KR20190020131A - 아데노바이러스 벡터 - Google Patents

아데노바이러스 벡터 Download PDF

Info

Publication number
KR20190020131A
KR20190020131A KR1020197002318A KR20197002318A KR20190020131A KR 20190020131 A KR20190020131 A KR 20190020131A KR 1020197002318 A KR1020197002318 A KR 1020197002318A KR 20197002318 A KR20197002318 A KR 20197002318A KR 20190020131 A KR20190020131 A KR 20190020131A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
vector
virus
adenovirus
antigen
sequence
Prior art date
Application number
KR1020197002318A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102205908B1 (ko
Inventor
사라 씨 길버트
아드리안 브이에스 힐
매튜 쥐 코팅햄
매튜 딕스
수잔 제이 모리스
알렉산더 더글라스
Original Assignee
옥스포드 유니버시티 이노베이션 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 옥스포드 유니버시티 이노베이션 리미티드 filed Critical 옥스포드 유니버시티 이노베이션 리미티드
Publication of KR20190020131A publication Critical patent/KR20190020131A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102205908B1 publication Critical patent/KR102205908B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/235—Adenoviridae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C12N15/8613—Chimaeric vector systems comprising heterologous sequences for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10044—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y02A50/383—
    • Y02A50/392—
    • Y02A50/397—
    • Y02A50/41—
    • Y02A50/412—

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 재조합 아데노바이러스 벡터, 이의 면역원성 조성물 및 이들의 의약에서의 용도를 제공한다. 특히, 본 발명은 AdHu5와 AdY25 외의 아데노바이러스의 게놈을 포함한 아데노바이러스 벡터로서, 상기 벡터가 아데노바이러스의 고유의(native) E4 좌위를 결핍하고 AdY25로부터의 비상동성 E4Orf1, E4Orf2 및 E4Orf3 암호화 영역을 포함하도록 상기 아데노바이러스의 유전체가 변형된 것인, 아데노바이러스 벡터를 제공한다.

Description

아데노바이러스 벡터
본 발명은 신규한 아데노바이러스 벡터, 이의 면역원성 조성물 및 이들의 의약에서의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 출판물, 특허 및 특허 출원은 이들의 전체 기재 내용이 참고로 본원에 포함된다.
전통적으로, 백신은 완전히 불활성화되거나 약독화된(attenuated) 병원체에 기초했다. 그러나, 말라리아와 같은 많은 감염성 질병의 경우, 이 접근법은 비실용적(impractical)이고, 연구의 초점은 보호의 면역 상관관계(immune correlates of protection)를 유도하는 병원체 유래의 항원만 발현하는 '서브유닛 백신(subunit vaccines)'의 발달로 변화되었다.
서브유닛 백신은 완전한 감염성 유기체의 도입 없이 면역계로 항원을 제시한다. 이러한 방법 중 하나는, 감염성 유기체로부터 특이적인 분리된 단백질의 투여를 수반한다. 그러나, 이 기법은 대개 약한 면역 반응만을 유도하고, 분리된 단백질은 이의 정상적인 상황에서 단백질과 상이한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 이는 감염성 유기체를 인식할 수 없는 항체의 생성을 야기한다.
그러므로, 항원의 전달을 위한 바이러스 벡터를 활용한 대안적인 방법이 발달해왔다. 바이러스는 절대적인 세포내 기생체(obligate intracellular parasite)로, 이들의 DNA를 숙주세포 내로 형질 주입하고, 이 숙주세포가 바이러스 게놈을 발현하도록 유도함으로써 복제한다. 이 생식전략은 하나 이상의 비상동성 전이 유전자를 지니는 재조합, 비-복제의 바이러스 벡터를 만듦으로써 벡터 백신(vectored vaccine)을 만드는데 활용되었다. 재조합 바이러스 게놈의 숙주세포 내로 형질주입 또는 형질도입은 숙주세포에서 비상동성 전이 유전자의 발현을 야기한다. 비상동성 전이 유전자가 항원을 암호화하는 경우, 예를 들어, 숙주세포 내에서 항원의 발현은 숙주 면역계에 의한 예방적이거나 치료학적인 면역 반응을 유발할 수 있다. 이와 같이, 바이러스 벡터는 효과적인 백신으로서 기능할 수 있다. 대안적으로, 비상동성 전이 유전자는 유전자의 기능성 대립유전자를 암호화할 수 있고, 이의 발현은, 유전자 치료로서 공지된 과정에서, 유전자의 유해한 돌연변이 대립유전자의 효과에 대응하는데 이용될 수 있다.
바이러스 벡터로서 사용에 특히 적합한 것은 아데노바이러스이다. 아데노바이러스는 비-외피 바이러스(non-enveloped virus)로, 지름이 약 90-100nm이고, 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)와 선형 이중 가닥 DNA(linear double stranded DNA) 게놈을 포함한다. 바이러스 뉴클레오캡시드는 펜톤 캡소머(penton capsomer)와 헥손 캡소머(hexon capsomer)를 포함한다. 고유한 섬유(fibre)는 각 펜톤 염기와 관련 있고 숙주세포의 표면상에서 콕삭키-아데노바이러스 수용체(Coxsackie-adenovirus receptor)를 통한 숙주세포로의 바이러스의 부착에 도움이 된다. 아데노바이러스의 50이 넘는 혈청형 균주(serotype strain)가 확인되었고, 이중 대부분은 인간에서 기도 감염(respiratory tract infection), 결막염(conjunctivitis) 및 위장염(gastroentiritus)을 일으킨다. 아데노바이러스는 숙주 게놈 내로 통합되기 보다는, 보통 숙주세포의 핵에서 에피솜 인자(episomal element)로서 복제한다. 아데노바이러스의 게놈은 주로 조절 기능을 가지며 바이러스 복제를 위한 숙주세포를 준비하는 4개의 초기 전사 단위 (early transcriptional unit) (E1, E2, E3 및 E4)를 포함한다. 게놈은 단일 프로모터의 제어하에 있는 펜톤 (L2), 헥손 (L3), 스캐폴딩 단백질(scaffolding protein) (L4) 및 섬유 단백질 (L5)를 비롯한 구조적 단백질을 암호화하는 5개의 후기 전사 단위(late transcriptional unit) (L1, L2, L3, L4 및 L5)도 포함한다. 게놈의 각 맨 말단부(extremity)는 바이러스 복제에 필요한 역위 말단 반복(Inverted Terminal Repeat, ITR)을 포함한다.
본래, 재조합 아데노바이러스는 유전자 치료를 위해 개발되었으나, 이러한 유전자 전달 항원으로부터 유발된 강하고 지속적인 전이 유전자-특이적 면역 반응이 백신 담체(vaccine carrier)로서의 이들의 용도를 촉진하였다. 고면역원성(highly immunogenic)인 것 외에도, 아데노바이러스는 임상적인 백신 발달을 위한 많은 다른 이점을 제공한다. 아데노바이러스 게놈은 상대적으로 작고 (26 내지 45 kbp 사이), 잘 특성화되며 조작이 용이하다. 단일 전사 단위, E1의 결실은 바이러스를 이의 예측 가능성(predictability)을 증가시키고 임상적 적용에서 부작용을 감소시키는 복제-무능(replication-incompetent) 상태로 만든다. 서브유닛 설계의 유연성을 허용하는, 8kb까지의 일부 경우에서, 재조합 아데노바이러스는 상대적으로 큰 전이 유전자를 수용할 수 있고, 매우 다양한 세포와 조직으로 전이 유전자 전달을 용이하게 한 상대적으로 넓은 친화성(tropism)을 가진다. 임상적 적용에 있어서 중요하게, 높은 역가에 대한 재조합 아데노바이러스의 스케일드-업 생산 및 정제를 위한 방법이 잘 규명된다. 이제까지는, 하위그룹(subgroup) C 혈청형 AdHu2 또는 AdHu5가 벡터로 대부분 사용되어왔다.
그러나, 고무적인 전-임상 데이터 1 에도 불구하고, 원형의(archetypal) 인간 아데노바이러스 AdHu5에 기초한 1세대 백신 벡터는 임상 시험에서 불충분한 효능을 나타냈다. 자연적인 감염의 결과로서, 인간 성인의 대부분이 AdHu2 및 AdHu5와 같은 통상적인 인간 혈청형에 대한 중화 항체(neutralising antibody)의 현저한 역가를 숨기는 것이 그 뒤에 발견되었다. 중화 항체는 숙주세포 내로 바이러스의 진입을 차단함으로써 바이러스 벡터 백신의 효능을 감소시킬 수 있고, 때문에 표적 전이 유전자의 전달을 감소시킬 수 있다.
이전에 존재하는 항-벡터 면역력의 발생은, 침팬지 기원의 2 ,3 아데노바이러스 벡터를 비롯한, 인간 집단이 노출된 가능성이 적은 혈청형에 기초한 새로운 아데노바이러스 벡터의 개발을 통해 다뤄진다. 그러나, 이러한 침팬지 아데노바이러스 벡터 중 일부는, 인간 집단에서 설명되지 않은 면역력을 이유로, 제한된 효능, 인간 아데노바이러스와의 다양한 수준의 교차-반응성(cross-reactivity), 및 형질 전환된 세포주의 차선의 성장을 가진다. 또한, 벡터에 대응한 중화 항체의 유도가 다른 증상을 위한 이의 재투여를 예방할 수 있음을 이유로, 상이한 질병에 대응한 면역력 획득에 사용 가능한 상이한 아데노바이러스 벡터의 범위를 갖는 것이 이롭다.
국제특허공보 WO 제2012/172277호는 침팬지 아데노바이러스 AdY25로부터 유래된 아데노바이러스 벡터를 기술하며, 이는 상기에 기술된 기술분야의 문제 중 일부를 다룬다. 이 벡터는 ChAdOx1로 명명된다.
그러나, 표적 전이 유전자를 효과적으로 전달하고, 아데노바이러스 혈청형에 대해 이미 존재하는 면역력의 효과를 최소화하며, 형질전환된 세포주에서 효율적으로 복제하는, 고면역원성의, 비-인간 아데노바이러스 벡터에 대한 기술분야의 필요성이 지속적으로 존재한다.
제1 측면에서, 본 발명은 AdHu5와 AdY25 외의 아데노바이러스의 게놈(genome)을 포함한 아데노바이러스 벡터로서, 상기 벡터가 아데노바이러스의 고유의(native) E4 좌위를 결핍하고 AdY25로부터의 비상동성 E4Orf1, E4Orf2 및 E4Orf3 암호화 영역을 포함하도록 상기 아데노바이러스의 게놈이 변형된 것인, 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
바람직한 양태에서, 상기 벡터는 상기 아데노바이러스의 E4 좌위 내 AdHu5로부터의 비상동성 E4Orf4, E4Orf6 및 E4Orf6/7 암호화 영역을 더 포함한다.
바람직한 양태에서, 상기 아데노바이러스는 C68이다.
바람직한 양태에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 기능성 E1 좌위 (functional E1 locus)를 결핍하고/하거나 E3 좌위를 결핍한다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 아데노바이러스 벡터를 포함하고, 임의로 하나 이상의 추가의 활성 성분, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 아쥬반트를 포함하는, 면역원성 조성물 (immunogenic composition)을 제공한다.
바람직하게는, 상기 아쥬반트는 수중유형 아쥬반트(oil-in-water adjuvant)이다. 예를 들어, 상기 아쥬반트는 스쿠알렌(squalene)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 아쥬반트는 MF59®, AS03, AF03 또는 애다백스(Addavax)로부터 선택된다.
제3 측면은, 의약에서 제1 측면에 따른 아데노바이러스 벡터 또는 제2 측면에 따른 면역원성 조성물의 사용을 제공한다. 특히, 상기 아데노바이러스 벡터 및 면역원성 조성물은 숙주세포로 전이 유전자(transgene)의 전달, 동물에서 면역 반응의 유발, 동물에서 면역 반응을 증대하는 것, 적어도 하나의 질병을 치료하거나 예방하는 것, 자가-항원 및 유전자 치료에 대한 내성(tolerance)을 파괴할 동물에서 면역 반응을 유도하는 것에 제공된다.
제4 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 아데노바이러스 벡터를 암호화한 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본 발명의 제5 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터로 형질 도입된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 제6 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 제4 측면에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 박테리아 인공 염색체(Bacterial Artificial Chromosome, BAC)로 혼입시켜(incorporating) 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제7 측면은 본 발명의 제4 측면에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론을 제공한다.
본 발명의 제8 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터를 생산하는 패키징 세포주(packaging cell line)를 제공한다.
본 발명은 하기의 도면에 관하여 기술된다:
도 1. 침팬지 아데노바이러스 68 ( ChAd68 )의 분자 클론의 생성. a) 갭 수선(gap repair)에 의한 ChAd68 게놈 DNA의 pBAC '레스큐 벡터(rescue vector)' 내로 삽입. E1 좌측 플랭킹 영역(LF1)과 좌측 플랭킹 영역2 (LF2) 및 말단 우측 영역(RF)은 ChAd68 게놈 DNA로부터 증폭되어 pBACe3.6로 클로닝되고 BAC 아데노바이러스 레스큐 클론(rescue clone)을 생산한다. 재조합은 분리된 ChAd68 게놈과 BAC 레스큐 클론의 LF1과 LF2 사이 및 ChAd68 게놈과 BAC 레스큐 클론의 RF에서 일어난다. 생성되는 생성물은 E1이 결실된 ChAd68 게놈을 함유한 BAC이다. b) 재조합 유전공학(recombineering)에 의한 ChAd68의 E3 영역의 절제. 먼저, 갈락토키나아제 유전자 (GalK)를 E3의 플랭킹 영역(E3LF 및 E3RF)에 상동인 서열을 함유한 프라이머를 이용하여 pGalK로부터 증폭한다. E3 영역을 GalK 유전자에 의해 λ 레드 재조합(λ red recombination)을 이용하여 대체한다. GalK 유전자를 E3LF와 E3RF로 구성된 PCR 생성물에 의해 λ 레드 재조합을 다시 이용하여 추후에 치환한다. 생성되는 생성물은 E1E3가 결실된 ChAd68 게놈을 함유하는 BAC이다. c) E1 좌위에서 항원 카세트(antigen cassette)의 삽입. 먼저, 갈락토키나아제 유전자 (GalK)를 E1의 플랭킹 영역 (LF1 및 LF2)에 상동인 서열을 함유한 프라이머를 이용하여 pGalK로부터 증폭한다. E1 영역을 GalK 유전자에 의해 λ 레드 재조합을 이용하여 대체한다. GalK 유전자를 LF1-항원 발현 카세트-LF2로 구성된 PCR 생성물에 의해 λ 레드 재조합을 이용하여 추후에 대체한다. 생성되는 생성물은 E1 좌위에서 항원 발현 카세트가 있는, E1E3 결실의 ChAd68 게놈을 함유한 BAC이다.
도 2. att 재조합 부위를 이용한 항원 발현 카세트의 아데노바이러스 벡터로의 삽입. 특이 재조합 서열, attR1과 attR2에 의해 플랭킹된 ccdB 자살 유전자(suicide gene)와 박테리아 항생제 저항성 유전자를 발현하는 공통 카세트(universal cassette)는 BAC-아데노바이러스 게놈 클론의 E1 좌위 및/또는 E3 좌위에 위치된다. 게놈 (attL1/L2)에 존재하는 이들과 쌍을 형성하는 특이 재조합 부위에 의해 플랭킹된 항원 발현 카세트를 함유한 셔틀 플라스미드(Shuttle plasmid)는 박테리오파지 λ 통합효소(integrase)를 함유한 효소 혼합물, 통합 숙주 인자(integration host factor) 및 절제효소(excisionase)의 존재 하에 부위 특이적인 재조합을 허용한다.
도 3. ChAd68와 비교한 ChAdOx2의 성장. E1 보충 인간 배아 신장 293 세포(E1 complementing Human embryonic kidney 293 cell)를 세포 당 1 바이러스 벡터의 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)로 감염시켰다. 시료를 감염 후에 48 내지 96시간에서 취했다. 바이러스 수득률(yield)을 감염 후에 48시간에 계수된 HEK293 세포와 GFP 양성 세포 상에서 3회의 역가 측정(titration)에 의해 결정하였다. 결과는 두 번의 별개의 실험으로부터 1 ml 당 평균 Log10 형광 단위 (fluorescent unit, FU)로서 도시된 표준편차(standard deviation)와 표현된다.
도 4. ChAdOx2 - eGFP와 비교한 ChAdOx1 - eGFP의 면역원성. 암컷 BALB/c 마우스(그룹 당 4마리)를 108 감염 단위(infectious unit)의 벡터로 근육내로 감염시켰고, 2주 후에 비장을 수확하여 GFP에 대한 반응을 인터페론-감마 효소-결합 면역 흡착 스팟(interferon-gamma enyzyme-linked immunosorbent spot, IFN-γ ELISPOT)에 의해 측정하였다. 결과는 100만 비장세포(splenocyte) 당 스팟-형성 단위(spot-forming unit, SFU)로 표현된다. 만-위트니 검정(Mann-Whitney test)을 이용하여 결과를 통계적으로 분석하였고 평균과 SEM(Mean with SEM)이 도시된다.
도 5. 건강한 성인 지원자에서 후보 미코박테리움 아비움 아종 파라튜버큘로시스 (MAP) 백신 ChAdOx2 HAV의 안전성과 면역원성을 결정하기 위한 I기 임상시험(phase I clinical trial)의 연구 그룹(표 1) 및 등록자의 동향(current progress of enrollment) (표 2).
도 6 내지 도 11. 건강한 성인 지원자에서 후보 미코박테리움 아비움 아종 파라튜버큘로시스 (MAP) 백신 ChAdOx2 HAV을 연구하는 I기 임상시험의 상이한 용량 그룹에서 부작용 (adverse event, AE)을 나타내는 지원자의 비율. 도 6 및 7의 경우 5 x 109 vp의 투여량 및 도 8, 9, 10 및 11의 경우 2.5 x 1010 vp의 투여량.
도 12. 투여량에 의해 계층화된 HAV 백신 내 항원의 모든 풀(pool)에 대한 중앙값이 합계된 반응(median summed response). * 2.5x1010 용량 그룹에 대한 던의 다중 비교 검정(Dunn's multiple comparison test)을 이용한 p=0.01 크루스칼-왈리스 검정(Kruskall-Wallis test). 라인은 중앙값을 나타낸다.
도 13은 상이한 투여량의 HAV 백신으로 면역화된 참가자의 0일, 28일 및 56일에서 각 개체에 대한 반응표(tabulatd response)를 나타낸다.
도 14는 ChAdOx2 RabGP 백신에 대한 목적 벡터의 구조를 나타낸다.
도 15는 애다백스(Addavax)가 있는 및 없는 상이한 투여량으로 면역화된 ChAdOx2 RabGP 백신 그룹에 걸친 이원 ANOVA(two-way ANOVA)를 나타낸다.
도 16은 ChAdOx2 RabGP 백신 제작물의 높은 면역원성을 나타낸다. 만-위트니 검정에 의한 ELISA 반응 [임의 항체 단위 (arbitrary antibody unit, AU)으로 측정된]을 p=0.005 비교. ChAdOx2-RabGP의 면역원성은 AdC68의 면역원성에 비해 낫다. CD-1 이종 교배된 마우스에 107 감염 단위의, 광견병 당단백질을 발현하는 ChAdOx2 또는 AdC68를 근육내로 백신을 접종하였다. 백신 접종 4주 후에 혈청을 수집하였다. 항체 반응을 재조합 광견병 당단백질에 대응한 ELISA에 의해 평가하였고, 이 결과는 그래프 A와 표 B에 나타내었다.
본 발명은 AdHu5와 AdY25 외의 아데노바이러스로부터 유래된 신규한 아데노바이러스 벡터, 이의 면역원성 조성물 및 이들의 의약에서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 AdHu5와 AdY25 외의 아데노바이러스의 게놈을 포함한 아데노바이러스 벡터로서, 벡터가 아데노바이러스의 고유의(native) E4 좌위를 결핍하고 AdY25로부터의 비상동성 E4Orf1, E4Orf2 및 E4Orf3 암호화 영역을 포함하도록 아데노바이러스의 게놈이 변형된 것인, 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
아데노바이러스 E4 영역은 적어도 6개의 오픈 리딩 프레임(Open Reading Frame, ORF 또는 Orf)를 포함한다. 바람직하게는, 아데노바이러스의 고유의 E4 좌위는 결실된 것이다.
바람직한 양태에서, 아데노바이러스는 침팬지 아데노바이러스, C68 (또한, C9, Pan6 및 sAd25로 공지됨)이다. C68의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 1로서 제공된다. 유인원 아데노바이러스 25(simian adenovirus 25) (즉, C68)의 완전한 게놈은 GenBank의 수탁 번호 AC_000011로 기탁 및 배정되었다.
본 발명에 따라서, 아데노바이러스의 게놈은 벡터가 아데노바이러스의 고유의 E4 좌위를 결핍하도록 변형되었다. C68의 E4 영역은 본 명세서에서 SEQ ID NO. 2로 제공된다.
더욱이, 본 발명에 따라서, 아데노바이러스의 게놈은 벡터가 AdY25부터의 비상동성 E4Orf1, E4Orf2, 및 E4Orf3 암호화 영역을 포함하도록 변형된다. AdY25는 국제특허공보 WO 제2012/172277호에 상세히 기술된 침팬지 아데노바이러스이다.
AdY25의 완전한 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 6에 제공된다.
AdY25로부터 E4Orf1의 아미노산 서열은 본 명세서에서 SEQ ID NO. 3으로 제공된다. 대응하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 6의 뉴클레오티드 35930 내지 36304이다.
AdY25로부터 E4Orf2의 아미노산 서열은 본 명세서에 SEQ ID NO. 4로 제공된다. 대응하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 6의 뉴클레오티드 35491 내지 35880이다.
AdY25로부터 E4Orf3의 아미노산 서열은 본 명세서에서 SEQ ID NO. 5로 제공된다. 대응하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 6의 뉴클레오티드 35141 내지 35494이다.
바람직한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 AdHu5로부터의 비상동성 E4Orf4, E4Orf6, 및 E4Orf6/7 암호화 영역을 더 포함한다.
AdHu5은 인간 혈청형 5 아데노바이러스이다. AdHu5로부터의 E4Orf4의 아미노산 서열은 본 명세서에서 SEQ ID NO. 7로 제공된다. AdHu5로부터의 E4Orf6의 아미노산 서열은 본 명세서에서 SEQ ID NO. 8로 제공된다. AdHu5로부터의 E4Orf6/7의 아미노산 서열은 본 명세서에서 SEQ ID NO. 9로 제공된다.
통상의 기술자가 알게 될 기술분야에서 아데노바이러스 C68에 기초한 아데노바이러스 벡터를 AdCh68, AdC68, ChAd68 및 sAdV25를 비롯한 다양한 바이러스 명칭에 의해 나타낼 수 있다 [예를 들어, Abbink et al., J Virol.　2015 Feb;89(3):1512-22 (PubMed ID: 25410856) 및 Jeyanathan et al., Mucosal Immunol.　2015 Nov;8(6):1373-87 (PubMed ID: 25872483)를 참고한다]. 이러한 명칭은 본 명세서에서 상호 호환적으로도 사용된다.
본 발명의 벡터는 바람직하게는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터 유래된 캡시드를 포함한다. 바람직하게는, 캡시드는 펜톤 단백질, 헥손 단백질, 섬유 단백질 및/또는 스캐폴딩 단백질을 비롯한 고유의 또는 야생형(wild-type)의 C68 캡시드 단백질을 포함한다. 그러나, 통상의 기술자는 약간의 변형이 캡시드 단백질에 벡터 친화성(vector tropism)을 불리하게 변화시키지 않고 만들어질 수 있음을 용이하게 이해할 것이다.
특히 바람직한 양태에서, 벡터 캡시드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 캡시드 단백질을 포함한다:
a) SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 18315 내지 21116에 대응하는 암호화 서열, 또는 실질적으로 이와 동일한 서열에 의해 암호화된 헥손 단백질(hexon protein);
(b) SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 13884 내지 15488에 대응하는 암호화 서열, 또는 실질적으로 이와 동일한 서열에 의해 암호화된 펜톤 단백질; 및
(c) SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 32134 내지 33411에 대응하는 암호화 서열, 또는 실질적으로 이와 동일한 서열에 의해 암호화된 섬유 단백질(fibre protein).
바람직하게는, 헥손 단백질은 SEQ ID NO. 18의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO. 18에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 펜톤 단백질은 SEQ ID NO. 19의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO. 19에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 섬유 단백질은 SEQ ID NO. 20의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO. 20에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는, 상기에 기술된 헥손, 펜톤 및 섬유 단백질 중 하나, 상기 단백질 중 2개의 임의의 배합, 또는 상기 단백질 중 3개 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 본 명서세에서 ChAdOx2로 나타낸다. ChAdOx2 벡터 [E1 좌위 내 게이트웨이™ 카세트(Gateway™ cassette)가 있는]의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 10에 나타난다.
통상의 기술자는 본 발명에 기술된 모든 핵산 서열의 상동체(homologue), 등가물(equivalent) 및 유도체(derivative)가 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐서 이들과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 핵산 분자도 망라한다.
통상의 기술자는 본 발명이 본 명세서에서 예시되는 이러한 특정 핵산 분자의 변이도 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 이들은, 예를 들어, 균주 변이로 인해 자연적으로 발생할 수 있다. 예를 들어, 첨가, 치환 및/또는 결실이 포함된다. 통상의 기술자는 본 명세서에 예시된 특정 핵산 분자로부터의 변이가 유전 암호(genetic code)의 퇴화(degeneracy)로 인해 가능해질 것임을 또한 이해할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 변이는 본 명세서에 기술된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐서 이들에 대한 실질적 동일성을 가진다.
본 명세서에서 사용되는 "실질적 동일성"을 갖는 핵산 서열은 바람직하게는 상기의 서열과 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4% 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9%의 동일성을 가진다. 바람직하게는, 용어 "실질적 동일성"은 상기 서열이 선행기술의 핵산 서열과의 동일성 보다 더 높은 정도로 본 명세서에 기술된 임의의 서열과 동일성을 갖는 것을 나타낸다.
상동성의 정도 또는 동일성의 정도를 결정하는 목적을 위해 핵산 서열들을 비교하는 경우, BESTFIT 및 GAP [모두 위스콘신 제네틱스 컴퓨터 그룹(Wisconsin Genetics Computer Group, GCG) 소프트웨어 패키지의 프로그램]과 같은 프로그램을 이용할 수 있다. BESTFIT는, 예를 들어, 두 서열을 비교하고 가장 유사한 부분의 최적의 정렬을 생성한다. GAP은 서열이 이들의 전체 서열을 따라 정렬되고, 두 서열 중 어느 하나에 공간을 적절하게 삽입하여 최적의 정렬을 찾는 것을 가능하게 한다. 적절하게는, 본 발명의 맥락에서, 핵산 서열의 동일성을 논의하는 경우, 비교는 이들의 전체 길이를 따라 서열의 정렬에 의해 만들어진다. 상기는 본 출원에 개시된 모든 핵산 서열에 대해 준용하여(mutatis mutandis ) 적용하였다.
"핵산"에 대한 본 명세서에서 언급은 cDNA, mRNA를 비롯한 RNA 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid, PNA) 또는 이의 혼합물을 포함한 DNA 일 수 있다.
단지 통상의 기술자의 편의를 위해, ChAdOx2-GFP를 함유하는 박테리아 인공 염색체 (BAC)를 함유하는 E. 콜라이 (E. coli ) 균주 스텔라(Stellar)의 시료를 Isis 이노베이션 리미티드(Isis Innovation Limited)에 의해 2016년 6월 13일에 영국, 솔즈베리 SP4 0JG, 포턴 다운, 헬스 프로텍션 에이전시, 헬스 프로텍션 에이전시 컬쳐 콜렉션(Health Protection Agency Culture Collections, Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, United Kingdom) 소재의 유럽 세포 배양물 콜렉션 (European Collection of Cell Cultures, ECACC)에 부다페스트 조약하에 수탁하였고 임시 수탁번호(provisional accession no) 16061301로 지정되었다.
BAC를 함유하는 E. 콜라이는 클래스 I의 유전적으로 변형된 유기체이다. E.콜라이 균주 스텔라의 유전자형은 다음과 같다:
F-, endA1 , supE44 , thi -1, recA1 , relA1 , gyrA96 , phoA , Φ80d lacZΔ M15, Δ ( lacZYA - argF ) U169, Δ ( mrr - hsdRMS - mcrBC ), ΔmcrA , λ-. 바이러스 DNA 중합효소의 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 침팬지 아데노바이러스 ChAd68이 인간 아데노바이러스 E 종 내에 일시적으로 분류된다.
BAC은 복제 동안에 박테리아 내에서 증식하고 클로람페니콜(chloramphenicol)을 이용한 선택에 의해 유지될 수 있다. BAC을 함유한 E. 콜라이 균주 스텔라-게놈이 내부로 클로닝되는-는 12.5μg/mL의 클로람페니콜을 함유하는 루리아-베르타니 배지(Luria-Bertani broth) 또는 루리아-베르타니 한천(Luria-Bertani agar)에서, 37°C에서 증식할 수 있다.
바이러스 게놈의 BAC 클론을 바이러스로 전환시키는 것 ("레스큐")은 하기의 단계에 의해 수행될 수 있다. E . 콜라이 숙주를 증식시키고 BAC DNA를 표준 방법에 따라 박테리아로부터 정제한다. DNA를 제한 내부핵산 가수분해 효소(restriction endonuclease) PacI로 선형화하고 HEK293 세포 (또는 유사한 E1 보충 세포주)로 형질주입한다. 생성되는 아데노바이러스를, 예를 들어, 백신으로 사용하기 위해 이어서 증식시킬 수 있고 정제할 수 있다. 이러한 시약 및 세포 모두는 공개적으로 입수 가능하다. 침전물이 회복(rescue)된 경우, 생성되는 바이러스는 클래스 I의 유전적으로 변형된 유기체가 될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 구절(phrase)인 “바이러스 벡터”는 재조합 DNA를 포함한 유전물질을 숙주세포 또는 숙주 유기체로 형질도입 또는 비증식성 감염(non-productive infection)에 의해 도입할 수 있는 재조합 바이러스 또는 이의 유도체를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 벡터는 유전자 전달 벡터, 백신 벡터, 안티센스 전달 벡터(antisense delivery vector) 또는 유전자 치료 벡터 일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 “C68”은 침팬지 아데노바이러스 68 또는 이로부터 유래된 서브유닛(subunit)을 의미하고, 용어 “ChAd68”는 이로부터 유래된 벡터 또는 이에 기초한 벡터를 의미한다.
약어를 이용하여 야생형 바이러스에 대해 만들어진 변형을 나타낸다. 예를 들어, “ΔE1” 또는 “delE1”은 E1 좌위의 결실 또는 기능적 결실을 나타낸다. 표현 “Ad5E4Orf6”는 바이러스 벡터가 Ad5 바이러스로부터 비상동성 E4 오픈 리딩 프레임 6를 포함하는 것을 나타낸다.
통상의 기술자는 본 발명이 본 명세서에서 예시된 특정 아미노산 서열의 변이를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 특히 바람직한 것은, 하나 이상의 아미노산 잔기가 임의의 조합으로 치환, 결실 또는 첨가된 모단백질(parent protein)의 아미노산 서열과 유사한 아미노산 서열을 갖는 변이이다. 특히 바람직한 것은 본 발명의 단백질의 특성 및 활성을 변화시키지 않는 침묵 치환, 첨가 및 결실이다. 다양한 아미노산이 유사한 특성을 가지며, 물질의 하나 이상의 이러한 아미노산은 보통 이 물질의 목적하는 활성의 제거없이 하나 이상의 다른 이러한 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 따라서, 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 보통 서로 간에 치환될 수 있다 (지방속 측쇄를 갖는 아미노산). 이러한 가능한 치환들 중에서, 글리신과 알라닌이 이용되어 서로 간에 치환되는 것(이들이 상대적으로 짧은 측쇄를 가지기 때문) 및 발린, 류신 및 이소류신이 이용되어 서로 간에 치환되는 것 (이들은 소수성인 큰 지방족 측쇄를 가지기 때문)이 바람직하다. 서로 흔히 치환될 수 있는 다른 아미노산은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 (방향족 측쇄를 갖는 아미노산); 리신, 아르기닌 및 히스티딘 (염기성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파르트산 및 글루탐산 (산성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파라긴 및 글루타민 (아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및 시스테인 및 메티오닌 (황을 함유하는 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함한다. 변이는 자연적으로 발생한 변이와 인공적인 변이를 포함한다. 인공적인 변이는 돌연변이 유발(mutagenesis) 기법을 이용하여 생성될 수 있으며, 이들은 핵산 분자, 세포 또는 유기체에 적용된 것을 포함한다. 바람직하게는, 변이는 본 명세서에서 예시된 아미노산 서열에 대해 실질적 동일성을 가진다.
본 명세서에서 사용되는 “실질적 동일성”을 갖는 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기의 서열과 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%,99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9%의 동일성을 가진다. 바람직하게는, 용어 "실질적 동일성"은 상기 서열이 선행기술의 아미노산 서열과의 동일성 보다 더 높은 정도로 본 명세서에 기술된 임의의 서열과 동일성을 갖는 것을 나타낸다.
CLUSTAL 프로그램과 같은 프로그램을 이용하여 아미노산 서열들을 비교할 수 있다. 이 프로그램은 아미노산 서열들을 비교하고 두 서열 중 어느 한 서열에 적절하게 공간을 삽입함으로써 최적의 정렬을 찾는다. 최적의 정렬을 위한 아미노산 동일성 또는 유사성 [아미노산 유형의 보존 (conservation) 플러스 동일성]를 계산하는 것이 가능하다. BLASTx와 같은 프로그램은 유사한 서열의 가장 긴 구간을 정렬하여 핏(fit)에 대한 값을 부여할 것이다. 따라서, 각각이 상이한 점수를 갖는 일부 유사 영역(region of similarity)이 발견된 비교를 획득하는 것이 가능하다. 상기는 본 출원에 개시된 모든 핵산 서열에 대해 준용하여(mutatis mutandis ) 적용하였다.
본 발명의 벡터는 바람직하게는 외인성 뉴클레오티드 서열도 포함한다. 바람직하게는, 외인성 뉴클레오티드 서열은 동물 세포 및 아데노바이러스 패키징 신호 서열(denoviral packaging signal sequence)에서 이의 번역, 전사 및/또는 발현을 지시하는 발현 제어 서열에 작동가능하게 (operably) 연결된다.
바람직하게는, 외인성 뉴클레오티드 서열은 관심있는 분자를 암호화한다. 관심있는 분자는 관심있는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산 분자일 수 있다. 외인성 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의, 둘 이상의 또는 셋 이상의 관심있는 분자를 암호화할 수 있다.
관심있는 단백질 및 폴리펩티드는 항원, 분자 아쥬반트, 면역자극성 단백질 및 재조합효소를 포함한다.
바람직하게는, 항원은 병원체 유래의 항원이다. 바람직하게는, 병원체는 M. 튜버큘로시스, 플라스모디움 sp, 인플루엔자 바이러스, HIV, C형 간염 바이러스, 거대세포 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염, 풍진, 지카 바이러스, 리슈만 기생충 및 임의의 미코박테리아 종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 항원은 플라스모디움으로부터 TRAP, MSP-1, AMA-1 및 CSP, 인플루엔자 바이러스 항원, 또는 미코박테리움 튜버큘로시스로부터 ESAT6, TB10.4 85A 및 85B 항원으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 항원은 미코박테리움 튜버큘로시스부터의 Ag85A일 수 있다. 항원은 인플루엔자 A 바이러스로부터의 뉴클레오단백질 (nucleoprotein, NP) 및/또는 기질 단백질 1 (matrix protein 1, M1)일 수 있다.
더욱 바람직하게는, 항원이 미코박테리움 아비움 아종 파라튜버큘로시스 (MAP)로부터 기인될 수 있거나, 항원이 광견병 바이러스 당단백질이다.
바람직하게는, 관심있는 단백질 또는 폴리펩티드는 항원이다. 양태에서, 항원은 병원체 유래의 항원이다. 바람직하게는, 병원체는 박테리아, 바이러스, 프리온, 곰팡이, 원생생물(protist) 및 연충(helminth)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 항원은 M. 튜버큘로시스, 플라스모디움 sp, 인플루엔자 바이러스, HIV, C형 간염 바이러스, 거대세포 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염, 풍진, 지카 바이러스, 말라리아 기생충, 리슈만 기생충 또는 임의의 미코박테리아 종으로 이루어진 군으로부터 유래된다. 바람직한 항원은 플라스모디움으로부터의 TRAP, MSP-1, AMA-1 및 CSP, 인플루엔자 바이러스 항원 및 미코박테리움 튜버큘로시스로부터의 ESAT6, TB10.4 85A 및 85B 항원을 포함한다. 특히 바람직한 항원은 미코박테리움 튜버큘로시스로부터의 Ag85A 및 인플루엔자 A 바이러스로부터의 뉴클레오단백질 (NP) 및 기질 단백질 1 (M1), 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스를 포함한다.
미코박테리움 튜버큘로시스 단백질 Ag85A의 핵산 서열은 SEQ ID NO. 11에 나타나고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 12에 나타난다. 인플루엔자 A 바이러스로부터의 뉴클레오단백질 (NP) 및 기질 단백질 1 (M1)의 핵산 서열은 SEQ ID NO. 13에 나타나고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 14에 나타난다.
바람직한 양태에서, 백신은 캐틀(cattle)에서 요네병에 대한 원인물질이며 인간에서 크론병에 연관된 미코박테리움 아비움 아종 파라튜버큘로시스 (MAP)로부터의 항원을 함유한다.
다른 바람직한 양태에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 광견병 바이러스 당단백질, 바람직하게는 ERA 균주를 암호화한다.
대안적인 양태에서, 항원은 자가-항원이다. 적합한 자가-항원은 면역계가 종양 세포와 다른 세포 유형 사이를 화인하도록 허용하는 종양 세포에 의해 발현된 항원을 포함한다. 적합한 자가-항원은 세포 유형 및/또는 이의 환경에 대해 부적합하거나, 유기체의 발달 동안에 [예, 태아 항원 항원(foetal antigen)] 정상적으로만 존재하는 항원을 포함한다. 예를 들어, GD2는, 면역계에 대한 이의 노출이 혈관-뇌 장벽에 의해 제한되는 신경 세포의 바깥 표면 막(outer surface membrane) 상에서 현저한 수준으로 정상적으로만 발현된다. 그러나, GD2는 소세포 폐암(small-cell lung cancer), 신경모세포종(neuroblastoma), 흑색종(melanoma) 및 골육종(osteosarcoma)를 비롯한 광범위한 종양 세포의 표면상에 발현된다. 다른 적합한 자가-항원은 종양 세포 상에서는 발견되나 건강한 세포 상에서는 드물거나 없는 세포-표면 수용체를 포함한다. 이러한 수용체는 종양 세포의 조절되지 않은 성장 및 분열을 야기하는 세포 신호전달 활성화의 원인일 수 있다. 예를 들어, ErbB2는 유방암 종양 세포의 표면 상에서 비정상적으로 높은 수준으로 생성된다. 바람직하게는, 자가 항원은 종양-관련 항원(tumour-associated antigen, TAA)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 '항원'은 항원으로부터의 하나 이상의 항원 결정기를 망라하고, 모항원(parent antigen), 및 이의 단편과 변이체를 포함한다. 이러한 단편과 변이체는 모항원과 동일한 생물학적 활성 또는 기능을 필수적으로 유지한다. 바람직하게는, 이들은 모항원의 항원성 및/또는 면역원성을 유지하거나 이를 향상시킨다. 일반적으로, "항원성-"은 단백질 또는 폴리펩티드가 항체 또는 T 세포를 발생시키는데 사용될 수 있거나 실제로 개체에서 항체 또는 T 세포 반응을 유도할 수 있는 것을 의미하는 것으로 받아들여진다. "면역원성의-"는 단백질 또는 폴리펩티드가 개체에서 강력한 면역 반응 및 바람직하게는 보호적인 면역 반응을 유발할 수 있는 것을 의미하는 것으로 받아들여진다. 따라서, 후자의 경우, 단백질 또는 폴리펩티드는 항체 반응 및 항체에 기초하지 않은 면역 반응을 생성하는 것이 가능할 수 있다.
바람직하게는, 항원의 단편은 모항원의 서열로부터 적어도 n개의 연속한 아미노산을 포함하며, n은 바람직하게는 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 57, 58, 59, 60, 70, 80, 90 또는 100 이거나, 이들보다 크다. 단편은 바람직하게는 모항체로부터의 하나 이상의 항원결정 영역(epitopic region)을 포함한다. 실제로, 단편은 모항체로부터의 항원 결정기를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 대안적으로는, 단편은 이러한 영역에 실질적으로 유사하여 이들의 항원적 특성/면역원성 특성을 유지할 수 있다.
본 발명의 항원은 모항원의 유도체, 유사체, 상동체 또는 기능적 등가물과 같은 변이체를 포함한다. 특히 바람직한 것은 항원의 아미노산 서열과 유사한 아미노산 서열-하나 이상의 아미노산 잔기가 임의의 조합으로 치환, 결실 또는 첨가된-을 갖는 유도체, 유사체, 상동체 또는 기능적 등가물이다. 바람직하게는, 이러한 변이체는 항원적 결정요인(antigenic determinant) 또는 항원 결정기를 모항원과 마찬가지로 유지한다.
바람직하게는, 유도체, 유사체, 상동체, 및 기능적 등가물은 모항원의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진다.
외인성 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 항원을 암호화할 수 있다. 바이러스 벡터는 항원 결정기 스트링(epitope string)으로서 하나 이상의 항원 유전자를 발현하도록 설계될 수 있다. 바람직하게는, 불필요한 핵산 및/또는 아미노산 물질이 회피되도록 서열을 간섭하지 않고 다중 항원 결정기(multiple epitope)의 스트링 내 항원 결정기가 함께 연결된다. 항원 결정기 스트링의 생성은 바람직하게는 항원 결정기 스트링의 아미노산 서열을 암호화하는, 동일 리딩 프레임에서 하나 이상의 항원 결정기를 암호화한 DNA가 있는, 재조합 DNA 제작물을 이용하여 달성된다. 예시적 항원, TIPeGFP는 하기의 항원 결정기를 비롯한 항원 결정기 스트링을 포함한다: E6FP, SIV-gag, PyCD4 및 Py3. 대안적으로는, 항원은 별개의 폴리펩티드로 발현될 수 있다.
하나 이상의 항원 또는 항원 유전자는 C-말단 및/또는 N-말단에서 절단될 수 있다(truncating). 이는 벡터 백신의 클로닝 및 제작을 용이하게 할 수 있고/있거나 항원의 면역원성 또는 항원성을 강화할 수 있다. 절단을 위한 방법은 통상의 기술자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 유전공학의 다양한 잘 공지된 기법을 이용하여 항원 유전자의 양 말단 중 어느 하나에서 암호화 핵산 서열을 선택적으로 결실한 다음, 목적하는 암호화 서열을 바이러스 벡터로 삽입할 수 있다. 예를 들어, 3' 및/또는 5' 외부핵산 가수분해효소(exonuclease) 전략을 이용하여 암호화 핵산의 3' 및/또는 5' 말단 각각을 선택적으로 침식하여 후보 단백질의 절단을 만든다. 바람직하게는, 발현된 항원이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 모항원과 관련된 아미노산에 의해 절단되도록 야생형 유전자 서열이 절단된다. 바람직하게는, 항원 유전자는 야생형 항원에 관련된 C-말단의 10 - 20 아미노산에 의해 절단된다. 더욱 바람직하게는, 항원 유전자는 야생형 항원에 관련된 C-말단의 13 - 18 아미노산에 의해 절단되고, 가장 바람직하게는, 15 아미노산에 의해 절단된다. 바람직하게는, Ag85A 항원은 이 방식으로 C-말단이 절단된다.
하나 이상의 항원 유전자는 선도 서열(leader sequence)도 포함할 수 있다. 선도 서열은 mRNA로의 1차 전사의 과정, 번역 효율, mRNA 안정성에 영향을 끼칠 수 있고, 항원의 발현 및/또는 면역원성을 강화할 수 있다. 바람직하게는, 선도 서열은 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator, tPA)이다. 바람직하게는, tPA 선도 서열은 하나 이상의 항원에 대한 N-말단에 위치한다.
tPA 선도 서열과 같은 선도 서열은 펩티드 링커(peptide linker)를 통해 항원의 서열에 연결될 수 있다. 펩티드 링커는 일반적으로, 길이가 2 내지 약 50인 아미노산이고, 융합 단백질의 도메인 접힘으로 간섭될 2차 구조를 형성하지 않는다면, 임의의 서열을 가질 수 있다.
하나 이상의 항원 유전자는 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP) 마커와 같은 마커를 포함하여 삽입된 유전자 서열의 발현된 생성물의 검출을 용이하게 할 수 있다.
하나 이상의 항원 유전자는 번역 후에 항원에 공유결합적으로(covalently) 결합된 태그 폴리펩티드를 암호화한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 태그 폴리펩티드는 PK 태그, FLAG 태그, MYC 태그, 폴리히스티딘 태그(polyhistidine tag) 또는 단일클론 항체에 의해 검출될 수 있는 임의의 태그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 태그 폴리펩티드를 암호화한 핵산 서열은, 번역 후에, 발현된 항원의 C-말단 또는 N-말단에 태그가 위치되도록 배치되거나, 발현된 항원의 내부에 있을 수 있다. 바람직하게는, 태그는 발현된 항원의 C-말단에 위치한다. 바람직한 양태에서, 하나 이상의 항원 유전자는 PK 태그를 암호화한다. 이 유형의 태그는 항원 발현의 검출 및 항원을 발현하는 클론을 용이하게 할 수 있고/있거나 항원의 면역원성 또는 항원성을 강화할 수 있다.
태그 폴리펩티드가 이용된 경우, 링커 서열을 암호화하는 뉴클레오티드는 바람직하게는 태그 폴리펩티드를 암호화한 핵산과 발현된 항원을 암호화한 핵산 사이에 삽입된다. 예시적 링커는 IPNPLLGLD (SEQ ID NO.15)이다.
대안적인 양태에서, 관심있는 외인성 서열은 단백질을 암호화하지 않을 수 있다. 예를 들어, 외인성 뉴클레오티드 서열은 miRNA 또는 면역자극성 RNA 서열 일 수 있다.
아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 외인성 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 1, 2 또는 3 이상의 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 각 외인성 뉴클레오티드 서열은 전이 유전자를 포괄한다. 전이 유전자를 포괄하는 외인성 뉴클레오티드 서열은 유전자 또는 유전자의 기능성 부분일 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 관심있는 단일 분자를 암호화한 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 관심있는 분자를 암호화한 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 외인성 뉴클레오티드 서열은 아데노바이러스의 게놈 내에, 즉, 다른 아데노바이러스 서열을 함유하는 핵산 분자에 위치한다. 외인성 뉴클레오티드 서열은 부분적으로 또는 전체적으로 결실된 유전자 부위로, 예를 들어, 아데노바이러스 게놈 내의 E1 결실 또는 E3 결실 부위로 삽입될 수 있다.
외인성 뉴클레오티드 서열은 존재하는 C68 유전자 영역으로 삽입되어 이 영역의 기능을 방해할 수 있다. 대안적으로, 외인성 뉴클레오티드 서열은 주변 유전자의 기능 또는 서열에 대한 변경이 없는 게놈의 영역으로 삽입될 수 있다.
외인성 뉴클레오티드 서열 또는 전이 유전자는 숙주세포, 예를 들어, 포유류 세포에서 외인성 뉴클레오티드 서열/전이 유전자의 번역, 전사, 및/또는 발현을 유도하는데 필요한 조절 서열에 바람직하게는 작동가능하게 연결된다. 본 명세서에서 사용되는 구절인 “작동가능하게 연결된-”은 조절 서열이 이들이 조절하는 핵산 서열과 인접한 것 또는 상기 조절 서열이 트랜스로(in trans), 또는 거리를 두고 작용하여 조절된 핵산 서열을 제어하는 것을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사 개시 서열, 종결 서열, 인핸서 서열(enhancer sequence) 및 프로모터 서열(promoter sequence)과 같은 적합한 발현 제어 서열, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal)와 같은 효율적인 RNA 가공 신호, 번역 효율과 단백질 안정성을 강화하는 서열 및 단백질 분비를 촉진하는 서열을 포함한다. 추가적으로, 이들은 전이 유전자 발현의 억제를 위한 서열, 예를 들어, 세포주 발현에서 생산 동안에, 트랜스-활성화 수용체(trans-activating receptor)을 함유할 수 있다. 핵산의 발현을 제어하는 프로모터 및 다른 조절 서열은 기술분야에서 확인되었으며 공지되었다. 바람직하게는, 프로모터는 인간 CMV 프로모터, 유인원 CMV 프로모터, 쥐과(murine) CMV 프로모터, 유비퀴틴, EF1 프로모터, 개구리(frog) EF1 프로모터, 액틴 및 다른 표유류 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 것은 인간 CMV 프로모터, 특히 인간 CMV 주요 즉시 초기 프로모터(human CMV major immediate early promoter)이다.
관심있는 외인성 뉴클레오티드 서열(들)을 바이러스 벡터 내로 카세트의 부분으로서 도입할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어인 “카세트”는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열-이의 전사 제어 서열 및 번역 제어 서열과 함께 발현되어 숙주세포에서 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 허용할-을 포함하고, 카세트의 5' 말단 및 3' 말단에서의 제한 부위를 선택적으로 포함한 핵산 분자를 나타낸다. 제한 내부핵산 가수분해 효소부위로 인해(restriction endonuclease site), 카세트는 다른 카세트로 용이하게 삽입, 제거 또는 대체될 수 있다. 카세트를 변화시키는 것은 카세트가 혼입된 벡터에 의해 상이한 서열(들)의 발현을 야기할 것이다. 대안적으로는, 통상적 기술자에게 공지된 임의의 방법이 상기 카세트를 제작, 변형 또는 유도하는데 이용될 수 있으며, 그 예로는 PCR 돌연변이 유발, 인-퓨전®(In-Fusion®), 재조합 유전공학, 게이트웨이® 클로닝(Gateway® cloning), 부위-특이적인 재조합(site-specific recombination) 또는 국소이성질화 효소 클로닝(topoisomerase cloning)이 있다.
발현 제어 서열은 바람직하게는 복제 및 비리온 캡시드화(virion encapsidation)에 필요한 아데노바이러스 인자를 포함한다. 바람직하게는, 이 인자가 외인성 뉴클레오티드 서열을 플랭킹한다(flanking). 바람직하게는, ChAd68 벡터는 복제 기점(origin of replication)으로 기능하는 C68의 5' 역위 말단 반복(Inverted Terminal Repeat, ITR) 서열 및 3' ITR 서열을 포함한다.
패키징 신호 서열은 바이러스 벡터의 조립으로 유도하는 기능을하고, 기술분야에서 잘 특성화되어있으며 이해된다.
통상의 기술자는 바이러스 벡터에서 캡시드화될 수 있는 핵산 분자의 길이에 대한 최소 및 최대 제약이 있음을 이해할 것이다. 그러므로, 요구된다면, 핵산 분자는 “스터핑(stuffing)”, 즉, 요구된 크기까지 최종 벡터 게놈을 가져오기 위한 여분의 뉴클레오티드 서열(extra nucleotide sequence)도 포함할 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 핵산 분자가 야생형 핵산 분자의 길이의 약 80% 내지 약 108%인 것을 보장하기 위한 충분한 “스터핑”을 포함한다.
핵산 분자는 C68 게놈으로부터 하나 이상의 유전자 또는 좌위도 포함할 수 있다. 야생형 C68 게놈은 주로 조절 기능을 가지며 숙주세포를 바이러스 복제를 위해 준비하는 4개의 초기 전사 단위 (early transcriptional unit) (E1, E2, E3 및 E4)를 포함한다. 게놈은 단일 프로모터의 제어 하에 있는, 펜톤 (L2), 헥손 (L3), 스캐폴딩 단백질 (L4) 및 섬유 단백질 (L5)을 포함한 구조 단백질을 암호화하는 5개의 후기 전사 단위 (L1, L2, L3, L4 및 L5)도 포함한다. 게놈의 각 맨 말단부(extremity)는 바이러스 복제에 필요한 역위 말단 반복 (ITR)을 포함한다.
본 발명의 바이러스 벡터는 고유의 E4 영역이 결실되었고 AdY25로부터의 비상동성 E4Orf1, E4Orf2 및 E4Orf3 암호화 영역이 삽입된 완전한 고유의 C68 게놈에 기초할 수 있다.
C68의 고유의 E4 영역은 본 명세서에서 SEQ ID NO. 2로서 제공된다.
관심있는 외인성 뉴클레오티드 서열은 C68 게놈 내로도 삽입될 수 있다. 통상적 기술자는 바이러스 벡터를 만들 경우, 고유의 C68 게놈에 대한 다양한 추가의 변형이 가능하고, 실제로 목적되는 것임을 이해할 것이다.
하나 이상의 고유의 C68 유전자는 결실, 기능적으로 결실 또는 변형되어 바이러스 벡터를 최적화할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 구절인 “결실된-”은 유전자의 결실 전반을 나타내는 것인 반면, “기능적 결실”은 유전자/좌위를 발현하는 아데노바이러스의 능력을 파괴하거나 유전자 생성물을 비-기능적 상태로 만드는 유전자/좌위의 부분적 결실, 또는 프레임 이동 돌연변이(frame shift mutation)와 같은 일부 다른 변형을 나타낸다.
C68 게놈을 변형하여 숙주세포에서 삽입 능력을 증가시키거나 복제를 저해할 수 있고/있거나 형질전환된 패키징 세포주에서 바이러스 벡터의 성장 및 수득률을 증가시킬 수 있다. 통상적 기술자는 임의의 수의, 초기 또는 후기 유전자가 기능적으로 결실될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 변형된 바이러스 벡터의 복제는 결실된 유전자의 보충물을 포함하는 형질전환된 세포주에서 여전히 가능할 것이다. 예를 들어, 복제 및 조립에 필요한 바이러스 단백질은 조작된 패키징 세포주 또는 헬퍼 바이러스(helper virus)에 의해 트랜스로 제공될 수 있다.
그러므로, 외인성 뉴클레오티드 서열 외에도, 본 발명의 벡터는 외인성 뉴클레오티드 서열에 삽입된 완전한 고유의 아데노바이러스 게놈, 특정 유전자의 하나 이상의 결실 또는 기능적 결실이 있는 아데노바이러스 게놈, 또는 최소한의 아데노바이러스 서열을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 하나 이상의 초기 전사 단위는 변형, 결실 또는 기능적으로 결실된다.
양태에서, 바이러스 벡터는 비-복제적(non-replicating) 이거나 복제가 손상된 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어인 "비복제적-" 또는 "복제가 손상된-"은 다수의 정상 포유류 세포, 바람직하게는 정상 인간 세포에서 임의의 현저한 정도로 복제를 할 수 없음을 의미한다. 바이러스 벡터가 인간 환자에서 증식성 감염 또는 질병을 야기할 수 없는 것이 바람직하다. 그러나, 바이러스 벡터는 바람직하게는 면역 반응을 촉진할 수 있다. 비복제적이거나 복제가 손상된 바이러스는 매우 자연 상태로 되었을 수 있다, 즉, 이들이 그 자체로 자연으로부터 분리될 수 있다. 대안적으로는, 바이러스는, 예를 들어, 시험관내에서 품종개량(breeding) 또는 유전적 조작에 의해 인공적으로 비복제적이거나 복제가 손상된 상태로 될 수 있다. 예를 들어, 복제에 중요한 유전자가 기능적으로 결실될 수 있다.
바람직하게는, 아데노바이러스 벡터 복제는 바이러스 복제에 필수적인 단일 전사 단위의 기능적인 결실에 의해 무능한(incompetent) 상태로 된다. 바람직하게는, E1 유전자/좌위가 결실 또는 기능적으로 결실된다. E1 유전자/좌위는 비상동성 전이 유전자, 예를 들어, 관심있는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한 뉴클레오티드 서열 또는 발현 카세트로 대체될 수 있다.
C68의 고유의 E1 영역은 본 명세서에서 SEQ ID NO. 16로 제공된다.
본 명세서에서 논의되는 바와 같이, 재조합 아데노바이러스를 박테리아 인공 염색체 (BAC)에서 C68의 분자 클론을 생성하여 만들 수 있고, E1 좌위는 바람직하게는 아데노바이러스 E1 영역의 하류에 여분의 상동 플랭크 (extra homology flank)를 포함시켜 C68 바이러스 DNA와 선형의 BAC “레스큐 벡터(rescue vector)” 사이의 상동성 재조합 동안에 E1의 동시의 결실을 가능하게 함으로써 결실된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 바이러스 벡터는 하나 이상의 재조합 부위를 포함하여 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한 하나 이상의 전이 유전자 또는 카세트의 삽입을 가능하게 한다. 바람직하게는, 재조합 부위는 파지 람다 부위 특이적 부위(phage lambda site specific recombination site)를 포함한다. 이러한 재조합 부위는 임의의 적합한 좌위에 도입될 수 있으나, 바람직하게는 아데노바이러스E1 좌위에 도입된다. 따라서, 비복제적인 또는 복제가 손상된 벡터를 E1 유전자를 관심있는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한 뉴클레오티드 서열로 대체함으로써 제조할 수 있다. 바람직하게는, 재조합 부위 attR1 및 attR2는 아데노바이러스 E1 좌위에서 인비트로젠 게이트웨이® 데스티네이션 카세트(Invitrogen Gateway® destination cassette)의 부분으로서 도입된다.
바람직하게는, 벡터는 아데노바이러스 E3 유전자/좌위를 결핍한다. 아데노바이러스 E3 영역의 결실은 새 벡터의 삽입 능력을 약 5kb까지 증가시킨다. 이 영역이 바이러스 복제에 요구되지 않고, 따라서 패키징 세포주에서 트랜스로 제공될 필요가 없기 때문에, E3의 결실은 바이러스 벡터 수득률에 거의 영향을 주지 않는다. E3 좌위는 GalK 재조합 유전공학을 이용하여 결실될 수 있다.
C68의 고유의 E3 영역은 본 명세서에서 SEQ ID NO. 17로서 제공된다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, C68 게놈으로부터 E1 좌위와 E3 좌위가 모두 결실된다.
본 발명의 바이러스 벡터는 바이러스 복제에 요구된 임의의 결실된 유전자의 보충물을 함유한 조작된 세포주에서 제조될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 바이러스 벡터의 복제는 다른 혈청형의 복제를 용이하게 하도록 설계된 세포에서 차선일 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 바람직하게는, HEK293과 같은, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터에서 기능적으로 결실된 유전자를 발현한 형질전환된 세포주에서 벡터 성장 및 수득률을 최적화하도록 설계된 하나 이상의 변형을 더 포함한다.
HEK293 세포에서 바이러스 복제에 대해 특히 중요한 것은 E4Orf6의 유전자 생성물로, 이는 후기 바이러스 mRNA 스플라이싱 및 바이러스 mRNA의 선택적 확산(exportation), 바이러스 DNA 합성 및 세포자살의 저해에 연루된 다기능성 단백질이다. E4Orf6와 세포-발현의 E1B-55K 사이의 차선의 상호작용은 HEK293 세포에서 ChAdOx2 벡터의 수득률을 감소시키는 것으로 여겨진다. 그러므로, 고유의 E4Orf6 영역은 비상동성 E4Orf6 영역으로 대체될 수 있다.
바람직한 양태에서, 고유의 E4Orf4, E4Orf6 및 E4Orf6/7 암호화 영역은 AdHu5로부터의 E4Orf4, E4Orf6 및 E4Orf6/7 암호화 영역으로 대체된다. 특히 바람직한 양태에서, 재조합 E4 영역은 AdY25로부터의 E4Orf1, E4Orf2 및 E4Orf3 암호화 영역과 AdHu5부터의 E4Orf4, E4Orf6 및 E4Orf6/7 암호화 영역을 포함한다.
AdHu5로부터의 E4Orf4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 7에서 발견된다. 대응하는 뉴클레오티드 서열은 ChAdOx2 벡터 서열 (SEQ ID NO. 10)의 뉴클레오티드 29262 내지 28918에서 발견된다. AdHu5로부터의 E4Orf6의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 8에서 발견된다. 대응하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 10의 뉴클레오티드 28997 내지 28113에서 발견된다. AdHu5부터의 E4Orf6/7의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 9에서 발견된다. 대응하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 10의 뉴클레오티드 28997 내지 27834에서 발견된다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 벡터는 AdHu5 E4Orf4, E4Orf6 및 E4Orf6/7의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
AdY25로부터의 E4Orf1의 아미노산 서열은 본 명세서에서 SEQ ID NO. 3로서 제공된다. 대응하는 뉴클레오티드 서열은 ChAdOx2 벡터 서열(SEQ ID NO. 10)의 뉴클레오티드 30434 내지 30060에서 발견된다.
AdY25로부터의 E4Orf2의 아미노산 서열은 본 명세서에서 SEQ ID NO. 4로서 제공된다. 대응하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 10의 뉴클레오티드 30010 내지 29621에서 발견된다.
AdY25로부터의 E4Orf3의 아미노산 서열은 본 명세서에서 SEQ ID NO. 5로서 제공된다. 대응하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 10의 뉴클레오티드 29624 내지 29271에서 발견된다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 바이러스 벡터는 고유의 C68 뉴클레오티드 서열이 아데노바이러스 E1 및 E3 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 결핍하고, AdHu5로부터의 E4Orf4, E4Orf6 및 E4Orf6/7 암호화 영역 및 AdY25로부터의 E4Orf1, E4Orf2 및 E4Orf3 암호화 영역으로 대체된 고유의 E4 좌위를 갖는 고유의 C68 게놈의 변형된 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 이 특히 바람직한 바이러스 벡터는 본 명세서에서 “ChAdOx2”로 나타난다.
E1 좌위에서 게이트웨이® 데스티네이션 카세트(Gateway® Destination Cassette)로 ChAdOx2을 암호화한 예시적 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 10에 기술된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 바이러스 벡터의 게놈은 관심있는 단백질을 암호화한 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된 SEQ ID NO.10의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
본 발명의 제2 측면은 임의의 하나 이상의 추가의 활성 성분, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 아쥬반트와 배합한 본 발명의 제2 측면에 따른 바이러스 벡터를 포함한 약제학적 또는 면역원성 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 조성물은 면역원성 및/또는 항원성 조성물이다. 본 발명에 따른 면역원성 및/또는 항원성 조성물은 예방적 (감염을 예방하기 위한), 노출 후(감염 후, 그러나 질병 이전에 치료하기 위한) 또는 치료학적 (질병을 치료하기 위한)일 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 예방적이거나 노출 후일 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 백신이다.
면역원성 조성물이 예방적 사용을 위할 경우, 개체는 바람직하게는 유아, 어린 아이(young child), 보다 나이 든 아이(older child) 또는 십대이다. 면역원성 조성물이 치료학적 사용을 위할 경우, 개체는 바람직하게는 성인이다.
조성물은 항-염증제(anti-inflammatory agent) (예를 들어, p38 억제제, 글루탐산 수용체 길항제, 또는 칼슘 채널 길항제), AMPA 수용체 길항제, 화학요법제 및/또는 항증식제(antiproliferative agent)와 같은 하나 이상의 추가의 유효성분을 포함할 수 있다. 조성물은 하나 이상의 항균 화합물도 포함할 수 있다. 적합한 항균 화합물의 예시는 리팜피신(rifampicin), 이소니아지드(isoniazid), 에탐부톨(ethambutol) 및 피리진아미드(pyrizinamide)와 같은 항결핵 화학요법제(antituberculous chemotherapeutics)를 포함한다.
적합한 담체 및/또는 희석제는 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있고, 의약품 등급의 전분, 만니톨, 젖당, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탤컴(talcum), 셀룰로오스, 글루코스, 수크로스, (또는 다른 당), 마그네슘 카보네이트, 젤라틴, 오일, 알코올, 세제, 유화제 또는 물 (바람직하게는 살균한)을 포함한다. 조성물은 조성물의 혼합된 조제물일 수 있거나 동시의, 별도의 또는 순차적인 사용(투여를 포함한)을 위한 배합된 조제물일 수 있다.
적합한 아쥬반트는 기술분야에 잘 공지되어있고 불완전한 프로인드 아쥬반트(Freund's adjuvant), 완전한 프로인드 아쥬반트, 무라밀디펩티드(muramyldipeptide, MDP)와 프로인드 아쥬반트(Freund's adjuvant), 알룸 (알루미늄 하이드록시드), 알룸 플러스 보르데텔라 펄투시스 ( Bordatella pertussis ) 및 면역 촉진 복합체[(immune stimulatory complex, ISCOM), 전형적인 바이러스 단백질을 함유한 Quil A의 기질]를 포함한다.
전술된 징후(indication)에서 사용되기 위한 본 발명에 따른 조성물은 임의의 편리한 방법, 예를 들어, 경구투여 (흡입을 포함한), 비경구적 투여, 점막 투여 (예, 구강의, 설하의, 비강의), 직장 투여 또는 경피 투여로 투여될 수 있고, 조성물은 이에 따라 조정될 수 있다.
구강 투여의 경우, 조성물은 액체 또는 고체, 예를 들어, 용액, 시럽, 현탁액 또는 에멀젼, 정제, 캡슐 및 로젠지(lozenge)로 제형화될 수 있다.
액상 제제는 일반적으로 적합한 수용성 또는 비-수용성 액상 담체(들), 예를 들어, 물, 에탄올, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜 또는 오일에서 화합물의 용액 또는 현탁액 또는 생리학적으로 허용 가능한 염으로 구성될 것이다. 제제는 현탁화제(suspending agent), 보존제, 향미제 또는 착색제도 함유할 수 있다.
정제 형태의 조성물을 통상적으로 고형 제제를 제조하는데 이용되는 임의의 적합한 약제학적 담체(들)을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 담체의 예시는 마그네슘 스테아레이트, 전분, 젖당, 수크로오스 및 미세결정성 셀룰로오스를 포함한다.
캡슐 형태의 조성물은 통상적인 캡슐화 절차를 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 활성 성분을 함유한 파우더, 과립 또는 펠렛을 표준 담체를 이용하여 제조한 다음, 경질 젤라틴 캡슐(hard gelatine capsule)로 채울 수 있고; 대안적으로는, 분산 또는 현탁액이 임의의 적합한 약제학적 담체(들), 예를 들어, 수용성 검, 셀룰로오스, 실리케이트 또는 오일을 이용하여 제조할 수 있으며, 분산 또는 현탁액을 이어서, 연질 젤라틴 캡슐(soft gelatine capsule)로 채울 수 있다.
구강 투여를 위한 조성물은, 조성물이 소화관을 통과함에 따른 분해에 대한 활성 성분을, 예를 들어, 정제 또는 캡슐 상의 제제의 외부 코팅에 의해 보호하도록 설계될 수 있다.
통상적인 비경구적 조성물은 살균한 수용성 또는 비-수용성 담체 또는 비경구적으로 허용 가능한 오일, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 레시틴, 땅콩기름 또는 참기름에서 화합물의 현탁액 또는 용액 또는 생리학적으로 허용 가능한 염으로 구성된다. 대안적으로, 용액은 동결건조된 다음, 투여 바로 전에 적합한 용액으로 복원될 수 있다.
비강 또는 구강 투여를 위한 조성물은 에어로졸, 점적제(drops), 젤 및 파우더로 편리하게 조제될 수 있다. 에어로졸 제형화는 통상적으로 생리학적으로 허용 가능한 수용성 또는 비-수용성 용매에서 유효 물질의 용액 또는 미세 현탁액(fine suspension)을 포함하고, 대개는 분무 장치(atomising device)와 사용하기 위한 카트리지 또는 리필의 형태를 취할 수 있는 밀봉된 용기에서 살균한 형태로 단일 투여량 또는 다회 투여량으로 제시된다. 대안적으로, 밀봉된 용기는 용기의 내용물이 소진되면 제거를 위한 미터링 밸브(metering valve)로 피팅된 에어로졸 분배기(aerosol dispenser) 또는 단일 투여량 비강 흡입기(single dose nasal inhaler)와 같은 일원화 분배 장치(unitary dispensing device)일 수 있다. 제형이 에어로졸 분배기를 포함하는 경우, 이는 약제학적으로 허용 가능한 분사제를 함유할 것이다. 에어로졸 제형은 펌프-분무기(pump-atomiser)의 형태도 취할 수 있다.
구강 또는 설하 투여에 접합한 조성물은, 활성 성분이 당 및 아카시아, 트라가칸트(tragacanth), 또는 젤라틴 및 글리세린과 같은 담체로 제형화된 정제, 로젠지 및 파스틸(pastilles)을 포함할 수 있다.
직장 또는 질내 투여를 위한 조성물은 편리하게 좌약[코코아버터와 같은 통상적인 좌약 베이스(suppository base)를 함유한], 페서리(pessary), 질정(vaginal tab), 질 폼(vaginal foam) 또는 질 관장제(vaginal enema)의 형태이다.
경피 투여에 적합한 조성물은 연고, 젤, 패치 및 파우더 주사를 비롯한 주사를 포함한다.
편리하게는, 조성물은 정제, 캡슐 또는 앰플과 같은 단위 투여량 형태이다.
약제학적 조성물은 바람직하게는 살균한 것이다. 이는 바람직하게는 발열원이 없다(pyrogen-free). 이는 바람직하게는, 예를 들어, pH 6 내지 pH 8에서, 일반적으로는 약 pH 7에서 완충된다. 바람직하게는, 조성물은 인간과 실질적으로 등장성이다.
바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 바이러스 벡터의 면역원성적 또는 약제학적 유효량을 환자에게 전달한다. 본 명세서에서 사용되는 '면역원성적 또는 약제학적 유효량'은 단일 투여량 또는 일련의 투여량으로서 개인에게로 이 유효량의 투여가 질병 또는 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 것을 의미한다. 특히, 이 구절은 충분한 양의 항원이 환자의 세포에 의해 생성되어 질병 또는 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 면역 반응을 촉진하도록 충분한 양의 바이러스 벡터가 환자에게 적합한 기간동안 전달되는 것을 의미한다. 이 양은 치료될 개인의 건강 및 신체적 조건, 나이, 개인의 면역계의 능력, 목적하는 보호의 정도, 백신의 제제, 의학적 상황의 의사의 평가 및 다른 관련 요인에 따라 달라진다.
일반적으로, 약제학적 유효량은 1 x 107 내지 1 x 1012의 바이러스 입자 (viral particle, vp), 바람직하게는 1 x 1010 내지 1 x 1011의 입자를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 약제학적 유효 투여량은 2.5x1010 v.p. 내지 5 x 1010 vp를 포함한다. 가장 바람직하게는, 약제학적 유효 투여량은 2.5x1010 v.p.을 포함한다.
바람직한 양태에서, ChAdOx2에 기초한 백신이 제공되며, 이 백신은 미코박테리움 아비움 아종 파라튜버큘로시스　(MAP)로부터의 항원을 함유한다. 바람직하게는, 이 백신은 5 x 109 내지 5 x 1010 vp의 투여량으로 투여된다. 더욱 바람직하게는, 이 백신은 2.5x1010 v.p. 내지 5 x 1010 vp의 투여량으로 투여된다. 가장 바람직하게는, 백신은 2.5x1010 v.p.의 투여량으로 투여된다.
바람직한 양태에서, ChAdOx2에 기초한 백신이 제공되며, ChAdOx2 벡터는 광견병 바이러스 당단백질을 암호화한다. 바람직한 양태에서, 이 백신은 동물에게 1 x106 내지 1 x108의 감염성 단위(infectivity unit)의 투여량으로 투여된다. 다른 바람직한 양태에서, 이 백신은 인간에게 5 x 109 내지 5 x 1010 vp의 투여량으로 투여된다. 더욱 바람직하게는, 이 백신은 인간에서 2.5x1010 v.p. 내지 5 x 1010 vp의 투여량으로 투여된다. 가장 바람직하게는, 백신은 인간에서 2.5x1010 v.p.의 투여량으로 투여된다.
본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 다른 바이러스 벡터, 바람직하게는 다른 아데노바이러스 벡터도 포함할 수 있다.
본 발명의 제3 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터의 사용 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 면역원성 조성물을 제공한다. 특히, 제3 측면은 의약에서, 본 발명의 바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물의 사용을 제공한다.
이 측면은 또한 하기를 제공한다: i) 약제로 사용하기 위한 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물 및 ii) 약제로 사용하기 위한 약물(medicament)의 제조에서, 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물의 사용. 일부 예시적인 의학적 사용은 하기에서 더 자세히 기술된다.
양태에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 면역원성 조성물은 이용되어 전이 유전자를 숙주세포로 전달할 수 있다.
이 방법은 바람직하게는 상기 숙주세포로 본 발명의 제2 측면에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 숙주세포는 동물세포이고, 더욱 바람직하게는 포유류 세포이다. 바람직한 표유류는 닭, 다른 가금류, 카우(cow), 양, 염소, 돼지, 멧돼지, 버팔로, 들소, 말, 낙타과, 사슴, 코끼리, 오소리, 주머니쥐, 고양이, 사자, 원숭이 및 인간을 포함한다. 바람직하게는, 숙주세포는 체세포이다. 숙주세포는 항원-제시 수지상세포, 랑게르한스 세포(langerhans cell), 대식세포, B 세포, 림프구, 백혈구, 근세포 및 섬유아세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
이 방법은 시험관내 또는 체내에서 수행할 수 있다. 이 방법을 시험관내에서 수행할 경우, 바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물은 바이러스 벡터를 이용한 숙주세포의 형질도입 또는 비-증식성 감염이 용이해지도록 적합한 조건하에 숙주세포와 접촉될 수 있다. 이 양태에서, 숙주세포는 동물 개체로부터 분리된 숙주세포 또는 시료를 포함할 수 있다. 이 방법을 체내에서 수행할 경우, 바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물은 바람직하게는, 바이러스 벡터를 이용한 동물 개체의 하나 이상의 세포의 형질도입이 용이해지도록, 동물 개체에 투여된다. 바람직하게는, 바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물이 개체로 경구투여 (흡입을 포함한), 비경구적 투여(예, 근육내, 피하, 정맥내 또는 복강내), 점막 투여 (예, 구강의, 설하의, 비강의), 직장 투여 또는 경피 투여에 의해 투여된다.
바람직하게는, 본 발명의 바이러스 벡터를 이용한 숙주세포의 형질도입은 관심있는 외인성 뉴클레오티드 서열의 숙주세포내로 안정한 전달을 야기한다.
그러므로, 다른 양태에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 면역원성 조성물을 이용하여 동물에서 면역반응을 유발할 수 있다. 이 방법은 바람직하게는 상기 동물에 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
관심있는 단백질 또는 폴리펩티드가 항원인 경우, 동물에서 단백질 또는 폴리펩티드의 발현은 이 항원에 대한 1차 면역 반응의 유발을 야기할 것이며, 이는, 예를 들어, 항원이 유래된 병원체에 의한 감염에 대한 2차 유입의 사건에서 강화된 반응을 제공할 면역기억의 발달을 초래할 것이다.
바람직하게는, 동물은 면역반응을 겪지 않은 동물(naive animal), 즉, 논의가 되고 있는 병원체 또는 항원에 이전에 노출되지 않은 동물이다.
동물에서 면역반응을 유발하는 것 뿐만 아니라, 본 발명의 바이러스 벡터 또는 이의 면역원성 조성물을 이용하여 이전에 항원에 노출된 동물의 면역반응을 증대시킬 수 있다.
그러므로, 추가의 양태에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 면역원성 조성물을 이용하여 동물에서 면역 반응을 증대시킬 수 있다. 이 방법은 바람직하게는 상기 동물에 본 발명의 제2 측면에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 동물 개체는 논의가 되고 있는 항원에 이전에 노출되었거나, “대비되었다(primed)”. 예를 들어, 개체는 항원을 포함한 조성물로 이전에 접종 또는 백신 접종되었거나, 항원이 유래된 항원으로 이전에 감염되었다. 개체는 항원이 유래된 병원체로 잠재하여(latently) 감염될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 벡터 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 면역원성 조성물을 이용하여 환자에서 적어도 하나의 질병에 치료하거나 예방할 수 있다. 본 발명에 따른 환자에서 질병을 치료하거나 예방하는 방법은 바람직하게는 상기 환자에게 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 질병은 결핵(tuberculosis) 및 요네병(Johne's disease), 크론병(Crohn's disease), 말라리아, 인플루엔자, HIV/AIDS, C형 간염 바이러스 감염, 거대세포 바이러스 감염, 인간 유두종 바이러스 감염, 아데노바이러스 감염, 리슈만편모충증(leishmaniasis), 스트렙토코커스 spp . (streptococcus spp .) 감염, 스타필로코커스 spp .(staphylococcus spp.) 감염, 메닝고코커스 spp . (meningococcus spp .) 감염, 구제역(foot and mouth disease), 치쿤구니야 바이러스 감염(chikungunya virus infection), 지카 바이러스, 광견병, 크림 콩고 출혈열(Crimean Congo haemorrhagic fever), 에볼라 바이러스 질병, 마르부르크(Marburg), 라사열(Lassa fever), 메르스 및 사스 코로나바이러스 질병, 니파(Nipah) 및 리프트 밸리 열(Rift Valley fever), 지카, 치쿤구니야(Chikungunya)를 비롯한 다른 미코박테리아 감염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 질병은 결핵 및 다른 미코박테리아 감염, 및 광견병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
비상동성 항원이 유래된 병원성 유기체에 대한 면역반응을 유도하는 것 뿐만 아니라, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 바이러스 벡터가 유래된 아데노바이러스에 대한 면역반응도 유도할 수 있다. 이와 같이, C68에 대한 면역반응이 유발될 수 있다. 또한, C68에 대해 유도된 면역 반응은 다른 아데노바이러스 혈청형과 교차 반응적(cross-reactive)이고, 이와 같이 하나 이상의 아데노바이러스에 대한 면역 반응이 유발될 수 있다. 본 발명의 제2 측면에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 면역원성 조성물은 따라서 아데노바이러스성 질병을 치료하거나 예방하는데 또한 사용될 수 있다.
본 발명이 이 양태는 그러므로 환자에서 적어도 하나의 아데노바이러스성 질병 및 적어도 하나의 비-아데노바이러스성 질병의 치료 또는 예방 또한 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 면역원성 조성물을 이용하여 자가 항원에 대한 내성을 파괴할 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 이 방법은 바람직하게는 상기 동물에 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
종양 세포가, 적합한 조절 제어(regulatory control) 없이 성장, 분열 및 분산하는 환자 자신의 세포에 필수적이라는 이유로, 많은 종양 세포들이 환자의 면역계에 의해 내성이 생긴다. 따라서, 암 종양(cancerous tumour)은 환자의 신체 내에서 저지되지 않고 성장이 가능하다. 그러나, 본 발명의 바이러스 벡터를 이용하여 환자의 면역계가 “암 면역요법(cancer immunotherapy)”으로 공지된 과정에서 종양 세포를 공격하도록 자극할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 벡터를 이용하여 환자의 면역계가 파괴될 표적으로서 종양 세포를 인식하도록 '훈련'시킬 수 있다. 이는 바이러스 벡터 내에서 적합한 자가-항원을 암호화한 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함함으로써 달성될 수 있다. 이전에 기술된 바와 같이, 적합한 자가-항원은 면역계가 종양 세포 및 다른 세포 유형 사이를 구별하도록 허용하는 종양 세포에 의해 발현된 항원을 포함한다. 적합한 자가-항원은 세포유형 및/또는 이의 환경에 부적합하거나, 유기체의 발달 동안에 정상적으로만 존재하는 항원(예, 태아 항원)을 포함한다. 예를 들어, GD2는 면역계에 이의 노출이 혈관-뇌 장벽에 의해 제한되는 신경 세포의 바깥 표면 막(outer surface membrane) 상에서 현저한 수준으로 정상적으로만 발현된다. 그러나, GD2는 소세포 폐암(small-cell lung cancer), 신경모세포종(neuroblastoma), 흑색종(melanoma) 및 골육종(osteosarcoma)을 비롯한 광범위한 종양 세포의 표면상에 발현된다. 다른 적합한 자가-항원은 종양 세포 상에서는 발견되나 건강한 세포의 표면상에서는 드물거나 없는 세포-표면 수용체를 포함한다. 이러한 수용체는 종양 세포의 조절되지 않은 성장 및 분열을 야기하는 세포 신호전달 활성화의 원인일 수 있다. 예를 들어, ErbB2는 유방암 종양 세포의 표면상에서 비정상적으로 높은 수준으로 생성된다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 이용하여 종양 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 그러므로 암의 치료에 사용할 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터를 이용하여 비장, 췌장, 전립선, 간, 폐, 유방, 장(bowel), 뇌 및 결장의 암을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 암 또는 종양의 발달을 치료, 예방 또는 제한할 수 있다.
환자에서 암을 치료하거나 예방하는 방법은 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 치료학적인 유효 투여량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터를 또한 이용하여 자가면역 질환, 또는 자신의 항원에 대한 과민증(hypersensitivity)에 의해 야기된 질환을 치료할 수 있다.
환자에서 자가면역 질환을 치료하는 방법은 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 치료학적 유효 투여량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
하기의 상세 설명은 본 발명의 벡터 및 면역원성 조성물의 상기의 모든 사용에 준용하여 적용한다.
간기 말라리아 (liver stage malaria), 결핵(tuberculosis) 및 인플루엔자를 비롯한 많은 질병의 치료 및 예방은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 Th1-유형 사이토카인, 특히 IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 IL-17와 반응하는 능력 모두를 수반한 감염에 대한 강력한 세포-매개성 반응의 유지와 관련된다. 많은 서브유닛 백신 플랫폼이 효과적으로 인간 면역을 생성하나, 강인한 세포-매개성 면역 반응의 생성, 특히 CD4+ 및 CD8+ T 세포 면역 반응은 훨씬 더 도전적이었다. 본 발명의 바이러스 벡터는 바람직하게는 암호화된 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 모두를 촉진한다.
기억 면역 반응을 유도하는 것도 바람직하다. 전형적으로, 기억 면역 반응은 오래 생존된, 항원-특이적인 T 림프구의 재활성화(reactivation)-분화된 이펙터 T 세포로부터 직접적으로 발생하고 균등한 휴지 상태(uniformly quiescent state)에서 지속하는-덕분이다. 기억 T 세포는 이질적(heterogeneous)이며, 상이한 이동 능력(migratory capacity) 및 이펙터 기능을 부여받은 적어도 두 개의 부분집합; 이펙터 기억 T 세포 (effector memory T cell, TEM) 및 중심 기억 T 세포 (central memory T cell, CTM)를 포함함을 보였다. TEM과 1차 면역 반응에서 생성된 이펙터 세포는, 이들이 림프절-귀환 수용체(lymph node-homing receptor) L-셀렉틴 및 CCR7을 결핍하고, 염증이 있는 조직으로의 이동을 위한 수용체를 발현하는 점에서 비슷하다. 항원이 재유입하면, 이러한 TEM은 IFN-γ 또는 IL-4를 빠르게 생성할 수 있거나 미리 저장된 퍼폼(pre- stored perform)을 방출할 수 있다. TCM은 L-셀렉틴 및 CCR7을 발현하고 즉각적인 이펙터 기능은 결핍한다. 이러한 세포는 낮은 활성화 역치(activation threshold)를 가지며, 2차 림프 기관에서 재자극하면, 증식하고 이펙터로 분화한다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 면역원성 조성물은 항원-특이적 면역 반응을 유발, 유도 또는 증대시킬 수 있다. 바람직하게는, 면역반응은 강력한 T 세포 면역 반응, 예를 들어, 강력한 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응이다. 바람직하게는, T 세포 면역반응은 예방적 T 세포 면역 반응이다. 바람직하게는, T 세포 면역 반응은 길게 지속되고 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25년 이상 동안 계속된다. 바람직하게는, 유도된 면역 반응은 기억 T 세포 면역 반응이다.
본 발명의 제1 측면의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 제2 측면의 면역원성 조성물은 단일 예방접종 또는 복수의 예방접종(multiple immunisation)으로서 숙주세포 또는 개체에 투여될 수 있다. 바람직하게는, 바이러스 벡터 또는 이의 면역원성 조성물이 단일, 이중 또는 삼중 백신접종 전략의 일환으로서 투여될 수 있다. 이들은 상동성 또는 비상동성 프라임-부스트 예방접종 요법(prime-boost immunisation regime)의 일환으로서 또한 투여될 수 있다.
백신접종 전략 또는 예방접종 요법은 본 발명의 바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물의 제2 또는 후속적인 투여를 포함할 수 있다. 제2 투여는 단기간 동안 또는 장기간 동안 투여될 수 있다. 투여량은 시간(hour) 동안, 일(day) 동안, 주(week)동안, 개월(month)동안 또는 년(year)동안, 예를 들어, 제1 투여 후에 최대 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주 이상 또는 0.25, 0.5, 0.75, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40년 이상 동안 투여될 수 있다. 바람직하게는, 제2 투여는 제1 투여 후에 적어도 2개월에서 존재한다. 바람직하게는, 제2 투여는 제1 투여 후에 최대 10년간 존재한다. 이러한 시간 간격은 바람직하게는 임의의 후속적인 투여 사이의 기간에 준용하여 적용한다.
바이러스 벡터 및/또는 면역원성 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 다른 바이러스성 또는 비-바이러스성 DNA/단백질 백신과 배합하여 투여될 수 있다. 바람직한 예시는 변형된 백시니아 앙카라 (modified vaccinia Ankara, MVA), 계두 9(Fowlpox 9, FP9) 및 다른 아데노바이러스 벡터 백신을 포함한다.
바이러스 벡터 및/또는 면역원성 조성물은 개체에 경구투여 (흡입을 포함한), 비경구적 투여, 점막 투여 (예, 구강의, 설하의, 비강의), 직장 투여 또는 경피 투여에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로는, 바이러스 벡터 및/또는 면역원성 조성물은 분리된 숙주세포 또는 개체로부터의 시료에 세포(들)을 바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물과 시험관내에서 접촉시킴으로써 바이러스 벡터를 이용한 숙주세포의 형질도입을 용이하게하는 조건하에서 투여될 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터 및 면역원성 조성물은 항원을 암호화한 핵산 서열의 전달에 제한되는 것은 아니다. 암을 비롯한 많은 질병들은 환자의 게놈 내 하나 이상의 유해한 돌연변이 대립 유전자와 관련된다. 유전자 치료는 환자의 세포 또는 조직으로 유전자의 삽입을 수반하여 유해한 돌연변이 또는 비-기능성 대립유전자(들)을 '정상적인' 또는 기능성 대립유전자(들)로 대체하는 과정이다. 통상적으로, 기능성 대립유전자는 게놈 내 비-특이적인 위치로 삽입되어 비-기능성 대립 유전자를 대체한다. 대안적으로는, 비-특이적인 대립유전자는 상동 재조합을 통해 기능성 대립유전자와 교환될 수 있다. 표적 세포 내에서 기능성 대립유전자의 후속적인 발현은 표적 세포를 정상적인 상태로 복원하고, 따라서 질병에 대한 치료를 제공한다. '정상의-' 또는 기능성 대립유전자(들)은 바이러스 벡터를 이용하여 환자의 게놈으로 삽입될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 유전자 치료에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터의 사용 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 면역원성 조성물도 제공할 수 있다.
이 방법은 바람직하게는 본 발명의 제2 측면에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 면역원성 조성물을 상기 동물에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 벡터는 기능성 또는 '정상의-' 단백질-이의 비기능성 또는 '돌연변이' 버전은 질병 또는 질환과 관련된다-을 암호화한 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 표적 세포는 체세포이다. 치료될 개체는 바람직하게는 포유류이다. 바람직한 포유류는 닭, 다른 가금류, 카우, 양, 염소, 돼지, 멧돼지, 버팔로, 들소, 말, 낙타과, 사슴, 코끼리, 오소리, 주머니쥐, 고양이, 사자, 원숭이 및 인간을 포함한다.
본 발명의 제4 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터를 암호화한 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 10의 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 관심있는 외인성 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제5 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터로 형질도입되거나 감염된 숙주세포를 제공한다. 형질도입 또는 감염 후에, 숙주세포는 핵산 분자에서 외인성 뉴클레오티드 서열을 발현하여 관심있는 분자 외에도, 핵산 분자에 의해 암호화된 임의의 다른 아데노바이러스 단백질을 생성할 것이다. 바람직하게는, 숙주세포는 안정적으로 형질도입되고 바이러스 증식에 적합하다.
숙주세포는 분리된 숙주세포, 유기체로부터 조직 시료의 일부, 또는 다세포 유기체의 일부 또는 이의 기관 또는 조직일 수 있다.
바람직하게는, 숙주세포는 체세포이다. 바람직하게는, 숙주세포는 줄기세포, 특히 바람직하게는 배아 줄기세포, 더욱 바람직하게는 인간 배아 줄기세포가 아니다.
숙주세포는 항원-제시 수지상세포, 랑게르한스 세포, 대식세포, B 세포, 림프구, 백혈구, 근육세포 및 섬유아세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 숙주세포 동물세포이고, 더욱 바람직하게는 포유류 세포이다. 바람직한 포유류는 닭, 다른 가금류, 카우, 양, 염소, 돼지, 멧돼지, 버팔로, 들소, 말, 낙타과, 사슴, 코끼리, 오소리, 주머니쥐, 고양이, 사자, 원숭이 및 인간을 포함한다.
본 발명의 제5 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터로 형질도입되거나 감염된 동물도 망라한다. 바람직하게는, 동물은 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터로 형질전환되거나 형질주입된 하나 이상의 세포를 포함한다. 바람직하게는, 동물은 포유류이다. 바람직한 포유류는 닭, 다른 가금류, 카우, 양, 염소, 돼지, 멧돼지, 버팔로, 들소, 말, 낙타과, 사슴, 코끼리, 오소리, 주머니쥐, 고양이, 사자, 원숭이 및 인간을 포함한다.
제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터를 생산하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 방법은 본 발명의 제4 측면에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 박테리아 인공 염색체 (BAC)로 혼입시켜 Ad-BAC 벡터를 생산하는 단계를 포함한다.
플라스미드 벡터와 다르게, BAC는 E. 콜라이 내에 증가된 유전적 안정성을 수여하는 단일 카피로 존재한다. 또한, 단일 카피의 BAC 벡터는 바이러스 게놈에 만들어질 매우 정밀한 변형을 재조합 유전공학에 의해(재조합 매개의 유전공학) 허용한다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열(바람직하게는 C68로부터 유래된)의 박테리아 인공 염색체 (BAC)로의 혼입은 하기의 단계를 포함한다:
i) 바이러스 뉴클레오티드 서열의 좌측 플랭킹 및 우측 플랭킹에 대한 상동 영역(region of homology)을 포함한 BAC 레스큐 벡터 를 제작하는 단계;
ii) BAC 레스큐 벡터를 선형화하는 단계; 및
iii) 숙주세포 내 바이러스 뉴클레오티드 서열 및 선형 BAC 레스큐 벡터 사이에서 상동 재조합을 수행하여 BAC 레스큐 벡터로 바이 러스 뉴클레오티드 서열을 혼입시키는 단계.
바람직하게는, BAC 레스큐 벡터로 혼입된 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 10의 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
바람직하게는, 방법은 Ad-BAC 벡터 게놈을 더 변형하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 추가의 변형을 GalK 재조합 유전공학(GalK recombineering)에 의해 수행할 수 있다. Søren Warming과 동료들에 의해 개척된 이 기법은 GalK 유전자를 재조합 클론의 양성 및 음성 선택 모두에 이용한다 6 . 재조합이 수행될 수 있는 SW102 E. 콜라이 세포는 단독 탄소원으로서 갈락토오스의 이용에 필요한 GalK 유전자를 결핍하도록 특이적으로 조작되었다. 유전자 결실은 벡터 게놈과 결실을 위해 표적화된 유전자의 양측 중 어느 하나의 50bp 상동 영역에 의해 플랭킹된 PCR 증폭된 GalK 카세트 사이의 재조합에 의해 수행된다. 갈락토오스만 함유한 최소 배지상에서 선택은 GalK 유전자 (표적 유전자에 있는)를 함유한 재조합물만 성장해야함을 보장해야한다. 상이한 유전자 서열을 이용한 GalK의 대체는 유사한 방식으로 수행될 수 있으며, 이 때 GalK를 음성 선택에 이용한다. GalK의 생성물인 갈락토키나아제가 DOG를 E. 콜라이에 매우 독성적인 생성물로 물질대사하기 때문에, 2-데옥시갈락토오스 (deoxygalactose, DOG)의 선택 배지로의 추가는 GalK가 대체된 클론을 선택할 것이다. 바람직하게는, 숙주세포는 상기의 단계 i) 내지 iii)를 위한 BJ5183 E. 콜라이고, 추가의 변형을 위한 것은 SW102이다.
바람직하게는, 여분의 상동 플랭크(extra homology flank)는 아데노바이러스 E1 영역의 하류에 포함되어 E1의 동시의 결실을 가능하게 한다.
바람직하게는, 방법은 Ad-BAC 벡터 게놈의 E3 영역의 결실을 더 포함한다. E3 영역의 결실은 GalK 유전자 재조합 유전공학에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게는, 방법은 파지 람다 부위 특이적 재조합 부위(phage lambda site specific recombination site) attR1 및 attR2를 Ad E1 좌위에서 인비트로젠 게이트웨이® 데스티네이션 카세트의 일부로서 도입하는 단계를 더 포함한다. 이러한 변형은 백신 전이 유전자의 효율적인 방향성 삽입(directional insertion)을 가능하게 한다. 전이 유전자도 재조합 유전공학, 인-퓨전®, 통상의 라이게이션(ligation) 또는 갭 수선(gap repair)에 의해 삽입될 수 있다.
본 발명의 제7 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터를 암호화한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 박테리아 인공 염색체 (BAC) 클론을 제공한다.
바람직하게는, BAC 클론을 하기를 포함한다:
(a) BAC 원형주 (BAC backbone);
(b) 본 발명의 제4 측면에 따른 폴리뉴클레오티드 서열.
상기에 기술된 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터는, 필요한 경우, 바이러스로부터 결실된 임의의 유전자의 보충물을 포함하는 헬퍼 바이러스 [거트리스 벡터(gutless vector system)] 또는 형질전환된 세포주에서 복제될 수 있다. 숙주세포에서 복제를 저해하기 위해, 이러한 유전자는 바이러스로부터 결실될 수 있으나, 물론, 본 발명의 제2 측면에 따른 면역원성 조성물을 생성하기 위한 바이러스 벡터를 복제하기 위해 필요하다. 기능적으로 결실된 유전자를 발현하도록 변형된 야생형 아데노바이러스 복제의 임의의 허용 세포주(permissive cell line), 또는 기능적으로 결실된 유전자 외에도 CAR 또는 인테그린을 발현하도록 추가적이거나 또는 대안적으로 변형된 야생형 바이러스 복제의 허용 세포주가 아닌 세포주를 이용할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 제7 측면에 따른, 및 이의 증식에 적합한 박테리아 인공 염색체 (BAC)를 포함한 숙주세포를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 숙주세포는 박테리아, 가장 바람직하게는 E. 콜라이다. 적합한 예시는 E. 콜라이 균주 DH10B 및 SW102를 포함한다9.
본 발명의 제8 측면은, 그러므로, 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터를 생산하거나 생산이 가능한 세포주 또는 패키징 세포주를 제공한다.
패키징 세포 또는 세포주는 본 발명의 제1 측면의 바이러스 벡터를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 서열의 발현은 바이러스 벡터의 생성을 야기한다. 요구된 유전자들 중 일부는 제1 측면에 따른 바이러스 벡터를 이용한 세포 또는 세포주의 감염에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 바이러스 벡터로부터 결실되거나 기능적으로 결실된 임의의 유전자의 보충물을 포함한다. 바람직하게는, 세포는 HEK293 세포 또는 PER.C6® 세포이다.
단지 통상적 기술자의 편리를 위해, ChAdOx2-GFP를 함유한 박테리아 인공 염색체 (BAC)를 함유한 E. 콜라이 균주 스텔라의 시료를 Isis 이노베이션 리미티드(Isis Innovation Limited)에 의해 2016년 6월 13일에 영국, 솔즈베리 SP4 0JG, 포턴 다운, 헬스 프로텍션 에이전시, 헬스 프로텍션 에이전시 컬쳐 콜렉션(Health Protection Agency Culture Collections, Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, United Kingdom) 소재의 유럽 세포 배양물 콜렉션(European Collection of Cell Cultures, ECACC)에 부다페스트 조약하에 수탁하였고 임시 수탁번호(provisional accession no) 16061301로 지정되었다.
당 절차가 가능한 모든 지정국에 대해 및 해당 지정국의 법률하에서 법률적으로 허용되는 범위로, 기탁된 물질의 샘플은 관련 특허법 체계, 예를 들면, EPC 규칙 32조(1), 영국 특허 규칙 2007 규칙 13조(1) 및 별표 1, 오스트레일리아 특허 법령 제3.25조(3)호 및 기타 지정국의 일반적인 유사조항에 따라, 독립적인 전문가에게 이의 배포(issue)에 의해서만 이용 가능하게 될 것이 요구된다.
본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 벡터 ChAdOx2는 E1 영역의 결실, E3 영역의 결실, E4 영역의 변형 및 eGFP 모델 항원의 E1 좌위로의 삽입이 있는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터 유래된다. BAC을 함유한 E. 콜라이는 클래스 I의 유전적으로 변형된 유기체이다.
BAC은 복제 동안에 박테리아 내에서 증식하고 클로람페니콜(chloramphenicol)을 이용한 선택에 의해 유지될 수 있다. 박테리아 인공 염색체를 함유한 E. 콜라이 균주 SW102-게놈이 내부로 클로닝되는-는 12.5μg/mL의 클로람페니콜을 함유하는 루리아-베르타니 배지(Luria-Bertani broth) 또는 루리아-베르타니 한천(Luria-Bertani agar)에서, 32°C에서 증식할 수 있다. 게놈은, 본 명세서에서 기술되는 바와 같은, 표준 방법에 따라 E. 콜라이에서 유전 공학에 의해 변형되어, 예를 들어, eGFP를 대신하여 대안적인 재조합 항원을 삽입할 수 있다.
바이러스 게놈의 BAC 클론을 바이러스로 전환시키는 것 ("레스큐")은 하기의 단계에 의해 수행될 수 있다. E . 콜라이 숙주를 증식시키고 BAC DNA를 표준 방법에 따라 박테리아로부터 정제한다. DNA를 제한 내부핵산 가수분해 효소(restriction endonuclease) PacI로 선형화하고 HEK293 세포 (또는 유사한 E1 보충 세포주)로 형질주입한다. 생성되는 아데노바이러스를, 예를 들어, 백신으로 사용하기 위해 이어서 증식시킬 수 있고 정제할 수 있다. 이러한 시약 및 세포 모두는 공개적으로 입수 가능하다. 침전물이 회복(rescue)된 경우, 생성되는 바이러스는 클래스 I의 유전적으로 변형된 유기체가 될 것이다.
당 절차가 가능한 모든 지정국에 대해 및 해당 지정국의 법률하에서 법률적으로 허용되는 범위로, 기탁된 물질의 샘플은 관련 특허법 체계, 예를 들면, EPC 규칙 32조(1), 영국 특허 규칙 2007 규칙 13조(1) 및 별표 1, 오스트레일리아 특허 법령 제3.25조(3)호 및 기타 지정국의 일반적인 유사조항에 따라, 독립적인 전문가에게 이의 배포(issue)에 의해서만 이용 가능하게 될 것이 요구된다.
본 발명의 제4 측면의 특정 양태는 본 발명의 제1 측면에 따른 아데노바이러스 벡터를 암호화한 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 바이러스 벡터 ChAdOx2의 폴리뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO. 10)을 포함하거나 이로 구성된다.
ChAdOx2를 E. 콜라이 균주 스텔라에 함유된 BAC에, Isis 이노베이션 리미티드(Isis Innovation Limited)에 의해 2016년 6월 13일에 영국, 솔즈베리 SP4 0JG, 포턴 다운, 헬스 프로텍션 에이전시, 헬스 프로텍션 에이전시 컬쳐 콜렉션(Health Protection Agency Culture Collections, Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, United Kingdom) 소재의 유럽 세포 배양물 콜렉션(European Collection of Cell Cultures, ECACC)에 부다페스트 조약하에 수탁되었고 임시 수탁번호(provisional accession no) 16061301로 지정되었다. 수탁된 BAC는 항원 eGFP를 암호화한 전이 유전자를 추가로 포함한다. 본 발명의 이 관점에서, ChAdOx2에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 eGFP 항원을 암호화한 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스 벡터로 형질도입된 숙주세포를 제공하며, 상기 숙주세포는 바람직하게는 박테리움, 더욱 바람직하게는 ChAdOx2의 클로닝된 게놈을 함유한 박테리아 인공 염색체 (BAC)를 함유한 E.콜라이 균주 스텔라이며, 이는 Isis 이노베이션 리미티드(Isis Innovation Limited)에 의해 2016년 6월 13일에 영국, 솔즈베리 SP4 0JG, 포턴 다운, 헬스 프로텍션 에이전시, 헬스 프로텍션 에이전시 컬쳐 콜렉션(Health Protection Agency Culture Collections, Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, United Kingdom) 소재의 유럽 세포 배양물 콜렉션 (European Collection of Cell Cultures, ECACC)에 부다페스트 조약하에 수탁되었고 임시 수탁번호(provisional accession no) 16061301로 지정되었다. 수탁된 BAC는 항원 eGFP를 암호화한 전이 유전자를 추가로 포함한다. 본 발명의 이 관점에서, ChAdOx2에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 eGFP 항원을 암호화한 서열을 포함하지 않는다. 이러한 숙주세포는 BAC 증식에 사용될 수 있다.
본 발명의 제7 측면의 특정 양태는 본 발명의 제4 측면에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 박테리아 인공 염색체 (BAC) 클론을 제공하고, 상기 BAC는 ChAdOx2의 클로닝된 게놈을 함유한 BAC이며, E. 콜라이 균주 스텔라에 Isis 이노베이션 리미티드(Isis Innovation Limited)에 의해 2016년 6월 13일에 영국, 솔즈베리 SP4 0JG, 포턴 다운, 헬스 프로텍션 에이전시, 헬스 프로텍션 에이전시 컬쳐 콜렉션(Health Protection Agency Culture Collections, Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, United Kingdom) 소재의 유럽 세포 배양물 콜렉션 (European Collection of Cell Cultures, ECACC)에 부다페스트 조약하에 수탁되었고 임시 수탁번호(provisional accession no) 16061301로 지정되었다. 수탁된 BAC는 항원 eGFP를 암호화한 전이 유전자를 추가로 포함한다. 본 발명의 이 관점에서, ChAdOx2에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 eGFP 항원을 암호화한 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 추가의 측면은 사용을 위한 지시사항과 함께, 본 발명의 제1 측면에 따른 아데노바이러스 벡터, 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 면역원성 조성물을 포함한 키트를 제공한다.
키트는 아데노바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물을 개체에 투여하는 주사기와 같은 의료장비를 포함할 수 있다. 키트는 아데노바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물을 개체에 투여하기 위한 지시사항을 포함할 수 있고, 특정 투여량 지시사항을 포함할 수 있다. 키트는 면역반응을 유도하거나 강화함으로써 질병에 대비한 개체의 백신접종, 또는 다르게는 개체에서 질병의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.
혼선을 피하기 위해, 본 명세서에서 '바람직한', '바람직할 수 있는', "대안적인" 또는 그 밖의 유사한 것으로서 기술된 특징들이 본 발명에 별개로 또는 그렇게 기술된 임의의 하나 이상의 다른 특징들과 임의로 조합하여 존재할 수 있음 (문맥이 다르게 지시하지 않는 한)이 이로써 명백히 명시되었고, 이는 이러한 특징들의 조합의 명백한 개시를 구성한다.
상기에 기술된 각 양태의 모든 특징들은 본 발명의 모든 다른 양태에 준용하여 적용한다.
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예에 관하여 지금 더 기술될 것이다.
실시예 1
유인원 아데노바이러스 (Simian adenvorius , sAd ) 백신 벡터 설계 및 개발
백신으로서 사용하기 위한 sAd 벡터의 설계에서 주요 고려사항은 AdHu5에 대한 것과 유사하다. 백신 벡터는 비-복제성이어야 하며, 아데노바이러스 유전자 치료 벡터와 달리 사소한 면역 조절 활성(immune modulatory activity)을 가진다. 이 때문에, SAd 벡터는 바이러스 성장과 면역조절성 단백질 바이러스를 암호화한 E3 영역에 필수적인 바이러스 전사 활성 인자 단백질(viral transactivator protein)을 암호화한 E1 영역을 결핍한다.
박테리오파지 λ 레드 재조합 (재조합 유전공학) 기술에 결합된 박테리아 인공 염색체 (BAC)의 출현은 큰 바이러스 게놈의 조작을 용이하게 했다. 이 접근법을 이용하여, 비-인간 영장목(non-human primate)으로부터 분리된 선형 DNA 아데노바이러스 게놈을 바이러스 벡터로 사용하기 위해 클로닝하였다.
바이러스 분리 및 게놈 시퀀싱 후에 첫 번째 단계는 E1 영역 및 게놈의 우측 암(right arm)에 상동인 약 1000bp의 한 생성물-각각은 벡터 생성을 위한 게놈 절제(genome excision) 및 클로닝을 위한 고유한 제한 효소 부위를 혼입한-을 플랭킹한 게놈의 좌측 암(left arm)에 상동인 두 생성물의 증폭 또는 인공 합성 중 하나이다. 통상적인 제한 효소 클로닝에 의해, 이러한 단편을 조립하고 BAC에 삽입한다. 바이러스 게놈을 이어서 단일 단계 갭 수선 상동성 재조합(single step gap repair homologous recombination)에 의해 BAC 클론으로 삽입하고, E1 결실된 바이러스 벡터 분자 클론을 생성한다 (도 1a).
박테리오파지 λ 레드 재조합 (재조합 유전공학) 시스템을 이어서 이용하여 아데노바이러스 E3 면역 조절성 유전자의 심리스 결실(seamless deletion)을 허용한다. 첫째, 박테리아 갈락토키나아제 유전자 (GalK)를 이것이 E3 영역을 플랭킹한 ~50 bp의 상동성 암(homology arm)-이 유전자는 BAC 레스큐의 아데노바이러스 게놈(BAC rescued adenovirus genome)의 E3 좌위에서 λ 레드 재조합에 의해 삽입된다-을 함유하도록 플라스미드 pGalK로부터 증폭시킨다. 이 표현형이 GalK 유전자 생성물에 기인함에 따라, 클론을 갈락토오스 상에서 성장시키기 위해 스크리닝 한다. GalK 유전자를 이어서 λ 레드 제조합에 의해 E3 좌측 및 우측 플랭킹 영역으로만 구성된 PCR 생성물을 이용하여 제거한다 (도 1b).
양성 클론을 GalK 유전자를 발현하는 박테리아의 성장을 예방하는 2-데옥시갈락토오스 배지 상에서 선택한다. λ 레드 재조합을 먼저 이용하여 GalK 유전자를 삽입한 다음, 이를 E1 좌위에서 항원 발현 카세트(antigen expression cassette)로 교환하는 추가의 조작은 백신 벡터의 조작을 완료한다 (도 1c).
선형 바이러스 게놈을 BAC으로부터 고유한 재조합 유전자, 대개 PacI 또는 PmeI를 이용하여 절제하고 보충 세포로 형질주입하여 바이러스 벡터를 생성한다. 항원 카세트는 전형적으로 항원 발현을 유도하기 위한 최소 CMV 즉시 초기 프로모터(minimal CMV immediate early promoter)와 같은 강력한 프로모터, 관심있는 항원 및 폴리 아데닐화 신호로 이루어진다.
본 발명의 발명자는, 우리의 ChAd 유래의 백신 벡터로 E1 좌위 및/또는 E3 좌위에서, 박테리오파지 λ로부터 유래된 attR1 및 attR2와 같은 특이 재조합 서열에 의해 플랭킹된 박테리아 항생제 저항성 유전자를 발현하는 공통 카세트(universal cassette)를 삽입함으로써, ChAd 게놈 내의 설정 영역(set region)으로 임의의 유전자의 용이한 삽입을 허용한 분자 툴박스(molecular toolbox)를 생성하였다(이 시스템이 인비트로젠의 게이트웨이 클로닝 시스템에 기초함에 유의한다). 게놈 (예를 들어, attR1/R2 재조합 서열이 재조합 서열을 요구한다)에 존재하는 이들과 쌍을 형성한 특이 재조합 부위에 의해 플랭킹된 항원 발현 카세트를 함유한 셔틀 플라스미드는 박테리오파지 λ 통합효소, 통합 숙주 인자(integration host factor) 및 절제효소(excisionase)를 함유한 효소 혼합물의 존재 하에 부위 특이 재조합을 허용한다. (도 2).
SAd로부터 결실된 E1 영역은 인간 배아 신장 (human embryonic kidney, HEK) 293 세포 또는 PerC.6 세포에 의해 본질적으로 발현된 AdHu5 E1 단백질에 의해 보충되나, 바이러스 수득률은 SAd 형청형에 따라 달라진다. 모두가 침팬지로부터 유래된 Pan5, Pan6 및 Pan7의 높은 수득률은 ChAd1 수득률이 저조한 HEK293 세포로부터 수득할 수 있다. 복제가 저조한 바이러스 벡터에 대해, 추가의 게놈 조작이 수득률을 증가시키는 것을 보였다. AdHu5의 경우에, E4 유전자 생성물, 특히 orf3, orf4, orf6 및 orf6/7로부터의 생성물은 E1 단백질 (E1A 및 E1B 55K)과의 이들의 기능 및 숙주세포 공동인자(host cell cofactor)을 조정하여 바이러스 증식 동안에 일부 세포 기능을 결합하고, 조절하며, 탈억제(de-repression)한다. E4 영역의 조절은 그러므로, 바이러스 수득률을 증가시키는 것의 유망한 수단이 될 수 있다.
특허 공보 WO 제2012/172277호에서, 본 발명의 발명자는, 고유의 E4 orf4 orf6 및 orf6/7 유전자를 AdHu5로부터의 이들로 교환하기 위해 λ 레드 재조합에 의해 조작된 ChAd 혈청형 Y25로부터 유래된 키메라 백신 벡터(chimeric vaccine vector) ChAdOx1의 생성을 기술하였다. 이 벡터는, ChAd 모바이러스(parent virus)에 비해, HEK 293 세포로부터 헥손 단백질 생성의 증가를 보였다. 이 접근법을 이용하여, 본 발명의 발명자는 본 발명에 따른 신규한 아데노바이러스 벡터 ChAdOx2-ChAd68 (Pan6와 sAd25로도 지칭됨)로부터 유래된 E1/E3이 결실된 백신 벡터로, Y25로부터의 E4 orf1, orf2 및 orf3와 AdHu5로부터의 E4 orf4, orf6 및 orf6/7를 함유하여 HEK 293 세포에서 바이러스 수득률을 증가시킴-를 이제 생성하였다 (Fig 3).
면역원성을 개선하기 위한 SAd 벡터 조작
모기원(parental origin)에 상관없이, 아데노바이러스 백신 벡터는 투여 경로에 따라 체액성, 점막성 및 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러나, 유발된 T-세포 및 B-세포 반응이 대부분의 벡터에 좋지만, 면역원성 효능(immunological potency)의 수준은 아데노바이러스 벡터 모균주(parental strain)/모혈청형(parental serotype)에 따라 상이할 수 있다10 , 11. 예를 들어, E1 좌위에서 GFP 발현 카세트를 지니는 두 개의 유인원 벡터 ChAdOx1 (Y25로부터 유래되고 국제특허공보 WO 제2012/172277호에 기술된) 및 ChAdOx2 (C68로부터 유래된, 본 발명에 따른)를 비교한 경우, GFP에 대해 유발된 T-세포 반응은 ChAdOx2가 현저히 높았다 (도 4).
실시예 2: 후보 미코박테리움 아비움 아종 파라튜버큘로시스 (MAP) 백신 ChAdOx2 HAV의 I기 임상 시험의 결과
I기 임상 시험을 개시하여, 건강한 성인 지원자에서 후보 미코박테리움 아비 움 아종 파라튜버큘로시스 (MAP) 백신 ChAdOx2 HAV의 안정성 및 면역원성을 결정하였다. 상기 백신은 캐틀(cattle)에서 요네병의 원인 물질인 미코박테리움 아비움 아종 파라튜버큘로시스 (MAP)의 항원을 함유하고 인간에서 크론병에 연관되어있다.
20명의 지원자를 스크리닝하였다. 이들 중 13명이 연구에 참가할 자격이 있는 것으로 간주되었다. 1명의 지원자가 등록 전에 철회하였다. 9명의 참가자들이 이들의 ChAdOx2 HAV의 단일 투여를 받았다. 도 5는 연구 그룹 (표 1) 및 등록자의 동향을 나타낸다 [표 2, 완료된 추적 검사(follow-up) 방문은 음영처리됨]:
도 6 내지 도 11은 상이한 용량 그룹에서 부작용(adverse event, AE)을 보이는 지원자의 비율을 나타낸다. 이러한 도면에서 볼 수 있는 백신은 안전하고 내약성이 좋다(well tolerated). ChAdOx2 HAV에 관련된 중증도 또는 심각한 AE는 없었다. 도 6은 ChAdOx2 HAV (5 x 109 vp)의 단일 투여 후에 국소적 AE를 나타내는 지원자의 비율을 보인다. 도 7은 ChAdOx2 HAV (5 x 109 vp)의 단일 투여 후에 전신적 AE를 나타내는 지원자의 비율을 보인다. 도 8은 ChAdOx2 HAV (2.5 x 1010 vp)의 단일 투여 후에 국소적 AE를 나타내는 지원자의 비율을 보인다. 도 9는 ChAdOx2 HAV (2.5 x 1010 vp)의 단일 투여 후에 전신적 AE를 나타내는 지원자의 비율을 보인다. 도 10은 ChAdOx2 HAV (5 x 1010 vp)의 단일 투여 후에 국소적 AE를 나타내는 지원자의 비율을 보인다. 도 11은 ChAdOx2 HAV (5 x 1010 vp)의 단일 투여 후에 전신적 AE를 나타내는 지원자의 비율을 보인다.
인간에서 ChAdOx2 HAV을 이용한 백신 접종에 대한 반응을, HAV 백신 제작물을 포괄하는(spanning) 펩티드의 풀(pool of peptide)로 자극된 신선하게 분리된 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)을 이용한 인터페론 감마 ELISPOT 검정(interferon-gamma ELISPOT assay)을 이용하여 평가하였다. 백신 접종 전에(0 일), 백신 접종 후 1달 및 백신 접종 후 2달(28일 및 56일)에 검정을 수행하였다.
백신 접종 전에 HAV 항원에 대한 반응은 백만 PBMC 당 104 (spot-forming cell, SFC)의 중앙 반응(median response)으로 저조했었으며, 이는 모든 용량 그룹에 걸쳐 평균 잡은 28일에서 331 SFC의 중앙값으로 증가된다 (도 12). 반응은 28일에 2.5x1010 v.p.로 예방 접종된 참가자에서 5x109 v.p로 예방 접종된 참가자 보다 높았었다 [p<0.05, 던의 다중 비교 검정(Dunn's multiple comparison test)을 이용한 크루스칼-왈리스 검정(Kruskall-Wallis test)]. 개별적인 반응을 표로 나타낸다, 도 13을 참고한다.
실시예 3: ChAdOx2 RabGP로 백신 접종한 마우스에서 항체 반응
광견병 바이러스 당단백질 암호화 서열 [RabGP; ERA 균주; 젠뱅크 수탁 번호(Genbank accession number) AJ489620.1]을 Hildegund Ertl (위스타 인스티튜트(Wistar Institute))가 기꺼이 공급한 플라스미드로부터 Acc65I 및 NotI 제한 효소 부위를 플랭킹한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 이러한 효소를 이용한 절단 후에, 게이트웨이® 재조합 카세트에 의해 플랭킹되고 인트론 A를 포함한 인간 거대세포 바이러스 주요 즉시 초기 프로모터 (IE CMV)를 제공한 유사하게 절단된 pENTR4 플라스미드로 단편을 클로닝하였다. 게이트웨이 LR 재조합 클로닝 [라이프 테크놀러지스(Life Technologies)]를 이용하여 전이 유전자 카세트를 ChAdOx2 데스티네이션 벡터내 E1-상동성 부위로 전달하여 pBAC ChAdOx2 LPTOS RabGP ERA를 생성하였다.
ChAdOx2 RabGP 데스티네이션 플라스미드의 효소 선형화(enzymatic linearization) 및 HEK293A 세포(인비트로젠, Cat. R705-07)로 형질주입 후에, 생성되는 바이러스를 CsCl 기울기 초원심분리(CsCl gradient ultracentrifugation)에 의해 정제하였다. 역가를 퀵 타이터™ 아데노바이러스 역가 면역 검정 키트 (셀 바이오랩스 Inc)[QuickTiter™ Adenovirus Titer Immunoassay kit (Cell Biolabs Inc)]에 기초한 항-헥손 면역염색 검정(immunostaining assay)을 이용하여 HEK293A 세포 상에서 결정하였다.
데스티네이션 벡터 구조는 도 14에 나타난다. 광견병 당단백질의 아미노산 서열이 SEQ ID NO. 21에 제공된다.
백신을 투여 전에 PBS에서 희석하였고, 일부 경우에서, 스쿠알렌 수중유형 아쥬반트 (애다백스, 시그마)로 혼합하였다. 6주 된 암컷 CD1 이종 교배된 마우스를 다음의 제제로 예방 접종하였고 (n=6 마우스/그룹), 모두 각 비복근(gastrocnemius)으로 근육내로 주어졌다.
A: ChAdOx2-RabGP, 1e8 감염성 단위(infectivity unit, IU)
B: ChAdOx2-RabGP, 1e7 IU
C: ChAdOx2-RabGP, 1e6 IU
D: ChAdOx2-RabGP, with Addavax, 1e8 IU
E: ChAdOx2-RabGP, with Addavax, 1e7 IU
F: ChAdOx2-RabGP, with Addavax, 1e6 IU
예방 접종 28일 후에, 혈청을 수집하였고, 항체 역가를 재조합 광견병 당단백질 (막 관통 도메인을 결핍하고, C-말단의 C-태그가 있는, 및 C-태그 친화성 수지 [써모피셔]를 이용해 정제된 SAD B19 균주)에 대한 ELISA로 평가하였다. 결과를 양성 대조 시료의 연속 희석(dilution series) / 표준 곡선(standard curve)에 관한 임의 단위로 나타내었고, 분석 전에 log10 변환하였다.
백신은 상승하는 백신 투여 및 애다백스와의 공동 제제(co-formulation)와 관련된 항체 역가의 통계적으로 현저한 향상이 있는 광견병 당단백질에 대한 ELISA-검출 가능한 항체를 유도하였다. 도 15는 아쥬반트가 있는 및 없는 투여 범위에서 ChAdOx2 RabGP를 이용한 백신 접종된 마우스에서 항체 반응을 나타낸다 (A그룹-F그룹). 투여의 효과에 대한 p=0.004 및 아쥬반트 공동 제제의 효과에 대한 p=0.03, A그룹-F그룹에 걸친 이원 ANOVA.
동일한 항원 삽입물을 가진 ChAdOx2 백신 제작물과 AdC68 백신 제작물의 면역원성의 비교를 하였다. AdC68는 Xiang et al., Novel, Chimpanzee Serotype 68-based Adenoviral Vaccine Carrier for Induction of Antibodies to a Transgene Product, Journal of Virology, 76 (6), pp2667-2675에 기술된 바와 같이, 위스타 인스티튜트의 Hildegund Ertl의 친절한 선물이었다. 놀랍게도, ChAdOx2 백신 제작물은 도 16에서 나타난 AdC68 백신 보다 더 높은 면역원성을 갖는 것으로 발견되었다.
참고문헌
1. Buchbinder et al, Lancet, Vol 372, Nov 2008
2. Farina et al, J. Virol, Dec 2001, p11603-11613
3. Dudareva et al, Vaccine 27, 2009, 3501-3504
4. R. Wigand et al, Intervirology, Vol30; 1 1989
5. Roy et al, Hum. Gen. Ther., 2004, 15:519-530
6. Warming et al. Nuc. Acid. Res, 2005, Vol33;4
7. http://www.invitrogen.com/gateway
8. Havenga et al, J.G.V., 2006, 87, 2135-214
9. Warming, S. et al. Nucleic Acids Res, 2005, Feb 24; 33(4): e36
10. Colloca, S., et al., Sci Transl Med, 2012. 4(115): p. 115ra2.
11. Quinn, K.M., et al. J Immunol, 2013. 190(6): p. 2720-35.
시퀀스 리스트
Figure pct00001
유럽 세포 배양물 콜렉션 (ECACC) 16061301 20160613

Claims (30)

  1. AdHu5와 AdY25 외의 아데노바이러스의 게놈(genome)을 포함한 아데노바이러스 벡터로서, 상기 벡터가 아데노바이러스의 고유의(native) E4 좌위를 결핍하고 AdY25로부터의 비상동성 E4Orf1, E4Orf2 및 E4Orf3 암호화 영역을 포함하도록 상기 아데노바이러스의 게놈이 변형된 것인, 아데노바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 벡터는 상기 아데노바이러스의 E4 좌위 내 AdHu5로부터의 비상동성 E4Orf4, E4Orf6 및 E4Orf6/7 암호화 영역을 더 포함하는, 아데노바이러스 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 아데노바이러스는 C68인 것인, 아데노바이러스 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터는 기능성 E1 좌위 (functional E1 locus)를 결핍한 것인, 아데노바이러스 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터는 E3 좌위를 결핍한 것인, 아데노바이러스 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 캡시드 단백질(capsid protein)을 포함하는 것인, 아데노바이러스 벡터:
    (a) SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 18315 내지 21116에 대응하는 암호화 서열, 또는 실질적으로 이와 동일한 서열에 의해 암호화된 헥손 단백질(hexon protein);
    (b) SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 13884 내지 15488에 대응하는 암호화 서열, 또는 실질적으로 이와 동일한 서열에 의해 암호화된 펜톤 단백질; 및
    (c) SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 32134 내지 33411에 대응하는 암호화 서열, 또는 실질적으로 이와 동일한 서열에 의해 암호화된 섬유 단백질(fibre protein).
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는, 관심있는 외인성 뉴클레오티드 서열(exogenous nucleotide sequence of interest)을 더 포함하는, 아데노바이러스 벡터.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 단백질 또는 폴리펩티드는 항원, 분자 아쥬반트(molecular adjuvant), 면역자극성 단백질(immunostimulatory protein) 및 재조합효소(recombinase)를 포함한 군으로부터 선택된 것인, 아데노바이러스 벡터.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항원은 병원체 유래의 항원(pathogen-derived antigen)인 것인, 아데노바이러스 벡터.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 병원체는 M. 튜버큘로시스 (M. tuberculosis), 플라스모디움 sp (Plasmodium sp ), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), HIV, C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus), 거대세포 바이러스( Cytomegalovirus ), 인간 유두종 바이러스(Human papilloma virus), 광견병 바이러스(rabies virus), 홍역 바이러스(measles virus), 유행성 이하선염(mumps), 풍진(rubella), 지카 바이러스(zika virus), 리슈만 기생충(leishmania parasite) 및 미코박테리움 sp . (Mycobacterium sp.) 로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 아데노바이러스 벡터.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 항원은 미코박테리움 아비움 아종(subspecies) 파라튜버큘로시스 (Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, MAP)로부터 기인된 것인, 아데노바이러스 벡터.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 항원은 광견병 바이러스 당단백질(rabies virus glycoprotein)인 것인, 아데노바이러스 벡터.
  13. 제7항에 있어서,
    상기 관심있는 외인성 뉴클레오티드 서열은 miRNA 또는 면역자극성 RNA 서열(immunostimulatory RNA sequence)인 것인, 아데노바이러스 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 아데노바이러스 벡터를 포함하고, 임의로 하나 이상의 추가의 활성 성분, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 아쥬반트를 포함하는, 면역원성 조성물 (immunogenic composition).
  15. 제14항에 있어서,
    약제로 사용하기 위한 것인, 면역원성 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 결핵(tuberculosis) 및 요네병(Johne's disease), 크론병(Crohn's disease), 말라리아, 인플루엔자, HIV/AIDS, C형 간염 바이러스 감염, 거대세포 바이러스 감염, 인간 유두종 바이러스 감염, 아데노바이러스 감염, 리슈만편모충증(leishmaniasis), 스트렙토코커스 spp . (streptococcus spp .) 감염, 스타필로코커스 spp .(staphylococcus spp.) 감염, 메닝고코커스 spp . ( meningococcus spp .) 감염, 구제역(foot and mouth disease), 치쿤구니야 바이러스 감염(chikungunya virus infection), 지카 바이러스 감염, 광견병, 크림 콩고 출혈열(Crimean Congo haemorrhagic fever), 에볼라 바이러스 감염, 마르부르크(Marburg), 라사열(Lassa fever), 메르스 및 사스 코로나바이러스 질병, 니파(Nipah) 및 리프트 밸리 열(Rift Valley fever), 및 치쿤구니야(Chikungunya)를 비롯한 다른 미코박테리아 감염을 포함한 군으로부터 선택된 질병 치료에 사용하기 위한 것인, 면역원성 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    상기 질병은 결핵 및 다른 미코박테리아 감염, 및 광견병으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 면역원성 조성물.
  18. 제15항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사용은 숙주세포로 전이 유전자(transgene)를 전달하는 것을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  19. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사용은 동물에서 면역 반응을 유발하는 것을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  20. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사용은 동물에서 면역 반응을 증대시키는 것을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  21. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사용은 적어도 하나의 질병을 치료하거나 예방하는 것을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  22. 제15항에 있어서,
    상기 사용은 자가-항원에 대한 내성(tolerance)을 파괴할 동물에서 면역 반응을 유도하는 것을 포함한 것인, 면역원성 조성물.
  23. 제15항에 있어서,
    상기 사용은 유전자 치료를 포함한 것인, 면역원성 조성물.
  24. 제1항 내지 13항 중 어느 한 항에 기재된 아데노바이러스 벡터를 암호화한 폴리뉴클레오티드 서열.
  25. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 아데노바이러스 벡터로 형질 도입된 숙주세포.
  26. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 아데노바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 제24항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 박테리아 인공 염색체(Bacterial Artificial Chromosome, BAC)로 혼입시켜(incorporating) Ad-BAC 벡터를 생산하는 단계를 포함하는, 아데노바이러스 벡터를 생산하는 방법.
  27. 제24항에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론.
  28. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 바이러스 벡터를 생산하는 패키징 세포주(packaging cell line).
  29. 제28항에 있어서,
    상기 세포는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 바이러스 벡터에서 기능적으로 결실된 임의의 유전자의 보충물을 포함하는 것인, 패키징 세포주.
  30. (i) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 아데노바이러스 벡터 또는 제14항에 기재된 면역원성 조성물, 및 (ii) 사용을 위한 지침서를 포함한, 키트.
KR1020197002318A 2016-06-23 2017-06-23 아데노바이러스 벡터 KR102205908B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1610967.0 2016-06-23
GB1610967.0A GB2549809C (en) 2016-06-23 2016-06-23 Vector
PCT/GB2017/051851 WO2017221031A1 (en) 2016-06-23 2017-06-23 Adenoviral vector

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190020131A true KR20190020131A (ko) 2019-02-27
KR102205908B1 KR102205908B1 (ko) 2021-01-22

Family

ID=56891578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197002318A KR102205908B1 (ko) 2016-06-23 2017-06-23 아데노바이러스 벡터

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11306325B2 (ko)
EP (2) EP3943604A1 (ko)
JP (2) JP7187451B2 (ko)
KR (1) KR102205908B1 (ko)
CN (1) CN109790548B (ko)
AU (1) AU2017282102B2 (ko)
CA (1) CA3027686A1 (ko)
DK (1) DK3475433T3 (ko)
ES (1) ES2883354T3 (ko)
GB (1) GB2549809C (ko)
MX (1) MX2018016074A (ko)
SG (1) SG11201811178UA (ko)
WO (1) WO2017221031A1 (ko)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2971008B1 (en) 2013-03-14 2018-07-25 Salk Institute for Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
JP7015551B2 (ja) 2016-02-23 2022-02-15 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ ウイルス動態への影響を最小限にするための治療用アデノウイルスにおける外因性遺伝子発現
JP7054527B2 (ja) 2016-02-23 2022-04-14 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ アデノウイルスの複製動態を測定するための高スループットアッセイ
GB2549809C (en) 2016-06-23 2022-11-30 Univ Oxford Innovation Ltd Vector
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
BR112020019942A2 (pt) * 2018-04-09 2021-01-26 Salk Institute For Biological Studies composições de adenovírus oncolítico com propriedades de replicação aprimoradas
GB201812647D0 (en) 2018-08-03 2018-09-19 Chancellor Masters And Scholars Of The Univ Of Oxford Viral vectors and methods for the prevention or treatment of cancer
GB201814141D0 (en) * 2018-08-30 2018-10-17 Univ Oxford Innovation Ltd Method and compositions for producing a virus
GB201818084D0 (en) 2018-11-06 2018-12-19 Univ Oxford Innovation Ltd Compositions and methods
CN109602901B (zh) * 2019-01-08 2022-05-27 成都迈科康生物科技有限公司 一种带状疱疹病毒疫苗及其制备方法和应用
CA3140019A1 (en) * 2019-05-30 2020-12-03 Gritstone Bio, Inc. Modified adenoviruses
KR20220074917A (ko) 2019-09-30 2022-06-03 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Hbv 백신 및 hbv를 치료하는 방법
CN113088538A (zh) * 2020-01-08 2021-07-09 怡道生物科技(苏州)有限公司 一种基于黑猩猩ChAd3型腺病毒的表达载体及其构建方法
CN113088530A (zh) * 2020-01-08 2021-07-09 怡道生物科技(苏州)有限公司 一种基于黑猩猩ChAd63型腺病毒的表达载体及其构建方法
WO2021158815A1 (en) * 2020-02-05 2021-08-12 New York Blood Center, Inc. Zika virus immunogenic compositions
US12023376B1 (en) 2020-04-17 2024-07-02 Triad National Security, Llc Conserved region T cell vaccines for coronavirus and methods of use
RU2720614C9 (ru) * 2020-04-23 2021-02-09 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)
CN114845733A (zh) * 2020-08-22 2022-08-02 俄罗斯联邦卫生部的联邦国家预算机构“以名誉院士N.F.加马列亚命名的国家流行病学和微生物学研究中心” 抗严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的表达载体
WO2022122036A1 (zh) * 2020-12-10 2022-06-16 武汉博沃生物科技有限公司 一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用
CN112552380B (zh) * 2020-12-10 2021-12-24 武汉博沃生物科技有限公司 一种SARS-CoV-2病毒的免疫原及其应用
CN112831524B (zh) * 2021-02-20 2023-06-13 苏州相奕生物技术有限公司 人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用
CN116103242A (zh) * 2023-01-10 2023-05-12 潍坊医学院 一种靶向治疗结核病的esat6-car-t及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012172277A1 (en) * 2011-05-25 2012-12-20 Isis Innovation Limited Simian adenovirus and hybrid adenoviral vectors

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE449105T1 (de) * 2004-01-23 2009-12-15 Angeletti P Ist Richerche Bio Impfstoffträger für schimpansen-adenovirus
AU2010209938A1 (en) * 2009-02-02 2011-08-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
CA2851251C (en) * 2011-10-05 2023-09-12 Genvec, Inc. Simian (gorilla) adenovirus or adenoviral vectors and methods of use
GB201318084D0 (en) * 2013-10-11 2013-11-27 Isis Innovation Malaria vaccination
BR112016008806A2 (pt) 2013-11-01 2017-10-03 Pfizer Vetores para expressão de antígenos associados à próstata
GB201413530D0 (en) * 2014-07-30 2014-09-10 Isis Innovation Treatment and prevention of malaria
GB2549809C (en) 2016-06-23 2022-11-30 Univ Oxford Innovation Ltd Vector

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012172277A1 (en) * 2011-05-25 2012-12-20 Isis Innovation Limited Simian adenovirus and hybrid adenoviral vectors

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PLOS ONE, Vol. 7, No, 7, e40385. *

Also Published As

Publication number Publication date
US11306325B2 (en) 2022-04-19
ES2883354T3 (es) 2021-12-07
CA3027686A1 (en) 2017-12-28
CN109790548A (zh) 2019-05-21
EP3475433B1 (en) 2021-07-21
WO2017221031A1 (en) 2017-12-28
US20220220507A1 (en) 2022-07-14
EP3475433B9 (en) 2022-08-24
JP2019519252A (ja) 2019-07-11
EP3943604A1 (en) 2022-01-26
AU2017282102A1 (en) 2019-01-03
JP7333857B2 (ja) 2023-08-25
US20190175716A1 (en) 2019-06-13
GB2549809C (en) 2022-11-30
GB2549809B (en) 2019-04-03
AU2017282102B2 (en) 2023-03-23
JP7187451B2 (ja) 2022-12-12
GB201610967D0 (en) 2016-08-10
DK3475433T3 (da) 2021-08-16
MX2018016074A (es) 2019-09-09
EP3475433A1 (en) 2019-05-01
SG11201811178UA (en) 2019-01-30
US11970709B2 (en) 2024-04-30
JP2022159418A (ja) 2022-10-17
KR102205908B1 (ko) 2021-01-22
CN109790548B (zh) 2024-03-22
GB2549809A (en) 2017-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11970709B2 (en) Adenoviral vector
US11857640B2 (en) Simian adenovirus and hybrid adenoviral vectors
EP0736100B1 (en) Recombinant protein production in bovine adenovirus expression vector system
AU2012270144A1 (en) Simian adenovirus and hybrid adenoviral vectors
US9750801B2 (en) Replicating recombinant adenovirus vectors, compositions, and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right