EA015013B1 - Рекомбинантный вирус сендай с ослабленной способностью к репликации, предназначенный для использования в качестве вакцин - Google Patents
Рекомбинантный вирус сендай с ослабленной способностью к репликации, предназначенный для использования в качестве вакцин Download PDFInfo
- Publication number
- EA015013B1 EA015013B1 EA200701695A EA200701695A EA015013B1 EA 015013 B1 EA015013 B1 EA 015013B1 EA 200701695 A EA200701695 A EA 200701695A EA 200701695 A EA200701695 A EA 200701695A EA 015013 B1 EA015013 B1 EA 015013B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cell
- cells
- virus
- sendai virus
- protein
- Prior art date
Links
- 230000010076 replication Effects 0.000 title claims abstract description 59
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 39
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 139
- 230000002950 deficient Effects 0.000 title abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 140
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 70
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 269
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 68
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 52
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 52
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 claims description 48
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 34
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 33
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 20
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 20
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 17
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 claims description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 11
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 8
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 3
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 claims description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 2
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 claims 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 abstract description 25
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 abstract description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 61
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 46
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 30
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 28
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 24
- 108010015724 Prephenate Dehydratase Proteins 0.000 description 20
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 11
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 7
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 6
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 5
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 4
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 4
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 3
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 101000836268 Homo sapiens U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 3
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102100027244 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 2
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000712003 Human respirovirus 3 Species 0.000 description 2
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 2
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000006790 cellular biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- -1 etc. Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 102100033680 Bombesin receptor-activated protein C6orf89 Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000712005 Bovine respirovirus 3 Species 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 241000353621 Eilat virus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000658547 Escherichia coli (strain K12) Type I restriction enzyme EcoKI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000658543 Escherichia coli Type I restriction enzyme EcoAI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000658546 Escherichia coli Type I restriction enzyme EcoEI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000658530 Escherichia coli Type I restriction enzyme EcoR124II endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000658540 Escherichia coli Type I restriction enzyme EcoprrI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000658545 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Type I restriction enyme HindI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 102100036284 Hepcidin Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000984746 Homo sapiens BRCA1-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 101000944524 Homo sapiens Bombesin receptor-activated protein C6orf89 Proteins 0.000 description 1
- 101001021253 Homo sapiens Hepcidin Proteins 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 101150062031 L gene Proteins 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101000658548 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) Putative type I restriction enzyme MjaIXP endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000658542 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) Putative type I restriction enzyme MjaVIIIP endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000658529 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) Putative type I restriction enzyme MjaVIIP endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 101100269523 Mus musculus Akap8l gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101001042773 Staphylococcus aureus (strain COL) Type I restriction enzyme SauCOLORF180P endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000838760 Staphylococcus aureus (strain MRSA252) Type I restriction enzyme SauMRSORF196P endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000838761 Staphylococcus aureus (strain MSSA476) Type I restriction enzyme SauMSSORF170P endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000838758 Staphylococcus aureus (strain MW2) Type I restriction enzyme SauMW2ORF169P endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101001042566 Staphylococcus aureus (strain Mu50 / ATCC 700699) Type I restriction enzyme SauMu50ORF195P endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000838763 Staphylococcus aureus (strain N315) Type I restriction enzyme SauN315I endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000838759 Staphylococcus epidermidis (strain ATCC 35984 / RP62A) Type I restriction enzyme SepRPIP endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000838756 Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus (strain ATCC 15305 / DSM 20229 / NCIMB 8711 / NCTC 7292 / S-41) Type I restriction enzyme SsaAORF53P endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 229960003127 rabies vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 229940031418 trivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002966 varnish Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 238000000316 virotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18811—Sendai virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к рекомбинантному вирусу Сендай, обладающему ослабленной способностью к репликации генома и способного к транскрипции, который можно использовать для экспрессии трансгенов и, в частности, для разработки вакцин. Вирусный геном содержит мутацию в гене Р.
Description
Изобретение относится к имеющему ослабленную способность к репликации и обладающему транскрипционной активностью рекомбинантному вирусу Сендай с РНК с негативной цепью, который может использоваться для экспрессии трансгенов и, в частности, в области разработки вакцин.
Иммунизация живыми вакцинами аналогична естественной инфекции и вызывает универсальный иммунный ответ. При вакцинации используют ослабленные, но способные к размножению вирусы. Размножение вирусов должно происходить настолько медленно, что гарантируются иммунологический ответ и, тем самым, контролирование размножения или уничтожение вируса. Концепция живой вакцины многократно подтвердилась на различных возрастных группах. Правда, имеются важные целевые группы, иммунизация которых живыми вакцинами проблематична и требует дополнительных мер предосторожности. Материнские антитела защищают новорожденных в первые месяцы жизни. Одновременно они создают барьер, который должен быть преодолен при иммунизации живой вакциной, но чтобы при этом, с другой стороны, не наблюдалось излишнего размножения вируса вакцины и связанных с этим отрицательных последствий вакцинации. Другой целевой группой являются пожилые люди, иммунная система которых уже не настолько сильна, поэтому могут проявиться перегрузка в результате вакцинации и отрицательные последствия вакцинации из-за усиленного размножения вируса вакцины. Таким образом, существует проблема сделать иммунологически отличную живую вакцинацию еще надежнее для применения на определенных целевых группах, а также повысить профиль надежности для общего ее применения.
Вирусы с РНК с негативной цепью, как например, вирус бешенства или вирус Сендай (8еУ), уже на протяжении нескольких последних лет целенаправленно подвергают модификациям с помощью генной инженерии. ЕР-А-0702085 описывает приготовление рекомбинантных, инфекционных, воспроизводящихся несегментированных вирусов с РНК с негативной цепью из клонированной кДНК. ЕР-А-0863202 описывает рекомбинантный вирус Сендай, в геноме которого есть внедренный чужеродный ген или же один ген удален или инактивирован, но репликация такого генома еще не нарушена.
В качестве основы вакцины особенно пригодны вирусы с РНК с негативной цепью, так как их размножение происходит в цитоплазме и гены внутри генома вируса могут легко обмениваться. Так, уже удалось успешно получить рекомбинантные вирусы с поверхностными белками различных типов вирусов и использовать их в качестве вакцины в опытах с животными (8е1ишб1 е! а1., 1. У1го1. 75 (2001), 45944603 и АО 01/42445). Путем рекомбинантного встраивания Е- и ΗΝ-белков человеческого парагриппозного вируса типа 3 (11Р1У 3) и О- или Е-белков респираторного синциального вируса (Р8У) в вектор на основе коровьего парагриппозного вируса типа 3 (ЬР1У 3) удалось выявить при применении на хомяках мукозный иммунный ответ на 11Р1У 3 и К8У. Бивалентная антигенность этой испытанной в опытах с животными живой вакцины, таким образом, уже достигнута.
Из-за включения видовых барьеров коровий парагриппозный вирус должен быть достаточно разбавлен поверхностными антигенами человеческого РГУ 3 и К8У для того, чтобы быть использованным на человеке. Мутации по отношению к исходному виду ожидать не следует, так как все гены для вирусных поверхностных белков подверглись обмену. Уже начали клинические испытания вакцины.
Поскольку описанные мутанты вируса обладают способностью к репликации, в подвергнувшемся вакцинации наверняка происходит размножение вируса, которое хотя и ослаблено в результате модификации вируса, но все-таки не исключено полностью. Интенсивность ожидаемой вирусемии, а одновременно и проявление у вакцинированного побочных эффектов зависят при этом от индивидуальных факторов.
В рамках настоящего изобретения сделана попытка существенно уменьшить отрицательные последствия вакцинации живыми вакцинами, в частности отрицательные последствия для вакцинированных из определенных целевых групп.
Подход к этому заключается в подавлении репликации вирусного генома после введения вакцины. С помощью этого можно, независимо от иммунологической реакции вакцинированного, исключить размножение вируса и соответствующие вредные последствия вакцинации.
При таком подходе главная трудность заключается в том, что вирусная РНК-полимераза выполняет две функции, а именно синтеза вирусной мРНК и размножения вирусного генома. Эта двойственность в новой вакцине должна быть устранена, так как вакцина должна быть в состоянии только лишь осуществлять синтез вирусной мРНК.
Другая проблема заключается в том, что рекомбинантный вирус должен обладать способностью к эффективному синтезу вирусной мРНК, чтобы вообще быть пригодным в качестве живой вакцины. Таким образом, имеются два принципиально противоречащих друг другу требования, которые дают основание для значительных трудностей при приготовлении надежной и эффективной живой вакцины на основе вирусов с РНК с негативной цепью.
81ιο)ί е! а1. (Упо1оду 318 (2004), 295-305) описывают приготовление не имеющего Р-гена вируса бешенства и приводят его характеристику. Получают этот вирус с помощью вспомогательных клеток с экспрессией Р-белка. Вирусы без бе/иоуо/синтеза Р-белка в состоянии осуществлять только первичную транскрипцию. Слабая вирусная экспрессия генов проявляется в очень слабом сигнале для Ν-белка в иммунной флюоресценции и только лишь у очень небольшого количества клеток, более убедительное
- 1 015013 доказательство этой слабой вирусной экспрессии генов получают лишь методом РСК. Использование этого мутанта вируса в опыте по заражению в модели на мышах имело целью обнаружение защиты, правда отсутствует контрольный эксперимент с неактивным в отношении транскрипции вирусом и интервал для вирусного заражения слишком короток. Продолжительность предполагаемой защиты не исследовалась. Использование таких вирусных мутантов для приготовления разбавленной вакцины против бешенства видится, таким образом, малообещающим.
В рамках ведущих к настоящему изобретению исследований установлено, что у парамиксовирусов разъединение функций репликации и транскрипции может быть достигнуто тем, что составные части полимеразы, которые ответственны за функцию репликации генома, частично удаляются. При этом речь может идти об одном из вирусных белков Ν, Р и Ь или о специальной функциональной области такого белка.
Неожиданно было установлено, что в результате мутаций, при которых функция кодированных вирусными генами Ν, Ь или/и Р белков исключается не полностью, а частично, могут быть получены РНК вирусы с ослабленной способностью к репликации, которые обладают достаточной транскрипционной функцией для того, чтобы быть пригодными для приготовления живых вакцин.
Предметом настоящего изобретения является, таким образом, рекомбинантный вирус Сендай, который имеет ограниченную репликацию и обладает транскрипционной активностью. Соответствующий изобретению вирус имеет вирусный геном с мутацией в гене Р, приводящей к потере репликации генома без потери вторичной транскрипционной активности.
Соответствующий изобретению вирус может быть использован для приготовления живых вакцин, в частности для приготовления живых вакцин с повышенной степенью надежности, которые особенно пригодны для пациентов из групп риска со слабой или нарушенной иммунной системой.
Изобретение также относится к нуклеокапсиду, включающему негативную цепь РНК рекомбинантного вируса Сендай, комплексированную с белками Ν, Ь и Р, а также к изолированной негативной цепи РНК рекомбинантного вируса Сендай.
Следующим предметом изобретения является кДНК, которая кодирует соответствующую изобретению РНК с негативной цепью, в частности, вирусную РНК или/и комплементарную к ней РНК.
Следующим предметом изобретения является клеточная линия для размножения соответствующего изобретению рекомбинантного вируса Сендай.
Соответствующий изобретению рекомбинантный вирус с РНК с негативной цепью можно получить в результате мутации исходного вируса по меньшей мере в одном из генов Ν, Ь и Р. Исходным вирусом может быть природный вирус с РНК с негативной цепью, в частности, из семейств Рагашухоушбае или КйаЬбоушбае или их рекомбинантных вариантов. Особенно предпочтительными представителями являются парамиксовирусы, например вирус Сендай (11Р1У) типов 1, 2, 3, 4а или 4Ь, вирус ньюкаслской болезни, вирус паротита, вирус кори, или человеческий респираторный синциальный вирус (ЙК8У) или рабдовирусы, например, вирус везикулярного стоматита (У8У). Особенно предпочтителен из вирусов вирус Сендай, например штамм Ειΐδΐιίιηί (АТСС УК105). Кроме того, изобретение относится также к рекомбинантным вариантам вышеназванных вирусов, как они, например, описаны в ЕР-А-702085, ЕР-А0863202 или АО 01/42445.
К другим предпочтительным вирусам с РНК с негативной цепью относятся представители КбаЬбоушбае, Ебоушбае, Воггаушбае, Агепаушбае или Випуаушбае, например У8У.
Вирус Сендай, как и другие парамиксовирусы, является оболочечным вирусом со спиральным нуклеокапсидом (фиг. 1). Оболочка состоит из липидной мембраны, которая образуется из плазменной мембраны клетки-хозяина, из которой был выделен вирус. В вирусной оболочке закреплены трансмембранные гликобелки, а именно белок слияния (Е) и гемагглютинин-нейрамидаза (ΗΝ). Матричный белок (М) покрывает внутреннюю сторону мембраны. Находящийся в оболочке нуклеокапсид состоит из одноцепочной РНК в комплексе с нуклеобелком (Ν), причем 6 нуклеотидов связаны одним Ν-белком, зависимой от РНК РНК-полимеразой (Ь) и кофакторным фосфобелком (Р).
Геном РНК с негативной цепью у вируса Сендай содержит 6 структурных белков в следующей последовательности: 3'-Ν-Ρ/Ο-Μ-Ε-ΗΝ-Ε-5' (фиг. 2). Р/С-ген кодирует всего 8 белков, структурный фосфобелок и все известные в настоящее время неструктурные белки.
Белки Р, Ν и Ь важны для функциональной транскрипции и репликации (ЬашЬ е1 а1., Рагашухоушбае: Тбе Ушкек апб (Ней Керйсабоп (Семейство Рагашухоушбае: вирусы и их репликация) Е1е1бк Упо1оду, 4. АиадаЬе (2001) Ырркой, Айбашк & ΑίΙΚίηδ. РЫ1абе1рЫа, 1305-1340).
Соответствующий изобретению вирус с РНК с негативной цепью имеет мутацию по меньшей мере в одном из генов Ν, Ь и Р. Мутацией, которая приводит к ослаблению репликации вируса, но не лишает его способности к транскрипции, может быть делеция, замещение или/и инсерция в одном из генов Ν, Ь или Р. Мутация затрагивает преимущественно тот участок последовательности кодированных генами Ν, Ь или/и Р белков, который необходим для репликации, в то время как необходимые для транскрипции участки последовательности остаются функционально способными.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения рекомбинантный вирус имеет мутацию в гене Р, а именно в Ν-терминальном участке последовательности гена Р. Мутация касается
- 2 015013 предпочтительно, по меньшей мере, области аминокислот 33-41 белка Р, которые важны для репликационной способности. Кроме того, предпочтительно, если не имеет вредящих транскрипционной функции мутаций С-терминальная область (с аминокислоты 320). Особенно предпочтительной является вызывающая потерю репликационной способности мутация в области аминокислот 2-77, например, делеция аминокислот (а) кодированного геном Р белка или одного участка (Ь) последовательности из достаточных для потери репликационной способности участков последовательности аминокислот (а). Соответствующие мутации могут происходить и в Р-белках других вирусов с РНК с негативной цепью, например, других парамиксовирусов, например 11Р1У3.
Соответствующий изобретению рекомбинантный вирус имеет ограниченную репликацию и обладает транскрипционной активностью. Потеря репликационной способности означает, что в клетке-мишени (клетке, которая не обладает устраненными мутацией функциями ίη 1гап8) не обнаруживается никаких следов размножения генома вируса, причем, в отличие от уменьшенной или конициональной ограниченной репликации, нет в наличии и никаких разрешительных условий, при которых может происходить репликация. Определять потерю репликационной способности можно способом, описанным в примере 8. Соответствующий изобретению вирус, однако, в состоянии транскрибировать после инфицирования в клетке-мишени кодированный им генный материал, поэтому может происходить экспрессия вирусных белков, в том числе одного или нескольких чужеродных генных материалов в клетке-мишени. Важно то, что соответствующий изобретению рекомбинантный вирус обладает способностью к вторичной транскрипции, т. е. вирусные генные материалы, которые образуются в результате первичной транскрипции с первоначально содержавшимися в нуклеокапсиде белковыми компонентами, в состоянии сами вызывать или/и поддерживать вторичную транскрипцию. Размер вторичной транскрипции имеет при этом следствием синтез белка предпочтительно, по меньшей мере, в количестве 1%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4% или по меньшей мере 5% по сравнению с диким типом вируса, т.е. вирусом без мутации по меньшей мере в одном из генов Ν, Ь и Р. Способность к вторичной транскрипции по сравнению с соответствующим диким типом вируса может уменьшиться, предпочтительно, однако, на более чем в 20 раз, особенно предпочтительно в 10 раз. Способность к вторичной транскрипции можно определить, как в примере 7.1 или/и 7.3, путем количественного определения экспрессии одного из чужеродных генных материалов, например одного из репортерных белков.
Соответствующий изобретению рекомбинантный вирус наряду с мутацией имеет предпочтительно по меньшей мере один трансген, т. е. по меньшей мере одну кодирующую чужеродный генный материал последовательность. Чужеродным генным материалом может быть белок, например репортерный белок, например флюоресцентный белок, как например ОРР или его производное, или антиген, на который должен даваться иммунный ответ, или терапевтический белок, например белок для вирусной терапии, или же функциональная РНК-молекула, например, антисмысловая РНК, один из рибозимов или одна из обладающих интерференцией κίΡΗΚ-молекул. Предпочтителен чужеродный генный материал в виде антигена, который происходит от патогенов, как например вируса, бактерии, гриба или протозоа, а также опухолевого антигена или автоантигена. Особенно предпочтителен антиген в виде вирусного антигена, который происходит от чужеродного вируса с РНК с негативной цепью, как например, от человеческого парагриппозного вируса или КЯУ. например, 11Р1У3 Р и ΗΝ или 11В8У Р и О. Соответствующий изобретению вирус может содержать одну или несколько, например две или три, кодирующих чужеродный генный материал последовательностей.
Кодирующие чужеродные генные материалы последовательности могут быть встроены в геном рекомбинантного вируса. С другой стороны, кодирующие чужеродные генные материалы последовательности, например гены Р или/и ΗΝ, могут также замещаться последовательностями, которые кодируют чужеродные генные материалы, например химерные генные материалы. Возможны и комбинации встроенных и замещенных трансгенов.
Так, например, последовательности вируса Сендай замещаются полностью или частично чужеродными последовательностями других вирусов с РНК с негативной цепью, например последовательностями парагриппозных вирусов, например 11Р1У3 или/и последовательностяи К.8У. Особенно предпочтительны для применения химерные последовательности, т. е. последовательности, которые состоят из участков чужеродного вирусного генома. Например, могут быть внедрены в вирусный геном химерные гены Р или/и ΗΝ, которые состоят из последовательностей генома базового вируса, например вируса Сендай, и из чужеродных последовательностей, например из человеческих парагриппозных вирусов, как например 11Р1У3, или/и В8У.
Рекомбинантный вирус может содержать один или несколько разных трансгенов. В случае наличия нескольких трансгенов, они могут быть одинакового или разного происхождения, они могут, например, происходить от одного и того же или от разных патогенов, например вирусов. Так, например, могут присутствовать трансгены из нескольких, например 2 или 3, различных патогенов, предпочтительно вирусов, особенно предпочтительно вирусов с РНК с негативной цепью.
Встраивание трансгенов в парамиксовирусы описано, например, Накап е! а1. (1. Оеп. νίτοί. 78 (1997), 2813-2820), Виктеуеу е! а1. (1. νίτοί. 70 (1996), 6634-6641), Уи е! а1. (Оепек Се118 2 (1997), 457-466), Макай е! а1. (РА8ЕВУВ 1. 15 (2001), 1294-1296), 8Ыо!аш е! а1. (Оепе Тйетару 8 (2001), 1043-1050) и ВП/ег е! а1.
- 3 015013 (Мо1. Тйегару 7 (2003), 210-217). Предпочтительно трансгены встраиваются в З'-область вирусного генома. Инсерция происходит, например, в форме транскрипционных кассет, причем на векторном уровне (т.е. на уровне вектора, например плазмидного вектора, который кодирует РНК с негативной цепью) встраиваются непосредственно после лидерной области одна или несколько транскрипционных кассет с уникальными рестрикционными сайтами для интеграции соответствующих считывающих рамок. Интеграция нескольких трансгенов происходит предпочтительно в соответствующих независимых транскрипционных кассетах. Транскрипционная кассета преимущественно содержит кодирующую чужеродный генный материал последовательность в оперативной связи с последовательностью старта транскрипции и последовательностью завершения транскрипции и преимущественно трансляционными сигналами.
Другим предметом настоящего изобретения является одноцепочная или двуцепочная молекула ДНК, например, кДНК-молекула, которая кодирует соответствующий изобретению рекомбинантный вирусный геном с РНК с негативной цепью или его предшественник или же вирусный антигеном или его предшественник. Термин предшественник в данной связи означает, что ДНК-молекула еще не содержит никакой кодирующей чужеродный генный материал последовательности, а лишь место клонирования для включения такой последовательности. Место клонирования может быть рестрикционным сайтом встраивания, например единичным или множественным рестрикционным сайтом встраивания в ДНК или составным сайтом клонирования, включающим несколько следующих друг за другом рестрикционных сайтов, предпочтительно единичных рестрикционньгх сайтов. Кодирующая геном вируса или/и комплементарную последовательности ДНК-молекула предпочтительно находится в функциональной связи с соответствующими последовательностями контроля экспрессии.
ДНК-молекула предпочтительно является вектором, например, плазмидным вектором, который пригоден для размножения в пригодной для этого клетке-хозяине, т.е. в векторной или плазмидной размножающей клетке, предпочтительно в прокариотической клетке, а также в эукариотической клетке, в частности в клетке млекопитающего, и имеет для этого необходимые генетические элементы, как например, источник репликации, последовательности интеграции или/и последовательности селекционного маркера.
Молекула ДНК включает последовательность, кодирующую рекомбинантный вирус или комплементарную последовательности, предпочтительно под контролем транскрипционных сигнальных последовательностей, поэтому при транскрипции ДНК-зависимой РНК-полимеразой в пригодной для первичного приготовления вируса клетке-хозяине, т. е. в клетке для приготовления вируса, может образовываться вирусная РНК с негативной цепью. Транскрипционный сигнал выбирается таким, что он делает возможной эффективную транскрипцию ДНК в соответственно примененной клетке-хозяине. Для этого может применяться также чужеродный для соответствующей клетки транскрипционный сигнал, например, промотор бактериофагов, как например Т7- или 8Р6-промотор, причем клетка для приготовления вируса должна в этом случае содержать и соответствующую чужеродную обеспечивает ДНК-зависимую РНК-полимеразу, например Т7- или 8Р6-РНК-полимеразу, которая вызывает транскрипцию. Кроме того, молекула ДНК содержит наряду с транскрипционным сигналом предпочтительно на З'-конце кодирующей рекомбинантный вирус последовательности терминатор транскрипции и последовательности рибозима, которая делает возможной расщепление транскрипта на конце вирусной последовательности. Клетка для приготовления вируса является преимущественно эукариотической клеткой и в первую очередь клеткой млекопитающего.
Соответствующие изобретению производящие вирус клетки содержат кроме ДНК, кодирующей парамиксовирус с ослабленной репликацией, вспомогательные последовательности, генные материалы которых делают возможным сборку соответствующего изобретению рекомбинантного вируса РНК ίη 1гап5. Для этого эти клетки могут, например, содержать, кроме того, один или несколько векторов, которые вырабатывают Ν-белок, Р-белок или/и Ь-белок ίη 1гап5. В результате этого оказывается возможной сборка нуклеокапсидов соответствующего изобретению рекомбинантного вируса в производящей клетке.
Размножение собранного вначале в производящей вирус клетке рекомбинантного вируса происходит в производящей вирус клетке, которая инфицирована соответствующим изобретению вирусом. Кроме того, размножающая вирус клетка содержит вышеназванные вспомогательные последовательности для выработки Ν-белка, Р-белка или/и Ь-белка ίη 1гап5. Предпочтительно применяют клетку для размножения вируса, в которой происходит постоянная экспрессия вспомогательных последовательностей, например, путем геномной интеграции. Размножающей вирус клеткой является преимущественно клетка млекопитающего. Особенно предпочтительной клеткой для размножения является производная от клетки 293, человеческой эмбриональной клеточной линии почечных фибропластов, клетка Н29 или производная от нее клетка. Клетка Н29 депонирована 05.11.2004 (Ό8Μ АСС 2702) соответственно условиям Будапештского договора в ГмбХ Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Брауншвейг, (улица) МаБСЙгобег Аед. Кроме того, пригодны клетки, производные от клеток Уего, линии почечных клеток африканской зеленой мартышки, или от ЬЬСМК2-клеток, линии почечных клеток резус обезьян, которые устойчиво трансфицированы соответствующими вспомогательными последовательно- 4 015013 стяи, например 8еУ Ν- и Р-генами.
Следующим предметом изобретения является, поэтому, клетка, преимущественно эукариотическая клетка и, особенно предпочтительно, клетка млекопитающего, которая (ί) содержит молекулу ДНК, которая кодирует геном соответствующего изобретению рекомбинантного вируса или/и его комплементарную последовательности или его предшественник, или/и (и) содержащий РНК-геном соответствующего изобретению вируса. Данная клетка, как рассмотрено выше, может быть клеткой для размножения вектора, клеткой для приготовления вируса или клеткой для размножения вируса.
Если эта клетка является клеткой для размножения вектора, например клеткой для размножения плазмид, то для размножения соответствующего вектора можно применять любую пригодную для этого клетку, например, и прокариотическую клетку, как например, трансформированную клетку Ε.οοίί.
Если эта клетка является клеткой для выработки или клеткой для размножения вируса, то она содержит вспомогательные последовательности для выработки вирусных белков Ν, Р или/и Ь ίη 1гап5. Интегрированная для выработки вируса ДНК находится преимущественно под управлением чужеродного транскрипционного сигнала, причем лучше, если клетка, кроме того, содержит ДНК, которая кодирует чужеродную ДНК зависимую РНК-полимеразу, которая распознает чужеродный транскрипционный сигнал и вызывает транскрипцию ДНК, кодирующей рекомбинантный вирус с РНК с негативной цепью.
Если эта клетка является клеткой для размножения вируса, то она инфицирована геномной вирусной молекулой РНК, например, в форме нуклеокапсида, и содержит вспомогательные последовательности в постоянно экспримируемой форме.
Еще одним предметом настоящего изобретения является способ получения соответствующего изобретению рекомбинантного вируса с РНК с негативной цепью, включающий следующие этапы: (а) получение клетки для приготовления вируса, которая инфицирована молекулой ДНК, кодирующей геном вируса с РНК с негативной цепью, имеющего мутацию, по меньшей мере, в одном из генов Ν, Р и Ь, которая приводит к потере способности генома к репликации без потери способности к транскрипции, а также, при необходимости по меньшей мере одну кодирующую чужеродный генный материал последовательности и (Ь) культивирование клетки-хозяина в условиях, при которых происходит согласно (а) транскрипция молекулы ДНК и вначале образуется рекомбинантный вирус с РНК с негативной цепью. Клетка-хозяин предпочтительно в состоянии вырабатывать Ν-белок, Р-белок и/или Ь-белок ίη 1гап5. например, путем трансфекции с соответствующими вспомогательными капсидами, которые содержат кодирующие белки Ν, Р или/и Ь последовательности.
Для приготовления больших количеств нуклеокапсидов или вирусных частиц используют преимущественно клетку, которая конститутивно или репродуцируемо постоянно экспримирует белки Ν, Ь или/и Р, преимущественно, по меньшей мере, белок Р вируса с РНК с негативной цепью. Таким образом, изобретение относится и к способу размножения соответствующего изобретению рекомбинантного вируса с РНК с негативной цепью, предусматривающему этапы: (а) получение размножающей вирус клетки, которая инфицирована геномом вируса с РНК с негативной цепью, имеющим мутацию по меньшей мере в одном из генов Ν, Ь и Р, которая приводит к потере геномом репликационной способности без потери транскрипционной способности, а также, при необходимости по меньшей мере одну кодирующую чужеродный генный материал последовательности и (Ь) культивирование клетки-хозяина в условиях, приводящих к размножению вируса.
Еще одним предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая рекомбинантный, с ограниченной способностью к репликации и способный к транскрипции вирус с РНК с негативной цепью, как он был описан выше, или его нуклеокапсид в качестве действующего вещества, а также, при необходимости, обычно применяемые в фармацевтике наполнители или вспомогательные вещества. Фармацевтическая композиция пригодна для применения в медицине и ветеринарии. Его можно, в частности, применять в качестве вакцины или для противоопухолевой терапии, в частности для применения на пациентах из групп риска, как например, на детях, пожилых пациентах или/или пациентах с поврежденной или слабой иммунной системой. Фармацевтическая композиция может при этом содержать вирус с РНК с негативной отрицательной цепью в его нативной вирусной оболочке.
Особенно предпочтительно применение в качестве вакцины, например вакцины против таких патогенов, как вирусы, бактерии или простейшие. Если рекомбинантный вирус содержит один или несколько трансгенов одинакового происхождения, например из одного и того же патогена, речь идет о моновалентной вакцине. Если рекомбинантный вирус содержит трансгены разного происхождения, то он может быть использован также и в качестве поливалентной вакцины, например, в качестве бивалентной или тривалентной вакцины. Например, поливалентная вакцина может быть использована против нескольких патогенных вирусов, например, против нескольких патогенных вирусов с РНК с негативной цепью, как например, человеческого парагриппозного вируса и Р8У.
Соответствующая изобретению вакцина в состоянии вызывать гуморальный иммунный ответ, преимущественно образование нейтрализующих антител или/и Т-клеточный иммунный ответ. Особенно предпочтительно вызывается гуморальный иммунный ответ и Т-клеточный иммунный ответ.
Фармацевтическая композиция может быть в форме раствора, суспензии, лиофилизата или в любой другой пригодной форме. Наряду с действующим веществом состав может содержать средство для регу
- 5 015013 лирования рН, буфер, средство для регулирования осмотического давления, смачивающее средство и т.п., а также активизирующие иммунную систему вещества. Введение может осуществляться обычным путем, например, орально, накожно, назально, пульмонально и т.д. в форме аэрозолей, жидкостей, порошков и т.д. При этом пациенту вводят терапевтически эффективную дозу вируса, причем эта доза зависит от соответствующего способа применения (например, виротерапия или вакцина), вида заболевания, состояния здоровья и веса пациента, способа введения и формы лекарственного средства. Обычно в разовой дозе вводят 103-107 вирусных частиц, особенно предпочтительно примерно 104-106 вирусных частиц. При необходимости можно вводить одновременно несколько разных вирусных частиц, например, в случае комбинированных вакцин. Введение может проводиться одно- или многократно, в зависимости от потребности.
Предпочтительными областями применения являются, например, профилактика или лечение респираторных вирусных болезней.
Далее изобретение раскрывается с использованием нижеследующих фигур и примеров.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
1. Общие сведения.
Фиг. 1 отражает строение одного из вирусов Сендай (8еУ) по Филдсу, Р|е1б5 (У1то1оду. Ырршсой, ^1Шат8 и ХУПкпъ (2001), 4. издание; измененное). Геном состоит из одноцепочной РНК, которая представлена белками Ν, Р и Ь, в форме нуклеокапсида. Нуклеокапсид окружен мембранной оболочкой, в которой размещены белки ΗΝ и Р (состоящие соответственно из Ρι- и Р2-подъединиц). С внутренней стороной мембраны ассоциирован белок М, который одновременно присутствует и в соединениях с компонентами нуклеокапсида.
Геном из одноцепочной негативно ориентированной РНК вируса Сендай дикого типа состоит из 15384 нуклеотидов. Гены 6 структурных белков расположены в нем в последовательности З'-Ν-Ρ/Ο-Μ-ΡΗΝ-Γ-5' (фиг. 2). Между генами имеются мостики из 50-80 нуклеотидов, в каждом из которых имеется сильно консервативный участок из 22 нуклеотидов: терминирующий сигнал предшествующего гена, межгенная последовательность и инициирующий сигнал для последующего гена. Единицу, состоящую из инициирующего сигнала, открытой считывающей рамки (ОВР), в соответствующих случаях нетранслируемых участков и терминирующего сигнала называют транскрипционной кассетой. Перед Ν-концом находится состоящая из 55 нуклеотидов лидирующая последовательность (16), которая транскрибируется, но не транслируется. Вслед за Ь-геном располагается состоящая из 54 нуклеотидов терминирующая последовательность (1т). Указанные 16-участок и ΐτ-участок выступают в качестве геномных и антигеномных промоторов реликации генома или антигенома. Образовавшиеся путем транскрипции мРНКмолекулы, за исключением Р/С-РНК, являются моноцистронными.
Цикл размножения вируса Сендай включает внедрение в клетку-хозяина, транскрипцию и трансляцию, а также репликацию и созревание вируса с последующим выходом вновь выработанных вирусов. В процессе транскрипции особенно активно участвуют белки Ν, Р и Ь, причем Ь представляет вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза со всеми каталитическими активностями. Так как геном вируса Сендай представлен в негативноцепочной ориентации, вирусная РНК не может переводиться непосредственно в белки. Сначала происходит первичная транскрипция в мРНК с помощью РНК-полимеразы, которая ассоциированно с нуклеокапсидом вводится в клетку.
Фиг. 3 является схематичным изображением процесса транскрипции вируса Сендай. В нем полимеразный комплекс, состоящий из одного Ь-белка и одного гомотетрамера из Р-белков, перемещается по упакованной Ν-белками РНК в направлении 5'-конца. При этом считывается генетическая информация на геномной РНК с негативной цепью и транскрибируется в мРНК с положительной цепью.
Репликация генома включает выработку новых геномов вируса с отрицательной цепью. Для этого сначала образуются антигеномы, которые затем служат в качестве матриц для образования геномов. Поскольку транскрипция начинается на З'-конце генома (16), необходимо переключение из режима транскрипции в режим репликации. Это переключение обусловливается большим количеством свободного Νбелка в клетке. Репликация может происходить лишь после того, как образовалось достаточное количество Ν-белка после трансляции мРНК-молекул. После того, как появится в наличии антигеном, который по всей своей длине находится в комплексе с Ν-белками, эта матрица сможет служить для выработки других геномов. Они также упаковываются непосредственно Ν-белками. За процесс репликации опять же ответственны белки Ν, Р и Ь (фиг. 4).
Во время репликации вируса в результате увеличивающегося количества мРНК-молекул все больше синтезируется и вирусных белков. Затем комплексы из вирусных РНК и вирусных белков (нуклеокапсиды) транспортируются в форме секреторных пузырьков к цитоплазматическим мембранам, где происходит капсулирование вирусных частиц поверхностными белками и их почкование.
В рамках настоящего изобретения получают рекомбинантные вирусные мутанты, у которых функции транскрипции и репликации разделены, т.е. вирусы являются способными к транскрипции, но имеют ослабленную способность к репликации. Отсутствующая функция репликации генома для выработки вирусных частиц или их нуклеокапсидов должна компенсироваться вспомогательными клетками, которые комплементируют отсутствующий или с ослабленной функцией вирусный белок ίη 1гап5. Предпоч
- 6 015013 тительной вспомогательной клеткой такого рода является клеточная линия Н29 (ЛУШспЬппк и №иЬей, 1. У1го1. 68 (1994), 8413-8417). Эта клеточная линия в рамках настоящей заявки депонирована 05.11.2004 согласно условиям Будапештского договора под регистрационным номером Э8М АСС2702. Для выработки вирусов с ослабленной способностью к репликации, но способных к транскрипции удален не весь ген, кодирующий Р-белок, а только ответственный за репликацию генома домен. Так, из более ранних работ (Сиггап, Упо1оду 221 (1996), 130-140; Сиггап е1 а1. 1. Упо1оду 69 (1995), 849-855) известно, что в ίη νίΐτο системе при делеции аминокислот 2-77 белка Р ингибируется репликация генома, в то время как вирусная транскрипция остается активной.
На фиг. 5 схематично изображен Р-белок с его Ν- и С-концевыми доменами (ΡΝΤ, РСТ), доменами тетрамеризации (аминокислоты 320-446), Р:Ь-доменами (аминокислоты 411-445) и Ρ:ΚΝΡсоединительными доменами (аминокислоты 479-568). Для отключения функции репликации вирусного генома при одновременном сохранении способности к синтезу вирусной мРНК выбрана делеция первых 77 аминокислот белка Р. При этом впервые был получен соответствующий мутант вируса Сендай (8еУΡΔ2-77), в котором делегирована 5'-концевая область Ρ-ОКЕ. У таких вирусов могут кодироваться только Ν-терминально укороченные Р-белки. Изучение инфицирования показало, что вирусные мутанты в клеточной культуре не способны к размножению. С помощью вспомогательной линии Н29 (Э8М АСС2702), которая, кроме всего прочего, производит требуемый Р-белок дикого типа, может достигаться размножение вирусного мутанта. Эффективность размножения вируса составляет примерно 45% в сравнении с вирусом Сендай дикого типа.
После инфицирования соответствующий изобретению вирусный мутант в состоянии экспримировать вирус-специфические трансгены в инфицированные клетки. Произведенный вирусным мутантом укороченный белок Р в достаточной степени поддерживает вторичный синтез вирусной мРНК. Синтез вирус-специфических белков продолжается в инфицированных клетках на протяжении нескольких дней и по сравнению с диким типом вируса ослаблен лишь примерно в 10 раз, поэтому при использовании мутанта в качестве вакцины можно с уверенностью ожидать достаточный иммунный ответ.
2. Получение конструктов для имеющих ослабленную способность к репликации векторов вируса Сендай (8ЕУУ).
Приготовление кДНК-конструкта р8еУ-Х.
Кодирующая транскрипционная кассета была встроена в 3'-область 8еУ, штамм Ειΐδΐιίιηί (АТСС УК105). У всех мутаций генома обязательно общее число нуклеотидов рекомбинантного генома 8еУ должно быть кратным шести (правило шести).
На основе использованной в качестве матрицы кДНК р8еУ были выработаны два ΡСΚ-фрагмента ΡίΤ XI и ΡίΤ XII для приготовления р8еУ-Х (фиг. 6), ΡίΤ X I (370 Ьр) состоит из последовательности Т7-промотора (Т-7 Ργοιιι.). лидерной (^(-последовательности, начала Ν-гена с 5'-конца до инициаторного кодона Ν-ОКЕ ((Ореп Кеабшд Егаше - открытой рамки считывания). С помощью обратного праймера X I (+) (табл. 3) был встроен единичный рестрикционный сайт Νο!1 и 24 нуклеотида последовательности конца Ν-конца гена. Указанные 24 нуклеотида последовательности Ν-конца гена в ΡΟΡ X I, встроенные посредством мутагенного праймера X I (+), на следующем этапе конструирования выполняют роль области перекрытия с ₽СК XII.
ΡίΤ XII (970 Ьр) состоит из последовательности Ν-начала гена и первой трети Ν-ОКЕ. Через прямой-праймер XII была встроена последовательность 3'-ΝΤΚ Ν и последовательность Ν конца гена, а также межгенная область (ГК). Обратный-праймер X II (+) осуществляет связь в первой трети Ν-ОКЕ после единственного 8рЫ-сайта в геноме 8еУ. Ампликон ΡΟΚ X I располагался в 3'-области комплементарно к 5'-области Ρί.’Κ X II. Через эту область могли объединяться оба указанных ЕСК-фрагмента X I и X II. После Ρί,'Κ продукт (1310 Ьр) в результате рестрикционного расщепления М1и1 и 8р111 мог встраиваться в аналогично обработанный М1и1 и 8р111 вектор р8еУ. Из полученных клонов была выделена плазмидная ДНК и проанализирована с помощью рестрикционного анализа и секвенирования на правильность вставки транскрипционной кассеты. Таким образом был получен конструкт кДНК р8еУ.
Чтобы можно было легко проследить приготовление рекомбинантных вирусов, ген улучшенного зеленого флюоресцирующего белка (еСРТ) был встроен в пустую кассету р8еУ№. еСЕТ-ОКЕ был амплифицирован с помощью ΡΕΚ из ОКЕЕ-Ш (фирма С1оп1еей), причем с помощью мутагенного праймера было соблюдено правило шести и достигнуто включение двух фланкирующих сайтов №11. Образовавшийся ГСК-фрагмент размером 771 Ьр был расщеплен рестрикционным ферментом №11 и методом экстракции из гелей был выделен фрагмент размером 738 Ьр, который был встроен по сайту №11 р8еУ№ в его пустую транскрипционную кассету рЗеУ^. После трансформации Е.еоБ, плазмида и последующего секветирования выделенной плазмиды был получен конструкт кДНК р8еУ-еСЕ?.
2.2. Получение кДНК-конструкта рЗеУ^^.
С помощью конструкта рЗеУ^^ нужно было получить две дополнительные рестрикционные кассеты, в которые можно было бы встроить два трансгена. Применение рЗеУ^^ в качестве базисного вектора при приготовлении векторов с ослабленной способностью к репликации должно было обеспечить возможность создания вектора с мультивалентными, например, трехвалентными свойствами.
рЗеУ^^ был получен с помощью ?СК, в которой в качестве матрицы был использован р8еУ№
- 7 015013 (фиг. 7). Прямой праймер XX был гибридизирован с р8еУ-Х в области сайта Νοΐ1 и с З'-ΝΤΚ предназначенной для встраивания, второй транскрипционной кассеты. Уникальный рестрикционный сайт 8дгЛ1 был встроен с помощью прямого праймера XX между сайтом Νοΐί З'-ΝΤΚ. Он выполняет роль уникального рестрикционного сайта для последующего встраивания ОКЕ одного из трансгенов. В РСК-продукте XX следуют друг за другом конец гена, межгенная область (ΙΚ), начало гена и 5'-ΝΤΚ. С помощью праймера XX (+), который гибридизовали с 5'-ΝΤΚ, были встроены уникальные рестрикционные сайты Еке1 и №ц I. Еке1-сайт служит для встраивания ОКЕ-ов второго трансгена. Уникальный №и-1-сайт был встроен с целью иметь возможность при необходимости встроить третью транскрипционную кассету. Праймер XX (+) гибридизовали в З'-области с сайтом Νοΐί р8еУ^. РСК-продукт XX (220 Ьр) был обработан рестрикционным ферментом Νοΐί и методом гелевой экстракции был выделен фрагмент размером 144 Ьр. Этот фрагмент, по строению соответствующий правилу шести, можно было затем встраивать в плазмиду, также расщепленную Νοΐί. После проверки правильности ориентации Νοΐί РСК-фрагмента XX определения первичной структуры плазмида р8еУ^^ была готова. В уникальные сайты Езе1 и Νπι I можно встраивать любые трансгены.
Для исследований в данной работе обе транскрипционные кассеты (X) р8еУ^^ были обеспечены считывающими рамками двух разных флюоресцирующих белков. С одной стороны, была амплифицирована считывающая рамка для флюоресцирующего белка еОЕР из экспрессионного плазмида рЕОЕР-ΝΙ с помощью РСК с соблюдением правила шести, причем с помощью мутагенного праймера были добавлены два фланкирующих сайта 8дгА1. После рестрикционного расщепления с помощью 8дгЛ1 и экстракции из геля, фрагмент размером примерно 738 Ьр встраивали в первую транскрипционную кассету р8еУX-X (р8еУ- еОЕР^). Таким же образом, с другой стороны, ОКЕ флюоресцирующего белка ЭкКей (из плазмида рЭкКей, фирма С1οηΐесй) с соблюдением правила шести с помощью РСК была обеспечена рестрикционными сайтами Еке1, расшеплена, подвергнута экстракции из геля ДНК и этот фрагмент (702 Ьр) был клонирован во вторую транскрипционную кассету в З'области р8еУ- еСЕР^. Таким путем был создан геномный 8еУ кДНК конструкт р8еУ- еСЕР- ЭкКей.
3. Приготовление векторов (8еУУ) вируса Сендай с ослабленной способностью к репликации.
Были получены кДНК конструкты р8еУУ- еСЕР-ΔΝ, ДР и ДЬ, кодирующие вирусы Сендай с ослабленной способностью к репликации, в которых соответственно делегирован ген белка Ν, Р и Ь. Для этого необходимо было с соблюдением правила шести делетировать соответствующую считывающую рамку генов Ν, Р или Ь, причем должна была остаться некодирующая транскрипционная кассета в соответствующей области (фиг. 8 А).
Путем встраивания рестрикционного сайта вместо делетированной ОКЕ в каждом кДНК конструкте р8еУУ-еОЕР-ДН ДР и ДЬ для последующего использования должна была остаться еще одна функциональная транскрипционная кассета, в которую при необходимости можно было бы включить еще один трансген.
В качестве еще одного варианта 8еУУ с ограниченной способностью к репликации был получен делеционный мутант р8еУУ-еОЕР-РД2-77, который кодирует Ν-терминально укороченный Р белок, в котором отсутствуют аминокислоты 2-77 (фиг. 8В).
Все клонирования р8еУУ-еОЕР-ДН -ДР и -ДЬ проводили по одному и тому же принципу. В качестве примера, в ниже следующем абзаце приведено подробное описание клонирования р8еУУ-еОЕР-ДР. Вслед за этим в краткой форме сведены в таблицу различия в клонировании р8еУУ-еСЕР-ДХ и ДЬ.
3.1. Клонирование кДНК-конструктов р8еУУ- еСЕР-ДР и р8еУУ- еОЕР-РД2-77.
ОКЕ белка была удалена из кДНК конструкта способного к репликации вируса р8еУУ-еОЕР, чтобы получить новую кДНК р8еУУ-еОЕР-ДР, кодирующую вектор с ослабленной способностью к репликации. Вместо Р-ОКЕ был встроен X1ю1 рестрикционный сайт.
Для клонирования р8еУУ-еОЕР-ДР были созданы и впоследствии объединены два РСК-фрагмента, называемых РСК ДР I и РСК ДР II. В качестве матриц для обеих РСК-реакций служил р8еУУ-еОЕР. Для фрагмента РСК ДР I (1272 Ьр) матрицу в области Ν ОКЕ перед уникальным 8рй1-участком гибридизовали с прямым праймером ДР I (= Ν-578; табл. 3). Обратный праймер ДР I (+) гибридизовали с матрицей в 5'-ΝΤΡ. области Р-гена перед ΑΤΟ-кодоном Р, включая рестрикционный сайт X1ю1.
Фрагмент РСК ДР II состоит из 1938 Ьр, в качестве матрицы использовали р8еУ. Прямой праймер ДР II гибридизовали с частью 5^^. Р последовательности, включающий сайт X11ο1. Обратный праймер РСК ДР II (+) гибридизуется с ОКЕ Е гена вслед за уникальным Есо47Ш участком и дополнительно имеет не природный М1и1-сайт.
Оба РСК-фрагмента ДР I и ДР II объединяли по Xйο1-сайту. Продукт объединения - состоящий из частичной последовательности Ν ОКЕ, не кодирующей Р-транскрипционной кассеты с включенным рестрикционным Xйο1-сайтом, М, а также четверти Е ОКЕ - был расщеплен рестрикционными ферментами 8рЫ и М1и1, подвергнут промежуточному этапу клонирования и секвенирования. Из одного из подклонов с правильной последовательностью был вырезан 8рЫ-Есο47III фрагмент размером 3006 Ьр, который был лигирован аналогичным образом обработанный вектор р8еУУ-еОЕР. После проверки последовательности получен р8еУУ- еСЕР-ДР клон (геномная вирусная кДНК) (фиг. 9), который использовали для полу
- 8 015013 чения имеющего ослабленную способность к репликации 8еУУ-еСГР-АР.
Для сборки делеционного мутанта р8еУУ-еСРР-РА2-77 была использована одна РСК с двумя мутагенными праймерами. Прямой праймер Хйо1 РА2-77 имеет один Хйо1-сайт, за которым следуют инициаторный ЛТП-кодон, и кодоны аминокислот 78-86 Р белка. Обратный праймер РА2-77 (+) Хйо1 содержит 10 последних кодонов Р белка и один сайт Хйо1. Считывающая рамка укороченного с Ν-конца на 76 аминокислот Р-белка была создана с помощью РСК, на основе матрицы р8еУ, фрагмент размером 1488 Ьр в результате двух этапов клонирования был встроен в некодирующую транскрипционную кассету р8еУУ- еСРР-АР вместо первичной Р-ОКР. После секвенирования был получен геномный клон кДНК, который использовали для получения имеющего ослабленную способность к репликации р8еУУ-еПРРРА2-77.
Делеция кодонов 2-77 в Р ОКР привела к получению Ν-терминально укороченных неструктурных белков и белков V и ^, а из С-семейства кодирующим остается только лишь С', также транкированный; белки С, Υ1 и Υ2 из-за отсутствия инициаторных кодонов уже не могут транслироваться с укороченной мРНК.
3.2. Клонирование кДНК-конструктов р8еVV-е^БР-АN и -АЬ.
Получение р8еVV-е^БР-АN и р8еVV-е^БР-А^ проводили аналогично клонированию р8еVV-е^БРАР. Схема клонирования приведена в табл. 1.
Путем приготовления соответственно двух объединяющихся РСК-продуктов РСК I и РСК II с учетом правила шести удалили ОКР генов N или Б из р8еVV-е^БР и на их место встроили уникальный Ара1-рестрикционный сайт как в р8еVV-е^РР-АN, так и в р8еVΥ-е^БР-А^. Последовательности праймеров для клонирования р8еVV-е^БР-АN, -АР и -АЬ приведены в табл.3. Приготовленные РСК-продукты РСК I и РСК II были соединены и амплифицированы с помощью прямого праймера РСК I и обратного праймера РСК II. Затем продукты соединения РСК были расщеплены рестрикционными ферментами, имеющими уникальные сайты в р8еV- еСРР и допускают инсерцию соответствующих продуктов в р8еVеСРР (например: №г1 при клонировании р8еVV-е^ΕР-АN, см. табл. 1). Очищенный продукт был встроен в расщепленный соответствующими ферментами вектор р8еV-е^ΕР.
Таблица 1. Перечень применявшихся при клонировании р8еVV-е^ΕР-АX праймеров и рестрикционных сайтов
ρδενν-εζτΓΡ-ΔΝ | р8еУУ-еОРР-АР | р8еУУ-еСБР-АБ | |
Праймерная пара РСК I | ΔΝI, ΑΝ I (+) | АР I, АР I (+) | АБ I, АБ I (+) |
Праймерная пара РСК II | ΑΝ II, ΑΝ 11 (+) | АР II, АР II (+) | АБ II, АБ II (+) |
К88§ транскрипционной кассеты | Ара1 | ХЬо1 | Ара1 |
Κ88δ клонирования | Ыаг! | 8рЫ + Есо47Ш | Есо47Ш + Азе! |
§ К88 = рестрикционный сайт
Затем трансформировали Е. сой, и выделяли плазмидную ДНК в аналитических количествах. Плазмиды анализировали методом рестрикционного анализа и секвенирования, далее из каждого положительного клона выделяли по одному плазмидному препарату (прибор ΏΝΑ Мах1 Ргер-Κίΐ, Р1адеп), в результате чего были получены различные делеционные мутанты р8еVV-е^ΕР-АХ.
4. Приготовление вирусных мутантов с ослабленной способностью к репликации.
Из кДНК конструктов р8еVV-еСРР-АN, -АР и -АЬ в клеточной культуре были приготовлены 8еVвекторы (8еVV-е^БР-АX) с ослабленной способностью к репликации.
4.1. Первичное приготовление 8еVV-е^ΕР-АX.
Для приготовления рекомбинантного 8еV с полным геномом инфицируются и трансфицируются кДНК вирусного генома (р8еV), а также кодированными плазмидом генами Ν, Р и Б (рТМ-Ν, -Р, -Б; Е1гоу-8!еш е! а1. (1989) РУА8 86, 6126-6130), или клеточная линия В8К-Т7, которая стабильно экспримирует Т7 РНК-полимеразу (Бисййок е! а1. (1999) I. νΐΐΌ1. 73, 251-259), или клеточная культура с рекомбинантным Vасс^η^а вирусом ΜνΑ-Τ7, который экспримирует Т7 РНК-полимеразу (8и11ег е! а1. (1995) РЕВ8 371, 9-12).
После этого Т7-полимераза транскрибирует вирусный антигеном или/и комплементарные последовательности и гены Ν, Р и Б. Экспримированный посредством рТМ-Ν Ν-белок упаковывает синтезированную вирусную антигеномную или/и комплементарную РНК, и это нуклеокапсидное ядро (ΕΝΕ) образует вместе с белками Р и Б репликационный комплекс, посредством которого может снова приготовляться и упаковываться в нуклеокапсиды геномная РНК (Беуег е! а1., I. νΐΐΌί. Ме!й. 75 (1998), 47-55). В довершение к этому происходит транскрипция всех кодированных вирусом белков и репликация других вирусных геномов (фиг. 10).
В отличие от описанного приготовления рекомбинантного 8еV Ш с полным геном в кодированной плазмидом кДНК р8еVV-е^БР-АN, -АР и -АБ отсутствует генетическая информация соответственно одного гена Ν, Р или Б. В результате этого приготовленные вначале нуклеокапсиды могут теперь экспри
- 9 015013 мировать два соответствующих гена Ν, Р или Ь. Нужное для размножения р§еУУ-еСРР-ДЫ, -ΔΡ и -ЛЬ нуклеокапсидов количество отсутствующего белка должно вырабатываться, поэтому исключительно посредством управляемой Т7-промотором экспрессии кодированных плазмидом генов Ν, Р или Ь.
Приготовление имеющих ослабленную способность к репликации р8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР и -ЛЬ происходило аналогично приготовлению способных к репликации вариантов 8еУ в НеЬа-клетках (АТСС ССЬ2) или В8Я-Т7-клетках. После 48-часовой инкубации НеЬа-клеток определяли, были ли вирусные частицы р8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР или -ЛЬ высвобождены в надклеточную среду и как много появилось первичных делеционных мутантов.
4.2. Детекция первичных приготовленных 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР или -ЛЬ.
Клеточные среды НеЬа-клеток и В8Р-Т7-клеток, в которых должны были бы быть первично приготовлены 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР или -ЛЬ, исследовали на присутствие этих вирусных векторов. 8еУУ-еСРРЛ^ -ЛР или -ЛЬ, в отличие от рекомбинантного 8еУ \\1. интегрировали в З'-области репортерный ген для еСРР. Этот детекционный маркер применяли теперь для того, чтобы определить, как много образовалось 8еУУ-еСРР-ЛХ.
В параллельных опытах 5х105 клеток Уего (АТСС ССЬ18) с каждым 1 мл клеточной среды трансфицированных при первичном приготовлении 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР, -ЛЬ НеЬа-клеток и одновременно с 8еУ \\1 (МО1=3) коинфицировали с целью транскомплементации отсутствующего белка. В качестве контроля инфицировали клетки Уего или только с 1 мл первично приготовленных 8еУУ-еСРР или же с первично приготовленными 8еУУ-еСРР и одновременно с 8еУ \\1 (МО1=3).
Результат коинфекции клеток с остатками культуры для приготовления 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР или ЛЬ и 8еУ \\1 указывает на то, что все три вирусных мутанта 8еУУ-еСРР-ЛХ могут быть приготовлены первично и после первичного приготовления в состоянии инфицировать клетки, что можно детектировать с помощью проявляющуюся еСРР-трансгенную экспрессию. Первично можно приготовлять примерно 13 х 102 8еУУ-еСРР, 6,7 х 102 8еУУ-еОРР-ЛН 3,2 х 102 8еУУ-еСРР-ЛР и 0,55 х 102 8еУУ-еСРРЛЬ вирусных мутантов.
5. Размножение 8еУУ-еСРР-ЛХ.
Определяли, могут ли размножаться векторы 8еУУ-еСРР-ЛХ, т.е. функциональны ли они биологически. Способность к репликации определяли в первую очередь по выработке белков отсутствующих генов Ν, Р или Ь путем вирусной транскомплементации с 8еУ.
5.1. Подтверждение способности 8еУ к размножению.
Прежде всего нужно было доказать, что мутанты при соответствующей транскомплементации посредством вируса 8еУ \\1 в состоянии размножаться и при этом инфицировать окружающие их клетки. Для изучения способности 8еУУ-еСРР-ЛХ к размножению опять же предлагается коинфекция клеток с 8еУУ-еСРР-ЛХ и 8еУ \\1. Клетки в этом исследовании инфицировали 8еУ \\1 при низкой МО1, коинфицировали с 8еУУ-еСРР-ЛХ и в течение нескольких дней инкубировали, чтобы таким образом можно было детектировать распространение векторов 8еУУ-еСРР-ЛХ по увеличивающемуся количеству флюоресцирующих клеток.
Одновременно в среднем со 100 мл первично приготовленных 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР или -ЛЬ и 8еУ \\1 (МО1=0,2) инфицировали 5х105 клеток Уего. В качестве положительного контроля служила коинфекция клеток Уего с примерно 100 частицами способного к репликации вируса 8еУУ-еСРР и 8еУ \\1. В течение 48-часовой инкубационной фазы наблюдали размножение всех трех делеционных мутантов: сначала, естественно, флюоресцировали только отдельные клетки Уего, которые были коинфицированы 8еУУ-еСРР-ЛХ и 8еУ \\1. Примерно через 24 ч из этих клеток были высвобождены вирусные частицы, которые теперь были в состоянии проникать в прилегающие к ним клетки. Если эти клетки снова инфицировали одновременно с 8еУУ-еСРР-ЛХ и 8еУ \\Ь то и в таких клетках начиналась детектируемая флюоресценция. Размножение 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР и -ЛЬ в коинфицированных \\1 клетках можно было детектировать по этому шлейфообразованию флюоресцирующих клеток через 48 ч после начала культуры и после этого.
В результате этого исследования было выявлено, что геномные кДНК-конструкты, из которых образовались 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР и -ЛЬ, функциональны во всех областях. Кроме того, удалось показать, что при добавлении отсутствующего вирусного белка размножение вирусных мутантов возможно. Достаточно лишь предоставляемого \\1 вирусом белка (например, Р), чтобы размножать не только делеционные мутанты, но и \\Г т.е., возможно, и субоптимальное количество Р-белка приводит к образованию функциональных нуклеокапсидов 8еУ \\1 и 8еУУ-еСРР-ЛР. Путем предоставления отсутствующего белка партнером транскомплементации 8еУ \\1 удалось достигнуть наблюдаемого размножения, регистрируемого по увеличению количества флюоресцирующих клеток, всех 8еУУ-еСРР-ЛХ в повторностях их культуры.
5.2. Определение требуемых для размножения 8еУУ-еСРР-ЛХ белков.
В первую очередь изучили, какие белки должны предоставляться в каждом отдельном случае размножения 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР и -ЛЬ вспомогательной клеткой, если бы нужно было добиться того, что
- 10 015013 бы УеУ белки Ν, Р и Ь могли синтезироваться независимо друг от друга. Для независимого синтеза УеУ белков Ν, Р и В были в распоряжении три рекомбинантных вируса Уасшша (УУ) УУ-Ν, УУ-Р, УУ-Ь, которые рекомбинантно экспримируют УеУ белки Ν, Р или Ь (СгаеЕ, Н. (1994) Типк1юпе11е Сйага1еп81егип§ без гекошЪшаЩеп Зепба1-У1ги8 Ьагде (Ь) Рго1етз. П188ег1а1юп, ЕЪегйагб-Каг18-ип1уег811ае1 ТиеЪтдеп - Г. Греф (1994) Функциональная характеристика рекомбинантного В белка вируса Сендай. Диссертация, Университет Эберхарда - Карла в Тюбингене).
Коинфицировали 1 χ 106 клеток Уего одновременно УеУУ-еСТР-АХ или УеУУ-еСТР (МО1=0,01) и УУ. УУ-Ν, - Р и -В использовали при этом по отдельности или в комбинациях (МО1=0,5). После одночасового периода абсорбции произошла замена питательной среды ЭМЕМ + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ТКУ) + цитозин-арабинозид (АгаС) (100 мкг/мл) и клетки инкубировали в течение 72 ч при 33° С, причем питательную среду меняли ежедневно, чтобы добавить АгаС.
Распространение УеУУ-еСТР-АХ определили на основании еСТР-экспрессии через 72 ч. За это время в положительных опытах было выявлено увеличение количества флюоресцирующих зеленых клеток с одной первичной клетки до 10-30 соседних, флюоресцирующих клеток.
Результаты исследования, направленного на выявление того, какие УеУ белки необходимы для размножения ЗеУУ-еСТР-ΑΝ, -АР или -АЬ в клетках Уего, приведены в табл. 2. Экспрессия вирусом УУ-Ν только лишь УеУ Ν не приводит к размножению ЗеУУ-еСТР-ΑΝ. ЗеУУ-еСТР-ΑΝ размножается только в том случае, если УеУ белки Ν и Р с помощью рекомбинантных вирусов Уасшша УУ-Ν и УУ-Р в инфицированных клетках экспримируются одновременно. УеУУ-еСТР-АР может размножаться отдельно в результате экспрессии УеУ Р-белков с помощью УУ-Р в клетках Уего. Для размножения ЗеУУ-еСТР-АЬ необходим одновременный синтез белков Р или В вирусом УУ. В ЗеУУ-еСТР-АЬ и инфицированной только лишь УУ-Ь клетке Уего размножения ЗеУУ-еСТР-АЬ не происходит.
Табл. 2. УеУ белки, необходимые для размножения УеУУ-еСТР-АХ
ΐη νϊίΐΌ-размножение с помощью УУ | ||
δενν-εΟΕΡ-ΔΝ | Ν- | (Ν + Ρ) + |
8еУУ-еСЕР-АР | Р + | (Ν + Р) + |
ЗеУУ-еСЕР-АЬ | Г- | (Ь + Р) + |
Для размножения Зе'УУ-е'СВР-вспомогательная клетка должна экспримировать одновременно УеУ белки Ν и Р, для размножения УеУУ-еСТР-АР достаточно экспрессии УеУ Р-белка во вспомогательной клетке, а амплификация ЗеУУ-еСТР-АЬ была бы возможной в результате клеточной экспрессии УеУ белков Р и В.
5.3. Поддержка амплификации УеУУ-еСТР-АХ вспомогательными клетками Н29.
Изучение размножения УеУУ-еСТР-АХ проводили с помощью клеточной линии Н29. Для этого 1 χ 106 клеток Н29 в 4 разных опытах соответственно инфицировали с примерно 100 первично приготовленными в НеЬа-клетках вирусными частицами 8еУУ-еСВР-А\, -АР или -АЬ или в качестве контроля для успешного размножения способного к репликации УеУ в клетках Н29 с примерно 100 вирусными частицами УеУУ-еСТР. Начиная с 1-го по 10-й день после инфицирования определяли размножение УеУУеСТР-АХ путем регистрации шлейфообразного распространения флюоресцирующих клеток (образование пятна от первично инфицированной клетки Н29.
В контрольном опыте зарегистрировано размножение УеУУ-еСТР, от единично флюоресцирующих клеток в 1-й день после инфицирования до пятен из флюоресцирующих клеток в количестве до 50 на 3-й день после инфицирования. Таким образом было установлено, что при выбранной методике проведения эксперимента осуществляется размножение УеУ.
В инфицированных УеУУ-еСТР-А\ клетках Н29 также происходило размножение вируса. Наряду с клетками Н29 (производное от человеческих почечных клеток 293) для размножения вируса пригодны также производные клеток Уего (почечные клетки африканской зеленой мартышки) и производные ГЬСМК2-клетки (почечные клетки резус обезьяны), стабильно трансфицированные УеУ Р и Ν-генами.
В опыте с УеУУ-еСТР-АР через 1 день были детектированы 100 первично инфицированных отдельных клеток. Через 3 дня после начала опыта примерно 70% флюоресцирующих отдельных клеток превратились в пятна, в которых было до 30 флюоресцирующих клеток. Таким образом, удалось точно выявить распространение УеУУ-еСТР-АР на расположенные вокруг клетки Н29. Тем самым впервые стало возможным размножить вирусный вектор УеУ, у которого делегирована Р-ОКТ. Характеристика размножения УеУУ-еСТР-АР будет приведена в следующем подпункте.
5.4. Размножение УеУУ-еСТР-АР в Н29-клетках.
УеУУ-еСТР-АР может быть амплифицирован выработанными вспомогательными Н29-клетками УеУ Р-белками. Высвобожденные делеционные Р-мутанты в состоянии инфицировать прилегающие клетки Н29. Анализ распространения УеУУ-еСТР-АР ограничен в данном случае сравнением его с распространением способного к репликации УеУУ-еСТР.
Для этого инфицировали 1 χ 106 клеток Н29 в среднем 100 УеУУ-еСТР-АР или УеУУ-еСТР. Через 3, 5 и 10 дней культуры с помощью флюоресцентного микроскопа происходила детекция флюоресцирую
- 11 015013 щих зеленым клеток.
Размножение 8еУУ-еОРР-ДР удалось провести успешно благодаря клеточной выработке 8еУ Рбелков. Во все даты наблюдений было видно, что 8еУУ-еОРР-ДР и 8еУУ-еОРР успешно размножаются на клетках Н29.
В противовес этому, распространения 8еУУ-еОРР-ДР на клетках, которые не вырабатывают отсутствующий Р-белок (клетки-мишени, например клетки Уего), не отмечено, что подтверждает ослабленность способности 8еУУ-еОРР-ДР к репликации (см. пункт 8).
5.5. Генная экспрессия 8е-еОРР-ДР в инфицированных клетках-мишенях.
Удалось подтвердить отсутствие размножения 8еУУ-еОРР-ДР на типах клеток, которые не вырабатывают Р белок ίη 1гаи8. Одновременно ниже ожидаемого уровня была степень выраженности экспрессии.
Как и в случае с -ДР мутантами вируса бешенства, (81юф е1 а1. (2004) У1го1о§у 318, 295-305) слабая еОРР-флюоресценция проявилась только у некоторых инфицированных клеток (меньше 5% см. фиг. 11), хотя статистически при МО1=1 фактически каждая из примерно 70% клеток была инфицирована вирусной частицей. И при большем значении МО1=5 можно было наблюдать только отдельные светящиеся изза 8еУУ-еОРР-ДР зеленым клетки Уего (см. фиг. 12, вверху слева).
Это подтверждает гипотезу о том, что после инфицирования клетки вирусом с отсутствующим Р геном возможна только первичная транскрипция посредством введенного полимеразного комплекса из вирусной частицы. В случае 8еУ ДР-мутантов, кроме того, видимо, к тому способны только несколько процентов инфицированных клеток или генную экспрессию можно наблюдать только тогда, когда в клетке находится одновременно несколько транскрибируемых нуклеокапсидов.
Для терапевтического применения этого обладающего слабой способностью к репликации 8еУУ выраженность экспрессия, Вероятно, очень слаба или нужно было бы использовать несоразмерно много частиц 8еУУ ДР в расчете на одного пациента. Поэтому желательно применять вариант 8еУУ с ослабленной способностью к репликации, который осуществляет также вторичную транскрипцию. Это дает возможность разрабатывать другие модифицированные полимеразные комплексы, которые не могут реплицировать вирусный геном, но обладают способностью к повышенной экспрессии терапевтического гена или антигена.
6. Приготовление модифицированного 8еУУ-еОРР-ДР кДНК конструкта.
Для возможного улучшения транскрипционной деятельности 8еУУ с дефицитом Р гена в клеткемишени был приготовлен другой рекомбинантный конструкт, который в позиции первичной Рсчитывающей рамки кодирует укороченную Ν-конца на 76 аминокислоты форму Р-белка (р8еУУ-еОРРРД2-77; см. пункт 3.1 и фиг. 8В).
Получение 8еУУ-еОРР-РД2-77 частиц и их размножение происходили аналогично пунктам 4.1 и 5.4.
6.1. Размножение 8еУУ-еОРР-РД2-77 во вспомогательных клетках Н29.
В инфицированных р8еУУ-еОРР-РД2-77 вспомогательных клетках Н29 укороченный с Ν-конца на 76 аминокислот, кодированный вирусом РД2-77-белок синтезируется вместе с клеточно кодированным Р-белком.
Для изучения влияния экспрессии укороченного Р-белка РД2-77 на вирусную репликацию инфекцию (МО1=3) клеток Н29 8еУУ-еОРР-РД2-77, 8еУ-еОРР-ДР или контрольным вирусом 8еУ-еОРР проводили способом, аналогичным описанному при изложении кинетики роста 8еУУ-еОРР-ДР. Клеточные среды отдельных повторностей опыта на протяжении 120 ч анализировали способом тестирования на дозу инфицирования клеток, определяя титр вирусного потомства по числу еОРР-экспримирующих клеток.
Из одной инфицированной 8еУ-еОРР Н29-клетки (положительный контроль) в течение 120 ч высвобождалось в среднем 80 вирусных частиц, причем транскомплементация Р-белка клетками Н29 в данном случае необходимой не являлась. 8еУУ-еОРР-РД2-77 мог в Н29-транскомплементационной системе размножаться примерно с такой же эффективностью, как 8еУУ-еОРР-ДР: из инфицированных клеток Н29 по истечении 120 ч высвобождалось примерно 20х106 вирусных частиц 8еУУ-еОРР-ДР или 8еУУеОРР-РД2-77, что соответствует примерно 40 высвобожденным вирусным частицам Р-мутантов в расчете на одну клетку Н29.
7. Сравнение генной экспрессии 8еУУ-еОРР-ДР и 8еУУ-еОРР-РД2-77 и количественное выражение синтеза белка в инфицированных клетках-мишенях.
Для выяснения того, проявляет ли вектор 8еУУ-еОРР-РД2-77 в инфицированных клетках повышенную трансгенную экспрессию - по сравнению с 8еУУ-еОРР-ДР - подробно характеризовали кодированную вирусами экспрессию репортерного гена еОРР, а также ΗΝ белка.
Инфицировали (МО1=1) 8еУУ-еОРР-РД2-77 5х105 клеток Уего, причем на второй день после инфицирования можно было наблюдать примерно 70% флюоресцирующих клеток Уего (не показано). Это означает, что почти каждый ΚΝΓ-комплекс этого вирусного векторного варианта в состоянии вызывать
- 12 015013 измеряемую транскрипцию в клетке-мишени.
7.1. Количественное выражение еСЕР-экспрессии с помощью ЕАС8-анализа.
Транскрипционная кассета, в которой репортерный ген еСЕР был встроен в 8еУУ-еСЕР-РД2-77, должна при последующем применении в медицинских целях кодировать антиген какого-нибудь патогена, например, требующегося вируса. Экспрессия антигена должна быть достаточной для того, чтобы вызвать у пациента защитный иммунный ответ.
Для того чтобы убедиться, что каждый 8еУУ-еСЕР-РД2-77 нуклеокапсид, инфицировавший клетку, в состоянии осуществить детектируемую экспрессию трансгена, одинаковое число клеток Уего и клеток Н29 инфицировали одним и тем же количеством вирусных частиц и с помощью ЕЛС8 (сортинг флюоресцентно активированных клеток) - анализа при использовании проточного цитометра ЕАС8-СайЬиг сравнивали число экспримирующих еСЕР клеток Н29 и клеток Уего. Данные обрабатывали с помощью компьютерной гистограммы, сопоставляя флюоресцентные сигналы инфицированных клеток с общим количеством клеток.
Инфицировали 2,5 х 105 клеток Уего или клеток Н29 8еУУ-еСЕР-РД2-77 или вирусом 8еУУ-еСЕРДР с дефицитом гена Р при МО1=1. ЕАС8-анализ проб проводили через 24 ч после инфицирования. Инфицированные клетки собирали в РВ8 и методом проточной цитометрии определяли количество флюоресцирующих клеток. Результат в виде доли [%] флюоресцирующих Уего- и Н29-клеток показан на фиг. 11.
Через 24 ч после инфицирования вспомогательных клеток Н29 вирусом 8еУУ-еСЕР-ДР путем ЕАС8-анализа удалось детектировать 86% экспримирующих еСЕР клеток Н29. В данном случае клеточный синтез Р-белка поддерживает образование нового Р: Ь-комплекса и, тем самым, выработку новой мРНК, что приводит к синтезу еСЕР-белков в инфицированной клетке. Если же клетки Уего были инфицированы 8еУУ-еСЕР-ДР, то ни через 24 ч после инфицирования, ни в более поздние сроки в других повторностях опыта экспрессии еСЕР-белка обнаружить не удалось. Трансферированные нуклеокапсидами 8еУУ-еСЕР-ДР Р: Ь-комплексы при инфицировании с МО1=1 не в состоянии привнести детектируемую экспрессию в инфицированные клетки Уего.
Зато через 24 ч после инфицирования 8еУУ-еСЕР-РД2-77 удалось идентифицировать ЕАС8анализом почти 80% экспримирующих еСЕР клеток Н29 и также 75% экспримирующих еСЕР клеток Уего. При инфицировании клеток Н29 транскрипция еСЕР мРНК может поддерживаться клеточным синтезом Р-белка и, тем самым, новыми Р: Ь-комплексами. При инфицировании клеток Уего 8еУУ-еСЕРРД2-77 транскрипция усиливается новым синтезом укороченного с Ν-конца Р-белка РД2-77.
Из приведенных результатов можно сделать важный вывод о количестве способных к транскрипции 8еУУ-еСЕР-РД2-77: клетки Н29 и клетки Уего инфицировались при МО1=1. Теоретически возможные многократные инфицирования одной клетки в обоих повторениях статистически маловероятны. Через 24 ч после инфицирования идентифицировали почти 80% экспримирующих еСЕР клеток Н29 и примерно 75% экспримирующих еСЕР клеток Уего. Из всего этого можно заключить, что каждый КНРкомплекс с укороченным Р-вариантом РД2-77, который способен к экспрессии трансгенов в Рвспомогательной клетке, также вызывает экспрессию трансгенов в инфицированной клетке-мишени. В отличие от этого, вариант 8еУУ-еСЕР-ДР с полной делецией Р ОРТ таким свойством не обладает.
7.2. Функциональный тест экспримированного в инфицированной клетке-мишени ΗΝ-белка.
С помощью гемаадсорбционного (НАЭ)-теста определяли на отдельных инфицированных клетках эффективность адсорбции человеческих эритроцитов и тем самым эффективность экспозиции вирусных ΗΝ-белков (фиг. 12).
х 105 клеток Уего инфицировали 8еУУ-еСЕР-РД2-77 при низком МО1=0,5. В отличие от этого, клетки Уего в случае 8еУУ-еСЕР-Д нужно было инфицировать при 10-кратно большей МО1=5, чтобы вообще можно наблюдать отдельные флюоресцирующие клетки. После 1-часовой адсорбции заменяли среду ЭМЕМ + 10% ЕВ8. Затем клетки в течение нескольких дней инкубировали при 33°С. Экспрессию трансгенов для двух векторных вариантов сначала определяли с помощью еСЕР-флюоресценции. На 5-й и 9-й дни после инфицирования проводили серии (НАЭ)-тестов, чтобы проанализировать экспозицию вирусных ΗΝ-белков на основании адсорбции человеческих эритроцитов.
Хотя в случае 8еУУ-еСЕР-ДР при МО1=5 статистически должны бы быть инфицированы 99,3% клеток Уего, под микроскопом удалось наблюдать только лишь 0,01% еСЕР-положительных клеток (фиг. 12 вверху слева). Наоборот, с 8еУУ-еСЕР-РД2-77 можно было согласно ожиданиям наблюдать зеленую флюоресценцию при МО1=0,5 в 40% клеток (фиг. 12 внизу слева).
Через 2 дня после инфицирования 8еУУ-еСЕР-ДР только половина еСЕР-положительных клеток (25 из 5х105 инфицированных) была способна закреплять на своей поверхности эритроциты (фиг. 12 вверху в середине). После дальнейшей инкубации и очередного НАЭ-теста на инфицированных клетках адсорбции эритроцитов больше не происходило. Со вторым с ослабленной способностью к репликации 8еУУ вариантом 8еУУ-еСЕР-РД2-77 опять были получены значительно лучшие результаты: через 5 дней после инфицирования примерно 40% инфицированных клеток (МО1=0,5) были в состоянии адсорбиро
- 13 015013 вать эритроциты на своей поверхности (фиг. 12 внизу в середине). При этом у отдельных клеток можно было наблюдать различную активность связывания от 10 до 70 адсорбированных эритроцитов. Тем самым было показано, что инфицированные 8еУУ-еСЕР-РД2-77 клетки через 5 дней после инфицирования в состоянии экспонировать ΗΝ-белки на поверхности клеток, функциональный ΗΑΌ-тест может оцениваться как положительный. Одновременно на основании различных количеств адсорбированных эритроцитов удалось выявить эффективную экспрессию ΗΝ-белка в инфицированных клетках.
Инфицированные клетки продолжали инкубировать при 33°С, причем нейраминидазная активность ΗΝ-белка приводила к отделению прикрепленных к инфицированным клеткам эритроцитов. Клетки промывали, чтобы удалить отделившиеся эритроциты и инкубировали еще на протяжении 4 дней при 33°С. Очередной ΗΆΌ-тест провели на 9-й день после инфицирования. Теперь удалось детектировать только лишь 30% ΗΆΌ-положнтельных клеток Уего. При этом число прикрепленных красных кровяных телец уменьшилось до 5-20 эритроцитов на одну клетку.
Следовательно через 9 дней после инфицирования имевшим ослабленную способность к репликации вариантом 8еУУ-еСЕР-РД2-77 синтезировалось все еще достаточно функциональных ΗΝ. В противовес этому, вариант 8еУУ-еСЕР-ДР с полной делецией Р ОРЕ такими свойствами не обладает.
7.3. Количественное выражение еОРР-экспрессии с помощью анализа ХУеЧегп Βίοι.
Полуколичественная оценка еОРР-экспрессии обладающего ослабленной способностью к репликации 8еУ-вектора в сравнении со способным к репликации 8еУ-еСЕР была проведена с помошью анализа ХУеЧегп Βίοι путем серийных разведений клеточного общего белка.
5х105 клеток Уего (МО1=3) инфицировали 8еУ-еСЕР или 8еУУ-еОЕР-РД2-77. Через 24 ч после инфицирования произошло растворение клеток; после чего серийное разведение (1:2) клеточных экстрактов от 20 мкг до 2,5 мкг общего количества разделяли с помощью 8Э8-РАОЕ. Белки переносили на РУЭР-мембрану и с помощью ХУеЧегп Βίοι анализа определили кодированный вирусом еСРР-белок (26 кДа) (фиг. 13).
С помощью ХУеЧегп Βίοι анализа флюоресцентный белок еСЕР обнаруживали в клетках Уего, инфицированных как в 8еУ-еСЕР, так и в 8еУУ-еСЕР-РД2-77. Сравнение интенсивности еСЕР-сигналов подтверждает, что экспрессия для 8еУУ-еСЕР-РД2-77 с ослабленной способностью к репликации была меньше примерно в 16 раз по сравнению со способным к репликации 8еУУ-еСЕР.
Уменьшение в 16 раз при этом является небольшим и позволяет сказать, что 8еУУ-еСЕР-РД2-77 несмотря на модифицированный Р-белок может обеспечивать очень эффективную вторичную транскрипцию.
7.4. Оценка ΗΝ-экспрессии с помощью ХУеЧегп Βίοι анализа.
ΗΝ-белок 8еУ является, в отличие от еСЕР-белка, мембранным поверхностным белком и представляет собой важный антигенный детерминант. Путем относительной количественной оценки интенсивности экспрессии ΗΝ-белка в инфицированных 8еУУ-еСЕР-РД2-77 клетках оказалось возможным оценивать интенсивность экспрессии ΗΝ-антигена 8еУ.
Полуколичественная оценка ΗΝ-экспрессии для обладающего ослабленной способностью к репликации 8еУ-вектора в сравнении со способным к репликации 8еУ-еСЕР проводилась с помощью ХУеЧегп Βίοι анализа серийных разведений клеточного общего белка. 5х105 клеток Уего инфицировали в 2 параллельных повторностях 8еУ-еСЕР или 8еУУ-еСЕР-РД2-77 (МО1=1) и инкубировали в течение 24 и 48 ч. Затем происходило растворение клеток; в серийные разведения (1:2) клеточных экстрактов от 16 мкг до 2 мкг общего количества разделяли в 8Э8-РАОЕ. Белки переносили на РУЭЕ-мембрану и определяли кодированный вирусом ΗΝ-белок (60 кДа) с помощью моноклонального ΗΝ-антитела (фиг. 14).
ΗΝ-белок в случае инфицированных 8еУ-еСЕР клеток Уего после обоих периодов инкубирования можно было эффективно детектировать на всех дорожках (от 16 до 2 мкг общего белка; дорожки 2-5 слева и справа). В случае 8еУУ-е6РР-РД2-77 полоса ΗΝ-белка еще видна в дорожках с 16 и 8 мкг общего белка (дорожки 7, 8), однако гораздо слабее. Относительная количественная оценка ΗΝ-экспрессии в инфицированных 8еУУ-е6РР-РД2-77 клетках Уего по сравнению с 8еУ-еСЕР проводилась путем сопоставления дорожек с 16 и 8 мкг относительно 2 мкг общего белка (дорожки 7 и 8 относительно 5, слева и справа) и дает основание считать уменьшение ΗΝ-экспрессии в Р-делеционном варианте 8-16-кратным, независимо от продолжительности инкубации. На основании это можно сделать вывод об относительно высокой степени транскрипции в инфицированных 8еУУ-еСЕР-РД2-77 клетках и вместе с тем о высокой в целом экспрессии трансгена вирусного вектора с ослабленной способностью к репликации.
С учетом обоих измерений (еСЕР- и ΗΝ-белок) можно исходить из среднего уменьшения экспрессии в 10 раз.
8. Ослабленная способность к репликации у 8еУУ-еСЕР-РД2-77 в клетке-мишени.
Если клетки Уего инфицируют способным к репликации 8еУУ-еСЕР, вокруг первично инфицированных, сильно флюоресцирующих клеток в последующие два дня образуется пятно из других флюоресцирующих клеток в количестве до тысячи. Чтобы доказать ослабленную способность 8еУУ-еСЕР-РД2-77 к репликации в клетках Уего, нужно было подтвердить отсутствие увеличения флюоресцирующих зеленым клеток вокруг первично инфицированной клетки-мишени с учетом естественной скорости деления
- 14 015013 клеток Уего. Клетки Уего делились в среднем каждые 24 ч. Если клетки Уего инфицированы 8еУУеОЕР-РД2-77, детектируемую еОЕР-экспрессию можно наблюдать примерно через 24 ч. Отмечали, что после последующей 24-часовой фазы инкубации из этой первично инфицированной, флюоресцирующей клетки Уего в результате естественного деления в некоторых случаях возникают две (слабее) флюоресцирующие дочерние клетки. Это наблюдение не имеет никакого отношения к размножению вируса, при котором из одной инфицированной клетки высвобождается от 101 до 104 вирусных частиц, которые затем инфицируют расположенные поблизости клетки. Эта естественная интенсивность деления инфицированных клеток оказывает, с другой стороны, влияние на интенсивность еОЕР-экспрессии, которая с увеличением количества делений клеток уменьшается. Это наблюдение показывает, что вирусный вектор 8еУУ-еСЕР-РД2-77 является ослабленным в отношении репликации генома, следовательно новые геномы синтезироваться не могут. Если несколько следующих друг за другом делений инфицированной клетки приводят к непрерывному уменьшению интенсивности флюоресценции, пока она наконец не прекратится, то размножение вируса можно исключить.
Для окончательного подтверждения ослабленной репликационной способности 8еУУ-еСЕР-РД2-77 в клетках-мишенях было проведено последнее исследование.
Роллер Т75 засевали примерно 20 χ 106 клетками Уего. Клетки уже до начала инкубационной фазы были высеяны с высокой плотностью и поэтому не проявляли больше сильной активности деления. Далее клетки Уего инфицировали 8еУУ-е6ЕР-РД2-77 с МОГ=0,001. Смену среды ΌΜΕΜ с 5% ЕК8 (для уменьшения активности деления) происходила после одночасового инкубационного периода и клетки Уего инкубировали при 33°С (Р1). Через 2 дня после инфицирования удалось наблюдать, соответственно примененной МОГ=0,001, несколько тысяч отдельно расположенных первично инфицированных, флюоресцирующих клеток Уего. Из-за высокой плотности клеток в последующие 4 инкубационных дня деления клеток практически не происходило, т.е. количество первично инфицированных клеток, детектированных по флюоресценции, не менялось. Если бы в этих клетках образовались вирусные частицы, они бы могли инфицировать расположенные рядом клетки, что отразилось бы в усилении флюоресценции. Распространения вирусного вектора из-за отсутствия новых инфекций окружающих клеток не было и через 8 дней. Для обеспечения клеток свежей средой надклеточную среду удаляли, и клетки Уего покрывали новой средой. Через 12 дней после начала инкубации клетки Уего отделились от субстрата. В течение всего периода проведения опыта не проявлялось никакой репликации вирусного вектора в форме увеличения количества флюоресцирующих клеток. Следовательно, удалось исключить распространение 8еУУ-еСЕР-РД2-77 путем выработки новых вирусных геномов и частиц от первично инфицированных клеток на расположенные вокруг клетки Уего. Поэтому 8еУУ-еСЕР-РД2-77 можно считать вирусным вектором с ослабленной способностью к репликации.
Резюме.
Приведенные выше результаты показывают, что путем целенаправленной манипуляции с генами компонентов полимеразного комплекса можно приготовить вирусы с РНК с негативной цепью с ослабленной способностью к репликации, которые в состоянии транскрибировать кодированные вирусами гены, но не могут больше реплицировать вирусный геном.
В случае вируса Сендай специально исследовано детальнее два варианта, в которых ген для полимеразного кофактора фосфо-белка делетировали или полностью, или удаляли кодоны для аминокислот 2 - 77 (8еУУ-е6ЕР-РД2-77). Оба 8еУ вектора в клетках, которые предоставляют Р белок не ίη 1гап5 (так называемые клетки-мишени), имеют ослабленную способность к репликации, однако сильно отличаются по эффективности своей генной экспрессии.
Хотя в случае 8еУУ-еСЕР-ДР при МОГ=5 статистически инфицированными остаются только 0,7% вирусных клеток - 99,3% должны бы содержать, по меньшей мере, один КНР-комплекс - под микроскопом удалось наблюдать только 0,01% еОЕР-положительных клеток. Из этого путем расчетов можно прийти к выводу, что видимая трансгенная экспрессия имеет место только тогда, когда в инфицированной клетке одновременно присутствуют 15 или больше КНР 8еУУ-еСЕР-ДР.
Этот 8еУУ с дефектным геном Р проявляет такую же слабую экспрессию, как и аналогичный ДРвариант бешенства (8Ко_ц е! а1., см. выше). Оба вектора в инфицированных клетках способны только к первичной транскрипции с помощью привнесенного полимеразного комплекса из вирусной частицы. Для терапевтического же применения вектора желательна более сильная экспрессия кодированного трансгена или антигена. Это условие может быть выполнено с помощью имеющего ослабленную способность к репликации варианта 8еУУ-еСЕР-РД2-77. который в клетках-мишенях обеспечивает в среднем в 10 раз меньшую интенсивность экспрессии по сравнению со способным к репликации 8еУ. Благодаря присутствию в геноме гена Ν-терминально укороченного Р белка возможна не только первичная, но и вторичная транскрипция. Она обеспечивается недавно появившимися, модифицированными полимеразными комплексами, которые содержат кодированный вектором РД2-77 белок; он, однако, не поддерживает репликационный режим полимеразы.
Путем количественной характеристики синтеза белка в инфицированных клетках-мишенях доказано, что имеющий ослабленную способность к репликации вирусный вектор 8еУУ-еСЕР-РД2-77 в со
- 15 015013 стоянии осуществлять эффективную транскрипцию и экспрессию кодированных вирусом генов. При этом эффективно синтезируется не только З'-проксимальный трансген (еСЕР); также по меньшей мере через 9 дней после инфицирования транскрибируется расположенный в геномной позиции 6 ΗΝ-ген, функционально активный продукт которого экспонируется на инфицированных клетках-мишенях.
9. Определение иммунного ответа индуцированного РНК-вакциной с ослабленной способностью к репликации, на модели на мышах.
Было показано, что в результате делиции в Р-гене (РД2-77) возникает измененный вирусный полимеразный комплекс, который больше не обеспечивает синтеза новых геномов. Одновременно после инфицирования такими вирусами с ослабленной способностью к репликации определенная в клеткемишени экспрессия вирусных генов приблизительно в 10 раз меньше по сравнению с инфицированием способным к репликации вирусом.
Для доказательства достаточной иммуногенной способности обладающего ослабленной способностью к репликации вируса с РНК с негативной цепью в вирусный геном встроили антигены или антигенные детерминанты двух гетерогенных вирусов (человеческого парагриппозного вируса типа 3, БРГУ3, и респираторного синциального вируса, Р8У). Для этого был выбран 8еУ РД2-77 с ослабленной способностью к репликации, в котором гены первичных поверхностных белков Е и ΗΝ заменены на гены, которые кодируют химерные Е и ΗΝ белки 8еУ/БРГУ3. Химерный Е-белок содержит 558 аминокислот и состоит из внеклеточного домена 11Р1У3 (493 аминокислоты), трансмембранного домена 8еУ (23 аминокислоты) и цитоплазматического домена 8еУ (42 аминокислоты). Химерный ΗΝ-белок имеет 579 аминокислот и состоит из цитоплазматического домена 8еУ (35 аминокислот), трансмембранного домена 8еУ (25 аминокислот), а также внеклеточного домена 11Р1У3 (519 аминокислот). Аминокислотные последовательности химерного Е-белка и химерного ΗΝ-белка в перечне последовательностей приведены под номерами 8ЕО ΙΌ № 27 и 28.
В результате инсерции химерных генов в вирусный геном создаются новые антигены и одновременно обеспечивается эффективное объединение вакцинных частиц при их приготовлении.
В дополнительной экспрессионной кассете, встроенной между двумя вирусными генами, происходило кодирование поверхностного белка Е В8У, в результате чего конструкт был увеличен до бивалентной вакцины.
Эта новая вакцина проверена в модели на животных. Группы мышей Ва1Ь/С трижды с интервалом 3 недели иммунизировали интраназально двумя разными вирусными препаратами (каждая из групп А и С по 104 инфекционных единиц), контрольная группа (В) получала вместо вакцины РВ8. После третьей иммунизации отбирали для анализа мукозного иммунного ответа назальную промывочную жидкость (ΝΑ), а также проводили бронхоальвеолярные полоскания (ВЛЬ) и изолировали для анализа гуморального иммунного ответа сыворотку. С помощью ЕЫ8Л определяли количество индуцированных иммунглобулинов ГдА и ГдС, специфичных для БРГУ, а также Р8У. Прототип вакцины с ослабленной способностью к репликации вызывал явную индукцию ГдА-антител, специфичных для 11РГУ (фиг. 15А), индукция анти- Р8У ГдА-антител проявлялась слабее (не показано). Индукция гуморального ответа на поверхностные антигены обоих вирусов обеспечила сравнимые титры, количество специфичного ГдС отличается в 2 раза (фиг. 15 В). Более глубокий анализ анти- БР1У3-ГдС показал, что индуцированные антитела проявляют нейтрализующие свойства (титр 1/64). В отличие от этого у контрольной группы не удалось выявить - как и ожидалось - какой бы то ни было специфичной ГдА- или ГдС-индукции.
Соответствующая изобретению вакцина не могла индуцировать специфичного мукозного и гуморального ответа на чужеродные вирусные антигены. Дополнительные эксперименты показали, что лимфоциты иммунизированных мышей продуцировали интерферон-7, в то время как ГЬ-5 обнаружить не удалось. Этот результат указывает на то, что бивалентная, с ослабленной способностью к репликации РНК-вакцина в состоянии индуцировать Т-клеточный иммунный ответ, который является предпосылкой длительно сохраняющегося иммунитета.
Резюме.
После инфицирования подопытных животных модифицированным вектором, в котором были использованы последовательности, кодирующие антигены двух чужеродных вирусов, была выявлена индукция нейтрализующих антител. Это свидетельствует о потенциале имеющих ослабленную способность к репликации вирусов с РНК с негативной цепью для разработки новых вакцин.
9. Список применявшихся ДНК-олигонуклеотидов.
Применявшиеся в вышеприведенных примерах ДНК-олигонуклеотиды перечислены в нижеследующей табл. 3
- 16 015013
Таблица 3
Порядковый номер последовательности | Обозначение | Длина [ηΐ] | Последовательность 5’-» 3’ | Тт[°С] |
1 | Х1 = М13 | 19 | ООАААСАОСТАТОАССАТО | 54 |
2 | ХК+) | 59 | ООАТСАТТАОТАССТТОААОССТСОТАОАТ СОС ООССОСОТОААСТТТООСАОСАААО | 56 |
3 | XII | 57 | ООСТТСМООТАСТААТОАТССОТАОТААОААА ААСТТАОООТОАААОТАТТССАСС | 64 |
4 | XII (+)=Ν- - 1029 (+) | 18 | ООТАООТОТСТАТОАООС | 56 |
5 | XX | 44 | ООААССААААОСООССОССООСОООАТСА ТАСОАООСТТСААОО | 61 |
6 | ХХ(+) | 57 | ССТОТОТТТСТОСООССОССОТТСОСОАООС С ООСССОТОААСТТТООСАОСАААОС | 61 |
7 | ΝοίΙ еОРР | 44 | СОСОООСССООООСООССОСОТСОССАССА Т ООТОАССААООСС | 60 |
8 | еОРРАо?/(+) | 26 | ОАТОСАТОСТСОАОСООССООТТТАС | 58 |
9 | 8§гА1 еОРР | 36 | ООАТТАСТАТСОССООССОТСОССАССАТО ОТ САОС | 61 |
10 | еОРР 8§гА1 (+) | 37 | СОСТААСТОТСОССООСОТТТАСТТСТАСАО СТ сотсс | 63 |
11 | Еае1 ОзКеб | 36 | СООАТСААОТООССООССОТСОССАССАТО ОТ ССОС | 59 |
12 | ϋδΚεά Ряе1 (+) | 42 | СОСОААТАТСООССООССААОТСТАСАОСА АС АООТООТООС | 63 |
13 | ΔΝΙ = Μ13 | 19 | ООАААСАОСТАТОАССАТО | 54 |
14 | ΔΝΙ(+) | 35 | СООТОСОООСССОСАСОТОААСТТТООСАС СА ЛАОС | 50 |
15 | ΔΝΙΙ | 28 | ОТТСАСОТОСОООСССОАТСАТАСОАОО | 44 |
16 | ΔΝΙΙ(+) =Ρ-2892 (+) | 19 | СОСОТСТСОООАТОАТТСО | 62 |
17 | ΔΡΙ=Ν-578 | 17 | СССТОАСАСАСТССТТС | 54 |
18 | ΔΡΙ(+) | 31 | ОСОССОСТСОАООСООТААОТОТАОССОАА п | 64 |
19 | ΔΡΙΙ | 34 . | ССТОСОСТСОАОСТС АТСССОООТОАООС А ТС СС | 64 |
20 | ΔΡ II (+) | 34 | ООСОАСССОТСАОТСТСАСАОССТААТТСО | 64 |
21 | ХЬо! ΡΔ2-77 | 47 | СССССТТ1 ПС1СОА0АТОТСОАСССААОАТАА ТСОАТСАООТОАОО | 84 |
22 ’ | ΡΔ2-77 (+) ХЬо1 | 46 | ТТТТТССССССТСОАОТТАСТАОТТОСТСАО ТО АСТСТАТОТССТС | 80 |
23 | ДЫ = Р-4871 | 20 | АОСАТАТАТССАОАООТСАС | 58 |
24 | ΔΤΙ (+) | 38 | ОООАСТААТТАОТСОООСССОАСС | 58 |
25 | ΔΡΙΙ | 31 | ОСАСТТОООСССОАСТААТТАОТСССТС | 60 |
26 | ЛЬ II (+) | 21 | СОААТООСОСОССТОАТОСОО | 64 ~ |
- 17 015013
ЗедиепгргококоИ
<110> | Мах-Р1апск-Сезе118С11а£Е е.У. | гиг Ебгбегипд бег Зл31ззепзсЪ.а£кеп |
<120> | К.ер11каЫопзбе£1г1еп-Ье : | ЕША-Уггеп а!з 1трзко££е |
<130> | 337783? ТО | |
<150> <151> | ϋΕ102005006388.8 2005-02-11 | |
<1б0> | 28 | |
<170> | РакепЫп тегзхоп 3.3 | |
<210> <211> <212> <213> | 1 19 ΏΝΑ кйпзШске Зедиепг | |
<220> <223> | ОИдопик1еоЫс1 | |
<400> | 1 |
ддааасадск акдассакд <210>
<211>
<212>
<213>
ΠΝΆ кйпзкИсЬе Зедиепг <220>
<223>
О1±допик1еоЫб <400>
ддаксаккад Ьасс'Ькдаад ссксд-еадак сдсддссдсд
ЕдаасЕЕЕдд садсааад <210>
<211>
<212>
<213>
ϋΝΑ кипзкИске Зедиепг <220>
<223>
011допик1еоЫс1 ддср-Ьсаадд каскаакда!: ссдкадкаад <400>
ааааасккад ддЕдагадка ЕЕссасс <210> 4 <211> 18 <212> 0ΝΑ <213> кипзкИске Зедиепг <220>
- 18 015013 <223> 011допик1еоЕхс1 <400> 4 дд-ЕаддЬд-Ьс Еакдаддс <210>
<211>
<212>
<213>
ΌΝΆ кйпзЕИсЬе Зедиепг <220>
<223>
О1±допик1еоЫс1 ддааддаааа дсддссдссд дсддда1:са1г <400>
асдаддс-Ысс аадд <210>
<211>
<212>
<213>
ϋΝΆ кйпзЕИсЬе Зедиепг <220>
<223>
ОИдопикТеоЪШ <400>
сс'кдЪд'Ь-еес Едсддссдсс дЪЕсдсдадд ссддсссдЬд аас'Е'Ь'Ьддса дсааадс <210>
<211>
<212>
<213>
ПКА кЦпэкИске Зедиепг <400>
сдсдддсссд дддсддссдс дксдссасса
ЕддЕдадсаа дддс <210> <211>
<212>
<213>
<220>
<223>
ОИдопикГеоЫй <400>
дакдсакдск сдадсддссд ε±ΐ±βο
2ё <210>
<211>
<212>
<213>
ΏΝΆ кйпзЕИсЬе Зедиепг <220>
<223>
О11допик1еоЫс1
- 19 015013
<400> дда-Ька< | 9 . | |
Лак сдссддсддЕ сдссассакд дкдадс | 36 | |
<210> | 10 . | |
<211> | 38 | |
<212> | ϋΝΑ | |
<213> | кЛазбИске 3®ςμβηζ | |
<220> | ||
<223> | 011допик1еоЪ1с1 | |
<400> | 10 | |
сдс-Ьаас-'Ьд-е сдссддсдЪЬ -кас±-Ьд-Ьаса дсксдксс | 38 | |
<210> | 11 | |
<211> | 36 · | |
<212> | ΠΝΆ | |
<213> | к-ЦизкИске Зедиепг | |
<220> | ||
<223> | ОИдопик1еок±с1 | |
<400> | 11 | |
сддаксаадк. ддссддссдк сдссассакд дЪдсдс | 36 | |
<210> | 12 | |
<211?- | 42 | |
<212> | ΏΝΆ | |
<213> | кипзкИсЬе Зедиепг | |
<220> | ||
<223> | ОИдопик1еок±сЗ | |
<400> | 12 | |
сдсдаагагс ддссддссаа дксгкасадда асаддсддЕд дс | 42 | |
<210> | 13 | |
<211> | 19 | |
<212> | ΟΝΑ - | |
<213> | кипзкИсЬе Зесщепг | |
<220> | ||
<223> | О1±допик1ео-Ы0 | |
<400> | 13 | |
ддааасадск акдассакд | 19 | |
<210> | 14 . | |
<211?- | 36 | |
<212?- | ΟΝΑ- | |
<213?- | кипзкИске Зедиепг |
- 20 015013
<220 <223> | ОИдопикТеоЫй | |
<400> | 14 | |
сддкдсдддс ссдсасдкда ас-Ь’ЬЬддсад сааадс | • 36 | |
<210 | 15 | |
<211> | 28 | |
<212> | ϋΝΆ | |
<213> | кипз-ЬИске Зедиепг | |
<220 | ||
<223> | 011допик1еоЫ<1 | |
<400> | 15 | |
дЪЕсасдкдс дддсссдакс акасдадд | 28 | |
<210 | 16 | |
<211> | 19 | |
<212> | ϋΝΑ | |
<213> | кипзЫхсЪе Зечиепг | |
<220> | ||
<223> | 011доггик1еок1с1 | |
<400> | 16 | |
сдсдксксдд дакдаЕксд | 19 | |
<210> | 17 | |
<211> | 17 | |
<212> | ОКА | |
<213> | кйпзкИсЬе Зедиепг | |
<220> | ||
<223> | ОИдопик1еоЪ1<1 | |
<400> | 17 | |
ссскдасаса сксск-Ес ' | . 17 | |
<210> | 18 | |
<211> | 31 | |
<212> | ϋΝΑ | |
<213> | кипзСПскё Зедиепг | |
<220> | ||
<223> | 0Идопик1еоЫс1 | |
<400> | 18 | |
дсдссдсгсд аддсддЪаад •Ьд’Ьадссдаа д | 31 | |
<210> | 19 | |
<211> | 34 | |
<212> | ϋΚΑ |
- 21 015013 <213>
кипзЕИсЬе Зедиепг <220>
<223>
ОИдолик1ео1:1с4 <400> 19 сс-Ьдсдсксд адсЕсакссс дддкдаддса Ессс <210> 20 <211> 30 <212> ϋΝΑ <213> кйпзкИсЬе Зедиепз <220>
<22 3> ОИдопик1ео'Ыс1 <400> 20 ддсдасдсдк садксксаса дсс±ааГ±сд <210> 21 <211> 47 <212> ϋΝΑ <213> кипзкЫсЪе Ββφίεηζ <220>
<223> О1хдопик1еоЪ1й <400> 21 .
сссссЕЛЕ-ЬЕ с-Ьсдадакдк сдасссаада кааксдакса ддкдадд <210> 22 <211> 46 <212> ϋΝΆ <213> кИпзЕИске Ξβφίβηζ <220>
<22 3> 011допик1еоЕ1с1 <400> 22
ЕЕЕЕ-ессссс сксдадЕЕас ЕадЕЕдд-Ьса дкдаскс-Ьа-Ь дкссйс 46 <210> 23 <211> 20 <212> ША <213> кипзЕИсЬе Зедиепг <220>
<223> ОИдопик1еоЕ±с1 <400> 23 адсакакакс сададдБсас
- 22 015013
<2Ь0> <2И> <2Ь2> <2ЬЗ> | 24 24 ΏΝΑ кипзЕИсЬе Зедиепг |
<220> <223> | ОНдопикЬеоЫс! |
<400> 24 дддасЕаак'Ь адксдддссс дасс <210> 25 <211> 28 <212> ϋΝΑ <213> кйпзЪИсЬе Ηεφίεηζ <220>
<223> ОНдопикЬеокЬё.
<400>25 дсасЬЕдддс ссдасгЬаа'Ы: адксссЕс <2Ь0>26 <2Ы>21 <212> ΌΝΑ <213> кипзЕНсЬе Ξθφίβηζ <220>
<223> ОИдопикЬеоНЦ <400>26 сдааЕддсдс дсскдакдсд д <210>27 <211> 558* <212> РКТ <213> кйпзЬНсЬе Зесщепг <220>
<223> сЫтагез Ргокехп <400>27
Мек. Рго ТЬг Зег Не Ьеи Ьеи Не 11е ТЬг ТЬг Мек 11е Мек АЬа Зег
1015
РЬе Суз СЬп ЬЬе Азр Не ТЬг Ьуз Ьеи СЬп ΗΪ3 УаЬ СЬу УаЬ Ьеи УаЬ
2530
- 23 015013
Азп Зег | Рго 35 | Ьуз | 81у МеЕ Ьуз | Не 40 | Зег | 31п Азп РЬе | 31и ТЬг 45 | Агд Туг | |||||||
Ьеи | Не | Ьеи | Зег | Ьеи | Не | Рго | Ьуз | Не | 31и | Азр | Зег | Азп | Зег | Суз | 31у |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Азр | С1п | 31п | Не | Ьуз | 31п | Туг | Ьуз | Агд | Ьеи | Ьеи | Азр | Агд | Ьеи | Не | Не |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Рго | Ьеи | Туг | Азр | 31у | Ьеи | Агд | Ьеи | С1п | Ьуз | Азр | Уа1 | Не | Уа1 | Зег | Азп |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
(51X1 | 31 и | Зег | Азп | С1и | Азп | ТЬг | Азр | Рго | Агд | ТЬг | Ьуз | Агд | РЬе | РЬе | 31у |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
(51у | Уа1 | Не | 31у | ТЬг | Не | А1а | Ьеи | 31у | Уа1 | А1а | ТЬг | Зег | А1а | 31п | Не |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
ТЬг | А1а | А1а | Уа1 | А1а | Ьеи | Уа1 | 31и | А1а | Ьуз | 31п | А1а | Агд | Зег | Азр | 11е |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
31и | Ьуз | Ьеи | Ьуз | 81и | А1а | Не | Агд | Азр | ТЬг | Азп | Ьуз | А1а | Уа1 | 31п | Зег |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Уа1 | С1п | Зег | Зег | Не | 31у | Азп | Ьеи | 11е | Уа1 | А1а | Не | Ьуз | Зег | Уа1 | 81п |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Азр | Туг | Уа1 | Азп | Ьуз | 81и | Не | Уа1 | Рго | Зег | 11е | А1а | Агд | Ьеи | 31у | Суз |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
31и | А1а | А1а | 31у | Ьеи | 31п | Ьеи | Б1у | Не | А1а | Ьеи | ТЬг | 31п | ΗΪ3 | Туг | Зег |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
31и | Ьеи | ТЬг | Азп | Не | РЬе | 31у | Азр | Азп | Не | 31у | Зег | Ьеи | 31п | В1и | Ьуз |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
31у | Не | Ьуз | Ьеи | 31п | 31у | Не | А1а | Зег | Ьеи | Туг | Агд | ТЬг | Азп | Не | ТЬг |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
31и | Не | РЬе | ТЬг | ТЬг | Зег | ТЬг | Уа1 | Азр | Ьуз | Туг | Азр | Не | Туг | Азр | Ьеи |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Ьеи | РЬе | ТЬг | 31и | Зег | Не | Ьуз | Уа1 | Агд | Уа1 | Не | Азр | Уа1 | Азр | Ьеи | Азп |
260 265 270
- 24 015013
Азр | Туг | Зег | Не | ТЬг | Ьеи | С1п | УаЬ | Агд | Ьеи | Рго | Ьеи | Ьеи | ТЫ | Агд | Ьеи |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Ьеи | Азп | ТЬг | сьп | 11е | Туг | Агд | УаЬ | Азр | Зег | ЬЬе | Зег | Туг | Азп | ЬЬе | СЬп |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Азп | Агд | СЬи | Тгр | Туг | ЬЬе | Рго | Ьеи | Рго | Зег | НЬз | ЬЬе | Мек | ТЬг | Ьуз | 51у |
305 | ЗЬО | 315 | 320 | ||||||||||||
АЬа | РЬе | Ьеи | СЬу | С1у | АЬа | Азр | УаЬ | Ьуз | СЬи | Суз | ЬЬе | СЬи | АЬа | РЬе | Зег |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Зег | Туг | Не | Суз | Рго | Зег | Азр | Рго | СЬу | РЬе | УаЬ | Ьеи | Азп | НЬз | СЬи | Меё |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
С1и | Зёг | Суз | Ьеи | Зег | СЬу | Азп | ЬЬе | Зег | СЬп | Суз | Рго | Агд | ТЬг | УаЬ | УаЬ |
.355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Ьуз | Зег Азр | Не | УаЬ | Рго | Агд | Туг | АЬа | РЬе | УаЬ | Азп | СЬу | СЬу | УаЬ | УаЬ | |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
АЬа | Азп | Суз | Не | ТЫ | ТЬг | ТЫ | Суз | ТЫ | Суз | Азп | СЬу | ЬЬе | СЬу | Азп | Агд |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Не | Азп | СЬп | Рго | Рго | Азр | С1п | СЬу | УаЬ | Ьуз | ЬЬе | ЬЬе | ТЬг | НЬз | Ьуз | С1и |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Суз | Азп | ТЬг | Не | сьу | ЬЬе | Азп | СЬу | Мек | Ьеи | РЬе | Азп | ТЬг | Азп | Ьуз | СЬи |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
СЬу | ТЫ | Ьеи | АЬа | РЬе | Туг | ТЬг | Рго | Азп. | Азр | ЬЬе | ТЬг | Ьеи | Азп | Азп | Зег |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Уа1 | АЬа | Ьеи | Азр | Рго | Не | Азр | ЬЬе | Зег | ЬЬе | СЬи | Ьеи | Азп | Ьуз | А1а | Ьуз |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Зег | Азр | Ьеи | СЬи | СЬи | Зег | Ьуз | СЬи | Тгр | ЬЬе | Агд | Агд | Зег | Азп | С1п | Ьуз |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Ьеи | Азр | Зег | Не | С1у | Азп | Тгр | ΗΪ3 | СЬп | Зег | Зег | ТЬг | ТЬг | УаЬ | Не | ТЫ |
485 490 495
- 25 015013
Ие | Ие | Уа1 | Уа1 500 | Мер | Уа1 | Уа1 | Ие | Ьеи 505 | Уа1 | Уа1 | Ие | Ие | Уа1 510 | Не | Уа1 |
Ие | Уа1 | Ьеи 515 | Туг | Агд | Ьеи | Ьуз | Агд 520 | Зег | МеЕ | Ьеи | Меб | (31у 525 | Азп | Рго | Азр |
Азр | Агд 530 | Ие | Рго | Агд | Азр | ТЫ 535 | Туг | ТЬг | Ьеи | б1и | Рго 540 | Ьуз | Ие | Агд | Н1з |
Меб 545 | туг | ТЬг | Азп | 61у | (31у 550 | РЬе | Азр | А1а | МеЬ | А1а 555 | <31и .Ьуз | Агд |
<210> . | 28 |
<211> | 579 |
<212> | РКТ |
<213> | кйпзЬИсЬе Зедиепг |
<220> <223> | сЫтагез Ргобехп |
<400> 28
Меб 1 | Азр С1у | Азр Агд 61у Ьуз Агд Азр 5 ' | Зег Туг Тгр Зег ТЫ Зег Рго | ||||||||||||
10 | 15 | ||||||||||||||
Зег | 61у | Зег | ТЬг 20 | ТЫ | Ьуз | Ьеи | А1а | Зег 25 | 51у | Тгр | С1и | Агд | Зег 30 | Зег | Ьуз |
Уа1 | Азр | ТЫ 35 | Тгр | Ьеи | Ьеи | Ие | Ьеи 40· | Зег | РЬе | ТЬг | 31п | Тгр 45 | А1а | Ьеи | Зег |
Ие | А1а 50 | ТЫ | Уа1 | Ие | Ие | Суз 55 | Ие | Ие | Ие | Зег | А1а 60 | Азп | Зег | Ие | Ьуз |
Зег 65 | 51и | Ьуз | А1а | ΗΪ3 | (31и 70 | Зег | Ьеи | Ьеи | С1п | Азр 75 | Уа1 | Азп | Азп | 61и | РЬе 80 |
Меб | С1и | Уа1 | ТЫ | С1и 85 | Ьуз | Ие | С1п | МеЬ | А1а 90 | Зег | Азр | Азп | Ие | Азп 95 | Авр |
Ьеи | Ие | С1п | Зег 100 | 61у | Уа1 | Азп | ТЬг | Агд 105 | Ьеи | Ьеи | ТЬг | Ие | (31п 110 | Зег | ΗΪ3 |
Уа1 | е1п | Азп 115 | Туг | Ие | Рго | Ие | Зег 120 | Ьеи | ТЬг | С1п | (31 п | МеЬ 125 | Зег | Азр | Ьеи |
- 26 015013
Агд Ьуз 130 | РЬе | Не Зег 61и | Не 135 | ТЬг 11е Агд Азп Азр Азп Агд 61и Уа1 140 | |||||||||||
Рго | Рго | С1п | Агд | Не | ТЬг | Нхз | Азр | А1а | 61у | Не | Ьуз | Рго | Ьеи | Азп | Рго |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Азр | Азр | РЬе | Тгр | Агд | Суз | ТЬг | Зег | 61у | Ьеи | Рго | Зег | Ьеи | МеЬ | Ьуз | ТЬг |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Рго | Ьуз | Не | Агд | Ьеи | МеЬ | Рго | 61у | Рго | 61у | Ьеи | Ьеи | А1а | МеЬ | Рго | ТЬг |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
ТЬг | Уа1 | Азр | 61у | Суз | Уа1 | Агд | ,ТЬг | Рго | Зег | Ьеи | Уа1 | Не | Азп | Азр | Ьеи |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Не | Туг | А1а | Туг | ТЬг | Зег | Азп | Ьеи | Не | ТЬг | Агд | 61у | Суз | 61п | Азр | Не |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
С1у | Ьуз | Зег | туг | 61п | Уа1 | Ьеи | 61п | Не | 61у | Не | Не | ТЬг | Уа1 | Азп | Зег |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Азр | Ьей | Уа1 | Рго | Азр | Ьеи | Азп | Рго | Агд | Не | Зег | Нхз | ТЬг | РЬе | Азп | Не |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Азп | Азр | Азп | Агд | Ьуз | Зег | Суз | Зег | Ьеи | А1а | Ьеи | Ьеи | Азп | ТЬг | Азр | Уа1 |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Туг | Б1П | Ьеи | Суз | Зег | ТЬг | Рго | Ьуз | Уа1 | Азр | 61и | Агд | Зег | Азр | Туг | А1а |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Зег | Зег | е1у | Не | 61и | Азр | Не | Уа1 | Ьеи | Азр | Не | Уа1 | Азп | Нхз | Азр | 61у |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Зег | Не | Зег | ТЬг | ТЬг | Агд | РЬе | Ьуз | Азп | Азп | Азп | Не | Зег | РЬе | Азр | 61п |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Рго | Туг | А1а | А1а | Ьеи | Туг | Рго | Зег | Уа1 | С1у | Рго | 61у | Не | Туг | Туг | Ьуз |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
С1у | Ьуз | Не | Не | РЬе | Ьеи | 61у | Туг | 61у | 61 у | Ьеи | С1и | НХЗ | Рго | Не | Азп |
340 | 345 | 350 |
- 27 015013
Сби Азп | Аба ббе 355 | Суз Азп | ТЬг ТЬг Сбу 360 | Суз | Рго | Сбу | Буз 365 | ТЬг | Сбп Агд | ||||||
Азр | Суз | Азп | Сбп | Аба | Зег | Нбз | Зег | Рго | Тгр | РЬе | Зег | Азр | Агд | Агд | Меб. |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Уаб | Азп | Зег | ббе | Ббе | Уаб | Уаб | Азр | Буз | Сбу | Беи | Азп | Зег | Ббе | Рго | Ьуз |
385 | 390 | 395 | '400 | ||||||||||||
Ьеи | Ьуз | Уаб | Тгр | ТЬг | Ббе | Зег | Меб | Агд | Сбп | Азп | Туг | Тгр | Сбу | Зег | Сби |
405 | 460 | 465 | |||||||||||||
С1у | Агд | Беи | Беи | Ьеи | Беи | ббу | Азп | Буз | Ббе | Туг | Ббе | туг | ТЬг | Агд | Зег |
• | 420 | 425 | 430 | ||||||||||||
ТЬг | Зег | Тгр | Нбз | Зег | Буз | Беи | Сбп | Беи | Сбу | Ббе | Ббе | Азр | Ббе | ТЬг | Азр |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Туг | Зег | Азр | Ббе | Агд | Ббе | Буз | Тгр' | ТЬг | Тгр | Нбз | Азп | Уаб | Ьеи | Зег | Агд |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Рго | Сбу | Азп | Азп | Сби | Суз | Рго | Тгр | Сбу | Нбз | Зег | Суз | Рго | Азр | Сбу | Суз |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Не | ТЬг | Сбу | Уаб | Туг | ТЬг | Азр | Аба | Туг | Рго | Ьеи | Азп | Рго | ТЬг | Сбу | Зег |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Ббе | Уаб | Зег | Зег | Уаб | Ббе | Ьеи | Азр | Зег | Сбп | Буз | Зег | Агд | Уаб | Азп | Рго |
500 | 505 | 560 | |||||||||||||
Уаб | ббе | ТНг | Туг | Зег | ТЬг | Зег | ТЬг | Сби | Агд | Уаб | Азп | Сби | Беи | Аба | Ббе |
565 | 520 | 525 | |||||||||||||
Агд | Азп | Буз | ТЬг | Беи | Зег | Аба | Сбу | Туг | ТЬг | ТЬг | ТЬг | Зег | Суз | ббе | ТЬг |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Нбз | Туг | Азп | Буз | Сбу | Туг | Суз | РЬе | Нбз | Ббе | Уаб | Сби | Ббе | Азп | Нбз | Буз |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Зег | Беи | Азр | ТЬг | РЬе | Сбп | Рго | Меб | Беи | РЬе | Буз | ТЬг | Сби | Ббе | Рго | Буз |
565 | 570 | 575 |
Зег Суз Зег
Claims (32)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Рекомбинантный вирус Сендай, содержащий вирусный геном с делецией аминокислот 2-77 белка, кодируемого Р-геном, приводящей к потере способности к репликации без потери вторичной способности к транскрипции.
- 2. Рекомбинантный вирус Сендай по п.1, отличающийся тем, что вирусный геном дополнительно содержит по меньшей мере одну последовательность, кодирующую чужеродный генный продукт.
- 3. Рекомбинантный вирус Сендай по п.2, отличающийся тем, что чужеродный генный продукт является белком, рибозимом, антисмысловой молекулой или молекулой миРНК.
- 4. Рекомбинантный вирус Сендай по п.3, отличающийся тем, что чужеродный генный продукт является репортерным белком, антигенным или терапевтическим белком.
- 5. Рекомбинантный вирус Сендай по п.4, отличающийся тем, что чужеродный генный продукт является антигенным белком патогена, выбранного из вирусов, бактерий и простейших.
- 6. Рекомбинантный вирус Сендай по п.5, отличающийся тем, что антигенный белок является вирус- 28 015013 ным белком.
- 7. Рекомбинантный вирус Сендай по п.6, отличающийся тем, что вирусный белок происходит от одинаковых или разных вирусов.
- 8. Рекомбинантный вирус Сендай по любому из пп.2-7, отличающийся тем, что по меньшей мере одна из последовательностей, кодирующих чужеродный генный продукт, встроена в вирусный геном, в частности, заменяет последовательность, кодирующую гомологичный генный продукт.
- 9. Рекомбинантный вирус Сендай по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что его транскрипционная способность уменьшена не более чем в 20 раз по сравнению с диким типом.
- 10. Нуклеокапсид рекомбинантного вируса Сендай по любому из пп.1-9.
- 11. Геном рекомбинантного вируса Сендай по любому из пп.1-9.
- 12. Молекула ДНК, которая кодирует геном и/или антигеном рекомбинантного вируса Сендай по любому из пп.1-9.
- 13. Молекула ДНК по п.12, отличающаяся тем, что она функционально связана с транскрипционным сигналом.
- 14. Молекула ДНК по п.13, отличающаяся тем, что транскрипционный сигнал является промотором бактериофага, например, Т7 или 8Р6-промотором.
- 15. Клетка, которая содержит рекомбинантный вирус Сендай по любому из пп.1-9, нуклеокапсид по п.10, геном по п.11 или молекулу ДНК по любому из пп.12-14.
- 16. Клетка по п.15, отличающаяся тем, что она является клеткой, способной к размножению рекомбинантного вируса Сендай.
- 17. Клетка по п.15, отличающаяся тем, что она является клеткой, способной к продуцированию рекомбинантного вируса Сендай.
- 18. Клетка по п.17, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит молекулу ДНК, кодирующую чужеродную ДНК-зависимую РНК-полимеразу, осуществляющую транскрипцию молекулы ДНК, кодирующую рекомбинантный вирус Сендай.
- 19. Клетка по пп.15-18, отличающаяся тем, что дополнительно содержит молекулу ДНК, кодирующую Р-ген.
- 20. Способ получения рекомбинантного вируса Сендай по любому из пп.1-9, включающий следующие этапы:(а) получение клетки, трансфицированной молекулой ДНК, которая кодирует геном рекомбинантного вируса Сендай, содержащий мутацию в Р-гене, приводящую к потере вирусным геномом способности к репликации без потери вторичной способности к транскрипции, и, при необходимости, содержащий по меньшей мере одну последовательность, кодирующую чужеродный генный продукт, и, (б) культивирование клетки в условиях, при которых происходит транскрипция ДНК согласно (а) и образуется рекомбинантный вирус Сендай.
- 21. Способ по п.20, дополнительно включающий получение нуклеокапсида или вирусного генома рекомбинантного вируса Сендай.
- 22. Способ размножения рекомбинантного вируса Сендай по любому из пп.1-9, включающий следующие этапы:(а) получение клетки, которая инфицирована рекомбинантным вирусом Сендай, содержащим мутацию в Р-гене, приводящую к потере вирусным геномом способности к репликации без потери вторичной способности к транскрипции, и, при необходимости, содержащий по меньшей мере одну последовательность, кодирующую чужеродный генный продукт, и (б) культивирование клетки в условиях, в которых происходит размножение вируса.
- 23. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный вирус Сендай по любому из пп.19, нуклеокапсид по п.10 или вирусный геном по п.11 в качестве действующего вещества, а также, при необходимости, фармацевтически приемлемые наполнители и/или вспомогательные вещества.
- 24. Фармацевтическая композиция по п.23, предназначенная для использования в качестве вакцины.
- 25. Фармацевтическая композиция по п.24, предназначенная для использования в качестве моноили поливалентной вакцины.
- 26. Фармацевтическая композиция по пп.23 и 24, предназначенная для использования в качестве вакцины против вирусных инфекций, например в качестве вакцины против инфекций патогенными вирусами с РНК-негативной цепью.
- 27. Фармацевтическая композиция по п.23, предназначенная для использования в антиопухолевой терапии.
- 28. Фармацевтическая композиция по любому из пп.23-27, предназначенная для использования у пациентов из групп риска, таких как дети, пожилые люди и пациенты с поврежденной или ослабленной иммунной системой.
- 29. Фармацевтическая композиция по любому из пп.23-28, содержащая нуклеокапсид в нативной вирусной оболочке.
- 30. Применение клетки, которая конститутивно или репродуцируемо стабильно экспрессирует Рбелок рекомбинантного вируса Сендай для продуцирования или размножения рекомбинантного вируса- 29 015013Сендай по любому из пп.1-9, нуклеокапсида по п.10 или вирусного генома по п.11.
- 31. Применение по п.30, отличающееся тем, что клетка является клеткой млекопитающего.
- 32. Применение по пп.30 и 31, отличающееся тем, что клетка выбрана из клетки Н29 (Э8М АСС2702) или производной от нее клетки.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE102005006388A DE102005006388A1 (de) | 2005-02-11 | 2005-02-11 | Replikationsdefiziente RNA-Viren als Impfstoffe |
PCT/EP2006/001251 WO2006084746A1 (de) | 2005-02-11 | 2006-02-10 | Replikationsdefiziente rna-viren als impfstoffe |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200701695A1 EA200701695A1 (ru) | 2008-02-28 |
EA015013B1 true EA015013B1 (ru) | 2011-04-29 |
Family
ID=36353666
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200701695A EA015013B1 (ru) | 2005-02-11 | 2006-02-10 | Рекомбинантный вирус сендай с ослабленной способностью к репликации, предназначенный для использования в качестве вакцин |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20090041725A1 (ru) |
EP (2) | EP2045260A1 (ru) |
JP (2) | JP5679620B2 (ru) |
KR (1) | KR101279636B1 (ru) |
CN (1) | CN101155826B (ru) |
AT (1) | ATE421529T1 (ru) |
AU (1) | AU2006212385B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0607487A2 (ru) |
CA (1) | CA2599036C (ru) |
DE (2) | DE102005006388A1 (ru) |
DK (1) | DK1851239T3 (ru) |
EA (1) | EA015013B1 (ru) |
ES (1) | ES2321651T3 (ru) |
HK (1) | HK1118297A1 (ru) |
HR (1) | HRP20090230T1 (ru) |
IL (1) | IL185147A (ru) |
MX (1) | MX2007009628A (ru) |
PL (1) | PL1851239T3 (ru) |
PT (1) | PT1851239E (ru) |
RS (1) | RS50977B (ru) |
SI (1) | SI1851239T1 (ru) |
WO (1) | WO2006084746A1 (ru) |
ZA (1) | ZA200707216B (ru) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102005006388A1 (de) | 2005-02-11 | 2006-08-24 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Replikationsdefiziente RNA-Viren als Impfstoffe |
LT2604695T (lt) | 2007-12-27 | 2022-12-12 | Universität Zürich | Replikacijos defektų turintys arenaviruso vektoriai |
EP2085479A1 (en) * | 2008-01-31 | 2009-08-05 | Institut Pasteur | Reverse genetics of negative-strand rna viruses in yeast |
JP5633075B2 (ja) * | 2009-05-18 | 2014-12-03 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 多能性幹細胞作成用ベクター材料及びこれを用いた多能性幹細胞作成方法 |
US9365866B2 (en) | 2009-06-03 | 2016-06-14 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Vectors for generating pluripotent stem cells and methods of producing pluripotent stem cells using the same |
DE102010018961B4 (de) * | 2010-04-23 | 2012-09-20 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum | Genetisch modifiziertes Paramyxovirus zur Behandlung von Tumorerkrankungen |
EP2674491B1 (en) | 2011-02-08 | 2017-06-14 | Mie University | Method for producing virus vector for gene transfer |
BR112014008284A2 (pt) * | 2011-10-05 | 2020-10-27 | Genvec Inc. | adenovirus (gorilla) simian ou vetores adenovirais e métodos de uso |
EP2669381A1 (en) * | 2012-05-30 | 2013-12-04 | AmVac AG | Method for expression of heterologous proteins using a recombinant negative-strand RNA virus vector comprising a mutated P protein |
US9809801B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-11-07 | Université De Genève | Anti-mycobacterial vaccines |
EP2813574B1 (en) * | 2013-06-10 | 2019-02-20 | RSV Genius GmbH | Semi-live respiratory syncytial virus vaccine |
CN105378090B (zh) * | 2013-06-10 | 2020-07-10 | 阿姆瓦克股份公司 | 呼吸道合胞病毒半活疫苗 |
WO2023227758A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Vaccine with reduced anti-vector antigenicity |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1437593A1 (en) * | 2001-09-18 | 2004-07-14 | Dnavec Research Inc. | Method of examining (-)-strand rna virus vector having lowered ability to form grains and method of constructing the same |
WO2004113517A2 (en) * | 2003-06-09 | 2004-12-29 | Wyeth | IMPROVED METHOD FOR THE RECOVERY OF NON-SEGMENTED, NEGATIVE-STRANDED RNA VIRUSES FROM cDNA |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2210273T5 (es) | 1994-07-18 | 2010-03-29 | Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr. | Virus con arn de cadena negativa no segmentado recombinante infeccioso. |
EP0863202B1 (en) | 1995-11-01 | 2010-06-09 | Dnavec Research Inc. | Recombinant sendai virus |
JP4795597B2 (ja) | 1999-12-10 | 2011-10-19 | アメリカ合衆国 | パラインフルエンザウィルス(piv)及びヒトの病原体により引き起こされる感染及び疾病を保護するためへの組換えpivのベクターとしての使用 |
JP4791651B2 (ja) * | 2000-05-18 | 2011-10-12 | 株式会社ディナベック研究所 | 外来遺伝子導入用パラミクソウイルスベクター |
JP2004344001A (ja) * | 2003-03-07 | 2004-12-09 | Dnavec Research Inc | 胚性幹細胞に遺伝子を導入する方法 |
JP2004357689A (ja) * | 2003-06-03 | 2004-12-24 | Dnavec Research Inc | 遺伝子導入ベクターの非侵襲的インビボ評価方法 |
DE102005006388A1 (de) | 2005-02-11 | 2006-08-24 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Replikationsdefiziente RNA-Viren als Impfstoffe |
-
2005
- 2005-02-11 DE DE102005006388A patent/DE102005006388A1/de not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-02-10 DK DK06706871T patent/DK1851239T3/da active
- 2006-02-10 PT PT06706871T patent/PT1851239E/pt unknown
- 2006-02-10 RS RSP-2009/0185A patent/RS50977B/sr unknown
- 2006-02-10 PL PL06706871T patent/PL1851239T3/pl unknown
- 2006-02-10 EA EA200701695A patent/EA015013B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-02-10 CN CN2006800090622A patent/CN101155826B/zh active Active
- 2006-02-10 SI SI200630270T patent/SI1851239T1/sl unknown
- 2006-02-10 CA CA2599036A patent/CA2599036C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-02-10 MX MX2007009628A patent/MX2007009628A/es active IP Right Grant
- 2006-02-10 EP EP09000617A patent/EP2045260A1/de not_active Withdrawn
- 2006-02-10 DE DE502006002711T patent/DE502006002711D1/de active Active
- 2006-02-10 AT AT06706871T patent/ATE421529T1/de active
- 2006-02-10 ES ES06706871T patent/ES2321651T3/es active Active
- 2006-02-10 BR BRPI0607487-1A patent/BRPI0607487A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-02-10 EP EP06706871A patent/EP1851239B1/de active Active
- 2006-02-10 WO PCT/EP2006/001251 patent/WO2006084746A1/de active Application Filing
- 2006-02-10 AU AU2006212385A patent/AU2006212385B2/en not_active Ceased
- 2006-02-10 KR KR1020077020606A patent/KR101279636B1/ko active IP Right Grant
- 2006-02-10 JP JP2007554510A patent/JP5679620B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-08-09 IL IL185147A patent/IL185147A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-08-09 US US11/836,322 patent/US20090041725A1/en not_active Abandoned
- 2007-08-27 ZA ZA200707216A patent/ZA200707216B/en unknown
-
2008
- 2008-08-20 HK HK08109296.4A patent/HK1118297A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-04-20 HR HR20090230T patent/HRP20090230T1/xx unknown
-
2012
- 2012-07-23 JP JP2012162993A patent/JP2012213407A/ja active Pending
-
2017
- 2017-05-25 US US15/605,568 patent/US11028409B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1437593A1 (en) * | 2001-09-18 | 2004-07-14 | Dnavec Research Inc. | Method of examining (-)-strand rna virus vector having lowered ability to form grains and method of constructing the same |
WO2004113517A2 (en) * | 2003-06-09 | 2004-12-29 | Wyeth | IMPROVED METHOD FOR THE RECOVERY OF NON-SEGMENTED, NEGATIVE-STRANDED RNA VIRUSES FROM cDNA |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
CORTESE CASE K. ET AL.: "Mutations in domain V of the Sendai virus L polymerase protein uncouple transcription and replication and differentially affect replication in vitro and in vivo" VIROLOGY, vol. 277, no. 2, 25 November 2000 (2000-11-25), pages 387-396, XP004435822 ISSN: 0042-6822 SS18, SS21 table 1 * |
CURRAN JOSEPH: "Reexamination of the Sendai virus P protein domains required for RNA synthesis: A possible supplemental role for the protein" VIROLOGY, vol. 221, no. 1, 1996, pages 130-140, XP002382077 ISSN: 0042-6822 cited in the application page 131, right-hand column, paragraph 2 * |
KHATTAR SUNIL K. ET AL.: "Deletion and substitution analysis defines regions and residues within the phosphoprotein of bovine respiratory syncytial virus that affect transcription, RNA replication, and interaction with the nucleoprotein" VIROLOGY, vol. 285, no. 2, 5 July 2001 (2001-07-05), pages 253-269, XP002382075 ISSN: 0042-6822 page 262, right-hand column, paragraph 1 * |
MYERS TINA M. ET AL.: "An amino-terminal domain of the Sendai virus nucleocapsid protein is required for template function in viral RNA synthesis" JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 71, no. 2, 1997, pages 918-924, XP002382076 ISSN: 0022-538X page 921, right-hand column, paragraph 2 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA015013B1 (ru) | Рекомбинантный вирус сендай с ослабленной способностью к репликации, предназначенный для использования в качестве вакцин | |
JP4704232B2 (ja) | 組換え伝染性非セグメント化陰性鎖rnaウイルス | |
Casais et al. | Reverse genetics system for the avian coronavirus infectious bronchitis virus | |
Weiss et al. | Coronavirus pathogenesis | |
KR0179994B1 (ko) | 칠면조의 재조합 포진바이러스 및 이로부터 유도된 생존상태의 벡터 백신 | |
CN112618707B (zh) | 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法 | |
US7153510B1 (en) | Recombinant vesiculoviruses and their uses | |
HU230488B1 (hu) | Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására | |
HU228121B1 (en) | Corona-virus-like particles comprising functionally deleted genomes | |
JPH09511143A (ja) | アルファーウイルスcDNAベクター | |
JPH06504198A (ja) | Dna発現系 | |
Zakhartchouk et al. | Construction and characterization of E3-deleted bovine adenovirus type 3 expressing full-length and truncated form of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD | |
CZ302785B6 (cs) | Zpusob prípravy DNA odvozené od koronaviru, príslušné infekcní klony, vektory a vakcíny | |
Tan et al. | Coexpression of double or triple copies of the rabies virus glycoprotein gene using a ‘self-cleaving’2A peptide-based replication-defective human adenovirus serotype 5 vector | |
CN110951699B (zh) | 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用 | |
CN111996174A (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法 | |
CN105378090B (zh) | 呼吸道合胞病毒半活疫苗 | |
JP7303369B2 (ja) | 腫瘍溶解性ウイルス、その使用、およびがんを治療する医薬品 | |
EP3865180A1 (en) | Live recombinant measles virus expressing coronavirus antigens - its use in eliciting immunity against coronaviruses | |
Dollenmaier et al. | Membrane-associated respiratory syncytial virus F protein expressed from a human rhinovirus type 14 vector is immunogenic | |
WO2023070873A1 (zh) | SARS-CoV-2病毒样颗粒的制备方法及其应用 | |
Li et al. | Characterization of an emerging porcine respirovirus 1 isolate in the US: A novel viral vector for expression of foreign antigens | |
CN117357643B (zh) | 一种用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗及制备方法 | |
Oberholster | Evaluation of recombinant Newcastle disease viruses (NDV) as candidate vaccine delivery vectors for rotavirus VP7 and NSP4 | |
CN117860880A (zh) | 一种依赖于RdRp的非洲猪瘟taRNA疫苗及其构建方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |