decir, una secuencia de nucleótidos adicional para hacer que el genoma final del vector tenga el tamaño requerido. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico comprende suficiente “relleno” como para garantizar que la molécula de ácido nucleico tenga de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 108% de la longitud de la molécula de ácido nucleico de tipo natural.

La molécula de ácido nucleico también puede comprender uno o más genes o locus del genoma de C68. El genoma de C68 de tipo natural comprende 4 unidades transcripcionales tempranas (E1, E2, E3 y E4), que principalmente tienen funciones reguladoras y preparan a la célula huésped para la replicación viral. El genoma también comprende 5 unidades transcripcionales tardías (L1, L2, L3, L4 y L5), que codifican para proteínas estructurales incluyendo el pentón (L2), el hexón (L3), la proteína de armazón (L4) y la proteína de fibra (L5), que están bajo el control de un único promotor. Cada miembro del genoma comprende una repetición terminal invertida (ITR) que es necesaria para la replicación viral.

El vector viral de la presente invención se basa en el genoma completo de C68 nativo, del cual se ha delecionado la región E4 nativa y en el que se han insertado las regiones codificantes E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3 heterólogas del AdY25, tal como se define en las reivindicaciones.

Una secuencia de nucleótidos exógena de interés también puede insertarse en el genoma de C68. Un experto en la técnica apreciará que son posibles diversas modificaciones adicionales del genoma de C68 nativo y, de hecho, son deseables cuando se crea un vector viral.

Pueden delecionarse, delecionarse funcionalmente o modificarse uno o más genes de C68 nativo para optimizar el vector viral.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “delecionado” se refiere a la deleción total de un gen, mientras que “deleción funcional” se refiere a una deleción parcial de un gen/locus, o a alguna otra modificación, tal como una mutación de cambio del marco, que destruye la capacidad del adenovirus de expresar el gen/locus o hace que el producto génico no sea funcional.

El genoma de C68 puede modificarse para aumentar la capacidad de inserción o dificultar la replicación en células huésped y/o aumentar el crecimiento y la producción del vector viral en líneas celulares de encapsidación transformadas. Un experto en la técnica apreciará que pueden delecionarse funcionalmente varios genes tempranos o tardíos. La replicación de tales vectores virales modificados todavía será posible en líneas celulares transformadas que comprendan un complemento de los genes delecionados. Por ejemplo, las proteínas virales necesarias para la replicación y el ensamblaje pueden proporcionarse en trans mediante líneas celulares de encapsidación modificadas por ingeniería o mediante un virus auxiliar.

Por tanto, además de la secuencia de nucleótidos exógena, el vector de la presente invención puede comprender las secuencias adenovirales mínimas, el genoma adenoviral con una o más deleciones o deleciones funcionales de genes particulares o el genoma adenoviral nativo completo en el que se ha insertado la secuencia de nucleótidos exógena.

Preferiblemente, se modifican, delecionan o delecionan funcionalmente una o más de las unidades transcripcionales tempranas.

En una realización, el vector viral es no replicante o tiene replicación alterada. Tal como se usa en el presente documento, el término “no replicante” o “con replicación alterada” significa que no puede replicarse hasta ningún grado significativo en la mayoría de las células de mamífero normales, preferiblemente células humanas normales. Se prefiere que el vector viral no pueda provocar una enfermedad o infección productiva en el paciente humano. Sin embargo, preferiblemente, el vector viral puede estimular una respuesta inmunitaria. Los virus que no son replicantes o que tienen replicación alterada pueden haberse vuelto así de forma natural, es decir, pueden aislarse como tal a partir de la naturaleza. Alternativamente, los virus pueden convertirse en no replicantes o presentar replicación alterada artificialmente, por ejemplo, mediante cultivo in vitro o mediante manipulación genética. Por ejemplo, puede delecionarse funcionalmente un gen que es crítico para la replicación.

Preferiblemente, la replicación del vector adenoviral se vuelve incompetente mediante la deleción funcional de una única unidad transcripcional que es esencial para la replicación viral. Preferiblemente, se deleciona o deleciona funcionalmente el gen/locus E1. El gen/locus E1 puede sustituirse por un transgén heterólogo, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos o un casete de expresión que codifica para una proteína o un polipéptido de interés.

Tal como se comenta en el presente documento, el adenovirus recombinante puede crearse generando un clon molecular de C68 en un cromosoma artificial bacteriano (BAC), y el locus E1 se deleciona preferiblemente incluyendo un flanco de homología adicional en el sentido de 3' de la región E1 del adenovirus para permitir la deleción simultánea de E1 durante la recombinación homóloga entre el ADN viral de C68 y un “vector de rescate” de BAC linealizado.

Preferiblemente, el vector viral según la presente invención comprende uno o más sitios de recombinación para permitir la inserción de uno o más transgenes o casetes que comprenden la secuencia de nucleótidos exógena. Preferiblemente, los sitios de recombinación comprenden sitios de recombinación específicos del sitio del fago lambda. Estos sitios de recombinación pueden introducirse en cualquier locus adecuado, pero preferiblemente se introducen en el locus E1 del adenovirus. Por tanto, el vector no replicante o con replicación alterada puede prepararse sustituyendo el gen E1 por una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína o el polipéptido de interés. Preferiblemente, se introducen los sitios de recombinación attRI y attR2 en el locus E1 del adenovirus como parte de un casete de destino Gateway® de Invitrogen.

Preferiblemente, el vector carece de un gen/locus E3 del adenovirus. La deleción de la región E3 del adenovirus aumenta la capacidad de inserción del nuevo vector en aproximadamente 5 kb. La deleción de E3 tiene pocas consecuencias para la producción del vector viral puesto que esta región no se requiere para la replicación del virus y, por tanto, no es necesario que se proporcione en trans en la línea celular de encapsidación. El locus E3 puede delecionarse usando ingeniería de recombinación de GalK.

En la presente invención, se delecionan tanto el locus E1 como el E3 del genoma de C68.

Los vectores virales de la presente invención pueden producirse en líneas celulares modificadas por ingeniería que contienen un complemento de cualquier gen delecionado requerido para la replicación viral. Sin embargo, la replicación de vectores virales según la presente invención puede ser por debajo de la óptima en células diseñadas para facilitar la replicación de otros serotipos. Por tanto, preferiblemente, los vectores adenovirales según la presente invención comprenden además una o más modificaciones diseñadas para optimizar el crecimiento y la producción del vector en líneas celulares transformadas, tales como HEK293, que expresan los genes funcionalmente delecionados en el vector adenoviral según la presente invención.

De particular importancia para la replicación viral en células HEK293 es el producto génico de E4Orf6, una proteína multifuncional involucrada en el corte y empalme de ARNm viral tardío y en la exportación selectiva de ARNm viral, la síntesis de ADN viral y la inhibición de la apoptosis. Se cree que la interacción por debajo de la óptima entre E4Orf6 y E1B-55K expresada por células reduce la producción de vectores ChAdOx2 en células HEK293. Por tanto, la región E4Orf6 nativa puede sustituirse por una región E4Orf6 heteróloga.

En la invención, las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 nativas se sustituyen por las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 del AdHu5, y la región E4 recombinante comprende las regiones codificantes E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3 del AdY25.

En una realización preferida, el vector de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, comprende las secuencias de nucleótidos de E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 del AdHu5.

En la presente invención, el vector viral comprende una forma modificada del genoma de C68 nativo, en el que la secuencia de nucleótidos de C68 nativo carece de las secuencias de nucleótidos que codifican para las regiones E1 y E3 del adenovirus y tiene el locus E4 nativo sustituido por las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 del AdHu5 y las regiones codificantes E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3 del AdY25. Este vector viral según la invención se denomina en el presente documento “ChAdOx2”.

Un segundo aspecto de la presente invención proporciona una composición farmacéutica o inmunogénica que comprende el vector viral según el segundo aspecto de la presente invención, opcionalmente en combinación con uno o más principios activos adicionales, un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Preferiblemente, la composición es una composición inmunogénica y/o antigénica. Las composiciones inmunogénicas y/o antigénicas según la presente invención puede ser profilácticas (para prevenir la infección), posteriores a la exposición (para tratar después de la infección pero antes de la enfermedad) o terapéuticas (para tratar la enfermedad). Preferiblemente, la composición es profiláctica o posterior a la exposición. Preferiblemente, la composición es una vacuna.

Cuando la composición inmunogénica es para uso profiláctico, el sujeto es preferiblemente un bebé, un niño pequeño, un niño mayor o un adolescente. Cuando la composición inmunogénica es para uso terapéutico, el sujeto es preferiblemente un adulto.

La composición puede comprender uno o más agentes activos adicionales, tales como un agente antiinflamatorio (por ejemplo, un inhibidor de p38, un antagonista del receptor de glutamato o un antagonista de los canales de calcio), un antagonista del receptor AMPA, un agente quimioterápico y/o un agente antiproliferativo. La composición también puede comprender uno o más compuestos antimicrobianos. Los ejemplos de compuestos antimicrobianos adecuados incluyen quimioterápicos antituberculosos tales como rifampicina, isoniazida, etambutol y pirizinamida.

En la técnica se conocen bien portadores y/o diluyentes adecuados, e incluyen almidón, manitol, lactosa, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa (u otro azúcar), carbonato de magnesio, gelatina, aceite, alcohol, detergentes, emulsionantes o agua (preferiblemente estéril) de calidad farmacéutica. La composición puede ser una preparación mixta de una composición o puede ser una preparación combinada para uso (incluyendo administración) simultáneo, independiente o secuencial.

En la técnica se conocen bien adyuvantes adecuados, e incluyen adyuvante incompleto de Freund, adyuvante completo de Freund, adyuvante de Freund con MDP (muramil dipéptido), alumbre (hidróxido de aluminio), alumbre más Bordatella pertussis y complejos estimuladores del sistema inmunitario (ISCOM, normalmente una matriz de Quil A que contiene proteínas virales).

La composición según la invención para su uso en las indicaciones anteriormente mencionadas puede administrarse mediante cualquier método conveniente, por ejemplo, mediante administración oral (incluyendo mediante inhalación), parenteral, a través de la mucosa (por ejemplo, bucal, sublingual, nasal), rectal o transdérmica, y las composiciones se adaptan en consecuencia.

Para la administración oral, la composición puede formularse como líquidos o sólidos, por ejemplo, disoluciones, jarabes, suspensiones o emulsiones, comprimidos, cápsulas y pastillas para chupar.

En general, una formulación líquida consistirá en una suspensión o disolución del compuesto, o de una sal fisiológicamente aceptable, en un portador líquido acuoso o no acuoso adecuado, por ejemplo, agua, etanol, glicerina, polietilenglicol o aceite. La formulación también puede contener un agente de suspensión, un conservante, un aromatizante o un agente colorante.

Una composición en forma de comprimido puede prepararse usando cualquier portador farmacéutico adecuado usado habitualmente para preparar formulaciones sólidas. Los ejemplos de tales portadores incluyen estearato de magnesio, almidón, lactosa, sacarosa y celulosa microcristalina.

Una composición en forma de cápsula puede prepararse usando procedimientos de encapsulación habituales. Por ejemplo, pueden prepararse polvos, gránulos o microgránulos que contienen el principio activo usando portadores convencionales y luego introduciéndolos en una cápsula dura de gelatina; alternativamente, puede prepararse una dispersión o suspensión usando cualquier portador farmacéutico adecuado, por ejemplo, gomas acuosas, celulosas, silicatos o aceites, y luego introduciendo la dispersión o suspensión en una cápsula blanda de gelatina.

Las composiciones para administración oral pueden diseñarse para proteger al principio activo de la degradación a medida que pasa a través del aparato digestivo, por ejemplo, mediante un recubrimiento exterior de la formulación en un comprimido o una cápsula.

Las composiciones parenterales típicas consisten en una disolución o suspensión del compuesto, o de una sal fisiológicamente aceptable, en un portador acuoso o no acuoso estéril o un aceite parenteralmente aceptable, por ejemplo, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, lecitina, aceite de cacahuete o aceite de sésamo. Alternativamente, la disolución puede liofilizarse y luego reconstituirse con un disolvente adecuado justo antes de la administración. Las composiciones para administración nasal u oral pueden formularse de manera conveniente como aerosoles, gotas, geles y polvos. Las formulaciones de aerosol comprenden normalmente una disolución o suspensión fina del principio activo en un disolvente acuoso o no acuoso fisiológicamente aceptable y, habitualmente, se presentan en cantidades individuales o en dosis múltiples en forma estéril en un envase sellado, que puede tener la forma de un cartucho o recambio para su uso con un dispositivo atomizador. Alternativamente, el envase sellado puede ser un dispositivo de dispensación unitaria, tal como un inhalador nasal monodosis o un dispensador de aerosol dotado de una válvula dosificadora, que está previsto para su eliminación una vez que se haya terminado el contenido del envase. Cuando la forma de dosificación comprende un dispensador de aerosol, contendrá un propelente farmacéuticamente aceptable. Las formas de dosificación de aerosol también pueden tener la forma de un atomizador con bomba.

Las composiciones adecuadas para administración bucal o sublingual incluyen comprimidos, pastillas para chupar y píldoras, en las que el principio activo se formula con un portador tal como azúcar y goma arábiga, tragacanto o gelatina y glicerina.

Las composiciones para administración rectal o vaginal están convenientemente en forma de supositorios (que contienen una base de supositorio convencional, tal como manteca de cacao), óvulos vaginales, comprimidos vaginales, espumas o enemas.

Las composiciones adecuadas para administración transdérmica incluyen pomadas, geles, parches e inyecciones, incluyendo inyecciones de polvo.

De manera conveniente, la composición está en forma de dosis unitaria, tal como un comprimido, una cápsula o una ampolla.

La composición farmacéutica es preferiblemente estéril. Preferiblemente, está libre de pirógenos. Preferiblemente, está tamponada, por ejemplo, entre pH 6 y pH 8, generalmente alrededor de pH 7. Preferiblemente, la composición es sustancialmente isotónica con los seres humanos.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención administran una cantidad inmunogénica o farmacéuticamente eficaz del vector viral a un paciente. Tal como se usa en el presente documento “cantidad inmunogénica o farmacéuticamente eficaz” significa que la administración de esa cantidad a un individuo, o bien como dosis única o bien como una serie de dosis, es eficaz para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o un estado. En particular, esta expresión significa que se administra una cantidad suficiente del vector viral al paciente a lo largo de un periodo de tiempo adecuado, de tal manera que se produce una cantidad suficiente del antígeno por parte de las células del paciente para estimular una respuesta inmunitaria que sea eficaz para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o un estado. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y el estado físico del individuo que va a tratarse, la edad, la capacidad del sistema inmunitario del individuo, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación por parte del médico de la situación médica y otros factores relevantes.

En general, una dosis farmacéuticamente eficaz comprende de 1 x 107 a 1 x 1012 partículas virales (pv), preferiblemente de 1 x 1010 a 1 x 1011 partículas. Más preferiblemente, una dosis farmacéuticamente eficaz comprende de 2,5x1010 pv a 5 x 1010 pv. Lo más preferiblemente, una dosis farmacéuticamente eficaz comprende 2,5x1010 pv.

En una realización preferida, se proporciona una vacuna basada en ChAdOx2, en la que la vacuna contiene antígenos de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP). Preferiblemente, esta vacuna se administra a una dosis de entre 5 x 109 y 5 x 1010 pv. Más preferiblemente, esta vacuna se administra a una dosis de entre 2,5x1010 pv y 5 x 1010 pv. Lo más preferiblemente, la vacuna se administra a una dosis de 2,5x1010 pv.

En una realización preferida, se proporciona una vacuna basada en ChAdOx2, en la que el vector ChAdOx2 codifica para la glicoproteína del virus de la rabia. En una realización preferida, esta vacuna se administra a animales a una dosis de entre 1 x106 y 1 x108 unidades de infectividad. En otra realización preferida, esta vacuna se administra a seres humanos a una dosis de entre 5 x 109 y 5 x 1010 pv. Más preferiblemente, esta vacuna se administra a seres humanos a una dosis de entre 2,5x1010 pv y 5 x 1010 pv. Lo más preferiblemente, la vacuna se administra a seres humanos a una dosis de 2,5x1010 pv.

La composición inmunogénica de la presente invención también puede comprender uno o más vectores virales diferentes, preferiblemente otros vectores adenovirales.

Un tercer aspecto de la presente invención proporciona el uso del vector viral según el primer aspecto de la presente invención o de la composición inmunogénica según el segundo aspecto de la presente invención. En particular, el tercer aspecto proporciona el uso del vector viral o de la composición inmunogénica de la presente invención en medicina.

Este aspecto también proporciona: i) el vector viral o la composición inmunogénica según la presente invención para su uso en medicina.

A continuación se describen con mayor detalle algunos usos médicos a modo de ejemplo.

En una realización, el vector viral según el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el segundo aspecto de la presente invención puede usarse para administrar un transgén a una célula huésped.

Este método comprende preferiblemente la etapa de administrar a dicha célula huésped un vector viral según el segundo aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el tercer aspecto de la presente invención.

Preferiblemente, la célula huésped es una célula animal, más preferiblemente una célula de mamífero. Los mamíferos preferidos incluyen gallinas, otras aves de corral, vacas, ovejas, cabras, cerdos, jabalí salvaje, búfalo, bisonte, caballos, camélidos, ciervo, elefantes, tejones, zarigüeyas, gatos, leones, monos y seres humanos. Preferiblemente, la célula huésped es una célula somática. La célula huésped puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula dendrítica presentadora de antígeno, una célula de Langerhans, un macrófago, una célula B, un linfocito, un leucocito, un miocito y un fibroblasto.

Este método puede llevarse a cabo in vitro o in vivo. Cuando el método se lleva a cabo in vitro, el vector viral o la composición inmunogénica se pone en contacto con la célula huésped en condiciones adecuadas de tal manera que se facilita la transducción o infección no productiva de la célula huésped con el vector viral. En esta realización, la célula huésped puede comprender una célula huésped aislada o una muestra de un sujeto animal. Cuando el método se lleva a cabo in vivo, el vector viral o la composición inmunogénica se administra preferiblemente al sujeto animal de tal manera que se facilita la transducción de una o más células del sujeto con el vector viral. Preferiblemente, el vector viral o la composición inmunogénica se administra al sujeto mediante administración oral (incluyendo mediante inhalación), parenteral (por ejemplo, intramuscular, subcutánea, intravenosa o intraperitoneal), a través de la mucosa (por ejemplo, bucal, sublingual, nasal), rectal o transdérmica.

Preferiblemente, la transducción de la célula huésped con el vector viral de la presente invención da como resultado la administración estable de la secuencia de nucleótidos exógena de interés a la célula huésped.

Por tanto, en otra realización, el vector viral según el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el segundo aspecto de la presente invención puede usarse para provocar una respuesta inmunitaria en un animal. Este método comprende preferiblemente la etapa de administrar a dicho animal un vector viral según el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el segundo aspecto de la presente invención.

Cuando la proteína o el polipéptido de interés es un antígeno, la expresión de la proteína o el polipéptido en un animal dará como resultado que se provoque una respuesta inmunitaria primaria a ese antígeno, conduciendo al desarrollo de una memoria inmunológica que proporcionará una respuesta potenciada en el caso de un encuentro secundario, por ejemplo, tras la infección por el patógeno a partir del cual se derivó el antígeno.

Preferiblemente, el animal es un animal no sometido previamente a experimentación, es decir, un animal que no se ha expuesto previamente al patógeno o a los antígenos en cuestión.

Además de provocar una respuesta inmunitaria en un animal, el vector viral de la presente invención o la composición inmunogénica del mismo puede usarse para potenciar la respuesta inmunitaria de un animal previamente expuesto al antígeno.

Por tanto, en una realización adicional, el vector viral según el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el segundo aspecto de la presente invención puede usarse para potenciar una respuesta inmunitaria en un animal. Este método comprende preferiblemente la etapa de administrar a dicho animal un vector viral según el segundo aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el tercer aspecto de la presente invención.

Preferiblemente, el sujeto animal se ha expuesto previamente al antígeno en cuestión o se ha “sensibilizado”. Por ejemplo, al sujeto puede habérsele inoculado o vacunado previamente con una composición que comprende el antígeno, o puede haberse infectado con el patógeno a partir del cual se derivó el antígeno. El sujeto puede infectarse implícitamente con el patógeno a partir del cual se derivó el antígeno.

En otra realización, el vector según el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el segundo aspecto de la presente invención puede usarse para tratar o prevenir al menos una enfermedad en un paciente. Un método para tratar o prevenir una enfermedad en un paciente comprende preferiblemente la etapa de administrar a dicho paciente un vector viral según el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el segundo aspecto de la presente invención.

Preferiblemente, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en tuberculosis y otras infecciones micobacterianas, incluyendo enfermedad de Johne, enfermedad de Crohn, malaria, gripe, VIH/SIDA, hepatitis C, infección por citomegalovirus, infección por virus del papiloma humano, infección adenoviral, leishmaniosis, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Meningococcus spp., infección, glosopeda, infección por virus Chikungunya, virus de Zika, rabia, fiebre hemorrágica de Crimea y el Congo, enfermedad por el virus del Ébola, virus de Marburgo, fiebre de Lassa, enfermedades por coronavirus del MERS y del SARS, fiebre de Nipah y del Gran Valle del Rift, Zika, Chikungunya.

Lo más preferiblemente, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en tuberculosis y otras infecciones micobacterianas, y rabia.

Además de inducir una respuesta inmunitaria contra el organismo patógeno a partir del cual se deriva el antígeno heterólogo, el vector adenoviral de la presente invención también puede inducir una respuesta inmunitaria contra el adenovirus a partir del cual se deriva el vector viral. Como tal, puede provocarse una respuesta inmunitaria contra C68. La respuesta inmunitaria inducida contra C68 también puede tener reactividad cruzada con otros serotipos adenovirales y, como tal, puede provocarse una respuesta inmunitaria contra más de un adenovirus. Por tanto, el vector viral según el segundo aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el tercer aspecto de la presente invención también puede usarse para tratar o prevenir una enfermedad adenoviral.

Por tanto, esta realización de la presente divulgación también proporciona el tratamiento o la prevención de al menos una enfermedad adenoviral y al menos una enfermedad no adenoviral en un paciente.

En una realización adicional, el vector viral según el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el segundo aspecto de la presente invención puede usarse para inducir una respuesta inmunitaria en un animal que romperá la tolerancia a un autoantígeno. Este método comprende preferiblemente la etapa de administrar a dicho animal un vector viral según el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el segundo aspecto de la presente invención.

Muchas células tumorales son toleradas por el sistema inmunitario del paciente, basándose en que las células tumorales son esencialmente las propias células del paciente que están en crecimiento, división y propagación sin un control regulatorio apropiado. Por tanto, los tumores cancerosos pueden crecer sin control dentro del cuerpo del paciente. Sin embargo, el vector viral de la presente invención puede usarse para estimular el sistema inmunitario de un paciente para atacar a las células tumorales en un proceso conocido como “inmunoterapia contra el cáncer”. Específicamente, el vector de la presente invención puede usarse para “entrenar” al sistema inmunitario del paciente para reconocer a las células tumorales como dianas para su destrucción. Esto puede lograrse incluyendo dentro del vector viral una secuencia de nucleótidos exógena que codifica para un autoantígeno adecuado. Tal como se describió previamente, los autoantígenos adecuados incluyen antígenos expresados por células tumorales que permiten al sistema inmunitario diferenciar entre células tumorales y otros tipos de células. Los autoantígenos adecuados incluyen antígenos que o bien son inapropiados para el tipo de célula y/o su entorno, o bien sólo están presentes normalmente durante el desarrollo de los organismos (por ejemplo, antígenos fetales). Por ejemplo, GD2 sólo se expresa normalmente a un nivel significativo en las membranas de las superficies exteriores de células neuronales, en las que su exposición al sistema inmunitario está limitada por la barrera hematoencefálica. Sin embargo, GD2 se expresa en las superficies de una amplia gama de células tumorales, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, neuroblastoma, melanomas y osteosarcomas. Otros autoantígenos adecuados incluyen receptores de superficie celular que se hallan en células tumorales, pero rara vez o nunca se hallan en la superficie de células sanas. Tales receptores pueden ser los responsables de la activación de rutas de señalización celular que dan como resultado el crecimiento y la división desregulados de la célula tumoral. Por ejemplo, ErbB2 se produce a niveles anómalamente altos en la superficie de células tumorales de cáncer de mama. Por tanto, el vector adenoviral de la presente invención puede usarse para inducir una respuesta inmunitaria contra una célula tumoral y, por tanto, puede usarse en el tratamiento del cáncer.

El vector adenoviral de la invención puede usarse para tratar, prevenir o limitar el desarrollo de un tumor o cáncer, incluyendo, pero sin limitarse a, cáncer de bazo, páncreas, próstata, hígado, pulmón, mama, intestino, cerebro y colon.

Un método para tratar o prevenir cáncer en un paciente comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz del vector adenoviral de la invención a un paciente.

El vector adenoviral de la invención también puede usarse para tratar estados autoinmunitarios o estados provocados por hipersensibilidad a los propios antígenos.

Un método para tratar un estado autoinmunitario en un paciente comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz del vector adenoviral de la invención a un paciente.

Los siguientes detalles se aplica, haciendo los cambios necesarios, a todos los usos anteriores del vector y de la composición inmunogénica de la presente invención.

El tratamiento y la prevención de muchas enfermedades, incluyendo malaria en fase hepática, tuberculosis y gripe, se asocian con el mantenimiento de una respuesta fuerte mediada por células a la infección que implica tanto células T CD4+ como CD8+ y la capacidad de responder con citocinas de tipo Th1, particularmente IFN-y, TNF-a, IL-2 e IL-17. Aunque muchas plataformas de vacunas de subunidades generan eficazmente inmunidad en seres humanos, la generación de respuestas inmunitarias robustas mediadas por células, particularmente respuestas inmunitarias a células T CD4+ y CD8+, ha supuesto un desafío mucho mayor. El vector viral de la presente invención estimula preferiblemente respuestas inmunitarias tanto celulares como humorales contra el antígeno codificado.

También es deseable inducir una respuesta inmunitaria de memoria. Las respuestas inmunitarias de memoria se atribuyen normalmente a la reactivación de linfocitos T de larga vida específicos de antígeno, que surgen directamente a partir de células T efectoras diferenciadas y persisten en un estado quiescente de manera uniforme. Se ha demostrado que las células T de memoria son heterogéneas y comprenden al menos dos subconjuntos, dotados de diferente capacidad migratoria y función efectora; células T de memoria efectoras (TEM) y células T de memoria centrales (CTM). Las TEM se asemejan a las células efectoras generadas en la respuesta primaria en que carecen de los receptores que se dirigen a los ganglios linfáticos, L-selectina y CCR7, y expresan receptores para la migración hacia los tejidos inflamados. Tras el reencuentro con el antígeno, estas TEM puede producir rápidamente IFN-y o IL-4 o liberar el desempeño almacenado previamente. Las TCM expresan L-selectina y CCR7 y carecen de función efectora inmediata. Estas células tienen un bajo umbral de activación y, tras la reestimulación en órganos linfoides secundarios, proliferan y se diferencian en efectores. Preferiblemente, el vector viral según el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el segundo aspecto de la presente invención puede provocar, inducir o potenciar una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria fuerte de células T, por ejemplo, una respuesta fuerte a células T CD8+ y CD4+. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria a células T es una respuesta inmunitaria a células T protectora. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria a células T es de larga duración y persiste durante al menos 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25 o más años. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria inducida es una respuesta inmunitaria a células T de memoria.

El vector viral según el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el segundo aspecto de la presente invención puede administrarse a la célula huésped o al sujeto o bien como una inmunización única o bien como múltiples inmunizaciones. Preferiblemente, el vector viral o la composición inmunogénica del mismo se administra como parte de una estrategia de vacunación única, doble o triple. También pueden administrarse como parte de un régimen de vacunación de sensibilización-potenciación homólogo o heterólogo.

La estrategia de vacunación o el régimen de vacunación puede incluir una segunda o posteriores administraciones del vector viral o de la composición inmunogénica de la presente invención. La segunda administración puede administrarse durante un periodo de tiempo corto o durante un periodo de tiempo largo. Las dosis pueden administrarse durante un periodo de horas, días, semanas, meses o años, por ejemplo, hasta o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más semanas o 0,25, 0,5, 0,75, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ó 40 o más años después de la primera administración. Preferiblemente, la segunda administración tiene lugar al menos 2 meses después de la primera administración. Preferiblemente, la segunda administración tiene lugar hasta 10 años después de la primera administración. Estos intervalos de tiempo se aplican preferiblemente, haciendo los cambios necesarios, al periodo entre cualquiera de las dosis posteriores.

El vector viral y/o la composición inmunogénica pueden administrarse solos o en combinación con otra vacuna de proteína/ADN viral o no viral. Los ejemplos preferidos incluyen virus vaccinia Ankara modificado (MVA), viruela aviar 9 (FP9) y otras vacunas de vectores adenovirales.

El vector viral y/o la composición inmunogénica pueden administrarse al sujeto mediante administración oral (incluyendo mediante inhalación), parenteral, a través de la mucosa (por ejemplo, bucal, sublingual, nasal), rectal o transdérmica. Alternativamente, el vector viral y/o la composición inmunogénica pueden administrarse a una muestra o célula huésped aislada a partir de un sujeto poniendo en contacto la(s) célula(s) con el vector viral o la composición inmunogénica in vitro en condiciones que faciliten la transducción de la célula huésped con el vector viral.

El vector viral y la composición inmunogénica de la presente invención no se limitan a la administración de secuencias de ácido nucleico que codifican para antígenos. Muchas enfermedades, incluyendo el cáncer, están asociadas con uno o más alelos mutantes perjudiciales en el genoma de un paciente. La terapia génica es un procedimiento que implica la inserción de genes en los tejidos o en las células del paciente para sustituir el/los alelo(s) no funcional(es) o mutante(s) perjudicial(es) por alelo(s) “normal(es)” o funcional(es). Habitualmente, se inserta un alelo funcional en una ubicación inespecífica dentro del genoma para sustituir el alelo no funcional. Alternativamente, el alelo no funcional puede intercambiarse por el alelo funcional mediante recombinación homóloga. La posterior expresión del alelo funcional dentro de la célula diana restablece a la célula diana a un estado normal y, por tanto, proporciona un tratamiento para la enfermedad. Los alelo(s) “normal(es)” o funcional(es) puede(n) insertarse en el genoma de un paciente usando un vector viral. Por tanto, la presente invención también proporciona el uso del vector viral según el primer aspecto de la presente invención o de la composición inmunogénica según el segundo aspecto de la presente invención en terapia génica.

Este método comprende preferiblemente la etapa de administrar a dicho animal un vector viral según el segundo aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el tercer aspecto de la presente invención.

El vector de la presente invención puede comprender una secuencia de nucleótidos exógena que codifica para la proteína funcional o “normal”, cuya versión no funcional o “mutante” está asociada con una enfermedad o un estado.

Preferiblemente, la célula diana es una célula somática. El sujeto que va a tratarse es preferiblemente un mamífero. Los mamíferos preferidos incluyen gallinas, otras aves de corral, vacas, ovejas, cabras, cerdos, jabalí salvaje, búfalo, bisonte, caballos, camélidos, ciervo, elefantes, tejones, zarigüeyas, gatos, leones, monos y seres humanos.

Un cuarto aspecto de la presente invención proporciona una secuencia de polinucleótido que codifica para el vector viral según el primer aspecto de la presente invención.

Un quinto aspecto de la presente invención proporciona una célula huésped transducida o infectada con el vector viral según el primer aspecto de la presente invención. Tras la transducción o infección, la célula huésped expresará la secuencia de nucleótidos exógena en la molécula de ácido nucleico para producir la molécula de interés, además de cualquier otra proteína adenoviral codificada por la molécula de ácido nucleico. Preferiblemente, la célula huésped se transduce de manera estable y es adecuada para la propagación viral. La célula huésped puede ser una célula huésped aislada, parte de una muestra de tejido de un organismo o parte de un organismo multicelular u órgano o tejido del mismo.

Preferiblemente, la célula huésped es una célula somática. Preferiblemente, la célula huésped no es una célula madre, más particularmente una célula madre embrionaria, más particularmente una célula madre embrionaria humana.

La célula huésped puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula dendrítica presentadora de antígeno, una célula de Langerhans, un macrófago, una célula B, un linfocito, un leucocito, un miocito y un fibroblasto.

Preferiblemente, la célula huésped es una célula animal, más preferiblemente una célula de mamífero. Los mamíferos preferidos incluyen gallinas, otras aves de corral, vacas, ovejas, cabras, cerdos, jabalí salvaje, búfalo, bisonte, caballos, camélidos, ciervo, elefantes, tejones, zarigüeyas, gatos, leones, monos y seres humanos. El quinto aspecto de la presente invención también abarca un animal transducido o infectado con el vector viral según el primer aspecto de la presente invención. Preferiblemente, el animal comprende una o más células transformadas o transfectadas con el vector viral según el primer aspecto de la presente invención. Preferiblemente, el animal es un mamífero. Los mamíferos preferidos incluyen gallinas, otras aves de corral, vacas, ovejas, cabras, cerdos, jabalí salvaje, búfalo, bisonte, caballos, camélidos, ciervo, elefantes, tejones, zarigüeyas, gatos, leones, monos y seres humanos.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para producir el vector viral según el primer aspecto de la presente invención. Preferiblemente, el método comprende la etapa de incorporar la secuencia de polinucleótido según el cuarto aspecto de la invención en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) para producir un vector Ad-BAC.

A diferencia de los vectores plasmídicos, los BAC están presentes dentro de E. coli en una única copia que confiere estabilidad genética aumentada. Además, los vectores de BAC con una única copia permiten la realización de modificaciones muy precisas al genoma viral mediante ingeniería de recombinación (ingeniería genética mediada por recombinación).

Preferiblemente, la incorporación de la secuencia de polinucleótido de la invención (derivada de C68) en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) comprende las etapas de:

i) construir un vector de rescate de BAC que comprende regiones de homología con los flancos izquierdo y derecho de la secuencia de nucleótidos viral;

ii) linealizar el vector de rescate de BAC; y

iii) realizar recombinación homóloga en una célula huésped entre la secuencia de nucleótidos viral y el vector de rescate de BAC linealizado para incorporar la secuencia de nucleótidos viral en el vector de rescate de BAC.

Preferiblemente, el método comprende además la etapa de modificar adicionalmente el genoma del vector Ad-BAC. Estas modificaciones adicionales pueden llevarse a cabo mediante ingeniería de recombinación de GalK. Esta técnica, iniciada por S0ren Warming y colaboradores, utiliza el gen GalK para la selección tanto positiva como negativa de clones recombinantes6. Las células de E. coli SW102, en las que puede realizarse la recombinación, se han modificado por ingeniería específicamente para carecer del gen GalK que es necesario para la utilización de galactosa como única fuente de carbono. La deleción del gen se realiza mediante recombinación entre el genoma del vector y un casete de GalK amplificado por PCR, flanqueado por regiones de 50 pb de homología en cualquier lado del gen seleccionado como diana para la deleción. La selección en medio mínimo que contiene únicamente galactosa debe garantizar que únicamente crezcan recombinantes que contienen el gen GalK (en lugar del gen diana). La sustitución de GalK por una secuencia génica diferente puede realizarse de una manera similar, esta vez usando GalK para la selección negativa. La adición de 2-desoxigalactosa (DOG) al medio de selección seleccionará clones en los que se ha sustituido GalK, puesto que el producto de GalK, galactocinasa, metaboliza la DOG en un producto que es altamente tóxico para E. coli. Preferiblemente, la célula huésped es E. coli BJ5183 para las etapas i) a iii) anteriores y SW102 para las modificaciones adicionales.

Preferiblemente, se incluye un flanco de homología adicional en el sentido de 3' de la región E1 del adenovirus para permitir la deleción simultánea de E1.

Preferiblemente, el método incluye además la deleción de la región E3 del genoma del vector Ad-BAC. La deleción de la región E3 puede llevarse a cabo mediante ingeniería de recombinación de GalK.

Preferiblemente, el método incluye además introducir los sitios de recombinación específicos del sitio del fago lambda, attRI y attR2, en el locus E1 de Ad como parte de un casete de destino Gateway® de Invitrogen. Una modificación de este tipo permite la inserción direccional eficiente de transgenes de vacuna. Los transgenes también podrían insertarse mediante ingeniería de recombinación, In-Fusion®, ligación convencional o reparación de huecos.

Un séptimo aspecto de la presente invención proporciona un clon de cromosoma artificial bacteriano (BAC) que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para el vector viral según el primer aspecto de la presente invención.

Preferiblemente, el clon de BAC comprende:

(a) una estructura principal de BAC;

(b) la secuencia de polinucleótido según el cuarto aspecto de la presente invención.

Tal como se describió anteriormente, el vector viral según el primer aspecto de la presente invención puede replicarse en una línea celular transformada o un virus auxiliar (sistema de vectores auxiliares dependientes (“gutless")) que, si es necesario, comprende el complemento de cualquier gen delecionado del virus. Tales genes pueden delecionarse del virus con el fin de dificultar la replicación en células huésped, pero por supuesto son necesarios con el fin de replicar el vector viral para producir composiciones inmunogénicas según el segundo aspecto de la presente invención. Puede usarse cualquier línea celular que permita la replicación de adenovirus de tipo natural que se ha modificado para expresar los genes funcionalmente delecionados, o una línea celular que no permita la replicación del virus de tipo natural que se ha modificado adicional o alternativamente para expresar un CAR o integrinas además de los genes funcionalmente delecionados.

La presente invención proporciona células huésped que comprenden un cromosoma artificial bacteriano (BAC) según el séptimo aspecto de la presente invención y adecuadas para su propagación. Preferiblemente, tales células huésped son bacterias, lo más preferiblemente E. coli. Los ejemplos adecuados incluyen las cepas de E. coli DH10B y SW1029.

Por tanto, un octavo aspecto de la presente invención proporciona una línea celular o célula de encapsidación que produce o puede producir el vector viral según el primer aspecto de la presente invención.

La línea celular o célula de encapsidación comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican para el vector viral según el primer aspecto de la presente invención. La expresión de estas secuencias da como resultado la producción del vector viral. Algunos de los genes necesarios pueden proporcionarse mediante infección de la línea celular o célula con un vector viral según el primer aspecto. Preferiblemente, la célula comprende el complemento de cualquier gen delecionado o funcionalmente delecionado del vector viral. Preferiblemente, la célula es una célula HEK293 o una célula PER.C6®.

Con respecto a todos los estados designados en los que dicha acción es posible y en la medida en que sea legalmente permisible según la ley del estado designado, se solicita que esté disponible una muestra del material depositado únicamente para la emisión de la misma a un experto independiente, según la legislación de patentes relevante, por ejemplo, Regla 32(1) EPC, Regla 13(1) y Anexo 1 de las Reglas de Patentes del Reino Unido 2007, Regulación 3.25(3) de las Regulaciones de Patentes Australianas y disposiciones generalmente similares, haciendo los cambios necesarios, para cualquier otro estado designado.

Tal como se describe en el presente documento, el vector ChAdOx2 se deriva del adenovirus de chimpancé C68, con deleción de la región E1 y la región E3, modificación de la región E4 e inserción del antígeno modelo eGFP en el locus E1. La E. coli que contiene el BAC es un organismo genéticamente modificado de clase I.

El BAC se propaga dentro de las bacterias durante la replicación y puede mantenerse mediante selección con cloranfenicol. La cepa de E. coli SW102, que contiene los cromosomas artificiales bacterianos en los que se clonan los genomas, puede propagarse en caldo Luria-Bertani o agar que contiene cloranfenicol 12,5 |ig/ml a 32°C. El genoma puede modificarse mediante ingeniería genética en E. coli según métodos convencionales, tal como se describe en la memoria descriptiva, por ejemplo, para insertar un antígeno recombinante alternativo en lugar de eGFP.

Se depositó ChAdOx2 en un BAC que contenía la cepa de E. coli Stellar por parte de Isis Innovation Limited el 13 de junio de 2016 en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), en las Colecciones de Cultivo de la Agencia de Protección de la Salud, Agencia de Protección de la Salud, Porton Down, Salisbury SP40JG, Reino Unido bajo el Tratado de Budapest y designada con el n.° de registro provisional 16061301. El BAC depositado comprende además un transgén que codifica para el antígeno eGFP. En este aspecto de la presente invención, la secuencia de polinucleótido para ChAdOx2 preferiblemente no incluye la secuencia que codifica para el antígeno eGFP.

Una realización adicional de la presente invención proporciona una célula huésped transducida con el vector viral según el primer aspecto de la presente invención, en la que dicha célula huésped es preferiblemente una bacteria, más preferiblemente la cepa de E. coli Stellar que contiene un cromosoma artificial bacteriano (BAC) que contiene el genoma clonado de ChAdOx2 depositado por parte de Isis Innovation Limited el 13 de junio de 2016 en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), en las Colecciones de Cultivo de la Agencia de Protección de la Salud, Agencia de Protección de la Salud, Porton Down, Salisbury SP40JG, Reino Unido bajo el Tratado de Budapest y designada con el n.° de registro provisional 16061301. El BAC depositado comprende además un transgén que codifica para el antígeno eGFP. En este aspecto de la presente invención, la secuencia de polinucleótido para ChAdOx2 preferiblemente no incluye la secuencia que codifica para el antígeno eGFP. Una célula huésped de este tipo puede usarse para la propagación de BAC.

Una realización específica según el séptimo aspecto de la presente invención proporciona un clon de cromosoma artificial bacteriano (BAC) que comprende la secuencia de polinucleótido según el cuarto aspecto de la presente invención, en el que dicho BAC es el BAC que contiene el genoma clonado de ChAdOx2 depositado en la cepa de E. coli Stellar por parte de Isis Innovation Limited el 13 de junio de 2016 en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), en las Colecciones de Cultivo de la Agencia de Protección de la Salud, Agencia de Protección de la Salud, Porton Down, Salisbury SP40JG, Reino Unido bajo el Tratado de Budapest y designada con el n.° de registro provisional 16061301. El BAC depositado comprende además un transgén que codifica para el antígeno eGFP. En este aspecto de la presente invención, la secuencia de polinucleótido para ChAdOx2 preferiblemente no incluye la secuencia que codifica para el antígeno eGFP.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un kit que comprende un vector adenoviral según el primer aspecto de la invención o una composición inmunogénica según el segundo aspecto de la invención junto con instrucciones para su uso.

El kit puede incluir equipos médicos para administrar el vector adenoviral o la composición inmunogénica a un sujeto, tal como una jeringa. El kit puede comprender instrucciones para administrar el vector adenoviral o la composición inmunogénica a un sujeto y puede incluir instrucciones de dosificación específicas. El kit puede ser útil para vacunar a un sujeto contra una enfermedad induciendo o potenciando una respuesta inmunitaria, o para tratar o prevenir de otro modo una enfermedad en un sujeto.

Para evitar dudas, por el presente documento se establece expresamente que las características descritas en el presente documento como “preferidas”, “preferibles”, “alternativas” o similares pueden estar presentes en la invención solas o en cualquier combinación con una cualquiera o más de otras características así descritas (a menos que el contexto dicte lo contrario), y esto constituye una divulgación explícita de tales combinaciones de características.

Todas las características de cada realización descritas anteriormente se aplican, haciendo los cambios necesarios, a las demás realizaciones de la presente invención.

Ahora se describirá adicionalmente la invención con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1

Diseño y desarrollo de vector de vacuna de adenovirus de simio (sAd)

Las consideraciones clave en el diseño de vectores de sAd para su uso como vacunas son similares a las de AdHu5. El vector de vacuna debe ser no replicante y, a diferencia de los vectores de adenovirus para terapia génica, tener una actividad inmunomoduladora insignificante. Por tanto, los vectores de sAd carecen de la región E1 que codifica para proteínas transactivadoras virales que son esenciales para el crecimiento del virus y de la región E3 que codifica para proteínas inmunomoduladoras.

El advenimiento de los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) junto con la tecnología de recombinación de Red del bacteriófago X (ingeniería de recombinación) ha facilitado la manipulación de genomas de virus grandes. Usando este enfoque, se han clonado genomas de adenovirus de ADN lineal aislados de primates no humanos para su uso como vectores virales.

La primera etapa, tras el aislamiento del virus y la secuenciación del genoma, es o bien la amplificación o bien la síntesis artificial de dos productos homólogos al miembro izquierdo del genoma, que flanquea la región E1, y un producto, de aproximadamente 1000 pb, homólogo al miembro derecho del genoma, cada uno incorporando un único sitio de enzima de restricción para la clonación y la escisión del genoma para la producción del vector.

Estos fragmentos se ensamblan y se insertan en un BAC mediante clonación de enzimas de restricción convencional. Después se inserta el genoma del virus en el clon de BAC mediante recombinación homóloga de reparación de huecos en una sola etapa para generar un clon molecular de vector viral con E1 delecionada (figura 1a).

Después se usa el sistema de recombinación de Red del bacteriófago X (ingeniería de recombinación) para permitir una deleción perfecta de los genes inmunomoduladores de E3 del adenovirus. En primer lugar, se amplifica el gen bacteriano galactocinasa (GaIK) a partir del plásmido, pGalK, de tal manera que contiene miembros de homología de ~50 pb que flanquean la región E3, se inserta este gen en el locus E3 del genoma del adenovirus rescatado por BAC mediante recombinación de A Red. Se examinan los clones para determinar su crecimiento en galactosa, ya que este fenotipo se atribuye al producto del gen GalK. Después se retira el gen GalK mediante recombinación de A Red con un producto de PCR compuesto únicamente por la región flanqueante izquierda y derecha de E3 (figura 1b).

Se seleccionan clones positivos en un medio de 2-desoxigalactosa que impide el crecimiento de bacterias que expresan el gen GalK. La posterior manipulación usando recombinación de A Red en primer lugar para insertar el gen GalK y después intercambiarlo por un casete de expresión de antígenos en el locus E1 completa la modificación por ingeniería del vector de vacuna (figura 1c).

El genoma del virus lineal se escinde del BAC usando enzimas de restricción únicas, habitualmente Pacl o Pmel, y se transfecta en células complementarias para generar el vector viral. El casete de antígenos consiste normalmente en un promotor fuerte, tal como el promotor temprano inmediato del CMV mínimo para dirigir la expresión de antígenos, el antígeno de interés y una señal de poliadenilación.

Los inventores han generado una caja de herramientas molecular que permite la inserción de cualquier gen fácilmente en una región establecida dentro del genoma de ChAd insertando casetes universales que expresan un gen resistente a antibióticos bacterianos flanqueado por secuencias de recombinación específicas, tales como attR1 y attR2, derivadas del bacteriófago X (cabe destacar que este sistema se basa en el sistema de clonación Gateway de Invitrogen), en los presentes vectores de vacuna derivados de ChAd en el locus E1 y/o el locus E3. Los plásmidos lanzadera que contienen un casete de expresión de antígenos flanqueados por sitios de recombinación específicos emparejados con aquellos presentes en el genoma (por ejemplo, la secuencia de recombinación attR1/R2 requiere la secuencia de recombinación attL1/L2) permiten la recombinación específica del sitio en presencia de una mezcla de enzimas que contiene la integrasa del bacteriófago X, el factor de integración del huésped y escisionasa (figura 2).

Aunque la región E1 delecionada de sAd se complementa por proteínas de E1 del AdHu5 expresadas de manera constitutiva por células PerC.6 o células 293 de riñón embrionario humano (HEK), las producciones virales varían dependiendo del serotipo del sAd. Pueden obtenerse altas producciones de Pan5, Pan6 y Pan7, todos derivados de chimpancés, a partir de células HEK293, mientras que las producciones de ChAd1 son escasas. Para los vectores virales con escasa replicación, se ha demostrado que la manipulación adicional del genoma aumenta las producciones. En el caso de AdHu5, los productos génicos de E4, en particular aquellos de orf3, orf4, orf6 y orf6/7, coordinan su función con las proteínas de E1 (E1A y E1B-55K) y con los cofactores de la célula huésped para unirse, regular y desreprimir varias funciones celulares durante la multiplicación viral. Por tanto, la manipulación de la región E4 puede ser un medio prometedor para aumentar las producciones de virus.

En la publicación de patente WO2012/172277, los presentes inventores describieron la generación de un vector de vacuna quimérico, ChAdOx1, derivado del serotipo Y25 de ChAd modificado por ingeniería mediante recombinación de A Red para intercambiar los genes orf4, orf6 y orf6/7 de E4 nativos por los del AdHu5. Este vector mostró un aumento de la producción de proteínas del hexón a partir de células HEK293 en comparación con el virus ChAd original. Usando este enfoque, los inventores han generado ahora un novedoso vector de adenovirus según la presente invención, ChAdOx2, un vector de vacuna con E1/E3 delecionada derivado de ChAd68 (también denominado Pan6 y sAd25) que contiene los orf1, orf2 y orf3 de E4 del Y25 y los orf4, orf6 y orf6/7 de E4 del AdHu5 para aumentar las producciones de virus en células HEK293 (figura 3).

Modificación por ingeniería del vector de sAd para mejorar la inmunogenicidad

Los vectores de vacuna de adenovirus, independientemente del origen parental, pueden inducir respuestas inmunitarias humorales, de la mucosa y celulares, dependiendo de la vía de administración. Sin embargo, aunque las respuestas de las células T y B provocadas son buenas para la mayoría de los vectores, el nivel de potencia inmunológica puede diferir dependiendo de la cepa/serotipo del vector de adenovirus parental1011. Por ejemplo, cuando se compararon los dos vectores de simio, ChAdOx1 (derivado de Y25 y dado a conocer en el documento WO2012/172277) y ChAdOx2 (derivado de C68, según la presente invención), que portaban ambos un casete de expresión de GFP en el locus E1, la respuesta de las células T provocó que GFP fuera significativamente mayor para ChAdOx2 (figura 4).

Ejemplo 2: resultados del ensayo clínico de fase I de la vacuna experimental de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP), ChAdOx2 HAV

Se inició un ensayo clínico de fase I para determinar la seguridad y la inmunogenicidad de la vacuna experimental de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP), ChAdOx2 HAV, en voluntarios adultos sanos. La vacuna contiene antígenos de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP), que es el agente causante de la enfermedad de Johne en ganado bovino y se ha relacionado con la enfermedad de Crohn en seres humanos.

Se seleccionaron 20 voluntarios. 13 de ellos se consideraron elegibles para participar en el estudio. 1 voluntario retiró su consentimiento antes del reclutamiento. 9 participantes recibieron su dosis única de ChAdOx2 HAV. La figura 5 muestra los grupos de estudio (tabla 1) y el progreso actual de reclutamiento (tabla 2, visitas de seguimiento completadas sombreadas).

Las figuras 6 a 11 muestran las proporciones de voluntarios que presentaron acontecimientos adversos (AA) en los diferentes grupos de dosis. Tal como puede observarse a partir de estas figuras, la vacuna es segura y se tolera bien. No ha habido ningún AA grave o serio relacionado con ChAdOx2 HAV. La figura 6 muestra la proporción de voluntarios que presentaron AA locales después de una dosis única de ChAdOx2 HAV (5 x 109 pv). La figura 7 muestra la proporción de voluntarios que presentaron AA sistémicos después de una dosis única de ChAdOx2 HAV (5 x 109 pv). La figura 8 muestra la proporción de voluntarios que presentaron AA locales después de una dosis única de ChAdOx2 HAV (2,5 x 1010 pv). La figura 9 muestra la proporción de voluntarios que presentaron AA sistémicos después de una dosis única de ChAdOx2 HAV (2,5 x 1010 pv). La figura 10 muestra la proporción de voluntarios que presentaron AA locales después de una dosis única de ChAdOx2 HAV (5 x 1010 pv). La figura 11 muestra la proporción de voluntarios que presentaron AA sistémicos después de una dosis única de ChAdOx2 HAV (5 x 1010 pv).

Se evaluaron las respuestas a la vacunación con ChAdOx2 HAV en seres humanos usando el ensayo ELISPOT con interferón-gamma usando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién aisladas estimuladas con conjuntos de péptidos que abarcan el constructo de vacuna de HAV. Los ensayos se realizaron antes de la vacunación (día 0) y uno y dos meses posteriores a la vacunación (días 28 y 56).

Las respuestas a los antígenos de HAV antes de la vacunación fueron bajas, con una mediana de respuesta de 104 células formadoras de manchas (SFC) por millón de PBMC, que aumentaron hasta una mediana de 331 SFC el día 28 tomando un promedio entre todos los grupos de dosis (figura 12). Las respuestas fueron mayores el día 28 en los participantes inmunizados con 2,5x1010 pv que con 5x109 pv (p<0,05, prueba de Kruskall-Wallis con prueba de comparaciones múltiples de Dunn). Las respuestas individuales están tabuladas, véase la figura 13.

Ejemplo 3: respuestas de anticuerpos en ratones vacunados con ChAdOx2-RabGP

Se amplificó por PCR la secuencia codificante de la glicoproteína del virus de la rabia (RabGP; cepa ERA; número de registro de GenBank AJ489620.1) a partir de un plásmido proporcionado amablemente por Hildegund Ertl (Wistar Institute), usando cebadores que flanquean los sitios de enzimas de restricción Acc65l y Notl. Después de la digestión con estas enzimas, se clonó el fragmento en un plásmido pENTR4 digerido de manera similar que proporciona el promotor temprano inmediato principal del citomegalovirus humano (IE CMV) que incluye el intrón A y flanqueado por casetes de recombinación Gateway@. Se usó clonación por recombinación con Gateway LR (Life Technologies) para transferir el casete del transgén al vector de destino ChAdOx2 en el sitio homólogo a E1 para producir pBAC ChAdOx2 LPTOS RabGP ERA.

Tras la linealización enzimática del plásmido de destino ChAdOx2-RabGP y la transfección en células HEK293A (Invitrogen, n.° de cat. R705-07), se purificaron los virus resultantes mediante ultracentrifugación por gradiente de CsCI. Se determinaron los títulos en células HEK293A usando el kit de inmunotinción de anticuerpos anti-hexón basándose en el kit de inmunoensayo de títulos de adenovirus QuickTiter™ (Cell Biolabs Inc).

En la figura 14 se muestra la estructura del vector de destino.

Se diluyó la vacuna en PBS antes de la administración y, en algunos casos, se mezcló con escualeno como adyuvante de aceite en agua (Addavax, Sigma). Se inmunizaron ratones no consanguíneos CD1 hembra de 6 semanas de edad con las siguientes formulaciones (n=6 ratones/grupo), todas ellas administradas por vía intramuscular en cada músculo gemelo.

A: ChAdOx2-RabGP, 1e8 unidades de infectividad (UI)

B: ChAdOx2-RabGP, 1e7 UI

C: ChAdOx2-RabGP, 1e6 UI

D: ChAdOx2-RabGP, con Addavax, 1e8 UI

E: ChAdOx2-RabGP, con Addavax, 1e7 UI

F: ChAdOx2-RabGP, con Addavax, 1e6 UI

Se recogió suero 28 días después de la inmunización y se evaluaron los títulos de anticuerpo mediante ELISA contra una glicoproteína de la rabia recombinante (cepa SAD B19, que carece del dominio transmembrana, con una etiqueta C en el extremo C-terminal y purificada usando una resina de afinidad de etiqueta C [ThermoFisher]). Los resultados se expresaron en unidades arbitrarias, en relación con una serie de diluciones / curva de calibración de una muestra de control positivo, y se transformaron a log10 antes del análisis.

La vacuna indujo un anticuerpo detectable mediante ELISA contra la glicoproteína de la rabia, con potenciaciones estadísticamente significativas del título de anticuerpo asociado con el aumento de la dosis de la vacuna y con la formulación conjunta con Addavax. La figura 15 muestra las respuestas de anticuerpos en ratones vacunados con ChAdOx2-RabGP en un intervalo de dosis, con y sin adyuvante (grupos A-F). p=0,004 para el efecto de la dosis y p=0,03 para el efecto de la formulación conjunta con adyuvante en el ANOVA de dos vías de los grupos A-F.

Se realizó una comparación de la inmunogenicidad del constructo de vacuna ChAdOx2 con un constructo de vacuna AdC68 que tenía el mismo inserto de antígeno. El AdC68 fue un amable obsequio de Hildegund Ertl, Wistar Institute, tal como se da a conocer en Xiang et al., Novel, Chimpanzee Serotype 68-based Adenoviral Vaccine Carrier for Induction of Antibodies to a Transgene Product, Journal of Virology, 76 (6), págs. 2667-2675. Sorprendentemente, se halló que el constructo de vacuna ChAdOx2 tenía una inmunogenicidad mayor que la vacuna de AdC68, tal como se muestra en la figura 16.

Bibliografía

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11. Quinn, K.M., et al. J Immunol, 2013. 190(6): págs. 2720-35.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Vector adenoviral que comprende el genoma del adenovirus de chimpancé C68, en el que el genoma del adenovirus se ha modificado de tal manera que el vector carece del locus E4 nativo del adenovirus C68 y comprende las regiones codificantes E4Orf4, E40rf6 y E40rf6/7 heterólogas del AdHu5 en el locus E4 del adenovirus C68 y en el que el vector adenoviral comprende además las regiones codificantes E40rf1, E40rf2 y E40rf3 heterólogas del AdY25, en el que el vector adenoviral carece de un locus E1 funcional y en el que el vector adenoviral carece de un locus E3.

2. Vector adenoviral según la reivindicación 1, que comprende además una secuencia de nucleótidos exógena de interés que codifica para una proteína o un polipéptido, y

opcionalmente, en el que dicha secuencia de nucleótidos exógena de interés es un miARN o una secuencia de ARN inmunoestimuladora; y, preferiblemente, en el que dicha proteína o dicho polipéptido se selecciona del grupo que comprende un antígeno, un adyuvante molecular, una proteína inmunoestimuladora o una recombinasa; y, opcionalmente, en el que el antígeno es un antígeno derivado de patógenos y, preferiblemente, en el que el patógeno se selecciona del grupo que consiste en M. tuberculosis, Plasmodium sp, virus de la gripe, VIH, virus de la hepatitis C, citomegalovirus, virus del papiloma humano, virus de la rabia, virus del sarampión, parotiditis, rubéola, virus de Zika, parásitos de la leishmaniosis o Mycobacterium sp. y, más preferiblemente, en el que dicha Mycobacterium sp. es Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP); y, además, opcionalmente, cuando el patógeno es el virus de la rabia, el antígeno es una glicoproteína del virus de la rabia.

3. Composición inmunogénica que comprende el vector de adenovirus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y, opcionalmente, uno o más principios activos adicionales, un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

4. Composición inmunogénica según la reivindicación 3, para su uso en medicina, preferiblemente, en la que la composición inmunogénica es para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que comprende tuberculosis y otras infecciones micobacterianas, incluyendo enfermedad de Johne, enfermedad de Crohn, malaria, gripe, VIH/SIDA, infección por virus de la hepatitis C, infección por citomegalovirus, infección por virus del papiloma humano, infección adenoviral, leishmaniosis, infección por Streptococcus spp., infección por Staphylococcus spp., infección por Meningococcus spp., glosopeda, infección por virus Chikungunya, infección por virus de Zika, rabia, fiebre hemorrágica de Crimea y el Congo, infección por el virus del Ébola, virus de Marburgo, fiebre de Lassa, enfermedades por coronavirus del MERS y del SARS, fiebre de Nipah y del Gran Valle del Rift y Chikungunya.

5. Composición inmunogénica para su uso según la reivindicación 4, en la que dicho uso comprende:

i) administrar un transgén a una célula huésped;

ii) provocar una respuesta inmunitaria en un animal;

iii) potenciar una respuesta inmunitaria en un animal;

iv) tratar o prevenir al menos una enfermedad;

v) inducir una respuesta inmunitaria en un animal que romperá la tolerancia a un autoantígeno; y/o vi) terapia génica.

6. Secuencia de polinucleótido que codifica para el vector adenoviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

7. Célula huésped transducida con el vector adenoviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

8. Método para producir el vector adenoviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, 15 que comprende la etapa de incorporar el polinucleótido según la reivindicación 6 en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) para producir un vector Ad-BAC.

9. Clon de cromosoma artificial bacteriano (BAC) que comprende la secuencia de polinucleótido según la reivindicación 6. 20

10. Línea celular de encapsidación que comprende y produce el vector viral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y, opcionalmente, en la que dicha célula comprende el complemento de cualquier gen funcionalmente delecionado en el vector viral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

11. Kit que comprende: (i) un vector adenoviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o una composición inmunogénica según la reivindicación 3 y (ii) instrucciones para su uso.