EA015013B1 - Рекомбинантный вирус сендай с ослабленной способностью к репликации, предназначенный для использования в качестве вакцин - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к рекомбинантному вирусу Сендай, обладающему ослабленной способностью к репликации генома и способного к транскрипции, который можно использовать для экспрессии трансгенов и, в частности, для разработки вакцин. Вирусный геном содержит мутацию в гене Р.

Description

Изобретение относится к имеющему ослабленную способность к репликации и обладающему транскрипционной активностью рекомбинантному вирусу Сендай с РНК с негативной цепью, который может использоваться для экспрессии трансгенов и, в частности, в области разработки вакцин.

Иммунизация живыми вакцинами аналогична естественной инфекции и вызывает универсальный иммунный ответ. При вакцинации используют ослабленные, но способные к размножению вирусы. Размножение вирусов должно происходить настолько медленно, что гарантируются иммунологический ответ и, тем самым, контролирование размножения или уничтожение вируса. Концепция живой вакцины многократно подтвердилась на различных возрастных группах. Правда, имеются важные целевые группы, иммунизация которых живыми вакцинами проблематична и требует дополнительных мер предосторожности. Материнские антитела защищают новорожденных в первые месяцы жизни. Одновременно они создают барьер, который должен быть преодолен при иммунизации живой вакциной, но чтобы при этом, с другой стороны, не наблюдалось излишнего размножения вируса вакцины и связанных с этим отрицательных последствий вакцинации. Другой целевой группой являются пожилые люди, иммунная система которых уже не настолько сильна, поэтому могут проявиться перегрузка в результате вакцинации и отрицательные последствия вакцинации из-за усиленного размножения вируса вакцины. Таким образом, существует проблема сделать иммунологически отличную живую вакцинацию еще надежнее для применения на определенных целевых группах, а также повысить профиль надежности для общего ее применения.

Вирусы с РНК с негативной цепью, как например, вирус бешенства или вирус Сендай (8еУ), уже на протяжении нескольких последних лет целенаправленно подвергают модификациям с помощью генной инженерии. ЕР-А-0702085 описывает приготовление рекомбинантных, инфекционных, воспроизводящихся несегментированных вирусов с РНК с негативной цепью из клонированной кДНК. ЕР-А-0863202 описывает рекомбинантный вирус Сендай, в геноме которого есть внедренный чужеродный ген или же один ген удален или инактивирован, но репликация такого генома еще не нарушена.

В качестве основы вакцины особенно пригодны вирусы с РНК с негативной цепью, так как их размножение происходит в цитоплазме и гены внутри генома вируса могут легко обмениваться. Так, уже удалось успешно получить рекомбинантные вирусы с поверхностными белками различных типов вирусов и использовать их в качестве вакцины в опытах с животными (8е1ишб1 е! а1., 1. У1го1. 75 (2001), 45944603 и АО 01/42445). Путем рекомбинантного встраивания Е- и ΗΝ-белков человеческого парагриппозного вируса типа 3 (11Р1У 3) и О- или Е-белков респираторного синциального вируса (Р8У) в вектор на основе коровьего парагриппозного вируса типа 3 (ЬР1У 3) удалось выявить при применении на хомяках мукозный иммунный ответ на 11Р1У 3 и К8У. Бивалентная антигенность этой испытанной в опытах с животными живой вакцины, таким образом, уже достигнута.

Из-за включения видовых барьеров коровий парагриппозный вирус должен быть достаточно разбавлен поверхностными антигенами человеческого РГУ 3 и К8У для того, чтобы быть использованным на человеке. Мутации по отношению к исходному виду ожидать не следует, так как все гены для вирусных поверхностных белков подверглись обмену. Уже начали клинические испытания вакцины.

Поскольку описанные мутанты вируса обладают способностью к репликации, в подвергнувшемся вакцинации наверняка происходит размножение вируса, которое хотя и ослаблено в результате модификации вируса, но все-таки не исключено полностью. Интенсивность ожидаемой вирусемии, а одновременно и проявление у вакцинированного побочных эффектов зависят при этом от индивидуальных факторов.

В рамках настоящего изобретения сделана попытка существенно уменьшить отрицательные последствия вакцинации живыми вакцинами, в частности отрицательные последствия для вакцинированных из определенных целевых групп.

Подход к этому заключается в подавлении репликации вирусного генома после введения вакцины. С помощью этого можно, независимо от иммунологической реакции вакцинированного, исключить размножение вируса и соответствующие вредные последствия вакцинации.

При таком подходе главная трудность заключается в том, что вирусная РНК-полимераза выполняет две функции, а именно синтеза вирусной мРНК и размножения вирусного генома. Эта двойственность в новой вакцине должна быть устранена, так как вакцина должна быть в состоянии только лишь осуществлять синтез вирусной мРНК.

Другая проблема заключается в том, что рекомбинантный вирус должен обладать способностью к эффективному синтезу вирусной мРНК, чтобы вообще быть пригодным в качестве живой вакцины. Таким образом, имеются два принципиально противоречащих друг другу требования, которые дают основание для значительных трудностей при приготовлении надежной и эффективной живой вакцины на основе вирусов с РНК с негативной цепью.

81ιο)ί е! а1. (Упо1оду 318 (2004), 295-305) описывают приготовление не имеющего Р-гена вируса бешенства и приводят его характеристику. Получают этот вирус с помощью вспомогательных клеток с экспрессией Р-белка. Вирусы без бе/иоуо/синтеза Р-белка в состоянии осуществлять только первичную транскрипцию. Слабая вирусная экспрессия генов проявляется в очень слабом сигнале для Ν-белка в иммунной флюоресценции и только лишь у очень небольшого количества клеток, более убедительное

- 1 015013 доказательство этой слабой вирусной экспрессии генов получают лишь методом РСК. Использование этого мутанта вируса в опыте по заражению в модели на мышах имело целью обнаружение защиты, правда отсутствует контрольный эксперимент с неактивным в отношении транскрипции вирусом и интервал для вирусного заражения слишком короток. Продолжительность предполагаемой защиты не исследовалась. Использование таких вирусных мутантов для приготовления разбавленной вакцины против бешенства видится, таким образом, малообещающим.

В рамках ведущих к настоящему изобретению исследований установлено, что у парамиксовирусов разъединение функций репликации и транскрипции может быть достигнуто тем, что составные части полимеразы, которые ответственны за функцию репликации генома, частично удаляются. При этом речь может идти об одном из вирусных белков Ν, Р и Ь или о специальной функциональной области такого белка.

Неожиданно было установлено, что в результате мутаций, при которых функция кодированных вирусными генами Ν, Ь или/и Р белков исключается не полностью, а частично, могут быть получены РНК вирусы с ослабленной способностью к репликации, которые обладают достаточной транскрипционной функцией для того, чтобы быть пригодными для приготовления живых вакцин.

Предметом настоящего изобретения является, таким образом, рекомбинантный вирус Сендай, который имеет ограниченную репликацию и обладает транскрипционной активностью. Соответствующий изобретению вирус имеет вирусный геном с мутацией в гене Р, приводящей к потере репликации генома без потери вторичной транскрипционной активности.

Соответствующий изобретению вирус может быть использован для приготовления живых вакцин, в частности для приготовления живых вакцин с повышенной степенью надежности, которые особенно пригодны для пациентов из групп риска со слабой или нарушенной иммунной системой.

Изобретение также относится к нуклеокапсиду, включающему негативную цепь РНК рекомбинантного вируса Сендай, комплексированную с белками Ν, Ь и Р, а также к изолированной негативной цепи РНК рекомбинантного вируса Сендай.

Следующим предметом изобретения является кДНК, которая кодирует соответствующую изобретению РНК с негативной цепью, в частности, вирусную РНК или/и комплементарную к ней РНК.

Следующим предметом изобретения является клеточная линия для размножения соответствующего изобретению рекомбинантного вируса Сендай.

Соответствующий изобретению рекомбинантный вирус с РНК с негативной цепью можно получить в результате мутации исходного вируса по меньшей мере в одном из генов Ν, Ь и Р. Исходным вирусом может быть природный вирус с РНК с негативной цепью, в частности, из семейств Рагашухоушбае или КйаЬбоушбае или их рекомбинантных вариантов. Особенно предпочтительными представителями являются парамиксовирусы, например вирус Сендай (11Р1У) типов 1, 2, 3, 4а или 4Ь, вирус ньюкаслской болезни, вирус паротита, вирус кори, или человеческий респираторный синциальный вирус (ЙК8У) или рабдовирусы, например, вирус везикулярного стоматита (У8У). Особенно предпочтителен из вирусов вирус Сендай, например штамм Ειΐδΐιίιηί (АТСС УК105). Кроме того, изобретение относится также к рекомбинантным вариантам вышеназванных вирусов, как они, например, описаны в ЕР-А-702085, ЕР-А0863202 или АО 01/42445.

К другим предпочтительным вирусам с РНК с негативной цепью относятся представители КбаЬбоушбае, Ебоушбае, Воггаушбае, Агепаушбае или Випуаушбае, например У8У.

Вирус Сендай, как и другие парамиксовирусы, является оболочечным вирусом со спиральным нуклеокапсидом (фиг. 1). Оболочка состоит из липидной мембраны, которая образуется из плазменной мембраны клетки-хозяина, из которой был выделен вирус. В вирусной оболочке закреплены трансмембранные гликобелки, а именно белок слияния (Е) и гемагглютинин-нейрамидаза (ΗΝ). Матричный белок (М) покрывает внутреннюю сторону мембраны. Находящийся в оболочке нуклеокапсид состоит из одноцепочной РНК в комплексе с нуклеобелком (Ν), причем 6 нуклеотидов связаны одним Ν-белком, зависимой от РНК РНК-полимеразой (Ь) и кофакторным фосфобелком (Р).

Геном РНК с негативной цепью у вируса Сендай содержит 6 структурных белков в следующей последовательности: 3'-Ν-Ρ/Ο-Μ-Ε-ΗΝ-Ε-5' (фиг. 2). Р/С-ген кодирует всего 8 белков, структурный фосфобелок и все известные в настоящее время неструктурные белки.

Белки Р, Ν и Ь важны для функциональной транскрипции и репликации (ЬашЬ е1 а1., Рагашухоушбае: Тбе Ушкек апб (Ней Керйсабоп (Семейство Рагашухоушбае: вирусы и их репликация) Е1е1бк Упо1оду, 4. АиадаЬе (2001) Ырркой, Айбашк & ΑίΙΚίηδ. РЫ1абе1рЫа, 1305-1340).

Соответствующий изобретению вирус с РНК с негативной цепью имеет мутацию по меньшей мере в одном из генов Ν, Ь и Р. Мутацией, которая приводит к ослаблению репликации вируса, но не лишает его способности к транскрипции, может быть делеция, замещение или/и инсерция в одном из генов Ν, Ь или Р. Мутация затрагивает преимущественно тот участок последовательности кодированных генами Ν, Ь или/и Р белков, который необходим для репликации, в то время как необходимые для транскрипции участки последовательности остаются функционально способными.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения рекомбинантный вирус имеет мутацию в гене Р, а именно в Ν-терминальном участке последовательности гена Р. Мутация касается

- 2 015013 предпочтительно, по меньшей мере, области аминокислот 33-41 белка Р, которые важны для репликационной способности. Кроме того, предпочтительно, если не имеет вредящих транскрипционной функции мутаций С-терминальная область (с аминокислоты 320). Особенно предпочтительной является вызывающая потерю репликационной способности мутация в области аминокислот 2-77, например, делеция аминокислот (а) кодированного геном Р белка или одного участка (Ь) последовательности из достаточных для потери репликационной способности участков последовательности аминокислот (а). Соответствующие мутации могут происходить и в Р-белках других вирусов с РНК с негативной цепью, например, других парамиксовирусов, например 11Р1У3.

Соответствующий изобретению рекомбинантный вирус имеет ограниченную репликацию и обладает транскрипционной активностью. Потеря репликационной способности означает, что в клетке-мишени (клетке, которая не обладает устраненными мутацией функциями ίη 1гап8) не обнаруживается никаких следов размножения генома вируса, причем, в отличие от уменьшенной или конициональной ограниченной репликации, нет в наличии и никаких разрешительных условий, при которых может происходить репликация. Определять потерю репликационной способности можно способом, описанным в примере 8. Соответствующий изобретению вирус, однако, в состоянии транскрибировать после инфицирования в клетке-мишени кодированный им генный материал, поэтому может происходить экспрессия вирусных белков, в том числе одного или нескольких чужеродных генных материалов в клетке-мишени. Важно то, что соответствующий изобретению рекомбинантный вирус обладает способностью к вторичной транскрипции, т. е. вирусные генные материалы, которые образуются в результате первичной транскрипции с первоначально содержавшимися в нуклеокапсиде белковыми компонентами, в состоянии сами вызывать или/и поддерживать вторичную транскрипцию. Размер вторичной транскрипции имеет при этом следствием синтез белка предпочтительно, по меньшей мере, в количестве 1%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4% или по меньшей мере 5% по сравнению с диким типом вируса, т.е. вирусом без мутации по меньшей мере в одном из генов Ν, Ь и Р. Способность к вторичной транскрипции по сравнению с соответствующим диким типом вируса может уменьшиться, предпочтительно, однако, на более чем в 20 раз, особенно предпочтительно в 10 раз. Способность к вторичной транскрипции можно определить, как в примере 7.1 или/и 7.3, путем количественного определения экспрессии одного из чужеродных генных материалов, например одного из репортерных белков.

Соответствующий изобретению рекомбинантный вирус наряду с мутацией имеет предпочтительно по меньшей мере один трансген, т. е. по меньшей мере одну кодирующую чужеродный генный материал последовательность. Чужеродным генным материалом может быть белок, например репортерный белок, например флюоресцентный белок, как например ОРР или его производное, или антиген, на который должен даваться иммунный ответ, или терапевтический белок, например белок для вирусной терапии, или же функциональная РНК-молекула, например, антисмысловая РНК, один из рибозимов или одна из обладающих интерференцией κίΡΗΚ-молекул. Предпочтителен чужеродный генный материал в виде антигена, который происходит от патогенов, как например вируса, бактерии, гриба или протозоа, а также опухолевого антигена или автоантигена. Особенно предпочтителен антиген в виде вирусного антигена, который происходит от чужеродного вируса с РНК с негативной цепью, как например, от человеческого парагриппозного вируса или КЯУ. например, 11Р1У3 Р и ΗΝ или 11В8У Р и О. Соответствующий изобретению вирус может содержать одну или несколько, например две или три, кодирующих чужеродный генный материал последовательностей.

Кодирующие чужеродные генные материалы последовательности могут быть встроены в геном рекомбинантного вируса. С другой стороны, кодирующие чужеродные генные материалы последовательности, например гены Р или/и ΗΝ, могут также замещаться последовательностями, которые кодируют чужеродные генные материалы, например химерные генные материалы. Возможны и комбинации встроенных и замещенных трансгенов.

Так, например, последовательности вируса Сендай замещаются полностью или частично чужеродными последовательностями других вирусов с РНК с негативной цепью, например последовательностями парагриппозных вирусов, например 11Р1У3 или/и последовательностяи К.8У. Особенно предпочтительны для применения химерные последовательности, т. е. последовательности, которые состоят из участков чужеродного вирусного генома. Например, могут быть внедрены в вирусный геном химерные гены Р или/и ΗΝ, которые состоят из последовательностей генома базового вируса, например вируса Сендай, и из чужеродных последовательностей, например из человеческих парагриппозных вирусов, как например 11Р1У3, или/и В8У.

Рекомбинантный вирус может содержать один или несколько разных трансгенов. В случае наличия нескольких трансгенов, они могут быть одинакового или разного происхождения, они могут, например, происходить от одного и того же или от разных патогенов, например вирусов. Так, например, могут присутствовать трансгены из нескольких, например 2 или 3, различных патогенов, предпочтительно вирусов, особенно предпочтительно вирусов с РНК с негативной цепью.

Встраивание трансгенов в парамиксовирусы описано, например, Накап е! а1. (1. Оеп. νίτοί. 78 (1997), 2813-2820), Виктеуеу е! а1. (1. νίτοί. 70 (1996), 6634-6641), Уи е! а1. (Оепек Се118 2 (1997), 457-466), Макай е! а1. (РА8ЕВУВ 1. 15 (2001), 1294-1296), 8Ыо!аш е! а1. (Оепе Тйетару 8 (2001), 1043-1050) и ВП/ег е! а1.

- 3 015013 (Мо1. Тйегару 7 (2003), 210-217). Предпочтительно трансгены встраиваются в З'-область вирусного генома. Инсерция происходит, например, в форме транскрипционных кассет, причем на векторном уровне (т.е. на уровне вектора, например плазмидного вектора, который кодирует РНК с негативной цепью) встраиваются непосредственно после лидерной области одна или несколько транскрипционных кассет с уникальными рестрикционными сайтами для интеграции соответствующих считывающих рамок. Интеграция нескольких трансгенов происходит предпочтительно в соответствующих независимых транскрипционных кассетах. Транскрипционная кассета преимущественно содержит кодирующую чужеродный генный материал последовательность в оперативной связи с последовательностью старта транскрипции и последовательностью завершения транскрипции и преимущественно трансляционными сигналами.

Другим предметом настоящего изобретения является одноцепочная или двуцепочная молекула ДНК, например, кДНК-молекула, которая кодирует соответствующий изобретению рекомбинантный вирусный геном с РНК с негативной цепью или его предшественник или же вирусный антигеном или его предшественник. Термин предшественник в данной связи означает, что ДНК-молекула еще не содержит никакой кодирующей чужеродный генный материал последовательности, а лишь место клонирования для включения такой последовательности. Место клонирования может быть рестрикционным сайтом встраивания, например единичным или множественным рестрикционным сайтом встраивания в ДНК или составным сайтом клонирования, включающим несколько следующих друг за другом рестрикционных сайтов, предпочтительно единичных рестрикционньгх сайтов. Кодирующая геном вируса или/и комплементарную последовательности ДНК-молекула предпочтительно находится в функциональной связи с соответствующими последовательностями контроля экспрессии.

ДНК-молекула предпочтительно является вектором, например, плазмидным вектором, который пригоден для размножения в пригодной для этого клетке-хозяине, т.е. в векторной или плазмидной размножающей клетке, предпочтительно в прокариотической клетке, а также в эукариотической клетке, в частности в клетке млекопитающего, и имеет для этого необходимые генетические элементы, как например, источник репликации, последовательности интеграции или/и последовательности селекционного маркера.

Молекула ДНК включает последовательность, кодирующую рекомбинантный вирус или комплементарную последовательности, предпочтительно под контролем транскрипционных сигнальных последовательностей, поэтому при транскрипции ДНК-зависимой РНК-полимеразой в пригодной для первичного приготовления вируса клетке-хозяине, т. е. в клетке для приготовления вируса, может образовываться вирусная РНК с негативной цепью. Транскрипционный сигнал выбирается таким, что он делает возможной эффективную транскрипцию ДНК в соответственно примененной клетке-хозяине. Для этого может применяться также чужеродный для соответствующей клетки транскрипционный сигнал, например, промотор бактериофагов, как например Т7- или 8Р6-промотор, причем клетка для приготовления вируса должна в этом случае содержать и соответствующую чужеродную обеспечивает ДНК-зависимую РНК-полимеразу, например Т7- или 8Р6-РНК-полимеразу, которая вызывает транскрипцию. Кроме того, молекула ДНК содержит наряду с транскрипционным сигналом предпочтительно на З'-конце кодирующей рекомбинантный вирус последовательности терминатор транскрипции и последовательности рибозима, которая делает возможной расщепление транскрипта на конце вирусной последовательности. Клетка для приготовления вируса является преимущественно эукариотической клеткой и в первую очередь клеткой млекопитающего.

Соответствующие изобретению производящие вирус клетки содержат кроме ДНК, кодирующей парамиксовирус с ослабленной репликацией, вспомогательные последовательности, генные материалы которых делают возможным сборку соответствующего изобретению рекомбинантного вируса РНК ίη 1гап5. Для этого эти клетки могут, например, содержать, кроме того, один или несколько векторов, которые вырабатывают Ν-белок, Р-белок или/и Ь-белок ίη 1гап5. В результате этого оказывается возможной сборка нуклеокапсидов соответствующего изобретению рекомбинантного вируса в производящей клетке.

Размножение собранного вначале в производящей вирус клетке рекомбинантного вируса происходит в производящей вирус клетке, которая инфицирована соответствующим изобретению вирусом. Кроме того, размножающая вирус клетка содержит вышеназванные вспомогательные последовательности для выработки Ν-белка, Р-белка или/и Ь-белка ίη 1гап5. Предпочтительно применяют клетку для размножения вируса, в которой происходит постоянная экспрессия вспомогательных последовательностей, например, путем геномной интеграции. Размножающей вирус клеткой является преимущественно клетка млекопитающего. Особенно предпочтительной клеткой для размножения является производная от клетки 293, человеческой эмбриональной клеточной линии почечных фибропластов, клетка Н29 или производная от нее клетка. Клетка Н29 депонирована 05.11.2004 (Ό8Μ АСС 2702) соответственно условиям Будапештского договора в ГмбХ Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Брауншвейг, (улица) МаБСЙгобег Аед. Кроме того, пригодны клетки, производные от клеток Уего, линии почечных клеток африканской зеленой мартышки, или от ЬЬСМК2-клеток, линии почечных клеток резус обезьян, которые устойчиво трансфицированы соответствующими вспомогательными последовательно- 4 015013 стяи, например 8еУ Ν- и Р-генами.

Следующим предметом изобретения является, поэтому, клетка, преимущественно эукариотическая клетка и, особенно предпочтительно, клетка млекопитающего, которая (ί) содержит молекулу ДНК, которая кодирует геном соответствующего изобретению рекомбинантного вируса или/и его комплементарную последовательности или его предшественник, или/и (и) содержащий РНК-геном соответствующего изобретению вируса. Данная клетка, как рассмотрено выше, может быть клеткой для размножения вектора, клеткой для приготовления вируса или клеткой для размножения вируса.

Если эта клетка является клеткой для размножения вектора, например клеткой для размножения плазмид, то для размножения соответствующего вектора можно применять любую пригодную для этого клетку, например, и прокариотическую клетку, как например, трансформированную клетку Ε.οοίί.

Если эта клетка является клеткой для выработки или клеткой для размножения вируса, то она содержит вспомогательные последовательности для выработки вирусных белков Ν, Р или/и Ь ίη 1гап5. Интегрированная для выработки вируса ДНК находится преимущественно под управлением чужеродного транскрипционного сигнала, причем лучше, если клетка, кроме того, содержит ДНК, которая кодирует чужеродную ДНК зависимую РНК-полимеразу, которая распознает чужеродный транскрипционный сигнал и вызывает транскрипцию ДНК, кодирующей рекомбинантный вирус с РНК с негативной цепью.

Если эта клетка является клеткой для размножения вируса, то она инфицирована геномной вирусной молекулой РНК, например, в форме нуклеокапсида, и содержит вспомогательные последовательности в постоянно экспримируемой форме.

Еще одним предметом настоящего изобретения является способ получения соответствующего изобретению рекомбинантного вируса с РНК с негативной цепью, включающий следующие этапы: (а) получение клетки для приготовления вируса, которая инфицирована молекулой ДНК, кодирующей геном вируса с РНК с негативной цепью, имеющего мутацию, по меньшей мере, в одном из генов Ν, Р и Ь, которая приводит к потере способности генома к репликации без потери способности к транскрипции, а также, при необходимости по меньшей мере одну кодирующую чужеродный генный материал последовательности и (Ь) культивирование клетки-хозяина в условиях, при которых происходит согласно (а) транскрипция молекулы ДНК и вначале образуется рекомбинантный вирус с РНК с негативной цепью. Клетка-хозяин предпочтительно в состоянии вырабатывать Ν-белок, Р-белок и/или Ь-белок ίη 1гап5. например, путем трансфекции с соответствующими вспомогательными капсидами, которые содержат кодирующие белки Ν, Р или/и Ь последовательности.

Для приготовления больших количеств нуклеокапсидов или вирусных частиц используют преимущественно клетку, которая конститутивно или репродуцируемо постоянно экспримирует белки Ν, Ь или/и Р, преимущественно, по меньшей мере, белок Р вируса с РНК с негативной цепью. Таким образом, изобретение относится и к способу размножения соответствующего изобретению рекомбинантного вируса с РНК с негативной цепью, предусматривающему этапы: (а) получение размножающей вирус клетки, которая инфицирована геномом вируса с РНК с негативной цепью, имеющим мутацию по меньшей мере в одном из генов Ν, Ь и Р, которая приводит к потере геномом репликационной способности без потери транскрипционной способности, а также, при необходимости по меньшей мере одну кодирующую чужеродный генный материал последовательности и (Ь) культивирование клетки-хозяина в условиях, приводящих к размножению вируса.

Еще одним предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая рекомбинантный, с ограниченной способностью к репликации и способный к транскрипции вирус с РНК с негативной цепью, как он был описан выше, или его нуклеокапсид в качестве действующего вещества, а также, при необходимости, обычно применяемые в фармацевтике наполнители или вспомогательные вещества. Фармацевтическая композиция пригодна для применения в медицине и ветеринарии. Его можно, в частности, применять в качестве вакцины или для противоопухолевой терапии, в частности для применения на пациентах из групп риска, как например, на детях, пожилых пациентах или/или пациентах с поврежденной или слабой иммунной системой. Фармацевтическая композиция может при этом содержать вирус с РНК с негативной отрицательной цепью в его нативной вирусной оболочке.

Особенно предпочтительно применение в качестве вакцины, например вакцины против таких патогенов, как вирусы, бактерии или простейшие. Если рекомбинантный вирус содержит один или несколько трансгенов одинакового происхождения, например из одного и того же патогена, речь идет о моновалентной вакцине. Если рекомбинантный вирус содержит трансгены разного происхождения, то он может быть использован также и в качестве поливалентной вакцины, например, в качестве бивалентной или тривалентной вакцины. Например, поливалентная вакцина может быть использована против нескольких патогенных вирусов, например, против нескольких патогенных вирусов с РНК с негативной цепью, как например, человеческого парагриппозного вируса и Р8У.

Соответствующая изобретению вакцина в состоянии вызывать гуморальный иммунный ответ, преимущественно образование нейтрализующих антител или/и Т-клеточный иммунный ответ. Особенно предпочтительно вызывается гуморальный иммунный ответ и Т-клеточный иммунный ответ.

Фармацевтическая композиция может быть в форме раствора, суспензии, лиофилизата или в любой другой пригодной форме. Наряду с действующим веществом состав может содержать средство для регу

- 5 015013 лирования рН, буфер, средство для регулирования осмотического давления, смачивающее средство и т.п., а также активизирующие иммунную систему вещества. Введение может осуществляться обычным путем, например, орально, накожно, назально, пульмонально и т.д. в форме аэрозолей, жидкостей, порошков и т.д. При этом пациенту вводят терапевтически эффективную дозу вируса, причем эта доза зависит от соответствующего способа применения (например, виротерапия или вакцина), вида заболевания, состояния здоровья и веса пациента, способа введения и формы лекарственного средства. Обычно в разовой дозе вводят 10³-10⁷ вирусных частиц, особенно предпочтительно примерно 10⁴-10⁶ вирусных частиц. При необходимости можно вводить одновременно несколько разных вирусных частиц, например, в случае комбинированных вакцин. Введение может проводиться одно- или многократно, в зависимости от потребности.

Предпочтительными областями применения являются, например, профилактика или лечение респираторных вирусных болезней.

Далее изобретение раскрывается с использованием нижеследующих фигур и примеров.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

1. Общие сведения.

Фиг. 1 отражает строение одного из вирусов Сендай (8еУ) по Филдсу, Р|е1б5 (У1то1оду. Ырршсой, ^1Шат8 и ХУПкпъ (2001), 4. издание; измененное). Геном состоит из одноцепочной РНК, которая представлена белками Ν, Р и Ь, в форме нуклеокапсида. Нуклеокапсид окружен мембранной оболочкой, в которой размещены белки ΗΝ и Р (состоящие соответственно из Ρι- и Р₂-подъединиц). С внутренней стороной мембраны ассоциирован белок М, который одновременно присутствует и в соединениях с компонентами нуклеокапсида.

Геном из одноцепочной негативно ориентированной РНК вируса Сендай дикого типа состоит из 15384 нуклеотидов. Гены 6 структурных белков расположены в нем в последовательности З'-Ν-Ρ/Ο-Μ-ΡΗΝ-Γ-5' (фиг. 2). Между генами имеются мостики из 50-80 нуклеотидов, в каждом из которых имеется сильно консервативный участок из 22 нуклеотидов: терминирующий сигнал предшествующего гена, межгенная последовательность и инициирующий сигнал для последующего гена. Единицу, состоящую из инициирующего сигнала, открытой считывающей рамки (ОВР), в соответствующих случаях нетранслируемых участков и терминирующего сигнала называют транскрипционной кассетой. Перед Ν-концом находится состоящая из 55 нуклеотидов лидирующая последовательность (16), которая транскрибируется, но не транслируется. Вслед за Ь-геном располагается состоящая из 54 нуклеотидов терминирующая последовательность (1т). Указанные 16-участок и ΐτ-участок выступают в качестве геномных и антигеномных промоторов реликации генома или антигенома. Образовавшиеся путем транскрипции мРНКмолекулы, за исключением Р/С-РНК, являются моноцистронными.

Цикл размножения вируса Сендай включает внедрение в клетку-хозяина, транскрипцию и трансляцию, а также репликацию и созревание вируса с последующим выходом вновь выработанных вирусов. В процессе транскрипции особенно активно участвуют белки Ν, Р и Ь, причем Ь представляет вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза со всеми каталитическими активностями. Так как геном вируса Сендай представлен в негативноцепочной ориентации, вирусная РНК не может переводиться непосредственно в белки. Сначала происходит первичная транскрипция в мРНК с помощью РНК-полимеразы, которая ассоциированно с нуклеокапсидом вводится в клетку.

Фиг. 3 является схематичным изображением процесса транскрипции вируса Сендай. В нем полимеразный комплекс, состоящий из одного Ь-белка и одного гомотетрамера из Р-белков, перемещается по упакованной Ν-белками РНК в направлении 5'-конца. При этом считывается генетическая информация на геномной РНК с негативной цепью и транскрибируется в мРНК с положительной цепью.

Репликация генома включает выработку новых геномов вируса с отрицательной цепью. Для этого сначала образуются антигеномы, которые затем служат в качестве матриц для образования геномов. Поскольку транскрипция начинается на З'-конце генома (16), необходимо переключение из режима транскрипции в режим репликации. Это переключение обусловливается большим количеством свободного Νбелка в клетке. Репликация может происходить лишь после того, как образовалось достаточное количество Ν-белка после трансляции мРНК-молекул. После того, как появится в наличии антигеном, который по всей своей длине находится в комплексе с Ν-белками, эта матрица сможет служить для выработки других геномов. Они также упаковываются непосредственно Ν-белками. За процесс репликации опять же ответственны белки Ν, Р и Ь (фиг. 4).

Во время репликации вируса в результате увеличивающегося количества мРНК-молекул все больше синтезируется и вирусных белков. Затем комплексы из вирусных РНК и вирусных белков (нуклеокапсиды) транспортируются в форме секреторных пузырьков к цитоплазматическим мембранам, где происходит капсулирование вирусных частиц поверхностными белками и их почкование.

В рамках настоящего изобретения получают рекомбинантные вирусные мутанты, у которых функции транскрипции и репликации разделены, т.е. вирусы являются способными к транскрипции, но имеют ослабленную способность к репликации. Отсутствующая функция репликации генома для выработки вирусных частиц или их нуклеокапсидов должна компенсироваться вспомогательными клетками, которые комплементируют отсутствующий или с ослабленной функцией вирусный белок ίη 1гап5. Предпоч

- 6 015013 тительной вспомогательной клеткой такого рода является клеточная линия Н29 (ЛУШспЬппк и №иЬей, 1. У1го1. 68 (1994), 8413-8417). Эта клеточная линия в рамках настоящей заявки депонирована 05.11.2004 согласно условиям Будапештского договора под регистрационным номером Э8М АСС2702. Для выработки вирусов с ослабленной способностью к репликации, но способных к транскрипции удален не весь ген, кодирующий Р-белок, а только ответственный за репликацию генома домен. Так, из более ранних работ (Сиггап, Упо1оду 221 (1996), 130-140; Сиггап е1 а1. 1. Упо1оду 69 (1995), 849-855) известно, что в ίη νίΐτο системе при делеции аминокислот 2-77 белка Р ингибируется репликация генома, в то время как вирусная транскрипция остается активной.

На фиг. 5 схематично изображен Р-белок с его Ν- и С-концевыми доменами (ΡΝΤ, РСТ), доменами тетрамеризации (аминокислоты 320-446), Р:Ь-доменами (аминокислоты 411-445) и Ρ:ΚΝΡсоединительными доменами (аминокислоты 479-568). Для отключения функции репликации вирусного генома при одновременном сохранении способности к синтезу вирусной мРНК выбрана делеция первых 77 аминокислот белка Р. При этом впервые был получен соответствующий мутант вируса Сендай (8еУΡΔ2-77), в котором делегирована 5'-концевая область Ρ-ОКЕ. У таких вирусов могут кодироваться только Ν-терминально укороченные Р-белки. Изучение инфицирования показало, что вирусные мутанты в клеточной культуре не способны к размножению. С помощью вспомогательной линии Н29 (Э8М АСС2702), которая, кроме всего прочего, производит требуемый Р-белок дикого типа, может достигаться размножение вирусного мутанта. Эффективность размножения вируса составляет примерно 45% в сравнении с вирусом Сендай дикого типа.

После инфицирования соответствующий изобретению вирусный мутант в состоянии экспримировать вирус-специфические трансгены в инфицированные клетки. Произведенный вирусным мутантом укороченный белок Р в достаточной степени поддерживает вторичный синтез вирусной мРНК. Синтез вирус-специфических белков продолжается в инфицированных клетках на протяжении нескольких дней и по сравнению с диким типом вируса ослаблен лишь примерно в 10 раз, поэтому при использовании мутанта в качестве вакцины можно с уверенностью ожидать достаточный иммунный ответ.

2. Получение конструктов для имеющих ослабленную способность к репликации векторов вируса Сендай (8ЕУУ).

Приготовление кДНК-конструкта р8еУ-Х.

Кодирующая транскрипционная кассета была встроена в 3'-область 8еУ, штамм Ειΐδΐιίιηί (АТСС УК105). У всех мутаций генома обязательно общее число нуклеотидов рекомбинантного генома 8еУ должно быть кратным шести (правило шести).

На основе использованной в качестве матрицы кДНК р8еУ были выработаны два ΡСΚ-фрагмента ΡίΤ XI и ΡίΤ XII для приготовления р8еУ-Х (фиг. 6), ΡίΤ X I (370 Ьр) состоит из последовательности Т7-промотора (Т-7 Ργοιιι.). лидерной (^(-последовательности, начала Ν-гена с 5'-конца до инициаторного кодона Ν-ОКЕ ((Ореп Кеабшд Егаше - открытой рамки считывания). С помощью обратного праймера X I (+) (табл. 3) был встроен единичный рестрикционный сайт Νο!1 и 24 нуклеотида последовательности конца Ν-конца гена. Указанные 24 нуклеотида последовательности Ν-конца гена в ΡΟΡ X I, встроенные посредством мутагенного праймера X I (+), на следующем этапе конструирования выполняют роль области перекрытия с ₽СК XII.

ΡίΤ XII (970 Ьр) состоит из последовательности Ν-начала гена и первой трети Ν-ОКЕ. Через прямой-праймер XII была встроена последовательность 3'-ΝΤΚ Ν и последовательность Ν конца гена, а также межгенная область (ГК). Обратный-праймер X II (+) осуществляет связь в первой трети Ν-ОКЕ после единственного 8рЫ-сайта в геноме 8еУ. Ампликон ΡΟΚ X I располагался в 3'-области комплементарно к 5'-области Ρί.’Κ X II. Через эту область могли объединяться оба указанных ЕСК-фрагмента X I и X II. После Ρί,'Κ продукт (1310 Ьр) в результате рестрикционного расщепления М1и1 и 8р111 мог встраиваться в аналогично обработанный М1и1 и 8р111 вектор р8еУ. Из полученных клонов была выделена плазмидная ДНК и проанализирована с помощью рестрикционного анализа и секвенирования на правильность вставки транскрипционной кассеты. Таким образом был получен конструкт кДНК р8еУ.

Чтобы можно было легко проследить приготовление рекомбинантных вирусов, ген улучшенного зеленого флюоресцирующего белка (еСРТ) был встроен в пустую кассету р8еУ№. еСЕТ-ОКЕ был амплифицирован с помощью ΡΕΚ из ОКЕЕ-Ш (фирма С1оп1еей), причем с помощью мутагенного праймера было соблюдено правило шести и достигнуто включение двух фланкирующих сайтов №11. Образовавшийся ГСК-фрагмент размером 771 Ьр был расщеплен рестрикционным ферментом №11 и методом экстракции из гелей был выделен фрагмент размером 738 Ьр, который был встроен по сайту №11 р8еУ№ в его пустую транскрипционную кассету рЗеУ^. После трансформации Е.еоБ, плазмида и последующего секветирования выделенной плазмиды был получен конструкт кДНК р8еУ-еСЕ?.

2.2. Получение кДНК-конструкта рЗеУ^^.

С помощью конструкта рЗеУ^^ нужно было получить две дополнительные рестрикционные кассеты, в которые можно было бы встроить два трансгена. Применение рЗеУ^^ в качестве базисного вектора при приготовлении векторов с ослабленной способностью к репликации должно было обеспечить возможность создания вектора с мультивалентными, например, трехвалентными свойствами.

рЗеУ^^ был получен с помощью ?СК, в которой в качестве матрицы был использован р8еУ№

- 7 015013 (фиг. 7). Прямой праймер XX был гибридизирован с р8еУ-Х в области сайта Νοΐ1 и с З'-ΝΤΚ предназначенной для встраивания, второй транскрипционной кассеты. Уникальный рестрикционный сайт 8дгЛ1 был встроен с помощью прямого праймера XX между сайтом Νοΐί З'-ΝΤΚ. Он выполняет роль уникального рестрикционного сайта для последующего встраивания ОКЕ одного из трансгенов. В РСК-продукте XX следуют друг за другом конец гена, межгенная область (ΙΚ), начало гена и 5'-ΝΤΚ. С помощью праймера XX (+), который гибридизовали с 5'-ΝΤΚ, были встроены уникальные рестрикционные сайты Еке1 и №ц I. Еке1-сайт служит для встраивания ОКЕ-ов второго трансгена. Уникальный №и-1-сайт был встроен с целью иметь возможность при необходимости встроить третью транскрипционную кассету. Праймер XX (+) гибридизовали в З'-области с сайтом Νοΐί р8еУ^. РСК-продукт XX (220 Ьр) был обработан рестрикционным ферментом Νοΐί и методом гелевой экстракции был выделен фрагмент размером 144 Ьр. Этот фрагмент, по строению соответствующий правилу шести, можно было затем встраивать в плазмиду, также расщепленную Νοΐί. После проверки правильности ориентации Νοΐί РСК-фрагмента XX определения первичной структуры плазмида р8еУ^^ была готова. В уникальные сайты Езе1 и Νπι I можно встраивать любые трансгены.

Для исследований в данной работе обе транскрипционные кассеты (X) р8еУ^^ были обеспечены считывающими рамками двух разных флюоресцирующих белков. С одной стороны, была амплифицирована считывающая рамка для флюоресцирующего белка еОЕР из экспрессионного плазмида рЕОЕР-ΝΙ с помощью РСК с соблюдением правила шести, причем с помощью мутагенного праймера были добавлены два фланкирующих сайта 8дгА1. После рестрикционного расщепления с помощью 8дгЛ1 и экстракции из геля, фрагмент размером примерно 738 Ьр встраивали в первую транскрипционную кассету р8еУX-X (р8еУ- еОЕР^). Таким же образом, с другой стороны, ОКЕ флюоресцирующего белка ЭкКей (из плазмида рЭкКей, фирма С1οηΐесй) с соблюдением правила шести с помощью РСК была обеспечена рестрикционными сайтами Еке1, расшеплена, подвергнута экстракции из геля ДНК и этот фрагмент (702 Ьр) был клонирован во вторую транскрипционную кассету в З'области р8еУ- еСЕР^. Таким путем был создан геномный 8еУ кДНК конструкт р8еУ- еСЕР- ЭкКей.

3. Приготовление векторов (8еУУ) вируса Сендай с ослабленной способностью к репликации.

Были получены кДНК конструкты р8еУУ- еСЕР-ΔΝ, ДР и ДЬ, кодирующие вирусы Сендай с ослабленной способностью к репликации, в которых соответственно делегирован ген белка Ν, Р и Ь. Для этого необходимо было с соблюдением правила шести делетировать соответствующую считывающую рамку генов Ν, Р или Ь, причем должна была остаться некодирующая транскрипционная кассета в соответствующей области (фиг. 8 А).

Путем встраивания рестрикционного сайта вместо делетированной ОКЕ в каждом кДНК конструкте р8еУУ-еОЕР-ДН ДР и ДЬ для последующего использования должна была остаться еще одна функциональная транскрипционная кассета, в которую при необходимости можно было бы включить еще один трансген.

В качестве еще одного варианта 8еУУ с ограниченной способностью к репликации был получен делеционный мутант р8еУУ-еОЕР-РД2-77, который кодирует Ν-терминально укороченный Р белок, в котором отсутствуют аминокислоты 2-77 (фиг. 8В).

Все клонирования р8еУУ-еОЕР-ДН -ДР и -ДЬ проводили по одному и тому же принципу. В качестве примера, в ниже следующем абзаце приведено подробное описание клонирования р8еУУ-еОЕР-ДР. Вслед за этим в краткой форме сведены в таблицу различия в клонировании р8еУУ-еСЕР-ДХ и ДЬ.

3.1. Клонирование кДНК-конструктов р8еУУ- еСЕР-ДР и р8еУУ- еОЕР-РД2-77.

ОКЕ белка была удалена из кДНК конструкта способного к репликации вируса р8еУУ-еОЕР, чтобы получить новую кДНК р8еУУ-еОЕР-ДР, кодирующую вектор с ослабленной способностью к репликации. Вместо Р-ОКЕ был встроен X1ю1 рестрикционный сайт.

Для клонирования р8еУУ-еОЕР-ДР были созданы и впоследствии объединены два РСК-фрагмента, называемых РСК ДР I и РСК ДР II. В качестве матриц для обеих РСК-реакций служил р8еУУ-еОЕР. Для фрагмента РСК ДР I (1272 Ьр) матрицу в области Ν ОКЕ перед уникальным 8рй1-участком гибридизовали с прямым праймером ДР I (= Ν-578; табл. 3). Обратный праймер ДР I (+) гибридизовали с матрицей в 5'-ΝΤΡ. области Р-гена перед ΑΤΟ-кодоном Р, включая рестрикционный сайт X1ю1.

Фрагмент РСК ДР II состоит из 1938 Ьр, в качестве матрицы использовали р8еУ. Прямой праймер ДР II гибридизовали с частью 5^^. Р последовательности, включающий сайт X11ο1. Обратный праймер РСК ДР II (+) гибридизуется с ОКЕ Е гена вслед за уникальным Есо47Ш участком и дополнительно имеет не природный М1и1-сайт.

Оба РСК-фрагмента ДР I и ДР II объединяли по Xйο1-сайту. Продукт объединения - состоящий из частичной последовательности Ν ОКЕ, не кодирующей Р-транскрипционной кассеты с включенным рестрикционным Xйο1-сайтом, М, а также четверти Е ОКЕ - был расщеплен рестрикционными ферментами 8рЫ и М1и1, подвергнут промежуточному этапу клонирования и секвенирования. Из одного из подклонов с правильной последовательностью был вырезан 8рЫ-Есο47III фрагмент размером 3006 Ьр, который был лигирован аналогичным образом обработанный вектор р8еУУ-еОЕР. После проверки последовательности получен р8еУУ- еСЕР-ДР клон (геномная вирусная кДНК) (фиг. 9), который использовали для полу

- 8 015013 чения имеющего ослабленную способность к репликации 8еУУ-еСГР-АР.

Для сборки делеционного мутанта р8еУУ-еСРР-РА2-77 была использована одна РСК с двумя мутагенными праймерами. Прямой праймер Хйо1 РА2-77 имеет один Хйо1-сайт, за которым следуют инициаторный ЛТП-кодон, и кодоны аминокислот 78-86 Р белка. Обратный праймер РА2-77 (+) Хйо1 содержит 10 последних кодонов Р белка и один сайт Хйо1. Считывающая рамка укороченного с Ν-конца на 76 аминокислот Р-белка была создана с помощью РСК, на основе матрицы р8еУ, фрагмент размером 1488 Ьр в результате двух этапов клонирования был встроен в некодирующую транскрипционную кассету р8еУУ- еСРР-АР вместо первичной Р-ОКР. После секвенирования был получен геномный клон кДНК, который использовали для получения имеющего ослабленную способность к репликации р8еУУ-еПРРРА2-77.

Делеция кодонов 2-77 в Р ОКР привела к получению Ν-терминально укороченных неструктурных белков и белков V и ^, а из С-семейства кодирующим остается только лишь С', также транкированный; белки С, Υ1 и Υ2 из-за отсутствия инициаторных кодонов уже не могут транслироваться с укороченной мРНК.

3.2. Клонирование кДНК-конструктов р8еVV-е^БР-АN и -АЬ.

Получение р8еVV-е^БР-АN и р8еVV-е^БР-А^ проводили аналогично клонированию р8еVV-е^БРАР. Схема клонирования приведена в табл. 1.

Путем приготовления соответственно двух объединяющихся РСК-продуктов РСК I и РСК II с учетом правила шести удалили ОКР генов N или Б из р8еVV-е^БР и на их место встроили уникальный Ара1-рестрикционный сайт как в р8еVV-е^РР-АN, так и в р8еVΥ-е^БР-А^. Последовательности праймеров для клонирования р8еVV-е^БР-АN, -АР и -АЬ приведены в табл.3. Приготовленные РСК-продукты РСК I и РСК II были соединены и амплифицированы с помощью прямого праймера РСК I и обратного праймера РСК II. Затем продукты соединения РСК были расщеплены рестрикционными ферментами, имеющими уникальные сайты в р8еV- еСРР и допускают инсерцию соответствующих продуктов в р8еVеСРР (например: №г1 при клонировании р8еVV-е^ΕР-АN, см. табл. 1). Очищенный продукт был встроен в расщепленный соответствующими ферментами вектор р8еV-е^ΕР.

Таблица 1. Перечень применявшихся при клонировании р8еVV-е^ΕР-АX праймеров и рестрикционных сайтов

	ρδενν-εζτΓΡ-ΔΝ	р8еУУ-еОРР-АР	р8еУУ-еСБР-АБ
Праймерная пара РСК I	ΔΝI, ΑΝ I (+)	АР I, АР I (+)	АБ I, АБ I (+)
Праймерная пара РСК II	ΑΝ II, ΑΝ 11 (+)	АР II, АР II (+)	АБ II, АБ II (+)
К88§ транскрипционной кассеты	Ара1	ХЬо1	Ара1
Κ88δ клонирования	Ыаг!	8рЫ + Есо47Ш	Есо47Ш + Азе!

§ К88 = рестрикционный сайт

Затем трансформировали Е. сой, и выделяли плазмидную ДНК в аналитических количествах. Плазмиды анализировали методом рестрикционного анализа и секвенирования, далее из каждого положительного клона выделяли по одному плазмидному препарату (прибор ΏΝΑ Мах1 Ргер-Κίΐ, Р1адеп), в результате чего были получены различные делеционные мутанты р8еVV-е^ΕР-АХ.

4. Приготовление вирусных мутантов с ослабленной способностью к репликации.

Из кДНК конструктов р8еVV-еСРР-АN, -АР и -АЬ в клеточной культуре были приготовлены 8еVвекторы (8еVV-е^БР-АX) с ослабленной способностью к репликации.

4.1. Первичное приготовление 8еVV-е^ΕР-АX.

Для приготовления рекомбинантного 8еV с полным геномом инфицируются и трансфицируются кДНК вирусного генома (р8еV), а также кодированными плазмидом генами Ν, Р и Б (рТМ-Ν, -Р, -Б; Е1гоу-8!еш е! а1. (1989) РУА8 86, 6126-6130), или клеточная линия В8К-Т7, которая стабильно экспримирует Т7 РНК-полимеразу (Бисййок е! а1. (1999) I. νΐΐΌ1. 73, 251-259), или клеточная культура с рекомбинантным Vасс^η^а вирусом ΜνΑ-Τ7, который экспримирует Т7 РНК-полимеразу (8и11ег е! а1. (1995) РЕВ8 371, 9-12).

После этого Т7-полимераза транскрибирует вирусный антигеном или/и комплементарные последовательности и гены Ν, Р и Б. Экспримированный посредством рТМ-Ν Ν-белок упаковывает синтезированную вирусную антигеномную или/и комплементарную РНК, и это нуклеокапсидное ядро (ΕΝΕ) образует вместе с белками Р и Б репликационный комплекс, посредством которого может снова приготовляться и упаковываться в нуклеокапсиды геномная РНК (Беуег е! а1., I. νΐΐΌί. Ме!й. 75 (1998), 47-55). В довершение к этому происходит транскрипция всех кодированных вирусом белков и репликация других вирусных геномов (фиг. 10).

В отличие от описанного приготовления рекомбинантного 8еV Ш с полным геном в кодированной плазмидом кДНК р8еVV-е^БР-АN, -АР и -АБ отсутствует генетическая информация соответственно одного гена Ν, Р или Б. В результате этого приготовленные вначале нуклеокапсиды могут теперь экспри

- 9 015013 мировать два соответствующих гена Ν, Р или Ь. Нужное для размножения р§еУУ-еСРР-ДЫ, -ΔΡ и -ЛЬ нуклеокапсидов количество отсутствующего белка должно вырабатываться, поэтому исключительно посредством управляемой Т7-промотором экспрессии кодированных плазмидом генов Ν, Р или Ь.

Приготовление имеющих ослабленную способность к репликации р8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР и -ЛЬ происходило аналогично приготовлению способных к репликации вариантов 8еУ в НеЬа-клетках (АТСС ССЬ2) или В8Я-Т7-клетках. После 48-часовой инкубации НеЬа-клеток определяли, были ли вирусные частицы р8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР или -ЛЬ высвобождены в надклеточную среду и как много появилось первичных делеционных мутантов.

4.2. Детекция первичных приготовленных 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР или -ЛЬ.

Клеточные среды НеЬа-клеток и В8Р-Т7-клеток, в которых должны были бы быть первично приготовлены 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР или -ЛЬ, исследовали на присутствие этих вирусных векторов. 8еУУ-еСРРЛ^ -ЛР или -ЛЬ, в отличие от рекомбинантного 8еУ \\1. интегрировали в З'-области репортерный ген для еСРР. Этот детекционный маркер применяли теперь для того, чтобы определить, как много образовалось 8еУУ-еСРР-ЛХ.

В параллельных опытах 5х10⁵ клеток Уего (АТСС ССЬ18) с каждым 1 мл клеточной среды трансфицированных при первичном приготовлении 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР, -ЛЬ НеЬа-клеток и одновременно с 8еУ \\1 (МО1=3) коинфицировали с целью транскомплементации отсутствующего белка. В качестве контроля инфицировали клетки Уего или только с 1 мл первично приготовленных 8еУУ-еСРР или же с первично приготовленными 8еУУ-еСРР и одновременно с 8еУ \\1 (МО1=3).

Результат коинфекции клеток с остатками культуры для приготовления 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР или ЛЬ и 8еУ \\1 указывает на то, что все три вирусных мутанта 8еУУ-еСРР-ЛХ могут быть приготовлены первично и после первичного приготовления в состоянии инфицировать клетки, что можно детектировать с помощью проявляющуюся еСРР-трансгенную экспрессию. Первично можно приготовлять примерно 13 х 10² 8еУУ-еСРР, 6,7 х 10² 8еУУ-еОРР-ЛН 3,2 х 10² 8еУУ-еСРР-ЛР и 0,55 х 10² 8еУУ-еСРРЛЬ вирусных мутантов.

5. Размножение 8еУУ-еСРР-ЛХ.

Определяли, могут ли размножаться векторы 8еУУ-еСРР-ЛХ, т.е. функциональны ли они биологически. Способность к репликации определяли в первую очередь по выработке белков отсутствующих генов Ν, Р или Ь путем вирусной транскомплементации с 8еУ.

5.1. Подтверждение способности 8еУ к размножению.

Прежде всего нужно было доказать, что мутанты при соответствующей транскомплементации посредством вируса 8еУ \\1 в состоянии размножаться и при этом инфицировать окружающие их клетки. Для изучения способности 8еУУ-еСРР-ЛХ к размножению опять же предлагается коинфекция клеток с 8еУУ-еСРР-ЛХ и 8еУ \\1. Клетки в этом исследовании инфицировали 8еУ \\1 при низкой МО1, коинфицировали с 8еУУ-еСРР-ЛХ и в течение нескольких дней инкубировали, чтобы таким образом можно было детектировать распространение векторов 8еУУ-еСРР-ЛХ по увеличивающемуся количеству флюоресцирующих клеток.

Одновременно в среднем со 100 мл первично приготовленных 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР или -ЛЬ и 8еУ \\1 (МО1=0,2) инфицировали 5х10⁵ клеток Уего. В качестве положительного контроля служила коинфекция клеток Уего с примерно 100 частицами способного к репликации вируса 8еУУ-еСРР и 8еУ \\1. В течение 48-часовой инкубационной фазы наблюдали размножение всех трех делеционных мутантов: сначала, естественно, флюоресцировали только отдельные клетки Уего, которые были коинфицированы 8еУУ-еСРР-ЛХ и 8еУ \\1. Примерно через 24 ч из этих клеток были высвобождены вирусные частицы, которые теперь были в состоянии проникать в прилегающие к ним клетки. Если эти клетки снова инфицировали одновременно с 8еУУ-еСРР-ЛХ и 8еУ \\Ь то и в таких клетках начиналась детектируемая флюоресценция. Размножение 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР и -ЛЬ в коинфицированных \\1 клетках можно было детектировать по этому шлейфообразованию флюоресцирующих клеток через 48 ч после начала культуры и после этого.

В результате этого исследования было выявлено, что геномные кДНК-конструкты, из которых образовались 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР и -ЛЬ, функциональны во всех областях. Кроме того, удалось показать, что при добавлении отсутствующего вирусного белка размножение вирусных мутантов возможно. Достаточно лишь предоставляемого \\1 вирусом белка (например, Р), чтобы размножать не только делеционные мутанты, но и \\Г т.е., возможно, и субоптимальное количество Р-белка приводит к образованию функциональных нуклеокапсидов 8еУ \\1 и 8еУУ-еСРР-ЛР. Путем предоставления отсутствующего белка партнером транскомплементации 8еУ \\1 удалось достигнуть наблюдаемого размножения, регистрируемого по увеличению количества флюоресцирующих клеток, всех 8еУУ-еСРР-ЛХ в повторностях их культуры.

5.2. Определение требуемых для размножения 8еУУ-еСРР-ЛХ белков.

В первую очередь изучили, какие белки должны предоставляться в каждом отдельном случае размножения 8еУУ-еСРР-ЛН -ЛР и -ЛЬ вспомогательной клеткой, если бы нужно было добиться того, что

- 10 015013 бы УеУ белки Ν, Р и Ь могли синтезироваться независимо друг от друга. Для независимого синтеза УеУ белков Ν, Р и В были в распоряжении три рекомбинантных вируса Уасшша (УУ) УУ-Ν, УУ-Р, УУ-Ь, которые рекомбинантно экспримируют УеУ белки Ν, Р или Ь (СгаеЕ, Н. (1994) Типк1юпе11е Сйага1еп81егип§ без гекошЪшаЩеп Зепба1-У1ги8 Ьагде (Ь) Рго1етз. П188ег1а1юп, ЕЪегйагб-Каг18-ип1уег811ае1 ТиеЪтдеп - Г. Греф (1994) Функциональная характеристика рекомбинантного В белка вируса Сендай. Диссертация, Университет Эберхарда - Карла в Тюбингене).

Коинфицировали 1 χ 10⁶ клеток Уего одновременно УеУУ-еСТР-АХ или УеУУ-еСТР (МО1=0,01) и УУ. УУ-Ν, - Р и -В использовали при этом по отдельности или в комбинациях (МО1=0,5). После одночасового периода абсорбции произошла замена питательной среды ЭМЕМ + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ТКУ) + цитозин-арабинозид (АгаС) (100 мкг/мл) и клетки инкубировали в течение 72 ч при 33° С, причем питательную среду меняли ежедневно, чтобы добавить АгаС.

Распространение УеУУ-еСТР-АХ определили на основании еСТР-экспрессии через 72 ч. За это время в положительных опытах было выявлено увеличение количества флюоресцирующих зеленых клеток с одной первичной клетки до 10-30 соседних, флюоресцирующих клеток.

Результаты исследования, направленного на выявление того, какие УеУ белки необходимы для размножения ЗеУУ-еСТР-ΑΝ, -АР или -АЬ в клетках Уего, приведены в табл. 2. Экспрессия вирусом УУ-Ν только лишь УеУ Ν не приводит к размножению ЗеУУ-еСТР-ΑΝ. ЗеУУ-еСТР-ΑΝ размножается только в том случае, если УеУ белки Ν и Р с помощью рекомбинантных вирусов Уасшша УУ-Ν и УУ-Р в инфицированных клетках экспримируются одновременно. УеУУ-еСТР-АР может размножаться отдельно в результате экспрессии УеУ Р-белков с помощью УУ-Р в клетках Уего. Для размножения ЗеУУ-еСТР-АЬ необходим одновременный синтез белков Р или В вирусом УУ. В ЗеУУ-еСТР-АЬ и инфицированной только лишь УУ-Ь клетке Уего размножения ЗеУУ-еСТР-АЬ не происходит.

Табл. 2. УеУ белки, необходимые для размножения УеУУ-еСТР-АХ

	ΐη νϊίΐΌ-размножение с помощью УУ
δενν-εΟΕΡ-ΔΝ	Ν-	(Ν + Ρ) +
8еУУ-еСЕР-АР	Р +	(Ν + Р) +
ЗеУУ-еСЕР-АЬ	Г-	(Ь + Р) +

Для размножения Зе'УУ-е'СВР-вспомогательная клетка должна экспримировать одновременно УеУ белки Ν и Р, для размножения УеУУ-еСТР-АР достаточно экспрессии УеУ Р-белка во вспомогательной клетке, а амплификация ЗеУУ-еСТР-АЬ была бы возможной в результате клеточной экспрессии УеУ белков Р и В.

5.3. Поддержка амплификации УеУУ-еСТР-АХ вспомогательными клетками Н29.

Изучение размножения УеУУ-еСТР-АХ проводили с помощью клеточной линии Н29. Для этого 1 χ 10⁶ клеток Н29 в 4 разных опытах соответственно инфицировали с примерно 100 первично приготовленными в НеЬа-клетках вирусными частицами 8еУУ-еСВР-А\, -АР или -АЬ или в качестве контроля для успешного размножения способного к репликации УеУ в клетках Н29 с примерно 100 вирусными частицами УеУУ-еСТР. Начиная с 1-го по 10-й день после инфицирования определяли размножение УеУУеСТР-АХ путем регистрации шлейфообразного распространения флюоресцирующих клеток (образование пятна от первично инфицированной клетки Н29.

В контрольном опыте зарегистрировано размножение УеУУ-еСТР, от единично флюоресцирующих клеток в 1-й день после инфицирования до пятен из флюоресцирующих клеток в количестве до 50 на 3-й день после инфицирования. Таким образом было установлено, что при выбранной методике проведения эксперимента осуществляется размножение УеУ.

В инфицированных УеУУ-еСТР-А\ клетках Н29 также происходило размножение вируса. Наряду с клетками Н29 (производное от человеческих почечных клеток 293) для размножения вируса пригодны также производные клеток Уего (почечные клетки африканской зеленой мартышки) и производные ГЬСМК2-клетки (почечные клетки резус обезьяны), стабильно трансфицированные УеУ Р и Ν-генами.

В опыте с УеУУ-еСТР-АР через 1 день были детектированы 100 первично инфицированных отдельных клеток. Через 3 дня после начала опыта примерно 70% флюоресцирующих отдельных клеток превратились в пятна, в которых было до 30 флюоресцирующих клеток. Таким образом, удалось точно выявить распространение УеУУ-еСТР-АР на расположенные вокруг клетки Н29. Тем самым впервые стало возможным размножить вирусный вектор УеУ, у которого делегирована Р-ОКТ. Характеристика размножения УеУУ-еСТР-АР будет приведена в следующем подпункте.

5.4. Размножение УеУУ-еСТР-АР в Н29-клетках.

УеУУ-еСТР-АР может быть амплифицирован выработанными вспомогательными Н29-клетками УеУ Р-белками. Высвобожденные делеционные Р-мутанты в состоянии инфицировать прилегающие клетки Н29. Анализ распространения УеУУ-еСТР-АР ограничен в данном случае сравнением его с распространением способного к репликации УеУУ-еСТР.

Для этого инфицировали 1 χ 10⁶ клеток Н29 в среднем 100 УеУУ-еСТР-АР или УеУУ-еСТР. Через 3, 5 и 10 дней культуры с помощью флюоресцентного микроскопа происходила детекция флюоресцирую

- 11 015013 щих зеленым клеток.

Размножение 8еУУ-еОРР-ДР удалось провести успешно благодаря клеточной выработке 8еУ Рбелков. Во все даты наблюдений было видно, что 8еУУ-еОРР-ДР и 8еУУ-еОРР успешно размножаются на клетках Н29.

В противовес этому, распространения 8еУУ-еОРР-ДР на клетках, которые не вырабатывают отсутствующий Р-белок (клетки-мишени, например клетки Уего), не отмечено, что подтверждает ослабленность способности 8еУУ-еОРР-ДР к репликации (см. пункт 8).

5.5. Генная экспрессия 8е-еОРР-ДР в инфицированных клетках-мишенях.

Удалось подтвердить отсутствие размножения 8еУУ-еОРР-ДР на типах клеток, которые не вырабатывают Р белок ίη 1гаи8. Одновременно ниже ожидаемого уровня была степень выраженности экспрессии.

Как и в случае с -ДР мутантами вируса бешенства, (81юф е1 а1. (2004) У1го1о§у 318, 295-305) слабая еОРР-флюоресценция проявилась только у некоторых инфицированных клеток (меньше 5% см. фиг. 11), хотя статистически при МО1=1 фактически каждая из примерно 70% клеток была инфицирована вирусной частицей. И при большем значении МО1=5 можно было наблюдать только отдельные светящиеся изза 8еУУ-еОРР-ДР зеленым клетки Уего (см. фиг. 12, вверху слева).

Это подтверждает гипотезу о том, что после инфицирования клетки вирусом с отсутствующим Р геном возможна только первичная транскрипция посредством введенного полимеразного комплекса из вирусной частицы. В случае 8еУ ДР-мутантов, кроме того, видимо, к тому способны только несколько процентов инфицированных клеток или генную экспрессию можно наблюдать только тогда, когда в клетке находится одновременно несколько транскрибируемых нуклеокапсидов.

Для терапевтического применения этого обладающего слабой способностью к репликации 8еУУ выраженность экспрессия, Вероятно, очень слаба или нужно было бы использовать несоразмерно много частиц 8еУУ ДР в расчете на одного пациента. Поэтому желательно применять вариант 8еУУ с ослабленной способностью к репликации, который осуществляет также вторичную транскрипцию. Это дает возможность разрабатывать другие модифицированные полимеразные комплексы, которые не могут реплицировать вирусный геном, но обладают способностью к повышенной экспрессии терапевтического гена или антигена.

6. Приготовление модифицированного 8еУУ-еОРР-ДР кДНК конструкта.

Для возможного улучшения транскрипционной деятельности 8еУУ с дефицитом Р гена в клеткемишени был приготовлен другой рекомбинантный конструкт, который в позиции первичной Рсчитывающей рамки кодирует укороченную Ν-конца на 76 аминокислоты форму Р-белка (р8еУУ-еОРРРД2-77; см. пункт 3.1 и фиг. 8В).

Получение 8еУУ-еОРР-РД2-77 частиц и их размножение происходили аналогично пунктам 4.1 и 5.4.

6.1. Размножение 8еУУ-еОРР-РД2-77 во вспомогательных клетках Н29.

В инфицированных р8еУУ-еОРР-РД2-77 вспомогательных клетках Н29 укороченный с Ν-конца на 76 аминокислот, кодированный вирусом РД2-77-белок синтезируется вместе с клеточно кодированным Р-белком.

Для изучения влияния экспрессии укороченного Р-белка РД2-77 на вирусную репликацию инфекцию (МО1=3) клеток Н29 8еУУ-еОРР-РД2-77, 8еУ-еОРР-ДР или контрольным вирусом 8еУ-еОРР проводили способом, аналогичным описанному при изложении кинетики роста 8еУУ-еОРР-ДР. Клеточные среды отдельных повторностей опыта на протяжении 120 ч анализировали способом тестирования на дозу инфицирования клеток, определяя титр вирусного потомства по числу еОРР-экспримирующих клеток.

Из одной инфицированной 8еУ-еОРР Н29-клетки (положительный контроль) в течение 120 ч высвобождалось в среднем 80 вирусных частиц, причем транскомплементация Р-белка клетками Н29 в данном случае необходимой не являлась. 8еУУ-еОРР-РД2-77 мог в Н29-транскомплементационной системе размножаться примерно с такой же эффективностью, как 8еУУ-еОРР-ДР: из инфицированных клеток Н29 по истечении 120 ч высвобождалось примерно 20х10⁶ вирусных частиц 8еУУ-еОРР-ДР или 8еУУеОРР-РД2-77, что соответствует примерно 40 высвобожденным вирусным частицам Р-мутантов в расчете на одну клетку Н29.

7. Сравнение генной экспрессии 8еУУ-еОРР-ДР и 8еУУ-еОРР-РД2-77 и количественное выражение синтеза белка в инфицированных клетках-мишенях.

Для выяснения того, проявляет ли вектор 8еУУ-еОРР-РД2-77 в инфицированных клетках повышенную трансгенную экспрессию - по сравнению с 8еУУ-еОРР-ДР - подробно характеризовали кодированную вирусами экспрессию репортерного гена еОРР, а также ΗΝ белка.

Инфицировали (МО1=1) 8еУУ-еОРР-РД2-77 5х10⁵ клеток Уего, причем на второй день после инфицирования можно было наблюдать примерно 70% флюоресцирующих клеток Уего (не показано). Это означает, что почти каждый ΚΝΓ-комплекс этого вирусного векторного варианта в состоянии вызывать

- 12 015013 измеряемую транскрипцию в клетке-мишени.

7.1. Количественное выражение еСЕР-экспрессии с помощью ЕАС8-анализа.

Транскрипционная кассета, в которой репортерный ген еСЕР был встроен в 8еУУ-еСЕР-РД2-77, должна при последующем применении в медицинских целях кодировать антиген какого-нибудь патогена, например, требующегося вируса. Экспрессия антигена должна быть достаточной для того, чтобы вызвать у пациента защитный иммунный ответ.

Для того чтобы убедиться, что каждый 8еУУ-еСЕР-РД2-77 нуклеокапсид, инфицировавший клетку, в состоянии осуществить детектируемую экспрессию трансгена, одинаковое число клеток Уего и клеток Н29 инфицировали одним и тем же количеством вирусных частиц и с помощью ЕЛС8 (сортинг флюоресцентно активированных клеток) - анализа при использовании проточного цитометра ЕАС8-СайЬиг сравнивали число экспримирующих еСЕР клеток Н29 и клеток Уего. Данные обрабатывали с помощью компьютерной гистограммы, сопоставляя флюоресцентные сигналы инфицированных клеток с общим количеством клеток.

Инфицировали 2,5 х 10⁵ клеток Уего или клеток Н29 8еУУ-еСЕР-РД2-77 или вирусом 8еУУ-еСЕРДР с дефицитом гена Р при МО1=1. ЕАС8-анализ проб проводили через 24 ч после инфицирования. Инфицированные клетки собирали в РВ8 и методом проточной цитометрии определяли количество флюоресцирующих клеток. Результат в виде доли [%] флюоресцирующих Уего- и Н29-клеток показан на фиг. 11.

Через 24 ч после инфицирования вспомогательных клеток Н29 вирусом 8еУУ-еСЕР-ДР путем ЕАС8-анализа удалось детектировать 86% экспримирующих еСЕР клеток Н29. В данном случае клеточный синтез Р-белка поддерживает образование нового Р: Ь-комплекса и, тем самым, выработку новой мРНК, что приводит к синтезу еСЕР-белков в инфицированной клетке. Если же клетки Уего были инфицированы 8еУУ-еСЕР-ДР, то ни через 24 ч после инфицирования, ни в более поздние сроки в других повторностях опыта экспрессии еСЕР-белка обнаружить не удалось. Трансферированные нуклеокапсидами 8еУУ-еСЕР-ДР Р: Ь-комплексы при инфицировании с МО1=1 не в состоянии привнести детектируемую экспрессию в инфицированные клетки Уего.

Зато через 24 ч после инфицирования 8еУУ-еСЕР-РД2-77 удалось идентифицировать ЕАС8анализом почти 80% экспримирующих еСЕР клеток Н29 и также 75% экспримирующих еСЕР клеток Уего. При инфицировании клеток Н29 транскрипция еСЕР мРНК может поддерживаться клеточным синтезом Р-белка и, тем самым, новыми Р: Ь-комплексами. При инфицировании клеток Уего 8еУУ-еСЕРРД2-77 транскрипция усиливается новым синтезом укороченного с Ν-конца Р-белка РД2-77.

Из приведенных результатов можно сделать важный вывод о количестве способных к транскрипции 8еУУ-еСЕР-РД2-77: клетки Н29 и клетки Уего инфицировались при МО1=1. Теоретически возможные многократные инфицирования одной клетки в обоих повторениях статистически маловероятны. Через 24 ч после инфицирования идентифицировали почти 80% экспримирующих еСЕР клеток Н29 и примерно 75% экспримирующих еСЕР клеток Уего. Из всего этого можно заключить, что каждый КНРкомплекс с укороченным Р-вариантом РД2-77, который способен к экспрессии трансгенов в Рвспомогательной клетке, также вызывает экспрессию трансгенов в инфицированной клетке-мишени. В отличие от этого, вариант 8еУУ-еСЕР-ДР с полной делецией Р ОРТ таким свойством не обладает.

7.2. Функциональный тест экспримированного в инфицированной клетке-мишени ΗΝ-белка.

С помощью гемаадсорбционного (НАЭ)-теста определяли на отдельных инфицированных клетках эффективность адсорбции человеческих эритроцитов и тем самым эффективность экспозиции вирусных ΗΝ-белков (фиг. 12).

х 10⁵ клеток Уего инфицировали 8еУУ-еСЕР-РД2-77 при низком МО1=0,5. В отличие от этого, клетки Уего в случае 8еУУ-еСЕР-Д нужно было инфицировать при 10-кратно большей МО1=5, чтобы вообще можно наблюдать отдельные флюоресцирующие клетки. После 1-часовой адсорбции заменяли среду ЭМЕМ + 10% ЕВ8. Затем клетки в течение нескольких дней инкубировали при 33°С. Экспрессию трансгенов для двух векторных вариантов сначала определяли с помощью еСЕР-флюоресценции. На 5-й и 9-й дни после инфицирования проводили серии (НАЭ)-тестов, чтобы проанализировать экспозицию вирусных ΗΝ-белков на основании адсорбции человеческих эритроцитов.

Хотя в случае 8еУУ-еСЕР-ДР при МО1=5 статистически должны бы быть инфицированы 99,3% клеток Уего, под микроскопом удалось наблюдать только лишь 0,01% еСЕР-положительных клеток (фиг. 12 вверху слева). Наоборот, с 8еУУ-еСЕР-РД2-77 можно было согласно ожиданиям наблюдать зеленую флюоресценцию при МО1=0,5 в 40% клеток (фиг. 12 внизу слева).

Через 2 дня после инфицирования 8еУУ-еСЕР-ДР только половина еСЕР-положительных клеток (25 из 5х10⁵ инфицированных) была способна закреплять на своей поверхности эритроциты (фиг. 12 вверху в середине). После дальнейшей инкубации и очередного НАЭ-теста на инфицированных клетках адсорбции эритроцитов больше не происходило. Со вторым с ослабленной способностью к репликации 8еУУ вариантом 8еУУ-еСЕР-РД2-77 опять были получены значительно лучшие результаты: через 5 дней после инфицирования примерно 40% инфицированных клеток (МО1=0,5) были в состоянии адсорбиро

- 13 015013 вать эритроциты на своей поверхности (фиг. 12 внизу в середине). При этом у отдельных клеток можно было наблюдать различную активность связывания от 10 до 70 адсорбированных эритроцитов. Тем самым было показано, что инфицированные 8еУУ-еСЕР-РД2-77 клетки через 5 дней после инфицирования в состоянии экспонировать ΗΝ-белки на поверхности клеток, функциональный ΗΑΌ-тест может оцениваться как положительный. Одновременно на основании различных количеств адсорбированных эритроцитов удалось выявить эффективную экспрессию ΗΝ-белка в инфицированных клетках.

Инфицированные клетки продолжали инкубировать при 33°С, причем нейраминидазная активность ΗΝ-белка приводила к отделению прикрепленных к инфицированным клеткам эритроцитов. Клетки промывали, чтобы удалить отделившиеся эритроциты и инкубировали еще на протяжении 4 дней при 33°С. Очередной ΗΆΌ-тест провели на 9-й день после инфицирования. Теперь удалось детектировать только лишь 30% ΗΆΌ-положнтельных клеток Уего. При этом число прикрепленных красных кровяных телец уменьшилось до 5-20 эритроцитов на одну клетку.

Следовательно через 9 дней после инфицирования имевшим ослабленную способность к репликации вариантом 8еУУ-еСЕР-РД2-77 синтезировалось все еще достаточно функциональных ΗΝ. В противовес этому, вариант 8еУУ-еСЕР-ДР с полной делецией Р ОРЕ такими свойствами не обладает.

7.3. Количественное выражение еОРР-экспрессии с помощью анализа ХУеЧегп Βίοι.

Полуколичественная оценка еОРР-экспрессии обладающего ослабленной способностью к репликации 8еУ-вектора в сравнении со способным к репликации 8еУ-еСЕР была проведена с помошью анализа ХУеЧегп Βίοι путем серийных разведений клеточного общего белка.

5х10⁵ клеток Уего (МО1=3) инфицировали 8еУ-еСЕР или 8еУУ-еОЕР-РД2-77. Через 24 ч после инфицирования произошло растворение клеток; после чего серийное разведение (1:2) клеточных экстрактов от 20 мкг до 2,5 мкг общего количества разделяли с помощью 8Э8-РАОЕ. Белки переносили на РУЭР-мембрану и с помощью ХУеЧегп Βίοι анализа определили кодированный вирусом еСРР-белок (26 кДа) (фиг. 13).

С помощью ХУеЧегп Βίοι анализа флюоресцентный белок еСЕР обнаруживали в клетках Уего, инфицированных как в 8еУ-еСЕР, так и в 8еУУ-еСЕР-РД2-77. Сравнение интенсивности еСЕР-сигналов подтверждает, что экспрессия для 8еУУ-еСЕР-РД2-77 с ослабленной способностью к репликации была меньше примерно в 16 раз по сравнению со способным к репликации 8еУУ-еСЕР.

Уменьшение в 16 раз при этом является небольшим и позволяет сказать, что 8еУУ-еСЕР-РД2-77 несмотря на модифицированный Р-белок может обеспечивать очень эффективную вторичную транскрипцию.

7.4. Оценка ΗΝ-экспрессии с помощью ХУеЧегп Βίοι анализа.

ΗΝ-белок 8еУ является, в отличие от еСЕР-белка, мембранным поверхностным белком и представляет собой важный антигенный детерминант. Путем относительной количественной оценки интенсивности экспрессии ΗΝ-белка в инфицированных 8еУУ-еСЕР-РД2-77 клетках оказалось возможным оценивать интенсивность экспрессии ΗΝ-антигена 8еУ.

Полуколичественная оценка ΗΝ-экспрессии для обладающего ослабленной способностью к репликации 8еУ-вектора в сравнении со способным к репликации 8еУ-еСЕР проводилась с помощью ХУеЧегп Βίοι анализа серийных разведений клеточного общего белка. 5х10⁵ клеток Уего инфицировали в 2 параллельных повторностях 8еУ-еСЕР или 8еУУ-еСЕР-РД2-77 (МО1=1) и инкубировали в течение 24 и 48 ч. Затем происходило растворение клеток; в серийные разведения (1:2) клеточных экстрактов от 16 мкг до 2 мкг общего количества разделяли в 8Э8-РАОЕ. Белки переносили на РУЭЕ-мембрану и определяли кодированный вирусом ΗΝ-белок (60 кДа) с помощью моноклонального ΗΝ-антитела (фиг. 14).

ΗΝ-белок в случае инфицированных 8еУ-еСЕР клеток Уего после обоих периодов инкубирования можно было эффективно детектировать на всех дорожках (от 16 до 2 мкг общего белка; дорожки 2-5 слева и справа). В случае 8еУУ-е6РР-РД2-77 полоса ΗΝ-белка еще видна в дорожках с 16 и 8 мкг общего белка (дорожки 7, 8), однако гораздо слабее. Относительная количественная оценка ΗΝ-экспрессии в инфицированных 8еУУ-е6РР-РД2-77 клетках Уего по сравнению с 8еУ-еСЕР проводилась путем сопоставления дорожек с 16 и 8 мкг относительно 2 мкг общего белка (дорожки 7 и 8 относительно 5, слева и справа) и дает основание считать уменьшение ΗΝ-экспрессии в Р-делеционном варианте 8-16-кратным, независимо от продолжительности инкубации. На основании это можно сделать вывод об относительно высокой степени транскрипции в инфицированных 8еУУ-еСЕР-РД2-77 клетках и вместе с тем о высокой в целом экспрессии трансгена вирусного вектора с ослабленной способностью к репликации.

С учетом обоих измерений (еСЕР- и ΗΝ-белок) можно исходить из среднего уменьшения экспрессии в 10 раз.

8. Ослабленная способность к репликации у 8еУУ-еСЕР-РД2-77 в клетке-мишени.

Если клетки Уего инфицируют способным к репликации 8еУУ-еСЕР, вокруг первично инфицированных, сильно флюоресцирующих клеток в последующие два дня образуется пятно из других флюоресцирующих клеток в количестве до тысячи. Чтобы доказать ослабленную способность 8еУУ-еСЕР-РД2-77 к репликации в клетках Уего, нужно было подтвердить отсутствие увеличения флюоресцирующих зеленым клеток вокруг первично инфицированной клетки-мишени с учетом естественной скорости деления

- 14 015013 клеток Уего. Клетки Уего делились в среднем каждые 24 ч. Если клетки Уего инфицированы 8еУУеОЕР-РД2-77, детектируемую еОЕР-экспрессию можно наблюдать примерно через 24 ч. Отмечали, что после последующей 24-часовой фазы инкубации из этой первично инфицированной, флюоресцирующей клетки Уего в результате естественного деления в некоторых случаях возникают две (слабее) флюоресцирующие дочерние клетки. Это наблюдение не имеет никакого отношения к размножению вируса, при котором из одной инфицированной клетки высвобождается от 10¹ до 10⁴ вирусных частиц, которые затем инфицируют расположенные поблизости клетки. Эта естественная интенсивность деления инфицированных клеток оказывает, с другой стороны, влияние на интенсивность еОЕР-экспрессии, которая с увеличением количества делений клеток уменьшается. Это наблюдение показывает, что вирусный вектор 8еУУ-еСЕР-РД2-77 является ослабленным в отношении репликации генома, следовательно новые геномы синтезироваться не могут. Если несколько следующих друг за другом делений инфицированной клетки приводят к непрерывному уменьшению интенсивности флюоресценции, пока она наконец не прекратится, то размножение вируса можно исключить.

Для окончательного подтверждения ослабленной репликационной способности 8еУУ-еСЕР-РД2-77 в клетках-мишенях было проведено последнее исследование.

Роллер Т75 засевали примерно 20 χ 10⁶ клетками Уего. Клетки уже до начала инкубационной фазы были высеяны с высокой плотностью и поэтому не проявляли больше сильной активности деления. Далее клетки Уего инфицировали 8еУУ-е6ЕР-РД2-77 с МОГ=0,001. Смену среды ΌΜΕΜ с 5% ЕК8 (для уменьшения активности деления) происходила после одночасового инкубационного периода и клетки Уего инкубировали при 33°С (Р1). Через 2 дня после инфицирования удалось наблюдать, соответственно примененной МОГ=0,001, несколько тысяч отдельно расположенных первично инфицированных, флюоресцирующих клеток Уего. Из-за высокой плотности клеток в последующие 4 инкубационных дня деления клеток практически не происходило, т.е. количество первично инфицированных клеток, детектированных по флюоресценции, не менялось. Если бы в этих клетках образовались вирусные частицы, они бы могли инфицировать расположенные рядом клетки, что отразилось бы в усилении флюоресценции. Распространения вирусного вектора из-за отсутствия новых инфекций окружающих клеток не было и через 8 дней. Для обеспечения клеток свежей средой надклеточную среду удаляли, и клетки Уего покрывали новой средой. Через 12 дней после начала инкубации клетки Уего отделились от субстрата. В течение всего периода проведения опыта не проявлялось никакой репликации вирусного вектора в форме увеличения количества флюоресцирующих клеток. Следовательно, удалось исключить распространение 8еУУ-еСЕР-РД2-77 путем выработки новых вирусных геномов и частиц от первично инфицированных клеток на расположенные вокруг клетки Уего. Поэтому 8еУУ-еСЕР-РД2-77 можно считать вирусным вектором с ослабленной способностью к репликации.

Резюме.

Приведенные выше результаты показывают, что путем целенаправленной манипуляции с генами компонентов полимеразного комплекса можно приготовить вирусы с РНК с негативной цепью с ослабленной способностью к репликации, которые в состоянии транскрибировать кодированные вирусами гены, но не могут больше реплицировать вирусный геном.

В случае вируса Сендай специально исследовано детальнее два варианта, в которых ген для полимеразного кофактора фосфо-белка делетировали или полностью, или удаляли кодоны для аминокислот 2 - 77 (8еУУ-е6ЕР-РД2-77). Оба 8еУ вектора в клетках, которые предоставляют Р белок не ίη 1гап5 (так называемые клетки-мишени), имеют ослабленную способность к репликации, однако сильно отличаются по эффективности своей генной экспрессии.

Хотя в случае 8еУУ-еСЕР-ДР при МОГ=5 статистически инфицированными остаются только 0,7% вирусных клеток - 99,3% должны бы содержать, по меньшей мере, один КНР-комплекс - под микроскопом удалось наблюдать только 0,01% еОЕР-положительных клеток. Из этого путем расчетов можно прийти к выводу, что видимая трансгенная экспрессия имеет место только тогда, когда в инфицированной клетке одновременно присутствуют 15 или больше КНР 8еУУ-еСЕР-ДР.

Этот 8еУУ с дефектным геном Р проявляет такую же слабую экспрессию, как и аналогичный ДРвариант бешенства (8Ко_ц е! а1., см. выше). Оба вектора в инфицированных клетках способны только к первичной транскрипции с помощью привнесенного полимеразного комплекса из вирусной частицы. Для терапевтического же применения вектора желательна более сильная экспрессия кодированного трансгена или антигена. Это условие может быть выполнено с помощью имеющего ослабленную способность к репликации варианта 8еУУ-еСЕР-РД2-77. который в клетках-мишенях обеспечивает в среднем в 10 раз меньшую интенсивность экспрессии по сравнению со способным к репликации 8еУ. Благодаря присутствию в геноме гена Ν-терминально укороченного Р белка возможна не только первичная, но и вторичная транскрипция. Она обеспечивается недавно появившимися, модифицированными полимеразными комплексами, которые содержат кодированный вектором РД2-77 белок; он, однако, не поддерживает репликационный режим полимеразы.

Путем количественной характеристики синтеза белка в инфицированных клетках-мишенях доказано, что имеющий ослабленную способность к репликации вирусный вектор 8еУУ-еСЕР-РД2-77 в со

- 15 015013 стоянии осуществлять эффективную транскрипцию и экспрессию кодированных вирусом генов. При этом эффективно синтезируется не только З'-проксимальный трансген (еСЕР); также по меньшей мере через 9 дней после инфицирования транскрибируется расположенный в геномной позиции 6 ΗΝ-ген, функционально активный продукт которого экспонируется на инфицированных клетках-мишенях.

9. Определение иммунного ответа индуцированного РНК-вакциной с ослабленной способностью к репликации, на модели на мышах.

Было показано, что в результате делиции в Р-гене (РД2-77) возникает измененный вирусный полимеразный комплекс, который больше не обеспечивает синтеза новых геномов. Одновременно после инфицирования такими вирусами с ослабленной способностью к репликации определенная в клеткемишени экспрессия вирусных генов приблизительно в 10 раз меньше по сравнению с инфицированием способным к репликации вирусом.

Для доказательства достаточной иммуногенной способности обладающего ослабленной способностью к репликации вируса с РНК с негативной цепью в вирусный геном встроили антигены или антигенные детерминанты двух гетерогенных вирусов (человеческого парагриппозного вируса типа 3, БРГУ3, и респираторного синциального вируса, Р8У). Для этого был выбран 8еУ РД2-77 с ослабленной способностью к репликации, в котором гены первичных поверхностных белков Е и ΗΝ заменены на гены, которые кодируют химерные Е и ΗΝ белки 8еУ/БРГУ3. Химерный Е-белок содержит 558 аминокислот и состоит из внеклеточного домена 11Р1У3 (493 аминокислоты), трансмембранного домена 8еУ (23 аминокислоты) и цитоплазматического домена 8еУ (42 аминокислоты). Химерный ΗΝ-белок имеет 579 аминокислот и состоит из цитоплазматического домена 8еУ (35 аминокислот), трансмембранного домена 8еУ (25 аминокислот), а также внеклеточного домена 11Р1У3 (519 аминокислот). Аминокислотные последовательности химерного Е-белка и химерного ΗΝ-белка в перечне последовательностей приведены под номерами 8ЕО ΙΌ № 27 и 28.

В результате инсерции химерных генов в вирусный геном создаются новые антигены и одновременно обеспечивается эффективное объединение вакцинных частиц при их приготовлении.

В дополнительной экспрессионной кассете, встроенной между двумя вирусными генами, происходило кодирование поверхностного белка Е В8У, в результате чего конструкт был увеличен до бивалентной вакцины.

Эта новая вакцина проверена в модели на животных. Группы мышей Ва1Ь/С трижды с интервалом 3 недели иммунизировали интраназально двумя разными вирусными препаратами (каждая из групп А и С по 10⁴ инфекционных единиц), контрольная группа (В) получала вместо вакцины РВ8. После третьей иммунизации отбирали для анализа мукозного иммунного ответа назальную промывочную жидкость (ΝΑ), а также проводили бронхоальвеолярные полоскания (ВЛЬ) и изолировали для анализа гуморального иммунного ответа сыворотку. С помощью ЕЫ8Л определяли количество индуцированных иммунглобулинов ГдА и ГдС, специфичных для БРГУ, а также Р8У. Прототип вакцины с ослабленной способностью к репликации вызывал явную индукцию ГдА-антител, специфичных для 11РГУ (фиг. 15А), индукция анти- Р8У ГдА-антител проявлялась слабее (не показано). Индукция гуморального ответа на поверхностные антигены обоих вирусов обеспечила сравнимые титры, количество специфичного ГдС отличается в 2 раза (фиг. 15 В). Более глубокий анализ анти- БР1У3-ГдС показал, что индуцированные антитела проявляют нейтрализующие свойства (титр 1/64). В отличие от этого у контрольной группы не удалось выявить - как и ожидалось - какой бы то ни было специфичной ГдА- или ГдС-индукции.

Соответствующая изобретению вакцина не могла индуцировать специфичного мукозного и гуморального ответа на чужеродные вирусные антигены. Дополнительные эксперименты показали, что лимфоциты иммунизированных мышей продуцировали интерферон-7, в то время как ГЬ-5 обнаружить не удалось. Этот результат указывает на то, что бивалентная, с ослабленной способностью к репликации РНК-вакцина в состоянии индуцировать Т-клеточный иммунный ответ, который является предпосылкой длительно сохраняющегося иммунитета.

Резюме.

После инфицирования подопытных животных модифицированным вектором, в котором были использованы последовательности, кодирующие антигены двух чужеродных вирусов, была выявлена индукция нейтрализующих антител. Это свидетельствует о потенциале имеющих ослабленную способность к репликации вирусов с РНК с негативной цепью для разработки новых вакцин.

9. Список применявшихся ДНК-олигонуклеотидов.

Применявшиеся в вышеприведенных примерах ДНК-олигонуклеотиды перечислены в нижеследующей табл. 3

- 16 015013

Таблица 3

Порядковый номер последовательности	Обозначение	Длина [ηΐ]	Последовательность 5’-» 3’	Тт[°С]
1	Х1 = М13	19	ООАААСАОСТАТОАССАТО	54
2	ХК+)	59	ООАТСАТТАОТАССТТОААОССТСОТАОАТ СОС ООССОСОТОААСТТТООСАОСАААО	56
3	XII	57	ООСТТСМООТАСТААТОАТССОТАОТААОААА ААСТТАОООТОАААОТАТТССАСС	64
4	XII (+)=Ν- - 1029 (+)	18	ООТАООТОТСТАТОАООС	56
5	XX	44	ООААССААААОСООССОССООСОООАТСА ТАСОАООСТТСААОО	61
6	ХХ(+)	57	ССТОТОТТТСТОСООССОССОТТСОСОАООС С ООСССОТОААСТТТООСАОСАААОС	61
7	ΝοίΙ еОРР	44	СОСОООСССООООСООССОСОТСОССАССА Т ООТОАССААООСС	60
8	еОРРАо?/(+)	26	ОАТОСАТОСТСОАОСООССООТТТАС	58
9	8§гА1 еОРР	36	ООАТТАСТАТСОССООССОТСОССАССАТО ОТ САОС	61
10	еОРР 8§гА1 (+)	37	СОСТААСТОТСОССООСОТТТАСТТСТАСАО СТ сотсс	63
11	Еае1 ОзКеб	36	СООАТСААОТООССООССОТСОССАССАТО ОТ ССОС	59
12	ϋδΚεά Ряе1 (+)	42	СОСОААТАТСООССООССААОТСТАСАОСА АС АООТООТООС	63
13	ΔΝΙ = Μ13	19	ООАААСАОСТАТОАССАТО	54
14	ΔΝΙ(+)	35	СООТОСОООСССОСАСОТОААСТТТООСАС СА ЛАОС	50
15	ΔΝΙΙ	28	ОТТСАСОТОСОООСССОАТСАТАСОАОО	44
16	ΔΝΙΙ(+) =Ρ-2892 (+)	19	СОСОТСТСОООАТОАТТСО	62
17	ΔΡΙ=Ν-578	17	СССТОАСАСАСТССТТС	54
18	ΔΡΙ(+)	31	ОСОССОСТСОАООСООТААОТОТАОССОАА п	64
19	ΔΡΙΙ	34 .	ССТОСОСТСОАОСТС АТСССОООТОАООС А ТС СС	64
20	ΔΡ II (+)	34	ООСОАСССОТСАОТСТСАСАОССТААТТСО	64
21	ХЬо! ΡΔ2-77	47	СССССТТ1 ПС1СОА0АТОТСОАСССААОАТАА ТСОАТСАООТОАОО	84
22 ’	ΡΔ2-77 (+) ХЬо1	46	ТТТТТССССССТСОАОТТАСТАОТТОСТСАО ТО АСТСТАТОТССТС	80
23	ДЫ = Р-4871	20	АОСАТАТАТССАОАООТСАС	58
24	ΔΤΙ (+)	38	ОООАСТААТТАОТСОООСССОАСС	58
25	ΔΡΙΙ	31	ОСАСТТОООСССОАСТААТТАОТСССТС	60
26	ЛЬ II (+)	21	СОААТООСОСОССТОАТОСОО	64 ~

- 17 015013

ЗедиепгргококоИ

<110>	Мах-Р1апск-Сезе118С11а£Е е.У.	гиг Ебгбегипд бег Зл31ззепзсЪ.а£кеп
<120>	К.ер11каЫопзбе£1г1еп-Ье :	ЕША-Уггеп а!з 1трзко££е
<130>	337783? ТО
<150> <151>	ϋΕ102005006388.8 2005-02-11
<1б0>	28
<170>	РакепЫп тегзхоп 3.3
<210> <211> <212> <213>	1 19 ΏΝΑ кйпзШске Зедиепг
<220> <223>	ОИдопик1еоЫс1
<400>	1

ддааасадск акдассакд <210>

<211>

<212>

<213>

ΠΝΆ кйпзкИсЬе Зедиепг <220>

<223>

О1±допик1еоЫб <400>

ддаксаккад Ьасс'Ькдаад ссксд-еадак сдсддссдсд

ЕдаасЕЕЕдд садсааад <210>

<211>

<212>

<213>

ϋΝΑ кипзкИске Зедиепг <220>

<223>

011допик1еоЫс1 ддср-Ьсаадд каскаакда!: ссдкадкаад <400>

ааааасккад ддЕдагадка ЕЕссасс <210> 4 <211> 18 <212> 0ΝΑ <213> кипзкИске Зедиепг <220>

- 18 015013 <223> 011допик1еоЕхс1 <400> 4 дд-ЕаддЬд-Ьс Еакдаддс <210>

<211>

<212>

<213>

ΌΝΆ кйпзЕИсЬе Зедиепг <220>

<223>

О1±допик1еоЫс1 ддааддаааа дсддссдссд дсддда1:са1г <400>

асдаддс-Ысс аадд <210>

<211>

<212>

<213>

ϋΝΆ кйпзЕИсЬе Зедиепг <220>

<223>

ОИдопикТеоЪШ <400>

сс'кдЪд'Ь-еес Едсддссдсс дЪЕсдсдадд ссддсссдЬд аас'Е'Ь'Ьддса дсааадс <210>

<211>

<212>

<213>

ПКА кЦпэкИске Зедиепг <400>

сдсдддсссд дддсддссдс дксдссасса

ЕддЕдадсаа дддс <210> <211>

<212>

<213>

<220>

<223>

ОИдопикГеоЫй <400>

дакдсакдск сдадсддссд ε±ΐ±βο

2ё <210>

<211>

<212>

<213>

ΏΝΆ кйпзЕИсЬе Зедиепг <220>

<223>

О11допик1еоЫс1

- 19 015013

<400> дда-Ька<	9 .
Лак сдссддсддЕ сдссассакд дкдадс	36
<210>	10 .
<211>	38
<212>	ϋΝΑ
<213>	кЛазбИске 3®ςμβηζ
<220>
<223>	011допик1еоЪ1с1
<400>	10
сдс-Ьаас-'Ьд-е сдссддсдЪЬ -кас±-Ьд-Ьаса дсксдксс	38
<210>	11
<211>	36 ·
<212>	ΠΝΆ
<213>	к-ЦизкИске Зедиепг
<220>
<223>	ОИдопик1еок±с1
<400>	11
сддаксаадк. ддссддссдк сдссассакд дЪдсдс	36
<210>	12
<211?-	42
<212>	ΏΝΆ
<213>	кипзкИсЬе Зедиепг
<220>
<223>	ОИдопик1еок±сЗ
<400>	12
сдсдаагагс ддссддссаа дксгкасадда асаддсддЕд дс	42
<210>	13
<211>	19
<212>	ΟΝΑ -
<213>	кипзкИсЬе Зесщепг
<220>
<223>	О1±допик1ео-Ы0
<400>	13
ддааасадск акдассакд	19
<210>	14 .
<211?-	36
<212?-	ΟΝΑ-
<213?-	кипзкИске Зедиепг

- 20 015013

<220 <223>	ОИдопикТеоЫй
<400>	14
сддкдсдддс ссдсасдкда ас-Ь’ЬЬддсад сааадс	• 36
<210	15
<211>	28
<212>	ϋΝΆ
<213>	кипз-ЬИске Зедиепг
<220
<223>	011допик1еоЫ<1
<400>	15
дЪЕсасдкдс дддсссдакс акасдадд	28
<210	16
<211>	19
<212>	ϋΝΑ
<213>	кипзЫхсЪе Зечиепг
<220>
<223>	011доггик1еок1с1
<400>	16
сдсдксксдд дакдаЕксд	19
<210>	17
<211>	17
<212>	ОКА
<213>	кйпзкИсЬе Зедиепг
<220>
<223>	ОИдопик1еоЪ1<1
<400>	17
ссскдасаса сксск-Ес '	. 17
<210>	18
<211>	31
<212>	ϋΝΑ
<213>	кипзСПскё Зедиепг
<220>
<223>	0Идопик1еоЫс1
<400>	18
дсдссдсгсд аддсддЪаад •Ьд’Ьадссдаа д	31
<210>	19
<211>	34
<212>	ϋΚΑ

- 21 015013 <213>

кипзЕИсЬе Зедиепг <220>

<223>

ОИдолик1ео1:1с4 <400> 19 сс-Ьдсдсксд адсЕсакссс дддкдаддса Ессс <210> 20 <211> 30 <212> ϋΝΑ <213> кйпзкИсЬе Зедиепз <220>

<22 3> ОИдопик1ео'Ыс1 <400> 20 ддсдасдсдк садксксаса дсс±ааГ±сд <210> 21 <211> 47 <212> ϋΝΑ <213> кипзкЫсЪе Ββφίεηζ <220>

<223> О1хдопик1еоЪ1й <400> 21 .

сссссЕЛЕ-ЬЕ с-Ьсдадакдк сдасссаада кааксдакса ддкдадд <210> 22 <211> 46 <212> ϋΝΆ <213> кИпзЕИске Ξβφίβηζ <220>

<22 3> 011допик1еоЕ1с1 <400> 22

ЕЕЕЕ-ессссс сксдадЕЕас ЕадЕЕдд-Ьса дкдаскс-Ьа-Ь дкссйс 46 <210> 23 <211> 20 <212> ША <213> кипзЕИсЬе Зедиепг <220>

<223> ОИдопик1еоЕ±с1 <400> 23 адсакакакс сададдБсас

- 22 015013

<2Ь0> <2И> <2Ь2> <2ЬЗ>	24 24 ΏΝΑ кипзЕИсЬе Зедиепг
<220> <223>	ОНдопикЬеоЫс!

<400> 24 дддасЕаак'Ь адксдддссс дасс <210> 25 <211> 28 <212> ϋΝΑ <213> кйпзЪИсЬе Ηεφίεηζ <220>

<223> ОНдопикЬеокЬё.

<400>25 дсасЬЕдддс ссдасгЬаа'Ы: адксссЕс <2Ь0>26 <2Ы>21 <212> ΌΝΑ <213> кипзЕНсЬе Ξθφίβηζ <220>

<223> ОИдопикЬеоНЦ <400>26 сдааЕддсдс дсскдакдсд д <210>27 <211> 558* <212> РКТ <213> кйпзЬНсЬе Зесщепг <220>

<223> сЫтагез Ргокехп <400>27

Мек. Рго ТЬг Зег Не Ьеи Ьеи Не 11е ТЬг ТЬг Мек 11е Мек АЬа Зег

1015

РЬе Суз СЬп ЬЬе Азр Не ТЬг Ьуз Ьеи СЬп ΗΪ3 УаЬ СЬу УаЬ Ьеи УаЬ

2530

- 23 015013

Азп Зег

Рго 35

Ьуз

81у МеЕ Ьуз

Не 40

Зег

31п Азп РЬе

31и ТЬг 45

Агд Туг

Ьеи

Не

Ьеи

Зег

Ьеи

Не

Рго

Ьуз

Не

31и

Азр

Зег

Азп

Зег

Суз

31у

50

55

60

Азр

С1п

31п

Не

Ьуз

31п

Туг

Ьуз

Агд

Ьеи

Ьеи

Азр

Агд

Ьеи

Не

Не

65

70

75

80

Рго

Ьеи

Туг

Азр

31у

Ьеи

Агд

Ьеи

С1п

Ьуз

Азр

Уа1

Не

Уа1

Зег

Азп

85

90

95

(51X1

31 и

Зег

Азп

С1и

Азп

ТЬг

Азр

Рго

Агд

ТЬг

Ьуз

Агд

РЬе

РЬе

31у

100

105

110

(51у

Уа1

Не

31у

ТЬг

Не

А1а

Ьеи

31у

Уа1

А1а

ТЬг

Зег

А1а

31п

Не

115

120

125

ТЬг

А1а

А1а

Уа1

А1а

Ьеи

Уа1

31и

А1а

Ьуз

31п

А1а

Агд

Зег

Азр

11е

130

135

140

31и

Ьуз

Ьеи

Ьуз

81и

А1а

Не

Агд

Азр

ТЬг

Азп

Ьуз

А1а

Уа1

31п

Зег

145

150

155

160

Уа1

С1п

Зег

Зег

Не

31у

Азп

Ьеи

11е

Уа1

А1а

Не

Ьуз

Зег

Уа1

81п

165

170

175

Азр

Туг

Уа1

Азп

Ьуз

81и

Не

Уа1

Рго

Зег

11е

А1а

Агд

Ьеи

31у

Суз

180

185

190

31и

А1а

А1а

31у

Ьеи

31п

Ьеи

Б1у

Не

А1а

Ьеи

ТЬг

31п

ΗΪ3

Туг

Зег

195

200

205

31и

Ьеи

ТЬг

Азп

Не

РЬе

31у

Азр

Азп

Не

31у

Зег

Ьеи

31п

В1и

Ьуз

210

215

220

31у

Не

Ьуз

Ьеи

31п

31у

Не

А1а

Зег

Ьеи

Туг

Агд

ТЬг

Азп

Не

ТЬг

225

230

235

240

31и

Не

РЬе

ТЬг

ТЬг

Зег

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Туг

Азр

Не

Туг

Азр

Ьеи

245

250

255

Ьеи

РЬе

ТЬг

31и

Зег

Не

Ьуз

Уа1

Агд

Уа1

Не

Азр

Уа1

Азр

Ьеи

Азп

260 265 270

- 24 015013

Азр

Туг

Зег

Не

ТЬг

Ьеи

С1п

УаЬ

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

Ьеи

ТЫ

Агд

Ьеи

275

280

285

Ьеи

Азп

ТЬг

сьп

11е

Туг

Агд

УаЬ

Азр

Зег

ЬЬе

Зег

Туг

Азп

ЬЬе

СЬп

290

295

300

Азп

Агд

СЬи

Тгр

Туг

ЬЬе

Рго

Ьеи

Рго

Зег

НЬз

ЬЬе

Мек

ТЬг

Ьуз

51у

305

ЗЬО

315

320

АЬа

РЬе

Ьеи

СЬу

С1у

АЬа

Азр

УаЬ

Ьуз

СЬи

Суз

ЬЬе

СЬи

АЬа

РЬе

Зег

325

330

335

Зег

Туг

Не

Суз

Рго

Зег

Азр

Рго

СЬу

РЬе

УаЬ

Ьеи

Азп

НЬз

СЬи

Меё

340

345

350

С1и

Зёг

Суз

Ьеи

Зег

СЬу

Азп

ЬЬе

Зег

СЬп

Суз

Рго

Агд

ТЬг

УаЬ

УаЬ

.355

360

365

Ьуз

Зег Азр

Не

УаЬ

Рго

Агд

Туг

АЬа

РЬе

УаЬ

Азп

СЬу

СЬу

УаЬ

УаЬ

370

375

380

АЬа

Азп

Суз

Не

ТЫ

ТЬг

ТЫ

Суз

ТЫ

Суз

Азп

СЬу

ЬЬе

СЬу

Азп

Агд

385

390

395

400

Не

Азп

СЬп

Рго

Рго

Азр

С1п

СЬу

УаЬ

Ьуз

ЬЬе

ЬЬе

ТЬг

НЬз

Ьуз

С1и

405

410

415

Суз

Азп

ТЬг

Не

сьу

ЬЬе

Азп

СЬу

Мек

Ьеи

РЬе

Азп

ТЬг

Азп

Ьуз

СЬи

420

425

430

СЬу

ТЫ

Ьеи

АЬа

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Азп.

Азр

ЬЬе

ТЬг

Ьеи

Азп

Азп

Зег

435

440

445

Уа1

АЬа

Ьеи

Азр

Рго

Не

Азр

ЬЬе

Зег

ЬЬе

СЬи

Ьеи

Азп

Ьуз

А1а

Ьуз

450

455

460

Зег

Азр

Ьеи

СЬи

СЬи

Зег

Ьуз

СЬи

Тгр

ЬЬе

Агд

Агд

Зег

Азп

С1п

Ьуз

465

470

475

480

Ьеи

Азр

Зег

Не

С1у

Азп

Тгр

ΗΪ3

СЬп

Зег

Зег

ТЬг

ТЬг

УаЬ

Не

ТЫ

485 490 495

- 25 015013

Ие

Ие

Уа1

Уа1 500

Мер

Уа1

Уа1

Ие

Ьеи 505

Уа1

Уа1

Ие

Ие

Уа1 510

Не

Уа1

Ие

Уа1

Ьеи 515

Туг

Агд

Ьеи

Ьуз

Агд 520

Зег

МеЕ

Ьеи

Меб

(31у 525

Азп

Рго

Азр

Азр

Агд 530

Ие

Рго

Агд

Азр

ТЫ 535

Туг

ТЬг

Ьеи

б1и

Рго 540

Ьуз

Ие

Агд

Н1з

Меб 545

туг

ТЬг

Азп

61у

(31у 550

РЬе

Азр

А1а

МеЬ

А1а 555

<31и .Ьуз

Агд

<210> .	28
<211>	579
<212>	РКТ
<213>	кйпзЬИсЬе Зедиепг
<220> <223>	сЫтагез Ргобехп

<400> 28

Меб 1

Азр С1у

Азр Агд 61у Ьуз Агд Азр 5 '

Зег Туг Тгр Зег ТЫ Зег Рго

10

15

Зег

61у

Зег

ТЬг 20

ТЫ

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег 25

51у

Тгр

С1и

Агд

Зег 30

Зег

Ьуз

Уа1

Азр

ТЫ 35

Тгр

Ьеи

Ьеи

Ие

Ьеи 40·

Зег

РЬе

ТЬг

31п

Тгр 45

А1а

Ьеи

Зег

Ие

А1а 50

ТЫ

Уа1

Ие

Ие

Суз 55

Ие

Ие

Ие

Зег

А1а 60

Азп

Зег

Ие

Ьуз

Зег 65

51и

Ьуз

А1а

ΗΪ3

(31и 70

Зег

Ьеи

Ьеи

С1п

Азр 75

Уа1

Азп

Азп

61и

РЬе 80

Меб

С1и

Уа1

ТЫ

С1и 85

Ьуз

Ие

С1п

МеЬ

А1а 90

Зег

Азр

Азп

Ие

Азп 95

Авр

Ьеи

Ие

С1п

Зег 100

61у

Уа1

Азп

ТЬг

Агд 105

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Ие

(31п 110

Зег

ΗΪ3

Уа1

е1п

Азп 115

Туг

Ие

Рго

Ие

Зег 120

Ьеи

ТЬг

С1п

(31 п

МеЬ 125

Зег

Азр

Ьеи

- 26 015013

Агд Ьуз 130

РЬе

Не Зег 61и

Не 135

ТЬг 11е Агд Азп Азр Азп Агд 61и Уа1 140

Рго

Рго

С1п

Агд

Не

ТЬг

Нхз

Азр

А1а

61у

Не

Ьуз

Рго

Ьеи

Азп

Рго

145

150

155

160

Азр

Азр

РЬе

Тгр

Агд

Суз

ТЬг

Зег

61у

Ьеи

Рго

Зег

Ьеи

МеЬ

Ьуз

ТЬг

165

170

175

Рго

Ьуз

Не

Агд

Ьеи

МеЬ

Рго

61у

Рго

61у

Ьеи

Ьеи

А1а

МеЬ

Рго

ТЬг

180

185

190

ТЬг

Уа1

Азр

61у

Суз

Уа1

Агд

,ТЬг

Рго

Зег

Ьеи

Уа1

Не

Азп

Азр

Ьеи

195

200

205

Не

Туг

А1а

Туг

ТЬг

Зег

Азп

Ьеи

Не

ТЬг

Агд

61у

Суз

61п

Азр

Не

210

215

220

С1у

Ьуз

Зег

туг

61п

Уа1

Ьеи

61п

Не

61у

Не

Не

ТЬг

Уа1

Азп

Зег

225

230

235

240

Азр

Ьей

Уа1

Рго

Азр

Ьеи

Азп

Рго

Агд

Не

Зег

Нхз

ТЬг

РЬе

Азп

Не

245

250

255

Азп

Азр

Азп

Агд

Ьуз

Зег

Суз

Зег

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Азп

ТЬг

Азр

Уа1

260

265

270

Туг

Б1П

Ьеи

Суз

Зег

ТЬг

Рго

Ьуз

Уа1

Азр

61и

Агд

Зег

Азр

Туг

А1а

275

280

285

Зег

Зег

е1у

Не

61и

Азр

Не

Уа1

Ьеи

Азр

Не

Уа1

Азп

Нхз

Азр

61у

290

295

300

Зег

Не

Зег

ТЬг

ТЬг

Агд

РЬе

Ьуз

Азп

Азп

Азп

Не

Зег

РЬе

Азр

61п

305

310

315

320

Рго

Туг

А1а

А1а

Ьеи

Туг

Рго

Зег

Уа1

С1у

Рго

61у

Не

Туг

Туг

Ьуз

325

330

335

С1у

Ьуз

Не

Не

РЬе

Ьеи

61у

Туг

61у

61 у

Ьеи

С1и

НХЗ

Рго

Не

Азп

340

345

350

- 27 015013

Сби Азп

Аба ббе 355

Суз Азп

ТЬг ТЬг Сбу 360

Суз

Рго

Сбу

Буз 365

ТЬг

Сбп Агд

Азр

Суз

Азп

Сбп

Аба

Зег

Нбз

Зег

Рго

Тгр

РЬе

Зег

Азр

Агд

Агд

Меб.

370

375

380

Уаб

Азп

Зег

ббе

Ббе

Уаб

Уаб

Азр

Буз

Сбу

Беи

Азп

Зег

Ббе

Рго

Ьуз

385

390

395

'400

Ьеи

Ьуз

Уаб

Тгр

ТЬг

Ббе

Зег

Меб

Агд

Сбп

Азп

Туг

Тгр

Сбу

Зег

Сби

405

460

465

С1у

Агд

Беи

Беи

Ьеи

Беи

ббу

Азп

Буз

Ббе

Туг

Ббе

туг

ТЬг

Агд

Зег

•

420

425

430

ТЬг

Зег

Тгр

Нбз

Зег

Буз

Беи

Сбп

Беи

Сбу

Ббе

Ббе

Азр

Ббе

ТЬг

Азр

435

440

445

Туг

Зег

Азр

Ббе

Агд

Ббе

Буз

Тгр'

ТЬг

Тгр

Нбз

Азп

Уаб

Ьеи

Зег

Агд

450

455

460

Рго

Сбу

Азп

Азп

Сби

Суз

Рго

Тгр

Сбу

Нбз

Зег

Суз

Рго

Азр

Сбу

Суз

465

470

475

480

Не

ТЬг

Сбу

Уаб

Туг

ТЬг

Азр

Аба

Туг

Рго

Ьеи

Азп

Рго

ТЬг

Сбу

Зег

485

490

495

Ббе

Уаб

Зег

Зег

Уаб

Ббе

Ьеи

Азр

Зег

Сбп

Буз

Зег

Агд

Уаб

Азп

Рго

500

505

560

Уаб

ббе

ТНг

Туг

Зег

ТЬг

Зег

ТЬг

Сби

Агд

Уаб

Азп

Сби

Беи

Аба

Ббе

565

520

525

Агд

Азп

Буз

ТЬг

Беи

Зег

Аба

Сбу

Туг

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Зег

Суз

ббе

ТЬг

530

535

540

Нбз

Туг

Азп

Буз

Сбу

Туг

Суз

РЬе

Нбз

Ббе

Уаб

Сби

Ббе

Азп

Нбз

Буз

545

550

555

560

Зег

Беи

Азр

ТЬг

РЬе

Сбп

Рго

Меб

Беи

РЬе

Буз

ТЬг

Сби

Ббе

Рго

Буз

565

570

575

Зег Суз Зег

Claims (32)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Рекомбинантный вирус Сендай, содержащий вирусный геном с делецией аминокислот 2-77 белка, кодируемого Р-геном, приводящей к потере способности к репликации без потери вторичной способности к транскрипции.
2. 2. Рекомбинантный вирус Сендай по п.1, отличающийся тем, что вирусный геном дополнительно содержит по меньшей мере одну последовательность, кодирующую чужеродный генный продукт.
3. 3. Рекомбинантный вирус Сендай по п.2, отличающийся тем, что чужеродный генный продукт является белком, рибозимом, антисмысловой молекулой или молекулой миРНК.
4. 4. Рекомбинантный вирус Сендай по п.3, отличающийся тем, что чужеродный генный продукт является репортерным белком, антигенным или терапевтическим белком.
5. 5. Рекомбинантный вирус Сендай по п.4, отличающийся тем, что чужеродный генный продукт является антигенным белком патогена, выбранного из вирусов, бактерий и простейших.
6. 6. Рекомбинантный вирус Сендай по п.5, отличающийся тем, что антигенный белок является вирус

   - 28 015013 ным белком.
7. 7. Рекомбинантный вирус Сендай по п.6, отличающийся тем, что вирусный белок происходит от одинаковых или разных вирусов.
8. 8. Рекомбинантный вирус Сендай по любому из пп.2-7, отличающийся тем, что по меньшей мере одна из последовательностей, кодирующих чужеродный генный продукт, встроена в вирусный геном, в частности, заменяет последовательность, кодирующую гомологичный генный продукт.
9. 9. Рекомбинантный вирус Сендай по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что его транскрипционная способность уменьшена не более чем в 20 раз по сравнению с диким типом.
10. 10. Нуклеокапсид рекомбинантного вируса Сендай по любому из пп.1-9.
11. 11. Геном рекомбинантного вируса Сендай по любому из пп.1-9.
12. 12. Молекула ДНК, которая кодирует геном и/или антигеном рекомбинантного вируса Сендай по любому из пп.1-9.
13. 13. Молекула ДНК по п.12, отличающаяся тем, что она функционально связана с транскрипционным сигналом.
14. 14. Молекула ДНК по п.13, отличающаяся тем, что транскрипционный сигнал является промотором бактериофага, например, Т7 или 8Р6-промотором.
15. 15. Клетка, которая содержит рекомбинантный вирус Сендай по любому из пп.1-9, нуклеокапсид по п.10, геном по п.11 или молекулу ДНК по любому из пп.12-14.
16. 16. Клетка по п.15, отличающаяся тем, что она является клеткой, способной к размножению рекомбинантного вируса Сендай.
17. 17. Клетка по п.15, отличающаяся тем, что она является клеткой, способной к продуцированию рекомбинантного вируса Сендай.
18. 18. Клетка по п.17, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит молекулу ДНК, кодирующую чужеродную ДНК-зависимую РНК-полимеразу, осуществляющую транскрипцию молекулы ДНК, кодирующую рекомбинантный вирус Сендай.
19. 19. Клетка по пп.15-18, отличающаяся тем, что дополнительно содержит молекулу ДНК, кодирующую Р-ген.
20. 20. Способ получения рекомбинантного вируса Сендай по любому из пп.1-9, включающий следующие этапы:

    (а) получение клетки, трансфицированной молекулой ДНК, которая кодирует геном рекомбинантного вируса Сендай, содержащий мутацию в Р-гене, приводящую к потере вирусным геномом способности к репликации без потери вторичной способности к транскрипции, и, при необходимости, содержащий по меньшей мере одну последовательность, кодирующую чужеродный генный продукт, и, (б) культивирование клетки в условиях, при которых происходит транскрипция ДНК согласно (а) и образуется рекомбинантный вирус Сендай.
21. 21. Способ по п.20, дополнительно включающий получение нуклеокапсида или вирусного генома рекомбинантного вируса Сендай.
22. 22. Способ размножения рекомбинантного вируса Сендай по любому из пп.1-9, включающий следующие этапы:

    (а) получение клетки, которая инфицирована рекомбинантным вирусом Сендай, содержащим мутацию в Р-гене, приводящую к потере вирусным геномом способности к репликации без потери вторичной способности к транскрипции, и, при необходимости, содержащий по меньшей мере одну последовательность, кодирующую чужеродный генный продукт, и (б) культивирование клетки в условиях, в которых происходит размножение вируса.
23. 23. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный вирус Сендай по любому из пп.19, нуклеокапсид по п.10 или вирусный геном по п.11 в качестве действующего вещества, а также, при необходимости, фармацевтически приемлемые наполнители и/или вспомогательные вещества.
24. 24. Фармацевтическая композиция по п.23, предназначенная для использования в качестве вакцины.
25. 25. Фармацевтическая композиция по п.24, предназначенная для использования в качестве моноили поливалентной вакцины.
26. 26. Фармацевтическая композиция по пп.23 и 24, предназначенная для использования в качестве вакцины против вирусных инфекций, например в качестве вакцины против инфекций патогенными вирусами с РНК-негативной цепью.
27. 27. Фармацевтическая композиция по п.23, предназначенная для использования в антиопухолевой терапии.
28. 28. Фармацевтическая композиция по любому из пп.23-27, предназначенная для использования у пациентов из групп риска, таких как дети, пожилые люди и пациенты с поврежденной или ослабленной иммунной системой.
29. 29. Фармацевтическая композиция по любому из пп.23-28, содержащая нуклеокапсид в нативной вирусной оболочке.
30. 30. Применение клетки, которая конститутивно или репродуцируемо стабильно экспрессирует Рбелок рекомбинантного вируса Сендай для продуцирования или размножения рекомбинантного вируса

    - 29 015013

    Сендай по любому из пп.1-9, нуклеокапсида по п.10 или вирусного генома по п.11.
31. 31. Применение по п.30, отличающееся тем, что клетка является клеткой млекопитающего.
32. 32. Применение по пп.30 и 31, отличающееся тем, что клетка выбрана из клетки Н29 (Э8М АСС2702) или производной от нее клетки.